キシロース糖液の製造方法
【課題】
キシラン含有バイオマスから発酵阻害物質の少ないキシロース糖液を製造する方法を提供する。
【解決手段】
キシラン含有バイオマスより、キシロース糖液を製造する方法であって、
（１）キシラン含有バイオマスを水熱処理し、水熱処理物を得る工程、
（２）水熱処理物に糖化酵素を添加し、さらにキシロースを資化しない微生物を添加し、糖化発酵液を得る工程、
（３）糖化発酵液を、少なくとも精密ろ過膜を使用して固液分離し、得られたろ液をナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過し、非透過液より濃縮および精製されたキシロース溶液を得る工程、を含むキシロース糖液の製造方法。
キシラン含有バイオマスから発酵阻害物質の少ないキシロース糖液を製造する方法を提供する。
【解決手段】
キシラン含有バイオマスより、キシロース糖液を製造する方法であって、
（１）キシラン含有バイオマスを水熱処理し、水熱処理物を得る工程、
（２）水熱処理物に糖化酵素を添加し、さらにキシロースを資化しない微生物を添加し、糖化発酵液を得る工程、
（３）糖化発酵液を、少なくとも精密ろ過膜を使用して固液分離し、得られたろ液をナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過し、非透過液より濃縮および精製されたキシロース溶液を得る工程、を含むキシロース糖液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシラン含有バイオマスからキシロース糖液を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、キシラン含有バイオマスから糖を製造し、この糖原料を使用したエタノールなどの化学品の発酵生産プロセスが盛んに研究されている。こうした糖の製造方法としては、濃硫酸を使用してバイオマスを酸加水分解して糖液を製造する方法（特許文献１、２）、バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後に、さらにセルラーゼなどの酵素処理することより糖液を製造する方法が開示されている（非特許文献１）。また酸を使用しない方法として、２５０〜５００℃程度の亜臨界水を使用しバイオマスを加水分解して糖液を製造する方法（特許文献３）、またバイオマスを亜臨界水処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許文献４）、バイオマスを２４０〜２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許文献５）が開示されている。こうした手法で得られる単糖は、キシロースのみでなく、グルコースも含んでなる。またこうした単糖が含まれる一方で、発酵阻害物質と呼ばれる、酢酸、ギ酸、ＨＭＦ、フルフラール、バニリン、といった低分子成分が含まれる（非特許文献２または３）。このような発酵阻害成分を多く含む糖液を炭素源として、エタノールなどの化学品を発酵生産する場合、微生物の増殖阻害、生産物の収率の低下を引き起こすことが課題となっている。こうした発酵阻害物質は、特に糖成分としてキシロースを炭素源として使用する微生物による生育あるいは発酵に悪影響があることが知られている（非特許文献４）。
【０００３】
こうした発酵阻害物質を糖液より除去する方法として、ナノろ過膜による発酵阻害物質の除去方法（特許文献６）が開示されている。具体的には、バイオマスから得られる発酵阻害物質を含む糖液を、ナノろ過膜に通じてろ過することにより、発酵阻害物質が透過液側から除去され、非透過液として発酵阻害物質が除去された糖液が得られることが開示されている。しかしながら、本技術においても発酵阻害物質のヒドロキシメチルフルフラール（以下、ＨＭＦとも言う。）の除去率について改善すべき余地があった。
【０００４】
その他、バイオマス由来の糖液に含まれる発酵阻害物質による発酵阻害を解決するための方法として、エタノールの発酵製造において、不純物耐性を有しかつエタノール発酵能を有する微生物をキシラン含有バイオマスから得られた糖液に添加して一次発酵を行った後、その後キシロース資化し、かつエタノール発酵能を有する微生物を添加し、二次発酵を行う方法が開示されている（特許文献７）。具体的には、一次発酵においてキシラン含有バイオマスから得られた糖液に含まれるＨＭＦといった発酵阻害物質は、酵母（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）による一次発酵中にその体内に取り込まれるため、二次発酵では発酵阻害物質による発酵阻害がおきずに、エタノールが効率よく製造されるとされている。しかしながら、前述の微生物（酵母）を使用した発酵阻害物質の除去においては、やはりギ酸、酢酸、レブリン酸といった有機酸の除去効果が少ないといった課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平１１−５０６９３４号公報
【特許文献２】特開２００５−２２９８２１号公報
【特許文献３】特開２００３−２１２８８８号公報
【特許文献４】特開２００１−９５５９７号公報
【特許文献５】特許３０４１３８０号公報
【特許文献６】ＷＯ２００９／１１０３７４
【特許文献７】特開２００５−２７００５６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】A. Adenら、“LignocellulosicBiomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NREL Technical Report (2002)
【非特許文献２】S. Larsonら、”The generation of fermentation inhibitors during dilute acid hydrolysis of softwood” Enzyme Microb. Technol.24.151-159. (1999)
【非特許文献３】HB. Klinkleら、“Inhibition of ethanol producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass”Appl. Microbiol. Biotechnol. 66. 10-26 (2004)
【非特許文献４】J.P.Delgenesら、“Effects of lignocellulose degradation products on ethanol fermentation of glucose and xyloseby Saccharomyces cerevisiase, Zymomonas mobilis, Pichia stipitis, and Candida shehatae”Enzyme Microbial. Technol. 19. 220-225.(1996)
【非特許文献５】M. Alfred ら、“Effect of pH, time and temperature of overliming on detoxification of dilute-acid hydrolyzates for fermentation by Saccaromyces cerevisiase”Process Biochemistry, 38,515-522 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のとおり、キシラン含有バイオマスよりキシロース糖液を製造して、これを微生物の発酵原料として利用する技術はあるが、キシロース糖液に含まれる発酵阻害物質を効率的に除去する方法に関しては、未だに多くの課題が残されていた。本発明では、キシラン含有バイオマスからキシロース糖液を製造するにあたり、発酵阻害物質の極めて少ないキシロース糖液を効率的に製造することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の［１］〜［７］の構成を有する。
【０００９】
［１］キシラン含有バイオマスより、キシロース糖液を製造する方法であって、
（１）キシラン含有バイオマスを水熱処理し、水熱処理物を得る工程、
（２）水熱処理物に糖化酵素を添加し、さらにキシロースを資化しない微生物を添加し、糖化発酵液を得る工程、
（３）糖化発酵液を、少なくとも精密ろ過膜を使用して固液分離し、得られたろ液をナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過し、非透過液より濃縮および精製されたキシロース溶液を得る工程、を含むキシロース糖液の製造方法。
【００１０】
［２］工程（１）の水熱処理物が、キシラン含有バイオマスを１８０〜３００℃の高圧熱水で処理した水熱処理液および／または水熱処理バイオマスである、［１］記載のキシロース糖液の製造方法。
【００１１】
［３］工程（２）の微生物が、サッカロミセス属およびカンジダ属の群から選ばれる微生物である、［１］または［２］に記載のキシロース糖液の製造方法。
【００１２】
［４］工程（３）の糖化発酵液をｐＨ１〜５の範囲に調整する、［１］〜［３］のいずれかに記載のキシロース糖液の製造方法。
【００１３】
［５］工程（３）の精密ろ過膜の平均細孔径が０．４μｍ以下である、［１］から［４］のいずれかに記載のキシロース糖液の製造方法。
【００１４】
［６］［５］記載のキシロース糖液を炭素源として微生物を培養することにより化学品を得る、化学品の製造方法。
【００１５】
［７］化学品がアルコールである、［６］記載の化学品の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、キシラン含有バイオマスからキシロース糖液を選択的に得ることができ、さらには得られるキシロース糖液からはＨＭＦ、フルフラール、バニリンなどの発酵阻害物質が除去されているため、該キシロース糖液をキシロースを資化する微生物の炭素源として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明のキシロース糖液の製造方法における手順を示す略図である。
【図２】図２は、本発明の固液分離において、精密ろ過膜を使用した際の膜フラックスと膜間差圧との関係性を示す図である。
【図３】図３は、本発明のキシロース製造方法で得たキシロース糖液を炭素源として微生物を培養することにより化学品（エタノール）を製造した例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
キシラン含有バイオマスは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、ビートパルプ、綿実殻、パーム空殻房、稲わら、麦わら、竹、笹、などの草本系バイオマス、あるいはシラカバ、ブナなどの樹木、廃建材などの木質系バイオマスに多量に含まれており、本発明ではこれらをキシロース糖液の原料として使用する。具体的には、キシラン含有バイオマスにはヘミセルロース成分であるキシラン、セルロース、芳香族高分子であるリグニン等を含まれており、本発明では、キシラン含有バイオマスを加水分解することで、キシロース糖液を得る。
【００１９】
本発明のキシロースの製造方法では、前述キシラン含有バイオマスを原料として、まず工程（１）として、キシラン含有バイオマスの水熱処理を行うことで、水熱処理物を得る。次に工程（１）で得られた水熱処理物に糖化酵素を添加することで、キシラン含有バイオマスの加水分解反応を行う。次にキシロースを資化しない微生物を添加し、グルコースを炭素源として生育させる。工程（２）では、糖化酵素およびキシロースを資化しない微生物の作用により糖化発酵液を得ることができる。次に工程（３）では、得られた糖化発酵液を少なくとも精密濾過膜を使用して固液分離し、キシラン含有バイオマスの未分解生物およびキシロースを資化しない微生物を除去したろ液を得る。得られたろ液は、ナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過することで、キシロース含有糖液を非透過液より濃縮および精製されたキシロース糖液を得る。
【００２０】
まず、工程（１）に関して説明する。
【００２１】
工程（１）では、キシラン含有バイオマスを水熱処理するための前処理工程について特に限定はないが、後述水熱処理の効率を向上させるため、適当な粒径・サイズに予めの裁断、微粉砕、などの処理を施すことが好ましい。
【００２２】
工程（１）の水熱処理の条件としては、キシラン含有バイオマスが、０．１〜５０重量％となるよう水を添加後、１００〜４００℃、好ましくは１８０〜３００℃の高圧熱水で、１秒〜６０分処理する。こうした温度条件において処理することにより、キシラン含有バイオマス中の成分である、キシラン、セルロース、リグニンなどの加水分解が起こる。処理回数は特に限定されず該処理を１回以上行えばよい。また、該処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。なお、工程（１）の水熱処理は、後述工程（２）で行う糖化酵素による糖化効率を向上させるための前処理であり、完全にキシランあるいはセルロースを加水分解する処理ではない。
【００２３】
キシラン含有バイオマスの水熱処理物は、水熱処理固体と水熱処理水より構成される。水熱処理固体には、主として、水熱処理で十分に分解できなかったセルロース、セロオリゴ糖、あるいはキシラン、キシロオリゴ糖、そしてリグニンなどが含まれる。一方、水熱処理水には、単糖、グルコース、キシロース、水溶性のセロオリゴ糖、水溶性のキシロオリゴ糖が含まれる。工程（１）の水熱処理物における水熱処理固体と水熱処理水の比率あるいは固体含量は特に限定されるものではない。また、水熱処理物を固液分離し、水熱処理水と水熱処理固体に分離しておき、それぞれの成分を水熱処理物として、後述の工程（２）に使用してもよい。水熱処理物を固形分離する手法例として、特開２０１０−２９８６２など水熱分解装置を使用する手法が例示でき、好ましく使用できる。
【００２４】
次に、工程（２）に関して説明する。
【００２５】
工程（２）の糖化酵素とは、水熱処理物のキシランあるいはセルロースを分解可能な酵素成分、すなわちセルラーゼあるいはヘミセルラーゼと呼ばれる酵素成分を含む酵素剤のことを指す。さらに詳細には、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼなどの酵素成分を含む酵素剤のことを指す。
【００２６】
糖化酵素に含まれる酵素成分に関して説明する。セロビオハイドラーゼとは、セルロースの末端部分から加水分解していくことを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドラーゼに帰属される酵素群が記載されている。エンドグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の中央部分から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４、ＥＣ３．２．１．６、ＥＣ３．２．１．３９、ＥＣ３．２．１．７３としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。エキソグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の末端から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．７４、ＥＣ３．２．１．５８としてエキソグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。βグルコシダーゼとは、セロオリゴ糖あるいはセロビオースに作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．２１としてβグルコシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。キシラナーゼとは、ヘミセルロースあるいは特にキシランに作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．８としてキシラナーゼに帰属される酵素群が記載されている。キシロシダーゼとは、キシロオリゴ糖に作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．３７としてキシロシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２７】
工程（２）の糖化酵素における前述の酵素成分の構成比は特に限定されないが、水熱処理物の糖化酵素による加水分解は、前述酵素成分が協奏的あるいは補完的に作用することで効率化されることが知られているため、複数の酵素成分を含んでなる酵素剤であることが好ましい。
【００２８】
工程（２）の糖化酵素は、好ましくはトリコデルマ属由来の糖化酵素である。トリコデルマ属の微生物は、前述した複数の酵素成分を、その培養過程で培養液に大量に分泌生産することが知られており、こうした培養液より糖化酵素を安価に大量に得ることができる。
【００２９】
前述のトリコデルマ属の微生物は、特に限定されないが、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が好ましく、具体的にはトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＲｕｔ Ｃ−３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ３−７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ９１２３）を例示することができる。また、前述のトリコデルマ属に由来する微生物であって、これらを変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、セルラーゼ生産性が向上した変異株であってもよい。
【００３０】
工程（２）の糖化酵素は、前述のトリコデルマ属の微生物がセルラーゼを産生するよう調整した培地中で、任意の期間該微生物を培養した培養上清より単離することができる。使用する培地成分は特に限定されないが、セルラーゼの産生を促進するために、セルロースあるいはセルロース含有バイオマスを添加した培地が一般的に使用できる。そして、こうした培養液を粗酵素物としてそのまま、あるいはトリコデルマ属の菌体を除去したのみの培養上清が好ましく使用される。またトリコデルマ属由来の糖化酵素に、さらに異種または同種のβグルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼを添加してもよい。また、トリコデルマ属の微生物に異種または同種のβグルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼの遺伝子を導入し、その培養液中に産生されるよう遺伝子組換えされたトリコデルマ属の微生物を培養し、その培養液を単離して得られた酵素を糖化酵素として使用してもよい。
【００３１】
前述した糖化酵素を、水熱処理物に添加することにより、セルロース、セロオリゴ糖、あるいはキシラン、キシロオリゴ糖の加水分解を行うことができる。この加水分解により、グルコースおよびキシロースを含む溶液を得ることができる。得られるグルコースおよびキシロース濃度は特に限定されないが、一般的に各々５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌ程度である。ここで得られるグルコースは、後述の「キシロースを資化しない微生物」の生育あるいは増殖の炭素源として消費される。
