ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキット
【課題】正常細胞に対する副作用が少なく、ガン細胞に対してのみ十分な効果を発揮し得る新規な手段を提供する。
【解決手段】ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキットであって、フコイダン抽出物を含むことを特徴とするキット。好ましくは、糖鎖認識タンパク質または糖鎖認識タンパク質発現細胞をさらに含む。
【解決手段】ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキットであって、フコイダン抽出物を含むことを特徴とするキット。好ましくは、糖鎖認識タンパク質または糖鎖認識タンパク質発現細胞をさらに含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンの免疫療法は、正常な細胞とガン細胞との抗原上の違いを免疫系の細胞に認識させて、直接的あるいは間接的にガンを攻撃する治療法の総称である。ガンという変異細胞に対して生体の免疫系が作用することは、純系動物を用いた移植腫瘍の拒絶実験において、宿主内免疫系が腫瘍を異物として特異的に認識することが明らかになっており、これらの機能を人為的に制御してガンに対抗する手段として利用することは、非常に有効なアプローチになると考えられる。また、免疫療法の特徴として、（１）生体が腫瘍が認識する機構を最大限に利用することから、克服が難しいとされている転移性のガン、他の手段では扱い難い部位にある腫瘍であっても効果が期待できること、（２）免疫系のガンに対抗する能力の多様性を利用して幅広い応用ができること、（３）ガン細胞への反応特異性の高さを利用することで、周りの正常細胞への障害作用を最小限にできることなどが挙げられ、これらの試みにより推測される副作用の軽減は、ガン患者のＱＯＬ（Quality Of Life）を実践する上で有用な手段となり得ることから、発展が期待される治療分野である。
【０００３】
しかしながら、ヒトのガンは様々な機序により免疫防御システムをすり抜けることが知られており、ガン細胞の免疫回避機構の解明とその克服法の開発は大きな課題となっている。その１つの要因として、生活習慣の変化による糖鎖異常に起因する細胞間の伝達機能の低下が挙げられる。すなわち、ヒトの細胞は、タンパク質、脂質に結合した糖鎖で密に覆われている。ここで、糖鎖とは、グルコースなどの糖が幾つも結合した分子を指す。
【０００４】
古くから、細胞がガン化すると糖鎖の構造を決定する酵素の遺伝子の発現が変化して糖鎖構造が著しく変化することが知られている。また、ガンの悪性化に伴い、さらに糖鎖発現、糖鎖構造が変化することも知られている。その結果、ガン化した細胞は細胞間に張り巡らされた繊維状の構造物（細胞外マトリクス）と結合できなくなる場合もあり、これはガン細胞が転移しやすい理由の１つとして考えられている。最近ではその一部は腫瘍マーカーとして実際に臨床において用いられているものである。また一方で、糖鎖形成に関与する８種類の糖鎖（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸）を直接摂取することで、糖鎖機能の正常化を図る代替医療も行われている。しかしながら、正常細胞に対する副作用が少なく、しかも十分な効果を発揮し得るような手段は未だなく、開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、正常細胞に対する副作用が少なく、ガン細胞に対してのみ十分な効果を発揮し得る新規な手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキットであって、フコイダン抽出物を含むことを特徴とする。
【０００７】
本発明のキットは、糖鎖認識タンパク質をさらに含むことが好ましく、この場合、糖鎖認識タンパク質はタチナタマメレクチンであることが特に好ましい。
【０００８】
本発明のキットはまた、上述した糖鎖認識タンパク質に代えて、糖鎖認識タンパク質発現細胞をさらに含んでいてもよい。この場合、糖鎖認識タンパク質発現細胞により発現される糖鎖認識タンパク質はタチナタマメレクチン様であることが特に好ましい。またこの場合、糖鎖認識タンパク質発現細胞が未分化状態または分化した状態の樹状細胞であることが特に好ましい。
【０００９】
また、本発明のキットにおけるフコイダン抽出物は、分子量が５００以下であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、フコイダン抽出物が、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導し得るという本発明者らによって初めて見出された知見に基づきなされたものであり、本発明のキットによれば、ガン患者に適用した場合に、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導し、悪性化したガン細胞がアポトーシスを起こしやすくすることができる。また、本発明のキットは、好ましくはフコイダン抽出物に加え、糖鎖認識タンパク質または糖鎖認識タンパク質産生細胞を含み、これによって、糖鎖認識タンパク質（糖鎖認識タンパク質産生細胞により産生された糖鎖認識タンパク質も含む）により、フコイダン抽出物が有するガン細胞に対するアポトーシス誘導能を有意に増強させることができ、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するだけでなく、悪性化したガン細胞がアポトーシスを起こしやすくすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキットであって、フコイダン抽出物を含むことを特徴とする。ここで、本発明における「フコイダン（fucoidan）」とは、モズク、コンブ、ワカメ、メカブなど褐藻類から抽出された分子量２０万〜３０万の粘質多糖類であり（当該褐藻類に乾燥重量で約４％含まれる）、以下に基本構造を示すように、Ｌ−フコースのエステル化硫酸を主成分として少量のガラクトース、キシロース、さらにグルクロン酸などを含む複雑な硫酸化多糖である。
【００１２】
【化１】
【００１３】
このようなフコイダン抽出物は、免疫賦活作用、血管新生抑制作用およびアポトーシス誘導作用の３つに起因する抗腫瘍作用を有することが知られており、近年、代替医療に対する関心の高まりとともに関心が寄せられており、様々な研究報告がなされている。上述のようにフコイダン抽出物は様々な構造を有する糖分子の混合物であり、このことが上述したような幅広い効果をもたらす一因であると考えられる。
【００１４】
本発明者らは、フコイダン抽出物が、ガン細胞の表面糖鎖の構造変化を有意に誘導する作用を有することを見出し、この知見に基づき、当該フコイダン抽出物を含有する、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキットを提供するものである。ここで、図１はヒト子宮頚ガン細胞株であるＨｅＬａ細胞についての糖鎖発現プロファイリング（後述する実験例１）の測定結果を示すグラフであり、図１（ａ）はタチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）、図１（ｂ）はインゲンマメレクチン−Ｅ４（ＰＨＡ−Ｅ４）、図１（ｃ）はレンズマメレクチン（ＬＣＡ）、図１（ｄ）はピーナッツレクチン（ＰＮＡ）、図１（ｅ）はドリコス豆凝集素（ＤＢＡ）、図１（ｆ）はハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−I）、図１（ｇ）はヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）、図１（ｈ）は小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）についての結果を示している。なお、図１中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。詳細は実験例１にて後述するが、図１は、ＨｅＬａ細胞について、１％または５％のフコイダン抽出物にて処理した後、レクチンであるＣｏｎＡ、ＤＢＡ、ＬＣＡ、ＰＨＡ−Ｅ４、ＰＮＡ、ＲＣＡ１２０、ＵＥＡ−ＩまたはＷＧＡをそれぞれ添加し、フローサイトメーターに供した結果を、当該処理を行わなかった対照群と比較して示している。図１から、ＣｏｎＡ、ＤＢＡ、ＵＥＡ−ＩおよびＷＧＡでフコイダン処理濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が確認されたことが分かる。すなわち、ＨｅＬａ細胞はフコイダン抽出物による処理によって、これらレクチンと特異性を有する糖鎖発現が増加したか、もしくはこれらのレクチンに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられる。また図１から、ＰＮＡではフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムの減少が見られることも分かる。すなわち、ＨｅＬａ細胞はフコイダン抽出物による処理によってＰＮＡとの特異性のある糖鎖発現を減少させるか、もしくはＰＮＡに認識されにくい糖鎖構造となったのではないかと考えられる。
【００１５】
また図２は、ヒト肺腺ガン細胞株であるＡ５４９細胞についての糖鎖発現プロファイリング（後述する実験例１）の測定結果を示すグラフであり、図２（ａ）はＣｏｎＡ、図２（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図２（ｃ）はＬＣＡ、図２（ｄ）はＰＮＡ、図２（ｅ）はＤＢＡ、図２（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図２（ｇ）はＲＣＡ１２０、図２（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図２中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。詳細は実験例１にて後述するが、図２は、Ａ５４９細胞について、上述したＨｅＬａ細胞の場合と同様の実験を行った結果を示している。図２から、ＣｏｎＡでのみフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が確認されたことが分かる。すなわち、Ａ５４９細胞はフコイダン抽出物による処理によってＣｏｎＡと特異性のある糖鎖発現が増加したか、ＣｏｎＡに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられる。また図２から、ＷＧＡとＲＣＡではフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムの減少が見られることが分かる。すなわち、Ａ５４９細胞はフコイダン抽出物で処理することで、これらレクチンと特異性を有する糖鎖発現を減少させるか、もしくはこれらレクチンに認識されにくい糖鎖構造となったのではないかと考えられる。
【００１６】
また図３は、ヒト繊維肉腫細胞株であるＨＴ１０８０細胞についての糖鎖発現プロファイリング（後述する実験例１）の測定結果を示すグラフであり、図３（ａ）はＣｏｎＡ、図３（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図３（ｃ）はＬＣＡ、図３（ｄ）はＰＮＡ、図３（ｅ）はＤＢＡ、図３（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図３（ｇ）はＲＣＡ１２０、図３（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図３中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。詳細は実験例１にて後述するが、図３は、ＨＴ１０８０細胞について、上述したＨｅＬａ細胞の場合と同様の実験を行った結果を示している。図３から、ＣｏｎＡ、ＰＮＡ、ＲＣＡ１２０およびＷＧＡでフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が確認されたことが分かる。すなわち、ＨＴ１０８０細胞はフコイダン抽出物による処理によってこれらのレクチンと特異性のある糖鎖発現が増加したか、これらのレクチンに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられる。また、図３から、ＤＢＡではフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムの減少が見られることが分かる。すなわち、ＨＴ１０８０細胞はフコイダン抽出物で処理することで、ＤＢＡと特異性を有する糖鎖発現を減少させるか、もしくはＤＢＡに認識されにくい糖鎖構造となったのではないかと考えられる。
【００１７】
さらに、図４は、ヒト正常線維芽細胞であるＴＩＧ−１細胞についての糖鎖発現プロファイリング（後述する実験例１）の測定結果を示すグラフであり、図４（ａ）はＣｏｎＡ、図４（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図４（ｃ）はＬＣＡ、図４（ｄ）はＰＮＡ、図４（ｅ）はＤＢＡ、図４（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図４（ｇ）はＲＣＡ１２０、図４（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図４中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。詳細は実験例１にて後述するが、図４は、ＴＩＧ−１細胞について、上述したＨｅＬａ細胞の場合と同様の実験を行った結果を示している。図４から、ＣｏｎＡ、ＬＣＡ、ＵＥＡ−ＩおよびＷＧＡにおいてフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が確認されたことが分かる。すなわち、ＴＩＧ−１細胞はフコイダン抽出物による処理によってこれらのレクチンと特異性のある糖鎖発現が増加したか、これらのレクチンに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられる。また図４から、正常細胞であるＴＩＧ−１細胞の場合には、ガン細胞とは異なり、ヒストグラムの減少は見られなかったことが分かる。
【００１８】
詳細は実験例１にて後述するが、図１〜図４を参照して上述した実験結果から、フコイダン抽出物による処理によって、ガン細胞表面における糖鎖構造の変化が誘導されたことが分かる。中でも、実験した全ての細胞において、フコイダン抽出物による処理でＣｏｎＡ反応性糖鎖の発現の上昇がみられており、ＣｏｎＡはマンノース鎖を特異的に認識するレクチンであることから、フコイダン抽出物による処理によってガン細胞表面のマンノース鎖の発現が高まったか、あるいはＣｏｎＡに認識されやすい糖鎖構造となったものと考えられる。本発明のキットは、このようなフコイダン抽出物が、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導し得るという本発明者らによって初めて見出された知見に基づきなされたものであり、ガン患者に適用した場合に、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導し、悪性化したガンを良性に向かわせることができる。
