ステロイドの測定方法
【課題】生体由来試料中に微量に含まれる水酸基を有するステロイドをＬＣ−ＭＳで測定する方法を提供すること。
【解決手段】生体由来試料中のステロイド水酸基に下記式（Ｉ）で示される化合物を反応させてエステル誘導体とし、得られたエステル誘導体をＬＣ−ＭＳで測定する。
（式中 Ｒはヒドロキシル基又は脱離基を表す）
【解決手段】生体由来試料中のステロイド水酸基に下記式（Ｉ）で示される化合物を反応させてエステル誘導体とし、得られたエステル誘導体をＬＣ−ＭＳで測定する。
（式中 Ｒはヒドロキシル基又は脱離基を表す）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるステロイドを液体クロマトグラフィー−質量分析計（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry：ＬＣ−ＭＳ）を用いて測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドは生体内において極微量で強力な生理作用を示すため、その量を正確に把握することは、臨床診断及び病態解析の上で重要である。しかしながら、その量は微量（数ｐｇ／ｍＬ）である上、構造類似化合物も存在することから、測定には高感度、特異性が高いことなどが必要となる。
【０００３】
ステロイドの測定には、通常、ラジオイムノアッセイ（Radio Immunoassay：ＲＩＡ）、酵素免疫反応（Enzyme Immunoassay：ＥＩＡ）、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ等が用いられる。このうち、ＲＩＡ及びＥＩＡについては、それら免疫法の一般的な定量限界は１０ｐｇ／ｍＬであり、それに加えて試料中には測定対象化合物の構造類似体や性ホルモン結合蛋白も存在しているため、定量値が大きく変動する可能性がある。最近になって、シーアイエス ダイアグノスティックス社から、検出感度が１.４ｐｇ／ｍＬと極めて高感度のエストラジオールＲＩＡ測定キットが発売されたが、この測定キットはエストラジオール−１７β グルクロナイドとの交差性にあまり優れておらず、エストラジオール特異性に問題が残っている。
【０００４】
ＬＣ−ＭＳについては、測定対象を誘導体化して検出感度を高め、微量測定を行う方法が種々試みられている。例えば、非特許文献１〜３には、ステロイド化合物に電子親和性原子団を導入し、ＬＣと正イオンモードの大気圧化学イオン化ＭＳ（Atmospheric Pressure Chemical Ionization based Mass Spectrometry：ＡＰＣＩ／ＭＳ）を組み合わせて測定する方法が示されている。また、ステロイドのカルボニル基をｐ−トルエンスルホンヒドラゾン化してＬＣ−ＭＳで測定する方法（非特許文献４参照）、ステロイドのアルコール性水酸基をＮ−アルキルピリジニウム化してＬＣとエレクトロスプレーイオン化ＭＳ（Electrospray ionization based Mass Spectrometry：ＥＳＩ／ＭＳ）を組み合わせて測定する方法（特許文献１参照）も提案されている。しかし、これらの方法における測定限界は数１０〜１００ｐｇ／ｍＬである。
【０００５】
非特許文献５には、種々の化合物をペンタフルオロベンジル化すると、ＬＣ−ＡＰＣＩ／ＭＳによりエストロン等を数ｐｇ以下のレベルで測定できることが記載されている。しかし、この文献においては、アンドロゲン、エストラジオール等の測定は行われておらず、この方法でステロイド類全般が同様のレベルで測定することができるかどうか不明である。また、特許文献２には、ステロイドのフェノール性水酸基をペンタフルオロベンゾイル化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定する方法が記載されているが、この誘導体は安定性に欠けるという欠点があり、またこの文献には測定感度が記載されていない。
非特許文献６には、ステロイドのフェノール性水酸基をダンシル化（５−ジメチルアミノナフタレン−１−イルスルフォン化）し、これをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定することにより、例えばエストラジオールの測定限界として６．３ｐｇを達成できたことが記載されている。しかし、この方法においては、特異性及びダンシル化した後の化合物の安定性に欠けるという欠点がある。
特許文献３には、ステロイドをフェニルヒドラゾン化又はフェニルアミノフェニルボロネート化した後、ＬＣ−負イオンＡＰＣＩ／ＭＳで測定することにより、ステロイドを数ｐｇのレベルで測定できることが記載されている。また、このときの測定感度は、ペンタフルオロベンジル化のときと比べ最大７倍上昇していることも示されている。しかしながら、この方法は、オキソ基又はビシナルジオール基を有するステロイドに対してのみ使用可能である。
【特許文献１】特開2003-161726号公報
【特許文献２】特開2000-88834号公報
【特許文献３】特開2004-257949号公報
【非特許文献１】Rapid Comm. Mass Spectrom.,16,1590,2002
【非特許文献２】Biomed.Chromatogr.,15,133,2001
【非特許文献３】J.Chromatogr.,B,772,229,2002
【非特許文献４】J.Chromatogr.,B,714,153,1998
【非特許文献５】J.Chromatogr.,B,780,315,2002
【非特許文献６】Anal.Chem.,72,3007,2000
【非特許文献７】Clin.Chem.,50(2),373,2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、試料中に含まれるステロイドをＬＣ−ＭＳにより測定する方法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、ＬＣ−ＭＳを用いるステロイド測定用の試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ステロイドの水酸基をピリジルカルボニル化してピリジルカルボン酸エステル誘導体とすることにより、ステロイドをＬＣ−ＭＳにより数ｐｇのレベルで測定できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、試料中に含まれるステロイドをＬＣ−ＭＳを用いて測定する方法であって、
１）試料中のステロイドの水酸基に下記式
【０００９】
【化２】
【００１０】
［式中におけるＲはヒドロキシル基又は脱離基を表す］
で示される化合物を反応させてエステル誘導体とする工程、
２）前記エステル誘導体を、ＬＣ−ＭＳを用いて測定する工程、
を含むことを特徴とする測定方法に関するものである。
また、本発明は、上記式（Ｉ）で示される化合物を含むことを特徴とする、ＬＣ−ＭＳを用いるステロイド測定用試薬に関するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の測定方法におけるピリジルカルボニル化操作は容易に行うことができ、その反応成績体である該エステル誘導体も安定である。一般に、水酸基を複数有するステロイドに対して同一の試薬により複数箇所誘導体化した場合、ＬＣ−ＭＳによる測定感度が、１箇所のみ誘導体化した場合に比べて低下してしまうことも多いが、本発明の方法においては、ステロイドにおける複数箇所の水酸基をピリジルカルボニル化した場合であっても同等の測定感度を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、「ステロイド」とは、ステロイド化合物及びビタミンＤ３類縁体を意味し、水酸基を含有するものであれば特に制限されず、例えば、テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プレグネノロン、アロプレグナノロン、エストロン、エストラジオール、エストリオール、カテコールエストロゲン、コルチゾール、コルチゾンなどのステロイド化合物及び２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３、１，２４，２５−（トリヒドロキシ）ビタミンＤ３等のビタミンＤ３類縁体を挙げることができる。この中、テストステロン、ジヒドロテストステロン及びエストラジオールが好ましい。
【００１３】
本明細書において、「水酸基」は、アルコール性でもフェノール性でもよく、また、一級でも二級でもよい。更に、「水酸基」は、ステロイド骨格上にあっても、ステロイド骨格の側鎖上にあってもよい。