【００３２】
糖化酵素の添加量は、水熱処理物の十分な加水分解効率が得られる量であれば限定されるものではない。また、糖化酵素を添加後、糖化酵素の最適な反応温度およびｐＨ条件下で、１分〜２４０時間保温することで加水分解を行うことができる。糖化酵素として、前述トリコデルマ属由来糖化酵素を使用する場合、反応温度は４０〜６０℃の範囲、ｐＨは、３．０〜７．５の範囲で実施することが好ましい。
【００３３】
工程（２）の「キシロースを資化しない微生物」とは、五単糖であるキシロースを炭素源として資化しない、あるいはその資化速度が極めて遅い微生物のことを指す。通常、六単糖であるグルコースを炭素源として資化することが微生物の普遍的な特徴であるが、一方で、キシロースを炭素源として資化する能力が本来備わった微生物種が存在する。したがって、ここでいう「キシロースを資化しない微生物」とは、以下の特徴１）、２）を有する微生物を除外したすべての微生物を指す。
【００３４】
特徴１）キシロースを炭素源として資化する能力が本来高い微生物とは、キシロースの代謝経路が発達しており、キシロースを炭素源として細胞内に取り込み、特にペントースリン酸経路を経てキシロースの代謝を行う。こうした微生物としては、ピキア属、特にピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、カンジダ属、特にカンジダ・シェハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）、あるいはカンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、パチソレン属、パチソレン・タノフィリス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス属、特にサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エシェリシア属、特にエシェリシア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス属、特にバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ロドスポリディウム属、特にロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス属、特にリポマイセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙ）、ブレルタノマイセス属、特にブレスタノマイセス クランゼニー（Ｂｒｅｎｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｎｓｅｎｉｉ）などを例示することができる。ここで例示した微生物以外にも、キシロースを炭素源として利用できる微生物はこの範疇に含まれる。
【００３５】
特徴２）遺伝子組換え手法によりキシロースの資化性を付与された微生物とは、遺伝子組換え手法によって、特にキシロース代謝遺伝子を導入あるいは強化することでキシロースを資化できる微生物のことを指す。キシロース代謝性遺伝子としては、キシロースイソメラーゼ、キシロースレダクターゼ、キシリトースデヒドロゲナーゼ、キシルロースキナーゼなどの酵素を例示することができる。こうした遺伝子組換え手法によりキシロースの資化性を付与された微生物としては、特許第４１２４２７０号公報、特表２０１０−５０４７５６号公報などを例示できる。ここで例示した微生物以外にも、キシロースを炭素源として利用できる微生物はこの範疇に含まれる。
【００３６】
こうした「キシロースを資化しない微生物」のうち、好ましく使用できる微生物としては、真核微生物に属する微生物である。真核微生物とは、別名真菌と呼ばれ、さらに子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）に分類される。こうした真核微生物は、原核微生物に比べ水熱処理物に含まれる酢酸やフルフラールなどの低分子化合物に対する耐性が比較的高く、本発明で好ましく使用できる。
【００３７】
真核微生物の中でも、特にサッカロミセス属またはカンジダ属が好ましく使用できる。サッカロミセス属またはカンジダ属は、１）低分子化合物に対する耐性が比較的高く、水熱処理物中でもグルコースを炭素源とした生育が優れる点、２）ＨＭＦ、フルフラール、バニリンなどの芳香族アルデヒドまたはフランアルデヒド類の分解あるいは吸着に優れる点、から好ましく本発明に使用することができる。サッカロミセス属またはカンジダ属の中でも、さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビジエまたはカンジダ・グラブラータである。
【００３８】
こうしたキシロースを資化しない微生物は、キシロースを資化せずにグルコースなどの単糖を炭素源として生育することができるが、生育の過程で発酵産物を生成する微生物であってもよい。発酵産物としては特に限定されるものではないが、具体例としてアルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。なお、サッカロミセス・セレビジエまたはカンジダ・グラブラータは、エタノール発酵性を示すものが多く存在し、グルコースを炭素源として生育し、その発酵産物としてエタノールを好ましく産生しうる。
【００３９】
工程（２）では、水熱処理物に前述の糖化酵素およびキシロースを資化しない微生物を添加し糖化発酵液を製造する。この際、糖化酵素およびキシロースを資化しない微生物を同時に投入することで糖化発酵を同時に実施してもよいし、糖化酵素を添加し水熱処理物の糖化を実施した後に、キシロースを資化しない微生物を添加して発酵させてもよい。糖化発酵における反応時間、温度、糖化酵素の添加量は、使用する酵素あるいは微生物の特性などを鑑みて適宜条件設定すればよい。但し、工程（２）の糖化発酵では、キシロースを資化しない微生物の作用により１）グルコースを消費させ、糖液中のキシロース成分比率を増加させること、２）ＨＭＦ、フルフラール、バニリンなどの不純物を分解あるいは吸着させること、を目的とするため、糖化発酵の反応時間は、得られる糖化発酵液中のグルコースおよびＨＭＦ、フルフラール、バニリンなどの発酵阻害物質の濃度が所望の量まで十分低下するまでの反応時間を設定し処理することが好ましい。こうした反応時間は、微生物の投入量、水熱処理物に含まれるＨＭＦなどの含有量によって変動するが、１〜１５０時間の範囲で設定することができる。
【００４０】
工程（２）で得られる糖化発酵液には、キシロースを資化しない微生物の性質に依存して、グルコースから代謝変換された発酵産物が含まれる場合がある。仮に、エタノール発酵性の微生物を使用した場合、グルコースから生成したエタノールが糖化発酵液に含まれる。あるいは乳酸発酵性の微生物を使用した場合、グルコースから生成した乳酸が糖化発酵液に含まれる。こうした糖化発酵液に含まれる発酵産物量は、キシラン含有バイオマスから生成したグルコース量に依存する。この工程（２）の糖化発酵液中の発酵産物は、後述の工程（３）でナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過することで、ナノろ過膜透過液として除去してもよいし、あるいはさらにこの透過液を回収してもよい。
【００４１】
次に、工程（３）に関して説明する。
【００４２】
工程（３）では、糖化発酵液を少なくとも精密ろ過膜を使用して固液分離する。この固液分離により工程（２）の水熱処理物の糖化反応で未分解の固形物を除去する。ここでいう未分解の固形物には、糖化酵素で十分分解できなかったリグニン成分、セルロース成分、キシラン成分などが含まれ、また、工程（２）で投入した微生物も固液分離により未分解の固形物に含まれる。一方、精密ろ過膜を使用した固液分離により得られるろ液にはキシロースが含まれる。
【００４３】
工程（３）で使用される精密ろ過膜とは、メンブレンフィルトレーションと呼ばれ、圧力差を駆動力として、微粒子懸濁液から０．０１〜１０μｍ程度の粒子を分離除去できる分離膜である。すなわち精密ろ過膜の表面には０．０１〜１０μｍの範囲の細孔を有し、その細孔以上の微粒子成分は膜側に分離除去することができる。
【００４４】
工程（３）では、０．４μｍ以下の平均細孔径を有する精密ろ過膜を使用することが好ましい。０．４μｍ以下の平均細孔径を有する精密ろ過膜を使用することにより、糖化発酵液中に含まれる発酵阻害物質であるＨＭＦ、フルフラールを除去できる効果を有しており、より不純物の少ないキシロース糖液を製造することができる。こうした平均細孔径は、各分離膜メーカーが提示の公称径を採用してもよいし、実際に測定してもよい。精密ろ過膜の平均細孔径を測定する方法として、バブルポイント法がある。バブルポイント法とは、膜二次側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力を測定し、使用した液体の表面張力と圧力との関係式から平均細孔径を算出する手法である。具体的には、ＡＳＴＭ Ｆ３１６−０３（バブルポイント法）に準拠して測定することが可能であり、例えば、日本ベル株式会社製の貫通細孔分布／ガス透過性解析装置を用いて測定することができる。
【００４５】
精密ろ過膜の材質は、酢酸セルロース、芳香族ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリアクリロニトリル、セラミック、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））などが例示できるが特に限定されるものではないが、工程（３）で使用される精密ろ過膜の素材は、上述素材のうち、対汚性、薬品耐性、強度、ろ過性といった観点において、ポリフッ化ビニリデン製の精密ろ過膜であることが好ましい。
【００４６】
精密ろ過膜による精密ろ過の方法としては、圧ろ過、真空ろ過、クロスフローろ過、遠心ろ過などがあるが、膜の目詰まりが少ないクロスフローろ過であることが好ましい。またろ過操作として、定圧ろ過、定流量ろ過、非定圧非定流量ろ過に大別されるが特に限定されない。
【００４７】
工程（３）での固液分離は、少なくとも精密ろ過膜を使用して固液分離を行えばよいが、場合によっては、精密ろ過に加えて他の固液分離手法を組み合わせてもよく限定されるものではない。他の固液分離の手法の具体例としては、プレスろ過、遠心分離が挙げられる。
【００４８】
また、工程（３）の固液分離を行った後、得られるろ液を限外ろ過膜に通じてろ過処理することも好ましい態様の１つである。限外ろ過膜処理の効果として、１）工程（２）で使用する糖化酵素を回収、および再利用できるため経済性が向上すること、２）工程（３）のナノろ過膜および／または逆浸透膜における膜の目詰まりがさらに低下すること、３）キシロース糖液のアミノ酸あるいはタンパク質とのメイラード反応を抑制することができること、が挙げられる。使用する限外ろ過膜は、特に限定されないが、ポリエーテルサルホンなどの合成高分子性膜であることが好ましく、分画分子量１０００〜２０００００の限外ろ過膜を使用することが好ましい。
【００４９】
次に前述固液分離で得られたろ液成分を、ナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過することに関して説明する。
【００５０】
工程（３）における「ナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過する」とは、糖化発酵液を固液分離したろ液を、ナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過することであり、本操作により、溶解している糖、特にキシロース糖液を非透過側に阻止または濾別し、発酵阻害物質を透過液、あるいはろ液として透過させることができる。
【００５１】
ここでいう発酵阻害物質とは、セルロース含有バイオマスの加水分解で生成する化合物であり、かつ本発明の製造方法によって得られる糖液を原料とする発酵工程において前述の通り阻害的に作用する物質のことを指し、特にセルロース含有バイオマスの酸処理の工程で生成される、有機酸、フラン系化合物、フェノール系化合物に大きく分類される。
【００５２】
有機酸としては、酢酸、ギ酸、レブリン酸などが具体例として挙げられる。フラン系化合物としては、ＨＭＦ、フルフラールなどが挙げられる。こうした有機酸あるいはフラン系化合物は、単糖であるグルコースあるいはキシロースの分解による産物である。
【００５３】
また、フェノール系化合物としては、バニリン、アセトバニリン、バニリン酸、シリンガ酸、没食子酸、コニフェリルアルデヒド、ジヒドロコニフェニルアルコール、ハイドロキノン、カテコール、アセトグアイコン、ホモバニリン酸、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル誘導体（Ｈｉｂｂｅｒｔ’ｓ ｋｅｔｏｎｅｓ）などが具体例として挙げられ、これらの化合物はリグニンまたはリグニン前駆体に由来する。
【００５４】
工程（３）の精密ろ過膜による固液分離により得られたろ液には、発酵阻害物質として前記物質のうち少なくとも１種が含まれており、実際には複数種含まれている。なお、これらの発酵阻害物質は、薄相クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなど、一般的な分析手法により検出および定量することが可能である。
【００５５】
工程（３）で使用するナノろ過膜とは、ナノフィルター（ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜）とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。また、工程（３）で使用する逆浸透膜とはＲＯ膜とも呼ばれるものであり、「１価のイオンを含めて脱塩機能を有する膜」と一般的に定義される膜であり、数オングストロームから数ナノメートル程度の超微小空隙を有していると考えられる膜で、主として海水淡水化や超純水製造などイオン成分除去に用いられる。
【００５６】
工程（３）で使用するナノろ過膜および逆浸透膜の性能を評価する方法として、糖液に含まれる対象化合物（発酵阻害物質、あるいは単糖など）の透過率（％）を算出することで評価できる。透過率（％）の算出方法を式１に示す。
【００５７】
透過率（％）＝（透過側の対象化合物濃度／非透過液の対象化合物濃度）×１００・・・（式１）。
【００５８】
式１における対象化合物濃度は、高い精度と再現性を持って測定可能な分析手法であれば限定されないが、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーなどが好ましく使用できる。本発明で使用するナノろ過膜および／または逆浸透膜は、対象化合物が単糖である場合、その透過率が低い方が好ましく、その一方で対象化合物が発酵阻害物質である場合、その透過率が高いものが好ましい。
【００５９】
ナノろ過膜および／または逆浸透膜に供する糖液のｐＨは特に限定されないが、１〜５の範囲であることが好ましい。ｐＨが１未満であると長期間使用した際に膜が変性してフラックス、透過率といった膜性能が著しく低下し、ｐＨが５より大きいと酢酸、ギ酸、レブリン酸といった有機酸の除去率が著しく低下する場合があるためである。ナノろ過膜および／または逆浸透膜は膜表面が電荷を帯びているため溶液中にイオン化している物質の方が、イオン化していない物質に比べて除去または阻止しやすいことから、糖水溶液中に含まれる有機酸の含量が高い場合、あるいは高い除去効果が必要な場合、前記の範囲のｐＨに糖液を調整することで、その除去効率を飛躍的に向上させることができる。また、糖液のｐＨを１〜５に調整してナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過する効果として、膜のファウリング抑制効果がある。一般的にｐＨが低下するにつれて初期フラックス値は低下するが、特にキシラン含有バイオマス由来の糖液に限っては、前期ｐＨ条件である方が膜の長期安定性が保つことができる。
【００６０】
また、特に逆浸透膜においては、糖液のｐＨを１〜３に調製することがより好ましい。ナノ濾過膜同様、ｐＨが１未満であると長期間使用時に膜が変性してフラックス、透過率といった膜性能が著しく低下することは同様であるが、ｐＨが３より大きいと有機酸の除去率が十分得られないことがあるためである。これは、逆浸透膜はナノ濾過膜に対し孔径等が小さい等の理由により溶出成分のイオン性由来の電荷をより一層抑制しないと有機酸の有効半径であるイオン半径が大きくなり、ナノ濾過膜と同等の除去性能が保てないものと推察される。なお、逆浸透膜の中でも操作圧力を低減できる低圧・超低圧タイプの逆浸透膜を使用すれば、原水の調整ｐＨが３より大きい値であっても、低圧・超低圧タイプでない逆浸透膜と同等の有機酸除去率となり、ｐＨ調整に使用する酸使用量、および後工程の発酵工程におけるｐＨ調整に使用するアルカリ使用量を低減させる効果が得られ、また、有機酸の除去率が低圧・超低圧タイプではない逆浸透膜に比べて有機酸の除去率が向上するため、本発明において好ましく使用される。ここで低圧・超低圧タイプの逆浸透膜とは、０．７５ＭＰａの濾過圧、ｐＨ６．５において、膜単位面積当たりの塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）の透過流量（ｍ３／ｍ２／ｄａｙ）が０．４以上の逆浸透膜を指す。膜単位面積当たりの透過流量（膜透過流束または膜フラックス）の評価方法としては、透過液量および透過液量を採水した時間および膜面積を測定することで、式２によって算出することができる。
【００６１】
膜透過流束（ｍ３／ｍ２／ｄａｙ）＝透過液量／膜面積／採水時間・・・（式２）。
【００６２】
糖液のｐＨ調整に使用する酸もしくはアルカリは特に限定されるものではない。酸として好ましくは塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、より好ましくは発酵時の阻害が起こりにくい観点から硫酸、硝酸、リン酸、さらに好ましくは経済性の観点から硫酸である。アルカリとして好ましくは経済性の観点からアンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムとそれらを含む水溶液、より好ましくは膜ファウリングの観点から１価イオンであるアンモニア、ナトリウム、さらに好ましくは発酵時の阻害が起こりにくい観点からアンモニアである。
【００６３】
糖液のｐＨ調整を行う段階は、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜処理の前であればよい。またセルロース含有バイオマスの加水分解に酵素を利用する場合は、加水分解反応時にｐＨを５以下に調整しておいてもよい。また、限外濾過膜を利用して酵素を再利用するプロセスを利用する場合はｐＨを４以下まで低下させると酵素の失活が起こりやすいため限外濾過膜処理後の濾液をｐＨ調整することが好ましい。
【００６４】
本発明におけるナノ濾過膜および／または逆浸透膜に供する糖液の温度は特に限定されないが、使用する膜の濾過時の発酵阻害物除去能を高める目的で適宜設定することができる。具体的には、ナノ濾過膜で濾過する場合、糖液の温度が４０〜８０℃であれば、ナノ濾過膜の発酵阻害物質除去能が高まるため、好ましく設定される。ナノ濾過膜で濾過する場合の糖液の温度が４０℃以上の範囲から除去能が大きくなるものの、８０℃より高いとナノ濾過膜が変性してしまうことによって膜特性が失われることがあるからである。