【００１９】
本発明のキットに用いられるフコイダン抽出物は、褐藻類から抽出された状態では通常は巨大な化合物である。本発明に用いられるフコイダン抽出物は、分子量については特に制限されるものではないが、分子量５００以下であることが好ましい。本発明においては、上述した巨大な化合物のままの状態のフコイダン抽出物を用いても勿論よいが、分子量５００以下にまで低分子化されたフコイダン抽出物を用いることによって、腸管からのフコイダン抽出物の吸収を促進させることができる。ここで、腸管からの吸収に注目する理由としては、全身の免疫を司るリンパ球の６０〜７０％が腸管に存在し、抗体全体の６０％は腸管で作られていることが挙げられる。生まれてからの免疫系の代表器官は骨髄と胸腺であることは知られているが、中年以後になると、免疫系器官の中心は胸腺から腸管リンパ組織へ移行する。そのため、いかにして腸管での吸収を高めるかは大きな意義があると考えられる。
【００２０】
フコイダン抽出物は、褐藻類（具体的にはトンガ王国産モズク（Cladosiphon novae-caledniae Kylin）など）から当分野において通常行われているように有機酸抽出し、脱塩処理して抽出することで作製することができる。また、上述したように分子量５００以下に低分子化されたフコイダン抽出物を用いる場合には、当分野において通常行われているような酵素消化処理（たとえば、アワビのグリコシダーゼを用いた酵素消化）、酸加水分解、放射線による分解なども考えられるが、酸加水分解では硫酸基まで分解してしまい、放射線による分解では放射線により構造まで壊れる可能性がある。これに対し、酵素処理は温和で、構造を維持した状態で分解が行えるという利点を有するため、好ましい。
【００２１】
また、本発明におけるフコイダン抽出物は、酵素消化フコイダン（パワーフコイダン（登録商標）、販売元：第一産業株式会社）などの市販品を用いても勿論よい。
【００２２】
本発明のキットにおけるフコイダン抽出物の含有量は特に制限されるものではないが、５０μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内であることが好ましく、１００μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲内であることがより好ましい。フコイダン抽出物の含有量が５０μｇ／ｍＬ未満である場合には、フコイダン抽出物により奏される効果が認められにくくなる虞があり、また、フコイダン抽出物の含有量が１０ｍｇ／ｍＬを超えても、それ以上の効果は得られにくい傾向にあるためである。
【００２３】
本発明のキットは、上述したフコイダン抽出物に加え、糖鎖認識タンパク質または糖鎖認識タンパク質産生細胞をさらに含んでいてもよい。これによって、糖鎖認識タンパク質（糖鎖認識タンパク質産生細胞により産生された糖鎖認識タンパク質も含む）により、フコイダン抽出物が有するガン細胞に対するアポトーシス誘導能を有意に増強させることができ、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化誘導だけでなく、ガン細胞に対するアポトーシス誘導によってもガン細胞に作用し、悪性化したガンを良性に向かわせることができる
ここで、図５〜図８は、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質との組み合わせによるアポトーシス感受性への効果を検定（後述する実験例２）した結果を示す図であり、図５はＨｅＬａ細胞、図６はＡ５４９細胞、図７はＨＴ１０８０細胞、図８はＴＩＧ−１細胞についての結果を示している。詳細は実験例２にて後述するが、図５〜図８は、各細胞について、１％のフコイダン抽出物で処理した後に糖鎖認識タンパク質としてタチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）を用いて刺激した後、フローサイトメーターに供した結果を、当該処理を行わなかった対照群と比較して示している。
【００２４】
図５から、フコイダン抽出物にて処理したＨｅＬａ細胞にＣｏｎＡを添加して刺激を加えた条件とすることで、アポトーシス誘導効果の増強作用が確認されたことが分かる。また図６から、ＨｅＬａ細胞ほどではなかったが、フコイダン抽出物にて処理したＡ５４９細胞にＣｏｎＡを添加して刺激を加えた条件とすることで、アポトーシス誘導効果の増強作用が確認されたことが分かる。また、図７から、フコイダン抽出物にて処理したＨＴ１０８０細胞にＣｏｎＡを添加して刺激を加えた条件とすることで、他のガン細胞と比較して最も顕著にアポトーシス誘導効果の増強作用が確認されたことが分かる。これらの結果に対し、図８から、正常細胞であるＴＩＧ−１細胞については、ガン細胞の場合とは異なり、フコイダン処理することによってアポトーシス誘導効果が対照やレクチンを処理しただけの条件のものより低下していることが分かる。これらの実験結果から、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質との組み合わせにより、フコイダン抽出物が有するガン細胞に対するアポトーシス誘導能を増強することができ、しかもこのアポトーシス誘導能の増強はガン細胞特異的であるという知見が本発明者らによって初めて得られた。
【００２５】
本発明のキットに好適に用いられ得る糖鎖認識タンパク質としては、レクチンが挙げられる。レクチンは、糖に親和性を示すタンパク質の総称で、一般に抗体、酵素を除くものとされている。しかし今日では様々な例外も報告され、糖鎖を特異的に認識して結合、架橋形成するタンパク質と定義するのが一般的である。本発明のキットに好適に用いられ得るレクチンとしては、たとえば、上述したタチナタマメレクチン（コンカナヴァリンＡ）（ＣｏｎＡ：Concanavallin A）、ドリコス豆凝集素（ＤＢＡ：Dolichos Bifiorus）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ：Lens Culinaris Agglutinin）、インゲンマメレクチン−Ｅ４（ＰＨＡ−Ｅ４：Erythroagglutinating Isolectin of Phytohemagglutinin）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ：Arachis Hypogaea Agglutinin）、ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０：Ricinus Communis Agglutinin）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−１：Ulex Europaeus Agglutinin）、小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ：Wheat Germ Agglutinin）が挙げられる。これらの中でも、マンノース特異的糖鎖を認識するレクチンであるタチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）が好ましい。既に上述したように、実験に供したＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞の全てにおいて、フコイダン抽出物による処理で、ＣｏｎＡ反応性糖鎖の発現の上昇の観察がみられており、フコイダン抽出物による処理によってガン細胞表面のマンノース鎖の発現が高まったか、あるいはＣｏｎＡに認識されやすい糖鎖構造となったと考えられ、より顕著な効果を奏するものと考えられるためである。
【００２６】
本発明のキットが糖鎖認識タンパク質を含む場合、糖鎖認識タンパク質は、１μｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの範囲内で含まれていることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの範囲内で含まれていることがより好ましい。糖鎖認識タンパク質の含有量が１μｇ／ｍＬ未満である場合には、糖鎖認識タンパク質を含むことにより奏される効果が認められにくくなる虞があり、また、糖鎖認識タンパク質の含有量が５ｍｇ／ｍＬを超える場合には、正常組織または正常細胞に対して細胞毒性が現れる傾向にある。
【００２７】
また本発明のキットにおいて好適に用いられ得る糖鎖認識タンパク質発現細胞としては、上述したような糖鎖認識タンパク質を発現し得る細胞であれば特に制限されるものではなく、たとえば樹状細胞、単球、マクロファージ、ランゲルハンス細胞などが挙げられる。なお、糖鎖認識タンパク質発現細胞は、未分化の状態、分化された状態のいずれの状態であってよい。未分化の状態の糖鎖認識タンパク質発現細胞を用いる場合には、本発明のキットを適用したガン組織において、当該糖鎖認識タンパク質発現細胞を分化させ、当該ガン組織で糖鎖認識タンパク質を発現し得るように実現され得る。樹状細胞は、各組織の免疫反応の初期段階に大きく影響することから、糖鎖認識タンパク質発現細胞は未分化状態または分化した状態の樹状細胞であり、当該細胞により発現される糖鎖認識タンパク質がタチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）様であることが好ましい。樹状細胞は、自分が取り込んだ抗原を、他の免疫系の細胞に伝える役割を有する抗原提示細胞として機能する免疫細胞の１種であり、マンノース認識能を有することが知られている。また、未分化状態の樹状細胞としては、マンノース認識レセプターを細胞表面上に発現しているヒト単球様細胞株で、各種刺激によりマクロファージ、ＤＣ（樹状細胞）へと分化することができる細胞として知られているＴＨＰ−１細胞を好適に用いることができる。なお、糖鎖認識タンパク質発現細胞は、ガン細胞数に対し５倍以上の数を使用し、フコイダン抽出物１５０μｇ／ｍＬに対し１×１０5個の細胞を用いることで好適に本発明のキットに用いられ得る。
【００２８】
本発明のキットは、たとえば、フコイダン抽出物（および糖鎖認識タンパク質または糖鎖認識タンパク質発現細胞）をガン組織に直接、またはガン患者に経口的に投与することによりガン治療効果を高め得る。なお、本発明のキットは、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質または糖鎖認識タンパク質発現細胞とを含む場合には、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質または糖鎖認識タンパク質発現細胞とを別々の容器に収容するように実現されてもよいし、１つの容器内に混合物として収容されて実現されてもよい。また本発明のキットは、ガン予防を目的とする健康食品（健康飲料を含む）として実現されてもよい。
【００２９】
以下に実験例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実験例に限定されるものではない。
【００３０】
＜実験例１＞
本実験例では、ガン細胞および正常細胞の表面の糖鎖発現にどのような違いがあるのかをレクチンとの感受性により確かめ、その感受性がフコイダン抽出物を用いることでどのように変化するのかをプロファイリングした。
【００３１】
なお、本実験例において、フコイダン抽出物としては、分子量５００以下にまで低分子化された酵素消化フコイダン（パワーフコイダン（登録商標）、販売元：第一産業株式会社）に、２回の遠心分離（１００００×ｇ、３０分間）を繰り返した後、上清をオートクレーブで滅菌したものを用いた。調製されたフコイダン抽出物は、ｐＨ６．８、浸透圧約０．２０６ｏｓｍｏｌ／ｋｇの水溶液であった。
【００３２】
また本実験例において、糖鎖認識タンパク質としては、予めＦＩＴＣ標識されたタチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）、ドリコス豆凝集素（ＤＢＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、インゲンマメレクチン−Ｅ４（ＰＨＡ−Ｅ４）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）、ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−I）および小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）を含む、ＦＩＴＣ標識レクチンのセット（Ｌｅｃｔｉｎ Ｓｅｔ Ｉ−ＦＩＴＣ（Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｋ６０６１）、Ｊ−オイルミルズ製）を用いた。
【００３３】
また、本実験例において用いたヒト子宮頚ガン細胞株であるＨｅＬａ細胞、ヒト肺腺ガン細胞株であるＡ５４９細胞、ヒト繊維肉腫細胞株であるＨＴ１０８０細胞、ヒト正常線維芽細胞であるＴＩＧ−１細胞は、いずれも、東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより譲渡されたものを用いた。Ａ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＴＩＧ−１細胞のいずれも、１０％ＦＢＳ、１％ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ：non essential amino acid）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）含有ＭＥＭ培地（日水製薬（株）製）を用い、３７℃、５％二酸化炭素／９５％空気の培養条件下でそれぞれ継代培養した。いずれも、３×１０6ｃｅｌｌｓの細胞を１ｍＬの凍結培地（ＭＥＭ：０．７ｍＬ、ＦＢＳ：０．２ｍＬ、ＤＭＳＯ：０．１ｍＬ）に懸濁し、−８０℃で保存した。
【００３４】
（１）ＨｅＬａ細胞の糖鎖発現プロファイリング
ＨｅＬａ細胞を６ウェルプレート中に１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して前培養を行った後、１％または５％のフコイダン抽出物をそれぞれ含有する培地中で３日間のフコイダン処理を施した。また、対照群としては、フコイダン抽出物の代わりにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含有する培地に同様に各細胞を播種した。細胞の形状を顕微鏡で確認した後、細胞を回収して５００μＬのＰＢＳに懸濁し、１．５ｍＬのエッペンチューブに回収した。遠心分離（８００×ｇ、１分間）し、上清をアスピレートした後、５０μＬのＰＢＳに細胞を懸濁した。
