シリカ粒子及びその製造方法並びにその使用方法
シリカ粒子、及びシリカ粒子を含む組成物を開示する。シリカ粒子の製造方法、及びシリカ粒子の使用方法も開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリカ粒子、シリカ粒子を含む組成物、シリカ粒子の製造方法、及びシリカ粒子の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムにおいては、密な分離媒体を与えるために充填媒体を比較的高い充填圧力にかける。例えば、１５００ｐｓｉ以下又はこれより高い充填圧力が典型的な充填圧力である。かかる高い充填圧力に曝露している間に、充填媒体、例えばシリカ粒子の一部が破壊されて粒子状物質の微粉を形成する可能性がある。充填プロセス中に生成する微粉の量が増加すると、カラムを通る流体の流れに対する過剰の抵抗、カラムを通る非均一な流体の流れ、及び減少したカラム効率など（しかしながら、これらに限定されない）の数多くのプロセスの問題が導かれる可能性がある。
【０００３】
当該技術において、最適のヤング率を有するシリカ粒子のような粒子を開発して、粒子がカラム充填中に控えめにしか弾性降伏しないようにする努力が継続されている。粒子の弾性率が低すぎると、過剰の弾性粒子変形によって上記に記載のもののようなプロセスの問題（例えば流体の流れに対する高い抵抗）が引き起こされる可能性がある。しかしながら、粒子の弾性率が高すぎると、粒子のカラムが適度な安定性に欠ける可能性がある。使用中において、及びシステムに機械的衝撃を与えると、非常に高い弾性の粒子が位置をシフトして、それにより流体の流れの均一性が低下し、カラム効率が減少する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
充填カラムにおいて用いる場合に、カラムの内部に「内部バネ効果」を生成する、即ち充填圧力にかけた場合にシリカ粒子がある程度の圧縮を受けるが破壊に対して抵抗性を示す最適の弾性率を有するシリカ粒子に関する必要性が当該技術において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、新規なシリカ粒子を発見することによって上記で議論した困難性及び問題点の幾つかに取り組むものである。本シリカ粒子は、シリカ粒子が充填されたカラム内において「内部バネ効果」を与える最適のヤング率を有する。本シリカ粒子は、塑性変形に対して高い抵抗性の内部、及び弾性変形に対して低い抵抗性（即ち低弾性率）を有する表面を有すると考えられる。この新規なシリカ粒子は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムにおいてクロマトグラフィー媒体として用いるのに特に好適である。この新規なシリカ粒子は、典型的には、高度に球状で、多孔質で、実質的にマクロ孔を有さないアモルファスのシリカ粒子であり、表面変性を行わずに（即ち、非結合形又は正常相で）、或いは表面変性を行って（即ち、結合形、又は逆相、ＨＩＣ等で）、クロマトグラフィー媒体として用いることができる。
【０００６】
１つの代表的な態様においては、本発明のシリカ粒子は、（ｉ）第１の弾性率を有する内部部分、及び（ｉｉ）第２の弾性率を有する粒子の外表面部分を含み、第１の弾性率が第２の弾性率よりも大きい、多孔質シリカ粒子を含む。与えられたシリカ粒子内での弾性率の相違は、シリカ粒子の領域内の孔密度の変動の結果である可能性がある。例えば、シリカ粒子の内部領域は、同じシリカ粒子の外表面領域よりも低い孔密度を有する可能性がある。
【０００７】
他の代表的な態様においては、本発明のシリカ粒子は、少なくとも約１００ＭＰａの塑性変形、及び約４ＧＰａ未満の弾性変形を有する多孔質シリカ粒子を含む。高い塑性変形及び低い弾性変形によって、かかるシリカ粒子は、クロマトグラフィー媒体として用いる場合に、粒子に損傷を与えることなくクロマトグラフィーカラム内に効率的に充填することができる。
【０００８】
本発明は、またシリカ粒子の製造方法にも関する。１つの代表的な方法においては、シリカ粒子の製造方法は、部分的に加水分解された材料を形成するように有機シリケートを部分的に加水分解し；部分的に加水分解された材料を蒸留して、エチルアルコールを除去し、蒸留された部分的に加水分解された材料を形成し；極性連続相中に部分的に加水分解されたシリケートの液滴を形成するように、蒸留された部分的に加水分解された材料を極性連続相中で乳化し；球状の多孔質粒子を形成するように、水酸化アンモニウムを用いる縮合反応によって液滴をゲル化し；球状の多孔質粒子を洗浄し；球状の多孔質粒子を水熱熟成し；そして、球状の多孔質粒子を乾燥して乾燥した多孔質粒子を形成する；ことを含む。
【０００９】
本発明は更に、シリカ粒子を使用する方法に関する。シリカ粒子を使用する１つの代表的な方法においては、該方法は、（ｉ）第１の弾性率を有する内部部分、及び（ｉｉ）第２の弾性率を有する粒子の外表面部分を含み、第１の弾性率が第２の弾性率よりも大きい少なくとも１つの多孔質シリカ粒子をクロマトグラフィーカラム中に導入することを含むクロマトグラフィーカラムの製造方法を含む。シリカ粒子を用いる更なる代表的な方法は、上記に記載のクロマトグラフィーカラムを用いて、１以上の材料をクロマトグラフィーカラムに通しながら互いに分離することを含むことができる。
【００１０】
本発明は更に、（ｉ）第１の弾性率を有する内部部分、及び（ｉｉ）第２の弾性率を有する粒子の外表面部分を含み、第１の弾性率が第２の弾性率よりも大きい少なくとも１つの多孔質シリカ粒子を含むクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィーカラムの製造方法、及びクロマトグラフィーカラムの使用方法に関する。
【００１１】
本発明のこれらの及び他の特徴並びに有利性は、開示された態様の以下の詳細な説明及び特許請求の範囲を検討した後には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の代表的なシリカ粒子の拡大図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、階段状の特性勾配を有する本発明の代表的なシリカ粒子の横断面図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実質的に連続的な特性勾配を有する本発明の代表的なシリカ粒子の横断面図を示す。
【図３】図３は、本発明の代表的なシリカ粒子をＨＰＬＣカラム内に充填する前及び後の粒径分析を示す。
【図４】図４は、ＨＰＬＣカラム内に充填した後の本発明の代表的なシリカ粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。
【図５】図５は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子のカラム充填効率を示す。
【図６】図６は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子のペプチド選択性を示すクロマトグラフを示す。
【図７】図７は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子の純合成ペプチド選択性を示すクロマトグラフを示す。
【図８】図８は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子の粗合成ペプチド選択性を示すクロマトグラフを示す。
【図９】図９は、本発明の代表的なシリカ粒子及び従来のシリカ粒子を用いた粗２０−ＡＡ合成ペプチドのクロマトグラフを示す。
【図１０】図１０は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子の血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）選択性を示すクロマトグラフを示す。
【図１１】図１１は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子のインシュリン充填容量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の原理の理解を促進するために、以下において本発明の特定の態様を説明し、特定の用語を用いて特定の態様を説明する。しかしながら、特定の用語を用いることによって本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されよう。議論される本発明の原理の変更、更なる修正、及び更なる適用は、本発明が属する技術の当業者が一般的に想到するものであると考えられる。
【００１４】
本発明は多孔質シリカ粒子に関する。本発明は更に、多孔質シリカ粒子の製造方法、並びに多孔質シリカ粒子の使用方法に関する。代表的な多孔質シリカ粒子、多孔質シリカ粒子の製造方法、及び多孔質シリカ粒子の使用方法の説明を以下に与える。
【００１５】
Ｉ．シリカ粒子：
本発明のシリカ粒子は、本シリカ粒子が公知のシリカ粒子と比較して１以上の有利性を与えることができる物理的構造及び特性を有する。
【００１６】
Ａ．シリカ粒子の物理的構造：
本発明のシリカ粒子は、平均最大粒子寸法（即ち最大直径寸法）を有する球状の粒子形状を有する。典型的には、本発明のシリカ粒子は、約７００μｍ未満、より典型的には約１００μｍ未満の平均最大粒子寸法を有する。本発明の１つの望ましい態様においては、シリカ粒子は約１．０〜約１００μｍ、より望ましくは約３．０〜約２０μｍの平均最大粒子寸法を有する。
【００１７】
本発明の多孔質シリカ粒子は、典型的には、例えば透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）法を用いて測定して約１．４未満のアスペクト比を有する。ここで用いる「アスペクト比」という用語は、（ｉ）シリカ粒子の平均最大粒子寸法と（ｉｉ）シリカ粒子の平均最大横断面粒子寸法（ここで、横断面粒子寸法は、シリカ粒子の最大粒子寸法に対して実質的に直交方向のものである）との間の比を表すように用いる。本発明の幾つかの態様においては、シリカ粒子は約１．３未満（又は約１．２未満、又は約１．１未満、又は約１．０５未満）のアスペクト比を有する。典型的には、シリカ粒子は約１．０〜約１．２のアスペクト比を有する。
【００１８】
本発明の多孔質シリカ粒子は、また、本シリカ粒子を望ましいクロマトグラフィー媒体にする孔容積を有する。典型的には、シリカ粒子は、窒素ポロシメトリーによって測定して少なくとも約０．４０ｃｃ／ｇの孔容積を有する。本発明の１つの代表的な態様においては、多孔質シリカ粒子は、窒素ポロシメトリーによって測定して約０．４０ｃｃ／ｇ〜約１．４ｃｃ／ｇの孔容積を有する。本発明の他の代表的な態様においては、多孔質シリカ粒子は、窒素ポロシメトリーによって測定して約０．７５ｃｃ／ｇ〜約１．１ｃｃ／ｇの孔容積を有する。
【００１９】
本発明の多孔質シリカ粒子は少なくとも約４０Åの平均孔直径を有する。本発明の１つの代表的な態様においては、シリカ粒子は約４０Å〜約７００Åの平均孔直径を有する。本発明の更なる代表的な態様においては、シリカ粒子は約９０Å〜約１５０Åの平均孔直径を有する。
【００２０】
本発明の多孔質シリカ粒子は、また、ＢＥＴ窒素吸着法（即ち、Brunauer Emmet Teller法）によって測定して少なくとも約１５０ｍ２／ｇの表面積を有する。本発明の１つの代表的な態様においては、シリカ粒子は約２００ｍ２／ｇ〜約４５０ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する。本発明の更なる代表的な態様においては、シリカ粒子は約２６０ｍ２／ｇ〜約３７０ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する。
【００２１】
１，０００倍の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）によって与えられる、本発明の代表的なシリカ粒子の拡大図を図１に示す。図１において示されているように、代表的なシリカ粒子１０は、球状の形状、及び比較的狭い粒径分布を有する。更に、図２Ａ及び２Ｂにおいて示されているように、代表的なシリカ粒子１０は、粒子の横断面に沿った粒子特性勾配を有すると考えられる。
【００２２】
図２Ａにおいて示されているように、本発明の１態様においては、代表的なシリカ粒子１０は、代表的なシリカ粒子１０の内部１２と外表面１１との間に階段状の特性勾配を有すると考えられる。例えば、代表的なシリカ粒子１０は、内部領域１３内においてより高いヤング率、及び表面領域１４内においてより低いヤング率を有することができる。例えば、代表的なシリカ粒子１０は、内部領域１３内においてより高いヤング率（又はより低い孔密度）、及び表面領域１４内においてより低いヤング率（又はより高い孔密度）を有することができる。この態様においては、代表的なシリカ粒子１０の内部１２と外表面１１との間に異なる粒子特性を有する２つより多い領域が存在していてもよいことを留意すべきである。
【００２３】
図２Ｂにおいて示されているように、本発明の他の態様においては、代表的なシリカ粒子１０は、内部１２における内部値から外表面１１に沿った表面値へと変化する実質的に連続の特性勾配を有すると考えられる。例えば、代表的なシリカ粒子１０は、内部１２において最大のヤング率（又は最小の孔密度Ｐｍｉｎ）、及び外表面１１に沿って最小のヤング率（又は最大の孔密度Ｐｍａｘ）を有していてよい。この態様においては、最大又は最小の特性値（例えば、最小孔密度Ｐｍｉｎ）は、図２Ｂにおいて示されるような内部１２ではなく、代表的なシリカ粒子１０の内部１２と外表面１１との間の幾つかの点において存在していてもよいことを留意すべきである。
【００２４】
Ｂ．シリカ粒子の特性：
本発明のシリカ粒子の上記に記載の物理特性の結果として、本シリカ粒子はＨＰＬＣ用途においてクロマトグラフィー媒体として用いるのに良く適している。実質的に球状の形状により、均一な充填及びしたがってＨＰＬＣカラムを通る液体のより均一な流れが可能であり、これによってより良好なカラム効率が得られる。更に、シリカ粒子の塑性変形特性により、本発明のシリカ粒子は充填圧力に曝露した際に破壊抵抗性を示し、これにより流体の流れに対する過剰の抵抗が防止され、ＨＰＬＣカラムを通る均一な流体の流れが保持される。
【００２５】
上記で議論したように、本発明のシリカ粒子は、カラム充填中に粒子が控えめに弾性降伏するのを可能にするが、粒子の破壊を引き起こすのには十分ではない最適のヤング率を有するように思われる。本発明のシリカ粒子は、ＨＰＬＣカラム内で用いた場合に、動的軸圧縮によって達成されるものと同じ様にカラムを安定化する「内部バネ効果」を与える。
【００２６】
更に、上記で議論したように、本発明のシリカ粒子は弾性率の放射状に広がる特性勾配を有すると考えられる。より具体的には、本発明のシリカ粒子は、シリカ粒子の内部領域よりも好適に低い弾性率を有する表面領域を有する。かかる粒子の構成により、本発明のシリカ粒子が何故にかかる安定化充填カラム（即ち、低い粒子移動及びカラム内の空隙形成）を形成するかが説明される。本発明のシリカ粒子は、粒子の表面においてはより大きな弾性変形を有するが、粒子の内部に向かって弾性率がより高くなっていて、内部の弾性率により粒子が全粒子（即ち塑性）変形を起こして粒子の破壊及び流体の流れに対する高い抵抗を引き起こすことが防止される。
【００２７】
更に、本発明のシリカ粒子の考えられている多孔性勾配により、本シリカ粒子は充填カラムにおいて用いた場合に良好な物質移動特性を与える。クロマトグラフィー分離においては、分子の殆どは粒子の最中心部には拡散しないので、上記に記載の放射状に広がる多孔性勾配によって粒子内部への及び粒子の外への物質移動を増加させて改良されたカラム効率を得ることができる。
【００２８】