【００６５】
また、逆浸透膜で濾過する場合、糖液の温度が１〜１５℃であれば、逆浸透膜の発酵阻害物質除去能が高まるため、好ましく設定される。逆浸透膜で濾過する場合の糖液の温度が１℃より低いと配管中の凍結により装置不良の原因となり、１５℃より高い場合は、損失低下に効果が大きく現れない。前記の温度制御は温度の高いと膜の膨張が起きてより分子量の大きいものが除去され、除去量も向上する傾向が得られ、温度が低いと膜の収縮が起きて膜の孔径が小さくなり糖の濾液側への損失が低減されることがあるからである。
【００６６】
本発明で使用されるナノ濾過膜の素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。複合膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載の、ポリスルホンを膜素材とする支持膜にポリアミドの機能層からなるナノフィルターを構成させた複合膜を用いることができる。
【００６７】
これらの中でも高耐圧性と高透水性、高溶質除去性能を兼ね備え、優れたポテンシャルを有する、ポリアミドを機能層とした複合膜が好ましい。操作圧力に対する耐久性と、高い透水性、阻止性能を維持できるためには、ポリアミドを機能層とし、それを多孔質膜や不織布からなる支持体で保持する構造のものが適している。また、ポリアミド半透膜としては、多官能アミンと多官能酸ハロゲン化物との重縮合反応により得られる架橋ポリアミドの機能層を支持体に有してなる複合半透膜が適している。
【００６８】
ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜において、ポリアミドを構成する単量体の好ましいカルボン酸成分としては、例えば、トリメシン酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸、トリメリット酸、ピロメット酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、ジフェニルカルボン酸、ピリジンカルボン酸などの芳香族カルボン酸が挙げられるが、製膜溶媒に対する溶解性を考慮すると、トリメシン酸、イソフタル酸、テレフタル酸、およびこれらの混合物がより好ましい。
【００６９】
前記ポリアミドを構成する単量体の好ましいアミン成分としては、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、ベンジジン、メチレンビスジアニリン、４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、ジアニシジン、３，３’，４−トリアミノビフェニルエーテル、３，３’，４，４’−テトラアミノビフェニルエーテル、３，３’−ジオキシベンジジン、１，８−ナフタレンジアミン、ｍ（ｐ）−モノメチルフェニレンジアミン、３，３’−モノメチルアミノ−４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、４，Ｎ，Ｎ’−（４−アミノベンゾイル）−ｐ（ｍ）−フェニレンジアミン−２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾイミダゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾオキサゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾチアゾール）等の芳香環を有する一級ジアミン、ピペラジン、ピペリジンまたはこれらの誘導体等の二級ジアミンが挙げられ、中でもピペラジンまたはピペリジンを単量体として含む架橋ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜は耐圧性、耐久性の他に、耐熱性、耐薬品性を有していることから好ましく用いられ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするナノろ過膜がより好ましく用いられる。架橋ピペラジンポリアミド系ナノろ過膜の具体例としては、東レ株式会社製の架橋ピペラジンポリアミド系ナノ濾過膜のＵＴＣ６０が挙げられる。
【００７０】
ナノ濾過膜は一般にスパイラル型の膜モジュールとして使用されるが、本発明で用いるナノ濾過膜も、スパイラル型の膜モジュールとして好ましく使用される。好ましいナノ濾過膜モジュールの具体例としては、例えば、酢酸セルロース系のナノ濾過膜であるＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ナノ濾過膜のＧＥｓｅｐａ、ポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００、ＮＦ−２７０またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０が挙げられ、より好ましくはポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分としたポリアミドを機能層とする東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０であり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分としたポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０である。
【００７１】
工程（２）におけるナノ濾過膜による濾過は、圧力をかけてもよく、その濾過圧は、０．１〜８ＭＰａの範囲であることが好ましい。濾過圧が０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるおそれがある。また、濾過圧が０．５〜７ＭＰａの範囲であれば、膜透過流束が高いことから、糖溶液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１〜６ＭＰａの範囲であることが特に好ましい。
【００７２】
本発明で使用される逆浸透膜の素材としては、酢酸セルロール系のポリマーを機能層とした複合膜（以下、酢酸セルロース系の逆浸透膜ともいう）またはポリアミドを機能層とした複合膜（以下、ポリアミド系の逆浸透膜ともいう）が挙げられる。ここで、酢酸セルロース系のポリマーとしては、酢酸セルロース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース等のセルロースの有機酸エステルの単独もしくはこれらの混合物並びに混合エステルを用いたものが挙げられる。ポリアミドとしては、脂肪族および／または芳香族のジアミンをモノマーとする線状ポリマーまたは架橋ポリマーが挙げられる。
【００７３】
本発明で使用される逆浸透膜の具体例としては、例えば、東レ株式会社製ポリアミド系逆浸透膜モジュールである超低圧タイプのＳＵＬ−Ｇ１０、ＳＵＬ−Ｇ２０、低圧タイプのＳＵ−７１０、ＳＵ−７２０、ＳＵ−７２０Ｆ、ＳＵ−７１０Ｌ、ＳＵ−７２０Ｌ、ＳＵ−７２０ＬＦ、ＳＵ−７２０Ｒ、ＳＵ−７１０Ｐ、ＳＵ−７２０Ｐの他、逆浸透膜としてＵＴＣ８０を含む高圧タイプのＳＵ−８１０、ＳＵ−８２０、ＳＵ−８２０Ｌ、ＳＵ−８２０ＦＡ、同社酢酸セルロース系逆浸透膜ＳＣ−Ｌ１００Ｒ、ＳＣ−Ｌ２００Ｒ、ＳＣ−１１００、ＳＣ−１２００、ＳＣ−２１００、ＳＣ−２２００、ＳＣ−３１００、ＳＣ−３２００、ＳＣ−８１００、ＳＣ−８２００、日東電工株式会社製ＮＴＲ−７５９ＨＲ、ＮＴＲ−７２９ＨＦ、ＮＴＲ−７０ＳＷＣ、ＥＳ１０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｕ、ＥＳ１５−Ｄ、ＥＳ１５−Ｕ、ＬＦ１０−Ｄ、アルファラバル製ＲＯ９８ｐＨｔ、ＲＯ９９、ＨＲ９８ＰＰ、ＣＥ４０４０Ｃ−３０Ｄ、ＧＥ製ＧＥ Ｓｅｐａ、Ｆｉｌｍｔｅｃ製ＢＷ３０−４０４０、ＴＷ３０−４０４０、ＸＬＥ−４０４０、ＬＰ−４０４０、ＬＥ−４０４０、ＳＷ３０−４０４０、ＳＷ３０ＨＲＬＥ−４０４０、ＫＯＣＨ製ＴＦＣ−ＨＲ、ＴＦＣ−ＵＬＰ、ＴＲＩＳＥＰ製ＡＣＭ−１、ＡＣＭ−２、ＡＣＭ−４などが挙げられる。
【００７４】
本発明では、逆浸透膜に通じてろ過することが好ましい。一般的に、ナノろ過膜を使用すると、キシロースの透過率が高くなり、非透過液としての回収できる量が低下する場合があるが、逆浸透膜であれば、非透過液としてキシロースを損失なく回収できる。したがって、ナノ濾過膜と逆浸透膜を組み合わせてキシロース糖液を得る場合、糖液をまずナノ濾過膜で濾過し、得られる濾過液をさらに逆浸透膜で濾過することにより、ナノろ過膜および逆浸透膜の非透過液からキシロール糖液を損失なく回収することができる。
【００７５】
前述の工程（３）により得られるキシロース糖液は、そのままでも工業原料として用いることができるが、さらに活性炭処理、イオン交換膜処理、晶析などの手法で精製処理を行ってもよい。
【００７６】
本発明により得られるキシロース糖液は、キシロース濃度が５０〜２００ｇ／Ｌであることが好ましい。キシロース濃度が低すぎると、工業原料としての使用が困難であり、２００ｇ／Ｌを超える範囲までキシロース糖液を濃縮することは、工程（３）におけるナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過する処理において、高い圧力を要すため経済的に好ましくない。
【００７７】
また、キシロース糖液に含まれる発酵阻害物質であるＨＭＦまたはフルフラールの濃度は、０〜１０００ｐｐｍの範囲であることが、該キシロース糖液を後述の微生物の炭素源として使用する場合において好ましい。
【００７８】
キシロース糖液の工業原料としての用途としては、食品添加剤、保存剤、香料などの用途が例示できる。また、本発明のキシロース糖液を原料として、さらに水素化反応することでキシリトールに変換することもでき、ガムなどの甘味料として使用することができる。また、キシロース糖液を炭素源として微生物を培養することにより、化学品を製造することができる。
【００７９】
以下、キシロース糖液を炭素源として微生物を培養することによる化学品の製造方法に関して説明する。
【００８０】
本発明により得られるキシロース糖液には、必要に応じて、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有させてもよい。さらに場合によっては、キシロースに加え、炭素源として、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなどを追加して、発酵原料として使用してもよい。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。
【００８１】
キシロース糖液を炭素源として微生物を培養する際の微生物は、キシロースを炭素源として利用できる微生物に限定される。それは、工程（２）の微生物の作用によりグルコースは、ほとんど消費されているためである。したがって、キシロースを炭素源として利用できる微生物以外は使用できない。
【００８２】
キシロースを炭素源として利用できる微生物の具体例としては、前述のとおり大きく２種に分類される。すなわち、本来キシロースを炭素源として資化できる微生物と、遺伝子組換え手法によりキシロースの資化性を付加した微生物である。
【００８３】
本来キシロースを炭素源として資化できる微生物の例としては、ピキア属、特にピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、カンジダ属、特にカンジダ・シェハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）、あるいはカンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、パチソレン属、パチソレン・タノフィリス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス属、特にサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エシェリシア属、特にエシェリシア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス属、特にバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ロドスポリディウム属、特にロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス属、特にリポマイセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙ）、ブレルタノマイセス属、特にブレスタノマイセス クランゼニー（Ｂｒｅｎｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｎｓｅｎｉｉ）などを例示することができる。こうした微生物のうち、好ましくは、エシェリシア・コリ（大腸菌）もしくはピキア・スティピティスであり、より好ましくは、ピキア・スティピティスである。
【００８４】
また、遺伝子組換え手法によりキシロースの資化性を付加した微生物の例としては、キシロース代謝遺伝子を導入した微生物を例示することができる。キシロース代謝性遺伝子としては、キシロースイソメラーゼ、キシロースレダクターゼ、キシリトースデヒドロゲナーゼ、キシルロースキナーゼなどの酵素を例示することができる。こうした遺伝子組換え手法によりキシロースの資化性を付与された微生物としては、特許第４１２４２７０号公報、特表２０１０−５０４７５６号公報などを例示できる。こうした微生物は、キシロースを炭素源として効率的に資化でき、かつ所望の発酵産物の生産能力を有する微生物であれば、特に限定されるものではない。
【００８５】
微生物の培養は、通常、培養する微生物の至適ｐＨおよび至適温度の範囲で行われる。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４〜８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００８６】
キシロース糖液を炭素源として微生物を培養する際、当業者に公知の発酵培養方法が採用されうるが、生産性の観点から、ＷＯ２００７／０９７２６０に開示される連続培養方法が好ましく採用される。
【００８７】
前述の化学品の製造方法により得られる化学品の具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸、ジアミンなど発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオール、グリセロールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、核酸であれば、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、またカダベリンなどのジアミン化合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。本発明において好ましく製造される化学品は、アルコールである。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８９】
（参考例１）糖化酵素の調整（トリコデルマ由来糖化酵素）
糖化酵素は以下の方法で調整した。
【００９０】
［前培養］
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加し、１００ｍＬを５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）添加した。この前培養培地にトリコデルマ・リーセイＰＣ３−７を１×１０５個／ｍＬになるように植菌し、２８℃、７２時間、１８０ｒｐｍで振とう培養し、前培養とした（振とう装置：ＴＡＩＴＥＣ社製 ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ−４０ＬＦ）。
【００９１】
［本培養］
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、セルロース（アビセル）１０％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム 0.2%（w/vol）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加し、２．５Ｌを５Ｌ容撹拌ジャー（ＡＢＬＥ社製 ＤＰＣ−２Ａ）容器に張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．１％添加し、あらかじめ前記の方法にて液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイＰＣ３−７を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃、８７時間、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍにて培養を行い、遠心分離後、上清を膜ろ過（ミリポア社製 ステリカップ−ＧＶ 材質：ＰＶＤＦ）した。この前述条件で調整した培養液に対し、βグルコシダーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８）をタンパク質重量比として、１／１００量添加し、これを糖化酵素として、以下実施例に使用した。
【００９２】
（参考例２）糖濃度の測定
本発明のグルコースおよびキシロース濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。なお水熱処理物、糖化液、糖化発酵液、キシロース糖液は、３５００Ｇで１０分間遠心分離を行い、その上清成分を下記分析に供した。
カラム：Ｌｕｎａ ＮＨ２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：ミリＱ：アセトニトリル＝２５：７５（流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：３０℃。
【００９３】
（参考例３）発酵阻害物質（ＨＭＦ、フルフラール、バニリン、酢酸、ギ酸）の分析
発酵阻害物質のうち、ＨＭＦ、フルフラール、バニリンは下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。なお水熱処理物、糖化液、糖化発酵液、キシロース糖液は、３５００Ｇで１０分間遠心分離を行い、その上清成分を下記分析に供した。
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ＨｉｄｒｏＲＰ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製）
移動相：アセトニトリル−０．１％ Ｈ３ＰＯ４（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：ＵＶ（２８３ｎｍ）
温度：４０℃。
【００９４】
