タウリンの分析方法
【課題】試料中のタウリンを、これまでの方法に比べ安価で簡易的に定量可能である酵素的定量法を提供する。この酵素的定量法を実施する際に利用できる測定用のキット及び酵素センサーを提供する。
【解決手段】検体に、タウリンジオキシゲナーゼを作用させ、生じた生成物を定量することを含む、前記試料に含有されるタウリンの測定方法。タウリンジオキシゲナーゼを用いることを特徴とする酵素センサー。以下の（１）〜（３）の試薬を含むタウリンの測定用キット。
（１）タウリンジオキシゲナーゼ
（２）２価鉄、およびα−ケトグルタル酸
（３）タウリンジオキシゲナーゼの反応により生成する生成物の検出用試薬
【解決手段】検体に、タウリンジオキシゲナーゼを作用させ、生じた生成物を定量することを含む、前記試料に含有されるタウリンの測定方法。タウリンジオキシゲナーゼを用いることを特徴とする酵素センサー。以下の（１）〜（３）の試薬を含むタウリンの測定用キット。
（１）タウリンジオキシゲナーゼ
（２）２価鉄、およびα−ケトグルタル酸
（３）タウリンジオキシゲナーゼの反応により生成する生成物の検出用試薬
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料溶液中のタウリンを、タウリンジオキシゲナーゼを用いて定量可能な生成物に変換することを含むタウリンの分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タウリンは、メチオニンやシステインの代謝産物の一つであり、動物組織内では遊離状態で存在する。また、胆汁中ではコール酸と抱合してタウロルコール酸として存在する。タウリンの生理作用は、脂肪及び脂肪性ビタミンの吸収促進、コレステロール値の低下など多岐にわたっており、これまで数多くの薬効薬理作用が報告されている。このため、各種ドリンク剤や配合食品も市販されている。
【０００３】
タウリンの定量は、これまで主に自働アミノ酸分析装置やプレカラム誘導体化逆相高速液体クロマトグラフィーなど分離と誘導体化を伴う機器分析的手法で行われている（特許文献１、２，３、非特許文献１）。また、化学発光によりクロマトグラフィーによる分離を行わない定量法も報告されている（非特許文献2）。タウリンの酵素的定量法については、ほとんど報告がなく、唯一タウロピン脱水素酵素を用いた定量が報告されているのみである（特許文献4）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１７３２７号公報
【特許文献２】特開２００２−７１６６０号公報
【特許文献３】ＷＯ２００５／１１６６２９
【特許文献４】特開２００７−８９５３８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Chromatog. B, 781 :251-267(2002)
【非特許文献２】Bunseki kagaku, 44 :765-770 (1995)
【非特許文献３】J. Bacteriol., 178 :5438-5446 (1996)
【非特許文献４】J.Boil.Chem. 272 :23031-23036 (1997)
【非特許文献５】Anal. Biochem. 353 :69-74 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、タウリンは、主にクロマトグラフィーを中心とした機器分析的手法により定量が行われてきた。しかし、タウリンの構造中には、適当な吸収波長をもつ官能基が存在しないため、一般的なＵＶ検出機では、検出できない。したがって、誘導体化を伴う手法が報告されているが、これらの方法には、煩雑な誘導体化操作や高額な試薬が必要である。また、質量分析装置や蒸発光散乱検出器、電気化学検出器等を用いることにより誘導体化を行わずにＨＰＬＣで分析することもできるが、これらの検出器は一般に極めて高価である。
【０００７】
また、ＨＰＬＣによる分離を行わない化学発光法は、一部のアミノ酸においても発光反応が起きるため、多様な化合物を含む粗試料に適用するには、選択性に問題がある。
【０００８】
酵素的定量法として、唯一報告されているタウロピン脱水素酵素を用いた方法（特許文献４）は、可逆反応によるものであり、正確な定量を行うには不向きである。また、この酵素はタウリンに対するKmが、20〜50 mM程度と高く、特に低濃度のタウリンしか含まない試料に対しては、不適である。
【０００９】
そこで、本発明は、試料溶液中のタウリンを簡便且つ特異的に定量可能である酵素的定量法を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに本発明は、上記酵素的定量法を実施する際に利用できる測定用キット及び酵素センサーを提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らが種々検討した結果、タウリンジオキシゲナーゼをタウリンに作用させることで検出可能な化合物が生産され、この検出可能な化合物は、さまざまな試料溶液中でタウリンの存在量に比例して検出できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
本発明は、以下に示す通りである。
［１］
被検体を含有する試料溶液に、タウリンジオキシゲナーゼ、二価鉄およびαケトグルタル酸を添加すること、およびタウリンジオキシゲナーゼの作用によりタウリンから生じる生成物を定量することを含む、タウリンの分析方法。
［２］
前記生成物が亜硫酸である［１］に記載の方法。
［３］
亜硫酸をイールマン試薬により検出する[２]に記載の方法。
［４］
亜硫酸を、亜硫酸オキシダーゼを用いたバイオセンサーにより測定する[２]記載の方法。
［５］
タウリンジオキシゲナーゼが大腸菌由来の酵素である［１］〜［４］いずれかに記載の方法。
［６］
前記生成物が2-アミノアセトアルデヒドである［１］に記載の方法。
［７］
2-アミノアセトアルデヒドをアルコールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨにより検出する［６］に記載の方法。
［８］
被検体がドリンク剤、魚介類の熱水抽出物、または尿である［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
以下の試薬を含むタウリン定量用キット。
（１）タウリンジオキシゲナーゼ
（２）２価鉄、αケトグルタル酸
（３）タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成する生成物検出用試薬
［１０］
生成物検出用試薬がイールマン試薬である［９］に記載の定量用キット。
［１１］
反応用緩衝液をさらに含む［９］および［１０］に記載の定量用キット。
［１２］
タウリンジオキシゲナーゼを検出用電極に直接または間接的に固定化したものであることを特徴とするタウリン定量に用いるための酵素センサー。
［１３］
タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素を検出用電極に直接または間接的に固定化したものである［１２］に記載の酵素センサー。
［１４］
タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素が亜硫酸オキシダーゼである［１２］および［１３］に記載のセンサー。
【発明の効果】
【００１３】
上記のように、本発明によれば、タウリンジオキシゲナーゼが特異的にタウリンに作用し、さまざまな化合物を含有する試料中であっても高い選択性でタウリンを簡便に定量することができる。
【００１４】
また、本発明は、さまざまな試料に対し有効であり、生成物の検出法により、発色法、蛍光法、さらには、電極型酵素センサーを提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】タウリンジオキシゲナーゼによるコハク酸の生成
【図２】タウリンジオキシゲナーゼ及びイールマン試薬を用いたタウリン定量の検量線＊エラーバーは、標準偏差を示す(n=6)
【図３】イカ熱水抽出物における添加回収プロット＊エラーバーは、標準偏差を示す(n=4)
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜タウリンの分析方法＞
本発明のタウリンの分析方法は、被検体を含有する試料溶液に、タウリンジオキシゲナーゼを添加して所定時間経過後に、タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生じる生成物を定量することを含む、被検体中のタウリン含有量を求める方法である。
