ケラチノサイト機能を調節するための方法および組成物
本開示は、一般に、ケラチノサイトの機能を調節するための方法および組成物に関し、より詳細には、ケラチノサイトの増殖および分化を正常化するための組成物および方法、ケラチノサイト中のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のレベルを調節するための組成物および方法、ならびにケラチノサイトの増殖を調節することにより皮膚の状態を治療するための組成物および方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、ケラチノサイト機能を調節するための方法および組成物に関し、より詳細には、ケラチノサイトの増殖および分化を正常化するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、身体の最も大きな器官であり、表皮と真皮から成る。皮膚の最も重要な機能は、不可欠な物理的および水透過性バリアを提供することである。表皮は、分化して機械的および水透過性バリアを生じさせ、従って、陸上生活を可能にする継続再生組織である。このバリアは、異なる表皮層を結果として生じさせる精密に調整されたケラチノサイト分化プログラムにより表皮内で樹立される。表皮の構造は、ケラチノサイトの微調整された増殖−分化間バランスによって維持され、その結果として、基底層、有棘層、顆粒層および角化層から成る多層構造が生じる。
【０００３】
基底膜と接触している最も内側の基底層は、増殖能を有する未分化ケラチノサイトの単層から成る。有棘層は、初期分化段階の非増殖性ケラチノサイトから成り、これらの細胞は、基底上層から外側に向かって移動するにつれて漸進的に成熟していく。有棘層分化後、顆粒層における後期分化、および最も外側の角化層における最終分化と続く（図１参照）。分化に入ると、基底層の細胞は増殖能を失い、最終分化角化層の方へと移動する。高細胞外カルシウムレベル、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３および他の分子に関する熱心な研究およびデータにもかかわらず、ケラチノサイト分化プロセスを開始および調整する正確なメカニズムは、未だ不明である。
【０００４】
適正な層化およびバリア形成の発生には、表皮における分化の精密な調整が重要である。表皮の恒常性は、ひとつには、分化の各段階での正しいケラチノサイトにおける遺伝子の発現を編成することにより維持されている。この分化プログラムの変更により、皮膚疾患、例えば、乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎、皮膚癌（例えば、扁平上皮癌および基底細胞癌）、ならびに無秩序な細胞分裂を特徴とする他の皮膚の状態が生じ得る。
【０００５】
従って、皮膚細胞の増殖シグナルと分化シグナルのバランスのあらゆる混乱により、様々な疾患または他の望ましくない皮膚の状態が生じ得る。ケラチノサイト増殖の過剰な刺激は、高増殖性皮膚状態、例えば、上で述べたもの（すなわち、乾癬および様々な非黒色腫性皮膚癌）をもたらすことがある一方で、ケラチノサイト増殖の刺激不足は、成長が低下した状況、例えば、老化皮膚（皮膚細胞老化）または損傷した皮膚を特徴とする状況をもたらすことがある。従って、ケラチノサイトの増殖の減少および／または阻害に向けた治療は、皮膚細胞の増殖亢進を特徴とする状態の治療に有用である。同様に、ケラチノサイトの増殖を増加させるための治療は、新たな成長が減速している老化または損傷皮膚状態の改善に、および／または創傷治癒の加速に有用である。特に有益な治療は、両方の状態を同時にまたは必要に応じて治療する能力を備えるものであるが、現在利用できるこのような治療はない。
【０００６】
従って、皮膚細胞の増殖過多または増殖不足に関連した状態および／または疾病のための新たなおよび有効な治療が必要とされている。ケラチノサイトの増殖および／または挙動を調節するための方法も必要とされている。特に、ケラチノサイト増殖を正常化するための新たな方法および治療が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
簡単に説明すると、本開示は、ケラチノサイト機能および／または増殖を正常化するための方法および組成物を提供する。本開示の態様は、ケラチノサイト機能の調節、および／またはケラチノサイト中のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のレベルの調節も含む。加えて、本開示は、ケラチノサイト増殖を調節することにより皮膚の状態を治療するための方法および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、ケラチノサイト機能を調節するための本開示の方法の実施形態は、ケラチノサイト中のＰＧまたはこの機能性誘導体の量の変更を含む。他の実施形態としては、ケラチノサイトを、このケラチノサイトにおけるシグナル伝達を調節するために有効量のＰＧまたはこのプロドラッグと接触させることを含む、ケラチノサイト機能の調節方法が挙げられる。ホスファチジン酸およびＰＧ生成の調節方法の実施形態は、ケラチノサイトを非グリセロール系アルコールと接触させることを含む。
【０００９】
さらに、皮膚の状態を治療するための本開示の実施形態は、この皮膚疾患の治療に有効量で、一定量のＰＧ、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグを宿主に投与することを含む。宿主における皮膚の状態を治療する他の実施形態は、宿主ケラチノサイト中のＰＧの量を増加させることを含む。宿主における皮膚の状態の治療方法は、この皮膚の状態の治療に有効量のＰＧを宿主に投与することも含み、この場合、ＰＧは、この皮膚の状態が皮膚細胞の増殖不足を特徴とするときには、皮膚細胞増殖を刺激し、ならびにこの皮膚の状態が皮膚細胞の増殖過多を特徴とするときには、皮膚細胞増殖を阻害する。
【００１０】
宿主におけるケラチノサイト増殖を正常化する方法の実施形態は、一定量のＰＧを宿主に投与することを含み、この場合、ＰＧは、増殖減少状態下ではケラチノサイト増殖を刺激し、ならびにＰＧは、増殖過多状態下ではケラチノサイト増殖を阻害する。本開示は、宿主における創傷治癒の加速方法も提供し、この方法は、宿主ケラチノサイト中のＰＧの量を増加させることを含む。
【００１１】
本開示は、様々な皮膚の状態を治療するための組成物も提供する。本開示の組成物の実施形態としては、皮膚細胞シグナル伝達を調節するために有効量のＰＧ、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグが挙げられる。本開示の組成物の他の実施形態としては、皮膚細胞シグナル伝達を調節するために有効量のＰＧまたはこの機能性誘導体のリポソームが挙げられる。
【００１２】
本開示の他の系、方法、特徴および利点は、以下の図面および詳細な説明の考察をもとに、当業者には明らかになる、またはなってくる。すべてのこのようなさらなる系、方法、特徴および利点は本明細書に含まれ、本開示の範囲内であり、添付の特許請求の範囲により保護されると解釈する。
【００１３】
本開示の多くの側面が以下の図面を参照することにより理解することができる。これら図面における構成要素は必ずしも尺度でなく、むしろ本開示の本質を明確に例示するためにあることが強調される。
【００１４】
本開示の実施形態は、別の指示がない限り、当分野の範囲内である合成有機化学、生化学および分子生物学などの技術を利用する。このような技術は、文献において十分に説明されている。
【００１５】
ここで開示し、特許請求する方法をどのように実施し、組成物および化合物をどのように使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために、以下の実施例を記載する。数（例えば、量、温度など）に関して確実に正確であるように努力したが、多少の間違いおよび逸脱はあると考えなければならない。別の指示がない限り、部は、重量部であり、温度は、℃でのものであり、圧力は、大気圧またはほぼ大気圧である。標準温度および圧は、２０℃で１気圧と定義する。
【００１６】
本開示の実施形態を詳細に説明する前に、他に別の指示がない限り、本開示は、特定の材料、試薬、反応材料または製造プロセスなどに限定されず、従って、変わる場合があることを理解しなければならない。ここで用いる専門用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、限定するためのものではないことも理解しなければならない。本開示において、論理的に可能である場合には、段階を別の順序で実行することもできる。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、この文脈が明確に別様に命じていない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「単数の支持体」への言及は、複数の支持体を含む。本明細書および後続の特許請求の範囲において多数の用語に言及するが、これらは、相反する意図が明らかでない限り、以下の意味を有すると定義する。
【００１８】
定義：
ここで用いる用語「宿主」または「生物」は、ヒトも、哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマなど）も、皮膚の状態／疾病の治療が必要な他の現生種も含む。現生生物は、例えば単個真核細胞ほども単純である場合もあり、哺乳動物ほども複雑である場合もある。さらに、「組成物」は、下で説明するような、１つ以上の化合物を含むことができる。
【００１９】
用語「誘導体」は、開示化合物の加水分解、還元または酸化生成物を含む（しかし、これらに限定されない。）開示化合物の変形を指す。加水分解、還元および酸化反応は、当分野では公知である。
【００２０】
用語「機能性誘導体」は、開示化合物の機能を保持する開示化合物の誘導体を指す。例えば、ＰＧの場合、本開示の文脈でのＰＧの機能性誘導体としては、皮膚細胞のシグナル伝達および／または増殖を調節する効果を有するＰＧの誘導体が挙げられる。本開示におけるＰＧの機能性誘導体の非限定的な例は、プロピレングリコールを使用してホスファチジル基転移反応で形成されたホスファチジルアルコールであり、これは、１つのヒドロキシル基を除きＰＧと同じ化学構造を有し、ＰＧの活性を保持する。
【００２１】
ここで用いる用語「治療有効量」は、ケラチノサイトの増殖過多または増殖不足が直接または間接的な原因となる１つ以上の症状をある程度軽減する投与される化合物の量を指す。ケラチノサイトの増殖過多または増殖不足が直接または間接的な原因となる状態／疾病に関して、治療有効量は、この疾病の素質を有するかもしれないが、この状態／疾病の症状をまだ経験および示していない動物におけるこの状態／疾病の発生の予防（予防的治療）、この状態／疾病の症状の緩和、この状態／疾病の程度の低下、この状態／疾病の安定化（すなわち、悪化させないこと）、この状態／疾病の進展の予防、この状態／疾病の進行の遅延または減速、この状態／疾病状態の改善または軽減、およびこれらの組み合わせの効果を有する量を指す。
【００２２】
「医薬的に許容される塩」は、生物学的有効性および遊離塩基の特性を保持する塩を指し、これらは、無機または有機酸（例えば、限定ではないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、リンゴ酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸およびクエン酸など）との反応によって得られる。
【００２３】
「医薬組成物」は、ここに記載する１つ以上の化合物またはこれらの医薬的に許容される塩と、他の化学成分（例えば、生理学的に許容される担体および賦形剤）との混合物を指す。医薬組成物の１つの目的は、生物への化合物の投与を可能にすることである。
【００２４】
ここで用いる「医薬的に許容される担体」は、生物に対して有意な刺激をもたらさず、投与化合物の生物活性および特性を無くさせない担体または希釈剤を指す。
【００２５】
「賦形剤」は、化合物の投与をさらに助長するために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
ここで用いる「治療する」、「治療すること」および「治療」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本開示の実施形態のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、この状態／疾病の素質を有するかもしれないが、この疾病の症状をまだ経験および示していない動物におけるこの状態／疾病の発生の予防（予防的治療）、この状態／疾病の症状の緩和、この状態／疾病の程度の低下、この状態／疾病の安定化（すなわち、悪化させないこと）、この状態／疾病の進展の予防、この状態／疾病の進行の遅延または減速、この状態／疾病状態の改善または軽減、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「治療する」、「治療すること」および「治療」は、治療を受けなかった場合に期待される生残と比較して生残を延長することも意味する。
【００２７】
用語「プロドラッグ」は、インビボで生物活性形態に変換される物質を指す。プロドラッグは、状況によっては親化合物より投与しやすいことがあるため、多くの場合有用である。これらは、例えば、経口投与により生体利用できるのに対し、親化合物はできない。プロドラッグは、親薬物と比較して、医薬組成物への溶解性が向上している場合もある。プロドラッグは、酵素的プロセスおよび代謝性加水分解を含む様々なメカニズムにより親薬物に変換され得る。Ｈａｒｐｅｒ，ＮＪ．（１９６２）．Ｄｒｕｇ Ｌａｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｊｕｃｋｅｒ，ｅｄ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４：２２１−２９４；Ｍｏｒｏｚｏｗｉｃｈら．（１９７７）．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｔｏ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ｉｎ Ｅ．Ｂ．Ｒｏｃｈｅ ｅｄ．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，ＡＰｈＡ；Ａｃａｄ．Ｐｈａｒｍ．ＳｃＬ；Ｅ．Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，ｅｄ．（１９７７）．Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｈｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＡＰｈＡ；Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ｅｄ．（１９８５）Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｗａｎｇら．（１９９９）Ｐｒｏｄｒｕｇ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ．５（４）：２６５−２８７；Ｐａｕｌｅｔｔｉら．（１９９７）．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ：Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２７：２３５−２５６；Ｍｉｚｅｎら．（１９９８）．Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｅｓｔｅｒｓ ａｓ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｆｏｒ Ｏｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ β−Ｌａｃｔａｍ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．ｌｌ，：３４５−３６５；Ｇａｉｇｎａｕｌｔら．（１９９６）．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ Ｉ． Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｐｒａｃｔ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６７１−６９６；Ｍ．Ａｓｇｈａｒｎｅｊａｄ（２０００）．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｏｒａｌ Ｄｒｕｇ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｖｉａ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｉｎ Ｇ．Ｌ．Ａｍｉｄｏｎ，Ｐ．Ｉ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｅ．Ｍ．Ｔｏｐｐ，Ｅｄｓ．，Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ｐ．１８５−２１８；Ｂａｌａｎｔら．（１９９０）．Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｒｕｇ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｖｉａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｏｕｔｅｓ ｏｆ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．ＤｒｕｇＭｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，１５（２）：１４３−５３；Ｂａｌｉｍａｎｅ ａｎｄ Ｓｉｎｋｏ（１９９９）．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒａｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，３９（ｌ−３）：１８３−２０９；Ｂｒｏｗｎｅ（１９９７）．Ｆｏｓｐｈｅｎｙｔｏｉｎ（Ｃｅｒｅｂｙｘ），Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０（１）：１−１２；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ（１９７９）．Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇｓ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ，Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｃｈｅｍｉ．８６（１）：１−３９；Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ｅｄ．（１９８５）．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｆｌｅｉｓｈｅｒら．（１９９６）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１９（２）：１１５−１３０；Ｆｌｅｉｓｈｅｒら．（１９８５）．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１２：３６０−８１；Ｆａｒｑｕｈａｒ Ｄ．ら．（１９８３）．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｄ．，７２（３）：３２４−３２５；Ｈａｎ，Ｈ．Ｋ．ら．（２０００）．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ．，２（１）：Ｅ６；Ｓａｄｚｕｋａ Ｙ．（２０００）．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｄｒｕｇ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｏ ａｃｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ，Ｃｕｒｒ．ＤｒｕｇＭｅｔａｂ．，１（１）：３１−４８；Ｄ．Ｍ．Ｌａｍｂｅｒｔ（２０００）．Ｒａｔｉｏｎａｌｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄｓ ａｓ ｐｒｏｄｒｕｇ ｃａｒｒｉｅｒｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ＳｃＬ，１１ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１５−２７；Ｗａｎｇ，Ｗ．ら．（１９９９）．Ｐｒｏｄｒｕｇ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇｓ．Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，５（４）：２６５−８７。
【００２８】
ここで用いる用語「局所活性薬剤」は、宿主への適用（接触）部位における薬理応答を惹起する、本開示の組成物を指す。
【００２９】
ここで用いる用語「局所的に」は、皮膚および粘膜細胞および組織の表面への本開示の組成物の適用を指す。
【００３０】
ここで用いる用語「阻害する」および／または「減少させる」は、自然の、期待されるもしくは平均的な状態を基準にして、または現在の状態を基準にして、機能、活性または挙動を直接または間接的に減少させる作用を一般に指す。例えば、ケラチノサイトの増殖を阻害するまたは減少させる何かが、新たなケラチノサイトの成長を停止または減速させることがある。
【００３１】
ここで用いる用語「増加させる」、「強化する」および／または「誘導する」は、一般に、自然の、期待されるもしくは平均的な状態を基準にして、または現在の状態を基準にして、機能または挙動を直接または間接的に改善するまたは増加させる作用を指す。例えば、ケラチノサイトの増殖を増加させるまたは強化する何かが、増殖が減速もしくは停止してしまっているケラチノサイトの増殖を誘導することがあり、または増殖の速度を通常の速度より加速することがある。
【００３２】
本明細書で用いる用語「調節する」、「修飾する」、および／または「調節因子」は、特定の機能または挙動に対する直接または間接的な促進／活性化または干渉／阻害作用を一般に指す。例えば、ケラチノサイト機能の調節因子は、ケラチノサイトの増殖もしくは分化を活性化もしくは増加させることがあり、またはケラチノサイト機能の調節因子は、ケラチノサイトの増殖もしくは分化を阻害することがある。場合により、調節因子は、一定の活性または機能を、この自然な状態を基準にして、または一般に期待される平均的な活性レベルを基準にして、または現在の活性レベルを基準にして、増加および／または減少させることができる。
【００３３】
ここで用いる用語「正常化する」は、２つ以上の活性、機能または状態の間の相対バランスまたは平衡を確立するおよび／または維持する作用を指す。例えば、ケラチノサイトの増殖の正常化は、一般に様々な状態のもとでケラチノサイトの増殖と分化の間の相対バランスを維持することを指す。増殖過多の状態のもとでの正常化は、増殖の減速または阻害を意味する一方で、成長が減速している状態のもとでの正常化は、増殖の誘導または増加を意味する。
【００３４】
ここで用いる用語「発現」は、構造遺伝子によりポリペプチドが生産されるプロセスを指す。これは、転写と翻訳の組み合わせである。従って、ＰＬＤ２またはＡＱＰ３の発現の誘導または増加は、ＰＬＤ２またはＡＱＰ３ポリペプチドの生産の増加または誘導を指し、これは、様々なアプローチ、例えば、このポリペプチドをコードする遺伝子の数を増加させること、（例えば、構成的プロモーターの制御下に遺伝子を置くことにより）この遺伝子の転写を増加させること、もしくはこの遺伝子の翻訳を増加させること、またはこれらのアプローチおよび／もしくは他のアプローチの組み合わせによって行われる。
【００３５】
用語「含む」、「など」、「例えば」などは、具体例としての実施形態を指すためのものであり、本開示の範囲を限定するためのものではない。
【００３６】
考察
ホスホリパーゼＤ
ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）は、成長、分化、小胞輸送および細胞骨格再配列を含む多数の細胞プロセスに関係付けられている脂肪分解酵素である。ＰＬＤは、ホスファチジルコリンの加水分解を触媒して、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびコリンを生じさせる。ＰＡおよびこの代謝産物、ジアシルグリセロールおよびリソホスファチジン酸は、多数の生理事象に関与している。第一アルコールの存在下、ＰＬＤは、ホスファチジル基転移反応を触媒して、ホスファチジルアルコールを生じさせる。このメカニズムに従って、ＰＬＤは、生理的第一アルコールグリセロールの存在下でホスファチジルコリンを代謝して、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を生じさせることができる。ＰＬＤの反応を図２に示す。
【００３７】
哺乳動物ＰＬＤの２つのアイソフォーム、ＰＬＤ１およびＰＬＤ２が、同定されている。ＰＬＤ１は、低い基礎活性を有し、小さなＧタンパク質（Ａｒｆ、ＲｈｏおよびＲａｃ）およびプロテインキナーゼＣによって活性化され、これに対してＰＬＤ２は、インビトロでモニターされた昆虫細胞への形質移入によって証明されるように、構成的活性であるようである。両方のＰＬＯが、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸（ＰＩＰ２）を補因子として利用し、ならびにケラチノサイトにおいて発現されることが証明されている。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、ケラチノサイト分化剤は、ＰＬＤ１の発現を誘導するが、ＰＬＤ２の発現は誘導しない。図３は、ＰＬＤの様々なシグナル伝達経路を説明する図である。ＨａＣａＴ細胞において、ＰＬＤ２は、カベオリンリッチな膜マイクロドメインに位置している。
【００３８】
より詳細に下で論じるように、ＰＬＤ２の位置およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を生産するこの能力が、ＰＬＤ２をケラチノサイトの挙動、特に、ケラチノサイトの増殖および分化を調節するためのシグナル伝達に関する挙動の調節に関与させる。
【００３９】
アクアポリン３
アクアポリンは、小さな膜貫通型水および／またはグリセロールチャネルの一ファミリーである。現在、１１の哺乳動物アクアポリン（ＡＱＰＯ−ＩＯ）が、同定および特性付けされている。これらの構造および機能特性に従って、アクアポリンは、２つのサブグループ（水のみを輸送する「アクアポリン」、および水とグリセロールの両方を輸送することができる「アクアグリセロポリン」）に分けることができる。アクアグリセロポリンサブグループに属するＡＱＰ３は、水の比較的弱い輸送体であるが、グリセロールの有効な輸送体である。ＡＱＰ３は、尿管、消化管および気道ならびに表皮を含む様々な組織からの、腎臓採取細胞、赤血球、樹状細胞および上皮細胞において発現される。表皮、気管および鼻咽頭上皮では、ＡＱＰ３は、表皮の基底細胞中に存在する。
【００４０】
ＡＱＰ３欠失マウスは、グリセロール含量の選択的減少、ならびに水分保持能力低下、表皮に関して、皮膚弾力性減損、角質層剥離後のバリア回復遅延および創傷治癒遅延を示し、これは、ケラチノサイトの増殖および分化の調整におけるＡＱＰ３の一定の役割を示唆している。この表現型は、グリセロールの局所または経口適用により修正できるが、他の浸透活性分子ではできず、これは、この効果が、単にグリセロールの親水特性の作用でないことを示唆している。上で論じたようにＰＧを生成するために用いることができるグリセロールを輸送するＡＱＰ３の能力、および下で論じるこの位置は、ＰＧの生成およびケラチノサイトの機能の調節におけるＡＱＰ３の一定の役割を暗示し、このことは、より詳細に下で論じる。
【００４１】
ＰＬＤ２／ＡＱＰ３／グリセロール／ＰＧ シグナル伝達モジュール
本開示の発明者らは、ケラチノサイトでは、ＡＱＰ３およびＰＬＤ２が、カベオリンリッチな膜マイクロドメインにおいて会合すること、ならびにＡＱＰ３グリセロールチャネルが、正常な表皮機能にとって重要であることを、以前に証明した（Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．ａｎｄ Ｂｏｌｌａｇ，Ｗ．Ｂ．（２００３）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１２１，１４８７−１４９５（これは、本明細書に参考として組み込まれる。））。小窩は、電子顕微鏡により原形質膜における直径５０〜１００ｎｍのフラスコ形陥入として特性付けられている、脂質ラフトマイクロドメインのサブセットである。カベオリン１は、小窩内で同定された最初の構造タンパク質成分であり、機能的に、広範なシグナル伝達プロセスに関係付けられている（Ｓｍａｒｔら、１９９９）。加えて、カベオリン１は、ケラチノサイト内の層状体と会合することが、最近、証明された（Ｓａｎｄｏら、２００３）。
【００４２】
カベオリンリッチな膜マイクロドメインにおけるＰＬＤ２とＡＱＰ３の共在性（ｃｏｌｏｃａｔｉｏｎ）は、ＡＱＰ３が、ＰＧを生成させるホスファチジル基転移反応において用いるためのグリセロールをＰＬＤ２に輸送すること、また、このＰＧが、ケラチノサイト機能を調節するための脂質第二メッセンジャーとして作用することを示唆しており、このことは、下の実施例１および２によってさらに証明する。実際、本明細書中の実施例により、ＡＱＰ３、ＰＬＤ２、グリセロールおよびＰＧから成る新規シグナル伝達モジュールの存在を実証する。
【００４３】
ＰＧリポソームの直接供給により急速分裂性ケラチノサイトにおけるＤＮＡ合成が用量依存的に阻害されたが、成長が阻害された細胞では、ＰＧリポソームによりＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みが用量依存的に強化されたことも、実施例２によって証明する。ＰＧリポソームがトランスグルタミナーゼ活性を刺激する傾向も観察された。これらのデータは、ＡＱＰ３、ＰＬＤ２、グリセロールおよびＰＧから成るシグナル伝達モジュールが、増殖性ケラチノサイトの成長阻害および／または初期分化の促進に関与しており、その結果、ケラチノサイトの挙動および／または増殖を調節するためのメカニズム、ならびにケラチノサイトの増殖の増加または減少を特徴とする様々な皮膚の状態を治療するための方法をもたらすことを支持している。
【００４４】
ケラチノサイトの増殖を調節する方法および皮膚の状態を治療する方法
本開示の実施形態は、ＰＬＤ２／ＡＱＰ３／グリセロール／ＰＧシグナル伝達モジュールの様々な成分の量および／または活性を調節することにより、ケラチノサイト機能、特に増殖、を調節する方法を含む。本開示の一定の実施形態において、ケラチノサイトの増殖は、ケラチノサイトにより生産される、またはケラチノサイトと接触しているＰＧ、またはこの機能性誘導体の量を調節することによって正常化する。本開示の実施形態において、ケラチノサイトと接触している、またはケラチノサイトによって生産されるＰＧの量の調節は、皮膚細胞成長減速または増殖不足状態にある皮膚細胞の増殖を刺激すること、および成長増加または増殖亢進状態にある皮膚細胞の増殖の減少させることによって、ケラチノサイト増殖を正常化する。
【００４５】
ケラチノサイトと接触しているＰＧの量を調節する一部の実施形態は、ケラチノサイトと接触しているＰＧ、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグの量を増加させることを含む。ＰＧの機能性誘導体の例としては、１つのヒドロキシ基をマイナスしたＰＧと同じ構造を有するプロピレングリコールのホスファチジル基転移反応生成物が挙げられるが、これに限定されない。
【００４６】
ケラチノサイトと接触しているＰＧの量を増加させてケラチノサイトの挙動を調節する実施形態は、ケラチノサイト増殖、ケラチノサイト皮膚細胞シグナル伝達および／またはケラチノサイト核酸合成を調節するために有効量のＰＧ、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグとケラチノサイトを接触させることを含む。下の実施例により、ＰＧが、ケラチノサイトにおけるシグナル伝達を調節するように作用し、様々な条件に依存してケラチノサイトにおける核酸合成を増加または減少させることができることを証明する。
【００４７】
本開示の驚くべき、有益な態様は、ＰＧが、ケラチノサイトにおいて二相性作用を示し、成長減速状態、例えば加齢（すなわち、細胞老化）または皮膚細胞傷害、例えば好ましくない状態（例えば、煙、日光、風および極端な温度）への暴露に起因する皮膚細胞障害または物理的傷害（例えば、創傷、やけど、すり傷、瘢痕、潰瘍など）のもとでは増殖のシグナルを誘導し、ならびに乾癬、湿疹、日光性角化症、アトピー性皮膚炎、基底細胞癌および他の非黒色腫性皮膚癌を含む（しかし、これらに限定されない）疾患などにおける増加したまたは過増殖性成長状態のもとでは増殖を阻害または減速するシグナルを誘導することである。従って、ＰＧレベルおよび／もしくは生成を調節することにより、ならびにまたはＰＬＤ２／ＡＱＰ３／グリセロール／ＰＧシグナル伝達モジュールを別様に調節することにより、成長過多状態または成長不足状態を別々に治療するのではなく、これらの状態に同時に対処することができる。
【００４８】