１態様においては、本発明の粒子は、原子間力顕微鏡測定（ＡＦＭ）によって測定して少なくとも約１００ＭＰａ、典型的には少なくとも約２００ＭＰａ、より典型的には少なくとも約３００ＭＰａ、更により典型的には少なくとも約４００ＭＰａの硬度又は塑性変形を有する。ＡＦＭは、Veeco Instrumentsから入手できるNanoman II SPMシステムを用い、ダイアモンドチッププローブによって３０μＮの力で行う。硬度は、式：硬度＝力／面積（ここで、面積はプローブによって形成される凹みの寸法である）によって求められる。ＡＦＭは、「原子間力顕微鏡を用いるナノスケールでの弾性率測定の理論モデル及び実施」, Journal of Physic: Conference Series 61, pp 1303-07, 2007に記載されているようにして行う。
【００２９】
他の態様においては、本発明の粒子は、ＡＦＭによって測定して約４ＧＰａ未満、典型的には約３ＧＰａ未満、より典型的には約２ＧＰａ未満、更により典型的には約１ＧＰａ未満のヤング率又は弾性変形を有する。ＡＦＭは、Veeco Instrumentsから入手できるNanoman II SPMシステムを用い、ダイアモンドチッププローブによって３．２９７μＮの力で行う。ヤング率は、「負荷及び置換感受性圧入実験を用いる硬度及び弾性率の測定のための改良された方法」, J. Mater. Res. vol.7, pp 1564-83, 1992に記載されているようにしてOliver-Pharr分析によって測定する。
【００３０】
他の代表的な態様においては、本発明のシリカ粒子は、少なくとも約１００ＭＰａの塑性変形及び約４ＧＰａ未満の弾性変形、好ましくは少なくとも約１００ＭＰａの塑性変形及び約３ＧＰａ未満の弾性変形、更により好ましくは少なくとも約１００ＭＰａの塑性変形及び約２ＧＰａ未満の弾性変形を有する多孔質シリカ粒子を含む。更に、本発明のシリカ粒子は、例えば少なくとも約１００ＭＰａ（又は２００ＭＰａ、３００ＭＰａ、或いは４００ＭＰａ等）の塑性変形及び約４ＧＰａ（又は３ＧＰａ、又は２ＧＰａ、又は１ＧＰａ等）未満の弾性変形のような、ここで示す塑性変形と弾性変形の特性の任意の組み合わせを有することができる。高い塑性変形及び低い弾性変形によって、かかるシリカ粒子をクロマトグラフィー媒体として用いる場合に、粒子に対して損傷を与えることなくクロマトグラフィーカラム内に効率的に充填することができる。
【００３１】
開示したシリカ粒子の上記で言及した特性を、図３〜５を参照して更に詳細に説明する。図３は、本発明の代表的なシリカ粒子をＨＰＬＣカラム内に充填する前及び後の粒径分析を示す。図３において示されているように、本発明のシリカ粒子は、（１）商業的に入手できるシリカ粒子であるEka Nobel ABから入手できるKromasil（登録商標） 10ミクロンC18に関する「前」及び「後」の数（％）ラインと比較した、本発明のシリカ粒子に関する「前」及び「後」の数（％）ラインの近似性；及び（２）商業的に入手できるシリカ粒子に関する増加した微粉の数と比較した、本発明のシリカ粒子に関して生成した最小の微粉量；によって示される動的軸圧縮充填中のより少ない粒子破壊を示す。本発明の粒子をカラム内に充填した後においては粒径分布は実質的には変化しないが、これに対して商業的に入手できる媒体の粒径分布は大きく異なる。例えば、本発明の粒子によれば最小の微粉（例えば全数を基準として約５０％未満の数の＜５μｍの微粉）が生成し、これに対して商業的に入手できる粒子によれば遙かに多くの微粉（例えば全数を基準として５０％より多い数の＜５μｍの微粉）が生成する。好ましくは、本発明の粒子の充填中に、約４０％未満、より好ましくは約３０％未満、更により好ましくは約２０％未満（即ち、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％等）の数の微粉が生成する。
【００３２】
図４は、ＨＰＬＣカラム内に動的軸圧縮充填した後の本発明の代表的なシリカ粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（倍率＝５００）（右側の画像）と、ＨＰＬＣカラム内に動的軸圧縮充填した後の上記で言及した商業的に入手できるシリカ粒子のＳＥＭ画像（左側の画像）とを示す。左側の画像は上記で言及した商業的に入手できるシリカ粒子の動的軸圧縮充填中に生成した微粉を示し、一方、右側の画像は本発明のシリカ粒子の動的軸圧縮充填中に生成する微粉を本質的に含まない。
【００３３】
図５は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子のカラム充填効率を示す。図５において示されているように、本発明のシリカ粒子は、商業的に入手できるシリカ粒子である、Eka Nobel ABから入手できるKromasil 10ミクロンC18、及びDaiso Co., Ltd.から入手できるDaiso 10ミクロンC18と比較して最も高いプレート／メートルの値を示した。
【００３４】
ＩＩ．シリカ粒子の製造方法：
本発明はまた、シリカ粒子の製造方法にも関する。本発明のシリカ粒子を形成するために用いる原材料、及び本発明のシリカ粒子を形成するための方法工程を以下に議論する。
【００３５】
Ａ．原材料：
本発明のシリカ粒子の製造方法は、多数のケイ素含有原材料から形成することができる。好適なケイ素含有原材料としては、Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO)などの数多くの供給源から商業的に入手できるテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）；Silbond Corporation (Weston, MI)から商業的に入手できるSILBONDTM40又はSILBONDTM 50のような部分的にオリゴマー化されたシリケート；Dynasil Corporation (West Berlin, NJ)から商業的に入手できるDYNASILTM 40のような部分的にオリゴマー化されたシリケート；及びWacker Chemie AG(Munich, Germany)から商業的に入手できるTES 40 WNのような部分的にオリゴマー化されたシリケート；が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
１つの望ましい態様においては、SILBONDTM40を用いて「小分子」生成物を形成する。ここで用いる「小分子」生成物という用語は、小分子クロマトグラフィー用途において特に有用な本発明のシリカ粒子を示すように用いる。本発明の「小分子」シリカ粒子は、典型的には、約０．７５〜約１．１ｃｃ／ｇの範囲のＮ２孔容積；約２６０〜約３７０ｍ２／ｇの範囲のＮ２表面積；及び約９０〜約１５０Åの範囲の平均孔直径；を有する。
【００３７】
Ｂ．プロセス工程：
本発明のシリカ粒子は、典型的には、上記に記載のもののような有機シリケートを部分的に加水分解し、蒸留し、次により極性の連続相中に分散させて、部分的に加水分解したシリケートの極性連続相中での非混和性によって小滴を形成する多工程プロセスを用いて製造する。これらの液滴は、次に、水酸化アンモニウムによって触媒する縮合反応の結果としてゲル化する。得られる球状の多孔質粒子を次に洗浄し、水熱熟成し、乾燥する。水熱熟成及び乾燥工程中のプロセス条件が、得られる粒子の孔構造を制御するのに特に重要であることが見出された。得られる多孔質シリカ粒子は、次に、従来の手段（例えば水簸又は空気分級）によって適当に狭い粒径分布に分級することができる。種々のプロセス工程の更なる説明を以下に与える。
【００３８】
１．部分的加水分解工程：
加水分解の程度は、望ましい物理特性（例えば最適のヤング率、粒径等）を有するシリカ粒子を得るために重要なプロセスパラメーターである。例えば、過度の加水分解は粒子形成工程の連続相中に完全に混和性の溶液を与える可能性があり、一方、加水分解が不足するとその後の縮合（即ちゲル化）工程中に反応性が低すぎる物質を与える可能性がある。
【００３９】
部分的加水分解は、典型的には０．１ＭのＨＣｌ（水溶液）を用いて行うが、他の酸を同様に用いることができる。この混合物に（撹拌しながら）エチルアルコール（ＥｔＯＨ）を加えて、有機シリケートと水相との間の非混和性を克服する。反応は雰囲気温度において自発的に進行する。１つの代表的な反応物質の組み合わせは、１００．０ｇのSILBONDTM 40、２１．５ｇのＥｔＯＨ、及び４．６ｇの０．１Ｍ−ＨＣｌ（水溶液）を含む。
【００４０】
２．蒸留工程：
部分的に加水分解した材料（ＰＨＳ）の蒸留を行ってＥｔＯＨ（即ち、加えたものと加水分解工程中に副生成物として形成されたものの両方）を除去することができる。蒸留工程により、マクロ孔を含まない粒子の形成が最小になるか及び／又は排除される。ここで用いる「マクロ孔を含まない粒子」という用語は、実質的に連続なミクロ細孔粒子構造を有するシリカ粒子を指す。蒸留は、典型的には、真空下（即ち１００Ｔｏｒｒ未満）、約９０℃において、ＥｔＯＨを除去するのに必要な時間（典型的には約１時間未満）行う。
【００４１】
３．粒子形成（乳化）工程：
粒子の形成は、ＰＨＳをアンモニア処理した水相中に乳化させることによって行う。得られる小滴は、ＰＨＳが関与するアンモニア接触縮合反応によって速やかにゲル化（即ち固化）する。
【００４２】
１〜１００μｍの粒径範囲のシリカ粒子を製造するために２種類の方法が用いられている。第１の方法は、Cowlesミキサーを用いる２工程のバッチ法である。第１工程、即ち液滴形成工程においては、蒸留したＰＨＳをイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／水溶液（例えば３０重量％のＩＰＡ水溶液）中で乳化させる。次に、第２工程において連続的に混合しながらＮＨ４ＯＨを加えて縮合反応を進行させて、多孔質の球状粒子の固化を行う。ブレードチップ速度（例えば、速度がより速いとより小さな粒子が製造される）及び連続相の組成（例えば、アルコールがより多いとより小さな粒子が製造される）を組み合わせることによって平均粒径を制御する。
【００４３】
シリカ粒子を製造するための第２の方法は、インラインスタティックミキサーを用いてＰＨＳを３０重量％−ＩＰＡ／１重量％−ＮＨ４ＯＨ水溶液中に乳化することを用いる。この場合においては、インラインミキサーを通る速度がより速いとより小さな粒径が得られる。
【００４４】
４．濾過／デカンテーション工程：
粒子形成工程に続いて、典型的には濾過及びデカンテーションを用いて、過剰のアルコール及びアンモニアをシリカ生成物から除去する。典型的な濾過／デカンテーション工程においては、上記に記載の粒子形成工程から得られるフィルターケーキを脱イオンＨ２Ｏ（例えば１２Ｌの脱イオンＨ２Ｏ）中に再懸濁し、次に一晩（例えば１２時間）沈降させる。沈降時間の後に、粒子を含む溶液をデカンテーションして液体の大部分を除去する。
【００４５】
５．水熱熟成工程：
水熱熟成工程を用いて多孔質シリカ粒子の内表面積を減少させることができる。シリカゲルの製造と同様にして、より厳しい熟成（即ち、より長く、より熱く、及び／又はよりアルカリ性）によって、より多い表面積の減少、及びより大きい乾燥中の粒子多孔度（孔容積）の保持が得られる。熟成工程の終了時においては、十分な脱イオン水を加えて冷却し、これにより熟成プロセスをクエンチする。
【００４６】
１つの代表的な態様においては、水熱熟成工程は、上記に記載のデカンテーション／濾過工程において形成される沈降シリカケーキを、十分量の脱イオン水中に再懸濁して撹拌しうるスラリー（例えば、約１Ｌの添加水中に乾燥基準で約１ｋｇのシリカケーキ）を形成することを含む。次に、撹拌されたスラリーを約７５℃に約９０分間加熱する。雰囲気温度の約１２Ｌの脱イオン水（１Ｌの加熱水あたり）を加えることにより熟成を停止する。次に、懸濁液を濾過するか、又は沈降及びデカンテーションする。
【００４７】
６．乾燥工程：
乾燥速度も最終シリカ生成物の表面積及び孔容積に影響を与える。１つの代表的な態様においては、乾燥工程は、約１．２５ｃｍのシリカケーキの厚さを形成するように、デカンテーションした体積のシリカ生成物又はシリカ生成物のフィルターケーキをトレー中に拡げ；シリカケーキを含むトレーを重力対流オーブン内に約１４０℃のオーブン温度で約２０時間配置し；トレー及びシリカをオーブンから取り出し；シリカを回収する；ことを含む。乾燥したシリカ材料は、次に、引き続く場合によって用いるサイジング及び結合工程のために備えられる。
【００４８】
ＩＩＩ．シリカ粒子の使用方法：
本発明は更に、シリカ粒子を使用する方法に関する。上記で議論したように、本シリカ粒子はクロマトグラフィー媒体として用いることができる。シリカ粒子をクロマトグラフィー媒体として用いる種々の方法を図６〜１１に示す。
【００４９】
図６は、従来のシリカ粒子であるPhenomenex Inc.から入手できるLuna 5ミクロンC18と比較した本発明の代表的なシリカ粒子のペプチド選択性を示すクロマトグラフを示す。
図７は、従来のシリカ粒子であるAkzo Nobel ABから入手できるKromasil 5ミクロンC18と比較した本発明の代表的なシリカ粒子の純合成ペプチド選択性を示すクロマトグラフを示す。
【００５０】
図８は、従来のシリカ粒子であるAkzo Nobel ABから入手できるKromasil 5ミクロンC18と比較した本発明の代表的なシリカ粒子の粗合成ペプチド選択性を示すクロマトグラフを示す。
【００５１】
図９は、本発明の代表的なシリカ粒子、及び従来のシリカ粒子であるPhenomenex Inc.から入手できるJupiter Proteo 5ミクロンC18を用いた粗20-AA合成ペプチドのクロマトグラフを示す。
【００５２】
図１０は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子の血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）選択性を示すクロマトグラフを示す。
図１１は、従来のシリカ粒子であるAkzo Nobel ABから入手できるKromasil 5ミクロンC8、及びYMC Co., Ltd.から入手できるHydrosphere 5ミクロンC8と比較した本発明の代表的なシリカ粒子のインシュリン充填容量を示す。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例によって本発明を更に示すが、これらはいかなるようにも発明の範囲に対して限定を加えるものとは解釈されない。それどころか、本解決手段は種々の他の態様、変更、及びその均等物を有することができ、これらは本明細書中の記載を読んだ後は、本発明の精神及び／又は特許請求の範囲から逸脱することなくそれ自体当業者に示唆されることを明確に理解すべきである。
【００５４】
実施例１：
部分的に加水分解された材料（ＰＨＳ）の製造：
２３０ｇの０．１Ｍ−ＨＣｌ溶液（水溶液）を撹拌しながら５，０００ｇのSILBONDTM 40に加えた。次に、SILBONDTM40と水相との間の非混和性を克服するために、１０７５ｇのＥｔＯＨを撹拌しながらこの混合物に加えた。反応は雰囲気温度において自発的に進行した。
【００５５】
得られた部分的に加水分解された材料（ＰＨＳ）を蒸留して、混合物に加えたＥｔＯＨ及び加水分解工程中に副生成物として形成されたＥｔＯＨを除去した。蒸留は真空下（＜１００Ｔｏｒｒ）、９０℃において行った。
【００５６】
実施例２：
バッチ混合を用いる「小分子」シリカ粒子の製造：
実施例１において形成された３，８００ｇの蒸留ＰＨＳを、１４，９００ｇの３０重量％ＩＰＡ／水（予め調製して少なくとも１６時間放置して脱気させた）中に注ぎ入れた。Cowlesミキサーを始動し、１１６０ｒｐｍに５分間設定して乳化を完了させた。次に、混合を継続しながら３７８ｇの３０重量％ＮＨ４ＯＨを加えた（全量を一回で）。溶液を１１６０ｒｐｍにおいて更に２０分間混合し、この間に粒子のゲル化が完了した。シリカ懸濁液を一晩沈降させた。
【００５７】
翌日、シリカ懸濁液を濾過し、得られたシリカケーキを１２Ｌの脱イオンＨ２Ｏで再懸濁して過剰のアルコール及び／又はアンモニアを除去した。シリカ溶液を一晩沈降させ、翌日にデカンテーションした。この手順をもう１回繰り返した。
