タンパク質及び／またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む医薬組成物
治療有効量のタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物。前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含む。前記タンパク質またはポリペプチドは（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド、（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド及び（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択される。前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でなく、コロイド粒子中に封入されていない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種タンパク質及びポリペプチドの向上した半減期、効果及び安定性のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ａは最も頻繁に起こる遺伝性凝固疾患の１つである。血友病Ａ患者は凝固系の１つ以上の機能不全（misfunctions）の結果として頻繁に出血しやすい。血友病の原因の１つは血液中の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の欠乏である。この問題は第ＶＩＩＩ因子濃縮物を用いて治療され得る。しかしながら、患者の約１５％では第ＶＩＩＩ因子中和抗体（所謂、阻害剤）ができ、よって第ＶＩＩＩ因子濃縮物を用いる治療は殆ど不可能である。
【０００３】
ＦＶＩＩＩを阻害剤による不活化から防ぐための２つの基本的アプローチが文献に記載されている。
【０００４】
Hemkerの国際特許出願公開第８０／０１４５６号パンフレットは、リン脂質から形成した０．５〜１．０ミクロンのリポソーム内にＦＶＩＩＩを取り込んで含む経口投与に適した医薬組成物を開示している。前記リン脂質は実効電荷を有し、ＦＶＩＩＩはリポソームの層間に取り込まれている。血漿中のＦＶＩＩＩレベルは５０時間にわたり正常値の約５％以上に保たれていると記載されている。
【０００５】
Horikoshiの米国特許第４，３４８，３８４号明細書は、Hemkerに記載されている組成物を製造したが、満足な結果が得られなかったと述べている。従って、HorikoshiはＦＶＩＩＩのタンパク質分解を防ぐためにＦＶＩＩＩと一緒にプロテアーゼ阻害剤をリポソーム中に配合している。ＦＶＩＩＩの正常血漿レベルの３％が６時間にわたり得られた。
【０００６】
Woodleの米国特許第５，０１３，５５６号明細書は、各種薬物を血流を介してデリバリーするのに用いるためのリポソーム組成物を開示している。このリポソームはポリアルキルエーテルで誘導体化された両親媒性脂質を１〜２０モル％含む。このリポソームには薬物化合物も捕捉されている。前記リポソーム組成物はＳｔｅａｌｔｈ（登録商標）小胞（ＳＵＶ；リン脂質及び該リン脂質に共有結合しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる単ラメラ小胞）の名前で市販されている。
【０００７】
このアプローチの別の問題は、直径の大きいリポソームは半減期が短いことである。従って、前記リポソームは高圧力下で小型化されなければならず、これにより凝固第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子の場合と同様にタンパク質活性に悪影響を与える恐れがある。
【０００８】
第２のアプローチで、T.W.Barrowcliffeら, J.Lab.Clin.Med., 101:34-43(1983)は、ＦＶＩＩＩをヒト及び／または動物脳から抽出したリン脂質と混合するとインビトロでＦＶＩＩＩに対して十分な保護を与えることを教示している。このアプローチでは、リン脂質はＦＶＩＩＩを封入するのではなくＦＶＩＩＩに結合している。G.Kemball-Cook及びT.W.Barrowcliffe, Thromb.Res.,67:57-71(1992)は、ＦＶＩＩＩ結合のためには負に帯電したリン脂質表面が必要であると教示している。負に帯電したホスファチジルセリン及びホスファチジン酸はＦＶＩＩＩへの結合において非常に活性であることが判明したが、ホスファチジルコリンは不活性であった。しかしながら、負に帯電したリン脂質は有毒であり、脳組織由来のものは病原性物質を有していることがある。
【０００９】
欧州特許出願公開第６８９，４２８号明細書は、親水性ポリマー鎖の外表面層を有するリポソームを含むリポソーム組成物を開示している。ポリペプチドまたはポリサッカライドエフェクター分子は、エフェクターカップリング前に脂質アンカーを活性化することによりポリマー鎖の末端に共有結合している。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の目的は、治療のためにタンパク質またはポリペプチドを含む医薬組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、血流中で長い半減期を有する形態でタンパク質またはポリペプチドを提供することである。
【００１２】
本発明の更に別の目的は、血液凝固疾患、特に血友病を患っている患者の治療方法を提供することである。
【００１３】
本発明の１態様では、治療有効量のタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物を提供し、前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、前記タンパク質またはポリペプチドは（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド、（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド及び（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択される。前記タンパク質またはポリペプチドは前記コロイド粒子中に封入されていない。
【００１４】
好ましい実施態様において、コロイド粒子は実質的に中性であり、ポリマーは実質的に実効電荷を持たない。本明細書中、用語「実質的に中性（substantially neutral）」及び「実質的に実効電荷を持たない（substantially no net charge）」は正にも負にも帯電していないことを意味する。しかしながら、ゼロの実験誤差範囲内（within experimental error of zero）の非常に低い測定電荷は上記した用語の意味に含まれるとする。
【００１５】
本発明は、生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を含むリポソームが、タンパク質またはポリペプチドを結合させるため、タンパク質またはポリペプチドの薬物動態パラメーター（半減期及び曲線下面積）を向上させるため、及びタンパク質またはポリペプチドを血流中の阻害剤から保護するために使用され得るという驚くべき予期せぬ知見に基づく。使用する両親媒性脂質は合成であり、非毒性であり、よって治療のためにインビボで使用され得るので、本発明により従来技術の組成物に比して優れた作用効果が得られる。更に、小型リポソームは細網内皮系（ＲＥＳ）により除去されず、調合されるタンパク質またはポリペプチドの活性は損なわれない（インビトロ及びインビボで注射直後に十分な活性が認められた）のでインビボでより長い半減期を有する小型リポソームが使用され得るようにリポソームはタンパク質またはポリペプチドを封入していない。以下に詳記するように、タンパク質またはポリペプチドは、欧州特許出願公開第６８９，４２８号明細書に開示されている組成物とは異なりリポソームの外表面上のポリマー鎖と共有的に相互作用せず、ポリマー鎖を活性化するために化学反応を行わない。
【００１６】
用語「前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド（proteins or polypeptides capable of externally binding said colloidal particles）」は、凝固第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ及びグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、インターフェロンγ及びグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、及び４アミノ酸（Ｌ−ａｌａ、Ｌ−ｇｌｕ、Ｌ−ｌｙｓ及びＬ−ｔｙｒ）の反復単位からなるコポリマー（イスラエルに所在のテバ社のコパキソン）のようなタンパク質を含む。これらのタンパク質の同一性は当業者に公知のように実験的に確認し得る。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、当業者に公知のように各種疾患を治療するために使用され得る。例えば、コパキソンを含む組成物は、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞をグルタメート毒性から保護するため、グルタメート毒性に起因するかまたはグルタメート毒性により悪化する損傷または疾患を治療するために使用され得る。前記組成物は、米国特許出願第２００２００３７８４８号明細書に記載されているように多発性硬化症、糖尿病性神経障害、老人性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経（ベル）麻痺、緑内障、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん重積持続状態、非動脈炎性視神経異常症及びビタミン欠乏症を治療するためにも使用され得る。
【００１８】
用語「ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド」は、任意の非共有メカニズム（例えば、イオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合及びファンデルワールス引力）によりポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリー、及びその誘導体のポリマーに結合するタンパク質またはポリペプチドを含む（T.Arakawa及びS.N.Timasheff, Biochemistry, 24:6756-6762(1985)；J.C.Lee及びL.L.Y.Lee, J.Biol.Chem.,226:625-631(1981)）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が前記ポリマーの好ましい例である。
【００１９】
用語「治療有効量」は、所望治療効果を有する血流中のタンパク質またはポリペプチドレベルを生ずるタンパク質またはポリペプチドの量を指すと理解されたい。この量は、異なる量のタンパク質またはポリペプチドを含む組成物を投与することと、投与後の様々な時間に血中レベルを調べることとにより実験的に決定され得る。
【００２０】
コロイド粒子を作成するために使用される両親媒性脂質は天然または合成起源から入手し得る。最も好ましい脂質にはリン脂質、例えばホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミン；及びカルバメート結合非帯電リポポリマー、例えばアミノプロパンジオールジステアロイル（ＤＳ）が含まれる。生体親和性親水性ポリマーの目的はＳＵＶを立体的に安定化させて、インビトロでは小胞の融合を防止し、インビボでは小胞のＲＳＥによる吸収を避けることである。ポリマーは好ましくは約５００〜約５０００ダルトン、最も好ましくは約２０００ダルトンの分子量を有する。
【００２１】
コロイド粒子は好ましくは約０．０３〜約０．４ミクロン、最も好ましくは約０．１ミクロンの平均粒径（mean particle diameter）を有する。これは、インビボでの循環時間を延長させ、ＲＥＳによる吸収を防止するためである。両親媒性脂質は粒子の約０．５〜２０モル％、好ましくは約１〜６モル％、最も好ましくは３モル％を構成する。
【００２２】
各種の公知カップリング反応が親水性ポリマーで誘導体化された脂質を形成する小胞を作成するために使用され得る。例えば、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は塩化シアヌル酸基を介してホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のような脂質に誘導体化され得る。或いは、キャップドＰＥＧをカルボニルジイミダゾールカップリング剤を用いて活性化すると活性化イミダゾール化合物が形成され得る。カルバメート結合化合物を製造するには、ｐ−ニトロフェニルカルボネートを生成すべくＭＰＥＧ（メトキシＰＥＧ）の末端ヒドロキシをｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（p-nitrophenyl chloroformate）と反応させ得る。次いで、この生成物を１−アミノ−２，３−プロパンジオールと反応させると、中間体カルバメートが生ずる。ジオールのヒドロキシ基をアシル化すると、最終生成物が生ずる。１−アミノ−２，３−プロパンジオールの代わりにグリセロールを用いて同様に合成すると、国際特許出願公開第０１／０５８７３号パンフレットに記載されているカルバメート結合生成物が生成され得る。他の反応も公知であり、例えば援用により本明細書に含まれるとする上記米国特許第５，０１３，５５６号明細書に記載されている。
