キメラＨＩＶ−１糖タンパク質およびそれらの生物学的用途
ｇｐ１２０可変領域Ｖ１および／またはＶ２の少なくとも一部が、特異的体液性免疫反応を誘導することができるＣＤ４誘導エピトープまたはＣＤ４ｉの露出を達成するためにＣＤ４由来配列によって置換されている、キメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラｇｐ１２０糖タンパク質およびそれらの生物学的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
あまねく中和抗体を惹起することができる保存免疫原は、有効なＨＩＶ−１ワクチンの重要な成分であり得る。ＨＩＶ−１エンベロープを構成するタンパク質、表面ユニット（ＳＵ）糖タンパク質（ｇｐ１２０）およびｇｐ４１膜貫通（ＴＭ）糖タンパクは、中和予防的防御を発現させるための有望なターゲットである。感染した個体から分離された防御性モノクローナル抗体は、エンベロープ糖タンパク質上の幾つかの中和エピトープを示した。それらは、ＴＭ ｇｐ４１における幾つかの領域と、受容体結合ばかりでなくＶ２およびＶ３可変ループにも関係するＳＵ ｇｐ１２０内の保存構造（これらは、高免疫原性であり、従って、タイプ特異的抗体のみを誘導する）とを含む。しかし、これらの中和エピトープに対する抗体を生成させることは難しかった。主として、体液性免疫系へのエピトープ露出、特に受容体結合部位の減少に有意に寄与する、エンベロープ糖タンパク質の強い可変性および感染中に変化し得るその高いグリコシル化レベルのためである。
【０００３】
細胞感染前のＨＩＶへの可能な干渉を捜す上で、受容体結合部位およびそれらのごく近傍は、ＨＩＶ−１ワクチンの特に魅力的なターゲットである。ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質は、細胞受容体ＣＤ４に、そしてケモカイン受容体ファミリーのメンバー（主として、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４）に、順次結合する。ＣＤ４へのｇｐ１２０の結合は、ｇｐ１２０糖タンパク質の配座変化を誘導し、それによりｇｐ１２０共受容体結合部位、いわゆるＣＤ４誘導（ＣＤ４ｉ）エピトープ、が露出する。この後者は、ｇｐ１２０の最も保存される表面の１つであり、ＣＤ４結合部位よりも多い。共受容体結合は、後のウイルス−細胞融合のための最も重要な段階の１つであり、従って、ＨＩＶ−１感染症にとってきわめて重大であるので、エンベロープｇｐ１２０上のＣＤ４誘導（ＣＤ４ｉ）エピトープに特異的な抗体は、種々のＨＩＶ−１分離株による感染をあまねく阻止するために特に有用であろう。共受容体結合を阻止する幾つかのそうしたＣＤ４ｉ抗体が同定および特性付けされている。１７ｂと呼ばれる、それらの１つは、ＨＩＶ−１感染個体から分離されたものであり、一部のＴ細胞系統適応（ＴＣＬＡ）ＨＩＶ−１株を中和することができるが、初代分離株を中和することはあまりできない。もう１つのＣＤ４ｉ結合抗体であるＥ５１は、分離された初代ＨＩＶ−１に対する、より強力な中和応答を誘導する。ＣＤ４結合配座を認識し、初代ＨＩＶ−１分離株を効率的に中和するこれらの抗体の限られた数は、露出されるエピトープが、特異的体液性免疫反応を誘導するために効率的でない場合があること示す。従って、このエピトープおよびその近傍を永続的に提示できる分子を構築することは、非常に関心をひくであろう。
【０００４】
幾つかの戦略が、ｇｐ１２０上のＣＤ４ｉエピトープを露出させるために利用された。ｇｐ１２０の可変ループからの特定のＮ結合グリコシル化部位の除去は、これらの突然変異ウイルスを、ＣＤ４ｉ抗体によってより中和されやすくした。ｇｐ１２０とヒトＣＤ４の４つの細胞外ドメインとの可溶性架橋複合体が構築された。それらは、交差反応性中和活性を有する抗体をはじめとする、広範な初代ＨＩＶ−１分離株に対する中和抗体を生成する。可溶性タンパク質は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を刺激するが、ＨＩＶ−１感染症の制御に重要であることが知られている、ＣＤ８＋ Ｔ細胞媒介免疫反応を効率的に誘導しない。これらの問題を克服するための代替アプローチは、ｇｐ１２０−ＣＤ４複合中間体を模倣する一本鎖ポリペプチドの構築である。アミノ酸数２０のリンカーによりＣＤ４の最初の２つのドメインに連結されたＨＩＶ−１ ｇｐ１２０タンパク質が構築され、これは、ＣＤ４ｉエピトープの露出増加を示したが、ウイルス中和は媒介しなかった。より最近、ＪＲＬＦ ｇｐ１２０タンパク質を、ＣＤ４の同じＤ１およびＤ２ドメインに、またはＣＤ４のＣＤＲ２様ループを再生産するＣＤ４構造由来配列、ＣＤ４Ｍ９に接合させることによって、他の融合タンパク質が構築された。唯一ｇｐ１２０−ＣＤ４D12分子は、中和抗体を誘導したが、もっぱらＣＤ４に対するものであるようである。
【０００５】
ｇｐ１２０糖タンパク質の可変領域、Ｖ１／Ｖ２は、細胞受容体および共受容体のための結合部位を部分的に塞ぐという仮説が以前に立てられていたので、ｇｐ１２０ Ｖ２およびＶ１／Ｖ２ループの欠損研究は、向上した中和活性を示すＣＤ４ｉエピトープの露出を増加させる結果となった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、ＣＤ４由来の配列によってｇｐ１２０の特定の領域を置換することにより、リンカー配列または架橋剤を使用することなく、可変トランス配座ｇｐ１２０由来分子を得ることができることを発見した。そうしたキメラの研究を行って、それらが免疫原性であること、および特定のケモカイン（単数または複数）との組み合わせでワクチン／殺菌剤用途のための効力ある製品になることを明らかにした。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、キメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質を提供することである。
【０００８】
本発明のもう１つの目的は、そうした分子をコードするＤＮＡ構築物を提供することを目指す。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、前記キメラｇｐ１２０糖タンパク質の免疫学的および医薬的用途にも関する。
【００１０】
本発明のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質は、ｇｐ１２０可変領域Ｖ１および／またはＶ２の少なくとも一部が、ＣＤ４構造由来配列によって置換されていることを特徴とする。
【００１１】
結果として生じるキメラは、野生型ｇｐ１２０のものと類似したサイズおよび構造を有し、ならびにｇｐ１２０／ＣＤ４複合体の特性の大部分、特に、天然ＣＣＲ５受容体を認識するその能力および特異的体液性免疫反応を誘導することができるＣＤ４ｉエピトープを露出させるその能力を模倣する能力を示す。
【００１２】
好ましいキメラ糖タンパク質では、ＣＤ４由来配列が、Ｖ１可変領域と、Ｖ２可変領域の一部とを置換している。
【００１３】
有利には、前記ＣＤ構造由来（ｓｄＣＤ４）ペプチドは、ヒトＣＤ４受容体のＣＤＲ２様ループを模倣する。
【００１４】
好ましくは、前記ＣＤ４由来ペプチドは、ＣＤ４の１５〜３５のアミノ酸、とりわけ２０〜３０のアミノ酸を含む。
【００１５】
価値のあるＣＤ４構造由来ペプチドは、例えば、２８のアミノ酸を有し、有利には、配列番号５ ＣＮＬＥＡＣＱＫＲＣＱＳＬＧＬＱＧＫＣＡＧＳＦＣＡＣの配列を有する。
【００１６】
前記キメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０分子において、ＣＤ４由来配列は、有利には、Ｖ１と、Ｖ２ループからの１０〜２０のアミノ酸、例えば、Ｖ２ループの１６のアミノ酸とを置換している。
【００１７】
上で開示したキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質は、それらが抗ＣＤ４ｉモノクローナル抗体によって認識されるが、抗ＣＤ４抗体によって認識されないことを、さらに特徴とする。
【００１８】
さらにまた、本発明のキメラ糖タンパク質は、実施例において例証するように、ＣＧ１０、Ｅ５１およびＬＦ１７モノクローナル抗体によって認識される。
【００１９】
本発明のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質は、それらがＣＤ４受容体およびＣＣＲ５共受容体に結合することを、なお、特徴とする。
【００２０】
本発明は、上で開示したキメラ分子中の露出されたＣＤ４ｉエピトープに向けられた免疫処理用製品、抗血清および抗体にも関する。
【００２１】
前記抗体は、ポリクローナル抗体、例えば、動物に免疫し、その抗血清から回収することにより得られたポリクローナル抗体を含む。それらは、モノクローナル抗体、例えば、骨髄腫細胞とリンパ球（特に、上で定義したものなどのキメラ分子の注射によって事前に免疫した動物の脾臓または神経節のリンパ球）を融合させ、得られたハイブリドーマの上清を、例えばＥＬＩＳＡまたはＩＦＩ技術に従ってスクリーニングして、本キメラ分子に特異的に向けられた抗体を明らかにすることにより得られたもの、も含む。
【００２２】
これらのモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ株も本発明の一部である。
【００２３】
上で開示したキメラ分子をコードするＤＮＡ構築物も本発明の一部である。
【００２４】
有利には、これらのＤＮＡ構築物は、野生型ｇｐ１２０分子をコードするＤＮＡにおいて、ＣＤ４由来ペプチドをコードするフラグメントでＶ１および／またはＶ２ ｇｐ１２０可変領域をコードするフラグメントを置換することによって得られる。有利には、これらのフラグメントは、合成経路によって得られる。
【００２５】
その後、それらのＤＮＡ構築物を発現ベクターにおいてサブクローニングし、細胞のトランスフェクションのために使用する。
【００２６】
上に開示したキメラＨＩＶ−１構築物は、単独で、または組み合わせで、ＨＩＶ−１による感染症の予防に有用な特異的体液性免疫反応を誘導することができ、強力な免疫原性ツールでもある。
【００２７】
ＴＬＲリガンド、例えばＴＬＲ９リガンド（例えば、ＣｐＧ様モチーフ）を伴う本発明のキメラＨＩＶ−１構築物は、特に有用である。
【００２８】
対象となる他の組み合わせは、前記キメラ構築物とＩＬ−２２および／またはＣＣＬ２８を含む。
【００２９】
上で定義したものなどの特に好ましい組み合わせでのキメラ構築物は、例えば本実施例において開示するものなどのキメラ１および２である。
【００３０】
従って、本発明は、少なくとも１つのキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質（上で定義したとおり）の有効量と担体を含む、ＨＩＶ−１感染症に特異的なワクチン組成物に関する。
【００３１】
当業者は、前記ワクチン組成物の調合および用量を、所望される投与方法および考慮している患者（年齢、体重）に応じて、明らかにし、調整することができる。
【００３２】
これらの組成物は、１つ以上の生理学的に不活性なビヒクル、および特に、調合におよび／または所望される投与方法に適する賦形剤を含む。
【００３３】
本発明は、上で定義したものなどのＴＬＲリガンド、ＩＩ−２２および／またはＣＣＬ２８をさらに含むＨＩＶ−１感染症に特異的なワクチン組成物にも関する。
【００３４】
本発明は、ＨＩＶ−１感染症の存在または不在の診断のための、少なくとも１つの抗体（例えば、上で定義したもの）の、有効量での使用も目的とする。
【００３５】
本発明は、ＨＩＶ感染症を緩和および／または予防および／または治療するための組成物、特に医薬組成物を製造するための、抗体（例えば、上で定義したもの）の任意の使用も目的とする。
【００３６】
本発明の他の特徴および利点は、図１〜１９に関連して後続の実施例において与えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
材料および方法
細胞系統および抗体
すべての哺乳動物株細胞を５％ ＣＯ2雰囲気中、３７℃で維持した。
【００３８】
組み込まれたＨＩＶ ＬＴＲ−ｌａｃＺ（１）を有するＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５（ＣＤ４+／ＣＣＲ５+）およびＴａｔ発現性ＨｅＬａを使用した（Ｐ．Ｃｈａｒｎｅａｕ ａｎｄ Ｏ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ（フランス、パリのＰａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、これらの株細胞を成長させた。５０μｇ／ｍＬのヒグロマイシンＢおよび２ｍＭ メトトレキサートに加えて４００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）も、両方の細胞に、それぞれ補足した。
【００３９】
１０％ＦＢＳ、ゲンタマイシンおよび４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含有する改良型変性イーグル培地中で、ヒト胚性腎細胞（２９３Ｔ−ＨＥＫ）を培養した。
【００４０】
米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（メリーランド州、ロックヴィル）から入手したＣＤ４陽性ヒトリンパ球様細胞（ＣＥＭ）を、１０％ＦＢＳおよびゲンタマイシンを補足したＲＰＭＩ １６４０培地中で成長させた。
【００４１】
イヌ胎仔胸腺細胞（Ｃｆ２ＴｈＲ５−ＣＣＲ５+）を使用し（マサチューセッツ州、ボストン、Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＪ．Ｓｏｄｒｏｓｋｉ）、１０％ＦＢＳ、ゲンタマイシンおよび４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含有するＤＭＥＭ中で培養した。
【００４２】
変性させ、１０％ＦＢＳを補足したＴＣ１００培地（メリーランド州、ゲーサーズバーグのＧＩＢＣＯ ＢＲＬ ＬＩＦＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、２８℃で、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）昆虫細胞を増殖させた。
【００４３】
ヒツジポリクローナル抗ｇｐ１２０抗体Ｄ７３２４は、Ａａｌｔｏ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ（アイルランド、ダブリン）から入手した。
【００４４】
ウサギ抗ｇｐ１２０抗血清は、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌ Ｃｏｒｐ（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）で購入した組換えＨＩＶ−１ＩＩＩＢ ｇｐ１２０でウサギを免疫した後、研究室において製造した。
【００４５】
ヒトＣＤ４ｉモノクローナル抗体（ＭＡｂ）４．８Ｄ（２）Ｅ５１（３）およびＬＦ１７を使用した（Ｊ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（ルイジアナ州、ニューオリンズのＴｕｌａｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））。
【００４６】
ＣＤ４ｉ特異的ＭＡｂ ＣＧ１０は、Ｄｒ．Ｊ．Ｇｅｒｓｈｏｎｉ（イスラエル、テルアビブのＧｅｏｒｇｅ Ｗｉｓｅ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から得た。
【００４７】
ヒトＭＡｂ Ｆ１０５（４）を使用した（Ｍ．Ｐｏｓｎｅｒ（マサチューセッツ州、ボストンのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ））。
【００４８】
可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）は、Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ Ｃｏｒｐ．（ニューヨーク州、タリータウン）から購入した。
【００４９】
ＤＮＡ構築物
ＨＩＶ−１ ＹＵ２ ｇｐ１６０エンベロープＤＮＡを、ｐＴＺ−ＹＵ２（ＨＩＶ−１ ＹＵ２の全配列を含有するプラスミド）をテンプレートとして使用して、ＰＣＲによって増幅させた。配列番号１〜４をそれぞれ有する以下のプライマーを使用した。
ｐＳＶＩＩＩｅｎｖ構築のために、
フォワードとして、配列番号１：５’ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＧＡＣＧＧＡＧＡＴＣ（下線を引いたＫｐｎｌ部位を含有する）、および
リバースとして、配列番号２：５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＴＡＧＣＡ ＡＡＧＣＴＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＣＣ（下線を引いたＢａｍＨＩ部位を含有する）；ならびに
ｐＣＥＬ／Ｅ１６０構築のために、
フォワードとして、配列番号３：５’ ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＡＴＧＡＧＡＧＣＧＡＣＧＧＡＧＡＴＣ（下線を引いたＸｈｏｌ部位を含有する）、および
リバースとして、配列番号：５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＧＣＴＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＣＣ（下線を引いたＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する）。
【００５０】
Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖiｔｒｏｇｅｎ）を使用して生じさせたＰＣＲ生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。
【００５１】
由来するＣＤ４構造（配列番号５ ＣＮＬＥＡＣＱＫＲＣＱＳＬＧＬＱＧＫＣＡＧＳＦＣＡＣ）に対応する、合成により生じさせたフラグメントで、野生型ｇｐ１６０におけるＮｓｉｌ−Ｓｔｕｌカセットを置換することにより、ｇｐ１６０キメラをコードするＤＮＡフラグメントを構築した。
【００５２】
その後、これらの構築物をｐＳＶＩＩＩｅｎｖにサブクローニングして、ＢａｍＨＩ／Ｋｐｎｌ制限酵素の使用して野生型ｇｐ１６０をコードするＤＮＡフラグメントを置換し、ならびにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（マサチューセッツ州、ベヴァリーのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｇｉｏｌａｂｓ）によって平滑末端形を形成することによりサイトメガロウイルスＣＭＶプロモーターを有するｐＣＥＬ／Ｅ１６０ ＨＩＶ−１エンベロープ発現ベクターにもサブクローニングした。
【００５３】
野生型ｇｐ１２０タンパク質の発現のためのｐ１１９Ｌバキュロウイルストランスファーベクターは、以前に説明されている（４）とおり構築した。
【００５４】
配列番号６および７の配列を有する以下のプライマーを使用して、ｇｐ１２０キメラをコードするＤＮＡフラグメントを構築した：
フォワードとして、配列番号６：５’ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＴＣＴＴＡＴＧ（下線を引いたＨｐａｌ部位を含有する）、および
リバースとして、配列番号７：５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＴＡＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡ ＣＣＡ（下線を引いたＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する）。これらのＰＣＲ生成物をｐ１１９Ｌにクローニングして、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素の使用により野生型ｇｐ１２０配列を交換した。
【００５５】
タンパク質発現および精製
ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬（ドイツ、マンハイムのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用して、ｐ１０プロモーター（５）およびｇｐ１２０キメラを含有するｐ１１９Ｌトランスファーベクターの制御下、ポリヘドリン遺伝子を発現するウイルスＡｃＳＬＰ１０ ＤＮＡでＳｆ９昆虫細胞をコトランスフェクトすることにより、ｇｐ１２０エンベロープキメラを生産した。コトランスフェクションの４日後、上清を回収し、組換えウイルスプラークをプラークアッセイ（６）によって選択した。可能性のある組換えプラークを、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素での消化およびウエスタンブロット分析によってスクリーニングした。以前に説明されている（７）ような２つのタイプのカラム、セファロースＣｏＡゲルカラム（英国、バッキンガムシアのＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌｔｄ．）およびデキストランスルフェートゲルカラム（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、プールされた上清からエンベロープタンパク質を精製した。
