サンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法及びこの方法を実施するために用いるキット、そして因子を欠失した血漿を用いてサンプル中の因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法
【課題】本発明は、サンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度をｅｘ―ｖｉｖｏ（体外）で測定するための方法を実現することを目的としている。
【解決手段】このため、上記の方法は、ａ）サンプルをＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿とを混合するステップと、ｂ）カルシウム・イオン源、リン脂質剤、及び組織因子で構成されるトロンビン発生反応の開始成分を付加するステップと、Ｃ）反応液でトロンビン発生テストを行ってトロンボグラム付与パラメータを得るステップと、ｄ）トロンボグラムのパラメータを標準的なトロンボグラムのパラメータと比較し、各標準トロンボグラムが反応液内の１ｐＭから５ｎＭの範囲の固定較正済み濃度で得られるステップと、ｅ）ステップｄ）からＦＶＩＩａ濃度を推定するステップと、により構成される。
【解決手段】このため、上記の方法は、ａ）サンプルをＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿とを混合するステップと、ｂ）カルシウム・イオン源、リン脂質剤、及び組織因子で構成されるトロンビン発生反応の開始成分を付加するステップと、Ｃ）反応液でトロンビン発生テストを行ってトロンボグラム付与パラメータを得るステップと、ｄ）トロンボグラムのパラメータを標準的なトロンボグラムのパラメータと比較し、各標準トロンボグラムが反応液内の１ｐＭから５ｎＭの範囲の固定較正済み濃度で得られるステップと、ｅ）ステップｄ）からＦＶＩＩａ濃度を推定するステップと、により構成される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ）と因子ＶＩＩＩ （ＦＶＩＩＩ）、因子ＩＸ（ＦＩＸ）及び因子ＸＩ（ＦＸＩ）で構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失した血漿を用いて、サンプル内の活性化された因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固は、身体が血管を損傷した場合に出血を制御して、大量の出血を防ぐことを可能にするメカニズムである。
【０００３】
血液凝固は、血液内に存在して、蛋白質分解性酵素を介してその活性化された状態に変えられる種々の酵素前駆体及び共同因子前駆体が関与する一連のステップを通じて行われる。
この血液凝固の一連のステップにおいて、外因性凝集経路及び内因性凝集経路と名づけられた２つの経路を認めることができる。
両方の経路ともプロトロンビナーゼと呼ばれる複合体の形成に導き、この複合体は活性化された因子Ｘ（ＦＸａ）、活性化された因子Ｖ（ＦＶａ）、リン脂質、及びカルシウムで構成されている。
これは、プロトロンビンをトロンビンに活性化して、可溶性フィブリノゲンの血餅を形成する不溶性フィブリノゲンへの転換を可能にするトロンビン前駆体である。
【０００４】
この外因性経路は血漿内に存在するＦＶＩＩの作用を伴っている。
しかしながら、凝集連鎖を開始させるためには、予めＦＶＩＩａに活性化しておかなければならない。
ＦＶＩＩａ（複合化されていない）だけでは、蛋白質分解性が低い。
ＦＶＩＩａが血管損傷の際に放出されるリン脂質と結合した蛋白質である組織因子（ＴＦ）と複合化されると、この活性が増強される。
ＦＶＩＩａ‐ＴＦ複合体はカルシウム・イオンの存在下で因子Ｘを因子Ｘａに転化させる。
このＦＶＩＩａ‐ＴＦ複合体はＦＩＸもＦＩＸａに転化させて、凝集の内因性経路を触媒する。
その代わりに、因子ＩＸａとＸａはＦＶＩＩをＦＶＩＩａに活性化させる。
因子Ｖａ及びリン脂質（プロトロンビナーゼ）と複合化された因子Ｘａは、プロトロンビンをトロンビンに転化させる。
トロンビンはフィブリノゲンに作用してそれをフィブリンに転化させ、また因子Ｖを因子Ｖａに活性化させＦＶＩＩＩをＦＶＩＩＩａに活性化させる他の活性をも有している。
またトロンビンはカルシウムの存在下で因子ＸＩＩＩを因子ＸＩＩＩに活性化させ、これによりフィブリン塊の膠着を可能にする。
【０００５】
凝固の外因性経路においてＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体によってＦＩＸがＦＩＸａに活性化される際、内因性凝集経路においてＦＸＩａによってＦＩＸからＦＩＸａが生成され、そしてそれ自体が内皮下層などの電気的陰性の表面で血液と接触することにより活性化された因子ＸＩＩによって活性化される。
【０００６】
従ってビタミンＫ依存性糖蛋白質であるＦＶＩＩａは血餅の形成につながる凝固メカニズムにおいて重要な役割を果たす。
またＦＶＩＩａは、因子ＶＩＩＩ又はＩＸが存在しない場合でも、大量出血を生じさせる組織損傷の後に放出される組織因子の存在下で局所的に作用するといった利点を有する。
このためＦＶＩＩａは、出血に伴うある凝固性疾患の治療のために長年にわたって使用されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，４７２，８５０号
【特許文献２】米国特許第５，７４１，６５８号
【特許文献３】国際特許ＷＯ１９９２／０１８８７０号
【特許文献４】米国特許第５，７５０，３５８号
【特許文献５】米国特許第５，７４１，６５８号
【特許文献６】米国特許第５，４７２，８５０号
【特許文献７】欧州特許第０ ６４１ ４４３号
【特許文献８】国際特許ＷＯ ０３／００４６９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
最初のアプローチは血漿からＦＶＩＩａを得ることであった。
しかしこの血漿からのＦＶＩＩａの産生には供給源の有効性による制限があり、そしてこの血漿の使用には、例えばプリオンなどの病原体やウイルスを伝染させるリスクも伴う。
これらの問題は、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社による、血漿ＦＶＩＩａに構造的に類似した糖蛋白質である遺伝子組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）の開発によって解決された。
【０００９】
ｒＦＶＩＩａの主な治療の適応（米国、ヨーロッパ及び日本における）は、抗因子ＶＩＩＩ抗体を発現した血友病Ａの個体及び抗因子ＩＸ抗体を発現した血友病Ｂの個体における自発的または外科的誘導による出血の治療である。
またヨーロッパにおいては、先天的にＦＶＩＩが欠乏している患者やグランツマン血小板無力症に悩む患者への使用にも適応されている。
【００１０】
さらに血液凝固因子が欠乏しているのでも血小板無力症でもない患者の外科手術においても大量出血を抑制するのにｒＦＶＩＩａが有効であることについて多くの報告がなされている。
【００１１】
このようにＦＶＩＩａがますます広く用いられることにより、ＦＶＩＩａの活性を測定する方法、そしてまたＦＶＩＩａの濃度を判定する方法、例えば潜在的にＦＶＩＩａを含有するサンプルの濃度を測定するあるいは患者におけるＦＶＩＩａの血漿濃度を測定してＦＶＩＩａの投与量が治療対象となる止血障害の治療に十分に適合しているかどうか、また治療患者が低凝固または過凝固の状態にないかどうかを確認する方法が開発されるに至った。
【００１２】
ＦＶＩＩａ活性を検出するための最も知られた方法は、凝固時間、ＰＴＴ（部分トロンボプラスチン時間）、ａＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）の測定、そしてＴＥＧ（トロンボエラストグラフィー）及びＴＧＴ（トロンビン発生テスト）である。
これらの方法によってＦＶＩＩａの活性を測定することが可能になるが、ＦＶＩＩａの正確な濃度を直接測定することは不可能である。
【００１３】
ＦＶＩＩａによって生成されるＦＸａの色素原アッセイまたは蛍光原アッセイのようなＦＶＩＩａ濃度を直接測定する方法は、ＦＶｌｌａの影響とＦＶＩＩの影響との間に区別をつけることが不可能であるため、不適切であることが判明している。
【００１４】
ＦＶＩＩａ免疫アッセイキット（ＩＭＵＢＩＮＤ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ）が市場に出ているが、この技術を実行するための実験条件はその制御が困難である。
【００１５】
ＦＶＩＩａ濃度を測定するためのその他の方法は、組換え短縮型ＴＦを用いた蛋白質分解活性の測定（Ｓｔａｃｌｏｔ ＶＩＩａ−ｒＴＦ、Ｓｔａｇｏ）（米国特許第５，４７２，８５０号、米国特許第５，７４１，６５８号、国際特許ＷＯ１９９２／０１８８７０号、米国特許第５，７５０，３５８号、米国特許第５，７４１，６５８号、米国特許第５，４７２，８５０号、欧州特許第０ ６４１ ４４３号）あるいはＦＶＩＩａ−抗トロンビン複合体（ＷＯ ０３／００４６９４）の濃度の測定などについて記した文献に記載されている。
しかしこれらの方法はあまり正確ではなく、またその実行が困難でもある。
【００１６】
現在、ＦＶＩＩａを用いた治療の効力を評価するために生物学者及び医療関係者によってしばしば用いられる１つの方法はトロンボエラストグラフィーの利用に基づいている。
この方法は、血餅形成を時間との関連で機械的に分析することによって全血液の物理的性質を測定するステップにより構成されている。
トロンボエラストグラフ（登録商標）により生成されたグラフから抽出されるパラメータ（トロンボグラムまたはトロンボエラストグラム（登録商標））に基づいて医療関係者は患者の凝固能を評価することができる。
この方法は正確ではあるのだが単調であり、反復的なルーチン分析にはほとんど適合せず、また血液サンプル採取の後１時間以内に行う必要があることもあり、複数のサンプリングを行う場合には適用が困難である。
さらにこの方法ではＦＶＩＩａ濃度の測定も行うことができない。
【００１７】
従って、実行が容易であり、且つＦＶＩＩａ濃度の測定、例えばＦＶＩＩａを潜在的に含有するサンプルの濃度を測定する、あるいは上に述べたように患者のＦＶＩＩａの血漿濃度を測定して投与されるＦＶＩＩａの薬用量が治療対象となる止血障害に対して十分に適合しているか、また治療患者が低凝固または過凝固の状態にないかどうかを確認するために有効な方法が真に必要とされている。
【００１８】
この発明の目的は、実行が容易であり、且つＦＶＩＩａ濃度の測定、例えばＦＶＩＩａを潜在的に含有するサンプルの濃度を測定する、あるいは上に述べたように患者のＦＶＩＩａの血漿濃度を測定して投与されるＦＶＩＩａの薬用量が治療対象となる止血障害に対して十分に適合しているか、また治療患者が低凝固または過凝固の状態にないかどうかを確認するために有効な方法を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明はサンプル中のＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ‐ｖｉｖｏで測定する方法に関するものであり、この方法は：
ａ）前記サンプルをＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿と混合するステップと、
ｂ）カルシウム・イオン源、リン脂質剤、及び組織因子で構成されるトロンビン発生反応の開始成分を付加するステップと、
ｃ）このようにして得られた反応液でトロンビン発生テスト（ＴＧＴ）を行ってトロンボグラム付与パラメータを得るステップと、
ｄ）前記トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを標準的なトロンボグラムの類似のパラメータと比較するステップで、各標準トロンボグラムが前記反応液内の１ｐＭから５ｎＭの範囲の固定較正済み濃度で得られることを特徴とするステップと、
ｅ）ステップｄ）から前記サンプルの上に述べた範囲内のＦＶＩＩａ濃度を推定するステップと
により構成されている。
【００２０】
本出願人は、驚くべきことに、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失した血漿（二重欠損血漿）を使用することによって、サンプルのＦＶＩＩａ濃度を測定する方法において使用が可能であり、また信頼性が高く、再生可能で、その使用が容易である試薬を得ることができるのを発見した。
【００２１】
本発明のこの方法を用いることによって、サンプルのＦＶＩＩａ濃度とトロンビン発生テストの特定のパラメータとの間に相関を確立することが可能となる。
【００２２】
標準的なトロンボグラムを用いて判定された、即ち反応液中のＦＶＩＩａの可変の、較正済み濃度を用いて得られたこの相関を利用することによって、標準的なトロンボグラムにより得られたデータと測定の対象となるサンプルのトロンボグラムにより得られたデータとを比較することで、サンプル中の未知のＦＶＩＩａ濃度を判定することが可能となる。
【００２３】
当業者には周知の、ステップｃ）のトロンビン発生テスト（ＴＧＴ）は、トロンビン発生反応の開始成分‐この場合はカルシウム・イオン源、リン脂質剤及び組織因子（ＴＦ）がＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿と混合されたＦＶＩＩａを含んでいるサンプルと接触する際の、生成されるトロンビンの量とこのトロンビンの生成に必要となる時間とを測定する連続測定に基づいている。
【００２４】
このように反応液を形成し、また所定の分量であるこれら全ての成分が接触した状態に置かれると同時に、トロンビン発生反応が開始され、これによってこのテスト（ｔ０）の開始時間を判定することが可能となる。
これらの各成分の分量はこの反応が確実に発生可能となるように選択される。
このテストは、好適には生成されたトロンビンを発現させる物質を用いて行われる。
前記物質は、トロンビンにより分解されて蛍光発生化合物を生成する蛍光原物質、あるいは色素原物質である。
【００２５】
蛍光は、トロンボグラムを得るために使用可能なデータを収集することができるソフトウェアにより構成される従来の蛍光定量器などの、反応液中のトロンビン形成を測定するための装置によって検出される。
このトロンボグラムは、実験時間に渡って描かれ、生成されるトロンビンの最大量に相当する最大値を有した曲線を示す。
サンプル中のＦＶＩＩａの量が増加すればするほど、反応液におけるトロンビンの生成時間はますます短縮され、その限界値へと近づく。
【００２６】
このトロンボグラムは、以下のように定義されるトロンボグラムの少なくとも１つのパラメータを表すデータを提供する（ステップｄ）。
【００２７】
