チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物およびそのエピマー
チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物、およびその対応するエピマーは、チゲサイクリンで処理されたヒトにおいて同定された。質量スペクトルデータを用いて、これらの構造が特定された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルクロニドに関し、さらに詳細には、チゲサイクリンのグルクロニド誘導体、その調製法およびこれを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
チゲサイクリン（ＧＡＲ−９３６）はグリシルサイクリン抗生物質および半合成テトラサイクリン、ミノサイクリンの類似体である。これは抗生物質に対して新たに発生する耐性の世界的な脅威に対して開発された。チゲサイクリンは、インビトロおよびインビボのどちらにおいても広範囲に及ぶ抗菌活性を有する。グリシルサイクリン抗生物質、例えばテトラサイクリン抗生物質は、細菌におけるタンパク質翻訳を阻害することにより作用する。
【０００３】
グリシルサイクリン、例えばチゲサイクリンは、多くの抗生物質耐性グラム陽性病原菌 、例えば、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ペニシリン耐性ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびバンコマイシン耐性腸球菌に対して活性である（Ｗｅｉｓｓら、１９９５；Ｆｒａｉｓｅら、１９９５）。大変重要なのは、排出およびリボソーム保護というテトラサイクリン耐性の２つの主な形態を有する細菌種に対するチゲサイクリンの活性である（ＳｃｈｎａｐｐｉｎｇｅｒおよびＨｉｌｌｅｎ、１９９５）。
【０００４】
テトラサイクリン抗生物質は、代謝をほとんどまたは全く受けない。ミノサイクリン９−ヒドロキシル化およびＮ−脱メチル化がヒトにおいて報告されているが、ごく限られた程度である（ＮｅｌｉｓおよびＤｅＬｅｅｎｈｅｅｒ、１９８２）。Ｃ４位でのエピマー化がほとんどのテトラサイクリン抗生物質について報告されており、一般に、代謝経路ではなく分解と見なされている（Ｒｅｍｍｅｒｓら、１９６３）。健康な男性ボランティアに静脈内投与した後の［１４Ｃ］チゲサイクリンの代謝動態を分析し、本研究から得られた結果をラットよびイヌにおける臨床前代謝研究において得られた結果と比較した。
【０００５】
［１４Ｃ］チゲサイクリンを健康な男性ボランティアに静脈内投与した後、血清、尿および大便中の放射標識されたチゲサイクリンベースの化合物に関して分析を行った。非放射性チゲサイクリンを男性ボランティアに静脈内投与した後のヒト血清および尿の分析後に同様の結果が報告され、この場合、最小代謝が報告された。非標識実験は、ラットおよびイヌを用いた代謝実験からの結果と一致し、この場合、チゲサイクリンは、静脈内投与後の血漿および尿中の主な化合物関連成分であった。
【０００６】
チゲサイクリンおよびＭ３ａ（ｔ−ブチルアミノ酢酸）のエピマーも各マトリックスにおいて観察された。チゲサイクリンのエピマーは、代謝物であるよりも分解物であることが証明されており、ラットおよびイヌ、血漿および尿、ならびにヒト血清および尿において観察されている。チゲサイクリンの多くはこれらのマトリックスについて用いられる抽出手順の代打にエピマーに変換されるので、血清および大便サンプル中のチゲサイクリンエピマーの量は過大評価されがちである。初期に溶出されるクロマトグラフィーピークは、Ｍ３ａと推定され、これもラット、イヌ、血漿および尿において観察される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本研究から得られた血清、尿および大便中で検出されたチゲサイクリン関連化合物をスキーム１において示す。
スキーム１ ヒト血清、尿および大便中で検出された［１４Ｃ］チゲサイクリン関連化合物
【化１】
【０００８】
Ｍ６（チゲサイクリングルクロニドのエピマー）およびＭ７（チゲサイクリングルクロニド）はどちらも血清および大便サンプルラジオクロマトグラムにおいて観察された。グルクロン酸化部位は未知のままである。代謝産物およびそのエピマーの可能な構造を以下に示す：
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【０００９】
Ｍ６でなくＭ７が尿サンプルのラジオクロマトグラムにおいて観察された。チゲサイクリンのグルクロン酸化は、ヒト肝臓ミクロソームまたはヒト肝細胞を用いてインビトロで、あるいはラット、イヌまたはヒトにおいてインビボではこれまでに報告されていない。ヒト血清および尿の従来の分析は、標識されていないチゲサイクリンを用い、チゲサイクリン代謝の予備的評価のためにＬＣ／ＭＳによるサンプル分析を用いて行われた。この実験の間、グルクロニド代謝産物は特に調査されなかった。［１４Ｃ］チゲサイクリンを用いてインビボのラットよびイヌサンプルの分析を行い、グルクロン酸化は観察されなかった。テトラサイクリン抗生物質についての代謝経路としてグルクロン酸化を特定する科学文献において周知の報告はない。
【００１０】
代謝産物Ｍ６およびＭ７は、チゲサイクリンのプロドラッグとして使用することができる。投与されると、β−グルクロニダーゼ酵素はＭ６およびＭ７を開裂させて、チゲサイクリンを放出することができる。チゲサイクリンの直接投与でなく、Ｍ６またはＭ７としての投与は、薬剤の吸収、分布、代謝、排出および／または副作用を変更し得る。さらに、これらの化合物は抗菌剤として直接役立つ。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、ヒトにおいて５０ｍｇ用量の［１４Ｃ］チゲサイクリンを１回静脈内投与した後の尿および大便中の放射能の削減にための平均（ＩＳＤ）である。
【００１２】
図２は、長時間にわたる血清中の平均（ＩＳＤ）チゲサイクリンおよび放射能濃度である。
【００１３】
図３Ａは、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後１時間で対象１から抽出されたヒト血清のＨＰＬＣラジオクロマトグラムを示す。
【００１４】
図３Ｂは、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後８時間で対象１から抽出されたヒト血清のＨＰＬＣラジオクロマトグラムを示す。
【００１５】
図４は、［１４Ｃ］ チゲサイクリンの投与後８時間で対象１から抽出されたヒト血清の複合ＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムである。
【００１６】
図５Ａは、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後０〜４時間で集められた対象４からのヒト尿のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【００１７】
図５Ｂは、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後２４〜４８時間で集められた対象４からのヒト尿のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【００１８】
図５Ｃは、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後２４〜４８時間で集められた対象４からのヒト大便のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【００１９】
図６は、ヒト尿中、３７℃でインキュベートされた［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性である。
【００２０】
図７は、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後０〜４時間で集められた対象８からのヒト尿の複合質量クロマトグラムである。
【００２１】
図８は、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後３４．２時間で集められた対象８からの抽出されたヒト大便のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【００２２】
図９は、チゲサイクリンのｍ／ｚ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【００２３】
図１０は、チゲサイクリンのエピマーのｍ／ｚ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【００２４】
図１１は、Ｍ２のｍ／ｚ６０２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【００２５】
図１２Ａは、ヒト尿から単離されたＭ３ａのラジオクロマトグラムである。
【００２６】
図１２Ｂは、ヒト尿から単離されたＭ３ａの質量クロマトグラムである。
【００２７】
図１３は、Ｍ３ａのＬＣ／ＭＳ質量スペクトルである。
【００２８】
図１４は、ヒト血清におけるＭ３（９−アミノミノサイクリン）についてのｍ／ｚ４７３→４５６ＳＲＭ遷移のＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムである。
【００２９】
図１５は、Ｍ６のＭ／Ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【００３０】
図１６は、Ｍ７のＭ／Ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【００３１】
図１７は、Ｍ９のＭ／Ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【００３２】
図１８は、チゲサイクリングルクロニドの提案された構造および質量スペクトルフラグメンテーションスキームである。
【００３３】
図１９Ａは、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析から得られたＵＶクロマトグラムである。
【００３４】
図１９Ｂは、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析からの選択された質量クロマトグラムである。
【００３５】
図１９Ｃは、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析からの選択された質量クロマトグラムである。
【００３６】
図２０Ａは、チゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンのフルスケールプロットであり；（Ｂ）は強度が低いプロダクトイオンを示すために拡大されたプロットである。
【００３７】
図２０Ｂは、強度が低いプロダクトイオンを示すために拡大されたチゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンのプロットである。
【００３８】
図２１Ａは、低強度プロダクトイオンを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【００３９】
図２１Ｂは、低強度プロダクトイオンを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【００４０】
図２１Ｃは、低強度プロダクトイオンを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【００４１】
図２１Ｄは、全イオンクロマトグラムを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【００４２】
図２２は、ヒト血清中、３７℃でインキュベートされた［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性である。
【００４３】
図２３Ａは、ヒト尿から集められたＨＰＬＣフラクションの直接注入から得られるチゲサイクリングルクロニドのプロダクトイオンを示す。
【００４４】
図２３Ｂは、ヒト尿から集められたＨＰＬＣフラクションの直接注入から得られるｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを示すチゲサイクリングルクロニドの質量スペクトルである。
【００４５】
図２４Ａは、ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドＬＣ／ＭＳ分析から得られたチゲサイクリングルクロニドのＬＣ／ＭＳスペクトルである。
【００４６】
図２４Ｂは、ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドのＬＣ／ＭＳ分析から得られたチゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのＭＳ２である。
【００４７】
図２４Ｃは、ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドＬＣ／ＭＳ分析から得られたチゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのＭＳ２である。
【００４８】
図２４Ｄは、ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドのＬＣ／ＭＳ分析から得られるチゲサイクリングルクロニドのプロダクトイオンを示す。
【００４９】
図２５は、合成Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）のＨＰＬＣ分析から得られるＵＶクロマトグラムである。
【００５０】
図２６Ａは、チゲサイクリンのｍ／ｚ５８６の衝突活性化解離から得られるＭＳ／ＭＳスペクトルの提案されたフラグメンテーションスキームである。
【００５１】
図２６Ｂは、チゲサイクリンのｍ／ｚ５８６の衝突活性化解離から得られるＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【００５２】
図２７Ａは、チゲサイクリンのエピマーのｍ／ｚ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンを示す。
【００５３】
図２７Ｂは、チゲサイクリンのエピマーのｍ／ｚ５８６質量スペクトルである。
【００５４】
図２８Ａは、Ｍ３のｍ／ｚ４７３質量スペクトルのプロダクトイオンを示す。
【００５５】
図２８Ｂは、Ｍ３のｍ／ｚ４７３質量スペクトルである。
【００５６】
図２９Ａは、Ｍ７のｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを示す。
【００５７】
図２９Ｂは、Ｍ７のｍ／ｚ７６２質量スペクトルである。
【００５８】
図３０は、ｍ／ｚ５１５→４９８トレースにおいて示されるＭ９を有するウサギ血清におけるチゲサイクリンとその代謝産物のＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムを示す。
【００５９】
図３１は、ウサギ血清の複合ＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムである。
【００６０】
図３２は、マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびヒトにおけるチゲサイクリンの提案された代謝経路を示すスキームである。
【００６１】
ヒトをチゲサイクリンで処理することにより、チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物がそのエピマーとともに産生されることが見出された。代謝物およびそのエピマーはどちらもヒト血清、尿、および大便中で見出され、その後抽出され、分析された。本発明の詳細な実験態様は、比較例１〜３および実施例１〜１０において記載され、６人の健康な男性ボランティアに投与されたチゲサイクリンの質量バランスおよび代謝産物特性を説明する。比較例１〜３は、これらの媒体におけるチゲサイクリンの相対的安定性を決定するのを助けるために使用される血清、尿および大便における対照実験を検討する。一方、実施例１〜１０は、前記の６人のボランティアに対して行われた実験に関する。
【００６２】
スキーム１を参照して、代謝産物Ｍ３（９−アミノミノサイクリン）、Ｍ８（Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリンのエピマー）およびＭ９（Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン）も血清および尿のＬＣ／ＭＳ分析により検出された。これらの代謝産物がｔ−ブチルアミノアセチルアミノ側鎖のアミド加水分解後に形成されたので、これらは放射標識されなかった。従って、血清および尿中のこれらの代謝産物の濃度は、ＬＣ／ＭＳデータからのみ評価できた。これらのデータに基づいて、Ｍ３およびＭ８は血清および尿中の副次的な代謝産物であるようであり、一方、Ｍ９は血清においては副次的な代謝産物であるようであるが、尿中ではＭ７と匹敵する濃度で存在する。Ｍ３はラット、イヌおよびヒト尿および血漿（ヒトについては血清）において報告されているが、Ｎ−アセチル代謝物（Ｍ８およびＭ９）は以前には報告されていない。代謝産物Ｍ８およびＭ９は放射標識されなかったので、従来のラットおよびイヌ代謝研究からのサンプル中に存在していたが、ＬＣ／ＭＳにより特異的に調査されなかったので検出されなかった。
【００６３】
ヒト排泄物中の放射能の平均合計回収率は９１．８％であり（±５．６、ｎ＝３）、尿中に３３．２±１．９％、大便中に５８．６％±４．４％排出された（図１）。これらのデータは、ラットおよびイヌからえられたデータと一致し、１回の静脈内［１４Ｃ］チゲサイクリン投与の約８９％（ケージリンスを含む）が各試験片中に回収された。ラットにおいて、３４％が尿中に、５３％が大便中に回収され、一方、イヌにおいては、３６％が尿中に、４７％が大便中に回収された。
【００６４】
血清中の放射能は、血清中のチゲサイクリン濃度よりもはるかに急速に減少した（図２）。この違いは、［１４Ｃ］チゲサイクリンの投与前に組織に分布する有意量の未標識チゲサイクリンにより引き起こされやすいが、これは［１４Ｃ］ チゲサイクリンの組織内取り込みの一部を制限する。この「後入れ先出し（ｌａｓｔ−ｉｎ、ｆｉｒｓｔ−ｏｕｔ）」現象は、おそらくはチゲサイクリンと比較した全放射能について遙かに少ない体積の分布および遙かに高いクリアランスをもたらす可能性が最も高かった。
【００６５】
［１４Ｃ］チゲサイクリン投与量の約５０％が最初の４８時間で回収された（尿中２７％、大便中２４％）。分析された尿サンプルにおいて、投与量の１５％が未変化チゲサイクリンとして、２．０％がチゲサイクリンのエピマーとして、４．１％がＭ７として、６．３％がＭ３ａとして排出された。大便ホモジネートサンプルにおいて、投与量の９．９％が未変化チゲサイクリンとして、５．５％がチゲサイクリンエピマーとして、５．４％がグルクロニド（Ｍ６＋Ｍ７）として、１．５％がＭ３ａとして排出された。Ｍ３ａとして排出された放射能は、形成されたＭ３、Ｍ８およびＭ９の量と等しいとみなされ、これは投与量の約８％であった。しかしながら、代謝産物Ｍ３、Ｍ８およびＭ９は放射標識を含有しなかったので、その血清、尿および大便中の濃度は、正確に評価できなかった。
【００６６】
ＬＣ／ＭＳを使用して、微量のヒドロキシチゲサイクリン代謝産物（Ｍ１、Ｍ２およびＭ４）が尿中で検出されたが、ラジオクロマトグラフィーにより検出されなかった。これらのヒドロキシチゲサイクリン代謝産物は以前にラットおよびイヌ、血漿および尿、ならびにヒト血清および尿における微量の代謝産物として報告されていない。しかしながら、従来報告され、評価されたこれらの代謝産物のヒト血清および尿中の濃度は、本研究におけるラジオクロマトグラフィーの検出の下限より低い。チゲサイクリンのＮ−デスメチル代謝産物はラット血漿および尿、ならびに従来の研究から得られたヒト尿サンプルにおいて微量代謝産物として報告された。この代謝産物は本研究において分析されたサンプルのいずれにおいても検出されなかった。
【００６７】
本研究は、［１４Ｃ］標識されたチゲサイクリン用量の体内動態のみを評価し、未標識用量から残存するチゲサイクリン関連生成物を明らかにしなかった。したがって、本明細書において報告されている、チゲサイクリン関連生成物の推定濃度は、血清、尿および大便中のこれらの成分の実際の濃度を過小評価すると予想された。実際、本研究から得られた血清および尿サンプル中の全チゲサイクリン（放射標識されたものおよび未標識のもの）の濃度は、［１４Ｃ］チゲサイクリン用量の放射能濃度および比活性度を用いて同じサンプルについて計算された濃度よりも一貫して大きかった（一般に１０〜３００％大きかった）。これは、本研究において用いられる投与計画（未標識用量を複数回、それに続いて［１４Ｃ］標識用量を１回）およびチゲサイクリンについて報告されている長い半減期に基づくと予想されないものではなかった。
【００６８】
従って、チゲサイクリンを複数回静脈内投与し、それに続いて［１４Ｃ］標識チゲサイクリン投与量を１回健康な男性ボランティアに投与した後、血清、尿および大便中の主な放射標識された成分は未変化チゲサイクリンであった。チゲサイクリンの主な代謝経路は、グルクロン酸化およびアミド加水分解とそれに続くＮ−アセチル化であった。分解生成物であるチゲサイクリンのエピマーも各サンプルにおいて検出された。
【００６９】
血清、尿および大便中のチゲサイクリン関連成分の濃度を他の場所で報告されている全放射能濃度に基づいて計算した。投与量の比活性度（１．００μＣｉ／ｍｇ）を用いてこれらの濃度をｎｇ−チゲサイクリン当量に換算した。この値を用いて、特異成分の濃度を次にラジオクロマトグラムにおける放射能の分布に基づいて評価した。これらの濃度は、［１４Ｃ］標識されたチゲサイクリン用量の体内動態のみを反映し、未標識用量から残存する任意のチゲサイクリン関連生成物の原因でない。
【００７０】
投与後１時間および８時間での対象１からの血清抽出物の代表的ＨＰＬＣラジオクロマトグラムを図３Ａおよび３Ｂに示す。血清抽出物についての代謝産物プロファイルは、異なる対象および異なる時点について類似していた。表１は、血清抽出物中の放射能の相対分布および各［１４Ｃ］チゲサイクリン関連成分の推定濃度を示す。
【表１】
ａ．相対分布は、重複サンプルから得られたＨＰＬＣラジオクロマトグラムにおけるピークの面積積分により決定された。
ｂ．かっこ内で、ｎｇ−チゲサイクリン当量／ｍＬとしての相対濃度は、血清放射能濃度（ｎｇ−チゲサイクリン当量／ｍＬとして）にＨＰＬＣラジオクロマトグラムからの分布（％）をかけることにより推定された。
ｃ．検出の限界は、１ｎｇ当量／ｍＬであった。
ｄ．血清抽出物中で観察されるチゲサイクリンエピマーの多くは、おそらくは抽出プロセスの結果であった、
ＮＤ．は代謝産物が検出されず、０が割り当てられたことを示す。
【００７１】
濃度は、投与量溶液の比活性度、他の場所で報告された血清放射能濃度、および各サンプル中の放射能の相対分布に基づいて推定された。すべての時点での全患者について、チゲサイクリンは検出された主な薬剤関連成分であり、１時間で放射能の６３％を占め、４時間および８時間でそれぞれ４８％および４６％まで減少した（表１）。
【００７２】
チゲサイクリンのエピマーは、存在する次に最も豊富な薬剤関連成分であり、放射能の約２０％に相当した。しかしながら、血清抽出物中のチゲサイクリンの大部分は抽出プロセスの間に形成され得る。抽出中に形成されたエピマーを補正した後、血清サンプル中のエピマーの量は５から８％の間に減少し、チゲサイクリンの量は５９から８０％に増加する。チゲサイクリングルクロニド（Ｍ７）は１時間での放射能の１％未満に相当するが、４および８時間で９および１２％に増加した。チゲサイクリンエピマーのグルクロニド（Ｍ６）は分析された血清サンプルの約半分において検出され、放射能の４％未満を占めた。初期に溶出するクロマトグラフィーピーク（Ｍ３ａ、ｔ−ブチルアミノ酢酸）（保持時間４〜７分）はすべての血清サンプルにおいて検出され、放射能の１０から２０％を占めた。図４は、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）モードにおいて、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて集められた、血清中で検出されたチゲサイクリン関連化合物、例えば、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）、Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリンのエピマー（Ｍ８）およびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）の複合ＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムを示す。ｔ−ブチルアミノアセチルアミノ側鎖が開裂され、放射能フロー検出を用いて定量化できなかったので、これらの代謝産物は放射標識されなかった。ＬＣ／ＭＳ分析に基づくと、これらは血清中の副次的代謝産物であった。
【００７３】
放射活性用量の約２７％は、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後４８時間以内に尿中に排出された。投与後０〜４時間および２４〜４８時間で集められた対象４からの尿の代表的なラジオクロマトグラムを図５Ａ〜５Ｃに示す。尿の代謝産物プロファイルは、患者間および異なる時点で類似していた。尿サンプル中の放射能の相対分布および尿中の各［１４Ｃ］チゲサイクリン関連成分の推定濃度を表２に示す。
【表２】
ａ．相対分布は、重複サンプルから得られたＨＰＬＣラジオクロマトグラムにおけるピークの面積積分により決定された。
ｂ．かっこ内で、μｇ−チゲサイクリン当量／収集としての相対的濃度は、全尿放射能（μｇ−チゲサイクリン当量）にＨＰＬＣラジオクロマトグラムから得られた分布（％）をかけることにより推定された。
ｃ．検出限界は９０ｎｇ当量／ｍＬであった。
ｄ．対象６について、２４〜４８時間収集は部分的収集であった。
ｅ．ＮＤは、代謝産物が検出されず、０を割り当てられたことを示す。
【００７４】
濃度は投与量溶液の比活性度、他の場所において報告された尿放射能濃度、および各サンプルにおける放射能の相対分布に基づいて推定された。［１４Ｃ］チゲサイクリン関連成分のそれぞれとして尿および大便中に排出された［１４Ｃ］チゲサイクリン用量のパーセントを表３に示す。
【表３】
ａ．対象＃６からの尿および大便収集は不完全であったために、２４〜４８時間の尿、合計尿、大便サンプルおよび合計について、ｎ＝５であった。
ｂ．大便ホモジネート抽出物中で観察されるチゲサイクリンエピマーの多くは抽出プロセスの結果である可能性が高かった。
ＮＤは代謝産物が検出されなかったことを示す。
【００７５】
すべての対象について、チゲサイクリンは表２の尿中に排出された主な薬剤関連成分であり、用量の約１５％は最初の４８時間以内に未変化薬剤として尿中に排出された（表３）。チゲサイクリンのエピマーとして同定される尿放射能の量は、０〜４時間収集における放射能の５％から２４〜４８時間収集における１１％まで増加した。安定性分析は尿中３７℃でインキュベートされた場合にチゲサイクリンが分解してエピマーになることを証明しているので、エピマーの一部は、膀胱において形成され得る（図６）。放射活性用量の合計２％は最初の４８時間以内にチゲサイクリンのエピマーとして尿中に排出された。代謝産物Ｍ７は、０〜４時間収集においては副次的成分にすぎなかったが、４〜８時間、８〜２４時間および２４〜４８時間に集められたサンプルにおいて尿放射能の約２０％に相当した。Ｍ３ａは尿中の放射能の約１５〜３７％に相当し、時間とともにチゲサイクリンに比べて増加した。
【００７６】
４８時間以内に尿中に排出される代謝産物Ｍ３ａおよびＭ７の量は、放射活性用量のそれぞれ６および４％を占めた。図７は、尿中で検出されたチゲサイクリン関連化合物の複合クロマトグラムを示す。放射標識されたヒドロキシチゲサイクリン代謝産物（Ｍ１、Ｍ２およびＭ４）、ならびにＭ６は、尿中の放射能の１％未満を占める微量の尿代謝産物であると見なされた。代謝産物Ｍ３、Ｍ８およびＭ９は放射標識されず、したがって相対量はＬＣ／ＭＳ分析に基づいてしか評価できなかった。ＬＣ／ＭＳデータに基づいて、Ｍ３およびＭ８は副次的な代謝産物であり、一方、Ｍ９はＭ７と類似した濃度で存在した。
【００７７】
放射活性投与の４８時間以内に、放射能の約２４％が大便中に回収された。投与後約３４時間で集められた対象８からの大便抽出物の代表的なＨＰＬＣラジオクロマトグラムを図８に示す。大便の代謝産物プロファイルは対象間および集められたすべてのサンプルについて類似していた。大便抽出物中の放射能の相対分布および大便中の各［１４Ｃ］チゲサイクリン関連成分の推定濃度を表３に示す。
【表４】
ａ．相対分布は、重複サンプルから得られたＨＰＬＣラジオクロマトグラムにおけるピークの面積積分により決定された。
ｂ．かっこにおいて、全大便放射能（ｍｇ−チゲサイクリン当量として）にＨＰＬＣラジオクロマトグラムから得られた分布（％）をかけることによりｍｇ−チゲサイクリン当量／収集としての相対的濃度を推定した。
ｃ．検出の限界は、ホモジネート１ｇあたり０．１５μｇ当量であった。
ｄ．大便ホモジネート抽出物において観察されるチゲサイクリンエピマーの多くは、抽出プロセスの結果である可能性が高い。
ｅ．他のクロマトグラフィーピークは、４１から４６分の間の保持時間を有していた。
ＮＤは代謝産物が検出されなかったことを示す。
対象６からは大便サンプルを受け取らなかった。
【００７８】
投与量溶液の比活性度、他の場所で報告されている大便放射能濃度、および各サンプル中の放射能の相対分布に基づいて濃度を推定した。すべての大便サンプルについて、チゲサイクリンは主な薬剤関連成分であり、大便放射能の２８〜５１％を占めていた（表３）。これは４８時間以内の大便において未変化薬剤として排出された放射活性用量の１０％に相当した（表２）。チゲサイクリンのエピマーは大便放射能の１２〜２７％に相当し、放射活性用量の５．５％に相当していた。血清に関して、有意な量のチゲサイクリンエピマーが抽出プロセスの間に形成された。抽出プロセスの間に形成されたエピマーについて補正すると、エピマーの量はサンプルすべてにおいて１２％未満に減少し、一方、チゲサイクリンの量は３９から６６％の間に増加した。代謝産物Ｍ７は大便中の放射能の１０〜２６％に相当し、一方、Ｍ６は最高９％までに相当した。０〜４８時間の大便サンプル中のグルクロニド代謝産物は放射活性用量の約５．５％に相当した。Ｍ３は大便中の放射能の４から１４％の間に相当し、用量の２％未満が大便中にＭ３ａとして排出された。大便放射能の最高１６％までに相当し、用量の約２％に相当するさらなるピークがいくつかの大便サンプルにおいて観察された。大便サンプルのＬＣ／ＭＳ分析は追加の代謝産物を検出しなかった。
【００７９】
血清、尿および大便において観察されるチゲサイクリン関連化合物のまとめを表４に示す。
【表５】
【００８０】
ヒト血清、尿および大便における特性化されたチゲサイクリン代謝産物についての質量スペクトルデータを以下で検討する。
【００８１】
ＬＣ／ＭＳ分析を用いて、ヒト血清、尿および大便、ならびにラットおよびイヌ血漿および尿におけるチゲサイクリン代謝産物の特性化を行った（表５）。これらの代謝産物の構造をスキーム１に示す。標準的クロマトグラフィー技術を用いて実質的に純粋なＭ６またはＭ７を単離できることが期待される。たとえば、実施例７、８および９において用いられるＨＰＬＣパラメータはＭ６およびＭ７の実質的に純粋なアリコートを提供することが期待される。