【００３５】
以降の操作は暗所で行った。まず、ＦＩＴＣ標識された各レクチンを２μｇ量（ＣｏｎＡでは０．９８μＬ、ＤＢＡでは１．８９μＬ、ＬＣＡでは１．２８μＬ、ＰＨＡ−Ｅ４では１．８５μＬ、ＰＮＡでは１．３６μＬ、ＲＣＡ１２０では１．１２μＬ、ＵＥＡ−Ｉでは２μＬ、ＷＧＡでは１．１７μＬ）ずつ添加し、室温（２５℃）で１５分間インキュベート（５分ごとにタッピング）後、１ｍＬのＰＢＳを入れて懸濁し、遠心分離した（８００×ｇ、１分間）。上清をアスピレートした後、５００μＬのＰＢＳで細胞を懸濁して、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＸＬ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ−ＪＫ、ベックマンコールター社製）に供した。なお、測定の手順は、ベックマンコールター社の取扱説明書に記載されたプロトコルを一部改変して使用した。
【００３６】
図１はＨｅＬａ細胞についての測定結果を示すグラフであり、図１（ａ）はＣｏｎＡ、図１（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図１（ｃ）はＬＣＡ、図１（ｄ）はＰＮＡ、図１（ｅ）はＤＢＡ、図１（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図１（ｇ）はＲＣＡ１２０、図１（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図１中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合の場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。図１に示されるように、結果、ＣｏｎＡ、ＤＢＡ、ＵＥＡ−ＩおよびＷＧＡでフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が確認された。すなわち、ＨｅＬａ細胞はフコイダン抽出物による処理によって、これらレクチンと特異性のある糖鎖発現が増加したか、もしくはこれらのレクチンに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられた。また逆の結果として、ＰＮＡではフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムの減少が見られた。すなわち、ＨｅＬａ細胞はフコイダン抽出物で処理することでＰＮＡとの特異性のある糖鎖発現を減少させるか、もしくはＰＮＡに認識されにくい糖鎖構造となったのではないかと考えられた。
【００３７】
（２）Ａ５４９細胞の糖鎖発現プロファイリング
Ａ５４９細胞を用いたこと以外は上述したＨｅＬａ細胞の場合と同様にして、糖鎖発現プロファイリングを行った。図２はＡ５４９細胞についての測定結果を示すグラフであり、図２（ａ）はＣｏｎＡ、図２（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図２（ｃ）はＬＣＡ、図２（ｄ）はＰＮＡ、図２（ｅ）はＤＢＡ、図２（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図２（ｇ）はＲＣＡ１２０、図２（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図２中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。図２に示されるように、結果、ＣｏｎＡでのみフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が見られた。すなわち、Ａ５４９細胞はフコイダン抽出物による処理によってＣｏｎＡと特異性のある糖鎖発現が増加したか、ＣｏｎＡに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられた。また逆の結果として、ＷＧＡとＲＣＡではフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムの減少が見られた。すなわち、Ａ５４９細胞はフコイダン抽出物で処理することで、これらレクチンと特異性を有する糖鎖発現を減少させるか、もしくはこれらレクチンに認識されにくい糖鎖構造となったのではないかと考えられた。
【００３８】
（３）ＨＴ１０８０細胞の糖鎖発現プロファイリング
ＨＴ１０８０細胞を用いたこと以外は上述したＨｅＬａ細胞の場合と同様にして、糖鎖発現プロファイリングを行った。図３はＨＴ１０８０細胞についての測定結果を示すグラフであり、図３（ａ）はＣｏｎＡ、図３（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図３（ｃ）はＬＣＡ、図３（ｄ）はＰＮＡ、図３（ｅ）はＤＢＡ、図３（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図３（ｇ）はＲＣＡ１２０、図３（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図３中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。図３に示されるように、結果、ＣｏｎＡ、ＰＮＡ、ＲＣＡ１２０およびＷＧＡでフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が見られた。すなわち、ＨＴ１０８０細胞はフコイダン抽出物による処理によってこれらのレクチンと特異性のある糖鎖発現が増加したか、これらのレクチンに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられた。また逆の結果として、ＤＢＡではフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムの減少が見られた。すなわち、ＨＴ１０８０細胞はフコイダン抽出物で処理することで、ＤＢＡと特異性を有する糖鎖発現を減少させるか、もしくはＤＢＡに認識されにくい糖鎖構造となったのではないかと考えられた。
【００３９】
（４）ＴＩＧ−１細胞の糖鎖発現プロファイリング
ＴＩＧ−１細胞を用い、フローサイトメーターによる測定の際のプロトコルとしてＴＩＧ ＣｏｎＡ（８種類のレクチン全て）に従ったこと以外は、上述したＨｅＬａ細胞の場合と同様にして、糖鎖発現プロファイリングを行った。図４はＴＩＧ−１細胞についての測定結果を示すグラフであり、図４（ａ）はＣｏｎＡ、図４（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図４（ｃ）はＬＣＡ、図４（ｄ）はＰＮＡ、図４（ｅ）はＤＢＡ、図４（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図４（ｇ）はＲＣＡ１２０、図４（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図４中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。図４に示されるように、結果、ＣｏｎＡ、ＬＣＡ、ＵＥＡ−ＩおよびＷＧＡにおいてフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が見られた。すなわち、ＴＩＧ−１細胞はフコイダン抽出物による処理によってこれらのレクチンと特異性のある糖鎖発現が増加したか、これらのレクチンに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられた。なお、ＴＩＧ−１細胞では、ガン細胞とは異なり、ヒストグラムの減少は見られなかった。
【００４０】
＜実験例２＞
実験例１の結果から、用いた全ての細胞においてフコイダン抽出物により、ＣｏｎＡとの感受性が上がることが示された。これは細胞表面がマンノースリッチな状態となっている可能性を示唆している。本実験例では、フコイダン抽出物による処理をガン細胞に行いＣｏｎＡとの感受性を高め、そこにＣｏｎＡ刺激が加わることでアポトーシス感受性が増強されるのではないかという仮説を実証するための検討を行った。また併せて、その結果はガン細胞特異的なものであるかどうかの確認として、正常細胞も用いて同様に検討を行った。
【００４１】
本実験例でも、フコイダン抽出物および各細胞は実験例１と同様のものを用いた。糖鎖認識タンパク質については、本実験例では、標識されていないＣｏｎＡ（和光純薬工業株式会社製）を用いた。
【００４２】
ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞およびＴＩＧ−１細胞を、６ウェルプレート中に１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでそれぞれ播種して前培養を行った後、１％、５％、１０％または２０％のフコイダン抽出物を含有する培地中に３日間のフコイダン処理を施した。また、対照群としては、フコイダン抽出物の代わりにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含有する培地に同様に各細胞を播種した。細胞の形状を顕微鏡で確認した後、１５ｍＬの遠心管に上清を回収後、１ｍＬのＰＢＳでウェルを洗浄してその液を回収し、ウェルに貼りついている細胞をトリプシンで剥がして回収した。遠心分離（２００×ｇ、５分間）後、上清をアスピレートして、５００μＬのＰＢＳに細胞を懸濁し、１．５ｍＬエッペンチューブに回収した。遠心分離（８００×ｇ、１分間）した後、上清をアスピレートし、５０μＬのＰＢＳに細胞を懸濁した。これにＣｏｎＡを５μＬ添加（対照群では未添加）後、室温で３０分間静置した。１ｍＬのＰＢＳを入れて洗浄（８００×ｇ、２分間）後、上清をアスピレートし、得られたペレットを１５０μＬのＰＢＳに懸濁後、３５０μＬの冷９９．５％エタノールを加えることで終濃度約７０％のエタノールとし、細胞を固定した。３０分間氷上静置後、遠心分離（８００×ｇ、２分間）し、得られたペレットに４７０μＬのＰＢＳおよび２０μＬの１ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡ／ＰＢＳ溶液を加え、懸濁後、室温で３０分間静置した。１０μＬの１ｍｇ／ｍＬのＰＩ／ＰＢＳ溶液を加え軽く振った後、室温で１０分間静置し、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＸＬ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ−ＪＫ、ベックマンコールター社製）に供した。なお、測定の手順は、ベックマンコールター社の取扱説明書に記載されたプロトコルを一部改変して使用した。
【００４３】
図５〜８は、１％のフコイダン抽出物で処理した場合のＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞およびＴＩＧ−１細胞についてのアポトーシス感受性への効果検定をそれぞれ示す図である。図５から分かるように、フコイダン抽出物にて処理したＨｅＬａ細胞にＣｏｎＡを添加して刺激を加えた条件とすることで、アポトーシス誘導効果の増強作用が見られた。また図６から分かるように、ＨｅＬａ細胞ほどではなかったが、フコイダン抽出物にて処理したＡ５４９細胞にＣｏｎＡを添加して刺激を加えた条件とすることで、アポトーシス誘導効果の増強作用が見られた。また、図７から分かるように、フコイダン抽出物にて処理したＨＴ１０８０細胞にＣｏｎＡを添加して刺激を加えた条件とすることで、他のガン細胞と比較して最も顕著にアポトーシス誘導効果の増強作用が見られた。なお、これらガン細胞におけるアポトーシス誘導効果の増強作用は、フコイダン抽出物の濃度が高い方がさらに増強される傾向がみられた（図示せず）。また、図８から、正常細胞であるＴＩＧ−１細胞については、ガン細胞の場合とは異なり、フコイダン処理することによってアポトーシス誘導効果が対照やレクチンを処理しただけの条件のものより低下していることが分かる。また、図９は、１０％のフコイダン抽出物で処理した場合のＴＩＧ−１細胞についてのアポトーシス感受性への効果検定を示す図であるが、図９に示されるように、正常細胞の場合であっても、フコイダンの濃度を１０％に上げた場合には、フコイダンの量が増えることによるストレスのためか、アポトーシスが引き起こされる結果となった。
【００４４】
実験例２の結果から、フコイダン抽出物によりＣｏｎＡ感受性を上げたガン細胞に対して、ＣｏｎＡ刺激を与えることで細胞死が誘導され、さらにこの細胞死経路は、ｓｕｂ−Ｇ１測定の結果からアポトーシスであると考えられた。また、Ａ５４９、ＨｅＬａおよびＨＴ１０８０の三種類のガン細胞に対してはフコイダン抽出物でＣｏｎＡ感受性を高めた状態でのＣｏｎＡ刺激はアポトーシス感受性の増強作用をもたらすが、ＴＩＧ−１においてはＣｏｎＡ刺激のみの場合より細胞死が抑えられており、この作用はガン細胞特異的なのではないかと考えられた。
【００４５】
＜実験例３＞
本実験例では、マンノース認識レセプターを細胞表面上に発現していることが知られているヒト単球様細胞株ＴＨＰ−１と各種ガン細胞を共培養することにより、ＣｏｎＡと同様に細胞死誘導効果の増強効果がフコイダン抽出物による処理によって誘導されるのではないかと考え検討を行った。
【００４６】
本実験例でも、フコイダン抽出物および各細胞は実験例１と同様のものを用いた。また、糖鎖認識タンパク質発現細胞として用いた、ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１は、理化学研究所細胞銀行（ＲＣＢ）より譲渡されたものを用いた。ＴＨＰ−１細胞は、１０％非働化ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）含有ＭＥＭ培地（日水製薬（株）製）を用い、３７℃、５％二酸化炭素／９５％空気の培養条件下で継代培養した。また、表面抗原を認識する抗体（分化マーカーとしてＣＤ１４、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、機能発現に関与するマーカーとしてＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、マンノース認識レセプターとしてＣＤ２０９）は、それぞれ、予めフィコエリスリン（ＰＥ）標識されたフナコシ株式会社製の市販品を用いた。
【００４７】
（１）ＴＨＰ−１細胞の分化処理
