ケフィアを用いた糖尿病治療剤とその製造方法、及びケフィアを用いた放射線障害防護剤、並びにケフィアを用いた健康食品
【課題】健康食品として利用される発酵乳ケフィアの分子量１０００以下の水溶性抽出物をグルコース取り込み担当細胞に添加することによりグルコース取り込み活性を増強させる。
【解決手段】ケフィア抽出物により生体内グルコース取り込みの主体である筋肉細胞のグルコース取り込みの増強が可能となり、生体のグルコース取り込みを増強させることができる。
【解決手段】ケフィア抽出物により生体内グルコース取り込みの主体である筋肉細胞のグルコース取り込みの増強が可能となり、生体のグルコース取り込みを増強させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康食品であるケフィアによる血糖値降下作用あるいは放射線障害防護作用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ケフィアはグルジア共和国コーカサス地方の人々が愛飲している発酵乳で、ウシやヤギ、ヒツジの乳をヤギの革袋に入れて保存していたものに偶然、乳酸菌、酵母が混入して乳酸及びアルコール発酵して生じたものである。コーカサス型発酵乳ケフィアは独立国家共同体のロシア共和国科学アカデミー微生物中央研究所が長年の歳月をかけ、製造方法を研究して得た安定なケフィア粒を菌種としたものである。消化機能を亢進させ、腎臓病、循環器疾患など、様々な疾患の治療食として医療機関で用いられている。ケフィア粒は１〜３ｃｍ前後のスポンジ状の固まりで約２０種類の乳酸菌の他、酵母菌、酢酸菌を有し、日本においては一般にヨーグルトきのこと呼ばれている。ケフィア粒に牛乳を入れ、所定時間常温で密閉することによりケフィア粒混入のケフィア（ケフィアヨーグルトと呼ばれる）が得られ、これをざるで濾してケフィア粒を取り除くことにより簡単にケフィアを得ることができ、健康食品として一般家庭でも愛用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
一方、日本においては近年、欧米型の食生活から、インスリン非依存性のＩＩ型糖尿病が増加の一途をたどり、多くの日本人を苦しめている。このＩＩ型糖尿病においては、健康維持の中核の生理作用である細胞のグルコース取り込みが行なえないことで、生態の恒常性維持が行えず、結果として様々な合併症を併発し深刻な症状を呈することが珍しくない。また、現代の原子力発電所の事故等による放射線障害、さらには放射線障害を抱えた多くの人への有効な薬剤の開発はまだ十分とはいえない。
本発明は日本人の糖尿病の９割を占めるＩＩ型糖尿病の治療において中核となる細胞のグルコース取り込みを増強することが可能な薬剤又は食品及びその製造方法を提供することを第１の目的とする。さらに、数多くの有益な生体防御機能が考えられるケフィアの放射線障害への利用を第２の目的としたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、分子量が１０００以下のケフィア抽出物を用いることにより、活性酸素低減により細胞の酸化ストレスを緩和すること、グルコース取り込みを制御するＰＩ３キナーゼの活性を促進すること、細胞のグルコース取り込みを増強させることに成功し、糖尿病、主としてＩＩ型糖尿病治療に使用する薬剤又は食品としての第１の発明を完成させた。
【０００５】
第１の発明に係る糖尿病治療に使用するケフィア抽出物は、水溶性を有し、酸性、あるいは中性で安定で、かつ高圧蒸気滅菌にも安定である。ここで、酸性あるいは中性で安定とは、ケフィア上清にアルカリ性溶液を加えて中性となったものが活性を有することをいう。
ケフィアを有効成分として用いた糖尿病治療剤の製造方法はケフィア（ケフィア原液）から、遠心分離、デカンテーション又は濾過等の公知の方法にて残渣を分離して、その上澄液（上清という）をゲル濾過、透析等の公知の方法によって得た分子量１０００以下のケフィア抽出液（抽出物の一例）を用いることを特徴とする。
【０００６】
第２の発明におけるケフィアを有効成分として含む放射線障害防護剤は、第１の発明である活性酸素の低減作用による酸化ストレスの低減作用の他数多くの有益な生体防御機能の考えられるケフィアの放射線障害への適用を目的として、本発明者等が鋭意研究した結果、ケフィアに放射線照射により動物に生じる放射線高感受性臓器（骨髄、脾臓、胸腺、小腸、大腸）のアポトーシス死に対して防護作用があることを発見し本発明を完成させた。
ここで、放射線障害防護剤の防護作用は、電離性放射線の生物学的効果を軽減し、放射線障害をやわらげることであり、放射線の化学間接作用によるラジカル形成にひき続いて起こる化学的変量を減少させる効果があると考えられている。そのため、防護剤は、照射を受ける前にあらかじめ投与しておく必要がある。
【０００７】
アポトーシスとは生理的な細胞死の過程又は形態であって、事故的な細胞死のネクローシス（壊死）とは区別され、放射線照射による細胞死には多くの場合アポトーシスが見られる。従って、放射線障害防護剤の作用も放射線照射により動物に生じる生体細胞のアポトーシス死に対する有効性を調べる事によって知りえる。放射線障害は一般に温度などの物質要因、酸素分圧・水分含量などの化学的要因、及び生物種・細胞の種類・遺伝子構成・細胞分裂周期・年齢・生理条件など多くの生物的要因によって変化するが、細胞分裂の盛んな器官ほど放射線に高感受性があり、骨髄、脾臓、胸腺、小腸、大腸等の放射線高感受性臓器のアポトーシスを見る事により放射線障害防護剤の効果を調べる。使用する放射線の単位は吸収線量のグレイ（Ｇｙ）が用いられる。
【０００８】
分子量が１０００以下のケフィア抽出物を有効成分として含むことを特徴とするケフィアを用いた健康食品は成分中にケフィア抽出物を含むので、抗糖尿病作用、放射線障害防護作用を有し、抗糖尿病食品、放射線障害防護食品として使用できる。
【発明の効果】
【０００９】
実施例に示すように、分子量が１０００以下のケフィア抽出物がグルコース取り込み細胞の活性酸素を低減させ、細胞の酸化ストレスを緩和させ、グルコース取り込みを制御するＰＩ３キナーゼの活性を促進させ、細胞のグルコース取り込みを増強させることにより、生体の恒常性維持をはかり、糖尿病、主としてＩＩ型糖尿病治療に有効であることが判明した。
また、ケフィアを用いた糖尿病治療剤において、ケフィアの抽出液（ケフィア抽出物）が水溶性を有し、酸性、あるいは中性で安定、高圧蒸気滅菌にも安定であることが分かった。
そして、ケフィアから、遠心分離、デカンテーション又は濾過等の公知の方法にて残渣を分離して、その上澄液をゲル濾過、透析等の公知の方法によって分子量１０００以下のケフィア抽出液を得ることによって、糖尿病治療剤が製造できることが分かった。
【００１０】
さらに、実施例により、ケフィアは放射線照射により動物に生じる放射線高感受性臓器（骨髄、脾臓、胸腺、小腸、大腸）のアポトーシス死に対して防護作用があることが判明した。特に、小腸の絨毛腺を再生していく再生腺管の放射線による照射死、胸腺、脾臓、結腸において細胞のアポトーシス、さらに消化管死だけでなく、骨髄死をもケフィアが防御できることが示唆された。
胸腺は免疫系に重要な働きをしているＴ細胞が作られる臓器であり、脾臓はリンパ球の増殖と機能発現に重要な働きをしている臓器である。したがって、ケフィアが放射線障害によっておきる免疫力の低下を防ぎ、放射線によって引き起こされる様々な急性及び慢性の疫病を防御できることが示唆された。
分子量が１０００以下のケフィア抽出物を有効成分として含むことを特徴とするケフィアを用いた健康食品は成分中にケフィア抽出物を含むので、抗糖尿病食品あるいは放射線障害防護食品として使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ケフィアはケフィアヨーグルトからケフィア粒を除いた上澄（培養液）であり、その成分の多くは水分で、水に溶けた蛋白質、糖、アルコールと脂溶性の脂質等がコロイド状に存在している。ここで使用するケフィアは日本ケフィア株式会社より供与されたもの（ケフィア原液という）を使用した。菌種はロシア共和国のライセンスイントルグ社からの菌種を適当な条件下で保管し、必要に応じて活性化するために継代培養を行い、ケフィア粒を十分活性化したものを使用した。培養は必要に応じて乳固形分は４〜１８％、耐熱安定剤としてペクチンを使用し、固形分調製後に殺菌・冷却して３０〜２５℃になれば、上記マザースターター（活性化した種菌）を３〜５％添加し、発酵タンク中で適当な温度・時間で培養して乳酸濃度を終点で決めて培養したものを使用した。実験の方法によって、ケフィア（ケフィア原液）は培養した液状のものを殺菌・瓶詰保存して使うか、凍結乾燥して粉砕して包装保存したものを使用した。
【００１２】
