グルカン酸の細胞での産生
本発明は、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼ、およびウロン酸デヒドロゲナーゼの組換え発現を介した、細胞内でのグルクロン酸およびグルカン酸の産生に関する。ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のクローニングおよび特徴づけも開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもとに２００８年４月４日に出願された米国仮出願番号第61/042,502号、名称「グルカン酸の微生物による産生」の利益を主張し、これは本明細書にその全体が参照として組み込まれる。
【０００２】
政府の利益
この研究は、海軍研究事務所による助成金番号N000140510656から資金の一部を得た。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明分野
本発明は、グルクロン酸およびグルカン酸の組換え遺伝子発現による産生に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
組換えＤＮＡ技術の応用を包含する代謝工学は、組換えタンパク質産生、生産力増強のための経路エンジニアリング、および新しい産物生成のための新規な経路設計などの多くの目的に対して、細胞機能を最適化するその潜在能力を示している。宿主種に見出されない変換のシーケンスとして定義された新規な経路であって、１，３−プロパンジオール（C. E. Nakamura and G. M. Whited (2003). Curr. Opin. Biotechnol. 14: 454-459）、アモルファジエン（Nature Biotech, 21, pp796-802）、および１，２，４−ブタントリオール（JACS, 125, pp12998-12999）の産生のための前記経路が、大腸菌内に設計され構築されている。これらのアプローチにおいて、各段階は酵素の利用可能性に基づいて設計され、種々の生物から採用した酵素の活性が同定され、これらの酵素的段階を組み合わせて、新規な経路が大腸菌内に構築された。これらの例の背景にある基本的なアイディアは、酵素を含むタンパク質を交換可能な部品とみなすことであり、用語「合成生物学」がこの概念を説明するために用いられている（Nature 421, p118；Nature Chemical Biology, 3, pp521-525）。
【０００５】
Ｄグルカン酸は果物、野菜および哺乳動物に見出され、コレステロールの低下（Z. Walaszek, et al. (1996). Nutr. Res. 16: 673-681）および癌の化学療法（J. Singh and K. P. Gupta (2003). Biomed. Environ. Sci. 16: 9-16）について研究されている。最近の報告では（T. Werpy and G. Petersen (2004). “Top Value Added Chemicals From Biomass,” Vol. I, PNNL and NREL）、Ｄグルカン酸は「バイオマスからの高付加価値化学物質」として、また新しいナイロンおよび超分岐ポリエステルを生産するための有望な出発物質として同定された。４つのキラル炭素を有する高度に機能化された化合物であるＤグルカン酸は、現在、Ｄグルコースの化学的酸化により産生されているが、これは、硝酸を酸化剤として用いる、非選択的で高価なプロセスである（T. Werpy and G. Petersen (2004). “Top Value Added Chemicals From Biomass,” Vol. I, PNNL and NREL）。酵素を用いる新しい触媒プロセスは、より高い生産性および選択性を導く可能性がある。グルカン酸を産生するための生物学的アプローチは、哺乳動物に存在するＤグルクロン酸経路を真似ることにより作成可能であった。しかしこれは、Ｄグルコースから出発し１０以上の変換段階からなる、非効率的な経路である。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本明細書には、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする第１のｕｄｈ遺伝子のクローニングおよび特徴づけが記載される。さらに本明細書には、大腸菌などの細胞内での、Ｄグルクロン酸またはＤグルカン酸いずれかの産生のための、異なる生物からの「生物学的部分」を組み合わせることによる、新規な経路の構築が記載される。第１の酵素、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ（Ｉｎｏ１／ＭＩＰＳ）は、グルコースからグルコース−６−リン酸を中間体としてミオイノシトールを産生する（Dean-Johnson and Henry 1989）。第２の酵素、ミオイノシトールオキシゲナーゼ（ＭＩＯＸ）は、ミオイノシトールをグルクロン酸に変換する。これらの２つの酵素の大腸菌などの細胞内での共発現により、グルコースからグルクロン酸の産生が可能となる。ウロン酸デヒドロゲナーゼは、グルクロン酸をグルカン酸に変換することができる（Bateman, Kosuge et al. 1970；Wagner and Hollman 1976）。本明細書に記載するように、この第３の遺伝子とＩＮＯ１およびＭＩＯＸとの発現により、グルコースからのグルカン酸の産生が可能となる。驚くべきことには、ウロン酸デヒドロゲナーゼの組換え発現は、経路のフラックスを大幅に増加させて、多量のグルカン酸を得ることができるようにした。
【０００７】
本発明は、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現し、かつミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する細胞を提供する。いくつかの態様において、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は細菌遺伝子であり、例えばPseudomonas syringae遺伝子またはAgrobacterium tumefaciens遺伝子である。いくつかの態様において、ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子は哺乳動物遺伝子、例えばマウス遺伝子である。いくつかの態様において、細胞はまた、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する。いくつかの態様におけるミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、真菌遺伝子または酵母遺伝子、例えばSaccharomyces cerevisiae遺伝子であってよい。
【０００８】
上記した、組換え技術により酵素を発現する細胞は、原核細胞または真核細胞であることができる。いくつかの態様において、細胞は、例えば大腸菌細胞などの細菌細胞である。いくつかの態様において、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されている。いくつかの態様において、細胞は、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である。
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、プラスミドから発現されることができ、または細胞のゲノム内に統合することができる。いくつかの態様において、グルカン酸の産生は、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により、または細胞内でグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより、増加する。本発明は、いくつかの態様において、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする１または２以上の組換え核酸分子を含む、遺伝的に改変された微生物を含む。
【０００９】
本発明はまた、グルクロン酸およびグルカン酸を産生する方法であって、本発明に関連する細胞を培養してグルクロン酸またはグルカン酸を産生すること、およびグルクロン酸またはグルカン酸を細胞から回収することを含む、前記方法も提供する。いくつかの態様において、グルクロン酸またはグルカン酸を産生する方法は、細胞を遺伝子操作して、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼの少なくとも１つを組換え技術により発現するようにすること、該細胞の集団を培養すること、およびグルカン酸を産生するように遺伝的に改変された細胞集団から、グルカン酸を回収することを含む。
いくつかの態様において、細胞は、ミオイノシトールオキシゲナーゼを組換え技術により発現し、グルクロン酸を産生する。いくつかの態様において、細胞は、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼを組換え技術により発現し、グルクロン酸を産生する。いくつかの態様において、細胞は、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびウロン酸デヒドロゲナーゼを組換え技術により発現し、グルカン酸を産生する。いくつかの態様において、細胞は、ミオイノシトールオキシゲナーゼ、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼおよびウロン酸デヒドロゲナーゼを組換え技術により発現し、グルカン酸を産生する。
【００１０】
いくつかの態様において、組換え技術により発現されたウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、Pseudomonas syringae遺伝子またはAgrobacterium tumefaciens遺伝子などの細菌遺伝子である。いくつかの態様において、組換え技術により発現されたミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、マウス遺伝子などの哺乳動物遺伝子である。いくつかの態様において、組換え技術により発現されるミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、Saccharomyces cerevisiae遺伝子などの真菌遺伝子または酵母遺伝子である。いくつかの態様において、上記の、酵素を組換え技術により発現する細胞は、原核細胞である。ある態様において、細胞は、大腸菌細胞などの細菌細胞である。ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されていてもよい。
【００１１】
いくつかの態様において、上記の、酵素を組換え技術により発現する細胞は、真核細胞である。ある態様において、細胞は、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である。ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、プラスミド上に発現されるか、細胞のゲノム内に統合されている。グルカン酸の産生は、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により、または、細胞内でグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより、増加する。
本発明はまた、上記の細胞または方法により産生されるグルカン酸を提供する。いくつかの態様において、グルカン酸は細胞培養物により産生され、ここで細胞培養物中の細胞は、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼの少なくとも１つを組換え技術により発現するように遺伝子操作されている。いくつかの態様において、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、Pseudomonas syringae遺伝子またはAgrobacterium tumefaciens遺伝子などの細菌遺伝子である。いくつかの態様において、ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、マウス遺伝子などの哺乳動物遺伝子である。いくつかの態様において、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、Saccharomyces cerevisiae遺伝子などの真菌遺伝子または酵母遺伝子である。
【００１２】
いくつかの態様において、グルカン酸は原核細胞から産生される。いくつかの態様において、原核細胞は、大腸菌細胞などの細菌細胞である。ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、いくつかの態様において、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されている。グルカン酸はまた、真核細胞から産生されることもできる。ある態様において、細胞は、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である。
グルカン酸の産生のために、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、プラスミド上に発現されるか、または細胞のゲノム内に統合することができる。いくつかの態様において、グルカン酸の産生は、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により、または、細胞内のグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより、増加する。
【００１３】
本発明はまた、単離された核酸分子であって、次を含むものも包含する：（ａ）配列番号１、配列番号２３または配列番号２５を含む、単離された核酸分子；（ｂ）配列番号２、配列番号２４または配列番号２６の配列を含むアミノ酸配列をコードする、単離された核酸分子；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の全長配列の逆補体である、単離された核酸分子；および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかと少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有する、単離された核酸分子。本発明にさらに包含されるのは、上述の核酸分子を含有し、転写調節要素に操作可能に結合した、組換え発現ベクターである。本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子によりコードされた、単離されたウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドも含む。いくつかの態様において、単離されたウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、配列番号２、配列番号２４または配列番号２６と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する。
【００１４】
本発明は、本明細書に記載の組換え発現ベクターを含む細胞を包含する。ある態様において、細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞である。ウロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を組換え技術により発現する細胞を用いて、ポリペプチドの発現を許容する条件下で細胞を培養し、細胞培地または細胞からポリペプチドを回収することにより、ウロン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を産生することができる。
本発明はまた、本明細書に記載のウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドに選択的に結合する、単離された抗体も含む。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドに選択的に結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号１と少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有する核酸によりコードされるポリペプチドに結合する。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはこれらの抗原結合断片であることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、大腸菌でのグルカン酸の産生用に設計された経路を示す概略図である。ＰＴＳ＝ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系；Ｉｎｏ１（ＭＩＰＳ）＝Saccharomyces cerevisiaeからのミオイノシトール１−リン酸シンターゼ、ホスファターゼ＝ＳｕｈＢ、ＭＩＯＸ＝内因性大腸菌酵素（Matsuhisa et al. J. Bacteriol. (1995) 177:200-205）；ＭＩＯＸ＝コドン最適化を有するミオイノシトールオキシゲナーゼのマウス版；Ｕｄｈ＝Pseudomonas syringaeからのウロン酸デヒドロゲナーゼ；ＰＥＰ＝ホスホエノールピルベート。
【図２】図２は、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＲＳＦＤ−ＩＮ−ＭＩ）におけるグルクロン酸の産生を示すグラフである。培養物は、１０ｇ／Ｌのグルコースおよび０．１ｍＭのＩＰＴＧを補足したＬＢ培地中、３０℃でトリプリケートで増殖させた。データ点は、３つの生物学的複製の平均値および標準偏差である。Δ＝グルクロン酸（左軸）；□＝ミオイノシトール（左軸）；◇＝グルコース（右軸）。グルコース濃度の単位はｇ／Ｌ。
【００１６】
【図３】図３は、３つの遺伝子を含んでいるＢＬ２１（ＤＥ３）に発現された、組換えＩｎｏ１、ＭＩＯＸ、およびＵｄｈのin vitro活性を示すグラフである。培養物は、１０ｇ／Ｌのグルコースを補足し０．０５ｍＭのＩＰＴＧで誘発したＬＢ培地中３０℃で増殖させた。ＭＩＯＸ活性は、バックグラウンドを明らかにするために純活性として表す。データは３つの生物学的複製の平均値および標準偏差である。Δ＝Ｉｎｏ１；□＝ＭＩＯＸ；◇＝Ｕｄｈ。
【図４−１】図４−１は、マウスＭＩＯＸ遺伝子および、大腸菌での発現用にコドン最適化されたその合成版の、ＤＮＡ配列アラインメントである。ＤＮＡ配列アラインメントは、Vector NTIソフトウェア（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて行った。
【図４−２】図４−２は、マウスＭＩＯＸ遺伝子および、大腸菌での発現用にコドン最適化されたその合成版の、ＤＮＡ配列アラインメントである。ＤＮＡ配列アラインメントは、Vector NTIソフトウェア（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて行った。
【図５】図５は、細菌におけるグルクロン酸およびグルカン酸の異化を示す概略図である。グルクロン酸消費は、ｕｘａＣ遺伝子のノックアウトにより防止される。ｕｘａＣノックアウトでのウロン酸デヒドロゲナーゼの存在は、グルクロン酸での大腸菌の増殖を可能とする。
【００１７】
【図６】図６は、P. syringaeからの推定Ｕｄｈの酵素アッセイを示すグラフである。ＰＳＰＴＯ＿１０５３のＯＲＦの発現タンパク質を含む大腸菌溶解物は、ＮＡＤ＋を補因子として用いて、グルクロン酸を酸化することができる。
【図７】図７は、大腸菌の粗溶解物中の種々のソースからの、発現ｕｄｈ遺伝子の活性を示すグラフである。ｐＴＡＴｕｄｈ２＝Agrobacterium tumefaciens、ｐＴＰＰｕｄｈ＝Pseudomonas putida、ｐＴＰＳｕｄｈ＝Pseudomonas syringae。白棒グラフ＝ＩＰＴＧなし、黒棒グラフ＝０．１ｍＭのＩＰＴＧ含む。
【図８】図８は、グルカレートのＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。図８ａは、酵素反応混合物から分離されたグルカレートを示す。図８ｂは、グルカレート標準を示す。グルカレートはその質量（ｍ／ｚ＝２０９、２１０、４１９、４２０および４４１）を特徴とし、溶出液のピークもまた、グルカレート標準の質量に対応した。
【００１８】
【図９】図９は、精製ＵｄｈのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。精製されたＵｄｈを、変性条件下で１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル中の電気泳動にかけた。レーン１、分子量マーカー；レーン２および３、ｐＥＴＡＴｕを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の、粗抽出物および精製A. tumefaciensＵｄｈ；レーン４および５、ｐＥＴＰＰｕを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の、粗抽出物および精製P. putidaＵｄｈ；レーン６および７、ｐＥＴＰＳｕを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の、粗抽出物および精製P. syringaeＵｄｈ。精製Ｕｄｈは矢印で示す。
【図１０】図１０は、A. tumefaciens、P. putida、およびP. syringaeのｕｄｈからのＵｄｈの活性に対する、ｐＨおよび温度の影響を示すグラフである。図１０ａは、ｐＨの関数としての相対活性を示す。図１０ｂは、示した温度において３０分間インキュベーションした後の相対活性を示す。図１０ｃは、アッセイ温度の関数としての相対活性を示す。実線と四角印：A. tumefaciensＵｄｈ。破線と丸印：P. putidaＵｄｈ。点線と三角印：P. syringaeＵｄｈ。
【００１９】
【図１１Ａ−Ｃ】図１１は、染色体上でのｕｄｈ遺伝子座を示す模式図、および隣接する遺伝子を示す表である。図１１ａ：P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００；図１１ｂ：P. putidaＫＴ２４４０；および図１１ｃ：A. tumefaciens株Ｃ５８。
【図１１Ｄ】図１１は、染色体上でのｕｄｈ遺伝子座を示す模式図、および隣接する遺伝子を示す表である。図１１ｄは、隣接する遺伝子の同一性を示す表である。これらの遺伝子座および同一性は、ＮＣ＿００４５７８（P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００）、ＮＣ＿００２９４７（P. putidaＫＴ２４４０）およびＮＣ＿００３０６３（A. tumefaciens株Ｃ５８）のゲノム配列を参照した。
【図１２Ａ】図１２は、配列アラインメントおよび系統学的解析を示す。図１２ａは、P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００、P. putidaＫＴ２４４０およびA. tumefaciens株Ｃ５８からのウロン酸デヒドロゲナーゼのアラインメントを示す。アラインメントに対して、同一、保存、および類似のアミノ酸配列を、それぞれ黒色、濃灰色および薄い灰色のブロックで表す。一次配列モチーフは、ＧｘｘＧｘｘＧおよびＹｘｘｘＫとして示す。
【図１２Ｂ】図１２は、配列アラインメントおよび系統学的解析を示す。図１２ｂは、多種類の原核種および真核種からのウロン酸デヒドロゲナーゼ相同体の系統学的解析を示す。系統学的解析は、P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００のＰＳＰＴＯ＿１０５３の相同体を用いて行った。ウロン酸デヒドロゲナーゼは太字で示す。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明の側面は、細胞内での組換え遺伝子発現を介した、グルクロン酸およびグルカン酸の産生のための方法および組成物である。本明細書に記載されるのは、グルクロン酸をグルカン酸に変換する酵素であるウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のクローニングである。ウロン酸デヒドロゲナーゼをミオイノシトール１−リン酸シンターゼおよびミオイノシトールオキシゲナーゼと組み合わせて組換え発現することを介して、グルコースからグルクロン酸およびグルカン酸を発現するように設計および実装された、新規な経路が記載される。この新規な経路は、ナイロンおよびポリエステルの生産から癌治療までの広い範囲の用途を有する分子である、グルカン酸を産生するための、非常に効率的な新しい系である。
【００２１】
細胞内でのグルクロン酸およびグルカン酸の産生のために本明細書に記載された新規な経路には、いくつかの酵素成分が関与する。第１の酵素であるミオイノシトール１−リン酸シンターゼ（Ｉｎｏ１／ＭＩＰＳ）は、Saccharomyces cerevisiaeのＩＮＯ１遺伝子によりコードされ、グルコースからグルコース−６−リン酸を中間体としてミオイノシトールを産生する（Dean-Johnson and Henry 1989）。Saccharomyces cerevisiaeの配列は、例えば、GenBankアクセッション番号ＮＣ＿００１１４２（GeneID：８５３２８８）を有する。酵母において、ミオイノシトールは膜のリン脂質の成分であり、その誘導体は細胞のシグナリングに重要である。ＭＩＰＳ基質であるグルコース−６−リン酸は、ＰＴＸ系による糖輸送の結果として大腸菌内に存在する（Postma, Lengeler et al. 1993）。第２の酵素であるミオイノシトールオキシゲナーゼ（ＭＩＯＸ）は、ミオイノシトールをグルクロン酸に変換する。この酵素は主に哺乳動物ソースに存在し、ミオイノシトール異化作用の第１段階を表す（Charalampous and Lyras 1957）。例えばマウスの配列は、GenBankアクセッション番号ＮＣ＿００００８１（GeneID：５６７２７）を有する。これら２つの酵素の、大腸菌などの細胞における共発現は、グルコースからのグルクロン酸の産生を可能とする。
【００２２】
グルカン酸産生のための新規な経路における第３の段階は、グルクロン酸のグルカン酸への変換であり、これは、ウロン酸デヒドロゲナーゼが行うことができる（Bateman, Kosuge et al. 1970；Wagner and Hollman 1976）。例２に記載するように、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、この経路の構築のためにクローニングして特徴づけた。例２に示すように、ウロン酸デヒドロゲナーゼを、P. syringae pv. tomato株ＤＣ３００、P. putidaＫＴ２４４０およびA. tumefaciens株Ｃ５８からクローニングした。P. syringaeからのｕｄｈ遺伝子配列は、GenBankアクセッション番号ＥＵ３７７５３８として寄託されている。P. syringae pv. tomato株ＤＣ３００ＡのｕｄｈのＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、それぞれ配列番号１および２として提供される。A. tumefaciensおよびP. putidaからの対応する遺伝子は、それぞれアクセッション番号ＢＫ００６４６２（ＤＮＡ：配列番号２３；タンパク質：配列番号２４）およびＢＫ００６３８０（ＤＮＡ：配列番号２５；タンパク質：配列番号２６）として寄託されている。ウロン酸デヒドロゲナーゼのクローニングにより、種々の種におけるウロン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の同定を、例えばＢＬＡＳＴ探索などの、当分野に知られた標準の同一性探索方法を用いて行うことが可能である。
【００２３】
本明細書において、細胞でのミオイノシトール１−リン酸シンターゼとミオイノシトールオキシゲナーゼの共発現は、グルコースからのグルクロン酸の産生を導く。これらの酵素を発現する細胞がさらにウロン酸デヒドロゲナーゼを発現する場合、これは、グルコースからのグルクロン酸の、次の３段階からなる経路を介した予想外に効率的な産生をもたらす：１）グルコースからのミオイノシトールの産生、２）ミオイノシトールのグルクロン酸への変換、および３）グルクロン酸のグルカン酸への変換。本発明にさらに包含されるのは、上記の第１段階を回避した２段階経路である。この特定の態様において、グルコースを生成可能な細胞を用いて、細胞増殖培地に対する、グルコース供給の必要性を取り除く。いくつかの態様において、かかる細胞は、コーンスターチなどのグルコースポリマーと共に提供される。
【００２４】
本発明の側面は、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼ、およびウロン酸デヒドロゲナーゼの少なくとも１つを組換え技術により発現する細胞に関する。本発明は、原核細胞および真核細胞を含む、任意の種類の細胞を包含する。いくつかの態様において、細胞は、大腸菌などの細菌細胞である。他の態様において、細胞は真菌細胞または酵母細胞、例えばS. cerevisiae細胞である。他の態様において、細胞は、マウス細胞などの哺乳動物細胞である。いくつかの細胞は、本発明に関連する少なくとも１つの酵素を内因的に発現できることが理解される。いくつかの態様において、細胞は、どの酵素も内因的に発現しないが、１、２または３つの酵素を組換え技術により発現する。他の態様において、細胞は、酵素の１つを内因的に発現し、および他の１または２つの酵素を組換え技術により発現する。他の酵素において、細胞は、酵素の２つを内因的に発現し、および他の１または２の酵素を組換え技術により発現する。いくつかの態様において、細胞は１または２以上の遺伝子を内因的に発現し、および同じ１または２以上の遺伝子を組換え技術により発現する。
【００２５】
いくつかの態様において、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼ、およびウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、組換え発現ベクターで発現される。本明細書において「ベクター」とは、所望の１つの配列または複数の配列を、異なる遺伝環境の間での移動についての、または宿主細胞内での発現についての制限およびライゲーションにより挿入することができる、任意数の核酸であってよい。ベクターは典型的にはＤＮＡで構成されるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターとしては、限定するものではないが、以下を含む：プラスミド、ホスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、および人工染色体。
クローニングベクターは、自己複製可能であるか、または宿主細胞内に統合されているベクターであって、これはさらに１または２以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を特徴とし、該部位においては、ベクターを確定的な様式で切断することができ、またその中に所望のＤＮＡ配列をライゲーションして、新しい組換えベクターが、宿主細胞内で複製するその能力を保持するようにすることができる。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、宿主細菌内でのプラスミドのコピー数が増加するに従って多数回生じるか、または、有糸分裂によって宿主が複製する前に、宿主当たり１回のみ生じる。ファージの場合、複製は、溶菌相の間に能動的に生じてもよく、または溶原相の間に受動的に生じてもよい。
【００２６】
発現ベクターは、その中に調節配列に操作可能に連結されるように制限およびライゲーションによって所望のＤＮＡ配列を挿入でき、これをＲＮＡ転写物として発現できるベクターである。ベクターはさらに、ベクターにより形質転換あるいは形質移入されているか、またはされていない細胞の同定に用いるのに適した、１または２以上のマーカー配列を含んでもよい。マーカーとしては、例えば以下が挙げられる：抗生物質または他の化合物への抵抗性または感受性のどちらかを、増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当分野に知られた標準アッセイにより検出可能な酵素をコードする遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはアルカリホスファターゼ）、および形質転換または形質移入された細胞、宿主、コロニー、またはプラーク(溶菌斑)の表現型に目に見える影響を与える遺伝子（例えば緑色蛍光タンパク質）。好ましいベクターは、それが操作可能に結合するＤＮＡセグメント内に存在する構造遺伝子産物の、自己複製および発現が可能なものである。
【００２７】
本明細書において、コード配列および調節配列は、これらが、コード配列の発現または転写を調節配列の影響下または制御下に置くように共有結合する場合に、「操作可能に」結合するという。コード配列が機能タンパク質に翻訳されることが望ましい場合、２つのＤＮＡ配列は以下の場合に、操作可能に結合するという：プロモーターの５’調節配列への誘導が、コード配列の転写をもたらし、および、２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさず、（２）プロモーター領域のコード配列の転写を誘導する能力を妨害せず、または（３）対応するＲＮＡ転写物の、タンパク質に翻訳される能力を妨害しない場合。したがって、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写に対し、結果として得られた転写物が、所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳できるような影響を与えることが可能であれば、プロモーター領域はコード配列に操作可能に結合したとされる。
【００２８】
クレームに記載された発明の任意の酵素をコードする核酸分子が細胞内で発現される場合、種々の転写制御配列（例えば、プロモーター／エンハンサー配列）を用いて、その発現を誘導することができる。プロモーターは、在来のプロモーター、すなわち、その内因性の文脈における遺伝子のプロモーターであることができ、これは遺伝子発現の正常な調節を提供する。いくつかの態様において、プロモーターは構成的（constitutive）であることができ、すなわち、プロモーターは調節されず、関連する遺伝子の連続的転写を可能とする。種々の条件プロモーターも用いることができ、例えば、分子の有無により制御されるプロモーターなどである。
遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種または細胞型により異なり得るが、しかし一般的に、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関連する５’非転写配列および５’非翻訳配列を含み、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等である。特にかかる５’非転写調節配列は、操作可能に結合した遺伝子の転写制御用のプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列はまた、所望により、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列を含んでもよい。本発明のベクターは、任意に、５’リーダー配列またはシグナル配列を含んでもよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。
【００２９】
発現に必要な全要素を含む発現ベクターは市販されており、当業者に知られている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと。細胞は、異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）の細胞内に導入することにより、遺伝的に操作される。異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、転写要素の操作可能な制御のもとに置かれて、宿主細胞内での異種ＤＮＡの発現を許容する。グルカン酸の産生のための新規な経路の異種発現を、大腸菌を用いて、実施例の節で実証する。新規なグルカン酸産生経路は、他の細菌細胞、古細菌細胞、真菌、哺乳動物細胞、植物細胞等において発現させることもできる。
いくつかの態様において、本発明の２または３以上の核酸を、同一の発現ベクターまたはプラスミド内でクローニングすることができる。実施例の節に記載するように、いくつかの態様においては、ＩＮＯ１遺伝子およびＭＩＯＸ遺伝子を、同一のプラスミド内、例えばｐＲＳＦＤプラスミドにクローニングする。
【００３０】
グルカン酸産生のための任意の酵素をコードする、１つまたは複数の核酸分子を、１つまたは複数の細胞内に、当分野で標準の方法および技法を用いて導入することができる。例えば、核酸分子の導入を、化学的形質転換およびエレクトロポレーション、形質導入、粒子照射などを含む形質転換などの標準のプロトコルにより、実施することができる。グルカン酸産生のための酵素をコードする核酸分子（単数または複数）の発現はまた、核酸分子をゲノムに組み込むことによっても実現してよい。核酸分子（単数または複数）は、細胞のゲノムＤＮＡに、当分野に知られた標準技法を用いて組み込むことができる。
いくつかの態様において、本発明に関連する酵素は、細菌細胞内に組換え技術により発現される。本発明による細菌細胞は、任意の種類および組成の培地（富栄養または最少）中で培養可能である。例１は、グルコースを補足しＩＰＴＧで誘導した富栄養培地（ＬＢ培地、BD Biosciences; San Jose, CA）が最適であると見出された態様を示す。当業者が理解するように、ルーチンの最適化により、Ｍ９最少培地などの最少培地を含む、他の種類の培地の使用も許容される。選択された培地には、種々の追加要素を補足することができる。同様に、培地および増殖条件の他の側面も、ルーチンの実験を介して最適化してよい。例えば、ｐＨおよび温度は、最適化できる因子の非限定例である。本発明の側面により、細胞を増殖させるのに用いる液体培養物は、当分野で知られ用いられている、任意の培養容器中に収容することができる。
【００３１】
本発明の側面は、細胞からのグルカン酸産生を最適化するための戦略を含む。グルカン酸の最適化された産生とは、最適化戦略に従うことにより、かかる戦略なしで達成されるよりも多量のグルカン酸を産生することを意味する。１つの戦略は、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはウロン酸デヒドロゲナーゼの発現レベルを、適切なプロモーターおよびリボソーム結合部位の選択により、最適化することである。いくつかの態様において、これは、高いコピー数のプラスミドまたは低いもしくは中程度のコピー数のプラスミドを、選択および使用することを含んでよい。転写終了の段階もまた、ステムループなどの構造の導入または除去を介して、遺伝子発現の調節用に標的化することができる。
