グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（改変ＧＧＴ）の製造方法
生物界に広く分布している酵素であるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）を用いて、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変ペプチド（即ち、改変ＧＧＴ）を製造することを本発明の課題とする。本発明に従って、ＧＧＴにおいて、１）γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基、又は２）活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基、からなる群より選択される１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することによって、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴを製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）の１又はそれ以上のアミノ酸残基を置換することを特徴とする、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴの製造方法、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴ、該改変ＧＧＴをコードする核酸分子、及び該改変ＧＧＴを発現している細胞に関する。さらに、本発明は、前記改変ＧＧＴを用いて、ＧＬ−７−ＡＣＡを処理し、セファロスポリン系（セフェム系）抗生物質の原料となる７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）を製造する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
２００２年の半合成セファロスポリンの販売額は、同年の医薬品の世界市場の総売り上げ約４，０００億ドルのうちの７６億ドルを占め、抗生物質のなかで販売額の最も多い医薬品である。半合成セファロスポリンは、７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）の３位と７位の側鎖を修飾することにより、生産されている。それゆえ、７−ＡＣＡの効率的な生産は、製薬業界にとって極めて重大な関心事である。工業的には、カビの一種であるＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの発酵生産するセファロスポリンＣの７位の側鎖を主として化学的に脱アシル化することにより生産されている。
【０００３】
しかしながら、化学的方法の場合、何段階もの複雑なプロセスを経ること、純度の高いセファロスポリンを必要とすること、特殊な条件（例えば、低温）で反応を行うこと、毒性を持った化合物を使うこと、廃棄物として多量の化学物質が出ることなどの欠点がある。
【０００４】
そこで、半合成ペニシリンの中間体である６−アミノペニシラン酸が、ペニシリンを微生物由来のペニシリンアシラーゼで脱アシル化して工業生産されているのと同様、セファロスポリンアシラーゼを生産する微生物を見つけ、その酵素によりセファロスポリンＣを７−ＡＣＡに変換する酵素法の開発が長く検討されてきた。セファロスポリンＣを直接脱アシル化する酵素も見つかっているが、セファロスポリンＣを基質とした場合の活性は極めて低い。そこで、セファロスポリンＣを化学的にＧＬ−７−ＡＣＡに変換した後、セファロスポリンアシラーゼで７−ＡＣＡに脱アシル化する方法が１９７８年より工業化されていた（非特許文献１）。一方、最近工業化されたバイオプロセスでは（非特許文献２）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとセファロスポリンアシラーゼの２種類の酵素が利用されている。このプロセスにおいて、セファロスポリンＣはＤ−アミノ酸オキシダーゼによりケトアジポイル−７−ＡＣＡに変換された後、この反応で副生した過酸化水素により非酵素的にＧＬ−７−ＡＣＡに変換される。ついで、ＧＬ−７−ＡＣＡはセファロスポリンアシラーゼにより脱アシル化されて、７−ＡＣＡになる。これらいずれのプロセスでも、効率的な変換を触媒するセファロスポリンアシラーゼが重要であり、広範なスクリーニングが行われてきたが、この活性を持った微生物は、限られた種類の細菌にしか見つかっていない。
【０００５】
効率的な酵素法のために、多種多様な生物に存在し、セファロスポリンアシラーゼに代わって７−ＡＣＡ生成の反応を触媒する酵素が強く求められている。
【０００６】
他方、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）は、細菌、植物、動物などの広範囲な生物種において存在し、γ−グルタミル化合物のアミド基のＣ−Ｎ結合を加水分解する酵素として広く知られている。例えば、γ−グルタミルペプチド ＋ 水 → グルタミン酸 ＋ ペプチド の反応を触媒する。
【０００７】
しかしながら、今までのところ、ＧＧＴがＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性をもつことを示す報告は、全くなされていない。
【非特許文献１】都築勝沼、小松謙一、市川茂彰、渋谷友三． 酵素法による７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）製造技術の研究． 日本農芸化学会誌， ６３， １８４７−１８５３ （１９８９）．
【非特許文献２】A. Schmid, F. Hollmann, J. B. Park, and B. Buhler. The use of enzymes in the chemical industry in Europe. Current Opinion in Biotechnology, 13, 359-366 (2002).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴを製造する方法、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴ、該改変ＧＧＴをコードする核酸分子、及び該改変ＧＧＴを発現している細胞を提供することを目的とする。さらに、本発明は、上記ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴを用いてＧＬ−７−ＡＣＡを処理し、セファロスポリン系（セフェム系）抗生物質の原料となる７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）を生産する方法を提供することもさらなる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、セファロスポリン系抗生物質の原料となる７−ＡＣＡを、酵素法により効率的に生産する方法を開発すべく鋭意研究を行った。その結果、ＧＧＴにおいて、１）γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基、又は２）活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基、からなる群より選択される１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換することにより、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴを製造することに成功した。
【００１０】
これまで、ＧＧＴの遺伝子が同定されクローニングされている種としては、大腸菌（Escherichia coli K-12）、Bacillus subtilis、Bacillus natto、Helicobacter pylori 26695、Pseudomonas A14、Rat、Mouse、Pig、Humanがある。これらの種の間でアミノ酸配列が完全に保存されているのは、大腸菌のＧＧＴの５８０アミノ酸残基のうちの７６アミノ酸残基である。そこで、この７６アミノ酸残基について、ＧＧＴとクラスＩＶセファロスポリンアシラーゼとの間で配列を比較したところ、ＧＧＴの７６アミノ酸残基のうち、５８アミノ酸残基は、クラスＩＶセファロスポリンアシラーゼ（Y. Kim, K.-H. Yoon, Y. Khang, S. Turley, and W. G. J. Hol. The 2.0 A crystal structure of cephalosporin acylase. Structure, 8, 1059-1068 (2000).）でも保存されていることがわかった。ＧＧＴとクラスＩＶセファロスポリンアシラーゼとの間で相違する１８アミノ酸残基については、これまでに２つの菌株から見つかったクラスＩＶセファロスポリンアシラーゼの間では保存されていた（図１ａ〜１ｃ及び２を参照のこと）。しかしながら、大腸菌のＧＧＴは、ＧＬ−７−ＡＣＡの加水分解活性を有さず、一方、クラスＩＶセファロスポリンアシラーゼは、ＧＬ−７−ＡＣＡを加水分解する活性を有する。そこで、本発明者らは、ＧＧＴにおいて、生物種間で保存されているが、クラスＩＶセファロスポリンアシラーゼとの間では異なるアミノ酸残基に注目した。
【００１１】
大腸菌のＧＧＴの４３３番目の残基であるアスパラギン酸（Ａｓｐ−４３３）に相当するヒトのＧＧＴのアミノ酸残基（Ａｓｐ−４２３）は、γ−グルタミル化合物のα位のアミノ基と相互作用して安定化させていることが示唆されていた（N. Taniguchi, and Y. Ikeda. γ-Glutamyl transpeptidase: catalytic mechanism and gene expression. Ad
v. Enzymol. Rel. Areas Mol. Biol. 72, 239-278 (1998)）。この大腸菌ＧＧＴの４３３番目に相当するアミノ酸残基は、ＧＧＴ間では完全に保存されているがクラスＩＶセファロスポリンアシラーゼとの間で異なる１８アミノ酸残基のうちの一つであった。また、クラスＩＶセファロスポリンアシラーゼの基質であるＧＬ−７−ＡＣＡの７位の側鎖は、グルタリル基が７位のアミノ基にアミド結合した構造である。グルタリル基は、γ−グルタミル基のα位のアミノ基が脱アミノ化した構造である。
【００１２】
そこで、本発明者らは、ＧＧＴにγ−グルタミル化合物との相互作用が変化するような変異を導入することにより、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴを作製することができるという仮説をたてた。この仮説に基づき、本発明者らは、γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換した改変ＧＧＴを作製したところ、該改変ＧＧＴは、改変前より有意に高いＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性を有していた。驚くべきことに、この改変ＧＧＴは、従来のセファロスポリンアシラーゼよりも、ＧＬ−７−ＡＣＡに対して、低いＫｍ値を有し、高い基質特異性を示していた。
【００１３】
また、大腸菌ＧＧＴの３９１番目のスレオニン残基に相当するアミノ酸残基が活性に必須なアミノ酸残基の一つであるということが、本発明者らによってすでに明らかにされていた。そこで、本発明者らは、ＧＧＴの活性中心周辺領域（例えば、大腸菌ＧＧＴの３９１番目のスレオニン残基に相当するアミノ酸残基の周辺領域）に変異を導入することにより、活性中心周辺領域のコンフォメーションが変化し、活性中心がＧＬ−７−ＡＣＡの７位炭素の隣のアミド結合に接近し、アミド結合を加水分解するという仮説をたてた。この仮説に基づき、ＧＧＴの活性中心周辺領域に変異を導入すれば、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性の増強された改変ＧＧＴが得られ得る。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の事項に関する。
項１．
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）において、
１）γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基、又は
２）活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基、
からなる群より選択される１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴの製造方法。
項２．
ＧＧＴにおいて、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第５０〜７８残基、第９３〜９８残基、第１１４〜１２５残基、第１４７〜１８８残基、第２０９〜３４７残基、第３９１〜４３４残基、第４５２〜４８７残基及び第５０８〜５６９残基の領域から選択される１又はそれ以上の領域に相当する領域において、１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、項１に記載の方法。
項３．
ＧＧＴにおいて、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第１６残基、第９４残基、第９８残基、第１１４残基、第１１５残基、第２０９残基、第２２７残基、第２４２残基、第２６３残基、第３３４残基、第３４２残基、第４３３残基、 第４５２残基、第４６０残基、第４６１残基、第４６２残基、第４６８残基、第４８４残基から選択される１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、項１に記載の方法。
項４．
ＧＧＴにおいて、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第４３３残基に相当するアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．
前記他のアミノ酸残基が、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンからなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸残基である、項４に記載の方法。
項６．
前記他のアミノ酸残基がアスパラギンである、項５に記載の方法。
項７．
項１〜６のいずれかに記載の方法により取得された改変ＧＧＴ。
項８．
項７に記載の改変ＧＧＴをコードする核酸分子。
項９．
項７に記載の改変ＧＧＴを発現している細胞。
項１０．
項７に記載の改変ＧＧＴでＧＬ−７−ＡＣＡを処理する工程を包含する、７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）の製造方法。
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１６】
本発明におけるＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性は、特に記載しない限り、ＧＬ−７−ＡＣＡの７位の側鎖のアミド結合を加水分解する活性を意味する。
【００１７】