本明細書において、「ＬＣ−ＭＳ」とは、例えば、一般的にはＬＣ−ＭＳ／ＭＳであり、その中、イオン化法を用いたものとしてはＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ及びＬＣ−ＡＰＣＩ／ＭＳを挙げることができ、中でも、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳが好ましい。
【００１４】
本発明において使用することのできる下記式
【００１５】
【化３】
【００１６】
で示されるピリジルカルボニル化合物におけるＲはヒドロキシル基又は脱離基を表す。ここで、脱離基とは、水酸基と反応して該水酸基に取って代わられることのできる基を意味し、本発明において特に制限されることはないが、例えば、ハロゲン基（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、低級アルキルカルボニルオキシ基、置換カルボニルアミノ基、イミダゾリル基、低級アルキルオキシカルボニル基、ジカルボン酸イミド基等を挙げることができる。
Ｒは、好ましくは脱離基であり、より好ましくはハロゲン基、最も好ましくはクロロである。
なお、上記低級アルキル基は、炭素数が１〜６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等を挙げることができる。
また、本発明において上記式（Ｉ）の化合物における−ＣＯＲの置換位置は、特に制限されることはないが、より好ましくは２位である。
なお、前記式（Ｉ）の化合物はその殆どが既知であり、たとえ新規であったとしても、既知化合物から既知の方法により容易に合成することができる。
【００１７】
本明細書において「試料」とは、生物、環境又は工業製品いずれの由来のものであってもよい。生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の血清、唾液、涙液、尿、糞、培養細胞、又は臓器から得られる調製物、あるいは植物からの抽出物などを挙げることができる。また、環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、排水、河川水、湖沼水又は海水などが挙げられる。さらに、工業製品由来の試料としては、例えば、食料品などが挙げられる。
【００１８】
本発明の測定方法について、以下に具体的に説明する。
試料の調製
試料は、有機溶媒による抽出の後、簡易カラムクロマトグラフィー、例えば、ウォーターズ社製ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ（登録商標）カートリッジ、バリアン社製Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｓｉ（登録商標）カートリッジ等による分離精製等の一般的調製方法を適宜選択して調製してから、次のエステル誘導体化反応に供することができる。
【００１９】
エステル誘導体化
上記で調製した試料に対し、前記式（Ｉ）の化合物を反応させて、ステロイドをエステル誘導体に変換する。
この反応は、一般に、不活性有機溶媒、例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類；アセトニトリル；ジメチルスルホキシド等の不活性有機溶媒に溶解又は懸濁した状態にて、適当な塩基、例えば、水素化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、ピリジン等の存在下にて行うことができる。反応温度は、通常、−５℃乃至８０℃の範囲内の温度とすることができ、好ましくは１０℃乃至３０℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常５〜２４０分の範囲内の時間とすることができ、好ましくは３０〜９０分の範囲内が適している。
【００２０】
上記エステル誘導体化反応において、試料の量に対する前記式（Ｉ）の化合物の使用割合は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｍＬあたり前記式（Ｉ）の化合物を少なくとも０．２ｍｇ、好ましくは１〜５ｍｇの範囲内で用いることができる。
また、上記エステル誘導体化反応において使用する塩基の量は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｍＬあたり塩基を少なくとも０．１ミリモル、好ましくは０．１〜０．５ミリモルの範囲内とすることができる。
【００２１】
なお、上記エステル誘導体化反応において、前記式（Ｉ）の化合物におけるＲがヒドロキシル基を表す場合は、この式（Ｉ）の化合物は予め、例えば、１，１−カルボニルジイミダゾール、１，１−チオニルジイミダゾール等で処理して、ヒロドキシル基を活性アミド等の脱離基に変換しておくことが望ましい。また、Ｒがハロゲン基を表す場合、式（Ｉ）の化合物は予め、例えばイミダゾール及びＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ[５．４．０]ウンデカ−７−エン）等で処理して、ハロゲンをイミダゾリド等の他の脱離基に変換しておくこともできる。
【００２２】
以上のようにエステル誘導体化反応を行った後、常法により後処理を行い、ＬＣ−ＭＳにより測定する。
ＬＣ−ＭＳ測定
上記エステル化誘導体反応において調製したエステル誘導体のＬＣ−ＭＳによる測定は、一般的なＬＣ、例えば、ヒューレット・パッカード社製ＨＰ１１００、ウォーターズ社製２７９５等のＬＣ、及び一般的なＭＳ、例えば、マイクロマス社製ＱＵＡＴＴＲＯII（登録商標）、ＱＵＡＴＴＲＯ ＭＩＣＲＯ（登録商標）、アプライド・バイオシステムズ社製ＡＰＩ４０００等のＭＳを用いて行うことができる。
【００２３】
実験例１ 各種ステロイド誘導体におけるＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの検出感度の比較
本発明において使用されるステロイドのエステル誘導体と、先に述べた先行技術文献に記載されている各種誘導体化試薬を用いて誘導体化されたステロイド誘導体についてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの検出感度を比較した。なお、誘導体化されるステロイド化合物には、テストステロン（Ｔ）及びエストラジオール（Ｅ２）を用いた。
Ｔについては、本発明において使用されるＴ−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体の他に、Ｔ−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体及びＴ−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル−３−エトオキシム誘導体について測定を行い、Ｅ２については、本発明において使用されるＥ２−３，１７−Ｏ−ジピコリノイルエステル誘導体の他に、Ｅ２−３−ペンタフルオロベンジル−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体について測定を行った。
【００２４】
上記測定で用いた各誘導体の化学構造式及びその誘導体化試薬が記載されている先行技術文献は次の通りである。
１）本発明において使用されるＴ−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体
【００２５】
【化４】
【００２６】
２）Ｔ−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体（特許文献１にＮ−メチルピリジニウム化試薬が記載されている）
【００２７】
【化５】
【００２８】
３）Ｔ−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル−３−エトオキシム誘導体（特許文献１に記載のＮ−メチルピリジニウム化試薬と非特許文献１に記載のエトオキシム化試薬の組み合わせ）
【００２９】
【化６】
【００３０】
４）本発明において使用されるＥ２−３，１７−Ｏ−ジピコリノイルエステル誘導体
【００３１】
【化７】
【００３２】
５）Ｅ２−３−ペンタフルオロベンジル−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体（特許文献１に記載のN-メチルピリジニウム化試薬と非特許文献６に記載のペンタフルオロベンジル化試薬の組み合わせ）
