スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
【課題】試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、信頼性に優れる測定値が得られる測定方法を提供する。
【解決手段】前記酸化還元反応に先立ち、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を試料に添加して、前記試料中に含まれるヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の還元物質としての影響を排除し、その後、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質を発生させ、この量を酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定する。スルホン酸化合物としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ニトロ化合物としては、４−ニトロフェノール等が使用できる。
【解決手段】前記酸化還元反応に先立ち、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を試料に添加して、前記試料中に含まれるヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の還元物質としての影響を排除し、その後、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質を発生させ、この量を酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定する。スルホン酸化合物としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ニトロ化合物としては、４−ニトロフェノール等が使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、酸化還元反応を利用して、試料中の測定対象物の量を測定することは、広く実施されており、例えば、生化学分析や臨床検査等における糖化タンパク質の測定にも適用されている。
【０００３】
例えば、血液中の糖化タンパク質、特に赤血球中の糖化ヘモグロビンは、生体血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされている。このような赤血球中の糖化タンパク質は、前記酸化還元反応を用いて、例えば、以下に示すようにして測定されている。
【０００４】
まず、赤血球を溶血させた試料を調製し、この溶血試料をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）で処理し、前記ＦＡＯＤを糖化タンパク質の糖化部分に作用させて過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記糖化タンパク質量に対応する。そして、この試料に、さらに、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および酸化により発色する基質（発色基質）等を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記発色基質との間で酸化還元反応させる。この時、酸化によって前記酸化基質が発色するため、この発色を測定することによって前記過酸化水素量を測定でき、この結果、赤血球中の糖化タンパク質量を知ることができる。
【０００５】
しかし、血液中には、通常、アスコルビン酸（ＡｓＡ）、ビリルビン等の各種還元物質が存在し、さらに、赤血球中には、グルタチオン（ＧＳＨ）等の各種還元物質が存在する。これらの還元物質によって、例えば、前記過酸化水素が還元されたり、前記酸化還元反応が阻害されたり、前記還元剤が発色した後に還元され退色するおそれがある。このため、赤血球中の糖化タンパク質量を正確に測定することが困難であるという問題があった。
【０００６】
また、試料ごとによって、含まれる還元物質の濃度も一定ではないため、測定精度が劣るという問題もあった。
【０００７】
このような問題を回避するために、例えば、種々の酸化剤を前記試料に添加するという方法がある。例えば、特開昭５６−１５１３５８号公報（特許文献１）には、酸化剤としてヨウ素酸、過ヨウ素酸等のハロゲン酸化物を用いる方法が開示されており、特開昭５７−１３３５７号公報（特許文献２）、特開昭５７−１６１６５０号公報（特許文献３）、特開昭５９−１９３３５４号公報（特許文献４）、特開昭６２−１６９０５３号公報（特許文献５）、特開平３−３０６９７号公報（特許文献６）には、酸化剤としてコバルト、鉄、セリウム等の金属錯体を用いる方法が開示されている。
【特許文献１】特開昭５６−１５１３５８号公報
【特許文献２】特開昭５７−１３３５７号公報
【特許文献３】特開昭５７−１６１６５０号公報
【特許文献４】特開昭５９−１９３３５４号公報
【特許文献５】特開昭６２−１６９０５３号公報
【特許文献６】特開平３−３０６９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、これら従来の方法では、試料によっては測定精度が十分に向上しない場合もある。また、前述のように、血液中の糖化タンパク質は、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされているため、これを測定するための酸化還元反応を用いた測定方法においても、更なる測定精度の向上が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明の目的は、試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法であって、信頼性に優れる測定値が得られる測定方法の提供である。
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明の測定方法は、ヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物を含む試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法であって、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を前記試料に添加して、前記試料に含まれる前記ヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物の影響を排除することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明者らは、（ｉ）前記従来の方法では、前記ＡｓＡやＧＳＨのような低分子量還元物質の影響は排除されるが、タンパク質等のような高分子量還元物質による影響が排除されないこと、さらに、（ｉｉ）試料をテトラゾリウム化合物で処理すれば、前記低分子量還元物質だけでなく、前記高分子量還元物質、特にヘモグロビンやヘモグロビン分解物（以下、両者あわせて「ヘモグロビン」という）の酸化還元物質としての影響も排除できることを見出した。なお、これについて、本出願人は別途出願している。しかしながら、前記テトラゾリウム化合物は、溶解性が低いため、試料中に高濃度に含まれるヘモグロビンに対応させ難く、また、テトラゾリウム化合物自体が酸化力を有するため、酸化により発色する前記基質に作用して、誤発色を生じるおそれがあるという問題があった。そこで、本発明者らは、測定系に影響を与えずにヘモグロビンの影響を排除すべく、さらに鋭意研究を行った。その結果、試料をスルホン酸化合物やニトロ化合物で処理することによって、測定系に影響与えることなくヘモグロビンの影響を防止できることを見出し、本発明に到達した。このような本発明の測定方法によれば、よりいっそう高精度な測定が可能となるため、前述のような臨床医療等における各種検査に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
前述のように本発明の測定方法は、試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法であって、前記試料にスルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を添加することを特徴とし、これによって試料中に含まれるヘモグロビンの測定系に対する影響が排除される。
【００１３】
具体的には、前記酸化還元反応に先立ち、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を前記試料に添加して前記試料中のヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物の影響を排除し、その後、前記測定対象物由来の酸化物質または還元物質を発生させ、この量を酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定することが好ましい。
【００１４】
本発明において、ヘモグロビンの影響を排除するために添加する物質は、例えば、スルホン酸化合物およびニトロ化合物のいずれか一方でもよいが、より一層影響を排除できることから、前記両化合物を前記試料に添加することが好ましい。なお、スルホン酸化合物とニトロ化合物の両方を添加する場合、添加の順序は制限されず、両方を同時に添加してもよいし、別々に添加してもよい。
【００１５】
本発明において、前記スルホン酸化合物としては、例えば、
一般式 Ｒ−ＳＯ3Ｘ
で表わされる化合物が使用できる。前記式において、Ｘは、例えば、Ｎａ、Ｋ、Ｌｉ、Ｈ等であり、Ｒは、疎水基であることが好ましく、例えば、ＣＨ3（ＣＨ2）n−、ＣＨ3（ＣＨ2）n−Ｃ6Ｈ4−、Ｃ6Ｈ5−、Ｃ6Ｈ5−Ｎ＝Ｎ−Ｃ6Ｈ4−、Ｃ6Ｈ5−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ6Ｈ4−等があげられる。前記Ｒにおけるｎは、例えば、１〜２０の範囲である。なお、前記Ｒにおいて、「Ｈ」は、アシル基、ニトロ基、ニトロソ基、フェニル基、アルキル基、アルキルエーテル基等で置換されてもよい。
【００１６】
前記スルホン酸化合物の具体例としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（以下、「ＳＬＳ」という）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（以下、「ＳＤＢＳ」という）、ラウリル硫酸リチウム（以下、「ＬｉＬＳ」という）、４−アミノアゾベンゼン−４’−スルホン酸ナトリウム（以下、「ＡＢＳＡ」という）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（以下、「ＡＮＤＳ」という）、４，４’−ジアゾスチルベンゼン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（以下、「ＤＡＤＳ」という）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−２−ハイドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、バソフェナントロリンスルホン酸等が使用でき、より好ましくは、ＳＬＳ、ＳＤＢＳ、ＬｉＬＳである。
【００１７】
本発明において、前記ニトロ化合物としては、特に制限されないが、例えば、ニトロベンゼン化合物やジニトロベンゼン化合物等があげられる。これらの化合物は、ベンゼン環が、ニトロ基の他に、例えば、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ3、−（ＣＨ2）nＣＨ3（ｎ＝２〜９）等の置換基を有することが好ましく、これらの中でも親水基を置換基として有することが好ましい。前記置換基としては、例えば、ハロゲン基、エーテル基、フェニル基などがあげられる。
【００１８】