本開示の方法は、ＰＧまたはグリセロールをケラチノサイトまたは宿主に投与することによりＰＧレベルを調節することに限定されず、ケラチノサイトによって生産されるＰＧの量を調節する方法も包含する。ケラチノサイトによって生産されるＰＧの量の調節に関する実施形態は、例えば、ＰＬＤ２および／もしくはＡＱＰ３の活性のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションにより、ならびに／またはケラチノサイトにおけるＰＬＤ２および／もしくはＡＱＰ３の発現を増加または減少させることにより、ホスホリパーゼＤ２（ＰＬＤ２）および／またはアクアポリン−３（ＡＱＰ３）の活性を調節することを含む。ＰＬＤ２またはＡＱＰ３の発現を増加させるための実施形態は、ＰＬＤ２またはＡＱＰ３ポリペプチドの生産の増加または誘導を含み、これは、当業者には公知の様々なアプローチによって行うことができ、この非限定的な例は、下の実施例で開示する。一般に、ＰＬＤ２またはＡＱＰ３の発現を増加させるためのアプローチとしては、（例えば、宿主細胞をこの遺伝子のさらなるコピーでトランスフェクトすることにより、遺伝子療法の当業者には公知の様々な方法により）このポリペプチドをコードする遺伝子の数を増加させること、（例えば、構成的プロモーターの制御下にこの遺伝子を置くことにより）この遺伝子の転写を増加させること、もしくは遺伝子の翻訳を増加させることなどの方法、またはこれらのアプローチおよび／または他のアプローチの組み合わせが挙げられる。
【００４９】
本開示の実施形態は、ケラチノサイトの増殖および／または機能を正常化および／または調節することによる、ケラチノサイトの増殖過多または増殖不足を特徴とする宿主の皮膚の状態／疾患を治療するための方法および組成物も提供する。本開示の方法および組成物により治療することができる皮膚の状態としては、高増殖性疾患、例えば乾癬、湿疹、日光性角化症、アトピー性皮膚炎、基底細胞癌、非黒色腫性皮膚癌、および無秩序な細胞分裂；成長減速状態、例えば、加齢、瘢痕化、皮膚細胞老化、および（例えば、日光、煙、風、および極端な温度などへの）暴露に起因する皮膚障害；ならびに物理的創傷（例えば、裂傷、潰瘍、例えば糖尿病性および加齢性潰瘍、やけど、すり傷など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
上の状態を治療する方法としては、数ある中でも、上で説明したケラチノサイト増殖および／または機能の調節／正規化方法が挙げられる。特に、上の状態を治療するための方法の実施形態は、ケラチノサイト増殖、ケラチノサイト皮膚細胞シグナル伝達および／またはケラチノサイト核酸合成を調節するために有効量のＰＧ、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグを投与することを含む。ケラチノサイトの挙動を調節するためおよび／または皮膚の状態を治療するための本開示の方法は、ＰＧの投与と併用で、下で説明するようにケラチノサイトをグリセロールまたはこの機能性誘導体と接触させて、細胞のＰＧ生産を刺激することも含む。本開示の方法は、より詳細に下で論じるように、非グリセロール系アルコールとケラチノサイトを接触させて、ホスファチジン酸、ＰＡ、ならびにＰＧ生産を調節することも含む。本開示の実施形態は、この必要がある宿主に本開示の医薬組成物を投与することによる、上の状態を治療するならびにケラチノサイトの機能および増殖を調節する方法も含む。本開示の医薬組成物を、より詳細に下で論じる。
【００５１】
医薬組成物
本開示の医薬組成物および剤形の実施形態は、ＰＧ、ＰＧの医薬的に許容される塩もしくはこの機能性誘導体、またはこの医薬的に許容される多形、溶媒和物、水和物、脱水物、共結晶、無水またはその非晶質形態を含む。本開示の医薬組成物の実施形態は、グリセロールまたはこの機能性誘導体も含むことがある。グリセロールは、ＰＧの生成のためにＰＬＤ２の基質として作用するので、グリセロールは、ホスファチジン酸（ＰＡ）をダウンレギュレートするさらなる効果を有し、下の実施例で実証するように、このＰＡも、ケラチノサイトの調節においても一定の役割を果たし得る。プロピレングリコールを含む（しかし、これに限定されない。）グリセロールの機能性誘導体は、ＰＧ機能性誘導体の生成増加においても、ＰＡの生成の下方制御においても、グリセロールと同じまたは同様の効果を有する。
【００５２】
本開示の組成物の他の実施形態は、下の実施例で実証するように、ＰＧとＰＡの両方のＰＬＤ２生成を下方制御するグリセロールの非機能性誘導体、例えば他の第一、非グリセロール系アルコール（例えば、１−ブタノールおよびエタノール）を含むことがある。このような組成物は、所望の効果に依存して、ＰＧを含むこともあり、含まないこともある。非グリセロール系アルコールを含み、ＰＧを含まない組成物は、ＰＡおよびＰＧの生成を阻害する／減少させることができ、一方、非グリセロール系アルコールおよびＰＧを含む組成物は、ＰＡ生産を阻害する／減少させることができ、ならびにケラチノサイトの挙動に対するＰＧ媒介調節を誘導することができる。
【００５３】
医薬組成物および単位剤形は、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤または希釈剤も含む。本活性組成物によってもたらされる利点、例えば、溶解度上昇および／または流動、純度もしくは安定（例えば、吸水）特性向上により（しかし、これに限定されない）、本組成物は、医薬調合物および／または患者への投与に、先行技術より良好に適するものであることができる。
【００５４】
本活性組成物の医薬単位剤形は、患者への局所投与、経皮投与、経口投与、粘膜投与（例えば、経鼻、舌下、経膣、口腔内または直腸内投与）、または非経口投与（例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内もしくはボーラス注射）に適する。剤形の例としては、錠剤；キャプレット；カプセル、例えば、ハードゼラチンカプセルおよびソフトゼラチンカプセル；カシェ剤；トローチ；ロゼンジ；分散液；坐剤；軟膏；ハップ剤（湿布剤）；ペースト；粉末；包帯剤；クリーム；硬膏剤；溶液；パッチ；エーロゾル（例えば、鼻スプレー剤または吸入剤）；ゲル；懸濁剤（例えば、水性または非水性懸濁液、水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョン）、溶液およびエリキシルを含む、患者への経口または粘膜投与に適する液体剤形；患者への非経口投与に適する液体剤形；ならびに再構成して、患者への非経口投与に適する液体剤形を提供することができる滅菌固体（例えば、結晶質または非晶質固体）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
活性組成物の剤形の組成、形状およびタイプは、これらの用途に依存して様々であり得る。例えば、疾病または疾患の急性治療において使用される剤形は、同じ疾病または疾患の慢性治療において使用される剤形より多くの量の活性成分（すなわち、活性組成物）を含有し得る。同様に、非経口剤形は、同じ疾病または疾患を治療するために使用される経口剤形より少ない量の活性成分を含有し得る。これらの方法、および本開示に包含される特定の剤形が互いに異なる他の方法は、当業者には容易にわかる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（１９９０））。
【００５６】
典型的な医薬組成物および剤形は、１つ以上の賦形剤を含むことができる。適する賦形剤は、調剤または医薬分野の当業者には周知である。特定の賦形剤が、医薬組成物または剤形への配合に適するかどうかは、この剤形を患者に投与する方法を含む（しかし、これに限定されない）、当分野では周知の様々な要因に依存する。例えば、錠剤またはカプセルなどの経口剤形は、非経口剤形での使用には適さない賦形剤を含有することがある。個々の賦形剤の適性は、この剤形中の具体的な活性成分にも依存し得る。
【００５７】
本開示は、活性成分が分解する速度を低下させる１つ以上の化合物を含む、医薬組成物および剤形を、さらに包含する。ここでは「安定剤」と呼ぶこのような化合物としては、抗酸化物質、例えばアスコルビン酸、ｐＨ緩衝剤、または塩緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、本開示の医薬組成物または剤形は、１つ以上の溶解度調節剤、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウムもしくはカリウムまたは有機酸、を含有することがある。具体的な溶解度調節剤は、酒石酸である。
【００５８】
賦形剤の量およびタイプと同様に、剤形中の活性成分の量および具体的なタイプは、これを患者に投与する経路、治療すべき状態、宿主のサイズなど（しかし、これらに限定されない）の要因に依存して異なることがある。しかし、本開示の化合物の典型的な剤形は、ＰＧ、この医薬的に許容される塩、または医薬的に許容される多形、溶媒和物、水和物、脱水物、共結晶、無水もしくは非晶質形態を、約０．０５ｍｇから約５０ｍｇの量で、好ましくは、約０．２５ｍｇから約１０ｍｇの量で、およびさらに好ましくは、約０．５ｍｇから５ｍｇの量で含む。
【００５９】
具体例としての実施形態において、ＰＧ、この機能性誘導体、医薬的に許容される塩、またはこのプロドラッグは、リポソームの形態で、場合によっては１つ以上の上記添加剤と混合して、送達することができる。本開示の組成物は、任意の形態で送達することができるが、皮膚疾患の治療には、局所剤形が好ましいだろう。
【００６０】
局所、経皮および粘膜用剤形
本開示の局所剤形としては、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、シャンプー、スプレー剤、エーロゾル、溶液、エマルジョン、および当業者には公知の他の剤形が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）；ａｎｄ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９８５））。噴霧不能局所剤形については、局所適用に適合した担体または１つ以上の賦形剤を含み、好ましくは水より大きい動粘性率を有する、粘性から半固体または固体形態が、一般に利用される。適する調合物としては、所望される場合には、滅菌されているか、様々な特性（例えば、浸透圧など）に影響を及ぼすように助剤（例えば、保存薬、安定剤、湿潤剤、緩衝剤または塩）と混合されている、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、リニメント剤および膏薬などが挙げられるが、これらに限定されない。他の適する局所剤形としては、噴霧可能エーロゾル製剤が挙げられ、この場合、活性成分は、好ましくは固体または液体不活性担体と併わせて、加圧揮発性物質（例えば、ガス状噴射剤、例えばフレオン）との混合物で、またはスクイーズボトルの中にパッケージングされる。所望される場合には、医薬組成物および剤形に、潤い付与剤または保湿剤も添加することができる。このような追加成分の例は、当分野では周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０））。
【００６１】
本活性組成物の経皮および粘膜用剤形としては、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、溶液、エマルジョン、懸濁液、坐剤、点眼剤、パッチ、スプレー剤、エーロゾルまたは当業者には公知の他の剤形が挙げられるが、これらに限定されない｛例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）；ａｎｄ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９８５））。口腔内の粘膜組織を治療するために適する剤形は、マウスウォッシュとして、経口ゲルとして、または口腔内パッチとして調合することができる。さらなる経皮剤形としては、皮膚に貼り、特定の期間にわたって身に着けて所望量の活性成分を浸透させることができる、「レザバー型」または「マトリックス型」パッチが挙げられる。
【００６２】
本開示に包含される経皮および粘膜用剤形をもたらすために使用することができる、適する賦形剤（例えば、担体および希釈剤）および他の材料は、医薬分野の当業者には周知であり、ならびに所与の医薬組成物または剤形が適用されることとなる特定の組織または器官に依存する。非毒性であり、医薬的に許容される剤形を形成することを念頭において、典型的な賦形剤としては、水、リン酸緩衝生理食塩水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱物油、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
治療すべき具体的な組織に依存して、活性組成物の医薬的に許容される塩での治療前に、治療と共に、または治療後に、追加成分を使用してもよい。例えば、浸透向上剤は、組織にまたは組織を横断して活性成分を送達することを助長するために使用することができる。適する浸透向上剤としては、アセトン；様々なアルコール、例えば、エタノール、オレイルおよびテトラヒドロフリルアルコール；アルキルスルホキシド、例えば、ジメチルスルホキシド；ジメチルアセトアミド；ジメチルホルムアミド；ポリエチレングリコール；ピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドン；コリドングレード（ポビドン、ポリビドン）；尿素；ならびに様々な水溶性または水不溶性糖エステル、例えば、ＴＷＥＥＮ ８０（ポリソルベート８０）およびＳＰＡＮ ６０（ソルビタンモノステアラート）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
医薬組成物もしくは剤形のｐＨまたはこの医薬組成物もしくは剤形を適用する組織のｐＨを調整して、活性成分（単数または複数）の送達を向上させることができる。同様に、溶媒担体の極性、このイオン強度または張度を調整して、送達を向上させることもできる。ステアラートなどの化合物を医薬組成物または剤形に追加して、送達を向上させるために有利に活性成分（単数または複数）の親水性または親油性を変えることもできる。これに関して、ステアラートは、この調合物のための脂質ビヒクルとして、乳化剤または界面活性剤として、および送達向上または浸透向上剤としての役割を果たすことができる。活性組成物の医薬的に許容される塩の種々の水和物、脱水物、共結晶、溶媒和物、多形、無水または非晶質形態を用いて、得られる組成物の特性をさらに調整することができる。
【００６５】
以下の図面を参照すると、本開示の多数の態様をより良好に理解できる。これらの図面の構成要素は、必ずしも縮尺で描かれているとは限らず、これよりも、本開示の原理を明瞭に説明することに重きを置いている。
【００６６】
（実施例）
さて、ケラチノサイトの機能および／または増殖を調節および／または正常化するための組成物および方法、ケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールレベルを調節する方法、ならびに皮膚の状態を治療するための方法および組成物の実施形態を一般に説明してきたが、以下の実施例では、ケラチノサイトの機能および／または増殖を調節および／または正常化するための組成物および方法、ケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールレベルを調節する方法、ならびに皮膚の状態を治療するための方法および組成物の一定の実施形態を説明する。実施例１から３ならびに対応する本文および図との関連で、このような実施形態を説明するが、これらの説明に本開示の実施形態を限定する意図はない。これどころか、本意図は、本開示の実施形態の精神および範囲に含まれるすべての代案、変形および等価物を包含することである。
【実施例１】
【００６７】
本実施例では、高細胞外カルシウム濃度へのケラチノサイトの長期暴露が、ＰＬＤ活性を増大させること、および高細胞外カルシウムは、［３Ｈ］または［１４Ｃ］グリセロールで標識した細胞におけるＰＬＤ媒介ホスファチジルグリセロール生成を増加させるが、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３はさせないことの証拠を提供する。慢性的高細胞外カルシウム暴露に基づくホスファチジルグリセロール生成のこの増加は、すべて、グリセロール取り込みの増加の結果というわけではない。加えて、ＰＭＡは、ＰＬＤ活性を増大させるが、ホスファチジルグリセロールの形成を増進しない。（１）ＰＬＤ−１の発現および活性は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３によって増加されるが、ＰＬＤ−２の発現および活性はされず、ならびに（２）ＰＭＡは、ＰＬＤ−２より大きな程度にＰＬＤ−１を活性化するので、これは、グリセロールへの暴露に基づく放射標識ＰＧ生成が、ケラチノサイトにおけるＰＬＤ−２の活性化の尺度であることを示唆している。
【００６８】
実験材料
ＰＬＤ−２を過発現するＳｆ９昆虫細胞から得た膜は、米国、カリフォルニア州のＯｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって提供されたものであった。［３Ｈ］オレイン酸、［３Ｈ−パルミトイル］ホスファチジルコリン、［３Ｈ］グリセロール｛製品が打ち切られたので、３つの異なる形態を使用した。［１，２，３−３Ｈ］グリセロール（２００ｍＣｉ／ｍｍｏｌの相対活性強度）、［１，２，３−３Ｈ］グリセロール（４０〜８０ｍＣｉ／ｍｍｏｌの相対活性強度）および［２−３Ｈ］グリセロール（２００ｍＣｉ／ｍｍｏｌの相対活性強度）｝ならびに［１，３−１４Ｃ］グリセロールは、ＮＥＮ／ＤｕＰｏｎｔ（米国、マサチューセッツ州、ボストン）から入手した。ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ならびにホスファチジルエタノール、ホスファチジン酸およびホスファチジルグリセロールの標準物質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（米国、アラバマ州、アラバスター）から購入した。ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）またはＳｉｇｍａ（米国、ミズーリ州、セントルイス）から入手した。カルシウム不含ＭＥＭおよび抗生物質は、Ｂｉｏｌｏｇｏｓ，Ｉｎｃ．（米国、イリノイ州、Ｍａｐｅｒｖｉｌｌｅ）から購入した。ウシ脳下垂体エキス、表皮成長因子およびＨＥＰＥＳ溶液（１Ｍ、ｐＨ７．４）は、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（米国、ニューヨーク州、グランドアイランド）から入手した。ＩＴＳ＋は、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（米国、マサチューセッツ州、ベッドフォード）によって供給され、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（米国、ジョージア州、アトランタ）がウシ胎仔血清を透析した。濃縮ゾーンを有するＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ ＴＬＣ プレートは、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ（米国、ニュージャージー州、ギブスタウン）から入手した。慣例に従って、他の試薬は、標準的な供給業者から入手し、これらは、入手できる最高グレードのものであった。
【００６９】
ホスファチジルグリセロール形成のインビトロアッセイ
［３Ｈ−パルミトイル］ホスファチジルコリンを基質として用いて、ＰＬＤ−２の活性をインビトロで測定した。Ｒ．Ｄ．Ｇｒｉｎｅｒ，Ｆ．Ｑｉｎ，Ｅ．Ｍ．Ｊｕｎｇ，ＣＫ．Ｓｕｅ−Ｌｉｎｇ，Ｋ．Ｂ．Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｒ．Ｍａｎｎ−Ｂｌａｋｅｎｅｙ，ＲＪ．Ｂｏｌｌａｇ，Ｗ．Ｂ．Ｂｏｌｌａｇ，１，２５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｕｓｅ ｅｐｉｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（１９９９）４６６３−４６７０（本明細書に参考として組み込まれる。）に記載されているように、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸から調製した脂質小胞に、放射標識ホスファチジルコリンを組み込んだ。グリセロールおよび／またはエタノールをこれらのリポソームと併せ、米国、カリフォルニア州、リッチモンドのＯｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって提供されたＰＬＤ−２過発現Ｓｆ９細胞膜の添加により反応を開始させた。その後、３７℃で３０分間、反応を進行させた後、５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．２％ ＳＤＳの添加により反応を停止させた。Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒの方法に従って脂質を抽出し、Ｗ．Ｂ．Ｂｏｌｌａｇ，「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ」，ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１０５（１９９８）１５１−１６０（本明細書に参考として組み込まれる。）に記載されているとおり、放射標識リン脂質を分離し、定量した。
【００７０】
細胞培養
日齢１〜３日の新生子ＩＣＲマウスから、皮膚のトリプシン浮上分離法および表皮と真皮の機械分離後、１次表皮ケラチノサイトを調製した。表皮細胞を擦過により剥離させ、遠心分離により回収し、２５μＭ カルシウム、２％ 透析ウシ胎仔血清、２ｍＭ グルタミン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、ＩＴＳ＋（６．２５μｇ／ｍＬ インスリン＋６．２５μｇ／ｍＬ トランスフェリン＋６．２５ｎｇ／ｍＬ 亜セレン酸＋５．３５μｇ／ｍＬ リノール酸＋１．２５％ ウシ血清アルブミン）、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍＬ フンギゾンを含有するＭＥＭから成る培地中、６ウエルシャーレにプレーティングした。一晩、インキュベートした後、これらの細胞に、２％ 透析ウシ胎仔血清を９０μｇ／ｍＬ ウシ脳下垂体エキスに替えた無血清ケラチノサイト培地（ＳＦＫＭ）を再供給した。１〜３日ごとに新たな培地を細胞に再供給した。
【００７１】
ＰＬＤ活性および［３Ｈ］または［１４Ｃ］ホスファチジルグリセロール形成
ＰＬＤアッセイのために、培養１次ケラチノサイトを、２０〜２４時間、２．５μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］オレイン酸で標識した。その後、０．５％ エタノールの存在下、ビヒクルまたは１００ｎＭ ＰＭＡに、３０分間、これらの細胞を暴露した。放射標識ホスファチジルグリセロールの形成を測定するために、ビヒクル、２５０ｎＭ １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３または１２５μＭ カルシウムを含有するＳＦＫＭで、２４時間、細胞を処理し、その後、さらに３０分間、１〜２．５μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］または０．４〜０．５μＣｉ／ｍＬ ［１４Ｃ］グリセロールで標識した。ＰＧ形成の細胞外カルシウム依存性を調査する実験については、様々なカルシウム濃度を含有するＳＦＫＭ中で、２４時間、細胞をインキュベートした後、３０分にわたって５μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］グリセロールを添加した。場合により、２５μＭ カルシウム（対照）含有または１２５μＭ カルシウム含有ＳＦＫＭで、２４時間、細胞を刺激した後、１％ エタノールが存在するおよび不在の状態の［１４Ｃ］グリセロールを添加した。ＰＭＡに応じてのホスファチジルグリセロール形成を測定するために、未標識細胞を、上のように、放射標識グリセロールの存在下、１００ｎＭ ＰＭＡで刺激した。反応を停止させ、放射標識ホスファチジルアルコールを抽出し、薄層クロマトグラフィーによって分離し、上で言及したＢｏｌｌａｇ（１９９８）による記載のとおりに定量した。
【００７２】
［１４Ｃ］ホスファチジルグリセロールのヘッドグループ位置における放射標識の実証
対照（２５μＭ カルシウム）または１２５μＭ カルシウム含有培地で、２４時間、前処理したケラチノサイトを、さらに３０分間、０．４〜０．５μＣｉ／ｍＬ ［１４Ｃ］グリセロールに暴露した。上で説明したように、脂質をクロロホルム／メタノールに抽出した。乾燥させた脂質抽出物を、その後、広範にボルテックスし、３７℃で短時間インキュベートすることにより、ホスホリパーゼ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２＋０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−ＸＩＯＯ）に可溶化し、各抽出物の約半分を清浄な試験管に移した。その後、蒸留水（未処理）、または蒸留水で稀釈した１ ＩＵ／ｍＬ（最終濃度）のストレプトミセス・クロモフスカス ＰＬＤ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ ＰＬＯ）（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）（ＰＬＤ−処理）を、脂質抽出サンプルの各々の添加し、これらを３７℃で６０分間、インキュベートした。その後、放出されたヘッドグループを、本質的にはＦｏｌｃｈ．Ｊ．Ｒｏｌｃｈ，Ｍ．Ｌｅｅｓ，Ｇ．Ｈ．Ｓ．Ｓｔａｎｌｅｙ，「Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６（１９５７）４９７−５０９（本明細書に参考として組み込まれる）の方法に従って、水性相への抽出によりリン脂質と分離した。簡単に言うと、７５μＬ 反応混合物を１．５ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１ 容量：容量）で稀釈し、その後、３００μＬの０．０５Ｍ ＮａＣｌを添加した。その後、上部水性層の一部を回収し、液体シンチレーションスペクトル分析により定量した。この水性層におけるＰＬＤ放出放射活性を、ＰＬＤ処理サンプルに放出された量−対応する未処理サンプルにおいて検出された量として計算した。他の実験では、ＰＧを、上で説明したように薄層クロマトグラフィーによって脂質抽出物から先ず単離し、ヨウ素蒸気で可視化した。クロロホルム／メタノール（２：１ 容量：容量）を使用して薄層プレートからＰＧを抽出し、窒素下で乾燥させた。その後、この単離されたＰＧを可溶化し、細菌性ＰＬＤとともにまたは伴わずにインキュベートし、上のように抽出した。カウンティングのために水性アリコートを除去した後、残りの水性相を吸引し、有機相を窒素下で乾燥させた。その後、この脂質抽出物を薄層クロマトグラフィーによって分離し、サンプル中のＰＧおよびホスファチジン酸を、上のように定量した。
【００７３】
［３Ｈ］グリセロール取り込み
集密１次ケラチノサイトを、３０、６０、９０、１２０、３００または６００秒間、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（さらなるｐＨ緩衝のため）、１μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］グリセロールおよび０．１％ ＤＭＳＯ（対照）または１００ｎＭ ＰＭＡを含有するＳＦＫＭとともにインキュベートした。二価カチオン不含の氷冷リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄することにより、反応を停止させた。その後、これらの細胞を０．３Ｍ ＮａＯＨに可溶化し、この抽出物のアリコートを液体シンチレーションカウンティングに付した。各時点での二重重複サンプルから得られたカウントを平均し、グラフにし、各条件について一次方程式を決定した。得られた相関係数は、典型的に、０．９９以上であった（対照についての平均相関係数は、０．９９２±０．００２であり、ＰＭＡについては、０．９９４±０．００１であった）。多数の実験から得られた傾きを平均し、条件間の有意差について統計解析した。
【００７４】
上で決定したグリセロール取り込みの直線性により、単一の時点での取り込みを測定して、このプロセスに対する他の処理の効果を判定することができる。例えば、集密ケラチノサイトを、３０分間、０．１％ ＤＭＳＯ（対照）または１００ｎＭ ＰＭＡとともにプレインキュベートした後、上のとおりだが５分でのみ、［３Ｈ］グリセロール取り込みを測定した。同様に、ほぼ集密の１次ケラチノサイトを、様々なカルシウム濃度を含有するＳＦＫＭとともに２４時間、インキュベートした後、５分間の放射標識グリセロール取り込みを測定した。
【００７５】
統計解析
平均値間の差の有意性は、プログラム Ｉｎｓｔａｔ（カリフォルニア州、サンディエゴのＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により行う分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて判定した。
【００７６】
結果
ＰＬＤ−２は、インビトロでのホスファチジル基転移反応に第一アルコールとしてグリセロールを利用する（応答の特性付け）
無傷細胞において、ＰＬＤは、ホスファチジン酸を形成するにリン脂質の加水分解ばかりでなく、第一アルコールの存在下、ホスファチジルアルコールを生成させるホスファチジル基転移反応も触媒するユニークな特性を有する。従って、ホスファチジルアルコールの生成は、ＰＬＤ活性の尺度として用いられている。一般には、エタノールまたは１−ブタノールなどの第一アルコールが使用される。これは、細胞によって容易に代謝されない新規ホスファチジルアルコールを生成させるからである。無傷細胞での以前の研究は、生理的第一アルコール、グリセロールも、ホスファチジル基転移反応のための基質としての役割を果たすことができることを示唆していた。ＰＬＤ２過発現Ｓｆ９膜を使用して、グリセロールがインビトロでＰＬＤ２のための基質でであるかどうかを調査した。図５Ａに示すように、ＰＬＤ２は、グリセロールの存在下、ホスファチジルコリンからのＰＧの形成を触媒した。この形成は、この反応混合物中のグリセロールの濃度に依存し（図５Ａ）、添加するＰＬＤ２の量およびインキュベーション時間にも依存した（データは示さない）。さらに、グリセロールは、第一アルコールエタノールと競合して、ホスファチジルエタノールの代わりにＰＧを生成させることができた（図５Ｂ）。ＰＬＤ−Ｉが、グリセロールの存在下、インビトロでＰＧを生成させることも観察された（データは示さない）。
【００７７】
無傷細胞への［３Ｈ］または［１４Ｃ］グリセロールの添加により形成される放射標識ホスファチジルグリセロールの生成は、ケラチノサイトを高いカルシウム濃度に暴露すると増加され、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３処理で減少される
本発明者らは、ケラチノサイト分化剤、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が、２４時間暴露後、ＰＬＤ−Ｉの発現および活性を増加させることを以前に証明した（上で言及したＧｒｉｎｅｒら参照）。この実験では、［３Ｈ］グリセロールの添加前、２４時間にわたって前処理した細胞におけるホスファチジルグリセロールの形成に対する、ケラチノサイトの分化を引き起こす１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３および他の物質、高細胞外カルシウムレベルの効果を調査した。以前の結果に基づき、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、ＰＬＤ−Ｉの活性および発現を刺激する物質であるので、ＰＧの生成を増加させると予想した。意外にも、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３への暴露は、対照細胞を基準にして、放射標識ＰＧの形成を増加させず、実際、むしろ、明らかな減少が観察された（図６）。一方、１２５μＭ カルシウム含有培地での前処理は、その後のＰＧ生成の増加を誘導した（図６）。この結果は、高いカルシウムがＰＬＤの活性化を誘導する可能性、またはグリセロール−３−リン酸をＣＤＰ−ジアシルグリセロールに付加させるメカニズムなどの他の経路がＰＧ合成に関係している可能性を示唆していた。
【００７８】
ＰＧ生産およびグリセロール取り込みに対する高カルシウム濃度の効果は、用量依存的である
高細胞外カルシウムレベルは、ケラチノサイトの様々な分化段階を濃度依存的に誘導する。１００〜１２５μＭの範囲のカルシウム濃度は、ケラチン−１、初期（有棘層）分化のマーカー、の発現を刺激するのに対し、より高い濃度は、後期分化のマーカー、例えばトランスグルタミナーゼ活性、を誘導する。従って、ここでは、ＰＧ生産に対する高細胞外カルシウムレベルの効果の用量依存性を調査した。［２５μＭ（対照）から１ｍＭの範囲にわたる］高細胞外カルシウム濃度に応じてのＰＧ形成は、二相性の用量依存性を示した（図７Ａ）。従って、放射標識ＰＧ形成の最大刺激が、１２５μＭ カルシウムで観察され、カルシウム濃度が高くなるにつれて徐々に低下した。
【００７９】
中間カルシウム濃度がＰＧ形成を最大に刺激できるのは、グリセロール取り込みの増加、ＰＬＤ活性の強化、または両方の結果であり得る。後の放射標識グリセロール取り込みに対する様々なカルシウム濃度でのケラチノサイトの前処理の影響を、説明するとおり判定した。１２５μＭおよび２５０μＭ カルシウム含有培地への事前暴露は、２５μＭ カルシウム対照と比較してグリセロール取り込みの（それぞれ、５６％および４１％の）増加を誘導し、これに対して、５００μＭ カルシウム前処理ケラチノサイトにおけるグリセロール取り込みは、対照値とほぼ同値であった（図７Ｂ）。一方、１ｍＭの濃度は、グリセロール取り込みのわずかではあるが、有意な阻害を（これらの実験において）誘導した。１２５μＭ カルシウム前処理で観察されたグリセロール取り込みの小さな増加が、単独で、放射標識ＰＧ生産の大きな増加の原因である可能性は低く、このことは、ＰＬＤが、中間カルシウム濃度によっても活性化されることを示唆していた。
【００８０】
中間カルシウム濃度がＰＧ合成を刺激できることは、このプロセスが初期分化事象と関係があることを示唆していた。従って、初期分化マーカーケラチン−１（１０ｎＭ）の発現を刺激することもわかっている、中間１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度のＰＧ合成に対する効果を検査した。中間カルシウム濃度での結果とは対照的に、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の濃度は、ＰＧ合成を増加させず、実際、中間濃度と高濃度（２５０ｎＭ）、両方の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が、ＰＧ生成を有意に阻害した（図８）。