酢酸、ギ酸は下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。なお水熱処理物、糖化液、糖化発酵液、キシロース糖液は、３５００Ｇで１０分間遠心分離を行い、その上清成分を下記分析に供した。
カラム：Ｓｈｉｍ−ＰａｃｋとＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＣＲ１０１Ｈ（株式会社島津製作所製）の直列
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【００９５】
（参考例４）エタノールの分析
エタノール蓄積濃度の測定には、ガスクロマトグラフ法により定量した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−２０１０キャピラリーＧＣ ＴＣ−１（ＧＬ ｓｃｉｅｎｃｅ） １５ ｍｅｔｅｒ Ｌ．＊０．５３ｍｍ Ｉ．Ｄ．，ｄｆ１．５μｍを用いて、水素塩イオン化検出器により検出・算出して評価した。
【００９６】
（実施例１）
工程（１）：キシラン含有バイオマスより水熱処理物を得る工程
キシラン含有バイオマスとして、稲藁を使用した。キシラン含有バイオマスを約１００μｍとなるようカッターミルで細断した。その後、キシラン含有バイオマスの固形分重量１５％となるように水を添加した。このキシラン含有バイオマス混合溶液を２００℃で１５分オートクレーブ処理（日東高圧製）した。処理後、固液物を軽く沈降させた後、上澄み成分を水熱処理物として使用した。この水熱処理物の固形物濃度は、約５％であった。実施例１の水熱処理物に含まれる成分組成を参考例２〜４の方法に準じて分析した。分析結果を表１に示す。
【００９７】
工程（２）：水熱処理物に糖化酵素を添加し、さらにキシロースを資化しない微生物を添加し、糖化発酵液を得る工程
工程（１）で調整した水熱処理物に参考例１で調整した糖化酵素を添加し、糖化を行った。糖化条件は以下の通りである。
［糖化条件］
水熱処理物：２Ｌ（実施例１で調製）
ｐＨ：５．０
糖化酵素：タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬとなる様に添加
反応温度および時間：５０℃、６時間。
【００９８】
上記条件で得られた糖化液の成分組成を参考例２〜４に準じて分析した結果を表１に示す。水熱処理物の糖化により、グルコース、キシロース成分が大幅に増加することが確認された。
【００９９】
次に、糖化液にキシロースを資化しない微生物を添加して発酵させた。キシロースを資化しない微生物としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣ−２（ワイン酵母）またはＣａｎｄｉｄａ ｇｒａｂｒａｔａ（ＮＢＲＣ１０３８５７）を使用した。上記２種のキシロースを資化しない微生物は、ＹＰＤ培地（２％グルコース、１％酵母エキス（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ／ＢＤ社）、２％ポリペプトン（日本製薬））にて、１日間２５℃で前培養を行った。次に、得られた培養液を、糖化後の前述水熱処理物に対し、１％（２０ｍＬ）となるように添加した。微生物を添加後、２５℃で２日間インキュベートした。この操作で得られたものを糖化発酵液とした。特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣ−２（ワイン酵母）を添加し調製した糖化発酵液を「糖化発酵液１」、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒａｂｒａｔａ（ＮＢＲＣ１０３８５７）を添加し調製した糖化発酵液を「糖化発酵液２」とした。糖化発酵液１および糖化発酵液２（いずれもｐＨ５．０）の成分組成を参考例２〜４に準じて分析した結果を表１に示す。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
キシロースを資化しない微生物の添加による発酵により、１）グルコースの選択的な消費とこれに伴う発酵産物であるエタノール生成、２）ＨＭＦ、フルフラール、バニリンの除去（消費）、が起きていることが確認できた。また、糖化発酵液１と糖化発酵液２の成分を比較により、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒａｂｒａｔａが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣ−２（ワイン酵母）よりもＨＭＦ、フルフラール、バニリンの除去に若干優れることが判明した。
【０１０２】
工程（３）：糖化発酵液を少なくとも精密ろ過膜で固液分離し、得られたろ液をナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過し、膜画分より濃縮および精製されたキシロース溶液を得る工程
まず、工程（２）で得られた糖化発酵液１および糖化発酵液２について、精密ろ過膜による固液分離を実施した。精密ろ過膜は、平均細孔径０．４μｍのポリサルホン製精密ろ過膜（ＧＥ社製）を使用した。小型平膜ろ過装置（ＧＥ製 Ｓｅｐａ（登録商標） ＣＦ ＩＩ Ｍｅｄ／Ｈｉｇｈ Ｆｏｕｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）において、精密ろ過膜を設置し、０．１ｍ３／ｍ２／ｄａｙの条件下で実施例２の糖化発酵液１、糖化発酵液２のクロスフローろ過を行い、膜透過液として、それぞれ精密ろ過膜ろ液１、精密ろ過膜ろ液２を得た。精密ろ過膜ろ液を参考例２〜４に準じて分析した結果を表２に示す。
【０１０３】
次に、精密ろ過膜による固液分離により得られた溶液成分１Ｌをナノろ過膜または逆浸透膜に通じてろ過した。ナノろ過膜として架橋ピペラジンポリアミド系ナノろ過膜“ＵＴＣ６０”（東レ株式会社製）、逆浸透膜として、架橋全芳香族ポリアミド系逆浸透膜“ＳＵＬ−Ｇ”（東レ株式会社製）を使用し、それぞれ小型平膜ろ過装置（ＧＥ製 Ｓｅｐａ（登録商標） ＣＦ ＩＩ Ｍｅｄ／Ｈｉｇｈ Ｆｏｕｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）にセットし、原水温度を２５℃、高圧ポンプの圧力を３ＭＰａでろ過処理を行い、０．８Ｌの透過液を得た。ナノろ過膜の非透過液（膜画分）として得られたキシロース溶液の成分組成を表２に、逆浸透膜の非透過液（膜画分）として得られたキシロース溶液の成分組成を表３示す。なお、糖化発酵液１を処理したものをキシロース糖液１、糖化発酵液２を処理したものをキシロース糖液２とした。
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
糖化発酵液１および糖化発酵液２（表１）に比べて、精密ろ過膜によって固液分離をした精密ろ過膜ろ液１および精密ろ過膜ろ液２（表２）の方が、ＨＭＦ、フルフラール、バニリンが低下することが判明した。また、ナノろ過膜または逆浸透膜に通じてろ過することで、キシロースを濃縮することができ、一方で、酢酸、ギ酸などの濃縮は低く抑えることができることが判明した。すなわち、キシロース濃度に対する酢酸、ギ酸の濃度は大幅に減少させながら、キシロース糖液を濃縮できることが判明した。また、ナノろ過膜でのキシロース濃縮（表２）と逆浸透膜でのキシロース濃縮（表３）を比較したところ、逆浸透膜の方がキシロースの損失が少なく濃縮できることが判明した。
【０１０７】
（実施例２）糖化発酵液のｐＨ調整がナノろ過膜または逆浸透膜ろ過に及ぼす影響
実施例３では、ｐＨ５．０の糖化発酵液を精密ろ過膜にて固液分離をした後、ナノろ過膜または逆浸透膜に通じてろ過処理している。したがって、ナノろ過膜または逆浸透膜処理時のｐＨは５．０である。本実施例では、実施例１の工程（２）で調製した糖化発酵液１のｐＨを、あらかじめｐＨ１、ｐＨ２．４、ｐＨ３．２、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０に調製した。ｐＨの調製には、０．１ＮのＮａＯＨ水溶液あるいは０．１Ｎの希硫酸溶液を使用して調製した。ｐＨ調製した糖化発酵液を、実施例１の工程（２）に記載の精密ろ過膜による固液分離を行った後に、ナノろ過膜または逆浸透膜に通じてろ過し、得られたキシロース糖液の成分比較を実施した。その結果を表４（ナノろ過膜処理）、および表５（逆浸透膜処理）に示す。
【０１０８】
【表４】
【０１０９】
【表５】
【０１１０】
ナノろ過膜および逆浸透膜のいずれの場合においても、ｐＨ５．０よりｐＨが大きいと有機酸成分、特に酢酸が濃縮されることが判明した。一方で、ｐＨ１．０〜５．０の範囲では、有機酸、特に酢酸を透過液として効率的に除去できるため、得られるキシロース糖液に含まれる酢酸濃度を低く抑えることができることが判明した。これは、ナノろ過膜または逆浸透膜に供される糖液のｐＨを１〜５の範囲に調整することで非解離状態の酢酸比率を増加させることにより、ナノろ過膜および逆浸透膜の透過性が向上したものと推察された。
【０１１１】
（実施例３）固液分離における精密ろ過膜の平均細孔径の効果
工程（３）の固液分離に使用する精密ろ過膜の平均細孔径の効果を確認するために、種々の平均細孔径を有する精密ろ過膜を使用して、糖化発酵液を固液分離して得られるろ液に含まれる成分比較を実施した。分離膜としては、ミリポア社製アイソポア（平均細孔径：０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、０．６μｍ、０．８μｍ、１．２μｍ）を使用した。本分離膜は、ポリカーボネートに対して電子線で細孔を形成しているため、孔径分布が極めて均一な精密ろ過膜である。前述精密ろ過膜を、攪拌式セル（Ｍｏｄｅｌ８０５０）にセットし、実施例１の工程（２）で得られた糖化発酵液１または糖化発酵液２の精密ろ過を行った。精密ろ過は、攪拌式セルに内径２ｍｍ×外径４ｍｍのシリコンチューブを連結し、一定流量でろ過を行った。得られたろ液を、参考例２〜４記載の方法で分析した結果を表６（糖化発酵液１の精密ろ過膜ろ液）および表７（糖化発酵液２の精密ろ過膜ろ液）に示す。
【０１１２】
【表６】
【０１１３】
【表７】
【０１１４】
糖化発酵液１および糖化発酵液２のいずれも、平均細孔径０．４μｍ以下の精密ろ過膜による固液分離によって、ろ液中のＨＭＦ、フルフラールの濃度を低く抑えることができることが判明した。なお、糖化発酵液１および糖化発酵液２で使用したキシロースを資化しない微生物は、サッカロミセス属またはカンジダ属の酵母であって、その菌体の大きさは１０μｍ前後であると言われており、一方、本実施例で使用される精密ろ過膜の平均細孔径は大きくとも１．２μｍであり、いずれの精密ろ過膜を使用した場合においても十分に微生物を固液分離することが可能であると考えられるが、本実施例では、０．４μｍの平均細孔径を境界にして、ろ液中のＨＭＦおよびフルフラール濃度が増減することが判明した。本現象は、ＨＭＦおよびフルフラールを細胞内に取り込んだ微生物が固液分離によって死滅することで生成した、ＨＭＦおよびフルフラールを保持する微生物由来の断片が、精密ろ過膜でろ別されるか否かという境界が平均細孔径０．４μｍであったものと推察された。
【０１１５】
（比較例１）工程（３）の固液分離として遠心分離を行う場合
実施例１の工程（２）で得られた糖化発酵液１および糖化発酵液２（各１Ｌ分）を２５００Ｇで１０分間遠心分離した。得られた上清を参考例２〜４に記載の方法で分析を行った。なお比較のため、実施例１の工程（３）で得られた精密ろ過膜（ろ液）１および精密ろ過膜（ろ液）２の分析結果についても併せて表８に示す。
【０１１６】
【表８】
【０１１７】
遠心分離による固液分離では、精密ろ過膜による固液分離の場合と比べ、ＨＭＦおよびフルフラール成分が固液分離後の上清に多く含まれていることが判明した。遠心分離による固液分離では、ＨＭＦおよびフルフラールを含む微粒子成分が、十分に除去できていないものと推察された。
【０１１８】
次に、得られた上清成分０．８Ｌを、実施例１の工程（３）に記載の方法で、ナノろ過膜または逆浸透膜でろ過した。しかしながら、０．１Ｌ程度の透過液をろ過した時点から、ろ過困難となり濃縮液を得ることができなかった。これは、おそらく、微生物あるいはバイオマス由来の微粒子成分が多く残っており、ナノろ過膜または逆浸透膜の目詰まりが急速に進んだためと推察された。すなわち、ナノろ過膜処理または逆浸透膜処理を実施する観点において、少なくとも精密ろ過膜による固液分離が必要であることが判明した。
【０１１９】
（実施例４）工程（２）のキシロースを資化しない微生物による発酵が、工程（３）の精密ろ過膜による固液分離に与える影響
工程（２）のキシロースを資化しない微生物による発酵が、工程（３）の精密ろ過膜による固液分離に与える影響を確認するために、実施例１の工程（２）で調製した糖化液（微生物添加前）と、糖化発酵液１および糖化発酵液２の精密ろ過処理に与える影響を検討した。実施例１の工程（３）に記載の精密ろ過膜と同じ分離膜を設置した小型平膜ろ過装置において、膜フラックスを０．０５ｍ３／ｍ２／ｄａｙから０．４ｍ３／ｍ２／ｄａｙに変化させながら精密ろ過膜の膜間差圧（ｋＰａ）を測定した。その結果を図２に示す。
【０１２０】
糖化発酵液１および糖化発酵液２の膜フラックス変化による膜間差圧はほぼ同じ傾向であることが確認された。一方、糖化液（微生物添加前）では、糖化発酵液１および糖化発酵液２に比べて、より低い膜フラックスで膜間差圧が急激に上昇することが分かった。これは、糖化発酵液１および糖化発酵液２に比べ、糖化液（微生物添加前）の方が、ろ過性が悪いことを示している。いいかえると、本発明の工程（２）においてキシロースを資化しない微生物を添加して発酵させることで、工程（３）の精密ろ過膜のろ過性が向上することが判明した。この結果は、キシロースを資化しない微生物の発酵により、ＨＭＦ、フルフラール、バニリンといった芳香族・フラン化合物のみでなく、その他の精密ろ過膜の目詰まりの要因となるような未知物質の分解（あるいは吸着）した結果を示唆するものである。
【０１２１】
（比較例２）工程（２）でキシロースを資化しない微生物を添加しない場合
実施例１の工程（２）で得た糖化液（微生物添加前）に、キシロースを資化しない微生物を添加せずに実施例１の工程（３）に記載の手順で精密ろ過膜による固液分離およびナノろ過膜処理を行った。得られたキシロース糖液（比較例）の成分を表９に示す。また、成分比較のために実施例１の工程（２）の糖化液（微生物添加前）、実施例１の工程（３）のキシロース糖液１の成分も併せて表９に示す。
【０１２２】
【表９】
【０１２３】
キシロース糖液（比較例２）では、キシロースを資化しない微生物を添加していないため、グルコースがそのままナノろ過膜により濃縮された。また、キシロース糖液１と比較して、キシロース糖液（比較例２）ではＨＭＦ、フルフラール、バニリンの含量が多くなった。
【０１２４】
（実施例５）キシロース糖液を炭素源として微生物を培養することによる化学品の製造例（ピキア・スティピティスによるエタノール発酵）
キシロース糖液として、実施例１の工程（３）で得られたキシロース糖液１を微生物の炭素源として使用した。また比較のために、比較例２で得たキシロース糖液（比較例２）、実施例１の工程（２）で得られた糖化液を微生物の炭素源として使用した。
【０１２５】
微生物は、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＮＲＲＬ Ｙ−７１２４株を使用した。
【０１２６】
培地ならびにエタノール発酵条件は以下の条件で実施した。
【０１２７】
［前培養］
５％キシロース、１％酵母エキス（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ／ＢＤ社）、２％ポリペプトン（日本製薬）を５０ｍＬ蒸留水に２００ｍＬ三角フラスコに溶解後、１２０℃、２０分間高圧滅菌を実施した。得られた培地に、ポテトデキストロース寒天プレートで生育したピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＮＲＲＬ Ｙ−７１２４を植菌した。三角フラスコは、２８℃で２日間浸とう培養を行った。得られた前培養液は後述エタノール発酵に使用した。
【０１２８】
［エタノール発酵］
キシロース糖液１およびキシロース糖液（比較例２）には、キシロース濃度が５０ｇ／Ｌとなるように蒸留水を使用して希釈した。糖化液については糖濃度の調製は行わずそのまま使用した。さらにキシロース糖液１、キシロース糖液（比較例２）、糖化液には、１％酵母エキス（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ／ＢＤ社）、２％ポリペプトン（日本製薬）（すべて最終濃度）となるように添加し、１２０℃、２０分間高圧滅菌を実施した。得られた培地に前培養液を５ｍＬ添加し、２８℃でエタノール発酵を行った。
【０１２９】
培養液中に蓄積されたエタノールは、参考例４記載の方法に準じて分析した。エタノール発酵後０〜１２０時間後に生成したエタノールの推移を図３に示す。糖化液では、発酵産物であるエタノールがほとんど生産されないことが判明した。この理由として、１）グルコースおよびキシロースの糖濃度が低く炭素源が不足しているため、２）ＨＭＦ、フルフラール、バニリン、酢酸などの発酵阻害物質が多く含まれるため、と推察された。一方で、キシロース糖液１およびキシロース糖液（比較例２）では、発酵産物であるエタノールの生成蓄積が確認された。但し、キシロース糖液１の方がキシロース糖液（比較例２）よりも発酵産物であるエタノールの生成および蓄積量が多いことが判明した。なお、表９の分析値にあるように、キシロース糖液１とキシロース糖液（比較例２）ではキシロース糖濃度は同じであり、むしろ、キシロース糖液（比較例２）の方がキシロースに加えグルコース成分も含み、炭素源としては多く含むにもかかわらず、キシロース糖液１を炭素源とする場合において発酵成績が優れた理由として、キシロース糖液１の方が、ＨＭＦ、フルフラール、バニリン、などの発酵阻害物質の含重量が極めて少ないためであると考えられる。
【０１３０】
したがって、実施例５では、本発明により得られたキシロース糖液を炭素源として微生物を培養することで化学品を製造することができることが判明した。また、本発明により得られたキシロース糖液は、従来技術で得たキシロース糖液よりも微生物の炭素源として優れることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明で得られるキシロース糖液は、微生物の発酵原料、ひいては工業原料として広く利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシラン含有バイオマスからキシロース糖液を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、キシラン含有バイオマスから糖を製造し、この糖原料を使用したエタノールなどの化学品の発酵生産プロセスが盛んに研究されている。こうした糖の製造方法としては、濃硫酸を使用してバイオマスを酸加水分解して糖液を製造する方法（特許文献１、２）、バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後に、さらにセルラーゼなどの酵素処理することより糖液を製造する方法が開示されている（非特許文献１）。また酸を使用しない方法として、２５０〜５００℃程度の亜臨界水を使用しバイオマスを加水分解して糖液を製造する方法（特許文献３）、またバイオマスを亜臨界水処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許文献４）、バイオマスを２４０〜２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許文献５）が開示されている。こうした手法で得られる単糖は、キシロースのみでなく、グルコースも含んでなる。またこうした単糖が含まれる一方で、発酵阻害物質と呼ばれる、酢酸、ギ酸、ＨＭＦ、フルフラール、バニリン、といった低分子成分が含まれる（非特許文献２または３）。このような発酵阻害成分を多く含む糖液を炭素源として、エタノールなどの化学品を発酵生産する場合、微生物の増殖阻害、生産物の収率の低下を引き起こすことが課題となっている。こうした発酵阻害物質は、特に糖成分としてキシロースを炭素源として使用する微生物による生育あるいは発酵に悪影響があることが知られている（非特許文献４）。