前記ニトロ化合物の具体例としては、例えば、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）、２，５−ジニトロフェニル、２，６−ジニトロフェニル、４，６−ジニトロ−２−メチルフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）、２，４−ジニトロアニリン（２，４−ＤＮＡ）、ｐ−ニトロアニリン（ｐ−ＮＡ）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ2）、亜硝酸カリウム（ＫＮＯ2）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（以下、「ＡＮＰＳ」という）、ニトロベンゼン等が使用できる。
【００１９】
また、スルホン酸化合物とニトロ化合物とを併用する場合、これらの組み合せは特に制限されない。
【００２０】
これらのスルホン酸化合物やニトロ化合物は、例えば、前述のようなテトラゾリウム化合物に比べて溶解性に優れるため、試料中のヘモグロビン濃度が高濃度であっても処理が容易であり、また、コストの面でも低価格であるため、非常に有用である。
【００２１】
本発明の測定方法において、前記スルホン酸化合物やニトロ化合物の添加量は、特に制限されず、例えば、試料の種類、前記試料に含まれるヘモグロビンの量やその他の還元物資の量等などによって適宜決定できる。具体的な例を以下に示す。
【００２２】
スルホン酸化合物およびニトロ化合物のいずれか一方を添加する場合は、例えば、試料１μｌ当たり、いずれかの化合物を、０．０１〜１０００μｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０３〜２００μｍｏｌの範囲、特に好ましくは、０．０５〜４０μｍｏｌの範囲である。
【００２３】
また、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の両方を添加する場合は、例えば、試料１μｌ当たり、前記スルホン酸化合物０．００５〜２０μｍｏｌの範囲、ニトロ化合物０．００５〜２５μｍｏｌの範囲で添加することが好ましく、より好ましくはスルホン酸化合物０．０２〜４μｍｏｌの範囲、ニトロ化合物０．０１〜５μｍｏｌの範囲である。
【００２４】
本発明において、前記酸化還元反応は、酸化酵素により、前記測定対象物由来の酸化物質を還元し、かつ、酸化により発色する基質（発色基質）を酸化させる発色反応であり、前記酸化物質の量の測定が、前記発色反応による発色の程度の測定であることが好ましい。前記発色程度の測定は、例えば、前記基質の検出波長における吸光度測定によって行うことができる。
【００２５】
前記発色基質としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（以下、「ＤＡ−６４」という）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとの組み合せ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’，−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン ヘキサソディウム塩（以下、「ＴＰＭ−ＰＳ」という）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４，４’、４’’−トリアミノトリフェニルメタン ヘキサソディウム塩（以下、「ＴＰＭ−ＯＳ」という）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩（以下、「ＤＡ−６７」という）、１０−（メチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（以下、「ＭＣＤＰ」という）、１０−（カルボキシアミノメチル−４−ベンゾアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩（以下、「ＭＭＸ」という）等が使用できる。これらの中でも、例えば、ＴＰＭ−ＰＳ、ＴＰＭ−ＯＳ等のトリフェニルメタン系の発色基質が好ましく、その中でも特にトリアミノトリフェニルメタン系の発色基質が好ましい。
【００２６】
前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記トリンダー試薬と組み合わせる化合物としては、前記４−アミノアンチピリンの他に、例えば、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。
【００２７】
以上に例示する発色基質は、通常、４００ｎｍ以上に吸収を持つため、同様に４００ｎｍに吸収を持つ前述のようなテトラゾリウム化合物を使用した場合、テトラゾリウム化合物の存在によって測定値に誤差が生じるおそれがあった。しかし、例示した前記スルホン酸化合物やニトロ化合物は、４００ｎｍ以上に吸収を持たないため、これらの発色基質と共に使用しても、吸光度測定において誤差が生じるおそれがない。
【００２８】
また、これらの発色基質と、前記スルホン酸化合物およびニトロ化合物との組み合せは、特に制限されないが、発色反応が精度良く行われることから、例えば、以下の組み合せが好ましい。なお、この発色基質と、スルホン酸化合物およびニトロ化合物との組み合せに応じて、発色反応の精度向上が見られることの理由は不明である。
【００２９】
前記発色基質が、ＤＡ−６４、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとの組み合せ等の場合、前記スルホン酸化合物およびニトロ化合物の両方を前記試料に添加することが好ましく、例えば、前記スルホン酸化合物としては、ＳＬＳ、ＳＤＢＳ、ＬｉＬＳを、ニトロ化合物としては２，４−ＤＮＡ、２，４−ＤＮＰ、ＰＮＡ、ＰＮＰを使用することが好ましい。
【００３０】
一方、前記発色基質が、ＴＰＭ−ＰＳ、ＴＰＭ−ＯＳ、ＤＡ−６７、ＭＣＤＰ、ＭＭＸ等の場合、スルホン酸化合物を前記試料に添加することが好ましく、より好ましくは、スルホン酸化合物とニトロ化合物の両方を添加する。
【００３１】
本発明において、前記測定対象物由来の酸化物質は、過酸化水素であることが好ましく、前記酸化酵素は、ペルオキシダーゼであることが好ましい。
【００３２】
本発明の測定方法において、前記測定試料は、特に制限されないが、全血、血漿、血清、血球等の血液試料の他に、例えば、尿、髄液、唾液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等もあげられる。
【００３３】
本発明の測定方法において、前記測定対象物は、酸化還元反応を利用するものであれば特に制限されないが、例えば、全血中成分、赤血球内成分、血漿中成分、血清中成分等もがあげられ、好ましくは赤血球内成分である。また、具体的には、例えば、糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、尿酸、コレステロール、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられ、より好ましくは糖化タンパク質である。例えば、前記赤血球成分を測定する場合、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。
【００３４】
本発明の測定方法において、前記測定対象物が糖化タンパク質の場合、前記糖化タンパク質にＦＡＯＤを作用させることによって、前記測定対象物由来の酸化合物物質として過酸化水素を発生させることが好ましい。前記糖化タンパク質の糖化部分がＦＡＯＤで酸化分解され、過酸化水素が生成するのである。また、前記糖化ペプチド、糖化アミノ酸等の糖化アミンも、同様にＦＡＯＤを作用させることが好ましい。なお、前記糖化タンパク質や糖化ペプチドは、必要に応じて、前記ＦＡＯＤ処理前に、プロテアーゼ処理することが好ましい。
【００３５】
前記ＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
【００３６】
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2 ＋ Ｈ2Ｏ ＋ Ｏ2
→Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ2−Ｒ2 ＋ Ｈ2Ｏ2 ．．．（１）
前記式（１）において、Ｒ1は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（Ｒ1）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ1）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ1）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］n−ＣＨ2ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
【００３７】
前記式（１）において、Ｒ2は、特に制限されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
【００３８】
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ2は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ3−ＣＯ−Ｒ4 ．．．（２）
前記式（２）において、Ｒ3はアミノ酸側鎖基を示す。また、Ｒ4は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ ．．．（３）
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ2は下記式（４）で示すことができる。
−Ｒ5−ＣＨ（ＮＨ− Ｒ6）−ＣＯ−Ｒ7 ・・・（４）
前記式（４）において、Ｒ5は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ5は
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ5は、
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ2）−
である。
【００３９】
また、前記式（４）において、Ｒ6は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＣＯ−ＣＨＲ3−ＮＨ）n−Ｈ ．．．（５）
また、前記式（４）において、Ｒ7は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ ．．．（６）
（実施形態１）
つぎに、本発明の測定方法について、血球中の糖化タンパク質を測定する例をあげて説明する。
【００４０】
まず、全血をそのまま溶血し、または全血から遠心分離等の常法により血球画分を分離してこれを溶血し、溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。
【００４１】
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニル エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキル エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン アルキル エーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．０１〜５重量％となるように前記界面活性剤を添加し、室温で、数秒（約５秒）〜１０分程度攪拌すればよい。
【００４２】
つぎに、前記溶血試料に対して、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を添加し、前記溶血試料の前処理を行う。
【００４３】
前記スルホン酸化合物とニトロ化合物は、いずれか一方でもよいし、両方を添加してもよいが、前述のように後の工程で使用する発色基質の種類によって、適宜決定することが好ましい。
【００４４】
スルホン酸化合物およびニトロ化合物のいずれか一方を添加する場合、その添加量は特に制限されず、前述の添加割合があげられる。具体的には、この前処理溶液中の血球濃度が１体積％の場合、例えば、ニトロ化合物の濃度が０．０５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．２〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、この前処理溶液中の血球濃度が１体積％の場合、例えば、スルホン酸化合物の濃度が０．０５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．２〜４０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【００４５】