【００８１】
無傷細胞における高カルシウム濃度での処理による放射標識ホスファチジルグリセロール形成の増加は、少なくとも一部はＰＬＤによって媒介される
図６Ａにおいて観察されるように、高細胞外カルシウム濃度は、ＰＧの合成ばかりでなく、ホスファチジルコリンおよびホスファジン酸の合成の増加も誘導するようであった。従って、カルシウムは、一般的なリン脂質合成を増進させて、リン脂質のヘッドグループへではなく骨格へのグリセロールの組み込みを刺激した可能性があり、従って、ＰＧ合成増加は、ＰＬＤ活性とは無関係に発生する可能性があった。エタノールおよびグリセロールは、両方とも、ホスファチジル基転移反応のための基質として作用する（図５Ｂ）ので、エタノールを使用して、高細胞外カルシウム濃度により惹起されるＰＧ形成刺激が、ＰＬＤの活性化によって発生するのかどうかを判定した。［１４Ｃ］グリセロールでＰＧ生成を開始させる数分前に１２５μＭ カルシウムで前処理したケラチノサイトに、エタノール（１％）を添加した。図９に示すように、エタノールは、高細胞外カルシウムレベルへの事前暴露により刺激されたＰＧ形成を有意に阻害したが、基礎（対照）ＰＧ生成には影響を及ぼさなかった。グリセロールと競合するエタノールの能力は、すべてではないかもしれないが一部は、高いカルシウム濃度により刺激されたＰＧの形成が、ＰＬＤ活性強化の結果であることを示唆している。
【００８２】
高細胞外カルシウムによって誘導されるＰＧ合成へのＰＬＤの関与を、脂質抽出物および単離されたＰＧから放射標識を放出させる細菌性ＰＬＤの能力によってさらに実証した。これらの実験では、２４時間、１２５μＭ カルシウム含有培地で、またはこれを用いずに細胞を前処理した後、３０分にわたって［１４Ｃ］グリセロールを添加した。その後、脂質抽出物を調製し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００含有緩衝液に可溶化し、１時間、細菌性ＰＬＤとともに、または伴わずにインキュベートした。この細菌性ＰＬＤを用いて、羊水中のホスファチジルグリセロールを、このグリセロールヘッドグループを放出させるこの能力によって定量した。その後、放出されたヘッドグループを、上で説明したようなＦｏｌｃｈ法を用いて水性相に分配した。細菌性ＰＬＤとインキュベートすると、１２５μＭ カルシウム前処理細胞からの［１４Ｃ］グリセロール標識脂質抽出物は、対照前処理細胞からのものの約４倍の量の放射標識を水性画分に放出した（対照：１．００±０．０９；カルシウム：対照レベルに対して４．２±０．４倍；３回の独立した実験からの６つのサンプルの平均±ＳＥＭを表す値でｐ０．００１）。この結果は、ＰＬＤ媒介ホスファチジル基転移反応の増進と一致して、カルシウム暴露につれて、より多くのグリセロールがヘッドグループ位置に組み込まれていったことを示唆している。
【００８３】
対照または高細胞外カルシウムで前処理細胞から単離されたＰＧを用いる類似の実験を図１０に示す。これもまた、細菌性ＰＬＤは、対照細胞からと比較して３倍より多い放射活性を１２５μＭ カルシウム前処理細胞から単離されたＰＧから放出させた（対照：１．００±０．０４；カルシウム：対照レベルに対して３．３±０．５倍；３回の独立した実験からの６つのサンプルの平均±ＳＥＭを表す値でｐ＜０．０１）。これらの細菌性ＰＬＤ処理および未処理ＰＧサンプルの薄層クロマトグラフ分析により、放射標識ＰＧの一部が、放射標識ＰＡに変換されたことを証明した。これは、一部のグリセロールが、リン脂質骨格中に存在することを示唆していた（図１０）。しかし、ＰＧにおいて見出された最初の放射標識の約４０％しか、ＰＡでは回収されず、これは、ＰＧ中の放射標識の約６０％が、ヘッドグループ位置に存在することを示していた。
【００８４】
ホルボールエステルは、ＰＬＤ活性を増大させるが、放射標識ＰＧ形成を増加させない
無傷細胞における持続性ＰＬＤ活性とケラチノサイト分化の両方を誘導することが知られているもう１つの物質は、ホルボールエステル、ＰＭＡである。従って、ＰＧ形成に対するＰＭＡの効果を判定した。実際、ＰＭＡは、［３Ｈ］オレエートを予め標識しておいたものにおける放射標識ホスファチジルエタノールの形成を尺度として用いてモニターしところ、ＰＬＤ活性の大きな増加（ｐ＜０．０２）を刺激した（図１１、左）にもかかわらず、ＰＧ生成の有意な（対応のないスチューデントｔ−検定により、ｐ＜０．０１）減少を惹起した（図１１、右）。放射標識ＰＧ生成を阻害するＰＭＡの能力は、ＰＭＡにより媒介されるグリセロール取り込み減少の結果であり得る。１００ｎＭ ＰＭＡの存在下および不在下での［３Ｈ］グリセロールとケラチノサイトの同時インキュベーションは、１０分にわたって測定したが、グリセロール取り込みに対する有意な効果を惹起しなかった（図１１）。ならびに「方法」および参考文献［２５］における記載のとおり判定して、１．００の対照値に対してＰＭＡの傾き値 ０．９９８±０．００９倍；ｎ＝３）。しかし、５分間の放射標識グリセロールの添加前のビヒクルまたはＰＭＡでの３０分間のケラチノサイトの前処理は、ＰＭＡにより誘導されるグリセロール取り込み減少を生じさせ（図１２）、これは、発現に（１０分より長い）時間を要するグリセロール輸送に対するホルボールエステルの効果を示唆していた。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３がＰＧ形成を増加できないこととともに、これらの結果は、ＰＧの生成が、ＰＬＤ活性化の普遍的で当然な結果ではないことを示唆している。
【００８５】
考察
ＰＬＤに関して、興味深い、有用な発見をした。ホスファチジル基転移反応における新規ホスファチジルアルコールの生成に第一アルコールを利用するこの能力。これらの特性は、ＰＬＤ活性を特異的に測定するためおよびＰＬＤ媒介シグナル生成を阻害するためにシグナル伝達の研究者に利用される。しかし、本データは、ＰＬＤが、非生理アルコールを利用するこの能力を保持するための生理アルコール、グリセロールが存在することを実証している。実際、インビトロ実験において、ＰＬＤ２は、ホスファチジル基転移反応のための基質としてグリセロールを利用できることが実証されている（図５）。さらに、これらの結果は、ホスファチジル基転移反応にグリセロールを利用することにより、ＰＬＤが、潜在的脂質シグナル伝達分子、ＰＧを生じさせることを実証している。
【００８６】
ＰＬＤ−２がホスファチジル基転移反応に第一生理アルコールとしてグリセロールを利用する推論されるメカニズムの１つは、ＰＬＤ−２が共局在し、グリセロールを取り込むメカニズムである。実際、以前の研究において、本開示の発明者らは、ＰＬＤ２が、カベオリンリッチな膜マイクロドメインにアクアポリン−３と共在することを発見した（上で言及したＺｈａｎｇ ａｎｄ Ｂｏｌｌａｇ（２００３）参照）。アクアポリン−３タンパク質発現が、表皮の基底層に局在することは証明されている。この結果と一致して、分化剤、高細胞外カルシウム濃度および１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３で１次ケラチノサイトを刺激するとアクアポリン−３ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現が減少することを研究により証明した。この発現減少が、また、阻害作用をもたらし、高細胞外カルシウム濃度と１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の両方が、放射標識グリセロール取り込みを減少させた。しかし、これら２つの物質による阻害に有意な差はなく、これは、放射標識ＰＧ生成に対するこれらの本質的に異なる効果が、放射標識グリセロールの取り込みを阻害するこれらの能力の差によるものでないことを示唆していた。一方、１２５μＭ カルシウムが、ＰＧ生成の最大増加を引き起こすことができるのは、これが、ＰＬＤ活性を刺激し、グリセロール取り込みを阻害しない結果である可能性が高い（実際、この濃度のカルシウムでの前処理は、グリセロール取り込みを刺激した）。より高いカルシウム濃度によるグリセロール取り込みの阻害によって、様々なカルシウム濃度に応じて観察された二相性ＰＧ生産が説明される（図７）。興味深いことに、ＰＭＡもグリセロール取り込みを阻害した（図１２）。これは、ＰＫＣが、アクアポリン−４について観察されたようにアクアポリン−３機能を調節するという考えと一致する。高カルシウム濃度が、ＰＫＣ活性を刺激することも報告されており、これは、高カルシウムレベルがグリセロール取り込みに影響を及ぼすメカニズムと言ってもよかろう。
【００８７】
高細胞外カルシウム濃度がＰＧ生成を刺激できるのに対し、追加のケラチノサイト分化剤、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３およびＰＭＡができないということは、これら３つの物質が分化応答を引き起こすメカニズム関する重要な相違を示唆している。従って、最高細胞外カルシウムおよび１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度は、これら２つの物質が完全に共通の経路を利用する場合に予想されるような付加的未満にではなく、相乗的に作用して、ケラチノサイト分化の様々なマーカーを増加させる。加えて、ＰＭＡは、後期（顆粒層）分化の誘導に準じたケラチノサイトの変化を生じさせることが知られており、実際、高細胞外カルシウムおよび１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３レベルの効果とは対照的に、初期分化のマーカーを阻害する。外因性（細菌性）ＰＬＤは、ケラチノサイト分化を誘導することができ、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、ＰＬＤ−Ｉの発現および活性を誘導させるという発見に基づき、ＰＬＤ−Ｉは、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により誘導されるケラチノサイトの後期分化を少なくとも一部は媒介することを提案した。一方、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、ＰＧの形成を増進せず（図６および８）、ＰＭＡもしない（図１１）。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が、ＰＬＤ−２の発現を増加させないこと、およびＰＭＡが、ＰＬＤ−２より大きな程度にＰＬＤ−１を活性化すると報告されていることから、グリセロールへの暴露に基づくケラチノサイトにおける放射標識ＰＧの生成は、ＰＬＤ−２活性化の尺度になり得る。従って、このアッセイは、両方のＰＬＤアイソフォームをプロセッシングする無傷細胞系において、ただ１つのＰＬＤ、ＰＬＤ−２の活性をモニターする方法となる。
【００８８】
これらの研究の興味深い態様は、放射標識グリセロールを付加させたときに観察される、ホスファチジルコリンおよびホスファチジン酸の形成であった。ＰＧでは、グリセロールが、ホスファチジル基転移反応において、おそらく、少なくとも一部はヘッドグループとして組み込まれる。この組み込みをエタノールによって阻害することができるからである（図９）。実際、細菌性ＰＬＤを利用してリン脂質ヘッドグループを放出させるインビトロ実験は、高細胞外カルシウム前処理が、ヘッドグループ位置へのグリセロールの組み込みを増進することを示した（図１０）。ホスファチジルコリンおよびホスファチジン酸において、グリセロールは、グリセロール骨格としてリン脂質に組み込まれる可能性が最も高い。グリセロールに対するグリセロールキナーゼの作用によって生じる、グリセロール３−リン酸への２つの脂肪酸の付加（脂肪−アシルＣｏＡ経由）によって、ホスファチジン酸が新たに形成され、脱リン酸化ホスファチジン酸（ジアシルグリセロール）へのコリンのその後の付加（ＣＤＰ−コリン経由）によって、ホスファチジルコリンを生成する。放射標識グリセロールを合計３０分間しか付加させなかったので、この結果は、急速で能動的なリン脂質合成を示唆していよう。この考えは、皮膚の水透過性バリアを形成するための脂質の生成におけるケラチノサイトの役割と一致する。放射標識グリセロールが、ＰＧの骨格にも組み込まれ、これが、放射標識ＰＧ形成の増加の原因の一部であることも明らかになった。従って、この結果は、ＰＧ合成が、少なくとも２つ方法（ＰＬＤ媒介ホスファチジル基転移反応による方法、ならびにＣＤＰ−ジアシルグリセロールへのグリセロール−３−リン酸の付加およびその後のリン酸基除去という、より伝統的な経路による方法）で発生し得ることを追認する。
【００８９】
ケラチノサイトにおけるＰＧの役割については、幾つかの可能性が存在する。皮膚の基底層へのグリセロール輸送性アクアポリン−３の局在に基づき、このシグナル伝達経路が増殖能力またはおそらく初期分化事象において機能すると予想することができよう。この考えは、放射標識ＰＧ生成が、ケラチン−１（初期分化のマーカー）のほぼ最大の発現を誘導することがわかっている中間カルシウム濃度（１２５μＭ；図７）によって最大に刺激されるという観察結果と一致する。このような解釈は、ＰＫＣ−βｕｅ−媒介有糸分裂進行におけるＰＧの一定の役割を示すデータによっても支持される。以前の研究は、マウスケラチノサイトのノーザン分析によりＰＫＣ−βの検出可能な発現がなかったと報告しているが、マウスとヒトの両方における他の研究は、ケラチノサイトにおけるこのアイソフォームの発現を示唆していた。一方、アクアポリン−３ヌルマウス突然変異体の最近の作製および初期特性付けは、正常な皮膚生理に対するこのアクアグリセロポリンの重要性を示唆している。これらのヌルマウスは、乾燥皮膚の皮膚表現型および変化した保水能力を示した。加えて、表皮からこの水不透過性外層（角質層）が剥がれることによる水分の吸収が、アクアポリン−３ヌルマウスでは異常であり、これは、この水分補給能力を阻害する、表皮構造の一部の態様の変化を示唆している。この結果に基づき、アクアポリン−３ヌルマウスにおけるＰＧ形成の減少によってケラチノサイトの成長および／または分化に欠陥が生じ、その結果、これらの突然変異体では異常な皮膚生理が観察されるのだと考えられる。
【実施例２】
【００９０】
本実施例では、酸感受性アクアグリセロポリンを通して進入するグリセロールが、ＰＧを形成するためにＰＬＤに利用されることを実証する、ケラチノサイトにおけるＰＬＤ２／ＡＱＰ３／グリセロール／ＰＧモジュールについてのさらなる証拠を提供する。一過性共形質移入試験において、ケラチノサイト増殖または分化状態のマーカーのプロモーターがルシフェラーゼ発現を発動するレポーター構築物と、ＡＱＰ３を共発現させた。これらの試験は、ＡＱＰ３の共発現が、ケラチン５（基底、増殖性ケラチノサイトのマーカー）のプロモーター活性を阻害し、ケラチン１０（初期ケラチノサイト分化のマーカー）のプロモーター活性を増大させ、ならびにインボルクリン（中期分化のマーカー）のプロモーター活性に対する高細胞外カルシウムレベルの効果を強化したことを示した。グリセロールおよび１，２−プロピレングリコール（３番の末端炭素上のヒドロキシル基が１個ないグリセロール）は、低カルシウム濃度（２５μＭ）においても、中間カルシウム濃度（１２５μＭ）においても、用量依存的にＤＮＡ合成を阻害し、これに対して等価濃度の浸透活性物質、キシリトールおよびソルビトールは、ほとんどまたは全く効果がなかった。ＰＧリポソームの直接供給によっても、急速分裂性ケラチノサイトにおけるＤＮＡ合成が用量依存的に阻害されたが、成長阻害細胞では、ＰＧリポソームにより、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みが用量依存的に増進された。ＰＧリポソームがトランスグルタミナーゼ活性を刺激する傾向も観察された。これらのデータが、ＡＱＰ３、ＰＬＤ２、グリセロールおよびＰＧから成り、ならびに増殖性ケラチノサイトの成長阻害および／または初期分化の促進に関与する、シグナル伝達モジュールのアイデアを支持している。
【００９１】
実験手順
ケラチノサイト調製および細胞培養
ケラチノサイトは、ＩＣＲ ＣＤ−Ｉ 非近交系交配マウスから、研究機関内動物管理使用委員会（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認されたプロトコルに従って調整した。簡単に言うと、皮膚を回収し、一晩、０．２５％ トリプシン中、４℃でインキュベートした。表皮と真皮を分離し、基底ケラチノサイトをこの表皮の下側からかき落とした。遠心分離により細胞を回収し、Ｄｏｄｄ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｉｓｔｉｃｈ，Ｖ．Ｌ．，Ｒａｙ，Ｓ．，Ｌｏｂｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｂｏｌｌａｇ，Ｗ．Ｂ．（Ｉｎ ｐｒｅｓｓ）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ（本明細書に参考として組み込まれる）に記載されているようなプレーティング培地中で一晩、９５％ 空気／５％ 二酸化炭素の雰囲気下、３７℃でインキュベートした。このプレーティング培地を、同じくＤｏｄｄらに記載されているような無血清ケラチノサイト培地（ＳＦＫＭ）に替え、使用するまで１〜２日ごとに新たな培地を細胞に供給した。
【００９２】
［３Ｈ］グリセロール取り込みアッセイ
ほぼ集密のケラチノサイト培養物を、ＳＦＫＭ（２５μＭ カルシウム）、または１２５μＭ カルシウムを含有するＳＦＫＭ（１２５μＭ Ｃａ２＋−ＳＦＫＭ）中で２４時間、インキュベートし、Ｚｈｅｎｇ ＆ Ｂｏｌｌａｇ（２００３）に以前に記載されたとおりグリセロール取り込みアッセイを行った。簡単に言うと、細胞を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（さらなるｐＨ緩衝のため）および１μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］グリセロールを含有するＳＦＫＭとともに、５分間［この時点が、［３Ｈ］グリセロール取り込みの線形範囲内にあることが以前に証明されている（Ｚｈｅｎｇ ＆ Ｂｏｌｌａｇ（２００３））ので］、インキュベートした。二価カチオン不含の氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−）での３回の迅速な洗浄により反応を停止させた。その後、これらの細胞を０．３Ｍ ＮａＯＨに可溶化し、［３Ｈ］グリセロール取り込みを液体シンチレーションスペクトル分析により定量した。
【００９３】
ＰＧ合成
ほぼ集密のケラチノサイトを、ＳＦＫＭ（２５μＭ カルシウム）、または１２５μＭ カルシウムを含有するＳＦＫＭ（１２５μＭ Ｃａ２＋−ＳＦＫＭ）中で２４時間、インキュベートした後、０．５から１μＣｉ／ｍＬ ［１４Ｃ］グリセロールを１０分にわたって添加し、ＰＧ合成を［６］におけるがごとく判定した。簡単に言うと、放射標識ＰＧをクロロホルム／メタノールに抽出し、Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．，Ｒａｙ，Ｓ．ａｎｄ Ｂｏｌｌａｇ，Ｗ．Ｂ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１６４３，２５−３６（本明細書の参考として援用されている）に記載されているとおりシリカゲル６０プレートでの薄層クロマトグラフィーによって分離した。
【００９４】
共形質移入分析
共形質移入実験は、ｐｃＤＮＡ３空ベクターまたはＡＱＰ３をプロセッシングする構築物を１ｎｇ、ケラチン５、ケラチン１０またはインボルクリンのプロモーターがルシフェラーゼの発現を発動するレポーター構築物のうちの１つを１ｎｇ、および形質移入効率を正常化するためのｐＲＬ−ＳＶ４０ コントロールベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｋｉｔに含まれているもの）を０．２５ｎｇ使用して行った。ケラチン５およびケラチン１０プロモーター−ルシフェラーゼ構築物は、Ｄｒ．Ｂｏｇｉ Ａｎｄｅｒｓｅｎ（カリフォルニア州、アーヴィンのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって提供され、インボルクリンプロモーター−ルシフェラーゼ構築物は、Ｄｒ．Ｄａｎｉｅｌ Ｂｉｋｌｅ（カリフォルニア州、サンフランシスコのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって提供された。ＴｒａｎｓＩｔＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅをこの製造業者の説示に従って使用して、亜集密（約３０％）ケラチノサイトをトランスフェクトした。２４時間後、２５μＭ（対照）または１ｍＭ−Ｃａ２＋を含有する培地をさらに２４時間にわたって細胞に供給した。その後、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ウィスコンシン州、マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）をこの製造業者による指図どおりに使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００９５】
ＤＮＡ合成のアッセイ
上述のＧｒｉｎｅｒらの以前の記載のとおり、ＤＮＡ合成の尺度としてＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みを判定した。ほぼ集密のケラチノサイト培養物を、示した添加物を含有するＳＦＫＭ中で２４時間、インキュベートした。ＳＦＫＮ中の乾燥ＰＧのバス超音波処理（ｂａｔｈ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）により調製したリポソームの形態でＰＧを添加して、２ｍｇ／ｍＬの原液を作った。その後、１μＣｉ／ｍＬの最終濃度で［３Ｈ］チミジンを細胞に添加して、さらに１時間、インキュベートした。ＰＢＳ−での洗浄により反応を停止させ、氷冷５％トリクロロ酢酸で高分子を沈殿させた。細胞を０．３Ｍ ＮａＯＨに可溶化し、ＤＮＡに組み込まれた放射活性を液体シンチレーションスペクトル分析によって定量した。
【００９６】
トランスグルタミナーゼアッセイ
ケラチノサイトをＰＧリポソームで処理し、かき落とすことで回収し、均質化用緩衝液中で遠心分離し、１回の冷凍解凍サイクル後に超音波処理により溶解させた。これらの破壊細胞におけるトランスグルタミナーゼ活性を、Ｂｏｌｌａｇ，Ｗ．Ｂ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｘ．，Ｄｏｄｄ，Ｍ．Ｅ．，Ｈａｒｄｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．ａｎｄ Ａｌｌｒｅｄ，Ｗ．Ｔ．（２００５）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，３１２，１２２３−１２３１（本明細書に参考として組み込まれる）に記載されているとおり、ジメチル化カゼインに架橋した［３Ｈ］プトレッシンの量としてモニターした。架橋したプトレッシン−カゼインをトリクロロ酢酸で沈殿させ、濾過によって回収した。データを各サンプル中のタンパク質の量に対して正規化し、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いるＢｉｏｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙを使用して判定し、適切な対照を基準にして表した。
【００９７】
統計
実験は、指示どおり最低３回は行った。Ｉｎｓｔａｔ（カリフォルニア州、サンディエゴのＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎｎ−Ｋｅｕｌｓ 多重比較検定での分散分析（ＡＮＯＶＡ）により、値の統計学的有意性を分析した。
【００９８】
結果
酸性培地でのグリセロール取り込みの阻害は、ＰＧ合成を阻害する
上で論じたように、本発明者らは、ＰＬＤ２およびＡＱＰ３が、ケラチノサイト中のカベオリンリッチな膜マイクロドメインに局在することを以前に示した。加えて、示したように、ＰＬＤ媒介ＰＧ合成は、ケラチノサイト中の高細胞外カルシウムレベルによって刺激され、ならびにＰＧを生成するホスファチジル基転移反応のために、ＡＱＰ３が、ＰＬＤ２にグリセロールを供給するようである。肺細胞ＡＱＰ３は、酸性培地によって阻害されるので、低ｐＨの培地がグリセロール取り込みおよびＰＧ合成を阻害するかどうかを調査した。ケラチノサイトを、対照ＳＦＫＭ（２５μＭ Ｃａ２＋）、または１２５μＭ Ｃａ２＋を含有するＳＦＫＭとともに２４時間、インキュベートした後、ｐＨ４または７．４のＳＦＫＭ中での［３Ｈ］グリセロール取り込みおよび［１４Ｃ］ＰＧ生成を測定した。図１３Ａに示すように、１２５μＭ Ｃａ２＋は、対照培地におけるグリセロール取り込みを有意に刺激した。低ｐＨ培地は、基底条件下でも、中間カルシウム濃度で刺激したときも、グリセロール取り込みを有意に阻害した（図１３Ａ）。同様に、ｐＨ４培地は、対照培地とともにインキュベートした細胞においても、１２５μＭ Ｃａ２＋培地とともにインキュベートした細胞においても、［１４Ｃ］グリセロールとの１０分のインキュベーション後、放射標識ＰＧ合成を有意に阻害した（図１３Ｂ）。ｐＨ４培地によるグリセロール取り込みおよび／またはＰＧ生産の阻害が毒性と関係しないことを保障するために、一部の細胞は、ｐＨ４培地との５分間のプレインキュベーションも行い、その後、対照ｐＨ７．４培地中でのグリセロール取り込みまたはＰＧ合成を測定した（ｐＨ４／７）。ｐＨ４培地とのプレインキュベーションは、グリセロール取り込みまたはＰＧ生成に対して本質的に効果がなかった（図１３）。
【００９９】
ＡＱＰ３の共発現は、ケラチン５プロモーター活性を阻害し、ケラチン１０プロモーター活性を刺激し、インボルクリンプロモーター活性に対する高細胞外カルシウムレベルの効果を強化する
１次マウス表皮ケラチノサイトは、高効率でトランスフェクトすることが難しい場合がある。この限界を克服するために、細胞を、ＡＱＰ３または空ベクターと、Ｄｏｄｄらが記載したようなケラチノサイト増殖または分化マーカーのプロモーターがルシフェラーゼ発現を制御するレポーター構築物とでコ・トランスフェクトした。トランフェクション前にベクターを入念に混合するので、１つのベクターを取り込む細胞が、他のベクターを受け入れることができ、その結果、ＡＱＰ３または空ベクターも有する細胞のみのレポータールシフェラーゼ活性を測定することができる。ケラチン５発現は、基底増殖性ケラチノサイトの特徴であるのに対し、ケラチン１０およびインボルクリンは、分化性有棘細胞の特色であり、ケラチン１０は、初期分化マーカーとしておよびインボルクリンは、中間分化のマーカーとしての役割を果たす。図１４Ａは、基底条件下の、および分化剤（１ｍＭ カルシウム）とともに２４時間インキュベートした後の、ケラチン５プロモーターに対するＡＱＰ３共発現の効果を説明する図である。ＡＱＰ３共発現は、ケラチン５プロモーター活性の（空ベクターでトランスフェクトされた対照の４９±１２％への）有意な減少を誘導した。カルシウム（１ｍＭ）もケラチン５プロモーターを（６４％）阻害し、ＡＱＰ３共発現の有意なさらなる効果はなかった。一方、ＡＱＰ３共発現は、ケラチン１０プロモーター活性を刺激した（図１４Ｂ）。１ｍＭ カルシウムでの処理は、ケラチン１０の発現を２２％阻害し、この効果は、ＡＱＰ３共発現によって、一部、くつがえされた。分化剤として、１ｍＭ カルシウムは、ケラチノサイト１０プロモーター活性を増大させると予想されるが、このような高いカルシウム濃度は、ケラチンを後期分化に駆り立て、実際には初期分化マーカーの発現を減少させる。最後に、ＡＱＰ３共発現は、インボルクリンプロモーターのみに対しては有意な効果はなかったが、１ｍＭ カルシウムにより誘導された刺激を強化した（図１４Ｃ）。これらの結果は、ＡＱＰ３共発現が初期ケラチノサイト分化を促進することと一致する。
【０１００】
グリセロールおよび１，２−プロピレングリコールはＤＮＡ合成を阻害するが、キシリトールおよびソルビトールはしない
ＡＱＰ３およびＰＬＤ２は、ＰＧを生成させるためのホスファチジル基転移反応においてＰＬＤ２が使用するグリセロールを提供するために共局在するようであり、その後、このＰＧが、初期ケラチノサイト分化を促進するように作用する。これは、ＡＱＰ３チャネルを通したグリセロールの送達の増加も、初期分化を引き起こすことができることを示唆している。初期分化の第一の顕著な特徴の１つが、細胞周期からの退出およびＤＮＡ合成の減少であるので、ＤＮＡ合成の尺度であるＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みに対する（このチャネルを通るフラックスを増す）外因性グリセロールの効果を調査した。図１５Ａに示すように、０．０２％のような低いグリセロール濃度（＝２．７３ｍＭ）が、ケラチノサイトＤＮＡ合成を有意に阻害した。より高いグリセロール濃度の効果も調査した。しかし、浸透ストレスがケラチノサイト機能を調整するので、グリセロール等価濃度の２つの他の浸透圧調整剤（キシリトールおよびソルビトール）の任意の浸透効果に対する制御も、対照として用いた。図１５Ｂに示すように、０．１から１％の濃度のグリセロールは、ＤＮＡ合成を阻害し、１２５μＭ Ｃａ２＋の阻害効果を強化した。一方、キシリトールは、基底または１２５μＭ Ｃａ２＋阻害ＤＮＡ合成に対して有意な効果を有さなかった。同様に、対照に対しても、１２５μＭ Ｃａ２＋によって低減されるＤＮＡへの［３Ｈ］チミジンの組み込みに対しても、有意な効果が観察されなかった（図１５Ｃ）。
【０１０１】
ＡＱＰ３ヌル突然変異マウスの試験において、グリセロールは、このノックアウトモデルの表皮表現型を修正することができたが、キシリトールまたは１，２−プロピレングリコール（または１，３−プロピレングリコール）は、できなかった。従って、１，２−プロピレングリコールを、基本的に、および１２５μＭ Ｃａ２＋での分化時に、ＤＮＡ合成を阻害するこの能力についても検査した。１，２−プロピレングリコールの効果は、グリセロールのものと類似しており、対照（２５μＭ Ｃａ２＋）条件下でおよび１２５μＭ Ｃａ２＋での分化時に［３Ｈ］チミジンの用量依存的阻害を示した。グリセロールおよび１，２−プロピレングリコールの類似性の証拠となるこれらの構造も、図１６Ｂに示す。
【０１０２】
ＰＧリポソームは、急速分裂性ケラチノサイトにおけるＤＮＡ合成を阻害し、トランスグルタミナーゼ活性を刺激する
さらに、ＰＧそれ自体の直接供給も初期分化を引き起こすと考えられる。リポソームの形態のＰＧをケラチノサイトに直接供給することにより、高増殖性細胞におけるＤＮＡ合成が阻害されることが判明した（図１７Ａ）。最大阻害は２５μｇ／ｍＬで観察され、５０〜１００μｇ／ｍＬはプラトーであった。細胞死の特徴である形態学的変化が観察されなかった（データは示さない）ので、この効果が毒性を意味する可能性は低い。加えて、ＰＧリポソームは、トランスグルタミナーゼ活性（後期ケラチノサイト分化のマーカー）増加方向の用量依存的傾向を誘導した（図１７Ｂ）。
【０１０３】
ＰＧリポソームは遅増殖性細胞におけるＤＮＡ合成を刺激する
毒性がないことのさらなる証拠は、おそらく接触阻害の結果として増殖減少を示す、観察されたケラチノサイトに対するＰＧリポソームの効果によって提供される。従って、（対照条件下でのＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みの減少によって示されるような）増殖能力が低下したケラチノサイトにＰＧリポソームを適用した場合、ＤＮＡ合成は、約３５μｇ／ｍＬの濃度で半最大効果および１００μｇ／ｍＬで最大刺激と、用量依存的に刺激された（図１８）。この結果は、急速分裂性細胞の増殖を阻害し、成長が低下した設定では増殖を増加させるケラチノサイトの増殖を正常化する能力をＰＧが有することを示唆している。
【０１０４】
考察
ＰＧを合成するためのホスファチジル基転移反応においてグリセロールを利用するＰＬＤの能力、およびＰＬＤ２とＡＱＰ３との相互作用は、グリセロールがホスファチジル基転移のためにこのアイソエンザイムに到達することができるメカニズムを示唆している。ＡＱＰ３のグリセロール取り込み機能に対するこの阻害は、ＰＧ合成も減少させ得る。図１３は、酸性培地が、１２５μＭ Ｃａ２＋により惹起されるグリセロール取り込みとＰＧ合成の同時減少を誘導することを示している。しかし、他のアクアポリン、例えばアクアポリン−９、は、グリセロールを輸送することができ、ケラチノサイトによって発現されるので、これら他のアクアグリセロポリンも、ケラチノサイトにおけるグリセロール取り込みおよびＰＧ合成に寄与し得る。
【０１０５】
ＰＬＤ２／ＡＱＰ３シグナル伝達モジュールによって合成されるＰＧは、ケラチノサイトおよび表皮機能を調整する脂質メッセンジャーとしての役割を果たすと考えられる。ＡＱＰ３ヌル突然変異マウスは、グリセロールによって修正され得るが、他の浸透活性物質によっては修正されない表皮表現型を示す。本共発現試験は、ＡＱＰ３が、初期ケラチノサイト分化を促進する：ＡＱＰ３が、ケラチン５（基底増殖層のマーカー）のプロモーター活性を低下させることを示唆している（図１４Ａ）。ケラチン５発現のダウンレギュレーションは、有棘層における第一基底上細胞への基底ケラチノサイトの移行の特徴である。ケラチン１０の発現の増加；ＡＱＰ３の共発現によって減少するケラチン１０プロモーター活性も、有棘ケラチノサイトの特徴である（図１４Ｂ）。高いカルシウムレベルは、ケラチノサイトを、初期分化段階を通り過ぎて後期分化段階に進ませることがあり、その結果、ケラチン１０プロモーター活性がわずかに減少する（図１４Ｂ）。ケラチノサイトが、多数の有棘層を通って上に移動するように進むにつれて、インボルクリンを発現し始める。ＡＱＰ３共発現だけでは、インボルクリンプロモーター活性を有意に増大させなかったが、ＡＱＰ３は、この中間分化マーカーのプロモーター活性に対する別の分化剤、高細胞外カルシウム濃度の効果を強化した（図１４Ｃ）。ＡＱＰ３が、これらの様々なマーカーのプロモーター活性に、直接、すなわち、他の転写因子および／またはプロモーターこれら自体との相互作用により、影響を及ぼす可能性は低いようであることに留意しなければならない。むしろ、これらの結果は、初期分化表現型を誘導するＡＱＰ３の発現、ならびに細胞の分化状態がこれらのプロモーターの活性を制御することに準じる。
【０１０６】