【０００３】
こうした発酵阻害物質を糖液より除去する方法として、ナノろ過膜による発酵阻害物質の除去方法（特許文献６）が開示されている。具体的には、バイオマスから得られる発酵阻害物質を含む糖液を、ナノろ過膜に通じてろ過することにより、発酵阻害物質が透過液側から除去され、非透過液として発酵阻害物質が除去された糖液が得られることが開示されている。しかしながら、本技術においても発酵阻害物質のヒドロキシメチルフルフラール（以下、ＨＭＦとも言う。）の除去率について改善すべき余地があった。
【０００４】
その他、バイオマス由来の糖液に含まれる発酵阻害物質による発酵阻害を解決するための方法として、エタノールの発酵製造において、不純物耐性を有しかつエタノール発酵能を有する微生物をキシラン含有バイオマスから得られた糖液に添加して一次発酵を行った後、その後キシロース資化し、かつエタノール発酵能を有する微生物を添加し、二次発酵を行う方法が開示されている（特許文献７）。具体的には、一次発酵においてキシラン含有バイオマスから得られた糖液に含まれるＨＭＦといった発酵阻害物質は、酵母（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）による一次発酵中にその体内に取り込まれるため、二次発酵では発酵阻害物質による発酵阻害がおきずに、エタノールが効率よく製造されるとされている。しかしながら、前述の微生物（酵母）を使用した発酵阻害物質の除去においては、やはりギ酸、酢酸、レブリン酸といった有機酸の除去効果が少ないといった課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平１１−５０６９３４号公報
【特許文献２】特開２００５−２２９８２１号公報
【特許文献３】特開２００３−２１２８８８号公報
【特許文献４】特開２００１−９５５９７号公報
【特許文献５】特許３０４１３８０号公報
【特許文献６】ＷＯ２００９／１１０３７４
【特許文献７】特開２００５−２７００５６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】A. Adenら、“LignocellulosicBiomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NREL Technical Report (2002)
【非特許文献２】S. Larsonら、”The generation of fermentation inhibitors during dilute acid hydrolysis of softwood” Enzyme Microb. Technol.24.151-159. (1999)
【非特許文献３】HB. Klinkleら、“Inhibition of ethanol producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass”Appl. Microbiol. Biotechnol. 66. 10-26 (2004)
【非特許文献４】J.P.Delgenesら、“Effects of lignocellulose degradation products on ethanol fermentation of glucose and xyloseby Saccharomyces cerevisiase, Zymomonas mobilis, Pichia stipitis, and Candida shehatae”Enzyme Microbial. Technol. 19. 220-225.(1996)
【非特許文献５】M. Alfred ら、“Effect of pH, time and temperature of overliming on detoxification of dilute-acid hydrolyzates for fermentation by Saccaromyces cerevisiase”Process Biochemistry, 38,515-522 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のとおり、キシラン含有バイオマスよりキシロース糖液を製造して、これを微生物の発酵原料として利用する技術はあるが、キシロース糖液に含まれる発酵阻害物質を効率的に除去する方法に関しては、未だに多くの課題が残されていた。本発明では、キシラン含有バイオマスからキシロース糖液を製造するにあたり、発酵阻害物質の極めて少ないキシロース糖液を効率的に製造することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の［１］〜［７］の構成を有する。
【０００９】
［１］キシラン含有バイオマスより、キシロース糖液を製造する方法であって、
（１）キシラン含有バイオマスを水熱処理し、水熱処理物を得る工程、
（２）水熱処理物に糖化酵素を添加し、さらにキシロースを資化しない微生物を添加し、糖化発酵液を得る工程、
（３）糖化発酵液を、少なくとも精密ろ過膜を使用して固液分離し、得られたろ液をナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過し、非透過液より濃縮および精製されたキシロース溶液を得る工程、を含むキシロース糖液の製造方法。
【００１０】
［２］工程（１）の水熱処理物が、キシラン含有バイオマスを１８０〜３００℃の高圧熱水で処理した水熱処理液および／または水熱処理バイオマスである、［１］記載のキシロース糖液の製造方法。
【００１１】
［３］工程（２）の微生物が、サッカロミセス属およびカンジダ属の群から選ばれる微生物である、［１］または［２］に記載のキシロース糖液の製造方法。
【００１２】
［４］工程（３）の糖化発酵液をｐＨ１〜５の範囲に調整する、［１］〜［３］のいずれかに記載のキシロース糖液の製造方法。
【００１３】
［５］工程（３）の精密ろ過膜の平均細孔径が０．４μｍ以下である、［１］から［４］のいずれかに記載のキシロース糖液の製造方法。
【００１４】
［６］［５］記載のキシロース糖液を炭素源として微生物を培養することにより化学品を得る、化学品の製造方法。
【００１５】
［７］化学品がアルコールである、［６］記載の化学品の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、キシラン含有バイオマスからキシロース糖液を選択的に得ることができ、さらには得られるキシロース糖液からはＨＭＦ、フルフラール、バニリンなどの発酵阻害物質が除去されているため、該キシロース糖液をキシロースを資化する微生物の炭素源として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明のキシロース糖液の製造方法における手順を示す略図である。
【図２】図２は、本発明の固液分離において、精密ろ過膜を使用した際の膜フラックスと膜間差圧との関係性を示す図である。
【図３】図３は、本発明のキシロース製造方法で得たキシロース糖液を炭素源として微生物を培養することにより化学品（エタノール）を製造した例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
キシラン含有バイオマスは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、ビートパルプ、綿実殻、パーム空殻房、稲わら、麦わら、竹、笹、などの草本系バイオマス、あるいはシラカバ、ブナなどの樹木、廃建材などの木質系バイオマスに多量に含まれており、本発明ではこれらをキシロース糖液の原料として使用する。具体的には、キシラン含有バイオマスにはヘミセルロース成分であるキシラン、セルロース、芳香族高分子であるリグニン等を含まれており、本発明では、キシラン含有バイオマスを加水分解することで、キシロース糖液を得る。
【００１９】
本発明のキシロースの製造方法では、前述キシラン含有バイオマスを原料として、まず工程（１）として、キシラン含有バイオマスの水熱処理を行うことで、水熱処理物を得る。次に工程（１）で得られた水熱処理物に糖化酵素を添加することで、キシラン含有バイオマスの加水分解反応を行う。次にキシロースを資化しない微生物を添加し、グルコースを炭素源として生育させる。工程（２）では、糖化酵素およびキシロースを資化しない微生物の作用により糖化発酵液を得ることができる。次に工程（３）では、得られた糖化発酵液を少なくとも精密濾過膜を使用して固液分離し、キシラン含有バイオマスの未分解生物およびキシロースを資化しない微生物を除去したろ液を得る。得られたろ液は、ナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過することで、キシロース含有糖液を非透過液より濃縮および精製されたキシロース糖液を得る。
【００２０】
まず、工程（１）に関して説明する。
【００２１】
工程（１）では、キシラン含有バイオマスを水熱処理するための前処理工程について特に限定はないが、後述水熱処理の効率を向上させるため、適当な粒径・サイズに予めの裁断、微粉砕、などの処理を施すことが好ましい。
【００２２】
工程（１）の水熱処理の条件としては、キシラン含有バイオマスが、０．１〜５０重量％となるよう水を添加後、１００〜４００℃、好ましくは１８０〜３００℃の高圧熱水で、１秒〜６０分処理する。こうした温度条件において処理することにより、キシラン含有バイオマス中の成分である、キシラン、セルロース、リグニンなどの加水分解が起こる。処理回数は特に限定されず該処理を１回以上行えばよい。また、該処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。なお、工程（１）の水熱処理は、後述工程（２）で行う糖化酵素による糖化効率を向上させるための前処理であり、完全にキシランあるいはセルロースを加水分解する処理ではない。
【００２３】
キシラン含有バイオマスの水熱処理物は、水熱処理固体と水熱処理水より構成される。水熱処理固体には、主として、水熱処理で十分に分解できなかったセルロース、セロオリゴ糖、あるいはキシラン、キシロオリゴ糖、そしてリグニンなどが含まれる。一方、水熱処理水には、単糖、グルコース、キシロース、水溶性のセロオリゴ糖、水溶性のキシロオリゴ糖が含まれる。工程（１）の水熱処理物における水熱処理固体と水熱処理水の比率あるいは固体含量は特に限定されるものではない。また、水熱処理物を固液分離し、水熱処理水と水熱処理固体に分離しておき、それぞれの成分を水熱処理物として、後述の工程（２）に使用してもよい。水熱処理物を固形分離する手法例として、特開２０１０−２９８６２など水熱分解装置を使用する手法が例示でき、好ましく使用できる。
【００２４】
次に、工程（２）に関して説明する。
【００２５】
工程（２）の糖化酵素とは、水熱処理物のキシランあるいはセルロースを分解可能な酵素成分、すなわちセルラーゼあるいはヘミセルラーゼと呼ばれる酵素成分を含む酵素剤のことを指す。さらに詳細には、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼなどの酵素成分を含む酵素剤のことを指す。
【００２６】
糖化酵素に含まれる酵素成分に関して説明する。セロビオハイドラーゼとは、セルロースの末端部分から加水分解していくことを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドラーゼに帰属される酵素群が記載されている。エンドグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の中央部分から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４、ＥＣ３．２．１．６、ＥＣ３．２．１．３９、ＥＣ３．２．１．７３としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。エキソグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の末端から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．７４、ＥＣ３．２．１．５８としてエキソグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。βグルコシダーゼとは、セロオリゴ糖あるいはセロビオースに作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．２１としてβグルコシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。キシラナーゼとは、ヘミセルロースあるいは特にキシランに作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．８としてキシラナーゼに帰属される酵素群が記載されている。キシロシダーゼとは、キシロオリゴ糖に作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．３７としてキシロシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２７】
工程（２）の糖化酵素における前述の酵素成分の構成比は特に限定されないが、水熱処理物の糖化酵素による加水分解は、前述酵素成分が協奏的あるいは補完的に作用することで効率化されることが知られているため、複数の酵素成分を含んでなる酵素剤であることが好ましい。
【００２８】
工程（２）の糖化酵素は、好ましくはトリコデルマ属由来の糖化酵素である。トリコデルマ属の微生物は、前述した複数の酵素成分を、その培養過程で培養液に大量に分泌生産することが知られており、こうした培養液より糖化酵素を安価に大量に得ることができる。
【００２９】
前述のトリコデルマ属の微生物は、特に限定されないが、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が好ましく、具体的にはトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＲｕｔ Ｃ−３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ３−７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ９１２３）を例示することができる。また、前述のトリコデルマ属に由来する微生物であって、これらを変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、セルラーゼ生産性が向上した変異株であってもよい。
【００３０】
工程（２）の糖化酵素は、前述のトリコデルマ属の微生物がセルラーゼを産生するよう調整した培地中で、任意の期間該微生物を培養した培養上清より単離することができる。使用する培地成分は特に限定されないが、セルラーゼの産生を促進するために、セルロースあるいはセルロース含有バイオマスを添加した培地が一般的に使用できる。そして、こうした培養液を粗酵素物としてそのまま、あるいはトリコデルマ属の菌体を除去したのみの培養上清が好ましく使用される。またトリコデルマ属由来の糖化酵素に、さらに異種または同種のβグルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼを添加してもよい。また、トリコデルマ属の微生物に異種または同種のβグルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼの遺伝子を導入し、その培養液中に産生されるよう遺伝子組換えされたトリコデルマ属の微生物を培養し、その培養液を単離して得られた酵素を糖化酵素として使用してもよい。
【００３１】
前述した糖化酵素を、水熱処理物に添加することにより、セルロース、セロオリゴ糖、あるいはキシラン、キシロオリゴ糖の加水分解を行うことができる。この加水分解により、グルコースおよびキシロースを含む溶液を得ることができる。得られるグルコースおよびキシロース濃度は特に限定されないが、一般的に各々５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌ程度である。ここで得られるグルコースは、後述の「キシロースを資化しない微生物」の生育あるいは増殖の炭素源として消費される。
【００３２】
糖化酵素の添加量は、水熱処理物の十分な加水分解効率が得られる量であれば限定されるものではない。また、糖化酵素を添加後、糖化酵素の最適な反応温度およびｐＨ条件下で、１分〜２４０時間保温することで加水分解を行うことができる。糖化酵素として、前述トリコデルマ属由来糖化酵素を使用する場合、反応温度は４０〜６０℃の範囲、ｐＨは、３．０〜７．５の範囲で実施することが好ましい。
【００３３】
工程（２）の「キシロースを資化しない微生物」とは、五単糖であるキシロースを炭素源として資化しない、あるいはその資化速度が極めて遅い微生物のことを指す。通常、六単糖であるグルコースを炭素源として資化することが微生物の普遍的な特徴であるが、一方で、キシロースを炭素源として資化する能力が本来備わった微生物種が存在する。したがって、ここでいう「キシロースを資化しない微生物」とは、以下の特徴１）、２）を有する微生物を除外したすべての微生物を指す。
【００３４】
特徴１）キシロースを炭素源として資化する能力が本来高い微生物とは、キシロースの代謝経路が発達しており、キシロースを炭素源として細胞内に取り込み、特にペントースリン酸経路を経てキシロースの代謝を行う。こうした微生物としては、ピキア属、特にピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、カンジダ属、特にカンジダ・シェハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）、あるいはカンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、パチソレン属、パチソレン・タノフィリス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス属、特にサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エシェリシア属、特にエシェリシア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス属、特にバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ロドスポリディウム属、特にロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス属、特にリポマイセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙ）、ブレルタノマイセス属、特にブレスタノマイセス クランゼニー（Ｂｒｅｎｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｎｓｅｎｉｉ）などを例示することができる。ここで例示した微生物以外にも、キシロースを炭素源として利用できる微生物はこの範疇に含まれる。