グルコース取り込み測定に用いる細胞は生体の中でもインスリン刺激に応答してグルコース取り込みを行なう機能を有する筋肉組織様に分化させたＬ６筋管細胞として使用した。分化処理としては細胞がシャーレの中で一杯に増殖したコンフルエント状態のＬ６細胞に２％の低血清処理で１週間処理することで行なった。
【００１３】
細胞のグルコース取り込みはケフィア抽出物の処理を終了した細胞にトリチウム標識した２−デオキシグルコースを取り込ませ、細胞を溶解した後シンチレーションカウンターによるカウント値を測定することにより行なった。
【００１４】
ケフィア上清は以下の方法で調製したものを用いた。ケフィア原液を４℃にて５，０００×ｇで１時間遠心処理して上清を集め、さらに１０，０００×ｇで２０分間遠心処理した上清を集めケフィア上清１（ｐＨ４．０／ケフィア水抽出物）を得た。このケフィア上清はこの段階ではｐＨ４．０程度である。
【００１５】
ケフィア原液（培養上澄ともいう）を凍結乾燥した粉末を１０倍容のクロロホルム／メタノール（２：１）混液に懸濁後、４℃にて２４時間攪拌後、５，０００×ｇで１時間遠心処理すると、クロロホルムに溶けない糖、蛋白質等の水溶性物質は下に沈殿する。ここで、上清（ケフィアクロロホルム／メタノール抽出物）を集め、減圧濃縮機にてクロロホルム、メタノールを除去し、得られた残渣をエタノールに溶かし、ケフィア上清２（ケフィアクロロホルム／メタノール抽出物）を得た。
【００１６】
前記ケフィア上清１（ｐＨ４．０）にオートクレーブ処理（高圧蒸気滅菌処理）を１２０℃、２０分した。処理により沈殿が生じるので１０，０００×ｇで２０分間遠心処理して上清を集めケフィア上清３（加熱処理）を得た。前記ケフィア上清１（ｐＨ４．０）を水酸化ナトリウム水溶液を用い、ｐＨ７．０になるように中和した。中和により沈殿が生じるので１０，０００×ｇで２０分間遠心処理して上清を集めケフィア上清４（ｐＨ７．０）を得た。
【００１７】
前記ケフィア上清４（ｐＨ７．０）を排除限界分子量１，０００の透析膜を用い、水に対して透析を行った。透析により沈殿が生じるので１０，０００×ｇで２０分間遠心処理して上清を集めケフィア上清５（透析処理）を得た。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例により説明する。が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】
（実施例１）
筋管細胞に分化させたラット由来Ｌ６細胞を用い、Ｌ６細胞培養液の１／４容量のケフィア上清１（ｐＨ４．０）、ケフィア上清２（ケフィアクロロホルム／メタノール抽出物）を加え、４時間処理（無菌状態、３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気下）後、ケフィア抽出物のグルコースの取り込みに対する影響を調べた。Ｌ６細胞のグルコース取り込みはトリチウム標識した２−デオキシグルコースを細胞に取り込ませ測定した。
【００２０】
その結果を図１に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図１から明らかなように、ケフィア上清１（ｐＨ４．０）において、Ｌ６細胞のグルコース取り込み能が増強されていた。この増強効果はインスリン刺激の有無に関わらず認められた。一方でケフィア上清２（ケフィアクロロホルム／メタノール抽出物）においてはむしろ取り込み能が抑制されていた。このことから、ケフィア活性成分は脂溶性ではなく、水溶性であることがわかる。
【００２１】
（実施例２）
実施例１と同様、筋管細胞に分化させたラット由来Ｌ６細胞に、Ｌ６細胞培養液の１／４容量のケフィア上清１（ｐＨ４．０）、ケフィア上清３（加熱処理）、ケフィア上清４（ｐＨ７．０）を加え、４時間処理（無菌状態、３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気下）で、ケフィア抽出物のグルコースの取り込みに対する影響を調べた。
【００２２】
その結果を図２に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図２から明らかなように、ケフィア上清のグルコース取り込み増強活性は１２０℃、２０分間の加熱処理やｐＨ７．０への中和処理、両者においても保持されていた。これらのことからグルコース取り込み増強活性は、酸性（ｐＨ４．０）、中性（ｐＨ７．０）、そして１２０℃、２０分間のオートクレーブ処理において安定であることが明らかとなった。
【００２３】
（実施例３）
実施例１と同様の条件で、ケフィア上清４（ｐＨ７．０）、ケフィア上清５（透析処理）を加え、ケフィア抽出物のグルコースの取り込みに対する影響を調べた。
【００２４】
その結果を図３に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図３から明らかなように、ケフィア上清のグルコース取り込み増強活性は透析処理により消失した。このことからグルコース取り込み増強活性は、排除限界分子量１，０００の透析膜を通過するサイズであると考えられた。
【００２５】
（実施例４）
実施例１と同様の条件で、ケフィア上清４（ｐＨ７．０）を加え、ただし、処理時間を７２時間まで変化させて、ケフィア抽出物のグルコース取り込み増強活性を調べた。
【００２６】
その結果を図４に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図４から明らかなように、ケフィア上清のグルコース取り込み増強活性は４８時間まで直線的に上昇し、以降はプラート（平面）に達していた。
このことからグルコース取り込み増強活性は、４８時間まで時間依存的に増強活性が上昇し、その後安定して効果が持続することが明らかとなった。
【００２７】
（実施例５）
未分化状態のＬ６細胞にケフィア上清１（ｐＨ４．０）、ケフィア上清４（ｐＨ７．０）を加え、ケフィア抽出物の細胞内酸化還元状態を還元状態に誘導する活性を調べた。
すなわち、３５ｍｍ培養皿にてセミコンフルエント状態（細胞がシャーレに半分程度まで増殖）のＬ６細胞に５分から３０分間ケフィア抽出物を添加し、処理後ＨＢＳＳ（ハンクス緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄後、５μＭの蛍光試薬ＤＣＦＨ−ＤＡ（ジクロロフルオレセインジアセテート）を含むＨＢＳＳで５分間処理し、ＨＢＳＳで２回洗浄後、レーザー生物顕微鏡で細胞中のＤＣＦ（ジクロロフルオレセイン）の蛍光強度を測定し数値化し細胞の酸化還元状態の指標とした。
【００２８】
その結果を図５に示す。縦軸は細胞内過酸化水素と反応し蛍光を発しているＤＣＦの蛍光強度をコントロール（ケフィア抽出物未処理）を１とした相対値で示したもの。横軸は処理時間を示す。グラフの白抜きはケフィア上清１（ｐＨ４．０）を、黒はケフィア上清４（ｐＨ７．０）の結果である。
図５から明らかなように、ｐＨの状態に関わらず、ケフィア上清１（ｐＨ４．０）、ケフィア上清４（ｐＨ７．０）を処理した細胞中のＤＣＦの蛍光強度は急速に下降しており、ケフィア抽出物は細胞内酸化還元状態を素早く還元状態へ移行させる活性があることが明らかとなった。
この現象は細胞内活性酸素減少によるものと考えられ、一方で細胞のグルコース取り込み能が活性酸素による酸化ストレスにより阻害されることから、ケフィア上清のグルコース取り込み増強活性の作用にこの活性酸素減少が関与していることが考えられる。
【００２９】
（実施例６）
実施例１と同様の条件で、あらかじめ細胞にＰＩ３キナーゼ阻害剤であるワートマニンを処理しＰＩ３キナーゼを抑制した細胞に、ケフィア上清４（ｐＨ７．０）を加え、ケフィア抽出物のグルコース取り込み増強活性を調べた。
【００３０】
その結果を図６に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図６から明らかなように、ワートマニンの濃度依存的にケフィア抽出物のグルコース取り込み増強活性が抑制された。
この結果から、ケフィア抽出物は細胞のグルコース取り込みを制御するＰＩ３キナーゼを中心としたインスリンシグナル伝達経路のＰＩ３キナーゼを含めた上流側を活性化し、細胞のグルコース取り込み増強活性を増強していると考えられた。
【００３１】
（実施例７）
ケフィア上清４（ｐＨ７．０）５０ｍｌをＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＰ２ゲルろ過カラム（ベッド８００ｍｌ、流速２４０ｍｌ／時）に供し、素通り画分（分子量１，８００以上）を含めた６画分（ケフィアＰ２画分という）を分取した。結果を図７に示す。縦軸は吸光度を、横軸は溶出時間を示したもの。グラフの実線は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、蛋白質成分で吸光度が大となる。図７より、画分４、５には、活性の邪魔になる蛋白質が多く含まれ、画分３は蛋白質含有量が少ない事がわかる。
