グルテン摂取に関連する障害を有する個々の患者の健康向上のための微生物
本発明は、食物アレルギー、具体的にはセリアック病の治療のための微生物、および該微生物を選別するための方法に関する。この微生物の作用機構には（ｉ）自然免疫および適応免疫応答の制御、（ｉｉ）腸管腔内における毒性のグルテンペプチドエピトープの濃度の低減、（ｉｉｉ）有害な抗原および細菌に対する防御バリア機能の強化、および（ｉｖ）消化を促進する酵素活性の付与が含まれる。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、食品産業分野および薬剤分野に関し、具体的には、プロバイオティクス分野、ならびにこれから派生する、機能性食品および新規な食品、プロバイオティクス、シンバイオティクス、栄養補助食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）または食品サプリメント、および臨床的に応用可能な薬剤組成物の形の製品に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
セリアック病は、穀類のグルテンタンパク質に対する慢性的不耐性によって引き起こされ、遺伝的素因を有する患者が罹患する、免疫性の腸疾患、つまり腸の疾患の一種である。この疾患は、臨床的には広範囲の疾患を指し、典型的形態、非典型的形態、無症候性形態、および潜在性形態などを含む。典型的形態は、生後数年間（６ヶ月〜２４ヶ月）にもっとも頻繁に存在し、主に腸の症状および関連する変化（吸収疾患、慢性の下痢、体重減少、腹部膨満、成長遅延など）を伴って現れる。セリアック病は、現在もっともよくみられる慢性疾患であり、有病率は一般的な集団の０．７％〜２．０％、第一度近親者の１５％〜２０％に達する。さらに、グルテンの摂取およびセリアック病は、他の障害にも関連しており、例えば、ダウン症候群、１型糖尿病、疱疹状皮膚炎、ミオパチー、多発性硬化症、関節炎、自閉症、統合失調症、鬱病、リンパ腫、および運動失調などがその例としてあげられる。グルテン摂取と、精神性障害、神経性障害、および行動性障害との間の関係は、エグゾーフィン（ｅｘｏｒｐｈｉｎｓ）などの、オピオイド活性を有する生理活性ペプチドの生成の結果であると考えられている。
【０００３】
グルテンタンパク質（グリアジン、および類似のプロラミンおよびグルテニン）は、セリアック病およびその他の関連する障害を引き起こす、主要な環境的要因を代表するものである。これらのタンパク質は、プロリンおよびグルタミンに富んだペプチド配列を含有しているので、食品中の他のタンパク質に比べて消化酵素に対する耐性が強く、腸管腔中に残存できる。遺伝的素因を有する患者にとって、これらのペプチドは、自然免疫系および適応免疫系の両方が関与する異常反応の原因となる。この異常反応は、広く、腸の粘膜の慢性的炎症、上皮内リンパ球の増加、陰窩の過形成、および腸の絨毛の進行性悪化（絨毛が全く消滅することもある）につながる。グルテンの摂取につづいて生成される毒性のペプチドは、腸の上皮を通過することがあり、好ましくは組織におけるトランスグルタミナーゼの作用による脱アミド化につづいて、抗原提示細胞のＨＬＡ−ＤＱ２またはＨＬＡ−ＤＱ８分子によって認識される。こうすることによって、このペプチドはＴ細胞受容体に提示され、Ｔ細胞受容体を活性化する。これには、ＣＤ４抗原（ヘルパー（Ｔｈ）とも呼ばれる）の発現およびリンパ球亜集団への分化が関与し、それゆえ、獲得免疫が関与する。Ｔｈ２の亜集団は、Ｂ細胞と相互作用をし、Ｂ細胞は、血漿細胞に分化して抗−グリアジン抗体、抗−筋内膜抗体、および抗−組織トランスグルタミナーゼ抗体を産生する。亜集団Ｔｈ１は、炎症促進性のサイトカイン（主にＩＦＮ−γ）分泌の増加およびＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０比の増加の原因となる（Salvati et al 2005. Recombinant human interleukin 10 suppresses gliadin dependent T cell activation in ex vivo cultured coeliac intestinal mucosa. Gut. 54: 46-53）。グルテンペプチドは、さらに、サイトカインＩＬ−１５によって媒介される、腸の上皮における応答を引き起こし、これには自然免疫系が関与している（Green and Jabri 2006. Celiac disease. Ann Rev Med. 57:207-21）。摂取されたグリアジンは、上皮細胞におけるＩＬ−１５の産生を促進するが、この産生が、上皮内細胞の傷害性ＣＤ８のＴリンパ球のクローン増殖およびＩＦＮ−γの発現を助ける（Jabri et al. 2000. Selective expansion of intraepithelial lymphocytes expressing the HLA-E-specific natural killer receptor CD94 in celiac disease. Gastroenterology. 118 :867-79; Mention et al., 2003. Interleukin 15: a key to disrupted intraepithelial lymphocyte homeostasis and lymphomagenesis in celiac disease. Gastroenterology. 125: 730-45; Forsberg et al. 2007. Concomitant increase of IL-10 and pro-inflammatory cytokines in intraepithelial lymphocyte subsets in celiac disease. Int Immunol. 2007:19, 993-1001）。また、セリアック病患者の腸の細菌叢の組成は、コントロールとなる健常者の組成と比較すると不均衡であり、炎症促進性を有する細菌が圧倒的に多く、また、乳酸菌およびビフィドバクテリウム属の比率が低いことを特徴としている（Sanz et al., 2007. Differences in faecal bacterial communities in coeliac and healthy children as detected by PCR and denaturing gradient gel electrophoresis. FEMS Immunol Med Microbiol. 51(3):562-8. Nadal et al., 2007. Imbalance in the composition of the duodenal microbiota of children with coeliac disease. J Med Microbiol. 2007 Dec; 56(Pt 12):1669-74; Collado et al. 2009. Specific duodenal and faecal bacterial groups are associated with paediatric celiac disease. J Clin Pathol. 62: 264-269）。活動型セリアック病やその他の関連する障害の場合には、腸管腔および上皮における、グルテンと有害な細菌の増加との組み合わせは、トリガー因子として作用するか、または病理過程および炎症促進性反応を助けるかしうる。同様に、ある細菌種の存在または非存在は、グルテン毒性を助けるか、あるいはグルテン毒性に対して防御するかしうる。
【０００４】
セリアック病は発生率が高く、重症度も高いが、いまのところセリアック病患者に対する治療法は存在しない。唯一の代替策は、生涯にわたってグルテンを含まない食事を厳格に続けることである。この食事に関する勧告に従うことは困難であり、患者は、胃腸症状、栄養疾患、および健康に対するさらに高いリスク（免疫不全、骨粗鬆症、不妊性、癌など）に苦しみ続けることになる。また、患者の腸の生態系のバランスは、完全に復元されることはない。また、不応性セリアック病（５％〜１０％）の患者は、この食事に関する勧告に対して反応を示さない。
【０００５】
現在研究中の、セリアック病治療のための別の治療法またはコ−アジュバントとしては、植物または微生物から得られるタンパク質分解酵素を経口投与して、グルテンペプチドの胃腸での消化を加速させるというものがある（Shan et al. 2005. Enzyme treatment of foodstuffs for celiac sprue. 米国特許出願公開第２００５／０２４９７１９号明細書; Marti et al. 2006. Prolyl endopeptidase mediated destruction of T cell epitopes in whole gluten. 米国特許出願公開第２００６／０２８６６０１号明細書; Stepniak y Koning. 2006. Enzymatic gluten detoxification: the proof of the pudding is in the eating! Trends Biotechnol. 24:433-4; Gass et al. 2007. Combination enzyme therapy for gastric digestion of dietary gluten in patients with celiac sprue. Gastroenterology. 133:472-80）。この治療方法の有効性は、タンパク質製剤およびペプチド製剤、またはその組み換え型の等価物を使って、モデル系においては実証されている。しかし、インビボにおける有効性を実証するために、食品中に存在するグルテンを摂取する個々の患者において実施する研究がさらに必要である。この治療法は、グルテンを含まない食事におけるアジュバントとして潜在的な利点を有するものの、その効果は酵素製剤の摂取時刻に大きく依存し、たまたまグルテンを摂取した場合の毒性の閾値を低下させるだけである。その他の提案されている代替物としては、組織トランスグルタミナーゼ阻害剤の化合物の開発（Khosla et al., 2006. Transglutaminase inhibitors and methods of use thereof、国際公開第２００７０２５２４７号パンフレット）、グリアジンペプチドを捕捉可能な抗体（Fox, 2007. Antibody therapy for treatment of diseases associated with gluten intolerance. 米国特許出願公開第２００７／０１８４０４９号明細書）、グルテンペプチドがＨＬＡ−ＤＱ２またはＨＬＡ−ＤＱ８分子に結合する部位をブロックする化合物（Sollid et al. 2007. Drug therapy for celiac sprue. 米国特許出願公開第２００７／０１６１５７２号明細書；Peakman and Chicz. 2007. Peptide epitopes recognized by disease promoting CD4+ T lymphocytes. 米国特許出願公開第２００７／０１４２６２２号明細書）、ＩＦＮ−γなどの炎症促進性のサイトカイン拮抗薬（Maroun et al., 2007. Interferon antagonists useful for the treatment of interferon related diseases. 米国特許出願公開第２００７／０１６０６０９号明細書）、組み換え型の制御性サイトカインの経口投与（Salvati et al., 2005. Recombinant human interleukin 10 suppresses gliadin dependent T cell activation in ex vivo cultured coeliac intestinal mucosa. Gut. 2005; 54:46-53）、炎症反応に関与する接着分子の阻害剤、および傍細胞透過性の増加の原因となるゾヌリンの拮抗薬（Paterson and Ginski. 2007. Formulations for a tight junction effector 米国特許出願公開第２００７／０１９６５０１号明細書）などがある。これらの治療方法を実施するには、関与する分子をいくつかの生物学的プロセスにおいて修飾することが必須であり、この分子を使用することによって、望ましくない二次的な効果が生じる可能性がある。食品産業の分野では、ある品種のコムギを遺伝子操作したり、穀類の発酵プロセスにおいて、毒性のエピトープを分解できるタンパク質分解酵素および乳酸桿菌を使用したりすることによって、人が摂取する食品における、毒性のエピトープの存在を排除する方法が開発されている。以上のように、これらの研究の目的は、セリアック病それ自体を予防または治療するのではなく、セリアック病患者の食事を改善し、より多種多様な製品をセリアック病患者に提供することである（Rizzello et al. 2007. Highly efficient gluten degradation by lactobacilli and fungal proteases during food processing: new perspectives for celiac disease. Appl Environ Microbiol.73:4499-507）。
【０００６】
本発明の基本原理は、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｅｎｕｓ）に属する菌株を、セリアック病およびそれに関連する障害の治療および予防のために、プロバイオティクスまたは医薬製剤として使用することである。これを目的として特異的に選別されたビフィドバクテリウム属は、多数の利点を有する。ビフィドバクテリウム属は、新生児の腸管にコロニーを形成するという特殊な能力を有し、この能力によって、新生児の防御（免疫による防御も、その他の防御も含む）の発達と、食事に含まれる抗原に対する経口免疫寛容とに大きく寄与する。この細菌群は、生後数年間、特に母乳で育てられた子供の、腸の細菌叢における主要な構成要素の一つである。
【０００７】
〔発明の概要〕
本発明は、免疫応答を調節できる微生物または菌株を選別する方法を提供する。これらの微生物は、好ましくはビフィドバクテリウム属に属する微生物であって、免疫調節能力を有するので、免疫性疾患、例えばセリアック病の治療または予防に使用可能である。
【０００８】
また、本発明は、ビフィドバクテリウム属の新しい菌株（ＣＥＣＴ ７３４７；以後「本発明の菌株」と称する）（ＩＡＴＡ−ＥＳ１）、その細胞成分、その代謝の結果生じる分泌分子および分泌化合物、ならびにこれらの相互の、および／またはこれらと他の微生物もしくは生理活性化合物との組み合わせのいずれかを、セリアック病およびグルテン摂取に関連するその他の障害（アレルギー、自閉症、運動失調、糖尿病、多発性硬化症など）に罹患している個々の患者に対し、リスクを低減させるとともに、健康と生活の質とを向上させるように設計された製剤の形態にて、提供する。
【０００９】
本発明の菌株は、健康な母乳栄養児の糞便から単離され、１６ Ｓ ｒＲＮＡおよびｔｕｆ遺伝子の配列を決定することによって同定された。この菌株は、セリアック病およびその関連疾患（多発性硬化症、糖尿病、運動失調、など）に特徴的なＴｈ１型炎症促進性応答を制御することができる、免疫調節特性を有する。また、この菌株は、コムギタンパク質およびその他の穀類タンパク質の摂取に起因する、食物性タンパク質に対するＩｇＥ依存性アレルギー症に特徴的なＴｈ２型免疫応答を制御することができる、免疫調節特性を有する。本発明の菌株は、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ； ＰＢＭＣ）において、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γおよび炎症促進性のサイトカインＩＬ−１の産生量を抑制し、制御性のサイトカインＩＬ１０およびＴＧＦ−βの産生量を増加させることを特徴とする。本発明の菌株によって誘導されるこのようなサイトカインのプロファイルは、すべてのビフィドバクテリウム属およびヒトの腸内乳酸菌によく見られる特徴ではなく、また、本発明の菌株は、病気にかかりやすくなっている個々の患者において、グルテンタンパク質によって引き起こされる異常免疫応答を調節するのに特に適している。本発明の菌株と他の微生物（例えばビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）ＡＴＣＣ１５７０７）とを組み合わせれば、これらの病状に特徴的な炎症のプロセスの制御に役立つ、制御性のサイトカインＩＬ−１０の合成を増強することができる。これらの非生存細菌（例えば、加熱、凍結−解凍、照射などの各種方法で不活性化された細菌）では、細菌の免疫調節特性が維持されている。
【００１０】
本発明の菌株は、上述の疾患の原因となるグルテンペプチドを取り込んで加水分解することができ、こうして、毒性のエピトープの濃度およびその潜在的な病原性を低減させることができる。本発明の菌株は、グルテンタンパク質によく見られるプロリンを含有する基質を加水分解するための、特異的なペプチダーゼを有する。この菌株を、多様な特異性を有し、互いの作用を補完できるペプチダーゼを有する他のビフィドバクテリウム菌株と組み合わせると、有毒なエピトープの分解を助ける。ビフィドバクテリウム菌株と、他の微生物、例えば細胞壁にアンカーされたプロテイナーゼを有する、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ７１２などとの組み合わせは、ビフィドバクテリウム菌株の作用のみによる加水分解の効果をさらに増強できる。
【００１１】
本発明の菌株は、上記グルテンペプチドによって誘発される免疫応答を、
（ｉ）制御性のサイトカイン（ＩＬ−１０）の合成を誘導し、（ｉｉ）自然免疫応答および適応免疫応答に由来する炎症促進性のサイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−８、およびＩＬ−１５の産生を低減し、（ｉｉｉ）核内因子κＢ（実施例３、表３）によって媒介される炎症促進性の経路を阻害することによって調節することができる。
【００１２】
本発明の菌株および該菌株に由来する化合物はまた、どちらも、炎症を促進する潜在的な病原性因子を有するセリアック病患者の腸内の細菌叢から単離される病原菌を阻害することができ、腸のバランスの再確立を助けることができる（実施例４、表４および表５）。これらの菌株はまた、活動型セリアック病の患者およびグルテンを含まない食事を摂っている患者の、炎症促進性のサイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）の合成を低減させ、かつ、制御性のサイトカイン（ＩＬ−１０）の合成を増加させることによって、腸内細菌の炎症促進性応答を阻害することができる。
【００１３】
本発明の菌株はまた、栄養分の消化ならびにセリアック病患者に特徴的な吸収疾患および栄養障害症候群の改善を助ける、代謝活性（例えば、ホスファターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、およびＮ−アセチル−グルコサミニダーゼ）を有する。
【００１４】
本発明の菌株は、ムチン（１％〜４％）に接着する能力を有し、胃腸がストレスを受けている条件下（ｐＨが酸性であり、胆汁の濃度が高い；実施例５、表６および表７）でも、また、食品の貯蔵および準備の技術的プロセス（例えば、冷蔵、凍結乾燥、発酵など）においても安定である。インビボでは、本発明の菌株は、経口投与された後、ヒトの体内を通過しても生存することができる。これらすべての性質が、本発明の菌株が腸内で遷延的な持続性および有効性を有すること、ならびにプロバイオティクスおよびシンバイオティクス（プロバイオティクスとプレバイオティクスとの組み合わせ）として使用できることを保証している。さらに、この性質は、本発明の菌株が、セリアック病やその他のグルテン摂取に関連する疾患を有する被験者のリスクを低減し、被験者の健康および生活の質を向上させるための機能性食品、新規食品、食品サプリメント、栄養補助食品、および薬物の形態で使用できることも保証している。
【００１５】
上述のように、本発明の第１の態様は、食物アレルギーに対する免疫応答を調節することができる微生物または微生物の菌株を選別するための方法に関し、該方法は、（ａ）健常者（好ましくは母乳栄養児）から得られるサンプル（好ましくは糞便）から微生物を単離する段階と、（ｂ）免疫応答を調節し、食物アレルギー（好ましくはセリアック病）を引き起こす少なくとも１つの媒介物の作用機構を加水分解、不活性化、または妨害することができる、上記段階（ａ）の微生物を選別する段階とを含む。好ましくは、段階（ａ）で選別される微生物が、潜在的なプロバイオティクス属または種に属する。好適な実施形態では、段階（ａ）で得られる微生物によって調節される上記免疫応答が、Ｔｈ１型またはＴｈ２型の炎症促進性応答である。また、段階（ａ）および段階（ｂ）で得られる微生物が、上記免疫応答の調節能力の替わりに、あるいは、上記免疫応答の調節能力に加えて、腸内バリア機能を向上させる上皮細胞の生存能および／または完全性を増加させる能力が得られるように、選別されてもよい。
【００１６】
上記方法によって選別される微生物、つまり、食物アレルギーを引き起こす少なくとも１つの媒介物の作用機構を加水分解、不活性化、または妨害し、免疫応答を調節することができる微生物は、食物アレルギーの治療または予防のために使用され得る（以後「本発明の微生物」と称する）。そのため、本発明の第２の態様は、これらの微生物を医薬または食品組成物として使用する方法、好ましくはこれらの微生物を食物アレルギーの治療または予防のために使用する方法に関する。これらの微生物は、どの細菌の属または種に属していてもよく、好ましくはビフィドバクテリウム属、さらに好ましくはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）種に属する。
【００１７】
本発明の第３の態様は、受託番号ＣＥＣＴ ７３４７の菌株に関する。
【００１８】
本発明の第４の態様は、本発明の微生物のうちの少なくとも一つを含む組成物（以後「本発明の組成物」と称する）に関する。好ましくは本発明の菌株に関し、さらに、好ましくは本発明の菌株が上記組成物内に０．１％〜９９．９％、好ましくは１％〜９９％、さらに好ましくは１０％〜９０％の比率で存在する。この組成物は、さらに、例えば、本発明の微生物または本発明の菌株の免疫調節能力、または食物アレルギーを引き起こす媒介物の作用機構を加水分解、不活性化、もしくは妨害する能力などを増強する他の微生物または培地を含んでもよい。
【００１９】
本発明の第５の態様は、本発明の微生物に由来する生理活性化合物から得られる組成物に関し、この本発明の微生物の例としては、例えば、本発明の微生物のうちのいずれかの微生物の培養物の上清（以後「本発明の上清」と称する）、本発明の微生物のうちのいずれかの微生物または本発明の菌株の、純粋培養物または混合培養物から得られる抽出物（以後、「本発明の抽出物」と称する）、および当該技術分野において当業者に公知の物理化学的手法および／または生物工学的手法を使って得られる、本発明の微生物または本発明の菌株によって分泌される、細胞成分（つまり細胞成分分画）、代謝物、および生成物などがあげられる。なお、これらの例は本発明を説明するためのものであり、本発明の権利範囲を限定するものではない。これらの本発明の微生物により生成された生理活性化合物（以後「本発明における生成された生理活性化合物」と称する）を、食品、食品サプリメント、栄養補助食品、プロバイオティクスまたはシンバイオティクスに基づいた生成物、新規食品、または医薬の調製に使用してもよい。また、同様に、本発明の微生物の、これらとは異なる使用方法も、本発明の一部である。
【００２０】
本発明の別の態様は、本発明の組成物、または本発明の少なくとも１つの微生物、好ましくは本発明の菌株を含む食用品の調製のためのサポート材料に関する。好適な実施形態では、本発明の微生物は、サポート材料中に、少なくともサポート材料１ｇに対して約１０５ｃｆｕ／ｇ、好ましくは１０６ｃｆｕ／ｇ〜１０１２ｃｆｕ／ｇ、さらに好ましくは１０６ｃｆｕ／ｇ〜１０１０ｃｆｕ／ｇの量が含有されている。上記の記載によれば、本発明の組成物または本発明のサポート材料を含む任意の食用品または食品サプリメントも、本発明の一部である。
【００２１】
本発明の別の態様は、本発明の組成物、本発明に由来する生理活性化合物、本発明の上清、本発明の抽出物、本発明の微生物、本発明の菌株、および必要に応じて、薬理的に受容可能な培地および／または賦形剤のうちの、いずれかの化合物を含む薬学的組成物または食品組成物に関する。上記薬学的組成物または食品組成物が必ず含有しなければならない微生物の量には、その微生物の治療対象として設計される病状の種類によってばらつきがある。好ましくは、この病状は食物アレルギー、さらに好ましくはセリアック病である。食品組成物の調製の場合、また、本発明によれば、少なくとも１つの本発明の微生物または本発明における生成された生理活性化合物が、サポート材料中に、本発明の微生物の場合であれば、好ましくは、サポート材料１ｇに対して１０５ｃｆｕ／ｇ〜１０１４ｃｆｕ／ｇ、さらに好ましくは約１０８ｃｆｕ／ｇ〜１０１３ｃｆｕ／ｇ、さらに好ましくは１０７ｃｆｕ／ｇ〜１０１２ｃｆｕ／ｇの量で、また、本発明における生成された生理活性化合物の場合であれば、０．１％〜９９．９％、好ましくは１％〜９９％、さらに好ましくは１０％〜９０％の比で組み込まれる。これらの食品組成物は、栄養補助食品、機能性食品、プロバイオティクス、シンバイオティクス、栄養補助物、または好ましくは食物アレルギー、さらに好ましくはセリアック病の治療または予防のために設計される、その他の任意の種類の製品の調製に使用可能である。
【００２２】
本発明の薬学的組成物または本発明の食品組成物は、好ましくは錠剤、カプセル、マイクロカプセル、粉末、溶液、ペーストなどの形態中に含まれ得る。
【００２３】
本発明の別の態様は、本発明の組成物、本発明における生成された生理活性化合物、本発明の上清、本発明の抽出物、本発明の薬学的組成物、本発明の細胞成分分画、本発明の食品組成物、または本発明のサポート材料に関し、本発明の微生物または本発明の菌株が他の微生物、該微生物の培養物から得られる上清、または該微生物の細胞成分分画と組み合わせられる。好ましくは、この微生物は、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属し、好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）種に属し、さらに好ましくはラクトコッカス・ラクティスＮＣＤＯ７１２株に属する。
【００２４】
本発明の最後の態様は、本発明の組成物の別の提供形態に関し、該組成物は、食品、栄養補助食品、医薬製剤、食品サプリメント、プロバイオティクスもしくはシンバイオティクス、または新規食品として調製されてもよい。
【００２５】
〔定義〕
母乳栄養児：本説明全体を通じて、本用語は、好ましくは主に母乳で育てられた健常者、好ましくは主に母乳で育てられた年齢が２歳未満の健常者、さらに好ましくは主に母乳で育てられた年齢が１歳未満の健常者、さらに好ましくは主に母乳で育てられた年齢が６ヶ月未満の健常者を指す。
【００２６】
健常者：本用語は、好ましくは、専門医師の基準によれば、いかなる種類の慢性の病理または急性の病理にも罹患していない人を指す。好ましくは、この病理は腸の上皮の炎症を誘発するものであり、さらに好ましくはセリアック病である。
【００２７】
食物アレルギー：本説明全体を通じて、好ましくは、本用語は、好ましくは乳、卵、豆類、ナッツ類、甲殻類、魚類、軟体動物類、ゴマ、ヒマワリの種子、ワタの種子、ポピーの種子、豆類、エンドウマメ類、およびレンズマメ類によって引き起こされる食物アレルギーを指し、さらに好ましくはグルテンによって引き起こされる食物アレルギーを指す。
【００２８】
Ｔｈ１型炎症促進性応答：コントロールに比較して、好ましくは少なくとも１００倍、さらに好ましくは少なくとも１５倍、さらに好ましくは少なくとも１０倍、さらに好ましくは少なくとも４倍の、Ｔｈ１型サイトカインの大量生成、好ましくはサイトカインＩＦＮ−γの大量生成を引き起こす刺激に対する応答を指す。
【００２９】
Ｔｈ２型炎症促進性応答：コントロールに比較して、少なくとも１００倍、さらに好ましくは少なくとも１５倍、さらに好ましくは少なくとも１０倍、さらに好ましくは少なくとも４倍の、Ｔｈ２型サイトカインの大量生成、好ましくはサイトカインＩＬ４の大量生成を引き起こす刺激に対する応答を指す。
【００３０】
潜在的なプロバイオティクス属または種：好ましくは本説明全体を通じて、本用語は、以下の系統学的部門および原核生物属の種および菌株を指す。すなわち、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ヴェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、フソバクテリウム門（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ属（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）、フィブロバクター属（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓ）、デフェリバクター属（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、シアノバクテリア属（Ｃｉａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、メタノブレビバクター属（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、コプロコッカス属（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ズブドリングラヌラム属（Ｓｕｂｄｏｌｉｎｇｒａｎｕｌｕｍ）、ドレア属（Ｄｏｒｅａ）、ブレイジア属（Ｂｕｌｌｅｉｄｉａ）、アナエロフスティス属（Ａｎａｅｒｏｆｕｓｔｉｓ）、双子菌属（Ｇｅｍｅｌｌａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、カテニバクテリウム属（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、アナエロトランカス属（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ファエカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、パラバクテロイデス属（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アッケフマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブチリビブリオ属（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）などである。また、酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）などの菌類およびイースト菌の種および菌株をも指す。