【００３５】
特徴２）遺伝子組換え手法によりキシロースの資化性を付与された微生物とは、遺伝子組換え手法によって、特にキシロース代謝遺伝子を導入あるいは強化することでキシロースを資化できる微生物のことを指す。キシロース代謝性遺伝子としては、キシロースイソメラーゼ、キシロースレダクターゼ、キシリトースデヒドロゲナーゼ、キシルロースキナーゼなどの酵素を例示することができる。こうした遺伝子組換え手法によりキシロースの資化性を付与された微生物としては、特許第４１２４２７０号公報、特表２０１０−５０４７５６号公報などを例示できる。ここで例示した微生物以外にも、キシロースを炭素源として利用できる微生物はこの範疇に含まれる。
【００３６】
こうした「キシロースを資化しない微生物」のうち、好ましく使用できる微生物としては、真核微生物に属する微生物である。真核微生物とは、別名真菌と呼ばれ、さらに子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）に分類される。こうした真核微生物は、原核微生物に比べ水熱処理物に含まれる酢酸やフルフラールなどの低分子化合物に対する耐性が比較的高く、本発明で好ましく使用できる。
【００３７】
真核微生物の中でも、特にサッカロミセス属またはカンジダ属が好ましく使用できる。サッカロミセス属またはカンジダ属は、１）低分子化合物に対する耐性が比較的高く、水熱処理物中でもグルコースを炭素源とした生育が優れる点、２）ＨＭＦ、フルフラール、バニリンなどの芳香族アルデヒドまたはフランアルデヒド類の分解あるいは吸着に優れる点、から好ましく本発明に使用することができる。サッカロミセス属またはカンジダ属の中でも、さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビジエまたはカンジダ・グラブラータである。
【００３８】
こうしたキシロースを資化しない微生物は、キシロースを資化せずにグルコースなどの単糖を炭素源として生育することができるが、生育の過程で発酵産物を生成する微生物であってもよい。発酵産物としては特に限定されるものではないが、具体例としてアルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。なお、サッカロミセス・セレビジエまたはカンジダ・グラブラータは、エタノール発酵性を示すものが多く存在し、グルコースを炭素源として生育し、その発酵産物としてエタノールを好ましく産生しうる。
【００３９】
工程（２）では、水熱処理物に前述の糖化酵素およびキシロースを資化しない微生物を添加し糖化発酵液を製造する。この際、糖化酵素およびキシロースを資化しない微生物を同時に投入することで糖化発酵を同時に実施してもよいし、糖化酵素を添加し水熱処理物の糖化を実施した後に、キシロースを資化しない微生物を添加して発酵させてもよい。糖化発酵における反応時間、温度、糖化酵素の添加量は、使用する酵素あるいは微生物の特性などを鑑みて適宜条件設定すればよい。但し、工程（２）の糖化発酵では、キシロースを資化しない微生物の作用により１）グルコースを消費させ、糖液中のキシロース成分比率を増加させること、２）ＨＭＦ、フルフラール、バニリンなどの不純物を分解あるいは吸着させること、を目的とするため、糖化発酵の反応時間は、得られる糖化発酵液中のグルコースおよびＨＭＦ、フルフラール、バニリンなどの発酵阻害物質の濃度が所望の量まで十分低下するまでの反応時間を設定し処理することが好ましい。こうした反応時間は、微生物の投入量、水熱処理物に含まれるＨＭＦなどの含有量によって変動するが、１〜１５０時間の範囲で設定することができる。
【００４０】
工程（２）で得られる糖化発酵液には、キシロースを資化しない微生物の性質に依存して、グルコースから代謝変換された発酵産物が含まれる場合がある。仮に、エタノール発酵性の微生物を使用した場合、グルコースから生成したエタノールが糖化発酵液に含まれる。あるいは乳酸発酵性の微生物を使用した場合、グルコースから生成した乳酸が糖化発酵液に含まれる。こうした糖化発酵液に含まれる発酵産物量は、キシラン含有バイオマスから生成したグルコース量に依存する。この工程（２）の糖化発酵液中の発酵産物は、後述の工程（３）でナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過することで、ナノろ過膜透過液として除去してもよいし、あるいはさらにこの透過液を回収してもよい。
【００４１】
次に、工程（３）に関して説明する。
【００４２】
工程（３）では、糖化発酵液を少なくとも精密ろ過膜を使用して固液分離する。この固液分離により工程（２）の水熱処理物の糖化反応で未分解の固形物を除去する。ここでいう未分解の固形物には、糖化酵素で十分分解できなかったリグニン成分、セルロース成分、キシラン成分などが含まれ、また、工程（２）で投入した微生物も固液分離により未分解の固形物に含まれる。一方、精密ろ過膜を使用した固液分離により得られるろ液にはキシロースが含まれる。
【００４３】
工程（３）で使用される精密ろ過膜とは、メンブレンフィルトレーションと呼ばれ、圧力差を駆動力として、微粒子懸濁液から０．０１〜１０μｍ程度の粒子を分離除去できる分離膜である。すなわち精密ろ過膜の表面には０．０１〜１０μｍの範囲の細孔を有し、その細孔以上の微粒子成分は膜側に分離除去することができる。
【００４４】
工程（３）では、０．４μｍ以下の平均細孔径を有する精密ろ過膜を使用することが好ましい。０．４μｍ以下の平均細孔径を有する精密ろ過膜を使用することにより、糖化発酵液中に含まれる発酵阻害物質であるＨＭＦ、フルフラールを除去できる効果を有しており、より不純物の少ないキシロース糖液を製造することができる。こうした平均細孔径は、各分離膜メーカーが提示の公称径を採用してもよいし、実際に測定してもよい。精密ろ過膜の平均細孔径を測定する方法として、バブルポイント法がある。バブルポイント法とは、膜二次側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力を測定し、使用した液体の表面張力と圧力との関係式から平均細孔径を算出する手法である。具体的には、ＡＳＴＭ Ｆ３１６−０３（バブルポイント法）に準拠して測定することが可能であり、例えば、日本ベル株式会社製の貫通細孔分布／ガス透過性解析装置を用いて測定することができる。
【００４５】
精密ろ過膜の材質は、酢酸セルロース、芳香族ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリアクリロニトリル、セラミック、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））などが例示できるが特に限定されるものではないが、工程（３）で使用される精密ろ過膜の素材は、上述素材のうち、対汚性、薬品耐性、強度、ろ過性といった観点において、ポリフッ化ビニリデン製の精密ろ過膜であることが好ましい。
【００４６】
精密ろ過膜による精密ろ過の方法としては、圧ろ過、真空ろ過、クロスフローろ過、遠心ろ過などがあるが、膜の目詰まりが少ないクロスフローろ過であることが好ましい。またろ過操作として、定圧ろ過、定流量ろ過、非定圧非定流量ろ過に大別されるが特に限定されない。
【００４７】
工程（３）での固液分離は、少なくとも精密ろ過膜を使用して固液分離を行えばよいが、場合によっては、精密ろ過に加えて他の固液分離手法を組み合わせてもよく限定されるものではない。他の固液分離の手法の具体例としては、プレスろ過、遠心分離が挙げられる。
【００４８】
また、工程（３）の固液分離を行った後、得られるろ液を限外ろ過膜に通じてろ過処理することも好ましい態様の１つである。限外ろ過膜処理の効果として、１）工程（２）で使用する糖化酵素を回収、および再利用できるため経済性が向上すること、２）工程（３）のナノろ過膜および／または逆浸透膜における膜の目詰まりがさらに低下すること、３）キシロース糖液のアミノ酸あるいはタンパク質とのメイラード反応を抑制することができること、が挙げられる。使用する限外ろ過膜は、特に限定されないが、ポリエーテルサルホンなどの合成高分子性膜であることが好ましく、分画分子量１０００〜２０００００の限外ろ過膜を使用することが好ましい。
【００４９】
次に前述固液分離で得られたろ液成分を、ナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過することに関して説明する。
【００５０】
工程（３）における「ナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過する」とは、糖化発酵液を固液分離したろ液を、ナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過することであり、本操作により、溶解している糖、特にキシロース糖液を非透過側に阻止または濾別し、発酵阻害物質を透過液、あるいはろ液として透過させることができる。
【００５１】
ここでいう発酵阻害物質とは、セルロース含有バイオマスの加水分解で生成する化合物であり、かつ本発明の製造方法によって得られる糖液を原料とする発酵工程において前述の通り阻害的に作用する物質のことを指し、特にセルロース含有バイオマスの酸処理の工程で生成される、有機酸、フラン系化合物、フェノール系化合物に大きく分類される。
【００５２】
有機酸としては、酢酸、ギ酸、レブリン酸などが具体例として挙げられる。フラン系化合物としては、ＨＭＦ、フルフラールなどが挙げられる。こうした有機酸あるいはフラン系化合物は、単糖であるグルコースあるいはキシロースの分解による産物である。
【００５３】
また、フェノール系化合物としては、バニリン、アセトバニリン、バニリン酸、シリンガ酸、没食子酸、コニフェリルアルデヒド、ジヒドロコニフェニルアルコール、ハイドロキノン、カテコール、アセトグアイコン、ホモバニリン酸、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル誘導体（Ｈｉｂｂｅｒｔ’ｓ ｋｅｔｏｎｅｓ）などが具体例として挙げられ、これらの化合物はリグニンまたはリグニン前駆体に由来する。
【００５４】
工程（３）の精密ろ過膜による固液分離により得られたろ液には、発酵阻害物質として前記物質のうち少なくとも１種が含まれており、実際には複数種含まれている。なお、これらの発酵阻害物質は、薄相クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなど、一般的な分析手法により検出および定量することが可能である。
【００５５】
工程（３）で使用するナノろ過膜とは、ナノフィルター（ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜）とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。また、工程（３）で使用する逆浸透膜とはＲＯ膜とも呼ばれるものであり、「１価のイオンを含めて脱塩機能を有する膜」と一般的に定義される膜であり、数オングストロームから数ナノメートル程度の超微小空隙を有していると考えられる膜で、主として海水淡水化や超純水製造などイオン成分除去に用いられる。
【００５６】
工程（３）で使用するナノろ過膜および逆浸透膜の性能を評価する方法として、糖液に含まれる対象化合物（発酵阻害物質、あるいは単糖など）の透過率（％）を算出することで評価できる。透過率（％）の算出方法を式１に示す。
【００５７】
透過率（％）＝（透過側の対象化合物濃度／非透過液の対象化合物濃度）×１００・・・（式１）。
【００５８】
式１における対象化合物濃度は、高い精度と再現性を持って測定可能な分析手法であれば限定されないが、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーなどが好ましく使用できる。本発明で使用するナノろ過膜および／または逆浸透膜は、対象化合物が単糖である場合、その透過率が低い方が好ましく、その一方で対象化合物が発酵阻害物質である場合、その透過率が高いものが好ましい。
【００５９】
ナノろ過膜および／または逆浸透膜に供する糖液のｐＨは特に限定されないが、１〜５の範囲であることが好ましい。ｐＨが１未満であると長期間使用した際に膜が変性してフラックス、透過率といった膜性能が著しく低下し、ｐＨが５より大きいと酢酸、ギ酸、レブリン酸といった有機酸の除去率が著しく低下する場合があるためである。ナノろ過膜および／または逆浸透膜は膜表面が電荷を帯びているため溶液中にイオン化している物質の方が、イオン化していない物質に比べて除去または阻止しやすいことから、糖水溶液中に含まれる有機酸の含量が高い場合、あるいは高い除去効果が必要な場合、前記の範囲のｐＨに糖液を調整することで、その除去効率を飛躍的に向上させることができる。また、糖液のｐＨを１〜５に調整してナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過する効果として、膜のファウリング抑制効果がある。一般的にｐＨが低下するにつれて初期フラックス値は低下するが、特にキシラン含有バイオマス由来の糖液に限っては、前期ｐＨ条件である方が膜の長期安定性が保つことができる。
【００６０】
また、特に逆浸透膜においては、糖液のｐＨを１〜３に調製することがより好ましい。ナノ濾過膜同様、ｐＨが１未満であると長期間使用時に膜が変性してフラックス、透過率といった膜性能が著しく低下することは同様であるが、ｐＨが３より大きいと有機酸の除去率が十分得られないことがあるためである。これは、逆浸透膜はナノ濾過膜に対し孔径等が小さい等の理由により溶出成分のイオン性由来の電荷をより一層抑制しないと有機酸の有効半径であるイオン半径が大きくなり、ナノ濾過膜と同等の除去性能が保てないものと推察される。なお、逆浸透膜の中でも操作圧力を低減できる低圧・超低圧タイプの逆浸透膜を使用すれば、原水の調整ｐＨが３より大きい値であっても、低圧・超低圧タイプでない逆浸透膜と同等の有機酸除去率となり、ｐＨ調整に使用する酸使用量、および後工程の発酵工程におけるｐＨ調整に使用するアルカリ使用量を低減させる効果が得られ、また、有機酸の除去率が低圧・超低圧タイプではない逆浸透膜に比べて有機酸の除去率が向上するため、本発明において好ましく使用される。ここで低圧・超低圧タイプの逆浸透膜とは、０．７５ＭＰａの濾過圧、ｐＨ６．５において、膜単位面積当たりの塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）の透過流量（ｍ３／ｍ２／ｄａｙ）が０．４以上の逆浸透膜を指す。膜単位面積当たりの透過流量（膜透過流束または膜フラックス）の評価方法としては、透過液量および透過液量を採水した時間および膜面積を測定することで、式２によって算出することができる。
【００６１】
膜透過流束（ｍ３／ｍ２／ｄａｙ）＝透過液量／膜面積／採水時間・・・（式２）。
【００６２】
糖液のｐＨ調整に使用する酸もしくはアルカリは特に限定されるものではない。酸として好ましくは塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、より好ましくは発酵時の阻害が起こりにくい観点から硫酸、硝酸、リン酸、さらに好ましくは経済性の観点から硫酸である。アルカリとして好ましくは経済性の観点からアンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムとそれらを含む水溶液、より好ましくは膜ファウリングの観点から１価イオンであるアンモニア、ナトリウム、さらに好ましくは発酵時の阻害が起こりにくい観点からアンモニアである。
【００６３】
糖液のｐＨ調整を行う段階は、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜処理の前であればよい。またセルロース含有バイオマスの加水分解に酵素を利用する場合は、加水分解反応時にｐＨを５以下に調整しておいてもよい。また、限外濾過膜を利用して酵素を再利用するプロセスを利用する場合はｐＨを４以下まで低下させると酵素の失活が起こりやすいため限外濾過膜処理後の濾液をｐＨ調整することが好ましい。
【００６４】
本発明におけるナノ濾過膜および／または逆浸透膜に供する糖液の温度は特に限定されないが、使用する膜の濾過時の発酵阻害物除去能を高める目的で適宜設定することができる。具体的には、ナノ濾過膜で濾過する場合、糖液の温度が４０〜８０℃であれば、ナノ濾過膜の発酵阻害物質除去能が高まるため、好ましく設定される。ナノ濾過膜で濾過する場合の糖液の温度が４０℃以上の範囲から除去能が大きくなるものの、８０℃より高いとナノ濾過膜が変性してしまうことによって膜特性が失われることがあるからである。
【００６５】
また、逆浸透膜で濾過する場合、糖液の温度が１〜１５℃であれば、逆浸透膜の発酵阻害物質除去能が高まるため、好ましく設定される。逆浸透膜で濾過する場合の糖液の温度が１℃より低いと配管中の凍結により装置不良の原因となり、１５℃より高い場合は、損失低下に効果が大きく現れない。前記の温度制御は温度の高いと膜の膨張が起きてより分子量の大きいものが除去され、除去量も向上する傾向が得られ、温度が低いと膜の収縮が起きて膜の孔径が小さくなり糖の濾液側への損失が低減されることがあるからである。
【００６６】
本発明で使用されるナノ濾過膜の素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。複合膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載の、ポリスルホンを膜素材とする支持膜にポリアミドの機能層からなるナノフィルターを構成させた複合膜を用いることができる。
【００６７】
これらの中でも高耐圧性と高透水性、高溶質除去性能を兼ね備え、優れたポテンシャルを有する、ポリアミドを機能層とした複合膜が好ましい。操作圧力に対する耐久性と、高い透水性、阻止性能を維持できるためには、ポリアミドを機能層とし、それを多孔質膜や不織布からなる支持体で保持する構造のものが適している。また、ポリアミド半透膜としては、多官能アミンと多官能酸ハロゲン化物との重縮合反応により得られる架橋ポリアミドの機能層を支持体に有してなる複合半透膜が適している。
【００６８】
ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜において、ポリアミドを構成する単量体の好ましいカルボン酸成分としては、例えば、トリメシン酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸、トリメリット酸、ピロメット酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、ジフェニルカルボン酸、ピリジンカルボン酸などの芳香族カルボン酸が挙げられるが、製膜溶媒に対する溶解性を考慮すると、トリメシン酸、イソフタル酸、テレフタル酸、およびこれらの混合物がより好ましい。
【００６９】