【００２３】
本発明の組成物は注射により、好ましくはｉｖ、ｓｃまたはｉｍにより投与され得る。従来技術の組成物は、リポソーム組成物を注射したときに生ずる副作用のために経口使用のみを意図していた。一方、本発明の組成物は、明らかに大きさが小さく、有毒なリン脂質を含んでいないので注射しても有毒でない。ラットにおいてＰＥＧ化リポソーム及びＦＶＩＩＩの毒性は研究されており、５００単位／ｋｇの用量で毒性はみられなかった。最高０．５gm／ｋｇ体重の量の本発明のコロイド粒子が検出可能な毒性症状なしに注射された。本発明で使用されるタンパク質及びポリペプチドは遊離形態では血管系において短い半減期を有しているが、前記タンパク質及びポリペプチドを本発明の組成物の形態で投与すると半減期は少なくとも１．５倍長くなると予想される。本発明の組成物は「オンデマンド」で患者の予防治療において有効であると予想される。
【００２４】
本発明の別の態様で、８アミノ酸のコンセンサス配列が本発明のリポソームに結合するタンパク質内にあるが、リポソームに結合しないタンパク質中には存在しないことが判明した。このコンセンサス配列はＳ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）である。
【００２５】
本発明の別の態様で、ＰＥＧ化リポソーム（PEGylated liposomes）をタンパク質の注射と別に注射するとタンパク質の半減期は長くなり、長期間有効であることが判明した。
【００２６】
本発明の更なる態様で、コレステロールが医薬組成物に補充（supplemented）されている。
【００２７】
本発明を理解し、本発明を実際どのように実施し得るかを確かめるために、好ましい実施態様を非限定的実施例により添付図面を参照しながら説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
１．実施例１〜８
１．１ 材料及び方法
【００２９】
リポソーム作成：パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミンメチルポリエチレングリコール２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）（スイス国リースタルに所在のＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（モル比９７：３）からなるリポソーム、ＰＯＰＣ及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）（米国アラバマ州アラバスターに所在のＡｖｅｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）（モル比９７：３）からなるリポソームを以下のように作成した。脂質をｔｅｒｔ−ブタノール（ドイツ国ゼールシェに所在のＲｅｉｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ）中に１０％（ｗ／ｖ）まで溶解し、凍結し、溶液を凍結乾燥させた。生じた乾燥脂質粉末を５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に２〜１３％（ｗ／ｖ）まで再懸濁させてリポソームを形成した。このリポソームをＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ TM−１００押出機（カナダ国オタワに所在のＡｖｅｎｔｉｎ Ｉｎｃ．）を用い、１．２μｍ、０．２μｍ、０．１μｍ及び０．０５μｍのサイズのポリカーボネートフィルター（米国カリフォルニア州リバーモアに所在のＰｏｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）を介して濾過して、８０〜１００ｎｍのサイズのリポソームを形成した。次いで、このリポソーム溶液を０．２μｍ酢酸セルロース滅菌フィルター（米国マサチュセッツ州ベッドフォードに所在のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社のＳｔｅｒｉｖｅｘ TM）に通し、２〜８℃で保存した。
【００３０】
（リアルタイム相互作用）
表面プラズモン共鳴分析：結合研究をＢｉａｃｏｒｅ TM２０００バイオセンサー器具（スウェーデン国ウプサラに所在のＢｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて実施した。以下のタンパク質を業者が指示するアミンカップリングキットによりＣＭ５−センサーチップ（スウェーデン国ウプサラに所在のＢｉａｃｏｒｅ ＡＢ）上に１５００ＲＵ（〜１．５ｎｇ／ｍｍ２）で固定した：ＦＶＩＩＩ（米国カリフォルニア州バークリーに所在のＢａｙｅｒ社のＫｏｇｅｎａｔｅ−ＦＳ）、ＦＩＸ（米国マサチューセッツ州ケンブリッジに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社のＢｅｎｅｆｉｘ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、エリスロポエチン、ヒト成長ホルミン、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ（イスラエル国ネスジオナに所在のＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ）、ＧＬＰ−１、インスリン（Ｓｉｇｍａ）、コパキソン（イスラエル国のＴｅｖａ Ｐｈａｒｍａ）、ＩｇＧ及びＨＳＡ（イスラエル国テルアビブに所在のＯｍｒｉｘ）。ＳＰＲ分析は、ＰＥＧ化リポソームまたは対照リポソームを０．２〜２ｍＭの最終濃度で用いて５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中２５℃で１０μｌ／分の流速で４分間評価した。センサーチップ表面は、チップを１ｍＭ ＮａＯＨで１０μｌ／分の流速で１分間洗浄することにより再生させた。会合定数、解離定数及び親和性定数についてのＳＰＲデータの分析をＢＩＡ評価ソフトウェア（スウェーデン国ウプサラに所在のＢｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて実施した。
【００３１】
（多重アラインメント）
多重配列アラインメントをＭＵＳＣＡソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｃｓｒｖ．ｗａｔｓｏｎ．ｉｂｍ．ｃｏｍ）を用いて実施した。多重アラインメントのために以下のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース受託番号を使用した：ヒト（ｈ）ＦＶＩＩＩ（Ｐ００４５１）、ｈＦＩＸ（Ｐ００７４０）、ｈＧ−ＣＳＦ（Ｐ０９９１９）、ｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｐ０４１４１）、ｈＩＦＮ−γ（Ｐ０１５７９）及びｈＧＬＰ−１（Ｐ０１２７５）
【００３２】
１．２ 結果
タンパク質／ペプチドのＰＥＧ化リポソームに対する結合：
タンパク質及びペプチドのＰＥＧ化リポソームに対する結合をＢｉａｃｏｒｅ器具（スウェーデン国ウプサラに所在のＢｉａｃｏｅ）を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定により分析した。タンパク質／ペプチドをＣＭ５センサーチップ（スウェーデン国ウプサラに所在のＢｉａｃｏｅ）上に固定化した後、同一のサイズ（８０〜１１０ｎｍ）および濃度のＰＥＧ化リポソームまたは対照リポソームを注入し、タンパク質／ペプチドの流動摂取リポソームへの結合を測定および分析した。
【００３３】
ＰＯＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００からなるＰＥＧ化リポソームはＦＶＩＩＩ（図１ａ）に結合する。ＰＯＰＣ及びＰＯＰＣ：ＤＳＰＥからなる２種の対照リポソームはＦＶＩＩＩに結合しなかった（図１ａ）ので、この結合はＤＳＰＥ脂質に結合しているＰＥＧポリマーに依存していた。また、ＰＥＧ化リポソームはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合しなかった（図１ｂ）ので、この結合はＦＶＩＩＩに特異的であった。２部位結合モデルを用いる代表的曲線（図１ａ）の結合分析は、ＰＥＧ化リポソームがそれぞれ３．８３×１０５及び３．３７×１０６Ｍ−１Ｓ−１の会合速度定数（Ｋｏｎ）、１．７２×１０−３及び６．６×１０−３Ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）及び１．９６ｎＭ及び４．５ｎＭの親和性定数（Ｋｄ）値でＦＶＩＩＩ上の２部位に結合することを示している。
【００３４】
ポリクローナル抗ヒト第ＶＩＩＩ因子抗体［抗ＦＶＩＩＩ抗体（阻害剤）を発現している患者の血清］はＰＥＧ化リポソームの両部位への結合と競合する（図１ｃ）。対照実験は、全ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）はＰＥＧ化リポソームに対するＦＶＩＩＩの結合と競合しなかったことを示している（データ示さず）。このことは、ＰＥＧ化リポソームが抗ヒト第ＶＩＩＩ因子抗体と同一のタンパク質ドメインに特異的に結合することを示している。
【００３５】
数種の追加の組換え及び精製タンパク質を用いてＳＰＲ測定を実施した。以下のタンパク質はＰＥＧ化リポソームに結合することが判明した：第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ及びグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）（図２〜６）。また、以下のタンパク質はＰＥＧ化リポソームに結合しないことが判明した：ＨＳＡ、ＩｇＧ、インスリン、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、ヒト成長ホルモン及びエリスロポエチン。
【００３６】
更に、ポリクローナル抗ヒト第ＩＸ因子抗体（Ｓｉｇｍａ）はＰＥＧ化リポソームの両部位に対する結合と競合する（図７）。このことは、ＰＥＧ化リポソームが抗ヒト第ＩＸ因子抗体と同一のタンパク質ドメインに特異的に結合することを示している。
アミノ酸配列分析は、８アミノ酸（Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ）のコンセンサス配列がＰＥＧ化リポソームに結合するタンパク質内にある（図８ａ）が、ＰＥＧ化リポソームに結合しないタンパク質中には存在しないことを示している。コンセンサス配列及びＦＶＩＩＩ上の同定結合部位を試験するために、ＦＶＩＩＩのアミ酸１７８３−１７９６から誘導されるペプチドを合成し、そのＰＥＧ化リポソームに対する結合を調べた。このペプチドは２．２５ｎＭのＫｄでＰＥＧ化リポソームに結合したが、対照ＰＯＰＣリポソームには結合しなかった（図８ｃ）。このＫｄは前に調べたＦＶＩＩＩ及びＰＥＧ化リポソームのＫｄ値と同等である（表１）。
【００３７】
各種タンパク質及びペプチドのＫｏｎ値、Ｋｏｆｆ値及びＫｄ値を表１に要約して示す。
しかしながら、４アミノ酸（Ｌ−ａｌａ、Ｌ−ｇｌｕ、Ｌ−ｌｙｓ及びＬ−ｔｙｒ）の反復単位からなる合成ランダムコポリマーであるコパキソン（イスラエル国のテバ社）はコンセンサス配列を含まないが、ＰＥＧ化リポソームに結合する（図９）。
【００３８】
【表１】
【００３９】
各種タンパク質及びペプチドのＰＥＧ化リポソームに対する会合及び解離は「材料及び方法」の欄に記載したように評価した。試験したＰＥＧ化リポソーム濃度はＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γで１８．３５５ｎＭであり、ＧＬＰ−１で１８３．５５ｐＭであった。すべてのタンパク質について得たデータをＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）及び親和性定数（ｋｄ）を計算するために分析した。
【００４０】
２．実施例９〜１０
２．１ 材料及び方法
【００４１】
ＰＥＧ化リポソームとのＦＩＸ及びＧ−ＣＳＦの調合：ＰＥＧ化リポソームは、タンパク質をリポソーム溶液（１ｍｌのリポソーム溶液／２００単位のＦＩＸ及び１ｍｌのリポソーム溶液／１０μｇのＧ−ＣＳＦ）に溶解することによりＦＩＸ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ社のＯｃｔａｎｉｎｅ）またはＧ−ＣＳＦ（イスラエル国ネスジオナに所在のＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ）と調合した。バイアルを３３ｒｐｍ、振幅１６ｍｍで回転するＳＲＴ１ローラーミキサー（英国レッドヒルに所在のＳｔｕａｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて室温（２０〜２５℃）で１０分間（Ｇ−ＣＳＦ）または６０分間（ＦＩＸ）インキュベートした。
【００４２】
リポソーム調合したＧ−ＧＳＦ及び遊離Ｇ−ＣＳＦのマウスにおける薬物動態：２群のＣ５７黒色マウスにａ）５０μｌのＰＥＧ化リポソームと調合したＧ−ＧＳＦ（１０μｇ／ｍｌ）、ｂ）５０μｌの５０ｍＭ クエン酸Ｎａ緩衝液中に溶解させたＧ−ＧＳＦ（１０μｇ／ｍｌ）を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。注射後の異なる時点でマウスの眼窩後洞からクエン酸ナトリウム（最終濃度２０ｍＭ）収容微量遠心管に放血させ、血漿を４℃で２，７００×ｇで１０分間遠心させて分離した。マウス血漿中のＧ−ＣＳＦ濃度を製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社のＧ−ＣＳＦ ＤｏｕＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット）により測定した。