第１のパラメータは、上に述べたような生成される最大のトロンビンに相当するピーク高さである。
第２のパラメータは、ＴＧＴテスト（ｔ０）の開始からトロンビンの発生開始までの間に経過した時間に相当するラグ・タイムである。
第３のパラメータは、ＴＧＴテスト（ｔ０）の開始からトロンビンの生成量が最大に達するまでの間に経過した時間に相当するピークまでの時間である。
第４のパラメータは、トロンビンの形成速度をｎＭ／分で表した値で、前記ピーク高さを前記ピークに至るまでの時間と前記ラグ・タイムとの差で割った値に相当する。
これらのパラメータはトロンビン形成を測定する装置によって直接提供される。
【００２８】
従ってステップｄ）において、本発明の方法によって得られるトロンボグラムの少なくとも１つのパラメータは、ピーク高さ、速度、ラグ・タイム及びピークに至るまでの時間の中から選択される。
【００２９】
本発明によれば、標準的なトロンボグラムのパラメータは、同じ反応液から成る較正済みサンプルを用いた一連のＴＧＴテストを行うことによって判定されるが、各サンプルは、ピーク高さ及び速度から選択されるパラメータに対して１ｐＭから５ｎＭ、好ましくは１ｐＭから１ｎＭの範囲の、また４つのパラメータに対して好ましくは１ｐＭから５ｎＭの範囲の最終、固定較正済み濃度のＦＶＩＩａを含む。
従って作業条件は反応液の量を同一に保つために同一の条件が適用されるが、ＦＶＩＩａサンプルの追加を通じての若干量の変動は許容される。
従ってトロンボグラムはそのＦＶＩＩａ含量が較正済みの各反応液に対して得られる。
【発明の効果】
【００３０】
この発明によれば、実行が容易であり、且つＦＶＩＩａ濃度の測定、例えばＦＶＩＩａを潜在的に含有するサンプルの濃度を測定する、あるいは上に述べたように患者のＦＶＩＩａの血漿濃度を測定して投与されるＦＶＩＩａの薬用量が治療対象となる止血障害に対して十分に適合しているか、また治療患者が低凝固または過凝固の状態にないかどうかを確認するために有効な方法を実現することができる。
【００３１】
本発明の１つの実施の形態において、標準的なトロンボグラムのパラメータを確立するために用いられるＦＶＩＩａは英国の国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ）による国際ＦＶＩＩａ標準品（ＩＳ−ＦＶＩＩａ）である。
【００３２】
各標準的トロンボグラムから、反応液中のＦＶＩＩａの最終濃度に関する上述の各パラメータの較正変化曲線が判定される。
【００３３】
次にそのＦＶＩＩａ濃度が未知であるサンプルに対して得られる上述のパラメータがステップｄにおいて得られた類似のパラメータと比較される。
この方法において、測定されるサンプルのＦＶＩＩａ濃度は較正済みの標準濃度曲線との比較によって、即ち標準的なトロンボグラムを用いて判定されるため、このＦＶＩＩａ濃度は用いられるパラメータに関わりなく、直接推測することが可能である。
【００３４】
本発明によれば、ＦＶＩＩａサンプル、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失した血漿、トロンビン発生反応を開始させる成分は、液体であるか又は凍結乾燥した形態であってもよく、またこの反応液は注射用水（ＷＦＩ）などの適切な水性溶媒に溶解させることによって調製される。
【００３５】
本発明の特定の一実施の形態によれば、このＦＶＩＩａサンプルは液体の形態である。
標準的なトロンボグラムを得るために必要なのは、反応液の所望の最終濃度を得るために、考察している前記二重欠損血漿と混合するのに適切な量をサンプリングすることだけである。
これは一定量の、しかし異なる濃度のＦＶＩＩａサンプルを前記血漿に追加する方法によっても行うことができる。
【００３６】
判定対象となるＦＶＩＩａ含量を有する１つのサンプルについて、反応液の液量は一定に保ちつつ連続的に希釈し考察している二重欠損血漿に一定量を追加する方法によって、複数のトロンボグラムを得ることも可能である。
このようにして得られたパラメータの結果と標準的トロンボグラムのパラメータ及び希釈率の知見とを比較することによって、ＦＶＩＩａ含量を正確に判定することが可能となる。
【００３７】
リン脂質剤は本発明に適している。
これは濃縮物あるいは凍結乾燥物の形態であってよい。
またこれはホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンを主に含む、あるいはそれらのみで構成される混合物の形態であるのが好ましい。
【００３８】
同様に、天然、血漿、遺伝子組み換え又は形質転換ＴＦなどの任意のＴＦ（組織因子）も適している。
またさらに、因子ＶＩＩを因子ＶＩＩａに転化させる機能は失うが因子ＶＩＩａの酵素活性の補因子として作用する能力は維持している任意の短縮型ＴＦなどの改変型ＴＦも適している。
具体的に言うと、このＴＦは経膜ドメインを欠失しており、この欠失によってそのＴＦ機能において所望の選択的欠損を得ることが可能になる（この組織因子は市販され容易に入手できる）。
本発明の一実施の形態において、この改変型ＴＦは、ＦＶＩＩを含有するサンプルのＦＶＩＩａ濃度のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ−ｖｉｖｏ測定のためにも使用することができる。
【００３９】
本発明の一実施の形態によれば、このＦＶＩＩａを含有するサンプルは、液体又は凍結乾燥した形態の血漿ＦＶＩＩａ（ｐＦＶＩＩａ）、遺伝子組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）あるいは形質転換ＦＶＩＩａ（ＴｇＦＶＩＩａ）を含有する、又は含有していない治療サンプルである。
【００４０】
本発明の特定の一実施の形態において、このＦＶＩＩａを含んでいるサンプルは、哺乳動物の母乳のサンプル、具体的にはその内にＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａを産生する形質転換された哺乳動物の母乳のサンプルである。
【００４１】
形質転換動物の母乳中に遺伝子組み換え蛋白質を産生する方法は以下のステップを含む：所望のタンパク質をコードし、母乳中に天然に分泌される蛋白質のプロモータで制御される遺伝子を含む合成ＤＮＡ分子を非ヒト哺乳動物の胚に導入する。
次にこの胚を同一種の哺乳動物の雌に導入し、この雌が形質転換動物を出生する。
ここまでの手順が十分に完了した後、この哺乳動物から母乳を分泌させ、この母乳を回収する。
この母乳には所望の遺伝子組み換え蛋白質が含まれている。
【００４２】
ヒト以外の哺乳動物の雌の母乳中に蛋白質をつくりだすプロセスの一例が欧州特許第０５２７０６３号明細書において述べられており、この教示は本発明による所望の蛋白質の調製に適用することができる。
【００４３】
ＷＡＰプロモータを含むプラスミドは、ＷＡＰ遺伝子のプロモータを含む配列を導入することにより作成される。
またこのプラスミドはＷＡＰプロモータに依存することになる外来遺伝子を受け入れることができるように作成される。
この所望の蛋白質をコードする遺伝子はＷＡＰプロモータに組み込まれ、それに依存する状態になる。
このプロモータを含むプラスミド及び所望の蛋白質をコードする遺伝子は、ウサギなどの形質転換動物を得るためにウサギ胚の雄性前核の中にマイクロインジェクションすることによって用いられる。
続いてこの胚は体液的に準備された雌の卵管に導入される。
導入遺伝子の存在はサザンブロット法によって出生された若体形質転換ウサギから抽出されたＤＮＡを用いて検出される。
この動物の母乳中の濃度は特定の放射免疫アッセイによって評価される。
【００４４】
その他の文献において、ヒト以外の哺乳動物の雌の母乳中で蛋白質をつくりだす方法が述べられている（米国特許第７，０４５，６７６号及び欧州特許第１ ７３９ １７０号−形質転換哺乳動物中でのフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）の産生）。
【００４５】
もう１つの特定の実施の形態において、このサンプルは、液体又は凍結乾燥した形態の精製されたＦＶＩＩａを含んだサンプルである。
例えばこうしたＦＶＩＩａの純度は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは９９％である。
具体的に言うとこのサンプルは、液体又は凍結乾燥した形態の、精製されたＦＶＩＩａを含んだ治療サンプルである。
【００４６】
本発明の方法によって血漿ＦＶＩＩａ（ｐＦＶＩＩａ）、遺伝子組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）又は形質転換ＦＶＩＩａ（ＴｇＦＶＩＩａ）の濃度を測定することが可能となる。
【００４７】
従って本発明の特定の一実施の形態によれば、本発明は形質転換された哺乳動物の母乳のサンプルのＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ‐ｖｉｖｏ測定するための方法に関するものであって、この方法は：
ａ）前記サンプルをＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿と混合するステップと、
ｂ）カルシウム・イオン源、リン脂質剤、及び組織因子で構成されるトロンビン発生反応の開始成分を付加するステップと、
ｃ）このようにして得られた反応液でトロンビン発生テスト（ＴＧＴ）を行ってトロンボグラム付与パラメータを得るステップと、
ｄ）前記トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを標準的なトロンボグラムの類似のパラメータと比較するステップで、各標準トロンボグラムが前記反応液内の１ｐＭから５ｎＭの範囲の固定較正済み濃度で得られることを特徴とするステップと、
ｅ）ステップｄ）から前記サンプルの上に述べた範囲内のＦＶＩＩａ濃度を推定するステップと
により構成されている。
【００４８】
本発明のもう１つの特定の実施の形態によれば、本発明は精製されたＦＶＩＩａを含んだサンプルのＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ−ｖｉｖｏ測定するための方法に関するものであって、この方法は：
ａ）前記サンプルをＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿と混合するステップと、
ｂ）カルシウム・イオン源、リン脂質剤、及び組織因子で構成されるトロンビン発生反応の開始成分を付加するステップと、
ｃ）このようにして得られた反応液でトロンビン発生テスト（ＴＧＴ）を行ってトロンボグラム付与パラメータを得るステップと、
ｄ）前記トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを標準的なトロンボグラムの類似のパラメータと比較するステップで、各標準トロンボグラムが前記反応液内の１ｐＭから５ｎＭの範囲の固定較正済み濃度で得られることを特徴とするステップと、
ｅ）ステップｄ）から前記サンプルの上に述べた範囲内のＦＶＩＩａ濃度を推定するステップと
により構成されている。
【００４９】
ここで『欠失した』という用語は、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及び／又はＦＸＩの濃度が、当業者には周知の従来のアッセイで測定した際にこれらの因子の検出の閾値を下回るということを意味する。
従来の免疫アッセイを行うためには、例えば市販のキット又は試薬を用いることができる。
【００５０】
本発明の方法によれば、血漿 ＦＶＩＩａ、遺伝子組み換えＦＶＩＩａ及び／又は形質転換ＦＶＩＩａの濃度を測定することが可能となる。
【００５１】
本発明の好ましい一実施の形態によれば、本発明の方法において用いられる血漿は、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失している。
【００５２】
このＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿は種々の形態で得ることができる。
本発明の方法においては、例えば（ＦＶＩＩＩの欠失した）ＦＶＩＩの欠乏した血友病Ａの個体の血漿、（ＦＩＸの欠失した）ＦＶＩＩの欠乏した血友病Ｂの個体の血漿あるいは完全に因子ＸＩが欠失し、またＦＶＩＩの欠乏した患者の血漿を使用することができる。
【００５３】
本発明の特定の一実施の形態において、本発明の方法では、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿である免疫枯渇ヒト血漿を用いる。
【００５４】
この免疫枯渇は種々の形態で得ることができる。
例えば、
−ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩを欠失した血漿は、例えば抗ＦＶＩＩ、抗ＦＶＩＩＩ、抗ウィルブランド因子などの、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ又はこれらの因子の内の１つに結合した蛋白質の特定の抗体を用いて欠失させることによって得られる。
ここでこのウィルブランド因子とはＦＶＩＩＩを血液中に導入する血漿蛋白質である。
−ＦＶＩＩ及びＦＩＸを欠失した血漿は、例えばＦＶＩＩ、ＦＩＸの特定の抗体を用いて欠失させることによって得られる。
−ＦＶＩＩ及びＦＸＩを欠失した血漿は、例えば抗ＦＶＩＩ及び抗ＦＸＩなどの、ＦＶＩＩ、ＦＸＩ又はこれらの因子の内の１つに結合した蛋白質の特定の抗体を用いて欠失させることによって得られる。
【００５５】
本発明の特定の一実施の形態によれば、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿は化学的に枯渇されたヒト血漿である。
このヒト血漿は、ＥＤＴＡを用いてＣａ２＋依存性因子であるＦＶＩＩＩを枯渇させることができる。
一旦この血漿からＦＶＩＩＩが枯渇されると、ＥＤＴＡは当業者には周知の方法により、具体的には透析法によって除去される。
【００５６】
これらの枯渇方法を組み合わせ、前記因子の枯渇した血漿を得ることもできる。
【００５７】
ステップｂ）において反応液中のカルシウム・イオンの最終濃度は１４〜１８ｍＭ、特に１６．７ｍＭであるのが好ましい。このカルシウム・イオン源とはＣａＣｌ２などの生物適合性源を表している。
反応液中のリン脂質剤の最終濃度は１〜２０μＭ、好ましくは３〜５μＭ、また組織因子（ＴＦ）の最終濃度は０．１〜１０ｐＭ、好ましくは０．１〜６ｐＭの範囲内である。
【００５８】
本発明の特定の一実施の形態において、精製されたＦＶＩＩａのサンプルのＦＶＩＩａ濃度のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ‐ｖｉｖｏ測定の方法を実施するためのＴＦ濃度は、０．１〜１０ｐＭ、好ましくは１〜５ｐＭの範囲内にある。