【００５６】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
４℃で一晩、１０ｇ／ｍＬの抗ｇｐ１２０ Ｄ７３２４でマイクロタイタープレートを被覆した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間、３７℃でプレートをブロックし、その後、ＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。ＰＢＳ−１０％ＦＢＳで希釈した、可溶性ｇｐ１２０ＹＵ２およびキメラタンパク質を、ｓＣＤ４（２０μｇ／ｍＬ）の存在下または不在下、３７℃で１時間、インキュベートし、その後、その被覆抗体と共に１時間、３７℃でインキュベートした。その後、ＭＡｂの系列希釈物を捕捉タンパク質と共にインキュベートし、結合した抗体を１／１０，０００希釈でのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびｏ−フェニレンジアミン基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で検出した。５〜１０分後、２Ｍ Ｈ2ＳＯ4の添加により、呈色反応を停止させ、４９０ｎｍでの吸収を測定した。
【００５７】
表面プラズモン共鳴分析
実験は、ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００装置（スウェーデン、ウプサラのＢＩＡＣＯＲＥ）を使用して、ＨＢＳ−ＥＰ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％非イオン性界面活性剤 Ｐ２０、ｐＨ７．４）中、２５℃で行った。ＣＤ４ｉ ＭＡｂへのキメラタンパク質の親和性結合を判定するために、それらを、アミンカップリングを使用してＣＭ４センサーチップ表面に固定した。野生型ｇｐ１２０ＹＵ２を３７℃で１時間、ｓＣＤ４と予備混合した後、注入した。解離期の後に１０ｍＭ ＨＣｌでの再生段階を続けた。得られたすべてのセンサーグラムを、対照参照表面からのシグナルを引くことにより補正した。１：１ラングミュアモデルを使用して、会合および解離データを一致させた。
【００５８】
細胞表面受容体結合
合計２×１０5個のＣＥＭ（ＣＤ４+／ＣＣＲ５-）細胞またはＣｆ２ＴｈＲ５（ＣＣＲ５+）細胞をＰＢＳ−０．３％ＢＳＡで２回洗浄し、ｓＣＤ４（２０μｇ／ｍＬ）を伴うまたは伴わない１μｇ／ｍＬの野生型ｇｐ１２０またはキメラタンパク質と共にインキュベートした。１時間、３７℃で、抗ｇｐ１２０と共に細胞をインキュベートした。その後、洗浄した後、細胞を、４５分間、室温で、１：５０希釈での二次ＰＥコンジュゲート化抗体（ペンシルバニア州、ギルバートビルのＲｏｃｋｌａｎｄ）と共にインキュベートした。その後、細胞を同じ条件で洗浄し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してＦＡＣＳｏｒｔ装置（カリフォルニア州、マウンテンビューのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
【００５９】
シングルサイクル感染性アッセイ
野生型ｇｐ１６０またはキメラタンパク質を発現するｐＳＶＩＩＩｅｎｖプラスミドを、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（カリフォルニア州、バレンシアのＱｉａｇｅｎ）を使用して、ｐＣＭＶ Ｇａｇ−ＰｏｌパッケージングプラスミドおよびｐＨＩＶ−ｌｕｃベクターで２９３Ｔ−ＨＥＫ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３０時間後、細胞上清を回収し、細孔径０．４５μｍのフィルターによって濾過し、超遠心分離法によって濃縮した。Ｃｆ２ＴｈＲ５およびＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５細胞の感染のために、標準量の偽型ウイルス（２００ｎｇのｐ２４タンパク質）を細胞と共に、９６ウエル照度計プレート（バージニア州、シャンティイーのＤｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において４８時間、３７℃でインキュベートした。１００μＬのルシフェラーゼアッセイ用緩衝液および５０μＬのルシフェラーゼ基質（ウィスコンシン州、マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）を細胞可溶化物に添加し、ＴＥＣＡＮ Ｇｅｎｉｏｓ照度計で化学発光の強度を測定することにより、ルシフェラーゼ活性を決定した。
【００６０】
細胞−細胞融合アッセイ
６ウエルプレートにおいて集密度７０％に成長させたＨｅＬａ−ｔａｔを、製造業社によって推奨されているとおりにリポフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１μｇのエンベロープタンパク質発現性プラスミドでトランスフェクトした。等量のＨｅＬａ ＣＤ４+／ＣＣＲ５+ ＬＴＲ−ｌａｃＺ細胞をトランスフェクションの４８時間後に添加した。一晩、共培養した後、付着細胞を０．５％グルタルアルデヒドで１０分間固定し、β−ガラクトシダーゼ活性について、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）基質で、一晩、３７℃で染色した。ウエル当たりの青色に染色されたフォーカスの合計数をカウントし、顕微鏡写真を得た。
【００６１】
結果
ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ１ｓｄＣＤ４およびｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４タンパク質の構築および精製
本発明のキメラタンパク質は、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ＹＵ２配列に挿入されたｓｄＣＤ４を有するＣＤ４ｉ配座を示す一本鎖糖タンパク質である。ＣＤ４由来ペプチドは、２８のアミノ酸を有し、ならびにｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質のための主結合部位であるヒトＣＤ４受容体のＣＤＲ２様ループを模倣する。オリゴヌクレオチドから合成により生じさせたこのＣＤ４由来ペプチドのＤＮＡ配列を、図１に示すとおり、ｇｐ１２０ＹＵ２糖タンパク質のＶ１／Ｖ２可変領域にクローニングした。図１：（Ａ）野生型ｇｐ１２０ＹＵ２のＶ１／Ｖ２ループの予想アミノ酸配列。（Ｂ）Ｖ１とＶ２ループの一部（１６のアミノ酸）とがｓｄＣＤ４配列で置換されたｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４エンベロープタンパク質。（Ｃ）ｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４タンパク質において、１５６〜１６８アミノ酸をコードする領域を置換することによりｓｄＣＤ４をＶ２ループに挿入した。全Ｖ１ループを保持していた。アミノ酸数は、システイン残基に対応する。
【００６２】
ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４キメラタンパク質は、Ｖ１ループとＶ２ループからの１６のアミノ酸残基とをｓｄＣＤ４配列で置換することによって構築した。
【００６３】
ｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４キメラタンパク質は、全Ｖ１ループを保持するが、Ｖ２ループ内の１５６〜１６８アミノ酸をコードする領域はｓｄＣＤ４によって置換されている。
【００６４】
野生型およびキメラｇｐ１２０配列をバキュロウイルストラスファーベクター、ｐ１１９にクローニングした。組換えタンパク質の効率的な分泌を助長するために、天然ＨＩＶシグナル配列を、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）バキュロウイルスのエクジステロイドグリコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）遺伝子から単離された新たなシグナル配列（７）によって置換した。構築したすべてのキメラは、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析によって判定して、ほぼ同量のｇｐ１２０エンベロープタンパク質を発現した。挿入されたｓｄＣＤ４配列は、発現レベルに影響を及ぼさなかったようである。さらに、二段階精製手順を使用してこれらのタンパク質をＳｆ９昆虫細胞培養上清から精製し、その後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって特性付けした。結果を図２に与える。そのゲルをクマシン・ブルーで染色するか（図２Ａ）、または抗ｇｐ１２０ Ｄ７３２４抗体を使用するウエスタンブロット分析（図２Ｂ）のために処理した（右の矢印は、エンベロープタンパク質の位置を示す）。
【００６５】
１００ｋＤａの見かけの分子量（ＭＷ）を示すバンドに対応するキメラは、同じ条件下で発現された野生型ｇｐ１２０エンベロープのものと一致する。
【００６６】
キメラタンパク質の抗原特性
キメラタンパク質の構造の完全性は、公知エピトープ特異性に対するＭＡｂのパネル（Ｄ７３２４、ＣＧ１０、ＬＦ１７およびＦ１０５）での酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって判定した。前記ＥＬＩＳＡは、ＣＤ４誘導性結合部位に対するＣＤ１０およびＬＦ１７ ＭＡｂを用いて、「材料および方法」において説明したとおりに行った。
【００６７】
結果を図５に与える。野生型ｇｐ１２０（丸）、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４（四角）、ｇｐ１２０△Ｖ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４（ひし形）およびｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４（三角、◆）タンパク質をＤ７３２４抗体によって捕捉し、ＭＡｂｓ ＣＧ１０（Ａ）、ＬＦ１７（Ｂ）およびＦ１０５（Ｃ）を、示されている濃度で添加した。結合した抗体の量を固有のＦ（ａｂ’）２−ＨＲＰコンジュゲートによって検出し、４９０ｎｍでの光学密度として表した。
【００６８】
これらの抗体は、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体のみを認識し、ｓＣＤ４不在下ではｇｐ１２０を認識しない。両方のキメラタンパク質がＣＧ１０によって認識された。しかし、ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４キメラタンパク質のほうがｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４より効率的に認識された（図５Ａ）。これは、このエピトープの露出のほうが少なかったことを示唆している。図５Ｂに示すように、ＬＦ１７は、両方のキメラタンパク質に同様の効率で結合したが、野生型ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体と比較すると劣っていた。
【００６９】
ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体の形成は、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位の露出を阻害するので、キメラタンパク質に結合するＣＤ４結合部位抗体の能力を試験した。
【００７０】
図５Ｃに示すように、ヒトＦ１０５ ＭＡｂは、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体およびキメラタンパク質より良好に、野生型ｇｐ１２０タンパク質に結合した。ｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４は、前記複合体およびｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４タンパク質より効率的に認識された。
【００７１】
これらのデータは、ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４タンパク質が、より良好にＣＤ４ｉエピトープに暴露され、従って、ＣＤ４結合エピトープにはそれほど暴露されないという以前の結果と一致した。
【００７２】
前述の結果は、挿入されたｓｄＣＤ４が、特にＧＰ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４タンパク質において、ＣＤ４ｉエピトープの露出をもたらすキメラタンパク質の配座変化を生じさせることを明示している。
【００７３】
興味深いことに、抗ＣＤ４、ＳＴ４およびＢＦ５ ＭＡｂ（ＣＤ４分子に加えて、ｇｐ１２０および近傍エピトープへの結合にそれぞれ関与するエピトープを特異的に認識することができる）は、２つのｇｐ１２０／ＣＤ４キメラをいずれも認識しない。これは、これらの分子が、免疫処置後に抗ＣＤ４抗体を誘導する確率は低いことを意味する。
【００７４】
さらに、Ｖ２ループ、その配座エピトープ２Ｇ１２、ＣおよびＮ末端ペプチドそれぞれに対する抗ｇｐ１２０ＭＡｂは、キメラ上のこれらのエピトープを、それらが野生型ｇｐ１２０上でそれを認識するのと同様に認識することができた。
【００７５】
固定化ＣＤ４ｉＭａｂへのキメラタンパク質の結合強度のＢＩＡＣＯＲＥ分析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により会合速度定数（ｋa）、解離速度定数（ｋd）ならびに平衡解離定数（ＫＤ）を決定することにより、ＣＤ４ｉ ＭＡｂへのキメラタンパク質の定量的結合を行った。ｓＣＤ４、ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４またはｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４タンパク質を伴うまたは伴わない、様々な濃度の野生型ｇｐ１２０ＹＵ２を、固定化４．８ＤおよびＥ５１ ＣＤ４ｉ ＭＡｂの上に通した。
【００７６】
結果を次の表にまとめる：
表１．キメラｇｐ１２０と抗ＣＤ４ｉ ＭＡｂとの分子相互作用の動力学的パラメータ。会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）および平衡解離定数（ＫＤ）。Ｒｍａｘは、固定化抗体への最大タンパク質結合能力を表す。
【００７７】
【表１】
得られたセンサーグラムを図３Ａ〜Ｄに示す。様々な濃度のｇｐ１２０Ｖ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４（Ａ、Ｃ）およびｇｐ１２０Ｖ２ｓｄＣＤ４（Ｂ、Ｄ）タンパク質を固定化４．８Ｄ（Ａ、Ｂ）およびＥ５１（Ｃ、Ｄ）上に５０μＬ／分の流量で通した。ＭＡｂは、ＣＭ４センサーチップに、それぞれ２０００および１１００ ＲＵで固定した。ＲＵ、応答単位。結合定数の概要を図３Ｅに提示する。
【００７８】
ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４およびｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４の算出ＫＤ（ｋｄ／ｋａ）は、４．８ｄ ＭＡｂについては、それぞれ、０．０１５±０．０００４ｎＭおよび０．０３８±０．０００７ｎＭであったが、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体の対応するＫＤは、１００倍高かった。
【００７９】
この差は、主として、これらのキメラタンパク質についてのより高いｋａに起因する。
【００８０】
別のＣＤ４ｉ Ｍａｂ、Ｅ５１で同様の結果が観察された。ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４およびｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４のＫＤ値は、それぞれ、０．０１２±０．０００２ ｎＭおよび０．０１３±０．０００１ ｎＭであった。これは、Ｅ５１ ＭＡｂ対する高い親和性結合を示唆している。図４は、ｓＣＤ４を伴うまたは伴わないｇｐ１２０ＹＵ２とＣＤ４ｉ ＭＡｂとの相互作用ならびにキメラタンパク質とＣＤ４ｉ ＭＡｂとの相互作用についての重ね書きセンサーグラムを示すものである。４．８ｄ（Ａ）およびＥ５１（Ｂ）ＭＡｂを２０００および１１００ ＲＵで固定し、タンパク質を３０μＬ／分の流量で通過させた。ｇｐ１２０ＹＵ２タンパク質を３倍モル過剰のｓＣＤ４と共に１時間、３７℃でインキュベートした後、注入した。
【００８１】
ｓＣＤ４不在下、野生型ｇｐ１２０ＹＵ２は、４．８ｄに対する有意な結合を示さなかったが、Ｅ５１ ＭＡｂにはわずかに結合した。予想どおり、ｓＣＤ４は、高い親和性での両方のＣＤ４ｉ抗体に対する結合を増加させた。しかし、両方のキメラタンパク質が、より高い親和性で４．８ｄおよびＥ５１に結合した。これは、挿入されたｓｄＣＤ４が、それらのタンパク質の正しいフォールディングに影響を及ぼさないことを示している。
【００８２】
ＣＣＲ５およびＣＤ４受容体へのｇｐ１２０キメラタンパク質の結合
ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡＣＯＲＥ技術による上の結果によって、キメラタンパク質、特にｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４がＣＤ４結合配座を有することが明らかになったので、これらのタンパク質がＣＣＲ５ケモカイン受容体に結合するかどうかを評定する実験を行った。
【００８３】
多量のＣＣＲ５を発現するＣｆ２ｔｈＲ５細胞を、ｓＣＤ４の存在下または不在下で、野生型およびキメラｇｐ１２０タンパク質と共にインキュベートした。結果を図６に与える（図６は、Ｃｆ２ＴｈＲ５およびＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５株細胞それぞれにおいて発現されたＣＣＲ５受容体（Ａ）およびＣＤ４（Ｂ）受容体に対するＣＣＲ５の結合活性を示す）。それらの細胞をｇｐ１２０（＿ ＿）、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４（ ）、ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４（........）またはｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４（……）タンパク質のいずれかと共に１時間、３７℃でインキュベートした。結合したタンパク質を、抗ｇｐ１２０抗血清（Ａ）およびＣＧ１０ ＭＡｂ（Ｂ）を使用して検出し、ＰＥ結合二次抗体を使用して顕示した。染色された細胞を洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。
【００８４】
図６Ａに示されているように、両方のキメラタンパク質は、ｓＣＤ４の不在下では、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４タンパク質複合体と同様によくＣＣＲ５に結合し、これは、共受容体結合部位およびＣＤ４ｉエピトープの正しい露出を示唆している。ｓＣＤ４の存在は、ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４のＣＣＲ５への結合を増加させないが、ｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４の結合はわずかに増加させる。
【００８５】
第二のアッセイにおいて、ＣＤ４受容体に結合するキメラタンパク質を試験した。ＣＣＲ５タンパク質ではなくＣＤ４タンパク質を発現するＣＥＭ細胞を野生型およびキメラタンパク質と共に１時間、３７℃でインキュベートした。両方の組換えタンパク質は、野生型タンパク質と比較してＣＤ４結合の減少を示した（図６Ｂ）。ＣＤ４受容体に結合するｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４の能力は、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合タンパク質に類似していたが、ｇｐ１２０Ｖ２ｓｄＣＤ４は、より良好にＣＤ４に結合した。
【００８６】
細胞表面発現ＨＩＶ−１キメラエンベロープの細胞−細胞融合アッセイ
キメラタンパク質が、シンシチウム形成をもたらす融合活性を維持するかどうかを判定するために、ＨｅＬａ−Ｔａｔ細胞をｐＣＥＬエンベロープ発現ベクターでトランスフェクトした。それらのトランスフェクトされた細胞を、ＣＤ４およびＣＣＲ５受容体を発現するＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５細胞と共培養した。野生型ｇｐ１６０（Ａ）、ｇｐ１６０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４（Ｂ）またはｇｐ１６０ΔＶ２ｓｄＣＤ４（Ｃ）エンベロープ構築物で、ＨｅＬａ−Ｔａｔ細胞をトランスフェクトした（図７）。トランスフェクション後４８時間の時点で、それらの細胞を、組み込まれたＨＩＶ ＬＴＲ−ｌａｃＺを有し、ＣＣＲ５およびＣＤ４受容体を発現するＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５細胞と共培養した。細胞を固定し、Ｘ−Ｇａｌで染色した。一晩、インキュベートした後、シンシチウムをカウントした。いずれのキメラタンパク質も検出可能なシンシチウム形成を生じなかった。これらの条件下で野生型は、８９を超えるシンシチウムを形成した。