【００４３】
ＰｅｇＬｉｐ−ＦＩＸ及び遊離ＦＩＸの血友病マウスにおける薬物動態：３群のＣ５７ＢＬマウスの尾静脈に５０μｌのａ）２００単位／ｍｌのＰｅｇＬｉｐ−ＦＩＸ、ｂ）非調合ＦＩＸ、ｃ）緩衝液をＩＶ注射した。注射後の異なる時点でマウスの眼窩後洞からクエン酸ナトリウム（最終濃度２０ｍＭ）収容微量遠心管に放血させ、血漿を４℃で２，７００×ｇで１０分間遠心させて分離した。マウス血漿中のＦＩＸ活性を製造業者の指示に従って（Ｓｔａｇｏｄ試薬及びＳＴ４凝固装置を用いて）１段階凝固アッセイにより測定した。Ｃ５７ＢＬマウスは血漿中に内因性ＦＩＸ活性を有しているので、（対照マウスで測定した）この内因性活性を治療群の各時点で測定した活性から差し引いた。
【００４４】
薬物動態分析：薬物動態パラメーター（半減期及びＡＵＣ）はコンピューターソフトウェア（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ Ｉｎｃ．のＲＳＴＲＩＰ）により分析した。
【００４５】
統計分析：スチューデントのｔ検定。
【００４６】
２．２ 結果
リポソーム調合タンパク質のマウスにおける薬物動態：
遊離及びリポソーム調合のＦＩＸ及びＧ−ＣＳＦの薬物動態パラメーターをマウスにおいて調べた。表２〜３に示す結果は、ＰＥＧ化リポソームと調合したタンパク質の半減期及び曲線下面積は遊離タンパク質より高かったこと示している。
【００４７】
【表２】
【００４８】
Ｇ−ＣＳＦを５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）を用いて再構成するかまたはＰＥＧ化リポソームと調合し、マウス（１群あたり６匹のマウス）にｓ．ｃ．注射（５０μｌ）した。血漿中のヒトＧ−ＣＳＦ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を酵素結合免疫検定法（ＥＬｉｓａ）により測定した。各マウスについて薬物動態パラメーターを計算した。値は平均値±標準偏差である。ＰｅｇＬｉｐ−Ｇ−ＣＳＦ対Ｇ−ＣＳＦの半減期についてのスチューデントｔ検定 Ｐ＜０．００２。
【００４９】
【表３】
【００５０】
各マウスについて薬物動態パラメーターを計算した。値は平均値±標準偏差である。ＰｅｇＬｉｐ−ＦＩＸ対ＦＩＸの半減期についてのスチューデントｔ検定 Ｐ＜０．１５。
【００５１】
３．実施例１１
３．１ 血友病マウスにおけるインビボでＰＥＧ化リポソームと調合したＦＶＩＩＩの薬物動態及び生物学的活性
未調合第ＶＩＩＩ因子を注射してから１時間後にリポソームを注射することによりインビボでＰＥＧ化リポソームと調合した第ＶＩＩＩ因子の薬物動態及び生物学的活性を血友病マウスにおいて調べた。血友病マウスにａ）遊離（未調合）ＦＶＩＩＩを注射し、ｂ）遊離ＦＶＩＩＩを注射し、１時間後にＰＥＧ化リポソームの第２回注射をした。注射後の異なる時点にマウスから放血させた。ＦＶＩＩＩ活性を凝固アッセイにより測定した。リポソーム調合ＦＶＩＩＩのインビボ止血効果を試験し、遊離ＦＶＩＩＩの効果と比較するために、注射したマウスの尾を注射後の異なる時間に切断し、注射したマウスの生存数を調べた。
【００５２】
表４及び図１０の結果は、インビボでＰＥＧ化リポソームと調合した第ＶＩＩＩ因子の半減期及び曲線下面積は遊離ＶＩＩＩよりも高かったことを示している。従って、ＦＶＩＩＩを注射し、１時間後にリポソームを注射したマウスの生存数は有意に高かった。
【００５３】
【表４】
【００５４】
組換えＦＶＩＩＩ（バイエル社のＫｏｇｅｎａｔｅ−ＦＳ）を水で再構成し、血友病マウス（各群１０匹のマウス）の尾静脈に注射した（４０μｌ）。１時間後にＰＥＧ化リポソーム（９％脂質，ｗ／ｖ）をマウスの１群にi.v.注射した（４０μｌ）。各時点のプール血漿サンプルについてＦＶＩＩＩ活性を１段階凝固アッセイにより調べた。薬物動態パラメーター（半減期及びＡＵＣ）をコンピュータープログラム（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ Ｉｎｃ．のＲＳＴＲＩＰ）により分析した。
【００５５】
４．実施例１２
リアルタイム相互作用分析により、ＰＯＰＣ及びカルバメート結合非帯電リポポリマーからなるリポソームに対するＦＶＩＩＩの結合をＰＯＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧからなるリポソームに対するＦＶＩＩＩの結合と比較した。カルバメート結合非帯電リポポリマー、すなわちｍＰＥＧアミノプロパンジオールジステアロイル（ＤＳ−ｃ−ＰＥＧ）及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−メトキシポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）の概略構造を以下に示す。
【００５６】
【化１】
【００５７】
結果を図１１に示し、両タイプのリポソームがＦＶＩＩＩと相互作用することを示す。
【００５８】
５．実施例１３
凝固第ＶＩＩａ因子は通常、阻害剤を有する血友病患者を治療するため及び外傷性出血（例えば、戦争負傷、自動車事故）を止めるために使用されている。ＰＥＧ化リポソームと調合した第ＶＩＩａ因子の薬物動態をラットにおいて調べた。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（１８０ｇ）に遊離（未調合）ＦＶＩＩａ（Ｎｏｖａ Ｎｏｒｄｉｓｋ）またはＰＥＧ化リポソームと調合したＦＶＩＩａを３６μｇ／ラット注射した。注射後の異なる時間にラットから放血させ、ＦＶＩＩａ活性を凝固アッセイ（Ｓｔａｇｏ）により測定した。表５及び６の結果は、インビボでＰＥＧ化リポソームと調合した第ＶＩＩａ因子の半減期及び曲線下面積は遊離ＦＶＩＩａよりも高かったこと示している。
【００５９】
【表５】
【００６０】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＰＥＧ化リポソームの固定化ＦＶＩＩＩに対するリアルタイム相互作用を示す。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ｒＦＶＩＩＩに結合するが、対照ＰＯＰＣリポソーム（ＰＣ）もＰＯＰＣ：ＤＳＰＥリポソーム（ＰＣ：ＰＥ）も固定化ｒＦＶＩＩＩに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ｒＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）に結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｃ：ＰＥＧ化リポソームは抗ＦＶＩＩＩ抗体（２０ベセスダ単位／ｍｌの力価）を発現している血友病Ａ患者の希釈（×１００）血清の非存在下及び存在（阻害剤）下で固定化ｒＦＶＩＩＩに結合する。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。ａ〜ｃの応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合は固定化ＦＶＩＩＩ被覆チャネルへのＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図２】ＰＥＧ化リポソームの固定化ＦＩＸに対するリアルタイム相互作用。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＦＩＸに結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＦＩＸに結合するが、対照ＰＯＰＣリポソームは固定化ＦＩＸに結合しない。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合はＦＩＸ被覆チャネルへの結合に比して固定化ＦＩＸに対するＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図３】ＰＥＧ化リポソームの固定化Ｇ−ＣＳＦに対するリアルタイム相互作用。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化Ｇ−ＣＳＦに結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化Ｇ−ＣＳＦに結合するが、対照ＰＯＰＣリポソームは固定化Ｇ−ＣＳＦに結合しない。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合はＧ−ＣＳＦ被覆チャネルへの結合に比して固定化Ｇ−ＣＳＦに対するＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図４】ＰＥＧ化リポソームの固定化ＧＭ−ＣＳＦに対するリアルタイム相互作用。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＧＭ−ＣＳＦに結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＧＭ−ＣＳＦに結合するが、対照ＰＯＰＣリポソームは固定化ＧＭ−ＣＳＦに結合しない。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合はＧ−ＣＳＦ被覆チャネルへの結合に比して固定化ＧＭ−ＣＳＦに対するＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図５】ＰＥＧ化リポソームの固定化インターフェロンγに対するリアルタイム相互作用。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＩＦＮγに結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＩＦＮγに結合するが、対照ＰＯＰＣリポソームは固定化ＩＦＮγに結合しない。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合はＩＦＮ−γ被覆チャネルへの結合に比して固定化ＩＦＮ−γに対するＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図６】ＰＥＧ化リポソームの固定化ＧＬＰ−１に対するリアルタイム相互作用。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＧＬＰ−１に結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＧＬＰ−１に結合するが、対照ＰＯＰＣリポソームは固定化ＧＬＰ−１に結合しない。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合はＧＬＰ−１被覆チャネルへの結合に比して固定化ＧＬＰ−１に対するＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図７】ＰＥＧ化リポソームは、希釈（×１０）家兎ポリクローナル抗ヒトＦＩＸ抗体（Sigma）の非存在下及び存在（抗体）下で固定化ＦＩＸに結合する。
【図８】コンセンサス配列及びＰＥＧ化リポソームに対するＦＶＩＩＩ結合部位。ａ：各種タンパク質中のＰＥＧ化リポソームを結合するためのコンセンサス配列。保存アミノ酸は赤で示し、非保存アミノ酸は青で示す。ｂ：ヒトＦＶＩＩＩのドメイン構造。ヒトＦＶＩＩＩの不連続ドメイン構造はその一次構造から類推した。リポソーム結合部位は黒四角で示す。Ｔで示す赤色矢印はトロンビン活性化部位を表す。ｃ：ＰＥＧ化リポソームまたはＰＯＰＣリポソーム（ＰＣ）のＣＭ５センサーチップに固定化したＦＶＩＩＩ配列由来ペプチド（１７８３−１７９６アミノ酸）に対する結合。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。
【図９】ＰＥＧ化リポソームの固定化コパキソンに対するリアルタイム相互作用。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化コパキソンに結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化コパキソンに結合するが、対照ＰＯＰＣリポソームは固定化コパキソンに結合しない。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合はコパキソン被覆チャネルへの結合に比して固定化コパキソンに対するＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図１０】尾切断後の血友病マウスの生存数。血友病マウスにＦＶＩＩＩ（バイエル社のＫｏｇｅｎａｔｅ−ＦＳ）またはＦＶＩＩＩを注射し、（１時間後に）ＰＥＧ化リポソームを注射した場合をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒｂプロットで示す。Ｔ検定統計分析は群間の統計上有意な差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図１１】モル比９７：３のＰＯＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（スイス国リースタルに所在のＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の脂質）からなるＰＥＧ化リポソーム及びモル比９７：３のＰＯＰＣ：ＤＳ−ｃ−ＰＥＧ２０００（スイス国リースタルに所在のＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の脂質）からなるＰＥＧ化リポソームの固定化ＦＶＩＩＩに対するリアルタイム相互作用。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種タンパク質及びポリペプチドの向上した半減期、効果及び安定性のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ａは最も頻繁に起こる遺伝性凝固疾患の１つである。血友病Ａ患者は凝固系の１つ以上の機能不全（misfunctions）の結果として頻繁に出血しやすい。血友病の原因の１つは血液中の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の欠乏である。この問題は第ＶＩＩＩ因子濃縮物を用いて治療され得る。しかしながら、患者の約１５％では第ＶＩＩＩ因子中和抗体（所謂、阻害剤）ができ、よって第ＶＩＩＩ因子濃縮物を用いる治療は殆ど不可能である。