改変前の「γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）」は、任意の生物由来の、天然に存在するＧＧＴ及び非天然のＧＧＴ（人工的に合成されたＧＧＴ、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性以外の性質（例えば、熱安定性など）の改良を目的として改変されたＧＧＴを含む）を包含する。また、ＧＧＴ全長ではなく、Ｎ末端欠失型、Ｃ末端欠失型、Ｎ及びＣ末端欠失型のＧＧＴも同様に用いられる。Ｎ末端欠失型ＧＧＴとしては、例えば、大腸菌の１〜３４番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が欠失したＧＧＴが例示できる。Ｃ末端欠失型ＧＧＴとしては、例えば、大腸菌の５７２〜５８０番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が欠失したＧＧＴが例示できる。Ｎ及びＣ末端欠失型としては、例えば、大腸菌の１〜３４及び５７２〜５８０番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が欠失したＧＧＴが例示できる。
【００１８】
ＧＧＴの由来となる任意の生物としては、細菌（例えば、大腸菌、枯草菌、納豆菌、スードモナス（Pseudomonas）、ピロリ菌等）、動物（例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ブタ、ウサギ、ハムスター等）、昆虫（例えば、カイコ）、植物（例えば、インゲンマメ等）、藍藻（例えば、アオコ、スイセンジノリ、ユレモ、ネンジュモ等）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属等）が挙げられる（これらに限定されない）。
【００１９】
「γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基」としては、γ−グルタミル化合物に相互作用するアミノ酸残基であれば、いかなる残基でもよい。このようなアミノ酸残基としては、例えば、γ−グルタミル化合物のα位のアミノ基（−ＮＨ2、−ＮＨ3+）、α位のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯ-基）、β位及び／又はγ位のメチレン基（ＣＨ2基）と相互作用するアミノ酸残基が挙げられる。相互作用は、当業者が通常認識し得るような作用であり、例えば、イオン結合、水素結合、静電的相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等である。
【００２０】
γ−グルタミル化合物のα位のアミノ基と相互作用するアミノ酸残基としては、アミノ基と相互作用し得るアミノ酸残基であればいかなるアミノ酸残基であってもよいが、好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、システイン、グルタミン、アスパラギン、チロシンが例示できる（これらに限定されない）。
【００２１】
γ−グルタミル化合物のα位のカルボキシル基と相互作用するアミノ酸残基としては、カルボキシル基と相互作用し得るアミノ酸残基であればいかなるアミノ酸残基であってもよいが、好ましくは、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、セリン、システイン、スレオニンが例示できる（これらに限定されない）。
【００２２】
γ−グルタミル化合物のβ位及び／又はγ位のメチレン基（ＣＨ2基）と相互作用するアミノ酸残基としては、メチレン基と相互作用し得るアミノ酸残基であれば、いかなるアミノ酸残基であってもよいが、好ましくはフェニルアラニン、アラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリンが例示できる（これらに限定されない）。
【００２３】
「活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基」としては、活性中心及び活性中心と二次元及び三次元的に近いアミノ酸残基であればいかなるアミノ酸残基であってもよい。このような活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基として、例えば、大腸菌のＧＧＴの３９１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基の周辺の領域におけるアミノ酸残基が挙げられる。
【００２４】
従って、「γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基、又は活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基」としては、例えば、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第５０〜７８残基、第９３〜９８残基、第１１４〜１２５残基、第１４７〜１８８残基、第２０９〜３４７残基、第３９１〜４３４残基、第４５２〜４８７残基及び第５０８〜５６９残基の領域から選択される１又はそれ以上の領域に相当するＧＧＴの領域におけるアミノ酸残基が挙げられる。γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基の一つである大腸菌ＧＧＴのＡｓｐ−４３３ に相当するＧＧＴのアミノ酸残基や、ＧＧＴ活性の活性中心に存在するアミノ酸残基の一つである大腸菌ＧＧＴのＴｈｒ−３９１ に相当するＧＧＴのアミノ酸残基は、これらの領域内に存在している。
本発明の１つの好ましい実施形態において、本発明に従って置換されるアミノ酸残基は、ＧＧＴにおいて、生物種間で保存され且つクラスＩＶセファロスポリンアシラーゼとの間で保存されていないアミノ酸残基である。かかるアミノ酸残基は、例えば、大腸菌のＡｓｐ−４３３、Ｌｅｕ−１６、Ｇｌｙ−９４、Ｐｈｅ−９８、Ａｒｇ−１１４、Ｇｌｕ−１１５、Ｐｈｅ−２０９、Ｌｅｕ−２２７、Ｐｈｅ−２４２、Ｔｈｒ−２６３、Ｔｙｒ−３３４、Ｇｌｙ−３４２、 Ａｓｎ−４５２、Ｐｒｏ−４６０、Ｌｅｕ−４６１、Ｓｅｒ−４６２、Ｉｌｅ−４６８、Ｇｌｙ−４８４に相当するアミノ酸残基である。
【００２５】
置換後の「他のアミノ酸残基」は、置換前のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基であれば、いかなるアミノ酸であってもよい。好ましくは、置換前のアミノ酸残基と異なる性質（例えば、側鎖の、酸性／中性／塩基性、親水性／疎水性、嵩高さ等）をもつアミノ酸残基である。例えば、置換前のアミノ酸残基が酸性である場合、他のアミノ酸残基は塩基性又は中性であり、置換前のアミノ酸残基が塩基性である場合、他のアミノ酸残基は酸性又は中性であり、置換前のアミノ酸残基が中性である場合、他のアミノ酸残基は塩基性又は酸性のアミノ酸残基である。また、例えば、置換前のアミノ酸が疎水性である場合、他のアミノ酸残基は親水性であり、置換前のアミノ酸が親水性である場合、他のアミノ酸残基は疎水性である。例えば、大腸菌のＧＧＴの４３３番目のアスパラギン酸に相当するＧＧＴのアミノ酸残基を置換する場合、他のアミノ酸残基は、例えば、アスパラギン、グルタミン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、グルタミン酸、システイン、アルギニン、リジン、スレオニン、セリン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン（これらに限定されない）であり、好ましくは、アスパラギン、チロシン、グルタミン、トリプトファン、フェニルアラニンであり、より好ましくは、アスパラギン、チロシンであり、特に好ましくはアスパラギンである。
本発明の１つの好ましい実施形態において、他のアミノ酸残基は、図１a〜c中のＧＧＴのアミノ酸配列において下線が引かれているアミノ酸残基に対応するクラスIV セファロスポリンアシラーゼのアミノ酸残基である。
【００２６】
「グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された（される）」とは、前述のような置換によって、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性がいくらか増加した（高められた）ことを意味する。また、置換前のＧＧＴがＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性を有していなくても、有していてもよい。活性が増強された量（増加量）は、少しでも増加していれば、特に限定されず、例えば、０．０００１Ｕ／ｍｇ以上の増加量である。
【００２７】
「改変ＧＧＴ」とは、本発明の方法に従って製造された、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強されたＧＧＴの改変ペプチド及び／又は改変タンパク質を意味する。
「改変ＧＧＴをコードする核酸分子」とは、改変ＧＧＴと同じアミノ酸配列へ転写・翻訳されるＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子を意味する。なお、改変ＧＧＴをコードする核酸分子は、改変ＧＧＴを正しくコードしている限り、いかなるコドンを選択してもよい。コドンの選択は、常法に従って行うことができる。例えば、利用する宿主のコドンの使用頻度などを考慮し決定することができる。
【００２８】
「改変ＧＧＴを発現している細胞」とは、該改変ＧＧＴを発現している細胞（改変ＧＧＴをコードする核酸分子で形質転換された細胞を含む）であれば、いかなる細胞であってもよい。かかる細胞の種は、いかなる種であってもよいが、ＧＧＴの由来の種と同じであることが好ましい。
【００２９】
上述のような「改変ＧＧＴをコードする核酸分子」、「改変ＧＧＴ」及び「改変ＧＧＴを発現している細胞」は、常法に従って、取得することができる。
【００３０】
改変ＧＧＴをコードする核酸分子は、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法、ＡｌｔｅｒｅｄＳｉｔｅ法、ＰＣＲ法、Ｉｔｏ法などの変異導入法により、取得することができる。なお、これらの変異導入法を行うときに使用するプライマーは、採用する変異導入方法や改変ＧＧＴをコードする核酸分子の配列情報に基づいて、適宜設計でき、常法に従って合成できる。
【００３１】
取得した核酸分子の単離及び精製は、例えば、H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K-12 ggt and rapid isolation of γ-glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988)に記載される方法、ゲル電気泳動による分離精製又は分子ふるい操作などの通常用いられる方法によって、行うことができる。
【００３２】
また、上記のように得られた核酸分子は、必要に応じて、例えば、ジデオキシ法やマキサム−ギルバート法などに従って、又は市販のシークエンスキットなどを用いて、配列が決定される。
【００３３】
「改変ＧＧＴ」及び「改変ＧＧＴを発現している細胞」の取得については、前述ように取得された改変ＧＧＴをコードする核酸分子を用いて、常法の遺伝子組換技術に従って行うことができる（Sambrook, J., Frisch, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989 Current Protocls in Molecular Biology. John Wiley Sons, Inc. 1998. など）。簡潔には、例えば、改変ＧＧＴをコードする核酸分子を適当な発現ベクターへ挿入した後、これを適当な宿主細胞へ導入して形質転換し、適切な条件下において改変ＧＧＴを発現させることにより、改変ＧＧＴを発現している細胞を取得することができる。さらに、この改変ＧＧＴを発現している細胞から、改変ＧＧＴを回収することができる。この回収した改変ＧＧＴを、文献（H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K-12 ggt and rapid isolation of γ-glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988)）に記載の方法又は常法に従って、さらに精製してもよい。
【００３４】
ここで、発現プラスミドを宿主細胞へ導入する方法は、特に限定されず、一般的な方法を採用することができる。例えば、エレクトロポレーション、リポソーム法、リン酸カルシュウム法、ＤＥＡＥデキストラン法などを用いることができる。また、各ステップにおいて、目的物を選別する必要がある場合、適宜、サブクローニング操作やシークエンシングなどを行ってもよい。
【００３５】
発現プラスミドを導入するための宿主細胞としては、あらゆる種の原核生物及び真核生物の細胞（樹立細胞を含む）を使用することができる。
【００３６】
原核生物細胞としては、例えば、大腸菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、納豆菌、スードモナス、ピロリ菌又は藍藻（これらに限定されない）の細胞が挙げられる。大腸菌の細胞としては、例えば、Ｋ１２株、Ｂ株、ＳＨ６４１株、ＣＭ９株、ＳＨ７０３株に分類される細胞株（これらに限定されない）が好適である。また、枯草菌の細胞としては、とりわけＭＨ２３０８株（これらに限定されない）が好適である。
【００３７】
真核生物細胞としては、例えば、動物由来細胞（例えば、ヒト、ラット、マウス由来細胞）、昆虫由来細胞（例えば、カイコ由来細胞）、植物由来細胞（例えば、インゲンマメ由来細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。動物由来の樹立細胞としては、具体的には、サルの腎臓細胞であるＣＯＳ細胞（Cell, 23: 175 (1981)）、Ｖｅｒｏ細胞及びＭＫ細胞、チャイニーズハムスターの卵巣細胞であるＣＨＯ細胞、マウスの線維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞（J.Viol., 4:549(1969)）、及びヒトのＴ細胞リンパ腫由来細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞（J.Immunol., 133:123(1984)）などが挙げられる。酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）もまた、好適に利用される。
【００３８】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に改変ＧＧＴをコードする核酸分子、該核酸分子の上流にプロモーター、ＳＤ（シャイン−ダルガーノ）配列、及び必要に応じて開始コドン（例えば、ＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを、好適に利用することができる。
【００３９】
上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９がよく用いられるが、これらに限定されず、既知の各種ベクターを用いることができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−Ｐ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＥＴ２１、ｐＥＴ２１／ｌａｃＩq（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（これらに限定されない）を例示できる。