【００８７】
キメラエンベロープ糖タンパク質を含有するウイルス粒子による感染
ウイルス侵入を媒介するキメラタンパク質の能力を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするｅｎｖ欠損ＨＩＶ−１プロウイルスを補足する野生型またはキメラいずれかのエンベロープタンパク質を発現するプラスミドを使用して分析した。２９３Ｔ細胞において生産された組換えビリオンを、ＣＣＲ５およびＣＣＲ５／ＣＤ４をそれぞれ安定して発現するＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５およびＣｆ２ＴｈＲ５細胞のいずれかと共にインキュベートし、ターゲット細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定した。ホタルルシフェラーゼを発現する組換えウイルスと、野生型ｇｐ１６０（１）、ｇｐ１６０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４（２）またはｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４（３）エンベロープ構築物のいずれかとを、ＨｅＬａ ＣＤ４+ＣＣＲ５+（Ａ）またはＣｆ２Ｔｈ−ＣＣＲ５（Ｂ）細胞のいずれかと共にインキュベートした（図８）。４８時間後、ルシフェラーゼ活性を、「材料および方法」において説明したとおりに測定した。これらのデータは、４つの独立した実験の代表である。
【００８８】
機能的野生型エンベロープタンパク質を含有するウイルス偽性粒子は、ＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５細胞を感染させ、Ｃｆ２ＴｈＲ５細胞も感染させたが、予想どおり、ｓＣＤ４が存在する場合だけであった。しかし、キメラタンパク質は、Ｃｆ２ＴｈＲ５細胞も、ＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５細胞も感染させることができなかった。このことは、両方のタンパク質が、膜融合および複製プロセスのなんらかの側面を欠損しているようであることを示唆している。
【００８９】
本発明者らの結果を考え合わせると、ＨＩＶ−１ ＹＵ２からの野生型のｇｐ１２０の主要なエピトープがこれらの構築物では保存されるので、この種のタンパク質は、免疫処置の良好な原型とみなすことができると考えることができる。
【００９０】
マウスにおけるキメラプラスミドを使用するキメラ１およびキメラ２のインビボ免疫原性
この実験の目的は、ＨＩＶ ｇｐ１２０のその受容体への結合に干渉する小さなＣＤ４由来ペプチドを発現するキメラ（キメラ１およびキメラ２）の免疫反応に対する効果を評価することである。この目的を達成するために、リンカーまたは架橋剤を避けて、Ｖ１／Ｖ２可変領域にＣＤ４由来ペプチドを含有するキメラＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質でマウスを免疫した。２つの異なるアジュバント：ＣｐＧ様モチーフ（ＨＹＢ２０４８）およびインターロイキン−２２を使用した。
【００９１】
１．１．キメラ１またはキメラ２とＣｐＧ様モチーフ（ＨＹＢ２０４８）およびＩＬ−２２を併用する根本的理由
ここ数年にわたる広範な調査により、非メチル化ＣｐＧモチーフを含有する細菌ＤＮＡおよび合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＤＮＡ）は、Ｔｈ１サイトカインを生産するように、ＣＴＬ応答を促進するように、およびＢリンパ球による免疫グロブリンの生産を増進させるように免疫生得細胞を誘導する、効力あるアジュバントであることが実証された。ＣｐＧ ＤＮＡのこれらの効果は、樹状細胞の分化および成熟を刺激することが知られているＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）との相互作用の二次的なものである可能性が高い。様々なワクチン、抗原および免疫原とアジュバントとしてのＣｐＧ ＤＮＡの併用を、両腕の特異免疫の強化について評価した。例えば、不活化ｇｐ１２０欠損ＨＩＶ−１免疫原への合成ＣｐＧ ＤＮＡの追加は、齧歯動物および霊長類において細胞媒介ウイルス特異的免疫反応と体液性ウイルス特異的免疫反応の両方の増強をもたらす。最近、新規合成ＴＬＲ９アゴニストが利用可能となった。こうしたアゴニストの１つは、Ａｍｐｌｉｖａｘ（商標）と呼ばれるＨＹＢ２０４８２０５５である。ＨＹＢ２０４８２０５５は、新規３’−３’結合構造および合成ＣｐＲ（Ｒ＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン）モチーフからなる、免疫調節オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）である。この新規３’−３’構造は、自由な３’末端が不在のため、汎存ヌクレアーゼに対する、より大きな安定性をもたらし、ならびにＨＹＢ２０４８２０５５における２つの接触可能な５’末端の存在は、従来のＣｐＧ ＤＮＡと比較して強化されたＴＬＲ９活性化を生じさせる。加えて、合成ＣｐＲジヌクレオチドモチーフは、天然ＣｐＧジヌクレオチドモチーフと比較して高いＩＬ−１２および低いＩＬ−６を特徴とする独特なサイトカイン誘導プロフィールを誘導することが明らかになった。
【００９２】
ＩＬ−２２は、ＩＬ−１０を含む、ヒトＩ型ＩＦＮファミリーのメンバーである。ＩＬ−２２は、その受容体複合体内にＩＬ−２２Ｒ１を有するＩＬ−１０Ｒ２ｃ鎖に結合するので、ＩＬ−１０と相互作用する可能性がある。ＩＬ−２２は、炎症を媒介し、クラスＩＩサイトカイン受容体ヘテロ二量体ＩＬ−２２ ＲＡ１／ＣＲＦ２−４に結合する。このサイトカインは、免疫調節反応にも関与する。ＩＬ−２２阻害剤は、関節炎などの炎症性疾患を治療すると提唱されている。最近のデータは、ＩＬ−２２が、生得免疫を誘導し得ることを示唆しており（これらは、ＩＬ−２２が、暴露された未感染個体におけるＨＩＶに対する防御に関与することを示すデータによって完全なもととなった）、従って、ワクチンアジュバントの適するターゲットであるように考えられる。
【００９３】
単独でのならびにＨＹＢ２０５５およびＨＹＢ２０４８と組み合わせた場合のＨＩＶ−１免疫原、不完全フロイントアジュバントを用いて調合したｇｐ１２０欠損全滅ウイルスワクチン候補（ＨＩＶ−ＩＦＡ）の免疫原性をマウスモデルにおいて評価した。ＨＩＶ−ＩＦＡ単独と比較して、ＨＩＶ−ＩＦＡとＨＹＢ２０５５の組み合わせでの免疫処置は、ＨＩＶ特異的およびｐ２４特異的ＩＮＦγ、ＲＮＡＴＥＳ、ＭＩＰ １αおよびＭＩＰ １βの強力な生産、ならびにＨＩＶ特異的およびｐ２４特異的抗体の高い力価を惹起した。ＨＹＢ２０５５およびＨＹＢ２０４８を含めることにより、ＨＩＶ−ＩＦＡのみによって生産されるＩＬ−５のレベルも減少した。ＨＹＢ２０４８は、ＨＩＶ−ＩＦＡの免疫原性を強化し、１型サイトカインプロフィールの方に応答をシフトさせる。ＨＹＢ２０５５およびＨＹＢ２０４８アジュバントのこれらの免疫強化効果は、用量依存性であった。
【００９４】
従って、ＣｐＧ様モチーフまたはＩＬ−２２は、キメラ１および／またはキメラ２に対する免疫反応を増大させる有望なアジュバント候補であるように考えられる。
【００９５】
本発明の目的は、プラスミドとして単独で使用するイムノキメラが、ＨＩＶ特異的免疫反応を誘導することができるかどうか評定すること、ならびにＨＹＢ２０４８２０４８および／またはＩＬ−２２が、そうした反応を強化するかどうかを試験することである、研究である。
【００９６】
１．２．方法
１．２．１．キメラ構築物
野生型およびキメラｇｐ１２０配列をバキュロウイルストランスファーベクター、ｐ１１９Ｌにクローニングした。組換えタンパク質の効率的分泌を助長するために、天然ＨＩＶ−１シグナル配列を、オートグラファ・カリフォルニカバキュロウイルスのエクジステロイドグリコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）遺伝子から単離された新たなシグナル配列によって置換した。ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬を使用して、ｐ１０プロモーターおよびｇｐ１２０キメラを含有するｐ１１９Ｌトランスファーベクターの制御下、ポリヘドリン遺伝子を発現するウイルスＡｃＳＬＰ１０ ＤＮＡで、Ｓｆ９昆虫細胞をコトランスフェクトすることよって、ｇｐ１２０エンベロープキメラを生産した。コトランスフェクションの４日後、上清を回収し、組換えウイルスプラークをプラークアッセイによって選択した。可能性のある組換えプラークを、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素での消化、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。これらの実験において使用した試薬は、キメラ１およびキメラ２を含有する組換えバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞の上清であった。
【００９７】
１．２．２．プロトコルスキーム
７０匹の雌Ｃ５７／ＢＬ６マウス；週齢６〜８週（Ｎ＝５／群）を、イムノキメラ１もしくは２（マウス当たり２００μｇ：４頭筋当たり２×５０μｇ）および／またはマウスオリゴヌクレオチドＨＹＢ２０４８２０４８（マウス当たり１００μｇ：４頭筋当たり５０μｇ）および／またはＩＬ−２２（マウス当たり１００μｇ：４頭筋当たり５０μｇ）でＩＭ免疫した。初回免疫処置後、３週間の後、マウスに追加免疫した。
【００９８】
【表２】
【００９９】
１．２．３．免疫学的分析
単独で、天然ｐ２４抗原と共に、またはＨＩＶ−１抗原と共に、培地中で４日間、インビトロで刺激した新鮮な脾臓細胞を用いて、免疫学的分析を行った。
【０１００】
ＩＮＦ−ガンマ、ＩＬ−１２、ＩＬ−４；ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＭＩＰ１アルファ、ＭＩＰ１ベータ、ＲＡＮＴＥＳの生産をＥＬＩＳＡ法で評価した。
【０１０１】
Ｐ２４抗原およびＨＩＶ−１抗原特異的ＩＦＮ−ガンマ生産性リンパ球をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。
【０１０２】
１．２．４．統計解析
等しい中央値のウィルコキソン順位和検定を用いた。ベクトルｘおよびｙでの２つの独立したサンプルが、等しい中央値を有する分布から生じ、その検定からＰ値を返すという仮説の両側順位和検定を行う。ｐは、所与の結果を観察する確率、または万一、帰無仮設が真である、すなわち中央値が等しい場合には、１より大きい極値である。小さなｐ値は、帰無仮設の妥当性に疑いを投げかけ、従って、群間の差を示唆する。ことによると位置シフトを除いて同一であるが、他の点では任意である連続分布から、２セットのデータが生じると想定される。ｘおよびｙは、異なる長さを有する場合がある。
【０１０３】
１．３．結果
結果を図９〜１９のセットに提示する。
【０１０４】
図９．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−４の生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターロイキン−４の生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−４の生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−４の生産。すべてのパネルにおいて、両方のキメラでの免疫処置は、対照マウス（免疫処置なし）と比較してインターロイキン−４の生産を減少させる；左上のパネルにおける（基底条件における）両方のキメラについての差は有意であり、これは、両方のキメラがＩＬ−４の生産を抑制し、従って、ＴＨ２リンパ球の活性化を阻害することを示唆している。
【０１０５】
図１０．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−１０の生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターロイキン−１０の生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−１０の生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−１０の生産。インターロイキン−１０の生産は、対照マウスと比較して、キメラ２で免疫したマウスでは弱いが有意に（左上および下のパネル）増加した。これは、キメラ２の可能な抗炎症活性を示唆している。ＨＩＶ特異的刺激に反応して、ＩＬ−２２に反応して、同じ作用が観察される。
【０１０６】
図１１．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−５の生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターロイキン−５の生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−５の生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−５の生産。インターロイキン−５の生産は、対照マウスと比較して、免疫された場合に修飾されず、これにより、ＴＨ２活性化に対する抑制作用がさらに確認される。
【０１０７】
図１２．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産。インターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産は、対照マウスと比較して、免疫された場合に修飾されない（キメラ２で免疫された右上パネルにおけるマウスのみ、インターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産増加を示す）。結果は、キメラ２についてのＨＩＶ特異的応答の存在を示唆している。
【０１０８】
図１３．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−１２ ｐ７０サブユニットの生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターロイキン−１２ ｐ７０サブユニットの生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−１２ ｐ７０サブユニットの生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−１２ ｐ７０サブユニットの生産。インターロイキン−１２ ｐ７０サブユニットの生産は、対照マウスと比較して、免疫された場合に修飾されない。
【０１０９】
図１４．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＲＡＮＴＥＳの生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのＲＡＮＴＥＳの生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるＲＡＮＴＥＳの生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるＲＡＮＴＥＳの生産。ＲＡＮＴＥＳの生産は、免疫された場合、対照マウスと比較して増加する（キメラ２のほうが強い効果を有する：上のパネルを参照のこと）。統計学的有意性に達していないにもかかわらず、キメラ２は、ＲＮＡＴＥＳのＨＩＶ特異的生産を刺激する点で陽性の傾向を有し、これは、ＴＨ１細胞に対する刺激効果を示唆している。
【０１１０】
図１５．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＭＩＰ１−アルファの生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのＭＩＰ１−アルファの生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるＭＩＰ１−アルファの生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるＭＩＰ１−アルファの生産。ＭＩＰ１−アルファの生産は、対照マウスと比較して、免疫された場合に修飾されない。ｇｐ１６０特異的応答（右上のパネル）は、キメラ２がＨＹＢ２０４６およびＩＬ−２２と会合しているとき、印象的に増加し（第三グループの棒を参照のこと）、これは、キメラ２活性が、ｃｐｇ様分子およびＩＬ−２２の追加により、ＭＩＰ１−アルファのＨＩＶ特異的生産およびそうした組み合わせの可能な直接的抗ウイルス効果を増幅するように、有意に修飾され得ることを示唆している。
【０１１１】
図１６．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＭＩＰ１−ベータの生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのＭＩＰ１−ベータの生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるＭＩＰ１−ベータの生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるＭＩＰ１−ベータの生産。ＭＩＰ１−ベータの生産は、対照マウスと比較して、免疫された場合に修飾されない。
【０１１２】
図１７．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ４およびＣＤ８）。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターフェロンガンマの生産（ＣＤ４およびＣＤ８）。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ４およびＣＤ８）。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ４およびＣＤ８）。インターフェロンガンマの生産（ＣＤ４およびＣＤ８）は、対照マウスと比較して、免疫された場合に増加する（キメラ１のほうが強い効果を有する：右上および下のパネル参照）。ｇｐ１６０応答（右上のパネル）は、キメラ１および２がＨＹＢ２０４８およびＩＬ−２２と会合しているとき、特に印象的である（第三および第四グループの棒を参照のこと）。これは、キメラ２活性が、ｃｐｇ様分子およびＩＬ−２２の追加により、ＴＨ１バランスを優先して細胞媒介免疫を刺激するＩＦＮガンマのＨＩＶ特異的生産を増幅するように、有意に修飾され得ることを示唆している。
【０１１３】
図１８．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ８）。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターフェロンガンマの生産（ＣＤ８）。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ８）。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ８）。インターフェロンガンマの生産（ＣＤ８）は、対照マウスと比較して、免疫された場合に増加する（キメラ１のほうが強い効果を有する：左上および下のパネル参照）。データは、両方のキメラが、基底およびＨＩＶ特異的ＩＦＮガンマ生産を刺激する能力を有することを示唆している。
【０１１４】
図１９．左上のパネル：雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＣＣＲ５発現性ＣＤ４＋ Ｔ細胞の百分率。
右上パネル：雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＣＸＣＲ４発現性ＣＤ４＋ Ｔ細胞の百分率。
下のパネル：雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞による場合のＣＤ４＋／ＣＣＲ５＋のＣＤ４＋／ＣＸＣＲ４＋に対する比率。
ＣＣＲ５は、免疫されていないマウスと比較して、両方のキメラにより減少される；ＣＸＣＲ４は、キメラ１により有意に増加される；ＣＣＲ５ ＣＤ４＋ 細胞のＣＣＲ４ ＣＤ４＋ 細胞に対する比率は、両方での免疫処置によって有意に減少され、これは、ＨＩＶ感染症への細胞の罹病性が、有意に下方修飾されることを示している。データは、そうした分子が、ＨＩＶ疾患において予防ワクチンまたは殺菌剤として使用される可能性を有することを示唆している。
【０１１５】
結果は、キメラでマウスを免疫することによって免疫調節が確かに達成されることを示している。
【０１１６】
キメラに関連した免疫調節は、多くの側面を有し、例えば、それには、ＴＨ２細胞に対する阻害効果（インターロイキン−４の生産減少）、抗炎症成分（インターロイキン−１０の生産増加）、ＴＨ１リンパ球の直接刺激、ならびに細胞媒介免疫に対する効果（インターロイキン−１２の生産増加；ＩＮＦガンマ生産性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞数の増加）が挙げられる。