【００８２】
従って、さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されたようなチゲサイクリン代謝産物を実質的に純粋な形態、例えば、≧約９０％、好ましくは≧約９５％またはそれ以上、例えば、９８％の純度を有する形態で提供する。
【表６】
【００８３】
チゲサイクリンは、血清、尿および大便において観察された。チゲサイクリン真正標準のマススペクトル特性を代謝産物との比較のために調べた。チゲサイクリンのＬＣ／ＭＳスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン、［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ ５８６で観察された。チゲサイクリンのｍ／ｚ ５８６の衝突活性化解離から得られたＭＳ／ＭＳスペクトルおよび提案されたフラグメンテーションスキームを図９に示す。ｍ／ｚ ５８６からのＮＨ３の欠失は、ｍ／ｚ５６９プロダクトイオンを生成した。ｍ／ｚ ５１３でのプロダクトイオンはｔ−ブチルアミノアセチルアミノ（ＴＢＡＡＡ）側鎖からのｔ−ブチルアミノ基の欠失を表す。全ＴＢＡＡＡ側鎖の欠失およびそれに続く４−ジメチルアミノ基の欠失は、それぞれｍ／ｚ ４５６および４１１でプロダクトイオンを生成した。ｍ／ｚ ２１１でのプロダクトイオンは、フラグメンテーションスキームにおいて示すように、テトラサイクリン環のＤ環に由来していた。ｍ／ｚ ８６イオンは、ｔ−ブチルアミノメチレン基を表していた。
【００８４】
チゲサイクリンのエピマーは、血清、尿および大便において観察された。この生成物は、［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ ５８６で生成した。図１０において示されるｍ／ｚ ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンは、ｍ／ｚ ５６９、５１３、４５６、４１１、２１１、１５４および８６を包含し、これらはチゲサイクリンについても存在していた。エピマーとしての同定は、チゲサイクリンよりも短いその相対的保持時間に基づいて行われた。
【００８５】
代謝産物Ｍ１、Ｍ２およびＭ４は、尿において微量で観察された。これらの代謝産物は、［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ ６０２で産生した。提案されたフラグメンテーションスキームおよびＭ２のｍ／ｚ６０２質量スペクトルのプロダクトイオンを図１１に示す。ｍ／ｚ ５２９および４７２でのプロダクトイオンは、チゲサイクリンについて、それぞれｍ／ｚ５１３および４５６での対応するイオンよりも１６ Ｄａ大きかった。このことは、ｔ−ブチルアミノ−アセチルアミノ基ではなく、テトラサイクリン環が代謝の部位であることを示す。ｍ／ｚ２１１でのプロダクトイオンの存在は、チゲサイクリンについても観察され、代謝の部位としてのテトラサイクリンのＤ環を排除した。Ｍ１およびＭ４についての質量スペクトルデータは、ｍ／ｚ２１１プロダクトイオンがＭ１またはＭ４のいずれかについて観察されない以外は、Ｍ２についてと同様であった。従って、Ｍ１、Ｍ２およびＭ４代謝産物は、テトラサイクリン部分の酸化の生成物であった。
【００８６】
代謝産物Ｍ３ａは、血清、尿および大便において、初期に溶出するラジオクロマトグラムピークとして観察された。この初期に溶出するＭ３ａピークをヒト尿から単離し、その後、通常相ＨＰＬＣを用いてＬＣ／ＭＳ分析して、図１２Ａおよび１２Ｂにおいて示すラジオクロマトグラムおよび質量クロマトグラムを得た。Ｍ３ａについての［Ｍ＋Ｈ］＋および［ＭＨ＋ＣＨ３ＣＮ］＋はそれぞれ、図１３において示すようにｍ／ｚ １３２および１７３で観察された。これは、１３１の分子量を示した。代謝産物Ｍ３は放射標識の欠失のためにＬＣ／ＭＳによってのみ微量で血清および尿において観察された。代謝産物Ｍ３の［Ｍ＋Ｈ］＋ は、ｍ／ｚ ４７３で観察された。ｍ／ｚ ４７３質量スペクトルのプロダクトイオンは、ＮＨ３の欠失から生成したｍ／ｚ ４５６（データは省略）を包含し、これはチゲサイクリン関連化合物に特徴的であった。血清サンプルにおいて、この代謝産物は、図１４において示されるようなｍ／ｚ ４７３→４５６ ＳＲＭ遷移をモニターすることにより観察された。Ｍ３のＣＬ−３１８６１４（９−アミノミノサイクリン）としての同定は、イヌの代謝研究において行われた。代謝産物Ｍ３は、ＴＢＡＡＡ側鎖の放射標識されたｔ−ブチルアミノ酢酸（Ｍ３ａ）でのアミド加水分解により副生成物として生成することが提案された。
【００８７】
代謝産物Ｍ６およびＭ７は血清、尿および大便において観察された。Ｍ６およびＭ７の［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ ７６２で観察され、これはチゲサイクリンよりも１７６ Ｄａ大きかった。Ｍ６およびＭ７の質量スペクトルデータは類似していた。ｍ／ｚ７６２でのプロトン化分子イオンピークは、チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物またはその対応するエピマーの存在を示す。Ｍ６およびＭ７のｍ／ｚ ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンをそれぞれ図１５および１６に示す。Ｍ６およびＭ７のプロダクトイオンはｍ／ｚ ５８６、５６９、５１３、２１１、および８６、ならびにＭ７については１５４で存在していた。Ｍ６およびＭ７について、１７６ Ｄａのニュートラルロスはｍ／ｚ ５８６を生成し、これはチゲサイクリンについての［Ｍ＋Ｈ］＋であり、チゲサイクリンのグルクロニドを示した。ｍ／ｚ ５６９、５１３、４５６、２１１、１５４（ｍ／ｚ １５４はＭ７については観察されたが、Ｍ６については観察されなかった）および８６でのプロダクトイオンもチゲサイクリンについて観察された。代謝産物Ｍ６は、Ｍ７よりも早いＨＰＬＣ保持時間に基づいてＭ７のエピマーであることが提案された。これはチゲサイクリンよりも早期に溶出するチゲサイクリンエピマーと一致した。したがって、Ｍ６およびＭ７はそれぞれチゲサイクリンエピマーおよびチゲサイクリンのグルクロニドであることが提案された。
【００８８】
代謝産物Ｍ８およびＭ９は、血清および尿中で、ＬＣ／ＭＳによってのみ観察された。Ｍ８およびＭ９の［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ ５１５（ＭＷ ５１４）で観察され、これはチゲサイクリンより７１ Ｄａ小さかった。Ｍ８およびＭ９の質量スペクトルデータは類似していた。Ｍ９のｍ／ｚ ５１５質量スペクトルのプロダクトイオンを図１７に示す。ｍ／ｚ５１５からのＮＨ３の欠失は、ｍ／ｚ ４９８生成物を生成した。ｍ／ｚ ４５６、４１１および１５４でのプロダクトイオンも、チゲサイクリンについて観察され、テトラサイクリン環が変わっていないことを示した。Ｍ８およびＭ９のラジオクロマトグラフィーピークの欠損は、ＴＢＡＡＡ側鎖の放射標識されたカルボニル基の欠失と一致した。Ｍ９の形成について最もおこりやすいメカニズムは、アミド加水分解であって、ｔ−ブチルアミノ酢酸（Ｍ３ａ、放射標識を含有していた）および９−アミノミノサイクリン（Ｍ３、１４Ｃ標識なし）を生成した。９−アミノミノサイクリンのＮ−アセチル化は、Ｍ９を生成することが提案された。ｍ／ｚ ４５６プロダクトイオンおよび分子量（５１４）間の５８ Ｄａの差は、非放射標識アセチルアミノ基の存在と一致した。これらの代謝産物の確認は、合成Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（ＷＡＹ−１８８７４９）でスパイクされた尿抽出物の同時クロマトグラフィーにより得られた（データは省略）。代謝産物 Ｍ８は、Ｍ９よりも早いそのＨＰＬＣ保持時間に基づいてＭ９のエピマーであることが提案された。これは、チゲサイクリンより早期に溶出するチゲサイクリンエピマーと一致した。したがって、Ｍ８およびＭ９はそれぞれ、Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリンおよびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリンのエピマーであることが確認された。
【００８９】
図１８〜２１は、チゲサイクリングルクロニドのさらなる分析に関する。図１８は、構造Ｉ、ＩＩエピマー、ＩＩＩおよびＩＶエピマーと対応することができるチゲサイクリングルクロニドの提案された構造および質量スペクトルフラグメンテーションである。図１９ＡはＵＶクロマトグラムであり、図１９Ｂおよび１９Ｃはチゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析から得られた、選択された質量クロマトグラムである。図２０Ａおよび２０Ｂは、チゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを示し、ここにおいて、図２０Ａはフルスケールプロットであり、図２０Ｂは強度の低いプロダクトイオンを示すために拡大されたプロットである。図２１Ａ〜２１Ｄは、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ ７６２分析のプロダクトイオンから得られたＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示し、ここにおいて、図２１Ａ〜２１Ｃは、強度の低いプロダクトイオンの選択された質量クロマトグラムであり、図２１Ｄは全イオンクロマトグラムである。したがって、代謝産物およびそのエピマーの可能な構造は、本明細書においてすでに開示されている、Ｉ、ＩＩエピマー、ＩＩＩ、およびＩＶエピマーから選択される少なくとも１つの化合物を包含する。
【００９０】
一実施態様において、本明細書において開示されている化合物は、薬剤耐性菌に対する治療薬として用いることができ、他の抗生物質が効かない場合に効くことが証明されている。例えば、これはメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ペニシリン耐性ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、バンコマイシン耐性腸球菌（Ｄ．Ｊ． Ｂｅｉｄｅｎｂａｃｈら、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ４０：１７３−１７７（２００１）；Ｈ．Ｗ． Ｂｏｕｃｈｅｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４４：２２２５−２２２９ （２０００）；Ｐ．Ａ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｎｅｗｓｌｅｔｔ． ２６：１６３−１６８ （２００４）； Ｄ． Ｍｉｌａｔｏｖｉｃら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４７：４００−４０４ （２００３）； Ｒ． Ｐａｔｅｌら、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ３８：１７７−１７９ （２０００）； Ｐ．Ｊ． Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４６：２５９５−２６０１ （２００２）；およびＰ．Ｊ． Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４３：７３８−７４４（１９９９）、およびテトラサイクリン耐性の２つの主な形態：排出およびリボソーム保護のいずれかを有する生物（Ｃ． Ｂｅｔｒｉｕら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８：３２３−３２５ （２００４）； Ｔ． Ｈｉｒａｔａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８：２１７９−２１８４ （２００４）；およびＰ．Ｊ． Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ． ａｌ．， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４３：７３８−７４４（１９９９）に対して耐性であり得る。
【００９１】
一実施態様において、本明細書において開示される化合物は、多くの細菌感染症、例えば、合併症を伴う腹腔内感染症（ｃＩＡＩ）、複合皮膚および皮膚組織感染症（ｃＳＳＳＩ）、市中肺炎（ＣＡＰ）、ならびに院内感染性肺炎（ＨＡＰ）適応症（グラム陰性およびグラム陽性病原体、嫌気性菌、およびスタフィロコッカス・アウレウスのメチシリン感受性およびメチシリン耐性株（ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ）の両方により引き起こされ得るもの）の治療において用いることができる。さらに、本明細書において開示される化合物は、温血動物において、ＴｅｔＭおよびＴｅｔＫ耐性決定因子を有する細菌により引き起こされる感染症を治療または抑制するために用いることができる。さらに、本明細書において開示される化合物は、骨および関節感染症、カテーテル関連好中球減少症、産科および産婦人科感染症を治療するために、あるいは他の耐性病原体、例えば、ＶＲＥ、ＥＳＢＬ、腸、急速発育性マイコバクテリアなどを治療するために用いることができる。
【００９２】
したがって、本明細書にいて開示されているのは、少なくとも１つの細菌感染症を治療する方法であって、これを必要とする対象に、治療上有効な量の少なくとも１つの本発明において開示された化合物およびその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物を投与することを含む方法である。
【００９３】
一実施態様において、本発明において開示された化合物は、例えば、チゲサイクリンと比較して、吐き気を軽減し得る。
【００９４】
本明細書において用いられる「医薬組成物」とは、薬効のある組成物を意味する。医薬組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容される担体を含有することができる。
【００９５】
本明細書において用いられる「医薬的に許容される賦形剤」とは、特定の投与様式に好適であることが当業者に公知の任意の担体を含む、本発明において提供される化合物の投与に適した医薬担体またはビヒクルを意味する。例えば、非経口、皮内、皮下、局所適用に用いられる溶液または懸濁液は、無菌希釈剤（例えば、注射用水、塩溶液、不揮発性油など）；天然に存在する植物性油（例えば、ゴマ油、ココナツ油、ピーナッツ油、綿実油など）；合成脂肪族ビヒクル（例えば、オレイン酸エチル，ポリエチレングリコール、グリセリン，プロピレングリコールなど、例えば、合成溶媒を包含する）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベンなど）；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、重亜硫酸ナトリウム、など）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）など）；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩など）；および／または張性を調節するための試薬（例えば、塩化ナトリウム、デキストロースなど）；あるいはその混合物を含むことができる。さらなる例として、静脈内投与される場合、適当な担体としては、生理食塩水、リン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤および可溶化剤、例えば、グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどを含有する溶液、およびその混合物が挙げられる。
【００９６】
非制限的例として、本明細書において開示された化合物を任意に１以上の医薬的に許容される賦形剤として組み合わせることができ、錠剤、カプセル、分散性粉末、顆粒剤、または例えば約０．０５〜５％の懸濁化剤を含有する懸濁剤、例えば約１０〜５０％の糖を含有するシロップ、ならびに例えば約２０〜５０％のエタノールを含有するエリキシルなどの形態で経口的に、あるいは約０．０５〜５％の懸濁化剤を等張媒体中に含有する無菌注射溶液または懸濁液の形態で非経口的に投与することができる。このような医薬製剤は、例えば、約２５〜約９０％の活性成分を担体と、さらに一般的には約５重量％から約６０重量％で組み合わせて含有することができる。他の処方は、米国特許第５，４９４，９０３号および第５，５２９，９９０号においてさらに検討されており、この特許は本発明の一部として参照される。
【００９７】
「医薬的に許容される塩」なる用語は、本開示の化合物の酸付加塩または塩基付加塩を意味する。医薬的に許容される塩は、親化合物の活性を保持し、これが投与される対象に対して、またこれが投与されるという状況で有害または望ましくない影響を及ぼさない任意の塩である。医薬的に許容される塩としては、無機および有機酸両方の金属錯体および塩が挙げられる。医薬的に許容される塩としては、金属塩、例えば、アルミニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、マンガンおよび錯塩が挙げられる。医薬的に許容される塩としては、酸塩、例えば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アキセチル、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、酪酸塩、エデト酸カルシウム、カムシル酸塩、炭酸塩、クロロ安息香酸塩、シレキセチル、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩、エシル、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキサミン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムコ酸塩、ムコン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ｐ−ニトロメタンスルホン酸塩、パモン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、フタル酸塩、ポリガラクトウロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルファミン酸塩、スルファニリン酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクリン酸塩、トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。医薬的に許容される塩は、例えばシステインを包含するが、これに限定されないアミノ酸から誘導される。他の許容される塩は、例えば、Ｓｔａｈｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、ａｎｄ Ｕｓｅ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ； １ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｊｕｎｅ １５、２００２）において見出すことができる。
【００９８】
一実施態様において、「治療上有効な量」とは、患者において症状の予防または緩和、あるいは所望の生物学的結果、例えば、改善された臨床的兆候、疾患の開始の遅延、リンパ球および／または抗体のレベルの低下／上昇などをもたらす化合物の量を意味する。有効な量は、本明細書において記載されているようにして決定できる。選択された投与レベルは、特定の化合物の活性、投与経路、治療される状態の重さ、および治療される患者の状態および以前の病歴に依存するであろう。しかしながら、所望の治療効果を達成し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させるために必要であるよりも少ないレベルで化合物の投与を開始することは当業者の技術範囲内である。一実施態様において、検定から得られるデータをヒトにおいて用いられる投与量範囲の処方において用いることができる。
【００９９】
比較例１
［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性を、３７℃で２４時間までインキュベートされた対象において調べた。スパイクされた対照血清の抽出物中の［１４Ｃ］チゲサイクリンと関連する放射能（％）は２４時間にわたって約９％、０時で９０％から２４時で８１％まで減少した（図２２）。０時でのエピマーのパーセントは７％であり、２４時間まで一定のままであった。テトラサイクリンについて報告されているように（Ｒｅｍｍｅｒｓ ＥＧ、Ｓｉｅｇｅｒ ＧＭ、Ｄｏｅｒｓｃｈｕｋ ＡＰ． Ｓｏｍｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ．４ ｅｐｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ． １９６３；５２；７５２−７５６； Ｎｅｌｉｓ Ｈ、ＤｅＬｅｅｎｈｅｅｒ Ａ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ． １９８２；１０：１４２−１４６）、チゲサイクリンのエピマーはエピマー化の生成物であり、代謝産物とは見なされなかった。他の生成物の量は、約８％、０時で３％から２４時で１１％まで増大した。他の生成物に含まれるのは、保持時間が約４分の、初期に溶出するクロマトグラフィーピーク（Ｍ３ａ、ｔ−ブチルアミノ酢酸）であった。このピークは、従来、ラットおよびイヌ血漿および尿において観察された。スパイクされた対照から得られる放射能の回収は０から２４時間までの試験サンプルについて完了した。
【０１００】
比較例２
尿において、［１４Ｃ］チゲサイクリンは３７℃でインキュベートされた場合、血清中よりも安定性が低かった（図６）。スパイクされた対照尿中の［１４Ｃ］チゲサイクリンのパーセントは１８％、０時の９２％から２４時の７４％まで減少した。エピマーは１６％、０時の放射能７％から２４時の２３％まで増大した。他の副次的な生成物は、０時で１％から２４時で３％まで増大した。
【０１０１】
実験サンプルについて用いられる抽出法の間、［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性を対照血清および大便ホモジネートにおいて調べた。血清サンプル中、［１４Ｃ］チゲサイクリンはサンプルのスパイキングおよび抽出前の放射能の９４％を占めた。抽出プロセス後、［１４Ｃ］チゲサイクリンの量は、放射能の２４％から７０％まで減少した。対応して、他の放射活性成分、主にチゲサイクリンのエピマーが増大し、これは抽出前の４％から抽出後の２２％まで増大した。Ｍ３ａを包含する他の副次的な生成物は、抽出前の２％から抽出後の８％まで増大した。
【０１０２】
比較例３
［１４Ｃ］チゲサイクリンを対照大便ホモジネートから抽出した後に、同様の結果が観察された。これらのサンプルにおいて、［１４Ｃ］チゲサイクリンは抽出前の放射能の９４％、抽出後の放射能の６８％を占めた。対応してチゲサイクリンのエピマーが増大し、抽出前の放射能の４％、抽出後の放射能の２３％に相当した。Ｍ３ａの量も抽出の間に４％（１％から５％まで）増大した。他の副次的な生成物は抽出前の放射能の１％、抽出後の放射能の４％に相当した。
【０１０３】
実施例
実施例１
非盲検、入院患者、繰り返し投与チゲサイクリン、単回投与［１４Ｃ］チゲサイクリン代謝動態および質量バランス研究を、６人の健康な男性ボランティアにおいて行った。臨床プロトコルは１２人の患者を必要とした。これらの１２人のうち、６人（対象１、４、５、６、７、および８、対象８は後に研究から脱落）が放射性投与を受けた。試験対象者基準／除外基準、病歴、健康診断およびさらなる研究プロトコルにおいて概要を説明された追加の手順に基づいて、適格対象が選択された。各対象は、１００ｍｇの負荷量を第１日の朝に投与され、続いて１２時間おきにさらに５回、５０ｍｇの維持量を投与された。研究の第４日の朝、６人の対象は、５０ｍｇの［１４Ｃ］チゲサイクリン（５０μＣｉ）を１回投与された。各チゲサイクリン用量は、３０分の静脈内注入により投与された。６人の健康な男性ボランティアは［１４Ｃ］標識チゲサイクリンを、平均用量４５．９±０．９μＣｉ（４４．３〜４７．０ μＣｉの範囲）で投与された。［１４Ｃ］チゲサイクリンの放射化学的純度は、投与時で９８．６％と報告され、放射能の０．４％はチゲサイクリンエピマーと特定され、比活性度は１．００μＣｉ／ｍｇであった。
【０１０４】
チゲサイクリン投与前、および［１４Ｃ］標識投薬後１、４、８、２４および４８時間に、代謝産物プロファイリングのために血清サンプルを集めた。代謝産物プロファイリングのために、尿サンプルを０〜４、４〜８、８〜２４および２４〜４８時間で集め、大便サンプルを［１４Ｃ］標識投薬後最高４８時間まで集めた。血清および尿サンプル、ならびに大便ホモジネートをドライアイス上で、Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｗｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ， ＰＡまで輸送した。サンプル収集およびサンプル貯蔵の詳細は、研究の質量バランスの部分に記載されている。対象＃６の２４〜４８時間の尿および大便サンプルは、対象が研究から脱退したので不完全であった。この対象から得たサンプルを代謝産物プロファイリングに使用したが、このサンプルは質量バランス計算には含まれなかった。
【０１０５】
研究の臨床部分において用いられる非標識および［１４Ｃ］標識チゲサイクリン、ならびに用量の調製およびこれらのバッチの分析の詳細は、研究の質量バランスバッチにおいて記載されている。対象に投与された［１４Ｃ］チゲサイクリン（処方番号０９３１８５４Ｊ、ロット番号７９８１７０３）は１．００μＣｉ／ｍｇ（５０μＣｉ／５０ ｍｇ用量）の比活性度を有していた。血清、尿および大便ホモジネート中の［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性を評価するために使用される［１４Ｃ］チゲサイクリンのさらなるバッチ（バッチＣＦＱ１３３８９、９５．３μＣｉμＣｉ／ｍｇ、９７．２％放射化学的純度）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ（英国）から入手した。チゲサイクリン標準品（バッチＲＳ ７３８−４、純度９８．４％）、９−アミノミノサイクリン標準品（ＣＬ−３１８６１４、バッチ１４８００Ｂ−８９Ａ）およびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（ＷＡＹ−１８８７４９、バッチＬ２３５６６−１６２）をＷｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ， ＮＹから入手した。［１４Ｃ］チゲサイクリンの構造を、放射標識の部位を特定（＊）して以下に示す。
【化６】
【０１０６】
アセトン、アセトニトリル、氷酢酸およびメタノールをＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， ＮＪ）から入手した。エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）およびトリフルオロ酢酸をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から入手した。酢酸アンモニウムをＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ （Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）から入手した。すべての試薬を分析グレードまたはそれ以上であった。
【０１０７】
１００ｍｇの単回用量としてチゲサイクリンを静脈内投与し、続いて５回、５０ｍｇ、そして1回、５０ｍｇの［１４Ｃ］チゲサイクリンを投与することは、一般に安全かつ十分に許容された。もっとも頻繁に（＞１０％）報告される副作用は、吐き気（７５％）、嘔吐（５０％）、消化不良（１７％）、および注射部位の炎症（１７％）であった。
【０１０８】
実施例２
抽出効率を計算するための放射能測定は、Ｕｌｔｉｍａ ＧｏｌｄＴＭシンチレーション流体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）およびＵｌｔｉｍａ ＧｏｌｄＴＭ標準曲線を用いたＴｒｉ−Ｃａｒｂ Ｍｏｄｅｌ ３１００ＴＲ液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ， ＭＡ）を用いて行った。既知の放射能を有する外部標準を使用することにより、カウント／分（ＣＰＭ）を分解／分（ＤＰＭ）に変換した。各標準のクエンチは、外部放射活性標準の変換されたスペクトル指数（ｔＳＩＥ）により決定した。ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ放射計マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、９６深穴Ｌｕｍａプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中に集められたＨＰＬＣフラクションを分析した。
実施例３
【０１０９】
［１４Ｃ］標識チゲサイクリン投与後１、４および８時間で集められた個々の血清サンプルを代謝産物プロファイルについて分析した。放射能の濃度が低すぎたので（０〜１８ ｎｇ当量／ｍＬの範囲）、２４および４８時間サンプルは分析しなかった。サンプル体積を最小にするために、各血清サンプルを等しい体積（それぞれ約９ｍｌ）の２サンプルに分け、抽出し、別々に分析した。ＥＤＴＡ（１ｍＬのサンプルあたり０．５ Ｍ ＥＤＴＡを８０μＬ）を各サンプルに添加し、サンプルを撹拌混合した。３体積のアセトンを各サンプルに添加し、サンプルを次に１分間、マルチチューブボルテックスミキサーを用いて混合した。サンプルを２５００ｒｐｍ、４℃でＳｏｒｖａｌｌ Ｓｕｐｅｒ Ｔ２１遠心分離機（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗｔｏｗｎ， ＭＡ）中で１５分間遠心分離した。２０μL氷酢酸を含有する新しい試験管に上清を移した。ペレットを２ｍＬ水、１６０μＬの０．２Ｍ ＥＤＴＡおよび６ｍＬのアセトンで２回再抽出し、前記のように処理した。各サンプルから得られた上清を合し、Ｔｕｒｂｏｖａｐ Ｍｏｄｅｌ ＬＶエバポレーター（Ｚｙｍａｒｋ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を用いて窒素流下で蒸発乾固させた。残留物を３００μＬのアセトニトリル／水（１：９）で再構成し、１０分間１４０００ｒｐｍ、室温でＭｏｄｅｌ ５４１５Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ）を用いて遠心分離し、放射能について、ＨＰＬＣにより分析した。選択されたサンプルはまたＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１１０】