【００３３】
【化８】
【００３４】
それぞれの誘導体０．０５ｐｇを含有するアセトニトリル溶液２０μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定し、得られたＬＣ−ＭＳクロマトグラムよりＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を算出した。この結果を下表Ａに示す。
【００３５】
【表１】
ＰＹ ：１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体
ＥＡＰＹ ：１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル-３−エトオキシム誘導体
ＰＦＢＺＰＹ：３−ペンタフルオロベンジル−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体
ＰＩ（１） ：ピコリノイルエステル誘導体
ＰＩ（２） ：ジピコリノイルエステル誘導体
【００３６】
上記測定結果より、本発明において使用されるピコリノイルエステル誘導体はＮ−メチルピリジン−２−イル誘導体及びそのペンタフルオロベンジル誘導体よりもＳ／Ｎ比が大きく、より高感度で測定できることを確認した。
【００３７】
実験例２ 検量線の作成
エストロン（Ｅ１）及びエストラジオール（Ｅ２）について、本発明の方法により測定を行う際の検量線を作成した。
【００３８】
１）検出イオンの決定
まず、Ｅ１−３−Ｏ−ピコノイルエステル誘導体のＭＳ測定を行ったところ、ｍ/ｚ３７６．１に前駆イオンが検出され、この前駆イオンについて更にＭＳ測定を行うと、ｍ/ｚ１５６．９にピークを示すスペクトルが得られた（図１及び図２）。したがって、Ｅ１−３−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体については検出イオンをｍ/ｚ１５６．９と決定した。
次に、Ｅ２−３，１７−Ｏ−ジピコリノイルエステル誘導体についてＭＳ測定を行うと、ｍ/ｚ４８３．５に前駆イオンが検出され、この前駆イオンついて更にＭＳ測定を行うと、ｍ/ｚ３６０．１、２６４．１にピークを示すスペクトルが得られた（図３及び図４）。したがって、Ｅ２−３，１７−Ｏ−ジピコリノイルエステル誘導体については、検出イオンをｍ/ｚ２６４．１と決定した。
【００３９】
２）検量線の作成
Ｅ１及びＥ２それぞれについて ０．２、１、５、２０、１００、５００ｐｇ／ｍＬの水溶液（０．１ｍｇ／ｍＬのアセトニトリル溶液より水で希釈したもの）を調製し、それぞれ１ｍＬを量り、内部標準物質（Ｅ１については１３Ｃ４ −Ｅ１、Ｅ２については１６，１６，１７−ｄ３−Ｅ２）各１００ｐｇを加え、さらにジエチルエーテル４ｍＬを加えて振り混ぜ、ジエチルエーテル層を分離後、窒素気流下でジエチルエーテルを留去した。この残留物にピコリノイルクロリド塩酸塩のアセトニトリル溶液（１→２０）０．１ｍＬ及びピリジン３０μＬを加えて振り混ぜた後、室温で１時間放置した。反応後、１％塩酸１ｍＬを加え、ジエチルエーテル４ｍＬを加えて振り混ぜ、ジエチルエーテル層を分離後、窒素気流下で留去した。残留物をアセトニトリル０．２５ｍＬに溶解し、水１ｍＬを加えて希釈後、Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８に負荷し、アセトニトリル溶液（３→１０）３ｍＬで洗浄し、更にアセトニトリル溶液（４→５）２．５ｍＬで溶出した。溶媒を遠心エバポレーターで留去した後、アセトニトリル溶液（２→５）０．１ｍＬに溶解した。この液２０μＬについてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った。
ＬＣ−ＭＳ/ＭＳの測定条件を、下表Ｂに示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
上記の測定によって得られたＥ１及びＥ２それぞれの値に基づき検量線を作成した。これを図５及び図６に示す。Ｅ１においては０．５〜５００ｐｇの範囲において相関係数１．００００、また、Ｅ２においては０．５〜５００ｐｇの範囲において相関係数１．００００とそれぞれ良好な直線性を示した。
【００４２】
実験例３ Ｅ１及びＥ２の定量限界の比較
１個所をピコリノイルエステル誘導体化した場合と、複数箇所をピコリノイルエステル誘導体化した場合の、それぞれのＬＣ−ＭＳによる測定感度を比較するため、３位にフェノール性水酸基を有するＥ１と３位にフェノール性水酸基及び１７位にアルコール性水酸基を有するＥ２を用いて、以下のとおり定量限界を求めた。
Ｅ１及びＥ２をそれぞれ０．２、０．５及び２０ｐｇ含む溶液について、実験例２における検量線作成におけるのと同様の方法で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った。具体的にはＥ１及びＥ２のＬＣ−ＭＳクロマトグラムにおける生成イオンのピーク面積をそれぞれ測定し、それらと内部標準物質とのピーク面積比を算出し、これを検量線の値と比較して、Ｅ１及びＥ２の量を求めた。結果を下表Ｃに示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
この結果、Ｅ１−３−ピコリノイルエステル誘導体及びＥ２−３，１７−ジピコリノイルエステル誘導体として検出したＥ１及びＥ２の定量限界は、真度及び精度より、それぞれ０．５及び０．２ｐｇであった。このことから、本願発明の方法によれば、複数箇所の水酸基がエステル化された場合であっても、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定感度が低下することはなかった。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４６】
実施例１ 健常女性血清中のＥ１及びＥ２の量の同時測定
実験例２で行った方法と同様の方法を用いて、健常女性血清１０例についてＥ１及びＥ２の量を測定した。
【００４７】
１−１試料の調製
健常女性血清０．５ｍＬを採取し、これに内部標準物質として１３Ｃ４−Ｅ１及び１６，１６，１７−ｄ3−Ｅ−２にそれぞれ１００ｐｇを加えた後、ジエチルエーテル４ｍＬを加えて振とうし、ジエチルエーテル層を分離し、窒素気流下で留去した。
【００４８】
１−２ ピコリノイルエステル誘導体化
前項１−１で得た残留物にピコリノイルクロリド塩酸塩のアセトニトリル溶液（１→２０）０．１ｍＬ及びピリジン３０μＬを加えて振り混ぜた後、室温で１時間放置した。反応後、１％塩酸１ｍＬを加え、ジエチルエーテル４ｍＬを加えて振とうし、エーテル層を分離後、窒素気流下で留去した。残留物をアセトニトリル０．２５ｍＬに溶解し、水１ｍＬを加えて希釈後、Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８に負荷し、アセトニトリル溶液（３→１０）３ｍＬで洗浄し、更にアセトニトリル溶液（４→５）２．５ｍＬで溶出した。溶出液を遠心エバポレーターで留去した後、アセトニトリル溶液（２→５）１００μＬに溶解し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。
【００４９】
１−３ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定
前項１−２で得たアセトニトリル溶液１００μＬのうち、その２０μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定に用いた。測定は、実験例２と同様に行った。そしてＥ１及びＥ２のＬＣ−ＭＳクロマトグラムにおける生成イオンのピーク面積をそれぞれ測定し、それらと内部標準物質とのピーク面積比を算出し、検量線と比較してＥ１及びＥ２濃度を求めた。その結果を、下表Ｄに示す。
【００５０】
【表４】
【００５１】
従来は、Ｅ１及びＥ２をそれぞれ別個に測定する必要があったが、本発明の方法によれば、１回の測定でＥ１及びＥ２を０．５〜５００ｐｇ／ｍＬの範囲で同時定量することができる。
【００５２】
実施例２ 健常男性血清及び唾液中のテストステロン（Ｔ）及びジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の同時測定
２−１ 検出イオンの決定