【００３２】
実施例１と同様の条件で、調製したケフィアＰ２画分を加え、ケフィア抽出物のグルコースの取り込みに対する影響を調べた。
その結果を図８に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図８から明らかなように、ケフィアＰ２画分３にグルコース取り込み増強活性が最も高く保持されていた。
【００３３】
（実施例８）
先に調製したケフィアＰ２画分３の１０ｍｌをＴＯＨＳＯ株式会社製のＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ陰イオン交換カラム（ベッド１０ｍｌ）に供し、素通りした画分を分取した（ＤＥＡＥカラム素通り画分）。ケフィアＰ２画分３中の陰イオンは陰イオン交換カラムに吸着されるため、素通りした画分にはケフィアＰ２画分３中の陽イオン又は非荷電物質が含まれる。
次にケフィアＰ２画分３の陰イオンを吸着した陰イオン交換カラムをリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出した画分を分取した（ＤＥＡＥカラム１５０ｍＭＮａＣｌ溶出画分）。ここで、陰イオン交換カラムに吸着した陰イオンはＮａＣｌの塩素イオンと置換して、ＤＥＡＥカラム１５０ｍＭＮａＣｌ溶出画分には陰イオンが含まれる。
【００３４】
実施例１と同様の条件で、ＤＥＡＥカラム素通り画分、ＤＥＡＥカラム１５０ｍＭＮａＣｌ溶出画分について、ケフィア抽出物のグルコースの取り込みに対する影響を調べた。
その結果を図９に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図９から明らかなように、ＤＥＡＥカラム１５０ｍＭＮａＣｌ溶出画分にグルコース取り込み増強活性が保持されていた。
従って、ケフィアＰ２画分３中の陰イオンを含むＤＥＡＥカラムＮａＣｌ溶出画分にグルコース取り込み増強作用物質が含まれることが分かる。従って、ケフィアＰ２画分３中の陰イオン性物質にグルコース取り込み増強作用があることが分かる。
【００３５】
（実施例９／参考試験）
未分化Ｌ６細胞を培養した場合のケフィア上清（ケフィア抽出物）処理の細胞増殖に対する影響を調べた。培養液としては上記のＬ６細胞を培養した培養液を用いた。処理前日に細胞を播取し、Ｌ６細胞培養液の１／４容量の上清１或いは上清４を添加し、４時間処理した後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後通常の培養培地に交換し、細胞数を測定した。
【００３６】
結果を図１０に示す。縦軸は細胞数を、横軸は培養時間を示す。グラフの白抜きはコントロールを、黒はケフィア抽出物の結果である。
図１０に示すように、ケフィア抽出物を４時間処理しても細胞増殖には影響を与えなかった。
従って、ケフィア抽出物のグルコース取り込み増強作用はグルコース取り込み細胞の増殖作用では無いことがわかる。
【００３７】
以上により、ケフィア抽出物に含まれる活性を有する物質は水溶性、アルカリ処理に安定、１２０℃で２０分間の高圧蒸気滅菌処理、凍結処理、酸処理により安定であるが、クロロホルム／メタノールにより抽出されないこと、排除限界分子量１，０００の透析膜を用いた透析により失われる性質を有することがわかる。
さらに、ケフィア抽出物の細胞のグルコース取り込み増強作用は細胞の活性酸素量を低下させ、細胞の酸化ストレスを緩和させ、ＰＩ３キナーゼの活性を促進することによるものであることがわかる。
また、ケフィア抽出物の細胞のグルコース取り込み増強作用は、インスリン刺激の有無に関わらず、細胞培養に４時間の期間で加えることで、グルコース取り込みが上昇、さらに７２時間の長時間処理でさらに増強されることがわかる。
【００３８】
上記の結果より、ケフィア抽出物はケフィア（ケフィア原液）を遠心分離、デカンテーション（傾けて上澄みをとる）、濾過などの公知の方法にて残渣を分離し、上澄液（上清）をｐＨが中性となるまで水酸化ナトリウムにより中和する。中和によって出現した沈殿を再び、遠心分離、デカンテーション、濾過など公知の方法にて分離して得られた上澄液（上清）をゲル濾過に供し、分子量１，０００以下の画分のケフィア抽出液を得ることによって活性効果の強い糖尿病治療剤が製造できる。
【００３９】
上記、実施例ではケフィア抽出物を製造するのに日本ケフィア株式会社より供与されたケフィアをそのまま用いたが、ロシア以外のその他国由来のものでも、日本で製造、販売されたケフィアを使用しても良く、あるいはケフィア粒を求めて自分で培養したものを使用しても良い。
また、本実施例ではケフィアは培養した液状のものを殺菌・瓶詰保存して使うか、凍結乾燥して粉砕して包装保存したものを使用したが、濃縮物、あるいは乾燥物をあるいはその他の形状のものでもケフィアであれば何れの形状のものも原料として用いることが可能である。なお、濃縮又は乾燥には、例えば、凍結濃縮、凍結乾燥、減圧濃縮、減圧乾燥、泡沫乾燥などの公知の方法が用いられる。
【００４０】
上記実施例は糖尿病治療剤としての作用について実験したが、分子量１，０００以下のケフィア抽出物を含む健康食品についても上記実施例から抗糖尿病作用を有し、抗糖尿病食品なることがわかる。
また、分子量１，０００以下のケフィア抽出物を用いた健康食品は、美味しくするため、栄養価を上げる、更なる効果を期待するために更に他の栄養素、物質を加える事も可能である。
【００４１】
次に、第２の発明であるケフィア抽出物の放射線障害防御作用について以下に説明する。ケフィアが生体内で放射線誘発アポトーシスを抑制する効果があるかどうかを調べるため、高感受性臓器である小腸（空腸）、大腸（結腸）、脾臓、胸腺、骨髄のエックス線照射によるアポトーシスの発現を定量した。すなわち、ラットにケフィア投与後、ラットの各臓器での低線量照射後短時間のアポトーシスの出現、ＬＤ５０値の変化を調べることによりケフィアの生体内での放射線障害予防効果について実験した。放射線の消化管に対する障害は放射線照射後、直ぐに現れるためエックス線照射、２時間後のラットの臓器について観察した。骨髄に対する作用は凡そ３０日経過後で現れ約３０日以後も生存した場合には骨髄死は現れないのが通常のため、約３０日経過後の生存数を調べる事で調査した。
【００４２】
以下に実施例を示す。
ケフィアは日本ケフィア株式会社供与のケフィア（ケフィア原液）を使用し、遠心分離して上清液を調製しラットに投与した。
【００４３】
（実施例１０）
雄性ウィスターラット、７週齢を用いて、以下に調製したケフィア上清を用いて実験を行った。
（１）ケフィア上清の調製
ケフィア原液（ケフィア培養液）を１０，０００×ｇで２時間遠心分離後、上清を回収し、濾紙の上にセライトを入れた濾過装置に加え、吸引濾過し、その上清を０．２２μｍのフィルター装置にセットし、濾過滅菌してケフィア上清とした。
（２）ラットへの投与
調製した上清を２倍希釈し、飲水ボトルに入れ１４日間自由飲水させた。ケフィア投与群、対照群は各線量あたり、３〜５匹ずつを一群とした。
（３）エックス線照射
東芝ＥＸＳ−３００を用いて、ラットにエックス線全身照射を行った。
（２００ＫＶ、１５ｍＡの条件、０．５ｍｍＣｕ＋０．５ｍｍアルミニウムフィルター、線量率０．４４３Ｇｙ／ｍｉｎ）を用いた。
ケフィア投与群と対照群に０．２５Ｇｙ、０．５Ｇｙ、１Ｇｙの照射を行なった。
（４）照射とアポトーシスのカウント
Ｘ線照射２時間後、麻酔下で屠殺したラットから空腸、結腸、脾臓、胸腺を摘出し、ホルマリン固定した。空腸、結腸は長軸方向に切り出し、脾臓、胸腺共にパラフィン包埋し、３μｍの切片に薄切した。Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンアンドエオシン）染色を行い、細胞が凝縮、断片化したアポトーシス細胞をカウントした。空腸、結腸は４００倍の顕微鏡下で１クリプトあたりのアポトーシスをカウントし、その平均値をアポトーシスインデックスとした。１ラット当たり５０以上のクリプトをカウントした。脾臓、胸腺は、脾臓の白脾隋領域と胸腺の皮質領域を１０００倍の倍率で、１視野の総リンパ球数あたりのアポトーシス数をカウントし、アポトーシスの割合（％）をアポトーシスインデックスとした。
（５）統計学的処理
実験結果は平均値±標準偏差で表し、有意差検定はＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ─ｔｅｓｔを用いた。
【００４４】
（６）結果
図１１に示すように、空腸では０．２５Ｇｙ、０．５Ｇｙ、１Ｇｙのいずれの線量でもクリプトあたりのアポトーシス数は対照群、ケフィア群に有為な差は認められなかった。
図１２、図１３、図１４に示すように、胸腺、脾臓、結腸ではリンパ数に対するアポトーシスインデックスの割合が１Ｇｙで有意に抑制された。