【０１１７】
これらの免疫調節特性に加えて、キメラは、２つの別個のメカニズム（可溶性抗ウイルスケモカインＲＡＮＴＥＳの生産増加、およびＣＣＲ５、主ＨＩＶ共受容体の下方修飾）によって、ターゲット細胞のＨＩＶ感染症への罹病率を減少させる。両方のキメラにこれらの効果が付与されているという観察にもかかわらず、総合的な免疫調節および抗ウイルス活性は、キメラ２で免疫されたマウスにおけるほうが効力が高いようである。両方のキメラの効果は、ＣｐＧ様化合物（ＨＹＢ２０４８）およびインターロイキン−２２の追加によって増加される。キメラでの免疫処置が、結果として免疫調節および直接的抗ウイルス効果を生じさせるという観察は、キメラが、ＨＩＶ疾患において予防ワクチンまたは殺菌剤として使用される可能性を有することを示唆している。
【０１１８】
細胞媒介免疫に対する単独でのおよびＣＣＬ２８と併用でのキメラ１またはキメラ２の効果
感染の予防に成功すために、ＨＩＶに対する粘膜ワクチンは、体液性免疫反応と細胞媒介免疫反応の両方に対して作用できる必要があると想定される。従って、キメラが非常に高い親和性で抗体に結合できることを発見し次第、本発明者らは、キメラが、ＨＩＶに感染した患者からのＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞におけるサイトカイン生産に影響を及ぼすことができるかどうか、ならびにＨＩＶ＋患者から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）においてエクスビボで使用したとき、ＣＣＬ２８の追加がキメラの細胞活性を強化できるかどうか試験することを決意した。
【０１１９】
ＣＣＬ２８（粘膜関連上皮性ケモカイン、またはＭＥＣとしても知られている）は、ＩｇＡ分泌性形質細胞の移動に関与する、および従って、ＨＩＶ感染症を予防するメカニズムにおいて一定の役割を果す可能性を秘めている、最近記載されたサイトカインである。
【０１２０】
ＩｇＡ分泌性形質細胞の移動へのＣＣＬ２８の関与は、特定のケモカインおよびケモカイン受容体と相関することが、最近、明らかになった。例えば、Ｉｇ発現性形質芽細胞および形質細胞（ＩｇＡ−ＡＳＣ）は、特定のサイトカインによってライゲートされる、ＣＣＲ９、ＣＣＲ３およびＣＣＲ１０をはじめとする多数の表面受容体タンパク質を特徴とする。特に、ＣＣＲ１０とＣＣＲ３の両方が、ＣＣＬ２８に結合する。
【０１２１】
この相互作用は、粘膜固有層におけるＩｇＡ−ＡＳＣの移動および補充を誘導する。特に、ＣＣＬ２８は、マウスとヒトの両方において研究されているあらゆる粘膜エフェクター部位（乳腺、唾液腺、子宮粘膜および子宮頚粘膜を含む）において、広範に発現され、多様な粘膜リンパ器官起源ならびに腸組織および腸外の組織起源のＩｇＡ−ＡＳＣを強力に化学的に誘引する。
【０１２２】
従って、ＣＣＬ２８−ＣＣＲ１０／ＣＣＲ３回路は、粘膜エフェクター部位での形質芽細胞および形質細胞の帰巣において主要な役割を果す統合システムであると考えられる。興味深いことに、これらの化学的誘引能力は、ＩｇＭまたはＩｇＧ ＡＳＣのいずれの移動もＣＣＬ２８−ＣＣＲ１０／ＣＣＲ３システムによって刺激されないので、ＩｇＡ−ＡＳＣに限定される。
【０１２３】
ＣＣＬ２８−ＣＣＲ１０／ＣＣＲ３回路には他の興味深い特色も付与されている。例えば、ＣＣＬ２８は、グラム陽性微生物とグラム陰性微生物の両方に対する効力ある抗菌力を有する。加えて、このケモカインは、骨髄間質細胞によって発現され、これは、ＣＣ２８とＣＣＲ１０＋／ＣＣＲ３＋ Ｂ細胞の相互作用が、粘膜の免疫反応と全身の免疫反応との統合に寄与し得ることを示唆している。
【０１２４】
１．方法
ＨＩＶ感染患者およびＨＩＶに暴露したが未感染の個体（ＥＳＮ）においてＣＣＲ３／ＣＣＲ１０／ＣＣＬ２８回路を検査した。３９人のＨＩＶ患者、３７人のＥＳＮおよび２５人のＨＣにおいて、血漿、唾液および生殖腺分泌物中のＣＣＬ２８を定量した。ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋およびＣＤ１４＋ 末梢血細胞（同じ個体からの細胞）において、ＣＣＲ３およびＣＣＲ１０発現を測定した。６５人のＨＩＶ感染女性および９人の未感染対照からの母乳中のＣＣＬ２８も定量した。
【０１２５】
結果を次のとおりまとめる：
１．ＥＳＮおよびＨＩＶ患者の血漿、唾液および生殖腺分泌物中のＣＣＬ２８の濃度は、ＨＣと比較して増加される。
【０１２６】
２．ＨＣと比較して、ＥＳＮおよびＨＩＶ患者において、百分率および平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＤ１９＋／細胞におけるＣＣＲ３およびＣＣＲ１０の細胞内レベルに基づく表面密度の比較測定値は、増加される。
【０１２７】
３．ＨＩＶおよびＥＳＮにおける血漿、唾液および生殖腺分泌物において、ＣＣＬ２８とＨＩＶ特異的ＩｇＡの間に正の相関関係が観察される。
【０１２８】
ＥＳＮは、高濃度のＨＩＶ特異的ＩｇＡの存在を特徴とし、従って、ＣＣＬ２８は、ＨＩＶ陰性暴露個体（ＥＳＮ）における感染を防止する事象の生化学的カスケードにおいて重要な役割を果すことがわかり、これが、この分子を抗ウイルス（ＨＩＶ）ワクチンの可能なターゲットにする。
【０１２９】
結果は、ＨＩＶに関するデータにより証明されるように、感染、すなわちウイルスに対する健常な抗原特異的免疫反応にはＣＣＬ２８が重要であることを示唆している。この分子は、単独で使用することができる、または抗ウイルス（ＨＩＶ）ワクチン用のアジュバントとして使用することができる可能性が高い。
【０１３０】
２．方法
細胞媒介免疫に対するＣＣＬ２８の可能な効果を評価するために、ＣＣＬ−２８発現性プラスミドの存在下、および／または２つのキメラタンパク質の存在下で、ＨＩＶ感染個体の末梢血単核細胞を培養した。
【０１３１】
２．１．抗原およびマイトジェンで刺激したＴリンパ細胞によるサイトカイン生産
細胞内分析
２％ ＡＢ＋ 血清を補足した培地にＰＢＭＣを再び懸濁させ、昆虫細胞の上清（対照）、キメラ１（０．５μｇ）、キメラ２（０．０５μｇ）、キメラ１または２＋ｐＣｐＧＣＣＬ２８、（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＣｐＧ発現ベクターにクローニングされたマウスＣＣＬ２８）、ＥＮＶ（５μＭの最終濃度でのＨＩＶ−１のｇｐ１６０からの５つの合成ペプチドのプール）、ＧＡＧ（ｇａｇ ｐ１７およびｇａｇ ｐ２４（ＧＡＧ）からの６つの合成ペプチドのプール）およびブドウ球菌腸毒素Ｂ（ＳＥＢ、４０μｇ／ｍＬ）（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）（陽性対照）を有する滅菌管に接種する。インキュベーション中に、ＣＤ２８に対する抗体（ミネソタ州、ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１μｇ／ウエルの用量で添加して、共刺激を助長する。Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（１０μｇ／ｍＬ 最終濃度）を各管に添加する。ＰＢＭＣを４２時間インキュベートし、その後、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ＣＤ４／ＩＦＮ−ガンマ／ＩＬ−２について、およびＣＤ８／ＩＮＦ−ガンマ／ＴＮＦ−アルファについて染色する。
【０１３２】
２．２．ＣＦＳＥでの増殖アッセイおよび増殖性細胞の表現型決定
ＣＦＳＥ Ｆｌｏｗ法は、細胞の多数のパラメータの分析のための簡単で高感度な技術となる。この方法は、増殖性細胞の特定の集団の研究を可能にする。先ず、ＰＢＭＣを、細胞中に受動的に拡散する膜透過性、非蛍光ＣＦＳＥと共にインキュベートする。過剰な染料を洗い流し、昆虫細胞の上清（対照）、キメラ１（０．０５μｇ）、キメラ２（０．０５μｇ）、キメラ１または２＋ｐＣｐＧＣＣＬ２８、（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＣｐＧ発現ベクターにクローニングされたマウスＣＣＬ２８）、ＥＮＶ（５μＭの最終濃度でのＨＩＶ−１のｇｐ１６０からの５つの合成ペプチドのプール）、ＧＡＧ（ｇａｇ ｐ１７およびｇａｇ ｐ２４（ＧＡＧ）からの６つの合成ペプチドのプール）およびブドウ球菌腸毒素Ｂ（ＳＥＢ、４０μｇ／ｍＬ）（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）（陽性対照）でのインビトロ刺激によってＰＢＭＣを増殖するように誘導する。それらの細胞を培養状態で５日間、維持する。細胞表面分子ＣＤ４およびＣＤ８についての蛍光標識抗体での染色により、特定のリンパ球サブセットの増殖を検査することができる。
【０１３３】
３．結果
図２０および２１は、ＣＤ４ Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマの生産に対する、ならびにＣＤ８ Ｔ細胞によるＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファの生産に対するキメラ１（ＣＨ１）およびキメラ２（ＣＨ２）＋／− ＣＣＬ２８の効果をそれぞれ示すものである。
【０１３４】
ＣＤ４ Ｔ細胞によるおよびＣＤ８ Ｔ細胞によるサイトカインの生産に対するキメラ１（０．５μｇ）＋／−ＣＣＬ２８の効果は観察されなかった（図２２および図２３）。キメラ２は、単独で、ＣＤ４ Ｔ細胞によるＩＬ−２の生産を、培地中５．２％から７．２％に、わずかに増加させることができる（図２０）。ｇｐ１２０／ＣＤ４キメラ２と一緒にＣＣＬ２８発現性プラスミドは、ＣＤ４＋、ＩＬ−２分泌性Ｔ細胞に対して極めて強い効果を生じることができる。実際、ＣＣＬ２８のキメラ２への追加は、ＩＬ−２を発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞を５．２％から１５．６％に増加させた（図２０）。同様の結果が、ＴＮＦ−アルファを発現するＣＤ８ Ｔ細胞で示され、ＣＣＬ２８のキメラ２への追加は、ＴＮＦアルファを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞を４．１％から１２．２に増加させた（図２１）。
【０１３５】
結論として、ＣＣＬ２８の追加は、キメラ２の免疫原性を増加させる。
【０１３６】
これらの結果は、粘膜免疫を目的とした感染性疾患において体液性および細胞媒介免疫を惹起する新規戦略についての枢要な結論の代表である。
【０１３７】
図２２および２３は、ＣＦＳＥ法を使用して、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖（図２２）およびＣＤ８ Ｔ細胞増殖（図２３）に対するキメラ１（ＣＨ１）およびキメラ２（ＣＨ２）＋／− ＣＣＬ２８の効果を示すものである。ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１および２は、ＣＤ４ Ｔ細胞の強い増殖を誘導する（図２２ＡおよびＢ）。実際、昆虫細胞上清での対照と比較して、２〜３倍の増殖増加が観察された（図２２Ｂ）。ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖が０．４％から１〜２％に増加されるような、より低い程度にではあるが、同じ結果が、ＣＤ８ ｂｒｉｇｈｔ Ｔ細胞で観察された。
【０１３８】
これらの結果は、ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１および２が、ＣＤ４ Ｔ細胞の強い増殖、およびはるかに低い程度にＣＤ８ ｂｒｉｇｈｔ Ｔ細胞の増殖を誘導することを示唆している。
【０１３９】
このように、本発明は、抗ＨＩＶ抗体に対して高い親和性を有することに加えて、効力ある免疫調節および抗ウイルス効果も有するキメラを提供し、該キメラをＩＬ−２２およびＣＣｌ２８と組み合わせて増幅させて、ワクチン／殺菌剤用の効力ある新規製品を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０のＶ１／Ｖ２可変領域に導入されたＣＤ４フラグメントの局在定位（Ａ：野生型ｇｐ１２０ＹＵ２；Ｂ：ｇｐ１２０ ｃｘ１（キメラ１またはＣＨ1）；Ｃ：ｇｐ１２０ ｃｘ２（キメラ２またはＣＨ2））。
【図２】ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４およびｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４タンパク質の検出。
【図３】表面プラズモン共鳴を使用することにより４．８ＤおよびＥ５１ ＣＤ４ｉＭＡｂへのキメラタンパク質の結合を示す重ね書きセンサーグラム。
【図４】ｓＣＤ４を伴うまたは伴わないｇｐ１２０ＹＵ２のＣＤ４ｉ ＭＡｂへの結合とキメラタンパク質のＣＤ４ｉ ＭＡｂへの結合を比較するための重ね書きセンサーグラム。
【図５】ＣＧ１０、ＬＦ１７およびＦ１０５ ＭＡｂを使用することによるキメラタンパク質の免疫化学的特性付け。
【図６】ＣＣＲ５受容体へのｇｐ１２０エンベロープタンパク質の結合。
【図７】シンシチウム形成能力の評定。
【図８】１ラウンドの感染アッセイの結果。
【図９】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−４の生産。
【図１０】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−１０の生産。
【図１１】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−５の生産。
【図１２】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産。
【図１３】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−１２ ｐ７０サブユニットの生産。
【図１４】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＲＡＮＴＥＳの生産。
【図１５】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＭＩＰ１−アルファの生産。
【図１６】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＭＩＰ１−ベータの生産。
【図１７】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ４およびＣＤ８）。
【図１８】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ８）。
【図１９】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞による共受容体発現性ＣＤ４＋ Ｔ細胞の百分率。
【図２０】ＣＤ４ Ｔ細胞からのインターフェロン−ガンマおよびインターロイキン−２の細胞内発現に対する、ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１またはキメラ２の効果。
【図２１】ＣＤ８ Ｔ細胞からのインターフェロン−ガンマおよびＴＮＦ−アルファの細胞内発現に対する、ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１またはキメラ２の効果。
【図２２Ａ】インビトロでのＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖に対する、ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１またはキメラ２の効果。分裂したＣＤ４＋ 細胞のパーセント（ＣＦＳＥ低）。
【図２２Ｂ】インビトロでのＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖に対する、ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１またはキメラ２の効果。対照（昆虫細胞上清）と比較した増殖増加倍率。
【図２３】インビトロでのＣＤ８ ｂｒｉｇｈｔ Ｔ細胞の増殖に対する、ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１またはキメラ２の効果。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラｇｐ１２０糖タンパク質およびそれらの生物学的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
あまねく中和抗体を惹起することができる保存免疫原は、有効なＨＩＶ−１ワクチンの重要な成分であり得る。ＨＩＶ−１エンベロープを構成するタンパク質、表面ユニット（ＳＵ）糖タンパク質（ｇｐ１２０）およびｇｐ４１膜貫通（ＴＭ）糖タンパクは、中和予防的防御を発現させるための有望なターゲットである。感染した個体から分離された防御性モノクローナル抗体は、エンベロープ糖タンパク質上の幾つかの中和エピトープを示した。それらは、ＴＭ ｇｐ４１における幾つかの領域と、受容体結合ばかりでなくＶ２およびＶ３可変ループにも関係するＳＵ ｇｐ１２０内の保存構造（これらは、高免疫原性であり、従って、タイプ特異的抗体のみを誘導する）とを含む。しかし、これらの中和エピトープに対する抗体を生成させることは難しかった。主として、体液性免疫系へのエピトープ露出、特に受容体結合部位の減少に有意に寄与する、エンベロープ糖タンパク質の強い可変性および感染中に変化し得るその高いグリコシル化レベルのためである。
【０００３】
細胞感染前のＨＩＶへの可能な干渉を捜す上で、受容体結合部位およびそれらのごく近傍は、ＨＩＶ−１ワクチンの特に魅力的なターゲットである。ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質は、細胞受容体ＣＤ４に、そしてケモカイン受容体ファミリーのメンバー（主として、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４）に、順次結合する。ＣＤ４へのｇｐ１２０の結合は、ｇｐ１２０糖タンパク質の配座変化を誘導し、それによりｇｐ１２０共受容体結合部位、いわゆるＣＤ４誘導（ＣＤ４ｉ）エピトープ、が露出する。この後者は、ｇｐ１２０の最も保存される表面の１つであり、ＣＤ４結合部位よりも多い。共受容体結合は、後のウイルス−細胞融合のための最も重要な段階の１つであり、従って、ＨＩＶ−１感染症にとってきわめて重大であるので、エンベロープｇｐ１２０上のＣＤ４誘導（ＣＤ４ｉ）エピトープに特異的な抗体は、種々のＨＩＶ−１分離株による感染をあまねく阻止するために特に有用であろう。共受容体結合を阻止する幾つかのそうしたＣＤ４ｉ抗体が同定および特性付けされている。１７ｂと呼ばれる、それらの１つは、ＨＩＶ−１感染個体から分離されたものであり、一部のＴ細胞系統適応（ＴＣＬＡ）ＨＩＶ−１株を中和することができるが、初代分離株を中和することはあまりできない。もう１つのＣＤ４ｉ結合抗体であるＥ５１は、分離された初代ＨＩＶ−１に対する、より強力な中和応答を誘導する。ＣＤ４結合配座を認識し、初代ＨＩＶ−１分離株を効率的に中和するこれらの抗体の限られた数は、露出されるエピトープが、特異的体液性免疫反応を誘導するために効率的でない場合があること示す。従って、このエピトープおよびその近傍を永続的に提示できる分子を構築することは、非常に関心をひくであろう。
【０００４】
幾つかの戦略が、ｇｐ１２０上のＣＤ４ｉエピトープを露出させるために利用された。ｇｐ１２０の可変ループからの特定のＮ結合グリコシル化部位の除去は、これらの突然変異ウイルスを、ＣＤ４ｉ抗体によってより中和されやすくした。ｇｐ１２０とヒトＣＤ４の４つの細胞外ドメインとの可溶性架橋複合体が構築された。それらは、交差反応性中和活性を有する抗体をはじめとする、広範な初代ＨＩＶ−１分離株に対する中和抗体を生成する。可溶性タンパク質は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を刺激するが、ＨＩＶ−１感染症の制御に重要であることが知られている、ＣＤ８＋ Ｔ細胞媒介免疫反応を効率的に誘導しない。これらの問題を克服するための代替アプローチは、ｇｐ１２０−ＣＤ４複合中間体を模倣する一本鎖ポリペプチドの構築である。アミノ酸数２０のリンカーによりＣＤ４の最初の２つのドメインに連結されたＨＩＶ−１ ｇｐ１２０タンパク質が構築され、これは、ＣＤ４ｉエピトープの露出増加を示したが、ウイルス中和は媒介しなかった。より最近、ＪＲＬＦ ｇｐ１２０タンパク質を、ＣＤ４の同じＤ１およびＤ２ドメインに、またはＣＤ４のＣＤＲ２様ループを再生産するＣＤ４構造由来配列、ＣＤ４Ｍ９に接合させることによって、他の融合タンパク質が構築された。唯一ｇｐ１２０−ＣＤ４D12分子は、中和抗体を誘導したが、もっぱらＣＤ４に対するものであるようである。
【０００５】
ｇｐ１２０糖タンパク質の可変領域、Ｖ１／Ｖ２は、細胞受容体および共受容体のための結合部位を部分的に塞ぐという仮説が以前に立てられていたので、ｇｐ１２０ Ｖ２およびＶ１／Ｖ２ループの欠損研究は、向上した中和活性を示すＣＤ４ｉエピトープの露出を増加させる結果となった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、ＣＤ４由来の配列によってｇｐ１２０の特定の領域を置換することにより、リンカー配列または架橋剤を使用することなく、可変トランス配座ｇｐ１２０由来分子を得ることができることを発見した。そうしたキメラの研究を行って、それらが免疫原性であること、および特定のケモカイン（単数または複数）との組み合わせでワクチン／殺菌剤用途のための効力ある製品になることを明らかにした。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、キメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質を提供することである。