【０００３】
ＦＶＩＩＩを阻害剤による不活化から防ぐための２つの基本的アプローチが文献に記載されている。
【０００４】
Hemkerの国際特許出願公開第８０／０１４５６号パンフレットは、リン脂質から形成した０．５〜１．０ミクロンのリポソーム内にＦＶＩＩＩを取り込んで含む経口投与に適した医薬組成物を開示している。前記リン脂質は実効電荷を有し、ＦＶＩＩＩはリポソームの層間に取り込まれている。血漿中のＦＶＩＩＩレベルは５０時間にわたり正常値の約５％以上に保たれていると記載されている。
【０００５】
Horikoshiの米国特許第４，３４８，３８４号明細書は、Hemkerに記載されている組成物を製造したが、満足な結果が得られなかったと述べている。従って、HorikoshiはＦＶＩＩＩのタンパク質分解を防ぐためにＦＶＩＩＩと一緒にプロテアーゼ阻害剤をリポソーム中に配合している。ＦＶＩＩＩの正常血漿レベルの３％が６時間にわたり得られた。
【０００６】
Woodleの米国特許第５，０１３，５５６号明細書は、各種薬物を血流を介してデリバリーするのに用いるためのリポソーム組成物を開示している。このリポソームはポリアルキルエーテルで誘導体化された両親媒性脂質を１〜２０モル％含む。このリポソームには薬物化合物も捕捉されている。前記リポソーム組成物はＳｔｅａｌｔｈ（登録商標）小胞（ＳＵＶ；リン脂質及び該リン脂質に共有結合しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる単ラメラ小胞）の名前で市販されている。
【０００７】
このアプローチの別の問題は、直径の大きいリポソームは半減期が短いことである。従って、前記リポソームは高圧力下で小型化されなければならず、これにより凝固第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子の場合と同様にタンパク質活性に悪影響を与える恐れがある。
【０００８】
第２のアプローチで、T.W.Barrowcliffeら, J.Lab.Clin.Med., 101:34-43(1983)は、ＦＶＩＩＩをヒト及び／または動物脳から抽出したリン脂質と混合するとインビトロでＦＶＩＩＩに対して十分な保護を与えることを教示している。このアプローチでは、リン脂質はＦＶＩＩＩを封入するのではなくＦＶＩＩＩに結合している。G.Kemball-Cook及びT.W.Barrowcliffe, Thromb.Res.,67:57-71(1992)は、ＦＶＩＩＩ結合のためには負に帯電したリン脂質表面が必要であると教示している。負に帯電したホスファチジルセリン及びホスファチジン酸はＦＶＩＩＩへの結合において非常に活性であることが判明したが、ホスファチジルコリンは不活性であった。しかしながら、負に帯電したリン脂質は有毒であり、脳組織由来のものは病原性物質を有していることがある。
【０００９】
欧州特許出願公開第６８９，４２８号明細書は、親水性ポリマー鎖の外表面層を有するリポソームを含むリポソーム組成物を開示している。ポリペプチドまたはポリサッカライドエフェクター分子は、エフェクターカップリング前に脂質アンカーを活性化することによりポリマー鎖の末端に共有結合している。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の目的は、治療のためにタンパク質またはポリペプチドを含む医薬組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、血流中で長い半減期を有する形態でタンパク質またはポリペプチドを提供することである。
【００１２】
本発明の更に別の目的は、血液凝固疾患、特に血友病を患っている患者の治療方法を提供することである。
【００１３】
本発明の１態様では、治療有効量のタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物を提供し、前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、前記タンパク質またはポリペプチドは（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド、（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド及び（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択される。前記タンパク質またはポリペプチドは前記コロイド粒子中に封入されていない。
【００１４】
好ましい実施態様において、コロイド粒子は実質的に中性であり、ポリマーは実質的に実効電荷を持たない。本明細書中、用語「実質的に中性（substantially neutral）」及び「実質的に実効電荷を持たない（substantially no net charge）」は正にも負にも帯電していないことを意味する。しかしながら、ゼロの実験誤差範囲内（within experimental error of zero）の非常に低い測定電荷は上記した用語の意味に含まれるとする。
【００１５】
本発明は、生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を含むリポソームが、タンパク質またはポリペプチドを結合させるため、タンパク質またはポリペプチドの薬物動態パラメーター（半減期及び曲線下面積）を向上させるため、及びタンパク質またはポリペプチドを血流中の阻害剤から保護するために使用され得るという驚くべき予期せぬ知見に基づく。使用する両親媒性脂質は合成であり、非毒性であり、よって治療のためにインビボで使用され得るので、本発明により従来技術の組成物に比して優れた作用効果が得られる。更に、小型リポソームは細網内皮系（ＲＥＳ）により除去されず、調合されるタンパク質またはポリペプチドの活性は損なわれない（インビトロ及びインビボで注射直後に十分な活性が認められた）のでインビボでより長い半減期を有する小型リポソームが使用され得るようにリポソームはタンパク質またはポリペプチドを封入していない。以下に詳記するように、タンパク質またはポリペプチドは、欧州特許出願公開第６８９，４２８号明細書に開示されている組成物とは異なりリポソームの外表面上のポリマー鎖と共有的に相互作用せず、ポリマー鎖を活性化するために化学反応を行わない。
【００１６】
用語「前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド（proteins or polypeptides capable of externally binding said colloidal particles）」は、凝固第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ及びグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、インターフェロンγ及びグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、及び４アミノ酸（Ｌ−ａｌａ、Ｌ−ｇｌｕ、Ｌ−ｌｙｓ及びＬ−ｔｙｒ）の反復単位からなるコポリマー（イスラエルに所在のテバ社のコパキソン）のようなタンパク質を含む。これらのタンパク質の同一性は当業者に公知のように実験的に確認し得る。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、当業者に公知のように各種疾患を治療するために使用され得る。例えば、コパキソンを含む組成物は、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞をグルタメート毒性から保護するため、グルタメート毒性に起因するかまたはグルタメート毒性により悪化する損傷または疾患を治療するために使用され得る。前記組成物は、米国特許出願第２００２００３７８４８号明細書に記載されているように多発性硬化症、糖尿病性神経障害、老人性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経（ベル）麻痺、緑内障、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん重積持続状態、非動脈炎性視神経異常症及びビタミン欠乏症を治療するためにも使用され得る。
【００１８】
用語「ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド」は、任意の非共有メカニズム（例えば、イオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合及びファンデルワールス引力）によりポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリー、及びその誘導体のポリマーに結合するタンパク質またはポリペプチドを含む（T.Arakawa及びS.N.Timasheff, Biochemistry, 24:6756-6762(1985)；J.C.Lee及びL.L.Y.Lee, J.Biol.Chem.,226:625-631(1981)）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が前記ポリマーの好ましい例である。
【００１９】
用語「治療有効量」は、所望治療効果を有する血流中のタンパク質またはポリペプチドレベルを生ずるタンパク質またはポリペプチドの量を指すと理解されたい。この量は、異なる量のタンパク質またはポリペプチドを含む組成物を投与することと、投与後の様々な時間に血中レベルを調べることとにより実験的に決定され得る。
【００２０】
コロイド粒子を作成するために使用される両親媒性脂質は天然または合成起源から入手し得る。最も好ましい脂質にはリン脂質、例えばホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミン；及びカルバメート結合非帯電リポポリマー、例えばアミノプロパンジオールジステアロイル（ＤＳ）が含まれる。生体親和性親水性ポリマーの目的はＳＵＶを立体的に安定化させて、インビトロでは小胞の融合を防止し、インビボでは小胞のＲＳＥによる吸収を避けることである。ポリマーは好ましくは約５００〜約５０００ダルトン、最も好ましくは約２０００ダルトンの分子量を有する。
【００２１】
コロイド粒子は好ましくは約０．０３〜約０．４ミクロン、最も好ましくは約０．１ミクロンの平均粒径（mean particle diameter）を有する。これは、インビボでの循環時間を延長させ、ＲＥＳによる吸収を防止するためである。両親媒性脂質は粒子の約０．５〜２０モル％、好ましくは約１〜６モル％、最も好ましくは３モル％を構成する。
【００２２】
各種の公知カップリング反応が親水性ポリマーで誘導体化された脂質を形成する小胞を作成するために使用され得る。例えば、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は塩化シアヌル酸基を介してホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のような脂質に誘導体化され得る。或いは、キャップドＰＥＧをカルボニルジイミダゾールカップリング剤を用いて活性化すると活性化イミダゾール化合物が形成され得る。カルバメート結合化合物を製造するには、ｐ−ニトロフェニルカルボネートを生成すべくＭＰＥＧ（メトキシＰＥＧ）の末端ヒドロキシをｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（p-nitrophenyl chloroformate）と反応させ得る。次いで、この生成物を１−アミノ−２，３−プロパンジオールと反応させると、中間体カルバメートが生ずる。ジオールのヒドロキシ基をアシル化すると、最終生成物が生ずる。１−アミノ−２，３−プロパンジオールの代わりにグリセロールを用いて同様に合成すると、国際特許出願公開第０１／０５８７３号パンフレットに記載されているカルバメート結合生成物が生成され得る。他の反応も公知であり、例えば援用により本明細書に含まれるとする上記米国特許第５，０１３，５５６号明細書に記載されている。
【００２３】
本発明の組成物は注射により、好ましくはｉｖ、ｓｃまたはｉｍにより投与され得る。従来技術の組成物は、リポソーム組成物を注射したときに生ずる副作用のために経口使用のみを意図していた。一方、本発明の組成物は、明らかに大きさが小さく、有毒なリン脂質を含んでいないので注射しても有毒でない。ラットにおいてＰＥＧ化リポソーム及びＦＶＩＩＩの毒性は研究されており、５００単位／ｋｇの用量で毒性はみられなかった。最高０．５gm／ｋｇ体重の量の本発明のコロイド粒子が検出可能な毒性症状なしに注射された。本発明で使用されるタンパク質及びポリペプチドは遊離形態では血管系において短い半減期を有しているが、前記タンパク質及びポリペプチドを本発明の組成物の形態で投与すると半減期は少なくとも１．５倍長くなると予想される。本発明の組成物は「オンデマンド」で患者の予防治療において有効であると予想される。