［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性は、［１４Ｃ］チゲサイクリン（３μｇ／ｍＬ）でスパイクされ、３７℃でインキュベートされた対照ヒト血清において決定された。この濃度は本研究において報告されているＣｍａｘ値に近かったので、この濃度を用いた。アリコート（５００μＬ）を０、１、４、８および２４時間で取り出し、新しいバイアル中に入れた。ＥＤＴＡ（０．５Ｍを４０μＬ）を添加し、サンプルを１４０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機、Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ）。上清をＨＰＬＣバイアルに移し、放射能フロー検出を用いたＨＰＬＣにより分析した。
【０１１１】
追加の血清サンプルを前記のようにして調製し、抽出した。これは、もしあるならば、抽出プロセスが［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性に及ぼす影響を測定するために行われた。実施例６において記載されるように、放射能フロー検出を用いたＨＰＬＣによりこれらのサンプルを分析した。
【０１１２】
実施例４
以前に開発され、ラットおよびイヌ尿サンプルについて使用された方法を用いて、代謝産物プロファイリング用尿サンプルを以下で論議するように抽出した。様々な間隔で［１４Ｃ］チゲサイクリンの投与後最高４８時間まで集められた尿サンプルを抽出前に氷上で解凍した。個々の尿サンプルのアリコート（１ ｍＬ）を清浄な試験管に移し、０．２ Ｍ ＥＤＴＡ（最終濃度、４０ ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加した。ｐＨはｐＨ４．５〜５．５で一定であった。サンプルを混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣラジオクロマトグラフィーにより代謝産物について分析し、選択されたサンプルもＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１１３】
対照＃８から得られた追加の尿を用いて代謝産物Ｍ３ａを単離した。前述と同じ方法を用いてこの尿サンプルを処理した。ＨＰＬＣ法を用い、サンプル注入後２から５．５分までＨＰＬＣフローを集めてＭ３ａピークを単離した。Ｔｕｒｂｏｖａｐ Ｍｏｄｅｌ ＬＶを用いて、プールされたフラクションを窒素流下で濃縮した。サンプルを次いで遠心分離し、ＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１１４】
［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性を、［１４Ｃ］チゲサイクリン（５μｇ／ｍＬ）でスパイクされ、３７℃でインキュベートされた対照ヒト尿において決定した。本研究の尿中の［１４Ｃ］チゲサイクリン濃度の範囲内であったので、この濃度を使用した。アリコート（５００μＬ）を０、１、４、８および２４時間で取り出し、新しいバイアル中に入れた。これらの尿サンプルを比較例２において血清について記載したようにして処理し、分析した。
【０１１５】
実施例５
８０００ｄｐｍ／ｇより多く含有していた、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後４８時間まで集められた各大便サンプルから調製された個々の大便サンプルホモジネートを代謝産物プロファイルについて分析した。大便サンプルホモジネートの調製は、研究の質量バランスの部分において詳細に記載されている。簡単に説明すると、大便サンプルをＡＢＣ実験室（Ｃｏｌｕｍｂｉａ， ＭＯ）にて、３〜４体積の氷冷された水中で重量によって均質化し、凍結してＢｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｗｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ， ＰＡに輸送した。放射能の抽出のために、大便ホモジネートを氷上で解凍し、アリコート（約１ｇ）を１５ｍＬ試験管に移した。３体積のアセトンを添加し、マルチチューブボルテックスミキサーを用いてサンプルを１分間混合した。サンプルをＳｏｒｖａｌｌ Ｓｕｐｅｒ Ｔ２１遠心分離機中、１５分間２５００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。上清を新しい試験管に移し、ペレットを１ｍＬの水および８０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡで再懸濁させ、前記のようにして再抽出した。ペレットをこのようにして合計３回再抽出し、上清をプールした。Ｔｕｒｂｏｖａｐ Ｍｏｄｅｌ ＬＶを用いて、上清を窒素流下、蒸発乾固させた。残留物を５００μＬの水中に再懸濁させ、Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機を用いて１０分間１４０００ｒｐｍ、室温で遠心分離した。上清をＨＰＬＣバイアルに移し、放射能検出を伴うＨＰＬＣを用いて放射能および代謝産物プロファイルについて分析した。選択されたサンプルをさらにＬＤ／ＭＳにより分析した。
【０１１６】
抽出プロセスの間の［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性を［１４Ｃ］チゲサイクリン（５μｇ／ｇホモジネート）でスパイクされた対照ヒト大便ホモジネートにおいて決定した。この濃度は本研究から得られた大便ホモジネート中の［１４Ｃ］チゲサイクリン濃度の範囲内であったので、この濃度を使用した。サンプルを抽出し、放射能フロー検出を用いたＨＰＬＣにより分析した。
【０１１７】
実施例６
Ｗａｔｅｒｓ ２６９５ Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ）、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｏｄｅｌ ２４８７二波長ＵＶ吸収検出器（３５０ｎｍをモニターするために設定され、２０秒間隔でフラクションを集めるために装備されたＧｉｌｓｏｎ２１５液体ハンドラー（Ｇｉｌｓｏｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ， ＷＩ）と直列）を用いてＨＰＬＣ分析を行った。フラクションを９６深穴Ｌｕｍａプレート中に集め、ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴを用いて分析した。オートサンプラー温度を４℃に設定した。２つの移動相ＡおよびＢの直線的勾配を使用したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄＴＭガードカートリッジ（５μｍ）を備えたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム（１５０ ｘ ２．０ ｍｍ、５μｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ， ＣＡ）上でチゲサイクリンおよび薬剤誘導生成物の分離を行った。カラムは約２０℃の周囲温度であった。移動相Ａは水中１０ ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。移動相の流量は０．２ ｍＬ／分であり、以下に示すように供給された。
【表７】
【０１１８】
実施例７〜９
液体クロマトグラフィー／質量分析
質量分析に用いられたＨＰＬＣシステムは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｍｏｄｅｌ ２６９５ ＨＰＬＣシステムであった。これは、内蔵式オートサンプラーおよびＭｏｄｅｌ ９９６ダイオードアレイＵＶ検出器を装備していた。この研究において、ＬＣ／ＭＳ分析の間、３つのＨＰＬＣ条件を使用した。ＬＣ／ＭＳ条件１を代謝産物特性化のための大部分のサンプル分析および尿から代謝産物Ｍ３ａを単離するために使用した。グルクロニド代謝産物の保持時間を増大させ、代謝産物Ｍ８およびＭ９の同一性を確認するための同時クロマトグラフィー実験のために、選択されたサンプルに関してＬＣ／ＭＳ条件２を使用した。ＬＣ／ＭＳ条件３を使用して、ヒト尿から単離された極性代謝産物Ｍ３ａを分析した。
【０１１９】
実施例７
ＬＣ／ＭＳ条件１
３４０〜３６０ｎｍをモニターするためにＵＶ検出器を設定した。Ｕｎｉｇｕａｒｄ Ｃ１８ガードカラム（１０ ｘ ２ ｍｍ）（ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ， ＰＡ）を備えたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム（１５０ ｘ ２．０ ｍｍ、５μｍ）上で代謝産物特性化のための分離を行った。流量は０．２ｍＬ／分であった。ＬＣ／ＭＳサンプル分析の間、代謝産物の評価の前に、２分までの初期流れを質量分析計からそらした。移動相Ａは水中１０ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。直線的移動相勾配を以下に示す。
【表８】
【０１２０】
同様のＨＰＬＣ条件を使用して、代謝産物Ｍ３ａを含有するフラクションを集めた。移動相および直線勾配は同じであった。使用されたカラムはＳｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１８カラム（２５ ｃｍ ｘ １０ ｍｍ、５μｍ；Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）であり、流量は４．７ ｍＬ／分であった。Ｇｉｌｓｏｎフラクションコレクター、Ｍｏｄｅｌ ＦＣ２０４（Ｇｉｌｓｏｎ）を用いてフラクションを集めた。
【０１２１】
実施例８
ＬＣ／ＭＳ条件２
２１０〜４００ｎｍをモニターするためにＵＶ検出器を設定した。Ｕｎｉｇｕａｒｄ Ｃ１８ガードカラム（１０ ｘ ２ ｍｍ）（ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ）を備えたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム（２５０ ｘ ２．０ ｍｍ、５μｍ）上で分離を行った。流量は０．２ ｍＬ／分であった。ＬＣ／ＭＳサンプル分析の間、代謝産物の評価の前に０．５ 分までの初期流れを質量分析計からそらせた。移動相Ａは水中０．０２％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）であり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．０２％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）であった。直線的移動相勾配を以下に示す。
【表９】
【０１２２】
実施例９
ＬＣ／ＭＳ条件３
Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ ＨＩＬＩＣ Ｓｉｌｉｃａカラム（１５０ ｘ ２．１ ｍｍ、５μｍ）上で分離を行った。流量は０．２ ｍＬ／分であった。移動相Ａはアセトニトリル中０．０２％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）であり、移動相Ｂは水中０．０２％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）であった。直線的移動相勾配を以下に示す。
【表１０】
【０１２３】
実施例１０
質量分析
Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｕｌｔｉｍａトリプル四重極質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）を陽イオン化モードで操作した。Ｚ−スプレーインターフェースを用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）でＬＣ／ＭＳ分析を行った。ナノスプレーインターフェース中に直接注入することにより、選択されたサンプルからの個々のフラクションのＥＳＩ−ＭＳ分析を行った。質量分析計の設定を以下に示す。
【表１１】
【０１２４】
尿および大便サンプルをチゲサイクリンに特徴的なプロダクトイオンの前駆体についてのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によりチゲサイクリン代謝産物について分析した。さらに、チゲサイクリンの潜在的代謝産物を、動物およびヒトにおける従来の研究から得られた結果に基づいたＬＣ／ＭＳデータにおいて検索した。
【０１２５】
血清抽出物をチゲサイクリンおよび選択された代謝産物について、内部成分からの干渉を軽減するために選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）モード（ＬＣ／ＳＲＭ）においてＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。これらの実験を、２００ｍｓの滞留時間設定で行った。次のチゲサイクリン関連成分をモニターした。
【表１２】
【０１２６】
Ｆｌｏ−Ｏｎｅ分析ソフトウェア（バージョン ３．６５）を利用して、安定性分析および代謝産物プロファイルのために放射活性ピークを積分した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標） ２０００表計算を用いて平均および標準偏差を計算した。ＬＣ／ＭＳデータ分析に使用されたソフトウェアはＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＭａｓｓＬｙｎｘ（バージョン４．０、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）であった。
【０１２７】
実施例１１
材料
酢酸アンモニウムをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒｌａｗｎ、ＮＪ）から購入した。ＨＰＬＣグレード水および溶媒をＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， ＮＪ）から購入した。
【０１２８】
方法
尿サンプル調製
ＶｉｒＴｉｓ Ｓｅｎｔｒｙ ３５ＸＬ Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ（ＶｉｒＴｉｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ＮＹ）を用いて、チゲサイクリンを投与された対象から得られた尿サンプル（３００ ｍＬ）を凍結乾固させた。残留物を水中に再懸濁させ、容器を水で洗浄した。最終体積は３．５ ｍＬであった。Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ）を用いて、サンプルを１０分間１４０００ｒｐｍ、室温で遠心分離した。次いで、０．２または０．４５μｍ孔サイズのＣｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ Ｘ ＨＰＬＣナイロン製ミクロ遠心フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を用いてサンプルを濾過した。２４００ｒｐｍで作動するＩＥＣ Ｃｅｎｔｒａ Ｍｏｄｅｌ ＧＰ８Ｒ遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ）を用いて、濾過のための遠心分離を行った。得られた粗尿抽出物を前記のようなフラクション収集でＨＰＬＣにより処理した。
半調製的ＨＰＬＣによるチゲサイクリングルクロニドの単離
【０１２９】
チゲサイクリングルクロニドを含有する尿抽出物を４ｍＬのオートランプラーバイアルに移した。代謝産物単離用ＨＰＬＣ装置は、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ ４０００ ＨＰＬＣ システム、Ｗａｔｅｒｓ ２７６７ Ｓａｍｐｌｅ Ｍａｎａｇｅｒ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｌｕｍｎ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ ＯｒｇａｎｉｚｅｒおよびＷａｔｅｒｓ ９９６ダイオードアレイＵＶ検出器（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を含んでいた。分離は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１８カラム（２００ ｘ １０ｍｍ、５ μｍ）（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）を用いて行われた。２１０および４５０ｎｍをモニターするためにＵＶ検出器を設定した。移動相Ａは水中１０ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。直線的移動相は表１２に記載されているように供給された。
【表１３】
【０１３０】
フラクション収集のためのＨＰＬＣ装置をＦｒａｃｔｉｏｎＬｙｎｘ ｍｏｄｕｌｅのＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（バージョン４．０、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ）により制御した。ＦｒａｃｔｉｏｎＬｙｎｘを用いて、代謝産物フラクションの収集は３５０ｎｍでのＵＶ吸収のモニタリングに基づいた。フラクション収集後、選択されたフラクションのアリコートを以下に記載するようにしてＭＳにより分析して、チゲサイクリングルクロニドの存在を確認した。チゲサイクリングルクロニドを含有するフラクションを次いで前述のように凍結乾固させ、再構成し、ＬＣ／ＭＳにより分析して、チゲサイクリングルクロニドが単離されたことを確認した。
【０１３１】
液体クロマトグラフィー／質量分析
チゲサイクリン代謝産物分析に用いられるＨＰＬＣシステムは、バイナリーポンプおよびダイオードアレイＵＶ検出器を含むＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｏｄｅｌ １１００ ＨＰＬＣシステムを含んでいた。ＨＰＬＣ分離条件は、流量が０．２ｍＬ／分であり、ＨＰＬＣカラムの内径が２．１ｍｍである以外は、代謝産物単離のためのフラクション収集について前述の通りであった。凍結乾燥前の代謝産物フラクションの分析は、ＨＰＬＣカラムを使用せず、フラクションのアリコートを質量分析計に直接注入することにより行われた。
【０１３２】
代謝産物特性化に用いられた質量分析計は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）であった。これは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースを備え、陽イオン化モードで操作された。ＬＣ／ＭＳデータをＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（バージョン１．３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）で分析した。
【０１３３】
チゲサイクリングルクロニド質量スペクトル
ヒト尿のＨＰＬＣフラグメンテーションにより集められたチゲサイクリングルクロニド。チゲサイクリングルクロニドの［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ ７６２で観察され、これはチゲサイクリンよりも１７６Ｄａ大きかった。チゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを図２３Ａおよび２３Ｂに示す。１７６Ｄａのニュートラルロスは、ｍ／ｚ ５８６、さらにはチゲサイクリンの［Ｍ＋Ｈ］＋を生成し、これはチゲサイクリンのグルクロニドを示していた。凍結乾燥および再構成後のチゲサイクリングルクロニドフラクションのＬＣ／ＭＳ分析は図２４Ａ〜２４Ｄに示されるＭＳおよびＭＳｎスペクトルをもたらした。これらの質量スペクトルデータもチゲサイクリングルクロニドを示すものであった。
【０１３４】
この実施例は、ＩＶ量のチゲサイクリンを投与されたヒト対象の尿からチゲサイクリングルクロニドを単離できることを示す。
【０１３５】
実施例１２
この実施例は、２つのチゲサイクリン代謝経路、親化合物のグルクロニド化および９−アミノミノサイクリンのＮ−アセチル化が、チゲサイクリンを１回静脈内投与した後のマウスおよびウサギにおいて存在する可能性を調査した。各種から得た血清サンプルを集め、ＬＣ／ＭＳにより分析して、これらの代謝物の存在または不在を確認し、可能ならば、その濃度を評価した。マウスからの尿サンプルも集めて、チゲサイクリン代謝産物の存在を調べた。
【０１３６】
材料
マウスおよびウサギの静脈内投与用溶液を調製するために使用されたチゲサイクリン（ロットＡ９６５５９、純度１００％）、チゲサイクリン標準品（バッチＲＳ ７３８−４、純度９８．４％）、重水素化（ｔ−ブチル−ｄ９）チゲサイクリン（ＷＦＱ０１５９；内部標準として使用）、９−アミノミノサイクリン標準品およびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリンはＷｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ， ＮＹから入手した。
【０１３７】
対照ウサギおよびマウス血清をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）から入手した。アセトニトリルおよびメタノールをＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， ＮＪ）から入手した。エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から入手した。酢酸アンモニウムをＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）から入手した。すべての試薬は分析グレードまたはそれ以上であった。
【０１３８】
マウスおよびウサギ研究デザイン
動物
１５匹のオスＣＤ−１マウス（投与時の平均体重３１．３ｇ）を使用した。動物に食物および水を自由に与えた。０．５および２時間血液採取群のマウスを標準的ケージに入れ、一方、４時間血液採取群の動物は尿を収集するための代謝ケージ中に入れた。Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ａｔ Ｗｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ、ＰＡによりマウスに投薬した。
【０１３９】
３匹のメスニュージーランドホワイトウサギ（投与時の体重３．９ｋｇから４．３ｋｇの間）を使用した。動物に食物および水を自由に与えた。動物を個々に標準的ケージに入れた。Ｗｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｈａｚｙ、ＮＹによりウサギに投薬し、サンプルをＷｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ、ＰＡに凍結輸送した。
【０１４０】
投薬
マウスおよびウサギについて、５０ｍｇのチゲサイクリンを５．０ｍＬの０．９％無菌塩溶液中に溶解させて希釈標準ストック溶液を調製することにより、静脈内投与用溶液を調製した。希釈標準ストック溶液を０．９％無菌溶液でマウスについては０．５ｍｇ／ｍＬ、ウサギについては４ｍｇ／ｍＬまで希釈した。マウス用量（５ ｍｇ／ｋｇ、１０ ｍＬ／ｋｇ）を尾静脈からボーラス注入法により投与した。ウサギ用量（４ ｍｇ／ｋｇ、１ ｍＬ／ｋｇ）をボーラス注入法により耳周辺静脈から投与した。
【０１４１】
サンプル収集
マウス（ｎ＝５／時点）について、チゲサイクリン投与後０．５、２および４時間で心臓穿刺により血液（約０．７ ｍＬ）を集めた。ウサギについて、チゲサイクリン投与後０．５、２および６時間で耳静脈から血液（約７ ｍＬ）を集めた。血餅形成後、血清を室温で分離し、１５分間、４℃、３０００ｒｐｍで遠心分離した。血清を新しい試験管に移し、「ＬＣ／ＭＳ分析用血清サンプル調製」の項目で以下に記載するように、分析まで約−７０℃で保存した。加えて、尿を４時間血液採取群のマウスから集め、「ＬＣ／ＭＳ分析用尿サンプル調製」の項目で以下に記載するように、分析まで約−７０℃で保存した。
【０１４２】
Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリンＭ９の純度の評価
この研究において使用されたＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン、Ｍ９の純度を、「液体クロマトグラフィー／質量分析」の項目で以下に記載するように、ＵＶ検出を備えたＨＰＬＣにより評価した。１００ｎｇ／μＬサンプル中のＭ９関連成分の全ＵＶクロマトグラフィーピーク面積のパーセンテージとしてのＵＶクロマトグラフィーピーク面積に基づいて、Ｍ９純度を測定した。Ｍ９および他の関連する成分は同じＵＶモル吸収率を有し、他のＭ９関連物質は存在しないと仮定された。３７．６分ピークよりも少ない相対量（合計２．８％）で存在する個々の成分を微量成分と見なし、純度の概算に含めなかった。合成物質において、Ｍ９およびそのエピマーのみがＬＣ／ＭＳにより特性化され；他の分解物は特性化されなかった。各標準曲線サンプル中のＭ９の実際の濃度を、この方法により得られたＭ９純度の概算に基づいて調節した。
【０１４３】
ＬＣ／ＭＳ分析用尿サンプル調製
マウス尿を解凍し、アリコート（１ ｍＬ）を新しい試験管に移した。Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ）を用いて、サンプルを１４０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離して、粒子状物質を除去した。サンプルを次いで新しい試験管に移し、「液体クロマトグラフィー／質量分析」の項目において以下に記載するようにして、ＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１４４】
ＬＣ／ＭＳ用血清サンプル調製。
マウスおよびウサギ血清サンプルを各収集時間にプールし、チゲサイクリン、そのエピマー、チゲサイクリングルクロニド（Ｍ７およびそのエピマーＭ６）、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）およびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９およびそのエピマーＭ８）について分析した。血清のアリコート（５００μＬ）を新しい試験管に移し、重水素化チゲサイクリン（３０ ｎｇ／ｍＬ最終濃度）を内部標準（定量分析のみ）として添加した。ＥＤＴＡ（０．５ Ｍ ＥＤＴＡを４０μＬ）を各サンプルに添加し、サンプルを撹拌混合した。アセトニトリル（５００μＬ）を各サンプルに添加し、サンプルを撹拌混合し、Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて１４０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離することにより、変性タンパク質を分離した。上清を新しい試験管に移し、Ｔｕｒｂｏｖａｐ Ｍｏｄｅｌ ＬＶエバポレーター（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を用いて、溶媒を窒素流下で蒸発させた。「液体クロマトグラフィー／質量分析」の項目において以下に記載するように残存する水溶液をＬＣ／ＭＳにより分析した。幾つかのウサギ血清サンプルを対照ウサギ血清で５倍または５０倍に希釈して、検体反応が標準曲線の範囲内にあることを保証した。
【０１４５】
チゲサイクリン、Ｍ３およびＭ９の標準曲線をウサギ血清において作成した。内部標準および合成チゲサイクリンおよび代謝産物標準を対照血漿に添加することにより標準曲線を作成した。０、１０、２０、５０、１００、２００、５００および１０００ｎｇ／ｍＬのチゲサイクリン濃度、直線範囲が５〜２００ｎｇ／ｍＬで、標準曲線サンプルを調製した。９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）について、濃度は０、１、５、１０、２０、５０、１００および２００ｎｇ／ｍＬであり、直線範囲は１０〜２００ｎｇ／ｍＬであった。Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）について、濃度は、１．６、３．２、６．４、１６、３２、６４および９６ｎｇ／ｍＬであり、直線範囲は３．２〜９６ｎｇ／ｍＬであった。これらのサンプルを前記のように処理し、分析した。
【０１４６】
Ｍ７（チゲサイクリングルクロニド）を含有するヒト尿サンプルのアリコートをプールされた２時間ウサギ血清抽出物に添加して、ウサギにおいて観察されるグルクロニドがヒトにおいて観察されるものと同じかどうかを確認した。このサンプルを「液体クロマトグラフィー／質量分析」の項目において以下に記載するようにしてＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１４７】
液体クロマトグラフィー／質量分析
質量分析に使用したＨＰＬＣシステムは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｍｏｄｅｌ ２６９５ ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）であった。これは内蔵式オートサンプラーおよびＭｏｄｅｌ ９９６ダイオードアレイＵＶ検出器を備えていた。２１０〜４００ｎｍをモニターするためにＵＶ検出器を設定した。Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｕｎｉｇｕａｒｄ Ｃ１８ガードカラム（１０ ｘ ２．１ ｍｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）を備えたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム（１５０ ｘ ２．１ ｍｍ、５μｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）上で代謝産物特性化のための分離を行った。カラム温度は２５℃であった。流量は０．２ ｍＬ／分であった。移動相Ａは水中１０ ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。２つの直線的移動相勾配を使用し、表２．２．５−１および２．２．５−２に示した。勾配１は代謝産物同定（定量分析）のために使用した。勾配２は、ウサギ血清サンプルの半定量分析のために使用した。ＬＣ／ＭＳサンプル分析の間、１０分までの初期流れを代謝産物の評価前に質量分析計からそらせた。勾配１および勾配２のＬＣ／ＭＳ ＨＰＬＣデータを表１３および１４に示す。
【表１４】
【表１５】
【０１４８】
使用された質量分析器はＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｕｌｔｉｍａトリプル四重極質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）であった。これは、エレクトロスプレーインターフェースを備え、陽イオン化モードで操作された。質量分析計の設定を表１５に示す。
【表１６】
【０１４９】