また、低線量（０．２５及び０．５Ｇｙ）では、胸腺及び脾臓細胞の放射線障害によるアポトーシスが有意に制御できることが明らかとなった。
従って、ケフィア投与ラットの胸腺、脾臓、結腸において、１Ｇｙ以下のエックス全身照射後アポトーシス数が有為に抑制されることがわかった。１Ｇｙ以下の線量ではケフィアは胸腺、脾臓、結腸において細胞の放射線障害を何らかの方法で抑制していると考えられる。
（７）考察
胸腺は免疫系に重要な働きをしているＴ細胞が作られる臓器であり、脾臓はリンパ球の増殖と機能発現に重要な働きをしている臓器である。したがって、ケフィアが放射線障害によって生じる免疫力の低下を防ぎ、放射線によって引き起こされる様々な急性及び慢性の疫病を防御できることが示唆された。
【００４５】
（実施例１１）
次にケフイアの放射線防御効果として放射線の高感受性臓器である小腸消化管死の防御について実験した。
その目的は急性放射線障害において、骨髄死は骨髄移植により効果的に防ぐことができるが、消化管死を防ぐ有効な手法は少ない。そこで、ケフィアをマウスに投与し、小腸の放射線による腺管死をケフィアが防御できるかどうか調べた。
（１）方法
動物；６週齢雄Ｃｒｊ（チャールスリバー社製）：Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスを使用
原液を２倍希釈後（×２）、４倍希釈液（×４）、１０倍希釈液（×１０）を各々飲み水としてＸ線照射前１週間目より実験終了まで投与。
対照群としては蒸留水を用いた。２〜３日に一度交換、摂水量を測定。
餌；オリエンタル酵母（株）社製ＭＦ餌（摂取量を測定）
Ｘ線照射；フィルター無し／４５０ｃＧｙ（センチグレイ）／１分の線量率で全身照射
照射量；０、７、８、９、１０、１２Ｇｙ
マウス頭数；各照射群５匹。照射時には各群の動物を２匹ずつ入れ照射する。
屠殺；照射後３日目に頸椎脱臼により屠殺。体重測定後、小腸を取り出し内容物を洗浄し、カルノア液で固定。Ｈ＆Ｅ染色を行い小腸の再生腺管（クリプト）数を測定する。
【００４６】
【表１】
【００４７】
（３）結果
結果を表１に示す。
表１に示すように８グレイでの２倍希釈液投与群から９グレイ以上のすべての群でコントロールに比べて小腸再生腺管数がケフィア投与群で統計的に有意の差で増加しており、ケフィアに放射線障害（小腸腺管死）を防ぐ効果があることが判明した。
表１で、ＭＦは対照群を示す。Ｐは統計上の有意の差があるを０．０５で示し、このＰが小さい程有意の差が大である事を示す。つまり、Ｐが０．０１以下とは有意の差が非常に大きい事を示す。
（４）考察
小腸腺管細胞は活発に分裂し、絨毛を形成するが、放射線により腺管が死滅すると、小腸は絨毛のない状態になり食物中の栄養成分の吸収ができなくなり、出血し生体は死滅する。このような放射線による消化管死を有効に防御できる薬剤もしくは食品はこれまでほとんど知られておらず、放射線障害を防御するケフィアの存在は大である。
【００４８】
（実施例１２）
ここまで、放射線によるマウス小腸腺管死をケフィアが抑制する効果があることを明らかにした。
次にケフィアの放射線防御効果として放射線による骨髄死の防御について実験した。ここでは、骨髄死を抑制できるかどうかを見るために、放射線照射後約１ヶ月間のマウスの生存率を調べた。１ヶ月間放射線照射マウスが生存した場合は骨髄死を免れたと考えることができる。
（１）方法
動物；６週齢雄Ｃｒｊ（チャールスリバー社製）：Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスを使用
（２）ケフィア上清の調製
ケフィア原液を１０，０００×ｇで３時間遠心分離した上清を用いた。
ケフィア上清：１０倍希釈液（×１０）
飲料水として投与（２日ごとに交換）
コントロール（蒸留水）
実験群；
コントロール区 １０匹
８Ｇｙ（グレイ）Ｃｏγ照射線照射区 １０匹
（２）実験方法
ケフィアを１週間前より投与し、コバルトγ線照射後２８日間の生存率を観察する。
観察；朝、昼、夜の一日３回観察
いつ何匹死んだか確認する。もし新鮮な死亡例は剖検し、病理検索を行う。
２８日後に屠殺、解剖時に組織重量、病理検索。
【００４９】
（３）結果
図１５に示すようにコントロール群ではすべてのマウスが２３日後には死んだが、ケフィア１０倍希釈液投与群では３匹が生存し、体重も増加してきて２８日後にも生き残った。
（４）考察
このことから、８Ｇｙの照射線による骨髄死をケフィア投与区の３匹のマウスが免れ、放射線による消化管死だけでなく、骨髄死をもケフィアが防御できることが示唆された。
【００５０】
第２の発明において、上記実施例では、ケフィアは日本ケフィア株式会社供与のケフィア（ケフィア原液）を使用したが、日本で製造、販売されたケフィア菌を使用したケフィアでも、ロシア以外のその他国由来のものでも、あるいはケフィア粒を求めて自分で培養したものを使用しても良い。あるいは濃縮物又は乾燥物を原料として用いることも可能である。本実施例は放射線障害防護剤としての作用について実験したが、放射線障害防護食品についても上記の実施例は適用される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ケフィア上清（ｐＨ４．０、クロロホルム／メタノール抽出物）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図２】ケフィア上清（ｐＨ４．０、ｐＨ７．０、加熱処理）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図３】ケフィア上清（ｐＨ７．０、透析処理）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図４】ケフィア上清（ｐＨ７．０）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図５】ケフィア上清（ｐＨ４．０、ｐＨ７．０）の未分化Ｌ６細胞に対する細胞内酸化還元状態に与える効果を蛍光試薬ＤＣＦＨ−ＤＡを用いて測定した結果を示すグラフである。
【図６】ケフィア上清（ｐＨ７．０）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図７】ケフィア上清（ｐＨ７．０）のＢＩＯ−ＲＡＤＰ２カラムでゲル濾過を行った結果を示すグラフである。
【図８】ケフィア上清（ｐＨ７．０）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図９】ケフィア上清（ｐＨ７．０）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】ケフィア抽出物の未分化Ｌ６細胞に対する細胞増殖に与える効果を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】空腸での放射線照射による細胞のアポトーシスに対するケフィアの効果を示すグラフである。
【図１２】胸腺での放射線照射による細胞のアポトーシスに対するケフィアの効果を示すグラフである。
【図１３】脾臓での放射線照射による細胞のアポトーシスに対するケフィアの効果を示すグラフである。
【図１４】結腸での放射線照射による細胞のアポトーシスに対するケフィアの効果を示すグラフである。
【図１５】ケフィア投与による２８日間生存数（骨髄死）に対する効果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康食品であるケフィアによる血糖値降下作用あるいは放射線障害防護作用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ケフィアはグルジア共和国コーカサス地方の人々が愛飲している発酵乳で、ウシやヤギ、ヒツジの乳をヤギの革袋に入れて保存していたものに偶然、乳酸菌、酵母が混入して乳酸及びアルコール発酵して生じたものである。コーカサス型発酵乳ケフィアは独立国家共同体のロシア共和国科学アカデミー微生物中央研究所が長年の歳月をかけ、製造方法を研究して得た安定なケフィア粒を菌種としたものである。消化機能を亢進させ、腎臓病、循環器疾患など、様々な疾患の治療食として医療機関で用いられている。ケフィア粒は１〜３ｃｍ前後のスポンジ状の固まりで約２０種類の乳酸菌の他、酵母菌、酢酸菌を有し、日本においては一般にヨーグルトきのこと呼ばれている。ケフィア粒に牛乳を入れ、所定時間常温で密閉することによりケフィア粒混入のケフィア（ケフィアヨーグルトと呼ばれる）が得られ、これをざるで濾してケフィア粒を取り除くことにより簡単にケフィアを得ることができ、健康食品として一般家庭でも愛用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