【００３２】
いくつかの態様において、グルカン酸の産生用に以前に最適化されている細胞を用いることが有利となりえる。例えば、グルカン酸の産生に先立ち、細胞内のグルカン酸代謝経路の１または２以上の成分を突然変異させることが最適であり得るが、これにより、細胞が産生される産物を消費しないためである。いくつかの態様において、グルカン酸産生の増強をもたらす突然変異のスクリーニングを、ランダム突然変異誘発スクリーンを通して、または既知の突然変異のスクリーニングを介して行ってもよい。いくつかの態様において、ゲノム断片のショットガンクローニングを用いて、グルカン酸産生の増加のためのこれら断片を有する細胞または生物をスクリーニングすることにより、グルカン酸産生の増加をもたらすゲノム領域を同定することができる。
タンパク質発現の最適化にはまた、いくつかの態様において、本発明に関連する酵素をコードする遺伝子を、細胞内への導入の前に、細菌細胞内での発現のためのコドン最適化を介するなどして、改変することが求められる。種々の生物に対するコドンの使用は、インターネットサイト「コドン使用データベース」において評価することができる。例えば本発明は、大腸菌での発現用にコドン最適化により合成された、マウスＭＩＯＸ遺伝子を包含する。
【００３３】
いくつかの態様において、タンパク質工学を用いて、本発明に関連する１または２以上の酵素の発現または活性を最適化することができる。ある態様において、タンパク質工学のアプローチは、酵素の３次元（３Ｄ）構造を決定すること、または、関連するタンパク質の構造に基づき、酵素のための３Ｄ相同性モデルを構築することを含むことができる。３Ｄモデルに基づき、酵素における突然変異を構築し、細胞または生物中に組み込み、これを次に、グルカン酸の産生の増加についてスクリーニングすることができる。いくつかの態様において、細胞でのグルカン酸産生は、本発明に関連する酵素と同じ経路で作用する酵素の操作を通して、増加することができる。例えば、いくつかの態様において、本発明に関連する１つの酵素の上流で作用する酵素または別の因子の発現を増加させることが、有益となりえる。これは、任意の標準法を用いて、上流因子を過剰発現させることにより、実現可能である。
【００３４】
本発明はしたがって、１つの側面において、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド、そのポリペプチドをコードする遺伝子、その機能性改変物および変異体、ならびにこれらに関連する使用に関する。本発明のウロン酸デヒドロゲナーゼ核酸の相同体および対立遺伝子は、従来技術により同定可能である。本発明にさらに包含されるのは、ストリンジェント条件下で本明細書に記載のウロン酸デヒドロゲナーゼ核酸にハイブリダイズする核酸である。本明細書において用語「ストリンジェント条件」とは、当分野に精通されたパラメータを指す。核酸ハイブリダイゼーションパラメータは、かかる方法をまとめた参考文献中に見出すことができ、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkなどである。より具体的には、本明細書において用語「ストリンジェント条件」とは、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％Ficoll、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）中で、６５℃でハイブリダイズすることを言う。ＳＳＣは、０．１５Ｍの塩化ナトリウム／０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である；ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウム；およびＥＤＴＡはエチレンジアミンテトラ酢酸である。ハイブリダイゼーション後、その上にＤＮＡを移した膜を、例えば２×ＳＳＣで室温にて洗浄し、次に０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで６８℃までの温度で洗浄する。
【００３５】
同程度のストリンジェンシーをもたらす、用いることのできる他の条件、試薬などもある。当業者はかかる条件に精通しており、したがってここでは述べない。しかし、本発明のウロン酸デヒドロゲナーゼ核酸の相同体および対立遺伝子の明確な同定を許容するような様式で、当業者は条件を操作可能であることが理解される（例えば、より低いストリンジェンシー条件を用いて）。当業者はまた、かかる分子の発現のための細胞およびライブラリをスクリーニングし、次にルーチンにより単離し、続いて適切な核酸分子の単離および配列決定する方法論にも精通している。
一般に、相同体および対立遺伝子は典型的には、ウロン酸デヒドロゲナーゼ核酸およびポリペプチドと、それぞれ少なくとも７５％の核酸同一性および／または少なくとも９０％のアミノ酸同一性を共有しており、いくつかの例においては、少なくとも９０％の核酸同一性および／または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を共有しており、さらに他の例においては、少なくとも９５％の核酸同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有している。相同性は、ＮＣＢＩのインターネットサイトから入手可能な、ＮＣＢＩ（Bethesda, Maryland）により開発された種々の公的に利用可能なソフトウェアツールを用いて計算することができる。例示のツールとしては、ＮＣＢＩのインターネットサイト（www.ncbi.nlm.nih.gov）から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェアが挙げられる。ペアワイズおよびClustalWアラインメント（BLOSUM30マトリクスセッティング）、およびKyte-Doolittleヒドロパシー分析も、Mac Vector配列解析ソフトウェア（Oxford Molecular Group）を用いて得ることができる。前述の核酸のワトソン・クリック補体もまた、本発明に包含される。
【００３６】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニングにおいて、当業者に知られた技法、例えばサザーンブロッティング、ノーザンブロッティングおよび提示された配列にハイブリダイズするプライマーを用いる、ポリメラーゼ連鎖反応などの増幅プロトコルなども、適用可能である。
本発明はまた、天然材料に存在するものに対する代替的コドンも含む、変性核酸も含む。例えば、セリン残基は、コドンＴＣＡ、ＡＧＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴおよびＡＧＣによりコードされる。６つのコドンの各々は、セリン残基をコードする目的に対して等価である。したがって、セリンをコードするヌクレオチドトリプレットの任意のものを、in vivoまたはin vitroでのタンパク質合成装置の誘導に用いて、セリン残基が延長されたウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド内に組み込み可能であることは、当業者には明白である。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットには、限定はしないが以下が含まれる：ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧおよびＣＣＴ（プロリンコドン）；ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧおよびＡＣＴ（スレオニンコドン）；ＡＡＣおよびＡＡＴ（アスパラギンコドン）；およびＡＴＡ、ＡＴＣおよびＡＴＴ（イソロイシンコドン）。他のアミノ酸残基も、複数のヌクレオチド配列により同様にしてコードすることができる。したがって、本発明は、遺伝子コードの変性のために、生物学的に単離された核酸とはコドン配列が異なる、変性核酸を包含する。本発明はまた、宿主細胞の最適なコドン使用に適するコドン最適化も包含する。
【００３７】
本発明はまた、１または２以上のヌクレオチドの付加、置換および欠失を含む、改変核酸分子も提供する。好ましい態様において、これらの改変核酸分子および／またはそれらがコードするポリペプチドは、非改変の核酸分子および／またはポリペプチドの少なくとも１つの活性または機能を保持し、それは例えば、ウロン酸デヒドロゲナーゼ酵素活性である。ある態様において、改変核酸分子は、改変ポリペプチドをコードし、好ましくは、本明細書の別のところに記載されたように、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。改変核酸分子は非改変核酸分子と構造的に関連しており、好ましい態様においては、非改変核酸分子と充分構造的に関連しているため、改変および非改変の核酸分子は、当業者に知られたストリンジェント条件下でハイブリダイズする。
【００３８】
例えば、１つのアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする、改変核酸分子を調製することができる。これらの核酸分子の各々は、本明細書に記載の遺伝コードの縮退に対応するヌクレオチド変化を除く、１、２または３個のヌクレオチド置換を有することができる。同様に、２つのアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする改変核酸分子を、例えば２〜６個のヌクレオチド変化を有して、調製可能である。これらのような多くの改変核酸分子を当業者は容易に思い描くことができ、これには例えば、アミノ酸２および３、２および４、２および５、２および６などをコードするコドンにおけるヌクレオチドの置換が含まれる。前述の例において、２つのアミノ酸の各組み合わせが改変核酸分子のセットに含まれ、アミノ酸置換をコードする全てのヌクレオチド置換も含まれる。追加の置換（すなわち、３または４以上）、付加、または欠失（例えば、停止コドンまたはスプライス部位（単数または複数）の導入）を有するポリペプチドをコードする、追加の核酸分子もまた調製可能であり、当業者により容易に思い描かれて本発明に包含される。任意の前述の核酸またはポリペプチドは、ルーチンの実験により、本明細書に開示の核酸および／またはポリペプチドとの構造的関連性または活性の保持について、試験することできる。
【００３９】
本発明はまた、前述のウロン酸デヒドロゲナーゼ核酸によりコードされる、単離ポリペプチドも提供する。かかるポリペプチドは、例えば、グルクロン酸をグルカン酸へとin vivoまたはin vitroで変換するために、それのみで、または融合タンパク質として、有用である。ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、組織または細胞ホモジェネートを含む生体サンプルから単離することができ、また種々の原核および真核発現系において、発現系に適切な発現ベクターを構築し、発現ベクターを発現系に導入し、組換え発現されたタンパク質を単離することにより、組換え技術によって発現することができる。ポリペプチドは、良好に確立されたペプチド合成法を用いて、化学的に合成することもできる。
【００４０】
本発明は、上述のウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの変異体を包含する。本明細書において、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの「変異体」とは、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの一次アミノ酸配列に１または２以上の改変を含む、ポリペプチドである。ウロン酸デヒドロゲナーゼ変異体を作り出す改変は、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドに対して、以下をもたらす：１）ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの活性を低下させるか取り除くこと；２）ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの特性、例えばグルクロン酸をグルカン酸に変換する能力、または発現系でのタンパク質安定性もしくはタンパク質−タンパク質結合の安定性などを増強すること；３）ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドに、抗原エピトープの付加または検出可能部分の付加などの、新規な活性または特性を提供すること；または４）ウロン酸デヒドロゲナーゼ分子と他の分子（例えば、酵素基質）との間に、等価またはさらに良好な結合を提供すること。ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドへの改変は、典型的には、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸に対してなされ、これには、欠失、点変異、切断、アミノ酸置換およびアミノ酸もしくは非アミノ酸部分の付加を含むことができる。代替的に、改変は、ポリペプチドに直接行うこともでき、例えば、開裂、リンカー分子の付加、検出可能部分の付加、例えばビオチン、脂肪酸の付加などである。改変はまた、ウロン酸デヒドロゲナーゼアミノ酸配列の全てまたは一部を含む、融合タンパク質をも包含する。当業者は、タンパク質配列における変化の、タンパク質コンフォメーションに対する効果を予測する方法に精通しており、こうして、変異体ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドを既知の方法に従って「設計」することができる。かかる方法の１つの例は、Dahiyat and MayoによりScience 278:82-87, 1997に記載されており、これによりタンパク質はde novoで設計可能である。方法は既知のタンパク質に適用して、ポリペプチド配列の一部のみを変化させることができる。Dahiyat and Mayoのコンピュータによる方法を適用して、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの特定の変異体を提示し試験することにより、変異体が所望のコンフォメーションを保持するかどうかを決定することができる。
【００４１】
一般に、変異体は、その望ましい生理学的活性に関連しないポリペプチドの性質を変えるように特別に改変された、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドを含む。例えば、システイン残基を置換または除去して、望ましくないジスルフィド結合を防ぐことができる。同様に、あるアミノ酸を変化させて、発現系におけるプロテアーゼによるタンパク質の加水分解を除去することにより、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの発現を増強することができる（例えば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母発現系での、二塩基性アミノ酸残基）。
ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸の突然変異は、コード配列のアミノ酸リーディング・フレームを保存するのが好ましく、変異体ポリペプチドの発現に有害となり得るヘアピンやループなどの二次構造を、ハイブリダイズにより形成し勝ちである核酸領域を作らないのが好ましい。
【００４２】
突然変異は、アミノ酸置換を選択することにより、またはポリペプチドをコードする核酸の選択部位のランダム変異導入法により起こすことができる。変異体ポリペプチドは、次に、どの突然変異が所望の特性を有する変異体ポリペプチドを提供するかを決定する、１または２以上の活性について発現および試験する。さらなる突然変異を、ポリペプチドのアミノ酸配列についてサイレントであるが、特定の宿主における翻訳に好ましいコドンを提供する変異体（または非変異ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド）に、起こすことができる。例えば、大腸菌などの核酸の翻訳に好ましいコドンは、当業者に知られている。さらに他の突然変異をウロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子またはｃＤＮＡクローンの非コード配列に起こして、ポリペプチドの発現を増強することができる。ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの変異体の活性は、変異体ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする遺伝子を細菌または哺乳動物の発現ベクター内にクローニングし、ベクターを適切な宿主細胞に導入し、変異体ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドを発現させ、および本明細書に記載のように、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの機能について試験することにより、試験することができる。
【００４３】
当業者はまた、保存的アミノ酸置換をウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドに作成して、前述のポリペプチドに機能的に等価な変異体を提供してもよく、すなわち、該変異体は、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの機能を保持していることを理解する。本明細書において、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的電荷またはサイズの特性を変化させない、アミノ酸置換を意味する。変異体は、当業者に知られたポリペプチド配列を変化させる方法、例えば、かかる方法をまとめた文献、Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkなどに従って調製することができる。ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの例示の機能的等価変異体としては、本明細書に開示されたタンパク質のアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換体を含む。アミノ酸の保存的置換としては、次の群のアミノ酸に作られた置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００４４】
一般に、変異体ポリペプチドを調製する場合、全アミノ酸よりも少ないアミノ酸が改変されることが好ましい。特定のアミノ酸残基が機能を付与することが知られている場合、かかるアミノ酸は置き換えないか、または保存的アミノ酸置換により置き換える。変異体ポリペプチドを調製する場合、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の残基を改変することができる。一般に、最少数の置換を作るのが望ましい。したがって、変異体ポリペプチドを生成する１つの方法は、他の全アミノ酸を特定の１つのアミノ酸で置換し、次に変異体の活性を検定し、次にこのプロセスを、最高の活性を有する１または２以上のポリペプチドを用いて繰り返すことである。
ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの機能的に等価な変異体を産生するための、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸の変化により作られる。かかる置換は、当業者に知られた種々の方法により作ることができる。例えば、アミノ酸置換は、ＰＣＲ定方向（PCR-directed）突然変異、Kunkelの方法（Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985）による部位特異的突然変異、またはウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする遺伝子の化学的合成により、作ることができる。
【００４５】
本明細書に記載の発明は、多くの使用を有し、そのいくつかは本明細書の別の部分に記載される。第１に、本発明はウロン酸デヒドロゲナーゼタンパク質分子の単離を可能とする。当業者によく知られた種々の方法論を用いて、単離されたウロン酸デヒドロゲナーゼ分子を得ることができる。ポリペプチドは、クロマトグラフィーの手段または免疫学的認識により、ポリペプチドを天然に産生する細胞から精製してもよい。代替的に、発現ベクターを細胞内に導入して、ポリペプチドの産生をもたらしてもよい。他の方法において、ｍＲＮＡ転写物を細胞内にマイクロインジェクションするか、他の方法で導入して、コードされたポリペプチドの産生をもたらしてもよい。網状赤血球溶解物系などの細胞を有さない抽出物中でのｍＲＮＡの翻訳もまた、ポリペプチドの産生に用いてよい。当業者はまた、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドを単離するための既知の方法に容易に従うことができる。これらには、限定はしないが、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫親和性クロマトグラフィーが含まれる。
【００４６】
本発明の分子の発現は、当業者に知られたルーチンの方法を用いて決定してよい。これらの方法としては、限定はしないが以下が挙げられる：直接ＲＮＡ増幅、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ｃＤＮＡの増幅、ハイブリダイゼーション、および免疫学に基づくアッセイ法であって、これには限定することなく、免疫組織化学法、抗体サンドイッチ捕捉アッセイ、ＥＬＩＳＡ、および酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥｌｉＳｐｏｔアッセイ）を含む。例えば、対象または組織において、本発明の核酸分子のレベルの存在の決定は、任意の標準核酸決定アッセイにより行うことができ、これには、ポリメラーゼ連鎖反応、または標識化ハイブリダイゼーションプローブによるアッセイを含む。かかるハイブリダイゼーション法としてはマイクロアッセイ技術を含むが、これに限定はしない。
【００４７】
本発明はまた、ウロン酸デヒドロゲナーゼ（Ｕｄｈ）に対する抗体も提供する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドに結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号１と少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有する核酸分子によりコードされるポリペプチドに結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２４と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドに結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２３と少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有する核酸分子によりコードされるポリペプチドに結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２６と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドに結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２５と少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有する核酸分子によりコードされるポリペプチドに結合する。
【００４８】
本発明の抗体は、種々の方法の任意のものにより調製され、これには、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質を発現する細胞またはその断片などを動物に投与して、ポリクローナル抗体を誘発することを含む。本発明はまた、Ｕｄｈに対するモノクローナル抗体を産生する方法を提供する。モノクローナル抗体の産生は、当分野によく知られた技法に従って実施される。抗体分子の小さな部分であるパラトープのみが、抗体のそのエピトープへの結合に関与することは当分野でよく知られている（一般的に、Clark, W.R., 1986, The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York；Roitt, I., 1991, Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照）。例えばｐＦｃ’およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗体結合には関与しない。ｐＦｃ’領域がそれから酵素的に開裂された抗体、またはｐＦｃ’領域なしで産生された抗体は、Ｆ（ａｂ’）２断片と呼ばれ、これは無傷の抗体の両方の抗原結合部位を保持する。同様に、Ｆｃ領域がそれから酵素的に開裂された抗体、またはＦｃ領域なしで産生された抗体は、Ｆａｂ断片と呼ばれ、無傷の抗体分子の１つの抗原結合部位を保持する。Ｆａｂ断片は、共有結合された抗体の軽鎖と、Ｆｄと表される抗体重鎖の一部からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要な決定基であり（１つのＦｄ断片は、抗体の特異性を変更することなく、１０までの異なる軽鎖と関連することができる）、Ｆｄ断片は単離において、エピトープ結合能を保持する。
【００４９】
抗体の抗原結合部分内には、当分野でよく知られているように、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープの３次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般的には、Clark, 1986; Roitt, 1991を参照）。重鎖Ｆｄ断片とＩｇＧ免疫グロブリンの軽鎖の両方には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）によりそれぞれ分離されている４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、およびさらに特には重鎖ＣＤＲ３は、抗体の特異性に大きな役割を果たす。
【００５０】
現在当分野では、哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域は、もとの抗体のエピトープ特異性を保ちつつ、非特異的または異種特異的抗体の同様の領域で置き換え可能であることが確立されている。これは、「ヒト化」抗体の開発および使用においてもっとも明確に証明されており、ヒト化抗体では、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合して、機能的抗体を産生する。例えば、米国特許第4,816,567号、第5,225,539号、第5,585,089号、第5,693,762号、および第5,859,205号を参照のこと。完全なヒトモノクローナル抗体もまた、遺伝子導入マウスをヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大きな部分について免疫化することにより、調製可能である。これらのマウス（例えば、Ｘｅｎｏマウス（Abgenix）、ＨｕＭＡｂマウス（Medarex/GenPharm））の免疫化に続いて、モノクローナル抗体を標準のハイブリドーマ技法により調製可能である。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、したがってヒトに投与された場合に、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発しない。したがって、当業者に明らかであるように、本発明はまた、以下を提供する：Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦｄ断片；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同のヒトまたは非ヒト配列で置き換えられた、キメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同のヒトまたは非ヒト配列で置き換えられた、キメラＦ（ａｂ’）２断片抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同のヒトまたは非ヒト配列で置き換えられた、キメラＦａｂ断片抗体；およびＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が、相同のヒトまたは非ヒト配列で置き換えられた、キメラＦｄ断片抗体。本発明はまた、いわゆる単鎖抗体、ドメイン抗体および重鎖抗体も含む。
【００５１】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ、およびミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、種々のソースから得られることが理解されるべきである。本明細書の実施例の節で議論する態様において、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素は、Saccharomyces cerevisiae（ＩＮＯ１）からの遺伝子によりコードされ、ミオイノシトールオキシゲナーゼ酵素は、マウス遺伝子（ＭＩＯＸ）によりコードされ、ウロン酸デヒドロゲナーゼ酵素は、Pseudomonas syringae、Pseudomonas putida、またはAgrobacterium tumefaciens遺伝子（ｕｄｈ）によりコードされる。当業者に明らかなように、これら酵素の相同遺伝子は多くの種に存在しており、相同性探索により同定可能であり、例えば、ＮＣＢＩインターネットサイト（www.ncbi.nlm.nih.gov）で利用可能なタンパク質ＢＬＡＳＴ探索による。これらの酵素をコードする遺伝子は、所与の酵素を含む任意のソースからのＤＮＡから、当業者が理解するように例えば変性プライマーを用いて増幅可能である。いくつかの態様において、所与の酵素をコードする遺伝子は、合成物であることができる。本明細書に記載の酵素をコードする遺伝子を得るいかなる手段も、本発明の経路を構築するのに適合的である。
【００５２】
例
例１：グルカン酸産生：組換え大腸菌における生合成経路
大腸菌においてグルコースからグルクロン酸およびグルカン酸を産生するための合成経路が構築された（図１）。Saccharomyces cerevisiaeからのミオイノシトール１−リン酸シンターゼ（Ｉｎｏ１）およびマウスからのミオイノシトールオキシゲナーゼ（ＭＩＯＸ）をコードする遺伝子の共発現により、中間体ミオイノシトールを介したグルクロン酸の産生がもたらされる。０．３ｇ／Ｌまでのグルクロン酸濃度を培養ブロス内で測定した。ＭＩＯＸの活性は律速因子であり、ミオイノシトールおよび最終産物としてのグルクロン酸をほぼ同じ濃度で蓄積する。第３の酵素、Pseudomonas syringaeからのウロン酸デヒドロゲナーゼ（Ｕｄｈ）の含有により、グルクロン酸のグルカン酸への変換が促進された。この組換え酵素の活性は、Ｉｎｏ１およびＭＩＯＸのそれよりも２桁以上高く、経路を通る全フラックスを、グルカン酸濃度で１ｇ／Ｌを超えるものにと増加させた。これは、バイオマスからの「高付加価値化学物質」であるグルカン酸の生物学的産生のための、新規な微生物系を提示する。
【００５３】
材料および方法
株、増殖培地、およびプラスミド
大腸菌株ＤＨ１０Ｂ［F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 endA1 araΔ139Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL (StrR) nupG］を、全ての分子生物学的操作に用いた。ＤＨ１０ＢおよびＢＬ２１Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）［F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3)］を、有機酸産生の宿主として用いた。両株のコンピテント細胞を、Invitrogen Corporation（Carlsbad, CA）から購入した。培養物は、ＬＢまたはＭ９倍地のどちらかで増殖させた。ＬＢ（Miller）培地は、製造業者の指示に従って脱水パウダーから調製した（BD Biosciences, San Jose, CA）。Ｍ９は記載のようにして調製し（３２）、これは以下からなる：１×Ｍ９塩（１２．８ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４／７Ｈ２Ｏ、３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、および１０ｇ／Ｌ（１％）のグルコース。ロイシンを、最終濃度１０５μｇ／ｍＬでＤＨ１０Ｂに対して加えた。プラスミド維持のために選択的な圧力を提供することが望ましい場合には、カナマイシンを最終濃度２０μｇ／ｍＬで、およびアンピシリンを最終濃度１００μｇ／ｍＬで加えた。
【００５４】
全ての分子生物学的操作は、標準的技法に従って行った（３２）。ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ（Ｉｎｏ１、またＭＩＰＳとしても知られている）をコードするＩＮＯ１遺伝子を、Saccharomyces cerevisiaeのゲノムＤＮＡ調製物から、次のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：フォワードGAATTCATGACAGAAGATAATATTGCTC-3’（配列番号：３）；リバース5’-AAGCTTCTACAACAATCTCTCTTCG-3’（配列番号：４）。プライマーの５’末端に含まれるＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位には下線をつけた。ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードするマウスＭＩＯＸ遺伝子は、大腸菌での発現のためにコドン最適化と共にGenBankアクセッション番号ＡＦ１９７１２７に基づくＤＮＡ２．０（Menlo Park, CA）により合成した。８５８個のヌクレオチド（２８６コドン）配列の最適化はベンダーによって実施し、その結果の概要は以下である：１９．２％のヌクレオチドは変化され、２８６のコドン中１５３が影響を受けた（５３．５％）。最適化されたコドンのうち、１４４個（９４．１％）は第３ヌクレオチド位置のみで変化された。３つのコドンにおいては、全３つのヌクレオチドが変化された。合成遺伝子は、プラスミドｐＪ２−ＭＩＯＸとして受領された。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、それぞれ遺伝子の５’末端および３’末端に含まれた。マウスＭＩＯＸ遺伝子および大腸菌での発現用にコドン最適化されたその合成版の配列アラインメントは、図４に示す。両方の遺伝子は、発現された酵素の活性に適合するように、ＩＰＴＧ誘発性プラスミドｐＭＭＢ２０６（２５）およびｐＴｒｃ９９Ａ（２）内でサブクローニングされた。得られたプラスミドは、ｐＭＭＢ−ＩＮＯ１、ｐＴｒｃ−ＩＮＯ１、ｐＭＭＢ−ＭＩＯＸ、およびｐＴｒｃ−ＭＩＯＸと呼ばれた。両方の遺伝子の共発現のために、２つのＴ７プロモーターを含むNovagenからのｐＲＳＦＤｕｅｔ−１ベクターを用いた（Gibbstown, NJ）。ＩＮＯ１遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて第１位置にサブクローニングし、プラスミドｐＲＳＦＤ−ＩＮを産生した。ＭＩＯＸ遺伝子を第２位置に導入するために、ｐＪ２−ＭＩＯＸのＨｉｎｄＩＩＩ部位を、ＥｃｏＲＩでの消化の前に、クレノウ酵素を用いて末端充填した。ｐＲＳＦＤ−ＩＮを初めにＸｈｏＩで消化し、末端充填し、次にＭＩＯＸ遺伝子断片によるライゲーションの前に、ＥｃｏＲＩ適合性ＭｆｅＩで消化した。得られたプラスミドを、ｐＲＳＦＤ−ＩＮ−ＭＩと名付けた。Pseudomonas syringaeからのウロン酸デヒドロゲナーゼをコードするｕｄｈ遺伝子（GenBankアクセッション番号ＥＵ３７７５３８）の単離を、例２に示す。Pseudomonas syringaeからのｕｄｈ遺伝子を、ｐＴｒｃ９９Ａにサブクローニングして、ｐＴ１０５３（以下、ｐＴｒｃ−ｕｄｈと呼ぶ）を（４０）に記載のように産生した。
【００５５】
ＭＩＰＳ（ＩＮＯ１）、ＭＩＯＸ、およびＵＤＨ活性のための酵素アッセイ
ＩＮＯ１、ＭＩＯＸおよびｕｄｈ遺伝子の機能の発現を、酵素活性のin vitroアッセイにより確認した。粗溶解物（粗ライセート）を以下のようにして調製した：１〜２ｍＬ培養物からの細胞ペレットを、初めに、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含む１００〜２００μＬの１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁させた。細胞溶液を、液体窒素中での凍結と、３０〜４０℃の水での解凍を５サイクル繰り返すことにより、溶解させた。得られた溶液を１４，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離して、不溶解物を除去した。溶解物の総タンパク質濃度は、Bradford法（１１）を用いて決定した。
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ活性についてのアッセイは、前に記載のようにして行った（１、６）。簡単に述べると、グルコース−６−リン酸基質を、５０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ７．５）、０．８ｍＭのＮＡＤ＋、１４ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭのメルカプトエタノール、および５ｍＭのグルコース−６−リン酸からなる反応バッファー内で、ミオイノシトール１ホスファターゼに変換した。反応は、溶解物を加えることにより開始され、３７℃で１時間インキュベートした。反応は、０．４容積の２０％トリクロロ酢酸を加えて終了させた。産物の定量化のために、等量の０．２ＭのＮａＩＯ４を用いた酸化により、ミオイノシトール１−リン酸から無機リン酸塩を除去した。過剰の過ヨウ素酸塩を等量の１ＭのＮａ２ＳＯ３を加えて破壊した。コントロール反応は、グルコース−６−リン酸なしで、過ヨウ素酸塩の添加なしで行った。