【００１７】
本発明において用いるタウリンジオキシゲナーゼは、下記式Ａに示す反応を触媒して、タウリンから括弧内に示す水酸化された反応中間体を経て２−アミノアセトアルデヒド、亜硫酸、コハク酸、および二酸化炭素を生産する。このうち、上記「タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生じる生成物」は、２−アミノアセトアルデヒド、および亜硫酸である。
【００１８】
【化１】
【００１９】
上記式Ａに示す反応は、式Ａ中に示していないが、二価鉄の存在下に進行し、さらに、酸素およびαケトグルタル酸の存在を要する。従って、本発明の分析方法においては、被検体を含有する試料溶液にタウリンジオキシゲナーゼを添加するとともに、二価鉄およびαケトグルタル酸も添加し、かつ好気性雰囲気下、好ましくは空気中で、所定時間経過させる。二価鉄を含む化合物としては、例えば、硫酸第一鉄を用いることができる。タウリンジオキシゲナーゼ、二価鉄およびαケトグルタル酸の添加量については後述する。
【００２０】
タウリンジオキシゲナーゼは、上記のように二価鉄、酸素およびαケトグルタル酸の存在下でタウリンに作用し、水酸化された反応中間体を経て２−アミノアセトアルデヒドおよび亜硫酸、コハク酸、二酸化炭素を生産する反応を触媒する。本酵素は、硫黄欠乏環境下において発現されるタンパク質として大腸菌で報告された（非特許文献3,4）。また、コハク酸定量とのカップリングによりαケトグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼをスクリーニングする方法が、本酵素を用いて開発されている（非特許文献5）。しかし、本酵素をタウリン定量に用いた例は、これまでに報告されていない。
【００２１】
本発明で用いるタウリンジオキシゲナーゼは、特定の種より生産されるものに限られるものではなく、タウリンを基質として作用するαケトグルタル酸依存型のジオキシゲナーゼを意味する。タウリンジオキシゲナーゼとしては、例えば、大腸菌が生産するタウリンジオキシゲナーゼが挙げられる。
【００２２】
さらに、本発明に用いるタウリンジオキシゲナーゼは、同様の活性を有するものであれば、自然界より分離された生物に由来するもの、本酵素をコードする遺伝子を大腸菌や他の生物を宿主として発現させて得られる酵素またはタンパク質も含まれる。
【００２３】
また、異種発現による生産法としては、例えば、上記大腸菌より抽出したゲノムＤＮＡから該当する遺伝子をＰＣＲにて増幅しpETもしくはpUCなどに組み込んだプラスミドベクターを構築したのち、BL21、JM109などの宿主菌株に形質転換し、培養する方法が挙げられる。これら以外の公知の方法も適宜用いることができる。
【００２４】
本発明で用いるタウリンジオキシゲナーゼとは、上記式Ａに示す反応を触媒する酵素を意味し、従って、その由来やアミノ酸配列の違いで限定されることはない。
【００２５】
タウリンジオキシゲナーゼによるタウリンの分解反応においては、反応式に示すように、生成物として２−アミノアセトアルデヒド、亜硫酸、コハク酸、および二酸化炭素が生じる。
【００２６】
タウリンジオキシゲナーゼによるタウリンの分解反応において生じるコハク酸をタウリン含有量の定量に用いことも考えられる。この場合、公知のコハク酸定量反応を利用することができる。しかし、本酵素を含むαケトグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼによるαケトグルタル酸からコハク酸への反応は、タウリンなどの基質が存在しない状況下でも低速度で進行する（非特許文献５）。このため、後述の実施例でも示す通り、タウリンジオキシゲナーゼによるタウリンの分解反応において生じるコハク酸は、タウリン含有量の定量には適さない。
【００２７】
一方で、本酵素によって触媒される反応により生じる亜硫酸は、タウリンより脱離するため、化学量論的にタウリンと等量である。したがって、亜硫酸を検出することはタウリンの定量に適している。
【００２８】
亜硫酸の検出法としては、各種公知の方法が適宜利用可能であるが、例えばイールマン試薬を用いることができる。イールマン試薬による亜硫酸の検出反応を式Ｂに示す。
【００２９】
【化２】
【００３０】
また、亜硫酸オキシダーゼを利用して亜硫酸を検出することもできる。亜硫酸オキシダーゼを利用して亜硫酸を検出する方法は、例えばニワトリ肝臓由来の亜硫酸オキシダーゼを用い、亜硫酸の酸化に伴い生じる過酸化水素をペルオキシダーゼと適当は発色基質（２−アミノアンチピリン・フェノールなど）により定量する方法がある。さらに亜硫酸オキシダーゼを用い公知の方法により作製された亜硫酸センサーも利用することができる。亜硫酸オキシダーゼを用いる亜硫酸センサーは亜硫酸オキシダーゼ以外に、電子伝達タンパク質やペルオキシダーゼなど検出に寄与するタンパク質を含むことができる。亜硫酸オキシダーゼは、検出用電極に直接または間接的に固定化することができる。
【００３１】
被検体を含む試料溶液に対し、タウリンジオキシゲナーゼを作用させる反応及び生じた生成物を定量する反応は、一般的に酵素反応が可能な４〜８０℃の範囲で、タウリンジオキシゲナーゼ及び生成物の検出反応の至適温度を考慮して適宜決定される。上述の大腸菌由来のタウリンジオキシゲナーゼおよびイールマン試薬を用いる場合、好ましくは、常温付近である１５℃〜４０℃の範囲の温度で実施することが望ましい。また、反応液のｐＨは、タウリンジオキシゲナーゼ及び生成物の定量に酵素を用いる場合には、使用する酵素及びその他の試薬の安定性、可溶性が許す範囲においていずれのｐＨでも可能であるが、好ましくはその酵素の至適ｐＨ付近で行うことが望ましい。特に上述の大腸菌由来のタウリンジオキシゲナーゼ及びイールマン試薬を用いる場合は、中性付近（pH６〜８）が望ましい。また、本発明により定量可能なタウリン濃度は、使用するタウリンジオキシゲナーゼと生成物検出試薬に依存する。例えば後述の実施例に従い大腸菌由来のタウリンジオキシゲナーゼ及びイールマン試薬を用いる場合、試料中のタウリン濃度としては、例えば、25〜500μMが適当であり、より高濃度の試料については、希釈することにより定量が可能となる。また、タウリンジオキシゲナーゼの反応時間は、生成物の生成が止まるエンドポイントに達するまで行うことが好ましく、前述の濃度範囲の試料を用いる限り、例えば、5〜60分とすることができ、10〜20分程度が望ましい。
【００３２】
また、タウリンジオキシゲナーゼを作用させる反応により生じる生成物として2-アミノアセトアルデヒドを検出することによってもタウリンの定量を行うことができる。2-アミノアセトアルデヒドの検出方法としては、例えばアルコールデヒドロゲナーゼを用いてアルデヒドの還元に伴い減少するＮＡＤＨを測定することによることができる。
【００３３】
また、タウリンジオキシゲナーゼを作用させる反応及び生じた生成物を定量する反応は、同一の反応容器内で、同時（並行して）実施することもできるし、逐次実施することもできる。本発明では、タウリンジオキシゲナーゼを添加して所定時間経過後に、タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生じる生成物を定量することが適当である。
【００３４】
タウリンジオキシゲナーゼを作用させる反応及び生じた生成物を定量する反応を同一の反応容器内で同時（並行して）実施する場合には、試料溶液にタウリンジオキシゲナーゼ、二価鉄およびαケトグルタル酸を添加するとともに、生成物定量用の試薬を添加するか、またはセンサーを用いる場合には、上記反応容器にセンサーを設置してタウリンジオキシゲナーゼ反応と並行して生成物定量を行う。
【００３５】
タウリンジオキシゲナーゼを作用させる反応及び生じた生成物を定量する反応を逐次実施する場合には、試料溶液にタウリンジオキシゲナーゼ、二価鉄およびαケトグルタル酸を添加して所定時間経過後に、生成物定量用の試薬を添加して生成物定量を行うか、またはセンサーを用いる場合には、所定時間経過後の反応容器内の溶液中の生成物をセンサーにて定量する。タウリンジオキシゲナーゼ添加後、生成物を定量できるレベルにまで生成させるに要する所定時間は、被検体に含まれるタウリンの量やタウリンジオキシゲナーゼの力価、さらには反応温度などにより変動するが、例えば、１〜６０分の範囲である。但し、この範囲に限定する意図ではない。
【００３６】