一方、日本においては近年、欧米型の食生活から、インスリン非依存性のＩＩ型糖尿病が増加の一途をたどり、多くの日本人を苦しめている。このＩＩ型糖尿病においては、健康維持の中核の生理作用である細胞のグルコース取り込みが行なえないことで、生態の恒常性維持が行えず、結果として様々な合併症を併発し深刻な症状を呈することが珍しくない。また、現代の原子力発電所の事故等による放射線障害、さらには放射線障害を抱えた多くの人への有効な薬剤の開発はまだ十分とはいえない。
本発明は日本人の糖尿病の９割を占めるＩＩ型糖尿病の治療において中核となる細胞のグルコース取り込みを増強することが可能な薬剤又は食品及びその製造方法を提供することを第１の目的とする。さらに、数多くの有益な生体防御機能が考えられるケフィアの放射線障害への利用を第２の目的としたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、分子量が１０００以下のケフィア抽出物を用いることにより、活性酸素低減により細胞の酸化ストレスを緩和すること、グルコース取り込みを制御するＰＩ３キナーゼの活性を促進すること、細胞のグルコース取り込みを増強させることに成功し、糖尿病、主としてＩＩ型糖尿病治療に使用する薬剤又は食品としての第１の発明を完成させた。
【０００５】
第１の発明に係る糖尿病治療に使用するケフィア抽出物は、水溶性を有し、酸性、あるいは中性で安定で、かつ高圧蒸気滅菌にも安定である。ここで、酸性あるいは中性で安定とは、ケフィア上清にアルカリ性溶液を加えて中性となったものが活性を有することをいう。
ケフィアを有効成分として用いた糖尿病治療剤の製造方法はケフィア（ケフィア原液）から、遠心分離、デカンテーション又は濾過等の公知の方法にて残渣を分離して、その上澄液（上清という）をゲル濾過、透析等の公知の方法によって得た分子量１０００以下のケフィア抽出液（抽出物の一例）を用いることを特徴とする。
【０００６】
第２の発明におけるケフィアを有効成分として含む放射線障害防護剤は、第１の発明である活性酸素の低減作用による酸化ストレスの低減作用の他数多くの有益な生体防御機能の考えられるケフィアの放射線障害への適用を目的として、本発明者等が鋭意研究した結果、ケフィアに放射線照射により動物に生じる放射線高感受性臓器（骨髄、脾臓、胸腺、小腸、大腸）のアポトーシス死に対して防護作用があることを発見し本発明を完成させた。
ここで、放射線障害防護剤の防護作用は、電離性放射線の生物学的効果を軽減し、放射線障害をやわらげることであり、放射線の化学間接作用によるラジカル形成にひき続いて起こる化学的変量を減少させる効果があると考えられている。そのため、防護剤は、照射を受ける前にあらかじめ投与しておく必要がある。
【０００７】
アポトーシスとは生理的な細胞死の過程又は形態であって、事故的な細胞死のネクローシス（壊死）とは区別され、放射線照射による細胞死には多くの場合アポトーシスが見られる。従って、放射線障害防護剤の作用も放射線照射により動物に生じる生体細胞のアポトーシス死に対する有効性を調べる事によって知りえる。放射線障害は一般に温度などの物質要因、酸素分圧・水分含量などの化学的要因、及び生物種・細胞の種類・遺伝子構成・細胞分裂周期・年齢・生理条件など多くの生物的要因によって変化するが、細胞分裂の盛んな器官ほど放射線に高感受性があり、骨髄、脾臓、胸腺、小腸、大腸等の放射線高感受性臓器のアポトーシスを見る事により放射線障害防護剤の効果を調べる。使用する放射線の単位は吸収線量のグレイ（Ｇｙ）が用いられる。
【０００８】
分子量が１０００以下のケフィア抽出物を有効成分として含むことを特徴とするケフィアを用いた健康食品は成分中にケフィア抽出物を含むので、抗糖尿病作用、放射線障害防護作用を有し、抗糖尿病食品、放射線障害防護食品として使用できる。
【発明の効果】
【０００９】
実施例に示すように、分子量が１０００以下のケフィア抽出物がグルコース取り込み細胞の活性酸素を低減させ、細胞の酸化ストレスを緩和させ、グルコース取り込みを制御するＰＩ３キナーゼの活性を促進させ、細胞のグルコース取り込みを増強させることにより、生体の恒常性維持をはかり、糖尿病、主としてＩＩ型糖尿病治療に有効であることが判明した。
また、ケフィアを用いた糖尿病治療剤において、ケフィアの抽出液（ケフィア抽出物）が水溶性を有し、酸性、あるいは中性で安定、高圧蒸気滅菌にも安定であることが分かった。
そして、ケフィアから、遠心分離、デカンテーション又は濾過等の公知の方法にて残渣を分離して、その上澄液をゲル濾過、透析等の公知の方法によって分子量１０００以下のケフィア抽出液を得ることによって、糖尿病治療剤が製造できることが分かった。
【００１０】
さらに、実施例により、ケフィアは放射線照射により動物に生じる放射線高感受性臓器（骨髄、脾臓、胸腺、小腸、大腸）のアポトーシス死に対して防護作用があることが判明した。特に、小腸の絨毛腺を再生していく再生腺管の放射線による照射死、胸腺、脾臓、結腸において細胞のアポトーシス、さらに消化管死だけでなく、骨髄死をもケフィアが防御できることが示唆された。
胸腺は免疫系に重要な働きをしているＴ細胞が作られる臓器であり、脾臓はリンパ球の増殖と機能発現に重要な働きをしている臓器である。したがって、ケフィアが放射線障害によっておきる免疫力の低下を防ぎ、放射線によって引き起こされる様々な急性及び慢性の疫病を防御できることが示唆された。
分子量が１０００以下のケフィア抽出物を有効成分として含むことを特徴とするケフィアを用いた健康食品は成分中にケフィア抽出物を含むので、抗糖尿病食品あるいは放射線障害防護食品として使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ケフィアはケフィアヨーグルトからケフィア粒を除いた上澄（培養液）であり、その成分の多くは水分で、水に溶けた蛋白質、糖、アルコールと脂溶性の脂質等がコロイド状に存在している。ここで使用するケフィアは日本ケフィア株式会社より供与されたもの（ケフィア原液という）を使用した。菌種はロシア共和国のライセンスイントルグ社からの菌種を適当な条件下で保管し、必要に応じて活性化するために継代培養を行い、ケフィア粒を十分活性化したものを使用した。培養は必要に応じて乳固形分は４〜１８％、耐熱安定剤としてペクチンを使用し、固形分調製後に殺菌・冷却して３０〜２５℃になれば、上記マザースターター（活性化した種菌）を３〜５％添加し、発酵タンク中で適当な温度・時間で培養して乳酸濃度を終点で決めて培養したものを使用した。実験の方法によって、ケフィア（ケフィア原液）は培養した液状のものを殺菌・瓶詰保存して使うか、凍結乾燥して粉砕して包装保存したものを使用した。
【００１２】
グルコース取り込み測定に用いる細胞は生体の中でもインスリン刺激に応答してグルコース取り込みを行なう機能を有する筋肉組織様に分化させたＬ６筋管細胞として使用した。分化処理としては細胞がシャーレの中で一杯に増殖したコンフルエント状態のＬ６細胞に２％の低血清処理で１週間処理することで行なった。
【００１３】
細胞のグルコース取り込みはケフィア抽出物の処理を終了した細胞にトリチウム標識した２−デオキシグルコースを取り込ませ、細胞を溶解した後シンチレーションカウンターによるカウント値を測定することにより行なった。
【００１４】
ケフィア上清は以下の方法で調製したものを用いた。ケフィア原液を４℃にて５，０００×ｇで１時間遠心処理して上清を集め、さらに１０，０００×ｇで２０分間遠心処理した上清を集めケフィア上清１（ｐＨ４．０／ケフィア水抽出物）を得た。このケフィア上清はこの段階ではｐＨ４．０程度である。
【００１５】
ケフィア原液（培養上澄ともいう）を凍結乾燥した粉末を１０倍容のクロロホルム／メタノール（２：１）混液に懸濁後、４℃にて２４時間攪拌後、５，０００×ｇで１時間遠心処理すると、クロロホルムに溶けない糖、蛋白質等の水溶性物質は下に沈殿する。ここで、上清（ケフィアクロロホルム／メタノール抽出物）を集め、減圧濃縮機にてクロロホルム、メタノールを除去し、得られた残渣をエタノールに溶かし、ケフィア上清２（ケフィアクロロホルム／メタノール抽出物）を得た。
【００１６】
前記ケフィア上清１（ｐＨ４．０）にオートクレーブ処理（高圧蒸気滅菌処理）を１２０℃、２０分した。処理により沈殿が生じるので１０，０００×ｇで２０分間遠心処理して上清を集めケフィア上清３（加熱処理）を得た。前記ケフィア上清１（ｐＨ４．０）を水酸化ナトリウム水溶液を用い、ｐＨ７．０になるように中和した。中和により沈殿が生じるので１０，０００×ｇで２０分間遠心処理して上清を集めケフィア上清４（ｐＨ７．０）を得た。
【００１７】
前記ケフィア上清４（ｐＨ７．０）を排除限界分子量１，０００の透析膜を用い、水に対して透析を行った。透析により沈殿が生じるので１０，０００×ｇで２０分間遠心処理して上清を集めケフィア上清５（透析処理）を得た。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例により説明する。が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】