グリセロールインフラックスの増加により、ＰＧ合成が促進され、この初期分化表現型が促進される（この主要事象は、成長停止である）と考えられる。実際、グリセロールは、ＤＮＡ合成を阻害し、この阻害は、等価濃度の２つの他の浸透活性化合物（キシリトールおよびソルビトール）によっては再現されなかった（図１５）。これは、この阻害が、浸透圧重量モル濃度の増加の結果ではないことを示唆していた。興味深いことに、１，２−プロピレングリコール（１，２−プロパンジオール）は、ＤＮＡ合成に対してグリセロールと本質的に同じ効果を生じさせた（図１６）。１，２−プロピレングリコールでのホスファチジル基転移によって形成されたリン脂質（末端炭素上のヒドロキシ基がないＰＧ）は、ＰＧエフェクター酵素を活性化するために十分、ＰＧに似ていると考えられる。
【０１０７】
グリセロールが、ＰＧ形成のための基質としての役割を果たすことにより、ケラチノサイト増殖を改変するように機能する場合には、ＰＧの直接供給もＤＮＡ合成を阻害する。実際、（基底条件下でのＤＮＡへの高い［３Ｈ］チミジン組み込みによって判定されるような）急成長細胞の場合、ＰＧは、ＤＮＡ合成を用量依存的に減少させた（図１７）。毒性の形態学的相関現象が観察されなかった（データは示さない）ので、この効果は、非特異的毒性の結果であるようではなかった。加えて、ＰＧ用量の増加によってトランスグルタミナーゼ活性（後期ケラチノサイト分化のマーカー）が刺激される傾向も明らかになった。しかし、意外にも、ＤＮＡ合成減少を示したケラチノサイトでは、おそらく接触阻害の結果として、ＰＧは、用量依存的に、ＤＮＡ合成を刺激した（図１８）。この二相性応答のメカニズムは、不明である（しかし、可能性は、下で論じる）が、表皮が高増殖性である場合、ＰＧリポソームはケラチノサイト成長を阻害すると予想され、これに対して増殖が少なすぎる条件下（例えば、老化）ではこれらのリポソームは成長を増進させる。従って、これらの結果は、ＰＧリポソームが、病的条件下においても、生理状態下においても皮膚機能を正常化する理想的な治療法であり得ることを示唆している。
【０１０８】
ＰＧシグナルのエフェクター酵素も不明であるが、可能性としては、ＰＧ感受性プロテインキナーゼ、例えばプロテインキナーゼＣ−ＩＩ、ＰＫＣ−およびＰｋ−Ｐが挙げられる。もしくは、ＰＧを血漿膜および／または特定のマイクロドメインに組み込み、膜タンパク質構築および／またはマイクロドメイン機能に影響を及ぼすことができる。一例として、ＰＧは、青緑色細菌およびホウレンソウのチラコイド膜における光化学系構築に利用される。ＰＧは、カルジオリピン（＝ジホスファチジルグリセロール）の前駆体でもあり、ＰＧおよびカルジオリピンは、両方とも、ミトコンドリア機能において重要である。カルジオリピンは、シトクロムｃに結合し、この脂質の酸化は、ミトコンドリアからシトクロムｃを放出させると考えられ、この事象が、アポトーシスを開始させ得る。加えて、ミトコンドリアを枯渇させたカルジオリピンとＰＧ、両方のインキュベーションは、これらの膜電位を一部保持することができ、これは、シトクロムｃ放出およびアポトーシスに対抗する。実際、ＰＧは、網膜上皮細胞においてアポトーシスを阻害することができる。従って、ＰＧは、プロテインキナーゼ経路の活性化により急速増殖性ケラチノサイトの成長阻害を誘導することができる（図１７Ａにおけるとおり）が、このリン脂質は、ミトコンドリアの機能およびエネルギー生産を向上させることにより、阻害細胞における増殖を促進することができる（図１８におけるとおり）。紫外線への暴露によりＡＱＰ３発現に関して観察されたアップレギュレーションは、ＰＧ生成、ミトコンドリアの健康、および照射のストレスからの回復を促進する細胞の反応であると考えられる。従って、ＡＱＰ３、ＰＬＤ２、グリセロールおよびＰＧから成る新規シグナル伝達モジュールは、皮膚におけるグリセロールの有益な効果についてのメカニズムであると言える。さらに、本結果は、このモジュールが、インビトロおよびインビボでのケラチノサイトの成長および分化の重要な調節因子であり、様々な皮膚の疾患および／または状態のための新規治療法をもたらすことを示している。
【実施例３】
【０１０９】
グリセロールおよびホスファチジルグリセロールは創傷治癒を加速する
本実施例では、ＩＣＲ ＣＤ１マウスにおいて得られた創傷治癒に対するグリセロールおよびホスファチジルグリセロール治療の効果に関する最近のデータを提示する。約４ｍｍの２箇所の全厚皮膚パンチ生検を合計１６匹のマウスの背中において行った。各マウスについて、一方の創傷は、（ａ）治療しなかったか、（ｂ）水中２Ｍのグリセロールで治療、（ｃ）二価カチオン不含の酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−）で治療、または（ｄ）１００μｇ／ｍＬ ホスファチジルグリセロールを含有するＰＢＳ−（超音波処理してリポソームにしたもの）で治療した。その後、創傷治癒率を、デジタル写真およびコンピューター画像分析により、４日間にわたって追跡した。４グループの各々についての１日目を基準にした４日目における創傷治癒のパーセンテージを棒グラフとして図１９に示す。予想どおり、グリセロール治療は、創傷治癒率を向上させた。さらに重要なこととして、ＰＧリポソームも創傷治癒率を上昇させ、この向上は、統計学的に有意であった。これらの結果により、皮膚機能においてＰＧが重要であるという考えが確認される。
【０１１０】
本開示の上記実施形態は、実施の単なる可能例であり、本開示の原理を明瞭に理解するために示すものであることを強調しておく。本開示の精神および原理を実質的に逸脱することなく、本開示の上記実施形態に多くの変形および変更を成すことができる。慣例に従って、このような変更および変形は、ここでは本開示の範囲内に包含され、以下の特許請求の範囲によって保護されると解釈する。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】皮膚の層ならびにケラチノサイトの増殖および分化の段階の説明図である。
【図２】ＰＬＤのホスファチジル基転移反応を説明する図である。水の存在下、ＰＬＤは、リン脂質ホスファチジルコリンの加水分解を触媒して、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびコリンを生じさせる。しかし、少量の第一アルコール、例えばエタノール、１−ブタノールまたはグリセロールの存在下では、ＰＬＤは、ホスファチジル基転移反応を触媒して、対応するホスファチジルアルコールを生成させる。
【図３】調節酵素、シグナル生成酵素およびエフェクター酵素を含む、ＰＬＤシグナル伝達経路を説明する図である。
【図４】ＡＱＰ３−ＰＬＤ２−グリセロール−ホスファチジルグリセロールシグナル伝達モジュールのモデルである。
【図５】グリセロールが、インビトロでのホスファチジル基転移反応においてホスホリパーゼＤの基質としての役割を果たすことを説明する図である。リポソームは、［３Ｈ−ジパルミトイル］ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸から超音波処理によって作製した。１％エタノールの不在（Ａ）または存在（Ｂ）下、示されている濃度のグリセロールをこの反応混合物に添加した。Ｓｆ９ ＰＬＤ２過発現膜（１μｇ タンパク質）の添加により反応を開始させ、３０分間、３７℃でインキュベートし、０．２％ ＳＤＳ（±５ｍＭ ＥＤＴＡ）の添加により停止させた。脂質を抽出し、分離し、定量した。この図は、少なくとも２つの追加実験の代表である。形成されたホスファチジン酸（ＰＡ）、ＰＧおよびホスファチジルエタノール（ＰＥｔ）の絶対レベルには、多少の可変性があった。これは、超音波処理中に多層小胞が形成される程度のばらつきに起因する可能性が高い。
【図６】ホスファチジルグリセロール形成は、高細胞外カルシウム濃度に暴露された分化性細胞では増加されるが、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３に暴露された分化性細胞ではされないことを実証する図である。ほぼ集密のケラチノサイトを（Ａ）２５μＭ−カルシウム−ＳＦＫＭ含有ビヒクル（Ｃｏｎ；０．０５％ エタノール）、２５０ｎＭ １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｄ３）、または１２５μＭ カルシウム（＋０．０５％ エタノール；Ｃａ２＋）とともに、２４時間、インキュベートした。その後、２．５〜５μＣｉ／ウエル ［３Ｈ］グリセロールをさらに３０分にわたって３７℃で添加した。０．２％ ＳＤＳ（±５ｍＭ ＥＤＴＡ）の添加によって反応を停止させ、リン脂質を抽出し、分離し、定量した。結果は、対照値に対して〜倍と表し、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照に対して、＊ｐ＜０．００１。パネルＢに示す薄層クロマトグラムは、パネルＡにおいて定量した３つの実験の代表である。
【図７】高細胞外カルシウム濃度が、ホスファチジルグリセロールの生成およびより少ない程度ではあるがグリセロールの取り込みを用量依存的に増加させることを示す図である。ほぼ集密のケラチノサイトを、様々な濃度のカルシウムを含有するＳＦＫＭとともに、２４時間インキュベートした。（Ａ）その後、これらの細胞を、さらに３０分間、５μＣｉ／ウエル ［３Ｈ］グリセロールとともにインキュベートした後、０．２％ ＳＤＳ（±５ｍＭ ＥＤＴＡ）で反応を停止させ、放射標識ＰＧを抽出し、分離し、定量した。値は、対照（２５μＭ−カルシウム−ＳＦＫＭ）に対して〜倍と表し、５回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値に対して、＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）様々なカルシウム濃度で２４時間、前処理した後、これらの細胞を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有するＳＦＫＭ中の１μＣｉ／ウエル ［３Ｈ］グリセロールとともに、５分間、インキュベートし、その後、二価カチオン不含の氷冷リン酸緩衝生理食塩水での広範な洗浄によって反応を停止させた。値は、対照（２５μＭ−カルシウム−ＳＦＫＭ）に対して〜倍と表し、５回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値に対して、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図８】中および高濃度の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３に暴露された分化性細胞ではホスファチジルグリセロールの形成が阻害されることを示す棒グラフである。ほぼ集密のケラチノサイトを、０．０５％ エタノール（Ｃｏｎ）、１０ｎＭ １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、または２５０ｎＭ １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｄ３）を含有するＳＦＫＭとともに、２４時間、インキュベートした。その後、２．５〜５μＣｉ／ウエル ［３Ｈ］グリセロールを、さらに３０分にわたって、３７℃で添加した。０．２％ ＳＤＳ（＋５ｍＭ ＥＤＴＡ）の添加により反応を停止させ、「方法」において説明したようにリン脂質を抽出し、分離し、定量して、対照値に対して〜倍と表した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する。；対照に対して、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１。
【図９】細胞外カルシウム濃度により刺激されがホスファチジルグリセロールの形成が、エタノールにより阻害されることを説明する棒グラフである。ほぼ集密のケラチノサイトを、２５μＭ−カルシウム ＳＦＫＭ（対照）または１２５μＭ−カルシウム ＳＦＫＭとともに、２４時間、インキュベートした。その後、これらの細胞を、１％ エタノールの存在下および不在下で、０．５〜１μＣｉ／ウエル ［１４Ｈ］グリセロールとともに、さらに３０分間、インキュベートした。０．２％ ＳＤＳ（±５ｍＭ ＥＤＴＡ）の添加によって反応を停止させ、放射標識ＰＧを抽出し、薄層クロマトグラフィーによって分離し、定量した。値は、対照（エタノール不含）に対して〜倍と表し、４回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照に対して、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、１２５μＭカルシウム ＳＦＫＭのみに対して、○ｐ＜０．０１。
【図１０】細菌性ホスホリパーゼＤによって、対照細胞に対して高濃度の細胞外カルシウムで前処理した細胞から単離されたホスファチジルグリセロールからのほうが、増加した放射標識が放出されたことを示す図である。ほぼ集密のケラチノサイトを、２５μＭ−カルシウム ＳＦＫＭ（対照）または１２５μＭ−カルシウム ＳＦＫＭとともに、２４時間、インキュベートした。その後、これらの細胞を、１μＣｉ／ウエル ［１４Ｃ］グリセロールとともに、さらに３０分間、インキュベートし、その後、これらの脂質をクロロホルム／メタノールに抽出し、薄層クロマトグラフィーによってＰＧを分離した。可溶化後、対照細胞（Ｃｏｎ）または１２５μＭ カルシウム処理細胞（Ｃａ２＋）から単離されたＰＧを、細菌性（ＰＬＤ）とともに、または伴わずに（Ｈ２Ｏ）インキュベートし、薄層クロマトグラフ分離後、ＰＧ中に残存する放射活性（明るい縞模様の棒）およびホスファチジン酸中に残存する放射活性（暗い縞模様の棒）を定量した。値は、３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭを意味する；対応する未処理対照値に対して、＊ｐ＜０．００１、対応する未処理カルシウム処理値対して、○ｐ＜０．００１。
【図１１】ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）は、ＰＬＤを活性化するにもかかわらず、ホスファチジルグリセロールの形成を誘導しないことを示す棒グラフである。ほぼ集密のケラチノサイトを放射標識なしで（ホスファチジルグリセロール生成のため）または２．５μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］オレエートで前標識して（ホスファチジルエタノール形成のため）、２０〜２４時間、インキュベートした。その後、これらの細胞を、［３Ｈ］グリセロールの存在下（ホスファチジルグリセロール生成のため）、または０．５％ エタノールの存在下（ホスファチジルエタノール形成のため）で、ビヒクル（０．０５〜０．１％ ＤＭＳＯ；Ｃｏｎ）または１００ｎＭ ＰＭＡで刺激した。０．２％ ＳＤＳ（±５ｍＭ ＥＤＴＡ）の添加によって反応を停止させ、放射標識ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）またはホスファチジルエタノール（ＰＥｔ）を抽出し、薄層クロマトグラフィーによって分離し、定量した。値は、対照に対して〜倍と表し、二重重複または三重重複で行った３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対応のないスチューデントｔ−検定により、適切な対照に対して、＊ｐ＜０．０２。
【図１２】ＰＭＡとの同時インキュベーションではなく、ＰＭＡでの前処理により、［３Ｈ］グリセロール取り込みが阻害されることを説明する図である。グリセロール取り込みは、ＰＭＡを用いておよび用いずに、前処理または同時に処理した細胞において測定した。「前処理なし」サンプルについては、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］グリセロールおよび０．１％ ＤＭＳＯ（対照）または１００ｎＭ ＰＭＡを含有するＳＦＫＭ中で、５分間、細胞をインキュベートした。「ＰＭＡで３０分の前処理」サンプルについては、集密ケラチノサイトを、０．１％ ＤＭＳＯ（対照）または１００ｎＭ ＰＭＡを含有するＳＦＫＭ中で、３０分間、プレインキュベートした。その後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］グリセロールを含有するＳＦＫＭ中で、５分間、細胞をインキュベートした。サンプルの両方のセットについて、放射標識グリセロールの取り込みを測定した。値は、二重重複または三重重複で行った３回（前処理なし）または５回（３０分の前処理）の独立した実験の平均を意味する；１００％の対照値（点線）に対して、＊ｐ＜０．００１。
【図１３】ｐＨ４の細胞外培地が、放射標識グリセロール取り込み（Ａ）およびＰＧ合成（Ｂ）を阻害することを説明する図である。ケラチノサイトを、対照（２５μＭ Ｃａ２＋）培地（Ｃｏｎ）または１２５μＭ Ｃａ２＋（Ｃａ２＋）含有培地で、２４時間、前処理した。その後、一部の細胞を、５（パネルＡ）分間、ｐＨ４の培地とともにインキュベートし、その後、示されているようにｐＨ４または７（７．４）で、（Ａ）５分間の［３Ｈ］グリセロール取り込みを測定または（Ｂ）１０分間の［１４Ｃ］ＰＧ合成を行った。結果は、二重重複で行った（Ａ）４回または（Ｂ）３回の実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値（ｐＨ７で測定した対照細胞におけるグリセロールの取り込みまたはＰＧ合成）に対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１；ｐＨ７（７．４）で測定したＣａ２＋値に対して、ｔｐ＜０．０１、‖ｐ＜０．００１。［３Ｈ］グリセロール取り込み（パネルＡ）および［１４Ｃ］ＰＧ合成（パネルＢ）に対する低ｐＨの効果が本質的に可逆的であったことに注目すべし（ｐＨ７とｐＨ４／７を比較）。
【図１４】ＡＱＰ３過発現が、ケラチン５プロモーター活性を低下させ、ケラチン１０プロモーター活性を増大させ、ならびにインボルクリンプロモーター活性に対する高［Ｃａ２＋］ｅの効果を強化することを実証する棒グラフである。ＴｒａｎｓＩＴ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅをこの製造業者が説明しているとおりに使用して、１次ケラチノサイトを、ｐｃＤＮＡ３ベクター単独（対照）またはＡＱＰ３を有するこのベクターおよび（Ａ）ケラチン５プロモーター／レポーター遺伝子構築物または（Ｂ）インボルクリンプロモーター／レポーター遺伝子構築物（および正規化のためにｐＲＬ−ＳＶ４０）で、コ・トランスフェクトした。２４時間後、２５μＭ（対照）または１ ＨｉＭ−Ｃａ２＋を含有する培地をさらに２４時間にわたって細胞に供給した。その後、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｋｉｔをこの製造業者が指示しているとおりに使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。活性は、ｐｃＤＮＡ３でトランスフェクトした対照細胞を基準にして示し、三重重複で行った３回の実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照（未処理ｐｃＤＮＡ３ベクター）値に対して、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１；対照条件下、ＡＱＰ３でトランスフェクトした値に対して、ｆｐ０．０１、ｆ†ｐθ ．００１；およびＣａ２＋で処理したｐｃＤＮＡ３ベクター対照値に対して、§ｐ＜０．００１。
【図１５】グリセロールは、ＤＮＡ合成を阻害し、高い細胞外Ｃａ２＋濃度の阻害効果を強化するが、キシリトールおよびソルビトールではしないことを説明する図である。（Ａ）ほぼ集密のケラチノサイトを、２４時間、０．０２または０．１％ グリセロールとともにインキュベートし、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みについての組み込みとして、ＤＮＡ合成を測定した。（Ｂ）ほぼ集密のケラチノサイトを、２５μＭ（対照；白抜きの記号）または１２５μＭ Ｃａ２＋（Ｃａ２＋；黒塗りの記号）を含有するＳＦＫＭ中、示されている濃度のグリセロール（Ｇ、四角）または等価濃度のキシリトール（Ｘ、丸）とともに、２４時間、インキュベートした。（Ｃ）ほぼ集密のケラチノサイトを、２５μＭ（対照；白抜きの記号）または１２５μＭ Ｃａ２＋（Ｃａ２＋；黒塗りの記号）を含有するＳＦＫＭ中、示されている濃度のグリセロール（Ｇ）または等価濃度のソルビトール（Ｓ、三角）とともに、２４時間、インキュベートした。その後、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みを判定した。値は、二重重複で行った４から５回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値に対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；Ｃａ２＋が存在する状態での値のみに対して、ｆｐ＜０．０５。
【図１６】１，２−プロピレングリコール（１，２−プロパンジオール）が、ＤＮＡ合成を阻害し、高い細胞外 Ｃａ２＋濃度の阻害効果を強化することを実証する図である。（Ａ）ほぼ集密のケラチノサイトを、２５μＭ（対照；白抜きの記号）または１２５μＭ Ｃａ２＋（Ｃａ２＋；黒塗りの記号）を含有するＳＦＫＭ中、示されている濃度のグリセロール（Ｇ、四角）または等価濃度の１，２−プロピレングリコール（１，２−プロパンジオール、三角）とともに、２４時間、インキュベートした。その後、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みを、［３］におけるがごとく判定した。値は、二重重複で行った３から５回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値に対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；Ｃａ２＋が存在する状態での値のみに対して、｜ｐ＜０．０５。（Ｂ）グリセロールおよび１，２−プロピレングリコールの構造が、これらの立体配置の類似性の証拠となる。
【図１７】ＰＧリポソームが、増殖性ケラチノサイトにおけるＤＮＡ合成を阻害し、トランスグルタミナーゼ活性を用量依存的に刺激することを説明する図である。（Ａ）ほぼ集密のケラチノサイトを、無血清ケラチノサイト培地中でのＰＧのバス超音波処理により調製した、示されている濃度のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）で、２４時間、処理した。その後、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みを判定した。対照におけるＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みは、８５，５５０±５，７３０ｃｐｍ／ウエルであった。値は、二重重複で行った７から９回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値に対して、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）ほぼ集密のケラチノサイトを、無血清ケラチノサイト培地中でのＰＧのバス超音波処理により調製した、示されている濃度のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）で、２４時間、処理した。その後、トランスグルタミナーゼ活性を判定した。値は、二重重複で行った独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；用量が増すにつれて、有意な刺激の傾向を示した；＊ｐ＜０．０５。
【図１８】ＰＧリポソームが、成長阻害ケラチノサイトにおけるＤＮＡ合成を増加させることを示す図である。集密ケラチノサイトを、無血清ケラチノサイト培地中でのＰＧのバス超音波処理により調製した、示されている濃度のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）で、２４時間、処理した。［３Ｈ］チミジン組み込みを上のとおり判定した。対照条件下でのＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みは、１２，８８０±１，０４０ｃｐｍ／ウエルであった。値は、二重重複で行った３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値に対して、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１。
【図１９】創傷治癒率に対するグリセロールおよびホスファチジルグリセロールの効果を示す棒グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、ケラチノサイト機能を調節するための方法および組成物に関し、より詳細には、ケラチノサイトの増殖および分化を正常化するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、身体の最も大きな器官であり、表皮と真皮から成る。皮膚の最も重要な機能は、不可欠な物理的および水透過性バリアを提供することである。表皮は、分化して機械的および水透過性バリアを生じさせ、従って、陸上生活を可能にする継続再生組織である。このバリアは、異なる表皮層を結果として生じさせる精密に調整されたケラチノサイト分化プログラムにより表皮内で樹立される。表皮の構造は、ケラチノサイトの微調整された増殖−分化間バランスによって維持され、その結果として、基底層、有棘層、顆粒層および角化層から成る多層構造が生じる。
【０００３】
基底膜と接触している最も内側の基底層は、増殖能を有する未分化ケラチノサイトの単層から成る。有棘層は、初期分化段階の非増殖性ケラチノサイトから成り、これらの細胞は、基底上層から外側に向かって移動するにつれて漸進的に成熟していく。有棘層分化後、顆粒層における後期分化、および最も外側の角化層における最終分化と続く（図１参照）。分化に入ると、基底層の細胞は増殖能を失い、最終分化角化層の方へと移動する。高細胞外カルシウムレベル、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３および他の分子に関する熱心な研究およびデータにもかかわらず、ケラチノサイト分化プロセスを開始および調整する正確なメカニズムは、未だ不明である。
【０００４】
適正な層化およびバリア形成の発生には、表皮における分化の精密な調整が重要である。表皮の恒常性は、ひとつには、分化の各段階での正しいケラチノサイトにおける遺伝子の発現を編成することにより維持されている。この分化プログラムの変更により、皮膚疾患、例えば、乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎、皮膚癌（例えば、扁平上皮癌および基底細胞癌）、ならびに無秩序な細胞分裂を特徴とする他の皮膚の状態が生じ得る。
【０００５】
従って、皮膚細胞の増殖シグナルと分化シグナルのバランスのあらゆる混乱により、様々な疾患または他の望ましくない皮膚の状態が生じ得る。ケラチノサイト増殖の過剰な刺激は、高増殖性皮膚状態、例えば、上で述べたもの（すなわち、乾癬および様々な非黒色腫性皮膚癌）をもたらすことがある一方で、ケラチノサイト増殖の刺激不足は、成長が低下した状況、例えば、老化皮膚（皮膚細胞老化）または損傷した皮膚を特徴とする状況をもたらすことがある。従って、ケラチノサイトの増殖の減少および／または阻害に向けた治療は、皮膚細胞の増殖亢進を特徴とする状態の治療に有用である。同様に、ケラチノサイトの増殖を増加させるための治療は、新たな成長が減速している老化または損傷皮膚状態の改善に、および／または創傷治癒の加速に有用である。特に有益な治療は、両方の状態を同時にまたは必要に応じて治療する能力を備えるものであるが、現在利用できるこのような治療はない。
【０００６】
従って、皮膚細胞の増殖過多または増殖不足に関連した状態および／または疾病のための新たなおよび有効な治療が必要とされている。ケラチノサイトの増殖および／または挙動を調節するための方法も必要とされている。特に、ケラチノサイト増殖を正常化するための新たな方法および治療が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
簡単に説明すると、本開示は、ケラチノサイト機能および／または増殖を正常化するための方法および組成物を提供する。本開示の態様は、ケラチノサイト機能の調節、および／またはケラチノサイト中のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のレベルの調節も含む。加えて、本開示は、ケラチノサイト増殖を調節することにより皮膚の状態を治療するための方法および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、ケラチノサイト機能を調節するための本開示の方法の実施形態は、ケラチノサイト中のＰＧまたはこの機能性誘導体の量の変更を含む。他の実施形態としては、ケラチノサイトを、このケラチノサイトにおけるシグナル伝達を調節するために有効量のＰＧまたはこのプロドラッグと接触させることを含む、ケラチノサイト機能の調節方法が挙げられる。ホスファチジン酸およびＰＧ生成の調節方法の実施形態は、ケラチノサイトを非グリセロール系アルコールと接触させることを含む。
【０００９】
さらに、皮膚の状態を治療するための本開示の実施形態は、この皮膚疾患の治療に有効量で、一定量のＰＧ、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグを宿主に投与することを含む。宿主における皮膚の状態を治療する他の実施形態は、宿主ケラチノサイト中のＰＧの量を増加させることを含む。宿主における皮膚の状態の治療方法は、この皮膚の状態の治療に有効量のＰＧを宿主に投与することも含み、この場合、ＰＧは、この皮膚の状態が皮膚細胞の増殖不足を特徴とするときには、皮膚細胞増殖を刺激し、ならびにこの皮膚の状態が皮膚細胞の増殖過多を特徴とするときには、皮膚細胞増殖を阻害する。
【００１０】
宿主におけるケラチノサイト増殖を正常化する方法の実施形態は、一定量のＰＧを宿主に投与することを含み、この場合、ＰＧは、増殖減少状態下ではケラチノサイト増殖を刺激し、ならびにＰＧは、増殖過多状態下ではケラチノサイト増殖を阻害する。本開示は、宿主における創傷治癒の加速方法も提供し、この方法は、宿主ケラチノサイト中のＰＧの量を増加させることを含む。
【００１１】
本開示は、様々な皮膚の状態を治療するための組成物も提供する。本開示の組成物の実施形態としては、皮膚細胞シグナル伝達を調節するために有効量のＰＧ、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグが挙げられる。本開示の組成物の他の実施形態としては、皮膚細胞シグナル伝達を調節するために有効量のＰＧまたはこの機能性誘導体のリポソームが挙げられる。
【００１２】
本開示の他の系、方法、特徴および利点は、以下の図面および詳細な説明の考察をもとに、当業者には明らかになる、またはなってくる。すべてのこのようなさらなる系、方法、特徴および利点は本明細書に含まれ、本開示の範囲内であり、添付の特許請求の範囲により保護されると解釈する。
【００１３】
本開示の多くの側面が以下の図面を参照することにより理解することができる。これら図面における構成要素は必ずしも尺度でなく、むしろ本開示の本質を明確に例示するためにあることが強調される。
【００１４】
本開示の実施形態は、別の指示がない限り、当分野の範囲内である合成有機化学、生化学および分子生物学などの技術を利用する。このような技術は、文献において十分に説明されている。
【００１５】
ここで開示し、特許請求する方法をどのように実施し、組成物および化合物をどのように使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために、以下の実施例を記載する。数（例えば、量、温度など）に関して確実に正確であるように努力したが、多少の間違いおよび逸脱はあると考えなければならない。別の指示がない限り、部は、重量部であり、温度は、℃でのものであり、圧力は、大気圧またはほぼ大気圧である。標準温度および圧は、２０℃で１気圧と定義する。
【００１６】
本開示の実施形態を詳細に説明する前に、他に別の指示がない限り、本開示は、特定の材料、試薬、反応材料または製造プロセスなどに限定されず、従って、変わる場合があることを理解しなければならない。ここで用いる専門用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、限定するためのものではないことも理解しなければならない。本開示において、論理的に可能である場合には、段階を別の順序で実行することもできる。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、この文脈が明確に別様に命じていない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「単数の支持体」への言及は、複数の支持体を含む。本明細書および後続の特許請求の範囲において多数の用語に言及するが、これらは、相反する意図が明らかでない限り、以下の意味を有すると定義する。
【００１８】
定義：
ここで用いる用語「宿主」または「生物」は、ヒトも、哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマなど）も、皮膚の状態／疾病の治療が必要な他の現生種も含む。現生生物は、例えば単個真核細胞ほども単純である場合もあり、哺乳動物ほども複雑である場合もある。さらに、「組成物」は、下で説明するような、１つ以上の化合物を含むことができる。
【００１９】
用語「誘導体」は、開示化合物の加水分解、還元または酸化生成物を含む（しかし、これらに限定されない。）開示化合物の変形を指す。加水分解、還元および酸化反応は、当分野では公知である。
【００２０】
用語「機能性誘導体」は、開示化合物の機能を保持する開示化合物の誘導体を指す。例えば、ＰＧの場合、本開示の文脈でのＰＧの機能性誘導体としては、皮膚細胞のシグナル伝達および／または増殖を調節する効果を有するＰＧの誘導体が挙げられる。本開示におけるＰＧの機能性誘導体の非限定的な例は、プロピレングリコールを使用してホスファチジル基転移反応で形成されたホスファチジルアルコールであり、これは、１つのヒドロキシル基を除きＰＧと同じ化学構造を有し、ＰＧの活性を保持する。
【００２１】