【０００８】
本発明のもう１つの目的は、そうした分子をコードするＤＮＡ構築物を提供することを目指す。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、前記キメラｇｐ１２０糖タンパク質の免疫学的および医薬的用途にも関する。
【００１０】
本発明のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質は、ｇｐ１２０可変領域Ｖ１および／またはＶ２の少なくとも一部が、ＣＤ４構造由来配列によって置換されていることを特徴とする。
【００１１】
結果として生じるキメラは、野生型ｇｐ１２０のものと類似したサイズおよび構造を有し、ならびにｇｐ１２０／ＣＤ４複合体の特性の大部分、特に、天然ＣＣＲ５受容体を認識するその能力および特異的体液性免疫反応を誘導することができるＣＤ４ｉエピトープを露出させるその能力を模倣する能力を示す。
【００１２】
好ましいキメラ糖タンパク質では、ＣＤ４由来配列が、Ｖ１可変領域と、Ｖ２可変領域の一部とを置換している。
【００１３】
有利には、前記ＣＤ構造由来（ｓｄＣＤ４）ペプチドは、ヒトＣＤ４受容体のＣＤＲ２様ループを模倣する。
【００１４】
好ましくは、前記ＣＤ４由来ペプチドは、ＣＤ４の１５〜３５のアミノ酸、とりわけ２０〜３０のアミノ酸を含む。
【００１５】
価値のあるＣＤ４構造由来ペプチドは、例えば、２８のアミノ酸を有し、有利には、配列番号５ ＣＮＬＥＡＣＱＫＲＣＱＳＬＧＬＱＧＫＣＡＧＳＦＣＡＣの配列を有する。
【００１６】
前記キメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０分子において、ＣＤ４由来配列は、有利には、Ｖ１と、Ｖ２ループからの１０〜２０のアミノ酸、例えば、Ｖ２ループの１６のアミノ酸とを置換している。
【００１７】
上で開示したキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質は、それらが抗ＣＤ４ｉモノクローナル抗体によって認識されるが、抗ＣＤ４抗体によって認識されないことを、さらに特徴とする。
【００１８】
さらにまた、本発明のキメラ糖タンパク質は、実施例において例証するように、ＣＧ１０、Ｅ５１およびＬＦ１７モノクローナル抗体によって認識される。
【００１９】
本発明のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質は、それらがＣＤ４受容体およびＣＣＲ５共受容体に結合することを、なお、特徴とする。
【００２０】
本発明は、上で開示したキメラ分子中の露出されたＣＤ４ｉエピトープに向けられた免疫処理用製品、抗血清および抗体にも関する。
【００２１】
前記抗体は、ポリクローナル抗体、例えば、動物に免疫し、その抗血清から回収することにより得られたポリクローナル抗体を含む。それらは、モノクローナル抗体、例えば、骨髄腫細胞とリンパ球（特に、上で定義したものなどのキメラ分子の注射によって事前に免疫した動物の脾臓または神経節のリンパ球）を融合させ、得られたハイブリドーマの上清を、例えばＥＬＩＳＡまたはＩＦＩ技術に従ってスクリーニングして、本キメラ分子に特異的に向けられた抗体を明らかにすることにより得られたもの、も含む。
【００２２】
これらのモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ株も本発明の一部である。
【００２３】
上で開示したキメラ分子をコードするＤＮＡ構築物も本発明の一部である。
【００２４】
有利には、これらのＤＮＡ構築物は、野生型ｇｐ１２０分子をコードするＤＮＡにおいて、ＣＤ４由来ペプチドをコードするフラグメントでＶ１および／またはＶ２ ｇｐ１２０可変領域をコードするフラグメントを置換することによって得られる。有利には、これらのフラグメントは、合成経路によって得られる。
【００２５】
その後、それらのＤＮＡ構築物を発現ベクターにおいてサブクローニングし、細胞のトランスフェクションのために使用する。
【００２６】
上に開示したキメラＨＩＶ−１構築物は、単独で、または組み合わせで、ＨＩＶ−１による感染症の予防に有用な特異的体液性免疫反応を誘導することができ、強力な免疫原性ツールでもある。
【００２７】
ＴＬＲリガンド、例えばＴＬＲ９リガンド（例えば、ＣｐＧ様モチーフ）を伴う本発明のキメラＨＩＶ−１構築物は、特に有用である。
【００２８】
対象となる他の組み合わせは、前記キメラ構築物とＩＬ−２２および／またはＣＣＬ２８を含む。
【００２９】
上で定義したものなどの特に好ましい組み合わせでのキメラ構築物は、例えば本実施例において開示するものなどのキメラ１および２である。
【００３０】
従って、本発明は、少なくとも１つのキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質（上で定義したとおり）の有効量と担体を含む、ＨＩＶ−１感染症に特異的なワクチン組成物に関する。
【００３１】
当業者は、前記ワクチン組成物の調合および用量を、所望される投与方法および考慮している患者（年齢、体重）に応じて、明らかにし、調整することができる。
【００３２】
これらの組成物は、１つ以上の生理学的に不活性なビヒクル、および特に、調合におよび／または所望される投与方法に適する賦形剤を含む。
【００３３】
本発明は、上で定義したものなどのＴＬＲリガンド、ＩＩ−２２および／またはＣＣＬ２８をさらに含むＨＩＶ−１感染症に特異的なワクチン組成物にも関する。
【００３４】
本発明は、ＨＩＶ−１感染症の存在または不在の診断のための、少なくとも１つの抗体（例えば、上で定義したもの）の、有効量での使用も目的とする。
【００３５】
本発明は、ＨＩＶ感染症を緩和および／または予防および／または治療するための組成物、特に医薬組成物を製造するための、抗体（例えば、上で定義したもの）の任意の使用も目的とする。
【００３６】
本発明の他の特徴および利点は、図１〜１９に関連して後続の実施例において与えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
材料および方法
細胞系統および抗体
すべての哺乳動物株細胞を５％ ＣＯ2雰囲気中、３７℃で維持した。
【００３８】
組み込まれたＨＩＶ ＬＴＲ−ｌａｃＺ（１）を有するＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５（ＣＤ４+／ＣＣＲ５+）およびＴａｔ発現性ＨｅＬａを使用した（Ｐ．Ｃｈａｒｎｅａｕ ａｎｄ Ｏ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ（フランス、パリのＰａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、これらの株細胞を成長させた。５０μｇ／ｍＬのヒグロマイシンＢおよび２ｍＭ メトトレキサートに加えて４００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８）も、両方の細胞に、それぞれ補足した。
【００３９】
１０％ＦＢＳ、ゲンタマイシンおよび４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含有する改良型変性イーグル培地中で、ヒト胚性腎細胞（２９３Ｔ−ＨＥＫ）を培養した。
【００４０】
米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（メリーランド州、ロックヴィル）から入手したＣＤ４陽性ヒトリンパ球様細胞（ＣＥＭ）を、１０％ＦＢＳおよびゲンタマイシンを補足したＲＰＭＩ １６４０培地中で成長させた。
【００４１】
イヌ胎仔胸腺細胞（Ｃｆ２ＴｈＲ５−ＣＣＲ５+）を使用し（マサチューセッツ州、ボストン、Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＪ．Ｓｏｄｒｏｓｋｉ）、１０％ＦＢＳ、ゲンタマイシンおよび４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含有するＤＭＥＭ中で培養した。
【００４２】
変性させ、１０％ＦＢＳを補足したＴＣ１００培地（メリーランド州、ゲーサーズバーグのＧＩＢＣＯ ＢＲＬ ＬＩＦＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、２８℃で、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）昆虫細胞を増殖させた。
【００４３】
ヒツジポリクローナル抗ｇｐ１２０抗体Ｄ７３２４は、Ａａｌｔｏ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ（アイルランド、ダブリン）から入手した。
【００４４】
ウサギ抗ｇｐ１２０抗血清は、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌ Ｃｏｒｐ（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）で購入した組換えＨＩＶ−１ＩＩＩＢ ｇｐ１２０でウサギを免疫した後、研究室において製造した。
【００４５】
ヒトＣＤ４ｉモノクローナル抗体（ＭＡｂ）４．８Ｄ（２）Ｅ５１（３）およびＬＦ１７を使用した（Ｊ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（ルイジアナ州、ニューオリンズのＴｕｌａｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））。
【００４６】
ＣＤ４ｉ特異的ＭＡｂ ＣＧ１０は、Ｄｒ．Ｊ．Ｇｅｒｓｈｏｎｉ（イスラエル、テルアビブのＧｅｏｒｇｅ Ｗｉｓｅ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から得た。
【００４７】
ヒトＭＡｂ Ｆ１０５（４）を使用した（Ｍ．Ｐｏｓｎｅｒ（マサチューセッツ州、ボストンのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ））。
【００４８】
可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）は、Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ Ｃｏｒｐ．（ニューヨーク州、タリータウン）から購入した。
【００４９】
ＤＮＡ構築物
ＨＩＶ−１ ＹＵ２ ｇｐ１６０エンベロープＤＮＡを、ｐＴＺ−ＹＵ２（ＨＩＶ−１ ＹＵ２の全配列を含有するプラスミド）をテンプレートとして使用して、ＰＣＲによって増幅させた。配列番号１〜４をそれぞれ有する以下のプライマーを使用した。
ｐＳＶＩＩＩｅｎｖ構築のために、
フォワードとして、配列番号１：５’ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＧＡＣＧＧＡＧＡＴＣ（下線を引いたＫｐｎｌ部位を含有する）、および
リバースとして、配列番号２：５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＴＡＧＣＡ ＡＡＧＣＴＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＣＣ（下線を引いたＢａｍＨＩ部位を含有する）；ならびに
ｐＣＥＬ／Ｅ１６０構築のために、
フォワードとして、配列番号３：５’ ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＡＴＧＡＧＡＧＣＧＡＣＧＧＡＧＡＴＣ（下線を引いたＸｈｏｌ部位を含有する）、および
リバースとして、配列番号：５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＧＣＴＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＣＣ（下線を引いたＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する）。
【００５０】
Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖiｔｒｏｇｅｎ）を使用して生じさせたＰＣＲ生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。
【００５１】
由来するＣＤ４構造（配列番号５ ＣＮＬＥＡＣＱＫＲＣＱＳＬＧＬＱＧＫＣＡＧＳＦＣＡＣ）に対応する、合成により生じさせたフラグメントで、野生型ｇｐ１６０におけるＮｓｉｌ−Ｓｔｕｌカセットを置換することにより、ｇｐ１６０キメラをコードするＤＮＡフラグメントを構築した。
【００５２】
その後、これらの構築物をｐＳＶＩＩＩｅｎｖにサブクローニングして、ＢａｍＨＩ／Ｋｐｎｌ制限酵素の使用して野生型ｇｐ１６０をコードするＤＮＡフラグメントを置換し、ならびにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（マサチューセッツ州、ベヴァリーのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｇｉｏｌａｂｓ）によって平滑末端形を形成することによりサイトメガロウイルスＣＭＶプロモーターを有するｐＣＥＬ／Ｅ１６０ ＨＩＶ−１エンベロープ発現ベクターにもサブクローニングした。
【００５３】
野生型ｇｐ１２０タンパク質の発現のためのｐ１１９Ｌバキュロウイルストランスファーベクターは、以前に説明されている（４）とおり構築した。
【００５４】
配列番号６および７の配列を有する以下のプライマーを使用して、ｇｐ１２０キメラをコードするＤＮＡフラグメントを構築した：
フォワードとして、配列番号６：５’ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＴＣＴＴＡＴＧ（下線を引いたＨｐａｌ部位を含有する）、および
リバースとして、配列番号７：５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＴＡＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡ ＣＣＡ（下線を引いたＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する）。これらのＰＣＲ生成物をｐ１１９Ｌにクローニングして、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素の使用により野生型ｇｐ１２０配列を交換した。
【００５５】
タンパク質発現および精製
ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬（ドイツ、マンハイムのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用して、ｐ１０プロモーター（５）およびｇｐ１２０キメラを含有するｐ１１９Ｌトランスファーベクターの制御下、ポリヘドリン遺伝子を発現するウイルスＡｃＳＬＰ１０ ＤＮＡでＳｆ９昆虫細胞をコトランスフェクトすることにより、ｇｐ１２０エンベロープキメラを生産した。コトランスフェクションの４日後、上清を回収し、組換えウイルスプラークをプラークアッセイ（６）によって選択した。可能性のある組換えプラークを、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素での消化およびウエスタンブロット分析によってスクリーニングした。以前に説明されている（７）ような２つのタイプのカラム、セファロースＣｏＡゲルカラム（英国、バッキンガムシアのＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌｔｄ．）およびデキストランスルフェートゲルカラム（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、プールされた上清からエンベロープタンパク質を精製した。
【００５６】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
４℃で一晩、１０ｇ／ｍＬの抗ｇｐ１２０ Ｄ７３２４でマイクロタイタープレートを被覆した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間、３７℃でプレートをブロックし、その後、ＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。ＰＢＳ−１０％ＦＢＳで希釈した、可溶性ｇｐ１２０ＹＵ２およびキメラタンパク質を、ｓＣＤ４（２０μｇ／ｍＬ）の存在下または不在下、３７℃で１時間、インキュベートし、その後、その被覆抗体と共に１時間、３７℃でインキュベートした。その後、ＭＡｂの系列希釈物を捕捉タンパク質と共にインキュベートし、結合した抗体を１／１０，０００希釈でのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびｏ−フェニレンジアミン基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で検出した。５〜１０分後、２Ｍ Ｈ2ＳＯ4の添加により、呈色反応を停止させ、４９０ｎｍでの吸収を測定した。
【００５７】
表面プラズモン共鳴分析
実験は、ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００装置（スウェーデン、ウプサラのＢＩＡＣＯＲＥ）を使用して、ＨＢＳ−ＥＰ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％非イオン性界面活性剤 Ｐ２０、ｐＨ７．４）中、２５℃で行った。ＣＤ４ｉ ＭＡｂへのキメラタンパク質の親和性結合を判定するために、それらを、アミンカップリングを使用してＣＭ４センサーチップ表面に固定した。野生型ｇｐ１２０ＹＵ２を３７℃で１時間、ｓＣＤ４と予備混合した後、注入した。解離期の後に１０ｍＭ ＨＣｌでの再生段階を続けた。得られたすべてのセンサーグラムを、対照参照表面からのシグナルを引くことにより補正した。１：１ラングミュアモデルを使用して、会合および解離データを一致させた。
【００５８】
細胞表面受容体結合
合計２×１０5個のＣＥＭ（ＣＤ４+／ＣＣＲ５-）細胞またはＣｆ２ＴｈＲ５（ＣＣＲ５+）細胞をＰＢＳ−０．３％ＢＳＡで２回洗浄し、ｓＣＤ４（２０μｇ／ｍＬ）を伴うまたは伴わない１μｇ／ｍＬの野生型ｇｐ１２０またはキメラタンパク質と共にインキュベートした。１時間、３７℃で、抗ｇｐ１２０と共に細胞をインキュベートした。その後、洗浄した後、細胞を、４５分間、室温で、１：５０希釈での二次ＰＥコンジュゲート化抗体（ペンシルバニア州、ギルバートビルのＲｏｃｋｌａｎｄ）と共にインキュベートした。その後、細胞を同じ条件で洗浄し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してＦＡＣＳｏｒｔ装置（カリフォルニア州、マウンテンビューのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
【００５９】
シングルサイクル感染性アッセイ
野生型ｇｐ１６０またはキメラタンパク質を発現するｐＳＶＩＩＩｅｎｖプラスミドを、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（カリフォルニア州、バレンシアのＱｉａｇｅｎ）を使用して、ｐＣＭＶ Ｇａｇ−ＰｏｌパッケージングプラスミドおよびｐＨＩＶ−ｌｕｃベクターで２９３Ｔ−ＨＥＫ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３０時間後、細胞上清を回収し、細孔径０．４５μｍのフィルターによって濾過し、超遠心分離法によって濃縮した。Ｃｆ２ＴｈＲ５およびＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５細胞の感染のために、標準量の偽型ウイルス（２００ｎｇのｐ２４タンパク質）を細胞と共に、９６ウエル照度計プレート（バージニア州、シャンティイーのＤｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において４８時間、３７℃でインキュベートした。１００μＬのルシフェラーゼアッセイ用緩衝液および５０μＬのルシフェラーゼ基質（ウィスコンシン州、マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）を細胞可溶化物に添加し、ＴＥＣＡＮ Ｇｅｎｉｏｓ照度計で化学発光の強度を測定することにより、ルシフェラーゼ活性を決定した。
【００６０】
細胞−細胞融合アッセイ
６ウエルプレートにおいて集密度７０％に成長させたＨｅＬａ−ｔａｔを、製造業社によって推奨されているとおりにリポフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１μｇのエンベロープタンパク質発現性プラスミドでトランスフェクトした。等量のＨｅＬａ ＣＤ４+／ＣＣＲ５+ ＬＴＲ−ｌａｃＺ細胞をトランスフェクションの４８時間後に添加した。一晩、共培養した後、付着細胞を０．５％グルタルアルデヒドで１０分間固定し、β−ガラクトシダーゼ活性について、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）基質で、一晩、３７℃で染色した。ウエル当たりの青色に染色されたフォーカスの合計数をカウントし、顕微鏡写真を得た。