分化試薬としてＰＭＡ（Phorbol 12-myristate 13-acetate、Ｃ36Ｈ56Ｏ8、Fw＝６１６．８、ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。ＰＭＡは光によって分解されやすいので、暗所で用い、４℃で保存した。ＰＭＡ粉末は有機溶媒でないと溶けないのでエタノールに溶解し、それをさらにＭＥＭに希釈溶解した。ＴＨＰ−１細胞を撒く際に、終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるようにＰＭＡを処理し、３７℃ＣＯ2インキュベーターで２４時間インキュベートした。その後、シャーレの上清を遠心管に回収し、ＰＢＳでシャーレを洗浄した後、５ｍＭ ＥＤＴＡ−０．８５％ＮａＣｌ溶液をシャーレに添加し、２分間静置した。液を遠心管に回収し、遠心した（２００×ｇ、５分間）後、ＰＢＳで３回洗浄（２００×ｇ、５分間）し、５％非働化ＦＢＳ（fetal bovine serum）−ＭＥＭに細胞を懸濁した。なお、この非働化ＦＢＳは、ＦＢＳを５６℃の湯浴中で３０分加熱処理することで非働化（血清中の補体を不活化）されものである。このようにＦＢＳを非働化したのは、補体が活動すると抗体の働きのみを知ることができないためである。
【００４８】
（２）共培養
ＨｅＬａ細胞およびＨＴ１０８０細胞を６ウェルプレート中に１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでそれぞれ播種して前培養を行った後、５％のフコイダン抽出物を含有する培地中に３日間のフコイダン処理を施した。また、対照群としては、フコイダン抽出物の代わりにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含有する培地に同様に各細胞を播種した。その後、各細胞を６ウェルプレートから回収して新たな６ウェルプレートに１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで再度播種した。各細胞が接着した後、未分化の状態のＴＨＰ−１細胞または分化した状態のＴＨＰ−１細胞（食作用が増強されたマクロファージ）を５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した（ＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞：ＴＨＰ−１細胞＝１：５）。２４時間ごとに位相差顕微鏡により観察を行った。
【００４９】
ここで、図１０は、ＨｅＬａ細胞と未分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合、図１１は、ＨｅＬａ細胞と分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合、図１２は、ＨＴ１０８０細胞と未分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合、図１３は、ＨＴ１０８０細胞と分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合についての結果を示す写真である。なお、図１０（ａ）、図１１（ａ）、図１２（ａ）、図１３（ａ）はフコイダン未処理のＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞を単独培養させた場合、図１０（ｂ）、図１１（ｂ）、図１２（ｂ）、図１３（ｂ）は５％のフコイダン抽出物で処理したＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞を単独培養させた場合、図１０（ｃ）、図１１（ｃ）、図１２（ｃ）、図１３（ｃ）はフコイダン未処理のＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞をフコイダン未処理のＴＨＰ−１細胞と共培養させた場合、図１０（ｄ）、図１１（ｄ）、図１２（ｄ）、図１３（ｄ）は５％のフコイダン抽出物で処理したＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞をフコイダン未処理のＴＨＰ−１細胞と共培養させた場合、図１０（ｅ）、図１１（ｅ）、図１２（ｅ）、図１３（ｅ）は５％のフコイダン抽出物で処理したＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞を５％のフコイダン抽出物で処理したＴＨＰ−１細胞と共培養させた場合の結果をそれぞれ示している。なお、いずれも、共培養２日目の時点での写真を示している。図１０〜図１３から、フコイダン抽出物で処理したＨｅＬａ細胞、ＨＴ１０８０細胞は、未分化状態または分化した状態のＴＨＰ−１細胞による細胞傷害感受性が上昇していることが分かる。また、ＴＨＰ−１細胞についてもフコイダン抽出物で処理することで、その活性がさらに上昇していることが分かる。
【００５０】
（３）ＴＨＰ−１細胞の表面抗原分子の検討
未分化状態のＴＨＰ−１細胞を６ウェルプレート中に１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでそれぞれ播種して前培養を行った後、１％または５％のフコイダン抽出物を含有する培地中に３日間のフコイダン処理を施した。また、対照群としては、フコイダン抽出物の代わりにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含有する培地に同様に各細胞を播種した。その後、細胞を１．５ｍＬエッペンチューブに回収して遠心分離（８００×ｇ、２分間）し、上清をアスピレートした後、５０μＬの５％ＦＢＳ−ＰＢＳに細胞を懸濁した。表面抗原を認識する抗体（分化マーカーとしてＣＤ１４、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、機能発現に関与するマーカーとしてＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、マンノース認識レセプターとしてＣＤ２０９）を各々５μＬずつ添加し、氷上で３０分間静置した。用いた抗体はＰＥ標識されたものであるため、以降の操作は暗所で行った。１ｍＬのＰＢＳで洗浄して遠心分離（８００×ｇ、１分間）した後、上清をアスピレートし、３００μＬのＰＢＳに懸濁してフローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＸＬ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ−ＪＫ、ベックマンコールター社製）に供した。なお、測定の手順は、ベックマンコールター社の取扱説明書に記載されたプロトコルを一部改変して使用した。
【００５１】
図１４は、ＴＨＰ−１細胞の表面抗原分子の検討結果を示す図であり、図１４（ａ）はＣＤ１４、図１４（ｂ）はＣＤ１ａ、図１４（ｃ）はＣＤ１１ｃ、図１４（ｄ）はＨＬＡ−ＤＲ、図１４（ｅ）はＣＤ４０、図１４（ｆ）はＣＤ８０、図１４（ｇ）はＣＤ８３、図１４（ｈ）はＣＤ８６、図１４（ｉ）はＣＤ２０９についての結果をそれぞれ示している。結果、分化マーカーとしてより未分化な状態でみられるＣＤ１４、単球からマクロファージへ分化したときに発現上昇が見られるＣＤ１ａ、ＤＣへと分化したときに発現が上昇するＣＤ１１ｃ、また分化した細胞で発現上昇が見られるＨＬＡ−ＤＲの４つのＴＨＰ−１の分化に関するマーカー分子の発現には全く影響を及ぼさなかった。一方、ＴＨＰ−１の機能発現に関するマーカーであるＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＣＤ４０については、発現上昇が観察された。さらにＴＨＰ−１が有するマンノース認識レセプターの１つであるＣＤ２０９の発現もフコイダン抽出物による処理によって増強された。
【００５２】
実験例３の結果から、フコイダン抽出物はガン細胞表面のマンノースの発現変化を誘導し、マンノース認識能のあるＴＨＰ−１と強く作用することで細胞傷害活性効果をもたらすことが確認された。またその効果は、マクロファージに分化していない未分化状態のＴＨＰ−１細胞とでも確認できたことから、未分化状態であってもＴＨＰ−１細胞にはマンノースを認識し、作用する働きがあるのではないかと考えられる。また一方で、ＴＨＰ−１細胞も同時にフコイダン抽出物にて処理することで細胞傷害活性が上昇したことから、ＴＨＰ−１細胞にもフコイダン抽出物は作用していると考えられる。その仮説を裏付けるかの如く、本実験例では、フコイダン抽出物による処理によってＴＨＰ−１細胞の機能発現に関与するマーカーの発現増強効果が認められた。この結果において分化マーカーの発現には変化が見られなかったことから、フコイダン抽出物はＴＨＰ−１細胞に分化誘導効果をもたらしているのではなくて、機能変化をもたらしていると考えられる。また機能発現に関与するマーカーのうち、マンノース認識レセプターの１つであるＣＤ２０９で発現が上昇したことは、フコイダン抽出物による処理によりＴＨＰ−１細胞のマンノース認識能が増強されたことが示唆される。このことから、フコイダン抽出物による処理はガン細胞のマンノース発現に変化を及ぼすだけでなく、ＴＨＰ−１細胞のマンノース認識能にも変化をもたらしていることを示しており、すなわち、フコイダン抽出物はガン細胞の機能変化および免疫系の細胞によるガン細胞攻撃能の両面に作用することで、ガンの抑制効果を発揮しているものと考えられる。
【００５３】
今回開示された実施の形態および実験例は、全ての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ヒト子宮頚ガン細胞株であるＨｅＬａ細胞についての糖鎖発現プロファイリングの測定結果を示すグラフであり、図１（ａ）はタチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）、図１（ｂ）はインゲンマメレクチン−Ｅ４（ＰＨＡ−Ｅ４）、図１（ｃ）はレンズマメレクチン（ＬＣＡ）、図１（ｄ）はピーナッツレクチン（ＰＮＡ）、図１（ｅ）はドリコス豆凝集素（ＤＢＡ）、図１（ｆ）はハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−I）、図１（ｇ）はヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）、図１（ｈ）は小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）についての結果を示している。
【図２】ヒト肺腺ガン細胞株であるＡ５４９細胞についての糖鎖発現プロファイリングの測定結果を示すグラフであり、図２（ａ）はＣｏｎＡ、図２（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図２（ｃ）はＬＣＡ、図２（ｄ）はＰＮＡ、図２（ｅ）はＤＢＡ、図２（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図２（ｇ）はＲＣＡ１２０、図２（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。
【図３】ヒト繊維肉腫細胞株であるＨＴ１０８０細胞についての糖鎖発現プロファイリングの測定結果を示すグラフであり、図３（ａ）はＣｏｎＡ、図３（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図３（ｃ）はＬＣＡ、図３（ｄ）はＰＮＡ、図３（ｅ）はＤＢＡ、図３（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図３（ｇ）はＲＣＡ１２０、図３（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。
【図４】ヒト正常線維芽細胞であるＴＩＧ−１細胞についての糖鎖発現プロファイリングの測定結果を示すグラフであり、図４（ａ）はＣｏｎＡ、図４（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図４（ｃ）はＬＣＡ、図４（ｄ）はＰＮＡ、図４（ｅ）はＤＢＡ、図４（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図４（ｇ）はＲＣＡ１２０、図４（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。
【図５】ＨｅＬａ細胞について、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質との組み合わせによるアポトーシス感受性への効果を検定した結果を示す図である。
【図６】Ａ５４９細胞について、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質との組み合わせによるアポトーシス感受性への効果を検定した結果を示す図である。
【図７】ＨＴ１０８０細胞について、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質との組み合わせによるアポトーシス感受性への効果を検定した結果を示す図である。
【図８】ＴＩＧ−１細胞について、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質との組み合わせによるアポトーシス感受性への効果を検定した結果を示す図である。
【図９】１０％のフコイダン抽出物で処理した場合のＴＩＧ−１細胞についてのアポトーシス感受性への効果検定を示す図である。
【図１０】実験例３において、ＨｅＬａ細胞と未分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合の結果を示す写真である。
【図１１】実験例３において、ＨｅＬａ細胞と分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合の結果を示す写真である。
【図１２】実験例３において、ＨＴ１０８０細胞と未分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合の結果を示す写真である。
【図１３】実験例３において、ＨＴ１０８０細胞と分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合についての結果を示す写真である。
【図１４】ＴＨＰ−１細胞の表面抗原分子の検討結果を示す図であり、図１４（ａ）はＣＤ１４、図１４（ｂ）はＣＤ１ａ、図１４（ｃ）はＣＤ１１ｃ、図１４（ｄ）はＨＬＡ−ＤＲ、図１４（ｅ）はＣＤ４０、図１４（ｆ）はＣＤ８０、図１４（ｇ）はＣＤ８３、図１４（ｈ）はＣＤ８６、図１４（ｉ）はＣＤ２０９についての結果をそれぞれ示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンの免疫療法は、正常な細胞とガン細胞との抗原上の違いを免疫系の細胞に認識させて、直接的あるいは間接的にガンを攻撃する治療法の総称である。ガンという変異細胞に対して生体の免疫系が作用することは、純系動物を用いた移植腫瘍の拒絶実験において、宿主内免疫系が腫瘍を異物として特異的に認識することが明らかになっており、これらの機能を人為的に制御してガンに対抗する手段として利用することは、非常に有効なアプローチになると考えられる。また、免疫療法の特徴として、（１）生体が腫瘍が認識する機構を最大限に利用することから、克服が難しいとされている転移性のガン、他の手段では扱い難い部位にある腫瘍であっても効果が期待できること、（２）免疫系のガンに対抗する能力の多様性を利用して幅広い応用ができること、（３）ガン細胞への反応特異性の高さを利用することで、周りの正常細胞への障害作用を最小限にできることなどが挙げられ、これらの試みにより推測される副作用の軽減は、ガン患者のＱＯＬ（Quality Of Life）を実践する上で有用な手段となり得ることから、発展が期待される治療分野である。