Ｔ−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体についてＭＳ測定を行うと、ｍ/ｚ３９４．４に前駆イオンが検出された。この前駆イオンについて更にＭＳ測定を行うと、ｍ/ｚ２５３．４にピークを示すスペクトルが得られた（図７及び図８）。したがってＴ−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体についての検出イオンをｍ／ｚ２５３．４に決定した。
一方、ＤＨＴ−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体についてＭＳ測定を行うと、ｍ／ｚ３９６．４に前駆イオンが検出された。この前駆イオンについて更にＭＳ測定を行うと、ｍ／ｚ２５５．４にピークを示すスペクトルが得られた(図９及び図１０)。したがって、ＤＨＴ−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体についての検出イオンをｍ／ｚ２５５．４に決定した。
【００５３】
２−２ 試料の調製
健常男性血清２００μＬに内部標準物質（１６，１６，１７−ｄ３−Ｔ 及び１６，１６，１７−ｄ３−ＤＨＴ）、ジエチルエーテル４ｍＬを加えて、室温で１０分間振とうした後、エーテル層を分離し、窒素気流中で留去した。
なお、唾液の場合は、１ｍＬを採取し、血清と同様に操作した。
【００５４】
２−３ ピコリノイルエステル誘導体化
前項２−２で得た残留物にピコリノイルクロリド塩酸塩のアセトニトリル溶液（１→４０）２００μＬ及びピリジン５０μＬを加えて振り混ぜた後、室温で９０分間放置した。反応後、水７５０μＬ及びジエチルエーテル５ｍＬを加えて１０分間振り混ぜた後、エーテル層を分離した。このエーテル層に更に水７５０μＬを加えて振り混ぜた後、エーテル層を分取し、窒素気流下で留去した。残留物をアセトニトリル２５０μＬに溶解し、Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８カラムに負荷し、水１ｍＬ、次いでアセトニトリル溶液（２→５）４ｍＬで洗浄後、アセトニトリル溶液（７→１０）３ｍＬで溶出した。溶媒を遠心エバポレーターにより留去した後、残留物をアセトニトリル／０．１％ギ酸混液（７：３）１００μＬに溶解した。
【００５５】
２−４ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定
前項２−３で得たアセトニトリル／０．１％ギ酸混合溶液１００μＬのうち、その２０μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定に用いた。下表ＥにＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定条件を示す。
【００５６】
【表５】
【００５７】
Ｔ及びＤＨＴのＬＣ−ＭＳクロマトグラムにおける生成イオンのピーク面積と内部標準物質のピーク面積をそれぞれ測定し、これらからピーク面積比を算出し、検量線と比較してそれぞれの濃度を求めた。その結果を、下表Ｆに示す。
【００５８】
【表６】
【００５９】
なお、上記Ｔ及びＤＨＴの濃度を求めるための検量線をそれぞれ図１１及び図１２に示す。検量線は、Ｔ及びＤＨＴそれぞれ、０．２、１．５、２０、１００、５００ｐｇ／ｍＬの水溶液（０．１ｍｇ／ｍＬアセトニトリル溶液より水で希釈したもの）を、並びに内部標準物質として、Ｔについては１６，１６，１７−ｄ３−Ｔを、またＤＨＴについては１６，１６，１７−ｄ３−ＤＨＴを各５００ｐｇ用い、実験例２と同様の方法により作成した。なおＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定は前記表Ｅに示す測定条件により行った。Ｔにおいては０〜５００ｐｇの範囲において相関係数０．９９９８、またＤＨＴにおいては０〜５００ｐｇの範囲において相関係数０．９９９０と、それぞれ良好な直線性を示した。
【００６０】
実施例３ ヒト前立腺組織中のテストステロン（Ｔ）及びジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の同時測定
３−１ 試料の調製
前立腺組織約５０ｍｇを精密に量った後、液体窒素により凍結、粉砕し、水４ｍＬを加えてホモジナイズした。ホモジネートした液５００μＬをとり、これに内部標準物質として１６，１６，１７−ｄ３−Ｔ 及び１６，１６，１７−ｄ３−ＤＨＴをそれぞれ５００ｐｇ並びにエタノール４ｍＬを加え、５５℃で３時間振とうした後、冷却遠心分離した。遠心分離後の上清を分取し、遠心エバポレーターにより溶媒を留去し、得られた残留物をメタノール２５０μＬに溶解後、水１ｍＬで希釈した。この液を、あらかじめメタノール６ｍＬ及び水６ｍＬで調製したＢｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８カラムに負荷し、アセトニトリル溶液（３→１０）２ｍＬで洗浄した後、アセトニトリル溶液（７→１０）２．５ｍＬで溶出した。そして、窒素気流中にて溶媒を留去した。
【００６１】
３−２ ピコリノイルエステル誘導体化及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定
実施例２−３及び２−４と同様にして、ピコリノイルエステル誘導体化及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、前立腺組織中のＴ及びＤＨＴの濃度を求めた。
その結果を、下表Ｇに示す。
【００６２】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の方法によれば、試料中のステロイドの有無を検出したり、ステロイドの量を測定したりすることができる。
本発明は、例えば、医学、生化学、公衆衛生、食品検査などの分野で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、エストロン−３−ピコリノイルエステル誘導体のマススペクトルである。特徴的な前駆イオンｍ／ｚ３７６．０のピークを確認することができる。
【図２】図２は、エストロン−３−ピコリノイルエステル誘導体の前駆イオンｍ／ｚ３７６．０からの生成イオンのスペクトルである。
【図３】図３は、エストラジオール−３，１７―ジピコリノイルエステル誘導体のマススペクトルである。特徴的な前駆イオンｍ／ｚ４８３．５のピークが確認できる。
【図４】図４は、エストラジオール−３，１７―ジピコリノイルエステル誘導体の前駆イオンｍ／ｚ４８３．５からの生成イオンのスペクトルである。
【図５】図５は、本発明の測定方法に用いるためのエストロン０〜５００ｐｇの検量線である。
【図６】図６は、本発明の測定方法に用いるためのエストラジオール０〜５００ｐｇの検量線である。
【図７】図７は、テストステロン―１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体のマススペクトルである。前駆イオンｍ/ｚ３９４．４のピークが確認できる。
【図８】図８は、テストステロン―１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体の前駆イオンｍ／ｚ３９４．４からの生成イオンのスペクトルである。
【図９】図９は、ジヒドロテストステロン―１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体のマススペクトルである。前駆イオンｍ／ｚ３９６．４のピークが確認できる。
【図１０】図１０は、ジヒドロテストステロン―１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体の前駆イオンｍ／ｚ３９６．４からの生成イオンのスペクトルである。
【図１１】図１１は、本発明の測定方法に用いるためのテストステロン０〜５００ｐｇの検量線である。
【図１２】図１２は、本発明の測定方法に用いるためのジヒドロテストステロン０〜５００ｐｇの検量線である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるステロイドを液体クロマトグラフィー−質量分析計（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry：ＬＣ−ＭＳ）を用いて測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドは生体内において極微量で強力な生理作用を示すため、その量を正確に把握することは、臨床診断及び病態解析の上で重要である。しかしながら、その量は微量（数ｐｇ／ｍＬ）である上、構造類似化合物も存在することから、測定には高感度、特異性が高いことなどが必要となる。
【０００３】