本発明の測定対象となる被検体は、タウリンを含む可能性があり、タウリンジオキシゲナーゼの活性を損なう成分を含まない試料であれば、如何なるものでもよい。試料溶液中のタウリンにタウリンジオキシゲナーゼを作用させて生じる生成物として、上述のように、亜硫酸または2-アミノアセトアルデヒドを定量することで試料中のタウリンの濃度を測定することができる。
【００３７】
例えばイールマン試薬により上記亜硫酸を定量する場合、試料としては、イールマン試薬と反応しうる亜硫酸、チオール化合物、タンパク質などを含まない無色の水溶液であることが好ましい。亜硫酸については、試料中でタウリン含量の１０％以下の濃度であれば影響は誤差の範囲となる。チオール化合物として例えば、システインが含まれる試料については、イールマン試薬とシステインが反応し亜硫酸の場合と同等以上に発色してしまうため、測定値が過剰評価となる。また、タンパク質含有量が多い試料については、除タンパク処理を行うことにより正確な定量が可能となる。除タンパク質処理としては、例えばセントリコンを用いた限外濾過による方法が挙げられる。タウリンから生成する亜硫酸をイールマン試薬により定量する系では、例えば、栄養ドリンク剤、魚介類などの抽出液、尿など試料のタウリン濃含有量を良好に定量できる。亜硫酸オキシダーゼを利用して亜硫酸を検出する場合もほぼ同様である。
【００３８】
一方、タウリンから生成する2-アミノアセトアルデヒドを定量する系では、試料としては、アルデヒド化合物、アルコールなどを含まない無色の液体が好ましい。そのよう試料の例としては、上記栄養ドリンク剤などが挙げることができる。
【００３９】
本発明は、以下の（１）〜（３）の試薬を含むタウリンの測定用キットも包含する。このキットを用いることで上記本発明のタウリンの分析方法を実施できる。
（１）タウリンジオキシゲナーゼ
（２）２価鉄、およびαケトグルタル酸
（３）タウリンジオキシゲナーゼによる生成物の検出用試薬
【００４０】
（１）のタウリンジオキシゲナーゼは、天然の酵素であっても、遺伝子組換技術により生産された酵素であってもよい。天然の酵素は、例えば、大腸菌など微生物の培養物よりタウリンジオキシゲナーゼを採取し、必要により精製することで調製できる。遺伝子組換技術により生産された酵素とは、当該活性を有することが確認された酵素の遺伝子、若しくはそのホモログ、またはその改変体に由来する発現タンパク質がタウリンジオキシゲナーゼ活性を有していればよい。これらの遺伝子を導入した形質転換体、例えば、組み換え大腸菌を常法により培養、タンパク質の発現を誘導し、得られた菌体からタウリンジオキシゲナーゼを採取し、必要により精製することで調製できる。
【００４１】
（２）は、タウリンジオキシゲナーゼによる反応に必要な化合物である。タウリンジオキシゲナーゼは、非ヘム鉄に依存する酵素であり、２価の鉄イオンが必要不可欠である。２価鉄は、例えば硫酸第一鉄として加えることができる。αケトグルタル酸は、本酵素により脱炭酸されコハク酸になる。タウリンの分解、すなわち１位の水酸化は、この反応と共役して起こる。
【００４２】
（３）のタウリンジオキシゲナーゼによる生成物の検出用試薬は、上述の亜硫酸検出試薬を用いることができる。また、生成物検出用試薬による反応を行う前に、反応停止試薬を加えてタウリンジオキシゲナーゼの反応を停止させてから生成物の検出を行うこともできる。反応停止試薬としては、ＥＤＴＡなどのキレート剤を例として挙げることができる。
【００４３】
（３）のタウリンジオキシゲナーゼによる生成物の検出用試薬は、亜硫酸検出試薬以外に、2-アミノアセトアルデヒド検出試薬を挙げることもできる。2-アミノアセトアルデヒド検出試薬は、上述のアルコールデヒドロゲナーゼとＮＡＤＨを挙げることができる。
【００４４】
本発明の測定用キットは、上記（１）〜（３）に加えて、反応用緩衝液をさらに含むものであることができる。反応用緩衝液は特に制限はなく、タウリンジオキシゲナーゼ及び生成物の定量を阻害しないことを条件に至適ｐＨを考慮して適宜決定される。
【００４５】
＜酵素センサー＞
本発明の酵素センサーは、酵素センサーを構成する検出用電極にタウリンジオキシゲナーゼを直接または間接的に固定化したものであり、タウリンの定量に用いるためのものである。本発明の酵素センサーは、好ましくは、タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成する生成物を直接または間接的に定量的に検出できるものであることが好ましく、例えば、タウリンジオキシゲナーゼに加えて、亜硫酸オキシダーゼなどのタウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素を、上記検出用電極に直接または間接的に固定化したものであることもできる。加えて、本発明の酵素センサーは、上記酵素以外に、電子伝達タンパク質やペルオキシダーゼなど検出に寄与するタンパク質を、上記検出用電極に直接または間接的に固定化したものであることもできる。それ以外の構成は、公知の酵素センサーで採用されている構成をそのまま、または適宜改変して利用することができる。
【００４６】
本発明の酵素センサーは、被検体を含有する試験溶液に少なくとも検出用電極部分を浸漬し、タウリンジオキシゲナーゼのみを固定化したものである場合には、試験溶液に、タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素である亜硫酸オキシダーゼなどを添加して、その生成物を検出用電極で検出する。また、本発明の酵素センサーが、タウリンジオキシゲナーゼに加えて、亜硫酸オキシダーゼなどを固定化したものである場合には、被検体を含有する試験溶液に少なくとも検出用電極部分を浸漬し、亜硫酸オキシダーゼなどからの生成物を検出用電極で検出する。
【００４７】
本発明における酵素センサーは、公知の酵素電極の基本的な構成にタウリンジオキシゲナーゼを組み合わせた物であり、直接もしくは間接的にタウリンジオキシゲナーゼおよび前述の生成物定量用酵素を固定化した酵素電極を用いる電極型酵素センサーであることができる。さらに、この酵素電極の検出用電極付近に酵素と電極の間の電子の授受を容易にする電気化学メディエーターを存在させたものであることもできる。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
【００４９】
１、タウリンジオキシゲナーゼの調製例
大腸菌Ｋ１２株よりゲノムＤＮＡを調製し、データベース上にある同株のゲノムシークエンス（ＡＰ009048）を元に設計した下記のプライマーを用いてＰＣＲによりタウリンジオキシゲナーゼ遺伝子（TauD）を増幅した。増幅産物をpT7Blue vector を用いてJM109を宿主としてサブクローニングを行った。さらに、サブクローニングされたpT7Blue-TauDよりNdeI 及びBamHIにより当該遺伝子を切り出し、同様の制限酵素で処理したpET15bとライゲーションし、BL21(DE3)に導入した。このプラスミドは、Ｎ末端にヒスチジンが導入されるため、Bio-Rad Ni-IMACを用いて、精製したところSDS-PAGE的に単一となり、20U/mLの活性を有する酵素液を調製した。
【００５０】
TauD増幅用プライマー
K12TauD_fNdeI ：gaagtcatatgagtgaacgtctgagcattac（配列番号１）
K12TauD_rBamHI：atatatggatccttaccccgcccgataaaacg（配列番号２）
【００５１】
２、タウリン定量用試薬の調製例
（１）タウリンジオキシゲナーゼ反応液（１０回分）
（１）反応停止液
0.5 M EDTA-Na
（２）発色試薬（イールマン試薬）
５,５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）10 mg
50 mM リン酸カリウム緩衝液 10 mLに溶解
【００５２】
（１）タウリン定量法１（コハク酸検出）
ロシュ社製コハク酸定量キット、「F-kit コハク酸」とタウリンジオキシゲナーゼを組み合わせた方法を検討した。0.05 mLのタウリン溶液に対し、0.05 mLの（１）のタウリンジオキシゲナーゼ反応液を加え、さらに上記キットに含まれる試薬より調製した下記の３Ｘコハク酸定量酵素溶液0.05 mLを加えたのち、30℃で反応を行いマイクロプレートリーダーによりＮＡＤＨの消費による492 nmの吸収の減少を測定した。図１に示す通り、NADHの減少は、タウリン非存在下であっても進行した。このため、本反応によるタウリン定量は、困難であることが分かった。
【００５３】
【００５４】
(2)タウリン定量法２（亜硫酸検出）