【０００３】
しかしながら、ヒトのガンは様々な機序により免疫防御システムをすり抜けることが知られており、ガン細胞の免疫回避機構の解明とその克服法の開発は大きな課題となっている。その１つの要因として、生活習慣の変化による糖鎖異常に起因する細胞間の伝達機能の低下が挙げられる。すなわち、ヒトの細胞は、タンパク質、脂質に結合した糖鎖で密に覆われている。ここで、糖鎖とは、グルコースなどの糖が幾つも結合した分子を指す。
【０００４】
古くから、細胞がガン化すると糖鎖の構造を決定する酵素の遺伝子の発現が変化して糖鎖構造が著しく変化することが知られている。また、ガンの悪性化に伴い、さらに糖鎖発現、糖鎖構造が変化することも知られている。その結果、ガン化した細胞は細胞間に張り巡らされた繊維状の構造物（細胞外マトリクス）と結合できなくなる場合もあり、これはガン細胞が転移しやすい理由の１つとして考えられている。最近ではその一部は腫瘍マーカーとして実際に臨床において用いられているものである。また一方で、糖鎖形成に関与する８種類の糖鎖（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸）を直接摂取することで、糖鎖機能の正常化を図る代替医療も行われている。しかしながら、正常細胞に対する副作用が少なく、しかも十分な効果を発揮し得るような手段は未だなく、開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、正常細胞に対する副作用が少なく、ガン細胞に対してのみ十分な効果を発揮し得る新規な手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキットであって、フコイダン抽出物を含むことを特徴とする。
【０００７】
本発明のキットは、糖鎖認識タンパク質をさらに含むことが好ましく、この場合、糖鎖認識タンパク質はタチナタマメレクチンであることが特に好ましい。
【０００８】
本発明のキットはまた、上述した糖鎖認識タンパク質に代えて、糖鎖認識タンパク質発現細胞をさらに含んでいてもよい。この場合、糖鎖認識タンパク質発現細胞により発現される糖鎖認識タンパク質はタチナタマメレクチン様であることが特に好ましい。またこの場合、糖鎖認識タンパク質発現細胞が未分化状態または分化した状態の樹状細胞であることが特に好ましい。
【０００９】
また、本発明のキットにおけるフコイダン抽出物は、分子量が５００以下であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、フコイダン抽出物が、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導し得るという本発明者らによって初めて見出された知見に基づきなされたものであり、本発明のキットによれば、ガン患者に適用した場合に、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導し、悪性化したガン細胞がアポトーシスを起こしやすくすることができる。また、本発明のキットは、好ましくはフコイダン抽出物に加え、糖鎖認識タンパク質または糖鎖認識タンパク質産生細胞を含み、これによって、糖鎖認識タンパク質（糖鎖認識タンパク質産生細胞により産生された糖鎖認識タンパク質も含む）により、フコイダン抽出物が有するガン細胞に対するアポトーシス誘導能を有意に増強させることができ、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するだけでなく、悪性化したガン細胞がアポトーシスを起こしやすくすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキットであって、フコイダン抽出物を含むことを特徴とする。ここで、本発明における「フコイダン（fucoidan）」とは、モズク、コンブ、ワカメ、メカブなど褐藻類から抽出された分子量２０万〜３０万の粘質多糖類であり（当該褐藻類に乾燥重量で約４％含まれる）、以下に基本構造を示すように、Ｌ−フコースのエステル化硫酸を主成分として少量のガラクトース、キシロース、さらにグルクロン酸などを含む複雑な硫酸化多糖である。
【００１２】
【化１】
【００１３】
このようなフコイダン抽出物は、免疫賦活作用、血管新生抑制作用およびアポトーシス誘導作用の３つに起因する抗腫瘍作用を有することが知られており、近年、代替医療に対する関心の高まりとともに関心が寄せられており、様々な研究報告がなされている。上述のようにフコイダン抽出物は様々な構造を有する糖分子の混合物であり、このことが上述したような幅広い効果をもたらす一因であると考えられる。
【００１４】
本発明者らは、フコイダン抽出物が、ガン細胞の表面糖鎖の構造変化を有意に誘導する作用を有することを見出し、この知見に基づき、当該フコイダン抽出物を含有する、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキットを提供するものである。ここで、図１はヒト子宮頚ガン細胞株であるＨｅＬａ細胞についての糖鎖発現プロファイリング（後述する実験例１）の測定結果を示すグラフであり、図１（ａ）はタチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）、図１（ｂ）はインゲンマメレクチン−Ｅ４（ＰＨＡ−Ｅ４）、図１（ｃ）はレンズマメレクチン（ＬＣＡ）、図１（ｄ）はピーナッツレクチン（ＰＮＡ）、図１（ｅ）はドリコス豆凝集素（ＤＢＡ）、図１（ｆ）はハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−I）、図１（ｇ）はヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）、図１（ｈ）は小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）についての結果を示している。なお、図１中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。詳細は実験例１にて後述するが、図１は、ＨｅＬａ細胞について、１％または５％のフコイダン抽出物にて処理した後、レクチンであるＣｏｎＡ、ＤＢＡ、ＬＣＡ、ＰＨＡ−Ｅ４、ＰＮＡ、ＲＣＡ１２０、ＵＥＡ−ＩまたはＷＧＡをそれぞれ添加し、フローサイトメーターに供した結果を、当該処理を行わなかった対照群と比較して示している。図１から、ＣｏｎＡ、ＤＢＡ、ＵＥＡ−ＩおよびＷＧＡでフコイダン処理濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が確認されたことが分かる。すなわち、ＨｅＬａ細胞はフコイダン抽出物による処理によって、これらレクチンと特異性を有する糖鎖発現が増加したか、もしくはこれらのレクチンに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられる。また図１から、ＰＮＡではフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムの減少が見られることも分かる。すなわち、ＨｅＬａ細胞はフコイダン抽出物による処理によってＰＮＡとの特異性のある糖鎖発現を減少させるか、もしくはＰＮＡに認識されにくい糖鎖構造となったのではないかと考えられる。
【００１５】
また図２は、ヒト肺腺ガン細胞株であるＡ５４９細胞についての糖鎖発現プロファイリング（後述する実験例１）の測定結果を示すグラフであり、図２（ａ）はＣｏｎＡ、図２（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図２（ｃ）はＬＣＡ、図２（ｄ）はＰＮＡ、図２（ｅ）はＤＢＡ、図２（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図２（ｇ）はＲＣＡ１２０、図２（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図２中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。詳細は実験例１にて後述するが、図２は、Ａ５４９細胞について、上述したＨｅＬａ細胞の場合と同様の実験を行った結果を示している。図２から、ＣｏｎＡでのみフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が確認されたことが分かる。すなわち、Ａ５４９細胞はフコイダン抽出物による処理によってＣｏｎＡと特異性のある糖鎖発現が増加したか、ＣｏｎＡに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられる。また図２から、ＷＧＡとＲＣＡではフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムの減少が見られることが分かる。すなわち、Ａ５４９細胞はフコイダン抽出物で処理することで、これらレクチンと特異性を有する糖鎖発現を減少させるか、もしくはこれらレクチンに認識されにくい糖鎖構造となったのではないかと考えられる。
【００１６】
また図３は、ヒト繊維肉腫細胞株であるＨＴ１０８０細胞についての糖鎖発現プロファイリング（後述する実験例１）の測定結果を示すグラフであり、図３（ａ）はＣｏｎＡ、図３（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図３（ｃ）はＬＣＡ、図３（ｄ）はＰＮＡ、図３（ｅ）はＤＢＡ、図３（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図３（ｇ）はＲＣＡ１２０、図３（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図３中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。詳細は実験例１にて後述するが、図３は、ＨＴ１０８０細胞について、上述したＨｅＬａ細胞の場合と同様の実験を行った結果を示している。図３から、ＣｏｎＡ、ＰＮＡ、ＲＣＡ１２０およびＷＧＡでフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が確認されたことが分かる。すなわち、ＨＴ１０８０細胞はフコイダン抽出物による処理によってこれらのレクチンと特異性のある糖鎖発現が増加したか、これらのレクチンに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられる。また、図３から、ＤＢＡではフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムの減少が見られることが分かる。すなわち、ＨＴ１０８０細胞はフコイダン抽出物で処理することで、ＤＢＡと特異性を有する糖鎖発現を減少させるか、もしくはＤＢＡに認識されにくい糖鎖構造となったのではないかと考えられる。
【００１７】
さらに、図４は、ヒト正常線維芽細胞であるＴＩＧ−１細胞についての糖鎖発現プロファイリング（後述する実験例１）の測定結果を示すグラフであり、図４（ａ）はＣｏｎＡ、図４（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図４（ｃ）はＬＣＡ、図４（ｄ）はＰＮＡ、図４（ｅ）はＤＢＡ、図４（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図４（ｇ）はＲＣＡ１２０、図４（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図４中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。詳細は実験例１にて後述するが、図４は、ＴＩＧ−１細胞について、上述したＨｅＬａ細胞の場合と同様の実験を行った結果を示している。図４から、ＣｏｎＡ、ＬＣＡ、ＵＥＡ−ＩおよびＷＧＡにおいてフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が確認されたことが分かる。すなわち、ＴＩＧ−１細胞はフコイダン抽出物による処理によってこれらのレクチンと特異性のある糖鎖発現が増加したか、これらのレクチンに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられる。また図４から、正常細胞であるＴＩＧ−１細胞の場合には、ガン細胞とは異なり、ヒストグラムの減少は見られなかったことが分かる。
【００１８】
詳細は実験例１にて後述するが、図１〜図４を参照して上述した実験結果から、フコイダン抽出物による処理によって、ガン細胞表面における糖鎖構造の変化が誘導されたことが分かる。中でも、実験した全ての細胞において、フコイダン抽出物による処理でＣｏｎＡ反応性糖鎖の発現の上昇がみられており、ＣｏｎＡはマンノース鎖を特異的に認識するレクチンであることから、フコイダン抽出物による処理によってガン細胞表面のマンノース鎖の発現が高まったか、あるいはＣｏｎＡに認識されやすい糖鎖構造となったものと考えられる。本発明のキットは、このようなフコイダン抽出物が、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導し得るという本発明者らによって初めて見出された知見に基づきなされたものであり、ガン患者に適用した場合に、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導し、悪性化したガンを良性に向かわせることができる。
【００１９】
本発明のキットに用いられるフコイダン抽出物は、褐藻類から抽出された状態では通常は巨大な化合物である。本発明に用いられるフコイダン抽出物は、分子量については特に制限されるものではないが、分子量５００以下であることが好ましい。本発明においては、上述した巨大な化合物のままの状態のフコイダン抽出物を用いても勿論よいが、分子量５００以下にまで低分子化されたフコイダン抽出物を用いることによって、腸管からのフコイダン抽出物の吸収を促進させることができる。ここで、腸管からの吸収に注目する理由としては、全身の免疫を司るリンパ球の６０〜７０％が腸管に存在し、抗体全体の６０％は腸管で作られていることが挙げられる。生まれてからの免疫系の代表器官は骨髄と胸腺であることは知られているが、中年以後になると、免疫系器官の中心は胸腺から腸管リンパ組織へ移行する。そのため、いかにして腸管での吸収を高めるかは大きな意義があると考えられる。
【００２０】
フコイダン抽出物は、褐藻類（具体的にはトンガ王国産モズク（Cladosiphon novae-caledniae Kylin）など）から当分野において通常行われているように有機酸抽出し、脱塩処理して抽出することで作製することができる。また、上述したように分子量５００以下に低分子化されたフコイダン抽出物を用いる場合には、当分野において通常行われているような酵素消化処理（たとえば、アワビのグリコシダーゼを用いた酵素消化）、酸加水分解、放射線による分解なども考えられるが、酸加水分解では硫酸基まで分解してしまい、放射線による分解では放射線により構造まで壊れる可能性がある。これに対し、酵素処理は温和で、構造を維持した状態で分解が行えるという利点を有するため、好ましい。