ステロイドの測定には、通常、ラジオイムノアッセイ（Radio Immunoassay：ＲＩＡ）、酵素免疫反応（Enzyme Immunoassay：ＥＩＡ）、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ等が用いられる。このうち、ＲＩＡ及びＥＩＡについては、それら免疫法の一般的な定量限界は１０ｐｇ／ｍＬであり、それに加えて試料中には測定対象化合物の構造類似体や性ホルモン結合蛋白も存在しているため、定量値が大きく変動する可能性がある。最近になって、シーアイエス ダイアグノスティックス社から、検出感度が１.４ｐｇ／ｍＬと極めて高感度のエストラジオールＲＩＡ測定キットが発売されたが、この測定キットはエストラジオール−１７β グルクロナイドとの交差性にあまり優れておらず、エストラジオール特異性に問題が残っている。
【０００４】
ＬＣ−ＭＳについては、測定対象を誘導体化して検出感度を高め、微量測定を行う方法が種々試みられている。例えば、非特許文献１〜３には、ステロイド化合物に電子親和性原子団を導入し、ＬＣと正イオンモードの大気圧化学イオン化ＭＳ（Atmospheric Pressure Chemical Ionization based Mass Spectrometry：ＡＰＣＩ／ＭＳ）を組み合わせて測定する方法が示されている。また、ステロイドのカルボニル基をｐ−トルエンスルホンヒドラゾン化してＬＣ−ＭＳで測定する方法（非特許文献４参照）、ステロイドのアルコール性水酸基をＮ−アルキルピリジニウム化してＬＣとエレクトロスプレーイオン化ＭＳ（Electrospray ionization based Mass Spectrometry：ＥＳＩ／ＭＳ）を組み合わせて測定する方法（特許文献１参照）も提案されている。しかし、これらの方法における測定限界は数１０〜１００ｐｇ／ｍＬである。
【０００５】
非特許文献５には、種々の化合物をペンタフルオロベンジル化すると、ＬＣ−ＡＰＣＩ／ＭＳによりエストロン等を数ｐｇ以下のレベルで測定できることが記載されている。しかし、この文献においては、アンドロゲン、エストラジオール等の測定は行われておらず、この方法でステロイド類全般が同様のレベルで測定することができるかどうか不明である。また、特許文献２には、ステロイドのフェノール性水酸基をペンタフルオロベンゾイル化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定する方法が記載されているが、この誘導体は安定性に欠けるという欠点があり、またこの文献には測定感度が記載されていない。
非特許文献６には、ステロイドのフェノール性水酸基をダンシル化（５−ジメチルアミノナフタレン−１−イルスルフォン化）し、これをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定することにより、例えばエストラジオールの測定限界として６．３ｐｇを達成できたことが記載されている。しかし、この方法においては、特異性及びダンシル化した後の化合物の安定性に欠けるという欠点がある。
特許文献３には、ステロイドをフェニルヒドラゾン化又はフェニルアミノフェニルボロネート化した後、ＬＣ−負イオンＡＰＣＩ／ＭＳで測定することにより、ステロイドを数ｐｇのレベルで測定できることが記載されている。また、このときの測定感度は、ペンタフルオロベンジル化のときと比べ最大７倍上昇していることも示されている。しかしながら、この方法は、オキソ基又はビシナルジオール基を有するステロイドに対してのみ使用可能である。
【特許文献１】特開2003-161726号公報
【特許文献２】特開2000-88834号公報
【特許文献３】特開2004-257949号公報
【非特許文献１】Rapid Comm. Mass Spectrom.,16,1590,2002
【非特許文献２】Biomed.Chromatogr.,15,133,2001
【非特許文献３】J.Chromatogr.,B,772,229,2002
【非特許文献４】J.Chromatogr.,B,714,153,1998
【非特許文献５】J.Chromatogr.,B,780,315,2002
【非特許文献６】Anal.Chem.,72,3007,2000
【非特許文献７】Clin.Chem.,50(2),373,2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、試料中に含まれるステロイドをＬＣ−ＭＳにより測定する方法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、ＬＣ−ＭＳを用いるステロイド測定用の試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ステロイドの水酸基をピリジルカルボニル化してピリジルカルボン酸エステル誘導体とすることにより、ステロイドをＬＣ−ＭＳにより数ｐｇのレベルで測定できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、試料中に含まれるステロイドをＬＣ−ＭＳを用いて測定する方法であって、
１）試料中のステロイドの水酸基に下記式
【０００９】
【化２】
【００１０】
［式中におけるＲはヒドロキシル基又は脱離基を表す］
で示される化合物を反応させてエステル誘導体とする工程、
２）前記エステル誘導体を、ＬＣ−ＭＳを用いて測定する工程、
を含むことを特徴とする測定方法に関するものである。
また、本発明は、上記式（Ｉ）で示される化合物を含むことを特徴とする、ＬＣ−ＭＳを用いるステロイド測定用試薬に関するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の測定方法におけるピリジルカルボニル化操作は容易に行うことができ、その反応成績体である該エステル誘導体も安定である。一般に、水酸基を複数有するステロイドに対して同一の試薬により複数箇所誘導体化した場合、ＬＣ−ＭＳによる測定感度が、１箇所のみ誘導体化した場合に比べて低下してしまうことも多いが、本発明の方法においては、ステロイドにおける複数箇所の水酸基をピリジルカルボニル化した場合であっても同等の測定感度を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、「ステロイド」とは、ステロイド化合物及びビタミンＤ３類縁体を意味し、水酸基を含有するものであれば特に制限されず、例えば、テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プレグネノロン、アロプレグナノロン、エストロン、エストラジオール、エストリオール、カテコールエストロゲン、コルチゾール、コルチゾンなどのステロイド化合物及び２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３、１，２４，２５−（トリヒドロキシ）ビタミンＤ３等のビタミンＤ３類縁体を挙げることができる。この中、テストステロン、ジヒドロテストステロン及びエストラジオールが好ましい。
【００１３】
本明細書において、「水酸基」は、アルコール性でもフェノール性でもよく、また、一級でも二級でもよい。更に、「水酸基」は、ステロイド骨格上にあっても、ステロイド骨格の側鎖上にあってもよい。
本明細書において、「ＬＣ−ＭＳ」とは、例えば、一般的にはＬＣ−ＭＳ／ＭＳであり、その中、イオン化法を用いたものとしてはＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ及びＬＣ−ＡＰＣＩ／ＭＳを挙げることができ、中でも、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳが好ましい。
【００１４】
本発明において使用することのできる下記式
【００１５】
【化３】
【００１６】
で示されるピリジルカルボニル化合物におけるＲはヒドロキシル基又は脱離基を表す。ここで、脱離基とは、水酸基と反応して該水酸基に取って代わられることのできる基を意味し、本発明において特に制限されることはないが、例えば、ハロゲン基（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、低級アルキルカルボニルオキシ基、置換カルボニルアミノ基、イミダゾリル基、低級アルキルオキシカルボニル基、ジカルボン酸イミド基等を挙げることができる。
Ｒは、好ましくは脱離基であり、より好ましくはハロゲン基、最も好ましくはクロロである。