【００５９】
本発明のさらにもう１つの主題は、サンプル中の因子ＶＩＩａ濃度のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ−ｖｉｖｏ測定のための、因子ＶＩＩと因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ及び因子ＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿の使用に関する。
【００６０】
上述のように、血漿は因子ＦＶＩＩのみならず前記因子の内の少なくとも１つをも欠失しており、これによってこれまで未知であったサンプル中のＦＶＩＩａの量と特定のＴＧＴパラメータとの相関を判定することが可能となる。
【００６１】
本発明の好ましい一実施の形態によれば、ＦＶＩＩａ濃度が測定対象となるサンプルは、血漿サンプル、治療サンプル、あるいは上に述べたような遺伝子組み換え又は形質転換ＦＶＩＩａを含む治療サンプルである。
【００６２】
本発明のさらにもう１つの主題は、本発明の方法を実施するために用ることができるキットであって、このキットは：
−ＦＶＩＩと、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したリン脂質血漿と、
−リン脂質剤及び組織因子を含む凍結乾燥物と、
−カルシウム・イオン源、及び
−標準トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを判定するための、凍結乾燥されたＦＶＩＩａのサンプルと
で構成される。
【００６３】
故にこのキットは、本発明によるサンプル中のＦＶＩＩａ濃度を測定する方法を実施するために好適に利用される。
であるがこの目的のためには、ＴＧＴテストを行うための装置を備えることも必要である。
【００６４】
このトロンビン発生テストを行うための装置には、市販のトロンビン較正物質、生成されたトロンビンのための、例えば適切な蛍光発生試薬などの発現剤、例えばトロンボグラムを得るために用いることのできるデータを収集するのに適合したソフトウェアを備えた蛍光定量器などの測定装置、及びマイクロプレートが含まれる。
【００６５】
好適には、このキットには種々の凍結乾燥物を含むよう意図された受容器が含まれる。
この受容器の内容物は注射用水（ＷＦＩ）などの水性溶媒に溶解され、この関心対象の成分のＴＧＴテストを行うための有効濃度が得られる。
この受容器はマイクロプレートのウェルであってもよい。
反応液中のこの関心対象の成分の最終濃度は上に述べた範囲の濃度であるのが好ましい。
【００６６】
またこのキットには、ピペットやマイクロピペットなどのサンプリング装置が含まれるのが好ましい。
【００６７】
上述のように、好ましい一実施の形態による方法を実施するために、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したリン脂質血漿と、リン脂質剤、組織因子及びカルシウム・イオン源を含む凍結乾燥物とを、得られた反応液中のＦＶＩＩａの最終濃度が１ｐＭ〜５ｎＭの範囲となるよう種々の量の凍結乾燥ＦＶＩＩａを加えた注射用水ＷＩＦ中に溶解させる。
【００６８】
特定の一実施の形態において、本発明は形質転換された哺乳動物の母乳のサンプル中のＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ−ｖｉｖｏ測定する方法を実施するために用いることのできるキットに関するものであって、このキットは：
−ＦＶＩＩと、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したリン脂質血漿と、
−リン脂質剤及び組織因子を含む凍結乾燥物と、
−カルシウム・イオン源、及び
−標準トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを判定するための、凍結乾燥されたＦＶＩＩａのサンプルと
で構成される。
【００６９】
特定の一実施の形態において、本発明は精製されたＦＶＩＩａを含んだサンプル中のＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ−ｖｉｖｏ測定する方法を実施するために用いることのできるキットに関するものであって、このキットは：
−ＦＶＩＩと、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したリン脂質血漿と、
−リン脂質剤及び組織因子を含む凍結乾燥物と、
−カルシウム・イオン源、及び
−標準トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを判定するための、凍結乾燥されたＦＶＩＩａのサンプルと
で構成される。
【００７０】
本発明のさらにもう１つの主題は、サンプル中のＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｖｏ 、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ−ｖｉｖｏ測定するための上述のキットの使用に関する。
【００７１】
このキットは使用が容易であり、４℃の温度下で少なくとも１年間保管することが可能である。
必要となる備品は、ＴＧＴテストを行ってサンプルの未知のＦＶＩＩａ濃度を正確に判定するための、生成されたトロンビン用の、例えば適切な蛍光発生試薬などの発現剤、例えばトロンボグラムを得るために用いることのできるソフトウェアを備えた蛍光定量器などの測定装置、及びマイクロプレートのみである。
【００７２】
これは標準的なトロンボグラムとそのＦＶＩＩａ濃度が判定対象となるサンプルのトロンボグラムとを得ることを前提にしたものである。
【００７３】
特定の一実施の形態によれば、このキットは、上述の血漿、遺伝子組み換え又は形質転換ＦＶＩＩａを含有する、又は含有していない治療サンプルのＦＶＩＩａ濃度を測定するために用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１はＦＶＩＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ（０．０２ｎＭから１０ｎＭ）のトロンボグラム。（実施例２）
【図２】図２はＦＶＩＩＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ（０．０１ｎＭから１００ｎＭ）のトロンボグラム。（実施例２）
【図３】図３はＦＩＸ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ（０．０１ｎＭから１００ｎＭ）のトロンボグラム。（実施例２）
【図４】図４はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ（１ｐＭ−５ｎＭ）のトロンボグラム。（実施例４）
【図５】図５はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩ決失血漿内のＦＶＩＩａに対するピーク高さ。（実施例４）
【図６】図６はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩ決失血漿内のＦＶＩＩａ濃度に対するピークに至る時間。（実施例４）
【図７】図７はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対する速度。（実施例４）
【図７ｂ】図７ｂｉｓはＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するラグ・タイム。（実施例４）
【図８】図８はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度（５ｐＭ−１ｎＭ）のトロンボグラム。（実施例５）
【図９】図９はＦＶＩＩ及びＦＩＸ枯渇血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するピーク高さ。（実施例５）
【図１０】図１０はＦＶＩＩ及びＦＩＸ枯渇血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するラグ・タイプ。（実施例５）
【図１１】図１１はＦＶＩＩ及びＦＩＸ枯渇血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するピークに至るまでの時間。（実施例５）
【図１２】図１２はＦＶＩＩ及びＦＩＸ枯渇血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対する速度。（実施例５）
【図１３】図１３はＦＶＩＩ及びＦＸＩ枯渇血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度（５ｐＭ−１ｎＭ）のトロンボグラム。（実施例６）
【図１４】図１４はＦＶＩＩ及びＦＸＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するピーク高さ。（実施例６）
【図１５】図１５はＦＶＩＩ及びＦＸＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するラグ・タイム。（実施例６）
【図１６】図１６はＦＶＩＩ及びＦＸＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するピークに至る時間。（実施例６）
【図１７】図１７はＦＶＩＩ及びＦＸＩ 決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対する速度。（実施例６）
【発明を実施するための形態】
【００７５】
以下に実施例を示すが、これらの実施例は本発明の範囲の制限を意図するものではなく、例示として示されるものである。
【実施例１】
【００７６】
実施例１：ＦＶＩＩ決失血漿の獲得
【００７７】
精製されたヒト血漿ＦＶＩＩに向けられてウサギの体内でつくられたポリクローナル抗体をｒＣＮＢ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｈｉａ社）と結合させて、次に、得られたゲルの２ｍＬをカラム内に入れた。このカラムを２５ｍＬ均衡緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．４）で均衡化させた。
次に、ヒト血漿６ｍＬをこのカラムを通過させた。
これらの条件下で、ＦＶＩＩはカラムに固定されたままで、溶出液が回収された。そのカラムを２０ｍＬの再生緩衝液（５０ｍＭ Ｎａｃｌ、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．４）で再生して、固定されたＦＶＩＩを溶出させ、次に、そのカラムを２０ｍＬの均衡緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩、０．１５Ｍ Ｎａｃｌ、ｐＨ７．４）で再均衡化させた。
【００７８】
これらのステップを７−８回繰り返して、６ｍＬのＦＶＩＩ決失血漿を得た。
【実施例２】
【００７９】
実施例２：標準トロンボグラムを作成するための反応培養液の調製
【００８０】
十分な亮のｒＦＶＩＩａサンプル（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）−Ｎｏｖｏｎｏｒｄｉｓｋ）を用いて、これを、各反応混合物の最終較正濃度が０．０２から１０ｎＭの範囲となるように、実施例１で得たＦＶＩＩ欠損血漿８０μｌに加えた。
【００８１】
この反応混合物は、Ｃａ２＋，リン脂質及びＴＦで構成され、その成分の最終濃度が５ｐＭ ＴＦ、４μＭリン脂質（Ｂｉｏｄｉｓ ＴＳ ３０．００試薬−Ｂｉｏｄｉｓ）及び１６．７ｍＭ Ｃａ２＋であるようなトロンＢｉｎｎ発生反応の開始因子２０μｌとトロンビン固有蛍光発生剤（Ｆｌｕｃａ試薬キット Ｂｉｏｄｉｓ ＴＳ ５０．００）２０μｌを上に述べたｒＦＶＩＩａを含む血漿と混合することによって得られた。
【００８２】
ＴＧＴ曲線をｅＦＶＩＩａの最終濃度が０．０２ｎＭと１０ｎＭの間の範囲に対して作成し、図１に示されているトロンボグラムを得た。
これらの図は、トロンボグラムを作成するためのソフトウエア（Ｔｈｒｏｎｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ）を備えたトロンビン形成時間を測定するための蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ−Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を用いて、励起波長３９０ｎｍ、放出波長４６０ｎｍで検出を行って作成された。
【００８３】
この図は、ＦＶＩＩのみを決失している血漿に関して判定されトロンボグラムでは、ｒＦＶＩＩａ濃度とそのピークで測定されたトロンビン形成時間との間の相関性を得ることが不可能であることを示している。
実際、ピークにに至までの時間とｒＦＶＩＩａの量との間に差異は認められず、その量でのピーク高さに有意な差も認められない。
【００８４】
図２と図３は０．１ｎＭから１００ｎＭのｒＦＶＩＩａをダイアグノスチカ スタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）社からあるいはＡ型血友病患者から得たＦＶＩＩＩのみを決失している血漿と、ダイアグノスチカ スタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）社から得たＦＩＸのみを決失している血漿にそれぞれ加えることで作成された。
【００８５】
これらの図は、それぞれＦＶＩＩＩかＦＩＸのいずれかのみを決失した血漿に関して得られた異なったトロンボグラムでは、ＦＶＩＩａ濃度とピーク・トロンビン形成時間との間の相関性を得ることはできないことを示している。
このピークに至るまでの時間においては変差は認められず、実際的には加えられたＦＶＩＩａの量に対してはほぼ一定である。
【実施例３】
【００８６】
実施例３：ＦＶＩＩを決失しており、同時にＦＶＩＩＩ、ＦＩＸあるいはＦＸＩのいずれかを決失している血漿の獲得
【００８７】
精製されたヒト血漿ＦＶＩＩに向けられてウサギの体内でつくられたポリクローナル抗体をｒＣＮＢ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｈｉａ社）と結合させて、次に、得られたゲルの２ｍＬをカラム内に入れた。
このカラムを２５ｍＬ均衡緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．４）で均衡化させた。