【００５８】
デカンテーションした溶液からのシリカケーキを約１Ｌの脱イオン水中に再懸濁して撹拌しうるスラリーを形成した。次に、撹拌したスラリーを７５℃に９０分間加熱した。雰囲気温度の約１２Ｌの脱イオン水を加えることによって熟成を停止した。次に、懸濁液を濾過して過剰の流体を除去した。
【００５９】
シリカケーキ生成物をトレー中に拡げ、約１．２５ｃｍの厚さにならした。シリカケーキを含むトレーを１４０℃の重力対流オーブン内に２０時間配置した。次に、トレー及びシリカをオーブンから取り出し、シリカを容器に詰めた。
【００６０】
実施例３：
インラインスタティックミキサーを用いる「小分子」シリカ粒子の製造：
実施例１において形成された蒸留ＰＨＳ（９５０ｍＬ／分）及び３０％ＩＰＡ／１％ＮＨ４ＯＨ水溶液（４，０９０ｍＬ／分）を、直径１５．２ｃｍ（６インチ）のスタティックミキサーによって混合した。得られたシリカ粒子のスラリーを、次に、撹拌した容器中に流し入れた。シリカ懸濁液を一晩沈降させた。
【００６１】
翌日、シリカ懸濁液を濾過し、得られたシリカケーキを１２Ｌの脱イオンＨ２Ｏで再懸濁して過剰のアルコール及び／又はアンモニアを除去した。シリカ溶液を一晩沈降させ、翌日にデカンテーションした。この手順をもう１回繰り返した。
【００６２】
デカンテーションした溶液からのシリカケーキを約１Ｌの脱イオン水中に再懸濁して撹拌しうるスラリーを形成した。次に、撹拌したスラリーを７５℃に９０分間加熱した。雰囲気温度の約１２Ｌの脱イオン水を加えることによって熟成を停止した。次に、懸濁液を濾過して過剰の流体を除去した。
【００６３】
シリカケーキ生成物をトレー中に拡げ、約１．２５ｃｍの厚さにならした。シリカケーキを含むトレーを１４０℃の重力対流オーブン内に２０時間配置した。次に、トレー及びシリカをオーブンから取り出し、シリカを容器に詰めた。
【００６４】
実施例４：
ＡＦＭによるシリカ粒子の試験：
本実施例においては、１０μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をＡＦＭによって試験して弾性変形及び塑性変形の特性を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。弾性変形及び塑性変形の特性を、商業的に入手できるシリカ粒子である、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する１０μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するDaiso Co., Ltd.から商業的に入手できるDaiso SP-120-ODSと比較した。それぞれのシリカ粒子の弾性変形及び塑性変形の特性は、「原子間力顕微鏡を用いるナノスケールでの弾性率測定の理論モデル及び実施」, Journal of Physic: Conference Series 61, pp 1303-07, 2007に記載されているようにして測定した。塑性変形に関しては、Veeco Instrumentsから入手できるNanoman II SPMシステムを用い、ダイアモンドチッププローブによって３０μＮの力でＡＦＭを行った。硬度は式：硬度＝力／面積（ここで、面積はプローブによって形成される凹みの寸法である）によって求めた。弾性変形に関しては、Veeco Instrumentsから入手できるNanoman II SPMシステムを用い、ダイアモンドチッププローブによって３．２９７μＮの力でＡＦＭを行った。ヤング率は、「負荷及び置換感受性圧入実験を用いる硬度及び弾性率の測定のための改良された方法」, J. Mater. Res. vol.7, pp 1564-83, 1992に記載されているようにしてOliver-Pharr分析によって求めた。表１においてみられるように、本発明のシリカ粒子の塑性変形は従来のシリカ又は商業的に入手できるシリカのものよりも遙かに大きく、本発明のシリカ粒子の弾性変形は従来のシリカのものよりも遙かに小さい。
【００６５】
【表１】
【００６６】
実施例５：
クロマトグラフィーカラム中へのシリカ粒子の充填：
本実施例においては、１０μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して媒体充填効率を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のペプチド分離能を、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する１０μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するAkzo Nobel ABから商業的に入手できるKromasil（登録商標）、及びシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する１０μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するDaiso Co., Ltd.から商業的に入手できるDaiso SP-120-ODSなどの他の媒体のものと比較した。媒体を、Alltech Associates, Inc.から入手できる２５ｍｍ×４００ｍｍのSpringTMカラム中に充填した。媒体は、媒体６０ｇあたり１５０ｍＬのイソプロパノールを用いて１５００ｐｓｉでカラム中に充填した。最終カラム床長さは２５０ｍｍであった。図３において示されているように、充填後に生成する小粒子又は微粉の数は、従来のシリカのものよりも遙かに少なかった。例えば、本発明は、充填後にKromasilの半分未満の量の微粉（粒径５μｍ未満）を有していた。
【００６７】
それぞれのカラムの効率を評価するための分離方法として逆相クロマトグラフィーを用いた。ベンゼン、ナフタレン、及びビフェニルの混合物を、７０体積％のアセトニトリル及び３０体積％の水を含む移動相を用いてアイソクラチック条件下でそれぞれのカラム中に注入した。流速は１０ｍＬ／分であった。カラムを２５℃の室温で運転した。Super Prepフローセル及びRainin検出器（Varian, Inc.から入手できる）を用いて２５４ｎｍにおいて検出を行った。また、この分析において、Varian SD-1分取用ポンプ（Varian, Inc.から入手できる）、Valco prep手動注入器（Valco Instruments Company Inc.から入手できる）、及びEZ ChromTM（Scientific Software, Inc.から入手できる）も用いた。
【００６８】
結果を図５に示す。これは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体を凌ぐ向上したカラム効率を示す。
実施例６：
クロマトグラフィー媒体としてのシリカ粒子の使用：
本実施例においては、５μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して、ペプチドのような種々の生物学的物質を分離する能力を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のペプチド分離能を、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するPhenomex, Inc.から商業的に入手できるLuna（登録商標）の商品名の他の媒体のものと比較した。
【００６９】
それぞれのカラムに関する分離方法として逆相クロマトグラフィーを用いた。表１に列記するペプチドの混合物（GY (238 Da)、VYV (379 Da)、Met Enkephalin (YGGFM, 573 Da)、Anglotensin II (DRVYIHPF, 1045 Da)、及びLeu Enkephalin (YGGFL, 555 Da)）を、以下の条件下でそれぞれのカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）中に注入した。移動相は水中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ａ；及びアセトニトリル中の０．０８５％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ｂ；を含んでいた。カラムを１０％の溶媒Ｂ及び９０％の溶媒Ａで３０分間平衡化し；次に溶媒Ｂを１０％から４０％に増加させ（６０％の溶媒Ａ）；４０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持し；次に溶媒Ｂを４０％から９０％に増加させ（１０％の溶媒Ａ）；９０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持する；勾配プロセスを用いた。流速は１．０ｍＬ／分であった。カラムを２５℃の室温で運転した。UVD 170S検出器（Dionex Corp., Sunnyvale, CAから入手できる）を用いて２２５ｎｍにおいて検出を行った。この分析においては、Dionex HPLCシステム（Dionex Corp.から入手できるP580 HPG高圧勾配バイナリーポンプ）、Rheodyne手動注入器（IDEX Corp.から入手できる）、及びCHROMELEON（登録商標）データシステム（Dionex Corp.から入手できる）も用いた。結果を図６及び表２に示す。これらは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体を凌ぐそれぞれのペプチドピークの向上した分離能を示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
実施例７：
クロマトグラフィー媒体としてのシリカ粒子の使用：
本実施例においては、５μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して、ペプチドのような種々の生物学的物質を分離する能力を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のペプチド分離能を、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するAkzo Nobel ABから商業的に入手できるKromasil（登録商標）の商品名の他の媒体のものと比較した。
【００７２】
それぞれのカラムに関する分離方法として逆相クロマトグラフィーを用いた。ペプチドの混合物（Ac-RGGGGLGLGK-アミド (911 Da)、RGAGGLGLGK-アミド (883 Da)、Ac-RGAGGLGLGK-アミド (926 Da)、Ac-RGVGGLGLGK-アミド (954 Da)、及びAc-RGVVGLGLGK-アミド (996 Da)）を、以下の条件下でそれぞれのカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）中に注入した。移動相は水中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ａ；及びアセトニトリル中の０．０８５％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ｂ；を含んでいた。カラムを１０％の溶媒Ｂ及び９０％の溶媒Ａで３０分間平衡化し；次に溶媒Ｂを１０％から４０％に増加させ（６０％の溶媒Ａ）；４０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持し；次に溶媒Ｂを４０％から９０％に増加させ（１０％の溶媒Ａ）；９０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持する；勾配プロセスを用いた。流速は１．０ｍＬ／分であった。カラムを２５℃の室温で運転した。UVD 170S検出器（Dionex Corp., Sunnyvale, CAから入手できる）を用いて２２５ｎｍにおいて検出を行った。この分析においては、Dionex HPLCシステム（Dionex Corp.から入手できるP580 HPG高圧勾配バイナリーポンプ）、Rheodyne手動注入器（IDEX Corp.から入手できる）、及びCHROMELEON（登録商標）データシステム（Dionex Corp.から入手できる）も用いた。結果を図７に示す。これは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体を凌ぐそれぞれのペプチドピークの向上した分離能を示す。
【００７３】
実施例８：
クロマトグラフィー媒体としてのシリカ粒子の使用：
本実施例においては、５μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して、ペプチドのような目標の生物学的物質を不純物から分離する能力を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のペプチド分離能を、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するAkzo Nobel ABから商業的に入手できるKromasil（登録商標）の商品名の他の媒体のものと比較した。
【００７４】
それぞれのカラムに関する分離方法として逆相クロマトグラフィーを用いた。Bachem, Inc.から入手できる粗合成ペプチド、及び２種類の不純物の混合物を、以下の条件下でそれぞれのカラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）中に注入した。移動相は水中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ａ；及びアセトニトリル中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ｂ；を含んでいた。カラムを１５％の溶媒Ｂ及び８５％の溶媒Ａで３０分間平衡化し；次に溶媒Ｂを１５％から５０％に増加させ（５０％の溶媒Ａ）；５０％での溶媒Ｂの流れを１分間保持し；次に溶媒Ｂを５０％から８０％に増加させ（２０％の溶媒Ａ）；８０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持する；勾配プロセスを用いた。流速は０．８ｍＬ／分であった。カラムを２２℃の室温で運転した。UVD 170S検出器（Dionex Corp., Sunnyvale, CAから入手できる）を用いて２２０ｎｍにおいて検出を行った。この分析においては、Dionex HPLCシステム（Dionex Corp.から入手できるP580 HPG高圧勾配バイナリーポンプ）、Rheodyne手動注入器（IDEX Corp.から入手できる）、及びCHROMELEON（登録商標）データシステム（Dionex Corp.から入手できる）も用いた。結果を図８及び表３に示す。これらは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体を凌ぐ近接して溶出された不純物からのペプチドピークの向上した分離能を示す。
【００７５】
【表３】
【００７６】
実施例９：
クロマトグラフィー媒体としてのシリカ粒子の使用：
本実施例においては、５μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して、ペプチドのような目標の生物学的物質を不純物から分離する能力を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のペプチド分離能を、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する４μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するPhenomenex, Inc.から商業的に入手できるJupiter（登録商標）の商品名の他の媒体のものと比較した。