試料溶液 100μLを96ウェルマイクロプレートに添加し、上記タウリンジオキシゲナーゼ反応試薬、100μLを加えた後、30℃で15分間静置した。反応停止液 20μLを加え反応停止後、発色試薬20μLを加え、１０分間３０℃で静置したのち、TECAN Infinite M200を用いて、415 nmの吸光度を測定した。
【００５５】
(3)タウリンの検量線の作成
前述のタウリン定量法２に則り0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5 mMのタウリン水溶液を標準試料として用いて検量線を作成した。作成した検量線を図２に示す。図２で明らかなように本定量法では、0〜0.5 mMの範囲で、直線的な吸光度の増加がみられた。得られた直線の関係は、y = 2.5022x +0.1099（R2 = 0.9961）[ここでのyは415 nmの吸光度、xは、タウリン濃度、Ｒは、相関係数を示す]であって正確なタウリン定量が可能であることが分かった。
【００５６】
４、各種実試料のタウリン定量の実施例
実試料の前処理及び定量
実試料として、大正製薬製の栄養ドリンク（３製品）、アマエビ及びアオリイカの熱水抽出液、ヒト尿を用いた。
アマエビ及びアオリイカは、５ｇの細切れにした刺身を試験管にとり、３０ｍＬの脱イオン水を加えたのち、２０分間煮沸した。煮沸後の試料溶液を４枚重ねのガーゼでろ過し、ろ液を回収後、残渣を元の試験管に戻し再度３０ｍＬの脱イオン水を加え煮沸を繰り返した。合計３度抽出操作により得られた抽出液を合わせて、１００ｍＬのメスフラスコに定量的に移し、脱イオン水を加えて定容した。これを熱水抽出液とし-20℃で保存した。
ヒト尿は、発明者のものを使用し,採取後は-80℃にて保管した。
これらは、解凍後測定前にmicrocon YM-10により除タンパク処理を行った。
実試料の定量は、上記と同様の方法で検量線を逐次作製し行った。栄養ドリンクは2000倍、アオリイカ及びエビの抽出液とヒト尿では、１０倍に脱イオン水で希釈してから測定を行った。
【００５７】
ＵＰＬＣによるタウリン量の定量
タウリン定量の比較対象として、超高速アミノ酸分析システム(UPLC)を用いたプレカラム誘導体化法による定量を行った。前述の前処理済み試料0.01 mLをWaters AccQ-Tag Ultra derivatization kitを用いて誘導化し、超高速アミノ酸分析システム[Waters Acquity ultra performance LC (UPLC)]を用いて分析を行った。誘導体化条件を以下に示す。
【００５８】
誘導体化条件
トータルリカバリーバイアルに試料10μLに対し70μLのホウ酸塩緩衝液を加え混和後20μLのAccQ-Tag Ultra試薬を加え攪拌後室温で１分静置したのち、55℃で10分間加温し誘導体化試料とした。
【００５９】
分析条件
注入量 : １μL
検出 : 蛍光検出器
移動相 Ａ : 10% AccQ-Tag Ultra 溶離濃縮液Ａ
Ｂ : AccQ-Tag Ultra 溶離濃縮液Ｂ（原液）
分析温度 : 60℃
メソッド : FLR_Cell_Cult_Seq07
【００６０】
標準試料として、上記酵素法と同じ標準タウリン溶液を用いて検量線を作成した。
【００６１】
実試料のタウリン定量における酵素法と超高速アミノ酸分析システムとの比較
栄養ドリンク剤の製品表示値およびアマエビ、アオリイカ及びヒト尿のＵＰＬCによる各測定値と酵素法による測定値を表１示す。表１が示すとおり、いずれの試料においても本酵素法により得られる値は、製品記載値及びＵＰＬCによる測定値と１０％以下の誤差であった。また、これらの試料に関する限り、チオール化合物に由来するような大幅な測定値の上昇は見られなかった。本測定においては、除タンパク質以外の前処理を必要とせず、タウリンジオキシゲナーゼ反応開始から測定まで４０〜６０分程度の短時間で１〜９６サンプルの測定が可能であることから、本法は、簡便なタウリン定量法として実用的であることが確認された。
【００６２】
【表１】
【００６３】
アオリイカ熱水抽出液に対する添加回収実験
アオリイカ熱水抽出液の希釈液（タウリン濃度0.18 mM）に対し、添加濃度0.025, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2 mMとなるようにタウリン溶液を添加した試料に対し、上述と同様にタウリンジオキシゲナーゼを用いてタウリンの定量を行った結果を図３に示す。測定値は、タウリンの添加に伴い、直線的な増加（Ｒ2＝0.9984）を示し、添加量1 mM毎の測定値の増加は、1.06 mMと良好な値を示した。希釈熱水抽出液の測定値と各添加濃度の和に対するそれぞれの測定値の回収率は、９９〜１０３％であり、正確な測定が可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
タウリンは、疲労回復、成人病予防など、非常に多くの薬理的効果が報告されており、配合食品、ドリンク剤が、多く市販されている。また、体内コレストロールの蓄積を予防する効果が知られており「タウリン／コレストロール比」は、コレステロールの蓄積に指標となる。これらの理由から、食品やドリンク剤、尿などについて、タウリン量を測定することは、産業的にも医学的にも重要な技術となると考えられるが、現状では、高速液体クロマトフラフィーをはじめとする非常に高価な機器及び試薬が必要となる方法しか実用化されていない。したがって、本発明は、タウリン定量用キットや酵素センサーなどの形態で商品化が可能であり、安価かつ簡便なタウリン定量法として事業化できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料溶液中のタウリンを、タウリンジオキシゲナーゼを用いて定量可能な生成物に変換することを含むタウリンの分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タウリンは、メチオニンやシステインの代謝産物の一つであり、動物組織内では遊離状態で存在する。また、胆汁中ではコール酸と抱合してタウロルコール酸として存在する。タウリンの生理作用は、脂肪及び脂肪性ビタミンの吸収促進、コレステロール値の低下など多岐にわたっており、これまで数多くの薬効薬理作用が報告されている。このため、各種ドリンク剤や配合食品も市販されている。
【０００３】
タウリンの定量は、これまで主に自働アミノ酸分析装置やプレカラム誘導体化逆相高速液体クロマトグラフィーなど分離と誘導体化を伴う機器分析的手法で行われている（特許文献１、２，３、非特許文献１）。また、化学発光によりクロマトグラフィーによる分離を行わない定量法も報告されている（非特許文献2）。タウリンの酵素的定量法については、ほとんど報告がなく、唯一タウロピン脱水素酵素を用いた定量が報告されているのみである（特許文献4）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１７３２７号公報
【特許文献２】特開２００２−７１６６０号公報
【特許文献３】ＷＯ２００５／１１６６２９
【特許文献４】特開２００７−８９５３８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Chromatog. B, 781 :251-267(2002)
【非特許文献２】Bunseki kagaku, 44 :765-770 (1995)
【非特許文献３】J. Bacteriol., 178 :5438-5446 (1996)
【非特許文献４】J.Boil.Chem. 272 :23031-23036 (1997)
【非特許文献５】Anal. Biochem. 353 :69-74 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、タウリンは、主にクロマトグラフィーを中心とした機器分析的手法により定量が行われてきた。しかし、タウリンの構造中には、適当な吸収波長をもつ官能基が存在しないため、一般的なＵＶ検出機では、検出できない。したがって、誘導体化を伴う手法が報告されているが、これらの方法には、煩雑な誘導体化操作や高額な試薬が必要である。また、質量分析装置や蒸発光散乱検出器、電気化学検出器等を用いることにより誘導体化を行わずにＨＰＬＣで分析することもできるが、これらの検出器は一般に極めて高価である。
【０００７】
また、ＨＰＬＣによる分離を行わない化学発光法は、一部のアミノ酸においても発光反応が起きるため、多様な化合物を含む粗試料に適用するには、選択性に問題がある。