【００２４】
本発明の別の態様で、８アミノ酸のコンセンサス配列が本発明のリポソームに結合するタンパク質内にあるが、リポソームに結合しないタンパク質中には存在しないことが判明した。このコンセンサス配列はＳ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）である。
【００２５】
本発明の別の態様で、ＰＥＧ化リポソーム（PEGylated liposomes）をタンパク質の注射と別に注射するとタンパク質の半減期は長くなり、長期間有効であることが判明した。
【００２６】
本発明の更なる態様で、コレステロールが医薬組成物に補充（supplemented）されている。
【００２７】
本発明を理解し、本発明を実際どのように実施し得るかを確かめるために、好ましい実施態様を非限定的実施例により添付図面を参照しながら説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
１．実施例１〜８
１．１ 材料及び方法
【００２９】
リポソーム作成：パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミンメチルポリエチレングリコール２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）（スイス国リースタルに所在のＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（モル比９７：３）からなるリポソーム、ＰＯＰＣ及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）（米国アラバマ州アラバスターに所在のＡｖｅｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）（モル比９７：３）からなるリポソームを以下のように作成した。脂質をｔｅｒｔ−ブタノール（ドイツ国ゼールシェに所在のＲｅｉｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ）中に１０％（ｗ／ｖ）まで溶解し、凍結し、溶液を凍結乾燥させた。生じた乾燥脂質粉末を５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に２〜１３％（ｗ／ｖ）まで再懸濁させてリポソームを形成した。このリポソームをＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ TM−１００押出機（カナダ国オタワに所在のＡｖｅｎｔｉｎ Ｉｎｃ．）を用い、１．２μｍ、０．２μｍ、０．１μｍ及び０．０５μｍのサイズのポリカーボネートフィルター（米国カリフォルニア州リバーモアに所在のＰｏｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）を介して濾過して、８０〜１００ｎｍのサイズのリポソームを形成した。次いで、このリポソーム溶液を０．２μｍ酢酸セルロース滅菌フィルター（米国マサチュセッツ州ベッドフォードに所在のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社のＳｔｅｒｉｖｅｘ TM）に通し、２〜８℃で保存した。
【００３０】
（リアルタイム相互作用）
表面プラズモン共鳴分析：結合研究をＢｉａｃｏｒｅ TM２０００バイオセンサー器具（スウェーデン国ウプサラに所在のＢｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて実施した。以下のタンパク質を業者が指示するアミンカップリングキットによりＣＭ５−センサーチップ（スウェーデン国ウプサラに所在のＢｉａｃｏｒｅ ＡＢ）上に１５００ＲＵ（〜１．５ｎｇ／ｍｍ２）で固定した：ＦＶＩＩＩ（米国カリフォルニア州バークリーに所在のＢａｙｅｒ社のＫｏｇｅｎａｔｅ−ＦＳ）、ＦＩＸ（米国マサチューセッツ州ケンブリッジに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社のＢｅｎｅｆｉｘ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、エリスロポエチン、ヒト成長ホルミン、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ（イスラエル国ネスジオナに所在のＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ）、ＧＬＰ−１、インスリン（Ｓｉｇｍａ）、コパキソン（イスラエル国のＴｅｖａ Ｐｈａｒｍａ）、ＩｇＧ及びＨＳＡ（イスラエル国テルアビブに所在のＯｍｒｉｘ）。ＳＰＲ分析は、ＰＥＧ化リポソームまたは対照リポソームを０．２〜２ｍＭの最終濃度で用いて５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中２５℃で１０μｌ／分の流速で４分間評価した。センサーチップ表面は、チップを１ｍＭ ＮａＯＨで１０μｌ／分の流速で１分間洗浄することにより再生させた。会合定数、解離定数及び親和性定数についてのＳＰＲデータの分析をＢＩＡ評価ソフトウェア（スウェーデン国ウプサラに所在のＢｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて実施した。
【００３１】
（多重アラインメント）
多重配列アラインメントをＭＵＳＣＡソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｃｓｒｖ．ｗａｔｓｏｎ．ｉｂｍ．ｃｏｍ）を用いて実施した。多重アラインメントのために以下のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース受託番号を使用した：ヒト（ｈ）ＦＶＩＩＩ（Ｐ００４５１）、ｈＦＩＸ（Ｐ００７４０）、ｈＧ−ＣＳＦ（Ｐ０９９１９）、ｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｐ０４１４１）、ｈＩＦＮ−γ（Ｐ０１５７９）及びｈＧＬＰ−１（Ｐ０１２７５）
【００３２】
１．２ 結果
タンパク質／ペプチドのＰＥＧ化リポソームに対する結合：
タンパク質及びペプチドのＰＥＧ化リポソームに対する結合をＢｉａｃｏｒｅ器具（スウェーデン国ウプサラに所在のＢｉａｃｏｅ）を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定により分析した。タンパク質／ペプチドをＣＭ５センサーチップ（スウェーデン国ウプサラに所在のＢｉａｃｏｅ）上に固定化した後、同一のサイズ（８０〜１１０ｎｍ）および濃度のＰＥＧ化リポソームまたは対照リポソームを注入し、タンパク質／ペプチドの流動摂取リポソームへの結合を測定および分析した。
【００３３】
ＰＯＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００からなるＰＥＧ化リポソームはＦＶＩＩＩ（図１ａ）に結合する。ＰＯＰＣ及びＰＯＰＣ：ＤＳＰＥからなる２種の対照リポソームはＦＶＩＩＩに結合しなかった（図１ａ）ので、この結合はＤＳＰＥ脂質に結合しているＰＥＧポリマーに依存していた。また、ＰＥＧ化リポソームはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合しなかった（図１ｂ）ので、この結合はＦＶＩＩＩに特異的であった。２部位結合モデルを用いる代表的曲線（図１ａ）の結合分析は、ＰＥＧ化リポソームがそれぞれ３．８３×１０５及び３．３７×１０６Ｍ−１Ｓ−１の会合速度定数（Ｋｏｎ）、１．７２×１０−３及び６．６×１０−３Ｓ−１の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）及び１．９６ｎＭ及び４．５ｎＭの親和性定数（Ｋｄ）値でＦＶＩＩＩ上の２部位に結合することを示している。
【００３４】
ポリクローナル抗ヒト第ＶＩＩＩ因子抗体［抗ＦＶＩＩＩ抗体（阻害剤）を発現している患者の血清］はＰＥＧ化リポソームの両部位への結合と競合する（図１ｃ）。対照実験は、全ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）はＰＥＧ化リポソームに対するＦＶＩＩＩの結合と競合しなかったことを示している（データ示さず）。このことは、ＰＥＧ化リポソームが抗ヒト第ＶＩＩＩ因子抗体と同一のタンパク質ドメインに特異的に結合することを示している。
【００３５】
数種の追加の組換え及び精製タンパク質を用いてＳＰＲ測定を実施した。以下のタンパク質はＰＥＧ化リポソームに結合することが判明した：第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ及びグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）（図２〜６）。また、以下のタンパク質はＰＥＧ化リポソームに結合しないことが判明した：ＨＳＡ、ＩｇＧ、インスリン、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、ヒト成長ホルモン及びエリスロポエチン。
【００３６】
更に、ポリクローナル抗ヒト第ＩＸ因子抗体（Ｓｉｇｍａ）はＰＥＧ化リポソームの両部位に対する結合と競合する（図７）。このことは、ＰＥＧ化リポソームが抗ヒト第ＩＸ因子抗体と同一のタンパク質ドメインに特異的に結合することを示している。
アミノ酸配列分析は、８アミノ酸（Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ）のコンセンサス配列がＰＥＧ化リポソームに結合するタンパク質内にある（図８ａ）が、ＰＥＧ化リポソームに結合しないタンパク質中には存在しないことを示している。コンセンサス配列及びＦＶＩＩＩ上の同定結合部位を試験するために、ＦＶＩＩＩのアミ酸１７８３−１７９６から誘導されるペプチドを合成し、そのＰＥＧ化リポソームに対する結合を調べた。このペプチドは２．２５ｎＭのＫｄでＰＥＧ化リポソームに結合したが、対照ＰＯＰＣリポソームには結合しなかった（図８ｃ）。このＫｄは前に調べたＦＶＩＩＩ及びＰＥＧ化リポソームのＫｄ値と同等である（表１）。
【００３７】
各種タンパク質及びペプチドのＫｏｎ値、Ｋｏｆｆ値及びＫｄ値を表１に要約して示す。
しかしながら、４アミノ酸（Ｌ−ａｌａ、Ｌ−ｇｌｕ、Ｌ−ｌｙｓ及びＬ−ｔｙｒ）の反復単位からなる合成ランダムコポリマーであるコパキソン（イスラエル国のテバ社）はコンセンサス配列を含まないが、ＰＥＧ化リポソームに結合する（図９）。
【００３８】
【表１】
【００３９】
各種タンパク質及びペプチドのＰＥＧ化リポソームに対する会合及び解離は「材料及び方法」の欄に記載したように評価した。試験したＰＥＧ化リポソーム濃度はＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γで１８．３５５ｎＭであり、ＧＬＰ−１で１８３．５５ｐＭであった。すべてのタンパク質について得たデータをＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）及び親和性定数（ｋｄ）を計算するために分析した。
【００４０】
２．実施例９〜１０
２．１ 材料及び方法
【００４１】
ＰＥＧ化リポソームとのＦＩＸ及びＧ−ＣＳＦの調合：ＰＥＧ化リポソームは、タンパク質をリポソーム溶液（１ｍｌのリポソーム溶液／２００単位のＦＩＸ及び１ｍｌのリポソーム溶液／１０μｇのＧ−ＣＳＦ）に溶解することによりＦＩＸ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ社のＯｃｔａｎｉｎｅ）またはＧ−ＣＳＦ（イスラエル国ネスジオナに所在のＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ）と調合した。バイアルを３３ｒｐｍ、振幅１６ｍｍで回転するＳＲＴ１ローラーミキサー（英国レッドヒルに所在のＳｔｕａｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて室温（２０〜２５℃）で１０分間（Ｇ−ＣＳＦ）または６０分間（ＦＩＸ）インキュベートした。
【００４２】
リポソーム調合したＧ−ＧＳＦ及び遊離Ｇ−ＣＳＦのマウスにおける薬物動態：２群のＣ５７黒色マウスにａ）５０μｌのＰＥＧ化リポソームと調合したＧ−ＧＳＦ（１０μｇ／ｍｌ）、ｂ）５０μｌの５０ｍＭ クエン酸Ｎａ緩衝液中に溶解させたＧ−ＧＳＦ（１０μｇ／ｍｌ）を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。注射後の異なる時点でマウスの眼窩後洞からクエン酸ナトリウム（最終濃度２０ｍＭ）収容微量遠心管に放血させ、血漿を４℃で２，７００×ｇで１０分間遠心させて分離した。マウス血漿中のＧ−ＣＳＦ濃度を製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社のＧ−ＣＳＦ ＤｏｕＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット）により測定した。
【００４３】