【００６１】
結果
ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ１ｓｄＣＤ４およびｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４タンパク質の構築および精製
本発明のキメラタンパク質は、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ＹＵ２配列に挿入されたｓｄＣＤ４を有するＣＤ４ｉ配座を示す一本鎖糖タンパク質である。ＣＤ４由来ペプチドは、２８のアミノ酸を有し、ならびにｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質のための主結合部位であるヒトＣＤ４受容体のＣＤＲ２様ループを模倣する。オリゴヌクレオチドから合成により生じさせたこのＣＤ４由来ペプチドのＤＮＡ配列を、図１に示すとおり、ｇｐ１２０ＹＵ２糖タンパク質のＶ１／Ｖ２可変領域にクローニングした。図１：（Ａ）野生型ｇｐ１２０ＹＵ２のＶ１／Ｖ２ループの予想アミノ酸配列。（Ｂ）Ｖ１とＶ２ループの一部（１６のアミノ酸）とがｓｄＣＤ４配列で置換されたｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４エンベロープタンパク質。（Ｃ）ｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４タンパク質において、１５６〜１６８アミノ酸をコードする領域を置換することによりｓｄＣＤ４をＶ２ループに挿入した。全Ｖ１ループを保持していた。アミノ酸数は、システイン残基に対応する。
【００６２】
ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４キメラタンパク質は、Ｖ１ループとＶ２ループからの１６のアミノ酸残基とをｓｄＣＤ４配列で置換することによって構築した。
【００６３】
ｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４キメラタンパク質は、全Ｖ１ループを保持するが、Ｖ２ループ内の１５６〜１６８アミノ酸をコードする領域はｓｄＣＤ４によって置換されている。
【００６４】
野生型およびキメラｇｐ１２０配列をバキュロウイルストラスファーベクター、ｐ１１９にクローニングした。組換えタンパク質の効率的な分泌を助長するために、天然ＨＩＶシグナル配列を、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）バキュロウイルスのエクジステロイドグリコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）遺伝子から単離された新たなシグナル配列（７）によって置換した。構築したすべてのキメラは、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析によって判定して、ほぼ同量のｇｐ１２０エンベロープタンパク質を発現した。挿入されたｓｄＣＤ４配列は、発現レベルに影響を及ぼさなかったようである。さらに、二段階精製手順を使用してこれらのタンパク質をＳｆ９昆虫細胞培養上清から精製し、その後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって特性付けした。結果を図２に与える。そのゲルをクマシン・ブルーで染色するか（図２Ａ）、または抗ｇｐ１２０ Ｄ７３２４抗体を使用するウエスタンブロット分析（図２Ｂ）のために処理した（右の矢印は、エンベロープタンパク質の位置を示す）。
【００６５】
１００ｋＤａの見かけの分子量（ＭＷ）を示すバンドに対応するキメラは、同じ条件下で発現された野生型ｇｐ１２０エンベロープのものと一致する。
【００６６】
キメラタンパク質の抗原特性
キメラタンパク質の構造の完全性は、公知エピトープ特異性に対するＭＡｂのパネル（Ｄ７３２４、ＣＧ１０、ＬＦ１７およびＦ１０５）での酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって判定した。前記ＥＬＩＳＡは、ＣＤ４誘導性結合部位に対するＣＤ１０およびＬＦ１７ ＭＡｂを用いて、「材料および方法」において説明したとおりに行った。
【００６７】
結果を図５に与える。野生型ｇｐ１２０（丸）、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４（四角）、ｇｐ１２０△Ｖ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４（ひし形）およびｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４（三角、◆）タンパク質をＤ７３２４抗体によって捕捉し、ＭＡｂｓ ＣＧ１０（Ａ）、ＬＦ１７（Ｂ）およびＦ１０５（Ｃ）を、示されている濃度で添加した。結合した抗体の量を固有のＦ（ａｂ’）２−ＨＲＰコンジュゲートによって検出し、４９０ｎｍでの光学密度として表した。
【００６８】
これらの抗体は、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体のみを認識し、ｓＣＤ４不在下ではｇｐ１２０を認識しない。両方のキメラタンパク質がＣＧ１０によって認識された。しかし、ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４キメラタンパク質のほうがｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４より効率的に認識された（図５Ａ）。これは、このエピトープの露出のほうが少なかったことを示唆している。図５Ｂに示すように、ＬＦ１７は、両方のキメラタンパク質に同様の効率で結合したが、野生型ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体と比較すると劣っていた。
【００６９】
ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体の形成は、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位の露出を阻害するので、キメラタンパク質に結合するＣＤ４結合部位抗体の能力を試験した。
【００７０】
図５Ｃに示すように、ヒトＦ１０５ ＭＡｂは、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体およびキメラタンパク質より良好に、野生型ｇｐ１２０タンパク質に結合した。ｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４は、前記複合体およびｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４タンパク質より効率的に認識された。
【００７１】
これらのデータは、ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４タンパク質が、より良好にＣＤ４ｉエピトープに暴露され、従って、ＣＤ４結合エピトープにはそれほど暴露されないという以前の結果と一致した。
【００７２】
前述の結果は、挿入されたｓｄＣＤ４が、特にＧＰ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４タンパク質において、ＣＤ４ｉエピトープの露出をもたらすキメラタンパク質の配座変化を生じさせることを明示している。
【００７３】
興味深いことに、抗ＣＤ４、ＳＴ４およびＢＦ５ ＭＡｂ（ＣＤ４分子に加えて、ｇｐ１２０および近傍エピトープへの結合にそれぞれ関与するエピトープを特異的に認識することができる）は、２つのｇｐ１２０／ＣＤ４キメラをいずれも認識しない。これは、これらの分子が、免疫処置後に抗ＣＤ４抗体を誘導する確率は低いことを意味する。
【００７４】
さらに、Ｖ２ループ、その配座エピトープ２Ｇ１２、ＣおよびＮ末端ペプチドそれぞれに対する抗ｇｐ１２０ＭＡｂは、キメラ上のこれらのエピトープを、それらが野生型ｇｐ１２０上でそれを認識するのと同様に認識することができた。
【００７５】
固定化ＣＤ４ｉＭａｂへのキメラタンパク質の結合強度のＢＩＡＣＯＲＥ分析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により会合速度定数（ｋa）、解離速度定数（ｋd）ならびに平衡解離定数（ＫＤ）を決定することにより、ＣＤ４ｉ ＭＡｂへのキメラタンパク質の定量的結合を行った。ｓＣＤ４、ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４またはｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４タンパク質を伴うまたは伴わない、様々な濃度の野生型ｇｐ１２０ＹＵ２を、固定化４．８ＤおよびＥ５１ ＣＤ４ｉ ＭＡｂの上に通した。
【００７６】
結果を次の表にまとめる：
表１．キメラｇｐ１２０と抗ＣＤ４ｉ ＭＡｂとの分子相互作用の動力学的パラメータ。会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）および平衡解離定数（ＫＤ）。Ｒｍａｘは、固定化抗体への最大タンパク質結合能力を表す。
【００７７】
【表１】
得られたセンサーグラムを図３Ａ〜Ｄに示す。様々な濃度のｇｐ１２０Ｖ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４（Ａ、Ｃ）およびｇｐ１２０Ｖ２ｓｄＣＤ４（Ｂ、Ｄ）タンパク質を固定化４．８Ｄ（Ａ、Ｂ）およびＥ５１（Ｃ、Ｄ）上に５０μＬ／分の流量で通した。ＭＡｂは、ＣＭ４センサーチップに、それぞれ２０００および１１００ ＲＵで固定した。ＲＵ、応答単位。結合定数の概要を図３Ｅに提示する。
【００７８】
ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４およびｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４の算出ＫＤ（ｋｄ／ｋａ）は、４．８ｄ ＭＡｂについては、それぞれ、０．０１５±０．０００４ｎＭおよび０．０３８±０．０００７ｎＭであったが、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体の対応するＫＤは、１００倍高かった。
【００７９】
この差は、主として、これらのキメラタンパク質についてのより高いｋａに起因する。
【００８０】
別のＣＤ４ｉ Ｍａｂ、Ｅ５１で同様の結果が観察された。ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４およびｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４のＫＤ値は、それぞれ、０．０１２±０．０００２ ｎＭおよび０．０１３±０．０００１ ｎＭであった。これは、Ｅ５１ ＭＡｂ対する高い親和性結合を示唆している。図４は、ｓＣＤ４を伴うまたは伴わないｇｐ１２０ＹＵ２とＣＤ４ｉ ＭＡｂとの相互作用ならびにキメラタンパク質とＣＤ４ｉ ＭＡｂとの相互作用についての重ね書きセンサーグラムを示すものである。４．８ｄ（Ａ）およびＥ５１（Ｂ）ＭＡｂを２０００および１１００ ＲＵで固定し、タンパク質を３０μＬ／分の流量で通過させた。ｇｐ１２０ＹＵ２タンパク質を３倍モル過剰のｓＣＤ４と共に１時間、３７℃でインキュベートした後、注入した。
【００８１】
ｓＣＤ４不在下、野生型ｇｐ１２０ＹＵ２は、４．８ｄに対する有意な結合を示さなかったが、Ｅ５１ ＭＡｂにはわずかに結合した。予想どおり、ｓＣＤ４は、高い親和性での両方のＣＤ４ｉ抗体に対する結合を増加させた。しかし、両方のキメラタンパク質が、より高い親和性で４．８ｄおよびＥ５１に結合した。これは、挿入されたｓｄＣＤ４が、それらのタンパク質の正しいフォールディングに影響を及ぼさないことを示している。
【００８２】
ＣＣＲ５およびＣＤ４受容体へのｇｐ１２０キメラタンパク質の結合
ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡＣＯＲＥ技術による上の結果によって、キメラタンパク質、特にｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４がＣＤ４結合配座を有することが明らかになったので、これらのタンパク質がＣＣＲ５ケモカイン受容体に結合するかどうかを評定する実験を行った。
【００８３】
多量のＣＣＲ５を発現するＣｆ２ｔｈＲ５細胞を、ｓＣＤ４の存在下または不在下で、野生型およびキメラｇｐ１２０タンパク質と共にインキュベートした。結果を図６に与える（図６は、Ｃｆ２ＴｈＲ５およびＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５株細胞それぞれにおいて発現されたＣＣＲ５受容体（Ａ）およびＣＤ４（Ｂ）受容体に対するＣＣＲ５の結合活性を示す）。それらの細胞をｇｐ１２０（＿ ＿）、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４（ ）、ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４（........）またはｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４（……）タンパク質のいずれかと共に１時間、３７℃でインキュベートした。結合したタンパク質を、抗ｇｐ１２０抗血清（Ａ）およびＣＧ１０ ＭＡｂ（Ｂ）を使用して検出し、ＰＥ結合二次抗体を使用して顕示した。染色された細胞を洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。
【００８４】
図６Ａに示されているように、両方のキメラタンパク質は、ｓＣＤ４の不在下では、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４タンパク質複合体と同様によくＣＣＲ５に結合し、これは、共受容体結合部位およびＣＤ４ｉエピトープの正しい露出を示唆している。ｓＣＤ４の存在は、ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４のＣＣＲ５への結合を増加させないが、ｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４の結合はわずかに増加させる。
【００８５】
第二のアッセイにおいて、ＣＤ４受容体に結合するキメラタンパク質を試験した。ＣＣＲ５タンパク質ではなくＣＤ４タンパク質を発現するＣＥＭ細胞を野生型およびキメラタンパク質と共に１時間、３７℃でインキュベートした。両方の組換えタンパク質は、野生型タンパク質と比較してＣＤ４結合の減少を示した（図６Ｂ）。ＣＤ４受容体に結合するｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４の能力は、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合タンパク質に類似していたが、ｇｐ１２０Ｖ２ｓｄＣＤ４は、より良好にＣＤ４に結合した。
【００８６】
細胞表面発現ＨＩＶ−１キメラエンベロープの細胞−細胞融合アッセイ
キメラタンパク質が、シンシチウム形成をもたらす融合活性を維持するかどうかを判定するために、ＨｅＬａ−Ｔａｔ細胞をｐＣＥＬエンベロープ発現ベクターでトランスフェクトした。それらのトランスフェクトされた細胞を、ＣＤ４およびＣＣＲ５受容体を発現するＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５細胞と共培養した。野生型ｇｐ１６０（Ａ）、ｇｐ１６０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４（Ｂ）またはｇｐ１６０ΔＶ２ｓｄＣＤ４（Ｃ）エンベロープ構築物で、ＨｅＬａ−Ｔａｔ細胞をトランスフェクトした（図７）。トランスフェクション後４８時間の時点で、それらの細胞を、組み込まれたＨＩＶ ＬＴＲ−ｌａｃＺを有し、ＣＣＲ５およびＣＤ４受容体を発現するＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５細胞と共培養した。細胞を固定し、Ｘ−Ｇａｌで染色した。一晩、インキュベートした後、シンシチウムをカウントした。いずれのキメラタンパク質も検出可能なシンシチウム形成を生じなかった。これらの条件下で野生型は、８９を超えるシンシチウムを形成した。
【００８７】
キメラエンベロープ糖タンパク質を含有するウイルス粒子による感染
ウイルス侵入を媒介するキメラタンパク質の能力を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするｅｎｖ欠損ＨＩＶ−１プロウイルスを補足する野生型またはキメラいずれかのエンベロープタンパク質を発現するプラスミドを使用して分析した。２９３Ｔ細胞において生産された組換えビリオンを、ＣＣＲ５およびＣＣＲ５／ＣＤ４をそれぞれ安定して発現するＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５およびＣｆ２ＴｈＲ５細胞のいずれかと共にインキュベートし、ターゲット細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定した。ホタルルシフェラーゼを発現する組換えウイルスと、野生型ｇｐ１６０（１）、ｇｐ１６０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４（２）またはｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４（３）エンベロープ構築物のいずれかとを、ＨｅＬａ ＣＤ４+ＣＣＲ５+（Ａ）またはＣｆ２Ｔｈ−ＣＣＲ５（Ｂ）細胞のいずれかと共にインキュベートした（図８）。４８時間後、ルシフェラーゼ活性を、「材料および方法」において説明したとおりに測定した。これらのデータは、４つの独立した実験の代表である。
【００８８】
機能的野生型エンベロープタンパク質を含有するウイルス偽性粒子は、ＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５細胞を感染させ、Ｃｆ２ＴｈＲ５細胞も感染させたが、予想どおり、ｓＣＤ４が存在する場合だけであった。しかし、キメラタンパク質は、Ｃｆ２ＴｈＲ５細胞も、ＨｅＬａ Ｐ４Ｃ５細胞も感染させることができなかった。このことは、両方のタンパク質が、膜融合および複製プロセスのなんらかの側面を欠損しているようであることを示唆している。
【００８９】
本発明者らの結果を考え合わせると、ＨＩＶ−１ ＹＵ２からの野生型のｇｐ１２０の主要なエピトープがこれらの構築物では保存されるので、この種のタンパク質は、免疫処置の良好な原型とみなすことができると考えることができる。
【００９０】
マウスにおけるキメラプラスミドを使用するキメラ１およびキメラ２のインビボ免疫原性
この実験の目的は、ＨＩＶ ｇｐ１２０のその受容体への結合に干渉する小さなＣＤ４由来ペプチドを発現するキメラ（キメラ１およびキメラ２）の免疫反応に対する効果を評価することである。この目的を達成するために、リンカーまたは架橋剤を避けて、Ｖ１／Ｖ２可変領域にＣＤ４由来ペプチドを含有するキメラＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質でマウスを免疫した。２つの異なるアジュバント：ＣｐＧ様モチーフ（ＨＹＢ２０４８）およびインターロイキン−２２を使用した。
【００９１】
１．１．キメラ１またはキメラ２とＣｐＧ様モチーフ（ＨＹＢ２０４８）およびＩＬ−２２を併用する根本的理由
ここ数年にわたる広範な調査により、非メチル化ＣｐＧモチーフを含有する細菌ＤＮＡおよび合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＤＮＡ）は、Ｔｈ１サイトカインを生産するように、ＣＴＬ応答を促進するように、およびＢリンパ球による免疫グロブリンの生産を増進させるように免疫生得細胞を誘導する、効力あるアジュバントであることが実証された。ＣｐＧ ＤＮＡのこれらの効果は、樹状細胞の分化および成熟を刺激することが知られているＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）との相互作用の二次的なものである可能性が高い。様々なワクチン、抗原および免疫原とアジュバントとしてのＣｐＧ ＤＮＡの併用を、両腕の特異免疫の強化について評価した。例えば、不活化ｇｐ１２０欠損ＨＩＶ−１免疫原への合成ＣｐＧ ＤＮＡの追加は、齧歯動物および霊長類において細胞媒介ウイルス特異的免疫反応と体液性ウイルス特異的免疫反応の両方の増強をもたらす。最近、新規合成ＴＬＲ９アゴニストが利用可能となった。こうしたアゴニストの１つは、Ａｍｐｌｉｖａｘ（商標）と呼ばれるＨＹＢ２０４８２０５５である。ＨＹＢ２０４８２０５５は、新規３’−３’結合構造および合成ＣｐＲ（Ｒ＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン）モチーフからなる、免疫調節オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）である。この新規３’−３’構造は、自由な３’末端が不在のため、汎存ヌクレアーゼに対する、より大きな安定性をもたらし、ならびにＨＹＢ２０４８２０５５における２つの接触可能な５’末端の存在は、従来のＣｐＧ ＤＮＡと比較して強化されたＴＬＲ９活性化を生じさせる。加えて、合成ＣｐＲジヌクレオチドモチーフは、天然ＣｐＧジヌクレオチドモチーフと比較して高いＩＬ−１２および低いＩＬ−６を特徴とする独特なサイトカイン誘導プロフィールを誘導することが明らかになった。