【００５６】
ミオイノシトールオキシゲナーゼ活性についてのアッセイは、前に記載のようにして行った（４、３０、３１）。反応バッファーは、５０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭのＬ−システイン、１ｍＭのＦｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２および６０ｍＭのミオイノシトールからなった。試料は基質なしで３０℃で１０分間プレインキュベートして、ＭＩＯＸ酵素を活性化させた。反応物は３０℃で１時間インキュベートし、次に、１／１０容積の３０％トリクロロ酢酸を加えて終了させた。産生されたグルクロン酸をオルシノール試薬を用いて定量化した（１３）。試薬は、５．４ｍｇのＦｅＣｌ３を含有する１０ｍＬの濃縮ＨＣｌ中の、４０ｍｇのオルシノールからなった。１容量の試料を２容量のオルシノール試薬と混合し、沸騰水中で３０分間インキュベートした。室温に冷却後、６７０ｎｍでの吸収を測定して、グルクロン酸濃度を決定した。コントロール反応は、バックグラウンドを説明するためにミオイノシトールなしで確立した。
ウロン酸デヒドロゲナーゼ活性についてのアッセイは、前に記載のように（３５、４０）、３４０ｎｍでのＮＡＤＨ補因子生成をモニタリングすることにより行った。反応混合物は、１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭのグルクロン酸、０．９ｍＭのＮＡＤ+、および上述のようにして調製した細菌溶解物を含んだ。
【００５７】
酸の産生用の増殖条件
培養物は、１０ｇ／Ｌのグルコースを補足したＬＢ培地中で増殖させ、結果に示すようにＩＰＴＧで誘導した。接種物（inoculum）はＬＢ倍地中で調製し、１または２％（ｖ／ｖ）を用いて、５０または１００ｍＬの培地を含有する２５０ｍＬのバッフルフラスコへの接種を行った。培養物は３０℃で２５０ｒｐｍにてインキュベートし、培養倍地中の細胞密度および産物の濃度を決定するために定期的にサンプリングした。
【００５８】
有機酸の検出および定量
グルクロン酸およびグルカン酸を含む代謝物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量化した。グルカン酸アッセイには、試料は前述のようにして前処理し（２８、４０）、グルクロン酸を含む他の代謝物からグルカン酸を分離した。簡単に述べると、グルカン酸に存在する共平面隣接ｃｉｓ−ヒドロキシ基に親和性を有するボロン酸親和性ゲル（Affi-gel boronate gel, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）（２８）を試料と混合し、８０ｍＭのリン酸カリウム−２０ｍＭのホウ酸バッファー（ｐＨ７．０）で洗浄した。グルカン酸を０．１Ｍの塩酸で溶出した。溶出物を、１０ＭのＮａＯＨを加えて中性にし、つぎにＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析は、Aminex HPX-87Xカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）と屈折率およびダイオードアレイ検出器を備えたAglient 1100シリーズ装置により、次の条件下で行った：移動相、水中の５ｍＭの硫酸；流速、０．５ｍＬ／分；注入容量、５０μＬ；温度、５５℃；ＵＶ波長、２１０ｎｍ。
【００５９】
結果
組換えＩｎｏ１およびＭＩＯＸ活性の検証
Saccharomyces cerevisiaeからのミオイノシトール１−リン酸シンターゼ（Ｉｎｏ１）の、大腸菌発酵を介した高濃度のミオイノシトールの産生への使用は、前に報告されている（１５）。産物の２１ｇ/Ｌまでの力価が、高細胞密度の下で５４時間の補給バッチ（fed-batch）発酵で得られた。振とうフラスコ内でＩｎｏ１性能を確認するために、対応する遺伝子を増幅し、適合ベクター内に挿入し、つぎに高コピー数および中程度のコピー数プラスミドの両方に、共通の実験室株ＤＨ１０Ｂでの発現のためにサブクローニングした。プラスミドｐＴｒｃ−ＩＮＯ１は、数百のコピー数をもたらす改変ＣｏｌＥ１レプリコンを含み、一方、ｐＭＭＢ−ＩＮＯ１は、１０の桁のコピー数のＲＳＦ１０１０レプリコンに基づく。２つのプラスミドを評価して、ＩＮＯ１およびＭＩＯＸ遺伝子の、適合ベクターを用いた単一株内での共発現の可能性を探索した。３４４ｎｍｏｌ／時間／ｍｇおよび１２８ｎｍｏｌ／時間／ｍｇのin vitro活性がそれぞれ、ｐＴｒｃ−ＩＮＯ１およびｐＭＭＢ−ＩＮＯ１を含み、かつ３０℃でインキュベートした培養物に対して測定可能であり、酵素の発現の成功を示唆した（表１）。しかし、高コピー数プラスミドからの発現のみが、培養倍地中での測定可能な量、０．３７ｇ／Ｌのミオイノシトールの蓄積をもたらした。活性は温度の強い関数でもあり、３７℃で増殖した培養物には検出なしであった。ミオイノシトール産生を、Ｍ９最少培地でも試験した。最少培地中、グルコースのみを炭素源として増殖させると、グルコースフラックスが増加し、したがってミオイノシトール産生が増加すると考えられた。しかし、半分の量のミオイノシトールのみが産生され、このことは、グルコースフラックスは実際に高かったが、これらの条件下で発現されたＩｎｏ１酵素は解糖に対して基質と効率的に競合しないことを示唆した。次の実験を、グルコースを補足したＬＢ培地中で行った。
【００６０】
ＭＩＯＸは主に真核由来のタンパク質であり、ヒト、マウス、ラットおよび豚からの相同体が最もよく特徴づけられている（３、４、３０、３１）。ミオイノシトールオキシゲナーゼ（ＭＩＯＸ）は大腸菌内に機能的に発現され、酵素特性の特徴づけのために精製された；しかし、我々が知る限りでは、哺乳動物のＭＩＯＸは、全細胞の組換え系でグルクロン酸の産生のために用いられたことはない。酵素のマウス版は、大腸菌での発現で最も有利な特性を持つことが見出され（３）、研究に選択された。遺伝子の合成版は、大腸菌へのコドン最適化と共にＤＮＡ２．０から購入した。この遺伝子も、ＤＨ１０ＢでのＩｎｏ１活性の評価のために用いる高コピー数および低コピー数ベクターの両方にサブクローニングした。ＭＩＯＸ活性はまず３７℃で評価したが、これは、酵素が哺乳動物由来だからである。
【００６１】
ＭＩＯＸ酵素は、Ｆｅ２＋およびシステインをin vitroでの活性化のために必要とすることが知られている（４）。これら化合物の培養培地への添加は、in vitroアッセイで測定されるように、ｐＴｒｃ−ＭＩＯＸからの酵素の発現を改善せず、むしろ活性を低下させた（表２）。グルクロン酸はそれでも培養培地中で計測されたが、濃度は低かった。酵素活性の観察された低下は、細胞密度の顕著な低下と一致し、これら化合物の宿主に対する毒性を示唆した。前に報告されたように（３０、３１）、ＭＩＯＸ活性は高濃度のＦｅ２＋およびシステインにより阻害される。細胞外濃度はin vitroアッセイで酵素を活性化するレベルに設定したが、対応する細胞内濃度は未知であった。また、ミオイノシトールを培養培地に加えると、大腸菌でのＭＩＯＸの溶解性発現を改善した（３）。この挙動は本明細書でも観察され、ミオイノシトールの補足なしで発現された場合に、酵素活性の大幅な低下が示された（表２）。組換えＭＩＯＸの驚くべき性質の１つは、その見かけの不安定性である（３）。指数相の間に収集した試料では高い活性が観察されたが（播種の６時間後）、しかし定常相では大きく低下した（播種の２４時間後）（表２）。空のｐＴｒｃ９９Ａプラスミドを含有するコントロール試料で測定されたアッセイのバックグラウンド活性は、一般に時間と共に増加する。アッセイの高いバックグラウンドは、オリシノール試薬の非特異性によることを指摘する；該試薬は、低い程度ではあるが、他の生物学的化合物と反応することが知られている。そのため、アッセイは酵素活性の正確な定量化には信頼できない可能性がある。しかし、ミオイノシトール有りおよび無しの試料間、また初期および後期の時点でのミオイノシトール試料間で観察された差は充分に大きいため、これらの傾向は有意であると考えることができる。
【００６２】
in vitro酵素活性およびin vivoグルクロン酸産生のどちらも、低コピー数ｐＭＭＢ−ＭＩＯＸコンストラクトを含有する培養物中では観察されず、測定可能なＭＩＯＸ活性を実現するには、高い発現レベルが必要であることを示唆する。ＩＮＯ１は３０℃でのみ、活性に発現されるため、in vivo ＭＩＯＸ性能もこの温度において高コピー数プラスミドから評価した。グルクロン酸の適合量である０．４０ｇ／Ｌを、培養物中で２４時間後に産生し、力価は４８時間後に２倍の０．７８ｇ／Ｌとなった。
【００６３】
グルクロン酸の産生
グルコースからのグルクロン酸の産生には、ＩＮＯ１とＭＩＯＸ両方が、同じ株内で共発現することが必要である。適合プラスミドｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＭＭＢ２０６両方を、ｐＴｒｃ−ＩＮＯ１とｐＭＭＢ−ＭＩＯＸ、またはｐＭＭＢ−ＩＮＯ１とｐＴｒｃ−ＭＩＯＸを含有する２重に形質転換された株を産生に用いることができると予想して検討した。しかし結果は、培養倍地中のそれぞれ所望の産物の蓄積により決定される、合理的なin vivo活性は、高コピー数プラスミドからの両遺伝子の発現によってのみ実現可能であることを示した。この問題に取り組むため、両方の酵素を、それぞれがＴ７プロモーターの後ろにある複数クローニング部位の対を含む、高コピー数ｐＲＳＦＤｕｅｔベクターに導入した。酵素活性は前に記載のようにして確認し、発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（データ示されず）。この様式で、０．１ｍＭのＩＰＴＧ濃度が好ましいと決定された。宿主株は、ＤＨ１０ＢからＢＬ２１（ＤＥ３）に変えて、Ｔ７プロモーターからの発現を可能とした。我々は前に、ＤＨ１０Ｂがグルクロン酸を増殖のために消費できないことを観察した（データ示されず）。ＢＬ２１（ＤＥ３）はグルクロン酸を代謝可能である；しかし、その消費は、異化代謝産物抑制を受けるようであった（データ示されず）。したがって、過剰なグルコースでの株の培養は、所望産物の消費を防ぐ。
【００６４】
ｐＲＳＦＤ−ＩＮ−ＭＩを含むＢＬ２１（ＤＥ３）株は、〜２７０ｍｇ／Ｌのレベルでのみではあるが、グルコースからグルクロン酸を産生することができた（図２）。培養プロファイルによれば、グルクロン酸は中間体の検出なしに２４時間後に存在し、濃度は４日間で５０％増加した。しかし４８時間後に、多量のミオイノシトールが培養倍地中に現れた。ミオイノシトールは培地に蓄積され続けて、実験の終わりまでには、所望の最終産物であるグルクロン酸よりやや高い濃度で存在した。最終グルクロン酸濃度である０．２７ｇ／Ｌは、上記のＤＨ１０Ｂ（ｐＴｒｃ-ＭＩＯＸ）系でのミオイノシトールの直接変換で観察されたもの（０．７８ｇ／Ｌ）より低い。ミオイノシトールの蓄積は、ＭＩＯＸ活性が、高濃度のグルクロン酸の産生における律速因子であることを示唆する。in vitroアッセイにより、実験の経過を通して、Ｉｎｏ１活性がベクターのみの制御より顕著に高いこと、わずかなバックグラウンド活性が３日後に現れることを確認した（データ示されず）。対照的に、ＭＩＯＸ活性は１日後にバックグラウンドよりわずかに高いのみであり、その後バックグラウンドから識別不能となった。これは、ＭＩＯＸ活性が２４時間後に大きく低下することを示す、前に概説した結果と一致した（表２）。さらに、この系におけるＭＩＯＸの活性は、Ｉｎｏ１により産生されるミオイノシトールの濃度により制限されるようである。６０ｍＭ（１０．８ｇ／Ｌ）のミオイノシトールの細胞外補足は、細胞内濃度も高いことは意味しないので、Ｉｎｏ１活性から得られるミオイノシトールの細胞内濃度は、等価の濃度には足らないようであると考えるのは合理的である。
【００６５】
グルカン酸の産生
例２は、P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００からのウロン酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子の、クローニングおよび特徴づけを示す（４０）。ｕｄｈ遺伝子は、大腸菌で非常に良好に発現され、高い酵素活性をもたらすことが見出された。グルカン酸の産生のために、我々は、ｐＲＳＦＤ−ＩＮ−ＭＩに適合する、前に構築したｐＴｒｃ９９Ａのｕｄｈ遺伝子を含むベクターを用いた。両方のベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して、ＩＮＯ１、ＭＩＯＸ、およびｕｄｈを担持する大腸菌株を構築した。この株の生産性を、いくつかの異なる誘導条件下で測定した（表３）。最初の２つの遺伝子を含む系において前に観察されたのは０．２７ｇ／Ｌのみのグルクロン酸であったにもかかわらず、驚くべきことに、１ｇ／Ｌまでのグルカン酸が産生された。グルクロン酸に前に用いたものと同一の誘導条件下で（表３、条件Ａ）、０．７２ｇ／Ｌのグルカン酸が産生された。この系の特徴をさらに明らかにするために、粗溶解物中の酵素活性を、培養の各日に測定した（図３）。ｕｄｈ活性は最大であり、Ｉｎｏ１活性よりも２桁以上高く、ＭＩＯＸ活性よりも３桁以上高かった。Ｕｄｈの高い活性はしたがって、グルコースフラックスをグルカン酸経路を通って引き寄せ、グルカン酸の比較的高い力価をもたらす。これらの試料において、ＭＩＯＸ活性は前に観察されたのと同じく、時間とともに低下せず、しかし、活性の程度は非常に低いままである。さらに、ここでの最初のデータ点は１日後であり、これは、ＭＩＯＸ活性が指数増殖の間に観察された値から顕著に低下することが前に示された時期である（表２）。３日間の培養期間後にグルクロン酸は検出されず、一方、ミオイノシトールは蓄積されて、ＭＩＯＸが触媒する段階が律速的であることを確認した。
【００６６】
試験した３つの誘導条件により、０．７２〜１．１３ｇ／Ｌの範囲のグルカン酸濃度がもたらされた。一般により高い誘導レベル、すなわちより高いＩＰＴＧ濃度は、グルコースでのグルカン酸のより高い収率をもたらすが、しかし産物の濃度は低くなる（例えば表３の条件ＡとＢを比較のこと）。より高い誘導レベルはまた、低いグルコース消費と低い細胞密度をもたらし、３つの酵素の高い発現に関連する代謝負荷量を示唆する。しかし、低いグルコース消費速度の場合には、グルコースフラックスの高い断片が、グルカン酸産生対バイオマスに向けられる。我々はさらに、２５０ｍＬのバッフルフラスコ中の総培養容積が５０から１００ｍＬに倍増したことから生じる低いエアレーションが、グルカン酸力価を２分の１に低下させ、一方で増殖は影響を受けなかったことを観察した（データ示されず）。この力価の低下は、律速段階の酵素であるＭＩＯＸが、分子の酸素を共基質として用いるとの事実のためである（１２、３８）。最後に、グルカン酸の産生をＭ９最少培地中で試験した；しかし、ごく僅かのグルカン酸のみが産生された。
【００６７】
考察
本明細書に示されるのは、３つの異種のソース：S. cerevisiaeのＩＮＯ１、マウスのＭＩＯＸ、およびP. syringaeのＵｄｈからの酵素を用いた、グルカン酸産生のための生合成経路のアッセンブリーである。内因性のホスファターゼもまた、この経路に関与する。大腸菌のｓｕｈＢ遺伝子産物は、in vitroでイノシトール１リン酸活性を有することが示され、したがってこの内因性活性に対する合理的な候補である（２３）。この経路は熱力学的視点から魅力的であり、その理由は、グループ寄与理論により推定されるように（２１、２４）、また分子の酸素を究極の酸化剤と考えると、全３段階に対する標準の自由エネルギー変化（ΔＧ）が全て負だからである：グルコースからミオイノシトール段階に対して−１４．３Ｋｃａｌ／ｍｏｌ；ミオイノシトールからグルクロン酸段階に対して−８６．８Ｋｃａｌ／ｍｏｌ；グルクロン酸からグルカン酸段階に対して−５５．９Ｋｃａｌ／ｍｏｌ。しかし、Khosla and Keaslingが示したように（１８）、代謝工学は単に種々の酵素を採用するだけではない。これはまた、宿主生物への新しい経路の導入などの摂動がなされた場合の、代謝フラックスの全般的最適化も含む。プラスミドの維持およびプラスミドによりコードされる遺伝子の発現に関連する、代謝性負荷の問題は、この場合に特に興味深い（９、１０、１７）。我々の系において、検出可能量のグルクロン酸は、高コピー数プラスミドによってのみ、in vivoで産生された。過剰なグルコースを補足したＬＢ培地を増殖に用いているので、最初の基質であるグルコース−６−リン酸は中央代謝に対して律速的であってはならない。したがって、早くて頑強な解糖経路と競合し、グルコース−６−リン酸をグルクロン酸へと分流させるために、組換え遺伝子の高い発現レベルが必要となる。
【００６８】
Ｍ９培地中でごく少量のミオイノシトールのみが産生され、検出可能な量の有機酸は産生されなかったという結果は、グルコースがただ一つの炭素でエネルギー源である場合に、ほぼ全ての基質が内因性の細胞代謝に入ることを示す。この競合はまた、培地中のグルコース濃度が高い、プロセスの最初の２日間におけるグルコースでのグルカン酸の収率が、濃度が低い後の日におけるよりも一般に高くなる理由（データ示されず）を説明することができる。高いＭＩＯＸ活性を実現するためのミオイノシトールに対する必要条件は、Ｉｎｏ１酵素からの低い生産性が究極的には、Ｍ９倍地中での有機酸の形成に対する制限となり得ることを示唆する。代替的に、ＭＩＯＸは最少培地中では少量のみ発現され得る。Ｉｎｏ１を用いた前の研究では、代替的な化学的に規定された培地において、遺伝子発現のために高コピー数のプラスミドを用いた場合に、ミオイノシトールの高い産生レベルがもたらされたことは注目すべきである；しかし、これらの実験は大規模スケールで、数日間の補給バッチ発酵で行われた（１５）。グルコース補給開始前の初期バッチ期間の間（およそ１０時間）、ミオイノシトール濃度は１ｇ／Ｌ未満であった。したがって、補給バッチ条件下での培養が我々の系の産生を改善できる程度を探ることは価値あることである。
【００６９】
プラスミドのコピー数は、我々の合成系の性能に影響する発現レベルに関連する、ただ一つの因子ではない。表３に示すように、発現を増加させるために誘発物質の濃度を増加することにより、産物の濃度の低下がもたらされる。０．０５ｍＭより低いＩＰＴＧ濃度は、グルコース消費率および増殖率が代謝負荷量の低下により増強された場合にも、グルカン酸の産生を改善しなかった（データ示されず）。大腸菌の増殖は、３０℃よりも３７℃において活発であり、律速酵素ＭＩＯＸの活性は、３７℃においてより高いはずである。しかし、発酵は３０℃で行われ、その理由は、Ｉｎｏ１がこの低い温度においてのみ、機能的に発現されるからである。Ｕｄｈの通常でない温度不安定性の報告を考慮すると（７、３５）、３０℃より低い温度がその活性にはよいであろう；しかし我々は、３０℃でのＵｄｈ活性が、Ｉｎｏ１またはＭＩＯＸどちらかの活性よりも大幅に高いことを見出し（図３）、３０℃をＩｎｏ１の機能的発現を最大化する培養温度として選択した。
【００７０】
この系の産生への全体的な制限を考えると、経路内での中間体による潜在的阻害を試験すべきである。ブタ腎臓からのＭＩＯＸはin vitroでＤグルカン酸により阻害されたが、しかしＤグルクロン酸塩またはＤグルクロノラクトンによっては阻害されないことが報告された（３０、３１）。ＭＩＯＸ活性が定常期において、Ｄグルカン酸の不在においても大きく低下することを考慮すると（表２）、低いＭＩＯＸ活性は、中間体による阻害よりも、固有の不安定性のためである可能性が高い（３）。我々がｓｕｈＢ遺伝子または相同のホスファターゼを過剰発現させなかったこともまた、注目すべきである。しかし、培養産物の中にミオイノシトール−１−リン酸は検出されず、一方、ミオイノシトールは蓄積しなかった。したがって我々は、ホスファターゼ活性は経路を通るフラックスを制限しないと結論付けた。大腸菌もまたＤルグカレート異化作用経路を含む（１６）。実際、大腸菌が増殖のためにＤグルカレートを単一の炭素源として消費する能力を用いて、ウロン酸デヒドロゲナーゼ活性を同定するスクリーンを開発した（４０）。ＢＬ２１（ＤＥ３）もまた、Ｄグルクロン酸を代謝できる。しかし、両有機酸の消費は、カタボライト抑制（異化産物抑制）に付されるようであり、グルコースの存在下での望ましくない産物の損失を防いでいる（データ示されず）。したがってＤグルカン酸力価の理論的限界は、酸の毒性および各段階の反応速度論により決定されるようである。大腸菌の増殖およびグルコース消費はグルカ酸カリウム（カリウムグルカレート:potassium glucarate）およびグルクロン酸ナトリウムの、１０ｇ／Ｌまでの高濃度での添加によって影響されないことが観察された（データ示されず）；したがって、律速段階の反応速度論の改善に集中することによる、力価の改善の余地がある。この合成経路の、グルコースフラックスを増強するためのさらなる最適化には、異なるソースからより良好な酵素を採用すること、これらの酵素を操作すること、および競合経路を下方制御することが必要である。
【００７１】
表１．大腸菌にて高コピー数（ｐＴｒｃ）および中コピー数（ｐＭＭＢ）プラスミドから発現された組換えＩＮＯ１の活性。培養物は、１０ｇ／Ｌのグルコースおよび、０．１ｍＭのＩＰＴＧでｐＴｒｃ−ＩＮＯ１、または１．０ｍＭのＩＰＴＧでｐＭＭＢ−ＩＮＯ１を補足したＬＢ倍地中、３０℃にて増殖させた。in vitro活性は中間指数相で採取した試料の粗溶解物から決定し、in vivo活性は、培養倍地中４８時間後のミオイノシトール濃度として報告する。示したデータは、１つの実験からの代表値である。Ｎ／Ｄ＝不検出。
【表１】
【００７２】
表２．大腸菌にて高コピー数ｐＴｒｃ−ＭＩＯＸから種々の培養条件下で発現された、組換えＭＩＯＸの活性。培養物はＬＢ培地中３７℃で増殖させ、１．０ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。グルクロン酸は２４時において測定した。補足物：ＭＩ＝ミオイノシトール（６０ｍＭ、１０．８ｇ／Ｌ）、Ｆｅ＝Ｆｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２（１ｍＭ）、Ｃｙｓ＝Ｌ−システイン（２ｍＭ）。Ｎ／Ｄ＝不検出。Ｎ／Ａ＝測定せず。
【表２】
【００７３】
表３．ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＲＳＦＤ−ＩＮ−ＭＩ）（ｐＴｒｃ−ｕｄｈ）中で３日間培養後のグルカン酸の産生。培養物は、１０ｇ／Ｌのグルコースを補足したＬＢ培地中３７℃で増殖させ、ＩＰＴＧで誘導した。データは３つの独立した実験の平均値および標準偏差である。ＯＤ６００＝６００ｎｍにおける光学密度、Ｇｌｃ＝グルコース、ＭＩ＝ミオイノシトール、Ｃｕｒｏ＝グルクロン酸、Ｃａｒ＝グルカン酸、収率（％）＝１００×産生されたグルカン酸／消費されたグルコース（ｍｏｌ／ｍｏｌ）。条件Ａ＝０時に０．１ｍＭのＩＰＴＧ；条件Ｂ＝０時に０．０５ｍＭのＩＰＴＧ；条件Ｃ＝０時に０．０５ｍＭのＩＰＴＧおよび１７．５時に０．１ｍＭのＩＰＴＧ、Ｎ／Ｄ＝不検出。
【表３】
【００７４】
例１についての参考文献
【表４】
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
【００７７】
【表７】
【００７８】
例２：P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００およびAgrobacterium tumefaciens株Ｃ５８からのウロン酸デヒドロゲナーゼのクローニングおよび特徴づけ
ウロン酸デヒドロゲナーゼを、P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００、Pseudomonas putidaＫＴ２４４０、およびAgrobacterium tumefaciens株Ｃ５８からクローニングした。遺伝子は、グルクロン酸塩を単一の炭素原として消費することはできないが、グルカレートで増殖できる大腸菌変異体を用いた新規な相補性アッセイを用いることにより、同定した。P. syringaeのショットガンライブラリのスクリーニングを、変異体大腸菌内にて、グルクロン酸を含有する最少培地上で形質転換細胞を増殖することにより行った。生存したコロニーを、グルクロン酸をグルカン酸に変換できるウロン酸デヒドロゲナーゼについて評価した。この様式で、０．８Ｋｂのオープンリーディングフレームを同定し、続いてｕｄｈであることを確認した。相同の酵素を、配列決定ゲノムの類似性探索に基き、P. putidaおよびA. tumefaciensにおいて同定した。大腸菌で発現された３種の微生物の各々からの組換えタンパク質を精製して特徴づけた。全３種の酵素について、代謝回転数ｋｃａｔは、基質としてのグルクロン酸塩に対して、ガラクツロン酸塩に対するよりも高かった；しかし、ミカエリス定数Ｋｍはガラクツロン酸塩対して低かった。A. tumefaciens酵素は最大の速度定数を有することが見出され（グルクロン酸塩に対してｋｃａｔ＝１．９×１０２ｓ−１）、これは両方のPseudomonas酵素よりも２倍以上高かった。
【００７９】
緒言
細菌でのアルドヘキサウロネート（aldohexuronate）異化作用には、２つの異なる経路、すなわち異性化反応段階により開始される経路と、酸化段階により開始される経路とが関与すると報告されている。異性化反応経路において、アルドヘキサウロネート（グルクロン酸塩、ガラクツロン酸塩）がウロン酸イソメラーゼによりケトヘキサウロネートに異性化され、最終的にはピルベートと３−ホスホグリセルアルデヒドに分解される。異性化反応経路は前に細菌において起こることが報告されており、その細菌としては大腸菌（７）、Erwinia carotovora（１８）、Erwinia hrysanthemi（１５）、Areobacter aerogenes（９、２３）、およびSerratia marcescens（２８）が挙げられる。酸化経路においては、アルドヘキサウロネートは、ウロン酸デヒドロゲナーゼによりアルドヘキサレート（aldohexarate）に酸化され、さらにピルベートに異化される。（２、５、７、９、１８、１９、２４）。この経路の鍵となる酵素であるウロン酸デヒドロゲナーゼ（Ｕｄｈ）を、２種の植物病原性細菌であるPseudomonas syringaeおよびAgrobacterium tumefaciensにおいて検討した。これまで、Ｕｄｈの特性に関して限定された研究のみが文献に報告されており（３、６、３８、４３）、配列はまだ同定されていない。Ｕｄｈは、全分子量が約６０，０００のＮＡＤ結合酸化還元酵素として分類されている（EC 1.1.1.203）。これは、それぞれが約３０，０００の分子量の２つのサブユニットからなるホモダイマーである（３８）。Ｕｄｈは熱的に不安定で、可逆性酵素であり、最適なｐＨは約８．０である（３、６、３８）。
【００８０】
アルドヘキサウロネート異化のための異性化反応経路を有する大腸菌ＭＧ１６５５において、グルクロン酸塩はｅｘｕＴによりコードされたアルドヘキサウロネートトランスポーターにより輸送され、ｕｘａＣによりコードされるウロン酸イソメラーゼによりフルクツロン酸塩に変換される（２２、３０）。フルクツロン酸塩はエントナー・ドードロフ経路に移動されて、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホ−グルコネートを介してエネルギー源として利用される（７、２７、３１、３２）。したがって、ｕｘａＣが欠失した大腸菌ＭＧ１６５５は、グルクロン酸塩を炭素源として用いることができない。この同じ株において、グルカレートは、ｇｕｄＤによりコードされるＤ−グルカレートデヒドラターゼにより、５−ケト−４−デオキシ−Ｄ−グルカレートに変換され、ついでピルベートまたは２−ホスホグリセラートを介して解糖作用に移動される（２７、３３）。近年、多数の細菌ゲノム配列が公開され、これにはP. syringae pv. tomatoＤＣ３０００およびA. tumefaciens株Ｃ５８を含むＵｄｈのそれらも含まれる（４、１０）。P. syringaeのショットガンライブラリを構築して、Ｕｄｈをコードする遺伝子を同定した。Ｕｄｈのスクリーニングは、大腸菌ＭＧ１６５５ΔｕｘａＣにおいて行った。ウロン酸デヒドロゲナーゼはグルクロン酸塩をグルカレートに変換するため（図５）、グルクロン酸塩を単一の炭素源として含有する最少培地で増殖可能なP. syringaeのショットガンライブラリを含む大腸菌ΔｕｘａＣ株は、Ｕｄｈをコードする遺伝子を担持することができる。最初のＵｄｈがいったんP. syringaeから同定されれば、ＢＬＡＳＴ相同性探索により、他の細菌からのＵｄｈの同定を導くことができる。
【００８１】
材料および方法
細菌株、プラスミド、および増殖条件
本研究に用いた株、プラスミド、およびプライマー配列を表４に示す。培地および化学試薬はSigma（St. Louis, MO, USA）またはBD Biosciences（San Jose, CA, USA）から購入した。P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００はゲノムライブラリのソースとして用い、これはMassachusetts General HospitalのFrederick Ausubel博士から寄贈されたものである。P. syringaeは５０μｇ／ｍＬのリファムピシンを加えたＬＢ（Luria-Bertani）培地中３０℃で増殖させた。Pseudomonas putidaＫＴ２４４０（ATCC 47054）はAmerican Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA, USA）から購入し、ＬＢ培地中３０℃で増殖させた。大腸菌株は２ＹＴ培地（１リットル当たり１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母抽出物、および１０ｇの塩化ナトリウム）中３７℃で増殖させた。必要に応じて、アンピシリンおよびカナマイシンをそれぞれ１００および２５μｇ／ｍＬで培地に加えた。大腸菌ＤＨ１０Ｂ（F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu) 7697 galU galK λ- rpsL nupG）を、ゲノムライブラリに対する宿主株として、およびスクリーニングする遺伝子（Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA）のサブクローニングのために用いた。大腸菌ＭＧ１６５５のΔｕｘａＣは、University of Wisconsin-Madisonの大腸菌ゲノムプロジェクトのF. R. Blattner博士より提供を受けた。Ｍ９最少寒天については、２２ｍＭのグルコース、グルクロン酸塩、またはグルカレートを炭素源として用いた。プラスミドベクターｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＴｒｃ９９ＳＥを、それぞれゲノムライブラリの構築のため、および候補遺伝子に対する発現ベクターとして用いた（表４）。プラスミドｐＴｒｃ９９ＳＥは、Gyeongsang National University, KoreaのSeon-Won Kim博士より寄贈された。pBluescript（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を一般クローニングベクターとして用いた。
【００８２】
P. syringaeゲノムライブラリのゲノムＤＮＡの調製、構築およびスクリーニング
ゲノムＤＮＡの調製および一般クローニングの手順は、Sambrook et al.（３５）に記載のようにして行った。A. tumefaciens株Ｃｒ５８のゲノムＤＮＡは、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号３３９７０Ｄ）から購入した。制限酵素およびＴ４リガーゼは、New England Biolabs（Beverly, MA, USA）より購入した。P. syringaeゲノムＤＮＡはＢｆｕＣＩで部分的に消化され、次に０．８％アガロースゲル上に負荷した。２〜６Ｋｂの断片をゲルから精製し、脱リン酸化されたＢａｍＨＩ末端でｐＴｒｃ９９Ａにライゲーションした。４℃で２日間のライゲーション後に、反応混合物を用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。成功した形質転換体クローンを収集し、寒天プレートからプールし、次に−８０℃で保管した。コロニープールから単離したプラスミドプールを用いて大腸菌ＭＧ１６５５ΔｕｘａＣを形質転換し、Ｕｄｈ活性についてスクリーニングした。形質転換株を、２２ｍＭのグルクロン酸塩を加えたＭ９最少寒天プレート上、３０℃で４日間培養した。プレートからの生存クローンを、それらのプラスミドの精製および配列決定によりスクリーニングした。配列決定結果を、GenBankアクセッション番号ＮＣ＿００４５７８（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）に報告されているP. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００のゲノム配列と比較した。
【００８３】
ｕｄｈ遺伝子を含む発現プラスミドベクターの構築
ＰＣＲ増幅を、ＰｆｕターボＡＤを用いて、製造業者の記載（Stratagene, La Jolla, CA, USA）のようにして行った。３つの候補遺伝子、ｉｏｌＥ、ｉｏｌＢ、およびＰＳＰＴＯ＿１０５３を、それぞれ表４に挙げたプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶ消化pBluescriptIIに平滑末端ライゲーションし、ｐＢｉｏｌＥ、ｐＢｉｏｌＢ、ｐＢｉｏｌＥＢ、およびｐＢ１０５３を得て、これらはそれぞれ配列決定して、その同一性を確認した。ｉｏｌＥ、ｉｏｌＢ、およびｉｏｌＥＢは、それぞれＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩでの消化により開裂し、次に同じ酵素により消化されたｐＴｒｃ９９Ａにライゲーションして、それぞれｐＴｉｏｌＥ、ｐＴｉｏｌＢ、ｐＴｉｏｌＥＢを構築した。ｐＢ１０５３からのＰＳＰＴＯ＿１０５３は、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩでの消化により開裂し、次に同じ酵素により消化されたｐＴｒｃ９９Ａにライゲーションして、ｐＴ１０５３を得た。
A. tumefaciens、P. putida、およびP. syringaeのゲノムＤＮＡからの推定ｕｄｈ遺伝子を、それぞれプライマー対ＡＴｕｄｈ２−Ｆ／ＡＴｕｄｈ２−Ｒ、ＰＰｕｄｈ−Ｆ／ＰＰＴｕｄｈ−ＲおよびＰＳｕｄｈ−Ｆ／１０５３−Ｒを用いて増幅した（表４）。ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶで消化されたpBluescriptIIに平滑末端ライゲーションし、プラスミドｐＢＡＴｕｄｈ２、ｐＢＰＰｕｄｈ、およびｐＢＰＳｕｄｈを得た。プラスミドｐＴＡＴｕｄｈ２、ｐＴＰＰｕｄｈ、およびｐＴＰＳｕｄｈを構築するために、対応する遺伝子をそれぞれｐＢＡＴｕｄｈ２、ｐＢＰＰｕｄｈ、およびｐＢＰＳｕｄｈからのＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで切除し、ｐＴｒｃ９９ＳＥの同一部位に挿入した。
【００８４】
タンパク質精製および反応速度パラメータ
A. tumefaciens、P. putida、およびP. syringaeのゲノムＤＮＡからのｕｄｈ遺伝子を、表４に挙げたようにプライマーＡＴｕＥＱ−Ｆ／Ｒ、ＰＰｕＥＱ−Ｆ／Ｒ、およびＰＳｕＥＱ−Ｆ／Ｒを用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、６ＸＨｉｓ−Ｔａｇを含むｐＥＴ２１ｂの同じ部位に挿入して、それぞれｐＥＴＡＴｕ、ｐＥＴＰＰｕ、およびｐＥＴＰＳｕを構築した（表４）。これらのプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、これをタンパク質発現に用いた。組換え大腸菌ＢＬ２１株を、ＩＰＴＧ誘導後に３０℃、２５０ｒｐｍで６時間培養した。タンパク質精製は、ProBond（商標）精製システムを用いて、製造業者の記載に従って行った（Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）をSambrook et. al.の記載（３５）に従って行った。精製タンパク質の基質上での酵素活性は、室温で３４０ｎｍにおける初期のＮＡＤＨの生成をモニタリングすることにより、測定した。グルクロン酸塩およびガラクツロン酸塩の反応速度解析は、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の０〜１０ｍＭのグルクロン酸塩またはガラクツロン酸塩と１．２ｍＭのＮＡＤ＋を用いて行った。ＮＡＤ＋での反応速度解析は、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の０〜２ｍＭのＮＡＤ＋と１０ｍＭのグルクロン酸塩を用いて行った。一連の酵素分析を行って、初期の活性を出発基質濃度の関数として推定した。これらのデータを用いて、ミカエリス・メンテン反応速度モデルのパラメータｋｃａｔおよびＫｍを、非線形最小二乗回帰により適合させた。非線形最小二乗回帰分析は、ガウス−ニュートン法により、固有のMatlab（登録商標）関数nlinfitによる実行を介して行った。
【００８５】
Ｕｄｈによりグルクロン酸塩から産生されたグルカレート決定のためのＬＣ−ＭＳおよびＣＤ解析
Ｕｄｈによりグルクロン酸塩からグルカレートを産生するための反応混合物は、２０ｍＭのグルクロン酸塩、２１．６ｍＭのＮＡＤ＋、４０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．０、および上記のようにして調製した細菌溶解物からなる。酵素反応は、粗溶解物または精製タンパク質のどちらかを反応混合物に加え、室温で６０分間インキュベートし、ついで１Ｍの水酸化ナトリウム加えて停止することにより、実施した。グルカレートの共平面隣接ｃｉｓ−ヒドロキシル基に結合可能な、ボロン酸親和性ゲル（Affi-gelボロン酸ゲル、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）を充填したカラムを用いて、グルカレートを反応混合物から分離した。グルクロン酸塩はそのｔｒａｎｓ−ジオール基のためにこのゲルには結合できない。Affi-gelに反応混合物を負荷した後、カラムを８０ｍＭリン酸カリウム−２０ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ７．０）で洗浄し、次にグルカレートを０．１ＭのＨＣｌを添加して溶出した。溶出物を５ＭのＮａＯＨを加えて中性化し、ＬＣ−ＭＳにより、Aminex HPX-87Hカラム（３００×７．８ｍｍ、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA）および電子スプレーイオン化検出器を備えたAgilent 1100シリーズＬＣ／ＭＳＤ（Agilent Technologies, US）を用いて分析した。質量スペクトルを、陽イオンおよび陰イオン検出モードの両方で得た。図８に示すスペクトルは、陰イオン検出モードからのものである。０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸、ｐＨ２．０を移動相として、０．５ｍＬ／分の流速で室温にて用いた。