ＰｅｇＬｉｐ−ＦＩＸ及び遊離ＦＩＸの血友病マウスにおける薬物動態：３群のＣ５７ＢＬマウスの尾静脈に５０μｌのａ）２００単位／ｍｌのＰｅｇＬｉｐ−ＦＩＸ、ｂ）非調合ＦＩＸ、ｃ）緩衝液をＩＶ注射した。注射後の異なる時点でマウスの眼窩後洞からクエン酸ナトリウム（最終濃度２０ｍＭ）収容微量遠心管に放血させ、血漿を４℃で２，７００×ｇで１０分間遠心させて分離した。マウス血漿中のＦＩＸ活性を製造業者の指示に従って（Ｓｔａｇｏｄ試薬及びＳＴ４凝固装置を用いて）１段階凝固アッセイにより測定した。Ｃ５７ＢＬマウスは血漿中に内因性ＦＩＸ活性を有しているので、（対照マウスで測定した）この内因性活性を治療群の各時点で測定した活性から差し引いた。
【００４４】
薬物動態分析：薬物動態パラメーター（半減期及びＡＵＣ）はコンピューターソフトウェア（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ Ｉｎｃ．のＲＳＴＲＩＰ）により分析した。
【００４５】
統計分析：スチューデントのｔ検定。
【００４６】
２．２ 結果
リポソーム調合タンパク質のマウスにおける薬物動態：
遊離及びリポソーム調合のＦＩＸ及びＧ−ＣＳＦの薬物動態パラメーターをマウスにおいて調べた。表２〜３に示す結果は、ＰＥＧ化リポソームと調合したタンパク質の半減期及び曲線下面積は遊離タンパク質より高かったこと示している。
【００４７】
【表２】
【００４８】
Ｇ−ＣＳＦを５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）を用いて再構成するかまたはＰＥＧ化リポソームと調合し、マウス（１群あたり６匹のマウス）にｓ．ｃ．注射（５０μｌ）した。血漿中のヒトＧ−ＣＳＦ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を酵素結合免疫検定法（ＥＬｉｓａ）により測定した。各マウスについて薬物動態パラメーターを計算した。値は平均値±標準偏差である。ＰｅｇＬｉｐ−Ｇ−ＣＳＦ対Ｇ−ＣＳＦの半減期についてのスチューデントｔ検定 Ｐ＜０．００２。
【００４９】
【表３】
【００５０】
各マウスについて薬物動態パラメーターを計算した。値は平均値±標準偏差である。ＰｅｇＬｉｐ−ＦＩＸ対ＦＩＸの半減期についてのスチューデントｔ検定 Ｐ＜０．１５。
【００５１】
３．実施例１１
３．１ 血友病マウスにおけるインビボでＰＥＧ化リポソームと調合したＦＶＩＩＩの薬物動態及び生物学的活性
未調合第ＶＩＩＩ因子を注射してから１時間後にリポソームを注射することによりインビボでＰＥＧ化リポソームと調合した第ＶＩＩＩ因子の薬物動態及び生物学的活性を血友病マウスにおいて調べた。血友病マウスにａ）遊離（未調合）ＦＶＩＩＩを注射し、ｂ）遊離ＦＶＩＩＩを注射し、１時間後にＰＥＧ化リポソームの第２回注射をした。注射後の異なる時点にマウスから放血させた。ＦＶＩＩＩ活性を凝固アッセイにより測定した。リポソーム調合ＦＶＩＩＩのインビボ止血効果を試験し、遊離ＦＶＩＩＩの効果と比較するために、注射したマウスの尾を注射後の異なる時間に切断し、注射したマウスの生存数を調べた。
【００５２】
表４及び図１０の結果は、インビボでＰＥＧ化リポソームと調合した第ＶＩＩＩ因子の半減期及び曲線下面積は遊離ＶＩＩＩよりも高かったことを示している。従って、ＦＶＩＩＩを注射し、１時間後にリポソームを注射したマウスの生存数は有意に高かった。
【００５３】
【表４】
【００５４】
組換えＦＶＩＩＩ（バイエル社のＫｏｇｅｎａｔｅ−ＦＳ）を水で再構成し、血友病マウス（各群１０匹のマウス）の尾静脈に注射した（４０μｌ）。１時間後にＰＥＧ化リポソーム（９％脂質，ｗ／ｖ）をマウスの１群にi.v.注射した（４０μｌ）。各時点のプール血漿サンプルについてＦＶＩＩＩ活性を１段階凝固アッセイにより調べた。薬物動態パラメーター（半減期及びＡＵＣ）をコンピュータープログラム（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ Ｉｎｃ．のＲＳＴＲＩＰ）により分析した。
【００５５】
４．実施例１２
リアルタイム相互作用分析により、ＰＯＰＣ及びカルバメート結合非帯電リポポリマーからなるリポソームに対するＦＶＩＩＩの結合をＰＯＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧからなるリポソームに対するＦＶＩＩＩの結合と比較した。カルバメート結合非帯電リポポリマー、すなわちｍＰＥＧアミノプロパンジオールジステアロイル（ＤＳ−ｃ−ＰＥＧ）及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−メトキシポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）の概略構造を以下に示す。
【００５６】
【化１】
【００５７】
結果を図１１に示し、両タイプのリポソームがＦＶＩＩＩと相互作用することを示す。
【００５８】
５．実施例１３
凝固第ＶＩＩａ因子は通常、阻害剤を有する血友病患者を治療するため及び外傷性出血（例えば、戦争負傷、自動車事故）を止めるために使用されている。ＰＥＧ化リポソームと調合した第ＶＩＩａ因子の薬物動態をラットにおいて調べた。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（１８０ｇ）に遊離（未調合）ＦＶＩＩａ（Ｎｏｖａ Ｎｏｒｄｉｓｋ）またはＰＥＧ化リポソームと調合したＦＶＩＩａを３６μｇ／ラット注射した。注射後の異なる時間にラットから放血させ、ＦＶＩＩａ活性を凝固アッセイ（Ｓｔａｇｏ）により測定した。表５及び６の結果は、インビボでＰＥＧ化リポソームと調合した第ＶＩＩａ因子の半減期及び曲線下面積は遊離ＦＶＩＩａよりも高かったこと示している。
【００５９】
【表５】
【００６０】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＰＥＧ化リポソームの固定化ＦＶＩＩＩに対するリアルタイム相互作用を示す。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ｒＦＶＩＩＩに結合するが、対照ＰＯＰＣリポソーム（ＰＣ）もＰＯＰＣ：ＤＳＰＥリポソーム（ＰＣ：ＰＥ）も固定化ｒＦＶＩＩＩに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ｒＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）に結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｃ：ＰＥＧ化リポソームは抗ＦＶＩＩＩ抗体（２０ベセスダ単位／ｍｌの力価）を発現している血友病Ａ患者の希釈（×１００）血清の非存在下及び存在（阻害剤）下で固定化ｒＦＶＩＩＩに結合する。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。ａ〜ｃの応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合は固定化ＦＶＩＩＩ被覆チャネルへのＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図２】ＰＥＧ化リポソームの固定化ＦＩＸに対するリアルタイム相互作用。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＦＩＸに結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＦＩＸに結合するが、対照ＰＯＰＣリポソームは固定化ＦＩＸに結合しない。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合はＦＩＸ被覆チャネルへの結合に比して固定化ＦＩＸに対するＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図３】ＰＥＧ化リポソームの固定化Ｇ−ＣＳＦに対するリアルタイム相互作用。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化Ｇ−ＣＳＦに結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化Ｇ−ＣＳＦに結合するが、対照ＰＯＰＣリポソームは固定化Ｇ−ＣＳＦに結合しない。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合はＧ−ＣＳＦ被覆チャネルへの結合に比して固定化Ｇ−ＣＳＦに対するＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図４】ＰＥＧ化リポソームの固定化ＧＭ−ＣＳＦに対するリアルタイム相互作用。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＧＭ−ＣＳＦに結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＧＭ−ＣＳＦに結合するが、対照ＰＯＰＣリポソームは固定化ＧＭ−ＣＳＦに結合しない。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合はＧ−ＣＳＦ被覆チャネルへの結合に比して固定化ＧＭ−ＣＳＦに対するＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図５】ＰＥＧ化リポソームの固定化インターフェロンγに対するリアルタイム相互作用。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＩＦＮγに結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＩＦＮγに結合するが、対照ＰＯＰＣリポソームは固定化ＩＦＮγに結合しない。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合はＩＦＮ−γ被覆チャネルへの結合に比して固定化ＩＦＮ−γに対するＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図６】ＰＥＧ化リポソームの固定化ＧＬＰ−１に対するリアルタイム相互作用。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＧＬＰ−１に結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化ＧＬＰ−１に結合するが、対照ＰＯＰＣリポソームは固定化ＧＬＰ−１に結合しない。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合はＧＬＰ−１被覆チャネルへの結合に比して固定化ＧＬＰ−１に対するＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図７】ＰＥＧ化リポソームは、希釈（×１０）家兎ポリクローナル抗ヒトＦＩＸ抗体（Sigma）の非存在下及び存在（抗体）下で固定化ＦＩＸに結合する。
【図８】コンセンサス配列及びＰＥＧ化リポソームに対するＦＶＩＩＩ結合部位。ａ：各種タンパク質中のＰＥＧ化リポソームを結合するためのコンセンサス配列。保存アミノ酸は赤で示し、非保存アミノ酸は青で示す。ｂ：ヒトＦＶＩＩＩのドメイン構造。ヒトＦＶＩＩＩの不連続ドメイン構造はその一次構造から類推した。リポソーム結合部位は黒四角で示す。Ｔで示す赤色矢印はトロンビン活性化部位を表す。ｃ：ＰＥＧ化リポソームまたはＰＯＰＣリポソーム（ＰＣ）のＣＭ５センサーチップに固定化したＦＶＩＩＩ配列由来ペプチド（１７８３−１７９６アミノ酸）に対する結合。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。
【図９】ＰＥＧ化リポソームの固定化コパキソンに対するリアルタイム相互作用。ａ：ＰＥＧ化リポソームは固定化コパキソンに結合するが、固定化ＨＳＡに結合しない。ｂ：ＰＥＧ化リポソームは固定化コパキソンに結合するが、対照ＰＯＰＣリポソームは固定化コパキソンに結合しない。応答を共鳴単位（ＲＵ）で示す。応答はＨＳＡ被覆チャネルへの非特異的結合について補正した。この非特異的結合はコパキソン被覆チャネルへの結合に比して固定化コパキソンに対するＰＥＧ化リポソームのリアルタイム相互作用の５％未満であった。
【図１０】尾切断後の血友病マウスの生存数。血友病マウスにＦＶＩＩＩ（バイエル社のＫｏｇｅｎａｔｅ−ＦＳ）またはＦＶＩＩＩを注射し、（１時間後に）ＰＥＧ化リポソームを注射した場合をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒｂプロットで示す。Ｔ検定統計分析は群間の統計上有意な差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図１１】モル比９７：３のＰＯＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（スイス国リースタルに所在のＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の脂質）からなるＰＥＧ化リポソーム及びモル比９７：３のＰＯＰＣ：ＤＳ−ｃ−ＰＥＧ２０００（スイス国リースタルに所在のＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の脂質）からなるＰＥＧ化リポソームの固定化ＦＶＩＩＩに対するリアルタイム相互作用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物であって、
前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド、（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド及び（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択され、