なお、上記低級アルキル基は、炭素数が１〜６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等を挙げることができる。
また、本発明において上記式（Ｉ）の化合物における−ＣＯＲの置換位置は、特に制限されることはないが、より好ましくは２位である。
なお、前記式（Ｉ）の化合物はその殆どが既知であり、たとえ新規であったとしても、既知化合物から既知の方法により容易に合成することができる。
【００１７】
本明細書において「試料」とは、生物、環境又は工業製品いずれの由来のものであってもよい。生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の血清、唾液、涙液、尿、糞、培養細胞、又は臓器から得られる調製物、あるいは植物からの抽出物などを挙げることができる。また、環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、排水、河川水、湖沼水又は海水などが挙げられる。さらに、工業製品由来の試料としては、例えば、食料品などが挙げられる。
【００１８】
本発明の測定方法について、以下に具体的に説明する。
試料の調製
試料は、有機溶媒による抽出の後、簡易カラムクロマトグラフィー、例えば、ウォーターズ社製ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ（登録商標）カートリッジ、バリアン社製Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｓｉ（登録商標）カートリッジ等による分離精製等の一般的調製方法を適宜選択して調製してから、次のエステル誘導体化反応に供することができる。
【００１９】
エステル誘導体化
上記で調製した試料に対し、前記式（Ｉ）の化合物を反応させて、ステロイドをエステル誘導体に変換する。
この反応は、一般に、不活性有機溶媒、例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類；アセトニトリル；ジメチルスルホキシド等の不活性有機溶媒に溶解又は懸濁した状態にて、適当な塩基、例えば、水素化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、ピリジン等の存在下にて行うことができる。反応温度は、通常、−５℃乃至８０℃の範囲内の温度とすることができ、好ましくは１０℃乃至３０℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常５〜２４０分の範囲内の時間とすることができ、好ましくは３０〜９０分の範囲内が適している。
【００２０】
上記エステル誘導体化反応において、試料の量に対する前記式（Ｉ）の化合物の使用割合は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｍＬあたり前記式（Ｉ）の化合物を少なくとも０．２ｍｇ、好ましくは１〜５ｍｇの範囲内で用いることができる。
また、上記エステル誘導体化反応において使用する塩基の量は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｍＬあたり塩基を少なくとも０．１ミリモル、好ましくは０．１〜０．５ミリモルの範囲内とすることができる。
【００２１】
なお、上記エステル誘導体化反応において、前記式（Ｉ）の化合物におけるＲがヒドロキシル基を表す場合は、この式（Ｉ）の化合物は予め、例えば、１，１−カルボニルジイミダゾール、１，１−チオニルジイミダゾール等で処理して、ヒロドキシル基を活性アミド等の脱離基に変換しておくことが望ましい。また、Ｒがハロゲン基を表す場合、式（Ｉ）の化合物は予め、例えばイミダゾール及びＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ[５．４．０]ウンデカ−７−エン）等で処理して、ハロゲンをイミダゾリド等の他の脱離基に変換しておくこともできる。
【００２２】
以上のようにエステル誘導体化反応を行った後、常法により後処理を行い、ＬＣ−ＭＳにより測定する。
ＬＣ−ＭＳ測定
上記エステル化誘導体反応において調製したエステル誘導体のＬＣ−ＭＳによる測定は、一般的なＬＣ、例えば、ヒューレット・パッカード社製ＨＰ１１００、ウォーターズ社製２７９５等のＬＣ、及び一般的なＭＳ、例えば、マイクロマス社製ＱＵＡＴＴＲＯII（登録商標）、ＱＵＡＴＴＲＯ ＭＩＣＲＯ（登録商標）、アプライド・バイオシステムズ社製ＡＰＩ４０００等のＭＳを用いて行うことができる。
【００２３】
実験例１ 各種ステロイド誘導体におけるＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの検出感度の比較
本発明において使用されるステロイドのエステル誘導体と、先に述べた先行技術文献に記載されている各種誘導体化試薬を用いて誘導体化されたステロイド誘導体についてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの検出感度を比較した。なお、誘導体化されるステロイド化合物には、テストステロン（Ｔ）及びエストラジオール（Ｅ２）を用いた。
Ｔについては、本発明において使用されるＴ−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体の他に、Ｔ−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体及びＴ−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル−３−エトオキシム誘導体について測定を行い、Ｅ２については、本発明において使用されるＥ２−３，１７−Ｏ−ジピコリノイルエステル誘導体の他に、Ｅ２−３−ペンタフルオロベンジル−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体について測定を行った。
【００２４】
上記測定で用いた各誘導体の化学構造式及びその誘導体化試薬が記載されている先行技術文献は次の通りである。
１）本発明において使用されるＴ−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体
【００２５】
【化４】
【００２６】
２）Ｔ−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体（特許文献１にＮ−メチルピリジニウム化試薬が記載されている）
【００２７】
【化５】
【００２８】
３）Ｔ−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル−３−エトオキシム誘導体（特許文献１に記載のＮ−メチルピリジニウム化試薬と非特許文献１に記載のエトオキシム化試薬の組み合わせ）
【００２９】
【化６】
【００３０】
４）本発明において使用されるＥ２−３，１７−Ｏ−ジピコリノイルエステル誘導体
【００３１】
【化７】
【００３２】
５）Ｅ２−３−ペンタフルオロベンジル−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体（特許文献１に記載のN-メチルピリジニウム化試薬と非特許文献６に記載のペンタフルオロベンジル化試薬の組み合わせ）
【００３３】
【化８】
【００３４】
それぞれの誘導体０．０５ｐｇを含有するアセトニトリル溶液２０μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定し、得られたＬＣ−ＭＳクロマトグラムよりＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を算出した。この結果を下表Ａに示す。
【００３５】
【表１】
ＰＹ ：１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体
ＥＡＰＹ ：１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル-３−エトオキシム誘導体
ＰＦＢＺＰＹ：３−ペンタフルオロベンジル−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体
ＰＩ（１） ：ピコリノイルエステル誘導体
ＰＩ（２） ：ジピコリノイルエステル誘導体
【００３６】
上記測定結果より、本発明において使用されるピコリノイルエステル誘導体はＮ−メチルピリジン−２−イル誘導体及びそのペンタフルオロベンジル誘導体よりもＳ／Ｎ比が大きく、より高感度で測定できることを確認した。
【００３７】