前記ポリアミドを構成する単量体の好ましいアミン成分としては、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、ベンジジン、メチレンビスジアニリン、４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、ジアニシジン、３，３’，４−トリアミノビフェニルエーテル、３，３’，４，４’−テトラアミノビフェニルエーテル、３，３’−ジオキシベンジジン、１，８−ナフタレンジアミン、ｍ（ｐ）−モノメチルフェニレンジアミン、３，３’−モノメチルアミノ−４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、４，Ｎ，Ｎ’−（４−アミノベンゾイル）−ｐ（ｍ）−フェニレンジアミン−２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾイミダゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾオキサゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾチアゾール）等の芳香環を有する一級ジアミン、ピペラジン、ピペリジンまたはこれらの誘導体等の二級ジアミンが挙げられ、中でもピペラジンまたはピペリジンを単量体として含む架橋ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜は耐圧性、耐久性の他に、耐熱性、耐薬品性を有していることから好ましく用いられ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするナノろ過膜がより好ましく用いられる。架橋ピペラジンポリアミド系ナノろ過膜の具体例としては、東レ株式会社製の架橋ピペラジンポリアミド系ナノ濾過膜のＵＴＣ６０が挙げられる。
【００７０】
ナノ濾過膜は一般にスパイラル型の膜モジュールとして使用されるが、本発明で用いるナノ濾過膜も、スパイラル型の膜モジュールとして好ましく使用される。好ましいナノ濾過膜モジュールの具体例としては、例えば、酢酸セルロース系のナノ濾過膜であるＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ナノ濾過膜のＧＥｓｅｐａ、ポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００、ＮＦ−２７０またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０が挙げられ、より好ましくはポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分としたポリアミドを機能層とする東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０であり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分としたポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０である。
【００７１】
工程（２）におけるナノ濾過膜による濾過は、圧力をかけてもよく、その濾過圧は、０．１〜８ＭＰａの範囲であることが好ましい。濾過圧が０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるおそれがある。また、濾過圧が０．５〜７ＭＰａの範囲であれば、膜透過流束が高いことから、糖溶液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１〜６ＭＰａの範囲であることが特に好ましい。
【００７２】
本発明で使用される逆浸透膜の素材としては、酢酸セルロール系のポリマーを機能層とした複合膜（以下、酢酸セルロース系の逆浸透膜ともいう）またはポリアミドを機能層とした複合膜（以下、ポリアミド系の逆浸透膜ともいう）が挙げられる。ここで、酢酸セルロース系のポリマーとしては、酢酸セルロース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース等のセルロースの有機酸エステルの単独もしくはこれらの混合物並びに混合エステルを用いたものが挙げられる。ポリアミドとしては、脂肪族および／または芳香族のジアミンをモノマーとする線状ポリマーまたは架橋ポリマーが挙げられる。
【００７３】
本発明で使用される逆浸透膜の具体例としては、例えば、東レ株式会社製ポリアミド系逆浸透膜モジュールである超低圧タイプのＳＵＬ−Ｇ１０、ＳＵＬ−Ｇ２０、低圧タイプのＳＵ−７１０、ＳＵ−７２０、ＳＵ−７２０Ｆ、ＳＵ−７１０Ｌ、ＳＵ−７２０Ｌ、ＳＵ−７２０ＬＦ、ＳＵ−７２０Ｒ、ＳＵ−７１０Ｐ、ＳＵ−７２０Ｐの他、逆浸透膜としてＵＴＣ８０を含む高圧タイプのＳＵ−８１０、ＳＵ−８２０、ＳＵ−８２０Ｌ、ＳＵ−８２０ＦＡ、同社酢酸セルロース系逆浸透膜ＳＣ−Ｌ１００Ｒ、ＳＣ−Ｌ２００Ｒ、ＳＣ−１１００、ＳＣ−１２００、ＳＣ−２１００、ＳＣ−２２００、ＳＣ−３１００、ＳＣ−３２００、ＳＣ−８１００、ＳＣ−８２００、日東電工株式会社製ＮＴＲ−７５９ＨＲ、ＮＴＲ−７２９ＨＦ、ＮＴＲ−７０ＳＷＣ、ＥＳ１０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｕ、ＥＳ１５−Ｄ、ＥＳ１５−Ｕ、ＬＦ１０−Ｄ、アルファラバル製ＲＯ９８ｐＨｔ、ＲＯ９９、ＨＲ９８ＰＰ、ＣＥ４０４０Ｃ−３０Ｄ、ＧＥ製ＧＥ Ｓｅｐａ、Ｆｉｌｍｔｅｃ製ＢＷ３０−４０４０、ＴＷ３０−４０４０、ＸＬＥ−４０４０、ＬＰ−４０４０、ＬＥ−４０４０、ＳＷ３０−４０４０、ＳＷ３０ＨＲＬＥ−４０４０、ＫＯＣＨ製ＴＦＣ−ＨＲ、ＴＦＣ−ＵＬＰ、ＴＲＩＳＥＰ製ＡＣＭ−１、ＡＣＭ−２、ＡＣＭ−４などが挙げられる。
【００７４】
本発明では、逆浸透膜に通じてろ過することが好ましい。一般的に、ナノろ過膜を使用すると、キシロースの透過率が高くなり、非透過液としての回収できる量が低下する場合があるが、逆浸透膜であれば、非透過液としてキシロースを損失なく回収できる。したがって、ナノ濾過膜と逆浸透膜を組み合わせてキシロース糖液を得る場合、糖液をまずナノ濾過膜で濾過し、得られる濾過液をさらに逆浸透膜で濾過することにより、ナノろ過膜および逆浸透膜の非透過液からキシロール糖液を損失なく回収することができる。
【００７５】
前述の工程（３）により得られるキシロース糖液は、そのままでも工業原料として用いることができるが、さらに活性炭処理、イオン交換膜処理、晶析などの手法で精製処理を行ってもよい。
【００７６】
本発明により得られるキシロース糖液は、キシロース濃度が５０〜２００ｇ／Ｌであることが好ましい。キシロース濃度が低すぎると、工業原料としての使用が困難であり、２００ｇ／Ｌを超える範囲までキシロース糖液を濃縮することは、工程（３）におけるナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過する処理において、高い圧力を要すため経済的に好ましくない。
【００７７】
また、キシロース糖液に含まれる発酵阻害物質であるＨＭＦまたはフルフラールの濃度は、０〜１０００ｐｐｍの範囲であることが、該キシロース糖液を後述の微生物の炭素源として使用する場合において好ましい。
【００７８】
キシロース糖液の工業原料としての用途としては、食品添加剤、保存剤、香料などの用途が例示できる。また、本発明のキシロース糖液を原料として、さらに水素化反応することでキシリトールに変換することもでき、ガムなどの甘味料として使用することができる。また、キシロース糖液を炭素源として微生物を培養することにより、化学品を製造することができる。
【００７９】
以下、キシロース糖液を炭素源として微生物を培養することによる化学品の製造方法に関して説明する。
【００８０】
本発明により得られるキシロース糖液には、必要に応じて、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有させてもよい。さらに場合によっては、キシロースに加え、炭素源として、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなどを追加して、発酵原料として使用してもよい。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。
【００８１】
キシロース糖液を炭素源として微生物を培養する際の微生物は、キシロースを炭素源として利用できる微生物に限定される。それは、工程（２）の微生物の作用によりグルコースは、ほとんど消費されているためである。したがって、キシロースを炭素源として利用できる微生物以外は使用できない。
【００８２】
キシロースを炭素源として利用できる微生物の具体例としては、前述のとおり大きく２種に分類される。すなわち、本来キシロースを炭素源として資化できる微生物と、遺伝子組換え手法によりキシロースの資化性を付加した微生物である。
【００８３】
本来キシロースを炭素源として資化できる微生物の例としては、ピキア属、特にピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、カンジダ属、特にカンジダ・シェハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）、あるいはカンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、パチソレン属、パチソレン・タノフィリス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス属、特にサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エシェリシア属、特にエシェリシア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス属、特にバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ロドスポリディウム属、特にロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス属、特にリポマイセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙ）、ブレルタノマイセス属、特にブレスタノマイセス クランゼニー（Ｂｒｅｎｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｎｓｅｎｉｉ）などを例示することができる。こうした微生物のうち、好ましくは、エシェリシア・コリ（大腸菌）もしくはピキア・スティピティスであり、より好ましくは、ピキア・スティピティスである。
【００８４】
また、遺伝子組換え手法によりキシロースの資化性を付加した微生物の例としては、キシロース代謝遺伝子を導入した微生物を例示することができる。キシロース代謝性遺伝子としては、キシロースイソメラーゼ、キシロースレダクターゼ、キシリトースデヒドロゲナーゼ、キシルロースキナーゼなどの酵素を例示することができる。こうした遺伝子組換え手法によりキシロースの資化性を付与された微生物としては、特許第４１２４２７０号公報、特表２０１０−５０４７５６号公報などを例示できる。こうした微生物は、キシロースを炭素源として効率的に資化でき、かつ所望の発酵産物の生産能力を有する微生物であれば、特に限定されるものではない。
【００８５】
微生物の培養は、通常、培養する微生物の至適ｐＨおよび至適温度の範囲で行われる。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４〜８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００８６】
キシロース糖液を炭素源として微生物を培養する際、当業者に公知の発酵培養方法が採用されうるが、生産性の観点から、ＷＯ２００７／０９７２６０に開示される連続培養方法が好ましく採用される。
【００８７】
前述の化学品の製造方法により得られる化学品の具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸、ジアミンなど発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオール、グリセロールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、核酸であれば、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、またカダベリンなどのジアミン化合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。本発明において好ましく製造される化学品は、アルコールである。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８９】
（参考例１）糖化酵素の調整（トリコデルマ由来糖化酵素）
糖化酵素は以下の方法で調整した。
【００９０】
［前培養］
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加し、１００ｍＬを５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）添加した。この前培養培地にトリコデルマ・リーセイＰＣ３−７を１×１０５個／ｍＬになるように植菌し、２８℃、７２時間、１８０ｒｐｍで振とう培養し、前培養とした（振とう装置：ＴＡＩＴＥＣ社製 ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ−４０ＬＦ）。
【００９１】
［本培養］
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、セルロース（アビセル）１０％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム 0.2%（w/vol）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加し、２．５Ｌを５Ｌ容撹拌ジャー（ＡＢＬＥ社製 ＤＰＣ−２Ａ）容器に張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．１％添加し、あらかじめ前記の方法にて液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイＰＣ３−７を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃、８７時間、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍにて培養を行い、遠心分離後、上清を膜ろ過（ミリポア社製 ステリカップ−ＧＶ 材質：ＰＶＤＦ）した。この前述条件で調整した培養液に対し、βグルコシダーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８）をタンパク質重量比として、１／１００量添加し、これを糖化酵素として、以下実施例に使用した。
【００９２】
（参考例２）糖濃度の測定
本発明のグルコースおよびキシロース濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。なお水熱処理物、糖化液、糖化発酵液、キシロース糖液は、３５００Ｇで１０分間遠心分離を行い、その上清成分を下記分析に供した。
カラム：Ｌｕｎａ ＮＨ２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：ミリＱ：アセトニトリル＝２５：７５（流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：３０℃。
【００９３】
（参考例３）発酵阻害物質（ＨＭＦ、フルフラール、バニリン、酢酸、ギ酸）の分析
発酵阻害物質のうち、ＨＭＦ、フルフラール、バニリンは下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。なお水熱処理物、糖化液、糖化発酵液、キシロース糖液は、３５００Ｇで１０分間遠心分離を行い、その上清成分を下記分析に供した。
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ＨｉｄｒｏＲＰ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製）
移動相：アセトニトリル−０．１％ Ｈ３ＰＯ４（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：ＵＶ（２８３ｎｍ）
温度：４０℃。
【００９４】
酢酸、ギ酸は下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。なお水熱処理物、糖化液、糖化発酵液、キシロース糖液は、３５００Ｇで１０分間遠心分離を行い、その上清成分を下記分析に供した。
カラム：Ｓｈｉｍ−ＰａｃｋとＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＣＲ１０１Ｈ（株式会社島津製作所製）の直列
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【００９５】
（参考例４）エタノールの分析
エタノール蓄積濃度の測定には、ガスクロマトグラフ法により定量した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−２０１０キャピラリーＧＣ ＴＣ−１（ＧＬ ｓｃｉｅｎｃｅ） １５ ｍｅｔｅｒ Ｌ．＊０．５３ｍｍ Ｉ．Ｄ．，ｄｆ１．５μｍを用いて、水素塩イオン化検出器により検出・算出して評価した。
【００９６】
（実施例１）
工程（１）：キシラン含有バイオマスより水熱処理物を得る工程
キシラン含有バイオマスとして、稲藁を使用した。キシラン含有バイオマスを約１００μｍとなるようカッターミルで細断した。その後、キシラン含有バイオマスの固形分重量１５％となるように水を添加した。このキシラン含有バイオマス混合溶液を２００℃で１５分オートクレーブ処理（日東高圧製）した。処理後、固液物を軽く沈降させた後、上澄み成分を水熱処理物として使用した。この水熱処理物の固形物濃度は、約５％であった。実施例１の水熱処理物に含まれる成分組成を参考例２〜４の方法に準じて分析した。分析結果を表１に示す。
【００９７】
工程（２）：水熱処理物に糖化酵素を添加し、さらにキシロースを資化しない微生物を添加し、糖化発酵液を得る工程
工程（１）で調整した水熱処理物に参考例１で調整した糖化酵素を添加し、糖化を行った。糖化条件は以下の通りである。
［糖化条件］
水熱処理物：２Ｌ（実施例１で調製）
ｐＨ：５．０
糖化酵素：タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬとなる様に添加
反応温度および時間：５０℃、６時間。
【００９８】
上記条件で得られた糖化液の成分組成を参考例２〜４に準じて分析した結果を表１に示す。水熱処理物の糖化により、グルコース、キシロース成分が大幅に増加することが確認された。
【００９９】