【００４０】
プロモーターについても特に限定はなく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ／ＰＲ プロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター（これらに限定されない）などを好ましく利用できる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌である場合は、ＳＰ０１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。
【００４１】
真核生物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする核酸分子の上流にプロモーター、ＲＮＡのスプライシング部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列を保有し、更に必要に応じて複製起点を有するものが挙げられる。該発現ベクターの例としては、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)）（これらに限定されない）が例示できる。上記以外にも既知の各種市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系の場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社） 、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＥＦ１／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの動物細胞用ベクター、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ（ＧｉｂｃｉＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの昆虫細胞用ベクター（これらに限定されない）が挙げられる。
【００４２】
また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０ 由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインのプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーター、アデノウイルスプロモーター、エロンゲーションファクターのプロモーター（これらに限定されない）を例示できる。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えば、ｐＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター（これらに限定されない）を好適に利用できる。
【００４３】
このように取得された改変ＧＧＴの精製は、本発明者らが、既に報告した方法（H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K-12 ggt and rapid isolation of γ-glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988)）又は常法に従って、行うことができる。
【００４４】
さらに、本発明の改変ＧＧＴでＧＬ−７−ＡＣＡを処理し、７−ＡＣＡを製造することができる。
【００４５】
ＧＬ−７−ＡＣＡの合成については、例えば、Y. Shibuya, K. Matsumoto, and T. Fujii. Isolation and properties of 7β-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid acylase-producing bacteria. Agric. Biol. Chem., 45, 1561-1567 (1981)に従って、行うことができる。
【００４６】
処理は、常法を用いて（例えば、インキュベーションによって）行う。例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（例えば、ｐＨ７．６〜９．０）中で、改変ＧＧＴ及びＧＬ−７−ＡＣＡを、３７℃にて、３時間、インキュベーションする。この処理によって、該ＧＬ−７−ＡＣＡが７−ＡＣＡに変換される。
【００４７】
ＧＬ−７−ＡＣＡと７−ＡＣＡの測定は、例えば、逆相ＨＰＬＣ、アミノ酸アナライザーなどの慣例的な方法に従う。
【００４８】
さらに必要に応じて、７−ＡＣＡは、分離及び精製される。この分離及び精製は、例えば、DOWEX 1X8および逆相HPLC等によって行う。
【発明の効果】
【００４９】
本発明により、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴを製造することが可能になった。また、本発明により製造された改変ＧＧＴのＧＬ−７−ＡＣＡに対するＫｍ値は、従来のセファロスポリンアシラーゼに比べて小さく、本発明の改変ＧＧＴは、ＧＬ−７−ＡＣＡに対して優れた基質特異性を有している。
【００５０】
さらに、本発明により、７−ＡＣＡの効率的な酵素的製造方法が提供され、従来の化学法よりも安全、簡便、低コスト、且つ環境に優しく、セファロスポリン系（セフェム系）抗生物質の原料である７−ＡＣＡを生産することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１ａ】ＧＧＴ及びクラスIV セファロスポリンアシラーゼの全配列のアラインメントを図１ａ〜図１ｃに示す。各配列は、SwissProt又はGenBankより入手可能である。上から、Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylase（SwissProt Accession No. P15557：配列番号１９）、Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylase（SwissProt Accession No. Q05053：配列番号２１）、Escherichia coli K-12 GGT（SwissProt Accession No. P18956：配列番号１）、Bacillus subtilis 168 GGT（SwissProt Accession No. P54422：配列番号３）、Bacillus natto GGT（GenBank Accession No. 2321184A：配列番号５）、Helicobacter pylori 26695 GGT（GenBank Accession No. AE000618：配列番号７）、Pseudomonas A14 GGT（SwissProt Accession No. P36267：配列番号９）、Rat GGT（SwissProt Accession No. P07314：配列番号１１）、Mouse GGT（SwissProt Accession No. Q60928：配列番号１３）、Pig GGT（SwissProt Accession No. P20735：配列番号１５）、Human GGT1（SwissProt Accession No. P19440：配列番号１７）の配列である。下線を引いた斜体で表された残基は、すべてのGGTで保存されているがクラスIV セファロスポリンアシラーゼでは異なっているGGTの箇所を示している。斜体（下線無し）の残基は、すべてのGGT及びクラスIVセファロスポリンアシラーゼで保存されている残基を示した。図１ａは、前記アラインメントの一部を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、図１ａに示したアラインメントの続きである。
【図１ｃ】図１ｃは、図１ｂに示したアラインメントの続きである。
【図２】図２は、ＧＧＴ間でよく保存されている領域の一つである、大腸菌のＧＧＴの活性中心であるＴｈｒ−３９１から今回変異をかけたＡｓｐ−４３３付近のアラインメントを示す。各配列は、SwissProt又はGenBankより入手可能な前記配列（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１）の部分配列である。上から順に、Escherichia coli K-12 GGT（配列番号２４）、Bacillus subtilis 168 GGT（配列番号２５）、Bacillus natto GGT（配列番号２６）、Helicobacter pylori 26695 GGT（配列番号２７）、Pseudomonas A14 GGT（配列番号２８）、Rat GGT（配列番号２９）、Mouse GGT（配列番号３０）、Pig GGT（配列番号３１）、Human GGT1（配列番号３２）、Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylase（配列番号３３）、Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylase（配列番号３４）のアミノ酸配列である。すべてのGGTで保存されている残基を斜体（下線無し）で示した。下線を引いた斜体の文字は、すべてのGGTでAsp残基として保存されているが、クラスIV セファロスポリンアシラーゼではAsn残基となっているＧＧＴの箇所を示している。アラインメントの左右に示した数字は、この図の左端、右端の残基がそれぞれのN末端から何番目の残基であるかを示している。
【図３】図３は、酵素反応のＨＰＬＣのチャートを示す。反応混合液（２ｍＭ ＧＬ−７−ＡＣＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７３）、０．１ｍｇ／ｍｌ Ｄ４３３Ｎ）を、３７℃でインキュベーションすることによって、反応を行った。（Ａ）は反応０時間、（Ｂ）は反応３時間のサンプルである。
【図４】図４は、Ｄ４４３ＮのＧＬ−７−ＡＣＡ加水分解反応の至適ｐＨを検討した結果を示す。緩衝液は、ｐＨ６．５〜７．５ではリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ ７．５〜８．７３ではＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．７３〜１０．５ではＮＨ4Ｃｌ−ＮＨ4ＯＨ緩衝液を用いた。
【図５】図５は、ＮＭＲの結果を示す。(A)は市販品のGL-7-ACA、 (B)はこの実施例で得られた標品のNMRのチャートである。
【図６】図６は、実施例１〜２５において取得される各種改変ＧＧＴを示す。大腸菌の改変ＧＧＴに相当する、Bacillus subtilis 168（B. subtilis）、Bacillus natto（B. natto）、Helicobacter pylori 26695（H. pylori）、Pseudomonas A14（Pseudo）、rat、mouse、pig、humanの改変ＧＧＴを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
以下に実施例を示すが、これは、本発明の単なる例示であって、本発明を何ら制限するものではない。なお、以下の実施例では大腸菌のＧＧＴを用いているが、ＧＧＴのアミノ酸配列は大腸菌と他の生物種との間でよく保存されており、大腸菌以外の様々な生物種においても本発明を同様に実施できる。
【００５３】
ここで、本願の特許請求の範囲、明細書及び図面に記載されるアミノ酸、タンパク質、塩基配列、核酸等の略語による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００５４】
また、配列表に記載の各配列については、以下の通りである；
配列番号１：Escherichia coli K-12 GGTのアミノ酸配列
配列番号２：Escherichia coli K-12 GGTの核酸配列
配列番号３：Bacillus subtilis 168 GGTのアミノ酸配列
配列番号４：Bacillus subtilis 168 GGTの核酸配列
配列番号５：Bacillus natto GGTのアミノ酸配列
配列番号６：Bacillus natto GGTの核酸配列
配列番号７：Helicobacter pylori 26695 GGTのアミノ酸配列
配列番号８：Helicobacter pylori 26695 GGTの核酸配列
配列番号９：Pseudomonas A14 GGTのアミノ酸配列
配列番号１０：Pseudomonas A14 GGTの核酸配列
配列番号１１：Rat GGTのアミノ酸配列
配列番号１２：Rat GGTの核酸配列
配列番号１３：Mouse GGTのアミノ酸配列
配列番号１４：Mouse GGTの核酸配列
配列番号１５：Pig GGTのアミノ酸配列
配列番号１６：Pig GGTの核酸配列
配列番号１７：Human GGT1のアミノ酸配列
配列番号１８：Human GGT1の核酸配列
配列番号１９：Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylaseのアミノ酸配列
配列番号２０：Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylaseの核酸配列
配列番号２１：Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylaseのアミノ酸配列
配列番号２２：Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylaseの核酸配列
配列番号２３：実施例１で変異株を取得するために用いたプライマーの核酸配列
配列番号２４：図２に示される、Escherichia coli K-12 GGTの部分アミノ酸配列
配列番号２５：図２に示される、Bacillus subtilis 168 GGTの部分アミノ酸配列
配列番号２６：図２に示される、Bacillus natto GGTの部分アミノ酸配列
配列番号２７：図２に示される、Helicobacter pylori 26695 GGTの部分アミノ酸配列
配列番号２８：図２に示される、Pseudomonas A14 GGTの部分アミノ酸配列
配列番号２９：図２に示される、Rat GGTの部分アミノ酸配列
配列番号３０：図２に示される、Mouse GGTの部分アミノ酸配列
配列番号３１：図２に示される、Pig GGTの部分アミノ酸配列
配列番号３２：図２に示される、Human GGT1の部分アミノ酸配列
配列番号３３：図２に示される、Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylaseの部分アミノ酸配列
配列番号３４：図２に示される、Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylaseの部分アミノ酸配列。
実施例１
【００５５】
変異株の取得方法
１．野生型ＧＧＴへのＤ４３３Ｎ変異の導入