実験例２ 検量線の作成
エストロン（Ｅ１）及びエストラジオール（Ｅ２）について、本発明の方法により測定を行う際の検量線を作成した。
【００３８】
１）検出イオンの決定
まず、Ｅ１−３−Ｏ−ピコノイルエステル誘導体のＭＳ測定を行ったところ、ｍ/ｚ３７６．１に前駆イオンが検出され、この前駆イオンについて更にＭＳ測定を行うと、ｍ/ｚ１５６．９にピークを示すスペクトルが得られた（図１及び図２）。したがって、Ｅ１−３−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体については検出イオンをｍ/ｚ１５６．９と決定した。
次に、Ｅ２−３，１７−Ｏ−ジピコリノイルエステル誘導体についてＭＳ測定を行うと、ｍ/ｚ４８３．５に前駆イオンが検出され、この前駆イオンついて更にＭＳ測定を行うと、ｍ/ｚ３６０．１、２６４．１にピークを示すスペクトルが得られた（図３及び図４）。したがって、Ｅ２−３，１７−Ｏ−ジピコリノイルエステル誘導体については、検出イオンをｍ/ｚ２６４．１と決定した。
【００３９】
２）検量線の作成
Ｅ１及びＥ２それぞれについて ０．２、１、５、２０、１００、５００ｐｇ／ｍＬの水溶液（０．１ｍｇ／ｍＬのアセトニトリル溶液より水で希釈したもの）を調製し、それぞれ１ｍＬを量り、内部標準物質（Ｅ１については１３Ｃ４ −Ｅ１、Ｅ２については１６，１６，１７−ｄ３−Ｅ２）各１００ｐｇを加え、さらにジエチルエーテル４ｍＬを加えて振り混ぜ、ジエチルエーテル層を分離後、窒素気流下でジエチルエーテルを留去した。この残留物にピコリノイルクロリド塩酸塩のアセトニトリル溶液（１→２０）０．１ｍＬ及びピリジン３０μＬを加えて振り混ぜた後、室温で１時間放置した。反応後、１％塩酸１ｍＬを加え、ジエチルエーテル４ｍＬを加えて振り混ぜ、ジエチルエーテル層を分離後、窒素気流下で留去した。残留物をアセトニトリル０．２５ｍＬに溶解し、水１ｍＬを加えて希釈後、Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８に負荷し、アセトニトリル溶液（３→１０）３ｍＬで洗浄し、更にアセトニトリル溶液（４→５）２．５ｍＬで溶出した。溶媒を遠心エバポレーターで留去した後、アセトニトリル溶液（２→５）０．１ｍＬに溶解した。この液２０μＬについてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った。
ＬＣ−ＭＳ/ＭＳの測定条件を、下表Ｂに示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
上記の測定によって得られたＥ１及びＥ２それぞれの値に基づき検量線を作成した。これを図５及び図６に示す。Ｅ１においては０．５〜５００ｐｇの範囲において相関係数１．００００、また、Ｅ２においては０．５〜５００ｐｇの範囲において相関係数１．００００とそれぞれ良好な直線性を示した。
【００４２】
実験例３ Ｅ１及びＥ２の定量限界の比較
１個所をピコリノイルエステル誘導体化した場合と、複数箇所をピコリノイルエステル誘導体化した場合の、それぞれのＬＣ−ＭＳによる測定感度を比較するため、３位にフェノール性水酸基を有するＥ１と３位にフェノール性水酸基及び１７位にアルコール性水酸基を有するＥ２を用いて、以下のとおり定量限界を求めた。
Ｅ１及びＥ２をそれぞれ０．２、０．５及び２０ｐｇ含む溶液について、実験例２における検量線作成におけるのと同様の方法で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った。具体的にはＥ１及びＥ２のＬＣ−ＭＳクロマトグラムにおける生成イオンのピーク面積をそれぞれ測定し、それらと内部標準物質とのピーク面積比を算出し、これを検量線の値と比較して、Ｅ１及びＥ２の量を求めた。結果を下表Ｃに示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
この結果、Ｅ１−３−ピコリノイルエステル誘導体及びＥ２−３，１７−ジピコリノイルエステル誘導体として検出したＥ１及びＥ２の定量限界は、真度及び精度より、それぞれ０．５及び０．２ｐｇであった。このことから、本願発明の方法によれば、複数箇所の水酸基がエステル化された場合であっても、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定感度が低下することはなかった。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４６】
実施例１ 健常女性血清中のＥ１及びＥ２の量の同時測定
実験例２で行った方法と同様の方法を用いて、健常女性血清１０例についてＥ１及びＥ２の量を測定した。
【００４７】
１−１試料の調製
健常女性血清０．５ｍＬを採取し、これに内部標準物質として１３Ｃ４−Ｅ１及び１６，１６，１７−ｄ3−Ｅ−２にそれぞれ１００ｐｇを加えた後、ジエチルエーテル４ｍＬを加えて振とうし、ジエチルエーテル層を分離し、窒素気流下で留去した。
【００４８】
１−２ ピコリノイルエステル誘導体化
前項１−１で得た残留物にピコリノイルクロリド塩酸塩のアセトニトリル溶液（１→２０）０．１ｍＬ及びピリジン３０μＬを加えて振り混ぜた後、室温で１時間放置した。反応後、１％塩酸１ｍＬを加え、ジエチルエーテル４ｍＬを加えて振とうし、エーテル層を分離後、窒素気流下で留去した。残留物をアセトニトリル０．２５ｍＬに溶解し、水１ｍＬを加えて希釈後、Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８に負荷し、アセトニトリル溶液（３→１０）３ｍＬで洗浄し、更にアセトニトリル溶液（４→５）２．５ｍＬで溶出した。溶出液を遠心エバポレーターで留去した後、アセトニトリル溶液（２→５）１００μＬに溶解し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。
【００４９】
１−３ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定
前項１−２で得たアセトニトリル溶液１００μＬのうち、その２０μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定に用いた。測定は、実験例２と同様に行った。そしてＥ１及びＥ２のＬＣ−ＭＳクロマトグラムにおける生成イオンのピーク面積をそれぞれ測定し、それらと内部標準物質とのピーク面積比を算出し、検量線と比較してＥ１及びＥ２濃度を求めた。その結果を、下表Ｄに示す。
【００５０】
【表４】
【００５１】
従来は、Ｅ１及びＥ２をそれぞれ別個に測定する必要があったが、本発明の方法によれば、１回の測定でＥ１及びＥ２を０．５〜５００ｐｇ／ｍＬの範囲で同時定量することができる。
【００５２】
実施例２ 健常男性血清及び唾液中のテストステロン（Ｔ）及びジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の同時測定
２−１ 検出イオンの決定
Ｔ−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体についてＭＳ測定を行うと、ｍ/ｚ３９４．４に前駆イオンが検出された。この前駆イオンについて更にＭＳ測定を行うと、ｍ/ｚ２５３．４にピークを示すスペクトルが得られた（図７及び図８）。したがってＴ−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体についての検出イオンをｍ／ｚ２５３．４に決定した。
一方、ＤＨＴ−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体についてＭＳ測定を行うと、ｍ／ｚ３９６．４に前駆イオンが検出された。この前駆イオンについて更にＭＳ測定を行うと、ｍ／ｚ２５５．４にピークを示すスペクトルが得られた(図９及び図１０)。したがって、ＤＨＴ−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体についての検出イオンをｍ／ｚ２５５．４に決定した。
【００５３】
２−２ 試料の調製
健常男性血清２００μＬに内部標準物質（１６，１６，１７−ｄ３−Ｔ 及び１６，１６，１７−ｄ３−ＤＨＴ）、ジエチルエーテル４ｍＬを加えて、室温で１０分間振とうした後、エーテル層を分離し、窒素気流中で留去した。
なお、唾液の場合は、１ｍＬを採取し、血清と同様に操作した。
【００５４】
２−３ ピコリノイルエステル誘導体化