また、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の両方を試料に添加する場合も、その添加量は特に制限されず、例えば、前述の添加割合があげられる。具体的には、この前処理溶液中の血球濃度が、１体積％の場合、例えば、スルホン酸化合物濃度０．０５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ、ニトロ化合物濃度０．０５〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくはスルホン酸化合物濃度０．２〜４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ニトロ化合物濃度０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。このようにスルホン酸化合物とニトロ化合物との両方を添加する場合、前述のように、いずれを先に添加してもよいし、また同時に添加してもよい。
【００４６】
前記スルホン酸化合物およびニトロ化合物は、そのまま使用してもよいが、操作の簡便性や処理効率等の点から、溶媒に溶解したスルホン酸化合物溶液またはニトロ化合物溶液として使用することが好ましい。前記各溶液の濃度は、その種類等により適宜決定でき、例えば、スルホン酸化合物溶液は、５〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは５〜４００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、ニトロ化合物溶液は、０．５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。前記溶媒としては、例えば、蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が使用でき、前記緩衝液としては、例えば、後述の緩衝液等が使用できる。なお、前記両化合物は、それぞれ一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００４７】
この前処理は、通常、緩衝液中で行われる。前記緩衝液としては、例えば、アミン系緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ならびにＭＯＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳおよびＣＡＰＳＯ等のグッド緩衝液等が使用できる。前記アミン系緩衝液の緩衝剤としては、例えば、グリシン、エチルアミン、ジエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリスヒドロキシアミノメタン、トリエタノールアミン、グリシンアミド等があげられる。
【００４８】
前記緩衝液のｐＨは、ｐＨ７〜１２の範囲が好ましく、より好ましくはｐＨ８〜１１の範囲であり、特に好ましくはｐＨ８〜１０の範囲である。
【００４９】
この前処理の条件は、特に制限されないが、通常、温度１０〜３７℃の範囲であり、処理時間１０秒〜６０分の範囲である。
【００５０】
なお、この前処理に使用するスルホン酸化合物として、前述のようなラウリル硫酸ナトリウム等を使用する場合は、これ自身が界面活性剤としての作用を奏するため、例えば、前述のような溶血処理と、この前処理とを同じ物質（ラウリル硫酸ナトリウム等）の添加によって、同時に行うことが可能である。
【００５１】
つぎに、この前処理済み溶血試料に対し、プロテアーゼ処理を行う。これは、後の処理に使用するＦＡＯＤを測定対象物に作用し易くするためである。
【００５２】
前記プロテアーゼの種類は、特に制限されず、例えば、プロテアーゼＫ、ズブチリシン、トリプシン、アミノペプチダーゼ、メタロプロテアーゼ等が使用できる。プロテアーゼ処理の条件は、使用するプロテアーゼの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００５３】
具体的には、例えば、前記プロテアーゼとしてプロテアーゼＫを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度１０〜３０，０００ｍｇ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。このプロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われる。前記緩衝液としては、例えば、前記前処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００５４】
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた分解物を、前記ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理により、前記式（１）に示す反応が触媒される。
【００５５】
このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましい。その処理条件は、使用するＦＡＯＤの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００５６】
具体的には、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５０〜５０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜６０分、ｐＨ６〜９の範囲である。前記緩衝液の種類も特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００５７】
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理で生成した過酸化水素を、ＰＯＤおよび前記発色基質を用いて酸化還元反応により測定する。
【００５８】
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１０〜１００，０００ＩＵ／Ｌ、発色性基質濃度０．００５〜３０ｍｍｏｌ／ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間０．１〜３０分、ｐＨ５〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
【００５９】
前記酸化還元反応において、例えば、前記発色性基質を用いた場合、前記反応液の発色程度（吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の量を測定できる。そして、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて、試料中の糖化タンパク質量を求めることができる。
【００６０】
なお、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
【００６１】
この測定方法において、前記スルホン酸化合物やニトロ化合物による前処理工程は、前述のように、酸化還元反応が実質的に生じる前であれば、特に制限されないが、前記ＦＡＯＤ処理後に過酸化水素が発生することから、前記ＦＡＯＤ処理前に行うことが好ましい。また、各処理工程は、前述のように別々に行ってもよいが、例えば、以下に示すような組み合せで同時に行ってもよい処理工程がある。
【００６２】
１：溶血処理＋前処理
２：溶血処理＋前処理＋プロテアーゼ処理
３：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
４：ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ酸化還元処理
５：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ酸化還元処理
また、スルホン酸化合物やニトロ化合物の添加順序や、前記ＦＡＯＤ、ＰＯＤおよび発色性基質の添加順序も特に制限されない。
【００６３】
このような方法によれば、前記試料にスルホン酸化合物やニトロ化合物を接触させることにより、ＧＳＨ、ＡｓＡ、ジチオスレイトール、システイン、Ｎ−アセチル−システイン等の低分子量還元物質だけでなく、特にヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の還元物質としての影響を十分に排除することができる。このため、例えば、酸化還元反応反応や吸光度測定になんら影響与えることなく、高精度で測定を行うことができる。
【００６４】
また、本発明の測定方法の前記前処理工程において、例えば、前記スルホン酸化合物やニトロ化の他に、さらに酸化剤や酵素を併用してもよい。前記酸化剤としては、例えば、ヨード酢酸ナトリウム、ヨウ素酸、過ヨウ素酸等のハロゲン酸化物、ＥＤＴＡ−Ｆｅ等があげられ、酵素としては、例えば、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ等が使用できる。このような酸化剤の添加量は、例えば、試料１μｌ当たり０．００１〜０．１ｍｇの範囲である。
【００６５】
本発明の測定方法において、測定対象物は、酸化還元反応を利用するものであれば、特に制限されず、前記糖化タンパク質の他に、前述のように、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、コレステロール、尿酸、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられる。
【００６６】
過酸化水素を発生させて、前記各測定対象物の量を測定する場合は、例えば、前記グルコースにはグルコースオキシダーゼを、前記コレステロールにはコレステロールオキシダーゼを、前記尿酸にはウリカーゼを、前記クレアチニンにはサルコシンオキシダーゼを、前記サルコシンにはサルコシンオキシダーゼを、前記グリセロールにはグリセロールオキシダーゼを、それぞれ作用させて過酸化水素を発生させればよい。この過酸化水素量の測定方法は、前述と同様にして行うことができる。また、糖化ペプチド、糖化アミノ酸は、例えば、前記糖化タンパク質の測定と同様にして測定できる。
【００６７】
また、前記スルホン酸化合物やニトロ化合物による試料中のヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の処理後、測定対象物由来の還元物質を発生させ、この量を酸化還元反応により測定し、この測定値から、前記測定対象物の量を決定する場合は、例えば、以下に示すようにして測定を行うことができる。
【００６８】
例えば、前記測定対象物がグルコースの場合、例えば、ＮＡＤ+やＮＡＤＰ+等の存在下、グルコースデヒドロゲナーゼを用いて、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ等の還元物質を発生させる。そして、前記測定対象物由来の還元物質であるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを、例えば、ジアホラーゼと、還元により発色する基質とを用いて、酸化還元反応により測定する。そして、前述のように、この測定対象物由来の還元物質の濃度と検量線等とを用いて、試料中の測定対象物の量を求めることができる。また、例えば、測定対象物がコレステロールの場合はコレステロールデヒドロゲナーゼを、サルコシンの場合は、サルコシンデヒドロゲナーゼをそれぞれ使用できる。
【００６９】
前記還元により発色する基質としては、特に制限されないが、例えば、前記発色性のテトラゾリウム化合物や、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール等が使用できる。
【００７０】
実施例
つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。
（実施例１）