グルクロン酸塩から形成されたグルカレートの立体化学を、その円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを真正グルカレート標準のそれと比較することにより確認した。ＣＤは、Aviv Model 202ＣＤスペクトロメータ（Aviv Biomedical, Lakewood, NJ）で行った。反応混合物は、２０ｍＭのグルクロン酸、７ｍＭのＮＡＤ＋、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）、および上記のように調製した精製酵素を含む。グルカレートはグルクロン酸から、上記のようにボロン酸親和性ゲルを用いて分離した。
【００８６】
配列同定およびアラインメント解析を含むコンピュータによる解析
Biocyc（商標）（http://bicyc.org/）を用いて、関連する代謝経路および代謝物を同定した。P. syringae 、P. putida、およびA. tumefaciensのＤＮＡ配列をＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）より、それぞれアクセッション番号ＮＣ＿００４５７８、ＮＣ＿００２９４７、およびＮＣ＿００３０６３として得た。相同性および保存ドメイン探索は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて行った。配列の管理およびアラインメントは、Vector NTIソフトウェア（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて行った。アラインメントおよび系統学的解析は、Vector NTIのAlignXモジュールを用いて行った。
【００８７】
ｕｄｈ配列に対するGenBankアクセッション番号
P. syringaeからのｕｄｈ遺伝子配列を、GenBankにアクセッション番号ＥＵ３７７５３８（核酸配列は配列番号１；アミノ酸配列は配列番号２）として寄託した。A. tumefaciensおよびP. putidaからの対応する遺伝子を、それぞれアクセッション番号ＢＫ００６４６２（ＤＮＡ：配列番号２３；タンパク質：配列番号２４）およびＢＫ００６３８０（ＤＮＡ：配列番号２５；タンパク質：配列番号２６）として寄託した。
【００８８】
Ｕｄｈ活性の酵素分析
酵素分析用の細菌溶解物は、凍結融解法により調製した。ｕｄｈ遺伝子を含む大腸菌株は、０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシド）を含有するＬＢ倍地中一晩増殖させた。ペレットは１ｍｇ／ｍＬのリソザイム溶液中に再懸濁させ、氷上で３０分インキュベートした。懸濁物を液体窒素で凍結し、３７℃の水浴で融解した。このステップを５回繰り返した。細胞溶解物を１４，０００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心分離し、上清を酵素分析に用いた。グルクロン酸塩のＵｄｈ活性を、３４０ｎｍでのＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元）の生成をモニタリングすることにより測定した（３８）。反応混合物は、２．５ｍＭのグルクロン酸塩、０．９ｍＭのＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、および１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーからなる。反応は、溶解物を反応混合物に室温で加えることにより誘導し、モニタリングした。Ｕｄｈ活性用に最適なｐＨを決定するため、反応混合物のｐＨをＨＣｌまたはＮａＯＨ溶液を添加して６．５〜９．９に調節した。総タンパク質濃度はBradford法（Bradford (1976) Anal Biochem 72:248-54)）を用いて決定した。特異的活性は、総タンパク質１ミリグラム当たりの単位（１Ｕ＝生成した１μｍｏｌＮＡＤＨ／分）で表した。化学物質はSigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）から購入した。
【００８９】
結果
Pseudomonas syringaeからのｕｄｈ遺伝子のクローニング
P. syringaeのＵｄｈ活性に対応する遺伝子を同定するために確立されたスクリーンは、大腸菌ＭＧ１６５５の変異株を利用した。ｕｘａＣの欠失は、グルクロン酸塩での増殖を妨害し、一方でグルカレートを単一の炭素源として増殖する能力を保持する。Ｕｄｈはグルクロン酸塩のグルカレートへの変換を触媒するため（３、３８）、P. syringaeのゲノムライブラリからのｕｄｈ遺伝子を含む大腸菌ＭＧ１６５５ΔｕｘａＣクローンは、グルクロン酸塩を単一の炭素源として増殖するはずである。大腸菌ＤＨ１０ＢおよびｐＴｒｃ９９Ａを、それぞれ、P. syringaeのゲノムライブラリの最初の構築のための宿主株およびプラスミドベクターとして用いた。ライブラリプラスミドプールを大腸菌ＤＨ１０Ｂクローンプールから調製し、ΔｕｘａＣ株の形質転換に用いた。形質転換ΔｕｘａＣクローンを、グルクロン酸塩含有のＭ９最少寒天上、３０℃で４日間インキュベートした。
【００９０】
１０個の寒天プレートから、２８個のクローンをさらなるスクリーニングに選択し、これらの各々は２〜５ｋｂの挿入断片を含んだ。これらからサイズの異なる挿入物を有する８つのクローンを、P. syringaeのゲノム配列（GenBankアクセッション番号ＮＣ＿００４５７８）と比較するために配列決定した。これらのクローンのうち６つはｉｏｌＥ、ｉｏｌＢ、またはその両方を含み、１つのクローンは割り当てなしのＰＳＰＴＯ＿１０５３オープンリーディングフレームを含んでいた。最後のクローンは、ｉｏｌＥＢとＰＳＰＴＯ＿１０５３領域のキメラを含んでいた。ライブラリ断片からのオープンリーディングフレームをＰＣＲ増幅し、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａに挿入して、プラスミドｐＴｉｏｌＥ、ｐＴｉｏｌＢ、ｐＴｉｏｌＥＢ、およびｐＴ１０５３を産出した。これらのベクターを含むクローンを用いて、どの遺伝子がウロン酸デヒドロゲナーゼ活性に対応するかを決定した。候補遺伝子で形質転換された大腸菌ＭＧ１６５５、ΔｕｘａＣ誘導体、および４つのΔｕｘａＣクローンを、グルクロン酸塩を単一炭素源として含有するＭ９最少培地でインキュベートした。野生型、ΔｕｘａＣ（ｐＴｉｏｌＢ）、ΔｕｘａＣ（ｐＴｉｏｌＥＢ）、およびΔｕｘａＣ（ｐＴ１０５３）株はＭ９グルクロン酸寒天上で増殖し、一方ΔｕｘａＣ（ｐＴｒｃ９９Ａ）およびΔｕｘａＣ（ｐＴｉｏｌＥ）株は増殖しなかった。したがって、ｉｏｌＢおよびＰＳＰＴＯ＿１０５３が、グルクロン酸塩を単一炭素源とする増殖に役割を果たしたので、これらを候補ｕｄｈ遺伝子と同定した。
【００９１】
２つの候補遺伝子間をさらに識別するために、プラスミドｐＴｉｏｌＢおよびｐＴ１０５３を用いて、大腸菌ＤＨ１０Ｂを組換え遺伝子を発現するよう形質転換した。得られたクローンを、０．１ｍＭのＩＰＴＧを有するＬＢ培地で増殖させた。これら２つのクローンからの粗溶解物中のＵｄｈ活性の分析により、ｐＴ１０５３を含む株はｈＵｄｈ活性を示すが、ｐＴｉｏｌＢはそうではないことが示唆された（図６）。アッセイは、グルクロン酸塩を基質として用い、３４０ｎｍでのＮＡＤＨの産生をモニタリングした。その結果、８２８ｂｐのＰＳＰＴＯ＿１０５３遺伝子が、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードすると推定された。以下ではこの遺伝子をｕｄｈと呼び、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）にアクセッション番号ＥＵ３７７５３８（核酸配列は配列番号１；アミノ酸配列は配列番号２）として登録した。
【００９２】
P. putidaおよびA. tumefaciensからのｕｄｈ遺伝子のクローニングおよび同定
P. syringaeからのｕｄｈの翻訳タンパク質配列を、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）のＢＬＡＳＴＰを用いて解析し、推定相同体を同定した。A. tumefaciensのＵｄｈ活性は前に検討されている（５、６、４３）。A. tumefaciensのオープンリーディングフレームＡｔｕ３１４３の翻訳は、最大の配列同一性４７．８％を有し、相同体Ｕｄｈの候補と考えられた。他の候補となるオープンリーディングフレーム、Pseudomonas putidaＫＴ２４４０のＰＰ１１７１もまた、P. syringaeＵｄｈと、７５．６％の配列同一性という高い類似性を有することが見出された。Ａｔｕ３１４３およびＰＰ１１７１をそれぞれのゲノムからＰＣＲ増幅し、P. syringaeからのｕｄｈと共にプラスミドベクターｐＴｔｒｃ９９ＳＥに組み込んで、それぞれプラスミドｐＴＡＴｕｄｈ２、ｐＴＰＰｕｄｈ、およびｐＴＰＳｕｄｈを作り出し、発現組換えタンパク質の相対的活性を比較した。形質転換ＤＨ１０Ｂクローンは、０．１ｍＭのＩＰＴＧ有りまたは無しのＬＢで培養され、つぎに粗溶解物を調製して酵素分析を行った（図７）。これらのアッセイにより、P. syringaeで前に得られたものと同様に、A. tumefaciensおよびP. putidaの組換えタンパク質に対して、グルクロン酸塩が基質として存在する中でのＮＡＤ＋消費活性が確認された。A. tumefaciensおよびP. putidaからの２つのｕｄｈ遺伝子も、GenBankに、それぞれアクセッション番号ＢＫ００６４６２（ＤＮＡ：配列番号２３；タンパク質：配列番号２４）およびＢＫ００６３８０（ＤＮＡ：配列番号２５；タンパク質：配列番号２６）として寄託した。
【００９３】
組換えＵｄｈの精製および特徴づけ、および反応産物の分析
P. syringaeのｕｄｈ遺伝子を含む大腸菌粗溶解物を用いた酵素反応により、低い基質負荷について、反応速度がグルクロン酸塩濃度に比例している、グルクロン酸塩を基質として用いる活性の存在を確認した（データ示されず）。この活性は、ＮＡＤ＋も利用するが、補因子としてＮＡＤＰ＋は利用しない（データ示されず）。これらの結果は、基質が酸化されたことを示した。グルクロン酸塩の構造の検討により、２つの可能な酸化点が示唆される：アルコールのケトンへの変換、またはアルデヒドのカルボン酸への変換であり、後者の反応はグルカレートを産生する。これら２つの産物の違いは質量スペクトルからも明らかであり、前者は基質に対して−２の質量差であり、一方後者は＋１６の質量差が生じる。酵素反応の産物がグルカレートであることを確認するために、試料をＬＣ−ＭＳで分析した。酵素反応から分離された溶出物のスペクトルと、グルカレート標準のスペクトルは一致し、グルカレートがＵｄｈ反応の産物であることを示唆した（図８）。
【００９４】
３つのｕｄｈ遺伝子のそれぞれを６Ｘ−Ｈｉｓタグ付の大腸菌に発現して精製し、対応する酵素の反応速度パラメータを決定した。精製した酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、モノマーの分子量を確認し、純度を推定した（図９）。P. syringaeおよびP. putidaのＵｄｈは両方とも約３０ＫＤａの分子量であり、クローニングされた遺伝子の翻訳および前の報告と一致する（３８）。A. tumefaciensのＵｄｈは少し大きく、３２ＫＤａである。
精製した調製物を、各酵素の反応速度パラメータｋｃａｔおよびＫｍの決定に用いた。グルクロン酸塩およびガラクツロン酸塩の両方を基質として用いて、ＮＡＤ＋補因子濃度を変えて、対応するＫｍを決定した（表５）。補因子濃度を変えることにより得たｋｃａｔの測定値は、グルクロン酸塩を基質として用いて得た値の２０％以内であった（データ示されず）。全てのケースにおいて、ｋｃａｔはグルクロン酸塩に対してガラクツロン酸塩に対するよりも高かった。最大の速度定数は、グルクロン酸塩を基質として用いた、A. tumefaciens酵素について見出され（ｋｃａｔ＝１．９×１０２ｓ−１）、これはPseudomonas酵素についての速度よりも２倍以上大きかった。しかし、ミカエリス（親和性）定数は全てのケースにおいて、ガラクツロン酸塩に対して低く、最少のＫｍは０．０４ｍＭで、これはガラクツロン酸塩を基質として用いた、P. syringae酵素について見出された。一次速度定数ｋｃａｔ／Ｋｍは、ガラクツロン酸塩を基質として用いた場合にもっとも高く、グルクロン酸塩とガラクツロン酸塩の間の最大の差はP. syringaeについて観察された。
【００９５】
酵素活性のｐＨおよび温度の変化に対する応答も検討した（図１０）。ｐＨ最適値の８．０は、A. tumefaciensおよびP. syringae酵素両方について観察されたが、活性はP. syringaeＵｄｈについて、ｐＨ〜７およびｐＨ〜８の間では比較的不変であった（図１０ａ）。このｐＨ挙動は、P. syringaeＵｄｈについての前の報告と一致する（３）。P. putida酵素は、ｐＨ〜７．０で最大活性を示した。一般に、酵素活性はｐＨ〜５とｐＨ〜８の間でおよそ１０％変化し、全３つの酵素についてｐＨ値が８を超えると、活性の顕著な低下が観察された。
【００９６】
温度の影響は２つの方法で評価した。最初に、温度安定性を、酵素調製物を種々の温度に３０分間暴露し、次に、酵素アッセイを標準条件下で行うことにより試験した。A. tumefaciensＵｄｈは、Pseudomonas酵素のどちらよりも顕著に高い熱的安定性を示すことが見出された（図１０ｂ）。活性は、A. tumefaciens調製物を３７℃に暴露後に最大値の８０％近くにとどまり、一方、他の２つの酵素についての対応する活性は、最大値の２０％を下回った。両方のPseudomonas酵素の安定性プロファイルは、互いに類似していた。最後に酵素活性を温度増加の下でアッセイを行って評価した。これらの活性は、温度が４〜４２℃の間で増加する場合の活性の増加の一般傾向に従い、これは、温度に対する触媒速度定数のアレニウス型依存性と整合する（図１０ｃ）。
これらの反応の産物の最終的な特徴づけのために、ボロン酸親和性ゲルを用いて、精製タンパク質を用いたin vitro反応における全３種の酵素から産生された推定グルカレートを単離した。３つの産物の試料を次に円偏光二色性（ＣＤ）分析して、化合物の立体化学を試験した。全３つのスペクトルはグルカレート標準と一致し、産物がグルカン酸であることの同定を、および、３つの遺伝子がウロン酸デヒドロゲナーゼをコードするものであることの同定を確認した（データ示されず）。
【００９７】
考察
ウロン酸デヒドロゲナーゼ（Ｕｄｈ）は、細菌でのアルドヘキサウロネート異化作用のための酸化経路の第１段階を触媒する。細菌においては、P. syringaeおよびA. tumefaciensのＵｄｈの限定された研究のみが報告されている。さらに、Ｕｄｈは真核生物では研究報告はさらに稀である。Ｕｄｈ配列はワイン用ブドウVitis viniferaにおいて報告されており、ここではガラクツロン酸レダクターゼとして同定されている（EC 1.1.1.203；BRENDAアクセッション番号Ａ１Ｙ２Ｚ０、GenBankアクセッション番号ＤＱ８４３６００）。我々はこの遺伝子を、大腸菌内での発現用に最適化されたコドンを用いて合成し（DNA 2.0, Menlo Park, CA）、組換えタンパク質を発現した。しかし、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のどちらかを補因子として用いた場合に、Ｕｄｈに関連する活性は観察されていない（データ示されず）。この配列と本研究において同定されたP. syringaeＵｄｈのアラインメントは、これらの間に１０％のみの同一性を明らかにした。我々は、V. vinifera酵素が大腸菌で機能的に発現されなかった可能性を除外できない；しかし、アラインメントに基づけば、V. viniferaからの報告された配列は、ウロン酸デヒドロゲナーゼではないか、または酵素の高度に発散したもの（divergent version）である。
【００９８】
P. syringaeのショットガンライブラリを大腸菌ΔｕｘａＣに導入して、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードするｕｄｈ遺伝子についてスクリーニングし、ＰＳＰＴＯ＿１０５３およびｉｏｌＢ遺伝子を、可能性のあるＵｄｈ候補として同定およびスクリーニングした。酵素分析により、ＰＳＰＴＯ＿１０５３は最終的にウロン酸デヒドロゲナーゼをコードするｕｄｈ遺伝子として同定された。グルクロン酸塩の異化作用のない大腸菌のｕｘａＣ欠失変異体において、グルクロン酸塩はウロン酸デヒドロゲナーゼによりグルカレートに変換され、次にピルベートまたは２−ホスホグリセラートに分解され、これから、グルクロン酸塩はエネルギー源として利用することができる（２７、３３）。大腸菌ΔｕｘａＣにおいて、ｉｏｌＢ遺伝子の導入により、グルクロン酸塩を単一の炭素源として含むＭ９寒天上での増殖が可能となるが、しかし、この遺伝子はＵｄｈ活性を持たなかった。ＩｏｌＢは前に、Bacillus subtilisおよびLactobacillus caseiでのミオイノシトール異化作用に関連するタンパク質として報告されている（４１、４２）。ＩｏｌＢは、Bacillus subtilisでのミオイノシトール分解に用いられるｉｏｌオペロンに所属し、５−デオキシ−グルクロネートを２−デオキシ−５−ケト−グルコネートに変換する（４２）。P. syringaeのＩｏｌＢは、B. subtilisのそれと約４８％の相同性を有する。我々のスクリーンにおける、ＩｏｌＢを含む細胞でのグルクロン酸塩消費の正確なメカニズムは明らかではない。おそらく、このタンパク質はグルクロン酸塩を、大腸菌代謝に適合する類似の化合物に変換することができるのであろう。
【００９９】
P. syringae、P. putidaおよびA. tumefaciensのゲノムにおけるｕｄｈ遺伝子座を図１１に示す。P. syringaeおよびP. putidaのゲノムのｕｄｈ遺伝子座は、それぞれおよそ１，１５０および１，３４６ｋｂｐにあり、一方A. tumefaciensのｕｄｈ遺伝子座は、およそ１５０ｋｂｐにある。A. tumefaciensにおいて、ｕｄｈに隣接する遺伝子、Ａｔｕ３１４０、３１４１、３１４２、および３１４５は、それぞれｋｄｇＤ、ｋｄｕＤ、ｋｄｕＩ、およびｋｄｇＦであり、これらはペクチン分解に関連する。ペクチンはヘテロポリサッカリドであり、α−１，４−結合Ｄ−ガラクツロネート残基からなり、これは植物細胞壁に由来する。細菌によるペクチン分解および取り込みは、Erwinia chrysanthemiおよびErwinia carotovoraを含む植物病原性ペクト細菌において、Hugouvieux-Cotte-Pattat et al.により研究されている（１２〜１４）。E. chrysanthemiにおいて、ペクチンはｋｄｕまたはｋｄｇオペロンの遺伝子により、エネルギー源として用いるために分解される。P. syringaeおよびP. putidaにおいて、ｕｄｈに隣接する遺伝子は、ＴＲＡＰ（三連ＡＴＰ独立ペリプラズム）ジカルボキシレートトランスポーターおよびポリンとして同定されている。これらの遺伝子のうち、ポリンタンパク質（ＰＳＰＴＯ＿１０５４、ＰＰ＿１１７３）は、ペクチン分解に由来するオリゴガラクツロン酸塩の取り込みに関連することが知られている（３４）。植物病原性細菌のウロン酸デヒドロゲナーゼはしたがって、宿主植物細胞壁ペクチンに由来し、次にヘキサレートに変換される、ヘキサウロネートの利用に役割を果たす可能性がある。
【０１００】
P. syringae、P. putidaおよびA. tumefaciensからの３つのウロン酸デヒドロゲナーゼのアラインメントおよびそれらの相同体の系統学的解析を行った（図１２）。酵素の配列は、２つの一次配列モチーフ、ＹｘｘｘＫおよびＧｘｘＧｘｘＧを示し、これらは保存ドメインに関連する（図１２ａ）。ＹｘｘｘＫモチーフは、P. syringaeＵｄｈのＴｙｒ１４５およびＬｓｙ１４９の間に位置し、これは３−α／βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼドメインの一次モチーフである（１１、３７）。P. syringaeＵｄｈのＧｌｙｒ１８−２４に位置するＧｘｘＧｘｘＧは、ロスマン折り畳みであるＧｘｘｘＧまたはＧｘ１−２ＧｘｘＧに類似し、これはＮＡＤ＋結合ドメインに発見された（２０）。系統学的解析において、ウロン酸デヒドロゲナーゼは、古細菌および、プロテオバクテリア、シアノバクテリア、緑色非硫黄細菌、およびグラム陽性菌を含む細菌の、ＮＡＤ依存エピメラーゼ／デヒドラターゼ、ヌクレオチド糖エピメラーゼ、３−βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ／イソメラーゼ、および短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼと相同性を示し、また真菌、植物およびヒトを含む数種の真核生物のヌクレオチド糖エピメラーゼと相同性を示す（図１２ｂ）。本研究でスクリーニングされた３つのウロン酸デヒドロゲナーゼは、アルファおよびガンマプロテオバクテリアに存在し、それらの相同体は、古細菌：Halorubrum lacusprofundiおよびNatronomonas pharaonis、および真菌：Aspergillus nigerに比較的近い。
【０１０１】
我々は、A. tumefaciens、P. putidaおよびP. syringaeからの３つのウロン酸デヒドロゲナーゼをスクリーニングおよび配列決定し、これらはグルクロン酸塩を、効率的にグルカレートに変換することができる。この酵素は、数種の細菌におけるウロン酸の異化作用に重要であるが、これはまた、グルカン酸などのアルダル酸産生の生合成経路の開発に有用であり得る。グルカレートはヌクレオチド糖代謝の最終産物であり、天然の哺乳動物および植物に見出される（２１、３９）。グルカレートおよびその誘導体、例えばグルカロ−１，４−ラクトンは以前に、解毒および天然の抗発がん性化合物として（８、２１、３６、３９）、またポリマー合成の構成要素として（１６）検討されてきた。これはまた、バイオマスから産生される潜在的な「高付加価値」化学物質とされている。現在、グルカレートは硝酸または酸化窒素などの強い酸化剤を用いた化学的酸化により、グルコースから合成される（２５）。我々は本研究で同定されたP. syringaeからのｕｄｈを用いて、大腸菌の合成経路からグルカン酸を成功して産生した（２６）。
【０１０２】
例２についての参考文献
【表８】
【０１０３】
【表９】
【０１０４】
【表１０】
【０１０５】
【表１１】
【０１０６】
表４：本研究で用いた株、プラスミド、およびプライマー
【表１２】
【０１０７】
【表１３】
【０１０８】
【表１４】
【０１０９】
【表１５】
【０１１０】
当業者は、ルーチンの実験以上のものを用いることなく、本明細書に記載の発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、または確認することができる。かかる等価物は、以下のクレームに包含することが意図される。
本明細書に開示された全ての参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもとに２００８年４月４日に出願された米国仮出願番号第61/042,502号、名称「グルカン酸の微生物による産生」の利益を主張し、これは本明細書にその全体が参照として組み込まれる。
【０００２】
政府の利益
この研究は、海軍研究事務所による助成金番号N000140510656から資金の一部を得た。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明分野
本発明は、グルクロン酸およびグルカン酸の組換え遺伝子発現による産生に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
組換えＤＮＡ技術の応用を包含する代謝工学は、組換えタンパク質産生、生産力増強のための経路エンジニアリング、および新しい産物生成のための新規な経路設計などの多くの目的に対して、細胞機能を最適化するその潜在能力を示している。宿主種に見出されない変換のシーケンスとして定義された新規な経路であって、１，３−プロパンジオール（C. E. Nakamura and G. M. Whited (2003). Curr. Opin. Biotechnol. 14: 454-459）、アモルファジエン（Nature Biotech, 21, pp796-802）、および１，２，４−ブタントリオール（JACS, 125, pp12998-12999）の産生のための前記経路が、大腸菌内に設計され構築されている。これらのアプローチにおいて、各段階は酵素の利用可能性に基づいて設計され、種々の生物から採用した酵素の活性が同定され、これらの酵素的段階を組み合わせて、新規な経路が大腸菌内に構築された。これらの例の背景にある基本的なアイディアは、酵素を含むタンパク質を交換可能な部品とみなすことであり、用語「合成生物学」がこの概念を説明するために用いられている（Nature 421, p118；Nature Chemical Biology, 3, pp521-525）。
【０００５】
Ｄグルカン酸は果物、野菜および哺乳動物に見出され、コレステロールの低下（Z. Walaszek, et al. (1996). Nutr. Res. 16: 673-681）および癌の化学療法（J. Singh and K. P. Gupta (2003). Biomed. Environ. Sci. 16: 9-16）について研究されている。最近の報告では（T. Werpy and G. Petersen (2004). “Top Value Added Chemicals From Biomass,” Vol. I, PNNL and NREL）、Ｄグルカン酸は「バイオマスからの高付加価値化学物質」として、また新しいナイロンおよび超分岐ポリエステルを生産するための有望な出発物質として同定された。４つのキラル炭素を有する高度に機能化された化合物であるＤグルカン酸は、現在、Ｄグルコースの化学的酸化により産生されているが、これは、硝酸を酸化剤として用いる、非選択的で高価なプロセスである（T. Werpy and G. Petersen (2004). “Top Value Added Chemicals From Biomass,” Vol. I, PNNL and NREL）。酵素を用いる新しい触媒プロセスは、より高い生産性および選択性を導く可能性がある。グルカン酸を産生するための生物学的アプローチは、哺乳動物に存在するＤグルクロン酸経路を真似ることにより作成可能であった。しかしこれは、Ｄグルコースから出発し１０以上の変換段階からなる、非効率的な経路である。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本明細書には、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする第１のｕｄｈ遺伝子のクローニングおよび特徴づけが記載される。さらに本明細書には、大腸菌などの細胞内での、Ｄグルクロン酸またはＤグルカン酸いずれかの産生のための、異なる生物からの「生物学的部分」を組み合わせることによる、新規な経路の構築が記載される。第１の酵素、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ（Ｉｎｏ１／ＭＩＰＳ）は、グルコースからグルコース−６−リン酸を中間体としてミオイノシトールを産生する（Dean-Johnson and Henry 1989）。第２の酵素、ミオイノシトールオキシゲナーゼ（ＭＩＯＸ）は、ミオイノシトールをグルクロン酸に変換する。これらの２つの酵素の大腸菌などの細胞内での共発現により、グルコースからグルクロン酸の産生が可能となる。ウロン酸デヒドロゲナーゼは、グルクロン酸をグルカン酸に変換することができる（Bateman, Kosuge et al. 1970；Wagner and Hollman 1976）。本明細書に記載するように、この第３の遺伝子とＩＮＯ１およびＭＩＯＸとの発現により、グルコースからのグルカン酸の産生が可能となる。驚くべきことには、ウロン酸デヒドロゲナーゼの組換え発現は、経路のフラックスを大幅に増加させて、多量のグルカン酸を得ることができるようにした。
【０００７】
本発明は、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現し、かつミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する細胞を提供する。いくつかの態様において、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は細菌遺伝子であり、例えばPseudomonas syringae遺伝子またはAgrobacterium tumefaciens遺伝子である。いくつかの態様において、ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子は哺乳動物遺伝子、例えばマウス遺伝子である。いくつかの態様において、細胞はまた、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する。いくつかの態様におけるミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、真菌遺伝子または酵母遺伝子、例えばSaccharomyces cerevisiae遺伝子であってよい。
【０００８】
上記した、組換え技術により酵素を発現する細胞は、原核細胞または真核細胞であることができる。いくつかの態様において、細胞は、例えば大腸菌細胞などの細菌細胞である。いくつかの態様において、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されている。いくつかの態様において、細胞は、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である。
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、プラスミドから発現されることができ、または細胞のゲノム内に統合することができる。いくつかの態様において、グルカン酸の産生は、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により、または細胞内でグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより、増加する。本発明は、いくつかの態様において、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする１または２以上の組換え核酸分子を含む、遺伝的に改変された微生物を含む。
【０００９】
本発明はまた、グルクロン酸およびグルカン酸を産生する方法であって、本発明に関連する細胞を培養してグルクロン酸またはグルカン酸を産生すること、およびグルクロン酸またはグルカン酸を細胞から回収することを含む、前記方法も提供する。いくつかの態様において、グルクロン酸またはグルカン酸を産生する方法は、細胞を遺伝子操作して、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼの少なくとも１つを組換え技術により発現するようにすること、該細胞の集団を培養すること、およびグルカン酸を産生するように遺伝的に改変された細胞集団から、グルカン酸を回収することを含む。
いくつかの態様において、細胞は、ミオイノシトールオキシゲナーゼを組換え技術により発現し、グルクロン酸を産生する。いくつかの態様において、細胞は、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼを組換え技術により発現し、グルクロン酸を産生する。いくつかの態様において、細胞は、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびウロン酸デヒドロゲナーゼを組換え技術により発現し、グルカン酸を産生する。いくつかの態様において、細胞は、ミオイノシトールオキシゲナーゼ、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼおよびウロン酸デヒドロゲナーゼを組換え技術により発現し、グルカン酸を産生する。
【００１０】
いくつかの態様において、組換え技術により発現されたウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、Pseudomonas syringae遺伝子またはAgrobacterium tumefaciens遺伝子などの細菌遺伝子である。いくつかの態様において、組換え技術により発現されたミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、マウス遺伝子などの哺乳動物遺伝子である。いくつかの態様において、組換え技術により発現されるミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、Saccharomyces cerevisiae遺伝子などの真菌遺伝子または酵母遺伝子である。いくつかの態様において、上記の、酵素を組換え技術により発現する細胞は、原核細胞である。ある態様において、細胞は、大腸菌細胞などの細菌細胞である。ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されていてもよい。
【００１１】
いくつかの態様において、上記の、酵素を組換え技術により発現する細胞は、真核細胞である。ある態様において、細胞は、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である。ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、プラスミド上に発現されるか、細胞のゲノム内に統合されている。グルカン酸の産生は、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により、または、細胞内でグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより、増加する。
本発明はまた、上記の細胞または方法により産生されるグルカン酸を提供する。いくつかの態様において、グルカン酸は細胞培養物により産生され、ここで細胞培養物中の細胞は、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼの少なくとも１つを組換え技術により発現するように遺伝子操作されている。いくつかの態様において、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、Pseudomonas syringae遺伝子またはAgrobacterium tumefaciens遺伝子などの細菌遺伝子である。いくつかの態様において、ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、マウス遺伝子などの哺乳動物遺伝子である。いくつかの態様において、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、Saccharomyces cerevisiae遺伝子などの真菌遺伝子または酵母遺伝子である。
【００１２】
いくつかの態様において、グルカン酸は原核細胞から産生される。いくつかの態様において、原核細胞は、大腸菌細胞などの細菌細胞である。ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、いくつかの態様において、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されている。グルカン酸はまた、真核細胞から産生されることもできる。ある態様において、細胞は、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である。
グルカン酸の産生のために、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、プラスミド上に発現されるか、または細胞のゲノム内に統合することができる。いくつかの態様において、グルカン酸の産生は、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により、または、細胞内のグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより、増加する。
【００１３】
本発明はまた、単離された核酸分子であって、次を含むものも包含する：（ａ）配列番号１、配列番号２３または配列番号２５を含む、単離された核酸分子；（ｂ）配列番号２、配列番号２４または配列番号２６の配列を含むアミノ酸配列をコードする、単離された核酸分子；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の全長配列の逆補体である、単離された核酸分子；および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかと少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有する、単離された核酸分子。本発明にさらに包含されるのは、上述の核酸分子を含有し、転写調節要素に操作可能に結合した、組換え発現ベクターである。本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子によりコードされた、単離されたウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドも含む。いくつかの態様において、単離されたウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、配列番号２、配列番号２４または配列番号２６と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する。
【００１４】
本発明は、本明細書に記載の組換え発現ベクターを含む細胞を包含する。ある態様において、細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞である。ウロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を組換え技術により発現する細胞を用いて、ポリペプチドの発現を許容する条件下で細胞を培養し、細胞培地または細胞からポリペプチドを回収することにより、ウロン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を産生することができる。