ここで用いる用語「治療有効量」は、ケラチノサイトの増殖過多または増殖不足が直接または間接的な原因となる１つ以上の症状をある程度軽減する投与される化合物の量を指す。ケラチノサイトの増殖過多または増殖不足が直接または間接的な原因となる状態／疾病に関して、治療有効量は、この疾病の素質を有するかもしれないが、この状態／疾病の症状をまだ経験および示していない動物におけるこの状態／疾病の発生の予防（予防的治療）、この状態／疾病の症状の緩和、この状態／疾病の程度の低下、この状態／疾病の安定化（すなわち、悪化させないこと）、この状態／疾病の進展の予防、この状態／疾病の進行の遅延または減速、この状態／疾病状態の改善または軽減、およびこれらの組み合わせの効果を有する量を指す。
【００２２】
「医薬的に許容される塩」は、生物学的有効性および遊離塩基の特性を保持する塩を指し、これらは、無機または有機酸（例えば、限定ではないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、リンゴ酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸およびクエン酸など）との反応によって得られる。
【００２３】
「医薬組成物」は、ここに記載する１つ以上の化合物またはこれらの医薬的に許容される塩と、他の化学成分（例えば、生理学的に許容される担体および賦形剤）との混合物を指す。医薬組成物の１つの目的は、生物への化合物の投与を可能にすることである。
【００２４】
ここで用いる「医薬的に許容される担体」は、生物に対して有意な刺激をもたらさず、投与化合物の生物活性および特性を無くさせない担体または希釈剤を指す。
【００２５】
「賦形剤」は、化合物の投与をさらに助長するために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
ここで用いる「治療する」、「治療すること」および「治療」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本開示の実施形態のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、この状態／疾病の素質を有するかもしれないが、この疾病の症状をまだ経験および示していない動物におけるこの状態／疾病の発生の予防（予防的治療）、この状態／疾病の症状の緩和、この状態／疾病の程度の低下、この状態／疾病の安定化（すなわち、悪化させないこと）、この状態／疾病の進展の予防、この状態／疾病の進行の遅延または減速、この状態／疾病状態の改善または軽減、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「治療する」、「治療すること」および「治療」は、治療を受けなかった場合に期待される生残と比較して生残を延長することも意味する。
【００２７】
用語「プロドラッグ」は、インビボで生物活性形態に変換される物質を指す。プロドラッグは、状況によっては親化合物より投与しやすいことがあるため、多くの場合有用である。これらは、例えば、経口投与により生体利用できるのに対し、親化合物はできない。プロドラッグは、親薬物と比較して、医薬組成物への溶解性が向上している場合もある。プロドラッグは、酵素的プロセスおよび代謝性加水分解を含む様々なメカニズムにより親薬物に変換され得る。Ｈａｒｐｅｒ，ＮＪ．（１９６２）．Ｄｒｕｇ Ｌａｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｊｕｃｋｅｒ，ｅｄ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４：２２１−２９４；Ｍｏｒｏｚｏｗｉｃｈら．（１９７７）．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｔｏ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ｉｎ Ｅ．Ｂ．Ｒｏｃｈｅ ｅｄ．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，ＡＰｈＡ；Ａｃａｄ．Ｐｈａｒｍ．ＳｃＬ；Ｅ．Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，ｅｄ．（１９７７）．Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｈｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＡＰｈＡ；Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ｅｄ．（１９８５）Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｗａｎｇら．（１９９９）Ｐｒｏｄｒｕｇ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ．５（４）：２６５−２８７；Ｐａｕｌｅｔｔｉら．（１９９７）．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ：Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２７：２３５−２５６；Ｍｉｚｅｎら．（１９９８）．Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｅｓｔｅｒｓ ａｓ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｆｏｒ Ｏｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ β−Ｌａｃｔａｍ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．ｌｌ，：３４５−３６５；Ｇａｉｇｎａｕｌｔら．（１９９６）．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ Ｉ． Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｐｒａｃｔ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６７１−６９６；Ｍ．Ａｓｇｈａｒｎｅｊａｄ（２０００）．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｏｒａｌ Ｄｒｕｇ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｖｉａ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｉｎ Ｇ．Ｌ．Ａｍｉｄｏｎ，Ｐ．Ｉ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｅ．Ｍ．Ｔｏｐｐ，Ｅｄｓ．，Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ｐ．１８５−２１８；Ｂａｌａｎｔら．（１９９０）．Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｒｕｇ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｖｉａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｏｕｔｅｓ ｏｆ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．ＤｒｕｇＭｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，１５（２）：１４３−５３；Ｂａｌｉｍａｎｅ ａｎｄ Ｓｉｎｋｏ（１９９９）．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒａｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，３９（ｌ−３）：１８３−２０９；Ｂｒｏｗｎｅ（１９９７）．Ｆｏｓｐｈｅｎｙｔｏｉｎ（Ｃｅｒｅｂｙｘ），Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０（１）：１−１２；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ（１９７９）．Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇｓ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ，Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｃｈｅｍｉ．８６（１）：１−３９；Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ｅｄ．（１９８５）．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｆｌｅｉｓｈｅｒら．（１９９６）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１９（２）：１１５−１３０；Ｆｌｅｉｓｈｅｒら．（１９８５）．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１２：３６０−８１；Ｆａｒｑｕｈａｒ Ｄ．ら．（１９８３）．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｄ．，７２（３）：３２４−３２５；Ｈａｎ，Ｈ．Ｋ．ら．（２０００）．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ．，２（１）：Ｅ６；Ｓａｄｚｕｋａ Ｙ．（２０００）．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｄｒｕｇ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｏ ａｃｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ，Ｃｕｒｒ．ＤｒｕｇＭｅｔａｂ．，１（１）：３１−４８；Ｄ．Ｍ．Ｌａｍｂｅｒｔ（２０００）．Ｒａｔｉｏｎａｌｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄｓ ａｓ ｐｒｏｄｒｕｇ ｃａｒｒｉｅｒｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ＳｃＬ，１１ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１５−２７；Ｗａｎｇ，Ｗ．ら．（１９９９）．Ｐｒｏｄｒｕｇ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇｓ．Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，５（４）：２６５−８７。
【００２８】
ここで用いる用語「局所活性薬剤」は、宿主への適用（接触）部位における薬理応答を惹起する、本開示の組成物を指す。
【００２９】
ここで用いる用語「局所的に」は、皮膚および粘膜細胞および組織の表面への本開示の組成物の適用を指す。
【００３０】
ここで用いる用語「阻害する」および／または「減少させる」は、自然の、期待されるもしくは平均的な状態を基準にして、または現在の状態を基準にして、機能、活性または挙動を直接または間接的に減少させる作用を一般に指す。例えば、ケラチノサイトの増殖を阻害するまたは減少させる何かが、新たなケラチノサイトの成長を停止または減速させることがある。
【００３１】
ここで用いる用語「増加させる」、「強化する」および／または「誘導する」は、一般に、自然の、期待されるもしくは平均的な状態を基準にして、または現在の状態を基準にして、機能または挙動を直接または間接的に改善するまたは増加させる作用を指す。例えば、ケラチノサイトの増殖を増加させるまたは強化する何かが、増殖が減速もしくは停止してしまっているケラチノサイトの増殖を誘導することがあり、または増殖の速度を通常の速度より加速することがある。
【００３２】
本明細書で用いる用語「調節する」、「修飾する」、および／または「調節因子」は、特定の機能または挙動に対する直接または間接的な促進／活性化または干渉／阻害作用を一般に指す。例えば、ケラチノサイト機能の調節因子は、ケラチノサイトの増殖もしくは分化を活性化もしくは増加させることがあり、またはケラチノサイト機能の調節因子は、ケラチノサイトの増殖もしくは分化を阻害することがある。場合により、調節因子は、一定の活性または機能を、この自然な状態を基準にして、または一般に期待される平均的な活性レベルを基準にして、または現在の活性レベルを基準にして、増加および／または減少させることができる。
【００３３】
ここで用いる用語「正常化する」は、２つ以上の活性、機能または状態の間の相対バランスまたは平衡を確立するおよび／または維持する作用を指す。例えば、ケラチノサイトの増殖の正常化は、一般に様々な状態のもとでケラチノサイトの増殖と分化の間の相対バランスを維持することを指す。増殖過多の状態のもとでの正常化は、増殖の減速または阻害を意味する一方で、成長が減速している状態のもとでの正常化は、増殖の誘導または増加を意味する。
【００３４】
ここで用いる用語「発現」は、構造遺伝子によりポリペプチドが生産されるプロセスを指す。これは、転写と翻訳の組み合わせである。従って、ＰＬＤ２またはＡＱＰ３の発現の誘導または増加は、ＰＬＤ２またはＡＱＰ３ポリペプチドの生産の増加または誘導を指し、これは、様々なアプローチ、例えば、このポリペプチドをコードする遺伝子の数を増加させること、（例えば、構成的プロモーターの制御下に遺伝子を置くことにより）この遺伝子の転写を増加させること、もしくはこの遺伝子の翻訳を増加させること、またはこれらのアプローチおよび／もしくは他のアプローチの組み合わせによって行われる。
【００３５】
用語「含む」、「など」、「例えば」などは、具体例としての実施形態を指すためのものであり、本開示の範囲を限定するためのものではない。
【００３６】
考察
ホスホリパーゼＤ
ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）は、成長、分化、小胞輸送および細胞骨格再配列を含む多数の細胞プロセスに関係付けられている脂肪分解酵素である。ＰＬＤは、ホスファチジルコリンの加水分解を触媒して、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびコリンを生じさせる。ＰＡおよびこの代謝産物、ジアシルグリセロールおよびリソホスファチジン酸は、多数の生理事象に関与している。第一アルコールの存在下、ＰＬＤは、ホスファチジル基転移反応を触媒して、ホスファチジルアルコールを生じさせる。このメカニズムに従って、ＰＬＤは、生理的第一アルコールグリセロールの存在下でホスファチジルコリンを代謝して、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を生じさせることができる。ＰＬＤの反応を図２に示す。
【００３７】
哺乳動物ＰＬＤの２つのアイソフォーム、ＰＬＤ１およびＰＬＤ２が、同定されている。ＰＬＤ１は、低い基礎活性を有し、小さなＧタンパク質（Ａｒｆ、ＲｈｏおよびＲａｃ）およびプロテインキナーゼＣによって活性化され、これに対してＰＬＤ２は、インビトロでモニターされた昆虫細胞への形質移入によって証明されるように、構成的活性であるようである。両方のＰＬＯが、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸（ＰＩＰ２）を補因子として利用し、ならびにケラチノサイトにおいて発現されることが証明されている。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、ケラチノサイト分化剤は、ＰＬＤ１の発現を誘導するが、ＰＬＤ２の発現は誘導しない。図３は、ＰＬＤの様々なシグナル伝達経路を説明する図である。ＨａＣａＴ細胞において、ＰＬＤ２は、カベオリンリッチな膜マイクロドメインに位置している。
【００３８】
より詳細に下で論じるように、ＰＬＤ２の位置およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を生産するこの能力が、ＰＬＤ２をケラチノサイトの挙動、特に、ケラチノサイトの増殖および分化を調節するためのシグナル伝達に関する挙動の調節に関与させる。
【００３９】
アクアポリン３
アクアポリンは、小さな膜貫通型水および／またはグリセロールチャネルの一ファミリーである。現在、１１の哺乳動物アクアポリン（ＡＱＰＯ−ＩＯ）が、同定および特性付けされている。これらの構造および機能特性に従って、アクアポリンは、２つのサブグループ（水のみを輸送する「アクアポリン」、および水とグリセロールの両方を輸送することができる「アクアグリセロポリン」）に分けることができる。アクアグリセロポリンサブグループに属するＡＱＰ３は、水の比較的弱い輸送体であるが、グリセロールの有効な輸送体である。ＡＱＰ３は、尿管、消化管および気道ならびに表皮を含む様々な組織からの、腎臓採取細胞、赤血球、樹状細胞および上皮細胞において発現される。表皮、気管および鼻咽頭上皮では、ＡＱＰ３は、表皮の基底細胞中に存在する。
【００４０】
ＡＱＰ３欠失マウスは、グリセロール含量の選択的減少、ならびに水分保持能力低下、表皮に関して、皮膚弾力性減損、角質層剥離後のバリア回復遅延および創傷治癒遅延を示し、これは、ケラチノサイトの増殖および分化の調整におけるＡＱＰ３の一定の役割を示唆している。この表現型は、グリセロールの局所または経口適用により修正できるが、他の浸透活性分子ではできず、これは、この効果が、単にグリセロールの親水特性の作用でないことを示唆している。上で論じたようにＰＧを生成するために用いることができるグリセロールを輸送するＡＱＰ３の能力、および下で論じるこの位置は、ＰＧの生成およびケラチノサイトの機能の調節におけるＡＱＰ３の一定の役割を暗示し、このことは、より詳細に下で論じる。
【００４１】
ＰＬＤ２／ＡＱＰ３／グリセロール／ＰＧ シグナル伝達モジュール
本開示の発明者らは、ケラチノサイトでは、ＡＱＰ３およびＰＬＤ２が、カベオリンリッチな膜マイクロドメインにおいて会合すること、ならびにＡＱＰ３グリセロールチャネルが、正常な表皮機能にとって重要であることを、以前に証明した（Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．ａｎｄ Ｂｏｌｌａｇ，Ｗ．Ｂ．（２００３）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１２１，１４８７−１４９５（これは、本明細書に参考として組み込まれる。））。小窩は、電子顕微鏡により原形質膜における直径５０〜１００ｎｍのフラスコ形陥入として特性付けられている、脂質ラフトマイクロドメインのサブセットである。カベオリン１は、小窩内で同定された最初の構造タンパク質成分であり、機能的に、広範なシグナル伝達プロセスに関係付けられている（Ｓｍａｒｔら、１９９９）。加えて、カベオリン１は、ケラチノサイト内の層状体と会合することが、最近、証明された（Ｓａｎｄｏら、２００３）。
【００４２】
カベオリンリッチな膜マイクロドメインにおけるＰＬＤ２とＡＱＰ３の共在性（ｃｏｌｏｃａｔｉｏｎ）は、ＡＱＰ３が、ＰＧを生成させるホスファチジル基転移反応において用いるためのグリセロールをＰＬＤ２に輸送すること、また、このＰＧが、ケラチノサイト機能を調節するための脂質第二メッセンジャーとして作用することを示唆しており、このことは、下の実施例１および２によってさらに証明する。実際、本明細書中の実施例により、ＡＱＰ３、ＰＬＤ２、グリセロールおよびＰＧから成る新規シグナル伝達モジュールの存在を実証する。
【００４３】
ＰＧリポソームの直接供給により急速分裂性ケラチノサイトにおけるＤＮＡ合成が用量依存的に阻害されたが、成長が阻害された細胞では、ＰＧリポソームによりＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みが用量依存的に強化されたことも、実施例２によって証明する。ＰＧリポソームがトランスグルタミナーゼ活性を刺激する傾向も観察された。これらのデータは、ＡＱＰ３、ＰＬＤ２、グリセロールおよびＰＧから成るシグナル伝達モジュールが、増殖性ケラチノサイトの成長阻害および／または初期分化の促進に関与しており、その結果、ケラチノサイトの挙動および／または増殖を調節するためのメカニズム、ならびにケラチノサイトの増殖の増加または減少を特徴とする様々な皮膚の状態を治療するための方法をもたらすことを支持している。
【００４４】
ケラチノサイトの増殖を調節する方法および皮膚の状態を治療する方法
本開示の実施形態は、ＰＬＤ２／ＡＱＰ３／グリセロール／ＰＧシグナル伝達モジュールの様々な成分の量および／または活性を調節することにより、ケラチノサイト機能、特に増殖、を調節する方法を含む。本開示の一定の実施形態において、ケラチノサイトの増殖は、ケラチノサイトにより生産される、またはケラチノサイトと接触しているＰＧ、またはこの機能性誘導体の量を調節することによって正常化する。本開示の実施形態において、ケラチノサイトと接触している、またはケラチノサイトによって生産されるＰＧの量の調節は、皮膚細胞成長減速または増殖不足状態にある皮膚細胞の増殖を刺激すること、および成長増加または増殖亢進状態にある皮膚細胞の増殖の減少させることによって、ケラチノサイト増殖を正常化する。
【００４５】
ケラチノサイトと接触しているＰＧの量を調節する一部の実施形態は、ケラチノサイトと接触しているＰＧ、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグの量を増加させることを含む。ＰＧの機能性誘導体の例としては、１つのヒドロキシ基をマイナスしたＰＧと同じ構造を有するプロピレングリコールのホスファチジル基転移反応生成物が挙げられるが、これに限定されない。
【００４６】
ケラチノサイトと接触しているＰＧの量を増加させてケラチノサイトの挙動を調節する実施形態は、ケラチノサイト増殖、ケラチノサイト皮膚細胞シグナル伝達および／またはケラチノサイト核酸合成を調節するために有効量のＰＧ、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグとケラチノサイトを接触させることを含む。下の実施例により、ＰＧが、ケラチノサイトにおけるシグナル伝達を調節するように作用し、様々な条件に依存してケラチノサイトにおける核酸合成を増加または減少させることができることを証明する。
【００４７】
本開示の驚くべき、有益な態様は、ＰＧが、ケラチノサイトにおいて二相性作用を示し、成長減速状態、例えば加齢（すなわち、細胞老化）または皮膚細胞傷害、例えば好ましくない状態（例えば、煙、日光、風および極端な温度）への暴露に起因する皮膚細胞障害または物理的傷害（例えば、創傷、やけど、すり傷、瘢痕、潰瘍など）のもとでは増殖のシグナルを誘導し、ならびに乾癬、湿疹、日光性角化症、アトピー性皮膚炎、基底細胞癌および他の非黒色腫性皮膚癌を含む（しかし、これらに限定されない）疾患などにおける増加したまたは過増殖性成長状態のもとでは増殖を阻害または減速するシグナルを誘導することである。従って、ＰＧレベルおよび／もしくは生成を調節することにより、ならびにまたはＰＬＤ２／ＡＱＰ３／グリセロール／ＰＧシグナル伝達モジュールを別様に調節することにより、成長過多状態または成長不足状態を別々に治療するのではなく、これらの状態に同時に対処することができる。
【００４８】
本開示の方法は、ＰＧまたはグリセロールをケラチノサイトまたは宿主に投与することによりＰＧレベルを調節することに限定されず、ケラチノサイトによって生産されるＰＧの量を調節する方法も包含する。ケラチノサイトによって生産されるＰＧの量の調節に関する実施形態は、例えば、ＰＬＤ２および／もしくはＡＱＰ３の活性のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションにより、ならびに／またはケラチノサイトにおけるＰＬＤ２および／もしくはＡＱＰ３の発現を増加または減少させることにより、ホスホリパーゼＤ２（ＰＬＤ２）および／またはアクアポリン−３（ＡＱＰ３）の活性を調節することを含む。ＰＬＤ２またはＡＱＰ３の発現を増加させるための実施形態は、ＰＬＤ２またはＡＱＰ３ポリペプチドの生産の増加または誘導を含み、これは、当業者には公知の様々なアプローチによって行うことができ、この非限定的な例は、下の実施例で開示する。一般に、ＰＬＤ２またはＡＱＰ３の発現を増加させるためのアプローチとしては、（例えば、宿主細胞をこの遺伝子のさらなるコピーでトランスフェクトすることにより、遺伝子療法の当業者には公知の様々な方法により）このポリペプチドをコードする遺伝子の数を増加させること、（例えば、構成的プロモーターの制御下にこの遺伝子を置くことにより）この遺伝子の転写を増加させること、もしくは遺伝子の翻訳を増加させることなどの方法、またはこれらのアプローチおよび／または他のアプローチの組み合わせが挙げられる。
【００４９】
本開示の実施形態は、ケラチノサイトの増殖および／または機能を正常化および／または調節することによる、ケラチノサイトの増殖過多または増殖不足を特徴とする宿主の皮膚の状態／疾患を治療するための方法および組成物も提供する。本開示の方法および組成物により治療することができる皮膚の状態としては、高増殖性疾患、例えば乾癬、湿疹、日光性角化症、アトピー性皮膚炎、基底細胞癌、非黒色腫性皮膚癌、および無秩序な細胞分裂；成長減速状態、例えば、加齢、瘢痕化、皮膚細胞老化、および（例えば、日光、煙、風、および極端な温度などへの）暴露に起因する皮膚障害；ならびに物理的創傷（例えば、裂傷、潰瘍、例えば糖尿病性および加齢性潰瘍、やけど、すり傷など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
上の状態を治療する方法としては、数ある中でも、上で説明したケラチノサイト増殖および／または機能の調節／正規化方法が挙げられる。特に、上の状態を治療するための方法の実施形態は、ケラチノサイト増殖、ケラチノサイト皮膚細胞シグナル伝達および／またはケラチノサイト核酸合成を調節するために有効量のＰＧ、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグを投与することを含む。ケラチノサイトの挙動を調節するためおよび／または皮膚の状態を治療するための本開示の方法は、ＰＧの投与と併用で、下で説明するようにケラチノサイトをグリセロールまたはこの機能性誘導体と接触させて、細胞のＰＧ生産を刺激することも含む。本開示の方法は、より詳細に下で論じるように、非グリセロール系アルコールとケラチノサイトを接触させて、ホスファチジン酸、ＰＡ、ならびにＰＧ生産を調節することも含む。本開示の実施形態は、この必要がある宿主に本開示の医薬組成物を投与することによる、上の状態を治療するならびにケラチノサイトの機能および増殖を調節する方法も含む。本開示の医薬組成物を、より詳細に下で論じる。
【００５１】
医薬組成物
本開示の医薬組成物および剤形の実施形態は、ＰＧ、ＰＧの医薬的に許容される塩もしくはこの機能性誘導体、またはこの医薬的に許容される多形、溶媒和物、水和物、脱水物、共結晶、無水またはその非晶質形態を含む。本開示の医薬組成物の実施形態は、グリセロールまたはこの機能性誘導体も含むことがある。グリセロールは、ＰＧの生成のためにＰＬＤ２の基質として作用するので、グリセロールは、ホスファチジン酸（ＰＡ）をダウンレギュレートするさらなる効果を有し、下の実施例で実証するように、このＰＡも、ケラチノサイトの調節においても一定の役割を果たし得る。プロピレングリコールを含む（しかし、これに限定されない。）グリセロールの機能性誘導体は、ＰＧ機能性誘導体の生成増加においても、ＰＡの生成の下方制御においても、グリセロールと同じまたは同様の効果を有する。
【００５２】
本開示の組成物の他の実施形態は、下の実施例で実証するように、ＰＧとＰＡの両方のＰＬＤ２生成を下方制御するグリセロールの非機能性誘導体、例えば他の第一、非グリセロール系アルコール（例えば、１−ブタノールおよびエタノール）を含むことがある。このような組成物は、所望の効果に依存して、ＰＧを含むこともあり、含まないこともある。非グリセロール系アルコールを含み、ＰＧを含まない組成物は、ＰＡおよびＰＧの生成を阻害する／減少させることができ、一方、非グリセロール系アルコールおよびＰＧを含む組成物は、ＰＡ生産を阻害する／減少させることができ、ならびにケラチノサイトの挙動に対するＰＧ媒介調節を誘導することができる。
【００５３】
医薬組成物および単位剤形は、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤または希釈剤も含む。本活性組成物によってもたらされる利点、例えば、溶解度上昇および／または流動、純度もしくは安定（例えば、吸水）特性向上により（しかし、これに限定されない）、本組成物は、医薬調合物および／または患者への投与に、先行技術より良好に適するものであることができる。
【００５４】
本活性組成物の医薬単位剤形は、患者への局所投与、経皮投与、経口投与、粘膜投与（例えば、経鼻、舌下、経膣、口腔内または直腸内投与）、または非経口投与（例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内もしくはボーラス注射）に適する。剤形の例としては、錠剤；キャプレット；カプセル、例えば、ハードゼラチンカプセルおよびソフトゼラチンカプセル；カシェ剤；トローチ；ロゼンジ；分散液；坐剤；軟膏；ハップ剤（湿布剤）；ペースト；粉末；包帯剤；クリーム；硬膏剤；溶液；パッチ；エーロゾル（例えば、鼻スプレー剤または吸入剤）；ゲル；懸濁剤（例えば、水性または非水性懸濁液、水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョン）、溶液およびエリキシルを含む、患者への経口または粘膜投与に適する液体剤形；患者への非経口投与に適する液体剤形；ならびに再構成して、患者への非経口投与に適する液体剤形を提供することができる滅菌固体（例えば、結晶質または非晶質固体）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
活性組成物の剤形の組成、形状およびタイプは、これらの用途に依存して様々であり得る。例えば、疾病または疾患の急性治療において使用される剤形は、同じ疾病または疾患の慢性治療において使用される剤形より多くの量の活性成分（すなわち、活性組成物）を含有し得る。同様に、非経口剤形は、同じ疾病または疾患を治療するために使用される経口剤形より少ない量の活性成分を含有し得る。これらの方法、および本開示に包含される特定の剤形が互いに異なる他の方法は、当業者には容易にわかる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（１９９０））。
【００５６】
典型的な医薬組成物および剤形は、１つ以上の賦形剤を含むことができる。適する賦形剤は、調剤または医薬分野の当業者には周知である。特定の賦形剤が、医薬組成物または剤形への配合に適するかどうかは、この剤形を患者に投与する方法を含む（しかし、これに限定されない）、当分野では周知の様々な要因に依存する。例えば、錠剤またはカプセルなどの経口剤形は、非経口剤形での使用には適さない賦形剤を含有することがある。個々の賦形剤の適性は、この剤形中の具体的な活性成分にも依存し得る。
【００５７】
本開示は、活性成分が分解する速度を低下させる１つ以上の化合物を含む、医薬組成物および剤形を、さらに包含する。ここでは「安定剤」と呼ぶこのような化合物としては、抗酸化物質、例えばアスコルビン酸、ｐＨ緩衝剤、または塩緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、本開示の医薬組成物または剤形は、１つ以上の溶解度調節剤、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウムもしくはカリウムまたは有機酸、を含有することがある。具体的な溶解度調節剤は、酒石酸である。
【００５８】
賦形剤の量およびタイプと同様に、剤形中の活性成分の量および具体的なタイプは、これを患者に投与する経路、治療すべき状態、宿主のサイズなど（しかし、これらに限定されない）の要因に依存して異なることがある。しかし、本開示の化合物の典型的な剤形は、ＰＧ、この医薬的に許容される塩、または医薬的に許容される多形、溶媒和物、水和物、脱水物、共結晶、無水もしくは非晶質形態を、約０．０５ｍｇから約５０ｍｇの量で、好ましくは、約０．２５ｍｇから約１０ｍｇの量で、およびさらに好ましくは、約０．５ｍｇから５ｍｇの量で含む。
【００５９】
具体例としての実施形態において、ＰＧ、この機能性誘導体、医薬的に許容される塩、またはこのプロドラッグは、リポソームの形態で、場合によっては１つ以上の上記添加剤と混合して、送達することができる。本開示の組成物は、任意の形態で送達することができるが、皮膚疾患の治療には、局所剤形が好ましいだろう。
【００６０】
局所、経皮および粘膜用剤形
本開示の局所剤形としては、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、シャンプー、スプレー剤、エーロゾル、溶液、エマルジョン、および当業者には公知の他の剤形が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）；ａｎｄ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９８５））。噴霧不能局所剤形については、局所適用に適合した担体または１つ以上の賦形剤を含み、好ましくは水より大きい動粘性率を有する、粘性から半固体または固体形態が、一般に利用される。適する調合物としては、所望される場合には、滅菌されているか、様々な特性（例えば、浸透圧など）に影響を及ぼすように助剤（例えば、保存薬、安定剤、湿潤剤、緩衝剤または塩）と混合されている、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、リニメント剤および膏薬などが挙げられるが、これらに限定されない。他の適する局所剤形としては、噴霧可能エーロゾル製剤が挙げられ、この場合、活性成分は、好ましくは固体または液体不活性担体と併わせて、加圧揮発性物質（例えば、ガス状噴射剤、例えばフレオン）との混合物で、またはスクイーズボトルの中にパッケージングされる。所望される場合には、医薬組成物および剤形に、潤い付与剤または保湿剤も添加することができる。このような追加成分の例は、当分野では周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０））。