次に、それぞれダイアグノスチカ スタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）社から得られたＦＶＩＩＩ、ＦＩＸあるいはＦＸＩを枯渇させた市販の血漿６ｍＬを上記カラムを通過させた。
これらの条件下で、ＦＶＩＩはカラムに固定されたままで、溶出液が回収された。
そのカラムを２０ｍＬの再生緩衝液（５０ｍＭ Ｎａｃｌ、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．４）で再生して、固定されたＦＶＩＩを溶出させ、次に、そのカラムを２０ｍＬの均衡緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩、０．１５Ｍ Ｎａｃｌ、ｐＨ７．４）で再均衡化させた。
【００８８】
これらのステップを７−８回繰り返して、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸあるいはＦＸＩとＦＶＩＩを決失した二重枯渇血漿６ｍＬを得た。
【実施例４】
【００８９】
実施例４：標準トロンボグラムを作成するための反応培養液の調製
【００９０】
十分な量のｒＦＶＩＩａサンプルを用いて、ダイアグノスチカ スタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）社あるいはＡ型血友病患者から得たＦＶＩＩＩ決失血漿８０μｌに加えて、実施例１及び３の手順を従ってＦＶＩＩを枯渇させ、各反応混合物のｒＦＶＩＩａの最終較正濃度が１ｐＭから５ｎＭの範囲となるようにした。
【００９１】
この反応混合物は、Ｃａ２＋，リン脂質及びＴＦで構成され、その成分の最終濃度が５ｐＭ ＴＦ、４μＭリン脂質（Ｂｉｏｄｉｓ ＴＳ ３０．００試薬−Ｂｉｏｄｉｓ）及び１６．７ｍＭ Ｃａ２＋であるようなトロンＢｉｎｎ発生反応の開始因子２０μｌとトロンビン固有蛍光発生剤（Ｆｌｕｃａ試薬キット Ｂｉｏｄｉｓ ＴＳ ５０．００）２０μｌを上に述べたｒＦＶＩＩａを含む血漿と混合することによって得られた。
１ｐＭから５ｎＭの範囲のｒＦＶＩＩａの最終濃度に関してＴＧＴ曲線を作成し、その種々のパラメータ（ラグ・タイム、ピーク高さ、ピークまでの時間、及び速度）はＦＶＩＩａの含量に対応して容量に基づく方式で徐々に修正した。
これらの図は実施例２と同じ蛍光高度計を用い、同じ条件で測定した。
【００９２】
図４はＦＶＩＩとＦＶＩＩＩが決失した血漿における１ｐＭから５ｎＭの範囲の存在下で得られたトロンボグラムを示している。
ピーク・トロンビン形成時間の減少がサンプル中に存在するｒＦＶＩＩの量の関連して観察される。
この時間はｒＦＶＩＩ濃度が１ｎＭの時に３分と推定される限界に近づく。
ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩを決失している血漿はトロンビン形成を示されないことも観察される。
【００９３】
図５、６、７及び７ｂは、それぞれ、サンプル内、この例では反応培養液内に存在するｒＦＶＩＩａの量に関連するピーク高さ、ピークまでの時間、速度、及びラグ・タイムの変化を示している。
【００９４】
これらの結果は、得られた結果は、ＦＶＩＩａ濃度と１ｐＭから５ｎＭまでのトロンボグラムから得られる種々のパラメータの間での相関関係を求めることが可能であることを示唆している。
【００９５】
ＴＦ濃度が１ｐＭの場合についても同様に実験を行った（結果は図示せず）。
【実施例５】
【００９６】
実施例５：
【００９７】
実施例４の実験を繰り返し行ったが、実験対象はダイアグノスチカ スタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）社から入手したＦＩＸを決失した反応性血漿で、実施例１と３の手順に従ってＦＶＩＩを枯渇させたものである。
【００９８】
図８はＦＶＩＩとＦＩＸを決失した血漿内で５ｐＭから１ｎＭの範囲でｒＦＶＩＩａが存在している場合に得られたトロンボグラムを示している。
サンプル内に存在しているＦＶＩＩａの量に関連したピーク・トロンビン形成時間の減少が認められる。
この時間もｒＦＶＩＩａ濃度が１ｎＭの場合に３分と推定される限度に近づいていく。
なお、ＦＶＩＩａを付加しないＦＶＩＩあるいはＦＩＸを決失している血漿ではトロンビン形成が認められない。
【００９９】
図９、１０、１１及び１２はサンプル内、つまりこの例では反応培養液内に存在しているｒＦＶＩＩａの量に関連したピーク高さ、ラグ・タイム、ピークに至るまでの時間、そして速度の変化をそれぞれ示している。
【０１００】
得られた結果はＦＶＩＩａ濃度と上記トロンボグラムから推定される種々のパラメータの間の相関関係を確定することが可能であることを示している。
【実施例６】
【０１０１】
実施例６：
【０１０２】
実施例４の実験を繰り返し行ったが、実験対象はダイアグノスチカ スタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）社から入手したＦＸＩを決失した反応性血漿で、実施例１と３の手順に従ってＦＶＩＩを枯渇させたものである。
【０１０３】
図１３はＦＶＩＩとＦＸＩを決失した血漿内に５ｐＭから１ｎＭの範囲でｒＦＶＩＩａが存在している場合に得られたトロンボグラムを示している。
サンプル内に存在するＦＶＩＩａの量に関連してのピーク・トロンビン形成時間の減少が見られる。
なお、ＦＶＩＩとＦＸＩを決失した血漿はトロンビン形成を発生させない。
【０１０４】
図１４、１５、１６及び１７はサンプル内、つまりこの例では反応培養液内に存在しているｒＦＶＩＩａの量に関連したピーク高さ、ラグ・タイム、ピークに至るまでの時間、そして速度の変化をそれぞれ示している。
【０１０５】
得られた結果はＦＶＩＩａ濃度と上記トロンボグラムから推定される種々のパラメータの間の相関関係を確定することが可能であることを示している。
【実施例７】
【０１０６】
実施例７：濃度でのサンプル内でのＦＶＩＩａ濃度の測定例
【０１０７】
ｒＦＶＩＩａ濃度が分からないサンプル４μｌを、上に述べたようにＦＶＩＩとＦＶＩＩＩを枯渇させた血漿７６μｌと混合させた。
トロンビン発生反応を開始させる成分（Ｃａ２＋、リン脂質、及びＴＦ）を最終濃度が５ｐＭ ＴＦ、４μＭリン脂質（Ｂｉｏｄｉｓ試薬 ＴＳ ３０．００）、１６．７ｍＭ Ｃａ２＋となるように加え、合わせて、トロンビン固有蛍光発生剤（ＦＬｕｃａキット Ｂｉｏｄｉｓ ＴＳ ５０．００）も加えた。
【０１０８】
濃度未知のｒＦＶＩＩａサンプルの異なった希釈液をつくり（表１参照）、これらの希釈されたサンプルの一定量（４μｌ）をＦＶＩＩとＦＶＩＩＩを枯渇させた血漿７６μｌとトロンビン発生反応を開始させる成分２０μｌ、及びトロンビン固有蛍光発生剤２０μｌに加えて、総体積１２０μｌの反応培養液を得た。
【０１０９】
そのサンプルの種々の希釈液（表１参照）に対してＴＧＴテストを実施して、トロンボグラムと対応する種々のパラメータ、つまり、ラグ・タイム、ピーク高さ、ピークに至る時間、そして速度を得た。
【０１１０】
それと平行して、ｒＦＶＩＩａの較正濃度が分かっている種々のサンプルを４μｌづつ用意して、それをＦＶＩＩとＦＶＩＩＩを枯渇させた血漿７６μｌと混合して、総体積８０μｌ中のｒＦＶＩＩａの最終濃度を１ｐＭから５ｎＭの範囲となるようにした。
トロンビン発生反応の開始因子（Ｃａ２＋、リン脂質、及びＴＦ）を最終濃度が５ｐＭ ＴＦ、４μＭリン脂質（Ｂｉｏｄｉｓ試薬 ＴＳ ３０．００）、１６．７ｍＭ Ｃａ２＋となるように加え、合わせて、トロンビン固有蛍光発生剤（ＦＬｕｃａキット Ｂｉｏｄｉｓ ＴＳ ５０．００）２０μｌも加えた。
標準トロンボグラムのパラメータを測定して、それぞれのパラメータ値と最終ｒＦＶＩＩａ濃度のログ逆数との関係を示す較正曲線を得た （図５、６，７及び７ｂｉｓを参照）。
【０１１１】
ｒＦＶＩＩａの濃度が分からないサンプルの種々の希釈液に関して得られたパラメータ値を種々の標準較正曲線上にプロットした。
【０１１２】
１／２００から１／５０００の希釈液が０．２５ｎＭから０．０１ｎＭまでの較正曲線上のそれぞれの濃度と対応している。
希釈度を考慮に入れて、このサンプルのｒＦＶＩＩａ濃度は５０ｎＭと判定される。
【０１１３】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ）と因子ＶＩＩＩ （ＦＶＩＩＩ）、因子ＩＸ（ＦＩＸ）及び因子ＸＩ（ＦＸＩ）で構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失した血漿を用いて、サンプル内の活性化された因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固は、身体が血管を損傷した場合に出血を制御して、大量の出血を防ぐことを可能にするメカニズムである。
【０００３】
血液凝固は、血液内に存在して、蛋白質分解性酵素を介してその活性化された状態に変えられる種々の酵素前駆体及び共同因子前駆体が関与する一連のステップを通じて行われる。
この血液凝固の一連のステップにおいて、外因性凝集経路及び内因性凝集経路と名づけられた２つの経路を認めることができる。
両方の経路ともプロトロンビナーゼと呼ばれる複合体の形成に導き、この複合体は活性化された因子Ｘ（ＦＸａ）、活性化された因子Ｖ（ＦＶａ）、リン脂質、及びカルシウムで構成されている。
これは、プロトロンビンをトロンビンに活性化して、可溶性フィブリノゲンの血餅を形成する不溶性フィブリノゲンへの転換を可能にするトロンビン前駆体である。
【０００４】
この外因性経路は血漿内に存在するＦＶＩＩの作用を伴っている。
しかしながら、凝集連鎖を開始させるためには、予めＦＶＩＩａに活性化しておかなければならない。
ＦＶＩＩａ（複合化されていない）だけでは、蛋白質分解性が低い。
ＦＶＩＩａが血管損傷の際に放出されるリン脂質と結合した蛋白質である組織因子（ＴＦ）と複合化されると、この活性が増強される。
ＦＶＩＩａ‐ＴＦ複合体はカルシウム・イオンの存在下で因子Ｘを因子Ｘａに転化させる。
このＦＶＩＩａ‐ＴＦ複合体はＦＩＸもＦＩＸａに転化させて、凝集の内因性経路を触媒する。
その代わりに、因子ＩＸａとＸａはＦＶＩＩをＦＶＩＩａに活性化させる。
因子Ｖａ及びリン脂質（プロトロンビナーゼ）と複合化された因子Ｘａは、プロトロンビンをトロンビンに転化させる。
トロンビンはフィブリノゲンに作用してそれをフィブリンに転化させ、また因子Ｖを因子Ｖａに活性化させＦＶＩＩＩをＦＶＩＩＩａに活性化させる他の活性をも有している。
またトロンビンはカルシウムの存在下で因子ＸＩＩＩを因子ＸＩＩＩに活性化させ、これによりフィブリン塊の膠着を可能にする。
【０００５】
凝固の外因性経路においてＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体によってＦＩＸがＦＩＸａに活性化される際、内因性凝集経路においてＦＸＩａによってＦＩＸからＦＩＸａが生成され、そしてそれ自体が内皮下層などの電気的陰性の表面で血液と接触することにより活性化された因子ＸＩＩによって活性化される。
【０００６】
従ってビタミンＫ依存性糖蛋白質であるＦＶＩＩａは血餅の形成につながる凝固メカニズムにおいて重要な役割を果たす。
またＦＶＩＩａは、因子ＶＩＩＩ又はＩＸが存在しない場合でも、大量出血を生じさせる組織損傷の後に放出される組織因子の存在下で局所的に作用するといった利点を有する。
このためＦＶＩＩａは、出血に伴うある凝固性疾患の治療のために長年にわたって使用されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，４７２，８５０号
【特許文献２】米国特許第５，７４１，６５８号
【特許文献３】国際特許ＷＯ１９９２／０１８８７０号
【特許文献４】米国特許第５，７５０，３５８号
【特許文献５】米国特許第５，７４１，６５８号
【特許文献６】米国特許第５，４７２，８５０号
【特許文献７】欧州特許第０ ６４１ ４４３号
【特許文献８】国際特許ＷＯ ０３／００４６９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
最初のアプローチは血漿からＦＶＩＩａを得ることであった。
しかしこの血漿からのＦＶＩＩａの産生には供給源の有効性による制限があり、そしてこの血漿の使用には、例えばプリオンなどの病原体やウイルスを伝染させるリスクも伴う。
これらの問題は、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社による、血漿ＦＶＩＩａに構造的に類似した糖蛋白質である遺伝子組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）の開発によって解決された。
【０００９】
ｒＦＶＩＩａの主な治療の適応（米国、ヨーロッパ及び日本における）は、抗因子ＶＩＩＩ抗体を発現した血友病Ａの個体及び抗因子ＩＸ抗体を発現した血友病Ｂの個体における自発的または外科的誘導による出血の治療である。
またヨーロッパにおいては、先天的にＦＶＩＩが欠乏している患者やグランツマン血小板無力症に悩む患者への使用にも適応されている。
【００１０】
さらに血液凝固因子が欠乏しているのでも血小板無力症でもない患者の外科手術においても大量出血を抑制するのにｒＦＶＩＩａが有効であることについて多くの報告がなされている。
【００１１】
このようにＦＶＩＩａがますます広く用いられることにより、ＦＶＩＩａの活性を測定する方法、そしてまたＦＶＩＩａの濃度を判定する方法、例えば潜在的にＦＶＩＩａを含有するサンプルの濃度を測定するあるいは患者におけるＦＶＩＩａの血漿濃度を測定してＦＶＩＩａの投与量が治療対象となる止血障害の治療に十分に適合しているかどうか、また治療患者が低凝固または過凝固の状態にないかどうかを確認する方法が開発されるに至った。
【００１２】
ＦＶＩＩａ活性を検出するための最も知られた方法は、凝固時間、ＰＴＴ（部分トロンボプラスチン時間）、ａＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）の測定、そしてＴＥＧ（トロンボエラストグラフィー）及びＴＧＴ（トロンビン発生テスト）である。
これらの方法によってＦＶＩＩａの活性を測定することが可能になるが、ＦＶＩＩａの正確な濃度を直接測定することは不可能である。
【００１３】
ＦＶＩＩａによって生成されるＦＸａの色素原アッセイまたは蛍光原アッセイのようなＦＶＩＩａ濃度を直接測定する方法は、ＦＶｌｌａの影響とＦＶＩＩの影響との間に区別をつけることが不可能であるため、不適切であることが判明している。
【００１４】
ＦＶＩＩａ免疫アッセイキット（ＩＭＵＢＩＮＤ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ）が市場に出ているが、この技術を実行するための実験条件はその制御が困難である。
【００１５】