【００３１】
培地：本用語は、好ましくは、本発明の医薬、栄養性の組成物、組成物、サポート材料、上清、および食品の調合において使用するための、本発明の微生物におけるいずれかの特徴（例えば、安定性、免疫調節能力、アレルギーを引き起こす媒介物を接着する能力、発酵させる能力、加水分解する能力、または不活性化する能力など）を向上させる、好ましくは、培養液、基質、プレバイオティクス、ファイバ、生理活性化合物、賦形剤、成分などを指す。
【００３２】
サポート材料：好ましくは、サポート材料とは、乳、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、発酵乳に基づく食用品、発酵穀類、小麦粉、ジュース、糖、ケーキ、アイスクリーム、子供用剤形などから選別される食品組成物である。
【００３３】
医薬：本説明全体を通じて、本用語は、薬学的組成物または剤形を指し、好ましくは、アレルギー、食物アレルギー、腸の炎症性疾患、胃腸の感染症および病原性微生物またはその毒素の転移、腸のバランスの変化（腸内毒素症）、細菌性過成長、腸の透過性の変化、食品に対する不耐性、セリアック病、吸収不良症候群などの治療または予防のために設計された薬学的組成物または剤形を指す。
【００３４】
食品組成物：本説明全体を通じて、本用語は、食品（機能的食品、既存の食品、および新規食品）、食品サプリメント、栄養摂取を目的とした処方物、および好ましくはアレルギー、食物アレルギー、腸の炎症性疾患、胃腸の感染症および病原性微生物またはその毒素の転移、腸のバランスの変化（腸内毒素症）、細菌性過成長、腸の透過性の変化、食品に対する不耐性、セリアック病、吸収不良症候群などの治療または予防のために設計された栄養補助食品を指す。
【００３５】
微生物に由来する生理活性化合物：構造的部分、細胞成分、細胞成分分画、代謝物、または分泌される分子として、微生物の一部を形成するいずれかの化合物または分子を指す。なお、これらの化合物または分子は、例えば、遠心分離、濾過、凍結乾燥、沈殿、超音波処理、機械的および化学的細胞攪乱、酵素および／または化学的媒介物を使った培養物からの化合物抽出、クロマトグラフィーの手法を使った分離、クローニング、および健康に有益な機能を実施できる生理活性分子をコードする遺伝子の過剰発現を含む、物理化学的手法または生物工学的手法によって得られる。
【００３６】
〔図面の簡単な説明〕
（図１）
グリアジンの異なる消化のタンパク質のプロファイルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。パネルＡ：１）ペプシンを用いて消化した後のグリアジン（Ｇ−Ｐ）のコントロール；２）ペプシンおよびトリプシンを用いて消化した後のグリアジン（Ｇ−Ｐ−Ｔ）のコントロール；３）本発明の菌株とともにインキュベートしたＧ−Ｐ；４）本発明の菌株（ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＴＡ−ＥＳ１）とともにインキュベートしたＧ−Ｐ−Ｔ。パネルＢ：１）コントロールＧ−Ｐ；２）コントロールＧ−Ｐ−Ｔ；３）本発明の菌株およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ７１２とともにインキュベートしたＧ−Ｐ；４）本発明の菌株およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＤＯ７１２とともにインキュベートしたＧ−Ｐ−Ｔ。
【００３７】
（図２）
インビトロによるグリアジンの消化の透析可能な画分から得られるクロマトグラムを示す。ピーク２が、本発明の菌株によって加水分解されたと考えられるピークである。
【００３８】
（図３）
インビトロにおけるビフィドバクテリウム属の存在下または非存在下で、グリアジン（Ｇｌｄ）の、溶解性を有し消化される画分によって引き起こされる細胞の生存能の変化（リソソーム内の活性として測定）を示す。ウシアルブミン（ＢＳＡ）（ネガティブコントロール）；ＢｉｆＡ２（ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂ． ａｎｉｍａｌｉｓ））；Ｂｂ（ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ））、およびＢＬ（本発明の菌株；ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＩＡＴＡ−ＥＳ１−）。結果は平均値で示し、標準偏差は４通りにて決定する。
【００３９】
（図４）
インビトロにおけるビフィドバクテリウム属の存在下または非存在下で、グリアジン（Ｇｌｄ）の、溶解性を有し消化される画分に曝されるＣａｃｏ−２細胞培養における、炎症促進性のサイトカイン（ＴＮＦ−α）の生成および核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の発現。ウシアルブミン（ＢＳＡ）（ネガティブコントロール）；ＢｉｆＡ２（Ｂ． ａｎｉｍａｌｉｓ）；Ｂｂ（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ）、およびＢＬ（本発明の菌株；Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ ＩＡＴＡ−ＥＳ１−）。結果は平均値で示し、標準偏差は４回繰り返すことにより決定する。
【００４０】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、食物アレルギーにおける免疫応答を調節することができる、微生物または微生物の菌株を選別するための方法に関し、（ａ）健常者（好ましくは母乳栄養児）から得られるサンプルから微生物を単離するステップと、（ｂ）免疫応答を調節し、食物アレルギー（好ましくはセリアック病）を引き起こす少なくとも１つの媒介物の作用機構を加水分解、不活性化、または妨害することができる、先のステップの微生物を選別するステップとを含む。好ましくは、ステップａ）で選別される微生物が、潜在的なプロバイオティクス属または種に属する。
【００４１】
本発明の別の態様は、食物アレルギーを引き起こす少なくとも１つの媒介物の作用機構において、加水分解、不活性化、または妨害し、免疫応答を調節することができる微生物に関する。これらの微生物は、好ましくは、食物アレルギー、腸の炎症性疾患、腸内生態系（腸内毒素症）の不均衡、細菌性過成長、吸収不良症候群、胃腸の感染症および病原性微生物またはその毒素の転移、および腸の透過性の変化の治療または予防のために使用可能である。
【００４２】
本発明は、さらに、各種作用機構を利用することによって、グルテンの摂取に関連する疾患に罹患しているまたは罹患しやすくなっている個々の患者のリスクを低減し、健康状態を向上させる剤形を生成するために有用な微生物を提供し、該微生物が、健常者の腸内の細菌叢から抗炎性および制御性を得るために単離および選別された、非遺伝的に修正された微生物であることを特徴とする。
【００４３】
該微生物の複数の作用機構には、（ｉ）グルテンの毒性および免疫原性を有するペプチドによって引き起こされる自然免疫応答および適応免疫応答を制御すること、（ｉｉ）グルテンペプチドを輸送および加水分解することによって、腸管腔中の毒性のエピトープの濃度を低減すること、（ｉｉｉ）セリアック病患者の胃腸管から単離される、細菌またはその他の炎症促進性を有する媒介物および病原性因子に対して作用する、防御バリア機能を強化すること、（ｉｖ）これらの患者に典型的な吸収不良症候群を和らげるために、ペプチダーゼに加えて、栄養分の消化および供給を助ける酵素活性を提供することなどが含まれる。ただし、これらの作用機構は例示にすぎず、本発明の権利範囲を限定するものではない。本微生物は、上述した効果以外に、以下に列挙する有益な効果を奏することができる。すなわち、炎症に関連する酸化ストレスの低減、腸の透過性の制御、保護機能を有する有益なグラム陽性菌のコロニー形成の支持、抗原提示細胞の機能の制御、毒性のペプチドと宿主の免疫適格性上皮細胞との相互作用の阻害、金属プロテアーゼとの相互作用、細胞周期およびアポトーシスの制御、細胞の増殖および分化の制御、および神経内分泌機能の制御などの効果である。ただし、これらの効果は例示にすぎず、本発明の権利範囲を限定するものではない。（De Stefano et al., 2007. Lycopene, quercetin and tyrosol prevent macrophage activation induced by gliadin and IFN-γ.Eur J Pharmacol. 2; 566 (1-3):192-9; Silano et al., 2007. A decapeptide from durum wheat prevents celiac peripheral blood lymphocytes from activation by gliadin peptides. Pediatr Res. 61(1):67-71; Gross et al. 2007. Role of neuropeptides in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 3(7):918-32）。
【００４４】
本発明の微生物は、好ましくはビフィドバクテリウム属に属する。この属の微生物は、食品、新規食品、プロバイオティクス、シンバイオティクス、食品サプリメント、栄養補助食品、およびセリアック病およびその関連疾患の治療または予防のための医薬製剤の調製において長所を有する。ビフィドバクテリウム属は、新生児の腸管にコロニーを形成する特殊な能力を有し、新生児の防御の発達に大きく寄与する。
【００４５】
ある具体的な実施形態において、本発明の微生物は、好ましくはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）種に属する。一例をあげると、この種に属する本発明の菌株は、健康な母乳栄養児の糞便から単離され、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（実施例６）およびｔｕｆ遺伝子の配列決定によって特定された。なお、この例によって本発明の権利範囲が限定されるものではない。配列決定された断片（１４３７塩基）は、プライマー２７ｆおよびプライマー１４０１ｒを使ってＰＣＲによって増幅され、配列決定には、文献（Satokari et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67, 504-513; Favier et al. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68, 219-226）に記載の方法にしたがって、プライマー５３０ｆおよびプライマーＵ−９６８ｆをも使用した。得られた配列を、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）中の既知の配列とアラインメントしたところ、ビフィドバクテリウム・ロンガム種の１４の異なる菌株およびその中でもビフィドバクテリウム・ロンガムＢＧ３（受託番号ＡＹ７３５４０３．１）と同一の配列について、最大類似度が検出された。Ventura et al. (Analysis, characterization, and loci of the tuf genes in Lactobacillus and Bifidobacterium species and their direct application for species identification. Appl Environ Microbiol. 2003; 69(11):6908-22)に記載のプライマーを使って、ｔｕｆ遺伝子（４９８ｐｂ）の一部が増幅され、配列決定された。この場合にもまた、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ種について、具体的には、上記と同じ方法にそって、菌株Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ＡＴＣＣ １５７０７（受託番号ＡＹ３７２０４２．１）に対応する配列について、最大類似度が検出された。
【００４６】
これは、他の適宜選別されるこの属および種の菌株と同様の方法で本発明の免疫系を制御するための理想的な性質を、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍが提供し、グルテンの摂取に関連する疾患を有する個々の患者において同じ有益な効果を提供することを示している。
【００４７】
本発明の別の態様は、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ種に属し、国際寄託（スペイン）（Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ−ＣＥＣＴ、本部：Ｂｕｒｊａｓｓｏｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ））に２００７年１２月２０日に寄託された（受託番号ＣＥＣＴ ７３４７）菌株に関する。この菌株は、実施例６に記載するように、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に現在登録されている他の種との、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列における相同性によれば、また、この菌株とは別の菌株とのｔｕｆ遺伝子における相同性によれば、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ種に属する。後者は、医薬製剤または医薬、食品（新規な食品または機能的食品）または栄養補助物、または食品サプリメントにおいて使用することを可能にする性質を有する、ビフィドバクテリウム属の菌株の一例である。
【００４８】
本発明の微生物、および好ましくは本発明の菌株は、その保護性および代謝性を相乗作用または相補的作用を通じて向上させるために、他の微生物および生理活性化合物と組み合わせてもよい。この相乗作用または相補的作用の例としては、例えば、制御性のサイトカインの全合成量およびその種類が増加すること、病原菌に対する阻害能力および腸内バリア機能が強化されること、ならびにペプチダーゼおよび消化を助けるその他の酵素が、その全濃度または種類および特異性を増加させることによって寄与を増加させることなどがあげられる。
【００４９】
したがって、本発明の別の態様は、ビフィドバクテリウム属を他の微生物または生理活性化合物と相補的および／または相乗効果的に組み合わせた、免疫制御性の応答、およびグルテンの免疫原性を有する毒性のペプチドの分解を助ける組み合わせを含む。微生物の一例をあげると、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍＡＴＣＣ １５７０７株が、表１（実施例１）に示すように、ＩＬ−１０の合成を誘導する高い能力を有することによって、本発明の菌株の免疫調節効果を補強することができる。この作用は、第２の菌株によってのみ生成されるＴＧＦ−βの誘導も補完する（表１、実施例１）。また、ラクトコッカス・ラクティスＮＣＤ０７１２株は、ビフィドバクテリウム属によるグルテンペプチドの分解を補完および強化することができ、これにより、細胞エンドペプチダーゼとともに、細胞外タンパク質分解活性を有するので、グルテンの毒性のエピトープの濃度、ならびにそのエピトープの腸に対する損傷および腸外の損傷を低減することができる。タンパク質分解活性の強化は、実施例２および図１に示すが、この例では、本発明の菌株およびラクトコッカス・ラクティスＮＣＤ０７１２（図１、パネルＢ、レーン３および４）の細胞懸濁液とともに、グリアジンによって消化されたサンプルをインキュベートした後に、タンパク質のバンドがほぼ完全に消滅することがわかる。この加水分解は、本発明の菌株のみを用いてなされる加水分解に比べて、よく進行した（図１、パネルＡ、レーン３および４）。
【００５０】
本発明の別の態様は、本発明の微生物、好ましくは、本発明の菌株、ならびに免疫調節を目的として別の方法（凍結、加熱、放射など）によって不活性化された生存不能な、本発明の微生物および本発明の菌株の等価物の使用に関する。
【００５１】
別の方法（凍結、加熱、放射など）によって不活性化された本発明の生存不能な微生物は、治療目的または予防目的のための有用性が持続されており、また、本発明の一部でもある。ビフィドバクテリウム属の免疫調節効果は、少なくとも部分的には、構造的構成物質（ＤＮＡ、細胞壁の成分など）によって奏される。これによって、ビフィドバクテリウム属が、生存能を必ずしも維持しなくても、その免疫調節特性の一部を維持することが可能になる（Lammers et al., 2003. Immunomodulatory effects of probiotic bacteria DNA: IL-1 and IL-10 response in human peripheral blood mononuclear cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 38: 165-72）。したがって、実施例３および表３は、周期的に凍結および解凍することによって不活性化された本発明の菌株の細胞懸濁液は、末梢血単核球とともにコ−インキュベートされると、炎症促進性のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）の合成量を低減させ、かつ制御性のサイトカイン（例えばＩＬ−１０）の合成量を増加させることによって、グリアジンによって引き起こされる炎症促進性応答を調節することができることを示す。
【００５２】
また、周知の手法によって得られる、本発明の微生物から生成される生理活性化合物、例えば構造的化合物、代謝から得られる化合物、本発明の微生物または菌株のいずれかによって分泌される分子などは、本発明の一部をなし、免疫応答を調節するために使用可能である。例えば、遠心分離、濾過、凍結乾燥、沈殿、超音波処理、機械的細胞攪乱および化学的細胞攪乱、酵素および／または化学的媒介物を有する培養物に基づいた化合物の抽出、クロマトグラフィー手法を用いた分離、上記化合物をコードする遺伝子のクローニング、および上記化合物の過剰発現などを含む物理化学的手法および生物工学的手法である。
【００５３】
実施例１および表１は、ビフィドバクテリウム属の細胞表層の一部を形成する構造的成分が、少なくとも部分的には、制御性のサイトカイン（ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β）の誘導および生成の原因となることを示す。実施例３および表３では、グリアジンによって消化されたサンプルが、本発明の菌株の生存不能な細胞懸濁液とともにコ−インキュベートされ、同実施例および表には、これらの細胞の構造的成分が、グリアジンによってもたらされる炎症促進性応答を低減できること、および制御性のサイトカイン（ＩＬ−１０）の合成量を増加させられることも示されている。同様に、本発明の菌株によって分泌される構造的成分、代謝物、および物質は、実施例４および表４に示すように、セリアック病患者から単離された、潜在的に病原菌となりうる菌の増殖を阻害する効果を発揮した。上記の実施例では、本菌株の細胞培養の阻害効果を二重層法により評価した。この評価法では、阻害効果がこれらすべての成分の相乗効果的作用によって引き起こされるように、細胞ならびに代謝物および分泌物の両方を病原微生物に接触するように配置する。さらに、先に凍結乾燥しておいた細胞を含まない培養物の上清を阻害性媒介物として使用することによって、ビフィドバクテリウム属が培養液に分泌する代謝物および化合物の該阻害効果を評価した。このようにして、培養液に放出された化合物が、セリアック病患者の単離された潜在的な病原体に対して阻害効果を奏することが示された（表５）。
【００５４】
本発明の具体的な実施形態において、本発明の微生物、本発明の組成物、本発明における生成された生理活性化合物、本発明の上清、本発明の抽出物、本発明の医薬品または栄養性の組成物、本発明の菌株、その細胞成分または細胞成分分画、その代謝によって生じる化合物、ならびに分泌される分子およびこれらの組み合わせは、グルテンの有害なペプチドまたは他の食物アレルギーによって引き起こされる自然免疫応答および適応免疫応答を制御または調節できることを特徴とする。
【００５５】
本発明の菌株は、セリアック病およびその関連疾患（ダウン症候群、糖尿病１型、疱疹状皮膚炎、ミオパチー、多発性硬化症、関節炎、自閉症、統合失調症、鬱病、リンパ腫および運動失調）に特徴的なＴｈ１型炎症促進性応答、およびコムギおよび他の穀物性タンパク質の摂取の結果引き起こされるＴｈ２型アレルギー性反応を、制御することができる免疫調節特性が得られるように選別された。この菌株は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ；実施例１、表１）によって、サイトカインＴｈ１ ＩＦＮ−γ（例えば＜１００ｐｍ／ｍｌ）および炎症促進性のサイトカインＩＬ−１（例えば＜１５０ｐｍ／ｍｌ）のわずかな生成を誘導する能力、ならびに制御性のサイトカインＩＬ１０（例えば＞８００ｐｍ／ｍｌ）およびＴＧＦ−β（例えば＞５０ｐｍｏｌ／ｍ）の多量の生成を誘導することを特徴とする。これらのビフィドバクテリウム属によって誘導されたサイトカインのプロファイルは、すべてのビフィドバクテリウム属およびヒトの腸の乳酸菌（実施例１、表１）に共通して見られる特徴ではなく、活動型セリアック病に罹患しやすくなっている個々の患者および活動型セリアック病患者においてコムギタンパク質がもたらす異常免疫応答を調節するために、特に理想的なプロファイルである。これらの試験（実施例１および表１）において刺激として選別された菌株の細胞懸濁液を使用する場合に、これらの免疫調節効果が検出されることは、このビフィドバクテリウム属の細胞表層の一部を形成する構造的成分が、制御性のサイトカインの生成（ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β）を誘導することにより、グルテンペプチドが有する毒性および免疫原性による効果を低減させ得ることの、少なくとも部分的な原因となることを示唆している。また、実施例３および表３では、グリアジンによって消化されたサンプルとともにコ−インキュベートされた本発明の菌株（周期的に凍結および解凍することによって不活性化されている）の生存不能な細胞懸濁液を使用することによって、グリアジンによって引き起こされる炎症促進性のサイトカイン（例えばＩＮＦ−γおよびＩＬ−１５）の合成量を低減すること、および制御性のサイトカイン（例えばＩＮＦＩＬ−１０）の合成量を増加させることができることが示されている。したがって、細菌の生存能を厳密に必ずしも維持しなくても、ビフィドバクテリウム属の細胞の構造的成分が、グルテンによって引き起こされる異常免疫応答を制御することができることが実証される。
【００５６】
本発明の微生物、本発明の菌株、本発明における生成された生理活性化合物、その細胞成分、代謝によって生じる化合物、分泌される分子、およびこれらの組み合わせは、セリアック病患者の胃腸管から単離された有害な細菌、例えば炎症促進性を有する細菌、および病原性因子を有する細菌などに対する防御バリア機能を強化できることを特徴とする。
【００５７】
本発明の微生物は、セリアック病患者の腸から単離された、病原性となる潜在的能力および有毒となる潜在的能力を有する細菌を阻害することができる（実施例４、表４および５）。これらの病原体には、病原要因（例えば線毛）をコードし、毒性のある系統学的なグループ（例えば、Ｂ２）に属する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）種の菌株、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の菌株、組織の障害に寄与する金属プロテアーゼを生成するその他の属の菌株、十二指腸のバイオプシーから単離された溶血性の菌株などが含まれる。実施例４および表４では、この菌株の細胞培養物全体における、セリアック病患者から単離された病原体に対する阻害効果が二重層法を使って示され、またこの方法によって、これらの効果が本発明の菌株によって分泌される構造的成分、代謝物、および物質によって引き起こされることが実証されている。表５もまた、このビフィドバクテリウム属が培地に分泌した代謝物および化合物のみを含有する、この菌株の培養物の細胞を含まない上清の阻害効果を示している。どちらの場合も、比較目的の他の菌株を使ってアッセイして得た阻害効果に比較して、選別した菌株を使って得られる阻害効果は大きい。このようにして、本発明の微生物または本発明の菌株は、腸内生態系の復元に寄与し、また、炎症のプロセスを助け、上皮の透過性を増加させる微生物起源の抗原性負荷の低減にも寄与する。同様に、この選別された菌株は、末梢血単核球において、セリアック病患者の腸内の細菌叢によって活性化される炎症促進性のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）の合成を阻害することができる。例えば、セリアック病患者の細菌叢を用いた活性化状態でＰＢＭＣによって生成されるＩＦＮ−γの濃度、およびＴＮＦ−αの濃度は、本発明の菌株の存在下で、それぞれ、９０．８ｐｍｏｌ／ｍｌから８．２ｐｍｏｌ／ｍｌに、１９６６．３ｐｍｏｌ／ｍｌから２９５．２ｐｍｏｌ／ｍｌに低減される（実施例７）。この菌株は、セリアック病患者の腸内の細菌叢によって同時に低減される制御性のサイトカイン（ＩＬ−１０）の合成を、活性化することもできる。このようにして、例えば、セリアック病患者の細菌叢によって誘導されるＩＬ−１０の値は、ビフィドバクテリウム属の菌株ＩＡＴＡ−Ｈ１の活性化によって、４９．３ｐｍｏｌ／ｍｌから１０７．５ｐｍｏｌ／ｍｌに増加する。この免疫調節機構によって、この選別された菌株が、腸のバランスの復元に寄与することができ、また、有害な細菌叢によって引き起こされ、さらにグルテンによっても引き起こされることによって炎症を永続化させる悪循環を発生させ得る、免疫系の過剰な活性化の回避に寄与することができる。
【００５８】
また、本発明の微生物は、胃腸における消化の結果生じるグルテンペプチドを輸送する能力を有し、こうすることによって、有害なエピトープの濃度を低減することを特徴とする。
【００５９】
具体的に、本発明の菌株は、胃腸におけるグリアジンの消化、ペプシン（Ｐ）の作用を利用した胃における消化の結果生じる生成物、およびトリプシン（Ｔ）およびパンクレアチン（Ｘ）の作用を利用した腸における消化により生成される毒性のペプチドを受容する能力を有する（実施例２、図１）。選別された株の生存可能な細菌の存在下でグリアジンをインキュベートすることによって、グリアジンの濃度、およびＥＬＩＳＡサンドイッチ法によってＲ５抗体を使って同定される毒性のエピトープの存在量が低減される。したがって、該インキュベーションによって、腸内および腸外のレベルで起こりうる有害な効果が低減される。例えば、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法によって決定される２３４９ｐｐｍのグルテンの、（実施例２に示すように）ペプシン、トリプシン、およびパンクレアチンで消化されたグリアジンのサンプルの毒性のエピトープの濃度が、本発明の菌株の細胞懸濁液を用いてインキュベートした後に、グルテンが１６９ｐｐｍにまで低減された。同様に、胃腸と同じ条件で消化され、除去サイズが１５ｋＤａ未満の膜を用いて透析されたグリアジンを用いて本発明の菌株をインキュベートし、つづいて該菌株を逆相ＨＰＬＣによって分析することによって、＃２画分の濃度を少なくとも１０％低減する、このビフィドバクテリウム属の能力が明らかになった。これは、試験を行った他の菌株が持たない性質である（実施例８、図２）。なお、＃２画分は、消化されたグリアジンの主要画分であり、質量分析によって特定される免疫原性ペプチドを含有する画分である。Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ＩＡＴＡ−ＥＳ１株のこの性質が有する、腸の上皮に対する生物学的効果は、実施例８に記載のように、グリアジンによって消化された別のサンプルのＣａｃｏ−２細胞培養におけるインキュベーション後、実証された。この実施例は、試験を行った他の菌株とは異なり、本発明の菌株は、上皮細胞の生存能を上記のように増加させることができることを実証している（実施例８、図３）。また、本発明の菌株をグリアジンによって消化されたサンプルとともにコ−インキュベートすることによって、炎症促進性のサイトカイン（例えばＴＮＦ−α）の合成、および炎症促進性の遺伝子の発現の原因となるＮκＢ因子の発現に対する後者の効果が減少した（実施例８、図４）。
【００６０】