【００９２】
ＩＬ−２２は、ＩＬ−１０を含む、ヒトＩ型ＩＦＮファミリーのメンバーである。ＩＬ−２２は、その受容体複合体内にＩＬ−２２Ｒ１を有するＩＬ−１０Ｒ２ｃ鎖に結合するので、ＩＬ−１０と相互作用する可能性がある。ＩＬ−２２は、炎症を媒介し、クラスＩＩサイトカイン受容体ヘテロ二量体ＩＬ−２２ ＲＡ１／ＣＲＦ２−４に結合する。このサイトカインは、免疫調節反応にも関与する。ＩＬ−２２阻害剤は、関節炎などの炎症性疾患を治療すると提唱されている。最近のデータは、ＩＬ−２２が、生得免疫を誘導し得ることを示唆しており（これらは、ＩＬ−２２が、暴露された未感染個体におけるＨＩＶに対する防御に関与することを示すデータによって完全なもととなった）、従って、ワクチンアジュバントの適するターゲットであるように考えられる。
【００９３】
単独でのならびにＨＹＢ２０５５およびＨＹＢ２０４８と組み合わせた場合のＨＩＶ−１免疫原、不完全フロイントアジュバントを用いて調合したｇｐ１２０欠損全滅ウイルスワクチン候補（ＨＩＶ−ＩＦＡ）の免疫原性をマウスモデルにおいて評価した。ＨＩＶ−ＩＦＡ単独と比較して、ＨＩＶ−ＩＦＡとＨＹＢ２０５５の組み合わせでの免疫処置は、ＨＩＶ特異的およびｐ２４特異的ＩＮＦγ、ＲＮＡＴＥＳ、ＭＩＰ １αおよびＭＩＰ １βの強力な生産、ならびにＨＩＶ特異的およびｐ２４特異的抗体の高い力価を惹起した。ＨＹＢ２０５５およびＨＹＢ２０４８を含めることにより、ＨＩＶ−ＩＦＡのみによって生産されるＩＬ−５のレベルも減少した。ＨＹＢ２０４８は、ＨＩＶ−ＩＦＡの免疫原性を強化し、１型サイトカインプロフィールの方に応答をシフトさせる。ＨＹＢ２０５５およびＨＹＢ２０４８アジュバントのこれらの免疫強化効果は、用量依存性であった。
【００９４】
従って、ＣｐＧ様モチーフまたはＩＬ−２２は、キメラ１および／またはキメラ２に対する免疫反応を増大させる有望なアジュバント候補であるように考えられる。
【００９５】
本発明の目的は、プラスミドとして単独で使用するイムノキメラが、ＨＩＶ特異的免疫反応を誘導することができるかどうか評定すること、ならびにＨＹＢ２０４８２０４８および／またはＩＬ−２２が、そうした反応を強化するかどうかを試験することである、研究である。
【００９６】
１．２．方法
１．２．１．キメラ構築物
野生型およびキメラｇｐ１２０配列をバキュロウイルストランスファーベクター、ｐ１１９Ｌにクローニングした。組換えタンパク質の効率的分泌を助長するために、天然ＨＩＶ−１シグナル配列を、オートグラファ・カリフォルニカバキュロウイルスのエクジステロイドグリコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）遺伝子から単離された新たなシグナル配列によって置換した。ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬を使用して、ｐ１０プロモーターおよびｇｐ１２０キメラを含有するｐ１１９Ｌトランスファーベクターの制御下、ポリヘドリン遺伝子を発現するウイルスＡｃＳＬＰ１０ ＤＮＡで、Ｓｆ９昆虫細胞をコトランスフェクトすることよって、ｇｐ１２０エンベロープキメラを生産した。コトランスフェクションの４日後、上清を回収し、組換えウイルスプラークをプラークアッセイによって選択した。可能性のある組換えプラークを、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素での消化、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。これらの実験において使用した試薬は、キメラ１およびキメラ２を含有する組換えバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞の上清であった。
【００９７】
１．２．２．プロトコルスキーム
７０匹の雌Ｃ５７／ＢＬ６マウス；週齢６〜８週（Ｎ＝５／群）を、イムノキメラ１もしくは２（マウス当たり２００μｇ：４頭筋当たり２×５０μｇ）および／またはマウスオリゴヌクレオチドＨＹＢ２０４８２０４８（マウス当たり１００μｇ：４頭筋当たり５０μｇ）および／またはＩＬ−２２（マウス当たり１００μｇ：４頭筋当たり５０μｇ）でＩＭ免疫した。初回免疫処置後、３週間の後、マウスに追加免疫した。
【００９８】
【表２】
【００９９】
１．２．３．免疫学的分析
単独で、天然ｐ２４抗原と共に、またはＨＩＶ−１抗原と共に、培地中で４日間、インビトロで刺激した新鮮な脾臓細胞を用いて、免疫学的分析を行った。
【０１００】
ＩＮＦ−ガンマ、ＩＬ−１２、ＩＬ−４；ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＭＩＰ１アルファ、ＭＩＰ１ベータ、ＲＡＮＴＥＳの生産をＥＬＩＳＡ法で評価した。
【０１０１】
Ｐ２４抗原およびＨＩＶ−１抗原特異的ＩＦＮ−ガンマ生産性リンパ球をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。
【０１０２】
１．２．４．統計解析
等しい中央値のウィルコキソン順位和検定を用いた。ベクトルｘおよびｙでの２つの独立したサンプルが、等しい中央値を有する分布から生じ、その検定からＰ値を返すという仮説の両側順位和検定を行う。ｐは、所与の結果を観察する確率、または万一、帰無仮設が真である、すなわち中央値が等しい場合には、１より大きい極値である。小さなｐ値は、帰無仮設の妥当性に疑いを投げかけ、従って、群間の差を示唆する。ことによると位置シフトを除いて同一であるが、他の点では任意である連続分布から、２セットのデータが生じると想定される。ｘおよびｙは、異なる長さを有する場合がある。
【０１０３】
１．３．結果
結果を図９〜１９のセットに提示する。
【０１０４】
図９．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−４の生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターロイキン−４の生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−４の生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−４の生産。すべてのパネルにおいて、両方のキメラでの免疫処置は、対照マウス（免疫処置なし）と比較してインターロイキン−４の生産を減少させる；左上のパネルにおける（基底条件における）両方のキメラについての差は有意であり、これは、両方のキメラがＩＬ−４の生産を抑制し、従って、ＴＨ２リンパ球の活性化を阻害することを示唆している。
【０１０５】
図１０．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−１０の生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターロイキン−１０の生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−１０の生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−１０の生産。インターロイキン−１０の生産は、対照マウスと比較して、キメラ２で免疫したマウスでは弱いが有意に（左上および下のパネル）増加した。これは、キメラ２の可能な抗炎症活性を示唆している。ＨＩＶ特異的刺激に反応して、ＩＬ−２２に反応して、同じ作用が観察される。
【０１０６】
図１１．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−５の生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターロイキン−５の生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−５の生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−５の生産。インターロイキン−５の生産は、対照マウスと比較して、免疫された場合に修飾されず、これにより、ＴＨ２活性化に対する抑制作用がさらに確認される。
【０１０７】
図１２．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産。インターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産は、対照マウスと比較して、免疫された場合に修飾されない（キメラ２で免疫された右上パネルにおけるマウスのみ、インターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産増加を示す）。結果は、キメラ２についてのＨＩＶ特異的応答の存在を示唆している。
【０１０８】
図１３．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−１２ ｐ７０サブユニットの生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターロイキン−１２ ｐ７０サブユニットの生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−１２ ｐ７０サブユニットの生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターロイキン−１２ ｐ７０サブユニットの生産。インターロイキン−１２ ｐ７０サブユニットの生産は、対照マウスと比較して、免疫された場合に修飾されない。
【０１０９】
図１４．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＲＡＮＴＥＳの生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのＲＡＮＴＥＳの生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるＲＡＮＴＥＳの生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるＲＡＮＴＥＳの生産。ＲＡＮＴＥＳの生産は、免疫された場合、対照マウスと比較して増加する（キメラ２のほうが強い効果を有する：上のパネルを参照のこと）。統計学的有意性に達していないにもかかわらず、キメラ２は、ＲＮＡＴＥＳのＨＩＶ特異的生産を刺激する点で陽性の傾向を有し、これは、ＴＨ１細胞に対する刺激効果を示唆している。
【０１１０】
図１５．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＭＩＰ１−アルファの生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのＭＩＰ１−アルファの生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるＭＩＰ１−アルファの生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるＭＩＰ１−アルファの生産。ＭＩＰ１−アルファの生産は、対照マウスと比較して、免疫された場合に修飾されない。ｇｐ１６０特異的応答（右上のパネル）は、キメラ２がＨＹＢ２０４６およびＩＬ−２２と会合しているとき、印象的に増加し（第三グループの棒を参照のこと）、これは、キメラ２活性が、ｃｐｇ様分子およびＩＬ−２２の追加により、ＭＩＰ１−アルファのＨＩＶ特異的生産およびそうした組み合わせの可能な直接的抗ウイルス効果を増幅するように、有意に修飾され得ることを示唆している。
【０１１１】
図１６．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＭＩＰ１−ベータの生産。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのＭＩＰ１−ベータの生産。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるＭＩＰ１−ベータの生産。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるＭＩＰ１−ベータの生産。ＭＩＰ１−ベータの生産は、対照マウスと比較して、免疫された場合に修飾されない。
【０１１２】
図１７．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ４およびＣＤ８）。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターフェロンガンマの生産（ＣＤ４およびＣＤ８）。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ４およびＣＤ８）。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ４およびＣＤ８）。インターフェロンガンマの生産（ＣＤ４およびＣＤ８）は、対照マウスと比較して、免疫された場合に増加する（キメラ１のほうが強い効果を有する：右上および下のパネル参照）。ｇｐ１６０応答（右上のパネル）は、キメラ１および２がＨＹＢ２０４８およびＩＬ−２２と会合しているとき、特に印象的である（第三および第四グループの棒を参照のこと）。これは、キメラ２活性が、ｃｐｇ様分子およびＩＬ−２２の追加により、ＴＨ１バランスを優先して細胞媒介免疫を刺激するＩＦＮガンマのＨＩＶ特異的生産を増幅するように、有意に修飾され得ることを示唆している。
【０１１３】
図１８．雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ８）。左上のパネル：基底条件（非刺激細胞）でのインターフェロンガンマの生産（ＣＤ８）。右上のパネル：ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０でインビトロで刺激した細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ８）。下のパネル：ＨＩＶ−１天然ｐ２４でインビトロで刺激した細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ８）。インターフェロンガンマの生産（ＣＤ８）は、対照マウスと比較して、免疫された場合に増加する（キメラ１のほうが強い効果を有する：左上および下のパネル参照）。データは、両方のキメラが、基底およびＨＩＶ特異的ＩＦＮガンマ生産を刺激する能力を有することを示唆している。
【０１１４】
図１９．左上のパネル：雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＣＣＲ５発現性ＣＤ４＋ Ｔ細胞の百分率。
右上パネル：雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＣＸＣＲ４発現性ＣＤ４＋ Ｔ細胞の百分率。
下のパネル：雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞による場合のＣＤ４＋／ＣＣＲ５＋のＣＤ４＋／ＣＸＣＲ４＋に対する比率。
ＣＣＲ５は、免疫されていないマウスと比較して、両方のキメラにより減少される；ＣＸＣＲ４は、キメラ１により有意に増加される；ＣＣＲ５ ＣＤ４＋ 細胞のＣＣＲ４ ＣＤ４＋ 細胞に対する比率は、両方での免疫処置によって有意に減少され、これは、ＨＩＶ感染症への細胞の罹病性が、有意に下方修飾されることを示している。データは、そうした分子が、ＨＩＶ疾患において予防ワクチンまたは殺菌剤として使用される可能性を有することを示唆している。
【０１１５】
結果は、キメラでマウスを免疫することによって免疫調節が確かに達成されることを示している。
【０１１６】
キメラに関連した免疫調節は、多くの側面を有し、例えば、それには、ＴＨ２細胞に対する阻害効果（インターロイキン−４の生産減少）、抗炎症成分（インターロイキン−１０の生産増加）、ＴＨ１リンパ球の直接刺激、ならびに細胞媒介免疫に対する効果（インターロイキン−１２の生産増加；ＩＮＦガンマ生産性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞数の増加）が挙げられる。
【０１１７】
これらの免疫調節特性に加えて、キメラは、２つの別個のメカニズム（可溶性抗ウイルスケモカインＲＡＮＴＥＳの生産増加、およびＣＣＲ５、主ＨＩＶ共受容体の下方修飾）によって、ターゲット細胞のＨＩＶ感染症への罹病率を減少させる。両方のキメラにこれらの効果が付与されているという観察にもかかわらず、総合的な免疫調節および抗ウイルス活性は、キメラ２で免疫されたマウスにおけるほうが効力が高いようである。両方のキメラの効果は、ＣｐＧ様化合物（ＨＹＢ２０４８）およびインターロイキン−２２の追加によって増加される。キメラでの免疫処置が、結果として免疫調節および直接的抗ウイルス効果を生じさせるという観察は、キメラが、ＨＩＶ疾患において予防ワクチンまたは殺菌剤として使用される可能性を有することを示唆している。
【０１１８】
細胞媒介免疫に対する単独でのおよびＣＣＬ２８と併用でのキメラ１またはキメラ２の効果
感染の予防に成功すために、ＨＩＶに対する粘膜ワクチンは、体液性免疫反応と細胞媒介免疫反応の両方に対して作用できる必要があると想定される。従って、キメラが非常に高い親和性で抗体に結合できることを発見し次第、本発明者らは、キメラが、ＨＩＶに感染した患者からのＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞におけるサイトカイン生産に影響を及ぼすことができるかどうか、ならびにＨＩＶ＋患者から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）においてエクスビボで使用したとき、ＣＣＬ２８の追加がキメラの細胞活性を強化できるかどうか試験することを決意した。
【０１１９】
ＣＣＬ２８（粘膜関連上皮性ケモカイン、またはＭＥＣとしても知られている）は、ＩｇＡ分泌性形質細胞の移動に関与する、および従って、ＨＩＶ感染症を予防するメカニズムにおいて一定の役割を果す可能性を秘めている、最近記載されたサイトカインである。
【０１２０】
ＩｇＡ分泌性形質細胞の移動へのＣＣＬ２８の関与は、特定のケモカインおよびケモカイン受容体と相関することが、最近、明らかになった。例えば、Ｉｇ発現性形質芽細胞および形質細胞（ＩｇＡ−ＡＳＣ）は、特定のサイトカインによってライゲートされる、ＣＣＲ９、ＣＣＲ３およびＣＣＲ１０をはじめとする多数の表面受容体タンパク質を特徴とする。特に、ＣＣＲ１０とＣＣＲ３の両方が、ＣＣＬ２８に結合する。
【０１２１】
この相互作用は、粘膜固有層におけるＩｇＡ−ＡＳＣの移動および補充を誘導する。特に、ＣＣＬ２８は、マウスとヒトの両方において研究されているあらゆる粘膜エフェクター部位（乳腺、唾液腺、子宮粘膜および子宮頚粘膜を含む）において、広範に発現され、多様な粘膜リンパ器官起源ならびに腸組織および腸外の組織起源のＩｇＡ−ＡＳＣを強力に化学的に誘引する。
【０１２２】
従って、ＣＣＬ２８−ＣＣＲ１０／ＣＣＲ３回路は、粘膜エフェクター部位での形質芽細胞および形質細胞の帰巣において主要な役割を果す統合システムであると考えられる。興味深いことに、これらの化学的誘引能力は、ＩｇＭまたはＩｇＧ ＡＳＣのいずれの移動もＣＣＬ２８−ＣＣＲ１０／ＣＣＲ３システムによって刺激されないので、ＩｇＡ−ＡＳＣに限定される。
【０１２３】
ＣＣＬ２８−ＣＣＲ１０／ＣＣＲ３回路には他の興味深い特色も付与されている。例えば、ＣＣＬ２８は、グラム陽性微生物とグラム陰性微生物の両方に対する効力ある抗菌力を有する。加えて、このケモカインは、骨髄間質細胞によって発現され、これは、ＣＣ２８とＣＣＲ１０＋／ＣＣＲ３＋ Ｂ細胞の相互作用が、粘膜の免疫反応と全身の免疫反応との統合に寄与し得ることを示唆している。
【０１２４】
１．方法
ＨＩＶ感染患者およびＨＩＶに暴露したが未感染の個体（ＥＳＮ）においてＣＣＲ３／ＣＣＲ１０／ＣＣＬ２８回路を検査した。３９人のＨＩＶ患者、３７人のＥＳＮおよび２５人のＨＣにおいて、血漿、唾液および生殖腺分泌物中のＣＣＬ２８を定量した。ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋およびＣＤ１４＋ 末梢血細胞（同じ個体からの細胞）において、ＣＣＲ３およびＣＣＲ１０発現を測定した。６５人のＨＩＶ感染女性および９人の未感染対照からの母乳中のＣＣＬ２８も定量した。
【０１２５】
結果を次のとおりまとめる：
１．ＥＳＮおよびＨＩＶ患者の血漿、唾液および生殖腺分泌物中のＣＣＬ２８の濃度は、ＨＣと比較して増加される。
【０１２６】
２．ＨＣと比較して、ＥＳＮおよびＨＩＶ患者において、百分率および平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＤ１９＋／細胞におけるＣＣＲ３およびＣＣＲ１０の細胞内レベルに基づく表面密度の比較測定値は、増加される。
【０１２７】
３．ＨＩＶおよびＥＳＮにおける血漿、唾液および生殖腺分泌物において、ＣＣＬ２８とＨＩＶ特異的ＩｇＡの間に正の相関関係が観察される。
【０１２８】
ＥＳＮは、高濃度のＨＩＶ特異的ＩｇＡの存在を特徴とし、従って、ＣＣＬ２８は、ＨＩＶ陰性暴露個体（ＥＳＮ）における感染を防止する事象の生化学的カスケードにおいて重要な役割を果すことがわかり、これが、この分子を抗ウイルス（ＨＩＶ）ワクチンの可能なターゲットにする。
【０１２９】