【００２１】
また、本発明におけるフコイダン抽出物は、酵素消化フコイダン（パワーフコイダン（登録商標）、販売元：第一産業株式会社）などの市販品を用いても勿論よい。
【００２２】
本発明のキットにおけるフコイダン抽出物の含有量は特に制限されるものではないが、５０μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内であることが好ましく、１００μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲内であることがより好ましい。フコイダン抽出物の含有量が５０μｇ／ｍＬ未満である場合には、フコイダン抽出物により奏される効果が認められにくくなる虞があり、また、フコイダン抽出物の含有量が１０ｍｇ／ｍＬを超えても、それ以上の効果は得られにくい傾向にあるためである。
【００２３】
本発明のキットは、上述したフコイダン抽出物に加え、糖鎖認識タンパク質または糖鎖認識タンパク質産生細胞をさらに含んでいてもよい。これによって、糖鎖認識タンパク質（糖鎖認識タンパク質産生細胞により産生された糖鎖認識タンパク質も含む）により、フコイダン抽出物が有するガン細胞に対するアポトーシス誘導能を有意に増強させることができ、ガン細胞表面の糖鎖構造の変化誘導だけでなく、ガン細胞に対するアポトーシス誘導によってもガン細胞に作用し、悪性化したガンを良性に向かわせることができる
ここで、図５〜図８は、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質との組み合わせによるアポトーシス感受性への効果を検定（後述する実験例２）した結果を示す図であり、図５はＨｅＬａ細胞、図６はＡ５４９細胞、図７はＨＴ１０８０細胞、図８はＴＩＧ−１細胞についての結果を示している。詳細は実験例２にて後述するが、図５〜図８は、各細胞について、１％のフコイダン抽出物で処理した後に糖鎖認識タンパク質としてタチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）を用いて刺激した後、フローサイトメーターに供した結果を、当該処理を行わなかった対照群と比較して示している。
【００２４】
図５から、フコイダン抽出物にて処理したＨｅＬａ細胞にＣｏｎＡを添加して刺激を加えた条件とすることで、アポトーシス誘導効果の増強作用が確認されたことが分かる。また図６から、ＨｅＬａ細胞ほどではなかったが、フコイダン抽出物にて処理したＡ５４９細胞にＣｏｎＡを添加して刺激を加えた条件とすることで、アポトーシス誘導効果の増強作用が確認されたことが分かる。また、図７から、フコイダン抽出物にて処理したＨＴ１０８０細胞にＣｏｎＡを添加して刺激を加えた条件とすることで、他のガン細胞と比較して最も顕著にアポトーシス誘導効果の増強作用が確認されたことが分かる。これらの結果に対し、図８から、正常細胞であるＴＩＧ−１細胞については、ガン細胞の場合とは異なり、フコイダン処理することによってアポトーシス誘導効果が対照やレクチンを処理しただけの条件のものより低下していることが分かる。これらの実験結果から、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質との組み合わせにより、フコイダン抽出物が有するガン細胞に対するアポトーシス誘導能を増強することができ、しかもこのアポトーシス誘導能の増強はガン細胞特異的であるという知見が本発明者らによって初めて得られた。
【００２５】
本発明のキットに好適に用いられ得る糖鎖認識タンパク質としては、レクチンが挙げられる。レクチンは、糖に親和性を示すタンパク質の総称で、一般に抗体、酵素を除くものとされている。しかし今日では様々な例外も報告され、糖鎖を特異的に認識して結合、架橋形成するタンパク質と定義するのが一般的である。本発明のキットに好適に用いられ得るレクチンとしては、たとえば、上述したタチナタマメレクチン（コンカナヴァリンＡ）（ＣｏｎＡ：Concanavallin A）、ドリコス豆凝集素（ＤＢＡ：Dolichos Bifiorus）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ：Lens Culinaris Agglutinin）、インゲンマメレクチン−Ｅ４（ＰＨＡ−Ｅ４：Erythroagglutinating Isolectin of Phytohemagglutinin）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ：Arachis Hypogaea Agglutinin）、ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０：Ricinus Communis Agglutinin）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−１：Ulex Europaeus Agglutinin）、小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ：Wheat Germ Agglutinin）が挙げられる。これらの中でも、マンノース特異的糖鎖を認識するレクチンであるタチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）が好ましい。既に上述したように、実験に供したＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞の全てにおいて、フコイダン抽出物による処理で、ＣｏｎＡ反応性糖鎖の発現の上昇の観察がみられており、フコイダン抽出物による処理によってガン細胞表面のマンノース鎖の発現が高まったか、あるいはＣｏｎＡに認識されやすい糖鎖構造となったと考えられ、より顕著な効果を奏するものと考えられるためである。
【００２６】
本発明のキットが糖鎖認識タンパク質を含む場合、糖鎖認識タンパク質は、１μｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの範囲内で含まれていることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの範囲内で含まれていることがより好ましい。糖鎖認識タンパク質の含有量が１μｇ／ｍＬ未満である場合には、糖鎖認識タンパク質を含むことにより奏される効果が認められにくくなる虞があり、また、糖鎖認識タンパク質の含有量が５ｍｇ／ｍＬを超える場合には、正常組織または正常細胞に対して細胞毒性が現れる傾向にある。
【００２７】
また本発明のキットにおいて好適に用いられ得る糖鎖認識タンパク質発現細胞としては、上述したような糖鎖認識タンパク質を発現し得る細胞であれば特に制限されるものではなく、たとえば樹状細胞、単球、マクロファージ、ランゲルハンス細胞などが挙げられる。なお、糖鎖認識タンパク質発現細胞は、未分化の状態、分化された状態のいずれの状態であってよい。未分化の状態の糖鎖認識タンパク質発現細胞を用いる場合には、本発明のキットを適用したガン組織において、当該糖鎖認識タンパク質発現細胞を分化させ、当該ガン組織で糖鎖認識タンパク質を発現し得るように実現され得る。樹状細胞は、各組織の免疫反応の初期段階に大きく影響することから、糖鎖認識タンパク質発現細胞は未分化状態または分化した状態の樹状細胞であり、当該細胞により発現される糖鎖認識タンパク質がタチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）様であることが好ましい。樹状細胞は、自分が取り込んだ抗原を、他の免疫系の細胞に伝える役割を有する抗原提示細胞として機能する免疫細胞の１種であり、マンノース認識能を有することが知られている。また、未分化状態の樹状細胞としては、マンノース認識レセプターを細胞表面上に発現しているヒト単球様細胞株で、各種刺激によりマクロファージ、ＤＣ（樹状細胞）へと分化することができる細胞として知られているＴＨＰ−１細胞を好適に用いることができる。なお、糖鎖認識タンパク質発現細胞は、ガン細胞数に対し５倍以上の数を使用し、フコイダン抽出物１５０μｇ／ｍＬに対し１×１０5個の細胞を用いることで好適に本発明のキットに用いられ得る。
【００２８】
本発明のキットは、たとえば、フコイダン抽出物（および糖鎖認識タンパク質または糖鎖認識タンパク質発現細胞）をガン組織に直接、またはガン患者に経口的に投与することによりガン治療効果を高め得る。なお、本発明のキットは、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質または糖鎖認識タンパク質発現細胞とを含む場合には、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質または糖鎖認識タンパク質発現細胞とを別々の容器に収容するように実現されてもよいし、１つの容器内に混合物として収容されて実現されてもよい。また本発明のキットは、ガン予防を目的とする健康食品（健康飲料を含む）として実現されてもよい。
【００２９】
以下に実験例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実験例に限定されるものではない。
【００３０】
＜実験例１＞
本実験例では、ガン細胞および正常細胞の表面の糖鎖発現にどのような違いがあるのかをレクチンとの感受性により確かめ、その感受性がフコイダン抽出物を用いることでどのように変化するのかをプロファイリングした。
【００３１】
なお、本実験例において、フコイダン抽出物としては、分子量５００以下にまで低分子化された酵素消化フコイダン（パワーフコイダン（登録商標）、販売元：第一産業株式会社）に、２回の遠心分離（１００００×ｇ、３０分間）を繰り返した後、上清をオートクレーブで滅菌したものを用いた。調製されたフコイダン抽出物は、ｐＨ６．８、浸透圧約０．２０６ｏｓｍｏｌ／ｋｇの水溶液であった。
【００３２】
また本実験例において、糖鎖認識タンパク質としては、予めＦＩＴＣ標識されたタチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）、ドリコス豆凝集素（ＤＢＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、インゲンマメレクチン−Ｅ４（ＰＨＡ−Ｅ４）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）、ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−I）および小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）を含む、ＦＩＴＣ標識レクチンのセット（Ｌｅｃｔｉｎ Ｓｅｔ Ｉ−ＦＩＴＣ（Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｋ６０６１）、Ｊ−オイルミルズ製）を用いた。
【００３３】
また、本実験例において用いたヒト子宮頚ガン細胞株であるＨｅＬａ細胞、ヒト肺腺ガン細胞株であるＡ５４９細胞、ヒト繊維肉腫細胞株であるＨＴ１０８０細胞、ヒト正常線維芽細胞であるＴＩＧ−１細胞は、いずれも、東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより譲渡されたものを用いた。Ａ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＴＩＧ−１細胞のいずれも、１０％ＦＢＳ、１％ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ：non essential amino acid）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）含有ＭＥＭ培地（日水製薬（株）製）を用い、３７℃、５％二酸化炭素／９５％空気の培養条件下でそれぞれ継代培養した。いずれも、３×１０6ｃｅｌｌｓの細胞を１ｍＬの凍結培地（ＭＥＭ：０．７ｍＬ、ＦＢＳ：０．２ｍＬ、ＤＭＳＯ：０．１ｍＬ）に懸濁し、−８０℃で保存した。
【００３４】
（１）ＨｅＬａ細胞の糖鎖発現プロファイリング
ＨｅＬａ細胞を６ウェルプレート中に１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して前培養を行った後、１％または５％のフコイダン抽出物をそれぞれ含有する培地中で３日間のフコイダン処理を施した。また、対照群としては、フコイダン抽出物の代わりにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含有する培地に同様に各細胞を播種した。細胞の形状を顕微鏡で確認した後、細胞を回収して５００μＬのＰＢＳに懸濁し、１．５ｍＬのエッペンチューブに回収した。遠心分離（８００×ｇ、１分間）し、上清をアスピレートした後、５０μＬのＰＢＳに細胞を懸濁した。
【００３５】
以降の操作は暗所で行った。まず、ＦＩＴＣ標識された各レクチンを２μｇ量（ＣｏｎＡでは０．９８μＬ、ＤＢＡでは１．８９μＬ、ＬＣＡでは１．２８μＬ、ＰＨＡ−Ｅ４では１．８５μＬ、ＰＮＡでは１．３６μＬ、ＲＣＡ１２０では１．１２μＬ、ＵＥＡ−Ｉでは２μＬ、ＷＧＡでは１．１７μＬ）ずつ添加し、室温（２５℃）で１５分間インキュベート（５分ごとにタッピング）後、１ｍＬのＰＢＳを入れて懸濁し、遠心分離した（８００×ｇ、１分間）。上清をアスピレートした後、５００μＬのＰＢＳで細胞を懸濁して、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＸＬ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ−ＪＫ、ベックマンコールター社製）に供した。なお、測定の手順は、ベックマンコールター社の取扱説明書に記載されたプロトコルを一部改変して使用した。
【００３６】
図１はＨｅＬａ細胞についての測定結果を示すグラフであり、図１（ａ）はＣｏｎＡ、図１（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図１（ｃ）はＬＣＡ、図１（ｄ）はＰＮＡ、図１（ｅ）はＤＢＡ、図１（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図１（ｇ）はＲＣＡ１２０、図１（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図１中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合の場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。図１に示されるように、結果、ＣｏｎＡ、ＤＢＡ、ＵＥＡ−ＩおよびＷＧＡでフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が確認された。すなわち、ＨｅＬａ細胞はフコイダン抽出物による処理によって、これらレクチンと特異性のある糖鎖発現が増加したか、もしくはこれらのレクチンに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられた。また逆の結果として、ＰＮＡではフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムの減少が見られた。すなわち、ＨｅＬａ細胞はフコイダン抽出物で処理することでＰＮＡとの特異性のある糖鎖発現を減少させるか、もしくはＰＮＡに認識されにくい糖鎖構造となったのではないかと考えられた。