選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）モードにおけるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析（ＬＣ／ＳＲＭ）も血清抽出物に関して行って、チゲサイクリン代謝産物のサンプルをスクリーンし、チゲサイクリン代謝産物の推定濃度を得た。これらの実験は、２００ｍｓの滞留時間設定で行った。ＳＲＭ分析条件を表１６にまとめる。内部標準は使用しないか、または定量化分析のためにモニターしなかった。
【表１７】
【０１５０】
データ分析および計算
Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＭａｓｓＬｙｎｘ（バージョン４．０、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）をＬＣ／ＭＳデータの分析に使用した。チゲサイクリン、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）およびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）の血清中の濃度をウサギ血清において作成された標準曲線と比較して、サンプルにおける検体対内部標準ピーク面積比に基づいて計算した。
【０１５１】
Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）合成標準の純度
合成Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）のＨＰＬＣ分析から得られたＵＶクロマトグラムを図２５に示す。Ｍ９およびその分解物のＵＶクロマトグラムピーク面積を表１７に示す。
【表１８】
【０１５２】
Ｍ９エピマーは最も豊富な化合物関連成分であり、合成Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリンの約５１％を占めていた。Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリンの推定純度は３２％であった。
マウス血清および尿ならびにウサギ血清における代謝産物
【０１５３】
マウス血清において、チゲサイクリン、チゲサイクリンのエピマー、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）およびチゲサイクリングルクロニド（Ｍ７およびそのエピマーＭ６）がＬＣ／ＭＳ分析により観察された。これらの成分のマウス血清中の濃度は調べなかった。マウス血清においてはＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリンは観察されなかった。同じチゲサイクリン関連成分がマウス尿において観察された。
【０１５４】
ウサギ血清において、チゲサイクリン、チゲサイクリンのエピマー、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）、チゲサイクリングルクロニド（Ｍ７およびそのエピマーＭ６）およびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）がＬＣ／ＭＳ分析により観察された。ヒトにおいて観察されるものと同じであるウサギにおけるチゲサイクリングルクロニドの特性化は、Ｍ７を含有していることが公知のヒト尿を用いて行われた同時クロマトグラフィー実験により立証された（データは省略）。ウサギ血清中のチゲサイクリンの推定濃度は、１時間での２０２０ ｎｇ／ｍＬから２時間での１０４０ ｎｇ／ｍＬそして６時間での２８７ ｎｇ／ｍＬに減少した（表１８）。Ｍ３の濃度も時間とともに減少し、０．５、２および６時間で、それぞれ、５４５、３１２および９０．２ ｎｇ／ｍＬであった。しかしながら、Ｍ９濃度は時間とともに増大し、０．５時間での５．５ ｎｇ／ｍＬから２時間および６時間でのそれぞれ８．１および２０ ｎｇ／ｍＬに増大した。
【表１９】
【０１５５】
液体クロマトグラフィー／質量分析による代謝産物特性化
ＬＣ／ＭＳ分析をＣＤ−１マウスおよびウサギから得られた血清ならびにＣＤ−１マウスから得られた尿の抽出物に対して行った。これらのサンプル中で観察されるチゲサイクリン関連化合物のまとめを表１９に示す。チゲサイクリンおよびその代謝産物の質量スペクトルデータを以下で考察する。
【表２０】
ａ．ＬＣ／ＭＳデータファイルＵＬ＿０６３００５＿０００６およびＵＬ＿０７０１０５＿０００５から得られる保持時間
ｂ．ＴＢＡＡＡ＝ｔ−ブチルアミノアセチルアミノ
Ｍ：マウス； Ｒ：ウサギ； Ｓ：血清； Ｕ：尿
【０１５６】
チゲサイクリン
チゲサイクリンはマウス血清および尿、ならびにウサギ血清において観察された。チゲサイクリン真正標準のスペクトル特性を代謝産物との比較のために調べた。チゲサイクリンのＬＣ／ＭＳスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ ５８６で観察された。チゲサイクリンのｍ／ｚ ５８６の衝突活性化解離から得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを図２６Ａに示し、提案されたフラグメンテーションスキームを図２６Ｂに示す。提案されたフラグメンテーションスキームは、Ｋａｍｅｌおよび共同研究者により関連するテトラサイクリン構成物質について提案されたスキームと一致していた（Ａ． Ｍ． Ｋａｍｅｌら、エレクトロスプレーイオン化、Ｈ／Ｄ交換、および多段質量分析によるテトラサイクリンの質量スペクトル特性化（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ テトラサイクリンｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｈ／Ｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ、ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｔａｇｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ） Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、１３：５４３５５７、２００２）。ｍ／ｚ ５８６からのＮＨ３の欠失は、ｍ／ｚ ５６９を生成した。ｍ／ｚ ５１３でのプロダクトイオンは、ｔ−ブチルアミノアセチルアミノ（ＴＢＡＡＡ）側鎖からのｔ−ブチルアミノ基の欠失を表す。全ＴＢＡＡＡ側鎖の欠失はｍ／ｚ ４５６を生成した。ｍ／ｚ ２１１および１５４でのプロダクトイオンは、図２６Ｂのフラグメンテーションスキームにおいて示されるようなテトラサイクリン環系のＤ環起源であった。ｍ／ｚ ８６イオンはｔ−ブチルアミノメチレン基を表していた。
【０１５７】
チゲサイクリンエピマー
チゲサイクリンのエピマーは、マウス血清および尿、ならびにウサギ血清において観察され、ｍ／ｚ５８６で［Ｍ＋Ｈ］＋を生成した。図２７Ａおよび２７Ｂにおいて示されるｍ／ｚ ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンは、ｍ／ｚ ５６９、５１３、４５６および８６を含み、これはチゲサイクリンについても存在していた。エピマーとしての同定は、その相対保持時間がチゲサイクリンよりも短いことに基づいて行われた。
【０１５８】
代謝産物Ｍ３
代謝産物Ｍ３はマウス血清および尿、ならびにウサギ血清において観察された。代謝産物Ｍ３の［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ ４７３で観察された。Ｍ３のｍ／ｚ ４７３質量スペクトルのプロダクトイオンを図２８Ａおよび２８Ｂにおいて示す。ｍ／ｚ ４７３質量スペクトルのプロダクトイオンは、それぞれメチル基およびＮＨ３基の欠失から生成するｍ／ｚ ４５８および４５６を含んでいた。ｍ／ｚ １５４でのプロダクトイオンもチゲサイクリンについて観察され、これは未変化Ｄ環を示す。ｍ／ｚ４５８からのＨ２ＯおよびＮＨ３の欠失は、ｍ／ｚ ４２３を生成した。その後の２つのＣＯ分子の欠失はｍ／ｚ ３６７を生成した。ＣＯおよびＣＨ３−Ｎ＝ＣＨ２の両方の欠失は、ｍ／ｚ ３５２を生成した。このフラグメンテーション挙動は、ミノサイクリン関連物質（Ａ． Ｍ． Ｋａｍｅｌら、エレクトロスプレーイオン化、Ｈ／Ｄ交換、および多段質量分析によるテトラサイクリンの質量スペクトル特性化（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ テトラサイクリンｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｈ／Ｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ、ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｔａｇｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ） Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、１３：５４３−５５７、２００２）およびＭ３が９−アミノサイクリンであることと一致していた。Ｍ３のＨＰＬＣ保持時間およびＭＳ／ＭＳスペクトルデータを９−アミノミノサイクリンのものとマッチングすることにより確認した（データは省略）。
【０１５９】
代謝産物Ｍ６およびＭ７
代謝産物Ｍ６およびＭ７はマウス血清および尿、ならびにウサギ血清において観察された。Ｍ６およびＭ７の［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ ７６２で観察され、これはチゲサイクリンよりも１７６ Ｄａ大きかった。Ｍ６およびＭ７の質量スペクトルデータは類似していた。Ｍ７のｍ／ｚ ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを図２９Ａおよび２９Ｂに示す。１７６ Ｄａのニュートラルロスはｍ／ｚ ５８６を生成し、またチゲサイクリンについて［Ｍ＋Ｈ］＋を生成し、これはチゲサイクリンのグルクロニドを示した。ｍ／ｚ ５６９、５１３、４５６および１５４でのプロダクトイオンもチゲサイクリンについて観察されたが、接合の部位を示さなかった。５５１でのプロダクトイオンは、フラグメンテーションスキームにおいて示されるようにＣ環のフラグメンテーションにより形成され、このことはＡ環またはＣ環のいずれかの上のヒドロキシ基がグルクロン酸化の部位であったことを示す。チゲサイクリンのＡ環と類似したフェノール環を有する三環式化合物であるロソキサントロンを代謝させて、フェノールグルクロニドを得た（Ｒｅｎｎｅｒ ＵＤ、Ｐｉｐｅｒｏｐｏｕｌｏｓ Ｇ、Ｇｅｂｈａｒｄｔ Ｒ、Ｅｈｎｉｎｇｅｒ Ｇ、Ｚｅｌｌｅｒ ＫＰ． Ｔｈｅ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ （ＣＩ−９４１）． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ３０：４６４４７８、２００２）。これは、Ａ環のヒドロキシ基がチゲサイクリンのグルクロン酸化部位である確率が最も高いことを示す。代謝産物Ｍ６はＨＰＬＣ保持時間がＭ７よりも早いことに基づいてＭ７のエピマーであることが提案された。これは、チゲサイクリンよりも早期に溶出するチゲサイクリンエピマーと一致した（前述の「チゲサイクリンエピマー」の項を参照）。ウサギ血清抽出物のヒト尿抽出物との同時クロマトグラフィーは、両サンプルが同じチゲサイクリングルクロニド（Ｍ７）を含有していたことを示す（データは省略）。従って、Ｍ６およびＭ７はそれぞれチゲサイクリンエピマーおよびチゲサイクリンのグルクロニドであることが提案された。
【０１６０】
代謝産物Ｍ９
代謝産物Ｍ９はＬＣ／ＳＲＭ分析によりウサギ血清において観察された。この代謝産物 はマウス血清または尿において観察されなかった。図３０は、ｍ／ｚ ５１５→４９８トレースにおいて示される、Ｍ９を含むウサギ血清におけるチゲサイクリンおよびその代謝産物の個々のＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムを示す。ウサギ血清の複合ＬＣ／ＳＲＭ分析を図３１に示す。
【０１６１】
［１４Ｃ］チゲサイクリンを健康な男性ボランティアに静脈内投与した後、チゲサイクリンは血清中の主な放射標識された成分であった。しかしながら、ヒトにおけるチゲサイクリン代謝の２つの経路、９−アミノミノサイクリンのＮ−アセチル化および親化合物のグルクロン酸化はラットまたはイヌにおいて観察されなかった。この実施例における研究は、チゲサイクリン代謝のこれらの経路がマウスおよび／またはウサギにおいて存在するかどうかを調べた。従来の代謝データおよび本研究から得られたデータに基づいて、マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびヒトにおけるチゲサイクリンの提案された代謝経路を図３２に示す。
【０１６２】
ウサギおよびマウスの両方において、チゲサイクリンのグルクロン酸化が観察された。合成標準を入手できなかったので、存在するグルクロニド代謝産物の量は測定できなかった。チゲサイクリンの投与後に集められたヒト尿を用いた同時クロマトグラフィー実験において、ヒト尿におけるグルクロニドおよびウサギ血清におけるグルクロニドは同じ保持時間を有していたことが示された。マウス血清を用いて同時クロマトグラフィーを行わなかったが、マウス血清中のグルクロニドはウサギおよびヒトにおいて観察されるものと類似した保持時間を有し、Ｍ７であると推定される。
【０１６３】
Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）はウサギ血清において観察されたが、マウス血清においては観察されなかった。Ｍ９のウサギ血清中の推定濃度は５．５ ｎｇ／ｍＬから２０ ｎｇ／ｍＬに、投与後０．５から６時間で増大した。これらの濃度は、チゲサイクリンの繰り返し投与後のヒト血清中のＭ８について従来報告されているもの（３−１５ ｎｇ／ｍＬ）と類似していた。さらに、ウサギ血清において、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）は５４５ｎｇ／ｍＬもの高い濃度で観察された。代謝産物はマウス、ラット、イヌおよびヒトからの血清において観察されるが、これらの種においてはごく微量の代謝産物であった。Ｍ３はウサギにおける主な代謝産物であるようで、チゲサイクリンに対して最高３０％までの濃度である。
【０１６４】
まとめると、マウスおよびウサギにチゲサイクリンを１回静脈内投与し、次いで尿（マウスのみ）および血液を血清の調製のために投与後様々な時点で集めた。オスＣＤ−１マウスに５ｍｇ／ｋｇ投与し、投与後０．５、２および４時間で血液を集め、一方、尿を投与後０〜４時間で集めた。メスニュージーランドホワイトウサギに４ｍｇ／ｋｇのチゲサイクリンを投与し、血液を投与後０．５、２および６時間で集めた。選択されたモニタリングモードにおいてＬＣ／ＭＳにより分析される前の時点および種により血清サンプルをプールした。チゲサイクリン（およびそのエピマー）、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）、チゲサイクリングルクロニド（Ｍ７およびそのエピマー、Ｍ６）ならびにＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９およびそのエピマー、Ｍ８）の存在を調べた。非有効ＬＣ／ＭＳ法、合成標準および内部標準を用いてウサギ血清中のＭ３、Ｍ９およびチゲサイクリンの濃度を推定した。
【０１６５】
ウサギ血清において、チゲサイクリン、チゲサイクリンのエピマー、Ｍ３、Ｍ６、Ｍ７ およびＭ９が検出された。チゲサイクリンの０．５、２および６時間血清サンプル中の推定濃度はそれぞれ２０２０、１０４０および２８７ｎｇ／ｍＬであった。Ｍ３の濃度も時間とともに、０．５時間の５４５ｎｇ／ｍＬから６時間の９０．２ｎｇ／ｍＬまで減少した。Ｍ９の濃度は長時間にわたり、０．５時間の５．５ｎｇ／ｍＬから２時間の８．１ｎｇ／ｍＬ、そして6時間の２０ｎｇ／ｍＬまで増加した。Ｍ６およびＭ７の濃度は合成標準がないために測定できなかった。
【０１６６】
マウス血清および尿において、チゲサイクリン、チゲサイクリンのエピマー、Ｍ３、Ｍ６およびＭ７が検出された。これらの化合物のマウス血清および尿中の濃度は測定されなかった。Ｍ９はマウス血清および尿において観察されなかった。
【０１６７】
まとめると、チゲサイクリンをウサギおよびマウスに１回静脈内投与した後、チゲサイクリン、そのエピマー、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）およびチゲサイクリングルクロニド（Ｍ７、およびそのエピマーＭ６）が両種から得られる血清において観察された。加えて、Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）はウサギ血清において観察された。チゲサイクリンのＭ７へのグルクロン酸化およびＭ３のＭ９へのＮ−アセチル化もヒトにおいて観察されたが、ラットまたはイヌにおいては観察されなかった。これらの化合物は前記方法により単離することができる。
【０１６８】
本発明の他の実施態様は、本明細書および本明細書において開示された本発明の実施例を考慮すると当業者には明らかになるであろう。本明細書および実施例は例示のみとして見なされ、本発明の新の範囲および精神は以下の請求の範囲により示されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】ヒトにおいて５０ｍｇ用量の［１４Ｃ］チゲサイクリンを１回静脈内投与した後の尿および大便中の放射能の削減にための平均（ＩＳＤ）である。
【図２】長時間にわたる血清中の平均（ＩＳＤ）チゲサイクリンおよび放射能濃度である。
【図３Ａ】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後１時間で対象１から抽出されたヒト血清のＨＰＬＣラジオクロマトグラムを示す。
【図３Ｂ】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後８時間で対象１から抽出されたヒト血清のＨＰＬＣラジオクロマトグラムを示す。
【図４】［１４Ｃ］ チゲサイクリンの投与後８時間で対象１から抽出されたヒト血清の複合ＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムである。
【図５Ａ】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後０〜４時間で集められた対象４からのヒト尿のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【図５Ｂ】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後２４〜４８時間で集められた対象４からのヒト尿のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【図５Ｃ】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後２４〜４８時間で集められた対象４からのヒト大便のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【図６】ヒト尿中、３７℃でインキュベートされた［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性である。
【図７】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後０〜４時間で集められた対象８からのヒト尿の複合質量クロマトグラムである。
【図８】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後３４．２時間で集められた対象８からの抽出されたヒト大便のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【図９】チゲサイクリンのｍ／ｚ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【図１０】チゲサイクリンのエピマーのｍ／ｚ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【図１１】Ｍ２のｍ／ｚ６０２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【図１２Ａ】ヒト尿から単離されたＭ３ａのラジオクロマトグラムである。
【図１２Ｂ】ヒト尿から単離されたＭ３ａの質量クロマトグラムである。
【図１３】Ｍ３ａのＬＣ／ＭＳ質量スペクトルである。
【図１４】ヒト血清におけるＭ３（９−アミノミノサイクリン）についてのｍ／ｚ４７３→４５６ＳＲＭ遷移のＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムである。
【０１７０】
【図１５】Ｍ６のＭ／Ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【図１６】Ｍ７のＭ／Ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【図１７】Ｍ９のＭ／Ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【図１８】チゲサイクリングルクロニドの提案された構造および質量スペクトルフラグメンテーションスキームである。
【図１９Ａ】チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析から得られたＵＶクロマトグラムである。
【図１９Ｂ】チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析からの選択された質量クロマトグラムである。
【図１９Ｃ】チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析からの選択された質量クロマトグラムである。
【図２０Ａ】チゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンのフルスケールプロットであり；（Ｂ）は強度が低いプロダクトイオンを示すために拡大されたプロットである。
【図２０Ｂ】強度が低いプロダクトイオンを示すために拡大されたチゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンのプロットである。
【図２１Ａ】低強度プロダクトイオンを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図２１Ｂ】低強度プロダクトイオンを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図２１Ｃ】低強度プロダクトイオンを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図２１Ｄ】全イオンクロマトグラムを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図２２】ヒト血清中、３７℃でインキュベートされた［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性である。
【図２３Ａ】ヒト尿から集められたＨＰＬＣフラクションの直接注入から得られるチゲサイクリングルクロニドのプロダクトイオンを示す。
【図２３Ｂ】ヒト尿から集められたＨＰＬＣフラクションの直接注入から得られるｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを示すチゲサイクリングルクロニドの質量スペクトルである。
【図２４Ａ】ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドＬＣ／ＭＳ分析から得られたチゲサイクリングルクロニドのＬＣ／ＭＳスペクトルである。
【図２４Ｂ】ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドのＬＣ／ＭＳ分析から得られたチゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのＭＳ２である。
【図２４Ｃ】ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドＬＣ／ＭＳ分析から得られたチゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのＭＳ２である。
【図２４Ｄ】ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドのＬＣ／ＭＳ分析から得られるチゲサイクリングルクロニドのプロダクトイオンを示す。
【図２５】合成Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）のＨＰＬＣ分析から得られるＵＶクロマトグラムである。
【図２６Ａ】チゲサイクリンのｍ／ｚ５８６の衝突活性化解離から得られるＭＳ／ＭＳスペクトルの提案されたフラグメンテーションスキームである。
【図２６Ｂ】チゲサイクリンのｍ／ｚ５８６の衝突活性化解離から得られるＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【図２７Ａ】チゲサイクリンのエピマーのｍ／ｚ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンを示す。
【図２７Ｂ】チゲサイクリンのエピマーのｍ／ｚ５８６質量スペクトルである。
【図２８Ａ】Ｍ３のｍ／ｚ４７３質量スペクトルのプロダクトイオンを示す。
【図２８Ｂ】Ｍ３のｍ／ｚ４７３質量スペクトルである。
【図２９Ａ】Ｍ７のｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを示す。
【図２９Ｂ】Ｍ７のｍ／ｚ７６２質量スペクトルである。
【図３０】ｍ／ｚ５１５→４９８トレースにおいて示されるＭ９を有するウサギ血清におけるチゲサイクリンとその代謝産物のＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムを示す。
【図３１】ウサギ血清の複合ＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムである。
【図３２】マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびヒトにおけるチゲサイクリンの提案された代謝経路を示すスキームである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルクロニドに関し、さらに詳細には、チゲサイクリンのグルクロニド誘導体、その調製法およびこれを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
チゲサイクリン（ＧＡＲ−９３６）はグリシルサイクリン抗生物質および半合成テトラサイクリン、ミノサイクリンの類似体である。これは抗生物質に対して新たに発生する耐性の世界的な脅威に対して開発された。チゲサイクリンは、インビトロおよびインビボのどちらにおいても広範囲に及ぶ抗菌活性を有する。グリシルサイクリン抗生物質、例えばテトラサイクリン抗生物質は、細菌におけるタンパク質翻訳を阻害することにより作用する。
【０００３】
グリシルサイクリン、例えばチゲサイクリンは、多くの抗生物質耐性グラム陽性病原菌 、例えば、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ペニシリン耐性ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびバンコマイシン耐性腸球菌に対して活性である（Ｗｅｉｓｓら、１９９５；Ｆｒａｉｓｅら、１９９５）。大変重要なのは、排出およびリボソーム保護というテトラサイクリン耐性の２つの主な形態を有する細菌種に対するチゲサイクリンの活性である（ＳｃｈｎａｐｐｉｎｇｅｒおよびＨｉｌｌｅｎ、１９９５）。
【０００４】
テトラサイクリン抗生物質は、代謝をほとんどまたは全く受けない。ミノサイクリン９−ヒドロキシル化およびＮ−脱メチル化がヒトにおいて報告されているが、ごく限られた程度である（ＮｅｌｉｓおよびＤｅＬｅｅｎｈｅｅｒ、１９８２）。Ｃ４位でのエピマー化がほとんどのテトラサイクリン抗生物質について報告されており、一般に、代謝経路ではなく分解と見なされている（Ｒｅｍｍｅｒｓら、１９６３）。健康な男性ボランティアに静脈内投与した後の［１４Ｃ］チゲサイクリンの代謝動態を分析し、本研究から得られた結果をラットよびイヌにおける臨床前代謝研究において得られた結果と比較した。
【０００５】
［１４Ｃ］チゲサイクリンを健康な男性ボランティアに静脈内投与した後、血清、尿および大便中の放射標識されたチゲサイクリンベースの化合物に関して分析を行った。非放射性チゲサイクリンを男性ボランティアに静脈内投与した後のヒト血清および尿の分析後に同様の結果が報告され、この場合、最小代謝が報告された。非標識実験は、ラットおよびイヌを用いた代謝実験からの結果と一致し、この場合、チゲサイクリンは、静脈内投与後の血漿および尿中の主な化合物関連成分であった。
【０００６】
チゲサイクリンおよびＭ３ａ（ｔ−ブチルアミノ酢酸）のエピマーも各マトリックスにおいて観察された。チゲサイクリンのエピマーは、代謝物であるよりも分解物であることが証明されており、ラットおよびイヌ、血漿および尿、ならびにヒト血清および尿において観察されている。チゲサイクリンの多くはこれらのマトリックスについて用いられる抽出手順の代打にエピマーに変換されるので、血清および大便サンプル中のチゲサイクリンエピマーの量は過大評価されがちである。初期に溶出されるクロマトグラフィーピークは、Ｍ３ａと推定され、これもラット、イヌ、血漿および尿において観察される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本研究から得られた血清、尿および大便中で検出されたチゲサイクリン関連化合物をスキーム１において示す。
スキーム１ ヒト血清、尿および大便中で検出された［１４Ｃ］チゲサイクリン関連化合物
【化１】
【０００８】
Ｍ６（チゲサイクリングルクロニドのエピマー）およびＭ７（チゲサイクリングルクロニド）はどちらも血清および大便サンプルラジオクロマトグラムにおいて観察された。グルクロン酸化部位は未知のままである。代謝産物およびそのエピマーの可能な構造を以下に示す：
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【０００９】
Ｍ６でなくＭ７が尿サンプルのラジオクロマトグラムにおいて観察された。チゲサイクリンのグルクロン酸化は、ヒト肝臓ミクロソームまたはヒト肝細胞を用いてインビトロで、あるいはラット、イヌまたはヒトにおいてインビボではこれまでに報告されていない。ヒト血清および尿の従来の分析は、標識されていないチゲサイクリンを用い、チゲサイクリン代謝の予備的評価のためにＬＣ／ＭＳによるサンプル分析を用いて行われた。この実験の間、グルクロニド代謝産物は特に調査されなかった。［１４Ｃ］チゲサイクリンを用いてインビボのラットよびイヌサンプルの分析を行い、グルクロン酸化は観察されなかった。テトラサイクリン抗生物質についての代謝経路としてグルクロン酸化を特定する科学文献において周知の報告はない。
【００１０】
代謝産物Ｍ６およびＭ７は、チゲサイクリンのプロドラッグとして使用することができる。投与されると、β−グルクロニダーゼ酵素はＭ６およびＭ７を開裂させて、チゲサイクリンを放出することができる。チゲサイクリンの直接投与でなく、Ｍ６またはＭ７としての投与は、薬剤の吸収、分布、代謝、排出および／または副作用を変更し得る。さらに、これらの化合物は抗菌剤として直接役立つ。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、ヒトにおいて５０ｍｇ用量の［１４Ｃ］チゲサイクリンを１回静脈内投与した後の尿および大便中の放射能の削減にための平均（ＩＳＤ）である。