（実施例１）
筋管細胞に分化させたラット由来Ｌ６細胞を用い、Ｌ６細胞培養液の１／４容量のケフィア上清１（ｐＨ４．０）、ケフィア上清２（ケフィアクロロホルム／メタノール抽出物）を加え、４時間処理（無菌状態、３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気下）後、ケフィア抽出物のグルコースの取り込みに対する影響を調べた。Ｌ６細胞のグルコース取り込みはトリチウム標識した２−デオキシグルコースを細胞に取り込ませ測定した。
【００２０】
その結果を図１に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図１から明らかなように、ケフィア上清１（ｐＨ４．０）において、Ｌ６細胞のグルコース取り込み能が増強されていた。この増強効果はインスリン刺激の有無に関わらず認められた。一方でケフィア上清２（ケフィアクロロホルム／メタノール抽出物）においてはむしろ取り込み能が抑制されていた。このことから、ケフィア活性成分は脂溶性ではなく、水溶性であることがわかる。
【００２１】
（実施例２）
実施例１と同様、筋管細胞に分化させたラット由来Ｌ６細胞に、Ｌ６細胞培養液の１／４容量のケフィア上清１（ｐＨ４．０）、ケフィア上清３（加熱処理）、ケフィア上清４（ｐＨ７．０）を加え、４時間処理（無菌状態、３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気下）で、ケフィア抽出物のグルコースの取り込みに対する影響を調べた。
【００２２】
その結果を図２に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図２から明らかなように、ケフィア上清のグルコース取り込み増強活性は１２０℃、２０分間の加熱処理やｐＨ７．０への中和処理、両者においても保持されていた。これらのことからグルコース取り込み増強活性は、酸性（ｐＨ４．０）、中性（ｐＨ７．０）、そして１２０℃、２０分間のオートクレーブ処理において安定であることが明らかとなった。
【００２３】
（実施例３）
実施例１と同様の条件で、ケフィア上清４（ｐＨ７．０）、ケフィア上清５（透析処理）を加え、ケフィア抽出物のグルコースの取り込みに対する影響を調べた。
【００２４】
その結果を図３に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図３から明らかなように、ケフィア上清のグルコース取り込み増強活性は透析処理により消失した。このことからグルコース取り込み増強活性は、排除限界分子量１，０００の透析膜を通過するサイズであると考えられた。
【００２５】
（実施例４）
実施例１と同様の条件で、ケフィア上清４（ｐＨ７．０）を加え、ただし、処理時間を７２時間まで変化させて、ケフィア抽出物のグルコース取り込み増強活性を調べた。
【００２６】
その結果を図４に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図４から明らかなように、ケフィア上清のグルコース取り込み増強活性は４８時間まで直線的に上昇し、以降はプラート（平面）に達していた。
このことからグルコース取り込み増強活性は、４８時間まで時間依存的に増強活性が上昇し、その後安定して効果が持続することが明らかとなった。
【００２７】
（実施例５）
未分化状態のＬ６細胞にケフィア上清１（ｐＨ４．０）、ケフィア上清４（ｐＨ７．０）を加え、ケフィア抽出物の細胞内酸化還元状態を還元状態に誘導する活性を調べた。
すなわち、３５ｍｍ培養皿にてセミコンフルエント状態（細胞がシャーレに半分程度まで増殖）のＬ６細胞に５分から３０分間ケフィア抽出物を添加し、処理後ＨＢＳＳ（ハンクス緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄後、５μＭの蛍光試薬ＤＣＦＨ−ＤＡ（ジクロロフルオレセインジアセテート）を含むＨＢＳＳで５分間処理し、ＨＢＳＳで２回洗浄後、レーザー生物顕微鏡で細胞中のＤＣＦ（ジクロロフルオレセイン）の蛍光強度を測定し数値化し細胞の酸化還元状態の指標とした。
【００２８】
その結果を図５に示す。縦軸は細胞内過酸化水素と反応し蛍光を発しているＤＣＦの蛍光強度をコントロール（ケフィア抽出物未処理）を１とした相対値で示したもの。横軸は処理時間を示す。グラフの白抜きはケフィア上清１（ｐＨ４．０）を、黒はケフィア上清４（ｐＨ７．０）の結果である。
図５から明らかなように、ｐＨの状態に関わらず、ケフィア上清１（ｐＨ４．０）、ケフィア上清４（ｐＨ７．０）を処理した細胞中のＤＣＦの蛍光強度は急速に下降しており、ケフィア抽出物は細胞内酸化還元状態を素早く還元状態へ移行させる活性があることが明らかとなった。
この現象は細胞内活性酸素減少によるものと考えられ、一方で細胞のグルコース取り込み能が活性酸素による酸化ストレスにより阻害されることから、ケフィア上清のグルコース取り込み増強活性の作用にこの活性酸素減少が関与していることが考えられる。
【００２９】
（実施例６）
実施例１と同様の条件で、あらかじめ細胞にＰＩ３キナーゼ阻害剤であるワートマニンを処理しＰＩ３キナーゼを抑制した細胞に、ケフィア上清４（ｐＨ７．０）を加え、ケフィア抽出物のグルコース取り込み増強活性を調べた。
【００３０】
その結果を図６に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図６から明らかなように、ワートマニンの濃度依存的にケフィア抽出物のグルコース取り込み増強活性が抑制された。
この結果から、ケフィア抽出物は細胞のグルコース取り込みを制御するＰＩ３キナーゼを中心としたインスリンシグナル伝達経路のＰＩ３キナーゼを含めた上流側を活性化し、細胞のグルコース取り込み増強活性を増強していると考えられた。
【００３１】
（実施例７）
ケフィア上清４（ｐＨ７．０）５０ｍｌをＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＰ２ゲルろ過カラム（ベッド８００ｍｌ、流速２４０ｍｌ／時）に供し、素通り画分（分子量１，８００以上）を含めた６画分（ケフィアＰ２画分という）を分取した。結果を図７に示す。縦軸は吸光度を、横軸は溶出時間を示したもの。グラフの実線は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、蛋白質成分で吸光度が大となる。図７より、画分４、５には、活性の邪魔になる蛋白質が多く含まれ、画分３は蛋白質含有量が少ない事がわかる。
【００３２】
実施例１と同様の条件で、調製したケフィアＰ２画分を加え、ケフィア抽出物のグルコースの取り込みに対する影響を調べた。
その結果を図８に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図８から明らかなように、ケフィアＰ２画分３にグルコース取り込み増強活性が最も高く保持されていた。
【００３３】
（実施例８）
先に調製したケフィアＰ２画分３の１０ｍｌをＴＯＨＳＯ株式会社製のＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ陰イオン交換カラム（ベッド１０ｍｌ）に供し、素通りした画分を分取した（ＤＥＡＥカラム素通り画分）。ケフィアＰ２画分３中の陰イオンは陰イオン交換カラムに吸着されるため、素通りした画分にはケフィアＰ２画分３中の陽イオン又は非荷電物質が含まれる。
次にケフィアＰ２画分３の陰イオンを吸着した陰イオン交換カラムをリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出した画分を分取した（ＤＥＡＥカラム１５０ｍＭＮａＣｌ溶出画分）。ここで、陰イオン交換カラムに吸着した陰イオンはＮａＣｌの塩素イオンと置換して、ＤＥＡＥカラム１５０ｍＭＮａＣｌ溶出画分には陰イオンが含まれる。
【００３４】
実施例１と同様の条件で、ＤＥＡＥカラム素通り画分、ＤＥＡＥカラム１５０ｍＭＮａＣｌ溶出画分について、ケフィア抽出物のグルコースの取り込みに対する影響を調べた。
その結果を図９に示す。縦軸は、２−デオキシグルコース取り込み量をコントロール（インスリン刺激無）を１とした相対値で示したもの。グラフの白抜きはインスリン刺激無を、黒はインスリン刺激有の結果である。
図９から明らかなように、ＤＥＡＥカラム１５０ｍＭＮａＣｌ溶出画分にグルコース取り込み増強活性が保持されていた。
従って、ケフィアＰ２画分３中の陰イオンを含むＤＥＡＥカラムＮａＣｌ溶出画分にグルコース取り込み増強作用物質が含まれることが分かる。従って、ケフィアＰ２画分３中の陰イオン性物質にグルコース取り込み増強作用があることが分かる。
【００３５】
（実施例９／参考試験）