【００７７】
それぞれのカラムに関する分離方法として逆相クロマトグラフィーを用いた。Biopeptide Co., Inc.から入手できる粗合成ペプチドの混合物を、以下の条件下でそれぞれのカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）中に注入した。移動相は水中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ａ；及びアセトニトリル中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ｂ；を含んでいた。カラムを２０％の溶媒Ｂ及び８０％の溶媒Ａで２０分間平衡化し；次に溶媒Ｂを２０％から４０％に増加させる（６０％の溶媒Ａ）；勾配プロセスを用いた。流速は１．０ｍＬ／分であった。カラムを２５℃の室温で運転した。UVD 170S検出器（Dionex Corp., Sunnyvale, CAから入手できる）を用いて２２０ｎｍにおいて検出を行った。この分析においては、Dionex HPLCシステム（Dionex Corp.から入手できるP580 HPG高圧勾配バイナリーポンプ）、Rheodyne手動注入器（IDEX Corp.から入手できる）、及びCHROMELEON（登録商標）データシステム（Dionex Corp.から入手できる）も用いた。結果を図９に示す。これは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体を凌ぐ近接して溶出された不純物からのペプチドピークの向上した分離能を示す。
【００７８】
実施例１０：
クロマトグラフィー媒体としてのシリカ粒子の使用：
本実施例においては、５μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して、ペプチドのような目標の生物学的物質を不純物から分離する能力を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のペプチド分離能を、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するAkzo Nobel ABから商業的に入手できるKromasil（登録商標）、及びシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するPhenomenex, Inc.から商業的に入手できるLuna（登録商標）などの他の媒体のものと比較した。
【００７９】
それぞれのカラムに関する分離方法として逆相クロマトグラフィーを用いた。Karolinska Institutet, Stockholm, Swedenから入手できる血管作用性腸管ペプチド（２８−アミノ酸ペプチド、HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-アミド、分子量３３２５．８）、及び２種類の不純物の混合物を、以下の条件下でそれぞれのカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）中に注入した。移動相は水中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ａ；及びアセトニトリル中の０．０８５％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ｂ；を含んでいた。カラムを２０％の溶媒Ｂ及び８０％の溶媒Ａで３０分間平衡化し；次に溶媒Ｂを２０％から４０％に増加させ（６０％の溶媒Ａ）；４０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持し；次に溶媒Ｂを４０％から９０％に増加させ（１０％の溶媒Ａ）；９０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持する；勾配プロセスを用いた。流速は１．０ｍＬ／分であった。カラムを２５℃の室温で運転した。UVD 170S検出器（Dionex Corp., Sunnyvale, CAから入手できる）を用いて２２５ｎｍにおいて検出を行った。この分析においては、Dionex HPLCシステム（Dionex Corp.から入手できるP580 HPG高圧勾配バイナリーポンプ）、Rheodyne手動注入器（IDEX Corp.から入手できる）、及びCHROMELEON（登録商標）データシステム（Dionex Corp.から入手できる）も用いた。結果を図１０及び表４に示す。これらは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体を凌ぐ近接して溶出された不純物からのペプチドピークの向上した分離能を示す。
【００８０】
【表４】
【００８１】
実施例１１：
クロマトグラフィー媒体としてのシリカ粒子の使用：
本実施例においては、５μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して、カラムのインシュリン正面充填容量を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のインシュリン充填容量を、シリカ表面に共有結合しているＣ８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するAkzo Nobel ABから商業的に入手できるKromasil（登録商標）、及びシリカ表面に共有結合しているＣ８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するYMC Co., Ltdから商業的に入手できるHydrosphereなどの他の媒体のものと比較した。
【００８２】
以下の条件下でそれぞれのカラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を用いて分離法として逆相クロマトグラフィーを用いた。移動相は水中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ａ；及び５ｍＬのアセトニトリル、２ｍＬの５０％氷酢酸、及び４３ｍＬのＤＩ水中に２５０ｍｇのインシュリンを含む溶媒Ｂ；を含んでいた。これをＤＩ水中の０．１％−ＴＦＡで１：５に希釈して１ｍｇ／ｍＬのインシュリン溶液を形成した。カラムを１００％の溶媒Ａで平衡化し；次に１分間で溶媒Ｂを０％から１００％に増加させ；１００％での溶媒Ｂの流れを２００分間保持し；次に１分間で溶媒Ａを０％から１００％に増加させる（０％の溶媒Ｂ）；勾配プロセスを用いた。流速は０．２ｍＬ／分であった。カラムを２５℃の室温で運転した。UVD 170S検出器（Dionex Corp., Sunnyvale, CAから入手できる）を用いて２７６ｎｍにおいて検出を行った。この分析においては、Dionex HPLCシステム（Dionex Corp.から入手できるP580 HPG高圧勾配バイナリーポンプ）、Rheodyne手動注入器（IDEX Corp.から入手できる）、及びCHROMELEON（登録商標）データシステム（Dionex Corp.から入手できる）も用いた。下記の等式からそれぞれの材料の容量を算出した。
【００８３】
【化１】
【００８４】
結果を図１１に示す。これは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体のものを凌ぐ向上したインシュリン充填容量を示す。例えば、本発明のシリカを用いるカラムのインシュリン充填容量は１５４ｍｇ／ｍＬであり、一方、Hydrosphere及びKromasil媒体は、それぞれ１３３ｍｇ／ｍＬ及び１４ｍｇ／ｍＬのインシュリン充填容量を与え、これは約１０〜約１０００％高い回収率に相当する。
【００８５】
本発明を限られた数の態様によって説明したが、これらの特定の態様は本明細書において記載され特許請求されている発明の範囲を限定することを意図するものではない。更なる修正及び変更が可能であることは、本明細書中の代表的な態様を検討することにより当業者に明らかである。実施例及び明細書の残りの部分における全ての部及びパーセントは、他に特定しない限り重量基準である。更に、明細書又は特許請求の範囲において示す全ての数値範囲、例えば特定の特性の組、測定値の単位、条件、物理的状態、又は割合を示すものは、明らかに、言及するか又は他の方法で示すかかる範囲内に含まれる全ての数、並びにそのように示されている全ての範囲内の数の全ての部分集合を文字通り含むものであると意図される。例えば、下限ＲＬ及び上限ＲＵを有する数値範囲が開示されている場合には常に、この範囲内に含まれる任意の数Ｒが具体的に開示されている。特に、この範囲内の次式の数Ｒ：Ｒ＝ＲＬ＋ｋ（ＲＵ−ＲＬ）（式中、ｋは１％の増分で１％〜１００％の範囲の変数であり、例えばｋは、１％、２％、３％、４％、５％、・・・５０％、５１％、５２％、・・・９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である）が具体的に開示されている。更に、上記で算出されるＲの任意の二つの値によって表される任意の数値範囲も、具体的に開示されている。本明細書において示し記載したものに加えて、本発明の任意の修正は、上記の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなろう。かかる修正は、特許請求の範囲内に包含されると意図される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリカ粒子、シリカ粒子を含む組成物、シリカ粒子の製造方法、及びシリカ粒子の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムにおいては、密な分離媒体を与えるために充填媒体を比較的高い充填圧力にかける。例えば、１５００ｐｓｉ以下又はこれより高い充填圧力が典型的な充填圧力である。かかる高い充填圧力に曝露している間に、充填媒体、例えばシリカ粒子の一部が破壊されて粒子状物質の微粉を形成する可能性がある。充填プロセス中に生成する微粉の量が増加すると、カラムを通る流体の流れに対する過剰の抵抗、カラムを通る非均一な流体の流れ、及び減少したカラム効率など（しかしながら、これらに限定されない）の数多くのプロセスの問題が導かれる可能性がある。
【０００３】
当該技術において、最適のヤング率を有するシリカ粒子のような粒子を開発して、粒子がカラム充填中に控えめにしか弾性降伏しないようにする努力が継続されている。粒子の弾性率が低すぎると、過剰の弾性粒子変形によって上記に記載のもののようなプロセスの問題（例えば流体の流れに対する高い抵抗）が引き起こされる可能性がある。しかしながら、粒子の弾性率が高すぎると、粒子のカラムが適度な安定性に欠ける可能性がある。使用中において、及びシステムに機械的衝撃を与えると、非常に高い弾性の粒子が位置をシフトして、それにより流体の流れの均一性が低下し、カラム効率が減少する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
充填カラムにおいて用いる場合に、カラムの内部に「内部バネ効果」を生成する、即ち充填圧力にかけた場合にシリカ粒子がある程度の圧縮を受けるが破壊に対して抵抗性を示す最適の弾性率を有するシリカ粒子に関する必要性が当該技術において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、新規なシリカ粒子を発見することによって上記で議論した困難性及び問題点の幾つかに取り組むものである。本シリカ粒子は、シリカ粒子が充填されたカラム内において「内部バネ効果」を与える最適のヤング率を有する。本シリカ粒子は、塑性変形に対して高い抵抗性の内部、及び弾性変形に対して低い抵抗性（即ち低弾性率）を有する表面を有すると考えられる。この新規なシリカ粒子は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムにおいてクロマトグラフィー媒体として用いるのに特に好適である。この新規なシリカ粒子は、典型的には、高度に球状で、多孔質で、実質的にマクロ孔を有さないアモルファスのシリカ粒子であり、表面変性を行わずに（即ち、非結合形又は正常相で）、或いは表面変性を行って（即ち、結合形、又は逆相、ＨＩＣ等で）、クロマトグラフィー媒体として用いることができる。
【０００６】
１つの代表的な態様においては、本発明のシリカ粒子は、（ｉ）第１の弾性率を有する内部部分、及び（ｉｉ）第２の弾性率を有する粒子の外表面部分を含み、第１の弾性率が第２の弾性率よりも大きい、多孔質シリカ粒子を含む。与えられたシリカ粒子内での弾性率の相違は、シリカ粒子の領域内の孔密度の変動の結果である可能性がある。例えば、シリカ粒子の内部領域は、同じシリカ粒子の外表面領域よりも低い孔密度を有する可能性がある。
【０００７】
他の代表的な態様においては、本発明のシリカ粒子は、少なくとも約１００ＭＰａの塑性変形、及び約４ＧＰａ未満の弾性変形を有する多孔質シリカ粒子を含む。高い塑性変形及び低い弾性変形によって、かかるシリカ粒子は、クロマトグラフィー媒体として用いる場合に、粒子に損傷を与えることなくクロマトグラフィーカラム内に効率的に充填することができる。
【０００８】
本発明は、またシリカ粒子の製造方法にも関する。１つの代表的な方法においては、シリカ粒子の製造方法は、部分的に加水分解された材料を形成するように有機シリケートを部分的に加水分解し；部分的に加水分解された材料を蒸留して、エチルアルコールを除去し、蒸留された部分的に加水分解された材料を形成し；極性連続相中に部分的に加水分解されたシリケートの液滴を形成するように、蒸留された部分的に加水分解された材料を極性連続相中で乳化し；球状の多孔質粒子を形成するように、水酸化アンモニウムを用いる縮合反応によって液滴をゲル化し；球状の多孔質粒子を洗浄し；球状の多孔質粒子を水熱熟成し；そして、球状の多孔質粒子を乾燥して乾燥した多孔質粒子を形成する；ことを含む。
【０００９】
本発明は更に、シリカ粒子を使用する方法に関する。シリカ粒子を使用する１つの代表的な方法においては、該方法は、（ｉ）第１の弾性率を有する内部部分、及び（ｉｉ）第２の弾性率を有する粒子の外表面部分を含み、第１の弾性率が第２の弾性率よりも大きい少なくとも１つの多孔質シリカ粒子をクロマトグラフィーカラム中に導入することを含むクロマトグラフィーカラムの製造方法を含む。シリカ粒子を用いる更なる代表的な方法は、上記に記載のクロマトグラフィーカラムを用いて、１以上の材料をクロマトグラフィーカラムに通しながら互いに分離することを含むことができる。
【００１０】
本発明は更に、（ｉ）第１の弾性率を有する内部部分、及び（ｉｉ）第２の弾性率を有する粒子の外表面部分を含み、第１の弾性率が第２の弾性率よりも大きい少なくとも１つの多孔質シリカ粒子を含むクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィーカラムの製造方法、及びクロマトグラフィーカラムの使用方法に関する。
【００１１】
本発明のこれらの及び他の特徴並びに有利性は、開示された態様の以下の詳細な説明及び特許請求の範囲を検討した後には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の代表的なシリカ粒子の拡大図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、階段状の特性勾配を有する本発明の代表的なシリカ粒子の横断面図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実質的に連続的な特性勾配を有する本発明の代表的なシリカ粒子の横断面図を示す。
【図３】図３は、本発明の代表的なシリカ粒子をＨＰＬＣカラム内に充填する前及び後の粒径分析を示す。
【図４】図４は、ＨＰＬＣカラム内に充填した後の本発明の代表的なシリカ粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。