【００１２】
図２は、長時間にわたる血清中の平均（ＩＳＤ）チゲサイクリンおよび放射能濃度である。
【００１３】
図３Ａは、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後１時間で対象１から抽出されたヒト血清のＨＰＬＣラジオクロマトグラムを示す。
【００１４】
図３Ｂは、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後８時間で対象１から抽出されたヒト血清のＨＰＬＣラジオクロマトグラムを示す。
【００１５】
図４は、［１４Ｃ］ チゲサイクリンの投与後８時間で対象１から抽出されたヒト血清の複合ＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムである。
【００１６】
図５Ａは、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後０〜４時間で集められた対象４からのヒト尿のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【００１７】
図５Ｂは、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後２４〜４８時間で集められた対象４からのヒト尿のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【００１８】
図５Ｃは、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後２４〜４８時間で集められた対象４からのヒト大便のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【００１９】
図６は、ヒト尿中、３７℃でインキュベートされた［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性である。
【００２０】
図７は、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後０〜４時間で集められた対象８からのヒト尿の複合質量クロマトグラムである。
【００２１】
図８は、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後３４．２時間で集められた対象８からの抽出されたヒト大便のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【００２２】
図９は、チゲサイクリンのｍ／ｚ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【００２３】
図１０は、チゲサイクリンのエピマーのｍ／ｚ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【００２４】
図１１は、Ｍ２のｍ／ｚ６０２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【００２５】
図１２Ａは、ヒト尿から単離されたＭ３ａのラジオクロマトグラムである。
【００２６】
図１２Ｂは、ヒト尿から単離されたＭ３ａの質量クロマトグラムである。
【００２７】
図１３は、Ｍ３ａのＬＣ／ＭＳ質量スペクトルである。
【００２８】
図１４は、ヒト血清におけるＭ３（９−アミノミノサイクリン）についてのｍ／ｚ４７３→４５６ＳＲＭ遷移のＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムである。
【００２９】
図１５は、Ｍ６のＭ／Ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【００３０】
図１６は、Ｍ７のＭ／Ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【００３１】
図１７は、Ｍ９のＭ／Ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【００３２】
図１８は、チゲサイクリングルクロニドの提案された構造および質量スペクトルフラグメンテーションスキームである。
【００３３】
図１９Ａは、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析から得られたＵＶクロマトグラムである。
【００３４】
図１９Ｂは、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析からの選択された質量クロマトグラムである。
【００３５】
図１９Ｃは、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析からの選択された質量クロマトグラムである。
【００３６】
図２０Ａは、チゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンのフルスケールプロットであり；（Ｂ）は強度が低いプロダクトイオンを示すために拡大されたプロットである。
【００３７】
図２０Ｂは、強度が低いプロダクトイオンを示すために拡大されたチゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンのプロットである。
【００３８】
図２１Ａは、低強度プロダクトイオンを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【００３９】
図２１Ｂは、低強度プロダクトイオンを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【００４０】
図２１Ｃは、低強度プロダクトイオンを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【００４１】
図２１Ｄは、全イオンクロマトグラムを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【００４２】
図２２は、ヒト血清中、３７℃でインキュベートされた［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性である。
【００４３】
図２３Ａは、ヒト尿から集められたＨＰＬＣフラクションの直接注入から得られるチゲサイクリングルクロニドのプロダクトイオンを示す。
【００４４】
図２３Ｂは、ヒト尿から集められたＨＰＬＣフラクションの直接注入から得られるｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを示すチゲサイクリングルクロニドの質量スペクトルである。
【００４５】
図２４Ａは、ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドＬＣ／ＭＳ分析から得られたチゲサイクリングルクロニドのＬＣ／ＭＳスペクトルである。
【００４６】
図２４Ｂは、ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドのＬＣ／ＭＳ分析から得られたチゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのＭＳ２である。
【００４７】
図２４Ｃは、ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドＬＣ／ＭＳ分析から得られたチゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのＭＳ２である。
【００４８】
図２４Ｄは、ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドのＬＣ／ＭＳ分析から得られるチゲサイクリングルクロニドのプロダクトイオンを示す。
【００４９】
図２５は、合成Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）のＨＰＬＣ分析から得られるＵＶクロマトグラムである。
【００５０】
図２６Ａは、チゲサイクリンのｍ／ｚ５８６の衝突活性化解離から得られるＭＳ／ＭＳスペクトルの提案されたフラグメンテーションスキームである。
【００５１】
図２６Ｂは、チゲサイクリンのｍ／ｚ５８６の衝突活性化解離から得られるＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【００５２】
図２７Ａは、チゲサイクリンのエピマーのｍ／ｚ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンを示す。
【００５３】
図２７Ｂは、チゲサイクリンのエピマーのｍ／ｚ５８６質量スペクトルである。
【００５４】
図２８Ａは、Ｍ３のｍ／ｚ４７３質量スペクトルのプロダクトイオンを示す。
【００５５】
図２８Ｂは、Ｍ３のｍ／ｚ４７３質量スペクトルである。
【００５６】
図２９Ａは、Ｍ７のｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを示す。
【００５７】
図２９Ｂは、Ｍ７のｍ／ｚ７６２質量スペクトルである。
【００５８】
図３０は、ｍ／ｚ５１５→４９８トレースにおいて示されるＭ９を有するウサギ血清におけるチゲサイクリンとその代謝産物のＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムを示す。
【００５９】
図３１は、ウサギ血清の複合ＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムである。
【００６０】
図３２は、マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびヒトにおけるチゲサイクリンの提案された代謝経路を示すスキームである。
【００６１】
ヒトをチゲサイクリンで処理することにより、チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物がそのエピマーとともに産生されることが見出された。代謝物およびそのエピマーはどちらもヒト血清、尿、および大便中で見出され、その後抽出され、分析された。本発明の詳細な実験態様は、比較例１〜３および実施例１〜１０において記載され、６人の健康な男性ボランティアに投与されたチゲサイクリンの質量バランスおよび代謝産物特性を説明する。比較例１〜３は、これらの媒体におけるチゲサイクリンの相対的安定性を決定するのを助けるために使用される血清、尿および大便における対照実験を検討する。一方、実施例１〜１０は、前記の６人のボランティアに対して行われた実験に関する。
【００６２】
スキーム１を参照して、代謝産物Ｍ３（９−アミノミノサイクリン）、Ｍ８（Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリンのエピマー）およびＭ９（Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン）も血清および尿のＬＣ／ＭＳ分析により検出された。これらの代謝産物がｔ−ブチルアミノアセチルアミノ側鎖のアミド加水分解後に形成されたので、これらは放射標識されなかった。従って、血清および尿中のこれらの代謝産物の濃度は、ＬＣ／ＭＳデータからのみ評価できた。これらのデータに基づいて、Ｍ３およびＭ８は血清および尿中の副次的な代謝産物であるようであり、一方、Ｍ９は血清においては副次的な代謝産物であるようであるが、尿中ではＭ７と匹敵する濃度で存在する。Ｍ３はラット、イヌおよびヒト尿および血漿（ヒトについては血清）において報告されているが、Ｎ−アセチル代謝物（Ｍ８およびＭ９）は以前には報告されていない。代謝産物Ｍ８およびＭ９は放射標識されなかったので、従来のラットおよびイヌ代謝研究からのサンプル中に存在していたが、ＬＣ／ＭＳにより特異的に調査されなかったので検出されなかった。
【００６３】
ヒト排泄物中の放射能の平均合計回収率は９１．８％であり（±５．６、ｎ＝３）、尿中に３３．２±１．９％、大便中に５８．６％±４．４％排出された（図１）。これらのデータは、ラットおよびイヌからえられたデータと一致し、１回の静脈内［１４Ｃ］チゲサイクリン投与の約８９％（ケージリンスを含む）が各試験片中に回収された。ラットにおいて、３４％が尿中に、５３％が大便中に回収され、一方、イヌにおいては、３６％が尿中に、４７％が大便中に回収された。
【００６４】
血清中の放射能は、血清中のチゲサイクリン濃度よりもはるかに急速に減少した（図２）。この違いは、［１４Ｃ］チゲサイクリンの投与前に組織に分布する有意量の未標識チゲサイクリンにより引き起こされやすいが、これは［１４Ｃ］ チゲサイクリンの組織内取り込みの一部を制限する。この「後入れ先出し（ｌａｓｔ−ｉｎ、ｆｉｒｓｔ−ｏｕｔ）」現象は、おそらくはチゲサイクリンと比較した全放射能について遙かに少ない体積の分布および遙かに高いクリアランスをもたらす可能性が最も高かった。
【００６５】
［１４Ｃ］チゲサイクリン投与量の約５０％が最初の４８時間で回収された（尿中２７％、大便中２４％）。分析された尿サンプルにおいて、投与量の１５％が未変化チゲサイクリンとして、２．０％がチゲサイクリンのエピマーとして、４．１％がＭ７として、６．３％がＭ３ａとして排出された。大便ホモジネートサンプルにおいて、投与量の９．９％が未変化チゲサイクリンとして、５．５％がチゲサイクリンエピマーとして、５．４％がグルクロニド（Ｍ６＋Ｍ７）として、１．５％がＭ３ａとして排出された。Ｍ３ａとして排出された放射能は、形成されたＭ３、Ｍ８およびＭ９の量と等しいとみなされ、これは投与量の約８％であった。しかしながら、代謝産物Ｍ３、Ｍ８およびＭ９は放射標識を含有しなかったので、その血清、尿および大便中の濃度は、正確に評価できなかった。
【００６６】
ＬＣ／ＭＳを使用して、微量のヒドロキシチゲサイクリン代謝産物（Ｍ１、Ｍ２およびＭ４）が尿中で検出されたが、ラジオクロマトグラフィーにより検出されなかった。これらのヒドロキシチゲサイクリン代謝産物は以前にラットおよびイヌ、血漿および尿、ならびにヒト血清および尿における微量の代謝産物として報告されていない。しかしながら、従来報告され、評価されたこれらの代謝産物のヒト血清および尿中の濃度は、本研究におけるラジオクロマトグラフィーの検出の下限より低い。チゲサイクリンのＮ−デスメチル代謝産物はラット血漿および尿、ならびに従来の研究から得られたヒト尿サンプルにおいて微量代謝産物として報告された。この代謝産物は本研究において分析されたサンプルのいずれにおいても検出されなかった。
【００６７】
本研究は、［１４Ｃ］標識されたチゲサイクリン用量の体内動態のみを評価し、未標識用量から残存するチゲサイクリン関連生成物を明らかにしなかった。したがって、本明細書において報告されている、チゲサイクリン関連生成物の推定濃度は、血清、尿および大便中のこれらの成分の実際の濃度を過小評価すると予想された。実際、本研究から得られた血清および尿サンプル中の全チゲサイクリン（放射標識されたものおよび未標識のもの）の濃度は、［１４Ｃ］チゲサイクリン用量の放射能濃度および比活性度を用いて同じサンプルについて計算された濃度よりも一貫して大きかった（一般に１０〜３００％大きかった）。これは、本研究において用いられる投与計画（未標識用量を複数回、それに続いて［１４Ｃ］標識用量を１回）およびチゲサイクリンについて報告されている長い半減期に基づくと予想されないものではなかった。
【００６８】
従って、チゲサイクリンを複数回静脈内投与し、それに続いて［１４Ｃ］標識チゲサイクリン投与量を１回健康な男性ボランティアに投与した後、血清、尿および大便中の主な放射標識された成分は未変化チゲサイクリンであった。チゲサイクリンの主な代謝経路は、グルクロン酸化およびアミド加水分解とそれに続くＮ−アセチル化であった。分解生成物であるチゲサイクリンのエピマーも各サンプルにおいて検出された。
【００６９】
血清、尿および大便中のチゲサイクリン関連成分の濃度を他の場所で報告されている全放射能濃度に基づいて計算した。投与量の比活性度（１．００μＣｉ／ｍｇ）を用いてこれらの濃度をｎｇ−チゲサイクリン当量に換算した。この値を用いて、特異成分の濃度を次にラジオクロマトグラムにおける放射能の分布に基づいて評価した。これらの濃度は、［１４Ｃ］標識されたチゲサイクリン用量の体内動態のみを反映し、未標識用量から残存する任意のチゲサイクリン関連生成物の原因でない。
【００７０】
投与後１時間および８時間での対象１からの血清抽出物の代表的ＨＰＬＣラジオクロマトグラムを図３Ａおよび３Ｂに示す。血清抽出物についての代謝産物プロファイルは、異なる対象および異なる時点について類似していた。表１は、血清抽出物中の放射能の相対分布および各［１４Ｃ］チゲサイクリン関連成分の推定濃度を示す。
【表１】
ａ．相対分布は、重複サンプルから得られたＨＰＬＣラジオクロマトグラムにおけるピークの面積積分により決定された。
ｂ．かっこ内で、ｎｇ−チゲサイクリン当量／ｍＬとしての相対濃度は、血清放射能濃度（ｎｇ−チゲサイクリン当量／ｍＬとして）にＨＰＬＣラジオクロマトグラムからの分布（％）をかけることにより推定された。
ｃ．検出の限界は、１ｎｇ当量／ｍＬであった。
ｄ．血清抽出物中で観察されるチゲサイクリンエピマーの多くは、おそらくは抽出プロセスの結果であった、
ＮＤ．は代謝産物が検出されず、０が割り当てられたことを示す。
【００７１】
濃度は、投与量溶液の比活性度、他の場所で報告された血清放射能濃度、および各サンプル中の放射能の相対分布に基づいて推定された。すべての時点での全患者について、チゲサイクリンは検出された主な薬剤関連成分であり、１時間で放射能の６３％を占め、４時間および８時間でそれぞれ４８％および４６％まで減少した（表１）。
【００７２】
チゲサイクリンのエピマーは、存在する次に最も豊富な薬剤関連成分であり、放射能の約２０％に相当した。しかしながら、血清抽出物中のチゲサイクリンの大部分は抽出プロセスの間に形成され得る。抽出中に形成されたエピマーを補正した後、血清サンプル中のエピマーの量は５から８％の間に減少し、チゲサイクリンの量は５９から８０％に増加する。チゲサイクリングルクロニド（Ｍ７）は１時間での放射能の１％未満に相当するが、４および８時間で９および１２％に増加した。チゲサイクリンエピマーのグルクロニド（Ｍ６）は分析された血清サンプルの約半分において検出され、放射能の４％未満を占めた。初期に溶出するクロマトグラフィーピーク（Ｍ３ａ、ｔ−ブチルアミノ酢酸）（保持時間４〜７分）はすべての血清サンプルにおいて検出され、放射能の１０から２０％を占めた。図４は、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）モードにおいて、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて集められた、血清中で検出されたチゲサイクリン関連化合物、例えば、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）、Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリンのエピマー（Ｍ８）およびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）の複合ＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムを示す。ｔ−ブチルアミノアセチルアミノ側鎖が開裂され、放射能フロー検出を用いて定量化できなかったので、これらの代謝産物は放射標識されなかった。ＬＣ／ＭＳ分析に基づくと、これらは血清中の副次的代謝産物であった。
【００７３】
放射活性用量の約２７％は、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後４８時間以内に尿中に排出された。投与後０〜４時間および２４〜４８時間で集められた対象４からの尿の代表的なラジオクロマトグラムを図５Ａ〜５Ｃに示す。尿の代謝産物プロファイルは、患者間および異なる時点で類似していた。尿サンプル中の放射能の相対分布および尿中の各［１４Ｃ］チゲサイクリン関連成分の推定濃度を表２に示す。
【表２】
ａ．相対分布は、重複サンプルから得られたＨＰＬＣラジオクロマトグラムにおけるピークの面積積分により決定された。
ｂ．かっこ内で、μｇ−チゲサイクリン当量／収集としての相対的濃度は、全尿放射能（μｇ−チゲサイクリン当量）にＨＰＬＣラジオクロマトグラムから得られた分布（％）をかけることにより推定された。
ｃ．検出限界は９０ｎｇ当量／ｍＬであった。
ｄ．対象６について、２４〜４８時間収集は部分的収集であった。
ｅ．ＮＤは、代謝産物が検出されず、０を割り当てられたことを示す。
【００７４】
濃度は投与量溶液の比活性度、他の場所において報告された尿放射能濃度、および各サンプルにおける放射能の相対分布に基づいて推定された。［１４Ｃ］チゲサイクリン関連成分のそれぞれとして尿および大便中に排出された［１４Ｃ］チゲサイクリン用量のパーセントを表３に示す。
【表３】
ａ．対象＃６からの尿および大便収集は不完全であったために、２４〜４８時間の尿、合計尿、大便サンプルおよび合計について、ｎ＝５であった。
ｂ．大便ホモジネート抽出物中で観察されるチゲサイクリンエピマーの多くは抽出プロセスの結果である可能性が高かった。
ＮＤは代謝産物が検出されなかったことを示す。
【００７５】
すべての対象について、チゲサイクリンは表２の尿中に排出された主な薬剤関連成分であり、用量の約１５％は最初の４８時間以内に未変化薬剤として尿中に排出された（表３）。チゲサイクリンのエピマーとして同定される尿放射能の量は、０〜４時間収集における放射能の５％から２４〜４８時間収集における１１％まで増加した。安定性分析は尿中３７℃でインキュベートされた場合にチゲサイクリンが分解してエピマーになることを証明しているので、エピマーの一部は、膀胱において形成され得る（図６）。放射活性用量の合計２％は最初の４８時間以内にチゲサイクリンのエピマーとして尿中に排出された。代謝産物Ｍ７は、０〜４時間収集においては副次的成分にすぎなかったが、４〜８時間、８〜２４時間および２４〜４８時間に集められたサンプルにおいて尿放射能の約２０％に相当した。Ｍ３ａは尿中の放射能の約１５〜３７％に相当し、時間とともにチゲサイクリンに比べて増加した。
【００７６】
４８時間以内に尿中に排出される代謝産物Ｍ３ａおよびＭ７の量は、放射活性用量のそれぞれ６および４％を占めた。図７は、尿中で検出されたチゲサイクリン関連化合物の複合クロマトグラムを示す。放射標識されたヒドロキシチゲサイクリン代謝産物（Ｍ１、Ｍ２およびＭ４）、ならびにＭ６は、尿中の放射能の１％未満を占める微量の尿代謝産物であると見なされた。代謝産物Ｍ３、Ｍ８およびＭ９は放射標識されず、したがって相対量はＬＣ／ＭＳ分析に基づいてしか評価できなかった。ＬＣ／ＭＳデータに基づいて、Ｍ３およびＭ８は副次的な代謝産物であり、一方、Ｍ９はＭ７と類似した濃度で存在した。
【００７７】
放射活性投与の４８時間以内に、放射能の約２４％が大便中に回収された。投与後約３４時間で集められた対象８からの大便抽出物の代表的なＨＰＬＣラジオクロマトグラムを図８に示す。大便の代謝産物プロファイルは対象間および集められたすべてのサンプルについて類似していた。大便抽出物中の放射能の相対分布および大便中の各［１４Ｃ］チゲサイクリン関連成分の推定濃度を表３に示す。
【表４】
ａ．相対分布は、重複サンプルから得られたＨＰＬＣラジオクロマトグラムにおけるピークの面積積分により決定された。
ｂ．かっこにおいて、全大便放射能（ｍｇ−チゲサイクリン当量として）にＨＰＬＣラジオクロマトグラムから得られた分布（％）をかけることによりｍｇ−チゲサイクリン当量／収集としての相対的濃度を推定した。
ｃ．検出の限界は、ホモジネート１ｇあたり０．１５μｇ当量であった。
ｄ．大便ホモジネート抽出物において観察されるチゲサイクリンエピマーの多くは、抽出プロセスの結果である可能性が高い。
ｅ．他のクロマトグラフィーピークは、４１から４６分の間の保持時間を有していた。
ＮＤは代謝産物が検出されなかったことを示す。
対象６からは大便サンプルを受け取らなかった。
【００７８】
投与量溶液の比活性度、他の場所で報告されている大便放射能濃度、および各サンプル中の放射能の相対分布に基づいて濃度を推定した。すべての大便サンプルについて、チゲサイクリンは主な薬剤関連成分であり、大便放射能の２８〜５１％を占めていた（表３）。これは４８時間以内の大便において未変化薬剤として排出された放射活性用量の１０％に相当した（表２）。チゲサイクリンのエピマーは大便放射能の１２〜２７％に相当し、放射活性用量の５．５％に相当していた。血清に関して、有意な量のチゲサイクリンエピマーが抽出プロセスの間に形成された。抽出プロセスの間に形成されたエピマーについて補正すると、エピマーの量はサンプルすべてにおいて１２％未満に減少し、一方、チゲサイクリンの量は３９から６６％の間に増加した。代謝産物Ｍ７は大便中の放射能の１０〜２６％に相当し、一方、Ｍ６は最高９％までに相当した。０〜４８時間の大便サンプル中のグルクロニド代謝産物は放射活性用量の約５．５％に相当した。Ｍ３は大便中の放射能の４から１４％の間に相当し、用量の２％未満が大便中にＭ３ａとして排出された。大便放射能の最高１６％までに相当し、用量の約２％に相当するさらなるピークがいくつかの大便サンプルにおいて観察された。大便サンプルのＬＣ／ＭＳ分析は追加の代謝産物を検出しなかった。
【００７９】
血清、尿および大便において観察されるチゲサイクリン関連化合物のまとめを表４に示す。
【表５】
【００８０】
ヒト血清、尿および大便における特性化されたチゲサイクリン代謝産物についての質量スペクトルデータを以下で検討する。
【００８１】
ＬＣ／ＭＳ分析を用いて、ヒト血清、尿および大便、ならびにラットおよびイヌ血漿および尿におけるチゲサイクリン代謝産物の特性化を行った（表５）。これらの代謝産物の構造をスキーム１に示す。標準的クロマトグラフィー技術を用いて実質的に純粋なＭ６またはＭ７を単離できることが期待される。たとえば、実施例７、８および９において用いられるＨＰＬＣパラメータはＭ６およびＭ７の実質的に純粋なアリコートを提供することが期待される。
【００８２】
従って、さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されたようなチゲサイクリン代謝産物を実質的に純粋な形態、例えば、≧約９０％、好ましくは≧約９５％またはそれ以上、例えば、９８％の純度を有する形態で提供する。
【表６】
【００８３】
チゲサイクリンは、血清、尿および大便において観察された。チゲサイクリン真正標準のマススペクトル特性を代謝産物との比較のために調べた。チゲサイクリンのＬＣ／ＭＳスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン、［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ ５８６で観察された。チゲサイクリンのｍ／ｚ ５８６の衝突活性化解離から得られたＭＳ／ＭＳスペクトルおよび提案されたフラグメンテーションスキームを図９に示す。ｍ／ｚ ５８６からのＮＨ３の欠失は、ｍ／ｚ５６９プロダクトイオンを生成した。ｍ／ｚ ５１３でのプロダクトイオンはｔ−ブチルアミノアセチルアミノ（ＴＢＡＡＡ）側鎖からのｔ−ブチルアミノ基の欠失を表す。全ＴＢＡＡＡ側鎖の欠失およびそれに続く４−ジメチルアミノ基の欠失は、それぞれｍ／ｚ ４５６および４１１でプロダクトイオンを生成した。ｍ／ｚ ２１１でのプロダクトイオンは、フラグメンテーションスキームにおいて示すように、テトラサイクリン環のＤ環に由来していた。ｍ／ｚ ８６イオンは、ｔ−ブチルアミノメチレン基を表していた。
【００８４】
チゲサイクリンのエピマーは、血清、尿および大便において観察された。この生成物は、［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ ５８６で生成した。図１０において示されるｍ／ｚ ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンは、ｍ／ｚ ５６９、５１３、４５６、４１１、２１１、１５４および８６を包含し、これらはチゲサイクリンについても存在していた。エピマーとしての同定は、チゲサイクリンよりも短いその相対的保持時間に基づいて行われた。
【００８５】
代謝産物Ｍ１、Ｍ２およびＭ４は、尿において微量で観察された。これらの代謝産物は、［Ｍ＋Ｈ］＋をｍ／ｚ ６０２で産生した。提案されたフラグメンテーションスキームおよびＭ２のｍ／ｚ６０２質量スペクトルのプロダクトイオンを図１１に示す。ｍ／ｚ ５２９および４７２でのプロダクトイオンは、チゲサイクリンについて、それぞれｍ／ｚ５１３および４５６での対応するイオンよりも１６ Ｄａ大きかった。このことは、ｔ−ブチルアミノ−アセチルアミノ基ではなく、テトラサイクリン環が代謝の部位であることを示す。ｍ／ｚ２１１でのプロダクトイオンの存在は、チゲサイクリンについても観察され、代謝の部位としてのテトラサイクリンのＤ環を排除した。Ｍ１およびＭ４についての質量スペクトルデータは、ｍ／ｚ２１１プロダクトイオンがＭ１またはＭ４のいずれかについて観察されない以外は、Ｍ２についてと同様であった。従って、Ｍ１、Ｍ２およびＭ４代謝産物は、テトラサイクリン部分の酸化の生成物であった。
【００８６】
代謝産物Ｍ３ａは、血清、尿および大便において、初期に溶出するラジオクロマトグラムピークとして観察された。この初期に溶出するＭ３ａピークをヒト尿から単離し、その後、通常相ＨＰＬＣを用いてＬＣ／ＭＳ分析して、図１２Ａおよび１２Ｂにおいて示すラジオクロマトグラムおよび質量クロマトグラムを得た。Ｍ３ａについての［Ｍ＋Ｈ］＋および［ＭＨ＋ＣＨ３ＣＮ］＋はそれぞれ、図１３において示すようにｍ／ｚ １３２および１７３で観察された。これは、１３１の分子量を示した。代謝産物Ｍ３は放射標識の欠失のためにＬＣ／ＭＳによってのみ微量で血清および尿において観察された。代謝産物Ｍ３の［Ｍ＋Ｈ］＋ は、ｍ／ｚ ４７３で観察された。ｍ／ｚ ４７３質量スペクトルのプロダクトイオンは、ＮＨ３の欠失から生成したｍ／ｚ ４５６（データは省略）を包含し、これはチゲサイクリン関連化合物に特徴的であった。血清サンプルにおいて、この代謝産物は、図１４において示されるようなｍ／ｚ ４７３→４５６ ＳＲＭ遷移をモニターすることにより観察された。Ｍ３のＣＬ−３１８６１４（９−アミノミノサイクリン）としての同定は、イヌの代謝研究において行われた。代謝産物Ｍ３は、ＴＢＡＡＡ側鎖の放射標識されたｔ−ブチルアミノ酢酸（Ｍ３ａ）でのアミド加水分解により副生成物として生成することが提案された。
【００８７】
代謝産物Ｍ６およびＭ７は血清、尿および大便において観察された。Ｍ６およびＭ７の［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ ７６２で観察され、これはチゲサイクリンよりも１７６ Ｄａ大きかった。Ｍ６およびＭ７の質量スペクトルデータは類似していた。ｍ／ｚ７６２でのプロトン化分子イオンピークは、チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物またはその対応するエピマーの存在を示す。Ｍ６およびＭ７のｍ／ｚ ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンをそれぞれ図１５および１６に示す。Ｍ６およびＭ７のプロダクトイオンはｍ／ｚ ５８６、５６９、５１３、２１１、および８６、ならびにＭ７については１５４で存在していた。Ｍ６およびＭ７について、１７６ Ｄａのニュートラルロスはｍ／ｚ ５８６を生成し、これはチゲサイクリンについての［Ｍ＋Ｈ］＋であり、チゲサイクリンのグルクロニドを示した。ｍ／ｚ ５６９、５１３、４５６、２１１、１５４（ｍ／ｚ １５４はＭ７については観察されたが、Ｍ６については観察されなかった）および８６でのプロダクトイオンもチゲサイクリンについて観察された。代謝産物Ｍ６は、Ｍ７よりも早いＨＰＬＣ保持時間に基づいてＭ７のエピマーであることが提案された。これはチゲサイクリンよりも早期に溶出するチゲサイクリンエピマーと一致した。したがって、Ｍ６およびＭ７はそれぞれチゲサイクリンエピマーおよびチゲサイクリンのグルクロニドであることが提案された。