グリアジンの消化により生成されるオリゴペプチドを捕獲する、本発明の微生物、好ましくは本発明の菌株の能力は、腸内と同じ条件、および胆汁塩の存在下で再現される。ラクトコッカス・ラクティス ＮＣＤＯ７１２とともにコ−インキュベートすることによって、この再現能力は増強される（実施例２、図１）。なお、該ＮＣＤＯ７１２は、大腸にコロニーを形成することはできないが、壁にアンカーされたプロテアーゼおよびその他のペプチダーゼの作用を利用して、摂取されたグルテンを加水分解する第１の段階において共通補助剤として作用することはできる。ラクトコッカス・ラクティス ＮＣＤ０７１２の作用を利用したタンパク質分解活性の強化は、図１で実証されている。同図からは、グリアジンによって消化されたサンプルを本発明の菌株、およびラクトコッカス・ラクティス ＮＣＤ０７１２の細胞懸濁液を用いてインキュベートした後に、タンパク質のバンドがほぼ完全に消滅したことがわかる（図１、パネルＢ、レーン３および４）。この加水分解は、本発明の菌株だけを使ってなされる加水分解に比べて、よく進行した（図１、パネルＡ、レーン３および４）。グルテンに対するビフィドバクテリウム属の活性はまた、抽出物の形態において、ラクトコッカス・ラクティス ＮＣＤＯ７１２のプロテアーゼおよびペプチダーゼとともにコ−インキュベートすることによって増強可能である。
【００６１】
本発明の菌株は、有害抗原として作用するペプチドを代謝するだけではなく、免疫制御性の機構を利用することによっても、グルテンの毒性のペプチドと個々の患者の免疫応答性細胞との相互作用によって引き起こされる異常な免疫応答を調節することができる（実施例３、表３）。胃腸においてグリアジンによって消化されたサンプルの存在下でＰＢＭＣととにもコ−インキュベートされた、選別された菌株の生存可能なまたは不活性化された細菌懸濁液は、胃のペプシン（Ｐ）、腸のトリプシン（Ｔ）、およびパンクレアチン（Ｘ）の作用によって、消化のそれぞれの局面においてこれらのタンパク質の炎症促進性効果に対抗することができる。本菌株は、適応免疫応答および自然免疫応答の原因となる、炎症促進性のサイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−８、およびＩＬ１５の生成量の低減、ならびに制御性のサイトカインＩＬ−１０の合成量の増加を誘導することができる（実施例３、表３）。これらの効果は、少なくとも部分的に、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｔｒａｎｓ ＡＭ ＮＦκＢ， Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｖｅ、ベルギー）によって決定される核内因子（ＮＦ）κＢ、ｐ５０、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ｃ−Ｒｅｌ、およびＲｅｌ Ｂの別のサブユニットの阻害が原因である。この転写因子の阻害は、炎症プロセス、具体的には、セリアック病において発生する炎症プロセスの、キーとなる制御点を表わす多数の炎症促進性の遺伝子の発現の阻害をともなう（Jelinkova et al., 2004. Gliadin stimulates human monocytes to production of IL-8 and TNF-alpha through a mechanism involving NF-κB. FEBS Lett. 571(1-3):81-5）。
【００６２】
本発明の微生物、本発明における生成された生理活性化合物、その細胞成分、代謝によって生じる化合物、分泌される分子、およびこれらの組み合わせは、そのペプチダーゼ活性によってグルテンペプチドを加水分解することができ、有害なエピトープの濃度を低減することを特徴とする。一例をあげると、本発明の菌株は、広い特異性を有するペプチダーゼと、プロリンを含有する基質に対する特異性を有するペプチダーゼとを有する。この基質はグリアジン中に非常に豊富に存在し、既存の酵素によるグルテンペプチドの加水分解を制限する（実施例２、表２）。具体的に、この菌株は、最も活発なイミノペプチダーゼ活性（＞３００Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を有する菌株の一つである。同様に本菌株は、プロリル−エンドペプチダーゼ活性（＞８Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｘ−プロリル−ジペプチジル−ペプチダーゼ（＞１５Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ならびにプロリダーゼおよびプロリナーゼ活性（＞１５Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を提供する。本菌株は、トリペプチダーゼ活性（基質Ｇｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに対して、＞１３０Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびロイシル−アミノペプチダーゼ活性（＞７０Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をも有する。プロリンを含有する基質（例えばＰｒｏ−ｐＮＡ）に対するこの菌株の活性は、他の乳酸菌において検出される活性（特にＰｒｏ−ｐＮＡ／Ｌｅｕ−ｐＮＡ活性比）より高い（Di Cagno et al. 2004. Sourdough bread made from wheat and nontoxic flours and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients. Appl Environ Microbiol. 70:1088-96; De Angelis et al. 2006. VSL#3 probiotic preparation has the capacity to hydrolyze gliadin polypeptides responsible for celiac sprue. Biochim Biophys Acta. 2006 1762(1):80-93）。プロリンを含有する基質に対するこの高い活性は、プロリンの含有量が多いグルテンペプチドの特異的な加水分解を助ける。
【００６３】
このように、本発明の菌株、本発明における生成された生理活性化合物、細胞成分、代謝によって生じる化合物、分泌される分子、およびこれらの組み合わせは、食事によって摂取された栄養分の消化を助け、吸収疾患症候群およびセリアック病患者に特徴的な栄養不足を改善するペプチダーゼ（例えば、ホスファターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、およびＮ−アセチル−グルコサミニダーゼ）の活性に加えて、代謝活性を有する。
【００６４】
最後に、別の具体的な実施形態は、グルテンの摂取またはその他の食物アレルギーに関連する疾患を有する患者のリスクを低減し、健康状態を改善するための剤形の生成における、本発明の微生物、本発明における生成された生理活性化合物、細胞成分、代謝によって生じる化合物、分泌される分子、およびこれらの他の微生物との組み合わせの使用である。
【００６５】
本発明の菌株を使って調製される剤形は、工業的に製造可能であって、例えば食品（機能的食品、既存の食品、および新規食品）、食品サプリメント、栄養補助食品、薬学的組成物、プロバイオティクス、および／またはシンバイオティクス、または新規な食品などの、消費に対する様々な提供形態を創造する（ただしこれらは例示にすぎないのであって、本発明の権利範囲を限定するものではない）。
【００６６】
本発明の菌株は、ムチン（１％〜４％）に対する接着能を有し、胃酸のｐＨ（２．０；２．５および３．０）ならびに小腸に存在する高濃度の胆汁塩（０．５；１．０；２．０；および３．０％）に対する耐性を有する。この耐性は、プロバイオティクスが腸管を通過する際における、ならびに食品発酵のプロセスおよび保存期間中における、プロバイオティクスの生存を制限する主要な生物学的バリアを構成する（実施例５、表６）。例えば、本菌株は、ｐＨ２．０〜２．５で９０分間のインキュベーションを行った後、５６％〜８６％の生存能および増殖能を維持する。したがって、本菌株は、表６からわかるように、他の単離された菌株および現在市販のプロバイオティクスの一部に比べて、高い確率で生存し、かつ機能する。本菌株は、インビボで胃腸内の通過に対する耐性を有する。発酵乳の形態で、１０７−１０８ｃｆｕ／ｍｌの投与量を一日２回、４週間のあいだ投与した後、本菌株は糞便から回収され、その濃度は、初期濃度（プロバイオティクス製品を摂取していない状態）に対して、対数表示では少なくとも１単位増加する。選別されたビフィドバクテリウム属は、各種食品および飲み物の中で増殖し、生存可能な状態で残存し、ビフィドバクテリウム属の摂取のための理想的なキャリアを形成する。例えば、選別されたビフィドバクテリウム属は、乳を発酵および凝固させることができ、発酵乳および他の乳の誘導体の調製のために使用可能である。選別されたビフィドバクテリウム属は、食品、食品サプリメント、および医薬製剤を製造および保存するための技術的処理（例えば、凍結乾燥温度および冷蔵温度）に対しても耐性を有し、工業的に利用可能であることを保証している。
【００６７】
本発明の具体的な態様は、本発明の微生物、本発明の菌株、または本発明における生成された生理活性化合物を、食品の形態で剤形を調製するために使用することを含む。
【００６８】
このように、本発明の微生物は、食品剤形の一部を形成することができ、通常の栄養価を超えた、グルテン摂取に関連する疾患を有する患者の健康上のリスクの低減および健康状態の改善に対する、有益な効果を提供する。
【００６９】
本発明の別の具体的な態様は、本発明の微生物、本発明の菌株、または本発明における生成された生理活性化合物を、非食品マトリクスで提供され、天然の生理活性物質と定義づけられる、栄養補助食品の形態で製剤を生成する際に使用することを含む。なお、この場合、この栄養補助食品は、グルテン摂取に関連する疾患を有する患者において有益な効果を奏し、患者のリスクを低減し、健康状態を改善する。
【００７０】
本発明の微生物、本発明の菌株、または本発明における生成された生理活性化合物を使用して、健康補助食品または食品サプリメントを得る場合、この健康補助食品または食品サプリメントは、その組成中に、健康を目的として食事を補完することを視野に入れた、および特定の場合には、グルテン摂取に関連する疾患を有する患者において有益な効果を奏し、患者のリスクを低減し、健康を向上させる目的で、微生物または微生物により生成される生理活性化合物を含む。
【００７１】
本発明の別の具体的な態様は、本発明の微生物、本発明の菌株、または本発明の生理活性化合物を、医薬製剤の生成において使用することを含む。この場合、この医薬製剤は、グルテン摂取に関連する疾患を有する患者の健康上のリスクの低減および健康状態の改善に対して有益な効果を奏する医薬として使用可能な、生物学的にアクティブな組成物の調製において使用される。
【００７２】
本発明の別の具体的な実施形態では、本発明の微生物、本発明の菌株、または本発明の生理活性化合物は、プロバイオティクスおよび／またはシンバイオティクス（プロバイオティクスおよびプレバイオティクスの組み合わせ）の生成において使用され、そこでは、該微生物は、例えば生きている状態または凍結乾燥された状態で、食品アレルギー、好ましくはグルテンの摂取に関連するアレルギーを有する個々の患者に対して有益な効果または治療用効果を実現することができる、適切な量および条件で組み込まれ、こうすることによって、患者のリスクを低減し、健康状態を改善する。
【００７３】
最後に、本発明の具体的な目的は、本発明の微生物、本発明の菌株、または本発明の生理活性化合物を、新しい食品の調製において使用することを含む。新規な食品とは、グルテン摂取に関連する疾患に罹患している患者において有益な効果を奏し、患者のリスクを低減し、健康状態を改善し得る、欧州連合内で１９９７年５月１５日の時点までの間に人が食するために通常供されなかったあらゆる食品または成分を意味する。
【００７４】
〔実施例〕
〔実施例１：ビフィドバクテリウム属の菌株を、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）においてサイトカインの生成を調節する能力によって選別する方法〕
（１．ビフィドバクテリウム属およびその他の腸の乳酸菌の培養物および上清の調製）
２４時間培養したこれらの菌株を、０．０５％のシステイン（ＭＲＳ−Ｃ）を含有する１０ｍｌのＭＲＳ増殖培地（Ｓｃｈａｒｌａｕ Ｃｈｅｍｉｅ Ｓ．Ａ．、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）に、１％において播種し、嫌気条件において３７℃で２２時間インキュベートした。（ＡｎａｅｒｏＧｅｎ；Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、ＵＫ）。遠心分離（６，０００ｇ、１５分間）によって細胞を回収し、ＰＢＳ（リン酸ナトリウム１０ｍＭ、塩化ナトリウム１３０ｍＭ、ｐＨ７．４）で二回洗浄し、２０％のグリセロールを含有するＰＢＳに再懸濁した。これらの懸濁液を等分した試料を液体窒素により凍結させ、−８０℃で保存した。ＭＲＳＣプレート上で４８時間インキュベートした後に計数することによって、凍結・融解サイクルを経た後の生細胞の個数を決定した。生存率は、どの場合にも９０％を超えていた。等分した各試料は１回の試験にのみ使用した。死滅した細菌による効果を評価するために、いくつかの試料について低温による不活性化（−２０℃で凍結して融解することを３回繰り返す）および熱による不活性化（３０分間、８０℃）を行なった。得られた上清のｐＨ値をＮａＯＨにより７．２に調整し、濾過（孔径０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）して、わずかに存在する生細胞を取り除くことによってエステル化した。細胞を含まない該上清の等分試料を、次に使用するまで−８０℃で保存した。
【００７５】
（２．ＰＢＭＣの単離および活性化）
ヘパリンを含むチューブ内における、４人の健康なボランティア（２４歳〜４０歳、平均年齢３０歳）の末梢血液から、ＰＢＭＣを単離した。このＰＢＭＣを、フィコール勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）中において遠心分離することによって単離した。ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）を用いて細胞を洗浄し、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｓｉｇｍａ社）をさらに含有するＲＰＭＩ１６４０培地により１×１０６個／ｍｌの密度に調節した。このＰＢＭＣを、刺激剤の存在下または非存在下で、平底型２４ウェルのポリスチレン製プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）において、５％のＣＯ２のもとで、３７℃で２４時間インキュベートした。生存細菌と死滅細菌との懸濁液を、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、および上清の容量を１５０μｌにおいて、刺激として使用した。ポジティブコントロールとして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１１１：Ｂ４の、精製されたリポ多糖類（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を、１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ネガティブコントロールとして、非活性化されたＰＢＭＣにおけるサイトカインの産生量について試験を行った。各種類の刺激について、各実験つき２回ずつ試験した。培養上清を遠心分離によって回収し、分割し、等分試料の形態で、サイトカインの検出まで−２０℃で保存した。
【００７６】
（３．サイトカインの同定）
ＥＬＩＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造業者の指示にしたがって使用して、上述した上清のサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−β）の濃度を測定した。
【００７７】
【表１】
【００７８】
〔実施例２：グルテンペプチドを加水分解し輸送することによって、グルテンペプチドの毒性を低減できるビフィドバクテリウム属を選別する方法〕
グルテンの免疫学的な毒性応答の原因となるペプチド内に存在する、プロリンを含有するペプチド配列を加水分解するための、広範囲の細胞内ペプチダーゼおよび特定の細胞内ペプチダーゼの活性を定量化することによって、グルテンから生成されるタンパク質およびペプチドを加水分解する菌株の能力を測定した。ＭＲＳＣにおいて１６時間〜１８時間増殖させた細菌性培養物の細胞を、遠心分離（９０００×ｇ、１０分間、４℃）によって回収し、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）で二回洗浄し、同じ緩衝液により、最初の培養体積に対して１０倍に濃縮して再懸濁した。細胞の体積に対して２倍の体積のガラスビーズを加え、Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、ＵＳＡ）を使って、１．５分間のパルスを２回印加して、この細胞を機械的に破壊した。遠心分離（８０００ｇ、１０分間）にかけて、不溶解性の断片および細胞を取り除いた後に得られた上清を、活性試験のための酵素の抽出液として使用した。試験を行った基質は、以下に列挙する。すなわち、幅広い特異性を有するアミノペプチダーゼを検出するためのＬｅｕ−パラニトロアニリド（−ｐＮＡ）、幅広い特異性を有するアミノペプチダーゼおよびトリペプチダーゼを検出するためのＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、プロリル−エンドペプチダーゼを検出するためのＳｕｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ、イミノペプチダーゼを検出するためのＰｒｏ−ＡＭＣ、Ｘ−プロリル−ジペプチジル−ペプチダーゼを検出するためのＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ；プロリダーゼを検出するためのＶａｌ−Ｐｒｏ、およびプロリナーゼを検出するためのＰｒｏ−Ｇｌｙである。パラニトロアニリドから生じる基質の場合、反応混合液は、０．５ｍＭの基質および５０μｌの酵素の抽出液を含有する２００μｌの５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）により構成した。該反応混合液を、３７℃で最大３０分間インキュベートした。上述した基質の加水分解およびパラニトロアニリンの放出を、分光光度計（５５０ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて４１９ｎｍで監視した。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼアッセイ（Hejgaard, 1978, Rapad assay to detect peptidases in column effluent fractions using L-amino acid oxidase. Analytical Biochem 90: 835-839）を用いて、ペプチドの加水分解を同定した。０．０５ｍＭの濃度を含む反応緩衝液の１００μｌを、５０μｌの酵素の抽出液とともに２０分間インキュベートした。この期間につづいて、１００μｌのＬ−アミノ酸オキシダーゼ試薬を加え、５分間のインキュベーションの後、５３０ｎｍにて吸光度を測定した。ＢｉｏＲａｄ社の市販キット（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使って、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法により、タンパク質濃度を測定した。１ユニットの活性は、１μｍｏｌの基質を３７℃で１分間に加水分解できる酵素の量として規定した。この活性を、Ｕ／ｍｇ タンパク質で表わした。
【００７９】
グリアジンが消化されて生じるペプチドを輸送および加水分解する菌株の能力を、電気泳動によって同定した。この場合、細胞懸濁液を、６５５ｎｍにおいて４の光学濃度（１０９ｃｆｕ／ｍｌと等価）に調節し、３つの異なるグリアジンの加水分解産物とともに、０．２％のグルコースを加えたＰＢＳにて最終濃度３００μｇ／ｍｌ〜６００μｇ／ｍｌとし、インキュベートした。グリアジンの加水分解産物（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、胃腸の消化のプロセスを以下のようにシミュレートすることによって得られた。すなわち、Ａ）１００ｇのグリアジンを、３７°で２時間、２ｇの精製ペプシンによって１ＬのＨＣＬ ０．２Ｎ（ｐＨ：１．８）中で消化した（この加水分解産物をＧ−Ｐと称する）。Ｂ）その結果生じた消化物を、２ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを８に調節した後、２ｇのトリプシンを加えることによって、トリプシンにより消化した（この加水分解産物をＧ−Ｐ＋Ｔと称する）。Ｃ）つぎに、この２度消化されたサンプルを、２ｇのパンクレアチンを用いて処理し、ｐＨ８において２時間攪拌した（この加水分解産物をＧ−Ｐ＋Ｔ＋Ｘと称する）。各段階での消化の後、サンプルを１０，０００ｇで１０分間、遠心分離し、さらに別の試験のために、その上清を−２０℃で保存した。消化されたサンプルを、１００℃で３０分間インキュベートすることによって不活性化した。細菌懸濁液を、３種類のグリアジンの加水分解産物（Ａ、Ｂ、およびＣ）の存在下、３７℃で６時間、嫌気条件においてインキュベートした。顕微鏡用の市販のシステムＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を製造業者の指示にしたがって使用して、インキュベーション中の生存数の変化を同定した。生存細菌（緑）および死滅細菌（赤）を、オリンパス社のＢＸ５１型落射蛍光顕微鏡（東京、日本）で計数した。どの場合にも、インキュベーションの後、生存数減少の最小値（０．０％〜１１．５％）が検出された。インキュベーション期間の後、遠心分離にかけて不溶解性の細胞およびタンパク質を取り除き、上清を濾過（孔径０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）して、わずかに存在している生細胞を取り除くことによってエステル化した。慣用されている１５％ポリアクリルアミドゲル、およびＴｒｉｓ−トリシンゲル（直線勾配１０％〜２０％のＲｅａｄｙゲル、濃縮用ゲル４％、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）を用いて、ペプチドを分離し、バンドの消滅を、評価することによって、複数種類のグリアジンの加水分解産物を輸送および使用する菌株の能力を同定した。タンパク質は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色することによって視覚化した。選別された細菌の作用による、グリアジンの輸送および消化の結果生じた毒性のエピトープの低減を、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法 Ｒ５ アッセイ（Ｃｅｎｔｒｏ Ｎａｃｉｏｎａｌ ｄｅ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ、Ｍａｄｒｉｄ）により評価した。
【００８０】
【表２】
【００８１】
〔実施例３：免疫調節特性のために選別したビフィドバクテリウム属の菌株とのコ−インキュベーションを用いた、免疫応答性細胞においてグリアジンによって引き起こされる免疫応答の選別制御〕
選別された菌株（１０６−１０９ＣＦＵ／ｍｌ）の懸濁液と、比較目的のためのその他の懸濁液とを、実施例３に記載のようにして得られた複数種類のグリアジンの加水分解産物（Ｐ、Ｐ＋Ｔ、およびＰ＋Ｔ＋Ｐ）、およびＰＢＭＣとともに、濃度１０６ｃｆｃ／ｍｌで２４時間インキュベートした。コントロール刺激として、細菌および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１１１：Ｂ４のＬＰＳを含まない、複数種類のグリアジンの加水分解産物を使用した。また、いかなる刺激をも加えない条件で、基底のサイトカイン産生を検出した。ＰＢＭＣを単離する方法、活性化する方法、およびサイトカインを検出するための方法は、実施例１に記載した通りである。
【００８２】
【表３】
【００８３】
〔実施例４：潜在的な病原性を有するセリアック病患者の腸の細菌叢からの単離菌の増殖を阻害する、選別されたビフィドバクテリウム属の能力〕
実施例１に記載の方法につづいて、免疫調節特性にしたがって先に選別されたビフィドバクテリウム属の菌株の抗微生物活性を、（ｉ）二重層法および（ｉｉ）寒天拡散法の２つの方法で同定した。
【００８４】
潜在的な病原性を有する、セリアック病患者の腸内の細菌叢から単離された細菌を指示菌として使った二重層法で、各菌株の抗菌活性を包括的に評価した。ビフィドバクテリウム属はＭＲＳ−Ｃプレートにおいて約２ｃｍの線状に増殖させ、最適な条件で１６時間インキュベートし、その後のビフィドバクテリウム属の成長をクロロホルムにより阻害した。指示菌を、１０４−１０５ＣＦＵ／ｍｌの濃度で１０ｍｌの適切な半流動性寒天に播種し、保護菌の寒天の層の上に注ぎ、嫌気条件において３７℃でインキュベートした。２４時間後に、ビフィドバクテリウム属の培養線の周囲における阻害輪（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｈａｌｏ）を測定した。
【００８５】
タンパク質特性を有する化合物の分泌に起因する抗菌活性を評価するために、寒天において拡散させる手法を使用した。各ビフィドバクテリウム属を２４時間培養したものを、１０ｍｌのＭＲＳ−Ｃ増殖培地に１％で播種し、３７℃で１６時間インキュベートした。遠心分離（１２．０００ｇ、１５分間、４℃）によって上清を得て、凍結乾燥によって濃縮した。凍結乾燥させたサンプルを、ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸塩緩衝液１ｍｌの中に再懸濁し、発酵によって生成される有機酸の効果を取り除くために、ｐＨが６．５になるまでＮａＯＨで中和し、濾過によって無菌化した。これらのサンプルは、ビフィドバクテリウム属によって生成された抗菌活性を有するタンパク質が同定される可能性がある、未精製の抽出液を構成した。指示菌を、１０４−１０５個／ｍｌの濃度で１０ｍｌの適切な半流動性寒天に播種し、同じ培地の寒天の固体層の上に注いだ。固化後、５ｍｍのウェルを作成し、各ビフィドバクテリウム属の、中和された無菌の抽出液を４０μｌ加えた。抽出液を、４℃で４時間拡散させ、つづいて指示菌または病原性微生物に対して最適な条件でインキュベートした。インキュベートした後、ウェルの周囲の阻害輪を測定した。
【００８６】
【表４】
【００８７】
【表５】
【００８８】
〔実施例５ 胃腸のストレスの条件に対する、ビフィドバクテリウム属の耐性の評価〕
摂取後のプロバイオティクス生存能を制限する最初の生物学的バリアを構成する胃液の酸性条件に対する、単離されたビフィドバクテリウム属の耐性を、回収した個々の菌株について確認した。この確認をするために、３ｇ／ｌのペプシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＰＢＳにおいて、各菌株の細胞懸濁液（１０８個／ｍｌ）を調製し、ＨＣｌを用いてｐＨを２に調節し、３７℃で合計１２０分間インキュベートした。ＭＲＳ−Ｃ寒天プレートを用いて計数することにより生存能を決定するために、平均的な胃内容排出の時間（９０分間）を含めた、それぞれ異なる時間（０分間、９０分間、および１２０分間）において、一定分量を分取した。つづいて、酸性ｐＨに対して耐性を有する菌株の、他のストレス条件、例えば胆汁、ＮａＣｌ、および高温などに対する許容性を、調べた。調べる対象となる菌株の、胆汁に対する許容性を知るために、様々な濃度（０．５％〜１．５％）の牛胆汁エキス（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を加えたＭＲＳ−Ｃにおいて、その菌株の増殖能力を評価した。各培地２００μｌの一定分量に、２４時間培養したものを１％で播種し、マルチウェルプレートに載せ、３７℃でインキュベートした。５５０ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ分光光度計（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ 、ＣＡ）を用いて、６５５ｎｍにおける吸光度を測定することによって、増殖を監視した。
【００８９】
【表６】
【００９０】
【表７】
【００９１】
〔実施例６：選別したビフィドバクテリウム属の単離および同定〕