【図５】図５は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子のカラム充填効率を示す。
【図６】図６は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子のペプチド選択性を示すクロマトグラフを示す。
【図７】図７は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子の純合成ペプチド選択性を示すクロマトグラフを示す。
【図８】図８は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子の粗合成ペプチド選択性を示すクロマトグラフを示す。
【図９】図９は、本発明の代表的なシリカ粒子及び従来のシリカ粒子を用いた粗２０−ＡＡ合成ペプチドのクロマトグラフを示す。
【図１０】図１０は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子の血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）選択性を示すクロマトグラフを示す。
【図１１】図１１は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子のインシュリン充填容量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の原理の理解を促進するために、以下において本発明の特定の態様を説明し、特定の用語を用いて特定の態様を説明する。しかしながら、特定の用語を用いることによって本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されよう。議論される本発明の原理の変更、更なる修正、及び更なる適用は、本発明が属する技術の当業者が一般的に想到するものであると考えられる。
【００１４】
本発明は多孔質シリカ粒子に関する。本発明は更に、多孔質シリカ粒子の製造方法、並びに多孔質シリカ粒子の使用方法に関する。代表的な多孔質シリカ粒子、多孔質シリカ粒子の製造方法、及び多孔質シリカ粒子の使用方法の説明を以下に与える。
【００１５】
Ｉ．シリカ粒子：
本発明のシリカ粒子は、本シリカ粒子が公知のシリカ粒子と比較して１以上の有利性を与えることができる物理的構造及び特性を有する。
【００１６】
Ａ．シリカ粒子の物理的構造：
本発明のシリカ粒子は、平均最大粒子寸法（即ち最大直径寸法）を有する球状の粒子形状を有する。典型的には、本発明のシリカ粒子は、約７００μｍ未満、より典型的には約１００μｍ未満の平均最大粒子寸法を有する。本発明の１つの望ましい態様においては、シリカ粒子は約１．０〜約１００μｍ、より望ましくは約３．０〜約２０μｍの平均最大粒子寸法を有する。
【００１７】
本発明の多孔質シリカ粒子は、典型的には、例えば透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）法を用いて測定して約１．４未満のアスペクト比を有する。ここで用いる「アスペクト比」という用語は、（ｉ）シリカ粒子の平均最大粒子寸法と（ｉｉ）シリカ粒子の平均最大横断面粒子寸法（ここで、横断面粒子寸法は、シリカ粒子の最大粒子寸法に対して実質的に直交方向のものである）との間の比を表すように用いる。本発明の幾つかの態様においては、シリカ粒子は約１．３未満（又は約１．２未満、又は約１．１未満、又は約１．０５未満）のアスペクト比を有する。典型的には、シリカ粒子は約１．０〜約１．２のアスペクト比を有する。
【００１８】
本発明の多孔質シリカ粒子は、また、本シリカ粒子を望ましいクロマトグラフィー媒体にする孔容積を有する。典型的には、シリカ粒子は、窒素ポロシメトリーによって測定して少なくとも約０．４０ｃｃ／ｇの孔容積を有する。本発明の１つの代表的な態様においては、多孔質シリカ粒子は、窒素ポロシメトリーによって測定して約０．４０ｃｃ／ｇ〜約１．４ｃｃ／ｇの孔容積を有する。本発明の他の代表的な態様においては、多孔質シリカ粒子は、窒素ポロシメトリーによって測定して約０．７５ｃｃ／ｇ〜約１．１ｃｃ／ｇの孔容積を有する。
【００１９】
本発明の多孔質シリカ粒子は少なくとも約４０Åの平均孔直径を有する。本発明の１つの代表的な態様においては、シリカ粒子は約４０Å〜約７００Åの平均孔直径を有する。本発明の更なる代表的な態様においては、シリカ粒子は約９０Å〜約１５０Åの平均孔直径を有する。
【００２０】
本発明の多孔質シリカ粒子は、また、ＢＥＴ窒素吸着法（即ち、Brunauer Emmet Teller法）によって測定して少なくとも約１５０ｍ２／ｇの表面積を有する。本発明の１つの代表的な態様においては、シリカ粒子は約２００ｍ２／ｇ〜約４５０ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する。本発明の更なる代表的な態様においては、シリカ粒子は約２６０ｍ２／ｇ〜約３７０ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する。
【００２１】
１，０００倍の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）によって与えられる、本発明の代表的なシリカ粒子の拡大図を図１に示す。図１において示されているように、代表的なシリカ粒子１０は、球状の形状、及び比較的狭い粒径分布を有する。更に、図２Ａ及び２Ｂにおいて示されているように、代表的なシリカ粒子１０は、粒子の横断面に沿った粒子特性勾配を有すると考えられる。
【００２２】
図２Ａにおいて示されているように、本発明の１態様においては、代表的なシリカ粒子１０は、代表的なシリカ粒子１０の内部１２と外表面１１との間に階段状の特性勾配を有すると考えられる。例えば、代表的なシリカ粒子１０は、内部領域１３内においてより高いヤング率、及び表面領域１４内においてより低いヤング率を有することができる。例えば、代表的なシリカ粒子１０は、内部領域１３内においてより高いヤング率（又はより低い孔密度）、及び表面領域１４内においてより低いヤング率（又はより高い孔密度）を有することができる。この態様においては、代表的なシリカ粒子１０の内部１２と外表面１１との間に異なる粒子特性を有する２つより多い領域が存在していてもよいことを留意すべきである。
【００２３】
図２Ｂにおいて示されているように、本発明の他の態様においては、代表的なシリカ粒子１０は、内部１２における内部値から外表面１１に沿った表面値へと変化する実質的に連続の特性勾配を有すると考えられる。例えば、代表的なシリカ粒子１０は、内部１２において最大のヤング率（又は最小の孔密度Ｐｍｉｎ）、及び外表面１１に沿って最小のヤング率（又は最大の孔密度Ｐｍａｘ）を有していてよい。この態様においては、最大又は最小の特性値（例えば、最小孔密度Ｐｍｉｎ）は、図２Ｂにおいて示されるような内部１２ではなく、代表的なシリカ粒子１０の内部１２と外表面１１との間の幾つかの点において存在していてもよいことを留意すべきである。
【００２４】
Ｂ．シリカ粒子の特性：
本発明のシリカ粒子の上記に記載の物理特性の結果として、本シリカ粒子はＨＰＬＣ用途においてクロマトグラフィー媒体として用いるのに良く適している。実質的に球状の形状により、均一な充填及びしたがってＨＰＬＣカラムを通る液体のより均一な流れが可能であり、これによってより良好なカラム効率が得られる。更に、シリカ粒子の塑性変形特性により、本発明のシリカ粒子は充填圧力に曝露した際に破壊抵抗性を示し、これにより流体の流れに対する過剰の抵抗が防止され、ＨＰＬＣカラムを通る均一な流体の流れが保持される。
【００２５】
上記で議論したように、本発明のシリカ粒子は、カラム充填中に粒子が控えめに弾性降伏するのを可能にするが、粒子の破壊を引き起こすのには十分ではない最適のヤング率を有するように思われる。本発明のシリカ粒子は、ＨＰＬＣカラム内で用いた場合に、動的軸圧縮によって達成されるものと同じ様にカラムを安定化する「内部バネ効果」を与える。
【００２６】
更に、上記で議論したように、本発明のシリカ粒子は弾性率の放射状に広がる特性勾配を有すると考えられる。より具体的には、本発明のシリカ粒子は、シリカ粒子の内部領域よりも好適に低い弾性率を有する表面領域を有する。かかる粒子の構成により、本発明のシリカ粒子が何故にかかる安定化充填カラム（即ち、低い粒子移動及びカラム内の空隙形成）を形成するかが説明される。本発明のシリカ粒子は、粒子の表面においてはより大きな弾性変形を有するが、粒子の内部に向かって弾性率がより高くなっていて、内部の弾性率により粒子が全粒子（即ち塑性）変形を起こして粒子の破壊及び流体の流れに対する高い抵抗を引き起こすことが防止される。
【００２７】
更に、本発明のシリカ粒子の考えられている多孔性勾配により、本シリカ粒子は充填カラムにおいて用いた場合に良好な物質移動特性を与える。クロマトグラフィー分離においては、分子の殆どは粒子の最中心部には拡散しないので、上記に記載の放射状に広がる多孔性勾配によって粒子内部への及び粒子の外への物質移動を増加させて改良されたカラム効率を得ることができる。
【００２８】
１態様においては、本発明の粒子は、原子間力顕微鏡測定（ＡＦＭ）によって測定して少なくとも約１００ＭＰａ、典型的には少なくとも約２００ＭＰａ、より典型的には少なくとも約３００ＭＰａ、更により典型的には少なくとも約４００ＭＰａの硬度又は塑性変形を有する。ＡＦＭは、Veeco Instrumentsから入手できるNanoman II SPMシステムを用い、ダイアモンドチッププローブによって３０μＮの力で行う。硬度は、式：硬度＝力／面積（ここで、面積はプローブによって形成される凹みの寸法である）によって求められる。ＡＦＭは、「原子間力顕微鏡を用いるナノスケールでの弾性率測定の理論モデル及び実施」, Journal of Physic: Conference Series 61, pp 1303-07, 2007に記載されているようにして行う。
【００２９】
他の態様においては、本発明の粒子は、ＡＦＭによって測定して約４ＧＰａ未満、典型的には約３ＧＰａ未満、より典型的には約２ＧＰａ未満、更により典型的には約１ＧＰａ未満のヤング率又は弾性変形を有する。ＡＦＭは、Veeco Instrumentsから入手できるNanoman II SPMシステムを用い、ダイアモンドチッププローブによって３．２９７μＮの力で行う。ヤング率は、「負荷及び置換感受性圧入実験を用いる硬度及び弾性率の測定のための改良された方法」, J. Mater. Res. vol.7, pp 1564-83, 1992に記載されているようにしてOliver-Pharr分析によって測定する。
【００３０】
他の代表的な態様においては、本発明のシリカ粒子は、少なくとも約１００ＭＰａの塑性変形及び約４ＧＰａ未満の弾性変形、好ましくは少なくとも約１００ＭＰａの塑性変形及び約３ＧＰａ未満の弾性変形、更により好ましくは少なくとも約１００ＭＰａの塑性変形及び約２ＧＰａ未満の弾性変形を有する多孔質シリカ粒子を含む。更に、本発明のシリカ粒子は、例えば少なくとも約１００ＭＰａ（又は２００ＭＰａ、３００ＭＰａ、或いは４００ＭＰａ等）の塑性変形及び約４ＧＰａ（又は３ＧＰａ、又は２ＧＰａ、又は１ＧＰａ等）未満の弾性変形のような、ここで示す塑性変形と弾性変形の特性の任意の組み合わせを有することができる。高い塑性変形及び低い弾性変形によって、かかるシリカ粒子をクロマトグラフィー媒体として用いる場合に、粒子に対して損傷を与えることなくクロマトグラフィーカラム内に効率的に充填することができる。
【００３１】
開示したシリカ粒子の上記で言及した特性を、図３〜５を参照して更に詳細に説明する。図３は、本発明の代表的なシリカ粒子をＨＰＬＣカラム内に充填する前及び後の粒径分析を示す。図３において示されているように、本発明のシリカ粒子は、（１）商業的に入手できるシリカ粒子であるEka Nobel ABから入手できるKromasil（登録商標） 10ミクロンC18に関する「前」及び「後」の数（％）ラインと比較した、本発明のシリカ粒子に関する「前」及び「後」の数（％）ラインの近似性；及び（２）商業的に入手できるシリカ粒子に関する増加した微粉の数と比較した、本発明のシリカ粒子に関して生成した最小の微粉量；によって示される動的軸圧縮充填中のより少ない粒子破壊を示す。本発明の粒子をカラム内に充填した後においては粒径分布は実質的には変化しないが、これに対して商業的に入手できる媒体の粒径分布は大きく異なる。例えば、本発明の粒子によれば最小の微粉（例えば全数を基準として約５０％未満の数の＜５μｍの微粉）が生成し、これに対して商業的に入手できる粒子によれば遙かに多くの微粉（例えば全数を基準として５０％より多い数の＜５μｍの微粉）が生成する。好ましくは、本発明の粒子の充填中に、約４０％未満、より好ましくは約３０％未満、更により好ましくは約２０％未満（即ち、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％等）の数の微粉が生成する。
【００３２】
図４は、ＨＰＬＣカラム内に動的軸圧縮充填した後の本発明の代表的なシリカ粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（倍率＝５００）（右側の画像）と、ＨＰＬＣカラム内に動的軸圧縮充填した後の上記で言及した商業的に入手できるシリカ粒子のＳＥＭ画像（左側の画像）とを示す。左側の画像は上記で言及した商業的に入手できるシリカ粒子の動的軸圧縮充填中に生成した微粉を示し、一方、右側の画像は本発明のシリカ粒子の動的軸圧縮充填中に生成する微粉を本質的に含まない。
【００３３】
図５は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子のカラム充填効率を示す。図５において示されているように、本発明のシリカ粒子は、商業的に入手できるシリカ粒子である、Eka Nobel ABから入手できるKromasil 10ミクロンC18、及びDaiso Co., Ltd.から入手できるDaiso 10ミクロンC18と比較して最も高いプレート／メートルの値を示した。
【００３４】
ＩＩ．シリカ粒子の製造方法：
本発明はまた、シリカ粒子の製造方法にも関する。本発明のシリカ粒子を形成するために用いる原材料、及び本発明のシリカ粒子を形成するための方法工程を以下に議論する。
【００３５】
Ａ．原材料：
本発明のシリカ粒子の製造方法は、多数のケイ素含有原材料から形成することができる。好適なケイ素含有原材料としては、Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO)などの数多くの供給源から商業的に入手できるテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）；Silbond Corporation (Weston, MI)から商業的に入手できるSILBONDTM40又はSILBONDTM 50のような部分的にオリゴマー化されたシリケート；Dynasil Corporation (West Berlin, NJ)から商業的に入手できるDYNASILTM 40のような部分的にオリゴマー化されたシリケート；及びWacker Chemie AG(Munich, Germany)から商業的に入手できるTES 40 WNのような部分的にオリゴマー化されたシリケート；が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
１つの望ましい態様においては、SILBONDTM40を用いて「小分子」生成物を形成する。ここで用いる「小分子」生成物という用語は、小分子クロマトグラフィー用途において特に有用な本発明のシリカ粒子を示すように用いる。本発明の「小分子」シリカ粒子は、典型的には、約０．７５〜約１．１ｃｃ／ｇの範囲のＮ２孔容積；約２６０〜約３７０ｍ２／ｇの範囲のＮ２表面積；及び約９０〜約１５０Åの範囲の平均孔直径；を有する。