前項２−２で得た残留物にピコリノイルクロリド塩酸塩のアセトニトリル溶液（１→４０）２００μＬ及びピリジン５０μＬを加えて振り混ぜた後、室温で９０分間放置した。反応後、水７５０μＬ及びジエチルエーテル５ｍＬを加えて１０分間振り混ぜた後、エーテル層を分離した。このエーテル層に更に水７５０μＬを加えて振り混ぜた後、エーテル層を分取し、窒素気流下で留去した。残留物をアセトニトリル２５０μＬに溶解し、Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８カラムに負荷し、水１ｍＬ、次いでアセトニトリル溶液（２→５）４ｍＬで洗浄後、アセトニトリル溶液（７→１０）３ｍＬで溶出した。溶媒を遠心エバポレーターにより留去した後、残留物をアセトニトリル／０．１％ギ酸混液（７：３）１００μＬに溶解した。
【００５５】
２−４ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定
前項２−３で得たアセトニトリル／０．１％ギ酸混合溶液１００μＬのうち、その２０μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定に用いた。下表ＥにＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定条件を示す。
【００５６】
【表５】
【００５７】
Ｔ及びＤＨＴのＬＣ−ＭＳクロマトグラムにおける生成イオンのピーク面積と内部標準物質のピーク面積をそれぞれ測定し、これらからピーク面積比を算出し、検量線と比較してそれぞれの濃度を求めた。その結果を、下表Ｆに示す。
【００５８】
【表６】
【００５９】
なお、上記Ｔ及びＤＨＴの濃度を求めるための検量線をそれぞれ図１１及び図１２に示す。検量線は、Ｔ及びＤＨＴそれぞれ、０．２、１．５、２０、１００、５００ｐｇ／ｍＬの水溶液（０．１ｍｇ／ｍＬアセトニトリル溶液より水で希釈したもの）を、並びに内部標準物質として、Ｔについては１６，１６，１７−ｄ３−Ｔを、またＤＨＴについては１６，１６，１７−ｄ３−ＤＨＴを各５００ｐｇ用い、実験例２と同様の方法により作成した。なおＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定は前記表Ｅに示す測定条件により行った。Ｔにおいては０〜５００ｐｇの範囲において相関係数０．９９９８、またＤＨＴにおいては０〜５００ｐｇの範囲において相関係数０．９９９０と、それぞれ良好な直線性を示した。
【００６０】
実施例３ ヒト前立腺組織中のテストステロン（Ｔ）及びジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の同時測定
３−１ 試料の調製
前立腺組織約５０ｍｇを精密に量った後、液体窒素により凍結、粉砕し、水４ｍＬを加えてホモジナイズした。ホモジネートした液５００μＬをとり、これに内部標準物質として１６，１６，１７−ｄ３−Ｔ 及び１６，１６，１７−ｄ３−ＤＨＴをそれぞれ５００ｐｇ並びにエタノール４ｍＬを加え、５５℃で３時間振とうした後、冷却遠心分離した。遠心分離後の上清を分取し、遠心エバポレーターにより溶媒を留去し、得られた残留物をメタノール２５０μＬに溶解後、水１ｍＬで希釈した。この液を、あらかじめメタノール６ｍＬ及び水６ｍＬで調製したＢｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８カラムに負荷し、アセトニトリル溶液（３→１０）２ｍＬで洗浄した後、アセトニトリル溶液（７→１０）２．５ｍＬで溶出した。そして、窒素気流中にて溶媒を留去した。
【００６１】
３−２ ピコリノイルエステル誘導体化及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定
実施例２−３及び２−４と同様にして、ピコリノイルエステル誘導体化及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、前立腺組織中のＴ及びＤＨＴの濃度を求めた。
その結果を、下表Ｇに示す。
【００６２】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の方法によれば、試料中のステロイドの有無を検出したり、ステロイドの量を測定したりすることができる。
本発明は、例えば、医学、生化学、公衆衛生、食品検査などの分野で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、エストロン−３−ピコリノイルエステル誘導体のマススペクトルである。特徴的な前駆イオンｍ／ｚ３７６．０のピークを確認することができる。
【図２】図２は、エストロン−３−ピコリノイルエステル誘導体の前駆イオンｍ／ｚ３７６．０からの生成イオンのスペクトルである。
【図３】図３は、エストラジオール−３，１７―ジピコリノイルエステル誘導体のマススペクトルである。特徴的な前駆イオンｍ／ｚ４８３．５のピークが確認できる。
【図４】図４は、エストラジオール−３，１７―ジピコリノイルエステル誘導体の前駆イオンｍ／ｚ４８３．５からの生成イオンのスペクトルである。
【図５】図５は、本発明の測定方法に用いるためのエストロン０〜５００ｐｇの検量線である。
【図６】図６は、本発明の測定方法に用いるためのエストラジオール０〜５００ｐｇの検量線である。
【図７】図７は、テストステロン―１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体のマススペクトルである。前駆イオンｍ/ｚ３９４．４のピークが確認できる。
【図８】図８は、テストステロン―１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体の前駆イオンｍ／ｚ３９４．４からの生成イオンのスペクトルである。
【図９】図９は、ジヒドロテストステロン―１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体のマススペクトルである。前駆イオンｍ／ｚ３９６．４のピークが確認できる。
【図１０】図１０は、ジヒドロテストステロン―１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体の前駆イオンｍ／ｚ３９６．４からの生成イオンのスペクトルである。
【図１１】図１１は、本発明の測定方法に用いるためのテストステロン０〜５００ｐｇの検量線である。
【図１２】図１２は、本発明の測定方法に用いるためのジヒドロテストステロン０〜５００ｐｇの検量線である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるステロイドをＬＣ−ＭＳを用いて測定する方法であって、
１）試料中のステロイドの水酸基に下記式
【化１】
［式中におけるＲはヒドロキシル基又は脱離基を表す。］
で示される化合物を反応させてエステル誘導体とする工程、
２）前記エステル誘導体を、ＬＣ−ＭＳを用いて測定する工程、
を含むことを特徴とする測定方法。
【請求項２】
請求項１の式（Ｉ）で示される化合物を含むことを特徴とする、ＬＣ−ＭＳを用いるステロイド測定用試薬。
【請求項１】
試料中に含まれるステロイドをＬＣ−ＭＳを用いて測定する方法であって、
１）試料中のステロイドの水酸基に下記式
【化１】
［式中におけるＲはヒドロキシル基又は脱離基を表す。］
で示される化合物を反応させてエステル誘導体とする工程、
２）前記エステル誘導体を、ＬＣ−ＭＳを用いて測定する工程、
を含むことを特徴とする測定方法。
【請求項２】
請求項１の式（Ｉ）で示される化合物を含むことを特徴とする、ＬＣ−ＭＳを用いるステロイド測定用試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００７−１３２７４１（Ｐ２００７−１３２７４１Ａ）
【公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３２４８５６（Ｐ２００５−３２４８５６）
【出願日】平成１７年１１月９日（２００５．１１．９）
【出願人】（０００００２９９０）あすか製薬株式会社 (39)
【出願人】（５０４１２５４５８）株式会社帝国臓器製薬メディカル (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月９日（２００５．１１．９）
【出願人】（０００００２９９０）あすか製薬株式会社 (39)
【出願人】（５０４１２５４５８）株式会社帝国臓器製薬メディカル (6)
【Ｆターム（参考）】
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