分析に先立つ少なくとも１ヶ月間、ビフィドバクテリウム属を含有する食品を摂取せず、かつ、抗生物質を使ったいかなる治療も受けなかった健康な母乳栄養児の糞便から、ビフィドバクテリウム属の菌株を単離した。サンプルは４℃で保管し、回収から２時間以内に分析した。各サンプル２ｇを、濃度が１３０ｍＭのＮａＣｌ（ＰＢＳ）を含有する１０ｍＭのリン酸塩緩衝液で希釈し、Ｌａｂ−Ｂｌｅｎｄｅｒ ４００型ストマッカー（Ｓｅｗａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）で３分間ホモジナイズし、そしてペプトン水で希釈した。多様な１０倍希釈液の０．１ｍｌの一定分量を、０．０５％のシステイン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；ＭＲＳ−Ｃ）および８０μｇ／ｍｌのムピロシン（ｍｕｐｉｒｏｃｉｎ）を含有するＭＲＳ寒天（Ｍａｎ Ｒｏｇｏｓａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｅ社、Ｓｃｈａｒｌａｕ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ）に播種した。嫌気条件における、３７℃、４８時間のインキュベーションにつづいて（ＡｎａｅｒｏＧｅｎ、Ｏｘｏｉｄ、ＵＫ）、単離されたコロニーを選別し、グラム染色法を利用してその形態を調べることによって、このコロニーの同一性を確認した。リボゾームの１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子における１．３５ｋｂの断片を増幅するプライマー（ＬＭ２６およびＬＭ３）を用いて、Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（1997, Identification and quantification of Bifidobacterium species isolated from food with genus-specific 16S rRNA-targeted probes by colony hybridization and PCR. Appl. Environ. Microbiol. 63: 1268-1273）に記載の方法に基づいて、属特異的なＰＣＲによって、単離された菌の同一性を確認した。また、全ＤＮＡから、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列を決定した。配列決定された断片を、プライマー２７ｆおよび１４０１ｒを用いて増幅し、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲの市販のシステム（Ａｍｅｒｓｈａｎ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）を用いて精製した。配列決定には、プライマー５３０ｆおよびＵ−９６８ｆについても、別の著者（Jonson, 1994. Similarity analysis of rRNAs. In Methods for General and Molecular Bacteriology; Gerhard, P.; Murray, R. G.E.; Wood, W.A.; Krieg, N.R., Eds. American Society for Microbiology, Washington, DC. Pp 683-700; Satokari et al., 2001. Bifidobacterial Diversity in Human Feces Detected by Genus-Specific PCR and Denaturating Gradient Gel Electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 67, 504-513; Favier et al. 2002. Molecular Monitoring of Succession of Bacterial Communities in Human Neonates. Appl. Environ. Microbiol. 68, 219-22）によって記載された方法にしたがって使用した。配列決定は、自動ＤＮＡ配列決定装置ＡＢＩ ３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて実施された。最も緊密に関連する配列を、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使ってＧｅｎＢａｎｋデータベースで検索した（Altschul et a., 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol Biol. 215, 403-410）。
【００９２】
〔実施例７：活動型疾患を有するセリアック病患者およびグルテンを含まない食事による治療後の患者の、腸内の細菌叢が変化することによって引き起こされる炎症促進性応答を制御する、ビフィドバクテリウム属の菌株の能力の評価〕
（１．腸のビフィドバクテリウム属の評価用培養物および評価用糞便サンプルの準備）
ビフィドバクテリウム属の菌株を２４時間培養したものを、約０．０５％のシステイン（ＭＲＳ−Ｃ）を含有する１０ｍｌのＭＲＳ増殖培地（Ｓｃｈａｒｌａｕ Ｃｈｅｍｉｅ Ｓ．Ａ．社、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）に、１％で播種し、嫌気条件において３７℃で２２時間インキュベートした（ＡｎａｅｒｏＧｅｎ； Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、ＵＫ）。遠心分離によって（６，０００ｇ、１５分間）細胞を回収し、ＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、２０％のグリセロールを含有するＰＢＳで再懸濁した。これらの懸濁液の等分試料を、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。凍結・融解サイクルを経た後の生細胞の個数を、４８時間のインキュベーションの後にＭＲＳＣプレート上で再計数することによって決定した。生存率は、どの場合にも９０％を超えていた。各試料は１回の試験にだけ使用した。
【００９３】
（診断時に）活動型疾患をともない、グルテンを含まない食事により少なくとも２年間の治療を受けたセリアック病患者から採取した糞便を、末梢血単核球において刺激として使用するために、リン酸塩緩衝液で１／１０に希釈し、ストマッカーにおいて３分間〜５分間ホモジナイズし、−２０℃で凍結させた。コントロールとして、糞便サンプルを健常者からも採取した。
【００９４】
（２．ＰＢＭＣの単離および活性化）
ヘパリンを含むチューブ内において、４人の健康なボランティア（２４歳〜４０歳、平均年齢３０歳）の末梢血液のＰＢＭＣを単離した。このＰＢＭＣは、フィコール勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）中において遠心分離することによって単離した。ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）を用いて細胞を洗浄し、１０の％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｓｉｇｍａ社）をさらに含有するＲＰＭＩ１６４０培地より、１×１０６個／ｍｌの密度に調節した。このＰＢＭＣを、刺激剤の存在下または非存在下で、平底型２４ウェルのポリスチレン製プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）において、５％のＣＯ２のもとで、３７℃で２４時間インキュベートした。健常者、活動型セリアック病患者、および非活動型セリアック病患者の糞便の抽出物を、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌの生存細菌の細胞懸濁液３０μｌの存在下または非存在下において、刺激として使用した。ポジティブコントロールとして、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４の、精製されたリポ多糖類（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ネガティブコントロールとして、非活性化されたＰＢＭＣにおけるサイトカインの産生量について試験を行なった。刺激については、各種類を各実験つき二回ずつ試験した。培養の上清を、遠心分離によって回収し、分割し、等分試料の形態で、サイトカインの検出まで−２０℃で保存した。
【００９５】
（３．サイトカインおよび細胞性活性化マーカーの同定）
ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造業者の指示にしたがって使用して、上述した上清のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−β）の濃度を測定した。互いに異なるリンパ球集団のマーカーおよび活性化のマーカーを、ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で標識をした抗ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ８６抗体、ならびにフローサイトメトリー（フローサイトメーターＥＰＩＣＳ（登録商標）ＸＬ−ＭＣＬ； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ 、Ｆｌｏｒｉｄａ）を使って検出した。免疫応答において核内因子（ＮＦ）κＢによって媒介されるシグナル伝達系との関連を、その阻害剤（ラクタシスチン）を加えることによって同定した。
【００９６】
（結果）
セリアック病患者の糞便は、細菌叢の組成における変化を示し、ＰＢＭＣにおいて、炎症促進性のサイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）については健常者より高く産生を誘導し、抗炎症のサイトカインＩＬ−１０については健常者より低く産生を誘導した。セリアック病患者の糞便は、さらに、コントロール糞便に比較すると、Ｔ細胞の活性化に必須の表面分子ＣＤ８６の合成を増加させた。ビフィドバクテリウム属とともにコ−インキュベートすると、セリアック病患者の糞便細菌叢によって誘導される炎症促進性のサイトカインのプロファイルが制御され、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの合成量を低減し、ＩＬ−１０の合成量を増加することができる。ラクタシスチンの存在下でサイトカインの合成が阻害されることは、ＮＦ κＢが、ビフィドバクテリウム属によって発揮される免疫調節効果に関与していることを示唆している。
【００９７】
〔実施例８ インビトロの消化プロセスにおいて生成されたグリアジンの各フラクションにおける特性、ビフィドバクテリウム属によるグリアジンの胃腸での消化により生じるペプチドの減少の特性、およびそれらの生物学的効果〕
（１．グリアジンの胃腸における消化）
全アミノ酸配列が入手可能なグリアジンのタンパク質のアイソフォームのうち４つ（α−／β−、γ−、およびω−グリアジン）を含有する、市販のグリアジンの試薬を使用した（Ｓｉｇｍａ社、Ｇ３３７５）。
【００９８】
市販のグリアジン抽出物の互いに異なる部分標本（１５０ｍｇ）を、等張性生理食塩水溶液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ）にｐＨ３にて溶解させ、この混合液を、攪拌しながらバス内で５５℃まで３０分間加熱した。サンプルは、ペプシン（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ７０００）（８００〜２５００ＵＩ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ブタのパンクレアチン（Ｐ１７５０）（活性、４×ＵＳＰ）、および胆汁抽出液（Ｂ３８８３）を用いて、胃腸の消化シミュレーション過程に供した。
【００９９】
胃における消化のシミュレーション（０．１ＭのＨＣｌ／ｐＨ３／１時間の条件でペプシンを使用し、攪拌した）は、遠心分離チューブ（５０ｍｌ）において実施した。胃のシミュレーションにつづいて、腸の段階（０．１ＭのＮａＨＣＯ３／ｐＨ６．９〜７／２時間の条件でパンクレアチンおよび胆汁を使用し、攪拌した）を、１５ＫＤの孔径を有する透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２．１、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ社、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）を備えた、２つの部屋から成るシステムの上側分室（供給側）（１．５ｍｌ）において実施した。下側分室（受け取り側）には、生理食塩水溶液を入れた（１ｍｌ）。消化過程が完了した時点で、胃腸における消化のシミュレーションによって得られたサンプルの上清（４０００ｒｐｍ／５分間／４℃）に含まれるタンパク質の合計含有量、および市販のキット（Ｓｉｇｍａ者、ＴＰ０２００）を使ってローリー法で透析されたサンプルに含まれるタンパク質の合計含有量を定量化した。
【０１００】
（２．インビトロの消化過程後の、グリアジンの各フラクションについてのクロマトグラフィー分析）
グリアジンを分析するために、逆相クロマトグラフィーを適用した。この分離は、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ製１０５０ＨＰＬＣ装置を使って、ＢｉｏＢａｓｉｃ Ｃ１８ カラム（５μｍ ４．６×２５０ｍｍ）を用いて実施した。使用した移動相は、（Ａ）アセトニトリル（ＡＣＮ、ＨＰＬＣ品質）の１５％（ｖ／ｖ）水溶液、および０．１％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ならびに（Ｂ）ＡＣＮの８０％（ｖ／ｖ）水溶液、および０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡからなっていた。使用した溶出勾配は、０分〜５分では溶媒Ｂの５％までの直線勾配、５分〜１２分では溶媒Ｂの２０％までの直線勾配であった。さらに、１００％の溶媒Ｂを使って、カラムを５分間洗浄し、初期条件を使って３分間平衡化させた。サンプルを、ナイロン膜（１３ｍｍ ０．２２ μｍ Ｍｉｌｌｅｘ ＧＮ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使って濾過した。各処理について、３つの独立した等分試料を分析した（１００μｌ）。紫外線領域における吸収を、２１０ｎｍで監視した。
【０１０１】
（３．逆相クロマトグラフィーを電気噴霧ＭｓＭｓ（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）と組み合わせて使った、グリアジンのペプチド配列特定）
四重極イオントラップ（Ｅｓｑｕｉｒｅ−ＬＣ−Ｍｓ（ｎ）、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を備えた質量分光計と組み合わせてＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ系装置を使用し、ＢｉｏＢａｓｉｃ Ｃ１８ カラム（５μｍ ４．６×２５０ｍｍ）において、クロマトグラフィーによる分離を実施した。採用したクロマトグラフィー溶出勾配は、前段に記載したものである。分析では、窒素を噴霧される乾燥気体として使用し、ヘリウムを、約５×１０−３ｂａｒの圧力で分子衝突させるための気体として使用した。衝突のキャピラリー電圧を４ｋＶで維持した。質量スペクトルを、質量／負荷が５００〜５０００の範囲で監視した。この方法により、１５個のスペクトルの平均質量分析（Ｍｓ）および５個のスペクトルの連続質量分析Ｍｓ（ｎ）が示される。質量連続分析を実施するためのイオン電流の限界値を５０００に決定した。前駆体イオンは、０．３９Ｖ〜２．６Ｖの電圧ランプで断片化され、ｍ／ｚ範囲が４．０において単離された。ｍ／ｚスペクトルのデータを、製造業者が提供する分析ソフトウェア（Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ３、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使って処理および変換した。スペクトルＭｓ（ｎ）のペプチド配列を、分析ソフトウェア（ＢｉｏＴｏｏｌｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１ （Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ））を使って決定した。
【０１０２】
（４．胃腸において消化されたグリアジンをビフィドバクテリウム属とともにコ−インキュベートする効果）
第１項で得られた、胃腸において消化されたグリアジンのサンプルを、腸の上皮モデルとして使用される、Ｃａｃｏ−２細胞のトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）の培養物の尖端部分（供給側）に設置した腸のビフィドバクテリウム属（例えば本発明の菌株）の存在下および非存在下においてコインキュベートした。本発明の菌株（ＩＡＴＡ−ＥＳ１）の存在下でのグリアジンの毒性効果の低減を評価することを目的として、ビフィドバクテリウム属の存在下および非存在下、下側分室（受け取り側）のＣａｃｏ−２細胞培養物において、炎症促進性のサイトカインＴＮＦ−αおよびＮＦκＢの合成量を、ＥＬＩＳＡ法により測定した（図３および図４）。
【０１０３】
（結果：胃腸において消化されたグリアジンのサンプルを透析することによって得られた、１５ＫＤ未満のタンパク質画分のＲＰ−ＨＰＬＣ分析）
クロマトグラフィーによって分離したところ（図２）、＃２画分が主要な画分である、５つのペプチド画分の存在が明らかになった。本発明者らの実験室で単離された、異なる菌株（つまり、本発明の菌株（ＩＡＴＡ−ＥＳ１）およびビフィドバクテリウム属 Ａ２）の存在下において、グリアジン由来のペプチドの透析可能性を調べたところ、これらの細菌がグリアジンに対して、具体的には＃２画分に対して、タンパク質分解能力を有することが実証された。＃２画分のもっとも重要な低下を引き起こした菌株は、本発明の菌株（ＩＡＴＡ−ＥＳ１）であり、調査時の条件においてこの画分の１０％を超える量を低下させた。
【０１０４】
〔実施例９：抗原提示に関連する樹状細胞における、グリアジンに誘導される成熟化と炎症促進性の表現型とを制御する、ビフィドバクテリウム属の菌株の能力の評価〕
（１．腸のビフィドバクテリウム属の培養物および評価用糞便サンプルの調製）
上記ビフィドバクテリウム属の菌株を２４時間培養したものを、０．０５％のシステイン（ＭＲＳ−Ｃ）を含有する１０ｍｌのＭＲＳ増殖培地（Ｓｃｈａｒｌａｕ Ｃｈｅｍｉｅ Ｓ．Ａ．社、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）に、１％で播種し、嫌気条件において３７℃で２２時間インキュベートした（ＡｎａｅｒｏＧｅｎ； Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、ＵＫ）。遠心分離（６，０００ｇ、１５分間）によって、細胞を回収し、ＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、２０％のグリセロールを含有するＰＢＳで再懸濁した。これらの懸濁液の等分試料を液体窒素により凍結させ、−８０℃で保存した。凍結・融解サイクルを経た後の生細胞の個数を、４８時間のインキュベーションの後にＭＲＳＣ寒天プレート上で計数することによって同定した。生存能は、どの場合にも９０％を超えていた。等分された各試料は１回の試験にのみ使用した。これを細胞刺激のために使用する前に、遠心分離によって細胞を洗浄し、ＰＢＳで再懸濁した。
【０１０５】
（２．末梢血液から得られた樹状細胞（ＤＣ）の単離および活性化）
ヘパリンを含むチューブにおいて、４人の健康なボランティア（２４歳〜４０歳、平均年齢３０歳）の末梢血液から、ＰＢＭＣを単離した。このＰＢＭＣは、フィコール勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において遠心分離によって単離した。ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）を用いて細胞を洗浄し、１０の％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｓｉｇｍａ社）をさらに含有するＲＰＭＩ１６４０培地により１×１０６個／ｍｌの密度に調節した。そのＰＢＭＣを、刺激剤の存在下または非存在下で、平底型２４ウェルのポリスチレン製プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）において、５％のＣＯ２のもとで、３７℃で２４時間インキュベートした。ビフィドバクテリウム属および他の腸内細菌の存在下および非存在下で、刺激としてグリアジン（０．１ｍｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（１５０ＵＩ）を使用した。ポジティブコントロールとして、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４の、精製されたリポ多糖類（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ネガティブコントロールとして、非活性化されたＰＢＭＣにおけるサイトカインの産生量について試験を行なった。刺激については、各種類を各実験につき二回ずつ試験した。培養液の上清を、遠心分離によって回収し、分割し、等分試料の形態で、サイトカインの検出まで−２０℃で保存した。
【０１０６】
（３．サイトカインおよび細胞性活性化マーカーの同定）
ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造業者の指示にしたがって使用して、上述した上清のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−β）の濃度を測定した。ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で標識をしたＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＣＤ８３に対する抗体を用いて、活性化分子のマーカーを検出し、フローサイトメトリー（フローサイトメーターＥＰＩＣＳ（登録商標）ＸＬ−ＭＣＬ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ 、Ｆｌｏｒｉｄａ）によって定量化した。
【０１０７】
（結果）
本発明の菌株（ＩＡＴＡ−ＥＳ１）は、ＩＦＮ−γの産生量を少なくとも１０％低下させた。なお、ＩＦＮ−γは、セリアック病患者においてグリアジンに応答して産生される主要な炎症性のサイトカインであり、グリアジンおよび他の潜在的に炎症促進性を有する腸内細菌（例えば、セリアック病患者から単離されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよび腸内細菌）を有する樹状細胞の活性化によって誘発される。さらに、本菌株は、樹状細胞による抗炎症のサイトカインＩＬ−１０の合成量を、グリアジンを用いた活性化によってなされた効果に比較すると少なくとも２００％増加させた。本発明の菌株（ＩＡＴＡ−ＥＳ１）は、グリアジンおよびＩＦＮ−γの存在下で樹状細胞をインキュベートした後に誘導されるＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６分子の発現を、１５％から２０％低減させた。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】グリアジンの異なる消化のタンパク質のプロファイルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。パネルＡ：１）ペプシンを用いて消化した後のグリアジン（Ｇ−Ｐ）のコントロール；２）ペプシンおよびトリプシンを用いて消化した後のグリアジン（Ｇ−Ｐ−Ｔ）のコントロール；３）本発明の菌株とともにインキュベートしたＧ−Ｐ；４）本発明の菌株（ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＴＡ−ＥＳ１）とともにインキュベートしたＧ−Ｐ−Ｔ。パネルＢ：１）コントロールＧ−Ｐ；２）コントロールＧ−Ｐ−Ｔ；３）本発明の菌株およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ７１２とともにインキュベートしたＧ−Ｐ；４）本発明の菌株およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＤＯ７１２とともにインキュベートしたＧ−Ｐ−Ｔ。
【図２】インビトロによるグリアジンの消化の透析可能な画分から得られるクロマトグラムを示す。ピーク２が、本発明の菌株によって加水分解されたと考えられるピークである。
【図３】インビトロにおけるビフィドバクテリウム属の存在下または非存在下で、グリアジン（Ｇｌｄ）の、溶解性を有し消化される画分によって引き起こされる細胞の生存能の変化（リソソーム内の活性として測定）を示す。ウシアルブミン（ＢＳＡ）（ネガティブコントロール）；ＢｉｆＡ２（ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂ． ａｎｉｍａｌｉｓ））；Ｂｂ（ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ））、およびＢＬ（本発明の菌株；ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＩＡＴＡ−ＥＳ１−）。結果は平均値で示し、標準偏差は４通りにて決定する。
【図４】インビトロにおけるビフィドバクテリウム属の存在下または非存在下で、グリアジン（Ｇｌｄ）の、溶解性を有し消化される画分に曝されるＣａｃｏ−２細胞培養における、炎症促進性のサイトカイン（ＴＮＦ−α）の生成および核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の発現。ウシアルブミン（ＢＳＡ）（ネガティブコントロール）；ＢｉｆＡ２（Ｂ． ａｎｉｍａｌｉｓ）；Ｂｂ（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ）、およびＢＬ（本発明の菌株；Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ ＩＡＴＡ−ＥＳ１−）。結果は平均値で示し、標準偏差は４回繰り返すことにより決定する。
【受託番号】
【０１０９】
ＣＥＣＴ ７３４７
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、食品産業分野および薬剤分野に関し、具体的には、プロバイオティクス分野、ならびにこれから派生する、機能性食品および新規な食品、プロバイオティクス、シンバイオティクス、栄養補助食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）または食品サプリメント、および臨床的に応用可能な薬剤組成物の形の製品に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
セリアック病は、穀類のグルテンタンパク質に対する慢性的不耐性によって引き起こされ、遺伝的素因を有する患者が罹患する、免疫性の腸疾患、つまり腸の疾患の一種である。この疾患は、臨床的には広範囲の疾患を指し、典型的形態、非典型的形態、無症候性形態、および潜在性形態などを含む。典型的形態は、生後数年間（６ヶ月〜２４ヶ月）にもっとも頻繁に存在し、主に腸の症状および関連する変化（吸収疾患、慢性の下痢、体重減少、腹部膨満、成長遅延など）を伴って現れる。セリアック病は、現在もっともよくみられる慢性疾患であり、有病率は一般的な集団の０．７％〜２．０％、第一度近親者の１５％〜２０％に達する。さらに、グルテンの摂取およびセリアック病は、他の障害にも関連しており、例えば、ダウン症候群、１型糖尿病、疱疹状皮膚炎、ミオパチー、多発性硬化症、関節炎、自閉症、統合失調症、鬱病、リンパ腫、および運動失調などがその例としてあげられる。グルテン摂取と、精神性障害、神経性障害、および行動性障害との間の関係は、エグゾーフィン（ｅｘｏｒｐｈｉｎｓ）などの、オピオイド活性を有する生理活性ペプチドの生成の結果であると考えられている。
【０００３】
グルテンタンパク質（グリアジン、および類似のプロラミンおよびグルテニン）は、セリアック病およびその他の関連する障害を引き起こす、主要な環境的要因を代表するものである。これらのタンパク質は、プロリンおよびグルタミンに富んだペプチド配列を含有しているので、食品中の他のタンパク質に比べて消化酵素に対する耐性が強く、腸管腔中に残存できる。遺伝的素因を有する患者にとって、これらのペプチドは、自然免疫系および適応免疫系の両方が関与する異常反応の原因となる。この異常反応は、広く、腸の粘膜の慢性的炎症、上皮内リンパ球の増加、陰窩の過形成、および腸の絨毛の進行性悪化（絨毛が全く消滅することもある）につながる。グルテンの摂取につづいて生成される毒性のペプチドは、腸の上皮を通過することがあり、好ましくは組織におけるトランスグルタミナーゼの作用による脱アミド化につづいて、抗原提示細胞のＨＬＡ−ＤＱ２またはＨＬＡ−ＤＱ８分子によって認識される。こうすることによって、このペプチドはＴ細胞受容体に提示され、Ｔ細胞受容体を活性化する。これには、ＣＤ４抗原（ヘルパー（Ｔｈ）とも呼ばれる）の発現およびリンパ球亜集団への分化が関与し、それゆえ、獲得免疫が関与する。Ｔｈ２の亜集団は、Ｂ細胞と相互作用をし、Ｂ細胞は、血漿細胞に分化して抗−グリアジン抗体、抗−筋内膜抗体、および抗−組織トランスグルタミナーゼ抗体を産生する。亜集団Ｔｈ１は、炎症促進性のサイトカイン（主にＩＦＮ−γ）分泌の増加およびＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０比の増加の原因となる（Salvati et al 2005. Recombinant human interleukin 10 suppresses gliadin dependent T cell activation in ex vivo cultured coeliac intestinal mucosa. Gut. 54: 46-53）。グルテンペプチドは、さらに、サイトカインＩＬ−１５によって媒介される、腸の上皮における応答を引き起こし、これには自然免疫系が関与している（Green and Jabri 2006. Celiac disease. Ann Rev Med. 57:207-21）。摂取されたグリアジンは、上皮細胞におけるＩＬ−１５の産生を促進するが、この産生が、上皮内細胞の傷害性ＣＤ８のＴリンパ球のクローン増殖およびＩＦＮ−γの発現を助ける（Jabri et al. 2000. Selective expansion of intraepithelial lymphocytes expressing the HLA-E-specific natural killer receptor CD94 in celiac disease. Gastroenterology. 118 :867-79; Mention et al., 2003. Interleukin 15: a key to disrupted intraepithelial lymphocyte homeostasis and lymphomagenesis in celiac disease. Gastroenterology. 125: 730-45; Forsberg et al. 2007. Concomitant increase of IL-10 and pro-inflammatory cytokines in intraepithelial lymphocyte subsets in celiac disease. Int Immunol. 2007:19, 993-1001）。また、セリアック病患者の腸の細菌叢の組成は、コントロールとなる健常者の組成と比較すると不均衡であり、炎症促進性を有する細菌が圧倒的に多く、また、乳酸菌およびビフィドバクテリウム属の比率が低いことを特徴としている（Sanz et al., 2007. Differences in faecal bacterial communities in coeliac and healthy children as detected by PCR and denaturing gradient gel electrophoresis. FEMS Immunol Med Microbiol. 51(3):562-8. Nadal et al., 2007. Imbalance in the composition of the duodenal microbiota of children with coeliac disease. J Med Microbiol. 2007 Dec; 56(Pt 12):1669-74; Collado et al. 2009. Specific duodenal and faecal bacterial groups are associated with paediatric celiac disease. J Clin Pathol. 62: 264-269）。活動型セリアック病やその他の関連する障害の場合には、腸管腔および上皮における、グルテンと有害な細菌の増加との組み合わせは、トリガー因子として作用するか、または病理過程および炎症促進性反応を助けるかしうる。同様に、ある細菌種の存在または非存在は、グルテン毒性を助けるか、あるいはグルテン毒性に対して防御するかしうる。