未分化Ｌ６細胞を培養した場合のケフィア上清（ケフィア抽出物）処理の細胞増殖に対する影響を調べた。培養液としては上記のＬ６細胞を培養した培養液を用いた。処理前日に細胞を播取し、Ｌ６細胞培養液の１／４容量の上清１或いは上清４を添加し、４時間処理した後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後通常の培養培地に交換し、細胞数を測定した。
【００３６】
結果を図１０に示す。縦軸は細胞数を、横軸は培養時間を示す。グラフの白抜きはコントロールを、黒はケフィア抽出物の結果である。
図１０に示すように、ケフィア抽出物を４時間処理しても細胞増殖には影響を与えなかった。
従って、ケフィア抽出物のグルコース取り込み増強作用はグルコース取り込み細胞の増殖作用では無いことがわかる。
【００３７】
以上により、ケフィア抽出物に含まれる活性を有する物質は水溶性、アルカリ処理に安定、１２０℃で２０分間の高圧蒸気滅菌処理、凍結処理、酸処理により安定であるが、クロロホルム／メタノールにより抽出されないこと、排除限界分子量１，０００の透析膜を用いた透析により失われる性質を有することがわかる。
さらに、ケフィア抽出物の細胞のグルコース取り込み増強作用は細胞の活性酸素量を低下させ、細胞の酸化ストレスを緩和させ、ＰＩ３キナーゼの活性を促進することによるものであることがわかる。
また、ケフィア抽出物の細胞のグルコース取り込み増強作用は、インスリン刺激の有無に関わらず、細胞培養に４時間の期間で加えることで、グルコース取り込みが上昇、さらに７２時間の長時間処理でさらに増強されることがわかる。
【００３８】
上記の結果より、ケフィア抽出物はケフィア（ケフィア原液）を遠心分離、デカンテーション（傾けて上澄みをとる）、濾過などの公知の方法にて残渣を分離し、上澄液（上清）をｐＨが中性となるまで水酸化ナトリウムにより中和する。中和によって出現した沈殿を再び、遠心分離、デカンテーション、濾過など公知の方法にて分離して得られた上澄液（上清）をゲル濾過に供し、分子量１，０００以下の画分のケフィア抽出液を得ることによって活性効果の強い糖尿病治療剤が製造できる。
【００３９】
上記、実施例ではケフィア抽出物を製造するのに日本ケフィア株式会社より供与されたケフィアをそのまま用いたが、ロシア以外のその他国由来のものでも、日本で製造、販売されたケフィアを使用しても良く、あるいはケフィア粒を求めて自分で培養したものを使用しても良い。
また、本実施例ではケフィアは培養した液状のものを殺菌・瓶詰保存して使うか、凍結乾燥して粉砕して包装保存したものを使用したが、濃縮物、あるいは乾燥物をあるいはその他の形状のものでもケフィアであれば何れの形状のものも原料として用いることが可能である。なお、濃縮又は乾燥には、例えば、凍結濃縮、凍結乾燥、減圧濃縮、減圧乾燥、泡沫乾燥などの公知の方法が用いられる。
【００４０】
上記実施例は糖尿病治療剤としての作用について実験したが、分子量１，０００以下のケフィア抽出物を含む健康食品についても上記実施例から抗糖尿病作用を有し、抗糖尿病食品なることがわかる。
また、分子量１，０００以下のケフィア抽出物を用いた健康食品は、美味しくするため、栄養価を上げる、更なる効果を期待するために更に他の栄養素、物質を加える事も可能である。
【００４１】
次に、第２の発明であるケフィア抽出物の放射線障害防御作用について以下に説明する。ケフィアが生体内で放射線誘発アポトーシスを抑制する効果があるかどうかを調べるため、高感受性臓器である小腸（空腸）、大腸（結腸）、脾臓、胸腺、骨髄のエックス線照射によるアポトーシスの発現を定量した。すなわち、ラットにケフィア投与後、ラットの各臓器での低線量照射後短時間のアポトーシスの出現、ＬＤ５０値の変化を調べることによりケフィアの生体内での放射線障害予防効果について実験した。放射線の消化管に対する障害は放射線照射後、直ぐに現れるためエックス線照射、２時間後のラットの臓器について観察した。骨髄に対する作用は凡そ３０日経過後で現れ約３０日以後も生存した場合には骨髄死は現れないのが通常のため、約３０日経過後の生存数を調べる事で調査した。
【００４２】
以下に実施例を示す。
ケフィアは日本ケフィア株式会社供与のケフィア（ケフィア原液）を使用し、遠心分離して上清液を調製しラットに投与した。
【００４３】
（実施例１０）
雄性ウィスターラット、７週齢を用いて、以下に調製したケフィア上清を用いて実験を行った。
（１）ケフィア上清の調製
ケフィア原液（ケフィア培養液）を１０，０００×ｇで２時間遠心分離後、上清を回収し、濾紙の上にセライトを入れた濾過装置に加え、吸引濾過し、その上清を０．２２μｍのフィルター装置にセットし、濾過滅菌してケフィア上清とした。
（２）ラットへの投与
調製した上清を２倍希釈し、飲水ボトルに入れ１４日間自由飲水させた。ケフィア投与群、対照群は各線量あたり、３〜５匹ずつを一群とした。
（３）エックス線照射
東芝ＥＸＳ−３００を用いて、ラットにエックス線全身照射を行った。
（２００ＫＶ、１５ｍＡの条件、０．５ｍｍＣｕ＋０．５ｍｍアルミニウムフィルター、線量率０．４４３Ｇｙ／ｍｉｎ）を用いた。
ケフィア投与群と対照群に０．２５Ｇｙ、０．５Ｇｙ、１Ｇｙの照射を行なった。
（４）照射とアポトーシスのカウント
Ｘ線照射２時間後、麻酔下で屠殺したラットから空腸、結腸、脾臓、胸腺を摘出し、ホルマリン固定した。空腸、結腸は長軸方向に切り出し、脾臓、胸腺共にパラフィン包埋し、３μｍの切片に薄切した。Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンアンドエオシン）染色を行い、細胞が凝縮、断片化したアポトーシス細胞をカウントした。空腸、結腸は４００倍の顕微鏡下で１クリプトあたりのアポトーシスをカウントし、その平均値をアポトーシスインデックスとした。１ラット当たり５０以上のクリプトをカウントした。脾臓、胸腺は、脾臓の白脾隋領域と胸腺の皮質領域を１０００倍の倍率で、１視野の総リンパ球数あたりのアポトーシス数をカウントし、アポトーシスの割合（％）をアポトーシスインデックスとした。
（５）統計学的処理
実験結果は平均値±標準偏差で表し、有意差検定はＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ─ｔｅｓｔを用いた。
【００４４】
（６）結果
図１１に示すように、空腸では０．２５Ｇｙ、０．５Ｇｙ、１Ｇｙのいずれの線量でもクリプトあたりのアポトーシス数は対照群、ケフィア群に有為な差は認められなかった。
図１２、図１３、図１４に示すように、胸腺、脾臓、結腸ではリンパ数に対するアポトーシスインデックスの割合が１Ｇｙで有意に抑制された。
また、低線量（０．２５及び０．５Ｇｙ）では、胸腺及び脾臓細胞の放射線障害によるアポトーシスが有意に制御できることが明らかとなった。
従って、ケフィア投与ラットの胸腺、脾臓、結腸において、１Ｇｙ以下のエックス全身照射後アポトーシス数が有為に抑制されることがわかった。１Ｇｙ以下の線量ではケフィアは胸腺、脾臓、結腸において細胞の放射線障害を何らかの方法で抑制していると考えられる。
（７）考察
胸腺は免疫系に重要な働きをしているＴ細胞が作られる臓器であり、脾臓はリンパ球の増殖と機能発現に重要な働きをしている臓器である。したがって、ケフィアが放射線障害によって生じる免疫力の低下を防ぎ、放射線によって引き起こされる様々な急性及び慢性の疫病を防御できることが示唆された。
【００４５】
（実施例１１）
次にケフイアの放射線防御効果として放射線の高感受性臓器である小腸消化管死の防御について実験した。
その目的は急性放射線障害において、骨髄死は骨髄移植により効果的に防ぐことができるが、消化管死を防ぐ有効な手法は少ない。そこで、ケフィアをマウスに投与し、小腸の放射線による腺管死をケフィアが防御できるかどうか調べた。
（１）方法
動物；６週齢雄Ｃｒｊ（チャールスリバー社製）：Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスを使用
原液を２倍希釈後（×２）、４倍希釈液（×４）、１０倍希釈液（×１０）を各々飲み水としてＸ線照射前１週間目より実験終了まで投与。
対照群としては蒸留水を用いた。２〜３日に一度交換、摂水量を測定。
餌；オリエンタル酵母（株）社製ＭＦ餌（摂取量を測定）
Ｘ線照射；フィルター無し／４５０ｃＧｙ（センチグレイ）／１分の線量率で全身照射
照射量；０、７、８、９、１０、１２Ｇｙ
マウス頭数；各照射群５匹。照射時には各群の動物を２匹ずつ入れ照射する。
屠殺；照射後３日目に頸椎脱臼により屠殺。体重測定後、小腸を取り出し内容物を洗浄し、カルノア液で固定。Ｈ＆Ｅ染色を行い小腸の再生腺管（クリプト）数を測定する。
【００４６】
【表１】
【００４７】
（３）結果
結果を表１に示す。
表１に示すように８グレイでの２倍希釈液投与群から９グレイ以上のすべての群でコントロールに比べて小腸再生腺管数がケフィア投与群で統計的に有意の差で増加しており、ケフィアに放射線障害（小腸腺管死）を防ぐ効果があることが判明した。