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でなく、
前記タンパク質またはポリペプチドはコロイド粒子中に封入されていない前記医薬組成物。
【請求項２】
前記コロイド粒子は実質的に中性であり、前記ポリマーは実質的に実効電荷を持たない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記コロイド粒子は約０．０３〜約０．４ミクロンの平均粒径を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記コロイド粒子は約０．１ミクロンの平均粒径を有する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記両親媒性脂質は天然または合成起源のリン脂質である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記両親媒性脂質はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記両親媒性脂質はカルバメート結合非帯電リポポリマーである、請求項１〜４のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記両親媒性脂質はアミノプロパンジオールジステアロイル（ＤＳ）である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記コロイド粒子は更に天然または合成起源から得られる第２の両親媒性脂質を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記第２の両親媒性脂質はホスファチジルコリンである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
コレステロールが前記組成物に補充されている、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記生体親和性親水性ポリマーはポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記生体親和性親水性ポリマーはポリエチレングリコールである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ポリエチレングリコールは約５００〜約５０００ダルトンの分子量を有する、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ポリエチレングリコールは約２０００ダルトンの分子量を有する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
タンパク質またはポリペプチドはプロトロンビン、第ＶＩＩａ因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）及びコパキソンからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ポリペプチドはコパキソンであり、前記組成物は多発性硬化症、糖尿病性神経障害、老人性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経（ベル）麻痺、緑内障、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん重積持続状態、非動脈炎性視神経異常症、及びビタミン欠乏症から選択される疾患の治療のために使用される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドは第ＶＩＩａ因子であり、前記組成物は阻害剤を有している血友病患者において外傷性出血を治療するために使用される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記タンパク質またはポリペプチドはＳ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）のアミノ酸コンセンサス配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
血友病を患っている患者に対して治療有効量の血友病の治療に有効なタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物を投与することを含む前記患者の治療方法であって、
前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド、（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド及び（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択され、
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でなく、
前記タンパク質またはポリペプチドは前記コロイド粒子中に封入されていない治療方法。
【請求項２１】
前記患者はタンパク質またはポリペプチドに対する阻害剤抗体を発現している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
治療有効量のタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む血友病患者を治療するための非経口投与用医薬組成物の製造におけるコロイド粒子の使用であって、
前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド、（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド及び（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択され、
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でなく、
前記タンパク質またはポリペプチドは前記コロイド粒子中に封入されていない前記使用。
【請求項２３】
前記患者は前記タンパク質またはポリペプチドに対する阻害剤抗体を発現している、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
治療有効量のタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物の製造におけるコロイド粒子の使用であって、
前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド、（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド及び（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択され、
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でなく、
前記タンパク質またはポリペプチドはコロイド粒子中に封入されていない前記使用。
【請求項２５】
病気を患っている患者に対して治療有効量の前記病気の治療に有効なタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物を投与することを含む前記患者の治療方法であって、
前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド、（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド及び（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択され、
前記コロイド粒子と前記タンパク質またはポリペプチドを別々に投与し、
前記タンパク質またはポリペプチドは前記コロイド粒子中に封入されていない前記方法。
【請求項２６】
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記コロイド粒子はリポソームであり、前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である請求項２５に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物であって、前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは：
（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド；
（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド；及び
（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でなく、前記タンパク質またはポリペプチドは前記コロイド粒子中に封入されていない前記医薬組成物。
【請求項２】
前記コロイド粒子は実質的に中性であり、前記ポリマーは実質的に実効電荷を持たない請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記両親媒性脂質は天然または合成起源のリン脂質である請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記両親媒性脂質はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）である請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記両親媒性脂質はカルバメート結合非帯電リポポリマーである請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記両親媒性脂質はアミノプロパンジオールジステアロイル（ＤＳ）である請求項5に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記コロイド粒子は更に天然または合成起源から得られる第２の両親媒性脂質を含む請求項１〜６のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記生体親和性親水性ポリマーはポリエチレングリコールである請求項１〜７のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記タンパク質またはポリペプチドはプロトロンビン、第ＶＩＩａ因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）及びコパキソンからなる群から選択される請求項１〜８のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは第ＶＩＩａ因子であり、前記組成物は阻害剤を有している血友病患者において外傷性出血を治療するために使用され得る請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
治療有効量のタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物であって、前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは：
（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド；
（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド；及び
（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記タンパク質またはポリペプチドは前記コロイド粒子中に封入されておらず、前記コロイド粒子及び前記タンパク質またはポリペプチドは独立している前記医薬組成物。
【請求項１２】
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でない請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記コロイド粒子はリポソームを含み、前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でない請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１】
治療有効量のタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物であって、
前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド、（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド及び（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択され、
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でなく、
前記タンパク質またはポリペプチドはコロイド粒子中に封入されていない前記医薬組成物。
【請求項２】