【００８８】
代謝産物Ｍ８およびＭ９は、血清および尿中で、ＬＣ／ＭＳによってのみ観察された。Ｍ８およびＭ９の［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ ５１５（ＭＷ ５１４）で観察され、これはチゲサイクリンより７１ Ｄａ小さかった。Ｍ８およびＭ９の質量スペクトルデータは類似していた。Ｍ９のｍ／ｚ ５１５質量スペクトルのプロダクトイオンを図１７に示す。ｍ／ｚ５１５からのＮＨ３の欠失は、ｍ／ｚ ４９８生成物を生成した。ｍ／ｚ ４５６、４１１および１５４でのプロダクトイオンも、チゲサイクリンについて観察され、テトラサイクリン環が変わっていないことを示した。Ｍ８およびＭ９のラジオクロマトグラフィーピークの欠損は、ＴＢＡＡＡ側鎖の放射標識されたカルボニル基の欠失と一致した。Ｍ９の形成について最もおこりやすいメカニズムは、アミド加水分解であって、ｔ−ブチルアミノ酢酸（Ｍ３ａ、放射標識を含有していた）および９−アミノミノサイクリン（Ｍ３、１４Ｃ標識なし）を生成した。９−アミノミノサイクリンのＮ−アセチル化は、Ｍ９を生成することが提案された。ｍ／ｚ ４５６プロダクトイオンおよび分子量（５１４）間の５８ Ｄａの差は、非放射標識アセチルアミノ基の存在と一致した。これらの代謝産物の確認は、合成Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（ＷＡＹ−１８８７４９）でスパイクされた尿抽出物の同時クロマトグラフィーにより得られた（データは省略）。代謝産物 Ｍ８は、Ｍ９よりも早いそのＨＰＬＣ保持時間に基づいてＭ９のエピマーであることが提案された。これは、チゲサイクリンより早期に溶出するチゲサイクリンエピマーと一致した。したがって、Ｍ８およびＭ９はそれぞれ、Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリンおよびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリンのエピマーであることが確認された。
【００８９】
図１８〜２１は、チゲサイクリングルクロニドのさらなる分析に関する。図１８は、構造Ｉ、ＩＩエピマー、ＩＩＩおよびＩＶエピマーと対応することができるチゲサイクリングルクロニドの提案された構造および質量スペクトルフラグメンテーションである。図１９ＡはＵＶクロマトグラムであり、図１９Ｂおよび１９Ｃはチゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析から得られた、選択された質量クロマトグラムである。図２０Ａおよび２０Ｂは、チゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを示し、ここにおいて、図２０Ａはフルスケールプロットであり、図２０Ｂは強度の低いプロダクトイオンを示すために拡大されたプロットである。図２１Ａ〜２１Ｄは、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ ７６２分析のプロダクトイオンから得られたＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示し、ここにおいて、図２１Ａ〜２１Ｃは、強度の低いプロダクトイオンの選択された質量クロマトグラムであり、図２１Ｄは全イオンクロマトグラムである。したがって、代謝産物およびそのエピマーの可能な構造は、本明細書においてすでに開示されている、Ｉ、ＩＩエピマー、ＩＩＩ、およびＩＶエピマーから選択される少なくとも１つの化合物を包含する。
【００９０】
一実施態様において、本明細書において開示されている化合物は、薬剤耐性菌に対する治療薬として用いることができ、他の抗生物質が効かない場合に効くことが証明されている。例えば、これはメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ペニシリン耐性ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、バンコマイシン耐性腸球菌（Ｄ．Ｊ． Ｂｅｉｄｅｎｂａｃｈら、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ４０：１７３−１７７（２００１）；Ｈ．Ｗ． Ｂｏｕｃｈｅｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４４：２２２５−２２２９ （２０００）；Ｐ．Ａ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｎｅｗｓｌｅｔｔ． ２６：１６３−１６８ （２００４）； Ｄ． Ｍｉｌａｔｏｖｉｃら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４７：４００−４０４ （２００３）； Ｒ． Ｐａｔｅｌら、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ３８：１７７−１７９ （２０００）； Ｐ．Ｊ． Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４６：２５９５−２６０１ （２００２）；およびＰ．Ｊ． Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４３：７３８−７４４（１９９９）、およびテトラサイクリン耐性の２つの主な形態：排出およびリボソーム保護のいずれかを有する生物（Ｃ． Ｂｅｔｒｉｕら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８：３２３−３２５ （２００４）； Ｔ． Ｈｉｒａｔａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８：２１７９−２１８４ （２００４）；およびＰ．Ｊ． Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ． ａｌ．， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４３：７３８−７４４（１９９９）に対して耐性であり得る。
【００９１】
一実施態様において、本明細書において開示される化合物は、多くの細菌感染症、例えば、合併症を伴う腹腔内感染症（ｃＩＡＩ）、複合皮膚および皮膚組織感染症（ｃＳＳＳＩ）、市中肺炎（ＣＡＰ）、ならびに院内感染性肺炎（ＨＡＰ）適応症（グラム陰性およびグラム陽性病原体、嫌気性菌、およびスタフィロコッカス・アウレウスのメチシリン感受性およびメチシリン耐性株（ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ）の両方により引き起こされ得るもの）の治療において用いることができる。さらに、本明細書において開示される化合物は、温血動物において、ＴｅｔＭおよびＴｅｔＫ耐性決定因子を有する細菌により引き起こされる感染症を治療または抑制するために用いることができる。さらに、本明細書において開示される化合物は、骨および関節感染症、カテーテル関連好中球減少症、産科および産婦人科感染症を治療するために、あるいは他の耐性病原体、例えば、ＶＲＥ、ＥＳＢＬ、腸、急速発育性マイコバクテリアなどを治療するために用いることができる。
【００９２】
したがって、本明細書にいて開示されているのは、少なくとも１つの細菌感染症を治療する方法であって、これを必要とする対象に、治療上有効な量の少なくとも１つの本発明において開示された化合物およびその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物を投与することを含む方法である。
【００９３】
一実施態様において、本発明において開示された化合物は、例えば、チゲサイクリンと比較して、吐き気を軽減し得る。
【００９４】
本明細書において用いられる「医薬組成物」とは、薬効のある組成物を意味する。医薬組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容される担体を含有することができる。
【００９５】
本明細書において用いられる「医薬的に許容される賦形剤」とは、特定の投与様式に好適であることが当業者に公知の任意の担体を含む、本発明において提供される化合物の投与に適した医薬担体またはビヒクルを意味する。例えば、非経口、皮内、皮下、局所適用に用いられる溶液または懸濁液は、無菌希釈剤（例えば、注射用水、塩溶液、不揮発性油など）；天然に存在する植物性油（例えば、ゴマ油、ココナツ油、ピーナッツ油、綿実油など）；合成脂肪族ビヒクル（例えば、オレイン酸エチル，ポリエチレングリコール、グリセリン，プロピレングリコールなど、例えば、合成溶媒を包含する）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベンなど）；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、重亜硫酸ナトリウム、など）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）など）；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩など）；および／または張性を調節するための試薬（例えば、塩化ナトリウム、デキストロースなど）；あるいはその混合物を含むことができる。さらなる例として、静脈内投与される場合、適当な担体としては、生理食塩水、リン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤および可溶化剤、例えば、グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどを含有する溶液、およびその混合物が挙げられる。
【００９６】
非制限的例として、本明細書において開示された化合物を任意に１以上の医薬的に許容される賦形剤として組み合わせることができ、錠剤、カプセル、分散性粉末、顆粒剤、または例えば約０．０５〜５％の懸濁化剤を含有する懸濁剤、例えば約１０〜５０％の糖を含有するシロップ、ならびに例えば約２０〜５０％のエタノールを含有するエリキシルなどの形態で経口的に、あるいは約０．０５〜５％の懸濁化剤を等張媒体中に含有する無菌注射溶液または懸濁液の形態で非経口的に投与することができる。このような医薬製剤は、例えば、約２５〜約９０％の活性成分を担体と、さらに一般的には約５重量％から約６０重量％で組み合わせて含有することができる。他の処方は、米国特許第５，４９４，９０３号および第５，５２９，９９０号においてさらに検討されており、この特許は本発明の一部として参照される。
【００９７】
「医薬的に許容される塩」なる用語は、本開示の化合物の酸付加塩または塩基付加塩を意味する。医薬的に許容される塩は、親化合物の活性を保持し、これが投与される対象に対して、またこれが投与されるという状況で有害または望ましくない影響を及ぼさない任意の塩である。医薬的に許容される塩としては、無機および有機酸両方の金属錯体および塩が挙げられる。医薬的に許容される塩としては、金属塩、例えば、アルミニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、マンガンおよび錯塩が挙げられる。医薬的に許容される塩としては、酸塩、例えば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アキセチル、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、酪酸塩、エデト酸カルシウム、カムシル酸塩、炭酸塩、クロロ安息香酸塩、シレキセチル、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩、エシル、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキサミン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムコ酸塩、ムコン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ｐ−ニトロメタンスルホン酸塩、パモン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、フタル酸塩、ポリガラクトウロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルファミン酸塩、スルファニリン酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクリン酸塩、トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。医薬的に許容される塩は、例えばシステインを包含するが、これに限定されないアミノ酸から誘導される。他の許容される塩は、例えば、Ｓｔａｈｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、ａｎｄ Ｕｓｅ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ； １ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｊｕｎｅ １５、２００２）において見出すことができる。
【００９８】
一実施態様において、「治療上有効な量」とは、患者において症状の予防または緩和、あるいは所望の生物学的結果、例えば、改善された臨床的兆候、疾患の開始の遅延、リンパ球および／または抗体のレベルの低下／上昇などをもたらす化合物の量を意味する。有効な量は、本明細書において記載されているようにして決定できる。選択された投与レベルは、特定の化合物の活性、投与経路、治療される状態の重さ、および治療される患者の状態および以前の病歴に依存するであろう。しかしながら、所望の治療効果を達成し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させるために必要であるよりも少ないレベルで化合物の投与を開始することは当業者の技術範囲内である。一実施態様において、検定から得られるデータをヒトにおいて用いられる投与量範囲の処方において用いることができる。
【００９９】
比較例１
［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性を、３７℃で２４時間までインキュベートされた対象において調べた。スパイクされた対照血清の抽出物中の［１４Ｃ］チゲサイクリンと関連する放射能（％）は２４時間にわたって約９％、０時で９０％から２４時で８１％まで減少した（図２２）。０時でのエピマーのパーセントは７％であり、２４時間まで一定のままであった。テトラサイクリンについて報告されているように（Ｒｅｍｍｅｒｓ ＥＧ、Ｓｉｅｇｅｒ ＧＭ、Ｄｏｅｒｓｃｈｕｋ ＡＰ． Ｓｏｍｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ．４ ｅｐｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ． １９６３；５２；７５２−７５６； Ｎｅｌｉｓ Ｈ、ＤｅＬｅｅｎｈｅｅｒ Ａ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ． １９８２；１０：１４２−１４６）、チゲサイクリンのエピマーはエピマー化の生成物であり、代謝産物とは見なされなかった。他の生成物の量は、約８％、０時で３％から２４時で１１％まで増大した。他の生成物に含まれるのは、保持時間が約４分の、初期に溶出するクロマトグラフィーピーク（Ｍ３ａ、ｔ−ブチルアミノ酢酸）であった。このピークは、従来、ラットおよびイヌ血漿および尿において観察された。スパイクされた対照から得られる放射能の回収は０から２４時間までの試験サンプルについて完了した。
【０１００】
比較例２
尿において、［１４Ｃ］チゲサイクリンは３７℃でインキュベートされた場合、血清中よりも安定性が低かった（図６）。スパイクされた対照尿中の［１４Ｃ］チゲサイクリンのパーセントは１８％、０時の９２％から２４時の７４％まで減少した。エピマーは１６％、０時の放射能７％から２４時の２３％まで増大した。他の副次的な生成物は、０時で１％から２４時で３％まで増大した。
【０１０１】
実験サンプルについて用いられる抽出法の間、［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性を対照血清および大便ホモジネートにおいて調べた。血清サンプル中、［１４Ｃ］チゲサイクリンはサンプルのスパイキングおよび抽出前の放射能の９４％を占めた。抽出プロセス後、［１４Ｃ］チゲサイクリンの量は、放射能の２４％から７０％まで減少した。対応して、他の放射活性成分、主にチゲサイクリンのエピマーが増大し、これは抽出前の４％から抽出後の２２％まで増大した。Ｍ３ａを包含する他の副次的な生成物は、抽出前の２％から抽出後の８％まで増大した。
【０１０２】
比較例３
［１４Ｃ］チゲサイクリンを対照大便ホモジネートから抽出した後に、同様の結果が観察された。これらのサンプルにおいて、［１４Ｃ］チゲサイクリンは抽出前の放射能の９４％、抽出後の放射能の６８％を占めた。対応してチゲサイクリンのエピマーが増大し、抽出前の放射能の４％、抽出後の放射能の２３％に相当した。Ｍ３ａの量も抽出の間に４％（１％から５％まで）増大した。他の副次的な生成物は抽出前の放射能の１％、抽出後の放射能の４％に相当した。
【０１０３】
実施例
実施例１
非盲検、入院患者、繰り返し投与チゲサイクリン、単回投与［１４Ｃ］チゲサイクリン代謝動態および質量バランス研究を、６人の健康な男性ボランティアにおいて行った。臨床プロトコルは１２人の患者を必要とした。これらの１２人のうち、６人（対象１、４、５、６、７、および８、対象８は後に研究から脱落）が放射性投与を受けた。試験対象者基準／除外基準、病歴、健康診断およびさらなる研究プロトコルにおいて概要を説明された追加の手順に基づいて、適格対象が選択された。各対象は、１００ｍｇの負荷量を第１日の朝に投与され、続いて１２時間おきにさらに５回、５０ｍｇの維持量を投与された。研究の第４日の朝、６人の対象は、５０ｍｇの［１４Ｃ］チゲサイクリン（５０μＣｉ）を１回投与された。各チゲサイクリン用量は、３０分の静脈内注入により投与された。６人の健康な男性ボランティアは［１４Ｃ］標識チゲサイクリンを、平均用量４５．９±０．９μＣｉ（４４．３〜４７．０ μＣｉの範囲）で投与された。［１４Ｃ］チゲサイクリンの放射化学的純度は、投与時で９８．６％と報告され、放射能の０．４％はチゲサイクリンエピマーと特定され、比活性度は１．００μＣｉ／ｍｇであった。
【０１０４】
チゲサイクリン投与前、および［１４Ｃ］標識投薬後１、４、８、２４および４８時間に、代謝産物プロファイリングのために血清サンプルを集めた。代謝産物プロファイリングのために、尿サンプルを０〜４、４〜８、８〜２４および２４〜４８時間で集め、大便サンプルを［１４Ｃ］標識投薬後最高４８時間まで集めた。血清および尿サンプル、ならびに大便ホモジネートをドライアイス上で、Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｗｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ， ＰＡまで輸送した。サンプル収集およびサンプル貯蔵の詳細は、研究の質量バランスの部分に記載されている。対象＃６の２４〜４８時間の尿および大便サンプルは、対象が研究から脱退したので不完全であった。この対象から得たサンプルを代謝産物プロファイリングに使用したが、このサンプルは質量バランス計算には含まれなかった。
【０１０５】
研究の臨床部分において用いられる非標識および［１４Ｃ］標識チゲサイクリン、ならびに用量の調製およびこれらのバッチの分析の詳細は、研究の質量バランスバッチにおいて記載されている。対象に投与された［１４Ｃ］チゲサイクリン（処方番号０９３１８５４Ｊ、ロット番号７９８１７０３）は１．００μＣｉ／ｍｇ（５０μＣｉ／５０ ｍｇ用量）の比活性度を有していた。血清、尿および大便ホモジネート中の［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性を評価するために使用される［１４Ｃ］チゲサイクリンのさらなるバッチ（バッチＣＦＱ１３３８９、９５．３μＣｉμＣｉ／ｍｇ、９７．２％放射化学的純度）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ（英国）から入手した。チゲサイクリン標準品（バッチＲＳ ７３８−４、純度９８．４％）、９−アミノミノサイクリン標準品（ＣＬ−３１８６１４、バッチ１４８００Ｂ−８９Ａ）およびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（ＷＡＹ−１８８７４９、バッチＬ２３５６６−１６２）をＷｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ， ＮＹから入手した。［１４Ｃ］チゲサイクリンの構造を、放射標識の部位を特定（＊）して以下に示す。
【化６】
【０１０６】
アセトン、アセトニトリル、氷酢酸およびメタノールをＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， ＮＪ）から入手した。エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）およびトリフルオロ酢酸をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から入手した。酢酸アンモニウムをＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ （Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）から入手した。すべての試薬を分析グレードまたはそれ以上であった。
【０１０７】
１００ｍｇの単回用量としてチゲサイクリンを静脈内投与し、続いて５回、５０ｍｇ、そして1回、５０ｍｇの［１４Ｃ］チゲサイクリンを投与することは、一般に安全かつ十分に許容された。もっとも頻繁に（＞１０％）報告される副作用は、吐き気（７５％）、嘔吐（５０％）、消化不良（１７％）、および注射部位の炎症（１７％）であった。
【０１０８】
実施例２
抽出効率を計算するための放射能測定は、Ｕｌｔｉｍａ ＧｏｌｄＴＭシンチレーション流体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）およびＵｌｔｉｍａ ＧｏｌｄＴＭ標準曲線を用いたＴｒｉ−Ｃａｒｂ Ｍｏｄｅｌ ３１００ＴＲ液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ， ＭＡ）を用いて行った。既知の放射能を有する外部標準を使用することにより、カウント／分（ＣＰＭ）を分解／分（ＤＰＭ）に変換した。各標準のクエンチは、外部放射活性標準の変換されたスペクトル指数（ｔＳＩＥ）により決定した。ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ放射計マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、９６深穴Ｌｕｍａプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中に集められたＨＰＬＣフラクションを分析した。
実施例３
【０１０９】
［１４Ｃ］標識チゲサイクリン投与後１、４および８時間で集められた個々の血清サンプルを代謝産物プロファイルについて分析した。放射能の濃度が低すぎたので（０〜１８ ｎｇ当量／ｍＬの範囲）、２４および４８時間サンプルは分析しなかった。サンプル体積を最小にするために、各血清サンプルを等しい体積（それぞれ約９ｍｌ）の２サンプルに分け、抽出し、別々に分析した。ＥＤＴＡ（１ｍＬのサンプルあたり０．５ Ｍ ＥＤＴＡを８０μＬ）を各サンプルに添加し、サンプルを撹拌混合した。３体積のアセトンを各サンプルに添加し、サンプルを次に１分間、マルチチューブボルテックスミキサーを用いて混合した。サンプルを２５００ｒｐｍ、４℃でＳｏｒｖａｌｌ Ｓｕｐｅｒ Ｔ２１遠心分離機（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗｔｏｗｎ， ＭＡ）中で１５分間遠心分離した。２０μL氷酢酸を含有する新しい試験管に上清を移した。ペレットを２ｍＬ水、１６０μＬの０．２Ｍ ＥＤＴＡおよび６ｍＬのアセトンで２回再抽出し、前記のように処理した。各サンプルから得られた上清を合し、Ｔｕｒｂｏｖａｐ Ｍｏｄｅｌ ＬＶエバポレーター（Ｚｙｍａｒｋ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を用いて窒素流下で蒸発乾固させた。残留物を３００μＬのアセトニトリル／水（１：９）で再構成し、１０分間１４０００ｒｐｍ、室温でＭｏｄｅｌ ５４１５Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ）を用いて遠心分離し、放射能について、ＨＰＬＣにより分析した。選択されたサンプルはまたＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１１０】
［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性は、［１４Ｃ］チゲサイクリン（３μｇ／ｍＬ）でスパイクされ、３７℃でインキュベートされた対照ヒト血清において決定された。この濃度は本研究において報告されているＣｍａｘ値に近かったので、この濃度を用いた。アリコート（５００μＬ）を０、１、４、８および２４時間で取り出し、新しいバイアル中に入れた。ＥＤＴＡ（０．５Ｍを４０μＬ）を添加し、サンプルを１４０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機、Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ）。上清をＨＰＬＣバイアルに移し、放射能フロー検出を用いたＨＰＬＣにより分析した。
【０１１１】
追加の血清サンプルを前記のようにして調製し、抽出した。これは、もしあるならば、抽出プロセスが［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性に及ぼす影響を測定するために行われた。実施例６において記載されるように、放射能フロー検出を用いたＨＰＬＣによりこれらのサンプルを分析した。
【０１１２】
実施例４
以前に開発され、ラットおよびイヌ尿サンプルについて使用された方法を用いて、代謝産物プロファイリング用尿サンプルを以下で論議するように抽出した。様々な間隔で［１４Ｃ］チゲサイクリンの投与後最高４８時間まで集められた尿サンプルを抽出前に氷上で解凍した。個々の尿サンプルのアリコート（１ ｍＬ）を清浄な試験管に移し、０．２ Ｍ ＥＤＴＡ（最終濃度、４０ ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加した。ｐＨはｐＨ４．５〜５．５で一定であった。サンプルを混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣラジオクロマトグラフィーにより代謝産物について分析し、選択されたサンプルもＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１１３】
対照＃８から得られた追加の尿を用いて代謝産物Ｍ３ａを単離した。前述と同じ方法を用いてこの尿サンプルを処理した。ＨＰＬＣ法を用い、サンプル注入後２から５．５分までＨＰＬＣフローを集めてＭ３ａピークを単離した。Ｔｕｒｂｏｖａｐ Ｍｏｄｅｌ ＬＶを用いて、プールされたフラクションを窒素流下で濃縮した。サンプルを次いで遠心分離し、ＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１１４】
［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性を、［１４Ｃ］チゲサイクリン（５μｇ／ｍＬ）でスパイクされ、３７℃でインキュベートされた対照ヒト尿において決定した。本研究の尿中の［１４Ｃ］チゲサイクリン濃度の範囲内であったので、この濃度を使用した。アリコート（５００μＬ）を０、１、４、８および２４時間で取り出し、新しいバイアル中に入れた。これらの尿サンプルを比較例２において血清について記載したようにして処理し、分析した。
【０１１５】
実施例５
８０００ｄｐｍ／ｇより多く含有していた、［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後４８時間まで集められた各大便サンプルから調製された個々の大便サンプルホモジネートを代謝産物プロファイルについて分析した。大便サンプルホモジネートの調製は、研究の質量バランスの部分において詳細に記載されている。簡単に説明すると、大便サンプルをＡＢＣ実験室（Ｃｏｌｕｍｂｉａ， ＭＯ）にて、３〜４体積の氷冷された水中で重量によって均質化し、凍結してＢｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｗｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ， ＰＡに輸送した。放射能の抽出のために、大便ホモジネートを氷上で解凍し、アリコート（約１ｇ）を１５ｍＬ試験管に移した。３体積のアセトンを添加し、マルチチューブボルテックスミキサーを用いてサンプルを１分間混合した。サンプルをＳｏｒｖａｌｌ Ｓｕｐｅｒ Ｔ２１遠心分離機中、１５分間２５００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。上清を新しい試験管に移し、ペレットを１ｍＬの水および８０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡで再懸濁させ、前記のようにして再抽出した。ペレットをこのようにして合計３回再抽出し、上清をプールした。Ｔｕｒｂｏｖａｐ Ｍｏｄｅｌ ＬＶを用いて、上清を窒素流下、蒸発乾固させた。残留物を５００μＬの水中に再懸濁させ、Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機を用いて１０分間１４０００ｒｐｍ、室温で遠心分離した。上清をＨＰＬＣバイアルに移し、放射能検出を伴うＨＰＬＣを用いて放射能および代謝産物プロファイルについて分析した。選択されたサンプルをさらにＬＤ／ＭＳにより分析した。
【０１１６】
抽出プロセスの間の［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性を［１４Ｃ］チゲサイクリン（５μｇ／ｇホモジネート）でスパイクされた対照ヒト大便ホモジネートにおいて決定した。この濃度は本研究から得られた大便ホモジネート中の［１４Ｃ］チゲサイクリン濃度の範囲内であったので、この濃度を使用した。サンプルを抽出し、放射能フロー検出を用いたＨＰＬＣにより分析した。
【０１１７】
実施例６