本発明はまた、本明細書に記載のウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドに選択的に結合する、単離された抗体も含む。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドに選択的に結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号１と少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有する核酸によりコードされるポリペプチドに結合する。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはこれらの抗原結合断片であることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、大腸菌でのグルカン酸の産生用に設計された経路を示す概略図である。ＰＴＳ＝ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系；Ｉｎｏ１（ＭＩＰＳ）＝Saccharomyces cerevisiaeからのミオイノシトール１−リン酸シンターゼ、ホスファターゼ＝ＳｕｈＢ、ＭＩＯＸ＝内因性大腸菌酵素（Matsuhisa et al. J. Bacteriol. (1995) 177:200-205）；ＭＩＯＸ＝コドン最適化を有するミオイノシトールオキシゲナーゼのマウス版；Ｕｄｈ＝Pseudomonas syringaeからのウロン酸デヒドロゲナーゼ；ＰＥＰ＝ホスホエノールピルベート。
【図２】図２は、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＲＳＦＤ−ＩＮ−ＭＩ）におけるグルクロン酸の産生を示すグラフである。培養物は、１０ｇ／Ｌのグルコースおよび０．１ｍＭのＩＰＴＧを補足したＬＢ培地中、３０℃でトリプリケートで増殖させた。データ点は、３つの生物学的複製の平均値および標準偏差である。Δ＝グルクロン酸（左軸）；□＝ミオイノシトール（左軸）；◇＝グルコース（右軸）。グルコース濃度の単位はｇ／Ｌ。
【００１６】
【図３】図３は、３つの遺伝子を含んでいるＢＬ２１（ＤＥ３）に発現された、組換えＩｎｏ１、ＭＩＯＸ、およびＵｄｈのin vitro活性を示すグラフである。培養物は、１０ｇ／Ｌのグルコースを補足し０．０５ｍＭのＩＰＴＧで誘発したＬＢ培地中３０℃で増殖させた。ＭＩＯＸ活性は、バックグラウンドを明らかにするために純活性として表す。データは３つの生物学的複製の平均値および標準偏差である。Δ＝Ｉｎｏ１；□＝ＭＩＯＸ；◇＝Ｕｄｈ。
【図４−１】図４−１は、マウスＭＩＯＸ遺伝子および、大腸菌での発現用にコドン最適化されたその合成版の、ＤＮＡ配列アラインメントである。ＤＮＡ配列アラインメントは、Vector NTIソフトウェア（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて行った。
【図４−２】図４−２は、マウスＭＩＯＸ遺伝子および、大腸菌での発現用にコドン最適化されたその合成版の、ＤＮＡ配列アラインメントである。ＤＮＡ配列アラインメントは、Vector NTIソフトウェア（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて行った。
【図５】図５は、細菌におけるグルクロン酸およびグルカン酸の異化を示す概略図である。グルクロン酸消費は、ｕｘａＣ遺伝子のノックアウトにより防止される。ｕｘａＣノックアウトでのウロン酸デヒドロゲナーゼの存在は、グルクロン酸での大腸菌の増殖を可能とする。
【００１７】
【図６】図６は、P. syringaeからの推定Ｕｄｈの酵素アッセイを示すグラフである。ＰＳＰＴＯ＿１０５３のＯＲＦの発現タンパク質を含む大腸菌溶解物は、ＮＡＤ＋を補因子として用いて、グルクロン酸を酸化することができる。
【図７】図７は、大腸菌の粗溶解物中の種々のソースからの、発現ｕｄｈ遺伝子の活性を示すグラフである。ｐＴＡＴｕｄｈ２＝Agrobacterium tumefaciens、ｐＴＰＰｕｄｈ＝Pseudomonas putida、ｐＴＰＳｕｄｈ＝Pseudomonas syringae。白棒グラフ＝ＩＰＴＧなし、黒棒グラフ＝０．１ｍＭのＩＰＴＧ含む。
【図８】図８は、グルカレートのＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。図８ａは、酵素反応混合物から分離されたグルカレートを示す。図８ｂは、グルカレート標準を示す。グルカレートはその質量（ｍ／ｚ＝２０９、２１０、４１９、４２０および４４１）を特徴とし、溶出液のピークもまた、グルカレート標準の質量に対応した。
【００１８】
【図９】図９は、精製ＵｄｈのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。精製されたＵｄｈを、変性条件下で１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル中の電気泳動にかけた。レーン１、分子量マーカー；レーン２および３、ｐＥＴＡＴｕを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の、粗抽出物および精製A. tumefaciensＵｄｈ；レーン４および５、ｐＥＴＰＰｕを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の、粗抽出物および精製P. putidaＵｄｈ；レーン６および７、ｐＥＴＰＳｕを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の、粗抽出物および精製P. syringaeＵｄｈ。精製Ｕｄｈは矢印で示す。
【図１０】図１０は、A. tumefaciens、P. putida、およびP. syringaeのｕｄｈからのＵｄｈの活性に対する、ｐＨおよび温度の影響を示すグラフである。図１０ａは、ｐＨの関数としての相対活性を示す。図１０ｂは、示した温度において３０分間インキュベーションした後の相対活性を示す。図１０ｃは、アッセイ温度の関数としての相対活性を示す。実線と四角印：A. tumefaciensＵｄｈ。破線と丸印：P. putidaＵｄｈ。点線と三角印：P. syringaeＵｄｈ。
【００１９】
【図１１Ａ−Ｃ】図１１は、染色体上でのｕｄｈ遺伝子座を示す模式図、および隣接する遺伝子を示す表である。図１１ａ：P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００；図１１ｂ：P. putidaＫＴ２４４０；および図１１ｃ：A. tumefaciens株Ｃ５８。
【図１１Ｄ】図１１は、染色体上でのｕｄｈ遺伝子座を示す模式図、および隣接する遺伝子を示す表である。図１１ｄは、隣接する遺伝子の同一性を示す表である。これらの遺伝子座および同一性は、ＮＣ＿００４５７８（P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００）、ＮＣ＿００２９４７（P. putidaＫＴ２４４０）およびＮＣ＿００３０６３（A. tumefaciens株Ｃ５８）のゲノム配列を参照した。
【図１２Ａ】図１２は、配列アラインメントおよび系統学的解析を示す。図１２ａは、P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００、P. putidaＫＴ２４４０およびA. tumefaciens株Ｃ５８からのウロン酸デヒドロゲナーゼのアラインメントを示す。アラインメントに対して、同一、保存、および類似のアミノ酸配列を、それぞれ黒色、濃灰色および薄い灰色のブロックで表す。一次配列モチーフは、ＧｘｘＧｘｘＧおよびＹｘｘｘＫとして示す。
【図１２Ｂ】図１２は、配列アラインメントおよび系統学的解析を示す。図１２ｂは、多種類の原核種および真核種からのウロン酸デヒドロゲナーゼ相同体の系統学的解析を示す。系統学的解析は、P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００のＰＳＰＴＯ＿１０５３の相同体を用いて行った。ウロン酸デヒドロゲナーゼは太字で示す。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明の側面は、細胞内での組換え遺伝子発現を介した、グルクロン酸およびグルカン酸の産生のための方法および組成物である。本明細書に記載されるのは、グルクロン酸をグルカン酸に変換する酵素であるウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のクローニングである。ウロン酸デヒドロゲナーゼをミオイノシトール１−リン酸シンターゼおよびミオイノシトールオキシゲナーゼと組み合わせて組換え発現することを介して、グルコースからグルクロン酸およびグルカン酸を発現するように設計および実装された、新規な経路が記載される。この新規な経路は、ナイロンおよびポリエステルの生産から癌治療までの広い範囲の用途を有する分子である、グルカン酸を産生するための、非常に効率的な新しい系である。
【００２１】
細胞内でのグルクロン酸およびグルカン酸の産生のために本明細書に記載された新規な経路には、いくつかの酵素成分が関与する。第１の酵素であるミオイノシトール１−リン酸シンターゼ（Ｉｎｏ１／ＭＩＰＳ）は、Saccharomyces cerevisiaeのＩＮＯ１遺伝子によりコードされ、グルコースからグルコース−６−リン酸を中間体としてミオイノシトールを産生する（Dean-Johnson and Henry 1989）。Saccharomyces cerevisiaeの配列は、例えば、GenBankアクセッション番号ＮＣ＿００１１４２（GeneID：８５３２８８）を有する。酵母において、ミオイノシトールは膜のリン脂質の成分であり、その誘導体は細胞のシグナリングに重要である。ＭＩＰＳ基質であるグルコース−６−リン酸は、ＰＴＸ系による糖輸送の結果として大腸菌内に存在する（Postma, Lengeler et al. 1993）。第２の酵素であるミオイノシトールオキシゲナーゼ（ＭＩＯＸ）は、ミオイノシトールをグルクロン酸に変換する。この酵素は主に哺乳動物ソースに存在し、ミオイノシトール異化作用の第１段階を表す（Charalampous and Lyras 1957）。例えばマウスの配列は、GenBankアクセッション番号ＮＣ＿００００８１（GeneID：５６７２７）を有する。これら２つの酵素の、大腸菌などの細胞における共発現は、グルコースからのグルクロン酸の産生を可能とする。
【００２２】
グルカン酸産生のための新規な経路における第３の段階は、グルクロン酸のグルカン酸への変換であり、これは、ウロン酸デヒドロゲナーゼが行うことができる（Bateman, Kosuge et al. 1970；Wagner and Hollman 1976）。例２に記載するように、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、この経路の構築のためにクローニングして特徴づけた。例２に示すように、ウロン酸デヒドロゲナーゼを、P. syringae pv. tomato株ＤＣ３００、P. putidaＫＴ２４４０およびA. tumefaciens株Ｃ５８からクローニングした。P. syringaeからのｕｄｈ遺伝子配列は、GenBankアクセッション番号ＥＵ３７７５３８として寄託されている。P. syringae pv. tomato株ＤＣ３００ＡのｕｄｈのＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、それぞれ配列番号１および２として提供される。A. tumefaciensおよびP. putidaからの対応する遺伝子は、それぞれアクセッション番号ＢＫ００６４６２（ＤＮＡ：配列番号２３；タンパク質：配列番号２４）およびＢＫ００６３８０（ＤＮＡ：配列番号２５；タンパク質：配列番号２６）として寄託されている。ウロン酸デヒドロゲナーゼのクローニングにより、種々の種におけるウロン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の同定を、例えばＢＬＡＳＴ探索などの、当分野に知られた標準の同一性探索方法を用いて行うことが可能である。
【００２３】
本明細書において、細胞でのミオイノシトール１−リン酸シンターゼとミオイノシトールオキシゲナーゼの共発現は、グルコースからのグルクロン酸の産生を導く。これらの酵素を発現する細胞がさらにウロン酸デヒドロゲナーゼを発現する場合、これは、グルコースからのグルクロン酸の、次の３段階からなる経路を介した予想外に効率的な産生をもたらす：１）グルコースからのミオイノシトールの産生、２）ミオイノシトールのグルクロン酸への変換、および３）グルクロン酸のグルカン酸への変換。本発明にさらに包含されるのは、上記の第１段階を回避した２段階経路である。この特定の態様において、グルコースを生成可能な細胞を用いて、細胞増殖培地に対する、グルコース供給の必要性を取り除く。いくつかの態様において、かかる細胞は、コーンスターチなどのグルコースポリマーと共に提供される。
【００２４】
本発明の側面は、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼ、およびウロン酸デヒドロゲナーゼの少なくとも１つを組換え技術により発現する細胞に関する。本発明は、原核細胞および真核細胞を含む、任意の種類の細胞を包含する。いくつかの態様において、細胞は、大腸菌などの細菌細胞である。他の態様において、細胞は真菌細胞または酵母細胞、例えばS. cerevisiae細胞である。他の態様において、細胞は、マウス細胞などの哺乳動物細胞である。いくつかの細胞は、本発明に関連する少なくとも１つの酵素を内因的に発現できることが理解される。いくつかの態様において、細胞は、どの酵素も内因的に発現しないが、１、２または３つの酵素を組換え技術により発現する。他の態様において、細胞は、酵素の１つを内因的に発現し、および他の１または２つの酵素を組換え技術により発現する。他の酵素において、細胞は、酵素の２つを内因的に発現し、および他の１または２の酵素を組換え技術により発現する。いくつかの態様において、細胞は１または２以上の遺伝子を内因的に発現し、および同じ１または２以上の遺伝子を組換え技術により発現する。
【００２５】
いくつかの態様において、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼ、およびウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、組換え発現ベクターで発現される。本明細書において「ベクター」とは、所望の１つの配列または複数の配列を、異なる遺伝環境の間での移動についての、または宿主細胞内での発現についての制限およびライゲーションにより挿入することができる、任意数の核酸であってよい。ベクターは典型的にはＤＮＡで構成されるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターとしては、限定するものではないが、以下を含む：プラスミド、ホスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、および人工染色体。
クローニングベクターは、自己複製可能であるか、または宿主細胞内に統合されているベクターであって、これはさらに１または２以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を特徴とし、該部位においては、ベクターを確定的な様式で切断することができ、またその中に所望のＤＮＡ配列をライゲーションして、新しい組換えベクターが、宿主細胞内で複製するその能力を保持するようにすることができる。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、宿主細菌内でのプラスミドのコピー数が増加するに従って多数回生じるか、または、有糸分裂によって宿主が複製する前に、宿主当たり１回のみ生じる。ファージの場合、複製は、溶菌相の間に能動的に生じてもよく、または溶原相の間に受動的に生じてもよい。
【００２６】
発現ベクターは、その中に調節配列に操作可能に連結されるように制限およびライゲーションによって所望のＤＮＡ配列を挿入でき、これをＲＮＡ転写物として発現できるベクターである。ベクターはさらに、ベクターにより形質転換あるいは形質移入されているか、またはされていない細胞の同定に用いるのに適した、１または２以上のマーカー配列を含んでもよい。マーカーとしては、例えば以下が挙げられる：抗生物質または他の化合物への抵抗性または感受性のどちらかを、増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当分野に知られた標準アッセイにより検出可能な酵素をコードする遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはアルカリホスファターゼ）、および形質転換または形質移入された細胞、宿主、コロニー、またはプラーク(溶菌斑)の表現型に目に見える影響を与える遺伝子（例えば緑色蛍光タンパク質）。好ましいベクターは、それが操作可能に結合するＤＮＡセグメント内に存在する構造遺伝子産物の、自己複製および発現が可能なものである。
【００２７】
本明細書において、コード配列および調節配列は、これらが、コード配列の発現または転写を調節配列の影響下または制御下に置くように共有結合する場合に、「操作可能に」結合するという。コード配列が機能タンパク質に翻訳されることが望ましい場合、２つのＤＮＡ配列は以下の場合に、操作可能に結合するという：プロモーターの５’調節配列への誘導が、コード配列の転写をもたらし、および、２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさず、（２）プロモーター領域のコード配列の転写を誘導する能力を妨害せず、または（３）対応するＲＮＡ転写物の、タンパク質に翻訳される能力を妨害しない場合。したがって、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写に対し、結果として得られた転写物が、所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳できるような影響を与えることが可能であれば、プロモーター領域はコード配列に操作可能に結合したとされる。
【００２８】
クレームに記載された発明の任意の酵素をコードする核酸分子が細胞内で発現される場合、種々の転写制御配列（例えば、プロモーター／エンハンサー配列）を用いて、その発現を誘導することができる。プロモーターは、在来のプロモーター、すなわち、その内因性の文脈における遺伝子のプロモーターであることができ、これは遺伝子発現の正常な調節を提供する。いくつかの態様において、プロモーターは構成的（constitutive）であることができ、すなわち、プロモーターは調節されず、関連する遺伝子の連続的転写を可能とする。種々の条件プロモーターも用いることができ、例えば、分子の有無により制御されるプロモーターなどである。
遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種または細胞型により異なり得るが、しかし一般的に、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関連する５’非転写配列および５’非翻訳配列を含み、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等である。特にかかる５’非転写調節配列は、操作可能に結合した遺伝子の転写制御用のプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列はまた、所望により、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列を含んでもよい。本発明のベクターは、任意に、５’リーダー配列またはシグナル配列を含んでもよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。
【００２９】
発現に必要な全要素を含む発現ベクターは市販されており、当業者に知られている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと。細胞は、異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）の細胞内に導入することにより、遺伝的に操作される。異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、転写要素の操作可能な制御のもとに置かれて、宿主細胞内での異種ＤＮＡの発現を許容する。グルカン酸の産生のための新規な経路の異種発現を、大腸菌を用いて、実施例の節で実証する。新規なグルカン酸産生経路は、他の細菌細胞、古細菌細胞、真菌、哺乳動物細胞、植物細胞等において発現させることもできる。
いくつかの態様において、本発明の２または３以上の核酸を、同一の発現ベクターまたはプラスミド内でクローニングすることができる。実施例の節に記載するように、いくつかの態様においては、ＩＮＯ１遺伝子およびＭＩＯＸ遺伝子を、同一のプラスミド内、例えばｐＲＳＦＤプラスミドにクローニングする。
【００３０】
グルカン酸産生のための任意の酵素をコードする、１つまたは複数の核酸分子を、１つまたは複数の細胞内に、当分野で標準の方法および技法を用いて導入することができる。例えば、核酸分子の導入を、化学的形質転換およびエレクトロポレーション、形質導入、粒子照射などを含む形質転換などの標準のプロトコルにより、実施することができる。グルカン酸産生のための酵素をコードする核酸分子（単数または複数）の発現はまた、核酸分子をゲノムに組み込むことによっても実現してよい。核酸分子（単数または複数）は、細胞のゲノムＤＮＡに、当分野に知られた標準技法を用いて組み込むことができる。
いくつかの態様において、本発明に関連する酵素は、細菌細胞内に組換え技術により発現される。本発明による細菌細胞は、任意の種類および組成の培地（富栄養または最少）中で培養可能である。例１は、グルコースを補足しＩＰＴＧで誘導した富栄養培地（ＬＢ培地、BD Biosciences; San Jose, CA）が最適であると見出された態様を示す。当業者が理解するように、ルーチンの最適化により、Ｍ９最少培地などの最少培地を含む、他の種類の培地の使用も許容される。選択された培地には、種々の追加要素を補足することができる。同様に、培地および増殖条件の他の側面も、ルーチンの実験を介して最適化してよい。例えば、ｐＨおよび温度は、最適化できる因子の非限定例である。本発明の側面により、細胞を増殖させるのに用いる液体培養物は、当分野で知られ用いられている、任意の培養容器中に収容することができる。
【００３１】
本発明の側面は、細胞からのグルカン酸産生を最適化するための戦略を含む。グルカン酸の最適化された産生とは、最適化戦略に従うことにより、かかる戦略なしで達成されるよりも多量のグルカン酸を産生することを意味する。１つの戦略は、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはウロン酸デヒドロゲナーゼの発現レベルを、適切なプロモーターおよびリボソーム結合部位の選択により、最適化することである。いくつかの態様において、これは、高いコピー数のプラスミドまたは低いもしくは中程度のコピー数のプラスミドを、選択および使用することを含んでよい。転写終了の段階もまた、ステムループなどの構造の導入または除去を介して、遺伝子発現の調節用に標的化することができる。
【００３２】
いくつかの態様において、グルカン酸の産生用に以前に最適化されている細胞を用いることが有利となりえる。例えば、グルカン酸の産生に先立ち、細胞内のグルカン酸代謝経路の１または２以上の成分を突然変異させることが最適であり得るが、これにより、細胞が産生される産物を消費しないためである。いくつかの態様において、グルカン酸産生の増強をもたらす突然変異のスクリーニングを、ランダム突然変異誘発スクリーンを通して、または既知の突然変異のスクリーニングを介して行ってもよい。いくつかの態様において、ゲノム断片のショットガンクローニングを用いて、グルカン酸産生の増加のためのこれら断片を有する細胞または生物をスクリーニングすることにより、グルカン酸産生の増加をもたらすゲノム領域を同定することができる。
タンパク質発現の最適化にはまた、いくつかの態様において、本発明に関連する酵素をコードする遺伝子を、細胞内への導入の前に、細菌細胞内での発現のためのコドン最適化を介するなどして、改変することが求められる。種々の生物に対するコドンの使用は、インターネットサイト「コドン使用データベース」において評価することができる。例えば本発明は、大腸菌での発現用にコドン最適化により合成された、マウスＭＩＯＸ遺伝子を包含する。
【００３３】
いくつかの態様において、タンパク質工学を用いて、本発明に関連する１または２以上の酵素の発現または活性を最適化することができる。ある態様において、タンパク質工学のアプローチは、酵素の３次元（３Ｄ）構造を決定すること、または、関連するタンパク質の構造に基づき、酵素のための３Ｄ相同性モデルを構築することを含むことができる。３Ｄモデルに基づき、酵素における突然変異を構築し、細胞または生物中に組み込み、これを次に、グルカン酸の産生の増加についてスクリーニングすることができる。いくつかの態様において、細胞でのグルカン酸産生は、本発明に関連する酵素と同じ経路で作用する酵素の操作を通して、増加することができる。例えば、いくつかの態様において、本発明に関連する１つの酵素の上流で作用する酵素または別の因子の発現を増加させることが、有益となりえる。これは、任意の標準法を用いて、上流因子を過剰発現させることにより、実現可能である。
【００３４】
本発明はしたがって、１つの側面において、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド、そのポリペプチドをコードする遺伝子、その機能性改変物および変異体、ならびにこれらに関連する使用に関する。本発明のウロン酸デヒドロゲナーゼ核酸の相同体および対立遺伝子は、従来技術により同定可能である。本発明にさらに包含されるのは、ストリンジェント条件下で本明細書に記載のウロン酸デヒドロゲナーゼ核酸にハイブリダイズする核酸である。本明細書において用語「ストリンジェント条件」とは、当分野に精通されたパラメータを指す。核酸ハイブリダイゼーションパラメータは、かかる方法をまとめた参考文献中に見出すことができ、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkなどである。より具体的には、本明細書において用語「ストリンジェント条件」とは、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％Ficoll、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）中で、６５℃でハイブリダイズすることを言う。ＳＳＣは、０．１５Ｍの塩化ナトリウム／０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である；ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウム；およびＥＤＴＡはエチレンジアミンテトラ酢酸である。ハイブリダイゼーション後、その上にＤＮＡを移した膜を、例えば２×ＳＳＣで室温にて洗浄し、次に０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで６８℃までの温度で洗浄する。
【００３５】
同程度のストリンジェンシーをもたらす、用いることのできる他の条件、試薬などもある。当業者はかかる条件に精通しており、したがってここでは述べない。しかし、本発明のウロン酸デヒドロゲナーゼ核酸の相同体および対立遺伝子の明確な同定を許容するような様式で、当業者は条件を操作可能であることが理解される（例えば、より低いストリンジェンシー条件を用いて）。当業者はまた、かかる分子の発現のための細胞およびライブラリをスクリーニングし、次にルーチンにより単離し、続いて適切な核酸分子の単離および配列決定する方法論にも精通している。
一般に、相同体および対立遺伝子は典型的には、ウロン酸デヒドロゲナーゼ核酸およびポリペプチドと、それぞれ少なくとも７５％の核酸同一性および／または少なくとも９０％のアミノ酸同一性を共有しており、いくつかの例においては、少なくとも９０％の核酸同一性および／または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を共有しており、さらに他の例においては、少なくとも９５％の核酸同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有している。相同性は、ＮＣＢＩのインターネットサイトから入手可能な、ＮＣＢＩ（Bethesda, Maryland）により開発された種々の公的に利用可能なソフトウェアツールを用いて計算することができる。例示のツールとしては、ＮＣＢＩのインターネットサイト（www.ncbi.nlm.nih.gov）から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェアが挙げられる。ペアワイズおよびClustalWアラインメント（BLOSUM30マトリクスセッティング）、およびKyte-Doolittleヒドロパシー分析も、Mac Vector配列解析ソフトウェア（Oxford Molecular Group）を用いて得ることができる。前述の核酸のワトソン・クリック補体もまた、本発明に包含される。
【００３６】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニングにおいて、当業者に知られた技法、例えばサザーンブロッティング、ノーザンブロッティングおよび提示された配列にハイブリダイズするプライマーを用いる、ポリメラーゼ連鎖反応などの増幅プロトコルなども、適用可能である。
本発明はまた、天然材料に存在するものに対する代替的コドンも含む、変性核酸も含む。例えば、セリン残基は、コドンＴＣＡ、ＡＧＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴおよびＡＧＣによりコードされる。６つのコドンの各々は、セリン残基をコードする目的に対して等価である。したがって、セリンをコードするヌクレオチドトリプレットの任意のものを、in vivoまたはin vitroでのタンパク質合成装置の誘導に用いて、セリン残基が延長されたウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド内に組み込み可能であることは、当業者には明白である。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットには、限定はしないが以下が含まれる：ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧおよびＣＣＴ（プロリンコドン）；ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧおよびＡＣＴ（スレオニンコドン）；ＡＡＣおよびＡＡＴ（アスパラギンコドン）；およびＡＴＡ、ＡＴＣおよびＡＴＴ（イソロイシンコドン）。他のアミノ酸残基も、複数のヌクレオチド配列により同様にしてコードすることができる。したがって、本発明は、遺伝子コードの変性のために、生物学的に単離された核酸とはコドン配列が異なる、変性核酸を包含する。本発明はまた、宿主細胞の最適なコドン使用に適するコドン最適化も包含する。
【００３７】
本発明はまた、１または２以上のヌクレオチドの付加、置換および欠失を含む、改変核酸分子も提供する。好ましい態様において、これらの改変核酸分子および／またはそれらがコードするポリペプチドは、非改変の核酸分子および／またはポリペプチドの少なくとも１つの活性または機能を保持し、それは例えば、ウロン酸デヒドロゲナーゼ酵素活性である。ある態様において、改変核酸分子は、改変ポリペプチドをコードし、好ましくは、本明細書の別のところに記載されたように、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。改変核酸分子は非改変核酸分子と構造的に関連しており、好ましい態様においては、非改変核酸分子と充分構造的に関連しているため、改変および非改変の核酸分子は、当業者に知られたストリンジェント条件下でハイブリダイズする。
【００３８】
例えば、１つのアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする、改変核酸分子を調製することができる。これらの核酸分子の各々は、本明細書に記載の遺伝コードの縮退に対応するヌクレオチド変化を除く、１、２または３個のヌクレオチド置換を有することができる。同様に、２つのアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする改変核酸分子を、例えば２〜６個のヌクレオチド変化を有して、調製可能である。これらのような多くの改変核酸分子を当業者は容易に思い描くことができ、これには例えば、アミノ酸２および３、２および４、２および５、２および６などをコードするコドンにおけるヌクレオチドの置換が含まれる。前述の例において、２つのアミノ酸の各組み合わせが改変核酸分子のセットに含まれ、アミノ酸置換をコードする全てのヌクレオチド置換も含まれる。追加の置換（すなわち、３または４以上）、付加、または欠失（例えば、停止コドンまたはスプライス部位（単数または複数）の導入）を有するポリペプチドをコードする、追加の核酸分子もまた調製可能であり、当業者により容易に思い描かれて本発明に包含される。任意の前述の核酸またはポリペプチドは、ルーチンの実験により、本明細書に開示の核酸および／またはポリペプチドとの構造的関連性または活性の保持について、試験することできる。
【００３９】
本発明はまた、前述のウロン酸デヒドロゲナーゼ核酸によりコードされる、単離ポリペプチドも提供する。かかるポリペプチドは、例えば、グルクロン酸をグルカン酸へとin vivoまたはin vitroで変換するために、それのみで、または融合タンパク質として、有用である。ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、組織または細胞ホモジェネートを含む生体サンプルから単離することができ、また種々の原核および真核発現系において、発現系に適切な発現ベクターを構築し、発現ベクターを発現系に導入し、組換え発現されたタンパク質を単離することにより、組換え技術によって発現することができる。ポリペプチドは、良好に確立されたペプチド合成法を用いて、化学的に合成することもできる。
【００４０】
本発明は、上述のウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの変異体を包含する。本明細書において、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの「変異体」とは、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの一次アミノ酸配列に１または２以上の改変を含む、ポリペプチドである。ウロン酸デヒドロゲナーゼ変異体を作り出す改変は、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドに対して、以下をもたらす：１）ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの活性を低下させるか取り除くこと；２）ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの特性、例えばグルクロン酸をグルカン酸に変換する能力、または発現系でのタンパク質安定性もしくはタンパク質−タンパク質結合の安定性などを増強すること；３）ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドに、抗原エピトープの付加または検出可能部分の付加などの、新規な活性または特性を提供すること；または４）ウロン酸デヒドロゲナーゼ分子と他の分子（例えば、酵素基質）との間に、等価またはさらに良好な結合を提供すること。ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドへの改変は、典型的には、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸に対してなされ、これには、欠失、点変異、切断、アミノ酸置換およびアミノ酸もしくは非アミノ酸部分の付加を含むことができる。代替的に、改変は、ポリペプチドに直接行うこともでき、例えば、開裂、リンカー分子の付加、検出可能部分の付加、例えばビオチン、脂肪酸の付加などである。改変はまた、ウロン酸デヒドロゲナーゼアミノ酸配列の全てまたは一部を含む、融合タンパク質をも包含する。当業者は、タンパク質配列における変化の、タンパク質コンフォメーションに対する効果を予測する方法に精通しており、こうして、変異体ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドを既知の方法に従って「設計」することができる。かかる方法の１つの例は、Dahiyat and MayoによりScience 278:82-87, 1997に記載されており、これによりタンパク質はde novoで設計可能である。方法は既知のタンパク質に適用して、ポリペプチド配列の一部のみを変化させることができる。Dahiyat and Mayoのコンピュータによる方法を適用して、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの特定の変異体を提示し試験することにより、変異体が所望のコンフォメーションを保持するかどうかを決定することができる。
【００４１】
一般に、変異体は、その望ましい生理学的活性に関連しないポリペプチドの性質を変えるように特別に改変された、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドを含む。例えば、システイン残基を置換または除去して、望ましくないジスルフィド結合を防ぐことができる。同様に、あるアミノ酸を変化させて、発現系におけるプロテアーゼによるタンパク質の加水分解を除去することにより、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの発現を増強することができる（例えば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母発現系での、二塩基性アミノ酸残基）。
ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸の突然変異は、コード配列のアミノ酸リーディング・フレームを保存するのが好ましく、変異体ポリペプチドの発現に有害となり得るヘアピンやループなどの二次構造を、ハイブリダイズにより形成し勝ちである核酸領域を作らないのが好ましい。
【００４２】