【００６１】
本活性組成物の経皮および粘膜用剤形としては、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、溶液、エマルジョン、懸濁液、坐剤、点眼剤、パッチ、スプレー剤、エーロゾルまたは当業者には公知の他の剤形が挙げられるが、これらに限定されない｛例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）；ａｎｄ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９８５））。口腔内の粘膜組織を治療するために適する剤形は、マウスウォッシュとして、経口ゲルとして、または口腔内パッチとして調合することができる。さらなる経皮剤形としては、皮膚に貼り、特定の期間にわたって身に着けて所望量の活性成分を浸透させることができる、「レザバー型」または「マトリックス型」パッチが挙げられる。
【００６２】
本開示に包含される経皮および粘膜用剤形をもたらすために使用することができる、適する賦形剤（例えば、担体および希釈剤）および他の材料は、医薬分野の当業者には周知であり、ならびに所与の医薬組成物または剤形が適用されることとなる特定の組織または器官に依存する。非毒性であり、医薬的に許容される剤形を形成することを念頭において、典型的な賦形剤としては、水、リン酸緩衝生理食塩水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱物油、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
治療すべき具体的な組織に依存して、活性組成物の医薬的に許容される塩での治療前に、治療と共に、または治療後に、追加成分を使用してもよい。例えば、浸透向上剤は、組織にまたは組織を横断して活性成分を送達することを助長するために使用することができる。適する浸透向上剤としては、アセトン；様々なアルコール、例えば、エタノール、オレイルおよびテトラヒドロフリルアルコール；アルキルスルホキシド、例えば、ジメチルスルホキシド；ジメチルアセトアミド；ジメチルホルムアミド；ポリエチレングリコール；ピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドン；コリドングレード（ポビドン、ポリビドン）；尿素；ならびに様々な水溶性または水不溶性糖エステル、例えば、ＴＷＥＥＮ ８０（ポリソルベート８０）およびＳＰＡＮ ６０（ソルビタンモノステアラート）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
医薬組成物もしくは剤形のｐＨまたはこの医薬組成物もしくは剤形を適用する組織のｐＨを調整して、活性成分（単数または複数）の送達を向上させることができる。同様に、溶媒担体の極性、このイオン強度または張度を調整して、送達を向上させることもできる。ステアラートなどの化合物を医薬組成物または剤形に追加して、送達を向上させるために有利に活性成分（単数または複数）の親水性または親油性を変えることもできる。これに関して、ステアラートは、この調合物のための脂質ビヒクルとして、乳化剤または界面活性剤として、および送達向上または浸透向上剤としての役割を果たすことができる。活性組成物の医薬的に許容される塩の種々の水和物、脱水物、共結晶、溶媒和物、多形、無水または非晶質形態を用いて、得られる組成物の特性をさらに調整することができる。
【００６５】
以下の図面を参照すると、本開示の多数の態様をより良好に理解できる。これらの図面の構成要素は、必ずしも縮尺で描かれているとは限らず、これよりも、本開示の原理を明瞭に説明することに重きを置いている。
【００６６】
（実施例）
さて、ケラチノサイトの機能および／または増殖を調節および／または正常化するための組成物および方法、ケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールレベルを調節する方法、ならびに皮膚の状態を治療するための方法および組成物の実施形態を一般に説明してきたが、以下の実施例では、ケラチノサイトの機能および／または増殖を調節および／または正常化するための組成物および方法、ケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールレベルを調節する方法、ならびに皮膚の状態を治療するための方法および組成物の一定の実施形態を説明する。実施例１から３ならびに対応する本文および図との関連で、このような実施形態を説明するが、これらの説明に本開示の実施形態を限定する意図はない。これどころか、本意図は、本開示の実施形態の精神および範囲に含まれるすべての代案、変形および等価物を包含することである。
【実施例１】
【００６７】
本実施例では、高細胞外カルシウム濃度へのケラチノサイトの長期暴露が、ＰＬＤ活性を増大させること、および高細胞外カルシウムは、［３Ｈ］または［１４Ｃ］グリセロールで標識した細胞におけるＰＬＤ媒介ホスファチジルグリセロール生成を増加させるが、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３はさせないことの証拠を提供する。慢性的高細胞外カルシウム暴露に基づくホスファチジルグリセロール生成のこの増加は、すべて、グリセロール取り込みの増加の結果というわけではない。加えて、ＰＭＡは、ＰＬＤ活性を増大させるが、ホスファチジルグリセロールの形成を増進しない。（１）ＰＬＤ−１の発現および活性は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３によって増加されるが、ＰＬＤ−２の発現および活性はされず、ならびに（２）ＰＭＡは、ＰＬＤ−２より大きな程度にＰＬＤ−１を活性化するので、これは、グリセロールへの暴露に基づく放射標識ＰＧ生成が、ケラチノサイトにおけるＰＬＤ−２の活性化の尺度であることを示唆している。
【００６８】
実験材料
ＰＬＤ−２を過発現するＳｆ９昆虫細胞から得た膜は、米国、カリフォルニア州のＯｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって提供されたものであった。［３Ｈ］オレイン酸、［３Ｈ−パルミトイル］ホスファチジルコリン、［３Ｈ］グリセロール｛製品が打ち切られたので、３つの異なる形態を使用した。［１，２，３−３Ｈ］グリセロール（２００ｍＣｉ／ｍｍｏｌの相対活性強度）、［１，２，３−３Ｈ］グリセロール（４０〜８０ｍＣｉ／ｍｍｏｌの相対活性強度）および［２−３Ｈ］グリセロール（２００ｍＣｉ／ｍｍｏｌの相対活性強度）｝ならびに［１，３−１４Ｃ］グリセロールは、ＮＥＮ／ＤｕＰｏｎｔ（米国、マサチューセッツ州、ボストン）から入手した。ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ならびにホスファチジルエタノール、ホスファチジン酸およびホスファチジルグリセロールの標準物質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（米国、アラバマ州、アラバスター）から購入した。ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）またはＳｉｇｍａ（米国、ミズーリ州、セントルイス）から入手した。カルシウム不含ＭＥＭおよび抗生物質は、Ｂｉｏｌｏｇｏｓ，Ｉｎｃ．（米国、イリノイ州、Ｍａｐｅｒｖｉｌｌｅ）から購入した。ウシ脳下垂体エキス、表皮成長因子およびＨＥＰＥＳ溶液（１Ｍ、ｐＨ７．４）は、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（米国、ニューヨーク州、グランドアイランド）から入手した。ＩＴＳ＋は、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（米国、マサチューセッツ州、ベッドフォード）によって供給され、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（米国、ジョージア州、アトランタ）がウシ胎仔血清を透析した。濃縮ゾーンを有するＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ ＴＬＣ プレートは、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ（米国、ニュージャージー州、ギブスタウン）から入手した。慣例に従って、他の試薬は、標準的な供給業者から入手し、これらは、入手できる最高グレードのものであった。
【００６９】
ホスファチジルグリセロール形成のインビトロアッセイ
［３Ｈ−パルミトイル］ホスファチジルコリンを基質として用いて、ＰＬＤ−２の活性をインビトロで測定した。Ｒ．Ｄ．Ｇｒｉｎｅｒ，Ｆ．Ｑｉｎ，Ｅ．Ｍ．Ｊｕｎｇ，ＣＫ．Ｓｕｅ−Ｌｉｎｇ，Ｋ．Ｂ．Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｒ．Ｍａｎｎ−Ｂｌａｋｅｎｅｙ，ＲＪ．Ｂｏｌｌａｇ，Ｗ．Ｂ．Ｂｏｌｌａｇ，１，２５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｕｓｅ ｅｐｉｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（１９９９）４６６３−４６７０（本明細書に参考として組み込まれる。）に記載されているように、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸から調製した脂質小胞に、放射標識ホスファチジルコリンを組み込んだ。グリセロールおよび／またはエタノールをこれらのリポソームと併せ、米国、カリフォルニア州、リッチモンドのＯｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって提供されたＰＬＤ−２過発現Ｓｆ９細胞膜の添加により反応を開始させた。その後、３７℃で３０分間、反応を進行させた後、５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．２％ ＳＤＳの添加により反応を停止させた。Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒの方法に従って脂質を抽出し、Ｗ．Ｂ．Ｂｏｌｌａｇ，「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ」，ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１０５（１９９８）１５１−１６０（本明細書に参考として組み込まれる。）に記載されているとおり、放射標識リン脂質を分離し、定量した。
【００７０】
細胞培養
日齢１〜３日の新生子ＩＣＲマウスから、皮膚のトリプシン浮上分離法および表皮と真皮の機械分離後、１次表皮ケラチノサイトを調製した。表皮細胞を擦過により剥離させ、遠心分離により回収し、２５μＭ カルシウム、２％ 透析ウシ胎仔血清、２ｍＭ グルタミン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、ＩＴＳ＋（６．２５μｇ／ｍＬ インスリン＋６．２５μｇ／ｍＬ トランスフェリン＋６．２５ｎｇ／ｍＬ 亜セレン酸＋５．３５μｇ／ｍＬ リノール酸＋１．２５％ ウシ血清アルブミン）、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍＬ フンギゾンを含有するＭＥＭから成る培地中、６ウエルシャーレにプレーティングした。一晩、インキュベートした後、これらの細胞に、２％ 透析ウシ胎仔血清を９０μｇ／ｍＬ ウシ脳下垂体エキスに替えた無血清ケラチノサイト培地（ＳＦＫＭ）を再供給した。１〜３日ごとに新たな培地を細胞に再供給した。
【００７１】
ＰＬＤ活性および［３Ｈ］または［１４Ｃ］ホスファチジルグリセロール形成
ＰＬＤアッセイのために、培養１次ケラチノサイトを、２０〜２４時間、２．５μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］オレイン酸で標識した。その後、０．５％ エタノールの存在下、ビヒクルまたは１００ｎＭ ＰＭＡに、３０分間、これらの細胞を暴露した。放射標識ホスファチジルグリセロールの形成を測定するために、ビヒクル、２５０ｎＭ １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３または１２５μＭ カルシウムを含有するＳＦＫＭで、２４時間、細胞を処理し、その後、さらに３０分間、１〜２．５μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］または０．４〜０．５μＣｉ／ｍＬ ［１４Ｃ］グリセロールで標識した。ＰＧ形成の細胞外カルシウム依存性を調査する実験については、様々なカルシウム濃度を含有するＳＦＫＭ中で、２４時間、細胞をインキュベートした後、３０分にわたって５μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］グリセロールを添加した。場合により、２５μＭ カルシウム（対照）含有または１２５μＭ カルシウム含有ＳＦＫＭで、２４時間、細胞を刺激した後、１％ エタノールが存在するおよび不在の状態の［１４Ｃ］グリセロールを添加した。ＰＭＡに応じてのホスファチジルグリセロール形成を測定するために、未標識細胞を、上のように、放射標識グリセロールの存在下、１００ｎＭ ＰＭＡで刺激した。反応を停止させ、放射標識ホスファチジルアルコールを抽出し、薄層クロマトグラフィーによって分離し、上で言及したＢｏｌｌａｇ（１９９８）による記載のとおりに定量した。
【００７２】
［１４Ｃ］ホスファチジルグリセロールのヘッドグループ位置における放射標識の実証
対照（２５μＭ カルシウム）または１２５μＭ カルシウム含有培地で、２４時間、前処理したケラチノサイトを、さらに３０分間、０．４〜０．５μＣｉ／ｍＬ ［１４Ｃ］グリセロールに暴露した。上で説明したように、脂質をクロロホルム／メタノールに抽出した。乾燥させた脂質抽出物を、その後、広範にボルテックスし、３７℃で短時間インキュベートすることにより、ホスホリパーゼ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２＋０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−ＸＩＯＯ）に可溶化し、各抽出物の約半分を清浄な試験管に移した。その後、蒸留水（未処理）、または蒸留水で稀釈した１ ＩＵ／ｍＬ（最終濃度）のストレプトミセス・クロモフスカス ＰＬＤ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ ＰＬＯ）（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）（ＰＬＤ−処理）を、脂質抽出サンプルの各々の添加し、これらを３７℃で６０分間、インキュベートした。その後、放出されたヘッドグループを、本質的にはＦｏｌｃｈ．Ｊ．Ｒｏｌｃｈ，Ｍ．Ｌｅｅｓ，Ｇ．Ｈ．Ｓ．Ｓｔａｎｌｅｙ，「Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６（１９５７）４９７−５０９（本明細書に参考として組み込まれる）の方法に従って、水性相への抽出によりリン脂質と分離した。簡単に言うと、７５μＬ 反応混合物を１．５ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１ 容量：容量）で稀釈し、その後、３００μＬの０．０５Ｍ ＮａＣｌを添加した。その後、上部水性層の一部を回収し、液体シンチレーションスペクトル分析により定量した。この水性層におけるＰＬＤ放出放射活性を、ＰＬＤ処理サンプルに放出された量−対応する未処理サンプルにおいて検出された量として計算した。他の実験では、ＰＧを、上で説明したように薄層クロマトグラフィーによって脂質抽出物から先ず単離し、ヨウ素蒸気で可視化した。クロロホルム／メタノール（２：１ 容量：容量）を使用して薄層プレートからＰＧを抽出し、窒素下で乾燥させた。その後、この単離されたＰＧを可溶化し、細菌性ＰＬＤとともにまたは伴わずにインキュベートし、上のように抽出した。カウンティングのために水性アリコートを除去した後、残りの水性相を吸引し、有機相を窒素下で乾燥させた。その後、この脂質抽出物を薄層クロマトグラフィーによって分離し、サンプル中のＰＧおよびホスファチジン酸を、上のように定量した。
【００７３】
［３Ｈ］グリセロール取り込み
集密１次ケラチノサイトを、３０、６０、９０、１２０、３００または６００秒間、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（さらなるｐＨ緩衝のため）、１μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］グリセロールおよび０．１％ ＤＭＳＯ（対照）または１００ｎＭ ＰＭＡを含有するＳＦＫＭとともにインキュベートした。二価カチオン不含の氷冷リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄することにより、反応を停止させた。その後、これらの細胞を０．３Ｍ ＮａＯＨに可溶化し、この抽出物のアリコートを液体シンチレーションカウンティングに付した。各時点での二重重複サンプルから得られたカウントを平均し、グラフにし、各条件について一次方程式を決定した。得られた相関係数は、典型的に、０．９９以上であった（対照についての平均相関係数は、０．９９２±０．００２であり、ＰＭＡについては、０．９９４±０．００１であった）。多数の実験から得られた傾きを平均し、条件間の有意差について統計解析した。
【００７４】
上で決定したグリセロール取り込みの直線性により、単一の時点での取り込みを測定して、このプロセスに対する他の処理の効果を判定することができる。例えば、集密ケラチノサイトを、３０分間、０．１％ ＤＭＳＯ（対照）または１００ｎＭ ＰＭＡとともにプレインキュベートした後、上のとおりだが５分でのみ、［３Ｈ］グリセロール取り込みを測定した。同様に、ほぼ集密の１次ケラチノサイトを、様々なカルシウム濃度を含有するＳＦＫＭとともに２４時間、インキュベートした後、５分間の放射標識グリセロール取り込みを測定した。
【００７５】
統計解析
平均値間の差の有意性は、プログラム Ｉｎｓｔａｔ（カリフォルニア州、サンディエゴのＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により行う分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて判定した。
【００７６】
結果
ＰＬＤ−２は、インビトロでのホスファチジル基転移反応に第一アルコールとしてグリセロールを利用する（応答の特性付け）
無傷細胞において、ＰＬＤは、ホスファチジン酸を形成するにリン脂質の加水分解ばかりでなく、第一アルコールの存在下、ホスファチジルアルコールを生成させるホスファチジル基転移反応も触媒するユニークな特性を有する。従って、ホスファチジルアルコールの生成は、ＰＬＤ活性の尺度として用いられている。一般には、エタノールまたは１−ブタノールなどの第一アルコールが使用される。これは、細胞によって容易に代謝されない新規ホスファチジルアルコールを生成させるからである。無傷細胞での以前の研究は、生理的第一アルコール、グリセロールも、ホスファチジル基転移反応のための基質としての役割を果たすことができることを示唆していた。ＰＬＤ２過発現Ｓｆ９膜を使用して、グリセロールがインビトロでＰＬＤ２のための基質でであるかどうかを調査した。図５Ａに示すように、ＰＬＤ２は、グリセロールの存在下、ホスファチジルコリンからのＰＧの形成を触媒した。この形成は、この反応混合物中のグリセロールの濃度に依存し（図５Ａ）、添加するＰＬＤ２の量およびインキュベーション時間にも依存した（データは示さない）。さらに、グリセロールは、第一アルコールエタノールと競合して、ホスファチジルエタノールの代わりにＰＧを生成させることができた（図５Ｂ）。ＰＬＤ−Ｉが、グリセロールの存在下、インビトロでＰＧを生成させることも観察された（データは示さない）。
【００７７】
無傷細胞への［３Ｈ］または［１４Ｃ］グリセロールの添加により形成される放射標識ホスファチジルグリセロールの生成は、ケラチノサイトを高いカルシウム濃度に暴露すると増加され、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３処理で減少される
本発明者らは、ケラチノサイト分化剤、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が、２４時間暴露後、ＰＬＤ−Ｉの発現および活性を増加させることを以前に証明した（上で言及したＧｒｉｎｅｒら参照）。この実験では、［３Ｈ］グリセロールの添加前、２４時間にわたって前処理した細胞におけるホスファチジルグリセロールの形成に対する、ケラチノサイトの分化を引き起こす１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３および他の物質、高細胞外カルシウムレベルの効果を調査した。以前の結果に基づき、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、ＰＬＤ−Ｉの活性および発現を刺激する物質であるので、ＰＧの生成を増加させると予想した。意外にも、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３への暴露は、対照細胞を基準にして、放射標識ＰＧの形成を増加させず、実際、むしろ、明らかな減少が観察された（図６）。一方、１２５μＭ カルシウム含有培地での前処理は、その後のＰＧ生成の増加を誘導した（図６）。この結果は、高いカルシウムがＰＬＤの活性化を誘導する可能性、またはグリセロール−３−リン酸をＣＤＰ−ジアシルグリセロールに付加させるメカニズムなどの他の経路がＰＧ合成に関係している可能性を示唆していた。
【００７８】
ＰＧ生産およびグリセロール取り込みに対する高カルシウム濃度の効果は、用量依存的である
高細胞外カルシウムレベルは、ケラチノサイトの様々な分化段階を濃度依存的に誘導する。１００〜１２５μＭの範囲のカルシウム濃度は、ケラチン−１、初期（有棘層）分化のマーカー、の発現を刺激するのに対し、より高い濃度は、後期分化のマーカー、例えばトランスグルタミナーゼ活性、を誘導する。従って、ここでは、ＰＧ生産に対する高細胞外カルシウムレベルの効果の用量依存性を調査した。［２５μＭ（対照）から１ｍＭの範囲にわたる］高細胞外カルシウム濃度に応じてのＰＧ形成は、二相性の用量依存性を示した（図７Ａ）。従って、放射標識ＰＧ形成の最大刺激が、１２５μＭ カルシウムで観察され、カルシウム濃度が高くなるにつれて徐々に低下した。
【００７９】
中間カルシウム濃度がＰＧ形成を最大に刺激できるのは、グリセロール取り込みの増加、ＰＬＤ活性の強化、または両方の結果であり得る。後の放射標識グリセロール取り込みに対する様々なカルシウム濃度でのケラチノサイトの前処理の影響を、説明するとおり判定した。１２５μＭおよび２５０μＭ カルシウム含有培地への事前暴露は、２５μＭ カルシウム対照と比較してグリセロール取り込みの（それぞれ、５６％および４１％の）増加を誘導し、これに対して、５００μＭ カルシウム前処理ケラチノサイトにおけるグリセロール取り込みは、対照値とほぼ同値であった（図７Ｂ）。一方、１ｍＭの濃度は、グリセロール取り込みのわずかではあるが、有意な阻害を（これらの実験において）誘導した。１２５μＭ カルシウム前処理で観察されたグリセロール取り込みの小さな増加が、単独で、放射標識ＰＧ生産の大きな増加の原因である可能性は低く、このことは、ＰＬＤが、中間カルシウム濃度によっても活性化されることを示唆していた。
【００８０】
中間カルシウム濃度がＰＧ合成を刺激できることは、このプロセスが初期分化事象と関係があることを示唆していた。従って、初期分化マーカーケラチン−１（１０ｎＭ）の発現を刺激することもわかっている、中間１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度のＰＧ合成に対する効果を検査した。中間カルシウム濃度での結果とは対照的に、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の濃度は、ＰＧ合成を増加させず、実際、中間濃度と高濃度（２５０ｎＭ）、両方の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が、ＰＧ生成を有意に阻害した（図８）。
【００８１】
無傷細胞における高カルシウム濃度での処理による放射標識ホスファチジルグリセロール形成の増加は、少なくとも一部はＰＬＤによって媒介される
図６Ａにおいて観察されるように、高細胞外カルシウム濃度は、ＰＧの合成ばかりでなく、ホスファチジルコリンおよびホスファジン酸の合成の増加も誘導するようであった。従って、カルシウムは、一般的なリン脂質合成を増進させて、リン脂質のヘッドグループへではなく骨格へのグリセロールの組み込みを刺激した可能性があり、従って、ＰＧ合成増加は、ＰＬＤ活性とは無関係に発生する可能性があった。エタノールおよびグリセロールは、両方とも、ホスファチジル基転移反応のための基質として作用する（図５Ｂ）ので、エタノールを使用して、高細胞外カルシウム濃度により惹起されるＰＧ形成刺激が、ＰＬＤの活性化によって発生するのかどうかを判定した。［１４Ｃ］グリセロールでＰＧ生成を開始させる数分前に１２５μＭ カルシウムで前処理したケラチノサイトに、エタノール（１％）を添加した。図９に示すように、エタノールは、高細胞外カルシウムレベルへの事前暴露により刺激されたＰＧ形成を有意に阻害したが、基礎（対照）ＰＧ生成には影響を及ぼさなかった。グリセロールと競合するエタノールの能力は、すべてではないかもしれないが一部は、高いカルシウム濃度により刺激されたＰＧの形成が、ＰＬＤ活性強化の結果であることを示唆している。
【００８２】
高細胞外カルシウムによって誘導されるＰＧ合成へのＰＬＤの関与を、脂質抽出物および単離されたＰＧから放射標識を放出させる細菌性ＰＬＤの能力によってさらに実証した。これらの実験では、２４時間、１２５μＭ カルシウム含有培地で、またはこれを用いずに細胞を前処理した後、３０分にわたって［１４Ｃ］グリセロールを添加した。その後、脂質抽出物を調製し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００含有緩衝液に可溶化し、１時間、細菌性ＰＬＤとともに、または伴わずにインキュベートした。この細菌性ＰＬＤを用いて、羊水中のホスファチジルグリセロールを、このグリセロールヘッドグループを放出させるこの能力によって定量した。その後、放出されたヘッドグループを、上で説明したようなＦｏｌｃｈ法を用いて水性相に分配した。細菌性ＰＬＤとインキュベートすると、１２５μＭ カルシウム前処理細胞からの［１４Ｃ］グリセロール標識脂質抽出物は、対照前処理細胞からのものの約４倍の量の放射標識を水性画分に放出した（対照：１．００±０．０９；カルシウム：対照レベルに対して４．２±０．４倍；３回の独立した実験からの６つのサンプルの平均±ＳＥＭを表す値でｐ０．００１）。この結果は、ＰＬＤ媒介ホスファチジル基転移反応の増進と一致して、カルシウム暴露につれて、より多くのグリセロールがヘッドグループ位置に組み込まれていったことを示唆している。
【００８３】
対照または高細胞外カルシウムで前処理細胞から単離されたＰＧを用いる類似の実験を図１０に示す。これもまた、細菌性ＰＬＤは、対照細胞からと比較して３倍より多い放射活性を１２５μＭ カルシウム前処理細胞から単離されたＰＧから放出させた（対照：１．００±０．０４；カルシウム：対照レベルに対して３．３±０．５倍；３回の独立した実験からの６つのサンプルの平均±ＳＥＭを表す値でｐ＜０．０１）。これらの細菌性ＰＬＤ処理および未処理ＰＧサンプルの薄層クロマトグラフ分析により、放射標識ＰＧの一部が、放射標識ＰＡに変換されたことを証明した。これは、一部のグリセロールが、リン脂質骨格中に存在することを示唆していた（図１０）。しかし、ＰＧにおいて見出された最初の放射標識の約４０％しか、ＰＡでは回収されず、これは、ＰＧ中の放射標識の約６０％が、ヘッドグループ位置に存在することを示していた。
【００８４】
ホルボールエステルは、ＰＬＤ活性を増大させるが、放射標識ＰＧ形成を増加させない
無傷細胞における持続性ＰＬＤ活性とケラチノサイト分化の両方を誘導することが知られているもう１つの物質は、ホルボールエステル、ＰＭＡである。従って、ＰＧ形成に対するＰＭＡの効果を判定した。実際、ＰＭＡは、［３Ｈ］オレエートを予め標識しておいたものにおける放射標識ホスファチジルエタノールの形成を尺度として用いてモニターしところ、ＰＬＤ活性の大きな増加（ｐ＜０．０２）を刺激した（図１１、左）にもかかわらず、ＰＧ生成の有意な（対応のないスチューデントｔ−検定により、ｐ＜０．０１）減少を惹起した（図１１、右）。放射標識ＰＧ生成を阻害するＰＭＡの能力は、ＰＭＡにより媒介されるグリセロール取り込み減少の結果であり得る。１００ｎＭ ＰＭＡの存在下および不在下での［３Ｈ］グリセロールとケラチノサイトの同時インキュベーションは、１０分にわたって測定したが、グリセロール取り込みに対する有意な効果を惹起しなかった（図１１）。ならびに「方法」および参考文献［２５］における記載のとおり判定して、１．００の対照値に対してＰＭＡの傾き値 ０．９９８±０．００９倍；ｎ＝３）。しかし、５分間の放射標識グリセロールの添加前のビヒクルまたはＰＭＡでの３０分間のケラチノサイトの前処理は、ＰＭＡにより誘導されるグリセロール取り込み減少を生じさせ（図１２）、これは、発現に（１０分より長い）時間を要するグリセロール輸送に対するホルボールエステルの効果を示唆していた。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３がＰＧ形成を増加できないこととともに、これらの結果は、ＰＧの生成が、ＰＬＤ活性化の普遍的で当然な結果ではないことを示唆している。
【００８５】
考察
ＰＬＤに関して、興味深い、有用な発見をした。ホスファチジル基転移反応における新規ホスファチジルアルコールの生成に第一アルコールを利用するこの能力。これらの特性は、ＰＬＤ活性を特異的に測定するためおよびＰＬＤ媒介シグナル生成を阻害するためにシグナル伝達の研究者に利用される。しかし、本データは、ＰＬＤが、非生理アルコールを利用するこの能力を保持するための生理アルコール、グリセロールが存在することを実証している。実際、インビトロ実験において、ＰＬＤ２は、ホスファチジル基転移反応のための基質としてグリセロールを利用できることが実証されている（図５）。さらに、これらの結果は、ホスファチジル基転移反応にグリセロールを利用することにより、ＰＬＤが、潜在的脂質シグナル伝達分子、ＰＧを生じさせることを実証している。
【００８６】
ＰＬＤ−２がホスファチジル基転移反応に第一生理アルコールとしてグリセロールを利用する推論されるメカニズムの１つは、ＰＬＤ−２が共局在し、グリセロールを取り込むメカニズムである。実際、以前の研究において、本開示の発明者らは、ＰＬＤ２が、カベオリンリッチな膜マイクロドメインにアクアポリン−３と共在することを発見した（上で言及したＺｈａｎｇ ａｎｄ Ｂｏｌｌａｇ（２００３）参照）。アクアポリン−３タンパク質発現が、表皮の基底層に局在することは証明されている。この結果と一致して、分化剤、高細胞外カルシウム濃度および１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３で１次ケラチノサイトを刺激するとアクアポリン−３ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現が減少することを研究により証明した。この発現減少が、また、阻害作用をもたらし、高細胞外カルシウム濃度と１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の両方が、放射標識グリセロール取り込みを減少させた。しかし、これら２つの物質による阻害に有意な差はなく、これは、放射標識ＰＧ生成に対するこれらの本質的に異なる効果が、放射標識グリセロールの取り込みを阻害するこれらの能力の差によるものでないことを示唆していた。一方、１２５μＭ カルシウムが、ＰＧ生成の最大増加を引き起こすことができるのは、これが、ＰＬＤ活性を刺激し、グリセロール取り込みを阻害しない結果である可能性が高い（実際、この濃度のカルシウムでの前処理は、グリセロール取り込みを刺激した）。より高いカルシウム濃度によるグリセロール取り込みの阻害によって、様々なカルシウム濃度に応じて観察された二相性ＰＧ生産が説明される（図７）。興味深いことに、ＰＭＡもグリセロール取り込みを阻害した（図１２）。これは、ＰＫＣが、アクアポリン−４について観察されたようにアクアポリン−３機能を調節するという考えと一致する。高カルシウム濃度が、ＰＫＣ活性を刺激することも報告されており、これは、高カルシウムレベルがグリセロール取り込みに影響を及ぼすメカニズムと言ってもよかろう。
【００８７】
高細胞外カルシウム濃度がＰＧ生成を刺激できるのに対し、追加のケラチノサイト分化剤、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３およびＰＭＡができないということは、これら３つの物質が分化応答を引き起こすメカニズム関する重要な相違を示唆している。従って、最高細胞外カルシウムおよび１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度は、これら２つの物質が完全に共通の経路を利用する場合に予想されるような付加的未満にではなく、相乗的に作用して、ケラチノサイト分化の様々なマーカーを増加させる。加えて、ＰＭＡは、後期（顆粒層）分化の誘導に準じたケラチノサイトの変化を生じさせることが知られており、実際、高細胞外カルシウムおよび１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３レベルの効果とは対照的に、初期分化のマーカーを阻害する。外因性（細菌性）ＰＬＤは、ケラチノサイト分化を誘導することができ、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、ＰＬＤ−Ｉの発現および活性を誘導させるという発見に基づき、ＰＬＤ−Ｉは、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により誘導されるケラチノサイトの後期分化を少なくとも一部は媒介することを提案した。一方、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、ＰＧの形成を増進せず（図６および８）、ＰＭＡもしない（図１１）。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が、ＰＬＤ−２の発現を増加させないこと、およびＰＭＡが、ＰＬＤ−２より大きな程度にＰＬＤ−１を活性化すると報告されていることから、グリセロールへの暴露に基づくケラチノサイトにおける放射標識ＰＧの生成は、ＰＬＤ−２活性化の尺度になり得る。従って、このアッセイは、両方のＰＬＤアイソフォームをプロセッシングする無傷細胞系において、ただ１つのＰＬＤ、ＰＬＤ−２の活性をモニターする方法となる。