この実施例は、発色性基質としてＴＰＭ−ＰＳを使用して、フルクトシルバリン（以下、「ＦＶ」という）を含むヘモグロビン試料を、スルホン酸化合物およびニトロ化合物で処理し、ＦＶ量を測定した例である。以下に、使用した試料、試薬および方法を示す。
【００７１】
（測定試料の調製）
ヘモグロビン凍結品を精製水で溶解し、５０ｇ／Ｌのヘモグロビン溶液を調製した。一方、ＦＶを、特開平２−６９６４４号公報にしたがって製造し、これを精製水に溶解して１ｍＭのＦＶ溶液を調製した。そして、前記ヘモグロビン溶液３７μｌ、ＦＶ溶液６０μｌおよび精製水２０３μｌを混合して、測定試料とした。
【００７２】
【化１】
【００７３】
前記第１試薬のスルホン酸化合物としては、ＳＬＳ（ナカライテスク社製）、ＳＤＢＳ（和光純薬社製）、ＡＢＳＡ（東京化成社製）、ＡＮＤＳ（東京化成社製）、ＤＡＤＳ（東京化成社製）をそれぞれ使用した。
【００７４】
【化２】
【００７５】
【化３】
【００７６】
（方法）
前記測定試料０．１４μＬに前記第１試薬８．２６μＬを添加した後、さらに、前記第２試薬７５．６μＬを混合して、３７℃で５分間放置した。そして、この混合液に前記第３試薬１８．９μＬを混合し、３７℃でインキュベートして発色反応を行った。そして、５分後の吸光度を商品名ＪＣＡ−ＢＭ８（日本電子社製）で測定した。測定波長は、主波長５７１ｎｍ、副波長８０５ｎｍとした。一方、比較例としては、第１試薬のスルホン酸化合物、第２試薬のニトロ化合物を添加してない以外は、前記実施例と同様にして吸光度の測定を行った。なお、試料に第１試薬および第２試薬を混合した時点での、試料１μＬに対するスルホン酸化合物の添加量は、０．１８９μｍｏｌ、０．３７８μｍｏｌ、０．７５５μｍｏｌであり、ニトロ化合物の添加量は、３．４６μｍｏｌであった。
【００７７】
【表１】
【００７８】
前記表１に示すように、実施例１のように、各種スルホン酸化合物またはこれらとニトロ化合物との併用によって、比較例に比べて、試料中のＦＶ量を示す吸光度が増加した。この結果から、本実施例によれば、前記スルホン酸化合物およびニトロ化合物によって、試料中のヘモグロビンの影響が排除されたことがわかる。
【００７９】
（実施例２）
この実施例は、発色性基質としてＤＡ−６４を使用して、ＦＶを含むヘモグロビン試料を、スルホン酸化合物およびニトロ化合物で処理し、ＦＶ量を測定した例である。以下に、使用した試料、試薬および方法を示す。
【００８０】
（測定試料の調製）
前記実施例１において調製したヘモグロビン溶液６０μＬと、前記ＦＶ溶液３７μＬおよび精製水２０３μＬを混合して、測定試料とした。
【００８１】
【化４】
【００８２】
【化５】
【００８３】
前記ニトロ化合物としては、２，４−ＤＮＡ（和光純薬工業社製）、ｐ−ＮＡ（和光純薬工業社製）、ｐ−ＮＰ（和光純薬工業社製）、ＮａＮＯ2（ナカライテスク社製）、２，４−ＤＮＨ（和光純薬工業社製）をそれぞれ使用した。なお、ニトロ化合物を二種類添加する場合は、それぞれ０．９ｍＭとし、合計１．８ｍＭとした。
【００８４】
【化６】
【００８５】
（方法）
前記測定試料０．１４μＬに前記第１試薬８．２６μＬを添加した後、さらに、前記第２試薬７５．６μＬを混合して、３７℃で５分間放置した。そして、この混合液に前記第３試薬１８．９μＬを混合し、３７℃でインキュベートして発色反応を行った。そして、５分後の吸光度を商品名ＪＣＡ−ＢＭ８（日本電子社製）で測定した。測定波長は、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍとした。一方、比較例としては、第１試薬のスルホン酸化合物、第２試薬のニトロ化合物を添加してない以外は、前記実施例と同様にして吸光度の測定を行った。これらの結果を下記表２に示す。
【００８６】
【表２】
【００８７】
前記表２に示すように、実施例２は、スルホン酸化合物および各種ニトロ化合物の併用によって、比較例に比べて、試料中のＦＶ量を示す吸光度が増加した。さらに、ニトロ化合物を二倍量添加することによって、より一層吸光度が増加した。これらの結果から、本実施例によれば、前記スルホン酸化合物およびニトロ化合物によって、試料中のヘモグロビンの影響が排除されたことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
以上のように、本発明の測定方法は、前記スルホン酸化合物やニトロ化合物を試料に添加することにより、試料中のヘモグロビンの還元物質としての影響を排除できるため、信頼性に優れた測定を行うことができる。したがって、本発明の測定方法は、例えば、臨床医療における各種分析に適用でき、特に、糖尿病診断において重要である、赤血球中の糖化ヘモグロビン等の糖化タンパク質の測定に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、酸化還元反応を利用して、試料中の測定対象物の量を測定することは、広く実施されており、例えば、生化学分析や臨床検査等における糖化タンパク質の測定にも適用されている。
【０００３】
例えば、血液中の糖化タンパク質、特に赤血球中の糖化ヘモグロビンは、生体血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされている。このような赤血球中の糖化タンパク質は、前記酸化還元反応を用いて、例えば、以下に示すようにして測定されている。
【０００４】
まず、赤血球を溶血させた試料を調製し、この溶血試料をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）で処理し、前記ＦＡＯＤを糖化タンパク質の糖化部分に作用させて過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記糖化タンパク質量に対応する。そして、この試料に、さらに、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および酸化により発色する基質（発色基質）等を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記発色基質との間で酸化還元反応させる。この時、酸化によって前記酸化基質が発色するため、この発色を測定することによって前記過酸化水素量を測定でき、この結果、赤血球中の糖化タンパク質量を知ることができる。
【０００５】
しかし、血液中には、通常、アスコルビン酸（ＡｓＡ）、ビリルビン等の各種還元物質が存在し、さらに、赤血球中には、グルタチオン（ＧＳＨ）等の各種還元物質が存在する。これらの還元物質によって、例えば、前記過酸化水素が還元されたり、前記酸化還元反応が阻害されたり、前記還元剤が発色した後に還元され退色するおそれがある。このため、赤血球中の糖化タンパク質量を正確に測定することが困難であるという問題があった。
【０００６】
また、試料ごとによって、含まれる還元物質の濃度も一定ではないため、測定精度が劣るという問題もあった。
【０００７】
このような問題を回避するために、例えば、種々の酸化剤を前記試料に添加するという方法がある。例えば、特開昭５６−１５１３５８号公報（特許文献１）には、酸化剤としてヨウ素酸、過ヨウ素酸等のハロゲン酸化物を用いる方法が開示されており、特開昭５７−１３３５７号公報（特許文献２）、特開昭５７−１６１６５０号公報（特許文献３）、特開昭５９−１９３３５４号公報（特許文献４）、特開昭６２−１６９０５３号公報（特許文献５）、特開平３−３０６９７号公報（特許文献６）には、酸化剤としてコバルト、鉄、セリウム等の金属錯体を用いる方法が開示されている。
【特許文献１】特開昭５６−１５１３５８号公報
【特許文献２】特開昭５７−１３３５７号公報
【特許文献３】特開昭５７−１６１６５０号公報
【特許文献４】特開昭５９−１９３３５４号公報
【特許文献５】特開昭６２−１６９０５３号公報
【特許文献６】特開平３−３０６９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、これら従来の方法では、試料によっては測定精度が十分に向上しない場合もある。また、前述のように、血液中の糖化タンパク質は、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされているため、これを測定するための酸化還元反応を用いた測定方法においても、更なる測定精度の向上が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明の目的は、試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法であって、信頼性に優れる測定値が得られる測定方法の提供である。
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明の測定方法は、ヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物を含む試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法であって、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を前記試料に添加して、前記試料に含まれる前記ヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物の影響を排除することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明者らは、（ｉ）前記従来の方法では、前記ＡｓＡやＧＳＨのような低分子量還元物質の影響は排除されるが、タンパク質等のような高分子量還元物質による影響が排除されないこと、さらに、（ｉｉ）試料をテトラゾリウム化合物で処理すれば、前記低分子量還元物質だけでなく、前記高分子量還元物質、特にヘモグロビンやヘモグロビン分解物（以下、両者あわせて「ヘモグロビン」という）の酸化還元物質としての影響も排除できることを見出した。なお、これについて、本出願人は別途出願している。しかしながら、前記テトラゾリウム化合物は、溶解性が低いため、試料中に高濃度に含まれるヘモグロビンに対応させ難く、また、テトラゾリウム化合物自体が酸化力を有するため、酸化により発色する前記基質に作用して、誤発色を生じるおそれがあるという問題があった。そこで、本発明者らは、測定系に影響を与えずにヘモグロビンの影響を排除すべく、さらに鋭意研究を行った。その結果、試料をスルホン酸化合物やニトロ化合物で処理することによって、測定系に影響与えることなくヘモグロビンの影響を防止できることを見出し、本発明に到達した。このような本発明の測定方法によれば、よりいっそう高精度な測定が可能となるため、前述のような臨床医療等における各種検査に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
前述のように本発明の測定方法は、試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法であって、前記試料にスルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を添加することを特徴とし、これによって試料中に含まれるヘモグロビンの測定系に対する影響が排除される。
【００１３】
具体的には、前記酸化還元反応に先立ち、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を前記試料に添加して前記試料中のヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物の影響を排除し、その後、前記測定対象物由来の酸化物質または還元物質を発生させ、この量を酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定することが好ましい。
【００１４】
本発明において、ヘモグロビンの影響を排除するために添加する物質は、例えば、スルホン酸化合物およびニトロ化合物のいずれか一方でもよいが、より一層影響を排除できることから、前記両化合物を前記試料に添加することが好ましい。なお、スルホン酸化合物とニトロ化合物の両方を添加する場合、添加の順序は制限されず、両方を同時に添加してもよいし、別々に添加してもよい。
【００１５】
本発明において、前記スルホン酸化合物としては、例えば、
一般式 Ｒ−ＳＯ3Ｘ