まず、ＧＧＴのアミノ酸配列の中でＡｓｐ−４３３をＡｓｎ−４３３に変えるように設計した合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡＴＡ*ＡＴＴＴＣＴＣＣＧＣＣ−３’（Ａ*は、野生型ＧＧＴではＧである）（配列番号２３）をプライマーとし、デオキシウラシルを導入した１本鎖のｐＳＨ１２４８（ｐＴＺ１８ＲのＨｉｎｄＩＩＩサイトにｐＳＨ２５３（J. O. Claudio, H. Suzuki, H. Kumagai, and T. Tochikura. Excretion and rapid purification of γ-glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K-12. J. Ferment. Bioeng., 72, 125-127 (1991).）の約0.9 kbのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを挿入したもの）を鋳型としてＫｕｎｋｅｌ法（T. A. Kunkel. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488-492 (1985).）により変異操作を行い、ＤＨ５α株を形質転換した。得られた菌株からプラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンスを行い、２株で目的の変異が入っていることを確認し、その１つのプラスミドをｐＣＭ２とした。ｐＣＭ２の約０．９kbのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとｐＳＨ２５３をＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる５．４ ｋｂのフラグメントをライゲーションし、ｐＣＭ３を得た。
【００５６】
ｐＣＭ３の３．２ ｋｂのＳｍａＩ−ＳｐｈＩフラグメントをＥｃｏＲＶとＳｐｈＩで切断したｐＢＲ３２２にライゲーションした。得られたプラスミドｐＣＭ７で、ＧＧＴ欠損株ＳＨ６４１を形質転換したものをＣＭ９（Ｄ４３３Ｎ）株とした（H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K-12 ggt and rapid isolation of γ-glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988).）。
実施例２
【００５７】
酵素の精製
野生型と変異型（Ｄ４３３Ｎ）の酵素はすでに報告している方法に従ってそれぞれＳＨ６４２株とＣＭ９株から精製した（H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K-12 ggt and rapid isolation of γ-glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988)）。
実施例３
【００５８】
ＧＬ−７−ＡＣＡを基質としたときのＤ４３３Ｎの加水分解活性
１．基質ＧＬ−７−ＡＣＡの合成法
基質ＧＬ−７−ＡＣＡの合成法を行うにあたり、Y. Shibuya, K. Matsumoto, and T. Fujii. Isolation and properties of 7β-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid acylase-producing bacteria. Agric. Biol. Chem., 45, 1561-1567 (1981)を参照した。反応液の組成は、以下の表１に示すとおりである。
【００５９】
【表１】
Ａ液をＢ液に加え、ＮａＯＨでｐＨを９．０に保ちながら、室温で３時間混合した。ロータリーエバポレーターでアセトンを蒸発させ、濃縮した。濃塩酸でｐＨを１．５に調整後、酢酸エチルを加え、分液ろ斗を用いて、酢酸エチル層を抽出した。水層に残った分を再び酢酸エチルで抽出した。ロータリーエバポレ−ターで酢酸エチルを蒸発させ、乾燥させた。再び酢酸エチルを加えて溶解し、ろ過した。ろ液をロータリーエバポレーターで乾燥させた。
【００６０】
本法により、収率８０％で、ＧＬ−７−ＡＣＡが得られた。得られたＧＬ−７−ＡＣＡ標品は1Ｈ−ＮＭＲにより、ＧＬ−７−ＡＣＡであることを確認した。
【００６１】
２．ＧＬ−７−ＡＣＡを基質としたときの酵素反応（加水分解反応）条件
反応液組成は、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．７３）、０．２〜２ ｍＭ ＧＬ−７−ＡＣＡ、０．０４〜１ ｍｇ／ｍｌ Ｄ４３３Ｎ酵素とし、３７℃で反応した。酵素溶液を反応液に加えることにより反応を開始した。経時的にサンプリング（２００μｌ）を行い、等量の３．５ Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨを加えてボルテクスすることにより反応を停止し、メンブレンフィルターでろ過した。
【００６２】
３．ＧＬ−７−ＡＣＡと７−ＡＣＡの測定法
反応液中のＧＬ−７−ＡＣＡと７−ＡＣＡの濃度は逆相ＨＰＬＣにより測定した。Ｉｎｅｒｓｉｌ ＯＤＳ−３ カラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ４．６ ｘ ２５０ ｍｍ）を装着したＨＰＬＣ（島津製作所、ＬＣ−１０）に通常５０μｌのサンプルをインジェクトし、２８０ ｎｍの吸収を測定した。移動相Ａは０．０５％のトリフルオロ酢酸水溶液、移動相Ｂは０．０５％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルとした。０〜２５分でＢの割合を０〜５０％（リニアグラジエント）、２５〜３４分はＢの割合を５０％、３４〜３５分でＢの割合を５０〜０％（リニアグラジエント）、３５〜５０分はＢの割合を０％、流速１ ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。
【００６３】
ＧＬ−７−ＡＣＡと７−ＡＣＡの溶出位置と濃度の計算には、上記のように生成したＧＬ−７−ＡＣＡと市販の７−ＡＣＡ （Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ． Ｃｏ．）を標準品として用いた。
実施例４
【００６４】
酵素反応液のＨＰＬＣのチャート
酵素反応液のＨＰＬＣのチャートを図３に示す。
実施例５
【００６５】
ＧＬ−７−ＡＣＡを基質としたときの反応（加水分解反応）の至適ｐＨ
反応液組成は、５０ ｍＭ緩衝液、２ ｍＭ ＧＬ−７−ＡＣＡ、１．０４ ｍｇ／ｍｌ酵素とし、３７℃で３時間反応した。１００℃で１分間煮沸することにより反応を停止させた後、メンブレンフィルターでろ過した。加水分解反応の至適ｐＨについて検討した結果を図４に示す。
実施例６
【００６６】
１．Ｄ４３３Ｎとの反応によりＧＬ−７−ＡＣＡから生成したものが７−ＡＣＡであることの確認
ここまで、Ｄ４３３ＮによるＧＬ−７−ＡＣＡから７−ＡＣＡへの加水分解反応は、逆相ＨＰＬＣでのリテンションタイムが市販の７−ＡＣＡと一致するピークが、７−ＡＣＡのピークであるという前提にたって行ってきた。しかし、本当にこのピークが７−ＡＣＡであるかどうかについては確認していなかった。そこで、市販の７−ＡＣＡと一致するリテンションタイムを示したものを大量に精製し、ＮＭＲ分析によりそのものが７−ＡＣＡであり、Ｄ４３３ＮによりＧＬ−７−ＡＣＡから７−ＡＣＡが生成したことを確認した。
【００６７】
反応条件
５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．７３）、２ ｍＭ ＧＬ−７−ＡＣＡ、３０．９ ｍｕ／ｍｌ （γ−ＧｐＮＡを基質とした場合の加水分解活性で）Ｄ４３３Ｎ酵素とし、全量７３０ ｍｌ、３７℃で反応した。
【００６８】
７−ＡＣＡの精製条件
７−ＡＣＡの精製には、ＤＯＷＥＸ １Ｘ８カラム（３０ ｍｌカラム）を用いた。
【００６９】
＜カラムの準備＞
２Ｎ ＮａＯＨ をカラム体積の５倍量流した。次に、蒸留水をカラム体積の５倍量流した（カラムからの流出液のｐＨが水のｐＨに等しくなるまで）。さらに、０．５Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨをカラム体積の５倍量流した。次いで、蒸留水をカラム体積の５倍量流した（カラムからの流出液のｐＨが水のｐＨに等しくなるまで）。
【００７０】
＜サンプルのアプライ＞
サンプルをアプライした。
【００７１】
＜溶出＞
蒸留水、０．０１Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨ、０．０５Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨ、０．１Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨ、０．５Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨ、１Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨ、５Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨの順番で、各々、カラム体積の５倍量流した。７−ＡＣＡは０．５Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨで溶出した。
【００７２】
＜確認＞
ニンヒドリン反応により、生成物の溶出箇所を確認した。具体的には、溶出した各フラクションをろ紙に２０μｌスポットし、乾燥させた後、上からニンヒドリン溶液を散布し、乾燥させたのち、ニンヒドリン反応を観察した。
【００７３】
＜ＨＰＬＣによる確認＞
呈色したフラクションをＨＰＬＣにかけ、市販品の７−ＡＣＡの溶出位置と一致することを確認した。収量１８．４ ｍｇであった。
【００７４】
凍結乾燥
ＤＯＷＥＸ １Ｘ８カラムにより溶出された生成物（７−ＡＣＡ）のフラクションを−８０℃のディープフリーザー内で凍結させた後、凍結乾燥機により乾燥させた。
【００７５】
ＨＰＬＣによる精製
凍結乾燥させたサンプルを蒸留水に溶かし、逆相ＨＰＬＣにより精製した。使用カラムは、ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ３８１５０−４１ Ｓｉｚｅ ２０×２５０ｍｍであり、インジェクト量は、５００μｌである。７−ＡＣＡの画分を凍結乾燥した。
【００７６】
ＮＭＲの結果
ＮＭＲの結果を、図５に示す。この結果から、精製したものは７−ＡＣＡであることが確認できた。
【００７７】
２．比活性、Ｋｍ値、ｋｃａｔ値
Ｄ４３３ＮのＧＬ−７−ＡＣＡを基質とした場合のＫｍ値を求めた。結果を以下に示す。
Ｋｍ ： ０．１０８ （ｍＭ）
実施例７〜２５
【００７８】
実施例１〜６に従って、図６に記載の改変ＧＧＴを作製し、そのＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性を測定する。このように作製された改変ＧＧＴは、大腸菌ＧＧＴ（Ｄ４３３Ｎ）と同様に、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性を有し得る。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明により、広く生物界に存在する酵素である γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）を原料として用い、該ＧＧＴのアミノ酸残基を置換することにより、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ペプチド（即ち、改変ＧＧＴ）を製造することが可能になった。素晴らしいことに、本発明の改変ＧＧＴは、ＧＬ−７−ＡＣＡに対して、小さいＫｍ値を有し、優れた基質特異性を有する。
【００８０】
さらに、本発明により、７−ＡＣＡの効率的な酵素法が提供され、従来の化学法よりも安全、簡便、低コスト、短時間、且つ環境に優しく、セファロスポリン系（セフェム系）抗生物質の原料である７−ＡＣＡを生産することが可能になった。セファロスポリン系（セフェム系）抗生物質は、非常に需要の大きい医薬品の一つであるため、本発明が医薬品業界に与える利益は大きい。
【００８１】
また、本発明は、生物界に広く分布している酵素を利用してＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼの新しいソースを提供しており、今後、本発明に基づいて、多種多様な生物種のGGTを用いて、抗生物質の酵素的製造方法についての研究が盛んになされるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）の１又はそれ以上のアミノ酸残基を置換することを特徴とする、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴの製造方法、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴ、該改変ＧＧＴをコードする核酸分子、及び該改変ＧＧＴを発現している細胞に関する。さらに、本発明は、前記改変ＧＧＴを用いて、ＧＬ−７−ＡＣＡを処理し、セファロスポリン系（セフェム系）抗生物質の原料となる７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）を製造する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
２００２年の半合成セファロスポリンの販売額は、同年の医薬品の世界市場の総売り上げ約４，０００億ドルのうちの７６億ドルを占め、抗生物質のなかで販売額の最も多い医薬品である。半合成セファロスポリンは、７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）の３位と７位の側鎖を修飾することにより、生産されている。それゆえ、７−ＡＣＡの効率的な生産は、製薬業界にとって極めて重大な関心事である。工業的には、カビの一種であるＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの発酵生産するセファロスポリンＣの７位の側鎖を主として化学的に脱アシル化することにより生産されている。
【０００３】
しかしながら、化学的方法の場合、何段階もの複雑なプロセスを経ること、純度の高いセファロスポリンを必要とすること、特殊な条件（例えば、低温）で反応を行うこと、毒性を持った化合物を使うこと、廃棄物として多量の化学物質が出ることなどの欠点がある。
【０００４】
そこで、半合成ペニシリンの中間体である６−アミノペニシラン酸が、ペニシリンを微生物由来のペニシリンアシラーゼで脱アシル化して工業生産されているのと同様、セファロスポリンアシラーゼを生産する微生物を見つけ、その酵素によりセファロスポリンＣを７−ＡＣＡに変換する酵素法の開発が長く検討されてきた。セファロスポリンＣを直接脱アシル化する酵素も見つかっているが、セファロスポリンＣを基質とした場合の活性は極めて低い。そこで、セファロスポリンＣを化学的にＧＬ−７−ＡＣＡに変換した後、セファロスポリンアシラーゼで７−ＡＣＡに脱アシル化する方法が１９７８年より工業化されていた（非特許文献１）。一方、最近工業化されたバイオプロセスでは（非特許文献２）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとセファロスポリンアシラーゼの２種類の酵素が利用されている。このプロセスにおいて、セファロスポリンＣはＤ−アミノ酸オキシダーゼによりケトアジポイル−７−ＡＣＡに変換された後、この反応で副生した過酸化水素により非酵素的にＧＬ−７−ＡＣＡに変換される。ついで、ＧＬ−７−ＡＣＡはセファロスポリンアシラーゼにより脱アシル化されて、７−ＡＣＡになる。これらいずれのプロセスでも、効率的な変換を触媒するセファロスポリンアシラーゼが重要であり、広範なスクリーニングが行われてきたが、この活性を持った微生物は、限られた種類の細菌にしか見つかっていない。