ＦＶＩＩａ濃度を測定するためのその他の方法は、組換え短縮型ＴＦを用いた蛋白質分解活性の測定（Ｓｔａｃｌｏｔ ＶＩＩａ−ｒＴＦ、Ｓｔａｇｏ）（米国特許第５，４７２，８５０号、米国特許第５，７４１，６５８号、国際特許ＷＯ１９９２／０１８８７０号、米国特許第５，７５０，３５８号、米国特許第５，７４１，６５８号、米国特許第５，４７２，８５０号、欧州特許第０ ６４１ ４４３号）あるいはＦＶＩＩａ−抗トロンビン複合体（ＷＯ ０３／００４６９４）の濃度の測定などについて記した文献に記載されている。
しかしこれらの方法はあまり正確ではなく、またその実行が困難でもある。
【００１６】
現在、ＦＶＩＩａを用いた治療の効力を評価するために生物学者及び医療関係者によってしばしば用いられる１つの方法はトロンボエラストグラフィーの利用に基づいている。
この方法は、血餅形成を時間との関連で機械的に分析することによって全血液の物理的性質を測定するステップにより構成されている。
トロンボエラストグラフ（登録商標）により生成されたグラフから抽出されるパラメータ（トロンボグラムまたはトロンボエラストグラム（登録商標））に基づいて医療関係者は患者の凝固能を評価することができる。
この方法は正確ではあるのだが単調であり、反復的なルーチン分析にはほとんど適合せず、また血液サンプル採取の後１時間以内に行う必要があることもあり、複数のサンプリングを行う場合には適用が困難である。
さらにこの方法ではＦＶＩＩａ濃度の測定も行うことができない。
【００１７】
従って、実行が容易であり、且つＦＶＩＩａ濃度の測定、例えばＦＶＩＩａを潜在的に含有するサンプルの濃度を測定する、あるいは上に述べたように患者のＦＶＩＩａの血漿濃度を測定して投与されるＦＶＩＩａの薬用量が治療対象となる止血障害に対して十分に適合しているか、また治療患者が低凝固または過凝固の状態にないかどうかを確認するために有効な方法が真に必要とされている。
【００１８】
この発明の目的は、実行が容易であり、且つＦＶＩＩａ濃度の測定、例えばＦＶＩＩａを潜在的に含有するサンプルの濃度を測定する、あるいは上に述べたように患者のＦＶＩＩａの血漿濃度を測定して投与されるＦＶＩＩａの薬用量が治療対象となる止血障害に対して十分に適合しているか、また治療患者が低凝固または過凝固の状態にないかどうかを確認するために有効な方法を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明はサンプル中のＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ‐ｖｉｖｏで測定する方法に関するものであり、この方法は：
ａ）前記サンプルをＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿と混合するステップと、
ｂ）カルシウム・イオン源、リン脂質剤、及び組織因子で構成されるトロンビン発生反応の開始成分を付加するステップと、
ｃ）このようにして得られた反応液でトロンビン発生テスト（ＴＧＴ）を行ってトロンボグラム付与パラメータを得るステップと、
ｄ）前記トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを標準的なトロンボグラムの類似のパラメータと比較するステップで、各標準トロンボグラムが前記反応液内の１ｐＭから５ｎＭの範囲の固定較正済み濃度で得られることを特徴とするステップと、
ｅ）ステップｄ）から前記サンプルの上に述べた範囲内のＦＶＩＩａ濃度を推定するステップと
により構成されている。
【００２０】
本出願人は、驚くべきことに、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失した血漿（二重欠損血漿）を使用することによって、サンプルのＦＶＩＩａ濃度を測定する方法において使用が可能であり、また信頼性が高く、再生可能で、その使用が容易である試薬を得ることができるのを発見した。
【００２１】
本発明のこの方法を用いることによって、サンプルのＦＶＩＩａ濃度とトロンビン発生テストの特定のパラメータとの間に相関を確立することが可能となる。
【００２２】
標準的なトロンボグラムを用いて判定された、即ち反応液中のＦＶＩＩａの可変の、較正済み濃度を用いて得られたこの相関を利用することによって、標準的なトロンボグラムにより得られたデータと測定の対象となるサンプルのトロンボグラムにより得られたデータとを比較することで、サンプル中の未知のＦＶＩＩａ濃度を判定することが可能となる。
【００２３】
当業者には周知の、ステップｃ）のトロンビン発生テスト（ＴＧＴ）は、トロンビン発生反応の開始成分‐この場合はカルシウム・イオン源、リン脂質剤及び組織因子（ＴＦ）がＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿と混合されたＦＶＩＩａを含んでいるサンプルと接触する際の、生成されるトロンビンの量とこのトロンビンの生成に必要となる時間とを測定する連続測定に基づいている。
【００２４】
このように反応液を形成し、また所定の分量であるこれら全ての成分が接触した状態に置かれると同時に、トロンビン発生反応が開始され、これによってこのテスト（ｔ０）の開始時間を判定することが可能となる。
これらの各成分の分量はこの反応が確実に発生可能となるように選択される。
このテストは、好適には生成されたトロンビンを発現させる物質を用いて行われる。
前記物質は、トロンビンにより分解されて蛍光発生化合物を生成する蛍光原物質、あるいは色素原物質である。
【００２５】
蛍光は、トロンボグラムを得るために使用可能なデータを収集することができるソフトウェアにより構成される従来の蛍光定量器などの、反応液中のトロンビン形成を測定するための装置によって検出される。
このトロンボグラムは、実験時間に渡って描かれ、生成されるトロンビンの最大量に相当する最大値を有した曲線を示す。
サンプル中のＦＶＩＩａの量が増加すればするほど、反応液におけるトロンビンの生成時間はますます短縮され、その限界値へと近づく。
【００２６】
このトロンボグラムは、以下のように定義されるトロンボグラムの少なくとも１つのパラメータを表すデータを提供する（ステップｄ）。
【００２７】
第１のパラメータは、上に述べたような生成される最大のトロンビンに相当するピーク高さである。
第２のパラメータは、ＴＧＴテスト（ｔ０）の開始からトロンビンの発生開始までの間に経過した時間に相当するラグ・タイムである。
第３のパラメータは、ＴＧＴテスト（ｔ０）の開始からトロンビンの生成量が最大に達するまでの間に経過した時間に相当するピークまでの時間である。
第４のパラメータは、トロンビンの形成速度をｎＭ／分で表した値で、前記ピーク高さを前記ピークに至るまでの時間と前記ラグ・タイムとの差で割った値に相当する。
これらのパラメータはトロンビン形成を測定する装置によって直接提供される。
【００２８】
従ってステップｄ）において、本発明の方法によって得られるトロンボグラムの少なくとも１つのパラメータは、ピーク高さ、速度、ラグ・タイム及びピークに至るまでの時間の中から選択される。
【００２９】
本発明によれば、標準的なトロンボグラムのパラメータは、同じ反応液から成る較正済みサンプルを用いた一連のＴＧＴテストを行うことによって判定されるが、各サンプルは、ピーク高さ及び速度から選択されるパラメータに対して１ｐＭから５ｎＭ、好ましくは１ｐＭから１ｎＭの範囲の、また４つのパラメータに対して好ましくは１ｐＭから５ｎＭの範囲の最終、固定較正済み濃度のＦＶＩＩａを含む。
従って作業条件は反応液の量を同一に保つために同一の条件が適用されるが、ＦＶＩＩａサンプルの追加を通じての若干量の変動は許容される。
従ってトロンボグラムはそのＦＶＩＩａ含量が較正済みの各反応液に対して得られる。
【発明の効果】
【００３０】
この発明によれば、実行が容易であり、且つＦＶＩＩａ濃度の測定、例えばＦＶＩＩａを潜在的に含有するサンプルの濃度を測定する、あるいは上に述べたように患者のＦＶＩＩａの血漿濃度を測定して投与されるＦＶＩＩａの薬用量が治療対象となる止血障害に対して十分に適合しているか、また治療患者が低凝固または過凝固の状態にないかどうかを確認するために有効な方法を実現することができる。
【００３１】
本発明の１つの実施の形態において、標準的なトロンボグラムのパラメータを確立するために用いられるＦＶＩＩａは英国の国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ）による国際ＦＶＩＩａ標準品（ＩＳ−ＦＶＩＩａ）である。
【００３２】
各標準的トロンボグラムから、反応液中のＦＶＩＩａの最終濃度に関する上述の各パラメータの較正変化曲線が判定される。
【００３３】
次にそのＦＶＩＩａ濃度が未知であるサンプルに対して得られる上述のパラメータがステップｄにおいて得られた類似のパラメータと比較される。
この方法において、測定されるサンプルのＦＶＩＩａ濃度は較正済みの標準濃度曲線との比較によって、即ち標準的なトロンボグラムを用いて判定されるため、このＦＶＩＩａ濃度は用いられるパラメータに関わりなく、直接推測することが可能である。
【００３４】
本発明によれば、ＦＶＩＩａサンプル、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失した血漿、トロンビン発生反応を開始させる成分は、液体であるか又は凍結乾燥した形態であってもよく、またこの反応液は注射用水（ＷＦＩ）などの適切な水性溶媒に溶解させることによって調製される。
【００３５】
本発明の特定の一実施の形態によれば、このＦＶＩＩａサンプルは液体の形態である。
標準的なトロンボグラムを得るために必要なのは、反応液の所望の最終濃度を得るために、考察している前記二重欠損血漿と混合するのに適切な量をサンプリングすることだけである。
これは一定量の、しかし異なる濃度のＦＶＩＩａサンプルを前記血漿に追加する方法によっても行うことができる。
【００３６】
判定対象となるＦＶＩＩａ含量を有する１つのサンプルについて、反応液の液量は一定に保ちつつ連続的に希釈し考察している二重欠損血漿に一定量を追加する方法によって、複数のトロンボグラムを得ることも可能である。
このようにして得られたパラメータの結果と標準的トロンボグラムのパラメータ及び希釈率の知見とを比較することによって、ＦＶＩＩａ含量を正確に判定することが可能となる。
【００３７】
リン脂質剤は本発明に適している。
これは濃縮物あるいは凍結乾燥物の形態であってよい。
またこれはホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンを主に含む、あるいはそれらのみで構成される混合物の形態であるのが好ましい。
【００３８】
同様に、天然、血漿、遺伝子組み換え又は形質転換ＴＦなどの任意のＴＦ（組織因子）も適している。
またさらに、因子ＶＩＩを因子ＶＩＩａに転化させる機能は失うが因子ＶＩＩａの酵素活性の補因子として作用する能力は維持している任意の短縮型ＴＦなどの改変型ＴＦも適している。
具体的に言うと、このＴＦは経膜ドメインを欠失しており、この欠失によってそのＴＦ機能において所望の選択的欠損を得ることが可能になる（この組織因子は市販され容易に入手できる）。
本発明の一実施の形態において、この改変型ＴＦは、ＦＶＩＩを含有するサンプルのＦＶＩＩａ濃度のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ−ｖｉｖｏ測定のためにも使用することができる。
【００３９】
本発明の一実施の形態によれば、このＦＶＩＩａを含有するサンプルは、液体又は凍結乾燥した形態の血漿ＦＶＩＩａ（ｐＦＶＩＩａ）、遺伝子組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）あるいは形質転換ＦＶＩＩａ（ＴｇＦＶＩＩａ）を含有する、又は含有していない治療サンプルである。
【００４０】
本発明の特定の一実施の形態において、このＦＶＩＩａを含んでいるサンプルは、哺乳動物の母乳のサンプル、具体的にはその内にＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａを産生する形質転換された哺乳動物の母乳のサンプルである。
【００４１】
形質転換動物の母乳中に遺伝子組み換え蛋白質を産生する方法は以下のステップを含む：所望のタンパク質をコードし、母乳中に天然に分泌される蛋白質のプロモータで制御される遺伝子を含む合成ＤＮＡ分子を非ヒト哺乳動物の胚に導入する。
次にこの胚を同一種の哺乳動物の雌に導入し、この雌が形質転換動物を出生する。
ここまでの手順が十分に完了した後、この哺乳動物から母乳を分泌させ、この母乳を回収する。
この母乳には所望の遺伝子組み換え蛋白質が含まれている。
【００４２】
ヒト以外の哺乳動物の雌の母乳中に蛋白質をつくりだすプロセスの一例が欧州特許第０５２７０６３号明細書において述べられており、この教示は本発明による所望の蛋白質の調製に適用することができる。
【００４３】
ＷＡＰプロモータを含むプラスミドは、ＷＡＰ遺伝子のプロモータを含む配列を導入することにより作成される。
またこのプラスミドはＷＡＰプロモータに依存することになる外来遺伝子を受け入れることができるように作成される。
この所望の蛋白質をコードする遺伝子はＷＡＰプロモータに組み込まれ、それに依存する状態になる。
このプロモータを含むプラスミド及び所望の蛋白質をコードする遺伝子は、ウサギなどの形質転換動物を得るためにウサギ胚の雄性前核の中にマイクロインジェクションすることによって用いられる。
続いてこの胚は体液的に準備された雌の卵管に導入される。
導入遺伝子の存在はサザンブロット法によって出生された若体形質転換ウサギから抽出されたＤＮＡを用いて検出される。
この動物の母乳中の濃度は特定の放射免疫アッセイによって評価される。
【００４４】
その他の文献において、ヒト以外の哺乳動物の雌の母乳中で蛋白質をつくりだす方法が述べられている（米国特許第７，０４５，６７６号及び欧州特許第１ ７３９ １７０号−形質転換哺乳動物中でのフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）の産生）。
【００４５】
もう１つの特定の実施の形態において、このサンプルは、液体又は凍結乾燥した形態の精製されたＦＶＩＩａを含んだサンプルである。
例えばこうしたＦＶＩＩａの純度は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは９９％である。
具体的に言うとこのサンプルは、液体又は凍結乾燥した形態の、精製されたＦＶＩＩａを含んだ治療サンプルである。
【００４６】
本発明の方法によって血漿ＦＶＩＩａ（ｐＦＶＩＩａ）、遺伝子組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）又は形質転換ＦＶＩＩａ（ＴｇＦＶＩＩａ）の濃度を測定することが可能となる。
【００４７】