【０００８】
酵素的定量法として、唯一報告されているタウロピン脱水素酵素を用いた方法（特許文献４）は、可逆反応によるものであり、正確な定量を行うには不向きである。また、この酵素はタウリンに対するKmが、20〜50 mM程度と高く、特に低濃度のタウリンしか含まない試料に対しては、不適である。
【０００９】
そこで、本発明は、試料溶液中のタウリンを簡便且つ特異的に定量可能である酵素的定量法を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに本発明は、上記酵素的定量法を実施する際に利用できる測定用キット及び酵素センサーを提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らが種々検討した結果、タウリンジオキシゲナーゼをタウリンに作用させることで検出可能な化合物が生産され、この検出可能な化合物は、さまざまな試料溶液中でタウリンの存在量に比例して検出できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
本発明は、以下に示す通りである。
［１］
被検体を含有する試料溶液に、タウリンジオキシゲナーゼ、二価鉄およびαケトグルタル酸を添加すること、およびタウリンジオキシゲナーゼの作用によりタウリンから生じる生成物を定量することを含む、タウリンの分析方法。
［２］
前記生成物が亜硫酸である［１］に記載の方法。
［３］
亜硫酸をイールマン試薬により検出する[２]に記載の方法。
［４］
亜硫酸を、亜硫酸オキシダーゼを用いたバイオセンサーにより測定する[２]記載の方法。
［５］
タウリンジオキシゲナーゼが大腸菌由来の酵素である［１］〜［４］いずれかに記載の方法。
［６］
前記生成物が2-アミノアセトアルデヒドである［１］に記載の方法。
［７］
2-アミノアセトアルデヒドをアルコールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨにより検出する［６］に記載の方法。
［８］
被検体がドリンク剤、魚介類の熱水抽出物、または尿である［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
以下の試薬を含むタウリン定量用キット。
（１）タウリンジオキシゲナーゼ
（２）２価鉄、αケトグルタル酸
（３）タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成する生成物検出用試薬
［１０］
生成物検出用試薬がイールマン試薬である［９］に記載の定量用キット。
［１１］
反応用緩衝液をさらに含む［９］および［１０］に記載の定量用キット。
［１２］
タウリンジオキシゲナーゼを検出用電極に直接または間接的に固定化したものであることを特徴とするタウリン定量に用いるための酵素センサー。
［１３］
タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素を検出用電極に直接または間接的に固定化したものである［１２］に記載の酵素センサー。
［１４］
タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素が亜硫酸オキシダーゼである［１２］および［１３］に記載のセンサー。
【発明の効果】
【００１３】
上記のように、本発明によれば、タウリンジオキシゲナーゼが特異的にタウリンに作用し、さまざまな化合物を含有する試料中であっても高い選択性でタウリンを簡便に定量することができる。
【００１４】
また、本発明は、さまざまな試料に対し有効であり、生成物の検出法により、発色法、蛍光法、さらには、電極型酵素センサーを提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】タウリンジオキシゲナーゼによるコハク酸の生成
【図２】タウリンジオキシゲナーゼ及びイールマン試薬を用いたタウリン定量の検量線＊エラーバーは、標準偏差を示す(n=6)
【図３】イカ熱水抽出物における添加回収プロット＊エラーバーは、標準偏差を示す(n=4)
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜タウリンの分析方法＞
本発明のタウリンの分析方法は、被検体を含有する試料溶液に、タウリンジオキシゲナーゼを添加して所定時間経過後に、タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生じる生成物を定量することを含む、被検体中のタウリン含有量を求める方法である。
【００１７】
本発明において用いるタウリンジオキシゲナーゼは、下記式Ａに示す反応を触媒して、タウリンから括弧内に示す水酸化された反応中間体を経て２−アミノアセトアルデヒド、亜硫酸、コハク酸、および二酸化炭素を生産する。このうち、上記「タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生じる生成物」は、２−アミノアセトアルデヒド、および亜硫酸である。
【００１８】
【化１】
【００１９】
上記式Ａに示す反応は、式Ａ中に示していないが、二価鉄の存在下に進行し、さらに、酸素およびαケトグルタル酸の存在を要する。従って、本発明の分析方法においては、被検体を含有する試料溶液にタウリンジオキシゲナーゼを添加するとともに、二価鉄およびαケトグルタル酸も添加し、かつ好気性雰囲気下、好ましくは空気中で、所定時間経過させる。二価鉄を含む化合物としては、例えば、硫酸第一鉄を用いることができる。タウリンジオキシゲナーゼ、二価鉄およびαケトグルタル酸の添加量については後述する。
【００２０】
タウリンジオキシゲナーゼは、上記のように二価鉄、酸素およびαケトグルタル酸の存在下でタウリンに作用し、水酸化された反応中間体を経て２−アミノアセトアルデヒドおよび亜硫酸、コハク酸、二酸化炭素を生産する反応を触媒する。本酵素は、硫黄欠乏環境下において発現されるタンパク質として大腸菌で報告された（非特許文献3,4）。また、コハク酸定量とのカップリングによりαケトグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼをスクリーニングする方法が、本酵素を用いて開発されている（非特許文献5）。しかし、本酵素をタウリン定量に用いた例は、これまでに報告されていない。
【００２１】
本発明で用いるタウリンジオキシゲナーゼは、特定の種より生産されるものに限られるものではなく、タウリンを基質として作用するαケトグルタル酸依存型のジオキシゲナーゼを意味する。タウリンジオキシゲナーゼとしては、例えば、大腸菌が生産するタウリンジオキシゲナーゼが挙げられる。
【００２２】
さらに、本発明に用いるタウリンジオキシゲナーゼは、同様の活性を有するものであれば、自然界より分離された生物に由来するもの、本酵素をコードする遺伝子を大腸菌や他の生物を宿主として発現させて得られる酵素またはタンパク質も含まれる。
【００２３】
また、異種発現による生産法としては、例えば、上記大腸菌より抽出したゲノムＤＮＡから該当する遺伝子をＰＣＲにて増幅しpETもしくはpUCなどに組み込んだプラスミドベクターを構築したのち、BL21、JM109などの宿主菌株に形質転換し、培養する方法が挙げられる。これら以外の公知の方法も適宜用いることができる。
【００２４】
本発明で用いるタウリンジオキシゲナーゼとは、上記式Ａに示す反応を触媒する酵素を意味し、従って、その由来やアミノ酸配列の違いで限定されることはない。
【００２５】
タウリンジオキシゲナーゼによるタウリンの分解反応においては、反応式に示すように、生成物として２−アミノアセトアルデヒド、亜硫酸、コハク酸、および二酸化炭素が生じる。
【００２６】
タウリンジオキシゲナーゼによるタウリンの分解反応において生じるコハク酸をタウリン含有量の定量に用いことも考えられる。この場合、公知のコハク酸定量反応を利用することができる。しかし、本酵素を含むαケトグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼによるαケトグルタル酸からコハク酸への反応は、タウリンなどの基質が存在しない状況下でも低速度で進行する（非特許文献５）。このため、後述の実施例でも示す通り、タウリンジオキシゲナーゼによるタウリンの分解反応において生じるコハク酸は、タウリン含有量の定量には適さない。
【００２７】
一方で、本酵素によって触媒される反応により生じる亜硫酸は、タウリンより脱離するため、化学量論的にタウリンと等量である。したがって、亜硫酸を検出することはタウリンの定量に適している。