突然変異は、アミノ酸置換を選択することにより、またはポリペプチドをコードする核酸の選択部位のランダム変異導入法により起こすことができる。変異体ポリペプチドは、次に、どの突然変異が所望の特性を有する変異体ポリペプチドを提供するかを決定する、１または２以上の活性について発現および試験する。さらなる突然変異を、ポリペプチドのアミノ酸配列についてサイレントであるが、特定の宿主における翻訳に好ましいコドンを提供する変異体（または非変異ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド）に、起こすことができる。例えば、大腸菌などの核酸の翻訳に好ましいコドンは、当業者に知られている。さらに他の突然変異をウロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子またはｃＤＮＡクローンの非コード配列に起こして、ポリペプチドの発現を増強することができる。ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの変異体の活性は、変異体ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする遺伝子を細菌または哺乳動物の発現ベクター内にクローニングし、ベクターを適切な宿主細胞に導入し、変異体ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドを発現させ、および本明細書に記載のように、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの機能について試験することにより、試験することができる。
【００４３】
当業者はまた、保存的アミノ酸置換をウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドに作成して、前述のポリペプチドに機能的に等価な変異体を提供してもよく、すなわち、該変異体は、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの機能を保持していることを理解する。本明細書において、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的電荷またはサイズの特性を変化させない、アミノ酸置換を意味する。変異体は、当業者に知られたポリペプチド配列を変化させる方法、例えば、かかる方法をまとめた文献、Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkなどに従って調製することができる。ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの例示の機能的等価変異体としては、本明細書に開示されたタンパク質のアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換体を含む。アミノ酸の保存的置換としては、次の群のアミノ酸に作られた置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００４４】
一般に、変異体ポリペプチドを調製する場合、全アミノ酸よりも少ないアミノ酸が改変されることが好ましい。特定のアミノ酸残基が機能を付与することが知られている場合、かかるアミノ酸は置き換えないか、または保存的アミノ酸置換により置き換える。変異体ポリペプチドを調製する場合、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の残基を改変することができる。一般に、最少数の置換を作るのが望ましい。したがって、変異体ポリペプチドを生成する１つの方法は、他の全アミノ酸を特定の１つのアミノ酸で置換し、次に変異体の活性を検定し、次にこのプロセスを、最高の活性を有する１または２以上のポリペプチドを用いて繰り返すことである。
ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの機能的に等価な変異体を産生するための、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸の変化により作られる。かかる置換は、当業者に知られた種々の方法により作ることができる。例えば、アミノ酸置換は、ＰＣＲ定方向（PCR-directed）突然変異、Kunkelの方法（Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985）による部位特異的突然変異、またはウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする遺伝子の化学的合成により、作ることができる。
【００４５】
本明細書に記載の発明は、多くの使用を有し、そのいくつかは本明細書の別の部分に記載される。第１に、本発明はウロン酸デヒドロゲナーゼタンパク質分子の単離を可能とする。当業者によく知られた種々の方法論を用いて、単離されたウロン酸デヒドロゲナーゼ分子を得ることができる。ポリペプチドは、クロマトグラフィーの手段または免疫学的認識により、ポリペプチドを天然に産生する細胞から精製してもよい。代替的に、発現ベクターを細胞内に導入して、ポリペプチドの産生をもたらしてもよい。他の方法において、ｍＲＮＡ転写物を細胞内にマイクロインジェクションするか、他の方法で導入して、コードされたポリペプチドの産生をもたらしてもよい。網状赤血球溶解物系などの細胞を有さない抽出物中でのｍＲＮＡの翻訳もまた、ポリペプチドの産生に用いてよい。当業者はまた、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドを単離するための既知の方法に容易に従うことができる。これらには、限定はしないが、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫親和性クロマトグラフィーが含まれる。
【００４６】
本発明の分子の発現は、当業者に知られたルーチンの方法を用いて決定してよい。これらの方法としては、限定はしないが以下が挙げられる：直接ＲＮＡ増幅、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ｃＤＮＡの増幅、ハイブリダイゼーション、および免疫学に基づくアッセイ法であって、これには限定することなく、免疫組織化学法、抗体サンドイッチ捕捉アッセイ、ＥＬＩＳＡ、および酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥｌｉＳｐｏｔアッセイ）を含む。例えば、対象または組織において、本発明の核酸分子のレベルの存在の決定は、任意の標準核酸決定アッセイにより行うことができ、これには、ポリメラーゼ連鎖反応、または標識化ハイブリダイゼーションプローブによるアッセイを含む。かかるハイブリダイゼーション法としてはマイクロアッセイ技術を含むが、これに限定はしない。
【００４７】
本発明はまた、ウロン酸デヒドロゲナーゼ（Ｕｄｈ）に対する抗体も提供する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドに結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号１と少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有する核酸分子によりコードされるポリペプチドに結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２４と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドに結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２３と少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有する核酸分子によりコードされるポリペプチドに結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２６と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドに結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号２５と少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有する核酸分子によりコードされるポリペプチドに結合する。
【００４８】
本発明の抗体は、種々の方法の任意のものにより調製され、これには、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質を発現する細胞またはその断片などを動物に投与して、ポリクローナル抗体を誘発することを含む。本発明はまた、Ｕｄｈに対するモノクローナル抗体を産生する方法を提供する。モノクローナル抗体の産生は、当分野によく知られた技法に従って実施される。抗体分子の小さな部分であるパラトープのみが、抗体のそのエピトープへの結合に関与することは当分野でよく知られている（一般的に、Clark, W.R., 1986, The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York；Roitt, I., 1991, Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照）。例えばｐＦｃ’およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗体結合には関与しない。ｐＦｃ’領域がそれから酵素的に開裂された抗体、またはｐＦｃ’領域なしで産生された抗体は、Ｆ（ａｂ’）２断片と呼ばれ、これは無傷の抗体の両方の抗原結合部位を保持する。同様に、Ｆｃ領域がそれから酵素的に開裂された抗体、またはＦｃ領域なしで産生された抗体は、Ｆａｂ断片と呼ばれ、無傷の抗体分子の１つの抗原結合部位を保持する。Ｆａｂ断片は、共有結合された抗体の軽鎖と、Ｆｄと表される抗体重鎖の一部からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要な決定基であり（１つのＦｄ断片は、抗体の特異性を変更することなく、１０までの異なる軽鎖と関連することができる）、Ｆｄ断片は単離において、エピトープ結合能を保持する。
【００４９】
抗体の抗原結合部分内には、当分野でよく知られているように、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープの３次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般的には、Clark, 1986; Roitt, 1991を参照）。重鎖Ｆｄ断片とＩｇＧ免疫グロブリンの軽鎖の両方には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）によりそれぞれ分離されている４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、およびさらに特には重鎖ＣＤＲ３は、抗体の特異性に大きな役割を果たす。
【００５０】
現在当分野では、哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域は、もとの抗体のエピトープ特異性を保ちつつ、非特異的または異種特異的抗体の同様の領域で置き換え可能であることが確立されている。これは、「ヒト化」抗体の開発および使用においてもっとも明確に証明されており、ヒト化抗体では、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合して、機能的抗体を産生する。例えば、米国特許第4,816,567号、第5,225,539号、第5,585,089号、第5,693,762号、および第5,859,205号を参照のこと。完全なヒトモノクローナル抗体もまた、遺伝子導入マウスをヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大きな部分について免疫化することにより、調製可能である。これらのマウス（例えば、Ｘｅｎｏマウス（Abgenix）、ＨｕＭＡｂマウス（Medarex/GenPharm））の免疫化に続いて、モノクローナル抗体を標準のハイブリドーマ技法により調製可能である。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、したがってヒトに投与された場合に、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発しない。したがって、当業者に明らかであるように、本発明はまた、以下を提供する：Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦｄ断片；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同のヒトまたは非ヒト配列で置き換えられた、キメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同のヒトまたは非ヒト配列で置き換えられた、キメラＦ（ａｂ’）２断片抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同のヒトまたは非ヒト配列で置き換えられた、キメラＦａｂ断片抗体；およびＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が、相同のヒトまたは非ヒト配列で置き換えられた、キメラＦｄ断片抗体。本発明はまた、いわゆる単鎖抗体、ドメイン抗体および重鎖抗体も含む。
【００５１】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ、およびミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、種々のソースから得られることが理解されるべきである。本明細書の実施例の節で議論する態様において、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素は、Saccharomyces cerevisiae（ＩＮＯ１）からの遺伝子によりコードされ、ミオイノシトールオキシゲナーゼ酵素は、マウス遺伝子（ＭＩＯＸ）によりコードされ、ウロン酸デヒドロゲナーゼ酵素は、Pseudomonas syringae、Pseudomonas putida、またはAgrobacterium tumefaciens遺伝子（ｕｄｈ）によりコードされる。当業者に明らかなように、これら酵素の相同遺伝子は多くの種に存在しており、相同性探索により同定可能であり、例えば、ＮＣＢＩインターネットサイト（www.ncbi.nlm.nih.gov）で利用可能なタンパク質ＢＬＡＳＴ探索による。これらの酵素をコードする遺伝子は、所与の酵素を含む任意のソースからのＤＮＡから、当業者が理解するように例えば変性プライマーを用いて増幅可能である。いくつかの態様において、所与の酵素をコードする遺伝子は、合成物であることができる。本明細書に記載の酵素をコードする遺伝子を得るいかなる手段も、本発明の経路を構築するのに適合的である。
【００５２】
例
例１：グルカン酸産生：組換え大腸菌における生合成経路
大腸菌においてグルコースからグルクロン酸およびグルカン酸を産生するための合成経路が構築された（図１）。Saccharomyces cerevisiaeからのミオイノシトール１−リン酸シンターゼ（Ｉｎｏ１）およびマウスからのミオイノシトールオキシゲナーゼ（ＭＩＯＸ）をコードする遺伝子の共発現により、中間体ミオイノシトールを介したグルクロン酸の産生がもたらされる。０．３ｇ／Ｌまでのグルクロン酸濃度を培養ブロス内で測定した。ＭＩＯＸの活性は律速因子であり、ミオイノシトールおよび最終産物としてのグルクロン酸をほぼ同じ濃度で蓄積する。第３の酵素、Pseudomonas syringaeからのウロン酸デヒドロゲナーゼ（Ｕｄｈ）の含有により、グルクロン酸のグルカン酸への変換が促進された。この組換え酵素の活性は、Ｉｎｏ１およびＭＩＯＸのそれよりも２桁以上高く、経路を通る全フラックスを、グルカン酸濃度で１ｇ／Ｌを超えるものにと増加させた。これは、バイオマスからの「高付加価値化学物質」であるグルカン酸の生物学的産生のための、新規な微生物系を提示する。
【００５３】
材料および方法
株、増殖培地、およびプラスミド
大腸菌株ＤＨ１０Ｂ［F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 endA1 araΔ139Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL (StrR) nupG］を、全ての分子生物学的操作に用いた。ＤＨ１０ＢおよびＢＬ２１Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）［F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3)］を、有機酸産生の宿主として用いた。両株のコンピテント細胞を、Invitrogen Corporation（Carlsbad, CA）から購入した。培養物は、ＬＢまたはＭ９倍地のどちらかで増殖させた。ＬＢ（Miller）培地は、製造業者の指示に従って脱水パウダーから調製した（BD Biosciences, San Jose, CA）。Ｍ９は記載のようにして調製し（３２）、これは以下からなる：１×Ｍ９塩（１２．８ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４／７Ｈ２Ｏ、３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、および１０ｇ／Ｌ（１％）のグルコース。ロイシンを、最終濃度１０５μｇ／ｍＬでＤＨ１０Ｂに対して加えた。プラスミド維持のために選択的な圧力を提供することが望ましい場合には、カナマイシンを最終濃度２０μｇ／ｍＬで、およびアンピシリンを最終濃度１００μｇ／ｍＬで加えた。
【００５４】
全ての分子生物学的操作は、標準的技法に従って行った（３２）。ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ（Ｉｎｏ１、またＭＩＰＳとしても知られている）をコードするＩＮＯ１遺伝子を、Saccharomyces cerevisiaeのゲノムＤＮＡ調製物から、次のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：フォワードGAATTCATGACAGAAGATAATATTGCTC-3’（配列番号：３）；リバース5’-AAGCTTCTACAACAATCTCTCTTCG-3’（配列番号：４）。プライマーの５’末端に含まれるＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位には下線をつけた。ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードするマウスＭＩＯＸ遺伝子は、大腸菌での発現のためにコドン最適化と共にGenBankアクセッション番号ＡＦ１９７１２７に基づくＤＮＡ２．０（Menlo Park, CA）により合成した。８５８個のヌクレオチド（２８６コドン）配列の最適化はベンダーによって実施し、その結果の概要は以下である：１９．２％のヌクレオチドは変化され、２８６のコドン中１５３が影響を受けた（５３．５％）。最適化されたコドンのうち、１４４個（９４．１％）は第３ヌクレオチド位置のみで変化された。３つのコドンにおいては、全３つのヌクレオチドが変化された。合成遺伝子は、プラスミドｐＪ２−ＭＩＯＸとして受領された。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、それぞれ遺伝子の５’末端および３’末端に含まれた。マウスＭＩＯＸ遺伝子および大腸菌での発現用にコドン最適化されたその合成版の配列アラインメントは、図４に示す。両方の遺伝子は、発現された酵素の活性に適合するように、ＩＰＴＧ誘発性プラスミドｐＭＭＢ２０６（２５）およびｐＴｒｃ９９Ａ（２）内でサブクローニングされた。得られたプラスミドは、ｐＭＭＢ−ＩＮＯ１、ｐＴｒｃ−ＩＮＯ１、ｐＭＭＢ−ＭＩＯＸ、およびｐＴｒｃ−ＭＩＯＸと呼ばれた。両方の遺伝子の共発現のために、２つのＴ７プロモーターを含むNovagenからのｐＲＳＦＤｕｅｔ−１ベクターを用いた（Gibbstown, NJ）。ＩＮＯ１遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて第１位置にサブクローニングし、プラスミドｐＲＳＦＤ−ＩＮを産生した。ＭＩＯＸ遺伝子を第２位置に導入するために、ｐＪ２−ＭＩＯＸのＨｉｎｄＩＩＩ部位を、ＥｃｏＲＩでの消化の前に、クレノウ酵素を用いて末端充填した。ｐＲＳＦＤ−ＩＮを初めにＸｈｏＩで消化し、末端充填し、次にＭＩＯＸ遺伝子断片によるライゲーションの前に、ＥｃｏＲＩ適合性ＭｆｅＩで消化した。得られたプラスミドを、ｐＲＳＦＤ−ＩＮ−ＭＩと名付けた。Pseudomonas syringaeからのウロン酸デヒドロゲナーゼをコードするｕｄｈ遺伝子（GenBankアクセッション番号ＥＵ３７７５３８）の単離を、例２に示す。Pseudomonas syringaeからのｕｄｈ遺伝子を、ｐＴｒｃ９９Ａにサブクローニングして、ｐＴ１０５３（以下、ｐＴｒｃ−ｕｄｈと呼ぶ）を（４０）に記載のように産生した。
【００５５】
ＭＩＰＳ（ＩＮＯ１）、ＭＩＯＸ、およびＵＤＨ活性のための酵素アッセイ
ＩＮＯ１、ＭＩＯＸおよびｕｄｈ遺伝子の機能の発現を、酵素活性のin vitroアッセイにより確認した。粗溶解物（粗ライセート）を以下のようにして調製した：１〜２ｍＬ培養物からの細胞ペレットを、初めに、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含む１００〜２００μＬの１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁させた。細胞溶液を、液体窒素中での凍結と、３０〜４０℃の水での解凍を５サイクル繰り返すことにより、溶解させた。得られた溶液を１４，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離して、不溶解物を除去した。溶解物の総タンパク質濃度は、Bradford法（１１）を用いて決定した。
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ活性についてのアッセイは、前に記載のようにして行った（１、６）。簡単に述べると、グルコース−６−リン酸基質を、５０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ７．５）、０．８ｍＭのＮＡＤ＋、１４ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭのメルカプトエタノール、および５ｍＭのグルコース−６−リン酸からなる反応バッファー内で、ミオイノシトール１ホスファターゼに変換した。反応は、溶解物を加えることにより開始され、３７℃で１時間インキュベートした。反応は、０．４容積の２０％トリクロロ酢酸を加えて終了させた。産物の定量化のために、等量の０．２ＭのＮａＩＯ４を用いた酸化により、ミオイノシトール１−リン酸から無機リン酸塩を除去した。過剰の過ヨウ素酸塩を等量の１ＭのＮａ２ＳＯ３を加えて破壊した。コントロール反応は、グルコース−６−リン酸なしで、過ヨウ素酸塩の添加なしで行った。
【００５６】
ミオイノシトールオキシゲナーゼ活性についてのアッセイは、前に記載のようにして行った（４、３０、３１）。反応バッファーは、５０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭのＬ−システイン、１ｍＭのＦｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２および６０ｍＭのミオイノシトールからなった。試料は基質なしで３０℃で１０分間プレインキュベートして、ＭＩＯＸ酵素を活性化させた。反応物は３０℃で１時間インキュベートし、次に、１／１０容積の３０％トリクロロ酢酸を加えて終了させた。産生されたグルクロン酸をオルシノール試薬を用いて定量化した（１３）。試薬は、５．４ｍｇのＦｅＣｌ３を含有する１０ｍＬの濃縮ＨＣｌ中の、４０ｍｇのオルシノールからなった。１容量の試料を２容量のオルシノール試薬と混合し、沸騰水中で３０分間インキュベートした。室温に冷却後、６７０ｎｍでの吸収を測定して、グルクロン酸濃度を決定した。コントロール反応は、バックグラウンドを説明するためにミオイノシトールなしで確立した。
ウロン酸デヒドロゲナーゼ活性についてのアッセイは、前に記載のように（３５、４０）、３４０ｎｍでのＮＡＤＨ補因子生成をモニタリングすることにより行った。反応混合物は、１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭのグルクロン酸、０．９ｍＭのＮＡＤ+、および上述のようにして調製した細菌溶解物を含んだ。
【００５７】
酸の産生用の増殖条件
培養物は、１０ｇ／Ｌのグルコースを補足したＬＢ培地中で増殖させ、結果に示すようにＩＰＴＧで誘導した。接種物（inoculum）はＬＢ倍地中で調製し、１または２％（ｖ／ｖ）を用いて、５０または１００ｍＬの培地を含有する２５０ｍＬのバッフルフラスコへの接種を行った。培養物は３０℃で２５０ｒｐｍにてインキュベートし、培養倍地中の細胞密度および産物の濃度を決定するために定期的にサンプリングした。
【００５８】
有機酸の検出および定量
グルクロン酸およびグルカン酸を含む代謝物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量化した。グルカン酸アッセイには、試料は前述のようにして前処理し（２８、４０）、グルクロン酸を含む他の代謝物からグルカン酸を分離した。簡単に述べると、グルカン酸に存在する共平面隣接ｃｉｓ−ヒドロキシ基に親和性を有するボロン酸親和性ゲル（Affi-gel boronate gel, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）（２８）を試料と混合し、８０ｍＭのリン酸カリウム−２０ｍＭのホウ酸バッファー（ｐＨ７．０）で洗浄した。グルカン酸を０．１Ｍの塩酸で溶出した。溶出物を、１０ＭのＮａＯＨを加えて中性にし、つぎにＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析は、Aminex HPX-87Xカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）と屈折率およびダイオードアレイ検出器を備えたAglient 1100シリーズ装置により、次の条件下で行った：移動相、水中の５ｍＭの硫酸；流速、０．５ｍＬ／分；注入容量、５０μＬ；温度、５５℃；ＵＶ波長、２１０ｎｍ。
【００５９】
結果
組換えＩｎｏ１およびＭＩＯＸ活性の検証
Saccharomyces cerevisiaeからのミオイノシトール１−リン酸シンターゼ（Ｉｎｏ１）の、大腸菌発酵を介した高濃度のミオイノシトールの産生への使用は、前に報告されている（１５）。産物の２１ｇ/Ｌまでの力価が、高細胞密度の下で５４時間の補給バッチ（fed-batch）発酵で得られた。振とうフラスコ内でＩｎｏ１性能を確認するために、対応する遺伝子を増幅し、適合ベクター内に挿入し、つぎに高コピー数および中程度のコピー数プラスミドの両方に、共通の実験室株ＤＨ１０Ｂでの発現のためにサブクローニングした。プラスミドｐＴｒｃ−ＩＮＯ１は、数百のコピー数をもたらす改変ＣｏｌＥ１レプリコンを含み、一方、ｐＭＭＢ−ＩＮＯ１は、１０の桁のコピー数のＲＳＦ１０１０レプリコンに基づく。２つのプラスミドを評価して、ＩＮＯ１およびＭＩＯＸ遺伝子の、適合ベクターを用いた単一株内での共発現の可能性を探索した。３４４ｎｍｏｌ／時間／ｍｇおよび１２８ｎｍｏｌ／時間／ｍｇのin vitro活性がそれぞれ、ｐＴｒｃ−ＩＮＯ１およびｐＭＭＢ−ＩＮＯ１を含み、かつ３０℃でインキュベートした培養物に対して測定可能であり、酵素の発現の成功を示唆した（表１）。しかし、高コピー数プラスミドからの発現のみが、培養倍地中での測定可能な量、０．３７ｇ／Ｌのミオイノシトールの蓄積をもたらした。活性は温度の強い関数でもあり、３７℃で増殖した培養物には検出なしであった。ミオイノシトール産生を、Ｍ９最少培地でも試験した。最少培地中、グルコースのみを炭素源として増殖させると、グルコースフラックスが増加し、したがってミオイノシトール産生が増加すると考えられた。しかし、半分の量のミオイノシトールのみが産生され、このことは、グルコースフラックスは実際に高かったが、これらの条件下で発現されたＩｎｏ１酵素は解糖に対して基質と効率的に競合しないことを示唆した。次の実験を、グルコースを補足したＬＢ培地中で行った。
【００６０】
ＭＩＯＸは主に真核由来のタンパク質であり、ヒト、マウス、ラットおよび豚からの相同体が最もよく特徴づけられている（３、４、３０、３１）。ミオイノシトールオキシゲナーゼ（ＭＩＯＸ）は大腸菌内に機能的に発現され、酵素特性の特徴づけのために精製された；しかし、我々が知る限りでは、哺乳動物のＭＩＯＸは、全細胞の組換え系でグルクロン酸の産生のために用いられたことはない。酵素のマウス版は、大腸菌での発現で最も有利な特性を持つことが見出され（３）、研究に選択された。遺伝子の合成版は、大腸菌へのコドン最適化と共にＤＮＡ２．０から購入した。この遺伝子も、ＤＨ１０ＢでのＩｎｏ１活性の評価のために用いる高コピー数および低コピー数ベクターの両方にサブクローニングした。ＭＩＯＸ活性はまず３７℃で評価したが、これは、酵素が哺乳動物由来だからである。
【００６１】
ＭＩＯＸ酵素は、Ｆｅ２＋およびシステインをin vitroでの活性化のために必要とすることが知られている（４）。これら化合物の培養培地への添加は、in vitroアッセイで測定されるように、ｐＴｒｃ−ＭＩＯＸからの酵素の発現を改善せず、むしろ活性を低下させた（表２）。グルクロン酸はそれでも培養培地中で計測されたが、濃度は低かった。酵素活性の観察された低下は、細胞密度の顕著な低下と一致し、これら化合物の宿主に対する毒性を示唆した。前に報告されたように（３０、３１）、ＭＩＯＸ活性は高濃度のＦｅ２＋およびシステインにより阻害される。細胞外濃度はin vitroアッセイで酵素を活性化するレベルに設定したが、対応する細胞内濃度は未知であった。また、ミオイノシトールを培養培地に加えると、大腸菌でのＭＩＯＸの溶解性発現を改善した（３）。この挙動は本明細書でも観察され、ミオイノシトールの補足なしで発現された場合に、酵素活性の大幅な低下が示された（表２）。組換えＭＩＯＸの驚くべき性質の１つは、その見かけの不安定性である（３）。指数相の間に収集した試料では高い活性が観察されたが（播種の６時間後）、しかし定常相では大きく低下した（播種の２４時間後）（表２）。空のｐＴｒｃ９９Ａプラスミドを含有するコントロール試料で測定されたアッセイのバックグラウンド活性は、一般に時間と共に増加する。アッセイの高いバックグラウンドは、オリシノール試薬の非特異性によることを指摘する；該試薬は、低い程度ではあるが、他の生物学的化合物と反応することが知られている。そのため、アッセイは酵素活性の正確な定量化には信頼できない可能性がある。しかし、ミオイノシトール有りおよび無しの試料間、また初期および後期の時点でのミオイノシトール試料間で観察された差は充分に大きいため、これらの傾向は有意であると考えることができる。
【００６２】
in vitro酵素活性およびin vivoグルクロン酸産生のどちらも、低コピー数ｐＭＭＢ−ＭＩＯＸコンストラクトを含有する培養物中では観察されず、測定可能なＭＩＯＸ活性を実現するには、高い発現レベルが必要であることを示唆する。ＩＮＯ１は３０℃でのみ、活性に発現されるため、in vivo ＭＩＯＸ性能もこの温度において高コピー数プラスミドから評価した。グルクロン酸の適合量である０．４０ｇ／Ｌを、培養物中で２４時間後に産生し、力価は４８時間後に２倍の０．７８ｇ／Ｌとなった。
【００６３】
グルクロン酸の産生
グルコースからのグルクロン酸の産生には、ＩＮＯ１とＭＩＯＸ両方が、同じ株内で共発現することが必要である。適合プラスミドｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＭＭＢ２０６両方を、ｐＴｒｃ−ＩＮＯ１とｐＭＭＢ−ＭＩＯＸ、またはｐＭＭＢ−ＩＮＯ１とｐＴｒｃ−ＭＩＯＸを含有する２重に形質転換された株を産生に用いることができると予想して検討した。しかし結果は、培養倍地中のそれぞれ所望の産物の蓄積により決定される、合理的なin vivo活性は、高コピー数プラスミドからの両遺伝子の発現によってのみ実現可能であることを示した。この問題に取り組むため、両方の酵素を、それぞれがＴ７プロモーターの後ろにある複数クローニング部位の対を含む、高コピー数ｐＲＳＦＤｕｅｔベクターに導入した。酵素活性は前に記載のようにして確認し、発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（データ示されず）。この様式で、０．１ｍＭのＩＰＴＧ濃度が好ましいと決定された。宿主株は、ＤＨ１０ＢからＢＬ２１（ＤＥ３）に変えて、Ｔ７プロモーターからの発現を可能とした。我々は前に、ＤＨ１０Ｂがグルクロン酸を増殖のために消費できないことを観察した（データ示されず）。ＢＬ２１（ＤＥ３）はグルクロン酸を代謝可能である；しかし、その消費は、異化代謝産物抑制を受けるようであった（データ示されず）。したがって、過剰なグルコースでの株の培養は、所望産物の消費を防ぐ。
【００６４】
ｐＲＳＦＤ−ＩＮ−ＭＩを含むＢＬ２１（ＤＥ３）株は、〜２７０ｍｇ／Ｌのレベルでのみではあるが、グルコースからグルクロン酸を産生することができた（図２）。培養プロファイルによれば、グルクロン酸は中間体の検出なしに２４時間後に存在し、濃度は４日間で５０％増加した。しかし４８時間後に、多量のミオイノシトールが培養倍地中に現れた。ミオイノシトールは培地に蓄積され続けて、実験の終わりまでには、所望の最終産物であるグルクロン酸よりやや高い濃度で存在した。最終グルクロン酸濃度である０．２７ｇ／Ｌは、上記のＤＨ１０Ｂ（ｐＴｒｃ-ＭＩＯＸ）系でのミオイノシトールの直接変換で観察されたもの（０．７８ｇ／Ｌ）より低い。ミオイノシトールの蓄積は、ＭＩＯＸ活性が、高濃度のグルクロン酸の産生における律速因子であることを示唆する。in vitroアッセイにより、実験の経過を通して、Ｉｎｏ１活性がベクターのみの制御より顕著に高いこと、わずかなバックグラウンド活性が３日後に現れることを確認した（データ示されず）。対照的に、ＭＩＯＸ活性は１日後にバックグラウンドよりわずかに高いのみであり、その後バックグラウンドから識別不能となった。これは、ＭＩＯＸ活性が２４時間後に大きく低下することを示す、前に概説した結果と一致した（表２）。さらに、この系におけるＭＩＯＸの活性は、Ｉｎｏ１により産生されるミオイノシトールの濃度により制限されるようである。６０ｍＭ（１０．８ｇ／Ｌ）のミオイノシトールの細胞外補足は、細胞内濃度も高いことは意味しないので、Ｉｎｏ１活性から得られるミオイノシトールの細胞内濃度は、等価の濃度には足らないようであると考えるのは合理的である。
【００６５】
グルカン酸の産生
例２は、P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００からのウロン酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子の、クローニングおよび特徴づけを示す（４０）。ｕｄｈ遺伝子は、大腸菌で非常に良好に発現され、高い酵素活性をもたらすことが見出された。グルカン酸の産生のために、我々は、ｐＲＳＦＤ−ＩＮ−ＭＩに適合する、前に構築したｐＴｒｃ９９Ａのｕｄｈ遺伝子を含むベクターを用いた。両方のベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して、ＩＮＯ１、ＭＩＯＸ、およびｕｄｈを担持する大腸菌株を構築した。この株の生産性を、いくつかの異なる誘導条件下で測定した（表３）。最初の２つの遺伝子を含む系において前に観察されたのは０．２７ｇ／Ｌのみのグルクロン酸であったにもかかわらず、驚くべきことに、１ｇ／Ｌまでのグルカン酸が産生された。グルクロン酸に前に用いたものと同一の誘導条件下で（表３、条件Ａ）、０．７２ｇ／Ｌのグルカン酸が産生された。この系の特徴をさらに明らかにするために、粗溶解物中の酵素活性を、培養の各日に測定した（図３）。ｕｄｈ活性は最大であり、Ｉｎｏ１活性よりも２桁以上高く、ＭＩＯＸ活性よりも３桁以上高かった。Ｕｄｈの高い活性はしたがって、グルコースフラックスをグルカン酸経路を通って引き寄せ、グルカン酸の比較的高い力価をもたらす。これらの試料において、ＭＩＯＸ活性は前に観察されたのと同じく、時間とともに低下せず、しかし、活性の程度は非常に低いままである。さらに、ここでの最初のデータ点は１日後であり、これは、ＭＩＯＸ活性が指数増殖の間に観察された値から顕著に低下することが前に示された時期である（表２）。３日間の培養期間後にグルクロン酸は検出されず、一方、ミオイノシトールは蓄積されて、ＭＩＯＸが触媒する段階が律速的であることを確認した。
【００６６】
試験した３つの誘導条件により、０．７２〜１．１３ｇ／Ｌの範囲のグルカン酸濃度がもたらされた。一般により高い誘導レベル、すなわちより高いＩＰＴＧ濃度は、グルコースでのグルカン酸のより高い収率をもたらすが、しかし産物の濃度は低くなる（例えば表３の条件ＡとＢを比較のこと）。より高い誘導レベルはまた、低いグルコース消費と低い細胞密度をもたらし、３つの酵素の高い発現に関連する代謝負荷量を示唆する。しかし、低いグルコース消費速度の場合には、グルコースフラックスの高い断片が、グルカン酸産生対バイオマスに向けられる。我々はさらに、２５０ｍＬのバッフルフラスコ中の総培養容積が５０から１００ｍＬに倍増したことから生じる低いエアレーションが、グルカン酸力価を２分の１に低下させ、一方で増殖は影響を受けなかったことを観察した（データ示されず）。この力価の低下は、律速段階の酵素であるＭＩＯＸが、分子の酸素を共基質として用いるとの事実のためである（１２、３８）。最後に、グルカン酸の産生をＭ９最少培地中で試験した；しかし、ごく僅かのグルカン酸のみが産生された。
【００６７】
考察
本明細書に示されるのは、３つの異種のソース：S. cerevisiaeのＩＮＯ１、マウスのＭＩＯＸ、およびP. syringaeのＵｄｈからの酵素を用いた、グルカン酸産生のための生合成経路のアッセンブリーである。内因性のホスファターゼもまた、この経路に関与する。大腸菌のｓｕｈＢ遺伝子産物は、in vitroでイノシトール１リン酸活性を有することが示され、したがってこの内因性活性に対する合理的な候補である（２３）。この経路は熱力学的視点から魅力的であり、その理由は、グループ寄与理論により推定されるように（２１、２４）、また分子の酸素を究極の酸化剤と考えると、全３段階に対する標準の自由エネルギー変化（ΔＧ）が全て負だからである：グルコースからミオイノシトール段階に対して−１４．３Ｋｃａｌ／ｍｏｌ；ミオイノシトールからグルクロン酸段階に対して−８６．８Ｋｃａｌ／ｍｏｌ；グルクロン酸からグルカン酸段階に対して−５５．９Ｋｃａｌ／ｍｏｌ。しかし、Khosla and Keaslingが示したように（１８）、代謝工学は単に種々の酵素を採用するだけではない。これはまた、宿主生物への新しい経路の導入などの摂動がなされた場合の、代謝フラックスの全般的最適化も含む。プラスミドの維持およびプラスミドによりコードされる遺伝子の発現に関連する、代謝性負荷の問題は、この場合に特に興味深い（９、１０、１７）。我々の系において、検出可能量のグルクロン酸は、高コピー数プラスミドによってのみ、in vivoで産生された。過剰なグルコースを補足したＬＢ培地を増殖に用いているので、最初の基質であるグルコース−６−リン酸は中央代謝に対して律速的であってはならない。したがって、早くて頑強な解糖経路と競合し、グルコース−６−リン酸をグルクロン酸へと分流させるために、組換え遺伝子の高い発現レベルが必要となる。
【００６８】