【００３７】
Ｂ．プロセス工程：
本発明のシリカ粒子は、典型的には、上記に記載のもののような有機シリケートを部分的に加水分解し、蒸留し、次により極性の連続相中に分散させて、部分的に加水分解したシリケートの極性連続相中での非混和性によって小滴を形成する多工程プロセスを用いて製造する。これらの液滴は、次に、水酸化アンモニウムによって触媒する縮合反応の結果としてゲル化する。得られる球状の多孔質粒子を次に洗浄し、水熱熟成し、乾燥する。水熱熟成及び乾燥工程中のプロセス条件が、得られる粒子の孔構造を制御するのに特に重要であることが見出された。得られる多孔質シリカ粒子は、次に、従来の手段（例えば水簸又は空気分級）によって適当に狭い粒径分布に分級することができる。種々のプロセス工程の更なる説明を以下に与える。
【００３８】
１．部分的加水分解工程：
加水分解の程度は、望ましい物理特性（例えば最適のヤング率、粒径等）を有するシリカ粒子を得るために重要なプロセスパラメーターである。例えば、過度の加水分解は粒子形成工程の連続相中に完全に混和性の溶液を与える可能性があり、一方、加水分解が不足するとその後の縮合（即ちゲル化）工程中に反応性が低すぎる物質を与える可能性がある。
【００３９】
部分的加水分解は、典型的には０．１ＭのＨＣｌ（水溶液）を用いて行うが、他の酸を同様に用いることができる。この混合物に（撹拌しながら）エチルアルコール（ＥｔＯＨ）を加えて、有機シリケートと水相との間の非混和性を克服する。反応は雰囲気温度において自発的に進行する。１つの代表的な反応物質の組み合わせは、１００．０ｇのSILBONDTM 40、２１．５ｇのＥｔＯＨ、及び４．６ｇの０．１Ｍ−ＨＣｌ（水溶液）を含む。
【００４０】
２．蒸留工程：
部分的に加水分解した材料（ＰＨＳ）の蒸留を行ってＥｔＯＨ（即ち、加えたものと加水分解工程中に副生成物として形成されたものの両方）を除去することができる。蒸留工程により、マクロ孔を含まない粒子の形成が最小になるか及び／又は排除される。ここで用いる「マクロ孔を含まない粒子」という用語は、実質的に連続なミクロ細孔粒子構造を有するシリカ粒子を指す。蒸留は、典型的には、真空下（即ち１００Ｔｏｒｒ未満）、約９０℃において、ＥｔＯＨを除去するのに必要な時間（典型的には約１時間未満）行う。
【００４１】
３．粒子形成（乳化）工程：
粒子の形成は、ＰＨＳをアンモニア処理した水相中に乳化させることによって行う。得られる小滴は、ＰＨＳが関与するアンモニア接触縮合反応によって速やかにゲル化（即ち固化）する。
【００４２】
１〜１００μｍの粒径範囲のシリカ粒子を製造するために２種類の方法が用いられている。第１の方法は、Cowlesミキサーを用いる２工程のバッチ法である。第１工程、即ち液滴形成工程においては、蒸留したＰＨＳをイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／水溶液（例えば３０重量％のＩＰＡ水溶液）中で乳化させる。次に、第２工程において連続的に混合しながらＮＨ４ＯＨを加えて縮合反応を進行させて、多孔質の球状粒子の固化を行う。ブレードチップ速度（例えば、速度がより速いとより小さな粒子が製造される）及び連続相の組成（例えば、アルコールがより多いとより小さな粒子が製造される）を組み合わせることによって平均粒径を制御する。
【００４３】
シリカ粒子を製造するための第２の方法は、インラインスタティックミキサーを用いてＰＨＳを３０重量％−ＩＰＡ／１重量％−ＮＨ４ＯＨ水溶液中に乳化することを用いる。この場合においては、インラインミキサーを通る速度がより速いとより小さな粒径が得られる。
【００４４】
４．濾過／デカンテーション工程：
粒子形成工程に続いて、典型的には濾過及びデカンテーションを用いて、過剰のアルコール及びアンモニアをシリカ生成物から除去する。典型的な濾過／デカンテーション工程においては、上記に記載の粒子形成工程から得られるフィルターケーキを脱イオンＨ２Ｏ（例えば１２Ｌの脱イオンＨ２Ｏ）中に再懸濁し、次に一晩（例えば１２時間）沈降させる。沈降時間の後に、粒子を含む溶液をデカンテーションして液体の大部分を除去する。
【００４５】
５．水熱熟成工程：
水熱熟成工程を用いて多孔質シリカ粒子の内表面積を減少させることができる。シリカゲルの製造と同様にして、より厳しい熟成（即ち、より長く、より熱く、及び／又はよりアルカリ性）によって、より多い表面積の減少、及びより大きい乾燥中の粒子多孔度（孔容積）の保持が得られる。熟成工程の終了時においては、十分な脱イオン水を加えて冷却し、これにより熟成プロセスをクエンチする。
【００４６】
１つの代表的な態様においては、水熱熟成工程は、上記に記載のデカンテーション／濾過工程において形成される沈降シリカケーキを、十分量の脱イオン水中に再懸濁して撹拌しうるスラリー（例えば、約１Ｌの添加水中に乾燥基準で約１ｋｇのシリカケーキ）を形成することを含む。次に、撹拌されたスラリーを約７５℃に約９０分間加熱する。雰囲気温度の約１２Ｌの脱イオン水（１Ｌの加熱水あたり）を加えることにより熟成を停止する。次に、懸濁液を濾過するか、又は沈降及びデカンテーションする。
【００４７】
６．乾燥工程：
乾燥速度も最終シリカ生成物の表面積及び孔容積に影響を与える。１つの代表的な態様においては、乾燥工程は、約１．２５ｃｍのシリカケーキの厚さを形成するように、デカンテーションした体積のシリカ生成物又はシリカ生成物のフィルターケーキをトレー中に拡げ；シリカケーキを含むトレーを重力対流オーブン内に約１４０℃のオーブン温度で約２０時間配置し；トレー及びシリカをオーブンから取り出し；シリカを回収する；ことを含む。乾燥したシリカ材料は、次に、引き続く場合によって用いるサイジング及び結合工程のために備えられる。
【００４８】
ＩＩＩ．シリカ粒子の使用方法：
本発明は更に、シリカ粒子を使用する方法に関する。上記で議論したように、本シリカ粒子はクロマトグラフィー媒体として用いることができる。シリカ粒子をクロマトグラフィー媒体として用いる種々の方法を図６〜１１に示す。
【００４９】
図６は、従来のシリカ粒子であるPhenomenex Inc.から入手できるLuna 5ミクロンC18と比較した本発明の代表的なシリカ粒子のペプチド選択性を示すクロマトグラフを示す。
図７は、従来のシリカ粒子であるAkzo Nobel ABから入手できるKromasil 5ミクロンC18と比較した本発明の代表的なシリカ粒子の純合成ペプチド選択性を示すクロマトグラフを示す。
【００５０】
図８は、従来のシリカ粒子であるAkzo Nobel ABから入手できるKromasil 5ミクロンC18と比較した本発明の代表的なシリカ粒子の粗合成ペプチド選択性を示すクロマトグラフを示す。
【００５１】
図９は、本発明の代表的なシリカ粒子、及び従来のシリカ粒子であるPhenomenex Inc.から入手できるJupiter Proteo 5ミクロンC18を用いた粗20-AA合成ペプチドのクロマトグラフを示す。
【００５２】
図１０は、従来のシリカ粒子と比較した本発明の代表的なシリカ粒子の血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）選択性を示すクロマトグラフを示す。
図１１は、従来のシリカ粒子であるAkzo Nobel ABから入手できるKromasil 5ミクロンC8、及びYMC Co., Ltd.から入手できるHydrosphere 5ミクロンC8と比較した本発明の代表的なシリカ粒子のインシュリン充填容量を示す。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例によって本発明を更に示すが、これらはいかなるようにも発明の範囲に対して限定を加えるものとは解釈されない。それどころか、本解決手段は種々の他の態様、変更、及びその均等物を有することができ、これらは本明細書中の記載を読んだ後は、本発明の精神及び／又は特許請求の範囲から逸脱することなくそれ自体当業者に示唆されることを明確に理解すべきである。
【００５４】
実施例１：
部分的に加水分解された材料（ＰＨＳ）の製造：
２３０ｇの０．１Ｍ−ＨＣｌ溶液（水溶液）を撹拌しながら５，０００ｇのSILBONDTM 40に加えた。次に、SILBONDTM40と水相との間の非混和性を克服するために、１０７５ｇのＥｔＯＨを撹拌しながらこの混合物に加えた。反応は雰囲気温度において自発的に進行した。
【００５５】
得られた部分的に加水分解された材料（ＰＨＳ）を蒸留して、混合物に加えたＥｔＯＨ及び加水分解工程中に副生成物として形成されたＥｔＯＨを除去した。蒸留は真空下（＜１００Ｔｏｒｒ）、９０℃において行った。
【００５６】
実施例２：
バッチ混合を用いる「小分子」シリカ粒子の製造：
実施例１において形成された３，８００ｇの蒸留ＰＨＳを、１４，９００ｇの３０重量％ＩＰＡ／水（予め調製して少なくとも１６時間放置して脱気させた）中に注ぎ入れた。Cowlesミキサーを始動し、１１６０ｒｐｍに５分間設定して乳化を完了させた。次に、混合を継続しながら３７８ｇの３０重量％ＮＨ４ＯＨを加えた（全量を一回で）。溶液を１１６０ｒｐｍにおいて更に２０分間混合し、この間に粒子のゲル化が完了した。シリカ懸濁液を一晩沈降させた。
【００５７】
翌日、シリカ懸濁液を濾過し、得られたシリカケーキを１２Ｌの脱イオンＨ２Ｏで再懸濁して過剰のアルコール及び／又はアンモニアを除去した。シリカ溶液を一晩沈降させ、翌日にデカンテーションした。この手順をもう１回繰り返した。
【００５８】
デカンテーションした溶液からのシリカケーキを約１Ｌの脱イオン水中に再懸濁して撹拌しうるスラリーを形成した。次に、撹拌したスラリーを７５℃に９０分間加熱した。雰囲気温度の約１２Ｌの脱イオン水を加えることによって熟成を停止した。次に、懸濁液を濾過して過剰の流体を除去した。
【００５９】
シリカケーキ生成物をトレー中に拡げ、約１．２５ｃｍの厚さにならした。シリカケーキを含むトレーを１４０℃の重力対流オーブン内に２０時間配置した。次に、トレー及びシリカをオーブンから取り出し、シリカを容器に詰めた。
【００６０】
実施例３：
インラインスタティックミキサーを用いる「小分子」シリカ粒子の製造：
実施例１において形成された蒸留ＰＨＳ（９５０ｍＬ／分）及び３０％ＩＰＡ／１％ＮＨ４ＯＨ水溶液（４，０９０ｍＬ／分）を、直径１５．２ｃｍ（６インチ）のスタティックミキサーによって混合した。得られたシリカ粒子のスラリーを、次に、撹拌した容器中に流し入れた。シリカ懸濁液を一晩沈降させた。
【００６１】
翌日、シリカ懸濁液を濾過し、得られたシリカケーキを１２Ｌの脱イオンＨ２Ｏで再懸濁して過剰のアルコール及び／又はアンモニアを除去した。シリカ溶液を一晩沈降させ、翌日にデカンテーションした。この手順をもう１回繰り返した。
【００６２】
デカンテーションした溶液からのシリカケーキを約１Ｌの脱イオン水中に再懸濁して撹拌しうるスラリーを形成した。次に、撹拌したスラリーを７５℃に９０分間加熱した。雰囲気温度の約１２Ｌの脱イオン水を加えることによって熟成を停止した。次に、懸濁液を濾過して過剰の流体を除去した。
【００６３】
シリカケーキ生成物をトレー中に拡げ、約１．２５ｃｍの厚さにならした。シリカケーキを含むトレーを１４０℃の重力対流オーブン内に２０時間配置した。次に、トレー及びシリカをオーブンから取り出し、シリカを容器に詰めた。
【００６４】
実施例４：
ＡＦＭによるシリカ粒子の試験：
本実施例においては、１０μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をＡＦＭによって試験して弾性変形及び塑性変形の特性を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。弾性変形及び塑性変形の特性を、商業的に入手できるシリカ粒子である、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する１０μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するDaiso Co., Ltd.から商業的に入手できるDaiso SP-120-ODSと比較した。それぞれのシリカ粒子の弾性変形及び塑性変形の特性は、「原子間力顕微鏡を用いるナノスケールでの弾性率測定の理論モデル及び実施」, Journal of Physic: Conference Series 61, pp 1303-07, 2007に記載されているようにして測定した。塑性変形に関しては、Veeco Instrumentsから入手できるNanoman II SPMシステムを用い、ダイアモンドチッププローブによって３０μＮの力でＡＦＭを行った。硬度は式：硬度＝力／面積（ここで、面積はプローブによって形成される凹みの寸法である）によって求めた。弾性変形に関しては、Veeco Instrumentsから入手できるNanoman II SPMシステムを用い、ダイアモンドチッププローブによって３．２９７μＮの力でＡＦＭを行った。ヤング率は、「負荷及び置換感受性圧入実験を用いる硬度及び弾性率の測定のための改良された方法」, J. Mater. Res. vol.7, pp 1564-83, 1992に記載されているようにしてOliver-Pharr分析によって求めた。表１においてみられるように、本発明のシリカ粒子の塑性変形は従来のシリカ又は商業的に入手できるシリカのものよりも遙かに大きく、本発明のシリカ粒子の弾性変形は従来のシリカのものよりも遙かに小さい。
【００６５】
【表１】
【００６６】
実施例５：
クロマトグラフィーカラム中へのシリカ粒子の充填：
本実施例においては、１０μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して媒体充填効率を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のペプチド分離能を、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する１０μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するAkzo Nobel ABから商業的に入手できるKromasil（登録商標）、及びシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する１０μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するDaiso Co., Ltd.から商業的に入手できるDaiso SP-120-ODSなどの他の媒体のものと比較した。媒体を、Alltech Associates, Inc.から入手できる２５ｍｍ×４００ｍｍのSpringTMカラム中に充填した。媒体は、媒体６０ｇあたり１５０ｍＬのイソプロパノールを用いて１５００ｐｓｉでカラム中に充填した。最終カラム床長さは２５０ｍｍであった。図３において示されているように、充填後に生成する小粒子又は微粉の数は、従来のシリカのものよりも遙かに少なかった。例えば、本発明は、充填後にKromasilの半分未満の量の微粉（粒径５μｍ未満）を有していた。
【００６７】
それぞれのカラムの効率を評価するための分離方法として逆相クロマトグラフィーを用いた。ベンゼン、ナフタレン、及びビフェニルの混合物を、７０体積％のアセトニトリル及び３０体積％の水を含む移動相を用いてアイソクラチック条件下でそれぞれのカラム中に注入した。流速は１０ｍＬ／分であった。カラムを２５℃の室温で運転した。Super Prepフローセル及びRainin検出器（Varian, Inc.から入手できる）を用いて２５４ｎｍにおいて検出を行った。また、この分析において、Varian SD-1分取用ポンプ（Varian, Inc.から入手できる）、Valco prep手動注入器（Valco Instruments Company Inc.から入手できる）、及びEZ ChromTM（Scientific Software, Inc.から入手できる）も用いた。
【００６８】