前記コロイド粒子は実質的に中性であり、前記ポリマーは実質的に実効電荷を持たない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記コロイド粒子は約０．０３〜約０．４ミクロンの平均粒径を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記コロイド粒子は約０．１ミクロンの平均粒径を有する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記両親媒性脂質は天然または合成起源のリン脂質である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記両親媒性脂質はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記両親媒性脂質はカルバメート結合非帯電リポポリマーである、請求項１〜４のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記両親媒性脂質はアミノプロパンジオールジステアロイル（ＤＳ）である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記コロイド粒子は更に天然または合成起源から得られる第２の両親媒性脂質を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記第２の両親媒性脂質はホスファチジルコリンである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
コレステロールが前記組成物に補充されている、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記生体親和性親水性ポリマーはポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記生体親和性親水性ポリマーはポリエチレングリコールである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ポリエチレングリコールは約５００〜約５０００ダルトンの分子量を有する、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ポリエチレングリコールは約２０００ダルトンの分子量を有する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
タンパク質またはポリペプチドはプロトロンビン、第ＶＩＩａ因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）及びコパキソンからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ポリペプチドはコパキソンであり、前記組成物は多発性硬化症、糖尿病性神経障害、老人性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経（ベル）麻痺、緑内障、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん重積持続状態、非動脈炎性視神経異常症、及びビタミン欠乏症から選択される疾患の治療のために使用される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドは第ＶＩＩａ因子であり、前記組成物は阻害剤を有している血友病患者において外傷性出血を治療するために使用される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記タンパク質またはポリペプチドはＳ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）のアミノ酸コンセンサス配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
血友病を患っている患者に対して治療有効量の血友病の治療に有効なタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物を投与することを含む前記患者の治療方法であって、
前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド、（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド及び（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択され、
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でなく、
前記タンパク質またはポリペプチドは前記コロイド粒子中に封入されていない治療方法。
【請求項２１】
前記患者はタンパク質またはポリペプチドに対する阻害剤抗体を発現している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
治療有効量のタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む血友病患者を治療するための非経口投与用医薬組成物の製造におけるコロイド粒子の使用であって、
前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド、（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド及び（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択され、
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でなく、
前記タンパク質またはポリペプチドは前記コロイド粒子中に封入されていない前記使用。
【請求項２３】
前記患者は前記タンパク質またはポリペプチドに対する阻害剤抗体を発現している、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
治療有効量のタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物の製造におけるコロイド粒子の使用であって、
前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド、（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド及び（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択され、
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でなく、
前記タンパク質またはポリペプチドはコロイド粒子中に封入されていない前記使用。
【請求項２５】
病気を患っている患者に対して治療有効量の前記病気の治療に有効なタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物を投与することを含む前記患者の治療方法であって、
前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド、（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド及び（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択され、
前記コロイド粒子と前記タンパク質またはポリペプチドを別々に投与し、
前記タンパク質またはポリペプチドは前記コロイド粒子中に封入されていない前記方法。
【請求項２６】
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記コロイド粒子はリポソームであり、前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である請求項２５に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物であって、前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは：
（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド；
（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド；及び
（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でなく、前記タンパク質またはポリペプチドは前記コロイド粒子中に封入されていない前記医薬組成物。
【請求項２】
前記コロイド粒子は実質的に中性であり、前記ポリマーは実質的に実効電荷を持たない請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記両親媒性脂質は天然または合成起源のリン脂質である請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記両親媒性脂質はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）である請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記両親媒性脂質はカルバメート結合非帯電リポポリマーである請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記両親媒性脂質はアミノプロパンジオールジステアロイル（ＤＳ）である請求項5に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記コロイド粒子は更に天然または合成起源から得られる第２の両親媒性脂質を含む請求項１〜６のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記生体親和性親水性ポリマーはポリエチレングリコールである請求項１〜７のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記タンパク質またはポリペプチドはプロトロンビン、第ＶＩＩａ因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）及びコパキソンからなる群から選択される請求項１〜８のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは第ＶＩＩａ因子であり、前記組成物は阻害剤を有している血友病患者において外傷性出血を治療するために使用され得る請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
治療有効量のタンパク質またはポリペプチド及びコロイド粒子を含む非経口投与用医薬組成物であって、前記粒子は生体親和性親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性脂質を約１〜２０モル％含み、
前記タンパク質またはポリペプチドは：
（ａ）前記コロイド粒子に外部結合し得るタンパク質またはポリペプチド；
（ｂ）ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーのポリマーに結合し得るタンパク質またはポリペプチド；及び
（ｃ）Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｌ／Ｉ／Ｖ−Ｉ／Ｖ／Ｑ／Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ及びＱは一般的意味を有する）のコンセンサス配列を含むタンパク質またはポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記タンパク質またはポリペプチドは前記コロイド粒子中に封入されておらず、前記コロイド粒子及び前記タンパク質またはポリペプチドは独立している前記医薬組成物。
【請求項１２】
前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でない請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記コロイド粒子はリポソームを含み、前記タンパク質またはポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）でない請求項11に記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００６−５２３６８３（Ｐ２００６−５２３６８３Ａ）
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０７６０７（Ｐ２００６−５０７６０７）
【出願日】平成１６年４月１５日（２００４．４．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００４／０００３２７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９１７２３
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５００４９８６７１）オッパーバス・ホールディング・ビー・ブイ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１５日（２００４．４．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００４／０００３２７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９１７２３
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５００４９８６７１）オッパーバス・ホールディング・ビー・ブイ (1)
【Ｆターム（参考）】
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