従って本発明の特定の一実施の形態によれば、本発明は形質転換された哺乳動物の母乳のサンプルのＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ‐ｖｉｖｏ測定するための方法に関するものであって、この方法は：
ａ）前記サンプルをＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿と混合するステップと、
ｂ）カルシウム・イオン源、リン脂質剤、及び組織因子で構成されるトロンビン発生反応の開始成分を付加するステップと、
ｃ）このようにして得られた反応液でトロンビン発生テスト（ＴＧＴ）を行ってトロンボグラム付与パラメータを得るステップと、
ｄ）前記トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを標準的なトロンボグラムの類似のパラメータと比較するステップで、各標準トロンボグラムが前記反応液内の１ｐＭから５ｎＭの範囲の固定較正済み濃度で得られることを特徴とするステップと、
ｅ）ステップｄ）から前記サンプルの上に述べた範囲内のＦＶＩＩａ濃度を推定するステップと
により構成されている。
【００４８】
本発明のもう１つの特定の実施の形態によれば、本発明は精製されたＦＶＩＩａを含んだサンプルのＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ−ｖｉｖｏ測定するための方法に関するものであって、この方法は：
ａ）前記サンプルをＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿と混合するステップと、
ｂ）カルシウム・イオン源、リン脂質剤、及び組織因子で構成されるトロンビン発生反応の開始成分を付加するステップと、
ｃ）このようにして得られた反応液でトロンビン発生テスト（ＴＧＴ）を行ってトロンボグラム付与パラメータを得るステップと、
ｄ）前記トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを標準的なトロンボグラムの類似のパラメータと比較するステップで、各標準トロンボグラムが前記反応液内の１ｐＭから５ｎＭの範囲の固定較正済み濃度で得られることを特徴とするステップと、
ｅ）ステップｄ）から前記サンプルの上に述べた範囲内のＦＶＩＩａ濃度を推定するステップと
により構成されている。
【００４９】
ここで『欠失した』という用語は、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及び／又はＦＸＩの濃度が、当業者には周知の従来のアッセイで測定した際にこれらの因子の検出の閾値を下回るということを意味する。
従来の免疫アッセイを行うためには、例えば市販のキット又は試薬を用いることができる。
【００５０】
本発明の方法によれば、血漿 ＦＶＩＩａ、遺伝子組み換えＦＶＩＩａ及び／又は形質転換ＦＶＩＩａの濃度を測定することが可能となる。
【００５１】
本発明の好ましい一実施の形態によれば、本発明の方法において用いられる血漿は、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失している。
【００５２】
このＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿は種々の形態で得ることができる。
本発明の方法においては、例えば（ＦＶＩＩＩの欠失した）ＦＶＩＩの欠乏した血友病Ａの個体の血漿、（ＦＩＸの欠失した）ＦＶＩＩの欠乏した血友病Ｂの個体の血漿あるいは完全に因子ＸＩが欠失し、またＦＶＩＩの欠乏した患者の血漿を使用することができる。
【００５３】
本発明の特定の一実施の形態において、本発明の方法では、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿である免疫枯渇ヒト血漿を用いる。
【００５４】
この免疫枯渇は種々の形態で得ることができる。
例えば、
−ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩを欠失した血漿は、例えば抗ＦＶＩＩ、抗ＦＶＩＩＩ、抗ウィルブランド因子などの、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ又はこれらの因子の内の１つに結合した蛋白質の特定の抗体を用いて欠失させることによって得られる。
ここでこのウィルブランド因子とはＦＶＩＩＩを血液中に導入する血漿蛋白質である。
−ＦＶＩＩ及びＦＩＸを欠失した血漿は、例えばＦＶＩＩ、ＦＩＸの特定の抗体を用いて欠失させることによって得られる。
−ＦＶＩＩ及びＦＸＩを欠失した血漿は、例えば抗ＦＶＩＩ及び抗ＦＸＩなどの、ＦＶＩＩ、ＦＸＩ又はこれらの因子の内の１つに結合した蛋白質の特定の抗体を用いて欠失させることによって得られる。
【００５５】
本発明の特定の一実施の形態によれば、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿は化学的に枯渇されたヒト血漿である。
このヒト血漿は、ＥＤＴＡを用いてＣａ２＋依存性因子であるＦＶＩＩＩを枯渇させることができる。
一旦この血漿からＦＶＩＩＩが枯渇されると、ＥＤＴＡは当業者には周知の方法により、具体的には透析法によって除去される。
【００５６】
これらの枯渇方法を組み合わせ、前記因子の枯渇した血漿を得ることもできる。
【００５７】
ステップｂ）において反応液中のカルシウム・イオンの最終濃度は１４〜１８ｍＭ、特に１６．７ｍＭであるのが好ましい。このカルシウム・イオン源とはＣａＣｌ２などの生物適合性源を表している。
反応液中のリン脂質剤の最終濃度は１〜２０μＭ、好ましくは３〜５μＭ、また組織因子（ＴＦ）の最終濃度は０．１〜１０ｐＭ、好ましくは０．１〜６ｐＭの範囲内である。
【００５８】
本発明の特定の一実施の形態において、精製されたＦＶＩＩａのサンプルのＦＶＩＩａ濃度のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ‐ｖｉｖｏ測定の方法を実施するためのＴＦ濃度は、０．１〜１０ｐＭ、好ましくは１〜５ｐＭの範囲内にある。
【００５９】
本発明のさらにもう１つの主題は、サンプル中の因子ＶＩＩａ濃度のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ−ｖｉｖｏ測定のための、因子ＶＩＩと因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ及び因子ＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿の使用に関する。
【００６０】
上述のように、血漿は因子ＦＶＩＩのみならず前記因子の内の少なくとも１つをも欠失しており、これによってこれまで未知であったサンプル中のＦＶＩＩａの量と特定のＴＧＴパラメータとの相関を判定することが可能となる。
【００６１】
本発明の好ましい一実施の形態によれば、ＦＶＩＩａ濃度が測定対象となるサンプルは、血漿サンプル、治療サンプル、あるいは上に述べたような遺伝子組み換え又は形質転換ＦＶＩＩａを含む治療サンプルである。
【００６２】
本発明のさらにもう１つの主題は、本発明の方法を実施するために用ることができるキットであって、このキットは：
−ＦＶＩＩと、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したリン脂質血漿と、
−リン脂質剤及び組織因子を含む凍結乾燥物と、
−カルシウム・イオン源、及び
−標準トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを判定するための、凍結乾燥されたＦＶＩＩａのサンプルと
で構成される。
【００６３】
故にこのキットは、本発明によるサンプル中のＦＶＩＩａ濃度を測定する方法を実施するために好適に利用される。
であるがこの目的のためには、ＴＧＴテストを行うための装置を備えることも必要である。
【００６４】
このトロンビン発生テストを行うための装置には、市販のトロンビン較正物質、生成されたトロンビンのための、例えば適切な蛍光発生試薬などの発現剤、例えばトロンボグラムを得るために用いることのできるデータを収集するのに適合したソフトウェアを備えた蛍光定量器などの測定装置、及びマイクロプレートが含まれる。
【００６５】
好適には、このキットには種々の凍結乾燥物を含むよう意図された受容器が含まれる。
この受容器の内容物は注射用水（ＷＦＩ）などの水性溶媒に溶解され、この関心対象の成分のＴＧＴテストを行うための有効濃度が得られる。
この受容器はマイクロプレートのウェルであってもよい。
反応液中のこの関心対象の成分の最終濃度は上に述べた範囲の濃度であるのが好ましい。
【００６６】
またこのキットには、ピペットやマイクロピペットなどのサンプリング装置が含まれるのが好ましい。
【００６７】
上述のように、好ましい一実施の形態による方法を実施するために、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩで構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したリン脂質血漿と、リン脂質剤、組織因子及びカルシウム・イオン源を含む凍結乾燥物とを、得られた反応液中のＦＶＩＩａの最終濃度が１ｐＭ〜５ｎＭの範囲となるよう種々の量の凍結乾燥ＦＶＩＩａを加えた注射用水ＷＩＦ中に溶解させる。
【００６８】
特定の一実施の形態において、本発明は形質転換された哺乳動物の母乳のサンプル中のＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ−ｖｉｖｏ測定する方法を実施するために用いることのできるキットに関するものであって、このキットは：
−ＦＶＩＩと、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したリン脂質血漿と、
−リン脂質剤及び組織因子を含む凍結乾燥物と、
−カルシウム・イオン源、及び
−標準トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを判定するための、凍結乾燥されたＦＶＩＩａのサンプルと
で構成される。
【００６９】
特定の一実施の形態において、本発明は精製されたＦＶＩＩａを含んだサンプル中のＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ−ｖｉｖｏ測定する方法を実施するために用いることのできるキットに関するものであって、このキットは：
−ＦＶＩＩと、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したリン脂質血漿と、
−リン脂質剤及び組織因子を含む凍結乾燥物と、
−カルシウム・イオン源、及び
−標準トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを判定するための、凍結乾燥されたＦＶＩＩａのサンプルと
で構成される。
【００７０】
本発明のさらにもう１つの主題は、サンプル中のＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｖｏ 、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ−ｖｉｖｏ測定するための上述のキットの使用に関する。
【００７１】
このキットは使用が容易であり、４℃の温度下で少なくとも１年間保管することが可能である。
必要となる備品は、ＴＧＴテストを行ってサンプルの未知のＦＶＩＩａ濃度を正確に判定するための、生成されたトロンビン用の、例えば適切な蛍光発生試薬などの発現剤、例えばトロンボグラムを得るために用いることのできるソフトウェアを備えた蛍光定量器などの測定装置、及びマイクロプレートのみである。
【００７２】
これは標準的なトロンボグラムとそのＦＶＩＩａ濃度が判定対象となるサンプルのトロンボグラムとを得ることを前提にしたものである。
【００７３】
特定の一実施の形態によれば、このキットは、上述の血漿、遺伝子組み換え又は形質転換ＦＶＩＩａを含有する、又は含有していない治療サンプルのＦＶＩＩａ濃度を測定するために用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１はＦＶＩＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ（０．０２ｎＭから１０ｎＭ）のトロンボグラム。（実施例２）
【図２】図２はＦＶＩＩＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ（０．０１ｎＭから１００ｎＭ）のトロンボグラム。（実施例２）
【図３】図３はＦＩＸ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ（０．０１ｎＭから１００ｎＭ）のトロンボグラム。（実施例２）
【図４】図４はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ（１ｐＭ−５ｎＭ）のトロンボグラム。（実施例４）
【図５】図５はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩ決失血漿内のＦＶＩＩａに対するピーク高さ。（実施例４）
【図６】図６はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩ決失血漿内のＦＶＩＩａ濃度に対するピークに至る時間。（実施例４）
【図７】図７はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対する速度。（実施例４）
【図７ｂ】図７ｂｉｓはＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するラグ・タイム。（実施例４）
【図８】図８はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度（５ｐＭ−１ｎＭ）のトロンボグラム。（実施例５）
【図９】図９はＦＶＩＩ及びＦＩＸ枯渇血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するピーク高さ。（実施例５）
【図１０】図１０はＦＶＩＩ及びＦＩＸ枯渇血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するラグ・タイプ。（実施例５）
【図１１】図１１はＦＶＩＩ及びＦＩＸ枯渇血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するピークに至るまでの時間。（実施例５）
【図１２】図１２はＦＶＩＩ及びＦＩＸ枯渇血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対する速度。（実施例５）