【０００４】
セリアック病は発生率が高く、重症度も高いが、いまのところセリアック病患者に対する治療法は存在しない。唯一の代替策は、生涯にわたってグルテンを含まない食事を厳格に続けることである。この食事に関する勧告に従うことは困難であり、患者は、胃腸症状、栄養疾患、および健康に対するさらに高いリスク（免疫不全、骨粗鬆症、不妊性、癌など）に苦しみ続けることになる。また、患者の腸の生態系のバランスは、完全に復元されることはない。また、不応性セリアック病（５％〜１０％）の患者は、この食事に関する勧告に対して反応を示さない。
【０００５】
現在研究中の、セリアック病治療のための別の治療法またはコ−アジュバントとしては、植物または微生物から得られるタンパク質分解酵素を経口投与して、グルテンペプチドの胃腸での消化を加速させるというものがある（Shan et al. 2005. Enzyme treatment of foodstuffs for celiac sprue. 米国特許出願公開第２００５／０２４９７１９号明細書; Marti et al. 2006. Prolyl endopeptidase mediated destruction of T cell epitopes in whole gluten. 米国特許出願公開第２００６／０２８６６０１号明細書; Stepniak y Koning. 2006. Enzymatic gluten detoxification: the proof of the pudding is in the eating! Trends Biotechnol. 24:433-4; Gass et al. 2007. Combination enzyme therapy for gastric digestion of dietary gluten in patients with celiac sprue. Gastroenterology. 133:472-80）。この治療方法の有効性は、タンパク質製剤およびペプチド製剤、またはその組み換え型の等価物を使って、モデル系においては実証されている。しかし、インビボにおける有効性を実証するために、食品中に存在するグルテンを摂取する個々の患者において実施する研究がさらに必要である。この治療法は、グルテンを含まない食事におけるアジュバントとして潜在的な利点を有するものの、その効果は酵素製剤の摂取時刻に大きく依存し、たまたまグルテンを摂取した場合の毒性の閾値を低下させるだけである。その他の提案されている代替物としては、組織トランスグルタミナーゼ阻害剤の化合物の開発（Khosla et al., 2006. Transglutaminase inhibitors and methods of use thereof、国際公開第２００７０２５２４７号パンフレット）、グリアジンペプチドを捕捉可能な抗体（Fox, 2007. Antibody therapy for treatment of diseases associated with gluten intolerance. 米国特許出願公開第２００７／０１８４０４９号明細書）、グルテンペプチドがＨＬＡ−ＤＱ２またはＨＬＡ−ＤＱ８分子に結合する部位をブロックする化合物（Sollid et al. 2007. Drug therapy for celiac sprue. 米国特許出願公開第２００７／０１６１５７２号明細書；Peakman and Chicz. 2007. Peptide epitopes recognized by disease promoting CD4+ T lymphocytes. 米国特許出願公開第２００７／０１４２６２２号明細書）、ＩＦＮ−γなどの炎症促進性のサイトカイン拮抗薬（Maroun et al., 2007. Interferon antagonists useful for the treatment of interferon related diseases. 米国特許出願公開第２００７／０１６０６０９号明細書）、組み換え型の制御性サイトカインの経口投与（Salvati et al., 2005. Recombinant human interleukin 10 suppresses gliadin dependent T cell activation in ex vivo cultured coeliac intestinal mucosa. Gut. 2005; 54:46-53）、炎症反応に関与する接着分子の阻害剤、および傍細胞透過性の増加の原因となるゾヌリンの拮抗薬（Paterson and Ginski. 2007. Formulations for a tight junction effector 米国特許出願公開第２００７／０１９６５０１号明細書）などがある。これらの治療方法を実施するには、関与する分子をいくつかの生物学的プロセスにおいて修飾することが必須であり、この分子を使用することによって、望ましくない二次的な効果が生じる可能性がある。食品産業の分野では、ある品種のコムギを遺伝子操作したり、穀類の発酵プロセスにおいて、毒性のエピトープを分解できるタンパク質分解酵素および乳酸桿菌を使用したりすることによって、人が摂取する食品における、毒性のエピトープの存在を排除する方法が開発されている。以上のように、これらの研究の目的は、セリアック病それ自体を予防または治療するのではなく、セリアック病患者の食事を改善し、より多種多様な製品をセリアック病患者に提供することである（Rizzello et al. 2007. Highly efficient gluten degradation by lactobacilli and fungal proteases during food processing: new perspectives for celiac disease. Appl Environ Microbiol.73:4499-507）。
【０００６】
本発明の基本原理は、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｅｎｕｓ）に属する菌株を、セリアック病およびそれに関連する障害の治療および予防のために、プロバイオティクスまたは医薬製剤として使用することである。これを目的として特異的に選別されたビフィドバクテリウム属は、多数の利点を有する。ビフィドバクテリウム属は、新生児の腸管にコロニーを形成するという特殊な能力を有し、この能力によって、新生児の防御（免疫による防御も、その他の防御も含む）の発達と、食事に含まれる抗原に対する経口免疫寛容とに大きく寄与する。この細菌群は、生後数年間、特に母乳で育てられた子供の、腸の細菌叢における主要な構成要素の一つである。
【０００７】
〔発明の概要〕
本発明は、免疫応答を調節できる微生物または菌株を選別する方法を提供する。これらの微生物は、好ましくはビフィドバクテリウム属に属する微生物であって、免疫調節能力を有するので、免疫性疾患、例えばセリアック病の治療または予防に使用可能である。
【０００８】
また、本発明は、ビフィドバクテリウム属の新しい菌株（ＣＥＣＴ ７３４７；以後「本発明の菌株」と称する）（ＩＡＴＡ−ＥＳ１）、その細胞成分、その代謝の結果生じる分泌分子および分泌化合物、ならびにこれらの相互の、および／またはこれらと他の微生物もしくは生理活性化合物との組み合わせのいずれかを、セリアック病およびグルテン摂取に関連するその他の障害（アレルギー、自閉症、運動失調、糖尿病、多発性硬化症など）に罹患している個々の患者に対し、リスクを低減させるとともに、健康と生活の質とを向上させるように設計された製剤の形態にて、提供する。
【０００９】
本発明の菌株は、健康な母乳栄養児の糞便から単離され、１６ Ｓ ｒＲＮＡおよびｔｕｆ遺伝子の配列を決定することによって同定された。この菌株は、セリアック病およびその関連疾患（多発性硬化症、糖尿病、運動失調、など）に特徴的なＴｈ１型炎症促進性応答を制御することができる、免疫調節特性を有する。また、この菌株は、コムギタンパク質およびその他の穀類タンパク質の摂取に起因する、食物性タンパク質に対するＩｇＥ依存性アレルギー症に特徴的なＴｈ２型免疫応答を制御することができる、免疫調節特性を有する。本発明の菌株は、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ； ＰＢＭＣ）において、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γおよび炎症促進性のサイトカインＩＬ−１の産生量を抑制し、制御性のサイトカインＩＬ１０およびＴＧＦ−βの産生量を増加させることを特徴とする。本発明の菌株によって誘導されるこのようなサイトカインのプロファイルは、すべてのビフィドバクテリウム属およびヒトの腸内乳酸菌によく見られる特徴ではなく、また、本発明の菌株は、病気にかかりやすくなっている個々の患者において、グルテンタンパク質によって引き起こされる異常免疫応答を調節するのに特に適している。本発明の菌株と他の微生物（例えばビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）ＡＴＣＣ１５７０７）とを組み合わせれば、これらの病状に特徴的な炎症のプロセスの制御に役立つ、制御性のサイトカインＩＬ−１０の合成を増強することができる。これらの非生存細菌（例えば、加熱、凍結−解凍、照射などの各種方法で不活性化された細菌）では、細菌の免疫調節特性が維持されている。
【００１０】
本発明の菌株は、上述の疾患の原因となるグルテンペプチドを取り込んで加水分解することができ、こうして、毒性のエピトープの濃度およびその潜在的な病原性を低減させることができる。本発明の菌株は、グルテンタンパク質によく見られるプロリンを含有する基質を加水分解するための、特異的なペプチダーゼを有する。この菌株を、多様な特異性を有し、互いの作用を補完できるペプチダーゼを有する他のビフィドバクテリウム菌株と組み合わせると、有毒なエピトープの分解を助ける。ビフィドバクテリウム菌株と、他の微生物、例えば細胞壁にアンカーされたプロテイナーゼを有する、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ７１２などとの組み合わせは、ビフィドバクテリウム菌株の作用のみによる加水分解の効果をさらに増強できる。
【００１１】
本発明の菌株は、上記グルテンペプチドによって誘発される免疫応答を、
（ｉ）制御性のサイトカイン（ＩＬ−１０）の合成を誘導し、（ｉｉ）自然免疫応答および適応免疫応答に由来する炎症促進性のサイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−８、およびＩＬ−１５の産生を低減し、（ｉｉｉ）核内因子κＢ（実施例３、表３）によって媒介される炎症促進性の経路を阻害することによって調節することができる。
【００１２】
本発明の菌株および該菌株に由来する化合物はまた、どちらも、炎症を促進する潜在的な病原性因子を有するセリアック病患者の腸内の細菌叢から単離される病原菌を阻害することができ、腸のバランスの再確立を助けることができる（実施例４、表４および表５）。これらの菌株はまた、活動型セリアック病の患者およびグルテンを含まない食事を摂っている患者の、炎症促進性のサイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）の合成を低減させ、かつ、制御性のサイトカイン（ＩＬ−１０）の合成を増加させることによって、腸内細菌の炎症促進性応答を阻害することができる。
【００１３】
本発明の菌株はまた、栄養分の消化ならびにセリアック病患者に特徴的な吸収疾患および栄養障害症候群の改善を助ける、代謝活性（例えば、ホスファターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、およびＮ−アセチル−グルコサミニダーゼ）を有する。
【００１４】
本発明の菌株は、ムチン（１％〜４％）に接着する能力を有し、胃腸がストレスを受けている条件下（ｐＨが酸性であり、胆汁の濃度が高い；実施例５、表６および表７）でも、また、食品の貯蔵および準備の技術的プロセス（例えば、冷蔵、凍結乾燥、発酵など）においても安定である。インビボでは、本発明の菌株は、経口投与された後、ヒトの体内を通過しても生存することができる。これらすべての性質が、本発明の菌株が腸内で遷延的な持続性および有効性を有すること、ならびにプロバイオティクスおよびシンバイオティクス（プロバイオティクスとプレバイオティクスとの組み合わせ）として使用できることを保証している。さらに、この性質は、本発明の菌株が、セリアック病やその他のグルテン摂取に関連する疾患を有する被験者のリスクを低減し、被験者の健康および生活の質を向上させるための機能性食品、新規食品、食品サプリメント、栄養補助食品、および薬物の形態で使用できることも保証している。
【００１５】
上述のように、本発明の第１の態様は、食物アレルギーに対する免疫応答を調節することができる微生物または微生物の菌株を選別するための方法に関し、該方法は、（ａ）健常者（好ましくは母乳栄養児）から得られるサンプル（好ましくは糞便）から微生物を単離する段階と、（ｂ）免疫応答を調節し、食物アレルギー（好ましくはセリアック病）を引き起こす少なくとも１つの媒介物の作用機構を加水分解、不活性化、または妨害することができる、上記段階（ａ）の微生物を選別する段階とを含む。好ましくは、段階（ａ）で選別される微生物が、潜在的なプロバイオティクス属または種に属する。好適な実施形態では、段階（ａ）で得られる微生物によって調節される上記免疫応答が、Ｔｈ１型またはＴｈ２型の炎症促進性応答である。また、段階（ａ）および段階（ｂ）で得られる微生物が、上記免疫応答の調節能力の替わりに、あるいは、上記免疫応答の調節能力に加えて、腸内バリア機能を向上させる上皮細胞の生存能および／または完全性を増加させる能力が得られるように、選別されてもよい。
【００１６】
上記方法によって選別される微生物、つまり、食物アレルギーを引き起こす少なくとも１つの媒介物の作用機構を加水分解、不活性化、または妨害し、免疫応答を調節することができる微生物は、食物アレルギーの治療または予防のために使用され得る（以後「本発明の微生物」と称する）。そのため、本発明の第２の態様は、これらの微生物を医薬または食品組成物として使用する方法、好ましくはこれらの微生物を食物アレルギーの治療または予防のために使用する方法に関する。これらの微生物は、どの細菌の属または種に属していてもよく、好ましくはビフィドバクテリウム属、さらに好ましくはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）種に属する。
【００１７】
本発明の第３の態様は、受託番号ＣＥＣＴ ７３４７の菌株に関する。
【００１８】
本発明の第４の態様は、本発明の微生物のうちの少なくとも一つを含む組成物（以後「本発明の組成物」と称する）に関する。好ましくは本発明の菌株に関し、さらに、好ましくは本発明の菌株が上記組成物内に０．１％〜９９．９％、好ましくは１％〜９９％、さらに好ましくは１０％〜９０％の比率で存在する。この組成物は、さらに、例えば、本発明の微生物または本発明の菌株の免疫調節能力、または食物アレルギーを引き起こす媒介物の作用機構を加水分解、不活性化、もしくは妨害する能力などを増強する他の微生物または培地を含んでもよい。
【００１９】
本発明の第５の態様は、本発明の微生物に由来する生理活性化合物から得られる組成物に関し、この本発明の微生物の例としては、例えば、本発明の微生物のうちのいずれかの微生物の培養物の上清（以後「本発明の上清」と称する）、本発明の微生物のうちのいずれかの微生物または本発明の菌株の、純粋培養物または混合培養物から得られる抽出物（以後、「本発明の抽出物」と称する）、および当該技術分野において当業者に公知の物理化学的手法および／または生物工学的手法を使って得られる、本発明の微生物または本発明の菌株によって分泌される、細胞成分（つまり細胞成分分画）、代謝物、および生成物などがあげられる。なお、これらの例は本発明を説明するためのものであり、本発明の権利範囲を限定するものではない。これらの本発明の微生物により生成された生理活性化合物（以後「本発明における生成された生理活性化合物」と称する）を、食品、食品サプリメント、栄養補助食品、プロバイオティクスまたはシンバイオティクスに基づいた生成物、新規食品、または医薬の調製に使用してもよい。また、同様に、本発明の微生物の、これらとは異なる使用方法も、本発明の一部である。
【００２０】
本発明の別の態様は、本発明の組成物、または本発明の少なくとも１つの微生物、好ましくは本発明の菌株を含む食用品の調製のためのサポート材料に関する。好適な実施形態では、本発明の微生物は、サポート材料中に、少なくともサポート材料１ｇに対して約１０５ｃｆｕ／ｇ、好ましくは１０６ｃｆｕ／ｇ〜１０１２ｃｆｕ／ｇ、さらに好ましくは１０６ｃｆｕ／ｇ〜１０１０ｃｆｕ／ｇの量が含有されている。上記の記載によれば、本発明の組成物または本発明のサポート材料を含む任意の食用品または食品サプリメントも、本発明の一部である。
【００２１】
本発明の別の態様は、本発明の組成物、本発明に由来する生理活性化合物、本発明の上清、本発明の抽出物、本発明の微生物、本発明の菌株、および必要に応じて、薬理的に受容可能な培地および／または賦形剤のうちの、いずれかの化合物を含む薬学的組成物または食品組成物に関する。上記薬学的組成物または食品組成物が必ず含有しなければならない微生物の量には、その微生物の治療対象として設計される病状の種類によってばらつきがある。好ましくは、この病状は食物アレルギー、さらに好ましくはセリアック病である。食品組成物の調製の場合、また、本発明によれば、少なくとも１つの本発明の微生物または本発明における生成された生理活性化合物が、サポート材料中に、本発明の微生物の場合であれば、好ましくは、サポート材料１ｇに対して１０５ｃｆｕ／ｇ〜１０１４ｃｆｕ／ｇ、さらに好ましくは約１０８ｃｆｕ／ｇ〜１０１３ｃｆｕ／ｇ、さらに好ましくは１０７ｃｆｕ／ｇ〜１０１２ｃｆｕ／ｇの量で、また、本発明における生成された生理活性化合物の場合であれば、０．１％〜９９．９％、好ましくは１％〜９９％、さらに好ましくは１０％〜９０％の比で組み込まれる。これらの食品組成物は、栄養補助食品、機能性食品、プロバイオティクス、シンバイオティクス、栄養補助物、または好ましくは食物アレルギー、さらに好ましくはセリアック病の治療または予防のために設計される、その他の任意の種類の製品の調製に使用可能である。
【００２２】
本発明の薬学的組成物または本発明の食品組成物は、好ましくは錠剤、カプセル、マイクロカプセル、粉末、溶液、ペーストなどの形態中に含まれ得る。
【００２３】
本発明の別の態様は、本発明の組成物、本発明における生成された生理活性化合物、本発明の上清、本発明の抽出物、本発明の薬学的組成物、本発明の細胞成分分画、本発明の食品組成物、または本発明のサポート材料に関し、本発明の微生物または本発明の菌株が他の微生物、該微生物の培養物から得られる上清、または該微生物の細胞成分分画と組み合わせられる。好ましくは、この微生物は、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属し、好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）種に属し、さらに好ましくはラクトコッカス・ラクティスＮＣＤＯ７１２株に属する。
【００２４】
本発明の最後の態様は、本発明の組成物の別の提供形態に関し、該組成物は、食品、栄養補助食品、医薬製剤、食品サプリメント、プロバイオティクスもしくはシンバイオティクス、または新規食品として調製されてもよい。
【００２５】
〔定義〕
母乳栄養児：本説明全体を通じて、本用語は、好ましくは主に母乳で育てられた健常者、好ましくは主に母乳で育てられた年齢が２歳未満の健常者、さらに好ましくは主に母乳で育てられた年齢が１歳未満の健常者、さらに好ましくは主に母乳で育てられた年齢が６ヶ月未満の健常者を指す。
【００２６】
健常者：本用語は、好ましくは、専門医師の基準によれば、いかなる種類の慢性の病理または急性の病理にも罹患していない人を指す。好ましくは、この病理は腸の上皮の炎症を誘発するものであり、さらに好ましくはセリアック病である。
【００２７】
食物アレルギー：本説明全体を通じて、好ましくは、本用語は、好ましくは乳、卵、豆類、ナッツ類、甲殻類、魚類、軟体動物類、ゴマ、ヒマワリの種子、ワタの種子、ポピーの種子、豆類、エンドウマメ類、およびレンズマメ類によって引き起こされる食物アレルギーを指し、さらに好ましくはグルテンによって引き起こされる食物アレルギーを指す。
【００２８】
Ｔｈ１型炎症促進性応答：コントロールに比較して、好ましくは少なくとも１００倍、さらに好ましくは少なくとも１５倍、さらに好ましくは少なくとも１０倍、さらに好ましくは少なくとも４倍の、Ｔｈ１型サイトカインの大量生成、好ましくはサイトカインＩＦＮ−γの大量生成を引き起こす刺激に対する応答を指す。
【００２９】
Ｔｈ２型炎症促進性応答：コントロールに比較して、少なくとも１００倍、さらに好ましくは少なくとも１５倍、さらに好ましくは少なくとも１０倍、さらに好ましくは少なくとも４倍の、Ｔｈ２型サイトカインの大量生成、好ましくはサイトカインＩＬ４の大量生成を引き起こす刺激に対する応答を指す。
【００３０】
潜在的なプロバイオティクス属または種：好ましくは本説明全体を通じて、本用語は、以下の系統学的部門および原核生物属の種および菌株を指す。すなわち、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ヴェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、フソバクテリウム門（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ属（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）、フィブロバクター属（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓ）、デフェリバクター属（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、シアノバクテリア属（Ｃｉａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、メタノブレビバクター属（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、コプロコッカス属（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ズブドリングラヌラム属（Ｓｕｂｄｏｌｉｎｇｒａｎｕｌｕｍ）、ドレア属（Ｄｏｒｅａ）、ブレイジア属（Ｂｕｌｌｅｉｄｉａ）、アナエロフスティス属（Ａｎａｅｒｏｆｕｓｔｉｓ）、双子菌属（Ｇｅｍｅｌｌａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、カテニバクテリウム属（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、アナエロトランカス属（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ファエカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、パラバクテロイデス属（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アッケフマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブチリビブリオ属（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）などである。また、酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）などの菌類およびイースト菌の種および菌株をも指す。
【００３１】
培地：本用語は、好ましくは、本発明の医薬、栄養性の組成物、組成物、サポート材料、上清、および食品の調合において使用するための、本発明の微生物におけるいずれかの特徴（例えば、安定性、免疫調節能力、アレルギーを引き起こす媒介物を接着する能力、発酵させる能力、加水分解する能力、または不活性化する能力など）を向上させる、好ましくは、培養液、基質、プレバイオティクス、ファイバ、生理活性化合物、賦形剤、成分などを指す。
【００３２】
サポート材料：好ましくは、サポート材料とは、乳、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、発酵乳に基づく食用品、発酵穀類、小麦粉、ジュース、糖、ケーキ、アイスクリーム、子供用剤形などから選別される食品組成物である。
【００３３】
医薬：本説明全体を通じて、本用語は、薬学的組成物または剤形を指し、好ましくは、アレルギー、食物アレルギー、腸の炎症性疾患、胃腸の感染症および病原性微生物またはその毒素の転移、腸のバランスの変化（腸内毒素症）、細菌性過成長、腸の透過性の変化、食品に対する不耐性、セリアック病、吸収不良症候群などの治療または予防のために設計された薬学的組成物または剤形を指す。
【００３４】
食品組成物：本説明全体を通じて、本用語は、食品（機能的食品、既存の食品、および新規食品）、食品サプリメント、栄養摂取を目的とした処方物、および好ましくはアレルギー、食物アレルギー、腸の炎症性疾患、胃腸の感染症および病原性微生物またはその毒素の転移、腸のバランスの変化（腸内毒素症）、細菌性過成長、腸の透過性の変化、食品に対する不耐性、セリアック病、吸収不良症候群などの治療または予防のために設計された栄養補助食品を指す。
【００３５】
微生物に由来する生理活性化合物：構造的部分、細胞成分、細胞成分分画、代謝物、または分泌される分子として、微生物の一部を形成するいずれかの化合物または分子を指す。なお、これらの化合物または分子は、例えば、遠心分離、濾過、凍結乾燥、沈殿、超音波処理、機械的および化学的細胞攪乱、酵素および／または化学的媒介物を使った培養物からの化合物抽出、クロマトグラフィーの手法を使った分離、クローニング、および健康に有益な機能を実施できる生理活性分子をコードする遺伝子の過剰発現を含む、物理化学的手法または生物工学的手法によって得られる。
【００３６】
〔図面の簡単な説明〕
（図１）
グリアジンの異なる消化のタンパク質のプロファイルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。パネルＡ：１）ペプシンを用いて消化した後のグリアジン（Ｇ−Ｐ）のコントロール；２）ペプシンおよびトリプシンを用いて消化した後のグリアジン（Ｇ−Ｐ−Ｔ）のコントロール；３）本発明の菌株とともにインキュベートしたＧ−Ｐ；４）本発明の菌株（ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＴＡ−ＥＳ１）とともにインキュベートしたＧ−Ｐ−Ｔ。パネルＢ：１）コントロールＧ−Ｐ；２）コントロールＧ−Ｐ−Ｔ；３）本発明の菌株およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ７１２とともにインキュベートしたＧ−Ｐ；４）本発明の菌株およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＤＯ７１２とともにインキュベートしたＧ−Ｐ−Ｔ。
【００３７】
（図２）
インビトロによるグリアジンの消化の透析可能な画分から得られるクロマトグラムを示す。ピーク２が、本発明の菌株によって加水分解されたと考えられるピークである。
【００３８】
（図３）