結果を図５に示す。これは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体を凌ぐ向上したカラム効率を示す。
実施例６：
クロマトグラフィー媒体としてのシリカ粒子の使用：
本実施例においては、５μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して、ペプチドのような種々の生物学的物質を分離する能力を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のペプチド分離能を、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するPhenomex, Inc.から商業的に入手できるLuna（登録商標）の商品名の他の媒体のものと比較した。
【００６９】
それぞれのカラムに関する分離方法として逆相クロマトグラフィーを用いた。表１に列記するペプチドの混合物（GY (238 Da)、VYV (379 Da)、Met Enkephalin (YGGFM, 573 Da)、Anglotensin II (DRVYIHPF, 1045 Da)、及びLeu Enkephalin (YGGFL, 555 Da)）を、以下の条件下でそれぞれのカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）中に注入した。移動相は水中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ａ；及びアセトニトリル中の０．０８５％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ｂ；を含んでいた。カラムを１０％の溶媒Ｂ及び９０％の溶媒Ａで３０分間平衡化し；次に溶媒Ｂを１０％から４０％に増加させ（６０％の溶媒Ａ）；４０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持し；次に溶媒Ｂを４０％から９０％に増加させ（１０％の溶媒Ａ）；９０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持する；勾配プロセスを用いた。流速は１．０ｍＬ／分であった。カラムを２５℃の室温で運転した。UVD 170S検出器（Dionex Corp., Sunnyvale, CAから入手できる）を用いて２２５ｎｍにおいて検出を行った。この分析においては、Dionex HPLCシステム（Dionex Corp.から入手できるP580 HPG高圧勾配バイナリーポンプ）、Rheodyne手動注入器（IDEX Corp.から入手できる）、及びCHROMELEON（登録商標）データシステム（Dionex Corp.から入手できる）も用いた。結果を図６及び表２に示す。これらは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体を凌ぐそれぞれのペプチドピークの向上した分離能を示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
実施例７：
クロマトグラフィー媒体としてのシリカ粒子の使用：
本実施例においては、５μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して、ペプチドのような種々の生物学的物質を分離する能力を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のペプチド分離能を、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するAkzo Nobel ABから商業的に入手できるKromasil（登録商標）の商品名の他の媒体のものと比較した。
【００７２】
それぞれのカラムに関する分離方法として逆相クロマトグラフィーを用いた。ペプチドの混合物（Ac-RGGGGLGLGK-アミド (911 Da)、RGAGGLGLGK-アミド (883 Da)、Ac-RGAGGLGLGK-アミド (926 Da)、Ac-RGVGGLGLGK-アミド (954 Da)、及びAc-RGVVGLGLGK-アミド (996 Da)）を、以下の条件下でそれぞれのカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）中に注入した。移動相は水中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ａ；及びアセトニトリル中の０．０８５％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ｂ；を含んでいた。カラムを１０％の溶媒Ｂ及び９０％の溶媒Ａで３０分間平衡化し；次に溶媒Ｂを１０％から４０％に増加させ（６０％の溶媒Ａ）；４０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持し；次に溶媒Ｂを４０％から９０％に増加させ（１０％の溶媒Ａ）；９０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持する；勾配プロセスを用いた。流速は１．０ｍＬ／分であった。カラムを２５℃の室温で運転した。UVD 170S検出器（Dionex Corp., Sunnyvale, CAから入手できる）を用いて２２５ｎｍにおいて検出を行った。この分析においては、Dionex HPLCシステム（Dionex Corp.から入手できるP580 HPG高圧勾配バイナリーポンプ）、Rheodyne手動注入器（IDEX Corp.から入手できる）、及びCHROMELEON（登録商標）データシステム（Dionex Corp.から入手できる）も用いた。結果を図７に示す。これは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体を凌ぐそれぞれのペプチドピークの向上した分離能を示す。
【００７３】
実施例８：
クロマトグラフィー媒体としてのシリカ粒子の使用：
本実施例においては、５μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して、ペプチドのような目標の生物学的物質を不純物から分離する能力を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のペプチド分離能を、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するAkzo Nobel ABから商業的に入手できるKromasil（登録商標）の商品名の他の媒体のものと比較した。
【００７４】
それぞれのカラムに関する分離方法として逆相クロマトグラフィーを用いた。Bachem, Inc.から入手できる粗合成ペプチド、及び２種類の不純物の混合物を、以下の条件下でそれぞれのカラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）中に注入した。移動相は水中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ａ；及びアセトニトリル中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ｂ；を含んでいた。カラムを１５％の溶媒Ｂ及び８５％の溶媒Ａで３０分間平衡化し；次に溶媒Ｂを１５％から５０％に増加させ（５０％の溶媒Ａ）；５０％での溶媒Ｂの流れを１分間保持し；次に溶媒Ｂを５０％から８０％に増加させ（２０％の溶媒Ａ）；８０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持する；勾配プロセスを用いた。流速は０．８ｍＬ／分であった。カラムを２２℃の室温で運転した。UVD 170S検出器（Dionex Corp., Sunnyvale, CAから入手できる）を用いて２２０ｎｍにおいて検出を行った。この分析においては、Dionex HPLCシステム（Dionex Corp.から入手できるP580 HPG高圧勾配バイナリーポンプ）、Rheodyne手動注入器（IDEX Corp.から入手できる）、及びCHROMELEON（登録商標）データシステム（Dionex Corp.から入手できる）も用いた。結果を図８及び表３に示す。これらは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体を凌ぐ近接して溶出された不純物からのペプチドピークの向上した分離能を示す。
【００７５】
【表３】
【００７６】
実施例９：
クロマトグラフィー媒体としてのシリカ粒子の使用：
本実施例においては、５μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して、ペプチドのような目標の生物学的物質を不純物から分離する能力を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のペプチド分離能を、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する４μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するPhenomenex, Inc.から商業的に入手できるJupiter（登録商標）の商品名の他の媒体のものと比較した。
【００７７】
それぞれのカラムに関する分離方法として逆相クロマトグラフィーを用いた。Biopeptide Co., Inc.から入手できる粗合成ペプチドの混合物を、以下の条件下でそれぞれのカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）中に注入した。移動相は水中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ａ；及びアセトニトリル中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ｂ；を含んでいた。カラムを２０％の溶媒Ｂ及び８０％の溶媒Ａで２０分間平衡化し；次に溶媒Ｂを２０％から４０％に増加させる（６０％の溶媒Ａ）；勾配プロセスを用いた。流速は１．０ｍＬ／分であった。カラムを２５℃の室温で運転した。UVD 170S検出器（Dionex Corp., Sunnyvale, CAから入手できる）を用いて２２０ｎｍにおいて検出を行った。この分析においては、Dionex HPLCシステム（Dionex Corp.から入手できるP580 HPG高圧勾配バイナリーポンプ）、Rheodyne手動注入器（IDEX Corp.から入手できる）、及びCHROMELEON（登録商標）データシステム（Dionex Corp.から入手できる）も用いた。結果を図９に示す。これは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体を凌ぐ近接して溶出された不純物からのペプチドピークの向上した分離能を示す。
【００７８】
実施例１０：
クロマトグラフィー媒体としてのシリカ粒子の使用：
本実施例においては、５μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して、ペプチドのような目標の生物学的物質を不純物から分離する能力を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のペプチド分離能を、シリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するAkzo Nobel ABから商業的に入手できるKromasil（登録商標）、及びシリカ表面に共有結合しているＣ１８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するPhenomenex, Inc.から商業的に入手できるLuna（登録商標）などの他の媒体のものと比較した。
【００７９】
それぞれのカラムに関する分離方法として逆相クロマトグラフィーを用いた。Karolinska Institutet, Stockholm, Swedenから入手できる血管作用性腸管ペプチド（２８−アミノ酸ペプチド、HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-アミド、分子量３３２５．８）、及び２種類の不純物の混合物を、以下の条件下でそれぞれのカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）中に注入した。移動相は水中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ａ；及びアセトニトリル中の０．０８５％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ｂ；を含んでいた。カラムを２０％の溶媒Ｂ及び８０％の溶媒Ａで３０分間平衡化し；次に溶媒Ｂを２０％から４０％に増加させ（６０％の溶媒Ａ）；４０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持し；次に溶媒Ｂを４０％から９０％に増加させ（１０％の溶媒Ａ）；９０％での溶媒Ｂの流れを５分間保持する；勾配プロセスを用いた。流速は１．０ｍＬ／分であった。カラムを２５℃の室温で運転した。UVD 170S検出器（Dionex Corp., Sunnyvale, CAから入手できる）を用いて２２５ｎｍにおいて検出を行った。この分析においては、Dionex HPLCシステム（Dionex Corp.から入手できるP580 HPG高圧勾配バイナリーポンプ）、Rheodyne手動注入器（IDEX Corp.から入手できる）、及びCHROMELEON（登録商標）データシステム（Dionex Corp.から入手できる）も用いた。結果を図１０及び表４に示す。これらは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体を凌ぐ近接して溶出された不純物からのペプチドピークの向上した分離能を示す。
【００８０】
【表４】
【００８１】
実施例１１：
クロマトグラフィー媒体としてのシリカ粒子の使用：
本実施例においては、５μｍの球状の多孔質粒子を含む本発明のシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム内で試験して、カラムのインシュリン正面充填容量を求めた。シリカは、表面処理を行ってシリカ表面に共有結合しているＣ８シランの層を与えており、これにより粒子が疎水性になっていた。この媒体のインシュリン充填容量を、シリカ表面に共有結合しているＣ８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するAkzo Nobel ABから商業的に入手できるKromasil（登録商標）、及びシリカ表面に共有結合しているＣ８シランの層を有する５μｍの球状の多孔質シリカ粒子を有するYMC Co., Ltdから商業的に入手できるHydrosphereなどの他の媒体のものと比較した。
【００８２】
以下の条件下でそれぞれのカラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を用いて分離法として逆相クロマトグラフィーを用いた。移動相は水中の０．１％ｖ／ｖ−ＴＦＡを含む溶媒Ａ；及び５ｍＬのアセトニトリル、２ｍＬの５０％氷酢酸、及び４３ｍＬのＤＩ水中に２５０ｍｇのインシュリンを含む溶媒Ｂ；を含んでいた。これをＤＩ水中の０．１％−ＴＦＡで１：５に希釈して１ｍｇ／ｍＬのインシュリン溶液を形成した。カラムを１００％の溶媒Ａで平衡化し；次に１分間で溶媒Ｂを０％から１００％に増加させ；１００％での溶媒Ｂの流れを２００分間保持し；次に１分間で溶媒Ａを０％から１００％に増加させる（０％の溶媒Ｂ）；勾配プロセスを用いた。流速は０．２ｍＬ／分であった。カラムを２５℃の室温で運転した。UVD 170S検出器（Dionex Corp., Sunnyvale, CAから入手できる）を用いて２７６ｎｍにおいて検出を行った。この分析においては、Dionex HPLCシステム（Dionex Corp.から入手できるP580 HPG高圧勾配バイナリーポンプ）、Rheodyne手動注入器（IDEX Corp.から入手できる）、及びCHROMELEON（登録商標）データシステム（Dionex Corp.から入手できる）も用いた。下記の等式からそれぞれの材料の容量を算出した。