【図１３】図１３はＦＶＩＩ及びＦＸＩ枯渇血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度（５ｐＭ−１ｎＭ）のトロンボグラム。（実施例６）
【図１４】図１４はＦＶＩＩ及びＦＸＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するピーク高さ。（実施例６）
【図１５】図１５はＦＶＩＩ及びＦＸＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するラグ・タイム。（実施例６）
【図１６】図１６はＦＶＩＩ及びＦＸＩ決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対するピークに至る時間。（実施例６）
【図１７】図１７はＦＶＩＩ及びＦＸＩ 決失血漿内のｒＦＶＩＩａ濃度に対する速度。（実施例６）
【発明を実施するための形態】
【００７５】
以下に実施例を示すが、これらの実施例は本発明の範囲の制限を意図するものではなく、例示として示されるものである。
【実施例１】
【００７６】
実施例１：ＦＶＩＩ決失血漿の獲得
【００７７】
精製されたヒト血漿ＦＶＩＩに向けられてウサギの体内でつくられたポリクローナル抗体をｒＣＮＢ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｈｉａ社）と結合させて、次に、得られたゲルの２ｍＬをカラム内に入れた。このカラムを２５ｍＬ均衡緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．４）で均衡化させた。
次に、ヒト血漿６ｍＬをこのカラムを通過させた。
これらの条件下で、ＦＶＩＩはカラムに固定されたままで、溶出液が回収された。そのカラムを２０ｍＬの再生緩衝液（５０ｍＭ Ｎａｃｌ、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．４）で再生して、固定されたＦＶＩＩを溶出させ、次に、そのカラムを２０ｍＬの均衡緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩、０．１５Ｍ Ｎａｃｌ、ｐＨ７．４）で再均衡化させた。
【００７８】
これらのステップを７−８回繰り返して、６ｍＬのＦＶＩＩ決失血漿を得た。
【実施例２】
【００７９】
実施例２：標準トロンボグラムを作成するための反応培養液の調製
【００８０】
十分な亮のｒＦＶＩＩａサンプル（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）−Ｎｏｖｏｎｏｒｄｉｓｋ）を用いて、これを、各反応混合物の最終較正濃度が０．０２から１０ｎＭの範囲となるように、実施例１で得たＦＶＩＩ欠損血漿８０μｌに加えた。
【００８１】
この反応混合物は、Ｃａ２＋，リン脂質及びＴＦで構成され、その成分の最終濃度が５ｐＭ ＴＦ、４μＭリン脂質（Ｂｉｏｄｉｓ ＴＳ ３０．００試薬−Ｂｉｏｄｉｓ）及び１６．７ｍＭ Ｃａ２＋であるようなトロンＢｉｎｎ発生反応の開始因子２０μｌとトロンビン固有蛍光発生剤（Ｆｌｕｃａ試薬キット Ｂｉｏｄｉｓ ＴＳ ５０．００）２０μｌを上に述べたｒＦＶＩＩａを含む血漿と混合することによって得られた。
【００８２】
ＴＧＴ曲線をｅＦＶＩＩａの最終濃度が０．０２ｎＭと１０ｎＭの間の範囲に対して作成し、図１に示されているトロンボグラムを得た。
これらの図は、トロンボグラムを作成するためのソフトウエア（Ｔｈｒｏｎｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ）を備えたトロンビン形成時間を測定するための蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ−Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を用いて、励起波長３９０ｎｍ、放出波長４６０ｎｍで検出を行って作成された。
【００８３】
この図は、ＦＶＩＩのみを決失している血漿に関して判定されトロンボグラムでは、ｒＦＶＩＩａ濃度とそのピークで測定されたトロンビン形成時間との間の相関性を得ることが不可能であることを示している。
実際、ピークにに至までの時間とｒＦＶＩＩａの量との間に差異は認められず、その量でのピーク高さに有意な差も認められない。
【００８４】
図２と図３は０．１ｎＭから１００ｎＭのｒＦＶＩＩａをダイアグノスチカ スタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）社からあるいはＡ型血友病患者から得たＦＶＩＩＩのみを決失している血漿と、ダイアグノスチカ スタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）社から得たＦＩＸのみを決失している血漿にそれぞれ加えることで作成された。
【００８５】
これらの図は、それぞれＦＶＩＩＩかＦＩＸのいずれかのみを決失した血漿に関して得られた異なったトロンボグラムでは、ＦＶＩＩａ濃度とピーク・トロンビン形成時間との間の相関性を得ることはできないことを示している。
このピークに至るまでの時間においては変差は認められず、実際的には加えられたＦＶＩＩａの量に対してはほぼ一定である。
【実施例３】
【００８６】
実施例３：ＦＶＩＩを決失しており、同時にＦＶＩＩＩ、ＦＩＸあるいはＦＸＩのいずれかを決失している血漿の獲得
【００８７】
精製されたヒト血漿ＦＶＩＩに向けられてウサギの体内でつくられたポリクローナル抗体をｒＣＮＢ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｈｉａ社）と結合させて、次に、得られたゲルの２ｍＬをカラム内に入れた。
このカラムを２５ｍＬ均衡緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．４）で均衡化させた。
次に、それぞれダイアグノスチカ スタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）社から得られたＦＶＩＩＩ、ＦＩＸあるいはＦＸＩを枯渇させた市販の血漿６ｍＬを上記カラムを通過させた。
これらの条件下で、ＦＶＩＩはカラムに固定されたままで、溶出液が回収された。
そのカラムを２０ｍＬの再生緩衝液（５０ｍＭ Ｎａｃｌ、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．４）で再生して、固定されたＦＶＩＩを溶出させ、次に、そのカラムを２０ｍＬの均衡緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩、０．１５Ｍ Ｎａｃｌ、ｐＨ７．４）で再均衡化させた。
【００８８】
これらのステップを７−８回繰り返して、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸあるいはＦＸＩとＦＶＩＩを決失した二重枯渇血漿６ｍＬを得た。
【実施例４】
【００８９】
実施例４：標準トロンボグラムを作成するための反応培養液の調製
【００９０】
十分な量のｒＦＶＩＩａサンプルを用いて、ダイアグノスチカ スタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）社あるいはＡ型血友病患者から得たＦＶＩＩＩ決失血漿８０μｌに加えて、実施例１及び３の手順を従ってＦＶＩＩを枯渇させ、各反応混合物のｒＦＶＩＩａの最終較正濃度が１ｐＭから５ｎＭの範囲となるようにした。
【００９１】
この反応混合物は、Ｃａ２＋，リン脂質及びＴＦで構成され、その成分の最終濃度が５ｐＭ ＴＦ、４μＭリン脂質（Ｂｉｏｄｉｓ ＴＳ ３０．００試薬−Ｂｉｏｄｉｓ）及び１６．７ｍＭ Ｃａ２＋であるようなトロンＢｉｎｎ発生反応の開始因子２０μｌとトロンビン固有蛍光発生剤（Ｆｌｕｃａ試薬キット Ｂｉｏｄｉｓ ＴＳ ５０．００）２０μｌを上に述べたｒＦＶＩＩａを含む血漿と混合することによって得られた。
１ｐＭから５ｎＭの範囲のｒＦＶＩＩａの最終濃度に関してＴＧＴ曲線を作成し、その種々のパラメータ（ラグ・タイム、ピーク高さ、ピークまでの時間、及び速度）はＦＶＩＩａの含量に対応して容量に基づく方式で徐々に修正した。
これらの図は実施例２と同じ蛍光高度計を用い、同じ条件で測定した。
【００９２】
図４はＦＶＩＩとＦＶＩＩＩが決失した血漿における１ｐＭから５ｎＭの範囲の存在下で得られたトロンボグラムを示している。
ピーク・トロンビン形成時間の減少がサンプル中に存在するｒＦＶＩＩの量の関連して観察される。
この時間はｒＦＶＩＩ濃度が１ｎＭの時に３分と推定される限界に近づく。
ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩを決失している血漿はトロンビン形成を示されないことも観察される。
【００９３】
図５、６、７及び７ｂは、それぞれ、サンプル内、この例では反応培養液内に存在するｒＦＶＩＩａの量に関連するピーク高さ、ピークまでの時間、速度、及びラグ・タイムの変化を示している。
【００９４】
これらの結果は、得られた結果は、ＦＶＩＩａ濃度と１ｐＭから５ｎＭまでのトロンボグラムから得られる種々のパラメータの間での相関関係を求めることが可能であることを示唆している。
【００９５】
ＴＦ濃度が１ｐＭの場合についても同様に実験を行った（結果は図示せず）。
【実施例５】
【００９６】
実施例５：
【００９７】
実施例４の実験を繰り返し行ったが、実験対象はダイアグノスチカ スタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）社から入手したＦＩＸを決失した反応性血漿で、実施例１と３の手順に従ってＦＶＩＩを枯渇させたものである。
【００９８】
図８はＦＶＩＩとＦＩＸを決失した血漿内で５ｐＭから１ｎＭの範囲でｒＦＶＩＩａが存在している場合に得られたトロンボグラムを示している。
サンプル内に存在しているＦＶＩＩａの量に関連したピーク・トロンビン形成時間の減少が認められる。
この時間もｒＦＶＩＩａ濃度が１ｎＭの場合に３分と推定される限度に近づいていく。
なお、ＦＶＩＩａを付加しないＦＶＩＩあるいはＦＩＸを決失している血漿ではトロンビン形成が認められない。
【００９９】
図９、１０、１１及び１２はサンプル内、つまりこの例では反応培養液内に存在しているｒＦＶＩＩａの量に関連したピーク高さ、ラグ・タイム、ピークに至るまでの時間、そして速度の変化をそれぞれ示している。
【０１００】
得られた結果はＦＶＩＩａ濃度と上記トロンボグラムから推定される種々のパラメータの間の相関関係を確定することが可能であることを示している。
【実施例６】
【０１０１】
実施例６：
【０１０２】
実施例４の実験を繰り返し行ったが、実験対象はダイアグノスチカ スタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）社から入手したＦＸＩを決失した反応性血漿で、実施例１と３の手順に従ってＦＶＩＩを枯渇させたものである。
【０１０３】
図１３はＦＶＩＩとＦＸＩを決失した血漿内に５ｐＭから１ｎＭの範囲でｒＦＶＩＩａが存在している場合に得られたトロンボグラムを示している。
サンプル内に存在するＦＶＩＩａの量に関連してのピーク・トロンビン形成時間の減少が見られる。
なお、ＦＶＩＩとＦＸＩを決失した血漿はトロンビン形成を発生させない。
【０１０４】
図１４、１５、１６及び１７はサンプル内、つまりこの例では反応培養液内に存在しているｒＦＶＩＩａの量に関連したピーク高さ、ラグ・タイム、ピークに至るまでの時間、そして速度の変化をそれぞれ示している。
【０１０５】
得られた結果はＦＶＩＩａ濃度と上記トロンボグラムから推定される種々のパラメータの間の相関関係を確定することが可能であることを示している。
【実施例７】
【０１０６】
実施例７：濃度でのサンプル内でのＦＶＩＩａ濃度の測定例
【０１０７】
ｒＦＶＩＩａ濃度が分からないサンプル４μｌを、上に述べたようにＦＶＩＩとＦＶＩＩＩを枯渇させた血漿７６μｌと混合させた。
トロンビン発生反応を開始させる成分（Ｃａ２＋、リン脂質、及びＴＦ）を最終濃度が５ｐＭ ＴＦ、４μＭリン脂質（Ｂｉｏｄｉｓ試薬 ＴＳ ３０．００）、１６．７ｍＭ Ｃａ２＋となるように加え、合わせて、トロンビン固有蛍光発生剤（ＦＬｕｃａキット Ｂｉｏｄｉｓ ＴＳ ５０．００）も加えた。
【０１０８】
濃度未知のｒＦＶＩＩａサンプルの異なった希釈液をつくり（表１参照）、これらの希釈されたサンプルの一定量（４μｌ）をＦＶＩＩとＦＶＩＩＩを枯渇させた血漿７６μｌとトロンビン発生反応を開始させる成分２０μｌ、及びトロンビン固有蛍光発生剤２０μｌに加えて、総体積１２０μｌの反応培養液を得た。
【０１０９】
そのサンプルの種々の希釈液（表１参照）に対してＴＧＴテストを実施して、トロンボグラムと対応する種々のパラメータ、つまり、ラグ・タイム、ピーク高さ、ピークに至る時間、そして速度を得た。
【０１１０】
それと平行して、ｒＦＶＩＩａの較正濃度が分かっている種々のサンプルを４μｌづつ用意して、それをＦＶＩＩとＦＶＩＩＩを枯渇させた血漿７６μｌと混合して、総体積８０μｌ中のｒＦＶＩＩａの最終濃度を１ｐＭから５ｎＭの範囲となるようにした。
トロンビン発生反応の開始因子（Ｃａ２＋、リン脂質、及びＴＦ）を最終濃度が５ｐＭ ＴＦ、４μＭリン脂質（Ｂｉｏｄｉｓ試薬 ＴＳ ３０．００）、１６．７ｍＭ Ｃａ２＋となるように加え、合わせて、トロンビン固有蛍光発生剤（ＦＬｕｃａキット Ｂｉｏｄｉｓ ＴＳ ５０．００）２０μｌも加えた。
標準トロンボグラムのパラメータを測定して、それぞれのパラメータ値と最終ｒＦＶＩＩａ濃度のログ逆数との関係を示す較正曲線を得た （図５、６，７及び７ｂｉｓを参照）。
【０１１１】
ｒＦＶＩＩａの濃度が分からないサンプルの種々の希釈液に関して得られたパラメータ値を種々の標準較正曲線上にプロットした。
【０１１２】
１／２００から１／５０００の希釈液が０．２５ｎＭから０．０１ｎＭまでの較正曲線上のそれぞれの濃度と対応している。
希釈度を考慮に入れて、このサンプルのｒＦＶＩＩａ濃度は５０ｎＭと判定される。
【０１１３】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度をｅｘ―ｖｉｖｏ（体外）で測定するための方法において、
ａ）前記サンプルをＦＶＩＩと因子ＶＩＩＩ （ＦＶＩＩＩ），因子ＩＸ（ＦＩＸ）及び因子ＸＩ（ＦＸＩ）で構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿とを混合するステップと、
ｂ）カルシウム・イオン源、リン脂質剤、及び組織因子で構成されるトロンビン発生反応の開始成分を付加するステップと、
ｃ）このようにして得られた反応液でトロンビン発生テスト（ＴＧＴ）を行ってトロンボグラム付与パラメータを得るステップと、