Ｗａｔｅｒｓ ２６９５ Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ）、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｏｄｅｌ ２４８７二波長ＵＶ吸収検出器（３５０ｎｍをモニターするために設定され、２０秒間隔でフラクションを集めるために装備されたＧｉｌｓｏｎ２１５液体ハンドラー（Ｇｉｌｓｏｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ， ＷＩ）と直列）を用いてＨＰＬＣ分析を行った。フラクションを９６深穴Ｌｕｍａプレート中に集め、ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴを用いて分析した。オートサンプラー温度を４℃に設定した。２つの移動相ＡおよびＢの直線的勾配を使用したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄＴＭガードカートリッジ（５μｍ）を備えたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム（１５０ ｘ ２．０ ｍｍ、５μｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ， ＣＡ）上でチゲサイクリンおよび薬剤誘導生成物の分離を行った。カラムは約２０℃の周囲温度であった。移動相Ａは水中１０ ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。移動相の流量は０．２ ｍＬ／分であり、以下に示すように供給された。
【表７】
【０１１８】
実施例７〜９
液体クロマトグラフィー／質量分析
質量分析に用いられたＨＰＬＣシステムは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｍｏｄｅｌ ２６９５ ＨＰＬＣシステムであった。これは、内蔵式オートサンプラーおよびＭｏｄｅｌ ９９６ダイオードアレイＵＶ検出器を装備していた。この研究において、ＬＣ／ＭＳ分析の間、３つのＨＰＬＣ条件を使用した。ＬＣ／ＭＳ条件１を代謝産物特性化のための大部分のサンプル分析および尿から代謝産物Ｍ３ａを単離するために使用した。グルクロニド代謝産物の保持時間を増大させ、代謝産物Ｍ８およびＭ９の同一性を確認するための同時クロマトグラフィー実験のために、選択されたサンプルに関してＬＣ／ＭＳ条件２を使用した。ＬＣ／ＭＳ条件３を使用して、ヒト尿から単離された極性代謝産物Ｍ３ａを分析した。
【０１１９】
実施例７
ＬＣ／ＭＳ条件１
３４０〜３６０ｎｍをモニターするためにＵＶ検出器を設定した。Ｕｎｉｇｕａｒｄ Ｃ１８ガードカラム（１０ ｘ ２ ｍｍ）（ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ， ＰＡ）を備えたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム（１５０ ｘ ２．０ ｍｍ、５μｍ）上で代謝産物特性化のための分離を行った。流量は０．２ｍＬ／分であった。ＬＣ／ＭＳサンプル分析の間、代謝産物の評価の前に、２分までの初期流れを質量分析計からそらした。移動相Ａは水中１０ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。直線的移動相勾配を以下に示す。
【表８】
【０１２０】
同様のＨＰＬＣ条件を使用して、代謝産物Ｍ３ａを含有するフラクションを集めた。移動相および直線勾配は同じであった。使用されたカラムはＳｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１８カラム（２５ ｃｍ ｘ １０ ｍｍ、５μｍ；Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）であり、流量は４．７ ｍＬ／分であった。Ｇｉｌｓｏｎフラクションコレクター、Ｍｏｄｅｌ ＦＣ２０４（Ｇｉｌｓｏｎ）を用いてフラクションを集めた。
【０１２１】
実施例８
ＬＣ／ＭＳ条件２
２１０〜４００ｎｍをモニターするためにＵＶ検出器を設定した。Ｕｎｉｇｕａｒｄ Ｃ１８ガードカラム（１０ ｘ ２ ｍｍ）（ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ）を備えたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム（２５０ ｘ ２．０ ｍｍ、５μｍ）上で分離を行った。流量は０．２ ｍＬ／分であった。ＬＣ／ＭＳサンプル分析の間、代謝産物の評価の前に０．５ 分までの初期流れを質量分析計からそらせた。移動相Ａは水中０．０２％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）であり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．０２％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）であった。直線的移動相勾配を以下に示す。
【表９】
【０１２２】
実施例９
ＬＣ／ＭＳ条件３
Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ ＨＩＬＩＣ Ｓｉｌｉｃａカラム（１５０ ｘ ２．１ ｍｍ、５μｍ）上で分離を行った。流量は０．２ ｍＬ／分であった。移動相Ａはアセトニトリル中０．０２％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）であり、移動相Ｂは水中０．０２％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）であった。直線的移動相勾配を以下に示す。
【表１０】
【０１２３】
実施例１０
質量分析
Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｕｌｔｉｍａトリプル四重極質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）を陽イオン化モードで操作した。Ｚ−スプレーインターフェースを用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）でＬＣ／ＭＳ分析を行った。ナノスプレーインターフェース中に直接注入することにより、選択されたサンプルからの個々のフラクションのＥＳＩ−ＭＳ分析を行った。質量分析計の設定を以下に示す。
【表１１】
【０１２４】
尿および大便サンプルをチゲサイクリンに特徴的なプロダクトイオンの前駆体についてのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によりチゲサイクリン代謝産物について分析した。さらに、チゲサイクリンの潜在的代謝産物を、動物およびヒトにおける従来の研究から得られた結果に基づいたＬＣ／ＭＳデータにおいて検索した。
【０１２５】
血清抽出物をチゲサイクリンおよび選択された代謝産物について、内部成分からの干渉を軽減するために選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）モード（ＬＣ／ＳＲＭ）においてＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。これらの実験を、２００ｍｓの滞留時間設定で行った。次のチゲサイクリン関連成分をモニターした。
【表１２】
【０１２６】
Ｆｌｏ−Ｏｎｅ分析ソフトウェア（バージョン ３．６５）を利用して、安定性分析および代謝産物プロファイルのために放射活性ピークを積分した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標） ２０００表計算を用いて平均および標準偏差を計算した。ＬＣ／ＭＳデータ分析に使用されたソフトウェアはＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＭａｓｓＬｙｎｘ（バージョン４．０、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）であった。
【０１２７】
実施例１１
材料
酢酸アンモニウムをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒｌａｗｎ、ＮＪ）から購入した。ＨＰＬＣグレード水および溶媒をＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， ＮＪ）から購入した。
【０１２８】
方法
尿サンプル調製
ＶｉｒＴｉｓ Ｓｅｎｔｒｙ ３５ＸＬ Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ（ＶｉｒＴｉｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ＮＹ）を用いて、チゲサイクリンを投与された対象から得られた尿サンプル（３００ ｍＬ）を凍結乾固させた。残留物を水中に再懸濁させ、容器を水で洗浄した。最終体積は３．５ ｍＬであった。Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ）を用いて、サンプルを１０分間１４０００ｒｐｍ、室温で遠心分離した。次いで、０．２または０．４５μｍ孔サイズのＣｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ Ｘ ＨＰＬＣナイロン製ミクロ遠心フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を用いてサンプルを濾過した。２４００ｒｐｍで作動するＩＥＣ Ｃｅｎｔｒａ Ｍｏｄｅｌ ＧＰ８Ｒ遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ）を用いて、濾過のための遠心分離を行った。得られた粗尿抽出物を前記のようなフラクション収集でＨＰＬＣにより処理した。
半調製的ＨＰＬＣによるチゲサイクリングルクロニドの単離
【０１２９】
チゲサイクリングルクロニドを含有する尿抽出物を４ｍＬのオートランプラーバイアルに移した。代謝産物単離用ＨＰＬＣ装置は、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ ４０００ ＨＰＬＣ システム、Ｗａｔｅｒｓ ２７６７ Ｓａｍｐｌｅ Ｍａｎａｇｅｒ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｌｕｍｎ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ ＯｒｇａｎｉｚｅｒおよびＷａｔｅｒｓ ９９６ダイオードアレイＵＶ検出器（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を含んでいた。分離は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１８カラム（２００ ｘ １０ｍｍ、５ μｍ）（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）を用いて行われた。２１０および４５０ｎｍをモニターするためにＵＶ検出器を設定した。移動相Ａは水中１０ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。直線的移動相は表１２に記載されているように供給された。
【表１３】
【０１３０】
フラクション収集のためのＨＰＬＣ装置をＦｒａｃｔｉｏｎＬｙｎｘ ｍｏｄｕｌｅのＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（バージョン４．０、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ）により制御した。ＦｒａｃｔｉｏｎＬｙｎｘを用いて、代謝産物フラクションの収集は３５０ｎｍでのＵＶ吸収のモニタリングに基づいた。フラクション収集後、選択されたフラクションのアリコートを以下に記載するようにしてＭＳにより分析して、チゲサイクリングルクロニドの存在を確認した。チゲサイクリングルクロニドを含有するフラクションを次いで前述のように凍結乾固させ、再構成し、ＬＣ／ＭＳにより分析して、チゲサイクリングルクロニドが単離されたことを確認した。
【０１３１】
液体クロマトグラフィー／質量分析
チゲサイクリン代謝産物分析に用いられるＨＰＬＣシステムは、バイナリーポンプおよびダイオードアレイＵＶ検出器を含むＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｏｄｅｌ １１００ ＨＰＬＣシステムを含んでいた。ＨＰＬＣ分離条件は、流量が０．２ｍＬ／分であり、ＨＰＬＣカラムの内径が２．１ｍｍである以外は、代謝産物単離のためのフラクション収集について前述の通りであった。凍結乾燥前の代謝産物フラクションの分析は、ＨＰＬＣカラムを使用せず、フラクションのアリコートを質量分析計に直接注入することにより行われた。
【０１３２】
代謝産物特性化に用いられた質量分析計は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）であった。これは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースを備え、陽イオン化モードで操作された。ＬＣ／ＭＳデータをＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（バージョン１．３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）で分析した。
【０１３３】
チゲサイクリングルクロニド質量スペクトル
ヒト尿のＨＰＬＣフラグメンテーションにより集められたチゲサイクリングルクロニド。チゲサイクリングルクロニドの［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ ７６２で観察され、これはチゲサイクリンよりも１７６Ｄａ大きかった。チゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを図２３Ａおよび２３Ｂに示す。１７６Ｄａのニュートラルロスは、ｍ／ｚ ５８６、さらにはチゲサイクリンの［Ｍ＋Ｈ］＋を生成し、これはチゲサイクリンのグルクロニドを示していた。凍結乾燥および再構成後のチゲサイクリングルクロニドフラクションのＬＣ／ＭＳ分析は図２４Ａ〜２４Ｄに示されるＭＳおよびＭＳｎスペクトルをもたらした。これらの質量スペクトルデータもチゲサイクリングルクロニドを示すものであった。
【０１３４】
この実施例は、ＩＶ量のチゲサイクリンを投与されたヒト対象の尿からチゲサイクリングルクロニドを単離できることを示す。
【０１３５】
実施例１２
この実施例は、２つのチゲサイクリン代謝経路、親化合物のグルクロニド化および９−アミノミノサイクリンのＮ−アセチル化が、チゲサイクリンを１回静脈内投与した後のマウスおよびウサギにおいて存在する可能性を調査した。各種から得た血清サンプルを集め、ＬＣ／ＭＳにより分析して、これらの代謝物の存在または不在を確認し、可能ならば、その濃度を評価した。マウスからの尿サンプルも集めて、チゲサイクリン代謝産物の存在を調べた。
【０１３６】
材料
マウスおよびウサギの静脈内投与用溶液を調製するために使用されたチゲサイクリン（ロットＡ９６５５９、純度１００％）、チゲサイクリン標準品（バッチＲＳ ７３８−４、純度９８．４％）、重水素化（ｔ−ブチル−ｄ９）チゲサイクリン（ＷＦＱ０１５９；内部標準として使用）、９−アミノミノサイクリン標準品およびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリンはＷｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ， ＮＹから入手した。
【０１３７】
対照ウサギおよびマウス血清をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）から入手した。アセトニトリルおよびメタノールをＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， ＮＪ）から入手した。エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から入手した。酢酸アンモニウムをＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）から入手した。すべての試薬は分析グレードまたはそれ以上であった。
【０１３８】
マウスおよびウサギ研究デザイン
動物
１５匹のオスＣＤ−１マウス（投与時の平均体重３１．３ｇ）を使用した。動物に食物および水を自由に与えた。０．５および２時間血液採取群のマウスを標準的ケージに入れ、一方、４時間血液採取群の動物は尿を収集するための代謝ケージ中に入れた。Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ａｔ Ｗｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ、ＰＡによりマウスに投薬した。
【０１３９】
３匹のメスニュージーランドホワイトウサギ（投与時の体重３．９ｋｇから４．３ｋｇの間）を使用した。動物に食物および水を自由に与えた。動物を個々に標準的ケージに入れた。Ｗｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｈａｚｙ、ＮＹによりウサギに投薬し、サンプルをＷｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ、ＰＡに凍結輸送した。
【０１４０】
投薬
マウスおよびウサギについて、５０ｍｇのチゲサイクリンを５．０ｍＬの０．９％無菌塩溶液中に溶解させて希釈標準ストック溶液を調製することにより、静脈内投与用溶液を調製した。希釈標準ストック溶液を０．９％無菌溶液でマウスについては０．５ｍｇ／ｍＬ、ウサギについては４ｍｇ／ｍＬまで希釈した。マウス用量（５ ｍｇ／ｋｇ、１０ ｍＬ／ｋｇ）を尾静脈からボーラス注入法により投与した。ウサギ用量（４ ｍｇ／ｋｇ、１ ｍＬ／ｋｇ）をボーラス注入法により耳周辺静脈から投与した。
【０１４１】
サンプル収集
マウス（ｎ＝５／時点）について、チゲサイクリン投与後０．５、２および４時間で心臓穿刺により血液（約０．７ ｍＬ）を集めた。ウサギについて、チゲサイクリン投与後０．５、２および６時間で耳静脈から血液（約７ ｍＬ）を集めた。血餅形成後、血清を室温で分離し、１５分間、４℃、３０００ｒｐｍで遠心分離した。血清を新しい試験管に移し、「ＬＣ／ＭＳ分析用血清サンプル調製」の項目で以下に記載するように、分析まで約−７０℃で保存した。加えて、尿を４時間血液採取群のマウスから集め、「ＬＣ／ＭＳ分析用尿サンプル調製」の項目で以下に記載するように、分析まで約−７０℃で保存した。
【０１４２】
Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリンＭ９の純度の評価
この研究において使用されたＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン、Ｍ９の純度を、「液体クロマトグラフィー／質量分析」の項目で以下に記載するように、ＵＶ検出を備えたＨＰＬＣにより評価した。１００ｎｇ／μＬサンプル中のＭ９関連成分の全ＵＶクロマトグラフィーピーク面積のパーセンテージとしてのＵＶクロマトグラフィーピーク面積に基づいて、Ｍ９純度を測定した。Ｍ９および他の関連する成分は同じＵＶモル吸収率を有し、他のＭ９関連物質は存在しないと仮定された。３７．６分ピークよりも少ない相対量（合計２．８％）で存在する個々の成分を微量成分と見なし、純度の概算に含めなかった。合成物質において、Ｍ９およびそのエピマーのみがＬＣ／ＭＳにより特性化され；他の分解物は特性化されなかった。各標準曲線サンプル中のＭ９の実際の濃度を、この方法により得られたＭ９純度の概算に基づいて調節した。
【０１４３】
ＬＣ／ＭＳ分析用尿サンプル調製
マウス尿を解凍し、アリコート（１ ｍＬ）を新しい試験管に移した。Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ）を用いて、サンプルを１４０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離して、粒子状物質を除去した。サンプルを次いで新しい試験管に移し、「液体クロマトグラフィー／質量分析」の項目において以下に記載するようにして、ＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１４４】
ＬＣ／ＭＳ用血清サンプル調製。
マウスおよびウサギ血清サンプルを各収集時間にプールし、チゲサイクリン、そのエピマー、チゲサイクリングルクロニド（Ｍ７およびそのエピマーＭ６）、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）およびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９およびそのエピマーＭ８）について分析した。血清のアリコート（５００μＬ）を新しい試験管に移し、重水素化チゲサイクリン（３０ ｎｇ／ｍＬ最終濃度）を内部標準（定量分析のみ）として添加した。ＥＤＴＡ（０．５ Ｍ ＥＤＴＡを４０μＬ）を各サンプルに添加し、サンプルを撹拌混合した。アセトニトリル（５００μＬ）を各サンプルに添加し、サンプルを撹拌混合し、Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて１４０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離することにより、変性タンパク質を分離した。上清を新しい試験管に移し、Ｔｕｒｂｏｖａｐ Ｍｏｄｅｌ ＬＶエバポレーター（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を用いて、溶媒を窒素流下で蒸発させた。「液体クロマトグラフィー／質量分析」の項目において以下に記載するように残存する水溶液をＬＣ／ＭＳにより分析した。幾つかのウサギ血清サンプルを対照ウサギ血清で５倍または５０倍に希釈して、検体反応が標準曲線の範囲内にあることを保証した。
【０１４５】
チゲサイクリン、Ｍ３およびＭ９の標準曲線をウサギ血清において作成した。内部標準および合成チゲサイクリンおよび代謝産物標準を対照血漿に添加することにより標準曲線を作成した。０、１０、２０、５０、１００、２００、５００および１０００ｎｇ／ｍＬのチゲサイクリン濃度、直線範囲が５〜２００ｎｇ／ｍＬで、標準曲線サンプルを調製した。９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）について、濃度は０、１、５、１０、２０、５０、１００および２００ｎｇ／ｍＬであり、直線範囲は１０〜２００ｎｇ／ｍＬであった。Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）について、濃度は、１．６、３．２、６．４、１６、３２、６４および９６ｎｇ／ｍＬであり、直線範囲は３．２〜９６ｎｇ／ｍＬであった。これらのサンプルを前記のように処理し、分析した。
【０１４６】
Ｍ７（チゲサイクリングルクロニド）を含有するヒト尿サンプルのアリコートをプールされた２時間ウサギ血清抽出物に添加して、ウサギにおいて観察されるグルクロニドがヒトにおいて観察されるものと同じかどうかを確認した。このサンプルを「液体クロマトグラフィー／質量分析」の項目において以下に記載するようにしてＬＣ／ＭＳにより分析した。
【０１４７】
液体クロマトグラフィー／質量分析
質量分析に使用したＨＰＬＣシステムは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｍｏｄｅｌ ２６９５ ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）であった。これは内蔵式オートサンプラーおよびＭｏｄｅｌ ９９６ダイオードアレイＵＶ検出器を備えていた。２１０〜４００ｎｍをモニターするためにＵＶ検出器を設定した。Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｕｎｉｇｕａｒｄ Ｃ１８ガードカラム（１０ ｘ ２．１ ｍｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）を備えたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム（１５０ ｘ ２．１ ｍｍ、５μｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）上で代謝産物特性化のための分離を行った。カラム温度は２５℃であった。流量は０．２ ｍＬ／分であった。移動相Ａは水中１０ ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。２つの直線的移動相勾配を使用し、表２．２．５−１および２．２．５−２に示した。勾配１は代謝産物同定（定量分析）のために使用した。勾配２は、ウサギ血清サンプルの半定量分析のために使用した。ＬＣ／ＭＳサンプル分析の間、１０分までの初期流れを代謝産物の評価前に質量分析計からそらせた。勾配１および勾配２のＬＣ／ＭＳ ＨＰＬＣデータを表１３および１４に示す。
【表１４】
【表１５】
【０１４８】
使用された質量分析器はＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｕｌｔｉｍａトリプル四重極質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）であった。これは、エレクトロスプレーインターフェースを備え、陽イオン化モードで操作された。質量分析計の設定を表１５に示す。
【表１６】
【０１４９】
選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）モードにおけるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析（ＬＣ／ＳＲＭ）も血清抽出物に関して行って、チゲサイクリン代謝産物のサンプルをスクリーンし、チゲサイクリン代謝産物の推定濃度を得た。これらの実験は、２００ｍｓの滞留時間設定で行った。ＳＲＭ分析条件を表１６にまとめる。内部標準は使用しないか、または定量化分析のためにモニターしなかった。
【表１７】
【０１５０】
データ分析および計算
Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＭａｓｓＬｙｎｘ（バージョン４．０、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）をＬＣ／ＭＳデータの分析に使用した。チゲサイクリン、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）およびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）の血清中の濃度をウサギ血清において作成された標準曲線と比較して、サンプルにおける検体対内部標準ピーク面積比に基づいて計算した。
【０１５１】
Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）合成標準の純度
合成Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）のＨＰＬＣ分析から得られたＵＶクロマトグラムを図２５に示す。Ｍ９およびその分解物のＵＶクロマトグラムピーク面積を表１７に示す。
【表１８】
【０１５２】
Ｍ９エピマーは最も豊富な化合物関連成分であり、合成Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリンの約５１％を占めていた。Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリンの推定純度は３２％であった。
マウス血清および尿ならびにウサギ血清における代謝産物
【０１５３】
マウス血清において、チゲサイクリン、チゲサイクリンのエピマー、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）およびチゲサイクリングルクロニド（Ｍ７およびそのエピマーＭ６）がＬＣ／ＭＳ分析により観察された。これらの成分のマウス血清中の濃度は調べなかった。マウス血清においてはＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリンは観察されなかった。同じチゲサイクリン関連成分がマウス尿において観察された。
【０１５４】
ウサギ血清において、チゲサイクリン、チゲサイクリンのエピマー、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）、チゲサイクリングルクロニド（Ｍ７およびそのエピマーＭ６）およびＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）がＬＣ／ＭＳ分析により観察された。ヒトにおいて観察されるものと同じであるウサギにおけるチゲサイクリングルクロニドの特性化は、Ｍ７を含有していることが公知のヒト尿を用いて行われた同時クロマトグラフィー実験により立証された（データは省略）。ウサギ血清中のチゲサイクリンの推定濃度は、１時間での２０２０ ｎｇ／ｍＬから２時間での１０４０ ｎｇ／ｍＬそして６時間での２８７ ｎｇ／ｍＬに減少した（表１８）。Ｍ３の濃度も時間とともに減少し、０．５、２および６時間で、それぞれ、５４５、３１２および９０．２ ｎｇ／ｍＬであった。しかしながら、Ｍ９濃度は時間とともに増大し、０．５時間での５．５ ｎｇ／ｍＬから２時間および６時間でのそれぞれ８．１および２０ ｎｇ／ｍＬに増大した。
【表１９】
【０１５５】
液体クロマトグラフィー／質量分析による代謝産物特性化
ＬＣ／ＭＳ分析をＣＤ−１マウスおよびウサギから得られた血清ならびにＣＤ−１マウスから得られた尿の抽出物に対して行った。これらのサンプル中で観察されるチゲサイクリン関連化合物のまとめを表１９に示す。チゲサイクリンおよびその代謝産物の質量スペクトルデータを以下で考察する。
【表２０】
ａ．ＬＣ／ＭＳデータファイルＵＬ＿０６３００５＿０００６およびＵＬ＿０７０１０５＿０００５から得られる保持時間
ｂ．ＴＢＡＡＡ＝ｔ−ブチルアミノアセチルアミノ
Ｍ：マウス； Ｒ：ウサギ； Ｓ：血清； Ｕ：尿
【０１５６】
チゲサイクリン
チゲサイクリンはマウス血清および尿、ならびにウサギ血清において観察された。チゲサイクリン真正標準のスペクトル特性を代謝産物との比較のために調べた。チゲサイクリンのＬＣ／ＭＳスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン［Ｍ＋Ｈ］＋がｍ／ｚ ５８６で観察された。チゲサイクリンのｍ／ｚ ５８６の衝突活性化解離から得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを図２６Ａに示し、提案されたフラグメンテーションスキームを図２６Ｂに示す。提案されたフラグメンテーションスキームは、Ｋａｍｅｌおよび共同研究者により関連するテトラサイクリン構成物質について提案されたスキームと一致していた（Ａ． Ｍ． Ｋａｍｅｌら、エレクトロスプレーイオン化、Ｈ／Ｄ交換、および多段質量分析によるテトラサイクリンの質量スペクトル特性化（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ テトラサイクリンｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｈ／Ｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ、ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｔａｇｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ） Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、１３：５４３５５７、２００２）。ｍ／ｚ ５８６からのＮＨ３の欠失は、ｍ／ｚ ５６９を生成した。ｍ／ｚ ５１３でのプロダクトイオンは、ｔ−ブチルアミノアセチルアミノ（ＴＢＡＡＡ）側鎖からのｔ−ブチルアミノ基の欠失を表す。全ＴＢＡＡＡ側鎖の欠失はｍ／ｚ ４５６を生成した。ｍ／ｚ ２１１および１５４でのプロダクトイオンは、図２６Ｂのフラグメンテーションスキームにおいて示されるようなテトラサイクリン環系のＤ環起源であった。ｍ／ｚ ８６イオンはｔ−ブチルアミノメチレン基を表していた。