Ｍ９培地中でごく少量のミオイノシトールのみが産生され、検出可能な量の有機酸は産生されなかったという結果は、グルコースがただ一つの炭素でエネルギー源である場合に、ほぼ全ての基質が内因性の細胞代謝に入ることを示す。この競合はまた、培地中のグルコース濃度が高い、プロセスの最初の２日間におけるグルコースでのグルカン酸の収率が、濃度が低い後の日におけるよりも一般に高くなる理由（データ示されず）を説明することができる。高いＭＩＯＸ活性を実現するためのミオイノシトールに対する必要条件は、Ｉｎｏ１酵素からの低い生産性が究極的には、Ｍ９倍地中での有機酸の形成に対する制限となり得ることを示唆する。代替的に、ＭＩＯＸは最少培地中では少量のみ発現され得る。Ｉｎｏ１を用いた前の研究では、代替的な化学的に規定された培地において、遺伝子発現のために高コピー数のプラスミドを用いた場合に、ミオイノシトールの高い産生レベルがもたらされたことは注目すべきである；しかし、これらの実験は大規模スケールで、数日間の補給バッチ発酵で行われた（１５）。グルコース補給開始前の初期バッチ期間の間（およそ１０時間）、ミオイノシトール濃度は１ｇ／Ｌ未満であった。したがって、補給バッチ条件下での培養が我々の系の産生を改善できる程度を探ることは価値あることである。
【００６９】
プラスミドのコピー数は、我々の合成系の性能に影響する発現レベルに関連する、ただ一つの因子ではない。表３に示すように、発現を増加させるために誘発物質の濃度を増加することにより、産物の濃度の低下がもたらされる。０．０５ｍＭより低いＩＰＴＧ濃度は、グルコース消費率および増殖率が代謝負荷量の低下により増強された場合にも、グルカン酸の産生を改善しなかった（データ示されず）。大腸菌の増殖は、３０℃よりも３７℃において活発であり、律速酵素ＭＩＯＸの活性は、３７℃においてより高いはずである。しかし、発酵は３０℃で行われ、その理由は、Ｉｎｏ１がこの低い温度においてのみ、機能的に発現されるからである。Ｕｄｈの通常でない温度不安定性の報告を考慮すると（７、３５）、３０℃より低い温度がその活性にはよいであろう；しかし我々は、３０℃でのＵｄｈ活性が、Ｉｎｏ１またはＭＩＯＸどちらかの活性よりも大幅に高いことを見出し（図３）、３０℃をＩｎｏ１の機能的発現を最大化する培養温度として選択した。
【００７０】
この系の産生への全体的な制限を考えると、経路内での中間体による潜在的阻害を試験すべきである。ブタ腎臓からのＭＩＯＸはin vitroでＤグルカン酸により阻害されたが、しかしＤグルクロン酸塩またはＤグルクロノラクトンによっては阻害されないことが報告された（３０、３１）。ＭＩＯＸ活性が定常期において、Ｄグルカン酸の不在においても大きく低下することを考慮すると（表２）、低いＭＩＯＸ活性は、中間体による阻害よりも、固有の不安定性のためである可能性が高い（３）。我々がｓｕｈＢ遺伝子または相同のホスファターゼを過剰発現させなかったこともまた、注目すべきである。しかし、培養産物の中にミオイノシトール−１−リン酸は検出されず、一方、ミオイノシトールは蓄積しなかった。したがって我々は、ホスファターゼ活性は経路を通るフラックスを制限しないと結論付けた。大腸菌もまたＤルグカレート異化作用経路を含む（１６）。実際、大腸菌が増殖のためにＤグルカレートを単一の炭素源として消費する能力を用いて、ウロン酸デヒドロゲナーゼ活性を同定するスクリーンを開発した（４０）。ＢＬ２１（ＤＥ３）もまた、Ｄグルクロン酸を代謝できる。しかし、両有機酸の消費は、カタボライト抑制（異化産物抑制）に付されるようであり、グルコースの存在下での望ましくない産物の損失を防いでいる（データ示されず）。したがってＤグルカン酸力価の理論的限界は、酸の毒性および各段階の反応速度論により決定されるようである。大腸菌の増殖およびグルコース消費はグルカ酸カリウム（カリウムグルカレート:potassium glucarate）およびグルクロン酸ナトリウムの、１０ｇ／Ｌまでの高濃度での添加によって影響されないことが観察された（データ示されず）；したがって、律速段階の反応速度論の改善に集中することによる、力価の改善の余地がある。この合成経路の、グルコースフラックスを増強するためのさらなる最適化には、異なるソースからより良好な酵素を採用すること、これらの酵素を操作すること、および競合経路を下方制御することが必要である。
【００７１】
表１．大腸菌にて高コピー数（ｐＴｒｃ）および中コピー数（ｐＭＭＢ）プラスミドから発現された組換えＩＮＯ１の活性。培養物は、１０ｇ／Ｌのグルコースおよび、０．１ｍＭのＩＰＴＧでｐＴｒｃ−ＩＮＯ１、または１．０ｍＭのＩＰＴＧでｐＭＭＢ−ＩＮＯ１を補足したＬＢ倍地中、３０℃にて増殖させた。in vitro活性は中間指数相で採取した試料の粗溶解物から決定し、in vivo活性は、培養倍地中４８時間後のミオイノシトール濃度として報告する。示したデータは、１つの実験からの代表値である。Ｎ／Ｄ＝不検出。
【表１】
【００７２】
表２．大腸菌にて高コピー数ｐＴｒｃ−ＭＩＯＸから種々の培養条件下で発現された、組換えＭＩＯＸの活性。培養物はＬＢ培地中３７℃で増殖させ、１．０ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。グルクロン酸は２４時において測定した。補足物：ＭＩ＝ミオイノシトール（６０ｍＭ、１０．８ｇ／Ｌ）、Ｆｅ＝Ｆｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２（１ｍＭ）、Ｃｙｓ＝Ｌ−システイン（２ｍＭ）。Ｎ／Ｄ＝不検出。Ｎ／Ａ＝測定せず。
【表２】
【００７３】
表３．ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＲＳＦＤ−ＩＮ−ＭＩ）（ｐＴｒｃ−ｕｄｈ）中で３日間培養後のグルカン酸の産生。培養物は、１０ｇ／Ｌのグルコースを補足したＬＢ培地中３７℃で増殖させ、ＩＰＴＧで誘導した。データは３つの独立した実験の平均値および標準偏差である。ＯＤ６００＝６００ｎｍにおける光学密度、Ｇｌｃ＝グルコース、ＭＩ＝ミオイノシトール、Ｃｕｒｏ＝グルクロン酸、Ｃａｒ＝グルカン酸、収率（％）＝１００×産生されたグルカン酸／消費されたグルコース（ｍｏｌ／ｍｏｌ）。条件Ａ＝０時に０．１ｍＭのＩＰＴＧ；条件Ｂ＝０時に０．０５ｍＭのＩＰＴＧ；条件Ｃ＝０時に０．０５ｍＭのＩＰＴＧおよび１７．５時に０．１ｍＭのＩＰＴＧ、Ｎ／Ｄ＝不検出。
【表３】
【００７４】
例１についての参考文献
【表４】
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
【００７７】
【表７】
【００７８】
例２：P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００およびAgrobacterium tumefaciens株Ｃ５８からのウロン酸デヒドロゲナーゼのクローニングおよび特徴づけ
ウロン酸デヒドロゲナーゼを、P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００、Pseudomonas putidaＫＴ２４４０、およびAgrobacterium tumefaciens株Ｃ５８からクローニングした。遺伝子は、グルクロン酸塩を単一の炭素原として消費することはできないが、グルカレートで増殖できる大腸菌変異体を用いた新規な相補性アッセイを用いることにより、同定した。P. syringaeのショットガンライブラリのスクリーニングを、変異体大腸菌内にて、グルクロン酸を含有する最少培地上で形質転換細胞を増殖することにより行った。生存したコロニーを、グルクロン酸をグルカン酸に変換できるウロン酸デヒドロゲナーゼについて評価した。この様式で、０．８Ｋｂのオープンリーディングフレームを同定し、続いてｕｄｈであることを確認した。相同の酵素を、配列決定ゲノムの類似性探索に基き、P. putidaおよびA. tumefaciensにおいて同定した。大腸菌で発現された３種の微生物の各々からの組換えタンパク質を精製して特徴づけた。全３種の酵素について、代謝回転数ｋｃａｔは、基質としてのグルクロン酸塩に対して、ガラクツロン酸塩に対するよりも高かった；しかし、ミカエリス定数Ｋｍはガラクツロン酸塩対して低かった。A. tumefaciens酵素は最大の速度定数を有することが見出され（グルクロン酸塩に対してｋｃａｔ＝１．９×１０２ｓ−１）、これは両方のPseudomonas酵素よりも２倍以上高かった。
【００７９】
緒言
細菌でのアルドヘキサウロネート（aldohexuronate）異化作用には、２つの異なる経路、すなわち異性化反応段階により開始される経路と、酸化段階により開始される経路とが関与すると報告されている。異性化反応経路において、アルドヘキサウロネート（グルクロン酸塩、ガラクツロン酸塩）がウロン酸イソメラーゼによりケトヘキサウロネートに異性化され、最終的にはピルベートと３−ホスホグリセルアルデヒドに分解される。異性化反応経路は前に細菌において起こることが報告されており、その細菌としては大腸菌（７）、Erwinia carotovora（１８）、Erwinia hrysanthemi（１５）、Areobacter aerogenes（９、２３）、およびSerratia marcescens（２８）が挙げられる。酸化経路においては、アルドヘキサウロネートは、ウロン酸デヒドロゲナーゼによりアルドヘキサレート（aldohexarate）に酸化され、さらにピルベートに異化される。（２、５、７、９、１８、１９、２４）。この経路の鍵となる酵素であるウロン酸デヒドロゲナーゼ（Ｕｄｈ）を、２種の植物病原性細菌であるPseudomonas syringaeおよびAgrobacterium tumefaciensにおいて検討した。これまで、Ｕｄｈの特性に関して限定された研究のみが文献に報告されており（３、６、３８、４３）、配列はまだ同定されていない。Ｕｄｈは、全分子量が約６０，０００のＮＡＤ結合酸化還元酵素として分類されている（EC 1.1.1.203）。これは、それぞれが約３０，０００の分子量の２つのサブユニットからなるホモダイマーである（３８）。Ｕｄｈは熱的に不安定で、可逆性酵素であり、最適なｐＨは約８．０である（３、６、３８）。
【００８０】
アルドヘキサウロネート異化のための異性化反応経路を有する大腸菌ＭＧ１６５５において、グルクロン酸塩はｅｘｕＴによりコードされたアルドヘキサウロネートトランスポーターにより輸送され、ｕｘａＣによりコードされるウロン酸イソメラーゼによりフルクツロン酸塩に変換される（２２、３０）。フルクツロン酸塩はエントナー・ドードロフ経路に移動されて、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホ−グルコネートを介してエネルギー源として利用される（７、２７、３１、３２）。したがって、ｕｘａＣが欠失した大腸菌ＭＧ１６５５は、グルクロン酸塩を炭素源として用いることができない。この同じ株において、グルカレートは、ｇｕｄＤによりコードされるＤ−グルカレートデヒドラターゼにより、５−ケト−４−デオキシ−Ｄ−グルカレートに変換され、ついでピルベートまたは２−ホスホグリセラートを介して解糖作用に移動される（２７、３３）。近年、多数の細菌ゲノム配列が公開され、これにはP. syringae pv. tomatoＤＣ３０００およびA. tumefaciens株Ｃ５８を含むＵｄｈのそれらも含まれる（４、１０）。P. syringaeのショットガンライブラリを構築して、Ｕｄｈをコードする遺伝子を同定した。Ｕｄｈのスクリーニングは、大腸菌ＭＧ１６５５ΔｕｘａＣにおいて行った。ウロン酸デヒドロゲナーゼはグルクロン酸塩をグルカレートに変換するため（図５）、グルクロン酸塩を単一の炭素源として含有する最少培地で増殖可能なP. syringaeのショットガンライブラリを含む大腸菌ΔｕｘａＣ株は、Ｕｄｈをコードする遺伝子を担持することができる。最初のＵｄｈがいったんP. syringaeから同定されれば、ＢＬＡＳＴ相同性探索により、他の細菌からのＵｄｈの同定を導くことができる。
【００８１】
材料および方法
細菌株、プラスミド、および増殖条件
本研究に用いた株、プラスミド、およびプライマー配列を表４に示す。培地および化学試薬はSigma（St. Louis, MO, USA）またはBD Biosciences（San Jose, CA, USA）から購入した。P. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００はゲノムライブラリのソースとして用い、これはMassachusetts General HospitalのFrederick Ausubel博士から寄贈されたものである。P. syringaeは５０μｇ／ｍＬのリファムピシンを加えたＬＢ（Luria-Bertani）培地中３０℃で増殖させた。Pseudomonas putidaＫＴ２４４０（ATCC 47054）はAmerican Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA, USA）から購入し、ＬＢ培地中３０℃で増殖させた。大腸菌株は２ＹＴ培地（１リットル当たり１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母抽出物、および１０ｇの塩化ナトリウム）中３７℃で増殖させた。必要に応じて、アンピシリンおよびカナマイシンをそれぞれ１００および２５μｇ／ｍＬで培地に加えた。大腸菌ＤＨ１０Ｂ（F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu) 7697 galU galK λ- rpsL nupG）を、ゲノムライブラリに対する宿主株として、およびスクリーニングする遺伝子（Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA）のサブクローニングのために用いた。大腸菌ＭＧ１６５５のΔｕｘａＣは、University of Wisconsin-Madisonの大腸菌ゲノムプロジェクトのF. R. Blattner博士より提供を受けた。Ｍ９最少寒天については、２２ｍＭのグルコース、グルクロン酸塩、またはグルカレートを炭素源として用いた。プラスミドベクターｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＴｒｃ９９ＳＥを、それぞれゲノムライブラリの構築のため、および候補遺伝子に対する発現ベクターとして用いた（表４）。プラスミドｐＴｒｃ９９ＳＥは、Gyeongsang National University, KoreaのSeon-Won Kim博士より寄贈された。pBluescript（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を一般クローニングベクターとして用いた。
【００８２】
P. syringaeゲノムライブラリのゲノムＤＮＡの調製、構築およびスクリーニング
ゲノムＤＮＡの調製および一般クローニングの手順は、Sambrook et al.（３５）に記載のようにして行った。A. tumefaciens株Ｃｒ５８のゲノムＤＮＡは、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号３３９７０Ｄ）から購入した。制限酵素およびＴ４リガーゼは、New England Biolabs（Beverly, MA, USA）より購入した。P. syringaeゲノムＤＮＡはＢｆｕＣＩで部分的に消化され、次に０．８％アガロースゲル上に負荷した。２〜６Ｋｂの断片をゲルから精製し、脱リン酸化されたＢａｍＨＩ末端でｐＴｒｃ９９Ａにライゲーションした。４℃で２日間のライゲーション後に、反応混合物を用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。成功した形質転換体クローンを収集し、寒天プレートからプールし、次に−８０℃で保管した。コロニープールから単離したプラスミドプールを用いて大腸菌ＭＧ１６５５ΔｕｘａＣを形質転換し、Ｕｄｈ活性についてスクリーニングした。形質転換株を、２２ｍＭのグルクロン酸塩を加えたＭ９最少寒天プレート上、３０℃で４日間培養した。プレートからの生存クローンを、それらのプラスミドの精製および配列決定によりスクリーニングした。配列決定結果を、GenBankアクセッション番号ＮＣ＿００４５７８（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）に報告されているP. syringae pv. tomato株ＤＣ３０００のゲノム配列と比較した。
【００８３】
ｕｄｈ遺伝子を含む発現プラスミドベクターの構築
ＰＣＲ増幅を、ＰｆｕターボＡＤを用いて、製造業者の記載（Stratagene, La Jolla, CA, USA）のようにして行った。３つの候補遺伝子、ｉｏｌＥ、ｉｏｌＢ、およびＰＳＰＴＯ＿１０５３を、それぞれ表４に挙げたプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶ消化pBluescriptIIに平滑末端ライゲーションし、ｐＢｉｏｌＥ、ｐＢｉｏｌＢ、ｐＢｉｏｌＥＢ、およびｐＢ１０５３を得て、これらはそれぞれ配列決定して、その同一性を確認した。ｉｏｌＥ、ｉｏｌＢ、およびｉｏｌＥＢは、それぞれＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩでの消化により開裂し、次に同じ酵素により消化されたｐＴｒｃ９９Ａにライゲーションして、それぞれｐＴｉｏｌＥ、ｐＴｉｏｌＢ、ｐＴｉｏｌＥＢを構築した。ｐＢ１０５３からのＰＳＰＴＯ＿１０５３は、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩでの消化により開裂し、次に同じ酵素により消化されたｐＴｒｃ９９Ａにライゲーションして、ｐＴ１０５３を得た。
A. tumefaciens、P. putida、およびP. syringaeのゲノムＤＮＡからの推定ｕｄｈ遺伝子を、それぞれプライマー対ＡＴｕｄｈ２−Ｆ／ＡＴｕｄｈ２−Ｒ、ＰＰｕｄｈ−Ｆ／ＰＰＴｕｄｈ−ＲおよびＰＳｕｄｈ−Ｆ／１０５３−Ｒを用いて増幅した（表４）。ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶで消化されたpBluescriptIIに平滑末端ライゲーションし、プラスミドｐＢＡＴｕｄｈ２、ｐＢＰＰｕｄｈ、およびｐＢＰＳｕｄｈを得た。プラスミドｐＴＡＴｕｄｈ２、ｐＴＰＰｕｄｈ、およびｐＴＰＳｕｄｈを構築するために、対応する遺伝子をそれぞれｐＢＡＴｕｄｈ２、ｐＢＰＰｕｄｈ、およびｐＢＰＳｕｄｈからのＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで切除し、ｐＴｒｃ９９ＳＥの同一部位に挿入した。
【００８４】
タンパク質精製および反応速度パラメータ
A. tumefaciens、P. putida、およびP. syringaeのゲノムＤＮＡからのｕｄｈ遺伝子を、表４に挙げたようにプライマーＡＴｕＥＱ−Ｆ／Ｒ、ＰＰｕＥＱ−Ｆ／Ｒ、およびＰＳｕＥＱ−Ｆ／Ｒを用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、６ＸＨｉｓ−Ｔａｇを含むｐＥＴ２１ｂの同じ部位に挿入して、それぞれｐＥＴＡＴｕ、ｐＥＴＰＰｕ、およびｐＥＴＰＳｕを構築した（表４）。これらのプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、これをタンパク質発現に用いた。組換え大腸菌ＢＬ２１株を、ＩＰＴＧ誘導後に３０℃、２５０ｒｐｍで６時間培養した。タンパク質精製は、ProBond（商標）精製システムを用いて、製造業者の記載に従って行った（Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）をSambrook et. al.の記載（３５）に従って行った。精製タンパク質の基質上での酵素活性は、室温で３４０ｎｍにおける初期のＮＡＤＨの生成をモニタリングすることにより、測定した。グルクロン酸塩およびガラクツロン酸塩の反応速度解析は、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の０〜１０ｍＭのグルクロン酸塩またはガラクツロン酸塩と１．２ｍＭのＮＡＤ＋を用いて行った。ＮＡＤ＋での反応速度解析は、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の０〜２ｍＭのＮＡＤ＋と１０ｍＭのグルクロン酸塩を用いて行った。一連の酵素分析を行って、初期の活性を出発基質濃度の関数として推定した。これらのデータを用いて、ミカエリス・メンテン反応速度モデルのパラメータｋｃａｔおよびＫｍを、非線形最小二乗回帰により適合させた。非線形最小二乗回帰分析は、ガウス−ニュートン法により、固有のMatlab（登録商標）関数nlinfitによる実行を介して行った。
【００８５】
Ｕｄｈによりグルクロン酸塩から産生されたグルカレート決定のためのＬＣ−ＭＳおよびＣＤ解析
Ｕｄｈによりグルクロン酸塩からグルカレートを産生するための反応混合物は、２０ｍＭのグルクロン酸塩、２１．６ｍＭのＮＡＤ＋、４０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．０、および上記のようにして調製した細菌溶解物からなる。酵素反応は、粗溶解物または精製タンパク質のどちらかを反応混合物に加え、室温で６０分間インキュベートし、ついで１Ｍの水酸化ナトリウム加えて停止することにより、実施した。グルカレートの共平面隣接ｃｉｓ−ヒドロキシル基に結合可能な、ボロン酸親和性ゲル（Affi-gelボロン酸ゲル、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）を充填したカラムを用いて、グルカレートを反応混合物から分離した。グルクロン酸塩はそのｔｒａｎｓ−ジオール基のためにこのゲルには結合できない。Affi-gelに反応混合物を負荷した後、カラムを８０ｍＭリン酸カリウム−２０ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ７．０）で洗浄し、次にグルカレートを０．１ＭのＨＣｌを添加して溶出した。溶出物を５ＭのＮａＯＨを加えて中性化し、ＬＣ−ＭＳにより、Aminex HPX-87Hカラム（３００×７．８ｍｍ、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA）および電子スプレーイオン化検出器を備えたAgilent 1100シリーズＬＣ／ＭＳＤ（Agilent Technologies, US）を用いて分析した。質量スペクトルを、陽イオンおよび陰イオン検出モードの両方で得た。図８に示すスペクトルは、陰イオン検出モードからのものである。０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸、ｐＨ２．０を移動相として、０．５ｍＬ／分の流速で室温にて用いた。
グルクロン酸塩から形成されたグルカレートの立体化学を、その円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを真正グルカレート標準のそれと比較することにより確認した。ＣＤは、Aviv Model 202ＣＤスペクトロメータ（Aviv Biomedical, Lakewood, NJ）で行った。反応混合物は、２０ｍＭのグルクロン酸、７ｍＭのＮＡＤ＋、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）、および上記のように調製した精製酵素を含む。グルカレートはグルクロン酸から、上記のようにボロン酸親和性ゲルを用いて分離した。
【００８６】
配列同定およびアラインメント解析を含むコンピュータによる解析
Biocyc（商標）（http://bicyc.org/）を用いて、関連する代謝経路および代謝物を同定した。P. syringae 、P. putida、およびA. tumefaciensのＤＮＡ配列をＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）より、それぞれアクセッション番号ＮＣ＿００４５７８、ＮＣ＿００２９４７、およびＮＣ＿００３０６３として得た。相同性および保存ドメイン探索は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて行った。配列の管理およびアラインメントは、Vector NTIソフトウェア（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて行った。アラインメントおよび系統学的解析は、Vector NTIのAlignXモジュールを用いて行った。
【００８７】
ｕｄｈ配列に対するGenBankアクセッション番号
P. syringaeからのｕｄｈ遺伝子配列を、GenBankにアクセッション番号ＥＵ３７７５３８（核酸配列は配列番号１；アミノ酸配列は配列番号２）として寄託した。A. tumefaciensおよびP. putidaからの対応する遺伝子を、それぞれアクセッション番号ＢＫ００６４６２（ＤＮＡ：配列番号２３；タンパク質：配列番号２４）およびＢＫ００６３８０（ＤＮＡ：配列番号２５；タンパク質：配列番号２６）として寄託した。
【００８８】
Ｕｄｈ活性の酵素分析
酵素分析用の細菌溶解物は、凍結融解法により調製した。ｕｄｈ遺伝子を含む大腸菌株は、０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシド）を含有するＬＢ倍地中一晩増殖させた。ペレットは１ｍｇ／ｍＬのリソザイム溶液中に再懸濁させ、氷上で３０分インキュベートした。懸濁物を液体窒素で凍結し、３７℃の水浴で融解した。このステップを５回繰り返した。細胞溶解物を１４，０００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心分離し、上清を酵素分析に用いた。グルクロン酸塩のＵｄｈ活性を、３４０ｎｍでのＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元）の生成をモニタリングすることにより測定した（３８）。反応混合物は、２．５ｍＭのグルクロン酸塩、０．９ｍＭのＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、および１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーからなる。反応は、溶解物を反応混合物に室温で加えることにより誘導し、モニタリングした。Ｕｄｈ活性用に最適なｐＨを決定するため、反応混合物のｐＨをＨＣｌまたはＮａＯＨ溶液を添加して６．５〜９．９に調節した。総タンパク質濃度はBradford法（Bradford (1976) Anal Biochem 72:248-54)）を用いて決定した。特異的活性は、総タンパク質１ミリグラム当たりの単位（１Ｕ＝生成した１μｍｏｌＮＡＤＨ／分）で表した。化学物質はSigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）から購入した。
【００８９】
結果
Pseudomonas syringaeからのｕｄｈ遺伝子のクローニング
P. syringaeのＵｄｈ活性に対応する遺伝子を同定するために確立されたスクリーンは、大腸菌ＭＧ１６５５の変異株を利用した。ｕｘａＣの欠失は、グルクロン酸塩での増殖を妨害し、一方でグルカレートを単一の炭素源として増殖する能力を保持する。Ｕｄｈはグルクロン酸塩のグルカレートへの変換を触媒するため（３、３８）、P. syringaeのゲノムライブラリからのｕｄｈ遺伝子を含む大腸菌ＭＧ１６５５ΔｕｘａＣクローンは、グルクロン酸塩を単一の炭素源として増殖するはずである。大腸菌ＤＨ１０ＢおよびｐＴｒｃ９９Ａを、それぞれ、P. syringaeのゲノムライブラリの最初の構築のための宿主株およびプラスミドベクターとして用いた。ライブラリプラスミドプールを大腸菌ＤＨ１０Ｂクローンプールから調製し、ΔｕｘａＣ株の形質転換に用いた。形質転換ΔｕｘａＣクローンを、グルクロン酸塩含有のＭ９最少寒天上、３０℃で４日間インキュベートした。
【００９０】
１０個の寒天プレートから、２８個のクローンをさらなるスクリーニングに選択し、これらの各々は２〜５ｋｂの挿入断片を含んだ。これらからサイズの異なる挿入物を有する８つのクローンを、P. syringaeのゲノム配列（GenBankアクセッション番号ＮＣ＿００４５７８）と比較するために配列決定した。これらのクローンのうち６つはｉｏｌＥ、ｉｏｌＢ、またはその両方を含み、１つのクローンは割り当てなしのＰＳＰＴＯ＿１０５３オープンリーディングフレームを含んでいた。最後のクローンは、ｉｏｌＥＢとＰＳＰＴＯ＿１０５３領域のキメラを含んでいた。ライブラリ断片からのオープンリーディングフレームをＰＣＲ増幅し、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａに挿入して、プラスミドｐＴｉｏｌＥ、ｐＴｉｏｌＢ、ｐＴｉｏｌＥＢ、およびｐＴ１０５３を産出した。これらのベクターを含むクローンを用いて、どの遺伝子がウロン酸デヒドロゲナーゼ活性に対応するかを決定した。候補遺伝子で形質転換された大腸菌ＭＧ１６５５、ΔｕｘａＣ誘導体、および４つのΔｕｘａＣクローンを、グルクロン酸塩を単一炭素源として含有するＭ９最少培地でインキュベートした。野生型、ΔｕｘａＣ（ｐＴｉｏｌＢ）、ΔｕｘａＣ（ｐＴｉｏｌＥＢ）、およびΔｕｘａＣ（ｐＴ１０５３）株はＭ９グルクロン酸寒天上で増殖し、一方ΔｕｘａＣ（ｐＴｒｃ９９Ａ）およびΔｕｘａＣ（ｐＴｉｏｌＥ）株は増殖しなかった。したがって、ｉｏｌＢおよびＰＳＰＴＯ＿１０５３が、グルクロン酸塩を単一炭素源とする増殖に役割を果たしたので、これらを候補ｕｄｈ遺伝子と同定した。
【００９１】
２つの候補遺伝子間をさらに識別するために、プラスミドｐＴｉｏｌＢおよびｐＴ１０５３を用いて、大腸菌ＤＨ１０Ｂを組換え遺伝子を発現するよう形質転換した。得られたクローンを、０．１ｍＭのＩＰＴＧを有するＬＢ培地で増殖させた。これら２つのクローンからの粗溶解物中のＵｄｈ活性の分析により、ｐＴ１０５３を含む株はｈＵｄｈ活性を示すが、ｐＴｉｏｌＢはそうではないことが示唆された（図６）。アッセイは、グルクロン酸塩を基質として用い、３４０ｎｍでのＮＡＤＨの産生をモニタリングした。その結果、８２８ｂｐのＰＳＰＴＯ＿１０５３遺伝子が、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードすると推定された。以下ではこの遺伝子をｕｄｈと呼び、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）にアクセッション番号ＥＵ３７７５３８（核酸配列は配列番号１；アミノ酸配列は配列番号２）として登録した。
【００９２】
P. putidaおよびA. tumefaciensからのｕｄｈ遺伝子のクローニングおよび同定
P. syringaeからのｕｄｈの翻訳タンパク質配列を、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）のＢＬＡＳＴＰを用いて解析し、推定相同体を同定した。A. tumefaciensのＵｄｈ活性は前に検討されている（５、６、４３）。A. tumefaciensのオープンリーディングフレームＡｔｕ３１４３の翻訳は、最大の配列同一性４７．８％を有し、相同体Ｕｄｈの候補と考えられた。他の候補となるオープンリーディングフレーム、Pseudomonas putidaＫＴ２４４０のＰＰ１１７１もまた、P. syringaeＵｄｈと、７５．６％の配列同一性という高い類似性を有することが見出された。Ａｔｕ３１４３およびＰＰ１１７１をそれぞれのゲノムからＰＣＲ増幅し、P. syringaeからのｕｄｈと共にプラスミドベクターｐＴｔｒｃ９９ＳＥに組み込んで、それぞれプラスミドｐＴＡＴｕｄｈ２、ｐＴＰＰｕｄｈ、およびｐＴＰＳｕｄｈを作り出し、発現組換えタンパク質の相対的活性を比較した。形質転換ＤＨ１０Ｂクローンは、０．１ｍＭのＩＰＴＧ有りまたは無しのＬＢで培養され、つぎに粗溶解物を調製して酵素分析を行った（図７）。これらのアッセイにより、P. syringaeで前に得られたものと同様に、A. tumefaciensおよびP. putidaの組換えタンパク質に対して、グルクロン酸塩が基質として存在する中でのＮＡＤ＋消費活性が確認された。A. tumefaciensおよびP. putidaからの２つのｕｄｈ遺伝子も、GenBankに、それぞれアクセッション番号ＢＫ００６４６２（ＤＮＡ：配列番号２３；タンパク質：配列番号２４）およびＢＫ００６３８０（ＤＮＡ：配列番号２５；タンパク質：配列番号２６）として寄託した。
【００９３】
組換えＵｄｈの精製および特徴づけ、および反応産物の分析
P. syringaeのｕｄｈ遺伝子を含む大腸菌粗溶解物を用いた酵素反応により、低い基質負荷について、反応速度がグルクロン酸塩濃度に比例している、グルクロン酸塩を基質として用いる活性の存在を確認した（データ示されず）。この活性は、ＮＡＤ＋も利用するが、補因子としてＮＡＤＰ＋は利用しない（データ示されず）。これらの結果は、基質が酸化されたことを示した。グルクロン酸塩の構造の検討により、２つの可能な酸化点が示唆される：アルコールのケトンへの変換、またはアルデヒドのカルボン酸への変換であり、後者の反応はグルカレートを産生する。これら２つの産物の違いは質量スペクトルからも明らかであり、前者は基質に対して−２の質量差であり、一方後者は＋１６の質量差が生じる。酵素反応の産物がグルカレートであることを確認するために、試料をＬＣ−ＭＳで分析した。酵素反応から分離された溶出物のスペクトルと、グルカレート標準のスペクトルは一致し、グルカレートがＵｄｈ反応の産物であることを示唆した（図８）。
【００９４】
３つのｕｄｈ遺伝子のそれぞれを６Ｘ−Ｈｉｓタグ付の大腸菌に発現して精製し、対応する酵素の反応速度パラメータを決定した。精製した酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、モノマーの分子量を確認し、純度を推定した（図９）。P. syringaeおよびP. putidaのＵｄｈは両方とも約３０ＫＤａの分子量であり、クローニングされた遺伝子の翻訳および前の報告と一致する（３８）。A. tumefaciensのＵｄｈは少し大きく、３２ＫＤａである。
精製した調製物を、各酵素の反応速度パラメータｋｃａｔおよびＫｍの決定に用いた。グルクロン酸塩およびガラクツロン酸塩の両方を基質として用いて、ＮＡＤ＋補因子濃度を変えて、対応するＫｍを決定した（表５）。補因子濃度を変えることにより得たｋｃａｔの測定値は、グルクロン酸塩を基質として用いて得た値の２０％以内であった（データ示されず）。全てのケースにおいて、ｋｃａｔはグルクロン酸塩に対してガラクツロン酸塩に対するよりも高かった。最大の速度定数は、グルクロン酸塩を基質として用いた、A. tumefaciens酵素について見出され（ｋｃａｔ＝１．９×１０２ｓ−１）、これはPseudomonas酵素についての速度よりも２倍以上大きかった。しかし、ミカエリス（親和性）定数は全てのケースにおいて、ガラクツロン酸塩に対して低く、最少のＫｍは０．０４ｍＭで、これはガラクツロン酸塩を基質として用いた、P. syringae酵素について見出された。一次速度定数ｋｃａｔ／Ｋｍは、ガラクツロン酸塩を基質として用いた場合にもっとも高く、グルクロン酸塩とガラクツロン酸塩の間の最大の差はP. syringaeについて観察された。
【００９５】
酵素活性のｐＨおよび温度の変化に対する応答も検討した（図１０）。ｐＨ最適値の８．０は、A. tumefaciensおよびP. syringae酵素両方について観察されたが、活性はP. syringaeＵｄｈについて、ｐＨ〜７およびｐＨ〜８の間では比較的不変であった（図１０ａ）。このｐＨ挙動は、P. syringaeＵｄｈについての前の報告と一致する（３）。P. putida酵素は、ｐＨ〜７．０で最大活性を示した。一般に、酵素活性はｐＨ〜５とｐＨ〜８の間でおよそ１０％変化し、全３つの酵素についてｐＨ値が８を超えると、活性の顕著な低下が観察された。
【００９６】
温度の影響は２つの方法で評価した。最初に、温度安定性を、酵素調製物を種々の温度に３０分間暴露し、次に、酵素アッセイを標準条件下で行うことにより試験した。A. tumefaciensＵｄｈは、Pseudomonas酵素のどちらよりも顕著に高い熱的安定性を示すことが見出された（図１０ｂ）。活性は、A. tumefaciens調製物を３７℃に暴露後に最大値の８０％近くにとどまり、一方、他の２つの酵素についての対応する活性は、最大値の２０％を下回った。両方のPseudomonas酵素の安定性プロファイルは、互いに類似していた。最後に酵素活性を温度増加の下でアッセイを行って評価した。これらの活性は、温度が４〜４２℃の間で増加する場合の活性の増加の一般傾向に従い、これは、温度に対する触媒速度定数のアレニウス型依存性と整合する（図１０ｃ）。
これらの反応の産物の最終的な特徴づけのために、ボロン酸親和性ゲルを用いて、精製タンパク質を用いたin vitro反応における全３種の酵素から産生された推定グルカレートを単離した。３つの産物の試料を次に円偏光二色性（ＣＤ）分析して、化合物の立体化学を試験した。全３つのスペクトルはグルカレート標準と一致し、産物がグルカン酸であることの同定を、および、３つの遺伝子がウロン酸デヒドロゲナーゼをコードするものであることの同定を確認した（データ示されず）。
【００９７】
考察
ウロン酸デヒドロゲナーゼ（Ｕｄｈ）は、細菌でのアルドヘキサウロネート異化作用のための酸化経路の第１段階を触媒する。細菌においては、P. syringaeおよびA. tumefaciensのＵｄｈの限定された研究のみが報告されている。さらに、Ｕｄｈは真核生物では研究報告はさらに稀である。Ｕｄｈ配列はワイン用ブドウVitis viniferaにおいて報告されており、ここではガラクツロン酸レダクターゼとして同定されている（EC 1.1.1.203；BRENDAアクセッション番号Ａ１Ｙ２Ｚ０、GenBankアクセッション番号ＤＱ８４３６００）。我々はこの遺伝子を、大腸菌内での発現用に最適化されたコドンを用いて合成し（DNA 2.0, Menlo Park, CA）、組換えタンパク質を発現した。しかし、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のどちらかを補因子として用いた場合に、Ｕｄｈに関連する活性は観察されていない（データ示されず）。この配列と本研究において同定されたP. syringaeＵｄｈのアラインメントは、これらの間に１０％のみの同一性を明らかにした。我々は、V. vinifera酵素が大腸菌で機能的に発現されなかった可能性を除外できない；しかし、アラインメントに基づけば、V. viniferaからの報告された配列は、ウロン酸デヒドロゲナーゼではないか、または酵素の高度に発散したもの（divergent version）である。
【００９８】