【００３７】
（２）Ａ５４９細胞の糖鎖発現プロファイリング
Ａ５４９細胞を用いたこと以外は上述したＨｅＬａ細胞の場合と同様にして、糖鎖発現プロファイリングを行った。図２はＡ５４９細胞についての測定結果を示すグラフであり、図２（ａ）はＣｏｎＡ、図２（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図２（ｃ）はＬＣＡ、図２（ｄ）はＰＮＡ、図２（ｅ）はＤＢＡ、図２（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図２（ｇ）はＲＣＡ１２０、図２（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図２中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。図２に示されるように、結果、ＣｏｎＡでのみフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が見られた。すなわち、Ａ５４９細胞はフコイダン抽出物による処理によってＣｏｎＡと特異性のある糖鎖発現が増加したか、ＣｏｎＡに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられた。また逆の結果として、ＷＧＡとＲＣＡではフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムの減少が見られた。すなわち、Ａ５４９細胞はフコイダン抽出物で処理することで、これらレクチンと特異性を有する糖鎖発現を減少させるか、もしくはこれらレクチンに認識されにくい糖鎖構造となったのではないかと考えられた。
【００３８】
（３）ＨＴ１０８０細胞の糖鎖発現プロファイリング
ＨＴ１０８０細胞を用いたこと以外は上述したＨｅＬａ細胞の場合と同様にして、糖鎖発現プロファイリングを行った。図３はＨＴ１０８０細胞についての測定結果を示すグラフであり、図３（ａ）はＣｏｎＡ、図３（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図３（ｃ）はＬＣＡ、図３（ｄ）はＰＮＡ、図３（ｅ）はＤＢＡ、図３（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図３（ｇ）はＲＣＡ１２０、図３（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図３中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。図３に示されるように、結果、ＣｏｎＡ、ＰＮＡ、ＲＣＡ１２０およびＷＧＡでフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が見られた。すなわち、ＨＴ１０８０細胞はフコイダン抽出物による処理によってこれらのレクチンと特異性のある糖鎖発現が増加したか、これらのレクチンに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられた。また逆の結果として、ＤＢＡではフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムの減少が見られた。すなわち、ＨＴ１０８０細胞はフコイダン抽出物で処理することで、ＤＢＡと特異性を有する糖鎖発現を減少させるか、もしくはＤＢＡに認識されにくい糖鎖構造となったのではないかと考えられた。
【００３９】
（４）ＴＩＧ−１細胞の糖鎖発現プロファイリング
ＴＩＧ−１細胞を用い、フローサイトメーターによる測定の際のプロトコルとしてＴＩＧ ＣｏｎＡ（８種類のレクチン全て）に従ったこと以外は、上述したＨｅＬａ細胞の場合と同様にして、糖鎖発現プロファイリングを行った。図４はＴＩＧ−１細胞についての測定結果を示すグラフであり、図４（ａ）はＣｏｎＡ、図４（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図４（ｃ）はＬＣＡ、図４（ｄ）はＰＮＡ、図４（ｅ）はＤＢＡ、図４（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図４（ｇ）はＲＣＡ１２０、図４（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。なお、図４中、点線は１％フコイダン抽出物により処理した場合、実線は５％フコイダン抽出物により処理した場合、破線（灰色で示す領域を囲む破線）は対照群を示している。図４に示されるように、結果、ＣｏｎＡ、ＬＣＡ、ＵＥＡ−ＩおよびＷＧＡにおいてフコイダン抽出物の濃度に応じてヒストグラムが右にシフトしており、感受性の増加が見られた。すなわち、ＴＩＧ−１細胞はフコイダン抽出物による処理によってこれらのレクチンと特異性のある糖鎖発現が増加したか、これらのレクチンに認識されやすい糖鎖構造になったのではないかと考えられた。なお、ＴＩＧ−１細胞では、ガン細胞とは異なり、ヒストグラムの減少は見られなかった。
【００４０】
＜実験例２＞
実験例１の結果から、用いた全ての細胞においてフコイダン抽出物により、ＣｏｎＡとの感受性が上がることが示された。これは細胞表面がマンノースリッチな状態となっている可能性を示唆している。本実験例では、フコイダン抽出物による処理をガン細胞に行いＣｏｎＡとの感受性を高め、そこにＣｏｎＡ刺激が加わることでアポトーシス感受性が増強されるのではないかという仮説を実証するための検討を行った。また併せて、その結果はガン細胞特異的なものであるかどうかの確認として、正常細胞も用いて同様に検討を行った。
【００４１】
本実験例でも、フコイダン抽出物および各細胞は実験例１と同様のものを用いた。糖鎖認識タンパク質については、本実験例では、標識されていないＣｏｎＡ（和光純薬工業株式会社製）を用いた。
【００４２】
ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞およびＴＩＧ−１細胞を、６ウェルプレート中に１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでそれぞれ播種して前培養を行った後、１％、５％、１０％または２０％のフコイダン抽出物を含有する培地中に３日間のフコイダン処理を施した。また、対照群としては、フコイダン抽出物の代わりにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含有する培地に同様に各細胞を播種した。細胞の形状を顕微鏡で確認した後、１５ｍＬの遠心管に上清を回収後、１ｍＬのＰＢＳでウェルを洗浄してその液を回収し、ウェルに貼りついている細胞をトリプシンで剥がして回収した。遠心分離（２００×ｇ、５分間）後、上清をアスピレートして、５００μＬのＰＢＳに細胞を懸濁し、１．５ｍＬエッペンチューブに回収した。遠心分離（８００×ｇ、１分間）した後、上清をアスピレートし、５０μＬのＰＢＳに細胞を懸濁した。これにＣｏｎＡを５μＬ添加（対照群では未添加）後、室温で３０分間静置した。１ｍＬのＰＢＳを入れて洗浄（８００×ｇ、２分間）後、上清をアスピレートし、得られたペレットを１５０μＬのＰＢＳに懸濁後、３５０μＬの冷９９．５％エタノールを加えることで終濃度約７０％のエタノールとし、細胞を固定した。３０分間氷上静置後、遠心分離（８００×ｇ、２分間）し、得られたペレットに４７０μＬのＰＢＳおよび２０μＬの１ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡ／ＰＢＳ溶液を加え、懸濁後、室温で３０分間静置した。１０μＬの１ｍｇ／ｍＬのＰＩ／ＰＢＳ溶液を加え軽く振った後、室温で１０分間静置し、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＸＬ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ−ＪＫ、ベックマンコールター社製）に供した。なお、測定の手順は、ベックマンコールター社の取扱説明書に記載されたプロトコルを一部改変して使用した。
【００４３】
図５〜８は、１％のフコイダン抽出物で処理した場合のＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞およびＴＩＧ−１細胞についてのアポトーシス感受性への効果検定をそれぞれ示す図である。図５から分かるように、フコイダン抽出物にて処理したＨｅＬａ細胞にＣｏｎＡを添加して刺激を加えた条件とすることで、アポトーシス誘導効果の増強作用が見られた。また図６から分かるように、ＨｅＬａ細胞ほどではなかったが、フコイダン抽出物にて処理したＡ５４９細胞にＣｏｎＡを添加して刺激を加えた条件とすることで、アポトーシス誘導効果の増強作用が見られた。また、図７から分かるように、フコイダン抽出物にて処理したＨＴ１０８０細胞にＣｏｎＡを添加して刺激を加えた条件とすることで、他のガン細胞と比較して最も顕著にアポトーシス誘導効果の増強作用が見られた。なお、これらガン細胞におけるアポトーシス誘導効果の増強作用は、フコイダン抽出物の濃度が高い方がさらに増強される傾向がみられた（図示せず）。また、図８から、正常細胞であるＴＩＧ−１細胞については、ガン細胞の場合とは異なり、フコイダン処理することによってアポトーシス誘導効果が対照やレクチンを処理しただけの条件のものより低下していることが分かる。また、図９は、１０％のフコイダン抽出物で処理した場合のＴＩＧ−１細胞についてのアポトーシス感受性への効果検定を示す図であるが、図９に示されるように、正常細胞の場合であっても、フコイダンの濃度を１０％に上げた場合には、フコイダンの量が増えることによるストレスのためか、アポトーシスが引き起こされる結果となった。
【００４４】
実験例２の結果から、フコイダン抽出物によりＣｏｎＡ感受性を上げたガン細胞に対して、ＣｏｎＡ刺激を与えることで細胞死が誘導され、さらにこの細胞死経路は、ｓｕｂ−Ｇ１測定の結果からアポトーシスであると考えられた。また、Ａ５４９、ＨｅＬａおよびＨＴ１０８０の三種類のガン細胞に対してはフコイダン抽出物でＣｏｎＡ感受性を高めた状態でのＣｏｎＡ刺激はアポトーシス感受性の増強作用をもたらすが、ＴＩＧ−１においてはＣｏｎＡ刺激のみの場合より細胞死が抑えられており、この作用はガン細胞特異的なのではないかと考えられた。
【００４５】
＜実験例３＞
本実験例では、マンノース認識レセプターを細胞表面上に発現していることが知られているヒト単球様細胞株ＴＨＰ−１と各種ガン細胞を共培養することにより、ＣｏｎＡと同様に細胞死誘導効果の増強効果がフコイダン抽出物による処理によって誘導されるのではないかと考え検討を行った。
【００４６】
本実験例でも、フコイダン抽出物および各細胞は実験例１と同様のものを用いた。また、糖鎖認識タンパク質発現細胞として用いた、ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１は、理化学研究所細胞銀行（ＲＣＢ）より譲渡されたものを用いた。ＴＨＰ−１細胞は、１０％非働化ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）含有ＭＥＭ培地（日水製薬（株）製）を用い、３７℃、５％二酸化炭素／９５％空気の培養条件下で継代培養した。また、表面抗原を認識する抗体（分化マーカーとしてＣＤ１４、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、機能発現に関与するマーカーとしてＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、マンノース認識レセプターとしてＣＤ２０９）は、それぞれ、予めフィコエリスリン（ＰＥ）標識されたフナコシ株式会社製の市販品を用いた。
【００４７】
（１）ＴＨＰ−１細胞の分化処理
分化試薬としてＰＭＡ（Phorbol 12-myristate 13-acetate、Ｃ36Ｈ56Ｏ8、Fw＝６１６．８、ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。ＰＭＡは光によって分解されやすいので、暗所で用い、４℃で保存した。ＰＭＡ粉末は有機溶媒でないと溶けないのでエタノールに溶解し、それをさらにＭＥＭに希釈溶解した。ＴＨＰ−１細胞を撒く際に、終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるようにＰＭＡを処理し、３７℃ＣＯ2インキュベーターで２４時間インキュベートした。その後、シャーレの上清を遠心管に回収し、ＰＢＳでシャーレを洗浄した後、５ｍＭ ＥＤＴＡ−０．８５％ＮａＣｌ溶液をシャーレに添加し、２分間静置した。液を遠心管に回収し、遠心した（２００×ｇ、５分間）後、ＰＢＳで３回洗浄（２００×ｇ、５分間）し、５％非働化ＦＢＳ（fetal bovine serum）−ＭＥＭに細胞を懸濁した。なお、この非働化ＦＢＳは、ＦＢＳを５６℃の湯浴中で３０分加熱処理することで非働化（血清中の補体を不活化）されものである。このようにＦＢＳを非働化したのは、補体が活動すると抗体の働きのみを知ることができないためである。
【００４８】
（２）共培養
ＨｅＬａ細胞およびＨＴ１０８０細胞を６ウェルプレート中に１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでそれぞれ播種して前培養を行った後、５％のフコイダン抽出物を含有する培地中に３日間のフコイダン処理を施した。また、対照群としては、フコイダン抽出物の代わりにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含有する培地に同様に各細胞を播種した。その後、各細胞を６ウェルプレートから回収して新たな６ウェルプレートに１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで再度播種した。各細胞が接着した後、未分化の状態のＴＨＰ−１細胞または分化した状態のＴＨＰ−１細胞（食作用が増強されたマクロファージ）を５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した（ＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞：ＴＨＰ−１細胞＝１：５）。２４時間ごとに位相差顕微鏡により観察を行った。