インビトロにおけるビフィドバクテリウム属の存在下または非存在下で、グリアジン（Ｇｌｄ）の、溶解性を有し消化される画分によって引き起こされる細胞の生存能の変化（リソソーム内の活性として測定）を示す。ウシアルブミン（ＢＳＡ）（ネガティブコントロール）；ＢｉｆＡ２（ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂ． ａｎｉｍａｌｉｓ））；Ｂｂ（ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ））、およびＢＬ（本発明の菌株；ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＩＡＴＡ−ＥＳ１−）。結果は平均値で示し、標準偏差は４通りにて決定する。
【００３９】
（図４）
インビトロにおけるビフィドバクテリウム属の存在下または非存在下で、グリアジン（Ｇｌｄ）の、溶解性を有し消化される画分に曝されるＣａｃｏ−２細胞培養における、炎症促進性のサイトカイン（ＴＮＦ−α）の生成および核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の発現。ウシアルブミン（ＢＳＡ）（ネガティブコントロール）；ＢｉｆＡ２（Ｂ． ａｎｉｍａｌｉｓ）；Ｂｂ（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ）、およびＢＬ（本発明の菌株；Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ ＩＡＴＡ−ＥＳ１−）。結果は平均値で示し、標準偏差は４回繰り返すことにより決定する。
【００４０】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、食物アレルギーにおける免疫応答を調節することができる、微生物または微生物の菌株を選別するための方法に関し、（ａ）健常者（好ましくは母乳栄養児）から得られるサンプルから微生物を単離するステップと、（ｂ）免疫応答を調節し、食物アレルギー（好ましくはセリアック病）を引き起こす少なくとも１つの媒介物の作用機構を加水分解、不活性化、または妨害することができる、先のステップの微生物を選別するステップとを含む。好ましくは、ステップａ）で選別される微生物が、潜在的なプロバイオティクス属または種に属する。
【００４１】
本発明の別の態様は、食物アレルギーを引き起こす少なくとも１つの媒介物の作用機構において、加水分解、不活性化、または妨害し、免疫応答を調節することができる微生物に関する。これらの微生物は、好ましくは、食物アレルギー、腸の炎症性疾患、腸内生態系（腸内毒素症）の不均衡、細菌性過成長、吸収不良症候群、胃腸の感染症および病原性微生物またはその毒素の転移、および腸の透過性の変化の治療または予防のために使用可能である。
【００４２】
本発明は、さらに、各種作用機構を利用することによって、グルテンの摂取に関連する疾患に罹患しているまたは罹患しやすくなっている個々の患者のリスクを低減し、健康状態を向上させる剤形を生成するために有用な微生物を提供し、該微生物が、健常者の腸内の細菌叢から抗炎性および制御性を得るために単離および選別された、非遺伝的に修正された微生物であることを特徴とする。
【００４３】
該微生物の複数の作用機構には、（ｉ）グルテンの毒性および免疫原性を有するペプチドによって引き起こされる自然免疫応答および適応免疫応答を制御すること、（ｉｉ）グルテンペプチドを輸送および加水分解することによって、腸管腔中の毒性のエピトープの濃度を低減すること、（ｉｉｉ）セリアック病患者の胃腸管から単離される、細菌またはその他の炎症促進性を有する媒介物および病原性因子に対して作用する、防御バリア機能を強化すること、（ｉｖ）これらの患者に典型的な吸収不良症候群を和らげるために、ペプチダーゼに加えて、栄養分の消化および供給を助ける酵素活性を提供することなどが含まれる。ただし、これらの作用機構は例示にすぎず、本発明の権利範囲を限定するものではない。本微生物は、上述した効果以外に、以下に列挙する有益な効果を奏することができる。すなわち、炎症に関連する酸化ストレスの低減、腸の透過性の制御、保護機能を有する有益なグラム陽性菌のコロニー形成の支持、抗原提示細胞の機能の制御、毒性のペプチドと宿主の免疫適格性上皮細胞との相互作用の阻害、金属プロテアーゼとの相互作用、細胞周期およびアポトーシスの制御、細胞の増殖および分化の制御、および神経内分泌機能の制御などの効果である。ただし、これらの効果は例示にすぎず、本発明の権利範囲を限定するものではない。（De Stefano et al., 2007. Lycopene, quercetin and tyrosol prevent macrophage activation induced by gliadin and IFN-γ.Eur J Pharmacol. 2; 566 (1-3):192-9; Silano et al., 2007. A decapeptide from durum wheat prevents celiac peripheral blood lymphocytes from activation by gliadin peptides. Pediatr Res. 61(1):67-71; Gross et al. 2007. Role of neuropeptides in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 3(7):918-32）。
【００４４】
本発明の微生物は、好ましくはビフィドバクテリウム属に属する。この属の微生物は、食品、新規食品、プロバイオティクス、シンバイオティクス、食品サプリメント、栄養補助食品、およびセリアック病およびその関連疾患の治療または予防のための医薬製剤の調製において長所を有する。ビフィドバクテリウム属は、新生児の腸管にコロニーを形成する特殊な能力を有し、新生児の防御の発達に大きく寄与する。
【００４５】
ある具体的な実施形態において、本発明の微生物は、好ましくはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）種に属する。一例をあげると、この種に属する本発明の菌株は、健康な母乳栄養児の糞便から単離され、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（実施例６）およびｔｕｆ遺伝子の配列決定によって特定された。なお、この例によって本発明の権利範囲が限定されるものではない。配列決定された断片（１４３７塩基）は、プライマー２７ｆおよびプライマー１４０１ｒを使ってＰＣＲによって増幅され、配列決定には、文献（Satokari et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67, 504-513; Favier et al. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68, 219-226）に記載の方法にしたがって、プライマー５３０ｆおよびプライマーＵ−９６８ｆをも使用した。得られた配列を、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）中の既知の配列とアラインメントしたところ、ビフィドバクテリウム・ロンガム種の１４の異なる菌株およびその中でもビフィドバクテリウム・ロンガムＢＧ３（受託番号ＡＹ７３５４０３．１）と同一の配列について、最大類似度が検出された。Ventura et al. (Analysis, characterization, and loci of the tuf genes in Lactobacillus and Bifidobacterium species and their direct application for species identification. Appl Environ Microbiol. 2003; 69(11):6908-22)に記載のプライマーを使って、ｔｕｆ遺伝子（４９８ｐｂ）の一部が増幅され、配列決定された。この場合にもまた、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ種について、具体的には、上記と同じ方法にそって、菌株Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ＡＴＣＣ １５７０７（受託番号ＡＹ３７２０４２．１）に対応する配列について、最大類似度が検出された。
【００４６】
これは、他の適宜選別されるこの属および種の菌株と同様の方法で本発明の免疫系を制御するための理想的な性質を、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍが提供し、グルテンの摂取に関連する疾患を有する個々の患者において同じ有益な効果を提供することを示している。
【００４７】
本発明の別の態様は、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ種に属し、国際寄託（スペイン）（Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ−ＣＥＣＴ、本部：Ｂｕｒｊａｓｓｏｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ））に２００７年１２月２０日に寄託された（受託番号ＣＥＣＴ ７３４７）菌株に関する。この菌株は、実施例６に記載するように、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に現在登録されている他の種との、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列における相同性によれば、また、この菌株とは別の菌株とのｔｕｆ遺伝子における相同性によれば、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ種に属する。後者は、医薬製剤または医薬、食品（新規な食品または機能的食品）または栄養補助物、または食品サプリメントにおいて使用することを可能にする性質を有する、ビフィドバクテリウム属の菌株の一例である。
【００４８】
本発明の微生物、および好ましくは本発明の菌株は、その保護性および代謝性を相乗作用または相補的作用を通じて向上させるために、他の微生物および生理活性化合物と組み合わせてもよい。この相乗作用または相補的作用の例としては、例えば、制御性のサイトカインの全合成量およびその種類が増加すること、病原菌に対する阻害能力および腸内バリア機能が強化されること、ならびにペプチダーゼおよび消化を助けるその他の酵素が、その全濃度または種類および特異性を増加させることによって寄与を増加させることなどがあげられる。
【００４９】
したがって、本発明の別の態様は、ビフィドバクテリウム属を他の微生物または生理活性化合物と相補的および／または相乗効果的に組み合わせた、免疫制御性の応答、およびグルテンの免疫原性を有する毒性のペプチドの分解を助ける組み合わせを含む。微生物の一例をあげると、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍＡＴＣＣ １５７０７株が、表１（実施例１）に示すように、ＩＬ−１０の合成を誘導する高い能力を有することによって、本発明の菌株の免疫調節効果を補強することができる。この作用は、第２の菌株によってのみ生成されるＴＧＦ−βの誘導も補完する（表１、実施例１）。また、ラクトコッカス・ラクティスＮＣＤ０７１２株は、ビフィドバクテリウム属によるグルテンペプチドの分解を補完および強化することができ、これにより、細胞エンドペプチダーゼとともに、細胞外タンパク質分解活性を有するので、グルテンの毒性のエピトープの濃度、ならびにそのエピトープの腸に対する損傷および腸外の損傷を低減することができる。タンパク質分解活性の強化は、実施例２および図１に示すが、この例では、本発明の菌株およびラクトコッカス・ラクティスＮＣＤ０７１２（図１、パネルＢ、レーン３および４）の細胞懸濁液とともに、グリアジンによって消化されたサンプルをインキュベートした後に、タンパク質のバンドがほぼ完全に消滅することがわかる。この加水分解は、本発明の菌株のみを用いてなされる加水分解に比べて、よく進行した（図１、パネルＡ、レーン３および４）。
【００５０】
本発明の別の態様は、本発明の微生物、好ましくは、本発明の菌株、ならびに免疫調節を目的として別の方法（凍結、加熱、放射など）によって不活性化された生存不能な、本発明の微生物および本発明の菌株の等価物の使用に関する。
【００５１】
別の方法（凍結、加熱、放射など）によって不活性化された本発明の生存不能な微生物は、治療目的または予防目的のための有用性が持続されており、また、本発明の一部でもある。ビフィドバクテリウム属の免疫調節効果は、少なくとも部分的には、構造的構成物質（ＤＮＡ、細胞壁の成分など）によって奏される。これによって、ビフィドバクテリウム属が、生存能を必ずしも維持しなくても、その免疫調節特性の一部を維持することが可能になる（Lammers et al., 2003. Immunomodulatory effects of probiotic bacteria DNA: IL-1 and IL-10 response in human peripheral blood mononuclear cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 38: 165-72）。したがって、実施例３および表３は、周期的に凍結および解凍することによって不活性化された本発明の菌株の細胞懸濁液は、末梢血単核球とともにコ−インキュベートされると、炎症促進性のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）の合成量を低減させ、かつ制御性のサイトカイン（例えばＩＬ−１０）の合成量を増加させることによって、グリアジンによって引き起こされる炎症促進性応答を調節することができることを示す。
【００５２】
また、周知の手法によって得られる、本発明の微生物から生成される生理活性化合物、例えば構造的化合物、代謝から得られる化合物、本発明の微生物または菌株のいずれかによって分泌される分子などは、本発明の一部をなし、免疫応答を調節するために使用可能である。例えば、遠心分離、濾過、凍結乾燥、沈殿、超音波処理、機械的細胞攪乱および化学的細胞攪乱、酵素および／または化学的媒介物を有する培養物に基づいた化合物の抽出、クロマトグラフィー手法を用いた分離、上記化合物をコードする遺伝子のクローニング、および上記化合物の過剰発現などを含む物理化学的手法および生物工学的手法である。
【００５３】
実施例１および表１は、ビフィドバクテリウム属の細胞表層の一部を形成する構造的成分が、少なくとも部分的には、制御性のサイトカイン（ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β）の誘導および生成の原因となることを示す。実施例３および表３では、グリアジンによって消化されたサンプルが、本発明の菌株の生存不能な細胞懸濁液とともにコ−インキュベートされ、同実施例および表には、これらの細胞の構造的成分が、グリアジンによってもたらされる炎症促進性応答を低減できること、および制御性のサイトカイン（ＩＬ−１０）の合成量を増加させられることも示されている。同様に、本発明の菌株によって分泌される構造的成分、代謝物、および物質は、実施例４および表４に示すように、セリアック病患者から単離された、潜在的に病原菌となりうる菌の増殖を阻害する効果を発揮した。上記の実施例では、本菌株の細胞培養の阻害効果を二重層法により評価した。この評価法では、阻害効果がこれらすべての成分の相乗効果的作用によって引き起こされるように、細胞ならびに代謝物および分泌物の両方を病原微生物に接触するように配置する。さらに、先に凍結乾燥しておいた細胞を含まない培養物の上清を阻害性媒介物として使用することによって、ビフィドバクテリウム属が培養液に分泌する代謝物および化合物の該阻害効果を評価した。このようにして、培養液に放出された化合物が、セリアック病患者の単離された潜在的な病原体に対して阻害効果を奏することが示された（表５）。
【００５４】
本発明の具体的な実施形態において、本発明の微生物、本発明の組成物、本発明における生成された生理活性化合物、本発明の上清、本発明の抽出物、本発明の医薬品または栄養性の組成物、本発明の菌株、その細胞成分または細胞成分分画、その代謝によって生じる化合物、ならびに分泌される分子およびこれらの組み合わせは、グルテンの有害なペプチドまたは他の食物アレルギーによって引き起こされる自然免疫応答および適応免疫応答を制御または調節できることを特徴とする。
【００５５】
本発明の菌株は、セリアック病およびその関連疾患（ダウン症候群、糖尿病１型、疱疹状皮膚炎、ミオパチー、多発性硬化症、関節炎、自閉症、統合失調症、鬱病、リンパ腫および運動失調）に特徴的なＴｈ１型炎症促進性応答、およびコムギおよび他の穀物性タンパク質の摂取の結果引き起こされるＴｈ２型アレルギー性反応を、制御することができる免疫調節特性が得られるように選別された。この菌株は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ；実施例１、表１）によって、サイトカインＴｈ１ ＩＦＮ−γ（例えば＜１００ｐｍ／ｍｌ）および炎症促進性のサイトカインＩＬ−１（例えば＜１５０ｐｍ／ｍｌ）のわずかな生成を誘導する能力、ならびに制御性のサイトカインＩＬ１０（例えば＞８００ｐｍ／ｍｌ）およびＴＧＦ−β（例えば＞５０ｐｍｏｌ／ｍ）の多量の生成を誘導することを特徴とする。これらのビフィドバクテリウム属によって誘導されたサイトカインのプロファイルは、すべてのビフィドバクテリウム属およびヒトの腸の乳酸菌（実施例１、表１）に共通して見られる特徴ではなく、活動型セリアック病に罹患しやすくなっている個々の患者および活動型セリアック病患者においてコムギタンパク質がもたらす異常免疫応答を調節するために、特に理想的なプロファイルである。これらの試験（実施例１および表１）において刺激として選別された菌株の細胞懸濁液を使用する場合に、これらの免疫調節効果が検出されることは、このビフィドバクテリウム属の細胞表層の一部を形成する構造的成分が、制御性のサイトカインの生成（ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β）を誘導することにより、グルテンペプチドが有する毒性および免疫原性による効果を低減させ得ることの、少なくとも部分的な原因となることを示唆している。また、実施例３および表３では、グリアジンによって消化されたサンプルとともにコ−インキュベートされた本発明の菌株（周期的に凍結および解凍することによって不活性化されている）の生存不能な細胞懸濁液を使用することによって、グリアジンによって引き起こされる炎症促進性のサイトカイン（例えばＩＮＦ−γおよびＩＬ−１５）の合成量を低減すること、および制御性のサイトカイン（例えばＩＮＦＩＬ−１０）の合成量を増加させることができることが示されている。したがって、細菌の生存能を厳密に必ずしも維持しなくても、ビフィドバクテリウム属の細胞の構造的成分が、グルテンによって引き起こされる異常免疫応答を制御することができることが実証される。
【００５６】
本発明の微生物、本発明の菌株、本発明における生成された生理活性化合物、その細胞成分、代謝によって生じる化合物、分泌される分子、およびこれらの組み合わせは、セリアック病患者の胃腸管から単離された有害な細菌、例えば炎症促進性を有する細菌、および病原性因子を有する細菌などに対する防御バリア機能を強化できることを特徴とする。
【００５７】
本発明の微生物は、セリアック病患者の腸から単離された、病原性となる潜在的能力および有毒となる潜在的能力を有する細菌を阻害することができる（実施例４、表４および５）。これらの病原体には、病原要因（例えば線毛）をコードし、毒性のある系統学的なグループ（例えば、Ｂ２）に属する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）種の菌株、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の菌株、組織の障害に寄与する金属プロテアーゼを生成するその他の属の菌株、十二指腸のバイオプシーから単離された溶血性の菌株などが含まれる。実施例４および表４では、この菌株の細胞培養物全体における、セリアック病患者から単離された病原体に対する阻害効果が二重層法を使って示され、またこの方法によって、これらの効果が本発明の菌株によって分泌される構造的成分、代謝物、および物質によって引き起こされることが実証されている。表５もまた、このビフィドバクテリウム属が培地に分泌した代謝物および化合物のみを含有する、この菌株の培養物の細胞を含まない上清の阻害効果を示している。どちらの場合も、比較目的の他の菌株を使ってアッセイして得た阻害効果に比較して、選別した菌株を使って得られる阻害効果は大きい。このようにして、本発明の微生物または本発明の菌株は、腸内生態系の復元に寄与し、また、炎症のプロセスを助け、上皮の透過性を増加させる微生物起源の抗原性負荷の低減にも寄与する。同様に、この選別された菌株は、末梢血単核球において、セリアック病患者の腸内の細菌叢によって活性化される炎症促進性のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）の合成を阻害することができる。例えば、セリアック病患者の細菌叢を用いた活性化状態でＰＢＭＣによって生成されるＩＦＮ−γの濃度、およびＴＮＦ−αの濃度は、本発明の菌株の存在下で、それぞれ、９０．８ｐｍｏｌ／ｍｌから８．２ｐｍｏｌ／ｍｌに、１９６６．３ｐｍｏｌ／ｍｌから２９５．２ｐｍｏｌ／ｍｌに低減される（実施例７）。この菌株は、セリアック病患者の腸内の細菌叢によって同時に低減される制御性のサイトカイン（ＩＬ−１０）の合成を、活性化することもできる。このようにして、例えば、セリアック病患者の細菌叢によって誘導されるＩＬ−１０の値は、ビフィドバクテリウム属の菌株ＩＡＴＡ−Ｈ１の活性化によって、４９．３ｐｍｏｌ／ｍｌから１０７．５ｐｍｏｌ／ｍｌに増加する。この免疫調節機構によって、この選別された菌株が、腸のバランスの復元に寄与することができ、また、有害な細菌叢によって引き起こされ、さらにグルテンによっても引き起こされることによって炎症を永続化させる悪循環を発生させ得る、免疫系の過剰な活性化の回避に寄与することができる。
【００５８】
また、本発明の微生物は、胃腸における消化の結果生じるグルテンペプチドを輸送する能力を有し、こうすることによって、有害なエピトープの濃度を低減することを特徴とする。
【００５９】
具体的に、本発明の菌株は、胃腸におけるグリアジンの消化、ペプシン（Ｐ）の作用を利用した胃における消化の結果生じる生成物、およびトリプシン（Ｔ）およびパンクレアチン（Ｘ）の作用を利用した腸における消化により生成される毒性のペプチドを受容する能力を有する（実施例２、図１）。選別された株の生存可能な細菌の存在下でグリアジンをインキュベートすることによって、グリアジンの濃度、およびＥＬＩＳＡサンドイッチ法によってＲ５抗体を使って同定される毒性のエピトープの存在量が低減される。したがって、該インキュベーションによって、腸内および腸外のレベルで起こりうる有害な効果が低減される。例えば、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法によって決定される２３４９ｐｐｍのグルテンの、（実施例２に示すように）ペプシン、トリプシン、およびパンクレアチンで消化されたグリアジンのサンプルの毒性のエピトープの濃度が、本発明の菌株の細胞懸濁液を用いてインキュベートした後に、グルテンが１６９ｐｐｍにまで低減された。同様に、胃腸と同じ条件で消化され、除去サイズが１５ｋＤａ未満の膜を用いて透析されたグリアジンを用いて本発明の菌株をインキュベートし、つづいて該菌株を逆相ＨＰＬＣによって分析することによって、＃２画分の濃度を少なくとも１０％低減する、このビフィドバクテリウム属の能力が明らかになった。これは、試験を行った他の菌株が持たない性質である（実施例８、図２）。なお、＃２画分は、消化されたグリアジンの主要画分であり、質量分析によって特定される免疫原性ペプチドを含有する画分である。Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ＩＡＴＡ−ＥＳ１株のこの性質が有する、腸の上皮に対する生物学的効果は、実施例８に記載のように、グリアジンによって消化された別のサンプルのＣａｃｏ−２細胞培養におけるインキュベーション後、実証された。この実施例は、試験を行った他の菌株とは異なり、本発明の菌株は、上皮細胞の生存能を上記のように増加させることができることを実証している（実施例８、図３）。また、本発明の菌株をグリアジンによって消化されたサンプルとともにコ−インキュベートすることによって、炎症促進性のサイトカイン（例えばＴＮＦ−α）の合成、および炎症促進性の遺伝子の発現の原因となるＮκＢ因子の発現に対する後者の効果が減少した（実施例８、図４）。
【００６０】
グリアジンの消化により生成されるオリゴペプチドを捕獲する、本発明の微生物、好ましくは本発明の菌株の能力は、腸内と同じ条件、および胆汁塩の存在下で再現される。ラクトコッカス・ラクティス ＮＣＤＯ７１２とともにコ−インキュベートすることによって、この再現能力は増強される（実施例２、図１）。なお、該ＮＣＤＯ７１２は、大腸にコロニーを形成することはできないが、壁にアンカーされたプロテアーゼおよびその他のペプチダーゼの作用を利用して、摂取されたグルテンを加水分解する第１の段階において共通補助剤として作用することはできる。ラクトコッカス・ラクティス ＮＣＤ０７１２の作用を利用したタンパク質分解活性の強化は、図１で実証されている。同図からは、グリアジンによって消化されたサンプルを本発明の菌株、およびラクトコッカス・ラクティス ＮＣＤ０７１２の細胞懸濁液を用いてインキュベートした後に、タンパク質のバンドがほぼ完全に消滅したことがわかる（図１、パネルＢ、レーン３および４）。この加水分解は、本発明の菌株だけを使ってなされる加水分解に比べて、よく進行した（図１、パネルＡ、レーン３および４）。グルテンに対するビフィドバクテリウム属の活性はまた、抽出物の形態において、ラクトコッカス・ラクティス ＮＣＤＯ７１２のプロテアーゼおよびペプチダーゼとともにコ−インキュベートすることによって増強可能である。
【００６１】
本発明の菌株は、有害抗原として作用するペプチドを代謝するだけではなく、免疫制御性の機構を利用することによっても、グルテンの毒性のペプチドと個々の患者の免疫応答性細胞との相互作用によって引き起こされる異常な免疫応答を調節することができる（実施例３、表３）。胃腸においてグリアジンによって消化されたサンプルの存在下でＰＢＭＣととにもコ−インキュベートされた、選別された菌株の生存可能なまたは不活性化された細菌懸濁液は、胃のペプシン（Ｐ）、腸のトリプシン（Ｔ）、およびパンクレアチン（Ｘ）の作用によって、消化のそれぞれの局面においてこれらのタンパク質の炎症促進性効果に対抗することができる。本菌株は、適応免疫応答および自然免疫応答の原因となる、炎症促進性のサイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−８、およびＩＬ１５の生成量の低減、ならびに制御性のサイトカインＩＬ−１０の合成量の増加を誘導することができる（実施例３、表３）。これらの効果は、少なくとも部分的に、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｔｒａｎｓ ＡＭ ＮＦκＢ， Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｖｅ、ベルギー）によって決定される核内因子（ＮＦ）κＢ、ｐ５０、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ｃ−Ｒｅｌ、およびＲｅｌ Ｂの別のサブユニットの阻害が原因である。この転写因子の阻害は、炎症プロセス、具体的には、セリアック病において発生する炎症プロセスの、キーとなる制御点を表わす多数の炎症促進性の遺伝子の発現の阻害をともなう（Jelinkova et al., 2004. Gliadin stimulates human monocytes to production of IL-8 and TNF-alpha through a mechanism involving NF-κB. FEBS Lett. 571(1-3):81-5）。
【００６２】
本発明の微生物、本発明における生成された生理活性化合物、その細胞成分、代謝によって生じる化合物、分泌される分子、およびこれらの組み合わせは、そのペプチダーゼ活性によってグルテンペプチドを加水分解することができ、有害なエピトープの濃度を低減することを特徴とする。一例をあげると、本発明の菌株は、広い特異性を有するペプチダーゼと、プロリンを含有する基質に対する特異性を有するペプチダーゼとを有する。この基質はグリアジン中に非常に豊富に存在し、既存の酵素によるグルテンペプチドの加水分解を制限する（実施例２、表２）。具体的に、この菌株は、最も活発なイミノペプチダーゼ活性（＞３００Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を有する菌株の一つである。同様に本菌株は、プロリル−エンドペプチダーゼ活性（＞８Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｘ−プロリル−ジペプチジル−ペプチダーゼ（＞１５Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ならびにプロリダーゼおよびプロリナーゼ活性（＞１５Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を提供する。本菌株は、トリペプチダーゼ活性（基質Ｇｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに対して、＞１３０Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびロイシル−アミノペプチダーゼ活性（＞７０Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をも有する。プロリンを含有する基質（例えばＰｒｏ−ｐＮＡ）に対するこの菌株の活性は、他の乳酸菌において検出される活性（特にＰｒｏ−ｐＮＡ／Ｌｅｕ−ｐＮＡ活性比）より高い（Di Cagno et al. 2004. Sourdough bread made from wheat and nontoxic flours and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients. Appl Environ Microbiol. 70:1088-96; De Angelis et al. 2006. VSL#3 probiotic preparation has the capacity to hydrolyze gliadin polypeptides responsible for celiac sprue. Biochim Biophys Acta. 2006 1762(1):80-93）。プロリンを含有する基質に対するこの高い活性は、プロリンの含有量が多いグルテンペプチドの特異的な加水分解を助ける。