【００８３】
【化１】
【００８４】
結果を図１１に示す。これは、本発明のシリカ粒子を用いた場合の従来の媒体のものを凌ぐ向上したインシュリン充填容量を示す。例えば、本発明のシリカを用いるカラムのインシュリン充填容量は１５４ｍｇ／ｍＬであり、一方、Hydrosphere及びKromasil媒体は、それぞれ１３３ｍｇ／ｍＬ及び１４ｍｇ／ｍＬのインシュリン充填容量を与え、これは約１０〜約１０００％高い回収率に相当する。
【００８５】
本発明を限られた数の態様によって説明したが、これらの特定の態様は本明細書において記載され特許請求されている発明の範囲を限定することを意図するものではない。更なる修正及び変更が可能であることは、本明細書中の代表的な態様を検討することにより当業者に明らかである。実施例及び明細書の残りの部分における全ての部及びパーセントは、他に特定しない限り重量基準である。更に、明細書又は特許請求の範囲において示す全ての数値範囲、例えば特定の特性の組、測定値の単位、条件、物理的状態、又は割合を示すものは、明らかに、言及するか又は他の方法で示すかかる範囲内に含まれる全ての数、並びにそのように示されている全ての範囲内の数の全ての部分集合を文字通り含むものであると意図される。例えば、下限ＲＬ及び上限ＲＵを有する数値範囲が開示されている場合には常に、この範囲内に含まれる任意の数Ｒが具体的に開示されている。特に、この範囲内の次式の数Ｒ：Ｒ＝ＲＬ＋ｋ（ＲＵ−ＲＬ）（式中、ｋは１％の増分で１％〜１００％の範囲の変数であり、例えばｋは、１％、２％、３％、４％、５％、・・・５０％、５１％、５２％、・・・９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である）が具体的に開示されている。更に、上記で算出されるＲの任意の二つの値によって表される任意の数値範囲も、具体的に開示されている。本明細書において示し記載したものに加えて、本発明の任意の修正は、上記の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなろう。かかる修正は、特許請求の範囲内に包含されると意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）第１の弾性率を有する内部部分、及び（ｉｉ）第２の弾性率を有する粒子の外表面部分を含み、第１の弾性率が第２の弾性率よりも大きい、多孔質シリカ粒子。
【請求項２】
粒子が、粒子の内部における最大弾性率、及び粒子の外表面に近接する箇所か又はその上における最小弾性率を有する弾性率勾配を有する、請求項１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項３】
粒子が、粒子の内部における第１の孔密度、及び粒子の外表面に近接する箇所か又はその上における第２の孔密度を有し、第２の孔密度が第１の孔密度よりも大きい、請求項１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項４】
粒子が実質的に球状である、請求項１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項５】
粒子が、約１００μｍ未満の平均最大粒子寸法、約０．４０ｃｃ／ｇ〜約１．４ｃｃ／ｇの孔容積、約４０Å〜約７００Åの平均孔直径、及び約２００ｍ２／ｇ〜約４５０ｍ２／ｇの表面積を有する、請求項１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項６】
粒子が、約３〜約２０μｍの平均最大粒子寸法、約０．７５ｃｃ／ｇ〜約１．１ｃｃ／ｇの孔容積、約９０Å〜約１５０Åの平均孔直径、及び約２６０ｍ２／ｇ〜約３７０ｍ２／ｇの表面積を有する、請求項１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項７】
粒子が約０．９５ｃｃ／ｇの孔容積及び約３２０ｍ２／ｇの表面積を有する、請求項６に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項８】
粒子が約３μｍ〜約２０μｍの平均最大粒子寸法を有する、請求項１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項９】
請求項１に記載の少なくとも１つの多孔質シリカ粒子を含む、複数のシリカ粒子。
【請求項１０】
請求項１に記載の少なくとも１つの多孔質シリカ粒子を含む、クロマトグラフィーカラムにおいて用いるための媒体。
【請求項１１】
請求項１に記載の少なくとも１つの多孔質シリカ粒子と組み合わされているクロマトグラフィーカラム。
【請求項１２】
少なくとも１つの多孔質シリカ粒子がカラム内に配置されている、請求項１１に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１３】
請求項１２に記載のクロマトグラフィーカラムを通して流体を処理する；
工程を含む、クロマトグラフィーカラムの使用方法。
【請求項１４】
部分的に加水分解された材料を形成するように有機シリケートを部分的に加水分解し；
部分的に加水分解された材料を蒸留して、エチルアルコールを除去し、蒸留された部分的に加水分解された材料を形成し；
極性連続相中に部分的に加水分解されたシリケートの液滴を形成するように、蒸留された部分的に加水分解された材料を極性連続相中で乳化し；
球状の多孔質粒子を形成するように、水酸化アンモニウムを用いる縮合反応によって液滴をゲル化し；
球状の多孔質粒子を洗浄し；
球状の多孔質粒子を水熱熟成し；そして
球状の多孔質粒子を乾燥して乾燥した多孔質粒子を形成する；
工程を含む、シリカ粒子の製造方法。
【請求項１５】
第１の粒径を有しないシリカ粒子から第１の粒径を有するシリカ粒子を分離することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１の粒径が約３μｍ〜約２０μｍの範囲である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法によって形成される少なくとも１つのシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム中に導入する；
工程を含む、クロマトグラフィーカラムの製造方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法によって形成される少なくとも１つのシリカ粒子を含むクロマトグラフィーカラムを通して流体を処理する；
工程を含む、クロマトグラフィーカラムの使用方法。
【請求項１９】
流体がペプチドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１４に記載の方法によって形成されるシリカ粒子。
【請求項２１】
少なくとも約１００ＭＰａの塑性変形を有する多孔質シリカ粒子。
【請求項２２】
塑性変形が少なくとも約２００ＭＰａである、請求項２１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項２３】
塑性変形が少なくとも約３００ＭＰａである、請求項２１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項２４】
塑性変形が少なくとも約４００ＭＰａである、請求項２１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項２５】
４ＧＰａ未満の表面弾性変形を有する多孔質シリカ粒子。
【請求項２６】
弾性変形が約３ＧＰａ未満である、請求項２５に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項２７】
弾性変形が約２ＧＰａ未満である、請求項２５に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項２８】
弾性変形が約１ＧＰａ未満である、請求項２５に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項２９】
少なくとも約１００ＭＰａの塑性変形及び約４ＧＰａ未満の弾性変形を有する多孔質シリカ粒子。
【請求項１】
（ｉ）第１の弾性率を有する内部部分、及び（ｉｉ）第２の弾性率を有する粒子の外表面部分を含み、第１の弾性率が第２の弾性率よりも大きい、多孔質シリカ粒子。
【請求項２】
粒子が、粒子の内部における最大弾性率、及び粒子の外表面に近接する箇所か又はその上における最小弾性率を有する弾性率勾配を有する、請求項１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項３】
粒子が、粒子の内部における第１の孔密度、及び粒子の外表面に近接する箇所か又はその上における第２の孔密度を有し、第２の孔密度が第１の孔密度よりも大きい、請求項１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項４】
粒子が実質的に球状である、請求項１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項５】
粒子が、約１００μｍ未満の平均最大粒子寸法、約０．４０ｃｃ／ｇ〜約１．４ｃｃ／ｇの孔容積、約４０Å〜約７００Åの平均孔直径、及び約２００ｍ２／ｇ〜約４５０ｍ２／ｇの表面積を有する、請求項１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項６】
粒子が、約３〜約２０μｍの平均最大粒子寸法、約０．７５ｃｃ／ｇ〜約１．１ｃｃ／ｇの孔容積、約９０Å〜約１５０Åの平均孔直径、及び約２６０ｍ２／ｇ〜約３７０ｍ２／ｇの表面積を有する、請求項１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項７】
粒子が約０．９５ｃｃ／ｇの孔容積及び約３２０ｍ２／ｇの表面積を有する、請求項６に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項８】
粒子が約３μｍ〜約２０μｍの平均最大粒子寸法を有する、請求項１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項９】
請求項１に記載の少なくとも１つの多孔質シリカ粒子を含む、複数のシリカ粒子。
【請求項１０】
請求項１に記載の少なくとも１つの多孔質シリカ粒子を含む、クロマトグラフィーカラムにおいて用いるための媒体。
【請求項１１】
請求項１に記載の少なくとも１つの多孔質シリカ粒子と組み合わされているクロマトグラフィーカラム。
【請求項１２】
少なくとも１つの多孔質シリカ粒子がカラム内に配置されている、請求項１１に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１３】
請求項１２に記載のクロマトグラフィーカラムを通して流体を処理する；
工程を含む、クロマトグラフィーカラムの使用方法。
【請求項１４】
部分的に加水分解された材料を形成するように有機シリケートを部分的に加水分解し；
部分的に加水分解された材料を蒸留して、エチルアルコールを除去し、蒸留された部分的に加水分解された材料を形成し；
極性連続相中に部分的に加水分解されたシリケートの液滴を形成するように、蒸留された部分的に加水分解された材料を極性連続相中で乳化し；
球状の多孔質粒子を形成するように、水酸化アンモニウムを用いる縮合反応によって液滴をゲル化し；
球状の多孔質粒子を洗浄し；
球状の多孔質粒子を水熱熟成し；そして
球状の多孔質粒子を乾燥して乾燥した多孔質粒子を形成する；
工程を含む、シリカ粒子の製造方法。
【請求項１５】
第１の粒径を有しないシリカ粒子から第１の粒径を有するシリカ粒子を分離することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１の粒径が約３μｍ〜約２０μｍの範囲である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法によって形成される少なくとも１つのシリカ粒子をクロマトグラフィーカラム中に導入する；
工程を含む、クロマトグラフィーカラムの製造方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法によって形成される少なくとも１つのシリカ粒子を含むクロマトグラフィーカラムを通して流体を処理する；
工程を含む、クロマトグラフィーカラムの使用方法。
【請求項１９】
流体がペプチドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１４に記載の方法によって形成されるシリカ粒子。
【請求項２１】
少なくとも約１００ＭＰａの塑性変形を有する多孔質シリカ粒子。
【請求項２２】
塑性変形が少なくとも約２００ＭＰａである、請求項２１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項２３】
塑性変形が少なくとも約３００ＭＰａである、請求項２１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項２４】
塑性変形が少なくとも約４００ＭＰａである、請求項２１に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項２５】
４ＧＰａ未満の表面弾性変形を有する多孔質シリカ粒子。
【請求項２６】
弾性変形が約３ＧＰａ未満である、請求項２５に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項２７】
弾性変形が約２ＧＰａ未満である、請求項２５に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項２８】
弾性変形が約１ＧＰａ未満である、請求項２５に記載の多孔質シリカ粒子。
【請求項２９】
少なくとも約１００ＭＰａの塑性変形及び約４ＧＰａ未満の弾性変形を有する多孔質シリカ粒子。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５３１７９８（Ｐ２０１０−５３１７９８Ａ）
【公表日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１１１８６（Ｐ２０１０−５１１１８６）
【出願日】平成２０年６月４日（２００８．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００７０３４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５０５３７
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０８２７０６０２）オールテック・アソシエイツ・インコーポレーテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月４日（２００８．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００７０３４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５０５３７
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０８２７０６０２）オールテック・アソシエイツ・インコーポレーテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]