【０００５】
効率的な酵素法のために、多種多様な生物に存在し、セファロスポリンアシラーゼに代わって７−ＡＣＡ生成の反応を触媒する酵素が強く求められている。
【０００６】
他方、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）は、細菌、植物、動物などの広範囲な生物種において存在し、γ−グルタミル化合物のアミド基のＣ−Ｎ結合を加水分解する酵素として広く知られている。例えば、γ−グルタミルペプチド ＋ 水 → グルタミン酸 ＋ ペプチド の反応を触媒する。
【０００７】
しかしながら、今までのところ、ＧＧＴがＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性をもつことを示す報告は、全くなされていない。
【非特許文献１】都築勝沼、小松謙一、市川茂彰、渋谷友三． 酵素法による７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）製造技術の研究． 日本農芸化学会誌， ６３， １８４７−１８５３ （１９８９）．
【非特許文献２】A. Schmid, F. Hollmann, J. B. Park, and B. Buhler. The use of enzymes in the chemical industry in Europe. Current Opinion in Biotechnology, 13, 359-366 (2002).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴを製造する方法、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴ、該改変ＧＧＴをコードする核酸分子、及び該改変ＧＧＴを発現している細胞を提供することを目的とする。さらに、本発明は、上記ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴを用いてＧＬ−７−ＡＣＡを処理し、セファロスポリン系（セフェム系）抗生物質の原料となる７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）を生産する方法を提供することもさらなる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、セファロスポリン系抗生物質の原料となる７−ＡＣＡを、酵素法により効率的に生産する方法を開発すべく鋭意研究を行った。その結果、ＧＧＴにおいて、１）γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基、又は２）活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基、からなる群より選択される１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換することにより、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴを製造することに成功した。
【００１０】
これまで、ＧＧＴの遺伝子が同定されクローニングされている種としては、大腸菌（Escherichia coli K-12）、Bacillus subtilis、Bacillus natto、Helicobacter pylori 26695、Pseudomonas A14、Rat、Mouse、Pig、Humanがある。これらの種の間でアミノ酸配列が完全に保存されているのは、大腸菌のＧＧＴの５８０アミノ酸残基のうちの７６アミノ酸残基である。そこで、この７６アミノ酸残基について、ＧＧＴとクラスＩＶセファロスポリンアシラーゼとの間で配列を比較したところ、ＧＧＴの７６アミノ酸残基のうち、５８アミノ酸残基は、クラスＩＶセファロスポリンアシラーゼ（Y. Kim, K.-H. Yoon, Y. Khang, S. Turley, and W. G. J. Hol. The 2.0 A crystal structure of cephalosporin acylase. Structure, 8, 1059-1068 (2000).）でも保存されていることがわかった。ＧＧＴとクラスＩＶセファロスポリンアシラーゼとの間で相違する１８アミノ酸残基については、これまでに２つの菌株から見つかったクラスＩＶセファロスポリンアシラーゼの間では保存されていた（図１ａ〜１ｃ及び２を参照のこと）。しかしながら、大腸菌のＧＧＴは、ＧＬ−７−ＡＣＡの加水分解活性を有さず、一方、クラスＩＶセファロスポリンアシラーゼは、ＧＬ−７−ＡＣＡを加水分解する活性を有する。そこで、本発明者らは、ＧＧＴにおいて、生物種間で保存されているが、クラスＩＶセファロスポリンアシラーゼとの間では異なるアミノ酸残基に注目した。
【００１１】
大腸菌のＧＧＴの４３３番目の残基であるアスパラギン酸（Ａｓｐ−４３３）に相当するヒトのＧＧＴのアミノ酸残基（Ａｓｐ−４２３）は、γ−グルタミル化合物のα位のアミノ基と相互作用して安定化させていることが示唆されていた（N. Taniguchi, and Y. Ikeda. γ-Glutamyl transpeptidase: catalytic mechanism and gene expression. Ad
v. Enzymol. Rel. Areas Mol. Biol. 72, 239-278 (1998)）。この大腸菌ＧＧＴの４３３番目に相当するアミノ酸残基は、ＧＧＴ間では完全に保存されているがクラスＩＶセファロスポリンアシラーゼとの間で異なる１８アミノ酸残基のうちの一つであった。また、クラスＩＶセファロスポリンアシラーゼの基質であるＧＬ−７−ＡＣＡの７位の側鎖は、グルタリル基が７位のアミノ基にアミド結合した構造である。グルタリル基は、γ−グルタミル基のα位のアミノ基が脱アミノ化した構造である。
【００１２】
そこで、本発明者らは、ＧＧＴにγ−グルタミル化合物との相互作用が変化するような変異を導入することにより、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴを作製することができるという仮説をたてた。この仮説に基づき、本発明者らは、γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換した改変ＧＧＴを作製したところ、該改変ＧＧＴは、改変前より有意に高いＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性を有していた。驚くべきことに、この改変ＧＧＴは、従来のセファロスポリンアシラーゼよりも、ＧＬ−７−ＡＣＡに対して、低いＫｍ値を有し、高い基質特異性を示していた。
【００１３】
また、大腸菌ＧＧＴの３９１番目のスレオニン残基に相当するアミノ酸残基が活性に必須なアミノ酸残基の一つであるということが、本発明者らによってすでに明らかにされていた。そこで、本発明者らは、ＧＧＴの活性中心周辺領域（例えば、大腸菌ＧＧＴの３９１番目のスレオニン残基に相当するアミノ酸残基の周辺領域）に変異を導入することにより、活性中心周辺領域のコンフォメーションが変化し、活性中心がＧＬ−７−ＡＣＡの７位炭素の隣のアミド結合に接近し、アミド結合を加水分解するという仮説をたてた。この仮説に基づき、ＧＧＴの活性中心周辺領域に変異を導入すれば、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性の増強された改変ＧＧＴが得られ得る。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の事項に関する。
項１．
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）において、
１）γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基、又は
２）活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基、
からなる群より選択される１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴの製造方法。
項２．
ＧＧＴにおいて、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第５０〜７８残基、第９３〜９８残基、第１１４〜１２５残基、第１４７〜１８８残基、第２０９〜３４７残基、第３９１〜４３４残基、第４５２〜４８７残基及び第５０８〜５６９残基の領域から選択される１又はそれ以上の領域に相当する領域において、１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、項１に記載の方法。
項３．
ＧＧＴにおいて、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第１６残基、第９４残基、第９８残基、第１１４残基、第１１５残基、第２０９残基、第２２７残基、第２４２残基、第２６３残基、第３３４残基、第３４２残基、第４３３残基、 第４５２残基、第４６０残基、第４６１残基、第４６２残基、第４６８残基、第４８４残基から選択される１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、項１に記載の方法。
項４．
ＧＧＴにおいて、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第４３３残基に相当するアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．
前記他のアミノ酸残基が、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンからなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸残基である、項４に記載の方法。
項６．
前記他のアミノ酸残基がアスパラギンである、項５に記載の方法。
項７．
項１〜６のいずれかに記載の方法により取得された改変ＧＧＴ。
項８．
項７に記載の改変ＧＧＴをコードする核酸分子。
項９．
項７に記載の改変ＧＧＴを発現している細胞。
項１０．
項７に記載の改変ＧＧＴでＧＬ−７−ＡＣＡを処理する工程を包含する、７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）の製造方法。
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１６】
本発明におけるＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性は、特に記載しない限り、ＧＬ−７−ＡＣＡの７位の側鎖のアミド結合を加水分解する活性を意味する。
【００１７】
改変前の「γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）」は、任意の生物由来の、天然に存在するＧＧＴ及び非天然のＧＧＴ（人工的に合成されたＧＧＴ、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性以外の性質（例えば、熱安定性など）の改良を目的として改変されたＧＧＴを含む）を包含する。また、ＧＧＴ全長ではなく、Ｎ末端欠失型、Ｃ末端欠失型、Ｎ及びＣ末端欠失型のＧＧＴも同様に用いられる。Ｎ末端欠失型ＧＧＴとしては、例えば、大腸菌の１〜３４番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が欠失したＧＧＴが例示できる。Ｃ末端欠失型ＧＧＴとしては、例えば、大腸菌の５７２〜５８０番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が欠失したＧＧＴが例示できる。Ｎ及びＣ末端欠失型としては、例えば、大腸菌の１〜３４及び５７２〜５８０番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が欠失したＧＧＴが例示できる。
【００１８】
ＧＧＴの由来となる任意の生物としては、細菌（例えば、大腸菌、枯草菌、納豆菌、スードモナス（Pseudomonas）、ピロリ菌等）、動物（例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ブタ、ウサギ、ハムスター等）、昆虫（例えば、カイコ）、植物（例えば、インゲンマメ等）、藍藻（例えば、アオコ、スイセンジノリ、ユレモ、ネンジュモ等）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属等）が挙げられる（これらに限定されない）。
【００１９】
「γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基」としては、γ−グルタミル化合物に相互作用するアミノ酸残基であれば、いかなる残基でもよい。このようなアミノ酸残基としては、例えば、γ−グルタミル化合物のα位のアミノ基（−ＮＨ2、−ＮＨ3+）、α位のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯ-基）、β位及び／又はγ位のメチレン基（ＣＨ2基）と相互作用するアミノ酸残基が挙げられる。相互作用は、当業者が通常認識し得るような作用であり、例えば、イオン結合、水素結合、静電的相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等である。
【００２０】
γ−グルタミル化合物のα位のアミノ基と相互作用するアミノ酸残基としては、アミノ基と相互作用し得るアミノ酸残基であればいかなるアミノ酸残基であってもよいが、好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、システイン、グルタミン、アスパラギン、チロシンが例示できる（これらに限定されない）。
【００２１】
γ−グルタミル化合物のα位のカルボキシル基と相互作用するアミノ酸残基としては、カルボキシル基と相互作用し得るアミノ酸残基であればいかなるアミノ酸残基であってもよいが、好ましくは、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、セリン、システイン、スレオニンが例示できる（これらに限定されない）。
【００２２】
γ−グルタミル化合物のβ位及び／又はγ位のメチレン基（ＣＨ2基）と相互作用するアミノ酸残基としては、メチレン基と相互作用し得るアミノ酸残基であれば、いかなるアミノ酸残基であってもよいが、好ましくはフェニルアラニン、アラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリンが例示できる（これらに限定されない）。
【００２３】