【００８８】
これらの研究の興味深い態様は、放射標識グリセロールを付加させたときに観察される、ホスファチジルコリンおよびホスファチジン酸の形成であった。ＰＧでは、グリセロールが、ホスファチジル基転移反応において、おそらく、少なくとも一部はヘッドグループとして組み込まれる。この組み込みをエタノールによって阻害することができるからである（図９）。実際、細菌性ＰＬＤを利用してリン脂質ヘッドグループを放出させるインビトロ実験は、高細胞外カルシウム前処理が、ヘッドグループ位置へのグリセロールの組み込みを増進することを示した（図１０）。ホスファチジルコリンおよびホスファチジン酸において、グリセロールは、グリセロール骨格としてリン脂質に組み込まれる可能性が最も高い。グリセロールに対するグリセロールキナーゼの作用によって生じる、グリセロール３−リン酸への２つの脂肪酸の付加（脂肪−アシルＣｏＡ経由）によって、ホスファチジン酸が新たに形成され、脱リン酸化ホスファチジン酸（ジアシルグリセロール）へのコリンのその後の付加（ＣＤＰ−コリン経由）によって、ホスファチジルコリンを生成する。放射標識グリセロールを合計３０分間しか付加させなかったので、この結果は、急速で能動的なリン脂質合成を示唆していよう。この考えは、皮膚の水透過性バリアを形成するための脂質の生成におけるケラチノサイトの役割と一致する。放射標識グリセロールが、ＰＧの骨格にも組み込まれ、これが、放射標識ＰＧ形成の増加の原因の一部であることも明らかになった。従って、この結果は、ＰＧ合成が、少なくとも２つ方法（ＰＬＤ媒介ホスファチジル基転移反応による方法、ならびにＣＤＰ−ジアシルグリセロールへのグリセロール−３−リン酸の付加およびその後のリン酸基除去という、より伝統的な経路による方法）で発生し得ることを追認する。
【００８９】
ケラチノサイトにおけるＰＧの役割については、幾つかの可能性が存在する。皮膚の基底層へのグリセロール輸送性アクアポリン−３の局在に基づき、このシグナル伝達経路が増殖能力またはおそらく初期分化事象において機能すると予想することができよう。この考えは、放射標識ＰＧ生成が、ケラチン−１（初期分化のマーカー）のほぼ最大の発現を誘導することがわかっている中間カルシウム濃度（１２５μＭ；図７）によって最大に刺激されるという観察結果と一致する。このような解釈は、ＰＫＣ−βｕｅ−媒介有糸分裂進行におけるＰＧの一定の役割を示すデータによっても支持される。以前の研究は、マウスケラチノサイトのノーザン分析によりＰＫＣ−βの検出可能な発現がなかったと報告しているが、マウスとヒトの両方における他の研究は、ケラチノサイトにおけるこのアイソフォームの発現を示唆していた。一方、アクアポリン−３ヌルマウス突然変異体の最近の作製および初期特性付けは、正常な皮膚生理に対するこのアクアグリセロポリンの重要性を示唆している。これらのヌルマウスは、乾燥皮膚の皮膚表現型および変化した保水能力を示した。加えて、表皮からこの水不透過性外層（角質層）が剥がれることによる水分の吸収が、アクアポリン−３ヌルマウスでは異常であり、これは、この水分補給能力を阻害する、表皮構造の一部の態様の変化を示唆している。この結果に基づき、アクアポリン−３ヌルマウスにおけるＰＧ形成の減少によってケラチノサイトの成長および／または分化に欠陥が生じ、その結果、これらの突然変異体では異常な皮膚生理が観察されるのだと考えられる。
【実施例２】
【００９０】
本実施例では、酸感受性アクアグリセロポリンを通して進入するグリセロールが、ＰＧを形成するためにＰＬＤに利用されることを実証する、ケラチノサイトにおけるＰＬＤ２／ＡＱＰ３／グリセロール／ＰＧモジュールについてのさらなる証拠を提供する。一過性共形質移入試験において、ケラチノサイト増殖または分化状態のマーカーのプロモーターがルシフェラーゼ発現を発動するレポーター構築物と、ＡＱＰ３を共発現させた。これらの試験は、ＡＱＰ３の共発現が、ケラチン５（基底、増殖性ケラチノサイトのマーカー）のプロモーター活性を阻害し、ケラチン１０（初期ケラチノサイト分化のマーカー）のプロモーター活性を増大させ、ならびにインボルクリン（中期分化のマーカー）のプロモーター活性に対する高細胞外カルシウムレベルの効果を強化したことを示した。グリセロールおよび１，２−プロピレングリコール（３番の末端炭素上のヒドロキシル基が１個ないグリセロール）は、低カルシウム濃度（２５μＭ）においても、中間カルシウム濃度（１２５μＭ）においても、用量依存的にＤＮＡ合成を阻害し、これに対して等価濃度の浸透活性物質、キシリトールおよびソルビトールは、ほとんどまたは全く効果がなかった。ＰＧリポソームの直接供給によっても、急速分裂性ケラチノサイトにおけるＤＮＡ合成が用量依存的に阻害されたが、成長阻害細胞では、ＰＧリポソームにより、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みが用量依存的に増進された。ＰＧリポソームがトランスグルタミナーゼ活性を刺激する傾向も観察された。これらのデータが、ＡＱＰ３、ＰＬＤ２、グリセロールおよびＰＧから成り、ならびに増殖性ケラチノサイトの成長阻害および／または初期分化の促進に関与する、シグナル伝達モジュールのアイデアを支持している。
【００９１】
実験手順
ケラチノサイト調製および細胞培養
ケラチノサイトは、ＩＣＲ ＣＤ−Ｉ 非近交系交配マウスから、研究機関内動物管理使用委員会（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認されたプロトコルに従って調整した。簡単に言うと、皮膚を回収し、一晩、０．２５％ トリプシン中、４℃でインキュベートした。表皮と真皮を分離し、基底ケラチノサイトをこの表皮の下側からかき落とした。遠心分離により細胞を回収し、Ｄｏｄｄ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｉｓｔｉｃｈ，Ｖ．Ｌ．，Ｒａｙ，Ｓ．，Ｌｏｂｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｂｏｌｌａｇ，Ｗ．Ｂ．（Ｉｎ ｐｒｅｓｓ）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ（本明細書に参考として組み込まれる）に記載されているようなプレーティング培地中で一晩、９５％ 空気／５％ 二酸化炭素の雰囲気下、３７℃でインキュベートした。このプレーティング培地を、同じくＤｏｄｄらに記載されているような無血清ケラチノサイト培地（ＳＦＫＭ）に替え、使用するまで１〜２日ごとに新たな培地を細胞に供給した。
【００９２】
［３Ｈ］グリセロール取り込みアッセイ
ほぼ集密のケラチノサイト培養物を、ＳＦＫＭ（２５μＭ カルシウム）、または１２５μＭ カルシウムを含有するＳＦＫＭ（１２５μＭ Ｃａ２＋−ＳＦＫＭ）中で２４時間、インキュベートし、Ｚｈｅｎｇ ＆ Ｂｏｌｌａｇ（２００３）に以前に記載されたとおりグリセロール取り込みアッセイを行った。簡単に言うと、細胞を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（さらなるｐＨ緩衝のため）および１μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］グリセロールを含有するＳＦＫＭとともに、５分間［この時点が、［３Ｈ］グリセロール取り込みの線形範囲内にあることが以前に証明されている（Ｚｈｅｎｇ ＆ Ｂｏｌｌａｇ（２００３））ので］、インキュベートした。二価カチオン不含の氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−）での３回の迅速な洗浄により反応を停止させた。その後、これらの細胞を０．３Ｍ ＮａＯＨに可溶化し、［３Ｈ］グリセロール取り込みを液体シンチレーションスペクトル分析により定量した。
【００９３】
ＰＧ合成
ほぼ集密のケラチノサイトを、ＳＦＫＭ（２５μＭ カルシウム）、または１２５μＭ カルシウムを含有するＳＦＫＭ（１２５μＭ Ｃａ２＋−ＳＦＫＭ）中で２４時間、インキュベートした後、０．５から１μＣｉ／ｍＬ ［１４Ｃ］グリセロールを１０分にわたって添加し、ＰＧ合成を［６］におけるがごとく判定した。簡単に言うと、放射標識ＰＧをクロロホルム／メタノールに抽出し、Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．，Ｒａｙ，Ｓ．ａｎｄ Ｂｏｌｌａｇ，Ｗ．Ｂ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１６４３，２５−３６（本明細書の参考として援用されている）に記載されているとおりシリカゲル６０プレートでの薄層クロマトグラフィーによって分離した。
【００９４】
共形質移入分析
共形質移入実験は、ｐｃＤＮＡ３空ベクターまたはＡＱＰ３をプロセッシングする構築物を１ｎｇ、ケラチン５、ケラチン１０またはインボルクリンのプロモーターがルシフェラーゼの発現を発動するレポーター構築物のうちの１つを１ｎｇ、および形質移入効率を正常化するためのｐＲＬ−ＳＶ４０ コントロールベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｋｉｔに含まれているもの）を０．２５ｎｇ使用して行った。ケラチン５およびケラチン１０プロモーター−ルシフェラーゼ構築物は、Ｄｒ．Ｂｏｇｉ Ａｎｄｅｒｓｅｎ（カリフォルニア州、アーヴィンのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって提供され、インボルクリンプロモーター−ルシフェラーゼ構築物は、Ｄｒ．Ｄａｎｉｅｌ Ｂｉｋｌｅ（カリフォルニア州、サンフランシスコのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって提供された。ＴｒａｎｓＩｔＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅをこの製造業者の説示に従って使用して、亜集密（約３０％）ケラチノサイトをトランスフェクトした。２４時間後、２５μＭ（対照）または１ｍＭ−Ｃａ２＋を含有する培地をさらに２４時間にわたって細胞に供給した。その後、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ウィスコンシン州、マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）をこの製造業者による指図どおりに使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００９５】
ＤＮＡ合成のアッセイ
上述のＧｒｉｎｅｒらの以前の記載のとおり、ＤＮＡ合成の尺度としてＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みを判定した。ほぼ集密のケラチノサイト培養物を、示した添加物を含有するＳＦＫＭ中で２４時間、インキュベートした。ＳＦＫＮ中の乾燥ＰＧのバス超音波処理（ｂａｔｈ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）により調製したリポソームの形態でＰＧを添加して、２ｍｇ／ｍＬの原液を作った。その後、１μＣｉ／ｍＬの最終濃度で［３Ｈ］チミジンを細胞に添加して、さらに１時間、インキュベートした。ＰＢＳ−での洗浄により反応を停止させ、氷冷５％トリクロロ酢酸で高分子を沈殿させた。細胞を０．３Ｍ ＮａＯＨに可溶化し、ＤＮＡに組み込まれた放射活性を液体シンチレーションスペクトル分析によって定量した。
【００９６】
トランスグルタミナーゼアッセイ
ケラチノサイトをＰＧリポソームで処理し、かき落とすことで回収し、均質化用緩衝液中で遠心分離し、１回の冷凍解凍サイクル後に超音波処理により溶解させた。これらの破壊細胞におけるトランスグルタミナーゼ活性を、Ｂｏｌｌａｇ，Ｗ．Ｂ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｘ．，Ｄｏｄｄ，Ｍ．Ｅ．，Ｈａｒｄｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．ａｎｄ Ａｌｌｒｅｄ，Ｗ．Ｔ．（２００５）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，３１２，１２２３−１２３１（本明細書に参考として組み込まれる）に記載されているとおり、ジメチル化カゼインに架橋した［３Ｈ］プトレッシンの量としてモニターした。架橋したプトレッシン−カゼインをトリクロロ酢酸で沈殿させ、濾過によって回収した。データを各サンプル中のタンパク質の量に対して正規化し、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いるＢｉｏｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙを使用して判定し、適切な対照を基準にして表した。
【００９７】
統計
実験は、指示どおり最低３回は行った。Ｉｎｓｔａｔ（カリフォルニア州、サンディエゴのＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎｎ−Ｋｅｕｌｓ 多重比較検定での分散分析（ＡＮＯＶＡ）により、値の統計学的有意性を分析した。
【００９８】
結果
酸性培地でのグリセロール取り込みの阻害は、ＰＧ合成を阻害する
上で論じたように、本発明者らは、ＰＬＤ２およびＡＱＰ３が、ケラチノサイト中のカベオリンリッチな膜マイクロドメインに局在することを以前に示した。加えて、示したように、ＰＬＤ媒介ＰＧ合成は、ケラチノサイト中の高細胞外カルシウムレベルによって刺激され、ならびにＰＧを生成するホスファチジル基転移反応のために、ＡＱＰ３が、ＰＬＤ２にグリセロールを供給するようである。肺細胞ＡＱＰ３は、酸性培地によって阻害されるので、低ｐＨの培地がグリセロール取り込みおよびＰＧ合成を阻害するかどうかを調査した。ケラチノサイトを、対照ＳＦＫＭ（２５μＭ Ｃａ２＋）、または１２５μＭ Ｃａ２＋を含有するＳＦＫＭとともに２４時間、インキュベートした後、ｐＨ４または７．４のＳＦＫＭ中での［３Ｈ］グリセロール取り込みおよび［１４Ｃ］ＰＧ生成を測定した。図１３Ａに示すように、１２５μＭ Ｃａ２＋は、対照培地におけるグリセロール取り込みを有意に刺激した。低ｐＨ培地は、基底条件下でも、中間カルシウム濃度で刺激したときも、グリセロール取り込みを有意に阻害した（図１３Ａ）。同様に、ｐＨ４培地は、対照培地とともにインキュベートした細胞においても、１２５μＭ Ｃａ２＋培地とともにインキュベートした細胞においても、［１４Ｃ］グリセロールとの１０分のインキュベーション後、放射標識ＰＧ合成を有意に阻害した（図１３Ｂ）。ｐＨ４培地によるグリセロール取り込みおよび／またはＰＧ生産の阻害が毒性と関係しないことを保障するために、一部の細胞は、ｐＨ４培地との５分間のプレインキュベーションも行い、その後、対照ｐＨ７．４培地中でのグリセロール取り込みまたはＰＧ合成を測定した（ｐＨ４／７）。ｐＨ４培地とのプレインキュベーションは、グリセロール取り込みまたはＰＧ生成に対して本質的に効果がなかった（図１３）。
【００９９】
ＡＱＰ３の共発現は、ケラチン５プロモーター活性を阻害し、ケラチン１０プロモーター活性を刺激し、インボルクリンプロモーター活性に対する高細胞外カルシウムレベルの効果を強化する
１次マウス表皮ケラチノサイトは、高効率でトランスフェクトすることが難しい場合がある。この限界を克服するために、細胞を、ＡＱＰ３または空ベクターと、Ｄｏｄｄらが記載したようなケラチノサイト増殖または分化マーカーのプロモーターがルシフェラーゼ発現を制御するレポーター構築物とでコ・トランスフェクトした。トランフェクション前にベクターを入念に混合するので、１つのベクターを取り込む細胞が、他のベクターを受け入れることができ、その結果、ＡＱＰ３または空ベクターも有する細胞のみのレポータールシフェラーゼ活性を測定することができる。ケラチン５発現は、基底増殖性ケラチノサイトの特徴であるのに対し、ケラチン１０およびインボルクリンは、分化性有棘細胞の特色であり、ケラチン１０は、初期分化マーカーとしておよびインボルクリンは、中間分化のマーカーとしての役割を果たす。図１４Ａは、基底条件下の、および分化剤（１ｍＭ カルシウム）とともに２４時間インキュベートした後の、ケラチン５プロモーターに対するＡＱＰ３共発現の効果を説明する図である。ＡＱＰ３共発現は、ケラチン５プロモーター活性の（空ベクターでトランスフェクトされた対照の４９±１２％への）有意な減少を誘導した。カルシウム（１ｍＭ）もケラチン５プロモーターを（６４％）阻害し、ＡＱＰ３共発現の有意なさらなる効果はなかった。一方、ＡＱＰ３共発現は、ケラチン１０プロモーター活性を刺激した（図１４Ｂ）。１ｍＭ カルシウムでの処理は、ケラチン１０の発現を２２％阻害し、この効果は、ＡＱＰ３共発現によって、一部、くつがえされた。分化剤として、１ｍＭ カルシウムは、ケラチノサイト１０プロモーター活性を増大させると予想されるが、このような高いカルシウム濃度は、ケラチンを後期分化に駆り立て、実際には初期分化マーカーの発現を減少させる。最後に、ＡＱＰ３共発現は、インボルクリンプロモーターのみに対しては有意な効果はなかったが、１ｍＭ カルシウムにより誘導された刺激を強化した（図１４Ｃ）。これらの結果は、ＡＱＰ３共発現が初期ケラチノサイト分化を促進することと一致する。
【０１００】
グリセロールおよび１，２−プロピレングリコールはＤＮＡ合成を阻害するが、キシリトールおよびソルビトールはしない
ＡＱＰ３およびＰＬＤ２は、ＰＧを生成させるためのホスファチジル基転移反応においてＰＬＤ２が使用するグリセロールを提供するために共局在するようであり、その後、このＰＧが、初期ケラチノサイト分化を促進するように作用する。これは、ＡＱＰ３チャネルを通したグリセロールの送達の増加も、初期分化を引き起こすことができることを示唆している。初期分化の第一の顕著な特徴の１つが、細胞周期からの退出およびＤＮＡ合成の減少であるので、ＤＮＡ合成の尺度であるＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みに対する（このチャネルを通るフラックスを増す）外因性グリセロールの効果を調査した。図１５Ａに示すように、０．０２％のような低いグリセロール濃度（＝２．７３ｍＭ）が、ケラチノサイトＤＮＡ合成を有意に阻害した。より高いグリセロール濃度の効果も調査した。しかし、浸透ストレスがケラチノサイト機能を調整するので、グリセロール等価濃度の２つの他の浸透圧調整剤（キシリトールおよびソルビトール）の任意の浸透効果に対する制御も、対照として用いた。図１５Ｂに示すように、０．１から１％の濃度のグリセロールは、ＤＮＡ合成を阻害し、１２５μＭ Ｃａ２＋の阻害効果を強化した。一方、キシリトールは、基底または１２５μＭ Ｃａ２＋阻害ＤＮＡ合成に対して有意な効果を有さなかった。同様に、対照に対しても、１２５μＭ Ｃａ２＋によって低減されるＤＮＡへの［３Ｈ］チミジンの組み込みに対しても、有意な効果が観察されなかった（図１５Ｃ）。
【０１０１】
ＡＱＰ３ヌル突然変異マウスの試験において、グリセロールは、このノックアウトモデルの表皮表現型を修正することができたが、キシリトールまたは１，２−プロピレングリコール（または１，３−プロピレングリコール）は、できなかった。従って、１，２−プロピレングリコールを、基本的に、および１２５μＭ Ｃａ２＋での分化時に、ＤＮＡ合成を阻害するこの能力についても検査した。１，２−プロピレングリコールの効果は、グリセロールのものと類似しており、対照（２５μＭ Ｃａ２＋）条件下でおよび１２５μＭ Ｃａ２＋での分化時に［３Ｈ］チミジンの用量依存的阻害を示した。グリセロールおよび１，２−プロピレングリコールの類似性の証拠となるこれらの構造も、図１６Ｂに示す。
【０１０２】
ＰＧリポソームは、急速分裂性ケラチノサイトにおけるＤＮＡ合成を阻害し、トランスグルタミナーゼ活性を刺激する
さらに、ＰＧそれ自体の直接供給も初期分化を引き起こすと考えられる。リポソームの形態のＰＧをケラチノサイトに直接供給することにより、高増殖性細胞におけるＤＮＡ合成が阻害されることが判明した（図１７Ａ）。最大阻害は２５μｇ／ｍＬで観察され、５０〜１００μｇ／ｍＬはプラトーであった。細胞死の特徴である形態学的変化が観察されなかった（データは示さない）ので、この効果が毒性を意味する可能性は低い。加えて、ＰＧリポソームは、トランスグルタミナーゼ活性（後期ケラチノサイト分化のマーカー）増加方向の用量依存的傾向を誘導した（図１７Ｂ）。
【０１０３】
ＰＧリポソームは遅増殖性細胞におけるＤＮＡ合成を刺激する
毒性がないことのさらなる証拠は、おそらく接触阻害の結果として増殖減少を示す、観察されたケラチノサイトに対するＰＧリポソームの効果によって提供される。従って、（対照条件下でのＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みの減少によって示されるような）増殖能力が低下したケラチノサイトにＰＧリポソームを適用した場合、ＤＮＡ合成は、約３５μｇ／ｍＬの濃度で半最大効果および１００μｇ／ｍＬで最大刺激と、用量依存的に刺激された（図１８）。この結果は、急速分裂性細胞の増殖を阻害し、成長が低下した設定では増殖を増加させるケラチノサイトの増殖を正常化する能力をＰＧが有することを示唆している。
【０１０４】
考察
ＰＧを合成するためのホスファチジル基転移反応においてグリセロールを利用するＰＬＤの能力、およびＰＬＤ２とＡＱＰ３との相互作用は、グリセロールがホスファチジル基転移のためにこのアイソエンザイムに到達することができるメカニズムを示唆している。ＡＱＰ３のグリセロール取り込み機能に対するこの阻害は、ＰＧ合成も減少させ得る。図１３は、酸性培地が、１２５μＭ Ｃａ２＋により惹起されるグリセロール取り込みとＰＧ合成の同時減少を誘導することを示している。しかし、他のアクアポリン、例えばアクアポリン−９、は、グリセロールを輸送することができ、ケラチノサイトによって発現されるので、これら他のアクアグリセロポリンも、ケラチノサイトにおけるグリセロール取り込みおよびＰＧ合成に寄与し得る。
【０１０５】
ＰＬＤ２／ＡＱＰ３シグナル伝達モジュールによって合成されるＰＧは、ケラチノサイトおよび表皮機能を調整する脂質メッセンジャーとしての役割を果たすと考えられる。ＡＱＰ３ヌル突然変異マウスは、グリセロールによって修正され得るが、他の浸透活性物質によっては修正されない表皮表現型を示す。本共発現試験は、ＡＱＰ３が、初期ケラチノサイト分化を促進する：ＡＱＰ３が、ケラチン５（基底増殖層のマーカー）のプロモーター活性を低下させることを示唆している（図１４Ａ）。ケラチン５発現のダウンレギュレーションは、有棘層における第一基底上細胞への基底ケラチノサイトの移行の特徴である。ケラチン１０の発現の増加；ＡＱＰ３の共発現によって減少するケラチン１０プロモーター活性も、有棘ケラチノサイトの特徴である（図１４Ｂ）。高いカルシウムレベルは、ケラチノサイトを、初期分化段階を通り過ぎて後期分化段階に進ませることがあり、その結果、ケラチン１０プロモーター活性がわずかに減少する（図１４Ｂ）。ケラチノサイトが、多数の有棘層を通って上に移動するように進むにつれて、インボルクリンを発現し始める。ＡＱＰ３共発現だけでは、インボルクリンプロモーター活性を有意に増大させなかったが、ＡＱＰ３は、この中間分化マーカーのプロモーター活性に対する別の分化剤、高細胞外カルシウム濃度の効果を強化した（図１４Ｃ）。ＡＱＰ３が、これらの様々なマーカーのプロモーター活性に、直接、すなわち、他の転写因子および／またはプロモーターこれら自体との相互作用により、影響を及ぼす可能性は低いようであることに留意しなければならない。むしろ、これらの結果は、初期分化表現型を誘導するＡＱＰ３の発現、ならびに細胞の分化状態がこれらのプロモーターの活性を制御することに準じる。
【０１０６】
グリセロールインフラックスの増加により、ＰＧ合成が促進され、この初期分化表現型が促進される（この主要事象は、成長停止である）と考えられる。実際、グリセロールは、ＤＮＡ合成を阻害し、この阻害は、等価濃度の２つの他の浸透活性化合物（キシリトールおよびソルビトール）によっては再現されなかった（図１５）。これは、この阻害が、浸透圧重量モル濃度の増加の結果ではないことを示唆していた。興味深いことに、１，２−プロピレングリコール（１，２−プロパンジオール）は、ＤＮＡ合成に対してグリセロールと本質的に同じ効果を生じさせた（図１６）。１，２−プロピレングリコールでのホスファチジル基転移によって形成されたリン脂質（末端炭素上のヒドロキシ基がないＰＧ）は、ＰＧエフェクター酵素を活性化するために十分、ＰＧに似ていると考えられる。
【０１０７】
グリセロールが、ＰＧ形成のための基質としての役割を果たすことにより、ケラチノサイト増殖を改変するように機能する場合には、ＰＧの直接供給もＤＮＡ合成を阻害する。実際、（基底条件下でのＤＮＡへの高い［３Ｈ］チミジン組み込みによって判定されるような）急成長細胞の場合、ＰＧは、ＤＮＡ合成を用量依存的に減少させた（図１７）。毒性の形態学的相関現象が観察されなかった（データは示さない）ので、この効果は、非特異的毒性の結果であるようではなかった。加えて、ＰＧ用量の増加によってトランスグルタミナーゼ活性（後期ケラチノサイト分化のマーカー）が刺激される傾向も明らかになった。しかし、意外にも、ＤＮＡ合成減少を示したケラチノサイトでは、おそらく接触阻害の結果として、ＰＧは、用量依存的に、ＤＮＡ合成を刺激した（図１８）。この二相性応答のメカニズムは、不明である（しかし、可能性は、下で論じる）が、表皮が高増殖性である場合、ＰＧリポソームはケラチノサイト成長を阻害すると予想され、これに対して増殖が少なすぎる条件下（例えば、老化）ではこれらのリポソームは成長を増進させる。従って、これらの結果は、ＰＧリポソームが、病的条件下においても、生理状態下においても皮膚機能を正常化する理想的な治療法であり得ることを示唆している。
【０１０８】
ＰＧシグナルのエフェクター酵素も不明であるが、可能性としては、ＰＧ感受性プロテインキナーゼ、例えばプロテインキナーゼＣ−ＩＩ、ＰＫＣ−およびＰｋ−Ｐが挙げられる。もしくは、ＰＧを血漿膜および／または特定のマイクロドメインに組み込み、膜タンパク質構築および／またはマイクロドメイン機能に影響を及ぼすことができる。一例として、ＰＧは、青緑色細菌およびホウレンソウのチラコイド膜における光化学系構築に利用される。ＰＧは、カルジオリピン（＝ジホスファチジルグリセロール）の前駆体でもあり、ＰＧおよびカルジオリピンは、両方とも、ミトコンドリア機能において重要である。カルジオリピンは、シトクロムｃに結合し、この脂質の酸化は、ミトコンドリアからシトクロムｃを放出させると考えられ、この事象が、アポトーシスを開始させ得る。加えて、ミトコンドリアを枯渇させたカルジオリピンとＰＧ、両方のインキュベーションは、これらの膜電位を一部保持することができ、これは、シトクロムｃ放出およびアポトーシスに対抗する。実際、ＰＧは、網膜上皮細胞においてアポトーシスを阻害することができる。従って、ＰＧは、プロテインキナーゼ経路の活性化により急速増殖性ケラチノサイトの成長阻害を誘導することができる（図１７Ａにおけるとおり）が、このリン脂質は、ミトコンドリアの機能およびエネルギー生産を向上させることにより、阻害細胞における増殖を促進することができる（図１８におけるとおり）。紫外線への暴露によりＡＱＰ３発現に関して観察されたアップレギュレーションは、ＰＧ生成、ミトコンドリアの健康、および照射のストレスからの回復を促進する細胞の反応であると考えられる。従って、ＡＱＰ３、ＰＬＤ２、グリセロールおよびＰＧから成る新規シグナル伝達モジュールは、皮膚におけるグリセロールの有益な効果についてのメカニズムであると言える。さらに、本結果は、このモジュールが、インビトロおよびインビボでのケラチノサイトの成長および分化の重要な調節因子であり、様々な皮膚の疾患および／または状態のための新規治療法をもたらすことを示している。
【実施例３】
【０１０９】
グリセロールおよびホスファチジルグリセロールは創傷治癒を加速する
本実施例では、ＩＣＲ ＣＤ１マウスにおいて得られた創傷治癒に対するグリセロールおよびホスファチジルグリセロール治療の効果に関する最近のデータを提示する。約４ｍｍの２箇所の全厚皮膚パンチ生検を合計１６匹のマウスの背中において行った。各マウスについて、一方の創傷は、（ａ）治療しなかったか、（ｂ）水中２Ｍのグリセロールで治療、（ｃ）二価カチオン不含の酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−）で治療、または（ｄ）１００μｇ／ｍＬ ホスファチジルグリセロールを含有するＰＢＳ−（超音波処理してリポソームにしたもの）で治療した。その後、創傷治癒率を、デジタル写真およびコンピューター画像分析により、４日間にわたって追跡した。４グループの各々についての１日目を基準にした４日目における創傷治癒のパーセンテージを棒グラフとして図１９に示す。予想どおり、グリセロール治療は、創傷治癒率を向上させた。さらに重要なこととして、ＰＧリポソームも創傷治癒率を上昇させ、この向上は、統計学的に有意であった。これらの結果により、皮膚機能においてＰＧが重要であるという考えが確認される。
【０１１０】
本開示の上記実施形態は、実施の単なる可能例であり、本開示の原理を明瞭に理解するために示すものであることを強調しておく。本開示の精神および原理を実質的に逸脱することなく、本開示の上記実施形態に多くの変形および変更を成すことができる。慣例に従って、このような変更および変形は、ここでは本開示の範囲内に包含され、以下の特許請求の範囲によって保護されると解釈する。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】皮膚の層ならびにケラチノサイトの増殖および分化の段階の説明図である。
【図２】ＰＬＤのホスファチジル基転移反応を説明する図である。水の存在下、ＰＬＤは、リン脂質ホスファチジルコリンの加水分解を触媒して、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびコリンを生じさせる。しかし、少量の第一アルコール、例えばエタノール、１−ブタノールまたはグリセロールの存在下では、ＰＬＤは、ホスファチジル基転移反応を触媒して、対応するホスファチジルアルコールを生成させる。
【図３】調節酵素、シグナル生成酵素およびエフェクター酵素を含む、ＰＬＤシグナル伝達経路を説明する図である。
【図４】ＡＱＰ３−ＰＬＤ２−グリセロール−ホスファチジルグリセロールシグナル伝達モジュールのモデルである。
【図５】グリセロールが、インビトロでのホスファチジル基転移反応においてホスホリパーゼＤの基質としての役割を果たすことを説明する図である。リポソームは、［３Ｈ−ジパルミトイル］ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸から超音波処理によって作製した。１％エタノールの不在（Ａ）または存在（Ｂ）下、示されている濃度のグリセロールをこの反応混合物に添加した。Ｓｆ９ ＰＬＤ２過発現膜（１μｇ タンパク質）の添加により反応を開始させ、３０分間、３７℃でインキュベートし、０．２％ ＳＤＳ（±５ｍＭ ＥＤＴＡ）の添加により停止させた。脂質を抽出し、分離し、定量した。この図は、少なくとも２つの追加実験の代表である。形成されたホスファチジン酸（ＰＡ）、ＰＧおよびホスファチジルエタノール（ＰＥｔ）の絶対レベルには、多少の可変性があった。これは、超音波処理中に多層小胞が形成される程度のばらつきに起因する可能性が高い。
【図６】ホスファチジルグリセロール形成は、高細胞外カルシウム濃度に暴露された分化性細胞では増加されるが、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３に暴露された分化性細胞ではされないことを実証する図である。ほぼ集密のケラチノサイトを（Ａ）２５μＭ−カルシウム−ＳＦＫＭ含有ビヒクル（Ｃｏｎ；０．０５％ エタノール）、２５０ｎＭ １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｄ３）、または１２５μＭ カルシウム（＋０．０５％ エタノール；Ｃａ２＋）とともに、２４時間、インキュベートした。その後、２．５〜５μＣｉ／ウエル ［３Ｈ］グリセロールをさらに３０分にわたって３７℃で添加した。０．２％ ＳＤＳ（±５ｍＭ ＥＤＴＡ）の添加によって反応を停止させ、リン脂質を抽出し、分離し、定量した。結果は、対照値に対して〜倍と表し、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照に対して、＊ｐ＜０．００１。パネルＢに示す薄層クロマトグラムは、パネルＡにおいて定量した３つの実験の代表である。
【図７】高細胞外カルシウム濃度が、ホスファチジルグリセロールの生成およびより少ない程度ではあるがグリセロールの取り込みを用量依存的に増加させることを示す図である。ほぼ集密のケラチノサイトを、様々な濃度のカルシウムを含有するＳＦＫＭとともに、２４時間インキュベートした。（Ａ）その後、これらの細胞を、さらに３０分間、５μＣｉ／ウエル ［３Ｈ］グリセロールとともにインキュベートした後、０．２％ ＳＤＳ（±５ｍＭ ＥＤＴＡ）で反応を停止させ、放射標識ＰＧを抽出し、分離し、定量した。値は、対照（２５μＭ−カルシウム−ＳＦＫＭ）に対して〜倍と表し、５回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値に対して、＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）様々なカルシウム濃度で２４時間、前処理した後、これらの細胞を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有するＳＦＫＭ中の１μＣｉ／ウエル ［３Ｈ］グリセロールとともに、５分間、インキュベートし、その後、二価カチオン不含の氷冷リン酸緩衝生理食塩水での広範な洗浄によって反応を停止させた。値は、対照（２５μＭ−カルシウム−ＳＦＫＭ）に対して〜倍と表し、５回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値に対して、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図８】中および高濃度の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３に暴露された分化性細胞ではホスファチジルグリセロールの形成が阻害されることを示す棒グラフである。ほぼ集密のケラチノサイトを、０．０５％ エタノール（Ｃｏｎ）、１０ｎＭ １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、または２５０ｎＭ １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｄ３）を含有するＳＦＫＭとともに、２４時間、インキュベートした。その後、２．５〜５μＣｉ／ウエル ［３Ｈ］グリセロールを、さらに３０分にわたって、３７℃で添加した。０．２％ ＳＤＳ（＋５ｍＭ ＥＤＴＡ）の添加により反応を停止させ、「方法」において説明したようにリン脂質を抽出し、分離し、定量して、対照値に対して〜倍と表した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する。；対照に対して、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１。