【００２８】
亜硫酸の検出法としては、各種公知の方法が適宜利用可能であるが、例えばイールマン試薬を用いることができる。イールマン試薬による亜硫酸の検出反応を式Ｂに示す。
【００２９】
【化２】
【００３０】
また、亜硫酸オキシダーゼを利用して亜硫酸を検出することもできる。亜硫酸オキシダーゼを利用して亜硫酸を検出する方法は、例えばニワトリ肝臓由来の亜硫酸オキシダーゼを用い、亜硫酸の酸化に伴い生じる過酸化水素をペルオキシダーゼと適当は発色基質（２−アミノアンチピリン・フェノールなど）により定量する方法がある。さらに亜硫酸オキシダーゼを用い公知の方法により作製された亜硫酸センサーも利用することができる。亜硫酸オキシダーゼを用いる亜硫酸センサーは亜硫酸オキシダーゼ以外に、電子伝達タンパク質やペルオキシダーゼなど検出に寄与するタンパク質を含むことができる。亜硫酸オキシダーゼは、検出用電極に直接または間接的に固定化することができる。
【００３１】
被検体を含む試料溶液に対し、タウリンジオキシゲナーゼを作用させる反応及び生じた生成物を定量する反応は、一般的に酵素反応が可能な４〜８０℃の範囲で、タウリンジオキシゲナーゼ及び生成物の検出反応の至適温度を考慮して適宜決定される。上述の大腸菌由来のタウリンジオキシゲナーゼおよびイールマン試薬を用いる場合、好ましくは、常温付近である１５℃〜４０℃の範囲の温度で実施することが望ましい。また、反応液のｐＨは、タウリンジオキシゲナーゼ及び生成物の定量に酵素を用いる場合には、使用する酵素及びその他の試薬の安定性、可溶性が許す範囲においていずれのｐＨでも可能であるが、好ましくはその酵素の至適ｐＨ付近で行うことが望ましい。特に上述の大腸菌由来のタウリンジオキシゲナーゼ及びイールマン試薬を用いる場合は、中性付近（pH６〜８）が望ましい。また、本発明により定量可能なタウリン濃度は、使用するタウリンジオキシゲナーゼと生成物検出試薬に依存する。例えば後述の実施例に従い大腸菌由来のタウリンジオキシゲナーゼ及びイールマン試薬を用いる場合、試料中のタウリン濃度としては、例えば、25〜500μMが適当であり、より高濃度の試料については、希釈することにより定量が可能となる。また、タウリンジオキシゲナーゼの反応時間は、生成物の生成が止まるエンドポイントに達するまで行うことが好ましく、前述の濃度範囲の試料を用いる限り、例えば、5〜60分とすることができ、10〜20分程度が望ましい。
【００３２】
また、タウリンジオキシゲナーゼを作用させる反応により生じる生成物として2-アミノアセトアルデヒドを検出することによってもタウリンの定量を行うことができる。2-アミノアセトアルデヒドの検出方法としては、例えばアルコールデヒドロゲナーゼを用いてアルデヒドの還元に伴い減少するＮＡＤＨを測定することによることができる。
【００３３】
また、タウリンジオキシゲナーゼを作用させる反応及び生じた生成物を定量する反応は、同一の反応容器内で、同時（並行して）実施することもできるし、逐次実施することもできる。本発明では、タウリンジオキシゲナーゼを添加して所定時間経過後に、タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生じる生成物を定量することが適当である。
【００３４】
タウリンジオキシゲナーゼを作用させる反応及び生じた生成物を定量する反応を同一の反応容器内で同時（並行して）実施する場合には、試料溶液にタウリンジオキシゲナーゼ、二価鉄およびαケトグルタル酸を添加するとともに、生成物定量用の試薬を添加するか、またはセンサーを用いる場合には、上記反応容器にセンサーを設置してタウリンジオキシゲナーゼ反応と並行して生成物定量を行う。
【００３５】
タウリンジオキシゲナーゼを作用させる反応及び生じた生成物を定量する反応を逐次実施する場合には、試料溶液にタウリンジオキシゲナーゼ、二価鉄およびαケトグルタル酸を添加して所定時間経過後に、生成物定量用の試薬を添加して生成物定量を行うか、またはセンサーを用いる場合には、所定時間経過後の反応容器内の溶液中の生成物をセンサーにて定量する。タウリンジオキシゲナーゼ添加後、生成物を定量できるレベルにまで生成させるに要する所定時間は、被検体に含まれるタウリンの量やタウリンジオキシゲナーゼの力価、さらには反応温度などにより変動するが、例えば、１〜６０分の範囲である。但し、この範囲に限定する意図ではない。
【００３６】
本発明の測定対象となる被検体は、タウリンを含む可能性があり、タウリンジオキシゲナーゼの活性を損なう成分を含まない試料であれば、如何なるものでもよい。試料溶液中のタウリンにタウリンジオキシゲナーゼを作用させて生じる生成物として、上述のように、亜硫酸または2-アミノアセトアルデヒドを定量することで試料中のタウリンの濃度を測定することができる。
【００３７】
例えばイールマン試薬により上記亜硫酸を定量する場合、試料としては、イールマン試薬と反応しうる亜硫酸、チオール化合物、タンパク質などを含まない無色の水溶液であることが好ましい。亜硫酸については、試料中でタウリン含量の１０％以下の濃度であれば影響は誤差の範囲となる。チオール化合物として例えば、システインが含まれる試料については、イールマン試薬とシステインが反応し亜硫酸の場合と同等以上に発色してしまうため、測定値が過剰評価となる。また、タンパク質含有量が多い試料については、除タンパク処理を行うことにより正確な定量が可能となる。除タンパク質処理としては、例えばセントリコンを用いた限外濾過による方法が挙げられる。タウリンから生成する亜硫酸をイールマン試薬により定量する系では、例えば、栄養ドリンク剤、魚介類などの抽出液、尿など試料のタウリン濃含有量を良好に定量できる。亜硫酸オキシダーゼを利用して亜硫酸を検出する場合もほぼ同様である。
【００３８】
一方、タウリンから生成する2-アミノアセトアルデヒドを定量する系では、試料としては、アルデヒド化合物、アルコールなどを含まない無色の液体が好ましい。そのよう試料の例としては、上記栄養ドリンク剤などが挙げることができる。
【００３９】
本発明は、以下の（１）〜（３）の試薬を含むタウリンの測定用キットも包含する。このキットを用いることで上記本発明のタウリンの分析方法を実施できる。
（１）タウリンジオキシゲナーゼ
（２）２価鉄、およびαケトグルタル酸
（３）タウリンジオキシゲナーゼによる生成物の検出用試薬
【００４０】
（１）のタウリンジオキシゲナーゼは、天然の酵素であっても、遺伝子組換技術により生産された酵素であってもよい。天然の酵素は、例えば、大腸菌など微生物の培養物よりタウリンジオキシゲナーゼを採取し、必要により精製することで調製できる。遺伝子組換技術により生産された酵素とは、当該活性を有することが確認された酵素の遺伝子、若しくはそのホモログ、またはその改変体に由来する発現タンパク質がタウリンジオキシゲナーゼ活性を有していればよい。これらの遺伝子を導入した形質転換体、例えば、組み換え大腸菌を常法により培養、タンパク質の発現を誘導し、得られた菌体からタウリンジオキシゲナーゼを採取し、必要により精製することで調製できる。
【００４１】
（２）は、タウリンジオキシゲナーゼによる反応に必要な化合物である。タウリンジオキシゲナーゼは、非ヘム鉄に依存する酵素であり、２価の鉄イオンが必要不可欠である。２価鉄は、例えば硫酸第一鉄として加えることができる。αケトグルタル酸は、本酵素により脱炭酸されコハク酸になる。タウリンの分解、すなわち１位の水酸化は、この反応と共役して起こる。
【００４２】
（３）のタウリンジオキシゲナーゼによる生成物の検出用試薬は、上述の亜硫酸検出試薬を用いることができる。また、生成物検出用試薬による反応を行う前に、反応停止試薬を加えてタウリンジオキシゲナーゼの反応を停止させてから生成物の検出を行うこともできる。反応停止試薬としては、ＥＤＴＡなどのキレート剤を例として挙げることができる。
【００４３】
（３）のタウリンジオキシゲナーゼによる生成物の検出用試薬は、亜硫酸検出試薬以外に、2-アミノアセトアルデヒド検出試薬を挙げることもできる。2-アミノアセトアルデヒド検出試薬は、上述のアルコールデヒドロゲナーゼとＮＡＤＨを挙げることができる。
【００４４】
本発明の測定用キットは、上記（１）〜（３）に加えて、反応用緩衝液をさらに含むものであることができる。反応用緩衝液は特に制限はなく、タウリンジオキシゲナーゼ及び生成物の定量を阻害しないことを条件に至適ｐＨを考慮して適宜決定される。
【００４５】
＜酵素センサー＞