「活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基」としては、活性中心及び活性中心と二次元及び三次元的に近いアミノ酸残基であればいかなるアミノ酸残基であってもよい。このような活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基として、例えば、大腸菌のＧＧＴの３９１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基の周辺の領域におけるアミノ酸残基が挙げられる。
【００２４】
従って、「γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基、又は活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基」としては、例えば、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第５０〜７８残基、第９３〜９８残基、第１１４〜１２５残基、第１４７〜１８８残基、第２０９〜３４７残基、第３９１〜４３４残基、第４５２〜４８７残基及び第５０８〜５６９残基の領域から選択される１又はそれ以上の領域に相当するＧＧＴの領域におけるアミノ酸残基が挙げられる。γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基の一つである大腸菌ＧＧＴのＡｓｐ−４３３ に相当するＧＧＴのアミノ酸残基や、ＧＧＴ活性の活性中心に存在するアミノ酸残基の一つである大腸菌ＧＧＴのＴｈｒ−３９１ に相当するＧＧＴのアミノ酸残基は、これらの領域内に存在している。
本発明の１つの好ましい実施形態において、本発明に従って置換されるアミノ酸残基は、ＧＧＴにおいて、生物種間で保存され且つクラスＩＶセファロスポリンアシラーゼとの間で保存されていないアミノ酸残基である。かかるアミノ酸残基は、例えば、大腸菌のＡｓｐ−４３３、Ｌｅｕ−１６、Ｇｌｙ−９４、Ｐｈｅ−９８、Ａｒｇ−１１４、Ｇｌｕ−１１５、Ｐｈｅ−２０９、Ｌｅｕ−２２７、Ｐｈｅ−２４２、Ｔｈｒ−２６３、Ｔｙｒ−３３４、Ｇｌｙ−３４２、 Ａｓｎ−４５２、Ｐｒｏ−４６０、Ｌｅｕ−４６１、Ｓｅｒ−４６２、Ｉｌｅ−４６８、Ｇｌｙ−４８４に相当するアミノ酸残基である。
【００２５】
置換後の「他のアミノ酸残基」は、置換前のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基であれば、いかなるアミノ酸であってもよい。好ましくは、置換前のアミノ酸残基と異なる性質（例えば、側鎖の、酸性／中性／塩基性、親水性／疎水性、嵩高さ等）をもつアミノ酸残基である。例えば、置換前のアミノ酸残基が酸性である場合、他のアミノ酸残基は塩基性又は中性であり、置換前のアミノ酸残基が塩基性である場合、他のアミノ酸残基は酸性又は中性であり、置換前のアミノ酸残基が中性である場合、他のアミノ酸残基は塩基性又は酸性のアミノ酸残基である。また、例えば、置換前のアミノ酸が疎水性である場合、他のアミノ酸残基は親水性であり、置換前のアミノ酸が親水性である場合、他のアミノ酸残基は疎水性である。例えば、大腸菌のＧＧＴの４３３番目のアスパラギン酸に相当するＧＧＴのアミノ酸残基を置換する場合、他のアミノ酸残基は、例えば、アスパラギン、グルタミン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、グルタミン酸、システイン、アルギニン、リジン、スレオニン、セリン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン（これらに限定されない）であり、好ましくは、アスパラギン、チロシン、グルタミン、トリプトファン、フェニルアラニンであり、より好ましくは、アスパラギン、チロシンであり、特に好ましくはアスパラギンである。
本発明の１つの好ましい実施形態において、他のアミノ酸残基は、図１a〜c中のＧＧＴのアミノ酸配列において下線が引かれているアミノ酸残基に対応するクラスIV セファロスポリンアシラーゼのアミノ酸残基である。
【００２６】
「グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された（される）」とは、前述のような置換によって、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性がいくらか増加した（高められた）ことを意味する。また、置換前のＧＧＴがＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性を有していなくても、有していてもよい。活性が増強された量（増加量）は、少しでも増加していれば、特に限定されず、例えば、０．０００１Ｕ／ｍｇ以上の増加量である。
【００２７】
「改変ＧＧＴ」とは、本発明の方法に従って製造された、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強されたＧＧＴの改変ペプチド及び／又は改変タンパク質を意味する。
「改変ＧＧＴをコードする核酸分子」とは、改変ＧＧＴと同じアミノ酸配列へ転写・翻訳されるＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子を意味する。なお、改変ＧＧＴをコードする核酸分子は、改変ＧＧＴを正しくコードしている限り、いかなるコドンを選択してもよい。コドンの選択は、常法に従って行うことができる。例えば、利用する宿主のコドンの使用頻度などを考慮し決定することができる。
【００２８】
「改変ＧＧＴを発現している細胞」とは、該改変ＧＧＴを発現している細胞（改変ＧＧＴをコードする核酸分子で形質転換された細胞を含む）であれば、いかなる細胞であってもよい。かかる細胞の種は、いかなる種であってもよいが、ＧＧＴの由来の種と同じであることが好ましい。
【００２９】
上述のような「改変ＧＧＴをコードする核酸分子」、「改変ＧＧＴ」及び「改変ＧＧＴを発現している細胞」は、常法に従って、取得することができる。
【００３０】
改変ＧＧＴをコードする核酸分子は、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法、ＡｌｔｅｒｅｄＳｉｔｅ法、ＰＣＲ法、Ｉｔｏ法などの変異導入法により、取得することができる。なお、これらの変異導入法を行うときに使用するプライマーは、採用する変異導入方法や改変ＧＧＴをコードする核酸分子の配列情報に基づいて、適宜設計でき、常法に従って合成できる。
【００３１】
取得した核酸分子の単離及び精製は、例えば、H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K-12 ggt and rapid isolation of γ-glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988)に記載される方法、ゲル電気泳動による分離精製又は分子ふるい操作などの通常用いられる方法によって、行うことができる。
【００３２】
また、上記のように得られた核酸分子は、必要に応じて、例えば、ジデオキシ法やマキサム−ギルバート法などに従って、又は市販のシークエンスキットなどを用いて、配列が決定される。
【００３３】
「改変ＧＧＴ」及び「改変ＧＧＴを発現している細胞」の取得については、前述ように取得された改変ＧＧＴをコードする核酸分子を用いて、常法の遺伝子組換技術に従って行うことができる（Sambrook, J., Frisch, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989 Current Protocls in Molecular Biology. John Wiley Sons, Inc. 1998. など）。簡潔には、例えば、改変ＧＧＴをコードする核酸分子を適当な発現ベクターへ挿入した後、これを適当な宿主細胞へ導入して形質転換し、適切な条件下において改変ＧＧＴを発現させることにより、改変ＧＧＴを発現している細胞を取得することができる。さらに、この改変ＧＧＴを発現している細胞から、改変ＧＧＴを回収することができる。この回収した改変ＧＧＴを、文献（H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K-12 ggt and rapid isolation of γ-glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988)）に記載の方法又は常法に従って、さらに精製してもよい。
【００３４】
ここで、発現プラスミドを宿主細胞へ導入する方法は、特に限定されず、一般的な方法を採用することができる。例えば、エレクトロポレーション、リポソーム法、リン酸カルシュウム法、ＤＥＡＥデキストラン法などを用いることができる。また、各ステップにおいて、目的物を選別する必要がある場合、適宜、サブクローニング操作やシークエンシングなどを行ってもよい。
【００３５】
発現プラスミドを導入するための宿主細胞としては、あらゆる種の原核生物及び真核生物の細胞（樹立細胞を含む）を使用することができる。
【００３６】
原核生物細胞としては、例えば、大腸菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、納豆菌、スードモナス、ピロリ菌又は藍藻（これらに限定されない）の細胞が挙げられる。大腸菌の細胞としては、例えば、Ｋ１２株、Ｂ株、ＳＨ６４１株、ＣＭ９株、ＳＨ７０３株に分類される細胞株（これらに限定されない）が好適である。また、枯草菌の細胞としては、とりわけＭＨ２３０８株（これらに限定されない）が好適である。
【００３７】
真核生物細胞としては、例えば、動物由来細胞（例えば、ヒト、ラット、マウス由来細胞）、昆虫由来細胞（例えば、カイコ由来細胞）、植物由来細胞（例えば、インゲンマメ由来細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。動物由来の樹立細胞としては、具体的には、サルの腎臓細胞であるＣＯＳ細胞（Cell, 23: 175 (1981)）、Ｖｅｒｏ細胞及びＭＫ細胞、チャイニーズハムスターの卵巣細胞であるＣＨＯ細胞、マウスの線維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞（J.Viol., 4:549(1969)）、及びヒトのＴ細胞リンパ腫由来細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞（J.Immunol., 133:123(1984)）などが挙げられる。酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）もまた、好適に利用される。
【００３８】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に改変ＧＧＴをコードする核酸分子、該核酸分子の上流にプロモーター、ＳＤ（シャイン−ダルガーノ）配列、及び必要に応じて開始コドン（例えば、ＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを、好適に利用することができる。
【００３９】
上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９がよく用いられるが、これらに限定されず、既知の各種ベクターを用いることができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−Ｐ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＥＴ２１、ｐＥＴ２１／ｌａｃＩq（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（これらに限定されない）を例示できる。
【００４０】
プロモーターについても特に限定はなく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ／ＰＲ プロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター（これらに限定されない）などを好ましく利用できる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌である場合は、ＳＰ０１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。
【００４１】
真核生物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする核酸分子の上流にプロモーター、ＲＮＡのスプライシング部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列を保有し、更に必要に応じて複製起点を有するものが挙げられる。該発現ベクターの例としては、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)）（これらに限定されない）が例示できる。上記以外にも既知の各種市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系の場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社） 、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＥＦ１／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの動物細胞用ベクター、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ（ＧｉｂｃｉＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの昆虫細胞用ベクター（これらに限定されない）が挙げられる。
【００４２】
また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０ 由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインのプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーター、アデノウイルスプロモーター、エロンゲーションファクターのプロモーター（これらに限定されない）を例示できる。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えば、ｐＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター（これらに限定されない）を好適に利用できる。
【００４３】
このように取得された改変ＧＧＴの精製は、本発明者らが、既に報告した方法（H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K-12 ggt and rapid isolation of γ-glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988)）又は常法に従って、行うことができる。
【００４４】
さらに、本発明の改変ＧＧＴでＧＬ−７−ＡＣＡを処理し、７−ＡＣＡを製造することができる。
【００４５】