で表わされる化合物が使用できる。前記式において、Ｘは、例えば、Ｎａ、Ｋ、Ｌｉ、Ｈ等であり、Ｒは、疎水基であることが好ましく、例えば、ＣＨ3（ＣＨ2）n−、ＣＨ3（ＣＨ2）n−Ｃ6Ｈ4−、Ｃ6Ｈ5−、Ｃ6Ｈ5−Ｎ＝Ｎ−Ｃ6Ｈ4−、Ｃ6Ｈ5−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ6Ｈ4−等があげられる。前記Ｒにおけるｎは、例えば、１〜２０の範囲である。なお、前記Ｒにおいて、「Ｈ」は、アシル基、ニトロ基、ニトロソ基、フェニル基、アルキル基、アルキルエーテル基等で置換されてもよい。
【００１６】
前記スルホン酸化合物の具体例としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（以下、「ＳＬＳ」という）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（以下、「ＳＤＢＳ」という）、ラウリル硫酸リチウム（以下、「ＬｉＬＳ」という）、４−アミノアゾベンゼン−４’−スルホン酸ナトリウム（以下、「ＡＢＳＡ」という）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（以下、「ＡＮＤＳ」という）、４，４’−ジアゾスチルベンゼン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（以下、「ＤＡＤＳ」という）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−２−ハイドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、バソフェナントロリンスルホン酸等が使用でき、より好ましくは、ＳＬＳ、ＳＤＢＳ、ＬｉＬＳである。
【００１７】
本発明において、前記ニトロ化合物としては、特に制限されないが、例えば、ニトロベンゼン化合物やジニトロベンゼン化合物等があげられる。これらの化合物は、ベンゼン環が、ニトロ基の他に、例えば、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ3、−（ＣＨ2）nＣＨ3（ｎ＝２〜９）等の置換基を有することが好ましく、これらの中でも親水基を置換基として有することが好ましい。前記置換基としては、例えば、ハロゲン基、エーテル基、フェニル基などがあげられる。
【００１８】
前記ニトロ化合物の具体例としては、例えば、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）、２，５−ジニトロフェニル、２，６−ジニトロフェニル、４，６−ジニトロ−２−メチルフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）、２，４−ジニトロアニリン（２，４−ＤＮＡ）、ｐ−ニトロアニリン（ｐ−ＮＡ）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ2）、亜硝酸カリウム（ＫＮＯ2）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（以下、「ＡＮＰＳ」という）、ニトロベンゼン等が使用できる。
【００１９】
また、スルホン酸化合物とニトロ化合物とを併用する場合、これらの組み合せは特に制限されない。
【００２０】
これらのスルホン酸化合物やニトロ化合物は、例えば、前述のようなテトラゾリウム化合物に比べて溶解性に優れるため、試料中のヘモグロビン濃度が高濃度であっても処理が容易であり、また、コストの面でも低価格であるため、非常に有用である。
【００２１】
本発明の測定方法において、前記スルホン酸化合物やニトロ化合物の添加量は、特に制限されず、例えば、試料の種類、前記試料に含まれるヘモグロビンの量やその他の還元物資の量等などによって適宜決定できる。具体的な例を以下に示す。
【００２２】
スルホン酸化合物およびニトロ化合物のいずれか一方を添加する場合は、例えば、試料１μｌ当たり、いずれかの化合物を、０．０１〜１０００μｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０３〜２００μｍｏｌの範囲、特に好ましくは、０．０５〜４０μｍｏｌの範囲である。
【００２３】
また、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の両方を添加する場合は、例えば、試料１μｌ当たり、前記スルホン酸化合物０．００５〜２０μｍｏｌの範囲、ニトロ化合物０．００５〜２５μｍｏｌの範囲で添加することが好ましく、より好ましくはスルホン酸化合物０．０２〜４μｍｏｌの範囲、ニトロ化合物０．０１〜５μｍｏｌの範囲である。
【００２４】
本発明において、前記酸化還元反応は、酸化酵素により、前記測定対象物由来の酸化物質を還元し、かつ、酸化により発色する基質（発色基質）を酸化させる発色反応であり、前記酸化物質の量の測定が、前記発色反応による発色の程度の測定であることが好ましい。前記発色程度の測定は、例えば、前記基質の検出波長における吸光度測定によって行うことができる。
【００２５】
前記発色基質としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（以下、「ＤＡ−６４」という）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとの組み合せ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’，−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン ヘキサソディウム塩（以下、「ＴＰＭ−ＰＳ」という）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４，４’、４’’−トリアミノトリフェニルメタン ヘキサソディウム塩（以下、「ＴＰＭ−ＯＳ」という）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩（以下、「ＤＡ−６７」という）、１０−（メチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（以下、「ＭＣＤＰ」という）、１０−（カルボキシアミノメチル−４−ベンゾアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩（以下、「ＭＭＸ」という）等が使用できる。これらの中でも、例えば、ＴＰＭ−ＰＳ、ＴＰＭ−ＯＳ等のトリフェニルメタン系の発色基質が好ましく、その中でも特にトリアミノトリフェニルメタン系の発色基質が好ましい。
【００２６】
前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記トリンダー試薬と組み合わせる化合物としては、前記４−アミノアンチピリンの他に、例えば、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。
【００２７】
以上に例示する発色基質は、通常、４００ｎｍ以上に吸収を持つため、同様に４００ｎｍに吸収を持つ前述のようなテトラゾリウム化合物を使用した場合、テトラゾリウム化合物の存在によって測定値に誤差が生じるおそれがあった。しかし、例示した前記スルホン酸化合物やニトロ化合物は、４００ｎｍ以上に吸収を持たないため、これらの発色基質と共に使用しても、吸光度測定において誤差が生じるおそれがない。
【００２８】
また、これらの発色基質と、前記スルホン酸化合物およびニトロ化合物との組み合せは、特に制限されないが、発色反応が精度良く行われることから、例えば、以下の組み合せが好ましい。なお、この発色基質と、スルホン酸化合物およびニトロ化合物との組み合せに応じて、発色反応の精度向上が見られることの理由は不明である。
【００２９】
前記発色基質が、ＤＡ−６４、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとの組み合せ等の場合、前記スルホン酸化合物およびニトロ化合物の両方を前記試料に添加することが好ましく、例えば、前記スルホン酸化合物としては、ＳＬＳ、ＳＤＢＳ、ＬｉＬＳを、ニトロ化合物としては２，４−ＤＮＡ、２，４−ＤＮＰ、ＰＮＡ、ＰＮＰを使用することが好ましい。
【００３０】
一方、前記発色基質が、ＴＰＭ−ＰＳ、ＴＰＭ−ＯＳ、ＤＡ−６７、ＭＣＤＰ、ＭＭＸ等の場合、スルホン酸化合物を前記試料に添加することが好ましく、より好ましくは、スルホン酸化合物とニトロ化合物の両方を添加する。
【００３１】
本発明において、前記測定対象物由来の酸化物質は、過酸化水素であることが好ましく、前記酸化酵素は、ペルオキシダーゼであることが好ましい。
【００３２】
本発明の測定方法において、前記測定試料は、特に制限されないが、全血、血漿、血清、血球等の血液試料の他に、例えば、尿、髄液、唾液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等もあげられる。
【００３３】
本発明の測定方法において、前記測定対象物は、酸化還元反応を利用するものであれば特に制限されないが、例えば、全血中成分、赤血球内成分、血漿中成分、血清中成分等もがあげられ、好ましくは赤血球内成分である。また、具体的には、例えば、糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、尿酸、コレステロール、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられ、より好ましくは糖化タンパク質である。例えば、前記赤血球成分を測定する場合、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。
【００３４】
本発明の測定方法において、前記測定対象物が糖化タンパク質の場合、前記糖化タンパク質にＦＡＯＤを作用させることによって、前記測定対象物由来の酸化合物物質として過酸化水素を発生させることが好ましい。前記糖化タンパク質の糖化部分がＦＡＯＤで酸化分解され、過酸化水素が生成するのである。また、前記糖化ペプチド、糖化アミノ酸等の糖化アミンも、同様にＦＡＯＤを作用させることが好ましい。なお、前記糖化タンパク質や糖化ペプチドは、必要に応じて、前記ＦＡＯＤ処理前に、プロテアーゼ処理することが好ましい。
【００３５】
前記ＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
【００３６】
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2 ＋ Ｈ2Ｏ ＋ Ｏ2
→Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ2−Ｒ2 ＋ Ｈ2Ｏ2 ．．．（１）
前記式（１）において、Ｒ1は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（Ｒ1）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ1）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ1）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］n−ＣＨ2ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
【００３７】
前記式（１）において、Ｒ2は、特に制限されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
【００３８】
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ2は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ3−ＣＯ−Ｒ4 ．．．（２）
前記式（２）において、Ｒ3はアミノ酸側鎖基を示す。また、Ｒ4は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ ．．．（３）
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ2は下記式（４）で示すことができる。
−Ｒ5−ＣＨ（ＮＨ− Ｒ6）−ＣＯ−Ｒ7 ・・・（４）