本発明の酵素センサーは、酵素センサーを構成する検出用電極にタウリンジオキシゲナーゼを直接または間接的に固定化したものであり、タウリンの定量に用いるためのものである。本発明の酵素センサーは、好ましくは、タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成する生成物を直接または間接的に定量的に検出できるものであることが好ましく、例えば、タウリンジオキシゲナーゼに加えて、亜硫酸オキシダーゼなどのタウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素を、上記検出用電極に直接または間接的に固定化したものであることもできる。加えて、本発明の酵素センサーは、上記酵素以外に、電子伝達タンパク質やペルオキシダーゼなど検出に寄与するタンパク質を、上記検出用電極に直接または間接的に固定化したものであることもできる。それ以外の構成は、公知の酵素センサーで採用されている構成をそのまま、または適宜改変して利用することができる。
【００４６】
本発明の酵素センサーは、被検体を含有する試験溶液に少なくとも検出用電極部分を浸漬し、タウリンジオキシゲナーゼのみを固定化したものである場合には、試験溶液に、タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素である亜硫酸オキシダーゼなどを添加して、その生成物を検出用電極で検出する。また、本発明の酵素センサーが、タウリンジオキシゲナーゼに加えて、亜硫酸オキシダーゼなどを固定化したものである場合には、被検体を含有する試験溶液に少なくとも検出用電極部分を浸漬し、亜硫酸オキシダーゼなどからの生成物を検出用電極で検出する。
【００４７】
本発明における酵素センサーは、公知の酵素電極の基本的な構成にタウリンジオキシゲナーゼを組み合わせた物であり、直接もしくは間接的にタウリンジオキシゲナーゼおよび前述の生成物定量用酵素を固定化した酵素電極を用いる電極型酵素センサーであることができる。さらに、この酵素電極の検出用電極付近に酵素と電極の間の電子の授受を容易にする電気化学メディエーターを存在させたものであることもできる。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
【００４９】
１、タウリンジオキシゲナーゼの調製例
大腸菌Ｋ１２株よりゲノムＤＮＡを調製し、データベース上にある同株のゲノムシークエンス（ＡＰ009048）を元に設計した下記のプライマーを用いてＰＣＲによりタウリンジオキシゲナーゼ遺伝子（TauD）を増幅した。増幅産物をpT7Blue vector を用いてJM109を宿主としてサブクローニングを行った。さらに、サブクローニングされたpT7Blue-TauDよりNdeI 及びBamHIにより当該遺伝子を切り出し、同様の制限酵素で処理したpET15bとライゲーションし、BL21(DE3)に導入した。このプラスミドは、Ｎ末端にヒスチジンが導入されるため、Bio-Rad Ni-IMACを用いて、精製したところSDS-PAGE的に単一となり、20U/mLの活性を有する酵素液を調製した。
【００５０】
TauD増幅用プライマー
K12TauD_fNdeI ：gaagtcatatgagtgaacgtctgagcattac（配列番号１）
K12TauD_rBamHI：atatatggatccttaccccgcccgataaaacg（配列番号２）
【００５１】
２、タウリン定量用試薬の調製例
（１）タウリンジオキシゲナーゼ反応液（１０回分）
（１）反応停止液
0.5 M EDTA-Na
（２）発色試薬（イールマン試薬）
５,５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）10 mg
50 mM リン酸カリウム緩衝液 10 mLに溶解
【００５２】
（１）タウリン定量法１（コハク酸検出）
ロシュ社製コハク酸定量キット、「F-kit コハク酸」とタウリンジオキシゲナーゼを組み合わせた方法を検討した。0.05 mLのタウリン溶液に対し、0.05 mLの（１）のタウリンジオキシゲナーゼ反応液を加え、さらに上記キットに含まれる試薬より調製した下記の３Ｘコハク酸定量酵素溶液0.05 mLを加えたのち、30℃で反応を行いマイクロプレートリーダーによりＮＡＤＨの消費による492 nmの吸収の減少を測定した。図１に示す通り、NADHの減少は、タウリン非存在下であっても進行した。このため、本反応によるタウリン定量は、困難であることが分かった。
【００５３】
【００５４】
(2)タウリン定量法２（亜硫酸検出）
試料溶液 100μLを96ウェルマイクロプレートに添加し、上記タウリンジオキシゲナーゼ反応試薬、100μLを加えた後、30℃で15分間静置した。反応停止液 20μLを加え反応停止後、発色試薬20μLを加え、１０分間３０℃で静置したのち、TECAN Infinite M200を用いて、415 nmの吸光度を測定した。
【００５５】
(3)タウリンの検量線の作成
前述のタウリン定量法２に則り0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5 mMのタウリン水溶液を標準試料として用いて検量線を作成した。作成した検量線を図２に示す。図２で明らかなように本定量法では、0〜0.5 mMの範囲で、直線的な吸光度の増加がみられた。得られた直線の関係は、y = 2.5022x +0.1099（R2 = 0.9961）[ここでのyは415 nmの吸光度、xは、タウリン濃度、Ｒは、相関係数を示す]であって正確なタウリン定量が可能であることが分かった。
【００５６】
４、各種実試料のタウリン定量の実施例
実試料の前処理及び定量
実試料として、大正製薬製の栄養ドリンク（３製品）、アマエビ及びアオリイカの熱水抽出液、ヒト尿を用いた。
アマエビ及びアオリイカは、５ｇの細切れにした刺身を試験管にとり、３０ｍＬの脱イオン水を加えたのち、２０分間煮沸した。煮沸後の試料溶液を４枚重ねのガーゼでろ過し、ろ液を回収後、残渣を元の試験管に戻し再度３０ｍＬの脱イオン水を加え煮沸を繰り返した。合計３度抽出操作により得られた抽出液を合わせて、１００ｍＬのメスフラスコに定量的に移し、脱イオン水を加えて定容した。これを熱水抽出液とし-20℃で保存した。
ヒト尿は、発明者のものを使用し,採取後は-80℃にて保管した。
これらは、解凍後測定前にmicrocon YM-10により除タンパク処理を行った。
実試料の定量は、上記と同様の方法で検量線を逐次作製し行った。栄養ドリンクは2000倍、アオリイカ及びエビの抽出液とヒト尿では、１０倍に脱イオン水で希釈してから測定を行った。
【００５７】
ＵＰＬＣによるタウリン量の定量
タウリン定量の比較対象として、超高速アミノ酸分析システム(UPLC)を用いたプレカラム誘導体化法による定量を行った。前述の前処理済み試料0.01 mLをWaters AccQ-Tag Ultra derivatization kitを用いて誘導化し、超高速アミノ酸分析システム[Waters Acquity ultra performance LC (UPLC)]を用いて分析を行った。誘導体化条件を以下に示す。
【００５８】
誘導体化条件
トータルリカバリーバイアルに試料10μLに対し70μLのホウ酸塩緩衝液を加え混和後20μLのAccQ-Tag Ultra試薬を加え攪拌後室温で１分静置したのち、55℃で10分間加温し誘導体化試料とした。
【００５９】
分析条件
注入量 : １μL
検出 : 蛍光検出器
移動相 Ａ : 10% AccQ-Tag Ultra 溶離濃縮液Ａ
Ｂ : AccQ-Tag Ultra 溶離濃縮液Ｂ（原液）
分析温度 : 60℃
メソッド : FLR_Cell_Cult_Seq07
【００６０】
標準試料として、上記酵素法と同じ標準タウリン溶液を用いて検量線を作成した。
【００６１】
実試料のタウリン定量における酵素法と超高速アミノ酸分析システムとの比較
栄養ドリンク剤の製品表示値およびアマエビ、アオリイカ及びヒト尿のＵＰＬCによる各測定値と酵素法による測定値を表１示す。表１が示すとおり、いずれの試料においても本酵素法により得られる値は、製品記載値及びＵＰＬCによる測定値と１０％以下の誤差であった。また、これらの試料に関する限り、チオール化合物に由来するような大幅な測定値の上昇は見られなかった。本測定においては、除タンパク質以外の前処理を必要とせず、タウリンジオキシゲナーゼ反応開始から測定まで４０〜６０分程度の短時間で１〜９６サンプルの測定が可能であることから、本法は、簡便なタウリン定量法として実用的であることが確認された。
【００６２】
【表１】
【００６３】
アオリイカ熱水抽出液に対する添加回収実験