ＧＬ−７−ＡＣＡの合成については、例えば、Y. Shibuya, K. Matsumoto, and T. Fujii. Isolation and properties of 7β-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid acylase-producing bacteria. Agric. Biol. Chem., 45, 1561-1567 (1981)に従って、行うことができる。
【００４６】
処理は、常法を用いて（例えば、インキュベーションによって）行う。例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（例えば、ｐＨ７．６〜９．０）中で、改変ＧＧＴ及びＧＬ−７−ＡＣＡを、３７℃にて、３時間、インキュベーションする。この処理によって、該ＧＬ−７−ＡＣＡが７−ＡＣＡに変換される。
【００４７】
ＧＬ−７−ＡＣＡと７−ＡＣＡの測定は、例えば、逆相ＨＰＬＣ、アミノ酸アナライザーなどの慣例的な方法に従う。
【００４８】
さらに必要に応じて、７−ＡＣＡは、分離及び精製される。この分離及び精製は、例えば、DOWEX 1X8および逆相HPLC等によって行う。
【発明の効果】
【００４９】
本発明により、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴを製造することが可能になった。また、本発明により製造された改変ＧＧＴのＧＬ−７−ＡＣＡに対するＫｍ値は、従来のセファロスポリンアシラーゼに比べて小さく、本発明の改変ＧＧＴは、ＧＬ−７−ＡＣＡに対して優れた基質特異性を有している。
【００５０】
さらに、本発明により、７−ＡＣＡの効率的な酵素的製造方法が提供され、従来の化学法よりも安全、簡便、低コスト、且つ環境に優しく、セファロスポリン系（セフェム系）抗生物質の原料である７−ＡＣＡを生産することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１ａ】ＧＧＴ及びクラスIV セファロスポリンアシラーゼの全配列のアラインメントを図１ａ〜図１ｃに示す。各配列は、SwissProt又はGenBankより入手可能である。上から、Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylase（SwissProt Accession No. P15557：配列番号１９）、Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylase（SwissProt Accession No. Q05053：配列番号２１）、Escherichia coli K-12 GGT（SwissProt Accession No. P18956：配列番号１）、Bacillus subtilis 168 GGT（SwissProt Accession No. P54422：配列番号３）、Bacillus natto GGT（GenBank Accession No. 2321184A：配列番号５）、Helicobacter pylori 26695 GGT（GenBank Accession No. AE000618：配列番号７）、Pseudomonas A14 GGT（SwissProt Accession No. P36267：配列番号９）、Rat GGT（SwissProt Accession No. P07314：配列番号１１）、Mouse GGT（SwissProt Accession No. Q60928：配列番号１３）、Pig GGT（SwissProt Accession No. P20735：配列番号１５）、Human GGT1（SwissProt Accession No. P19440：配列番号１７）の配列である。下線を引いた斜体で表された残基は、すべてのGGTで保存されているがクラスIV セファロスポリンアシラーゼでは異なっているGGTの箇所を示している。斜体（下線無し）の残基は、すべてのGGT及びクラスIVセファロスポリンアシラーゼで保存されている残基を示した。図１ａは、前記アラインメントの一部を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、図１ａに示したアラインメントの続きである。
【図１ｃ】図１ｃは、図１ｂに示したアラインメントの続きである。
【図２】図２は、ＧＧＴ間でよく保存されている領域の一つである、大腸菌のＧＧＴの活性中心であるＴｈｒ−３９１から今回変異をかけたＡｓｐ−４３３付近のアラインメントを示す。各配列は、SwissProt又はGenBankより入手可能な前記配列（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１）の部分配列である。上から順に、Escherichia coli K-12 GGT（配列番号２４）、Bacillus subtilis 168 GGT（配列番号２５）、Bacillus natto GGT（配列番号２６）、Helicobacter pylori 26695 GGT（配列番号２７）、Pseudomonas A14 GGT（配列番号２８）、Rat GGT（配列番号２９）、Mouse GGT（配列番号３０）、Pig GGT（配列番号３１）、Human GGT1（配列番号３２）、Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylase（配列番号３３）、Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylase（配列番号３４）のアミノ酸配列である。すべてのGGTで保存されている残基を斜体（下線無し）で示した。下線を引いた斜体の文字は、すべてのGGTでAsp残基として保存されているが、クラスIV セファロスポリンアシラーゼではAsn残基となっているＧＧＴの箇所を示している。アラインメントの左右に示した数字は、この図の左端、右端の残基がそれぞれのN末端から何番目の残基であるかを示している。
【図３】図３は、酵素反応のＨＰＬＣのチャートを示す。反応混合液（２ｍＭ ＧＬ−７−ＡＣＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７３）、０．１ｍｇ／ｍｌ Ｄ４３３Ｎ）を、３７℃でインキュベーションすることによって、反応を行った。（Ａ）は反応０時間、（Ｂ）は反応３時間のサンプルである。
【図４】図４は、Ｄ４４３ＮのＧＬ−７−ＡＣＡ加水分解反応の至適ｐＨを検討した結果を示す。緩衝液は、ｐＨ６．５〜７．５ではリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ ７．５〜８．７３ではＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．７３〜１０．５ではＮＨ4Ｃｌ−ＮＨ4ＯＨ緩衝液を用いた。
【図５】図５は、ＮＭＲの結果を示す。(A)は市販品のGL-7-ACA、 (B)はこの実施例で得られた標品のNMRのチャートである。
【図６】図６は、実施例１〜２５において取得される各種改変ＧＧＴを示す。大腸菌の改変ＧＧＴに相当する、Bacillus subtilis 168（B. subtilis）、Bacillus natto（B. natto）、Helicobacter pylori 26695（H. pylori）、Pseudomonas A14（Pseudo）、rat、mouse、pig、humanの改変ＧＧＴを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
以下に実施例を示すが、これは、本発明の単なる例示であって、本発明を何ら制限するものではない。なお、以下の実施例では大腸菌のＧＧＴを用いているが、ＧＧＴのアミノ酸配列は大腸菌と他の生物種との間でよく保存されており、大腸菌以外の様々な生物種においても本発明を同様に実施できる。
【００５３】
ここで、本願の特許請求の範囲、明細書及び図面に記載されるアミノ酸、タンパク質、塩基配列、核酸等の略語による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００５４】
また、配列表に記載の各配列については、以下の通りである；
配列番号１：Escherichia coli K-12 GGTのアミノ酸配列
配列番号２：Escherichia coli K-12 GGTの核酸配列
配列番号３：Bacillus subtilis 168 GGTのアミノ酸配列
配列番号４：Bacillus subtilis 168 GGTの核酸配列
配列番号５：Bacillus natto GGTのアミノ酸配列
配列番号６：Bacillus natto GGTの核酸配列
配列番号７：Helicobacter pylori 26695 GGTのアミノ酸配列
配列番号８：Helicobacter pylori 26695 GGTの核酸配列
配列番号９：Pseudomonas A14 GGTのアミノ酸配列
配列番号１０：Pseudomonas A14 GGTの核酸配列
配列番号１１：Rat GGTのアミノ酸配列
配列番号１２：Rat GGTの核酸配列
配列番号１３：Mouse GGTのアミノ酸配列
配列番号１４：Mouse GGTの核酸配列
配列番号１５：Pig GGTのアミノ酸配列
配列番号１６：Pig GGTの核酸配列
配列番号１７：Human GGT1のアミノ酸配列
配列番号１８：Human GGT1の核酸配列
配列番号１９：Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylaseのアミノ酸配列
配列番号２０：Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylaseの核酸配列
配列番号２１：Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylaseのアミノ酸配列
配列番号２２：Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylaseの核酸配列
配列番号２３：実施例１で変異株を取得するために用いたプライマーの核酸配列
配列番号２４：図２に示される、Escherichia coli K-12 GGTの部分アミノ酸配列
配列番号２５：図２に示される、Bacillus subtilis 168 GGTの部分アミノ酸配列
配列番号２６：図２に示される、Bacillus natto GGTの部分アミノ酸配列
配列番号２７：図２に示される、Helicobacter pylori 26695 GGTの部分アミノ酸配列
配列番号２８：図２に示される、Pseudomonas A14 GGTの部分アミノ酸配列
配列番号２９：図２に示される、Rat GGTの部分アミノ酸配列
配列番号３０：図２に示される、Mouse GGTの部分アミノ酸配列
配列番号３１：図２に示される、Pig GGTの部分アミノ酸配列
配列番号３２：図２に示される、Human GGT1の部分アミノ酸配列
配列番号３３：図２に示される、Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylaseの部分アミノ酸配列
配列番号３４：図２に示される、Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylaseの部分アミノ酸配列。
実施例１
【００５５】
変異株の取得方法
１．野生型ＧＧＴへのＤ４３３Ｎ変異の導入
まず、ＧＧＴのアミノ酸配列の中でＡｓｐ−４３３をＡｓｎ−４３３に変えるように設計した合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡＴＡ*ＡＴＴＴＣＴＣＣＧＣＣ−３’（Ａ*は、野生型ＧＧＴではＧである）（配列番号２３）をプライマーとし、デオキシウラシルを導入した１本鎖のｐＳＨ１２４８（ｐＴＺ１８ＲのＨｉｎｄＩＩＩサイトにｐＳＨ２５３（J. O. Claudio, H. Suzuki, H. Kumagai, and T. Tochikura. Excretion and rapid purification of γ-glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K-12. J. Ferment. Bioeng., 72, 125-127 (1991).）の約0.9 kbのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを挿入したもの）を鋳型としてＫｕｎｋｅｌ法（T. A. Kunkel. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488-492 (1985).）により変異操作を行い、ＤＨ５α株を形質転換した。得られた菌株からプラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンスを行い、２株で目的の変異が入っていることを確認し、その１つのプラスミドをｐＣＭ２とした。ｐＣＭ２の約０．９kbのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとｐＳＨ２５３をＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる５．４ ｋｂのフラグメントをライゲーションし、ｐＣＭ３を得た。
【００５６】
ｐＣＭ３の３．２ ｋｂのＳｍａＩ−ＳｐｈＩフラグメントをＥｃｏＲＶとＳｐｈＩで切断したｐＢＲ３２２にライゲーションした。得られたプラスミドｐＣＭ７で、ＧＧＴ欠損株ＳＨ６４１を形質転換したものをＣＭ９（Ｄ４３３Ｎ）株とした（H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K-12 ggt and rapid isolation of γ-glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988).）。
実施例２
【００５７】
酵素の精製
野生型と変異型（Ｄ４３３Ｎ）の酵素はすでに報告している方法に従ってそれぞれＳＨ６４２株とＣＭ９株から精製した（H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K-12 ggt and rapid isolation of γ-glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988)）。
実施例３
【００５８】
ＧＬ−７−ＡＣＡを基質としたときのＤ４３３Ｎの加水分解活性
１．基質ＧＬ−７−ＡＣＡの合成法
基質ＧＬ−７−ＡＣＡの合成法を行うにあたり、Y. Shibuya, K. Matsumoto, and T. Fujii. Isolation and properties of 7β-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid acylase-producing bacteria. Agric. Biol. Chem., 45, 1561-1567 (1981)を参照した。反応液の組成は、以下の表１に示すとおりである。
【００５９】
【表１】
Ａ液をＢ液に加え、ＮａＯＨでｐＨを９．０に保ちながら、室温で３時間混合した。ロータリーエバポレーターでアセトンを蒸発させ、濃縮した。濃塩酸でｐＨを１．５に調整後、酢酸エチルを加え、分液ろ斗を用いて、酢酸エチル層を抽出した。水層に残った分を再び酢酸エチルで抽出した。ロータリーエバポレ−ターで酢酸エチルを蒸発させ、乾燥させた。再び酢酸エチルを加えて溶解し、ろ過した。ろ液をロータリーエバポレーターで乾燥させた。