前記式（４）において、Ｒ5は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ5は
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ5は、
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ2）−
である。
【００３９】
また、前記式（４）において、Ｒ6は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＣＯ−ＣＨＲ3−ＮＨ）n−Ｈ ．．．（５）
また、前記式（４）において、Ｒ7は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ ．．．（６）
（実施形態１）
つぎに、本発明の測定方法について、血球中の糖化タンパク質を測定する例をあげて説明する。
【００４０】
まず、全血をそのまま溶血し、または全血から遠心分離等の常法により血球画分を分離してこれを溶血し、溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。
【００４１】
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニル エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキル エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン アルキル エーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．０１〜５重量％となるように前記界面活性剤を添加し、室温で、数秒（約５秒）〜１０分程度攪拌すればよい。
【００４２】
つぎに、前記溶血試料に対して、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を添加し、前記溶血試料の前処理を行う。
【００４３】
前記スルホン酸化合物とニトロ化合物は、いずれか一方でもよいし、両方を添加してもよいが、前述のように後の工程で使用する発色基質の種類によって、適宜決定することが好ましい。
【００４４】
スルホン酸化合物およびニトロ化合物のいずれか一方を添加する場合、その添加量は特に制限されず、前述の添加割合があげられる。具体的には、この前処理溶液中の血球濃度が１体積％の場合、例えば、ニトロ化合物の濃度が０．０５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．２〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、この前処理溶液中の血球濃度が１体積％の場合、例えば、スルホン酸化合物の濃度が０．０５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．２〜４０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【００４５】
また、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の両方を試料に添加する場合も、その添加量は特に制限されず、例えば、前述の添加割合があげられる。具体的には、この前処理溶液中の血球濃度が、１体積％の場合、例えば、スルホン酸化合物濃度０．０５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ、ニトロ化合物濃度０．０５〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくはスルホン酸化合物濃度０．２〜４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ニトロ化合物濃度０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。このようにスルホン酸化合物とニトロ化合物との両方を添加する場合、前述のように、いずれを先に添加してもよいし、また同時に添加してもよい。
【００４６】
前記スルホン酸化合物およびニトロ化合物は、そのまま使用してもよいが、操作の簡便性や処理効率等の点から、溶媒に溶解したスルホン酸化合物溶液またはニトロ化合物溶液として使用することが好ましい。前記各溶液の濃度は、その種類等により適宜決定でき、例えば、スルホン酸化合物溶液は、５〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは５〜４００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、ニトロ化合物溶液は、０．５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。前記溶媒としては、例えば、蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が使用でき、前記緩衝液としては、例えば、後述の緩衝液等が使用できる。なお、前記両化合物は、それぞれ一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００４７】
この前処理は、通常、緩衝液中で行われる。前記緩衝液としては、例えば、アミン系緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ならびにＭＯＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳおよびＣＡＰＳＯ等のグッド緩衝液等が使用できる。前記アミン系緩衝液の緩衝剤としては、例えば、グリシン、エチルアミン、ジエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリスヒドロキシアミノメタン、トリエタノールアミン、グリシンアミド等があげられる。
【００４８】
前記緩衝液のｐＨは、ｐＨ７〜１２の範囲が好ましく、より好ましくはｐＨ８〜１１の範囲であり、特に好ましくはｐＨ８〜１０の範囲である。
【００４９】
この前処理の条件は、特に制限されないが、通常、温度１０〜３７℃の範囲であり、処理時間１０秒〜６０分の範囲である。
【００５０】
なお、この前処理に使用するスルホン酸化合物として、前述のようなラウリル硫酸ナトリウム等を使用する場合は、これ自身が界面活性剤としての作用を奏するため、例えば、前述のような溶血処理と、この前処理とを同じ物質（ラウリル硫酸ナトリウム等）の添加によって、同時に行うことが可能である。
【００５１】
つぎに、この前処理済み溶血試料に対し、プロテアーゼ処理を行う。これは、後の処理に使用するＦＡＯＤを測定対象物に作用し易くするためである。
【００５２】
前記プロテアーゼの種類は、特に制限されず、例えば、プロテアーゼＫ、ズブチリシン、トリプシン、アミノペプチダーゼ、メタロプロテアーゼ等が使用できる。プロテアーゼ処理の条件は、使用するプロテアーゼの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００５３】
具体的には、例えば、前記プロテアーゼとしてプロテアーゼＫを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度１０〜３０，０００ｍｇ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。このプロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われる。前記緩衝液としては、例えば、前記前処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００５４】
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた分解物を、前記ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理により、前記式（１）に示す反応が触媒される。
【００５５】
このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましい。その処理条件は、使用するＦＡＯＤの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００５６】
具体的には、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５０〜５０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜６０分、ｐＨ６〜９の範囲である。前記緩衝液の種類も特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００５７】
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理で生成した過酸化水素を、ＰＯＤおよび前記発色基質を用いて酸化還元反応により測定する。
【００５８】
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１０〜１００，０００ＩＵ／Ｌ、発色性基質濃度０．００５〜３０ｍｍｏｌ／ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間０．１〜３０分、ｐＨ５〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
【００５９】
前記酸化還元反応において、例えば、前記発色性基質を用いた場合、前記反応液の発色程度（吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の量を測定できる。そして、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて、試料中の糖化タンパク質量を求めることができる。
【００６０】
なお、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
【００６１】
この測定方法において、前記スルホン酸化合物やニトロ化合物による前処理工程は、前述のように、酸化還元反応が実質的に生じる前であれば、特に制限されないが、前記ＦＡＯＤ処理後に過酸化水素が発生することから、前記ＦＡＯＤ処理前に行うことが好ましい。また、各処理工程は、前述のように別々に行ってもよいが、例えば、以下に示すような組み合せで同時に行ってもよい処理工程がある。
【００６２】
１：溶血処理＋前処理
２：溶血処理＋前処理＋プロテアーゼ処理
３：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
４：ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ酸化還元処理
５：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ酸化還元処理
また、スルホン酸化合物やニトロ化合物の添加順序や、前記ＦＡＯＤ、ＰＯＤおよび発色性基質の添加順序も特に制限されない。
【００６３】
このような方法によれば、前記試料にスルホン酸化合物やニトロ化合物を接触させることにより、ＧＳＨ、ＡｓＡ、ジチオスレイトール、システイン、Ｎ−アセチル−システイン等の低分子量還元物質だけでなく、特にヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の還元物質としての影響を十分に排除することができる。このため、例えば、酸化還元反応反応や吸光度測定になんら影響与えることなく、高精度で測定を行うことができる。
【００６４】
また、本発明の測定方法の前記前処理工程において、例えば、前記スルホン酸化合物やニトロ化の他に、さらに酸化剤や酵素を併用してもよい。前記酸化剤としては、例えば、ヨード酢酸ナトリウム、ヨウ素酸、過ヨウ素酸等のハロゲン酸化物、ＥＤＴＡ−Ｆｅ等があげられ、酵素としては、例えば、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ等が使用できる。このような酸化剤の添加量は、例えば、試料１μｌ当たり０．００１〜０．１ｍｇの範囲である。
【００６５】