ｄ）前記トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを標準的なトロンボグラムの類似のパラメータと比較するステップで、各標準トロンボグラムが前記反応液内の１ｐＭから５ｎＭの範囲の固定較正済み濃度で得られることを特徴とするステップと、
ｅ）ステップｄ）から前記サンプルの上に述べた範囲内のＦＶＩＩａ濃度を推定するステップ
で構成される
ことを特徴とするサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項２】
前記標準トロンボグラムのパラメータが同じ反応液を含む標準的なサンプルを用いた一連のトロンビン発生テストＴＧＴによって判定され、前記サンプルのそれぞれが１ｐＭから５ｎＭの範囲の固定最終較正済みＦＶＩＩａ濃度を含んでいることを特徴とする、請求項１記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項３】
前記ステップｄ）で、前記トロンボグラムの少なくとも１つのパラメータがピーク高さ、速度、ラグ・タイム、そしてピークに至るまでの時間から選択されることを特徴する、請求項１又は２記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項４】
ＦＶＩＩａを含んでいるサンプルが形質転換された哺乳動物の母乳のサンプルか、あるいは精製されたＦＶＩＩａを含んだサンプルであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項によるサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項５】
前記ＦＶＩＩａが血漿ＦＶＩＩａ（ｐＦＶＩＩａ）、遺伝子組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）、あるいは形質転換ＦＶＩＩａ（ＴｇＦＶＩＩａ）であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項によるサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項６】
前記ＦＶＩＩと、ＦＩＶＩＩ、ＦＩＣ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したヒト血漿が免疫枯渇ヒト血漿であることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項７】
前記ＦＶＩＩと、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したヒト血漿が化学的に枯渇されたヒト血漿であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項８】
前記因子ＶＩＩＩを欠失したヒト血漿がＥＤＴＡで化学的に枯渇されていることを特徴とする、請求項７記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項記載の方法を実施するために用いることができるキットにおいて、
−ＦＶＩＩと、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したリン脂質血漿と、
−リン脂質剤及び繊維因子を含む凍結乾燥物と、
−カルシウム・イオン源、及び
−標準トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを判定するための、濃度が分かっている凍結されたＦＶＩＩａのサンプル
で構成された
ことを特徴とするサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法を実施するために用いるキット。
【請求項１０】
前記サンプルのＦＶＩＩａ濃度をイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）あるいは体外（ｅｘ−ｖｉｖｏ）測定するための請求項９記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法を実施するために用いるキット。
【請求項１１】
前記サンプルが形質転換された哺乳動物の母乳あるいは精製されたＦＶＩＩａを含むサンプルであることを特徴とする、請求項１０記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法を実施するために用いるキット。
【請求項１２】
ＦＶＩＩａが血漿ＦＶＩＩａ（ｐＦＶＩＩａ）、遺伝子組み換えＦＶＩＩＩａ（ｅＦＶＩＩａ）、あるいは形質転換ＦＶＩＩａ（ＴｇＦＶＩＩａ）であることを特徴とする、請求項１０または１１記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法を実施するために用いるキット。
【請求項１３】
サンプル中のＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｅｘ―ｖｉｖｏで測定するための方法において、ＦＶＩＩと、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したヒト血漿を使用することを特徴とする因子を欠失した血漿を用いてサンプル中の因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項１４】
前記サンプルが形質転換された哺乳動物の母乳あるいは精製されたＦＶＩＩａを含んでいるサンプルであることを特徴とする、請求項１３記載の因子を欠失した血漿を用いてサンプル中の因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項１５】
前記ＦＶＩＩａが血漿ＦＶＩＩａ（ｐＨＶＩＩａ）、遺伝子組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）、あるいは形質転換ＦＶＩＩａ（ＴｇＦＶＩＩａ）であることを特徴とする、請求項１３あるいは１４記載の因子を欠失した血漿を用いてサンプル中の因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項１】
サンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度をｅｘ―ｖｉｖｏ（体外）で測定するための方法において、
ａ）前記サンプルをＦＶＩＩと因子ＶＩＩＩ （ＦＶＩＩＩ），因子ＩＸ（ＦＩＸ）及び因子ＸＩ（ＦＸＩ）で構成される群から選択される少なくとも他の１つの因子を欠失したヒト血漿とを混合するステップと、
ｂ）カルシウム・イオン源、リン脂質剤、及び組織因子で構成されるトロンビン発生反応の開始成分を付加するステップと、
ｃ）このようにして得られた反応液でトロンビン発生テスト（ＴＧＴ）を行ってトロンボグラム付与パラメータを得るステップと、
ｄ）前記トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを標準的なトロンボグラムの類似のパラメータと比較するステップで、各標準トロンボグラムが前記反応液内の１ｐＭから５ｎＭの範囲の固定較正済み濃度で得られることを特徴とするステップと、
ｅ）ステップｄ）から前記サンプルの上に述べた範囲内のＦＶＩＩａ濃度を推定するステップ
で構成される
ことを特徴とするサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項２】
前記標準トロンボグラムのパラメータが同じ反応液を含む標準的なサンプルを用いた一連のトロンビン発生テストＴＧＴによって判定され、前記サンプルのそれぞれが１ｐＭから５ｎＭの範囲の固定最終較正済みＦＶＩＩａ濃度を含んでいることを特徴とする、請求項１記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項３】
前記ステップｄ）で、前記トロンボグラムの少なくとも１つのパラメータがピーク高さ、速度、ラグ・タイム、そしてピークに至るまでの時間から選択されることを特徴する、請求項１又は２記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項４】
ＦＶＩＩａを含んでいるサンプルが形質転換された哺乳動物の母乳のサンプルか、あるいは精製されたＦＶＩＩａを含んだサンプルであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項によるサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項５】
前記ＦＶＩＩａが血漿ＦＶＩＩａ（ｐＦＶＩＩａ）、遺伝子組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）、あるいは形質転換ＦＶＩＩａ（ＴｇＦＶＩＩａ）であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項によるサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項６】
前記ＦＶＩＩと、ＦＩＶＩＩ、ＦＩＣ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したヒト血漿が免疫枯渇ヒト血漿であることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項７】
前記ＦＶＩＩと、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したヒト血漿が化学的に枯渇されたヒト血漿であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項８】
前記因子ＶＩＩＩを欠失したヒト血漿がＥＤＴＡで化学的に枯渇されていることを特徴とする、請求項７記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項記載の方法を実施するために用いることができるキットにおいて、
−ＦＶＩＩと、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したリン脂質血漿と、
−リン脂質剤及び繊維因子を含む凍結乾燥物と、
−カルシウム・イオン源、及び
−標準トロンボグラムのパラメータの少なくとも１つを判定するための、濃度が分かっている凍結されたＦＶＩＩａのサンプル
で構成された
ことを特徴とするサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法を実施するために用いるキット。
【請求項１０】
前記サンプルのＦＶＩＩａ濃度をイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）あるいは体外（ｅｘ−ｖｉｖｏ）測定するための請求項９記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法を実施するために用いるキット。
【請求項１１】
前記サンプルが形質転換された哺乳動物の母乳あるいは精製されたＦＶＩＩａを含むサンプルであることを特徴とする、請求項１０記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法を実施するために用いるキット。
【請求項１２】
ＦＶＩＩａが血漿ＦＶＩＩａ（ｐＦＶＩＩａ）、遺伝子組み換えＦＶＩＩＩａ（ｅＦＶＩＩａ）、あるいは形質転換ＦＶＩＩａ（ＴｇＦＶＩＩａ）であることを特徴とする、請求項１０または１１記載のサンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法を実施するために用いるキット。
【請求項１３】
サンプル中のＦＶＩＩａ濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｅｘ―ｖｉｖｏで測定するための方法において、ＦＶＩＩと、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子を欠失したヒト血漿を使用することを特徴とする因子を欠失した血漿を用いてサンプル中の因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項１４】
前記サンプルが形質転換された哺乳動物の母乳あるいは精製されたＦＶＩＩａを含んでいるサンプルであることを特徴とする、請求項１３記載の因子を欠失した血漿を用いてサンプル中の因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【請求項１５】
前記ＦＶＩＩａが血漿ＦＶＩＩａ（ｐＨＶＩＩａ）、遺伝子組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）、あるいは形質転換ＦＶＩＩａ（ＴｇＦＶＩＩａ）であることを特徴とする、請求項１３あるいは１４記載の因子を欠失した血漿を用いてサンプル中の因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図７ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図７ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１０−５１５０４５（Ｐ２０１０−５１５０４５Ａ）
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４３５０５（Ｐ２００９−５４３５０５）
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／００２１８８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９６０８２
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（３０９０４０４４６）エルエフビー バイオテクノロジーズ ソサイエテ パー アクションズ シンプリフィー ユニパーソンネリー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／００２１８８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９６０８２
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（３０９０４０４４６）エルエフビー バイオテクノロジーズ ソサイエテ パー アクションズ シンプリフィー ユニパーソンネリー (3)
【Ｆターム（参考）】
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