結果は、ＨＩＶに関するデータにより証明されるように、感染、すなわちウイルスに対する健常な抗原特異的免疫反応にはＣＣＬ２８が重要であることを示唆している。この分子は、単独で使用することができる、または抗ウイルス（ＨＩＶ）ワクチン用のアジュバントとして使用することができる可能性が高い。
【０１３０】
２．方法
細胞媒介免疫に対するＣＣＬ２８の可能な効果を評価するために、ＣＣＬ−２８発現性プラスミドの存在下、および／または２つのキメラタンパク質の存在下で、ＨＩＶ感染個体の末梢血単核細胞を培養した。
【０１３１】
２．１．抗原およびマイトジェンで刺激したＴリンパ細胞によるサイトカイン生産
細胞内分析
２％ ＡＢ＋ 血清を補足した培地にＰＢＭＣを再び懸濁させ、昆虫細胞の上清（対照）、キメラ１（０．５μｇ）、キメラ２（０．０５μｇ）、キメラ１または２＋ｐＣｐＧＣＣＬ２８、（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＣｐＧ発現ベクターにクローニングされたマウスＣＣＬ２８）、ＥＮＶ（５μＭの最終濃度でのＨＩＶ−１のｇｐ１６０からの５つの合成ペプチドのプール）、ＧＡＧ（ｇａｇ ｐ１７およびｇａｇ ｐ２４（ＧＡＧ）からの６つの合成ペプチドのプール）およびブドウ球菌腸毒素Ｂ（ＳＥＢ、４０μｇ／ｍＬ）（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）（陽性対照）を有する滅菌管に接種する。インキュベーション中に、ＣＤ２８に対する抗体（ミネソタ州、ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１μｇ／ウエルの用量で添加して、共刺激を助長する。Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（１０μｇ／ｍＬ 最終濃度）を各管に添加する。ＰＢＭＣを４２時間インキュベートし、その後、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ＣＤ４／ＩＦＮ−ガンマ／ＩＬ−２について、およびＣＤ８／ＩＮＦ−ガンマ／ＴＮＦ−アルファについて染色する。
【０１３２】
２．２．ＣＦＳＥでの増殖アッセイおよび増殖性細胞の表現型決定
ＣＦＳＥ Ｆｌｏｗ法は、細胞の多数のパラメータの分析のための簡単で高感度な技術となる。この方法は、増殖性細胞の特定の集団の研究を可能にする。先ず、ＰＢＭＣを、細胞中に受動的に拡散する膜透過性、非蛍光ＣＦＳＥと共にインキュベートする。過剰な染料を洗い流し、昆虫細胞の上清（対照）、キメラ１（０．０５μｇ）、キメラ２（０．０５μｇ）、キメラ１または２＋ｐＣｐＧＣＣＬ２８、（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＣｐＧ発現ベクターにクローニングされたマウスＣＣＬ２８）、ＥＮＶ（５μＭの最終濃度でのＨＩＶ−１のｇｐ１６０からの５つの合成ペプチドのプール）、ＧＡＧ（ｇａｇ ｐ１７およびｇａｇ ｐ２４（ＧＡＧ）からの６つの合成ペプチドのプール）およびブドウ球菌腸毒素Ｂ（ＳＥＢ、４０μｇ／ｍＬ）（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）（陽性対照）でのインビトロ刺激によってＰＢＭＣを増殖するように誘導する。それらの細胞を培養状態で５日間、維持する。細胞表面分子ＣＤ４およびＣＤ８についての蛍光標識抗体での染色により、特定のリンパ球サブセットの増殖を検査することができる。
【０１３３】
３．結果
図２０および２１は、ＣＤ４ Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマの生産に対する、ならびにＣＤ８ Ｔ細胞によるＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファの生産に対するキメラ１（ＣＨ１）およびキメラ２（ＣＨ２）＋／− ＣＣＬ２８の効果をそれぞれ示すものである。
【０１３４】
ＣＤ４ Ｔ細胞によるおよびＣＤ８ Ｔ細胞によるサイトカインの生産に対するキメラ１（０．５μｇ）＋／−ＣＣＬ２８の効果は観察されなかった（図２２および図２３）。キメラ２は、単独で、ＣＤ４ Ｔ細胞によるＩＬ−２の生産を、培地中５．２％から７．２％に、わずかに増加させることができる（図２０）。ｇｐ１２０／ＣＤ４キメラ２と一緒にＣＣＬ２８発現性プラスミドは、ＣＤ４＋、ＩＬ−２分泌性Ｔ細胞に対して極めて強い効果を生じることができる。実際、ＣＣＬ２８のキメラ２への追加は、ＩＬ−２を発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞を５．２％から１５．６％に増加させた（図２０）。同様の結果が、ＴＮＦ−アルファを発現するＣＤ８ Ｔ細胞で示され、ＣＣＬ２８のキメラ２への追加は、ＴＮＦアルファを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞を４．１％から１２．２に増加させた（図２１）。
【０１３５】
結論として、ＣＣＬ２８の追加は、キメラ２の免疫原性を増加させる。
【０１３６】
これらの結果は、粘膜免疫を目的とした感染性疾患において体液性および細胞媒介免疫を惹起する新規戦略についての枢要な結論の代表である。
【０１３７】
図２２および２３は、ＣＦＳＥ法を使用して、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖（図２２）およびＣＤ８ Ｔ細胞増殖（図２３）に対するキメラ１（ＣＨ１）およびキメラ２（ＣＨ２）＋／− ＣＣＬ２８の効果を示すものである。ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１および２は、ＣＤ４ Ｔ細胞の強い増殖を誘導する（図２２ＡおよびＢ）。実際、昆虫細胞上清での対照と比較して、２〜３倍の増殖増加が観察された（図２２Ｂ）。ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖が０．４％から１〜２％に増加されるような、より低い程度にではあるが、同じ結果が、ＣＤ８ ｂｒｉｇｈｔ Ｔ細胞で観察された。
【０１３８】
これらの結果は、ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１および２が、ＣＤ４ Ｔ細胞の強い増殖、およびはるかに低い程度にＣＤ８ ｂｒｉｇｈｔ Ｔ細胞の増殖を誘導することを示唆している。
【０１３９】
このように、本発明は、抗ＨＩＶ抗体に対して高い親和性を有することに加えて、効力ある免疫調節および抗ウイルス効果も有するキメラを提供し、該キメラをＩＬ−２２およびＣＣｌ２８と組み合わせて増幅させて、ワクチン／殺菌剤用の効力ある新規製品を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０のＶ１／Ｖ２可変領域に導入されたＣＤ４フラグメントの局在定位（Ａ：野生型ｇｐ１２０ＹＵ２；Ｂ：ｇｐ１２０ ｃｘ１（キメラ１またはＣＨ1）；Ｃ：ｇｐ１２０ ｃｘ２（キメラ２またはＣＨ2））。
【図２】ｇｐ１２０ΔＶ１／Ｖ２ｓｄＣＤ４およびｇｐ１２０ΔＶ２ｓｄＣＤ４タンパク質の検出。
【図３】表面プラズモン共鳴を使用することにより４．８ＤおよびＥ５１ ＣＤ４ｉＭＡｂへのキメラタンパク質の結合を示す重ね書きセンサーグラム。
【図４】ｓＣＤ４を伴うまたは伴わないｇｐ１２０ＹＵ２のＣＤ４ｉ ＭＡｂへの結合とキメラタンパク質のＣＤ４ｉ ＭＡｂへの結合を比較するための重ね書きセンサーグラム。
【図５】ＣＧ１０、ＬＦ１７およびＦ１０５ ＭＡｂを使用することによるキメラタンパク質の免疫化学的特性付け。
【図６】ＣＣＲ５受容体へのｇｐ１２０エンベロープタンパク質の結合。
【図７】シンシチウム形成能力の評定。
【図８】１ラウンドの感染アッセイの結果。
【図９】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−４の生産。
【図１０】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−１０の生産。
【図１１】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−５の生産。
【図１２】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−１２ ｐ４０サブユニットの生産。
【図１３】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターロイキン−１２ ｐ７０サブユニットの生産。
【図１４】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＲＡＮＴＥＳの生産。
【図１５】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＭＩＰ１−アルファの生産。
【図１６】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるＭＩＰ１−ベータの生産。
【図１７】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ４およびＣＤ８）。
【図１８】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞によるインターフェロンガンマの生産（ＣＤ８）。
【図１９】雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓細胞による共受容体発現性ＣＤ４＋ Ｔ細胞の百分率。
【図２０】ＣＤ４ Ｔ細胞からのインターフェロン−ガンマおよびインターロイキン−２の細胞内発現に対する、ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１またはキメラ２の効果。
【図２１】ＣＤ８ Ｔ細胞からのインターフェロン−ガンマおよびＴＮＦ−アルファの細胞内発現に対する、ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１またはキメラ２の効果。
【図２２Ａ】インビトロでのＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖に対する、ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１またはキメラ２の効果。分裂したＣＤ４＋ 細胞のパーセント（ＣＦＳＥ低）。
【図２２Ｂ】インビトロでのＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖に対する、ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１またはキメラ２の効果。対照（昆虫細胞上清）と比較した増殖増加倍率。
【図２３】インビトロでのＣＤ８ ｂｒｉｇｈｔ Ｔ細胞の増殖に対する、ＣＣＬ２８を伴うまたは伴わないキメラ１またはキメラ２の効果。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｇｐ１２０可変領域Ｖ１および／またはＶ２の少なくとも一部が、特異的体液性免疫反応を誘導することができるＣＤ４誘導エピトープまたはＣＤ４ｉの露出を達成するためにＣＤ４由来配列によって置換されている、キメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項２】
ＣＤ４由来配列が、Ｖ１ ｇｐ１２０可変領域と、Ｖ２ ｇｐ１２０可変領域の一部とを置換している、請求項１に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項３】
ＣＤ４由来ペプチドが、ヒトＣＤ４受容体のＣＤＲ２様ループを模倣する、請求項１または２に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項４】
１５〜３５のアミノ酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項５】
２０〜３０のアミノ酸を含む、請求項４に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項６】
前記ペプチドが、２８のアミノ酸を有する、請求項４または５に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項７】
配列番号５ ＣＮＬＥＡＣＱＫＲＣＱＳＬＧＬＱＧＫＣＡＧＳＦＣＡＣを有する、請求項６に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項８】
ＣＤ４由来配列が、Ｖ１と、Ｖ２ループからの１０〜２０のアミノ酸、特に１６のアミノ酸とを置換している、請求項２〜７のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項９】
抗ＣＤ４ｉモノクローナル抗体によって認識されるが、抗ＣＤ４抗体によって認識されない、請求項１〜８のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項１０】
ＣＤ４受容体およびＣＣＲ５共受容体に結合することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項１１】
図１Ｂおよび１ＣのキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項１２】
ＴＬＲリガンドとの組み合わせでの、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項１３】
ＩＬ２２および／またはＣＣＬ２８との組み合わせでの、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質中の露出されたＣＤ４ｉエピトープなどのＣＤ４ｉエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する抗血清。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質中の露出されたＣＤ４ｉエピトープなどのＣＤ４ｉエピトープに対するポリクローナル抗体。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質中の露出されたＣＤ４ｉエピトープなどのＣＤ４ｉエピトープに対するモノクローナル抗体。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質をコードするＤＮＡ構築物。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターによってトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗原性キメラＨＩＶ−１構築物の有効量と、担体、またはそれらのＴＬＲリガンドとの組み合わせを含む、ＨＩＶ−１感染症に特異的なワクチン組成物。
【請求項２１】
ＨＩＶ−１感染症を予防するための、請求項２０に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つのキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質の有効量、またはＴＬＲリガンド、ＩＬ２２および／もしくはＣＣＬ２８とそれらの組み合わせを含む、ＨＩＶ−１感染症を緩和および／または予防および／または治療するための医薬組成物。
【請求項１】
ｇｐ１２０可変領域Ｖ１および／またはＶ２の少なくとも一部が、特異的体液性免疫反応を誘導することができるＣＤ４誘導エピトープまたはＣＤ４ｉの露出を達成するためにＣＤ４由来配列によって置換されている、キメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項２】
ＣＤ４由来配列が、Ｖ１ ｇｐ１２０可変領域と、Ｖ２ ｇｐ１２０可変領域の一部とを置換している、請求項１に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項３】
ＣＤ４由来ペプチドが、ヒトＣＤ４受容体のＣＤＲ２様ループを模倣する、請求項１または２に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項４】
１５〜３５のアミノ酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項５】
２０〜３０のアミノ酸を含む、請求項４に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項６】
前記ペプチドが、２８のアミノ酸を有する、請求項４または５に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項７】
配列番号５ ＣＮＬＥＡＣＱＫＲＣＱＳＬＧＬＱＧＫＣＡＧＳＦＣＡＣを有する、請求項６に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項８】
ＣＤ４由来配列が、Ｖ１と、Ｖ２ループからの１０〜２０のアミノ酸、特に１６のアミノ酸とを置換している、請求項２〜７のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項９】
抗ＣＤ４ｉモノクローナル抗体によって認識されるが、抗ＣＤ４抗体によって認識されない、請求項１〜８のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項１０】
ＣＤ４受容体およびＣＣＲ５共受容体に結合することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項１１】
図１Ｂおよび１ＣのキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項１２】
ＴＬＲリガンドとの組み合わせでの、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項１３】
ＩＬ２２および／またはＣＣＬ２８との組み合わせでの、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質中の露出されたＣＤ４ｉエピトープなどのＣＤ４ｉエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する抗血清。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質中の露出されたＣＤ４ｉエピトープなどのＣＤ４ｉエピトープに対するポリクローナル抗体。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質中の露出されたＣＤ４ｉエピトープなどのＣＤ４ｉエピトープに対するモノクローナル抗体。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質をコードするＤＮＡ構築物。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターによってトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗原性キメラＨＩＶ−１構築物の有効量と、担体、またはそれらのＴＬＲリガンドとの組み合わせを含む、ＨＩＶ−１感染症に特異的なワクチン組成物。
【請求項２１】
ＨＩＶ−１感染症を予防するための、請求項２０に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つのキメラＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質の有効量、またはＴＬＲリガンド、ＩＬ２２および／もしくはＣＣＬ２８とそれらの組み合わせを含む、ＨＩＶ−１感染症を緩和および／または予防および／または治療するための医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３】
【公表番号】特表２００９−５１７０７７（Ｐ２００９−５１７０７７Ａ）
【公表日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４２８６２（Ｐ２００８−５４２８６２）
【出願日】平成１８年１１月２８日（２００６．１１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００４０３７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６６２３６
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（５０８１５９３３０）
【出願人】（５０８１５９３４１）
【出願人】（５０８１５９３５２）イミュノクリン リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２８日（２００６．１１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００４０３７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６６２３６
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（５０８１５９３３０）
【出願人】（５０８１５９３４１）
【出願人】（５０８１５９３５２）イミュノクリン リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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