本発明の測定方法において、測定対象物は、酸化還元反応を利用するものであれば、特に制限されず、前記糖化タンパク質の他に、前述のように、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、コレステロール、尿酸、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられる。
【００６６】
過酸化水素を発生させて、前記各測定対象物の量を測定する場合は、例えば、前記グルコースにはグルコースオキシダーゼを、前記コレステロールにはコレステロールオキシダーゼを、前記尿酸にはウリカーゼを、前記クレアチニンにはサルコシンオキシダーゼを、前記サルコシンにはサルコシンオキシダーゼを、前記グリセロールにはグリセロールオキシダーゼを、それぞれ作用させて過酸化水素を発生させればよい。この過酸化水素量の測定方法は、前述と同様にして行うことができる。また、糖化ペプチド、糖化アミノ酸は、例えば、前記糖化タンパク質の測定と同様にして測定できる。
【００６７】
また、前記スルホン酸化合物やニトロ化合物による試料中のヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の処理後、測定対象物由来の還元物質を発生させ、この量を酸化還元反応により測定し、この測定値から、前記測定対象物の量を決定する場合は、例えば、以下に示すようにして測定を行うことができる。
【００６８】
例えば、前記測定対象物がグルコースの場合、例えば、ＮＡＤ+やＮＡＤＰ+等の存在下、グルコースデヒドロゲナーゼを用いて、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ等の還元物質を発生させる。そして、前記測定対象物由来の還元物質であるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを、例えば、ジアホラーゼと、還元により発色する基質とを用いて、酸化還元反応により測定する。そして、前述のように、この測定対象物由来の還元物質の濃度と検量線等とを用いて、試料中の測定対象物の量を求めることができる。また、例えば、測定対象物がコレステロールの場合はコレステロールデヒドロゲナーゼを、サルコシンの場合は、サルコシンデヒドロゲナーゼをそれぞれ使用できる。
【００６９】
前記還元により発色する基質としては、特に制限されないが、例えば、前記発色性のテトラゾリウム化合物や、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール等が使用できる。
【００７０】
実施例
つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。
（実施例１）
この実施例は、発色性基質としてＴＰＭ−ＰＳを使用して、フルクトシルバリン（以下、「ＦＶ」という）を含むヘモグロビン試料を、スルホン酸化合物およびニトロ化合物で処理し、ＦＶ量を測定した例である。以下に、使用した試料、試薬および方法を示す。
【００７１】
（測定試料の調製）
ヘモグロビン凍結品を精製水で溶解し、５０ｇ／Ｌのヘモグロビン溶液を調製した。一方、ＦＶを、特開平２−６９６４４号公報にしたがって製造し、これを精製水に溶解して１ｍＭのＦＶ溶液を調製した。そして、前記ヘモグロビン溶液３７μｌ、ＦＶ溶液６０μｌおよび精製水２０３μｌを混合して、測定試料とした。
【００７２】
【化１】
【００７３】
前記第１試薬のスルホン酸化合物としては、ＳＬＳ（ナカライテスク社製）、ＳＤＢＳ（和光純薬社製）、ＡＢＳＡ（東京化成社製）、ＡＮＤＳ（東京化成社製）、ＤＡＤＳ（東京化成社製）をそれぞれ使用した。
【００７４】
【化２】
【００７５】
【化３】
【００７６】
（方法）
前記測定試料０．１４μＬに前記第１試薬８．２６μＬを添加した後、さらに、前記第２試薬７５．６μＬを混合して、３７℃で５分間放置した。そして、この混合液に前記第３試薬１８．９μＬを混合し、３７℃でインキュベートして発色反応を行った。そして、５分後の吸光度を商品名ＪＣＡ−ＢＭ８（日本電子社製）で測定した。測定波長は、主波長５７１ｎｍ、副波長８０５ｎｍとした。一方、比較例としては、第１試薬のスルホン酸化合物、第２試薬のニトロ化合物を添加してない以外は、前記実施例と同様にして吸光度の測定を行った。なお、試料に第１試薬および第２試薬を混合した時点での、試料１μＬに対するスルホン酸化合物の添加量は、０．１８９μｍｏｌ、０．３７８μｍｏｌ、０．７５５μｍｏｌであり、ニトロ化合物の添加量は、３．４６μｍｏｌであった。
【００７７】
【表１】
【００７８】
前記表１に示すように、実施例１のように、各種スルホン酸化合物またはこれらとニトロ化合物との併用によって、比較例に比べて、試料中のＦＶ量を示す吸光度が増加した。この結果から、本実施例によれば、前記スルホン酸化合物およびニトロ化合物によって、試料中のヘモグロビンの影響が排除されたことがわかる。
【００７９】
（実施例２）
この実施例は、発色性基質としてＤＡ−６４を使用して、ＦＶを含むヘモグロビン試料を、スルホン酸化合物およびニトロ化合物で処理し、ＦＶ量を測定した例である。以下に、使用した試料、試薬および方法を示す。
【００８０】
（測定試料の調製）
前記実施例１において調製したヘモグロビン溶液６０μＬと、前記ＦＶ溶液３７μＬおよび精製水２０３μＬを混合して、測定試料とした。
【００８１】
【化４】
【００８２】
【化５】
【００８３】
前記ニトロ化合物としては、２，４−ＤＮＡ（和光純薬工業社製）、ｐ−ＮＡ（和光純薬工業社製）、ｐ−ＮＰ（和光純薬工業社製）、ＮａＮＯ2（ナカライテスク社製）、２，４−ＤＮＨ（和光純薬工業社製）をそれぞれ使用した。なお、ニトロ化合物を二種類添加する場合は、それぞれ０．９ｍＭとし、合計１．８ｍＭとした。
【００８４】
【化６】
【００８５】
（方法）
前記測定試料０．１４μＬに前記第１試薬８．２６μＬを添加した後、さらに、前記第２試薬７５．６μＬを混合して、３７℃で５分間放置した。そして、この混合液に前記第３試薬１８．９μＬを混合し、３７℃でインキュベートして発色反応を行った。そして、５分後の吸光度を商品名ＪＣＡ−ＢＭ８（日本電子社製）で測定した。測定波長は、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍとした。一方、比較例としては、第１試薬のスルホン酸化合物、第２試薬のニトロ化合物を添加してない以外は、前記実施例と同様にして吸光度の測定を行った。これらの結果を下記表２に示す。
【００８６】
【表２】
【００８７】
前記表２に示すように、実施例２は、スルホン酸化合物および各種ニトロ化合物の併用によって、比較例に比べて、試料中のＦＶ量を示す吸光度が増加した。さらに、ニトロ化合物を二倍量添加することによって、より一層吸光度が増加した。これらの結果から、本実施例によれば、前記スルホン酸化合物およびニトロ化合物によって、試料中のヘモグロビンの影響が排除されたことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
以上のように、本発明の測定方法は、前記スルホン酸化合物やニトロ化合物を試料に添加することにより、試料中のヘモグロビンの還元物質としての影響を排除できるため、信頼性に優れた測定を行うことができる。したがって、本発明の測定方法は、例えば、臨床医療における各種分析に適用でき、特に、糖尿病診断において重要である、赤血球中の糖化ヘモグロビン等の糖化タンパク質の測定に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物を含む試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法であって、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を前記試料に添加して、前記試料に含まれる前記ヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物の影響を排除することを特徴とする測定方法。
【請求項２】
前記酸化還元反応に先立ち、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を前記試料に添加して前記試料に含まれるヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物の影響を排除し、その後、前記測定対象物由来の酸化物質または還元物質を発生させ、この量を前記酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定する請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項３】
スルホン酸化合物およびニトロ化合物の両方を前記試料に添加する請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項４】
前記スルホン酸化合物が、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ラウリル硫酸リチウム（ＬｉＬＳ）、４−アミノアゾベンゼン−４’−スルホン酸ナトリウム（ＡＢＳＡ）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＡＮＤＳ）および４，４’−ジアゾスチルベンゼン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＤＡＤＳ）からなる群から選択された少なくとも一つである請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項５】
前記ニトロ化合物が、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）、２，４−ジニトロアニリン（２，４−ＤＮＡ）、ｐ−ニトロアニリン（ｐ−ＮＡ）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ2）、亜硝酸カリウム（ＫＮＯ2）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＡＮＰＳ）およびニトロベンゼンからなる群から選択された少なくとも一つである請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項６】
前記酸化還元反応が、酸化酵素により、前記測定対象物由来の酸化物質を還元し、かつ、酸化により発色する基質を酸化させる発色反応であり、前記酸化物質の量の測定が、前記発色反応による発色程度の測定である請求の範囲２記載の測定方法。
【請求項７】
前記発色程度の測定が、前記基質の検出波長における吸光度測定である請求の範囲６記載の測定方法。
【請求項８】
前記測定対象物由来の酸化物質が、過酸化水素である請求の範囲２記載の測定方法。
【請求項９】
前記酸化酵素が、ペルオキシダーゼである請求の範囲６記載の測定方法。
【請求項１０】
測定対象物が、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つであって、前記測定対象物にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させることによって、前記測定対象物の酸化物質として過酸化水素を発生させる請求の範囲２記載の測定方法。
【請求項１１】
前記測定対象物に前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させる前に、前記試料にスルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を添加する請求の範囲１０記載の測定方法。
【請求項１２】
前記酸化により発色する基質が、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとの組み合せ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４，４’、４’’−トリアミノトリフェニルメタン ヘキサソディウム塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩、１０−（メチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンおよび１０−（カルボキシアミノメチル−４−ベンゾアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩からなる群から選択された少なくとも一つの化合物であって、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の両方を前記試料に添加する請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項１３】