【００６３】
このように、本発明の菌株、本発明における生成された生理活性化合物、細胞成分、代謝によって生じる化合物、分泌される分子、およびこれらの組み合わせは、食事によって摂取された栄養分の消化を助け、吸収疾患症候群およびセリアック病患者に特徴的な栄養不足を改善するペプチダーゼ（例えば、ホスファターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、およびＮ−アセチル−グルコサミニダーゼ）の活性に加えて、代謝活性を有する。
【００６４】
最後に、別の具体的な実施形態は、グルテンの摂取またはその他の食物アレルギーに関連する疾患を有する患者のリスクを低減し、健康状態を改善するための剤形の生成における、本発明の微生物、本発明における生成された生理活性化合物、細胞成分、代謝によって生じる化合物、分泌される分子、およびこれらの他の微生物との組み合わせの使用である。
【００６５】
本発明の菌株を使って調製される剤形は、工業的に製造可能であって、例えば食品（機能的食品、既存の食品、および新規食品）、食品サプリメント、栄養補助食品、薬学的組成物、プロバイオティクス、および／またはシンバイオティクス、または新規な食品などの、消費に対する様々な提供形態を創造する（ただしこれらは例示にすぎないのであって、本発明の権利範囲を限定するものではない）。
【００６６】
本発明の菌株は、ムチン（１％〜４％）に対する接着能を有し、胃酸のｐＨ（２．０；２．５および３．０）ならびに小腸に存在する高濃度の胆汁塩（０．５；１．０；２．０；および３．０％）に対する耐性を有する。この耐性は、プロバイオティクスが腸管を通過する際における、ならびに食品発酵のプロセスおよび保存期間中における、プロバイオティクスの生存を制限する主要な生物学的バリアを構成する（実施例５、表６）。例えば、本菌株は、ｐＨ２．０〜２．５で９０分間のインキュベーションを行った後、５６％〜８６％の生存能および増殖能を維持する。したがって、本菌株は、表６からわかるように、他の単離された菌株および現在市販のプロバイオティクスの一部に比べて、高い確率で生存し、かつ機能する。本菌株は、インビボで胃腸内の通過に対する耐性を有する。発酵乳の形態で、１０７−１０８ｃｆｕ／ｍｌの投与量を一日２回、４週間のあいだ投与した後、本菌株は糞便から回収され、その濃度は、初期濃度（プロバイオティクス製品を摂取していない状態）に対して、対数表示では少なくとも１単位増加する。選別されたビフィドバクテリウム属は、各種食品および飲み物の中で増殖し、生存可能な状態で残存し、ビフィドバクテリウム属の摂取のための理想的なキャリアを形成する。例えば、選別されたビフィドバクテリウム属は、乳を発酵および凝固させることができ、発酵乳および他の乳の誘導体の調製のために使用可能である。選別されたビフィドバクテリウム属は、食品、食品サプリメント、および医薬製剤を製造および保存するための技術的処理（例えば、凍結乾燥温度および冷蔵温度）に対しても耐性を有し、工業的に利用可能であることを保証している。
【００６７】
本発明の具体的な態様は、本発明の微生物、本発明の菌株、または本発明における生成された生理活性化合物を、食品の形態で剤形を調製するために使用することを含む。
【００６８】
このように、本発明の微生物は、食品剤形の一部を形成することができ、通常の栄養価を超えた、グルテン摂取に関連する疾患を有する患者の健康上のリスクの低減および健康状態の改善に対する、有益な効果を提供する。
【００６９】
本発明の別の具体的な態様は、本発明の微生物、本発明の菌株、または本発明における生成された生理活性化合物を、非食品マトリクスで提供され、天然の生理活性物質と定義づけられる、栄養補助食品の形態で製剤を生成する際に使用することを含む。なお、この場合、この栄養補助食品は、グルテン摂取に関連する疾患を有する患者において有益な効果を奏し、患者のリスクを低減し、健康状態を改善する。
【００７０】
本発明の微生物、本発明の菌株、または本発明における生成された生理活性化合物を使用して、健康補助食品または食品サプリメントを得る場合、この健康補助食品または食品サプリメントは、その組成中に、健康を目的として食事を補完することを視野に入れた、および特定の場合には、グルテン摂取に関連する疾患を有する患者において有益な効果を奏し、患者のリスクを低減し、健康を向上させる目的で、微生物または微生物により生成される生理活性化合物を含む。
【００７１】
本発明の別の具体的な態様は、本発明の微生物、本発明の菌株、または本発明の生理活性化合物を、医薬製剤の生成において使用することを含む。この場合、この医薬製剤は、グルテン摂取に関連する疾患を有する患者の健康上のリスクの低減および健康状態の改善に対して有益な効果を奏する医薬として使用可能な、生物学的にアクティブな組成物の調製において使用される。
【００７２】
本発明の別の具体的な実施形態では、本発明の微生物、本発明の菌株、または本発明の生理活性化合物は、プロバイオティクスおよび／またはシンバイオティクス（プロバイオティクスおよびプレバイオティクスの組み合わせ）の生成において使用され、そこでは、該微生物は、例えば生きている状態または凍結乾燥された状態で、食品アレルギー、好ましくはグルテンの摂取に関連するアレルギーを有する個々の患者に対して有益な効果または治療用効果を実現することができる、適切な量および条件で組み込まれ、こうすることによって、患者のリスクを低減し、健康状態を改善する。
【００７３】
最後に、本発明の具体的な目的は、本発明の微生物、本発明の菌株、または本発明の生理活性化合物を、新しい食品の調製において使用することを含む。新規な食品とは、グルテン摂取に関連する疾患に罹患している患者において有益な効果を奏し、患者のリスクを低減し、健康状態を改善し得る、欧州連合内で１９９７年５月１５日の時点までの間に人が食するために通常供されなかったあらゆる食品または成分を意味する。
【００７４】
〔実施例〕
〔実施例１：ビフィドバクテリウム属の菌株を、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）においてサイトカインの生成を調節する能力によって選別する方法〕
（１．ビフィドバクテリウム属およびその他の腸の乳酸菌の培養物および上清の調製）
２４時間培養したこれらの菌株を、０．０５％のシステイン（ＭＲＳ−Ｃ）を含有する１０ｍｌのＭＲＳ増殖培地（Ｓｃｈａｒｌａｕ Ｃｈｅｍｉｅ Ｓ．Ａ．、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）に、１％において播種し、嫌気条件において３７℃で２２時間インキュベートした。（ＡｎａｅｒｏＧｅｎ；Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、ＵＫ）。遠心分離（６，０００ｇ、１５分間）によって細胞を回収し、ＰＢＳ（リン酸ナトリウム１０ｍＭ、塩化ナトリウム１３０ｍＭ、ｐＨ７．４）で二回洗浄し、２０％のグリセロールを含有するＰＢＳに再懸濁した。これらの懸濁液を等分した試料を液体窒素により凍結させ、−８０℃で保存した。ＭＲＳＣプレート上で４８時間インキュベートした後に計数することによって、凍結・融解サイクルを経た後の生細胞の個数を決定した。生存率は、どの場合にも９０％を超えていた。等分した各試料は１回の試験にのみ使用した。死滅した細菌による効果を評価するために、いくつかの試料について低温による不活性化（−２０℃で凍結して融解することを３回繰り返す）および熱による不活性化（３０分間、８０℃）を行なった。得られた上清のｐＨ値をＮａＯＨにより７．２に調整し、濾過（孔径０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）して、わずかに存在する生細胞を取り除くことによってエステル化した。細胞を含まない該上清の等分試料を、次に使用するまで−８０℃で保存した。
【００７５】
（２．ＰＢＭＣの単離および活性化）
ヘパリンを含むチューブ内における、４人の健康なボランティア（２４歳〜４０歳、平均年齢３０歳）の末梢血液から、ＰＢＭＣを単離した。このＰＢＭＣを、フィコール勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）中において遠心分離することによって単離した。ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）を用いて細胞を洗浄し、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｓｉｇｍａ社）をさらに含有するＲＰＭＩ１６４０培地により１×１０６個／ｍｌの密度に調節した。このＰＢＭＣを、刺激剤の存在下または非存在下で、平底型２４ウェルのポリスチレン製プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）において、５％のＣＯ２のもとで、３７℃で２４時間インキュベートした。生存細菌と死滅細菌との懸濁液を、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、および上清の容量を１５０μｌにおいて、刺激として使用した。ポジティブコントロールとして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１１１：Ｂ４の、精製されたリポ多糖類（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を、１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ネガティブコントロールとして、非活性化されたＰＢＭＣにおけるサイトカインの産生量について試験を行った。各種類の刺激について、各実験つき２回ずつ試験した。培養上清を遠心分離によって回収し、分割し、等分試料の形態で、サイトカインの検出まで−２０℃で保存した。
【００７６】
（３．サイトカインの同定）
ＥＬＩＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造業者の指示にしたがって使用して、上述した上清のサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−β）の濃度を測定した。
【００７７】
【表１】
【００７８】
〔実施例２：グルテンペプチドを加水分解し輸送することによって、グルテンペプチドの毒性を低減できるビフィドバクテリウム属を選別する方法〕
グルテンの免疫学的な毒性応答の原因となるペプチド内に存在する、プロリンを含有するペプチド配列を加水分解するための、広範囲の細胞内ペプチダーゼおよび特定の細胞内ペプチダーゼの活性を定量化することによって、グルテンから生成されるタンパク質およびペプチドを加水分解する菌株の能力を測定した。ＭＲＳＣにおいて１６時間〜１８時間増殖させた細菌性培養物の細胞を、遠心分離（９０００×ｇ、１０分間、４℃）によって回収し、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）で二回洗浄し、同じ緩衝液により、最初の培養体積に対して１０倍に濃縮して再懸濁した。細胞の体積に対して２倍の体積のガラスビーズを加え、Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、ＵＳＡ）を使って、１．５分間のパルスを２回印加して、この細胞を機械的に破壊した。遠心分離（８０００ｇ、１０分間）にかけて、不溶解性の断片および細胞を取り除いた後に得られた上清を、活性試験のための酵素の抽出液として使用した。試験を行った基質は、以下に列挙する。すなわち、幅広い特異性を有するアミノペプチダーゼを検出するためのＬｅｕ−パラニトロアニリド（−ｐＮＡ）、幅広い特異性を有するアミノペプチダーゼおよびトリペプチダーゼを検出するためのＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、プロリル−エンドペプチダーゼを検出するためのＳｕｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ、イミノペプチダーゼを検出するためのＰｒｏ−ＡＭＣ、Ｘ−プロリル−ジペプチジル−ペプチダーゼを検出するためのＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ；プロリダーゼを検出するためのＶａｌ−Ｐｒｏ、およびプロリナーゼを検出するためのＰｒｏ−Ｇｌｙである。パラニトロアニリドから生じる基質の場合、反応混合液は、０．５ｍＭの基質および５０μｌの酵素の抽出液を含有する２００μｌの５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）により構成した。該反応混合液を、３７℃で最大３０分間インキュベートした。上述した基質の加水分解およびパラニトロアニリンの放出を、分光光度計（５５０ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて４１９ｎｍで監視した。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼアッセイ（Hejgaard, 1978, Rapad assay to detect peptidases in column effluent fractions using L-amino acid oxidase. Analytical Biochem 90: 835-839）を用いて、ペプチドの加水分解を同定した。０．０５ｍＭの濃度を含む反応緩衝液の１００μｌを、５０μｌの酵素の抽出液とともに２０分間インキュベートした。この期間につづいて、１００μｌのＬ−アミノ酸オキシダーゼ試薬を加え、５分間のインキュベーションの後、５３０ｎｍにて吸光度を測定した。ＢｉｏＲａｄ社の市販キット（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使って、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法により、タンパク質濃度を測定した。１ユニットの活性は、１μｍｏｌの基質を３７℃で１分間に加水分解できる酵素の量として規定した。この活性を、Ｕ／ｍｇ タンパク質で表わした。
【００７９】
グリアジンが消化されて生じるペプチドを輸送および加水分解する菌株の能力を、電気泳動によって同定した。この場合、細胞懸濁液を、６５５ｎｍにおいて４の光学濃度（１０９ｃｆｕ／ｍｌと等価）に調節し、３つの異なるグリアジンの加水分解産物とともに、０．２％のグルコースを加えたＰＢＳにて最終濃度３００μｇ／ｍｌ〜６００μｇ／ｍｌとし、インキュベートした。グリアジンの加水分解産物（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、胃腸の消化のプロセスを以下のようにシミュレートすることによって得られた。すなわち、Ａ）１００ｇのグリアジンを、３７°で２時間、２ｇの精製ペプシンによって１ＬのＨＣＬ ０．２Ｎ（ｐＨ：１．８）中で消化した（この加水分解産物をＧ−Ｐと称する）。Ｂ）その結果生じた消化物を、２ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを８に調節した後、２ｇのトリプシンを加えることによって、トリプシンにより消化した（この加水分解産物をＧ−Ｐ＋Ｔと称する）。Ｃ）つぎに、この２度消化されたサンプルを、２ｇのパンクレアチンを用いて処理し、ｐＨ８において２時間攪拌した（この加水分解産物をＧ−Ｐ＋Ｔ＋Ｘと称する）。各段階での消化の後、サンプルを１０，０００ｇで１０分間、遠心分離し、さらに別の試験のために、その上清を−２０℃で保存した。消化されたサンプルを、１００℃で３０分間インキュベートすることによって不活性化した。細菌懸濁液を、３種類のグリアジンの加水分解産物（Ａ、Ｂ、およびＣ）の存在下、３７℃で６時間、嫌気条件においてインキュベートした。顕微鏡用の市販のシステムＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を製造業者の指示にしたがって使用して、インキュベーション中の生存数の変化を同定した。生存細菌（緑）および死滅細菌（赤）を、オリンパス社のＢＸ５１型落射蛍光顕微鏡（東京、日本）で計数した。どの場合にも、インキュベーションの後、生存数減少の最小値（０．０％〜１１．５％）が検出された。インキュベーション期間の後、遠心分離にかけて不溶解性の細胞およびタンパク質を取り除き、上清を濾過（孔径０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）して、わずかに存在している生細胞を取り除くことによってエステル化した。慣用されている１５％ポリアクリルアミドゲル、およびＴｒｉｓ−トリシンゲル（直線勾配１０％〜２０％のＲｅａｄｙゲル、濃縮用ゲル４％、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）を用いて、ペプチドを分離し、バンドの消滅を、評価することによって、複数種類のグリアジンの加水分解産物を輸送および使用する菌株の能力を同定した。タンパク質は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色することによって視覚化した。選別された細菌の作用による、グリアジンの輸送および消化の結果生じた毒性のエピトープの低減を、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法 Ｒ５ アッセイ（Ｃｅｎｔｒｏ Ｎａｃｉｏｎａｌ ｄｅ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ、Ｍａｄｒｉｄ）により評価した。
【００８０】
【表２】
【００８１】
〔実施例３：免疫調節特性のために選別したビフィドバクテリウム属の菌株とのコ−インキュベーションを用いた、免疫応答性細胞においてグリアジンによって引き起こされる免疫応答の選別制御〕
選別された菌株（１０６−１０９ＣＦＵ／ｍｌ）の懸濁液と、比較目的のためのその他の懸濁液とを、実施例３に記載のようにして得られた複数種類のグリアジンの加水分解産物（Ｐ、Ｐ＋Ｔ、およびＰ＋Ｔ＋Ｐ）、およびＰＢＭＣとともに、濃度１０６ｃｆｃ／ｍｌで２４時間インキュベートした。コントロール刺激として、細菌および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１１１：Ｂ４のＬＰＳを含まない、複数種類のグリアジンの加水分解産物を使用した。また、いかなる刺激をも加えない条件で、基底のサイトカイン産生を検出した。ＰＢＭＣを単離する方法、活性化する方法、およびサイトカインを検出するための方法は、実施例１に記載した通りである。
【００８２】
【表３】
【００８３】
〔実施例４：潜在的な病原性を有するセリアック病患者の腸の細菌叢からの単離菌の増殖を阻害する、選別されたビフィドバクテリウム属の能力〕
実施例１に記載の方法につづいて、免疫調節特性にしたがって先に選別されたビフィドバクテリウム属の菌株の抗微生物活性を、（ｉ）二重層法および（ｉｉ）寒天拡散法の２つの方法で同定した。
【００８４】
潜在的な病原性を有する、セリアック病患者の腸内の細菌叢から単離された細菌を指示菌として使った二重層法で、各菌株の抗菌活性を包括的に評価した。ビフィドバクテリウム属はＭＲＳ−Ｃプレートにおいて約２ｃｍの線状に増殖させ、最適な条件で１６時間インキュベートし、その後のビフィドバクテリウム属の成長をクロロホルムにより阻害した。指示菌を、１０４−１０５ＣＦＵ／ｍｌの濃度で１０ｍｌの適切な半流動性寒天に播種し、保護菌の寒天の層の上に注ぎ、嫌気条件において３７℃でインキュベートした。２４時間後に、ビフィドバクテリウム属の培養線の周囲における阻害輪（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｈａｌｏ）を測定した。
【００８５】
タンパク質特性を有する化合物の分泌に起因する抗菌活性を評価するために、寒天において拡散させる手法を使用した。各ビフィドバクテリウム属を２４時間培養したものを、１０ｍｌのＭＲＳ−Ｃ増殖培地に１％で播種し、３７℃で１６時間インキュベートした。遠心分離（１２．０００ｇ、１５分間、４℃）によって上清を得て、凍結乾燥によって濃縮した。凍結乾燥させたサンプルを、ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸塩緩衝液１ｍｌの中に再懸濁し、発酵によって生成される有機酸の効果を取り除くために、ｐＨが６．５になるまでＮａＯＨで中和し、濾過によって無菌化した。これらのサンプルは、ビフィドバクテリウム属によって生成された抗菌活性を有するタンパク質が同定される可能性がある、未精製の抽出液を構成した。指示菌を、１０４−１０５個／ｍｌの濃度で１０ｍｌの適切な半流動性寒天に播種し、同じ培地の寒天の固体層の上に注いだ。固化後、５ｍｍのウェルを作成し、各ビフィドバクテリウム属の、中和された無菌の抽出液を４０μｌ加えた。抽出液を、４℃で４時間拡散させ、つづいて指示菌または病原性微生物に対して最適な条件でインキュベートした。インキュベートした後、ウェルの周囲の阻害輪を測定した。
【００８６】
【表４】
【００８７】
【表５】
【００８８】
〔実施例５ 胃腸のストレスの条件に対する、ビフィドバクテリウム属の耐性の評価〕
摂取後のプロバイオティクス生存能を制限する最初の生物学的バリアを構成する胃液の酸性条件に対する、単離されたビフィドバクテリウム属の耐性を、回収した個々の菌株について確認した。この確認をするために、３ｇ／ｌのペプシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＰＢＳにおいて、各菌株の細胞懸濁液（１０８個／ｍｌ）を調製し、ＨＣｌを用いてｐＨを２に調節し、３７℃で合計１２０分間インキュベートした。ＭＲＳ−Ｃ寒天プレートを用いて計数することにより生存能を決定するために、平均的な胃内容排出の時間（９０分間）を含めた、それぞれ異なる時間（０分間、９０分間、および１２０分間）において、一定分量を分取した。つづいて、酸性ｐＨに対して耐性を有する菌株の、他のストレス条件、例えば胆汁、ＮａＣｌ、および高温などに対する許容性を、調べた。調べる対象となる菌株の、胆汁に対する許容性を知るために、様々な濃度（０．５％〜１．５％）の牛胆汁エキス（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を加えたＭＲＳ−Ｃにおいて、その菌株の増殖能力を評価した。各培地２００μｌの一定分量に、２４時間培養したものを１％で播種し、マルチウェルプレートに載せ、３７℃でインキュベートした。５５０ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ分光光度計（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ 、ＣＡ）を用いて、６５５ｎｍにおける吸光度を測定することによって、増殖を監視した。
【００８９】
【表６】
【００９０】
【表７】
【００９１】
〔実施例６：選別したビフィドバクテリウム属の単離および同定〕
分析に先立つ少なくとも１ヶ月間、ビフィドバクテリウム属を含有する食品を摂取せず、かつ、抗生物質を使ったいかなる治療も受けなかった健康な母乳栄養児の糞便から、ビフィドバクテリウム属の菌株を単離した。サンプルは４℃で保管し、回収から２時間以内に分析した。各サンプル２ｇを、濃度が１３０ｍＭのＮａＣｌ（ＰＢＳ）を含有する１０ｍＭのリン酸塩緩衝液で希釈し、Ｌａｂ−Ｂｌｅｎｄｅｒ ４００型ストマッカー（Ｓｅｗａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）で３分間ホモジナイズし、そしてペプトン水で希釈した。多様な１０倍希釈液の０．１ｍｌの一定分量を、０．０５％のシステイン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；ＭＲＳ−Ｃ）および８０μｇ／ｍｌのムピロシン（ｍｕｐｉｒｏｃｉｎ）を含有するＭＲＳ寒天（Ｍａｎ Ｒｏｇｏｓａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｅ社、Ｓｃｈａｒｌａｕ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ）に播種した。嫌気条件における、３７℃、４８時間のインキュベーションにつづいて（ＡｎａｅｒｏＧｅｎ、Ｏｘｏｉｄ、ＵＫ）、単離されたコロニーを選別し、グラム染色法を利用してその形態を調べることによって、このコロニーの同一性を確認した。リボゾームの１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子における１．３５ｋｂの断片を増幅するプライマー（ＬＭ２６およびＬＭ３）を用いて、Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（1997, Identification and quantification of Bifidobacterium species isolated from food with genus-specific 16S rRNA-targeted probes by colony hybridization and PCR. Appl. Environ. Microbiol. 63: 1268-1273）に記載の方法に基づいて、属特異的なＰＣＲによって、単離された菌の同一性を確認した。また、全ＤＮＡから、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列を決定した。配列決定された断片を、プライマー２７ｆおよび１４０１ｒを用いて増幅し、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲの市販のシステム（Ａｍｅｒｓｈａｎ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）を用いて精製した。配列決定には、プライマー５３０ｆおよびＵ−９６８ｆについても、別の著者（Jonson, 1994. Similarity analysis of rRNAs. In Methods for General and Molecular Bacteriology; Gerhard, P.; Murray, R. G.E.; Wood, W.A.; Krieg, N.R., Eds. American Society for Microbiology, Washington, DC. Pp 683-700; Satokari et al., 2001. Bifidobacterial Diversity in Human Feces Detected by Genus-Specific PCR and Denaturating Gradient Gel Electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 67, 504-513; Favier et al. 2002. Molecular Monitoring of Succession of Bacterial Communities in Human Neonates. Appl. Environ. Microbiol. 68, 219-22）によって記載された方法にしたがって使用した。配列決定は、自動ＤＮＡ配列決定装置ＡＢＩ ３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて実施された。最も緊密に関連する配列を、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使ってＧｅｎＢａｎｋデータベースで検索した（Altschul et a., 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol Biol. 215, 403-410）。
【００９２】
〔実施例７：活動型疾患を有するセリアック病患者およびグルテンを含まない食事による治療後の患者の、腸内の細菌叢が変化することによって引き起こされる炎症促進性応答を制御する、ビフィドバクテリウム属の菌株の能力の評価〕
（１．腸のビフィドバクテリウム属の評価用培養物および評価用糞便サンプルの準備）
ビフィドバクテリウム属の菌株を２４時間培養したものを、約０．０５％のシステイン（ＭＲＳ−Ｃ）を含有する１０ｍｌのＭＲＳ増殖培地（Ｓｃｈａｒｌａｕ Ｃｈｅｍｉｅ Ｓ．Ａ．社、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）に、１％で播種し、嫌気条件において３７℃で２２時間インキュベートした（ＡｎａｅｒｏＧｅｎ； Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、ＵＫ）。遠心分離によって（６，０００ｇ、１５分間）細胞を回収し、ＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、２０％のグリセロールを含有するＰＢＳで再懸濁した。これらの懸濁液の等分試料を、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。凍結・融解サイクルを経た後の生細胞の個数を、４８時間のインキュベーションの後にＭＲＳＣプレート上で再計数することによって決定した。生存率は、どの場合にも９０％を超えていた。各試料は１回の試験にだけ使用した。