【００４９】
ここで、図１０は、ＨｅＬａ細胞と未分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合、図１１は、ＨｅＬａ細胞と分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合、図１２は、ＨＴ１０８０細胞と未分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合、図１３は、ＨＴ１０８０細胞と分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合についての結果を示す写真である。なお、図１０（ａ）、図１１（ａ）、図１２（ａ）、図１３（ａ）はフコイダン未処理のＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞を単独培養させた場合、図１０（ｂ）、図１１（ｂ）、図１２（ｂ）、図１３（ｂ）は５％のフコイダン抽出物で処理したＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞を単独培養させた場合、図１０（ｃ）、図１１（ｃ）、図１２（ｃ）、図１３（ｃ）はフコイダン未処理のＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞をフコイダン未処理のＴＨＰ−１細胞と共培養させた場合、図１０（ｄ）、図１１（ｄ）、図１２（ｄ）、図１３（ｄ）は５％のフコイダン抽出物で処理したＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞をフコイダン未処理のＴＨＰ−１細胞と共培養させた場合、図１０（ｅ）、図１１（ｅ）、図１２（ｅ）、図１３（ｅ）は５％のフコイダン抽出物で処理したＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞を５％のフコイダン抽出物で処理したＴＨＰ−１細胞と共培養させた場合の結果をそれぞれ示している。なお、いずれも、共培養２日目の時点での写真を示している。図１０〜図１３から、フコイダン抽出物で処理したＨｅＬａ細胞、ＨＴ１０８０細胞は、未分化状態または分化した状態のＴＨＰ−１細胞による細胞傷害感受性が上昇していることが分かる。また、ＴＨＰ−１細胞についてもフコイダン抽出物で処理することで、その活性がさらに上昇していることが分かる。
【００５０】
（３）ＴＨＰ−１細胞の表面抗原分子の検討
未分化状態のＴＨＰ−１細胞を６ウェルプレート中に１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでそれぞれ播種して前培養を行った後、１％または５％のフコイダン抽出物を含有する培地中に３日間のフコイダン処理を施した。また、対照群としては、フコイダン抽出物の代わりにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含有する培地に同様に各細胞を播種した。その後、細胞を１．５ｍＬエッペンチューブに回収して遠心分離（８００×ｇ、２分間）し、上清をアスピレートした後、５０μＬの５％ＦＢＳ−ＰＢＳに細胞を懸濁した。表面抗原を認識する抗体（分化マーカーとしてＣＤ１４、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、機能発現に関与するマーカーとしてＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、マンノース認識レセプターとしてＣＤ２０９）を各々５μＬずつ添加し、氷上で３０分間静置した。用いた抗体はＰＥ標識されたものであるため、以降の操作は暗所で行った。１ｍＬのＰＢＳで洗浄して遠心分離（８００×ｇ、１分間）した後、上清をアスピレートし、３００μＬのＰＢＳに懸濁してフローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＸＬ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ−ＪＫ、ベックマンコールター社製）に供した。なお、測定の手順は、ベックマンコールター社の取扱説明書に記載されたプロトコルを一部改変して使用した。
【００５１】
図１４は、ＴＨＰ−１細胞の表面抗原分子の検討結果を示す図であり、図１４（ａ）はＣＤ１４、図１４（ｂ）はＣＤ１ａ、図１４（ｃ）はＣＤ１１ｃ、図１４（ｄ）はＨＬＡ−ＤＲ、図１４（ｅ）はＣＤ４０、図１４（ｆ）はＣＤ８０、図１４（ｇ）はＣＤ８３、図１４（ｈ）はＣＤ８６、図１４（ｉ）はＣＤ２０９についての結果をそれぞれ示している。結果、分化マーカーとしてより未分化な状態でみられるＣＤ１４、単球からマクロファージへ分化したときに発現上昇が見られるＣＤ１ａ、ＤＣへと分化したときに発現が上昇するＣＤ１１ｃ、また分化した細胞で発現上昇が見られるＨＬＡ−ＤＲの４つのＴＨＰ−１の分化に関するマーカー分子の発現には全く影響を及ぼさなかった。一方、ＴＨＰ−１の機能発現に関するマーカーであるＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＣＤ４０については、発現上昇が観察された。さらにＴＨＰ−１が有するマンノース認識レセプターの１つであるＣＤ２０９の発現もフコイダン抽出物による処理によって増強された。
【００５２】
実験例３の結果から、フコイダン抽出物はガン細胞表面のマンノースの発現変化を誘導し、マンノース認識能のあるＴＨＰ−１と強く作用することで細胞傷害活性効果をもたらすことが確認された。またその効果は、マクロファージに分化していない未分化状態のＴＨＰ−１細胞とでも確認できたことから、未分化状態であってもＴＨＰ−１細胞にはマンノースを認識し、作用する働きがあるのではないかと考えられる。また一方で、ＴＨＰ−１細胞も同時にフコイダン抽出物にて処理することで細胞傷害活性が上昇したことから、ＴＨＰ−１細胞にもフコイダン抽出物は作用していると考えられる。その仮説を裏付けるかの如く、本実験例では、フコイダン抽出物による処理によってＴＨＰ−１細胞の機能発現に関与するマーカーの発現増強効果が認められた。この結果において分化マーカーの発現には変化が見られなかったことから、フコイダン抽出物はＴＨＰ−１細胞に分化誘導効果をもたらしているのではなくて、機能変化をもたらしていると考えられる。また機能発現に関与するマーカーのうち、マンノース認識レセプターの１つであるＣＤ２０９で発現が上昇したことは、フコイダン抽出物による処理によりＴＨＰ−１細胞のマンノース認識能が増強されたことが示唆される。このことから、フコイダン抽出物による処理はガン細胞のマンノース発現に変化を及ぼすだけでなく、ＴＨＰ−１細胞のマンノース認識能にも変化をもたらしていることを示しており、すなわち、フコイダン抽出物はガン細胞の機能変化および免疫系の細胞によるガン細胞攻撃能の両面に作用することで、ガンの抑制効果を発揮しているものと考えられる。
【００５３】
今回開示された実施の形態および実験例は、全ての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ヒト子宮頚ガン細胞株であるＨｅＬａ細胞についての糖鎖発現プロファイリングの測定結果を示すグラフであり、図１（ａ）はタチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）、図１（ｂ）はインゲンマメレクチン−Ｅ４（ＰＨＡ−Ｅ４）、図１（ｃ）はレンズマメレクチン（ＬＣＡ）、図１（ｄ）はピーナッツレクチン（ＰＮＡ）、図１（ｅ）はドリコス豆凝集素（ＤＢＡ）、図１（ｆ）はハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−I）、図１（ｇ）はヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）、図１（ｈ）は小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）についての結果を示している。
【図２】ヒト肺腺ガン細胞株であるＡ５４９細胞についての糖鎖発現プロファイリングの測定結果を示すグラフであり、図２（ａ）はＣｏｎＡ、図２（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図２（ｃ）はＬＣＡ、図２（ｄ）はＰＮＡ、図２（ｅ）はＤＢＡ、図２（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図２（ｇ）はＲＣＡ１２０、図２（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。
【図３】ヒト繊維肉腫細胞株であるＨＴ１０８０細胞についての糖鎖発現プロファイリングの測定結果を示すグラフであり、図３（ａ）はＣｏｎＡ、図３（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図３（ｃ）はＬＣＡ、図３（ｄ）はＰＮＡ、図３（ｅ）はＤＢＡ、図３（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図３（ｇ）はＲＣＡ１２０、図３（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。
【図４】ヒト正常線維芽細胞であるＴＩＧ−１細胞についての糖鎖発現プロファイリングの測定結果を示すグラフであり、図４（ａ）はＣｏｎＡ、図４（ｂ）はＰＨＡ−Ｅ４、図４（ｃ）はＬＣＡ、図４（ｄ）はＰＮＡ、図４（ｅ）はＤＢＡ、図４（ｆ）はＵＥＡ−Ｉ、図４（ｇ）はＲＣＡ１２０、図４（ｈ）はＷＧＡについての結果を示している。
【図５】ＨｅＬａ細胞について、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質との組み合わせによるアポトーシス感受性への効果を検定した結果を示す図である。
【図６】Ａ５４９細胞について、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質との組み合わせによるアポトーシス感受性への効果を検定した結果を示す図である。
【図７】ＨＴ１０８０細胞について、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質との組み合わせによるアポトーシス感受性への効果を検定した結果を示す図である。
【図８】ＴＩＧ−１細胞について、フコイダン抽出物と糖鎖認識タンパク質との組み合わせによるアポトーシス感受性への効果を検定した結果を示す図である。
【図９】１０％のフコイダン抽出物で処理した場合のＴＩＧ−１細胞についてのアポトーシス感受性への効果検定を示す図である。
【図１０】実験例３において、ＨｅＬａ細胞と未分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合の結果を示す写真である。
【図１１】実験例３において、ＨｅＬａ細胞と分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合の結果を示す写真である。
【図１２】実験例３において、ＨＴ１０８０細胞と未分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合の結果を示す写真である。
【図１３】実験例３において、ＨＴ１０８０細胞と分化状態のＴＨＰ−１細胞とを共培養した場合についての結果を示す写真である。
【図１４】ＴＨＰ−１細胞の表面抗原分子の検討結果を示す図であり、図１４（ａ）はＣＤ１４、図１４（ｂ）はＣＤ１ａ、図１４（ｃ）はＣＤ１１ｃ、図１４（ｄ）はＨＬＡ−ＤＲ、図１４（ｅ）はＣＤ４０、図１４（ｆ）はＣＤ８０、図１４（ｇ）はＣＤ８３、図１４（ｈ）はＣＤ８６、図１４（ｉ）はＣＤ２０９についての結果をそれぞれ示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキットであって、フコイダン抽出物を含むことを特徴とする、キット。
【請求項２】
糖鎖認識タンパク質をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
糖鎖認識タンパク質がタチナタマメレクチンである、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
糖鎖認識タンパク質発現細胞をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
糖鎖認識タンパク質発現細胞により発現される糖鎖認識タンパク質が、タチナタマメレクチン様である、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
糖鎖認識タンパク質発現細胞が未分化状態または分化した状態の樹状細胞である、請求項４または５に記載のキット。
【請求項７】
フコイダン抽出物の分子量が５００以下である、請求項１〜６のいずれかに記載のキット。
【請求項１】
ガン細胞表面の糖鎖構造の変化を誘導するためのキットであって、フコイダン抽出物を含むことを特徴とする、キット。
【請求項２】
糖鎖認識タンパク質をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
糖鎖認識タンパク質がタチナタマメレクチンである、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
糖鎖認識タンパク質発現細胞をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
糖鎖認識タンパク質発現細胞により発現される糖鎖認識タンパク質が、タチナタマメレクチン様である、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
糖鎖認識タンパク質発現細胞が未分化状態または分化した状態の樹状細胞である、請求項４または５に記載のキット。
【請求項７】
フコイダン抽出物の分子量が５００以下である、請求項１〜６のいずれかに記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００９−６７７０９（Ｐ２００９−６７７０９Ａ）
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３６５０５（Ｐ２００７−２３６５０５）
【出願日】平成１９年９月１２日（２００７．９．１２）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（５０１０８７８７０）第一産業株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１２日（２００７．９．１２）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（５０１０８７８７０）第一産業株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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