次に、糖化液にキシロースを資化しない微生物を添加して発酵させた。キシロースを資化しない微生物としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣ−２（ワイン酵母）またはＣａｎｄｉｄａ ｇｒａｂｒａｔａ（ＮＢＲＣ１０３８５７）を使用した。上記２種のキシロースを資化しない微生物は、ＹＰＤ培地（２％グルコース、１％酵母エキス（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ／ＢＤ社）、２％ポリペプトン（日本製薬））にて、１日間２５℃で前培養を行った。次に、得られた培養液を、糖化後の前述水熱処理物に対し、１％（２０ｍＬ）となるように添加した。微生物を添加後、２５℃で２日間インキュベートした。この操作で得られたものを糖化発酵液とした。特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣ−２（ワイン酵母）を添加し調製した糖化発酵液を「糖化発酵液１」、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒａｂｒａｔａ（ＮＢＲＣ１０３８５７）を添加し調製した糖化発酵液を「糖化発酵液２」とした。糖化発酵液１および糖化発酵液２（いずれもｐＨ５．０）の成分組成を参考例２〜４に準じて分析した結果を表１に示す。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
キシロースを資化しない微生物の添加による発酵により、１）グルコースの選択的な消費とこれに伴う発酵産物であるエタノール生成、２）ＨＭＦ、フルフラール、バニリンの除去（消費）、が起きていることが確認できた。また、糖化発酵液１と糖化発酵液２の成分を比較により、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒａｂｒａｔａが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣ−２（ワイン酵母）よりもＨＭＦ、フルフラール、バニリンの除去に若干優れることが判明した。
【０１０２】
工程（３）：糖化発酵液を少なくとも精密ろ過膜で固液分離し、得られたろ液をナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過し、膜画分より濃縮および精製されたキシロース溶液を得る工程
まず、工程（２）で得られた糖化発酵液１および糖化発酵液２について、精密ろ過膜による固液分離を実施した。精密ろ過膜は、平均細孔径０．４μｍのポリサルホン製精密ろ過膜（ＧＥ社製）を使用した。小型平膜ろ過装置（ＧＥ製 Ｓｅｐａ（登録商標） ＣＦ ＩＩ Ｍｅｄ／Ｈｉｇｈ Ｆｏｕｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）において、精密ろ過膜を設置し、０．１ｍ３／ｍ２／ｄａｙの条件下で実施例２の糖化発酵液１、糖化発酵液２のクロスフローろ過を行い、膜透過液として、それぞれ精密ろ過膜ろ液１、精密ろ過膜ろ液２を得た。精密ろ過膜ろ液を参考例２〜４に準じて分析した結果を表２に示す。
【０１０３】
次に、精密ろ過膜による固液分離により得られた溶液成分１Ｌをナノろ過膜または逆浸透膜に通じてろ過した。ナノろ過膜として架橋ピペラジンポリアミド系ナノろ過膜“ＵＴＣ６０”（東レ株式会社製）、逆浸透膜として、架橋全芳香族ポリアミド系逆浸透膜“ＳＵＬ−Ｇ”（東レ株式会社製）を使用し、それぞれ小型平膜ろ過装置（ＧＥ製 Ｓｅｐａ（登録商標） ＣＦ ＩＩ Ｍｅｄ／Ｈｉｇｈ Ｆｏｕｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）にセットし、原水温度を２５℃、高圧ポンプの圧力を３ＭＰａでろ過処理を行い、０．８Ｌの透過液を得た。ナノろ過膜の非透過液（膜画分）として得られたキシロース溶液の成分組成を表２に、逆浸透膜の非透過液（膜画分）として得られたキシロース溶液の成分組成を表３示す。なお、糖化発酵液１を処理したものをキシロース糖液１、糖化発酵液２を処理したものをキシロース糖液２とした。
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
糖化発酵液１および糖化発酵液２（表１）に比べて、精密ろ過膜によって固液分離をした精密ろ過膜ろ液１および精密ろ過膜ろ液２（表２）の方が、ＨＭＦ、フルフラール、バニリンが低下することが判明した。また、ナノろ過膜または逆浸透膜に通じてろ過することで、キシロースを濃縮することができ、一方で、酢酸、ギ酸などの濃縮は低く抑えることができることが判明した。すなわち、キシロース濃度に対する酢酸、ギ酸の濃度は大幅に減少させながら、キシロース糖液を濃縮できることが判明した。また、ナノろ過膜でのキシロース濃縮（表２）と逆浸透膜でのキシロース濃縮（表３）を比較したところ、逆浸透膜の方がキシロースの損失が少なく濃縮できることが判明した。
【０１０７】
（実施例２）糖化発酵液のｐＨ調整がナノろ過膜または逆浸透膜ろ過に及ぼす影響
実施例３では、ｐＨ５．０の糖化発酵液を精密ろ過膜にて固液分離をした後、ナノろ過膜または逆浸透膜に通じてろ過処理している。したがって、ナノろ過膜または逆浸透膜処理時のｐＨは５．０である。本実施例では、実施例１の工程（２）で調製した糖化発酵液１のｐＨを、あらかじめｐＨ１、ｐＨ２．４、ｐＨ３．２、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０に調製した。ｐＨの調製には、０．１ＮのＮａＯＨ水溶液あるいは０．１Ｎの希硫酸溶液を使用して調製した。ｐＨ調製した糖化発酵液を、実施例１の工程（２）に記載の精密ろ過膜による固液分離を行った後に、ナノろ過膜または逆浸透膜に通じてろ過し、得られたキシロース糖液の成分比較を実施した。その結果を表４（ナノろ過膜処理）、および表５（逆浸透膜処理）に示す。
【０１０８】
【表４】
【０１０９】
【表５】
【０１１０】
ナノろ過膜および逆浸透膜のいずれの場合においても、ｐＨ５．０よりｐＨが大きいと有機酸成分、特に酢酸が濃縮されることが判明した。一方で、ｐＨ１．０〜５．０の範囲では、有機酸、特に酢酸を透過液として効率的に除去できるため、得られるキシロース糖液に含まれる酢酸濃度を低く抑えることができることが判明した。これは、ナノろ過膜または逆浸透膜に供される糖液のｐＨを１〜５の範囲に調整することで非解離状態の酢酸比率を増加させることにより、ナノろ過膜および逆浸透膜の透過性が向上したものと推察された。
【０１１１】
（実施例３）固液分離における精密ろ過膜の平均細孔径の効果
工程（３）の固液分離に使用する精密ろ過膜の平均細孔径の効果を確認するために、種々の平均細孔径を有する精密ろ過膜を使用して、糖化発酵液を固液分離して得られるろ液に含まれる成分比較を実施した。分離膜としては、ミリポア社製アイソポア（平均細孔径：０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、０．６μｍ、０．８μｍ、１．２μｍ）を使用した。本分離膜は、ポリカーボネートに対して電子線で細孔を形成しているため、孔径分布が極めて均一な精密ろ過膜である。前述精密ろ過膜を、攪拌式セル（Ｍｏｄｅｌ８０５０）にセットし、実施例１の工程（２）で得られた糖化発酵液１または糖化発酵液２の精密ろ過を行った。精密ろ過は、攪拌式セルに内径２ｍｍ×外径４ｍｍのシリコンチューブを連結し、一定流量でろ過を行った。得られたろ液を、参考例２〜４記載の方法で分析した結果を表６（糖化発酵液１の精密ろ過膜ろ液）および表７（糖化発酵液２の精密ろ過膜ろ液）に示す。
【０１１２】
【表６】
【０１１３】
【表７】
【０１１４】
糖化発酵液１および糖化発酵液２のいずれも、平均細孔径０．４μｍ以下の精密ろ過膜による固液分離によって、ろ液中のＨＭＦ、フルフラールの濃度を低く抑えることができることが判明した。なお、糖化発酵液１および糖化発酵液２で使用したキシロースを資化しない微生物は、サッカロミセス属またはカンジダ属の酵母であって、その菌体の大きさは１０μｍ前後であると言われており、一方、本実施例で使用される精密ろ過膜の平均細孔径は大きくとも１．２μｍであり、いずれの精密ろ過膜を使用した場合においても十分に微生物を固液分離することが可能であると考えられるが、本実施例では、０．４μｍの平均細孔径を境界にして、ろ液中のＨＭＦおよびフルフラール濃度が増減することが判明した。本現象は、ＨＭＦおよびフルフラールを細胞内に取り込んだ微生物が固液分離によって死滅することで生成した、ＨＭＦおよびフルフラールを保持する微生物由来の断片が、精密ろ過膜でろ別されるか否かという境界が平均細孔径０．４μｍであったものと推察された。
【０１１５】
（比較例１）工程（３）の固液分離として遠心分離を行う場合
実施例１の工程（２）で得られた糖化発酵液１および糖化発酵液２（各１Ｌ分）を２５００Ｇで１０分間遠心分離した。得られた上清を参考例２〜４に記載の方法で分析を行った。なお比較のため、実施例１の工程（３）で得られた精密ろ過膜（ろ液）１および精密ろ過膜（ろ液）２の分析結果についても併せて表８に示す。
【０１１６】
【表８】
【０１１７】
遠心分離による固液分離では、精密ろ過膜による固液分離の場合と比べ、ＨＭＦおよびフルフラール成分が固液分離後の上清に多く含まれていることが判明した。遠心分離による固液分離では、ＨＭＦおよびフルフラールを含む微粒子成分が、十分に除去できていないものと推察された。
【０１１８】
次に、得られた上清成分０．８Ｌを、実施例１の工程（３）に記載の方法で、ナノろ過膜または逆浸透膜でろ過した。しかしながら、０．１Ｌ程度の透過液をろ過した時点から、ろ過困難となり濃縮液を得ることができなかった。これは、おそらく、微生物あるいはバイオマス由来の微粒子成分が多く残っており、ナノろ過膜または逆浸透膜の目詰まりが急速に進んだためと推察された。すなわち、ナノろ過膜処理または逆浸透膜処理を実施する観点において、少なくとも精密ろ過膜による固液分離が必要であることが判明した。
【０１１９】
（実施例４）工程（２）のキシロースを資化しない微生物による発酵が、工程（３）の精密ろ過膜による固液分離に与える影響
工程（２）のキシロースを資化しない微生物による発酵が、工程（３）の精密ろ過膜による固液分離に与える影響を確認するために、実施例１の工程（２）で調製した糖化液（微生物添加前）と、糖化発酵液１および糖化発酵液２の精密ろ過処理に与える影響を検討した。実施例１の工程（３）に記載の精密ろ過膜と同じ分離膜を設置した小型平膜ろ過装置において、膜フラックスを０．０５ｍ３／ｍ２／ｄａｙから０．４ｍ３／ｍ２／ｄａｙに変化させながら精密ろ過膜の膜間差圧（ｋＰａ）を測定した。その結果を図２に示す。
【０１２０】
糖化発酵液１および糖化発酵液２の膜フラックス変化による膜間差圧はほぼ同じ傾向であることが確認された。一方、糖化液（微生物添加前）では、糖化発酵液１および糖化発酵液２に比べて、より低い膜フラックスで膜間差圧が急激に上昇することが分かった。これは、糖化発酵液１および糖化発酵液２に比べ、糖化液（微生物添加前）の方が、ろ過性が悪いことを示している。いいかえると、本発明の工程（２）においてキシロースを資化しない微生物を添加して発酵させることで、工程（３）の精密ろ過膜のろ過性が向上することが判明した。この結果は、キシロースを資化しない微生物の発酵により、ＨＭＦ、フルフラール、バニリンといった芳香族・フラン化合物のみでなく、その他の精密ろ過膜の目詰まりの要因となるような未知物質の分解（あるいは吸着）した結果を示唆するものである。
【０１２１】
（比較例２）工程（２）でキシロースを資化しない微生物を添加しない場合
実施例１の工程（２）で得た糖化液（微生物添加前）に、キシロースを資化しない微生物を添加せずに実施例１の工程（３）に記載の手順で精密ろ過膜による固液分離およびナノろ過膜処理を行った。得られたキシロース糖液（比較例）の成分を表９に示す。また、成分比較のために実施例１の工程（２）の糖化液（微生物添加前）、実施例１の工程（３）のキシロース糖液１の成分も併せて表９に示す。
【０１２２】
【表９】
【０１２３】
キシロース糖液（比較例２）では、キシロースを資化しない微生物を添加していないため、グルコースがそのままナノろ過膜により濃縮された。また、キシロース糖液１と比較して、キシロース糖液（比較例２）ではＨＭＦ、フルフラール、バニリンの含量が多くなった。
【０１２４】
（実施例５）キシロース糖液を炭素源として微生物を培養することによる化学品の製造例（ピキア・スティピティスによるエタノール発酵）
キシロース糖液として、実施例１の工程（３）で得られたキシロース糖液１を微生物の炭素源として使用した。また比較のために、比較例２で得たキシロース糖液（比較例２）、実施例１の工程（２）で得られた糖化液を微生物の炭素源として使用した。
【０１２５】
微生物は、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＮＲＲＬ Ｙ−７１２４株を使用した。
【０１２６】
培地ならびにエタノール発酵条件は以下の条件で実施した。
【０１２７】
［前培養］
５％キシロース、１％酵母エキス（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ／ＢＤ社）、２％ポリペプトン（日本製薬）を５０ｍＬ蒸留水に２００ｍＬ三角フラスコに溶解後、１２０℃、２０分間高圧滅菌を実施した。得られた培地に、ポテトデキストロース寒天プレートで生育したピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＮＲＲＬ Ｙ−７１２４を植菌した。三角フラスコは、２８℃で２日間浸とう培養を行った。得られた前培養液は後述エタノール発酵に使用した。
【０１２８】
［エタノール発酵］
キシロース糖液１およびキシロース糖液（比較例２）には、キシロース濃度が５０ｇ／Ｌとなるように蒸留水を使用して希釈した。糖化液については糖濃度の調製は行わずそのまま使用した。さらにキシロース糖液１、キシロース糖液（比較例２）、糖化液には、１％酵母エキス（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ／ＢＤ社）、２％ポリペプトン（日本製薬）（すべて最終濃度）となるように添加し、１２０℃、２０分間高圧滅菌を実施した。得られた培地に前培養液を５ｍＬ添加し、２８℃でエタノール発酵を行った。
【０１２９】
培養液中に蓄積されたエタノールは、参考例４記載の方法に準じて分析した。エタノール発酵後０〜１２０時間後に生成したエタノールの推移を図３に示す。糖化液では、発酵産物であるエタノールがほとんど生産されないことが判明した。この理由として、１）グルコースおよびキシロースの糖濃度が低く炭素源が不足しているため、２）ＨＭＦ、フルフラール、バニリン、酢酸などの発酵阻害物質が多く含まれるため、と推察された。一方で、キシロース糖液１およびキシロース糖液（比較例２）では、発酵産物であるエタノールの生成蓄積が確認された。但し、キシロース糖液１の方がキシロース糖液（比較例２）よりも発酵産物であるエタノールの生成および蓄積量が多いことが判明した。なお、表９の分析値にあるように、キシロース糖液１とキシロース糖液（比較例２）ではキシロース糖濃度は同じであり、むしろ、キシロース糖液（比較例２）の方がキシロースに加えグルコース成分も含み、炭素源としては多く含むにもかかわらず、キシロース糖液１を炭素源とする場合において発酵成績が優れた理由として、キシロース糖液１の方が、ＨＭＦ、フルフラール、バニリン、などの発酵阻害物質の含重量が極めて少ないためであると考えられる。
【０１３０】
したがって、実施例５では、本発明により得られたキシロース糖液を炭素源として微生物を培養することで化学品を製造することができることが判明した。また、本発明により得られたキシロース糖液は、従来技術で得たキシロース糖液よりも微生物の炭素源として優れることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明で得られるキシロース糖液は、微生物の発酵原料、ひいては工業原料として広く利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシラン含有バイオマスより、キシロース糖液を製造する方法であって、
（１）キシラン含有バイオマスを水熱処理し、水熱処理物を得る工程、
（２）水熱処理物に糖化酵素を添加し、さらにキシロースを資化しない微生物を添加し、糖化発酵液を得る工程、
（３）糖化発酵液を、少なくとも精密ろ過膜を使用して固液分離し、得られたろ液をナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過し、非透過液より濃縮および精製されたキシロース溶液を得る工程、を含むキシロース糖液の製造方法。
【請求項２】
工程（１）の水熱処理物が、キシラン含有バイオマスを１８０〜３００℃の高圧熱水で処理した水熱処理液および／または水熱処理バイオマスである請求項１記載のキシロース糖液の製造方法。
【請求項３】
工程（２）の微生物が、サッカロミセス属およびカンジダ属の群から選ばれる微生物である、請求項１または２に記載のキシロース糖液の製造方法。
【請求項４】
工程（３）の糖化発酵液をｐＨ１〜５の範囲に調整する、請求項１〜３のいずれかに記載のキシロース糖液の製造方法。
【請求項５】
工程（３）の精密ろ過膜の平均細孔径が０．４μｍ以下である、請求項１から４いずれかに記載のキシロース糖液の製造方法。
【請求項６】
請求項５記載のキシロース糖液を炭素源として微生物を培養することにより化学品を得る、化学品の製造方法。
【請求項７】
化学品がアルコールである、請求項６記載の化学品の製造方法。
【請求項１】
キシラン含有バイオマスより、キシロース糖液を製造する方法であって、
（１）キシラン含有バイオマスを水熱処理し、水熱処理物を得る工程、
（２）水熱処理物に糖化酵素を添加し、さらにキシロースを資化しない微生物を添加し、糖化発酵液を得る工程、
（３）糖化発酵液を、少なくとも精密ろ過膜を使用して固液分離し、得られたろ液をナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過し、非透過液より濃縮および精製されたキシロース溶液を得る工程、を含むキシロース糖液の製造方法。
【請求項２】
工程（１）の水熱処理物が、キシラン含有バイオマスを１８０〜３００℃の高圧熱水で処理した水熱処理液および／または水熱処理バイオマスである請求項１記載のキシロース糖液の製造方法。
【請求項３】
工程（２）の微生物が、サッカロミセス属およびカンジダ属の群から選ばれる微生物である、請求項１または２に記載のキシロース糖液の製造方法。
【請求項４】
工程（３）の糖化発酵液をｐＨ１〜５の範囲に調整する、請求項１〜３のいずれかに記載のキシロース糖液の製造方法。
【請求項５】
工程（３）の精密ろ過膜の平均細孔径が０．４μｍ以下である、請求項１から４いずれかに記載のキシロース糖液の製造方法。
【請求項６】
請求項５記載のキシロース糖液を炭素源として微生物を培養することにより化学品を得る、化学品の製造方法。
【請求項７】
化学品がアルコールである、請求項６記載の化学品の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−２０５９８７（Ｐ２０１１−２０５９８７Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７７８７１（Ｐ２０１０−７７８７１）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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