【００６０】
本法により、収率８０％で、ＧＬ−７−ＡＣＡが得られた。得られたＧＬ−７−ＡＣＡ標品は1Ｈ−ＮＭＲにより、ＧＬ−７−ＡＣＡであることを確認した。
【００６１】
２．ＧＬ−７−ＡＣＡを基質としたときの酵素反応（加水分解反応）条件
反応液組成は、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．７３）、０．２〜２ ｍＭ ＧＬ−７−ＡＣＡ、０．０４〜１ ｍｇ／ｍｌ Ｄ４３３Ｎ酵素とし、３７℃で反応した。酵素溶液を反応液に加えることにより反応を開始した。経時的にサンプリング（２００μｌ）を行い、等量の３．５ Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨを加えてボルテクスすることにより反応を停止し、メンブレンフィルターでろ過した。
【００６２】
３．ＧＬ−７−ＡＣＡと７−ＡＣＡの測定法
反応液中のＧＬ−７−ＡＣＡと７−ＡＣＡの濃度は逆相ＨＰＬＣにより測定した。Ｉｎｅｒｓｉｌ ＯＤＳ−３ カラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ４．６ ｘ ２５０ ｍｍ）を装着したＨＰＬＣ（島津製作所、ＬＣ−１０）に通常５０μｌのサンプルをインジェクトし、２８０ ｎｍの吸収を測定した。移動相Ａは０．０５％のトリフルオロ酢酸水溶液、移動相Ｂは０．０５％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルとした。０〜２５分でＢの割合を０〜５０％（リニアグラジエント）、２５〜３４分はＢの割合を５０％、３４〜３５分でＢの割合を５０〜０％（リニアグラジエント）、３５〜５０分はＢの割合を０％、流速１ ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。
【００６３】
ＧＬ−７−ＡＣＡと７−ＡＣＡの溶出位置と濃度の計算には、上記のように生成したＧＬ−７−ＡＣＡと市販の７−ＡＣＡ （Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ． Ｃｏ．）を標準品として用いた。
実施例４
【００６４】
酵素反応液のＨＰＬＣのチャート
酵素反応液のＨＰＬＣのチャートを図３に示す。
実施例５
【００６５】
ＧＬ−７−ＡＣＡを基質としたときの反応（加水分解反応）の至適ｐＨ
反応液組成は、５０ ｍＭ緩衝液、２ ｍＭ ＧＬ−７−ＡＣＡ、１．０４ ｍｇ／ｍｌ酵素とし、３７℃で３時間反応した。１００℃で１分間煮沸することにより反応を停止させた後、メンブレンフィルターでろ過した。加水分解反応の至適ｐＨについて検討した結果を図４に示す。
実施例６
【００６６】
１．Ｄ４３３Ｎとの反応によりＧＬ−７−ＡＣＡから生成したものが７−ＡＣＡであることの確認
ここまで、Ｄ４３３ＮによるＧＬ−７−ＡＣＡから７−ＡＣＡへの加水分解反応は、逆相ＨＰＬＣでのリテンションタイムが市販の７−ＡＣＡと一致するピークが、７−ＡＣＡのピークであるという前提にたって行ってきた。しかし、本当にこのピークが７−ＡＣＡであるかどうかについては確認していなかった。そこで、市販の７−ＡＣＡと一致するリテンションタイムを示したものを大量に精製し、ＮＭＲ分析によりそのものが７−ＡＣＡであり、Ｄ４３３ＮによりＧＬ−７−ＡＣＡから７−ＡＣＡが生成したことを確認した。
【００６７】
反応条件
５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．７３）、２ ｍＭ ＧＬ−７−ＡＣＡ、３０．９ ｍｕ／ｍｌ （γ−ＧｐＮＡを基質とした場合の加水分解活性で）Ｄ４３３Ｎ酵素とし、全量７３０ ｍｌ、３７℃で反応した。
【００６８】
７−ＡＣＡの精製条件
７−ＡＣＡの精製には、ＤＯＷＥＸ １Ｘ８カラム（３０ ｍｌカラム）を用いた。
【００６９】
＜カラムの準備＞
２Ｎ ＮａＯＨ をカラム体積の５倍量流した。次に、蒸留水をカラム体積の５倍量流した（カラムからの流出液のｐＨが水のｐＨに等しくなるまで）。さらに、０．５Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨをカラム体積の５倍量流した。次いで、蒸留水をカラム体積の５倍量流した（カラムからの流出液のｐＨが水のｐＨに等しくなるまで）。
【００７０】
＜サンプルのアプライ＞
サンプルをアプライした。
【００７１】
＜溶出＞
蒸留水、０．０１Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨ、０．０５Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨ、０．１Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨ、０．５Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨ、１Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨ、５Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨの順番で、各々、カラム体積の５倍量流した。７−ＡＣＡは０．５Ｎ ＣＨ3ＣＯＯＨで溶出した。
【００７２】
＜確認＞
ニンヒドリン反応により、生成物の溶出箇所を確認した。具体的には、溶出した各フラクションをろ紙に２０μｌスポットし、乾燥させた後、上からニンヒドリン溶液を散布し、乾燥させたのち、ニンヒドリン反応を観察した。
【００７３】
＜ＨＰＬＣによる確認＞
呈色したフラクションをＨＰＬＣにかけ、市販品の７−ＡＣＡの溶出位置と一致することを確認した。収量１８．４ ｍｇであった。
【００７４】
凍結乾燥
ＤＯＷＥＸ １Ｘ８カラムにより溶出された生成物（７−ＡＣＡ）のフラクションを−８０℃のディープフリーザー内で凍結させた後、凍結乾燥機により乾燥させた。
【００７５】
ＨＰＬＣによる精製
凍結乾燥させたサンプルを蒸留水に溶かし、逆相ＨＰＬＣにより精製した。使用カラムは、ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ３８１５０−４１ Ｓｉｚｅ ２０×２５０ｍｍであり、インジェクト量は、５００μｌである。７−ＡＣＡの画分を凍結乾燥した。
【００７６】
ＮＭＲの結果
ＮＭＲの結果を、図５に示す。この結果から、精製したものは７−ＡＣＡであることが確認できた。
【００７７】
２．比活性、Ｋｍ値、ｋｃａｔ値
Ｄ４３３ＮのＧＬ−７−ＡＣＡを基質とした場合のＫｍ値を求めた。結果を以下に示す。
Ｋｍ ： ０．１０８ （ｍＭ）
実施例７〜２５
【００７８】
実施例１〜６に従って、図６に記載の改変ＧＧＴを作製し、そのＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性を測定する。このように作製された改変ＧＧＴは、大腸菌ＧＧＴ（Ｄ４３３Ｎ）と同様に、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性を有し得る。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明により、広く生物界に存在する酵素である γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）を原料として用い、該ＧＧＴのアミノ酸残基を置換することにより、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ活性が増強された改変ペプチド（即ち、改変ＧＧＴ）を製造することが可能になった。素晴らしいことに、本発明の改変ＧＧＴは、ＧＬ−７−ＡＣＡに対して、小さいＫｍ値を有し、優れた基質特異性を有する。
【００８０】
さらに、本発明により、７−ＡＣＡの効率的な酵素法が提供され、従来の化学法よりも安全、簡便、低コスト、短時間、且つ環境に優しく、セファロスポリン系（セフェム系）抗生物質の原料である７−ＡＣＡを生産することが可能になった。セファロスポリン系（セフェム系）抗生物質は、非常に需要の大きい医薬品の一つであるため、本発明が医薬品業界に与える利益は大きい。
【００８１】
また、本発明は、生物界に広く分布している酵素を利用してＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼの新しいソースを提供しており、今後、本発明に基づいて、多種多様な生物種のGGTを用いて、抗生物質の酵素的製造方法についての研究が盛んになされるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）において、
１）γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基、又は
２）活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基、
からなる群より選択される１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴの製造方法。
【請求項２】
ＧＧＴにおいて、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第５０〜７８残基、第９３〜９８残基、第１１４〜１２５残基、第１４７〜１８８残基、第２０９〜３４７残基、第３９１〜４３４残基、第４５２〜４８７残基及び第５０８〜５６９残基の領域から選択される１又はそれ以上の領域に相当する領域において、１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＧＴにおいて、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第１６残基、第９４残基、第９８残基、第１１４残基、第１１５残基、第２０９残基、第２２７残基、第２４２残基、第２６３残基、第３３４残基、第３４２残基、第４３３残基、 第４５２残基、第４６０残基、第４６１残基、第４６２残基、第４６８残基、第４８４残基から選択される１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＧＧＴにおいて、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第４３３残基に相当するアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記他のアミノ酸残基が、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンからなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸残基である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記他のアミノ酸残基がアスパラギンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法により取得された改変ＧＧＴ。
【請求項８】
請求項７に記載の改変ＧＧＴをコードする核酸分子。
【請求項９】
請求項７に記載の改変ＧＧＴを発現している細胞。
【請求項１０】
請求項７に記載の改変ＧＧＴでＧＬ−７−ＡＣＡを処理する工程を包含する、７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）の製造方法。
【請求項１】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）において、
１）γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基、又は
２）活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基、
からなる群より選択される１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴの製造方法。
【請求項２】
ＧＧＴにおいて、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第５０〜７８残基、第９３〜９８残基、第１１４〜１２５残基、第１４７〜１８８残基、第２０９〜３４７残基、第３９１〜４３４残基、第４５２〜４８７残基及び第５０８〜５６９残基の領域から選択される１又はそれ以上の領域に相当する領域において、１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＧＴにおいて、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第１６残基、第９４残基、第９８残基、第１１４残基、第１１５残基、第２０９残基、第２２７残基、第２４２残基、第２６３残基、第３３４残基、第３４２残基、第４３３残基、 第４５２残基、第４６０残基、第４６１残基、第４６２残基、第４６８残基、第４８４残基から選択される１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＧＧＴにおいて、配列番号１で表わされる大腸菌由来のＧＧＴのアミノ酸配列の第４３３残基に相当するアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記他のアミノ酸残基が、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンからなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸残基である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記他のアミノ酸残基がアスパラギンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法により取得された改変ＧＧＴ。
【請求項８】
請求項７に記載の改変ＧＧＴをコードする核酸分子。
【請求項９】
請求項７に記載の改変ＧＧＴを発現している細胞。
【請求項１０】
請求項７に記載の改変ＧＧＴでＧＬ−７−ＡＣＡを処理する工程を包含する、７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）の製造方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７５６５２
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【発行日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１７７１４（Ｐ２００５−５１７７１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００１５３３
【国際出願日】平成１７年２月２日（２００５．２．２）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【発行日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００１５３３
【国際出願日】平成１７年２月２日（２００５．２．２）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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