【０１５７】
チゲサイクリンエピマー
チゲサイクリンのエピマーは、マウス血清および尿、ならびにウサギ血清において観察され、ｍ／ｚ５８６で［Ｍ＋Ｈ］＋を生成した。図２７Ａおよび２７Ｂにおいて示されるｍ／ｚ ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンは、ｍ／ｚ ５６９、５１３、４５６および８６を含み、これはチゲサイクリンについても存在していた。エピマーとしての同定は、その相対保持時間がチゲサイクリンよりも短いことに基づいて行われた。
【０１５８】
代謝産物Ｍ３
代謝産物Ｍ３はマウス血清および尿、ならびにウサギ血清において観察された。代謝産物Ｍ３の［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ ４７３で観察された。Ｍ３のｍ／ｚ ４７３質量スペクトルのプロダクトイオンを図２８Ａおよび２８Ｂにおいて示す。ｍ／ｚ ４７３質量スペクトルのプロダクトイオンは、それぞれメチル基およびＮＨ３基の欠失から生成するｍ／ｚ ４５８および４５６を含んでいた。ｍ／ｚ １５４でのプロダクトイオンもチゲサイクリンについて観察され、これは未変化Ｄ環を示す。ｍ／ｚ４５８からのＨ２ＯおよびＮＨ３の欠失は、ｍ／ｚ ４２３を生成した。その後の２つのＣＯ分子の欠失はｍ／ｚ ３６７を生成した。ＣＯおよびＣＨ３−Ｎ＝ＣＨ２の両方の欠失は、ｍ／ｚ ３５２を生成した。このフラグメンテーション挙動は、ミノサイクリン関連物質（Ａ． Ｍ． Ｋａｍｅｌら、エレクトロスプレーイオン化、Ｈ／Ｄ交換、および多段質量分析によるテトラサイクリンの質量スペクトル特性化（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ テトラサイクリンｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｈ／Ｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ、ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｔａｇｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ） Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、１３：５４３−５５７、２００２）およびＭ３が９−アミノサイクリンであることと一致していた。Ｍ３のＨＰＬＣ保持時間およびＭＳ／ＭＳスペクトルデータを９−アミノミノサイクリンのものとマッチングすることにより確認した（データは省略）。
【０１５９】
代謝産物Ｍ６およびＭ７
代謝産物Ｍ６およびＭ７はマウス血清および尿、ならびにウサギ血清において観察された。Ｍ６およびＭ７の［Ｍ＋Ｈ］＋はｍ／ｚ ７６２で観察され、これはチゲサイクリンよりも１７６ Ｄａ大きかった。Ｍ６およびＭ７の質量スペクトルデータは類似していた。Ｍ７のｍ／ｚ ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを図２９Ａおよび２９Ｂに示す。１７６ Ｄａのニュートラルロスはｍ／ｚ ５８６を生成し、またチゲサイクリンについて［Ｍ＋Ｈ］＋を生成し、これはチゲサイクリンのグルクロニドを示した。ｍ／ｚ ５６９、５１３、４５６および１５４でのプロダクトイオンもチゲサイクリンについて観察されたが、接合の部位を示さなかった。５５１でのプロダクトイオンは、フラグメンテーションスキームにおいて示されるようにＣ環のフラグメンテーションにより形成され、このことはＡ環またはＣ環のいずれかの上のヒドロキシ基がグルクロン酸化の部位であったことを示す。チゲサイクリンのＡ環と類似したフェノール環を有する三環式化合物であるロソキサントロンを代謝させて、フェノールグルクロニドを得た（Ｒｅｎｎｅｒ ＵＤ、Ｐｉｐｅｒｏｐｏｕｌｏｓ Ｇ、Ｇｅｂｈａｒｄｔ Ｒ、Ｅｈｎｉｎｇｅｒ Ｇ、Ｚｅｌｌｅｒ ＫＰ． Ｔｈｅ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ （ＣＩ−９４１）． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ３０：４６４４７８、２００２）。これは、Ａ環のヒドロキシ基がチゲサイクリンのグルクロン酸化部位である確率が最も高いことを示す。代謝産物Ｍ６はＨＰＬＣ保持時間がＭ７よりも早いことに基づいてＭ７のエピマーであることが提案された。これは、チゲサイクリンよりも早期に溶出するチゲサイクリンエピマーと一致した（前述の「チゲサイクリンエピマー」の項を参照）。ウサギ血清抽出物のヒト尿抽出物との同時クロマトグラフィーは、両サンプルが同じチゲサイクリングルクロニド（Ｍ７）を含有していたことを示す（データは省略）。従って、Ｍ６およびＭ７はそれぞれチゲサイクリンエピマーおよびチゲサイクリンのグルクロニドであることが提案された。
【０１６０】
代謝産物Ｍ９
代謝産物Ｍ９はＬＣ／ＳＲＭ分析によりウサギ血清において観察された。この代謝産物 はマウス血清または尿において観察されなかった。図３０は、ｍ／ｚ ５１５→４９８トレースにおいて示される、Ｍ９を含むウサギ血清におけるチゲサイクリンおよびその代謝産物の個々のＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムを示す。ウサギ血清の複合ＬＣ／ＳＲＭ分析を図３１に示す。
【０１６１】
［１４Ｃ］チゲサイクリンを健康な男性ボランティアに静脈内投与した後、チゲサイクリンは血清中の主な放射標識された成分であった。しかしながら、ヒトにおけるチゲサイクリン代謝の２つの経路、９−アミノミノサイクリンのＮ−アセチル化および親化合物のグルクロン酸化はラットまたはイヌにおいて観察されなかった。この実施例における研究は、チゲサイクリン代謝のこれらの経路がマウスおよび／またはウサギにおいて存在するかどうかを調べた。従来の代謝データおよび本研究から得られたデータに基づいて、マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびヒトにおけるチゲサイクリンの提案された代謝経路を図３２に示す。
【０１６２】
ウサギおよびマウスの両方において、チゲサイクリンのグルクロン酸化が観察された。合成標準を入手できなかったので、存在するグルクロニド代謝産物の量は測定できなかった。チゲサイクリンの投与後に集められたヒト尿を用いた同時クロマトグラフィー実験において、ヒト尿におけるグルクロニドおよびウサギ血清におけるグルクロニドは同じ保持時間を有していたことが示された。マウス血清を用いて同時クロマトグラフィーを行わなかったが、マウス血清中のグルクロニドはウサギおよびヒトにおいて観察されるものと類似した保持時間を有し、Ｍ７であると推定される。
【０１６３】
Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）はウサギ血清において観察されたが、マウス血清においては観察されなかった。Ｍ９のウサギ血清中の推定濃度は５．５ ｎｇ／ｍＬから２０ ｎｇ／ｍＬに、投与後０．５から６時間で増大した。これらの濃度は、チゲサイクリンの繰り返し投与後のヒト血清中のＭ８について従来報告されているもの（３−１５ ｎｇ／ｍＬ）と類似していた。さらに、ウサギ血清において、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）は５４５ｎｇ／ｍＬもの高い濃度で観察された。代謝産物はマウス、ラット、イヌおよびヒトからの血清において観察されるが、これらの種においてはごく微量の代謝産物であった。Ｍ３はウサギにおける主な代謝産物であるようで、チゲサイクリンに対して最高３０％までの濃度である。
【０１６４】
まとめると、マウスおよびウサギにチゲサイクリンを１回静脈内投与し、次いで尿（マウスのみ）および血液を血清の調製のために投与後様々な時点で集めた。オスＣＤ−１マウスに５ｍｇ／ｋｇ投与し、投与後０．５、２および４時間で血液を集め、一方、尿を投与後０〜４時間で集めた。メスニュージーランドホワイトウサギに４ｍｇ／ｋｇのチゲサイクリンを投与し、血液を投与後０．５、２および６時間で集めた。選択されたモニタリングモードにおいてＬＣ／ＭＳにより分析される前の時点および種により血清サンプルをプールした。チゲサイクリン（およびそのエピマー）、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）、チゲサイクリングルクロニド（Ｍ７およびそのエピマー、Ｍ６）ならびにＮ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９およびそのエピマー、Ｍ８）の存在を調べた。非有効ＬＣ／ＭＳ法、合成標準および内部標準を用いてウサギ血清中のＭ３、Ｍ９およびチゲサイクリンの濃度を推定した。
【０１６５】
ウサギ血清において、チゲサイクリン、チゲサイクリンのエピマー、Ｍ３、Ｍ６、Ｍ７ およびＭ９が検出された。チゲサイクリンの０．５、２および６時間血清サンプル中の推定濃度はそれぞれ２０２０、１０４０および２８７ｎｇ／ｍＬであった。Ｍ３の濃度も時間とともに、０．５時間の５４５ｎｇ／ｍＬから６時間の９０．２ｎｇ／ｍＬまで減少した。Ｍ９の濃度は長時間にわたり、０．５時間の５．５ｎｇ／ｍＬから２時間の８．１ｎｇ／ｍＬ、そして6時間の２０ｎｇ／ｍＬまで増加した。Ｍ６およびＭ７の濃度は合成標準がないために測定できなかった。
【０１６６】
マウス血清および尿において、チゲサイクリン、チゲサイクリンのエピマー、Ｍ３、Ｍ６およびＭ７が検出された。これらの化合物のマウス血清および尿中の濃度は測定されなかった。Ｍ９はマウス血清および尿において観察されなかった。
【０１６７】
まとめると、チゲサイクリンをウサギおよびマウスに１回静脈内投与した後、チゲサイクリン、そのエピマー、９−アミノミノサイクリン（Ｍ３）およびチゲサイクリングルクロニド（Ｍ７、およびそのエピマーＭ６）が両種から得られる血清において観察された。加えて、Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）はウサギ血清において観察された。チゲサイクリンのＭ７へのグルクロン酸化およびＭ３のＭ９へのＮ−アセチル化もヒトにおいて観察されたが、ラットまたはイヌにおいては観察されなかった。これらの化合物は前記方法により単離することができる。
【０１６８】
本発明の他の実施態様は、本明細書および本明細書において開示された本発明の実施例を考慮すると当業者には明らかになるであろう。本明細書および実施例は例示のみとして見なされ、本発明の新の範囲および精神は以下の請求の範囲により示されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】ヒトにおいて５０ｍｇ用量の［１４Ｃ］チゲサイクリンを１回静脈内投与した後の尿および大便中の放射能の削減にための平均（ＩＳＤ）である。
【図２】長時間にわたる血清中の平均（ＩＳＤ）チゲサイクリンおよび放射能濃度である。
【図３Ａ】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後１時間で対象１から抽出されたヒト血清のＨＰＬＣラジオクロマトグラムを示す。
【図３Ｂ】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後８時間で対象１から抽出されたヒト血清のＨＰＬＣラジオクロマトグラムを示す。
【図４】［１４Ｃ］ チゲサイクリンの投与後８時間で対象１から抽出されたヒト血清の複合ＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムである。
【図５Ａ】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後０〜４時間で集められた対象４からのヒト尿のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【図５Ｂ】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後２４〜４８時間で集められた対象４からのヒト尿のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【図５Ｃ】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後２４〜４８時間で集められた対象４からのヒト大便のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【図６】ヒト尿中、３７℃でインキュベートされた［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性である。
【図７】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後０〜４時間で集められた対象８からのヒト尿の複合質量クロマトグラムである。
【図８】［１４Ｃ］チゲサイクリン投与後３４．２時間で集められた対象８からの抽出されたヒト大便のＨＰＬＣラジオクロマトグラムである。
【図９】チゲサイクリンのｍ／ｚ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【図１０】チゲサイクリンのエピマーのｍ／ｚ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【図１１】Ｍ２のｍ／ｚ６０２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【図１２Ａ】ヒト尿から単離されたＭ３ａのラジオクロマトグラムである。
【図１２Ｂ】ヒト尿から単離されたＭ３ａの質量クロマトグラムである。
【図１３】Ｍ３ａのＬＣ／ＭＳ質量スペクトルである。
【図１４】ヒト血清におけるＭ３（９−アミノミノサイクリン）についてのｍ／ｚ４７３→４５６ＳＲＭ遷移のＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムである。
【０１７０】
【図１５】Ｍ６のＭ／Ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【図１６】Ｍ７のＭ／Ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【図１７】Ｍ９のＭ／Ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンである。
【図１８】チゲサイクリングルクロニドの提案された構造および質量スペクトルフラグメンテーションスキームである。
【図１９Ａ】チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析から得られたＵＶクロマトグラムである。
【図１９Ｂ】チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析からの選択された質量クロマトグラムである。
【図１９Ｃ】チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のＬＣ／ＭＳ分析からの選択された質量クロマトグラムである。
【図２０Ａ】チゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンのフルスケールプロットであり；（Ｂ）は強度が低いプロダクトイオンを示すために拡大されたプロットである。
【図２０Ｂ】強度が低いプロダクトイオンを示すために拡大されたチゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンのプロットである。
【図２１Ａ】低強度プロダクトイオンを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図２１Ｂ】低強度プロダクトイオンを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図２１Ｃ】低強度プロダクトイオンを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図２１Ｄ】全イオンクロマトグラムを示す、チゲサイクリンを投与された対象からのヒト尿のｍ／ｚ７６２分析のプロダクトイオンから得られるＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図２２】ヒト血清中、３７℃でインキュベートされた［１４Ｃ］チゲサイクリンの安定性である。
【図２３Ａ】ヒト尿から集められたＨＰＬＣフラクションの直接注入から得られるチゲサイクリングルクロニドのプロダクトイオンを示す。
【図２３Ｂ】ヒト尿から集められたＨＰＬＣフラクションの直接注入から得られるｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを示すチゲサイクリングルクロニドの質量スペクトルである。
【図２４Ａ】ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドＬＣ／ＭＳ分析から得られたチゲサイクリングルクロニドのＬＣ／ＭＳスペクトルである。
【図２４Ｂ】ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドのＬＣ／ＭＳ分析から得られたチゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのＭＳ２である。
【図２４Ｃ】ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドＬＣ／ＭＳ分析から得られたチゲサイクリングルクロニドのｍ／ｚ７６２質量スペクトルのＭＳ２である。
【図２４Ｄ】ヒト尿から単離されたチゲサイクリングルクロニドのＬＣ／ＭＳ分析から得られるチゲサイクリングルクロニドのプロダクトイオンを示す。
【図２５】合成Ｎ−アセチル−９−アミノミノサイクリン（Ｍ９）のＨＰＬＣ分析から得られるＵＶクロマトグラムである。
【図２６Ａ】チゲサイクリンのｍ／ｚ５８６の衝突活性化解離から得られるＭＳ／ＭＳスペクトルの提案されたフラグメンテーションスキームである。
【図２６Ｂ】チゲサイクリンのｍ／ｚ５８６の衝突活性化解離から得られるＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【図２７Ａ】チゲサイクリンのエピマーのｍ／ｚ５８６質量スペクトルのプロダクトイオンを示す。
【図２７Ｂ】チゲサイクリンのエピマーのｍ／ｚ５８６質量スペクトルである。
【図２８Ａ】Ｍ３のｍ／ｚ４７３質量スペクトルのプロダクトイオンを示す。
【図２８Ｂ】Ｍ３のｍ／ｚ４７３質量スペクトルである。
【図２９Ａ】Ｍ７のｍ／ｚ７６２質量スペクトルのプロダクトイオンを示す。
【図２９Ｂ】Ｍ７のｍ／ｚ７６２質量スペクトルである。
【図３０】ｍ／ｚ５１５→４９８トレースにおいて示されるＭ９を有するウサギ血清におけるチゲサイクリンとその代謝産物のＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムを示す。
【図３１】ウサギ血清の複合ＬＣ／ＳＲＭクロマトグラムである。
【図３２】マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびヒトにおけるチゲサイクリンの提案された代謝経路を示すスキームである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトをチゲサイクリンで処理することにより産生されるチゲサイクリンのグルクロニド代謝産物。
【請求項２】
ヒトをチゲサイクリンで処理することにより産生されるチゲサイクリンのグルクロニド代謝産物のエピマー。
【請求項３】
ｍ／ｚ７６２で質量スペクトルピークを示す請求項１記載の代謝産物。
【請求項４】
ｍ／ｚ７６２で質量スペクトルピークを示す請求項２記載のエピマー代謝産物。
【請求項５】
さらに、５８６、５６９、５１３、２１１および８６で質量スペクトルピークを示す請求項３記載のエピマー代謝産物。
【請求項６】
さらに、５８６、５６９、５１３、２１１および８６で質量スペクトルピークを示す請求項４記載のエピマー代謝産物。
【請求項７】
ａ）ヒトに対してチゲサイクリンを投与する工程；
ｂ）血清、尿または大便のサンプルを前記ヒトから得る工程；
ｃ）前記サンプルを抽出して、チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物を得る工程を含む、チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物を調製する方法。
【請求項８】
代謝産物がｍ／ｚ７６２で質量スペクトルピークを示す請求項７記載の方法。
【請求項９】
ａ）ヒトにチゲサイクリンを投与する工程；
ｂ）大便または血清のサンプルを得る工程；
ｃ）前記サンプルを抽出して、チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物のエピマーを得る工程を含む、チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物のエピマーを調製する方法。
【請求項１０】
グルクロニドのエピマーがｍ／ｚ７６２で質量スペクトルピークを示す請求項７記載の方法。
【請求項１１】
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
から選択される化合物。
【請求項１２】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
から選択される化合物。
【請求項１３】
チゲサイクリンで処理されたヒトの血清、尿または大便から抽出することにより得ることができるチゲサイクリン代謝産物であって、ｍ／ｚ７６２で質量スペクトルピークを示すことを特徴とするチゲサイクリン代謝産物。
【請求項１４】
チゲサイクリンで処理されたヒトの血清、尿または大便から抽出することにより得ることができるチゲサイクリン代謝産物であって、ｍ／ｚ７６２、５８６、５６９、５１３、２１１、１５４および８６で質量スペクトルピークを示すことを特徴とするチゲサイクリン代謝産物。
【請求項１５】
実質的に純粋な形態における請求項１〜６および１１〜１４のいずれか1つに記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１〜６および１１〜１５のいずれか1つに記載の化合物ならびに医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
から選択される化合物。
【請求項１８】
【化１３】
および
【化１４】
から選択される請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
【化１５】
および
【化１６】
から選択される請求項１７記載の化合物。
【請求項２０】
【化１７】
から選択される請求項１７記載の化合物。
【請求項２１】
【化１８】
から選択される請求項１７記載の化合物。
【請求項２２】
【化１９】
から選択される請求項１７記載の化合物。
【請求項２３】
【化２０】
から選択される請求項１７記載の化合物。
【請求項２４】
これを必要とする対象に、治療上有効量の：
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
から選択される少なくとも１つの化合物またはその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物を投与することを含む、少なくとも１種の細菌感染症を治療する方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの化合物がＩ、ＩＩエピマー、ＩＩＩおよびＩＶエピマーから選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの細菌感染症が、複合腹腔内感染症（ｃＩＡＩ）、複合皮膚および皮膚組織感染症（ｃＳＳＳＩ）、市中肺炎（ＣＡＰ）、院内感染性肺炎（ＨＡＰ）適応症、ＴｅｔＭおよびＴｅｔＫ耐性決定因子を有する細菌により引き起こされる細菌感染症、骨および関節感染症、カテーテル関連好中球減少症、産科および産婦人科感染症、ならびにＶＲＥ、ＥＳＢＬ、腸、および急速発育性マイコバクテリアにより引き起こされる細菌感染症から選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項１】
ヒトをチゲサイクリンで処理することにより産生されるチゲサイクリンのグルクロニド代謝産物。
【請求項２】
ヒトをチゲサイクリンで処理することにより産生されるチゲサイクリンのグルクロニド代謝産物のエピマー。
【請求項３】
ｍ／ｚ７６２で質量スペクトルピークを示す請求項１記載の代謝産物。
【請求項４】
ｍ／ｚ７６２で質量スペクトルピークを示す請求項２記載のエピマー代謝産物。
【請求項５】
さらに、５８６、５６９、５１３、２１１および８６で質量スペクトルピークを示す請求項３記載のエピマー代謝産物。
【請求項６】
さらに、５８６、５６９、５１３、２１１および８６で質量スペクトルピークを示す請求項４記載のエピマー代謝産物。
【請求項７】
ａ）ヒトに対してチゲサイクリンを投与する工程；
ｂ）血清、尿または大便のサンプルを前記ヒトから得る工程；
ｃ）前記サンプルを抽出して、チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物を得る工程を含む、チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物を調製する方法。
【請求項８】
代謝産物がｍ／ｚ７６２で質量スペクトルピークを示す請求項７記載の方法。
【請求項９】
ａ）ヒトにチゲサイクリンを投与する工程；
ｂ）大便または血清のサンプルを得る工程；
ｃ）前記サンプルを抽出して、チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物のエピマーを得る工程を含む、チゲサイクリンのグルクロニド代謝産物のエピマーを調製する方法。
【請求項１０】
グルクロニドのエピマーがｍ／ｚ７６２で質量スペクトルピークを示す請求項７記載の方法。
【請求項１１】
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
から選択される化合物。
【請求項１２】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
から選択される化合物。
【請求項１３】
チゲサイクリンで処理されたヒトの血清、尿または大便から抽出することにより得ることができるチゲサイクリン代謝産物であって、ｍ／ｚ７６２で質量スペクトルピークを示すことを特徴とするチゲサイクリン代謝産物。
【請求項１４】
チゲサイクリンで処理されたヒトの血清、尿または大便から抽出することにより得ることができるチゲサイクリン代謝産物であって、ｍ／ｚ７６２、５８６、５６９、５１３、２１１、１５４および８６で質量スペクトルピークを示すことを特徴とするチゲサイクリン代謝産物。
【請求項１５】
実質的に純粋な形態における請求項１〜６および１１〜１４のいずれか1つに記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１〜６および１１〜１５のいずれか1つに記載の化合物ならびに医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
から選択される化合物。
【請求項１８】
【化１３】
および
【化１４】
から選択される請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
【化１５】
および
【化１６】
から選択される請求項１７記載の化合物。
【請求項２０】
【化１７】
から選択される請求項１７記載の化合物。
【請求項２１】
【化１８】
から選択される請求項１７記載の化合物。
【請求項２２】
【化１９】
から選択される請求項１７記載の化合物。
【請求項２３】
【化２０】
から選択される請求項１７記載の化合物。
【請求項２４】
これを必要とする対象に、治療上有効量の：
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
から選択される少なくとも１つの化合物またはその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物を投与することを含む、少なくとも１種の細菌感染症を治療する方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの化合物がＩ、ＩＩエピマー、ＩＩＩおよびＩＶエピマーから選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの細菌感染症が、複合腹腔内感染症（ｃＩＡＩ）、複合皮膚および皮膚組織感染症（ｃＳＳＳＩ）、市中肺炎（ＣＡＰ）、院内感染性肺炎（ＨＡＰ）適応症、ＴｅｔＭおよびＴｅｔＫ耐性決定因子を有する細菌により引き起こされる細菌感染症、骨および関節感染症、カテーテル関連好中球減少症、産科および産婦人科感染症、ならびにＶＲＥ、ＥＳＢＬ、腸、および急速発育性マイコバクテリアにより引き起こされる細菌感染症から選択される、請求項２４記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２２】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２４Ｄ】
【図２５】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２２】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２４Ｄ】
【図２５】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【公表番号】特表２００８−５１９０３８（Ｐ２００８−５１９０３８Ａ）
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４００６３（Ｐ２００７−５４００６３）
【出願日】平成１７年１１月３日（２００５．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３９９４４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５２７１７
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月３日（２００５．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３９９４４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５２７１７
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
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