表１で、ＭＦは対照群を示す。Ｐは統計上の有意の差があるを０．０５で示し、このＰが小さい程有意の差が大である事を示す。つまり、Ｐが０．０１以下とは有意の差が非常に大きい事を示す。
（４）考察
小腸腺管細胞は活発に分裂し、絨毛を形成するが、放射線により腺管が死滅すると、小腸は絨毛のない状態になり食物中の栄養成分の吸収ができなくなり、出血し生体は死滅する。このような放射線による消化管死を有効に防御できる薬剤もしくは食品はこれまでほとんど知られておらず、放射線障害を防御するケフィアの存在は大である。
【００４８】
（実施例１２）
ここまで、放射線によるマウス小腸腺管死をケフィアが抑制する効果があることを明らかにした。
次にケフィアの放射線防御効果として放射線による骨髄死の防御について実験した。ここでは、骨髄死を抑制できるかどうかを見るために、放射線照射後約１ヶ月間のマウスの生存率を調べた。１ヶ月間放射線照射マウスが生存した場合は骨髄死を免れたと考えることができる。
（１）方法
動物；６週齢雄Ｃｒｊ（チャールスリバー社製）：Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスを使用
（２）ケフィア上清の調製
ケフィア原液を１０，０００×ｇで３時間遠心分離した上清を用いた。
ケフィア上清：１０倍希釈液（×１０）
飲料水として投与（２日ごとに交換）
コントロール（蒸留水）
実験群；
コントロール区 １０匹
８Ｇｙ（グレイ）Ｃｏγ照射線照射区 １０匹
（２）実験方法
ケフィアを１週間前より投与し、コバルトγ線照射後２８日間の生存率を観察する。
観察；朝、昼、夜の一日３回観察
いつ何匹死んだか確認する。もし新鮮な死亡例は剖検し、病理検索を行う。
２８日後に屠殺、解剖時に組織重量、病理検索。
【００４９】
（３）結果
図１５に示すようにコントロール群ではすべてのマウスが２３日後には死んだが、ケフィア１０倍希釈液投与群では３匹が生存し、体重も増加してきて２８日後にも生き残った。
（４）考察
このことから、８Ｇｙの照射線による骨髄死をケフィア投与区の３匹のマウスが免れ、放射線による消化管死だけでなく、骨髄死をもケフィアが防御できることが示唆された。
【００５０】
第２の発明において、上記実施例では、ケフィアは日本ケフィア株式会社供与のケフィア（ケフィア原液）を使用したが、日本で製造、販売されたケフィア菌を使用したケフィアでも、ロシア以外のその他国由来のものでも、あるいはケフィア粒を求めて自分で培養したものを使用しても良い。あるいは濃縮物又は乾燥物を原料として用いることも可能である。本実施例は放射線障害防護剤としての作用について実験したが、放射線障害防護食品についても上記の実施例は適用される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ケフィア上清（ｐＨ４．０、クロロホルム／メタノール抽出物）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図２】ケフィア上清（ｐＨ４．０、ｐＨ７．０、加熱処理）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図３】ケフィア上清（ｐＨ７．０、透析処理）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図４】ケフィア上清（ｐＨ７．０）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図５】ケフィア上清（ｐＨ４．０、ｐＨ７．０）の未分化Ｌ６細胞に対する細胞内酸化還元状態に与える効果を蛍光試薬ＤＣＦＨ−ＤＡを用いて測定した結果を示すグラフである。
【図６】ケフィア上清（ｐＨ７．０）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図７】ケフィア上清（ｐＨ７．０）のＢＩＯ−ＲＡＤＰ２カラムでゲル濾過を行った結果を示すグラフである。
【図８】ケフィア上清（ｐＨ７．０）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図９】ケフィア上清（ｐＨ７．０）のＬ６筋管細胞に対するグルコース取り込み増強活性を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】ケフィア抽出物の未分化Ｌ６細胞に対する細胞増殖に与える効果を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】空腸での放射線照射による細胞のアポトーシスに対するケフィアの効果を示すグラフである。
【図１２】胸腺での放射線照射による細胞のアポトーシスに対するケフィアの効果を示すグラフである。
【図１３】脾臓での放射線照射による細胞のアポトーシスに対するケフィアの効果を示すグラフである。
【図１４】結腸での放射線照射による細胞のアポトーシスに対するケフィアの効果を示すグラフである。
【図１５】ケフィア投与による２８日間生存数（骨髄死）に対する効果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量が１０００以下のケフィア抽出物を用いたことを特徴とするケフィアを用いた糖尿病治療剤。
【請求項２】
請求項１記載のケフィアを用いた糖尿病治療剤において、前記ケフィア抽出物が活性酸素の低減作用を有することを特徴とするケフィアを用いた糖尿病治療剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のケフィアを用いた糖尿病治療剤において、前記ケフィア抽出物は、ＰＩ３キナーゼ活性化作用を有することを特徴とするケフィアを用いた糖尿病治療剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のケフィアを用いた糖尿病治療剤において、前記ケフィア抽出物は、水溶性を有し、酸性あるいは中性で安定で、かつ高圧蒸気滅菌にも安定であることを特徴とするケフィアを用いた糖尿病治療剤。
【請求項５】
ケフィアを用いた放射線障害防護剤。
【請求項６】
分子量が１０００以下のケフィア抽出物を用いたことを特徴とするケフィアを用いた健康食品。
【請求項１】
分子量が１０００以下のケフィア抽出物を用いたことを特徴とするケフィアを用いた糖尿病治療剤。
【請求項２】
請求項１記載のケフィアを用いた糖尿病治療剤において、前記ケフィア抽出物が活性酸素の低減作用を有することを特徴とするケフィアを用いた糖尿病治療剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のケフィアを用いた糖尿病治療剤において、前記ケフィア抽出物は、ＰＩ３キナーゼ活性化作用を有することを特徴とするケフィアを用いた糖尿病治療剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のケフィアを用いた糖尿病治療剤において、前記ケフィア抽出物は、水溶性を有し、酸性あるいは中性で安定で、かつ高圧蒸気滅菌にも安定であることを特徴とするケフィアを用いた糖尿病治療剤。
【請求項５】
ケフィアを用いた放射線障害防護剤。
【請求項６】
分子量が１０００以下のケフィア抽出物を用いたことを特徴とするケフィアを用いた健康食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００６−２０６６０６（Ｐ２００６−２０６６０６Ａ）
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１０６５６８（Ｐ２００６−１０６５６８）
【出願日】平成１８年４月７日（２００６．４．７）
【分割の表示】特願２０００−３００６１０（Ｐ２０００−３００６１０）の分割
【原出願日】平成１２年９月２９日（２０００．９．２９）
【出願人】（５９８１７０３３８）日本ケフィア株式会社 (7)
【出願人】（５００４５７４４９）
【出願人】（５９１１６４１７４）
【出願人】（５００４５７４５０）
【出願人】（５００４５７３９１）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月７日（２００６．４．７）
【分割の表示】特願２０００−３００６１０（Ｐ２０００−３００６１０）の分割
【原出願日】平成１２年９月２９日（２０００．９．２９）
【出願人】（５９８１７０３３８）日本ケフィア株式会社 (7)
【出願人】（５００４５７４４９）
【出願人】（５９１１６４１７４）
【出願人】（５００４５７４５０）
【出願人】（５００４５７３９１）
【Ｆターム（参考）】
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