アオリイカ熱水抽出液の希釈液（タウリン濃度0.18 mM）に対し、添加濃度0.025, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2 mMとなるようにタウリン溶液を添加した試料に対し、上述と同様にタウリンジオキシゲナーゼを用いてタウリンの定量を行った結果を図３に示す。測定値は、タウリンの添加に伴い、直線的な増加（Ｒ2＝0.9984）を示し、添加量1 mM毎の測定値の増加は、1.06 mMと良好な値を示した。希釈熱水抽出液の測定値と各添加濃度の和に対するそれぞれの測定値の回収率は、９９〜１０３％であり、正確な測定が可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
タウリンは、疲労回復、成人病予防など、非常に多くの薬理的効果が報告されており、配合食品、ドリンク剤が、多く市販されている。また、体内コレストロールの蓄積を予防する効果が知られており「タウリン／コレストロール比」は、コレステロールの蓄積に指標となる。これらの理由から、食品やドリンク剤、尿などについて、タウリン量を測定することは、産業的にも医学的にも重要な技術となると考えられるが、現状では、高速液体クロマトフラフィーをはじめとする非常に高価な機器及び試薬が必要となる方法しか実用化されていない。したがって、本発明は、タウリン定量用キットや酵素センサーなどの形態で商品化が可能であり、安価かつ簡便なタウリン定量法として事業化できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体を含有する試料溶液に、タウリンジオキシゲナーゼ、二価鉄およびαケトグルタル酸を添加すること、およびタウリンジオキシゲナーゼの作用によりタウリンから生じる生成物を定量することを含む、タウリンの分析方法。
【請求項２】
前記生成物が亜硫酸である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
亜硫酸をイールマン試薬により検出する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
亜硫酸を、亜硫酸オキシダーゼを用いたバイオセンサーにより測定する請求項２記載の方法。
【請求項５】
タウリンジオキシゲナーゼが大腸菌由来の酵素である請求項１〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記生成物が2-アミノアセトアルデヒドである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
2-アミノアセトアルデヒドをアルコールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨにより検出する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
被検体がドリンク剤、魚介類の熱水抽出物、または尿である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
以下の（１）〜（３）の試薬を含むタウリン定量用キット。
（１）タウリンジオキシゲナーゼ
（２）２価鉄、およびαケトグルタル酸
（３）タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成する生成物検出用試薬
【請求項１０】
生成物検出用試薬がイールマン試薬である請求項９に記載の定量用キット。
【請求項１１】
生成物検出用試薬がアルコールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨである請求項９に記載の定量用キット。
【請求項１２】
反応用緩衝液をさらに含む請求項９〜１１のいずれかに記載の定量用キット。
【請求項１３】
タウリンジオキシゲナーゼを検出用電極に直接または間接的に固定化したものであることを特徴とするタウリン定量に用いるための酵素センサー。
【請求項１４】
タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素を検出用電極に直接または間接的に固定化したものである請求項１３に記載の酵素センサー。
【請求項１５】
タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素が亜硫酸オキシダーゼである請求項１３および１４に記載のセンサー。
【請求項１】
被検体を含有する試料溶液に、タウリンジオキシゲナーゼ、二価鉄およびαケトグルタル酸を添加すること、およびタウリンジオキシゲナーゼの作用によりタウリンから生じる生成物を定量することを含む、タウリンの分析方法。
【請求項２】
前記生成物が亜硫酸である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
亜硫酸をイールマン試薬により検出する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
亜硫酸を、亜硫酸オキシダーゼを用いたバイオセンサーにより測定する請求項２記載の方法。
【請求項５】
タウリンジオキシゲナーゼが大腸菌由来の酵素である請求項１〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記生成物が2-アミノアセトアルデヒドである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
2-アミノアセトアルデヒドをアルコールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨにより検出する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
被検体がドリンク剤、魚介類の熱水抽出物、または尿である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
以下の（１）〜（３）の試薬を含むタウリン定量用キット。
（１）タウリンジオキシゲナーゼ
（２）２価鉄、およびαケトグルタル酸
（３）タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成する生成物検出用試薬
【請求項１０】
生成物検出用試薬がイールマン試薬である請求項９に記載の定量用キット。
【請求項１１】
生成物検出用試薬がアルコールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨである請求項９に記載の定量用キット。
【請求項１２】
反応用緩衝液をさらに含む請求項９〜１１のいずれかに記載の定量用キット。
【請求項１３】
タウリンジオキシゲナーゼを検出用電極に直接または間接的に固定化したものであることを特徴とするタウリン定量に用いるための酵素センサー。
【請求項１４】
タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素を検出用電極に直接または間接的に固定化したものである請求項１３に記載の酵素センサー。
【請求項１５】
タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素が亜硫酸オキシダーゼである請求項１３および１４に記載のセンサー。
【図２】
【図３】
【図１】
【図３】
【図１】
【公開番号】特開２０１１−１７７１５８（Ｐ２０１１−１７７１５８Ａ）
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４７６０１（Ｐ２０１０−４７６０１）
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度文部科学省知的クラスター創成事業（第ＩＩ期）「ほくりく健康創造クラスター」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００２３６９２０）富山県 (197)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度文部科学省知的クラスター創成事業（第ＩＩ期）「ほくりく健康創造クラスター」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００２３６９２０）富山県 (197)
【Ｆターム（参考）】
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