【００９３】
（診断時に）活動型疾患をともない、グルテンを含まない食事により少なくとも２年間の治療を受けたセリアック病患者から採取した糞便を、末梢血単核球において刺激として使用するために、リン酸塩緩衝液で１／１０に希釈し、ストマッカーにおいて３分間〜５分間ホモジナイズし、−２０℃で凍結させた。コントロールとして、糞便サンプルを健常者からも採取した。
【００９４】
（２．ＰＢＭＣの単離および活性化）
ヘパリンを含むチューブ内において、４人の健康なボランティア（２４歳〜４０歳、平均年齢３０歳）の末梢血液のＰＢＭＣを単離した。このＰＢＭＣは、フィコール勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）中において遠心分離することによって単離した。ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）を用いて細胞を洗浄し、１０の％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｓｉｇｍａ社）をさらに含有するＲＰＭＩ１６４０培地より、１×１０６個／ｍｌの密度に調節した。このＰＢＭＣを、刺激剤の存在下または非存在下で、平底型２４ウェルのポリスチレン製プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）において、５％のＣＯ２のもとで、３７℃で２４時間インキュベートした。健常者、活動型セリアック病患者、および非活動型セリアック病患者の糞便の抽出物を、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌの生存細菌の細胞懸濁液３０μｌの存在下または非存在下において、刺激として使用した。ポジティブコントロールとして、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４の、精製されたリポ多糖類（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ネガティブコントロールとして、非活性化されたＰＢＭＣにおけるサイトカインの産生量について試験を行なった。刺激については、各種類を各実験つき二回ずつ試験した。培養の上清を、遠心分離によって回収し、分割し、等分試料の形態で、サイトカインの検出まで−２０℃で保存した。
【００９５】
（３．サイトカインおよび細胞性活性化マーカーの同定）
ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造業者の指示にしたがって使用して、上述した上清のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−β）の濃度を測定した。互いに異なるリンパ球集団のマーカーおよび活性化のマーカーを、ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で標識をした抗ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ８６抗体、ならびにフローサイトメトリー（フローサイトメーターＥＰＩＣＳ（登録商標）ＸＬ−ＭＣＬ； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ 、Ｆｌｏｒｉｄａ）を使って検出した。免疫応答において核内因子（ＮＦ）κＢによって媒介されるシグナル伝達系との関連を、その阻害剤（ラクタシスチン）を加えることによって同定した。
【００９６】
（結果）
セリアック病患者の糞便は、細菌叢の組成における変化を示し、ＰＢＭＣにおいて、炎症促進性のサイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）については健常者より高く産生を誘導し、抗炎症のサイトカインＩＬ−１０については健常者より低く産生を誘導した。セリアック病患者の糞便は、さらに、コントロール糞便に比較すると、Ｔ細胞の活性化に必須の表面分子ＣＤ８６の合成を増加させた。ビフィドバクテリウム属とともにコ−インキュベートすると、セリアック病患者の糞便細菌叢によって誘導される炎症促進性のサイトカインのプロファイルが制御され、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの合成量を低減し、ＩＬ−１０の合成量を増加することができる。ラクタシスチンの存在下でサイトカインの合成が阻害されることは、ＮＦ κＢが、ビフィドバクテリウム属によって発揮される免疫調節効果に関与していることを示唆している。
【００９７】
〔実施例８ インビトロの消化プロセスにおいて生成されたグリアジンの各フラクションにおける特性、ビフィドバクテリウム属によるグリアジンの胃腸での消化により生じるペプチドの減少の特性、およびそれらの生物学的効果〕
（１．グリアジンの胃腸における消化）
全アミノ酸配列が入手可能なグリアジンのタンパク質のアイソフォームのうち４つ（α−／β−、γ−、およびω−グリアジン）を含有する、市販のグリアジンの試薬を使用した（Ｓｉｇｍａ社、Ｇ３３７５）。
【００９８】
市販のグリアジン抽出物の互いに異なる部分標本（１５０ｍｇ）を、等張性生理食塩水溶液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ）にｐＨ３にて溶解させ、この混合液を、攪拌しながらバス内で５５℃まで３０分間加熱した。サンプルは、ペプシン（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ７０００）（８００〜２５００ＵＩ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ブタのパンクレアチン（Ｐ１７５０）（活性、４×ＵＳＰ）、および胆汁抽出液（Ｂ３８８３）を用いて、胃腸の消化シミュレーション過程に供した。
【００９９】
胃における消化のシミュレーション（０．１ＭのＨＣｌ／ｐＨ３／１時間の条件でペプシンを使用し、攪拌した）は、遠心分離チューブ（５０ｍｌ）において実施した。胃のシミュレーションにつづいて、腸の段階（０．１ＭのＮａＨＣＯ３／ｐＨ６．９〜７／２時間の条件でパンクレアチンおよび胆汁を使用し、攪拌した）を、１５ＫＤの孔径を有する透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２．１、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ社、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）を備えた、２つの部屋から成るシステムの上側分室（供給側）（１．５ｍｌ）において実施した。下側分室（受け取り側）には、生理食塩水溶液を入れた（１ｍｌ）。消化過程が完了した時点で、胃腸における消化のシミュレーションによって得られたサンプルの上清（４０００ｒｐｍ／５分間／４℃）に含まれるタンパク質の合計含有量、および市販のキット（Ｓｉｇｍａ者、ＴＰ０２００）を使ってローリー法で透析されたサンプルに含まれるタンパク質の合計含有量を定量化した。
【０１００】
（２．インビトロの消化過程後の、グリアジンの各フラクションについてのクロマトグラフィー分析）
グリアジンを分析するために、逆相クロマトグラフィーを適用した。この分離は、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ製１０５０ＨＰＬＣ装置を使って、ＢｉｏＢａｓｉｃ Ｃ１８ カラム（５μｍ ４．６×２５０ｍｍ）を用いて実施した。使用した移動相は、（Ａ）アセトニトリル（ＡＣＮ、ＨＰＬＣ品質）の１５％（ｖ／ｖ）水溶液、および０．１％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ならびに（Ｂ）ＡＣＮの８０％（ｖ／ｖ）水溶液、および０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡからなっていた。使用した溶出勾配は、０分〜５分では溶媒Ｂの５％までの直線勾配、５分〜１２分では溶媒Ｂの２０％までの直線勾配であった。さらに、１００％の溶媒Ｂを使って、カラムを５分間洗浄し、初期条件を使って３分間平衡化させた。サンプルを、ナイロン膜（１３ｍｍ ０．２２ μｍ Ｍｉｌｌｅｘ ＧＮ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使って濾過した。各処理について、３つの独立した等分試料を分析した（１００μｌ）。紫外線領域における吸収を、２１０ｎｍで監視した。
【０１０１】
（３．逆相クロマトグラフィーを電気噴霧ＭｓＭｓ（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）と組み合わせて使った、グリアジンのペプチド配列特定）
四重極イオントラップ（Ｅｓｑｕｉｒｅ−ＬＣ−Ｍｓ（ｎ）、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を備えた質量分光計と組み合わせてＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ系装置を使用し、ＢｉｏＢａｓｉｃ Ｃ１８ カラム（５μｍ ４．６×２５０ｍｍ）において、クロマトグラフィーによる分離を実施した。採用したクロマトグラフィー溶出勾配は、前段に記載したものである。分析では、窒素を噴霧される乾燥気体として使用し、ヘリウムを、約５×１０−３ｂａｒの圧力で分子衝突させるための気体として使用した。衝突のキャピラリー電圧を４ｋＶで維持した。質量スペクトルを、質量／負荷が５００〜５０００の範囲で監視した。この方法により、１５個のスペクトルの平均質量分析（Ｍｓ）および５個のスペクトルの連続質量分析Ｍｓ（ｎ）が示される。質量連続分析を実施するためのイオン電流の限界値を５０００に決定した。前駆体イオンは、０．３９Ｖ〜２．６Ｖの電圧ランプで断片化され、ｍ／ｚ範囲が４．０において単離された。ｍ／ｚスペクトルのデータを、製造業者が提供する分析ソフトウェア（Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ３、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使って処理および変換した。スペクトルＭｓ（ｎ）のペプチド配列を、分析ソフトウェア（ＢｉｏＴｏｏｌｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１ （Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ））を使って決定した。
【０１０２】
（４．胃腸において消化されたグリアジンをビフィドバクテリウム属とともにコ−インキュベートする効果）
第１項で得られた、胃腸において消化されたグリアジンのサンプルを、腸の上皮モデルとして使用される、Ｃａｃｏ−２細胞のトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）の培養物の尖端部分（供給側）に設置した腸のビフィドバクテリウム属（例えば本発明の菌株）の存在下および非存在下においてコインキュベートした。本発明の菌株（ＩＡＴＡ−ＥＳ１）の存在下でのグリアジンの毒性効果の低減を評価することを目的として、ビフィドバクテリウム属の存在下および非存在下、下側分室（受け取り側）のＣａｃｏ−２細胞培養物において、炎症促進性のサイトカインＴＮＦ−αおよびＮＦκＢの合成量を、ＥＬＩＳＡ法により測定した（図３および図４）。
【０１０３】
（結果：胃腸において消化されたグリアジンのサンプルを透析することによって得られた、１５ＫＤ未満のタンパク質画分のＲＰ−ＨＰＬＣ分析）
クロマトグラフィーによって分離したところ（図２）、＃２画分が主要な画分である、５つのペプチド画分の存在が明らかになった。本発明者らの実験室で単離された、異なる菌株（つまり、本発明の菌株（ＩＡＴＡ−ＥＳ１）およびビフィドバクテリウム属 Ａ２）の存在下において、グリアジン由来のペプチドの透析可能性を調べたところ、これらの細菌がグリアジンに対して、具体的には＃２画分に対して、タンパク質分解能力を有することが実証された。＃２画分のもっとも重要な低下を引き起こした菌株は、本発明の菌株（ＩＡＴＡ−ＥＳ１）であり、調査時の条件においてこの画分の１０％を超える量を低下させた。
【０１０４】
〔実施例９：抗原提示に関連する樹状細胞における、グリアジンに誘導される成熟化と炎症促進性の表現型とを制御する、ビフィドバクテリウム属の菌株の能力の評価〕
（１．腸のビフィドバクテリウム属の培養物および評価用糞便サンプルの調製）
上記ビフィドバクテリウム属の菌株を２４時間培養したものを、０．０５％のシステイン（ＭＲＳ−Ｃ）を含有する１０ｍｌのＭＲＳ増殖培地（Ｓｃｈａｒｌａｕ Ｃｈｅｍｉｅ Ｓ．Ａ．社、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）に、１％で播種し、嫌気条件において３７℃で２２時間インキュベートした（ＡｎａｅｒｏＧｅｎ； Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、ＵＫ）。遠心分離（６，０００ｇ、１５分間）によって、細胞を回収し、ＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、２０％のグリセロールを含有するＰＢＳで再懸濁した。これらの懸濁液の等分試料を液体窒素により凍結させ、−８０℃で保存した。凍結・融解サイクルを経た後の生細胞の個数を、４８時間のインキュベーションの後にＭＲＳＣ寒天プレート上で計数することによって同定した。生存能は、どの場合にも９０％を超えていた。等分された各試料は１回の試験にのみ使用した。これを細胞刺激のために使用する前に、遠心分離によって細胞を洗浄し、ＰＢＳで再懸濁した。
【０１０５】
（２．末梢血液から得られた樹状細胞（ＤＣ）の単離および活性化）
ヘパリンを含むチューブにおいて、４人の健康なボランティア（２４歳〜４０歳、平均年齢３０歳）の末梢血液から、ＰＢＭＣを単離した。このＰＢＭＣは、フィコール勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において遠心分離によって単離した。ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）を用いて細胞を洗浄し、１０の％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｓｉｇｍａ社）をさらに含有するＲＰＭＩ１６４０培地により１×１０６個／ｍｌの密度に調節した。そのＰＢＭＣを、刺激剤の存在下または非存在下で、平底型２４ウェルのポリスチレン製プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）において、５％のＣＯ２のもとで、３７℃で２４時間インキュベートした。ビフィドバクテリウム属および他の腸内細菌の存在下および非存在下で、刺激としてグリアジン（０．１ｍｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（１５０ＵＩ）を使用した。ポジティブコントロールとして、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４の、精製されたリポ多糖類（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ネガティブコントロールとして、非活性化されたＰＢＭＣにおけるサイトカインの産生量について試験を行なった。刺激については、各種類を各実験につき二回ずつ試験した。培養液の上清を、遠心分離によって回収し、分割し、等分試料の形態で、サイトカインの検出まで−２０℃で保存した。
【０１０６】
（３．サイトカインおよび細胞性活性化マーカーの同定）
ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造業者の指示にしたがって使用して、上述した上清のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−β）の濃度を測定した。ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で標識をしたＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＣＤ８３に対する抗体を用いて、活性化分子のマーカーを検出し、フローサイトメトリー（フローサイトメーターＥＰＩＣＳ（登録商標）ＸＬ−ＭＣＬ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ 、Ｆｌｏｒｉｄａ）によって定量化した。
【０１０７】
（結果）
本発明の菌株（ＩＡＴＡ−ＥＳ１）は、ＩＦＮ−γの産生量を少なくとも１０％低下させた。なお、ＩＦＮ−γは、セリアック病患者においてグリアジンに応答して産生される主要な炎症性のサイトカインであり、グリアジンおよび他の潜在的に炎症促進性を有する腸内細菌（例えば、セリアック病患者から単離されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよび腸内細菌）を有する樹状細胞の活性化によって誘発される。さらに、本菌株は、樹状細胞による抗炎症のサイトカインＩＬ−１０の合成量を、グリアジンを用いた活性化によってなされた効果に比較すると少なくとも２００％増加させた。本発明の菌株（ＩＡＴＡ−ＥＳ１）は、グリアジンおよびＩＦＮ−γの存在下で樹状細胞をインキュベートした後に誘導されるＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６分子の発現を、１５％から２０％低減させた。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】グリアジンの異なる消化のタンパク質のプロファイルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。パネルＡ：１）ペプシンを用いて消化した後のグリアジン（Ｇ−Ｐ）のコントロール；２）ペプシンおよびトリプシンを用いて消化した後のグリアジン（Ｇ−Ｐ−Ｔ）のコントロール；３）本発明の菌株とともにインキュベートしたＧ−Ｐ；４）本発明の菌株（ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＴＡ−ＥＳ１）とともにインキュベートしたＧ−Ｐ−Ｔ。パネルＢ：１）コントロールＧ−Ｐ；２）コントロールＧ−Ｐ−Ｔ；３）本発明の菌株およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ７１２とともにインキュベートしたＧ−Ｐ；４）本発明の菌株およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＣＤＯ７１２とともにインキュベートしたＧ−Ｐ−Ｔ。
【図２】インビトロによるグリアジンの消化の透析可能な画分から得られるクロマトグラムを示す。ピーク２が、本発明の菌株によって加水分解されたと考えられるピークである。
【図３】インビトロにおけるビフィドバクテリウム属の存在下または非存在下で、グリアジン（Ｇｌｄ）の、溶解性を有し消化される画分によって引き起こされる細胞の生存能の変化（リソソーム内の活性として測定）を示す。ウシアルブミン（ＢＳＡ）（ネガティブコントロール）；ＢｉｆＡ２（ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂ． ａｎｉｍａｌｉｓ））；Ｂｂ（ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ））、およびＢＬ（本発明の菌株；ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＩＡＴＡ−ＥＳ１−）。結果は平均値で示し、標準偏差は４通りにて決定する。
【図４】インビトロにおけるビフィドバクテリウム属の存在下または非存在下で、グリアジン（Ｇｌｄ）の、溶解性を有し消化される画分に曝されるＣａｃｏ−２細胞培養における、炎症促進性のサイトカイン（ＴＮＦ−α）の生成および核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の発現。ウシアルブミン（ＢＳＡ）（ネガティブコントロール）；ＢｉｆＡ２（Ｂ． ａｎｉｍａｌｉｓ）；Ｂｂ（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ）、およびＢＬ（本発明の菌株；Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ ＩＡＴＡ−ＥＳ１−）。結果は平均値で示し、標準偏差は４回繰り返すことにより決定する。
【受託番号】
【０１０９】
ＣＥＣＴ ７３４７
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食物アレルギーの治療または予防において使用する微生物を選別するための方法であって、
ａ．健常者由来のサンプルから微生物を単離するステップと、
ｂ．免疫応答を制御し、食物アレルギーを引き起こす少なくとも１つの媒介物の作用機構を加水分解、不活性化、または妨害することができる、ステップａ）の微生物を選別するステップとを含む、方法。
【請求項２】
上記健常者が母乳栄養児である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記食物アレルギーがセリアック病である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
セリアック病の治療または予防において使用するための微生物。
【請求項５】
免疫応答を制御し、セリアック病を引き起こす少なくとも１つのグルテンペプチドの有害な作用機構を加水分解、不活性化、または妨害することができる、請求項４に記載のセリアック病の治療または予防において使用するための微生物。
【請求項６】
ビフィドバクテリウム属（ｇｅｎｕｓ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から選別される、請求項４または５に記載のセリアック病の治療または予防において使用するための微生物。
【請求項７】
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）種から選別される、請求項６に記載のセリアック病の治療または予防において使用するための微生物。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の微生物を含む、セリアック病の治療または予防において使用するための薬学的組成物または食品組成物。
【請求項９】
受託番号７３４７でＣＥＣＴに寄託されている、菌株。
【請求項１０】
医薬、食品、栄養補助食品、食品サプリメント、プロバイオティクスもしくはシンバイオティクス、または新規な食品として使用するための、請求項９に記載の菌株。
【請求項１１】
セリアック病の治療または予防のための医薬として使用するための、請求項１０に記載の菌株。
【請求項１２】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、組成物。
【請求項１３】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、薬学的組成物または食品組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、食品。
【請求項１５】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、栄養補助食品。
【請求項１６】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、食品サプリメント。
【請求項１７】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、プロバイオティクスまたはシンバイオティクス。
【請求項１８】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、新規な食品。
【請求項１９】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物または請求項９に記載の菌株により生成される、生理活性化合物。
【請求項２０】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物または請求項９に記載の菌株の培養液から得られる、上清。
【請求項２１】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物または請求項９に記載の菌株の培養液から得られる、抽出物。
【請求項１】
食物アレルギーの治療または予防において使用する微生物を選別するための方法であって、
ａ．健常者由来のサンプルから微生物を単離するステップと、
ｂ．免疫応答を制御し、食物アレルギーを引き起こす少なくとも１つの媒介物の作用機構を加水分解、不活性化、または妨害することができる、ステップａ）の微生物を選別するステップとを含む、方法。
【請求項２】
上記健常者が母乳栄養児である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記食物アレルギーがセリアック病である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
セリアック病の治療または予防において使用するための微生物。
【請求項５】
免疫応答を制御し、セリアック病を引き起こす少なくとも１つのグルテンペプチドの有害な作用機構を加水分解、不活性化、または妨害することができる、請求項４に記載のセリアック病の治療または予防において使用するための微生物。
【請求項６】
ビフィドバクテリウム属（ｇｅｎｕｓ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から選別される、請求項４または５に記載のセリアック病の治療または予防において使用するための微生物。
【請求項７】
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）種から選別される、請求項６に記載のセリアック病の治療または予防において使用するための微生物。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の微生物を含む、セリアック病の治療または予防において使用するための薬学的組成物または食品組成物。
【請求項９】
受託番号７３４７でＣＥＣＴに寄託されている、菌株。
【請求項１０】
医薬、食品、栄養補助食品、食品サプリメント、プロバイオティクスもしくはシンバイオティクス、または新規な食品として使用するための、請求項９に記載の菌株。
【請求項１１】
セリアック病の治療または予防のための医薬として使用するための、請求項１０に記載の菌株。
【請求項１２】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、組成物。
【請求項１３】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、薬学的組成物または食品組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、食品。
【請求項１５】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、栄養補助食品。
【請求項１６】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、食品サプリメント。
【請求項１７】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、プロバイオティクスまたはシンバイオティクス。
【請求項１８】
請求項９に記載の菌株または該菌株により生成される生理活性化合物を含む、新規な食品。
【請求項１９】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物または請求項９に記載の菌株により生成される、生理活性化合物。
【請求項２０】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物または請求項９に記載の菌株の培養液から得られる、上清。
【請求項２１】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物または請求項９に記載の菌株の培養液から得られる、抽出物。
【図２】
【図３】
【図４】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１１−５０７５４０（Ｐ２０１１−５０７５４０Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４０１４９（Ｐ２０１０−５４０１４９）
【出願日】平成２０年１２月２３日（２００８．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００８／０７０２４３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０８６２
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０８０１４３２７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２３日（２００８．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００８／０７０２４３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０８６２
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０８０１４３２７）
【Ｆターム（参考）】
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