P. syringaeのショットガンライブラリを大腸菌ΔｕｘａＣに導入して、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードするｕｄｈ遺伝子についてスクリーニングし、ＰＳＰＴＯ＿１０５３およびｉｏｌＢ遺伝子を、可能性のあるＵｄｈ候補として同定およびスクリーニングした。酵素分析により、ＰＳＰＴＯ＿１０５３は最終的にウロン酸デヒドロゲナーゼをコードするｕｄｈ遺伝子として同定された。グルクロン酸塩の異化作用のない大腸菌のｕｘａＣ欠失変異体において、グルクロン酸塩はウロン酸デヒドロゲナーゼによりグルカレートに変換され、次にピルベートまたは２−ホスホグリセラートに分解され、これから、グルクロン酸塩はエネルギー源として利用することができる（２７、３３）。大腸菌ΔｕｘａＣにおいて、ｉｏｌＢ遺伝子の導入により、グルクロン酸塩を単一の炭素源として含むＭ９寒天上での増殖が可能となるが、しかし、この遺伝子はＵｄｈ活性を持たなかった。ＩｏｌＢは前に、Bacillus subtilisおよびLactobacillus caseiでのミオイノシトール異化作用に関連するタンパク質として報告されている（４１、４２）。ＩｏｌＢは、Bacillus subtilisでのミオイノシトール分解に用いられるｉｏｌオペロンに所属し、５−デオキシ−グルクロネートを２−デオキシ−５−ケト−グルコネートに変換する（４２）。P. syringaeのＩｏｌＢは、B. subtilisのそれと約４８％の相同性を有する。我々のスクリーンにおける、ＩｏｌＢを含む細胞でのグルクロン酸塩消費の正確なメカニズムは明らかではない。おそらく、このタンパク質はグルクロン酸塩を、大腸菌代謝に適合する類似の化合物に変換することができるのであろう。
【００９９】
P. syringae、P. putidaおよびA. tumefaciensのゲノムにおけるｕｄｈ遺伝子座を図１１に示す。P. syringaeおよびP. putidaのゲノムのｕｄｈ遺伝子座は、それぞれおよそ１，１５０および１，３４６ｋｂｐにあり、一方A. tumefaciensのｕｄｈ遺伝子座は、およそ１５０ｋｂｐにある。A. tumefaciensにおいて、ｕｄｈに隣接する遺伝子、Ａｔｕ３１４０、３１４１、３１４２、および３１４５は、それぞれｋｄｇＤ、ｋｄｕＤ、ｋｄｕＩ、およびｋｄｇＦであり、これらはペクチン分解に関連する。ペクチンはヘテロポリサッカリドであり、α−１，４−結合Ｄ−ガラクツロネート残基からなり、これは植物細胞壁に由来する。細菌によるペクチン分解および取り込みは、Erwinia chrysanthemiおよびErwinia carotovoraを含む植物病原性ペクト細菌において、Hugouvieux-Cotte-Pattat et al.により研究されている（１２〜１４）。E. chrysanthemiにおいて、ペクチンはｋｄｕまたはｋｄｇオペロンの遺伝子により、エネルギー源として用いるために分解される。P. syringaeおよびP. putidaにおいて、ｕｄｈに隣接する遺伝子は、ＴＲＡＰ（三連ＡＴＰ独立ペリプラズム）ジカルボキシレートトランスポーターおよびポリンとして同定されている。これらの遺伝子のうち、ポリンタンパク質（ＰＳＰＴＯ＿１０５４、ＰＰ＿１１７３）は、ペクチン分解に由来するオリゴガラクツロン酸塩の取り込みに関連することが知られている（３４）。植物病原性細菌のウロン酸デヒドロゲナーゼはしたがって、宿主植物細胞壁ペクチンに由来し、次にヘキサレートに変換される、ヘキサウロネートの利用に役割を果たす可能性がある。
【０１００】
P. syringae、P. putidaおよびA. tumefaciensからの３つのウロン酸デヒドロゲナーゼのアラインメントおよびそれらの相同体の系統学的解析を行った（図１２）。酵素の配列は、２つの一次配列モチーフ、ＹｘｘｘＫおよびＧｘｘＧｘｘＧを示し、これらは保存ドメインに関連する（図１２ａ）。ＹｘｘｘＫモチーフは、P. syringaeＵｄｈのＴｙｒ１４５およびＬｓｙ１４９の間に位置し、これは３−α／βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼドメインの一次モチーフである（１１、３７）。P. syringaeＵｄｈのＧｌｙｒ１８−２４に位置するＧｘｘＧｘｘＧは、ロスマン折り畳みであるＧｘｘｘＧまたはＧｘ１−２ＧｘｘＧに類似し、これはＮＡＤ＋結合ドメインに発見された（２０）。系統学的解析において、ウロン酸デヒドロゲナーゼは、古細菌および、プロテオバクテリア、シアノバクテリア、緑色非硫黄細菌、およびグラム陽性菌を含む細菌の、ＮＡＤ依存エピメラーゼ／デヒドラターゼ、ヌクレオチド糖エピメラーゼ、３−βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ／イソメラーゼ、および短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼと相同性を示し、また真菌、植物およびヒトを含む数種の真核生物のヌクレオチド糖エピメラーゼと相同性を示す（図１２ｂ）。本研究でスクリーニングされた３つのウロン酸デヒドロゲナーゼは、アルファおよびガンマプロテオバクテリアに存在し、それらの相同体は、古細菌：Halorubrum lacusprofundiおよびNatronomonas pharaonis、および真菌：Aspergillus nigerに比較的近い。
【０１０１】
我々は、A. tumefaciens、P. putidaおよびP. syringaeからの３つのウロン酸デヒドロゲナーゼをスクリーニングおよび配列決定し、これらはグルクロン酸塩を、効率的にグルカレートに変換することができる。この酵素は、数種の細菌におけるウロン酸の異化作用に重要であるが、これはまた、グルカン酸などのアルダル酸産生の生合成経路の開発に有用であり得る。グルカレートはヌクレオチド糖代謝の最終産物であり、天然の哺乳動物および植物に見出される（２１、３９）。グルカレートおよびその誘導体、例えばグルカロ−１，４−ラクトンは以前に、解毒および天然の抗発がん性化合物として（８、２１、３６、３９）、またポリマー合成の構成要素として（１６）検討されてきた。これはまた、バイオマスから産生される潜在的な「高付加価値」化学物質とされている。現在、グルカレートは硝酸または酸化窒素などの強い酸化剤を用いた化学的酸化により、グルコースから合成される（２５）。我々は本研究で同定されたP. syringaeからのｕｄｈを用いて、大腸菌の合成経路からグルカン酸を成功して産生した（２６）。
【０１０２】
例２についての参考文献
【表８】
【０１０３】
【表９】
【０１０４】
【表１０】
【０１０５】
【表１１】
【０１０６】
表４：本研究で用いた株、プラスミド、およびプライマー
【表１２】
【０１０７】
【表１３】
【０１０８】
【表１４】
【０１０９】
【表１５】
【０１１０】
当業者は、ルーチンの実験以上のものを用いることなく、本明細書に記載の発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、または確認することができる。かかる等価物は、以下のクレームに包含することが意図される。
本明細書に開示された全ての参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現し、かつミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する細胞。
【請求項２】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、細菌遺伝子である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Pseudomonas syringae遺伝子またはPseudomonas putida遺伝子である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Agrobacterium tumefaciens遺伝子である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項５】
ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、哺乳動物遺伝子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、マウス遺伝子である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
細胞が、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の前記細胞。
【請求項８】
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、酵母遺伝子である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、Saccharomyces cerevisiae遺伝子である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
細胞が、原核細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の前記細胞。
【請求項１１】
細胞が、細菌細胞である、請求項１０に記載の前記細胞。
【請求項１２】
細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
細胞が、真核細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の前記細胞。
【請求項１５】
細胞が、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の前記細胞。
【請求項１６】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、プラスミド上に発現される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細胞のゲノム内に統合されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
グルカン酸の産生が、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により増加する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９】
グルカン酸の産生が、細胞内のグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより増加する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の細胞を培養することを含む、グルカン酸を産生するための方法。
【請求項２１】
グルカン酸を細胞から回収することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする１または２以上の組換え核酸分子を含む、遺伝的に改変された微生物。
【請求項２３】
グルカン酸を産生するための方法であって、細胞を、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼの少なくとも１つを組換え技術により発現するように、遺伝子操作すること、該細胞の集団を培養すること、およびグルカン酸を産生するように遺伝的に改変された細胞の集団から、グルカン酸を回収することを含む、前記方法。
【請求項２４】
細胞が、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細胞が、ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞が、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、細菌遺伝子である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Pseudomonas syringae遺伝子またはPseudomonas putida遺伝子である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Agrobacterium tumefaciens遺伝子である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、哺乳動物遺伝子である、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、マウス遺伝子である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、酵母遺伝子である、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、Saccharomyces cerevisiae遺伝子である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞が、原核細胞である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
細胞が、細菌細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されている、請求項２３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が、真核細胞である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
細胞が、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、プラスミド上に発現される、請求項２３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細胞のゲノム内に統合されている、請求項２３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
グルカン酸の産生が、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により増加する、請求項２３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
グルカン酸の産生が、細胞内のグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより増加する、請求項２３〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
細胞培養物により産生されたグルカン酸であって、前記細胞培養物中の細胞が、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼの少なくとも１つを組換え技術により発現するように遺伝的に改変された、前記グルカン酸。
【請求項４５】
細胞が、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項４４に記載のグルカン酸。
【請求項４６】
細胞が、ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項４４または４５に記載のグルカン酸。
【請求項４７】
細胞が、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項４８】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、細菌遺伝子である、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項４９】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Pseudomonas syringae遺伝子またはPseudomonas putida遺伝子である、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項５０】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Agrobacterium tumefaciens遺伝子である、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項５１】
ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、哺乳動物遺伝子である、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項５２】
ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、マウス遺伝子である、請求項５１に記載のグルカン酸。
【請求項５３】
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、酵母遺伝子である、請求項４４〜５２のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項５４】
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、Saccharomyces cerevisiae遺伝子である、請求項５３に記載のグルカン酸。
【請求項５５】
細胞が、原核細胞である、請求項４４〜５４のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項５６】
細胞が、細菌細胞である、請求項５５に記載のグルカン酸。
【請求項５７】
細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項５６に記載のグルカン酸。
【請求項５８】
ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されている、請求項４４〜５７のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項５９】
細胞が、真核細胞である、請求項４４〜５４のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項６０】
細胞が、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である、請求項５９に記載のグルカン酸。
【請求項６１】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、プラスミド上に発現される、請求項４４〜６０のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項６２】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細胞のゲノム内に統合されている、請求項４４〜６０のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項６３】
グルカン酸の産生が、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により増加する、請求項４４〜６２のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項６４】
グルカン酸の産生が、細胞内のグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより増加する、請求項４４〜６３のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項６５】
以下からなる群：
（ａ）配列番号１、配列番号２３または配列番号２５を含む、単離された核酸分子；
（ｂ）配列番号２、配列番号２４または配列番号２６の配列を含むアミノ酸配列をコードする、単離された核酸分子；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の全長配列の逆補体である、単離された核酸分子；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかと少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有する、単離された核酸分子、
から選択される、単離された核酸分子。
【請求項６６】
転写調節要素に操作可能に結合した請求項６５に記載の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
【請求項６７】
請求項６５に記載の核酸分子によりコードされた、単離されたウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド。
【請求項６８】
配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を含む、単離されたウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド。
【請求項６９】
請求項６６の組換え発現ベクターを含む、細胞。
【請求項７０】
細胞が、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞である、請求項６９に記載の細胞。
【請求項７１】
請求項６９または７０に記載の細胞を、ポリペプチドの発現を許容する条件下で培養することを含む、ウロン酸デヒドロゲナーゼの産生方法。
【請求項７２】
ポリペプチドを培養培地または細胞から回収することをさらに含む。請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
請求項６７のポリペプチドに選択的に結合する、単離された抗体。
【請求項７４】
請求項６８のポリペプチドに選択的に結合する、単離された抗体。
【請求項７５】
抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはこれらの抗原結合断片である、請求項７３または７４に記載の前記抗体。
【請求項１】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現し、かつミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する細胞。
【請求項２】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、細菌遺伝子である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Pseudomonas syringae遺伝子またはPseudomonas putida遺伝子である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Agrobacterium tumefaciens遺伝子である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項５】
ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、哺乳動物遺伝子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、マウス遺伝子である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
細胞が、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の前記細胞。
【請求項８】
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、酵母遺伝子である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、Saccharomyces cerevisiae遺伝子である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
細胞が、原核細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の前記細胞。
【請求項１１】
細胞が、細菌細胞である、請求項１０に記載の前記細胞。
【請求項１２】
細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
細胞が、真核細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の前記細胞。
【請求項１５】
細胞が、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の前記細胞。
【請求項１６】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、プラスミド上に発現される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細胞のゲノム内に統合されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
グルカン酸の産生が、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により増加する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９】
グルカン酸の産生が、細胞内のグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより増加する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の細胞を培養することを含む、グルカン酸を産生するための方法。
【請求項２１】
グルカン酸を細胞から回収することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする１または２以上の組換え核酸分子を含む、遺伝的に改変された微生物。
【請求項２３】
グルカン酸を産生するための方法であって、細胞を、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼの少なくとも１つを組換え技術により発現するように、遺伝子操作すること、該細胞の集団を培養すること、およびグルカン酸を産生するように遺伝的に改変された細胞の集団から、グルカン酸を回収することを含む、前記方法。
【請求項２４】
細胞が、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細胞が、ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞が、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、細菌遺伝子である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Pseudomonas syringae遺伝子またはPseudomonas putida遺伝子である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Agrobacterium tumefaciens遺伝子である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、哺乳動物遺伝子である、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、マウス遺伝子である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、酵母遺伝子である、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、Saccharomyces cerevisiae遺伝子である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞が、原核細胞である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
細胞が、細菌細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されている、請求項２３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が、真核細胞である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
細胞が、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、プラスミド上に発現される、請求項２３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細胞のゲノム内に統合されている、請求項２３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
グルカン酸の産生が、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により増加する、請求項２３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
グルカン酸の産生が、細胞内のグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより増加する、請求項２３〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
細胞培養物により産生されたグルカン酸であって、前記細胞培養物中の細胞が、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール１−リン酸シンターゼの少なくとも１つを組換え技術により発現するように遺伝的に改変された、前記グルカン酸。
【請求項４５】
細胞が、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項４４に記載のグルカン酸。
【請求項４６】
細胞が、ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項４４または４５に記載のグルカン酸。
【請求項４７】
細胞が、ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項４８】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、細菌遺伝子である、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項４９】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Pseudomonas syringae遺伝子またはPseudomonas putida遺伝子である、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項５０】
ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Agrobacterium tumefaciens遺伝子である、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項５１】
ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、哺乳動物遺伝子である、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項５２】
ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、マウス遺伝子である、請求項５１に記載のグルカン酸。
【請求項５３】
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、酵母遺伝子である、請求項４４〜５２のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項５４】
ミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、Saccharomyces cerevisiae遺伝子である、請求項５３に記載のグルカン酸。
【請求項５５】
細胞が、原核細胞である、請求項４４〜５４のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項５６】
細胞が、細菌細胞である、請求項５５に記載のグルカン酸。
【請求項５７】
細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項５６に記載のグルカン酸。
【請求項５８】
ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されている、請求項４４〜５７のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項５９】
細胞が、真核細胞である、請求項４４〜５４のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項６０】
細胞が、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である、請求項５９に記載のグルカン酸。
【請求項６１】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、プラスミド上に発現される、請求項４４〜６０のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項６２】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細胞のゲノム内に統合されている、請求項４４〜６０のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項６３】
グルカン酸の産生が、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび／またはミオイノシトール１−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により増加する、請求項４４〜６２のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項６４】
グルカン酸の産生が、細胞内のグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより増加する、請求項４４〜６３のいずれか一項に記載のグルカン酸。
【請求項６５】
以下からなる群：
（ａ）配列番号１、配列番号２３または配列番号２５を含む、単離された核酸分子；
（ｂ）配列番号２、配列番号２４または配列番号２６の配列を含むアミノ酸配列をコードする、単離された核酸分子；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の全長配列の逆補体である、単離された核酸分子；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかと少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有する、単離された核酸分子、
から選択される、単離された核酸分子。
【請求項６６】
転写調節要素に操作可能に結合した請求項６５に記載の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
【請求項６７】
請求項６５に記載の核酸分子によりコードされた、単離されたウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド。
【請求項６８】
配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を含む、単離されたウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド。
【請求項６９】
請求項６６の組換え発現ベクターを含む、細胞。
【請求項７０】
細胞が、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞である、請求項６９に記載の細胞。
【請求項７１】
請求項６９または７０に記載の細胞を、ポリペプチドの発現を許容する条件下で培養することを含む、ウロン酸デヒドロゲナーゼの産生方法。
【請求項７２】
ポリペプチドを培養培地または細胞から回収することをさらに含む。請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
請求項６７のポリペプチドに選択的に結合する、単離された抗体。
【請求項７４】
請求項６８のポリペプチドに選択的に結合する、単離された抗体。
【請求項７５】
抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはこれらの抗原結合断片である、請求項７３または７４に記載の前記抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ−Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ−Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５１６０６３（Ｐ２０１１−５１６０６３Ａ）
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０２９９１（Ｐ２０１１−５０２９９１）
【出願日】平成２１年４月３日（２００９．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００２１１１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４５８３８
【国際公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【出願人】（５００２１９５３７）マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー (25)
【氏名又は名称原語表記】ＭＡＳＳＡＣＨＵＳＥＴＴＳ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
【住所又は居所原語表記】７７ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ ０２１３９，Ｕ．Ｓ．Ａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月３日（２００９．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００２１１１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４５８３８
【国際公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【出願人】（５００２１９５３７）マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー (25)
【氏名又は名称原語表記】ＭＡＳＳＡＣＨＵＳＥＴＴＳ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
【住所又は居所原語表記】７７ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ ０２１３９，Ｕ．Ｓ．Ａ
【Ｆターム（参考）】
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