前記酸化により発色する基質が、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’，−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン ヘキサソディウム塩、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４，４’、４’’−トリアミノトリフェニルメタン ヘキサソディウム塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩、１０−（メチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンおよび１０−（カルボキシアミノメチル−４−ベンゾアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩からなる群から選択された少なくとも一つの化合物であって、少なくともスルホン酸化合物を前記試料に添加する請求の範囲１に記載の測定方法。
【請求項１４】
測定対象物が、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つである請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項１５】
糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビンである請求の範囲１４記載の測定方法。
【請求項１６】
前記試料が、赤血球の溶血試料である請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項１７】
前記試料に対するスルホン酸化合物の添加割合が、血球１体積％に対して０．０５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである請求の範囲１６記載の測定方法。
【請求項１８】
前記試料に対するニトロ化合物の添加割合が、血球１体積％に対して０．０５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである請求の範囲１６記載の測定方法。
【請求項１９】
前記試料に対するスルホン酸化合物およびニトロ化合物の添加割合が、血球１体積％に対してスルホン酸化合物０．０５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ、ニトロ化合物０．０５〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌである請求の範囲１６記載の測定方法。
【請求項１】
ヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物を含む試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法であって、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を前記試料に添加して、前記試料に含まれる前記ヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物の影響を排除することを特徴とする測定方法。
【請求項２】
前記酸化還元反応に先立ち、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を前記試料に添加して前記試料に含まれるヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物の影響を排除し、その後、前記測定対象物由来の酸化物質または還元物質を発生させ、この量を前記酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定する請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項３】
スルホン酸化合物およびニトロ化合物の両方を前記試料に添加する請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項４】
前記スルホン酸化合物が、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ラウリル硫酸リチウム（ＬｉＬＳ）、４−アミノアゾベンゼン−４’−スルホン酸ナトリウム（ＡＢＳＡ）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＡＮＤＳ）および４，４’−ジアゾスチルベンゼン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＤＡＤＳ）からなる群から選択された少なくとも一つである請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項５】
前記ニトロ化合物が、２，４−ジニトロフェノール（２，４−ＤＮＰ）、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）、２，４−ジニトロアニリン（２，４−ＤＮＡ）、ｐ−ニトロアニリン（ｐ−ＮＡ）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ2）、亜硝酸カリウム（ＫＮＯ2）、４−アミノ−４’−ニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸２ナトリウム（ＡＮＰＳ）およびニトロベンゼンからなる群から選択された少なくとも一つである請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項６】
前記酸化還元反応が、酸化酵素により、前記測定対象物由来の酸化物質を還元し、かつ、酸化により発色する基質を酸化させる発色反応であり、前記酸化物質の量の測定が、前記発色反応による発色程度の測定である請求の範囲２記載の測定方法。
【請求項７】
前記発色程度の測定が、前記基質の検出波長における吸光度測定である請求の範囲６記載の測定方法。
【請求項８】
前記測定対象物由来の酸化物質が、過酸化水素である請求の範囲２記載の測定方法。
【請求項９】
前記酸化酵素が、ペルオキシダーゼである請求の範囲６記載の測定方法。
【請求項１０】
測定対象物が、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つであって、前記測定対象物にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させることによって、前記測定対象物の酸化物質として過酸化水素を発生させる請求の範囲２記載の測定方法。
【請求項１１】
前記測定対象物に前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させる前に、前記試料にスルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を添加する請求の範囲１０記載の測定方法。
【請求項１２】
前記酸化により発色する基質が、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとの組み合せ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４，４’、４’’−トリアミノトリフェニルメタン ヘキサソディウム塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩、１０−（メチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンおよび１０−（カルボキシアミノメチル−４−ベンゾアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩からなる群から選択された少なくとも一つの化合物であって、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の両方を前記試料に添加する請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項１３】
前記酸化により発色する基質が、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’，−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン ヘキサソディウム塩、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４，４’、４’’−トリアミノトリフェニルメタン ヘキサソディウム塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩、１０−（メチルアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンおよび１０−（カルボキシアミノメチル−４−ベンゾアミノカルボニル）３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩からなる群から選択された少なくとも一つの化合物であって、少なくともスルホン酸化合物を前記試料に添加する請求の範囲１に記載の測定方法。
【請求項１４】
測定対象物が、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つである請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項１５】
糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビンである請求の範囲１４記載の測定方法。
【請求項１６】
前記試料が、赤血球の溶血試料である請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項１７】
前記試料に対するスルホン酸化合物の添加割合が、血球１体積％に対して０．０５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである請求の範囲１６記載の測定方法。
【請求項１８】
前記試料に対するニトロ化合物の添加割合が、血球１体積％に対して０．０５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである請求の範囲１６記載の測定方法。
【請求項１９】
前記試料に対するスルホン酸化合物およびニトロ化合物の添加割合が、血球１体積％に対してスルホン酸化合物０．０５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ、ニトロ化合物０．０５〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌである請求の範囲１６記載の測定方法。
【公開番号】特開２００７−１４７６３０（Ｐ２００７−１４７６３０Ａ）
【公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３３１３６２（Ｐ２００６−３３１３６２）
【出願日】平成１８年１２月８日（２００６．１２．８）
【分割の表示】特願２００４−５１３７７９（Ｐ２００４−５１３７７９）の分割
【原出願日】平成１５年４月２８日（２００３．４．２８）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月８日（２００６．１２．８）
【分割の表示】特願２００４−５１３７７９（Ｐ２００４−５１３７７９）の分割
【原出願日】平成１５年４月２８日（２００３．４．２８）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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