【図９】細胞外カルシウム濃度により刺激されがホスファチジルグリセロールの形成が、エタノールにより阻害されることを説明する棒グラフである。ほぼ集密のケラチノサイトを、２５μＭ−カルシウム ＳＦＫＭ（対照）または１２５μＭ−カルシウム ＳＦＫＭとともに、２４時間、インキュベートした。その後、これらの細胞を、１％ エタノールの存在下および不在下で、０．５〜１μＣｉ／ウエル ［１４Ｈ］グリセロールとともに、さらに３０分間、インキュベートした。０．２％ ＳＤＳ（±５ｍＭ ＥＤＴＡ）の添加によって反応を停止させ、放射標識ＰＧを抽出し、薄層クロマトグラフィーによって分離し、定量した。値は、対照（エタノール不含）に対して〜倍と表し、４回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照に対して、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、１２５μＭカルシウム ＳＦＫＭのみに対して、○ｐ＜０．０１。
【図１０】細菌性ホスホリパーゼＤによって、対照細胞に対して高濃度の細胞外カルシウムで前処理した細胞から単離されたホスファチジルグリセロールからのほうが、増加した放射標識が放出されたことを示す図である。ほぼ集密のケラチノサイトを、２５μＭ−カルシウム ＳＦＫＭ（対照）または１２５μＭ−カルシウム ＳＦＫＭとともに、２４時間、インキュベートした。その後、これらの細胞を、１μＣｉ／ウエル ［１４Ｃ］グリセロールとともに、さらに３０分間、インキュベートし、その後、これらの脂質をクロロホルム／メタノールに抽出し、薄層クロマトグラフィーによってＰＧを分離した。可溶化後、対照細胞（Ｃｏｎ）または１２５μＭ カルシウム処理細胞（Ｃａ２＋）から単離されたＰＧを、細菌性（ＰＬＤ）とともに、または伴わずに（Ｈ２Ｏ）インキュベートし、薄層クロマトグラフ分離後、ＰＧ中に残存する放射活性（明るい縞模様の棒）およびホスファチジン酸中に残存する放射活性（暗い縞模様の棒）を定量した。値は、３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭを意味する；対応する未処理対照値に対して、＊ｐ＜０．００１、対応する未処理カルシウム処理値対して、○ｐ＜０．００１。
【図１１】ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）は、ＰＬＤを活性化するにもかかわらず、ホスファチジルグリセロールの形成を誘導しないことを示す棒グラフである。ほぼ集密のケラチノサイトを放射標識なしで（ホスファチジルグリセロール生成のため）または２．５μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］オレエートで前標識して（ホスファチジルエタノール形成のため）、２０〜２４時間、インキュベートした。その後、これらの細胞を、［３Ｈ］グリセロールの存在下（ホスファチジルグリセロール生成のため）、または０．５％ エタノールの存在下（ホスファチジルエタノール形成のため）で、ビヒクル（０．０５〜０．１％ ＤＭＳＯ；Ｃｏｎ）または１００ｎＭ ＰＭＡで刺激した。０．２％ ＳＤＳ（±５ｍＭ ＥＤＴＡ）の添加によって反応を停止させ、放射標識ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）またはホスファチジルエタノール（ＰＥｔ）を抽出し、薄層クロマトグラフィーによって分離し、定量した。値は、対照に対して〜倍と表し、二重重複または三重重複で行った３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対応のないスチューデントｔ−検定により、適切な対照に対して、＊ｐ＜０．０２。
【図１２】ＰＭＡとの同時インキュベーションではなく、ＰＭＡでの前処理により、［３Ｈ］グリセロール取り込みが阻害されることを説明する図である。グリセロール取り込みは、ＰＭＡを用いておよび用いずに、前処理または同時に処理した細胞において測定した。「前処理なし」サンプルについては、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］グリセロールおよび０．１％ ＤＭＳＯ（対照）または１００ｎＭ ＰＭＡを含有するＳＦＫＭ中で、５分間、細胞をインキュベートした。「ＰＭＡで３０分の前処理」サンプルについては、集密ケラチノサイトを、０．１％ ＤＭＳＯ（対照）または１００ｎＭ ＰＭＡを含有するＳＦＫＭ中で、３０分間、プレインキュベートした。その後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］グリセロールを含有するＳＦＫＭ中で、５分間、細胞をインキュベートした。サンプルの両方のセットについて、放射標識グリセロールの取り込みを測定した。値は、二重重複または三重重複で行った３回（前処理なし）または５回（３０分の前処理）の独立した実験の平均を意味する；１００％の対照値（点線）に対して、＊ｐ＜０．００１。
【図１３】ｐＨ４の細胞外培地が、放射標識グリセロール取り込み（Ａ）およびＰＧ合成（Ｂ）を阻害することを説明する図である。ケラチノサイトを、対照（２５μＭ Ｃａ２＋）培地（Ｃｏｎ）または１２５μＭ Ｃａ２＋（Ｃａ２＋）含有培地で、２４時間、前処理した。その後、一部の細胞を、５（パネルＡ）分間、ｐＨ４の培地とともにインキュベートし、その後、示されているようにｐＨ４または７（７．４）で、（Ａ）５分間の［３Ｈ］グリセロール取り込みを測定または（Ｂ）１０分間の［１４Ｃ］ＰＧ合成を行った。結果は、二重重複で行った（Ａ）４回または（Ｂ）３回の実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値（ｐＨ７で測定した対照細胞におけるグリセロールの取り込みまたはＰＧ合成）に対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１；ｐＨ７（７．４）で測定したＣａ２＋値に対して、ｔｐ＜０．０１、‖ｐ＜０．００１。［３Ｈ］グリセロール取り込み（パネルＡ）および［１４Ｃ］ＰＧ合成（パネルＢ）に対する低ｐＨの効果が本質的に可逆的であったことに注目すべし（ｐＨ７とｐＨ４／７を比較）。
【図１４】ＡＱＰ３過発現が、ケラチン５プロモーター活性を低下させ、ケラチン１０プロモーター活性を増大させ、ならびにインボルクリンプロモーター活性に対する高［Ｃａ２＋］ｅの効果を強化することを実証する棒グラフである。ＴｒａｎｓＩＴ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅをこの製造業者が説明しているとおりに使用して、１次ケラチノサイトを、ｐｃＤＮＡ３ベクター単独（対照）またはＡＱＰ３を有するこのベクターおよび（Ａ）ケラチン５プロモーター／レポーター遺伝子構築物または（Ｂ）インボルクリンプロモーター／レポーター遺伝子構築物（および正規化のためにｐＲＬ−ＳＶ４０）で、コ・トランスフェクトした。２４時間後、２５μＭ（対照）または１ ＨｉＭ−Ｃａ２＋を含有する培地をさらに２４時間にわたって細胞に供給した。その後、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｋｉｔをこの製造業者が指示しているとおりに使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。活性は、ｐｃＤＮＡ３でトランスフェクトした対照細胞を基準にして示し、三重重複で行った３回の実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照（未処理ｐｃＤＮＡ３ベクター）値に対して、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１；対照条件下、ＡＱＰ３でトランスフェクトした値に対して、ｆｐ０．０１、ｆ†ｐθ ．００１；およびＣａ２＋で処理したｐｃＤＮＡ３ベクター対照値に対して、§ｐ＜０．００１。
【図１５】グリセロールは、ＤＮＡ合成を阻害し、高い細胞外Ｃａ２＋濃度の阻害効果を強化するが、キシリトールおよびソルビトールではしないことを説明する図である。（Ａ）ほぼ集密のケラチノサイトを、２４時間、０．０２または０．１％ グリセロールとともにインキュベートし、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みについての組み込みとして、ＤＮＡ合成を測定した。（Ｂ）ほぼ集密のケラチノサイトを、２５μＭ（対照；白抜きの記号）または１２５μＭ Ｃａ２＋（Ｃａ２＋；黒塗りの記号）を含有するＳＦＫＭ中、示されている濃度のグリセロール（Ｇ、四角）または等価濃度のキシリトール（Ｘ、丸）とともに、２４時間、インキュベートした。（Ｃ）ほぼ集密のケラチノサイトを、２５μＭ（対照；白抜きの記号）または１２５μＭ Ｃａ２＋（Ｃａ２＋；黒塗りの記号）を含有するＳＦＫＭ中、示されている濃度のグリセロール（Ｇ）または等価濃度のソルビトール（Ｓ、三角）とともに、２４時間、インキュベートした。その後、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みを判定した。値は、二重重複で行った４から５回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値に対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；Ｃａ２＋が存在する状態での値のみに対して、ｆｐ＜０．０５。
【図１６】１，２−プロピレングリコール（１，２−プロパンジオール）が、ＤＮＡ合成を阻害し、高い細胞外 Ｃａ２＋濃度の阻害効果を強化することを実証する図である。（Ａ）ほぼ集密のケラチノサイトを、２５μＭ（対照；白抜きの記号）または１２５μＭ Ｃａ２＋（Ｃａ２＋；黒塗りの記号）を含有するＳＦＫＭ中、示されている濃度のグリセロール（Ｇ、四角）または等価濃度の１，２−プロピレングリコール（１，２−プロパンジオール、三角）とともに、２４時間、インキュベートした。その後、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みを、［３］におけるがごとく判定した。値は、二重重複で行った３から５回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値に対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；Ｃａ２＋が存在する状態での値のみに対して、｜ｐ＜０．０５。（Ｂ）グリセロールおよび１，２−プロピレングリコールの構造が、これらの立体配置の類似性の証拠となる。
【図１７】ＰＧリポソームが、増殖性ケラチノサイトにおけるＤＮＡ合成を阻害し、トランスグルタミナーゼ活性を用量依存的に刺激することを説明する図である。（Ａ）ほぼ集密のケラチノサイトを、無血清ケラチノサイト培地中でのＰＧのバス超音波処理により調製した、示されている濃度のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）で、２４時間、処理した。その後、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みを判定した。対照におけるＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みは、８５，５５０±５，７３０ｃｐｍ／ウエルであった。値は、二重重複で行った７から９回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値に対して、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）ほぼ集密のケラチノサイトを、無血清ケラチノサイト培地中でのＰＧのバス超音波処理により調製した、示されている濃度のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）で、２４時間、処理した。その後、トランスグルタミナーゼ活性を判定した。値は、二重重複で行った独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；用量が増すにつれて、有意な刺激の傾向を示した；＊ｐ＜０．０５。
【図１８】ＰＧリポソームが、成長阻害ケラチノサイトにおけるＤＮＡ合成を増加させることを示す図である。集密ケラチノサイトを、無血清ケラチノサイト培地中でのＰＧのバス超音波処理により調製した、示されている濃度のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）で、２４時間、処理した。［３Ｈ］チミジン組み込みを上のとおり判定した。対照条件下でのＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン組み込みは、１２，８８０±１，０４０ｃｐｍ／ウエルであった。値は、二重重複で行った３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを意味する；対照値に対して、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１。
【図１９】創傷治癒率に対するグリセロールおよびホスファチジルグリセロールの効果を示す棒グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラチノサイトを、ケラチノサイトにおけるシグナル伝達を調節するために有効量のホスファチジルグリセロール、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグと接触させることを含む、ケラチノサイト機能の調節方法。
【請求項２】
核酸合成が、調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸合成が、阻害される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸合成が、増進される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
皮膚細胞シグナル伝達を調節するために有効量の、ホスファチジルグリセロール、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグを含む、皮膚の状態を治療するための組成物。
【請求項６】
医薬的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ホスファチジルグリセロールが、皮膚細胞分裂を阻害するまたは減少させるために有効量で存在する、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記ホスファチジルグリセロールが、皮膚細胞分裂を誘導または増進するために有効量で存在する、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記皮膚の状態が、望ましくない皮膚細胞増殖を特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記皮膚の状態が、乾癬、湿疹、日光性角化症、アトピー性皮膚炎、基底細胞癌、非黒色腫性皮膚癌および無秩序な細胞分裂のうちの少なくとも１つから選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
前記皮膚の状態が、細胞老化である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
前記皮膚の状態が、創傷、瘢痕または他の物理的皮膚損傷のうちの少なくとも１つのから選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項１３】
グリセロールまたはこの機能性誘導体をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１４】
皮膚細胞シグナル伝達を調節するために有効量の、ホスファチジルグリセロール、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグのリポソームを含む、皮膚の状態を治療するための組成物。
【請求項１５】
皮膚の状態を治療するための方法であって、ホスファチジルグリセロール、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグを、前記皮膚の状態を治療するために有効量で宿主に投与することを含む方法。
【請求項１６】
前記ホスファチジルグリセロールが、局所投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ホスファチジルグリセロールが、リポソームを使用して送達される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記皮膚の状態が、望ましくない皮膚細胞増殖を特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記皮膚の状態が、乾癬、湿疹、日光性角化症、アトピー性皮膚炎、基底細胞癌、非黒色腫性皮膚癌および無秩序な細胞分裂のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記皮膚の状態が、細胞老化、加齢、および露光に起因する皮膚損傷のうちの少なくとも１つのから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記皮膚の状態が、創傷、日焼け、糖尿病性潰瘍、加齢性潰瘍、瘢痕および他の物理的皮膚損傷のうちの少なくとも１つのから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
宿主のケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールまたはこの機能性誘導体の量を調節することを含む、宿主における皮膚の状態を治療するための方法。
【請求項２３】
宿主のケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールまたはこの機能性誘導体の量を調節することを含む、宿主における創傷治癒の加速方法。
【請求項２４】
ケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールまたはこの機能性誘導体の量を変更することによる、ケラチノサイト機能の調節方法。
【請求項２５】
前記ホスファチジルグリセロールの量の変更が、ホスファチジルグリセロールの量を増加させることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ホスファチジルグリセロールの量の増加が、ケラチノサイトを一定量のホスファチジルグリセロールと接触させることを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ホスファチジルグリセロールの量の増加が、細胞のホスファチジルグリセロール生産を増加させることを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞のホスファチジルグリセロール生産の増加が、ホスホリパーゼＤ２、アクアポリン−３またはこれらの組み合わせの活性を増大させることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ケラチノサイトを一定量のグリセロールまたはこの機能性誘導体と接触させることをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ケラチノサイト中のアクアポリン−３、ホスホリパーゼＤ２またはこれらの組み合わせの量または活性を調節して、このケラチノサイトにおけるシグナル伝達を調節することを含む、ケラチノサイト機能の調節方法。
【請求項３１】
アクアポリン−３、ホスホリパーゼＤ２またはこれらの組み合わせの量または活性を調節することにより、ケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールのレベルが調節される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記アクアポリン−３の量の調節が、ケラチノサイトにおけるアクアポリン−３の発現を増加させることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記アクアポリン−３の活性の調節が、ケラチノサイトにおけるアクアポリン−３の活性を増大させることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ホスホリパーゼＤ２の活性の調節が、ケラチノサイトにおけるホスホリパーゼＤ２の活性を増大させることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ケラチノサイトにおけるホスホリパーゼＤ２の量の調節が、ケラチノサイトにおけるホスホリパーゼＤ２の発現を増加させることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ケラチノサイトにおけるホスホリパーゼＤ２の量の調節が、ケラチノサイトにホスホリパーゼＤ２を投与することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
ホスファチド酸およびホスファチジルグリセロールの生産を調節するために有効量の非グリセロール系アルコールとケラチノサイトを接触させることを含む、ケラチノサイト機能の調節方法。
【請求項３８】
宿主における皮膚の状態を治療する方法であって、この宿主に前記皮膚の状態を治療するために有効量のホスファチジルグリセロール、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグを投与することを含み、前記皮膚の状態が皮膚細胞の増殖不足を特徴とする場合には、ホスファチジルグリセロールが皮膚細胞増殖を刺激し、ならびに前記皮膚の状態が皮膚細胞の増殖過多を特徴とする場合には、ホスファチジルグリセロールが皮膚細胞増殖を阻害する方法。
【請求項３９】
宿主におけるケラチノサイト増殖を正常化する方法であって、この宿主に一定量のホスファチジルグリセロール、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグを投与することを含み、増殖減少状態下ではホスファチジルグリセロールがケラチノサイト増殖を刺激し、増殖過多状態下ではホスファチジルグリセロールがケラチノサイト増殖を阻害する方法。
【請求項４０】
宿主ケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールまたはこの機能性誘導体の量を調節することを含む、宿主におけるケラチノサイト増殖の調節方法。
【請求項１】
ケラチノサイトを、ケラチノサイトにおけるシグナル伝達を調節するために有効量のホスファチジルグリセロール、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグと接触させることを含む、ケラチノサイト機能の調節方法。
【請求項２】
核酸合成が、調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸合成が、阻害される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸合成が、増進される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
皮膚細胞シグナル伝達を調節するために有効量の、ホスファチジルグリセロール、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグを含む、皮膚の状態を治療するための組成物。
【請求項６】
医薬的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ホスファチジルグリセロールが、皮膚細胞分裂を阻害するまたは減少させるために有効量で存在する、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記ホスファチジルグリセロールが、皮膚細胞分裂を誘導または増進するために有効量で存在する、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記皮膚の状態が、望ましくない皮膚細胞増殖を特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記皮膚の状態が、乾癬、湿疹、日光性角化症、アトピー性皮膚炎、基底細胞癌、非黒色腫性皮膚癌および無秩序な細胞分裂のうちの少なくとも１つから選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
前記皮膚の状態が、細胞老化である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
前記皮膚の状態が、創傷、瘢痕または他の物理的皮膚損傷のうちの少なくとも１つのから選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項１３】
グリセロールまたはこの機能性誘導体をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１４】
皮膚細胞シグナル伝達を調節するために有効量の、ホスファチジルグリセロール、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグのリポソームを含む、皮膚の状態を治療するための組成物。
【請求項１５】
皮膚の状態を治療するための方法であって、ホスファチジルグリセロール、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグを、前記皮膚の状態を治療するために有効量で宿主に投与することを含む方法。
【請求項１６】
前記ホスファチジルグリセロールが、局所投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ホスファチジルグリセロールが、リポソームを使用して送達される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記皮膚の状態が、望ましくない皮膚細胞増殖を特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記皮膚の状態が、乾癬、湿疹、日光性角化症、アトピー性皮膚炎、基底細胞癌、非黒色腫性皮膚癌および無秩序な細胞分裂のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記皮膚の状態が、細胞老化、加齢、および露光に起因する皮膚損傷のうちの少なくとも１つのから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記皮膚の状態が、創傷、日焼け、糖尿病性潰瘍、加齢性潰瘍、瘢痕および他の物理的皮膚損傷のうちの少なくとも１つのから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
宿主のケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールまたはこの機能性誘導体の量を調節することを含む、宿主における皮膚の状態を治療するための方法。
【請求項２３】
宿主のケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールまたはこの機能性誘導体の量を調節することを含む、宿主における創傷治癒の加速方法。
【請求項２４】
ケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールまたはこの機能性誘導体の量を変更することによる、ケラチノサイト機能の調節方法。
【請求項２５】
前記ホスファチジルグリセロールの量の変更が、ホスファチジルグリセロールの量を増加させることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ホスファチジルグリセロールの量の増加が、ケラチノサイトを一定量のホスファチジルグリセロールと接触させることを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ホスファチジルグリセロールの量の増加が、細胞のホスファチジルグリセロール生産を増加させることを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞のホスファチジルグリセロール生産の増加が、ホスホリパーゼＤ２、アクアポリン−３またはこれらの組み合わせの活性を増大させることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ケラチノサイトを一定量のグリセロールまたはこの機能性誘導体と接触させることをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ケラチノサイト中のアクアポリン−３、ホスホリパーゼＤ２またはこれらの組み合わせの量または活性を調節して、このケラチノサイトにおけるシグナル伝達を調節することを含む、ケラチノサイト機能の調節方法。
【請求項３１】
アクアポリン−３、ホスホリパーゼＤ２またはこれらの組み合わせの量または活性を調節することにより、ケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールのレベルが調節される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記アクアポリン−３の量の調節が、ケラチノサイトにおけるアクアポリン−３の発現を増加させることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記アクアポリン−３の活性の調節が、ケラチノサイトにおけるアクアポリン−３の活性を増大させることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ホスホリパーゼＤ２の活性の調節が、ケラチノサイトにおけるホスホリパーゼＤ２の活性を増大させることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ケラチノサイトにおけるホスホリパーゼＤ２の量の調節が、ケラチノサイトにおけるホスホリパーゼＤ２の発現を増加させることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ケラチノサイトにおけるホスホリパーゼＤ２の量の調節が、ケラチノサイトにホスホリパーゼＤ２を投与することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
ホスファチド酸およびホスファチジルグリセロールの生産を調節するために有効量の非グリセロール系アルコールとケラチノサイトを接触させることを含む、ケラチノサイト機能の調節方法。
【請求項３８】
宿主における皮膚の状態を治療する方法であって、この宿主に前記皮膚の状態を治療するために有効量のホスファチジルグリセロール、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグを投与することを含み、前記皮膚の状態が皮膚細胞の増殖不足を特徴とする場合には、ホスファチジルグリセロールが皮膚細胞増殖を刺激し、ならびに前記皮膚の状態が皮膚細胞の増殖過多を特徴とする場合には、ホスファチジルグリセロールが皮膚細胞増殖を阻害する方法。
【請求項３９】
宿主におけるケラチノサイト増殖を正常化する方法であって、この宿主に一定量のホスファチジルグリセロール、この機能性誘導体、この医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグを投与することを含み、増殖減少状態下ではホスファチジルグリセロールがケラチノサイト増殖を刺激し、増殖過多状態下ではホスファチジルグリセロールがケラチノサイト増殖を阻害する方法。
【請求項４０】
宿主ケラチノサイト中のホスファチジルグリセロールまたはこの機能性誘導体の量を調節することを含む、宿主におけるケラチノサイト増殖の調節方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２００８−５２１８１８（Ｐ２００８−５２１８１８Ａ）
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４３５２２（Ｐ２００７−５４３５２２）
【出願日】平成１７年１１月２３日（２００５．１１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８３３７３
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（５０７１６６１９５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２３日（２００５．１１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８３３７３
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（５０７１６６１９５）
【Ｆターム（参考）】
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