チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカン認識蛋白質を分離する方法
（ａ）一つ以上の合成ペプチドグリカンが結合された樹脂でカラムを充填して親和性クロマトグラフィカラムを準備する段階と、（ｂ）チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用する段階と、（ｃ）移動相（mobile phase）を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用し、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離されたペプチドグリカン認識蛋白質含有溶液を得る段階と、（ｄ）前記溶離された溶液からペプチドグリカン認識蛋白質を精製する段階とを含む、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカン（ＰＧＮ）認識蛋白質を分離する方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成ペプチドグリカンを利用し、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカンを認識する蛋白質（以下ペプチドグリカン認識蛋白質と略称する）を分離する方法、該方法により分離されたペプチドグリカン認識蛋白質、該ペプチドグリカン認識蛋白質をコーディングするポリヌクレオチド、及び該ペプチドグリカン認識蛋白質を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの生物体は、病原菌や寄生虫のような外部の有害環境因子から常に攻撃を受けているが、免疫システムによって前記外部の有害環境因子に対して自身を防御できる。免疫システムは、外部の異物を認識する方法によって、先天性（innate）と後天性（adaptive）との免疫システムに区分される。先天性免疫システムのみを有している無脊椎動物と異なり、人間のような脊椎動物は、先天性免疫システム及び後天性免疫システムをいずれも有している。脊椎動物でのみ観察される後天性免疫システムは、体内に侵入した有害異物（いわゆる抗原）それぞれの構造を認識し、抗原に特異的な抗体を選択的に生成することによって、持続的な免疫反応を誘導する記憶依存性免疫システムである。一方、脊椎動物及び無脊椎動物いずれでも観察される先天性免疫システムは、病原菌に共通して存在する要素（すなわち、パターン）を認識して迅速に反応する記憶非依存性免疫システムである。何年か前まででも、前記先天性免疫システムは、後天性免疫システムが抗体を生成するまで侵入した外部物質から生体を一次的に防御する、後天性免疫システムほど特異的ではなく、かつあまり発達していない防御メカニズムであると認識されてきた。
【０００３】
しかし、分子レベルで免疫システムについての活発な研究が最近数年間行われてきており、先天性免疫システムは、後天性免疫システムの活性化にも重要な役割を行うということが明らかになり、先天性免疫システムの重要性が認識されている[Carroll, M. C. et al, Curr. Opin. Immunol. 10, 36-48(1998); Ruslan, M. et al, Cell 91, 295-298(1997)]。
かような事実は、先天性免疫システムの調節が後天性免疫システムにおいて変化を引き起こし得ることを示唆する。従って、先天性免疫システムに対する新しい概念的アプローチが疾病の治療及び新薬の開発側面で要求される。最近、先天性免疫システムが多くの国内外研究者らによって分子レベルで活発に研究されている[Medzhitov, R. et al, Nature 388, 394-397(1997)]。
【０００４】
先天性免疫システムに対する研究は、主に先天性免疫システムを有する無脊椎動物を使用して行われてきた。特に、昆虫が先天性免疫システムに対する多くの研究で使われてきた。分子レベルでの最近の研究結果は、昆虫及び人間における先天性免疫系間に類似性が存在するということを示し、従って先天性免疫システムに対する研究が多様な昆虫を使用して活発に進められている[Medzhitov, R. et al,(1997) Nature 388, 394-397(1997); Hultmark, D. (1994), Nature 367, 116-117(1994); Wasserman, S. A. Mol. Biol. Cell. 4, 767-771(1993))]。
【０００５】
昆虫の免疫システムは、細胞性免疫反応と体液性免疫反応とに分けられる。体液性免疫反応は、外部物質の侵入に対応し、体液で抗菌性蛋白質の分泌、侵入した外部物質における特定糖を認識するレクチンの誘導、メラニン生成等に関連すると知られているプロ・フェノールオキシダーゼ（以下、ｐｒｏ−ＰＯと称する）の活性化などを含む。
【０００６】
昆虫でのｐｒｏ−ＰＯ活性化システムにかかわる研究結果によれば、セリンプロテイナーゼ（serine proteinase）阻害剤がフェノールオキシダーゼ（ＰＯ）の活性を選択的に抑制するということが明らかになった[Ashida, M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 113, 562-568(1983)]。ｐｒｏ−ＰＯは、セリンプロテイナーゼ性質を有するｐｒｏ−ＰＯ活性化因子（ＰＰＡＦｓ）によって媒介されるｐｒｏ−ＰＯカスケードによって活性化されるということが報告されている[Aspan A. et al, Insect Biochem., 21, 363-373(1991)]。また、前記ＰＰＡＦｓによって媒介されるｐｒｏ−ＰＯカスケードは、真菌細胞壁の構成成分であるベータ−１，３−グルカン[Kwon, T. H. et al, Mol. Cells. 7, 90-97(1997); Saul, S. et al, Archs. Insect Biochem. Physiol. 7, 91-103(1988); Ashida, M., Bombyxi mori, Insect Biochem. 11, 57-65(1981)]、または細菌細胞壁の構成成分であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）及びペプチドグリカン（ＰＧＮ）[Saul, S. et al, Archs. Insect Biochem. Physiol. 7, 91-103(1988); Ashida, M., Bombyxi mori, Insect Biochem. 11, 57-65(1981); Pye, A. E., Nature 251, 610-613(1974)]などの、いわゆるパターン（pattern）によって開始されるということが報告されている。
【０００７】
一般的にＰＯは、不活性の前酵素（チモーゲン）として存在する。ＰＯが活性化されれば、ＰＯは、ジフェノールのキノンへの酸化を触媒してメラニンを生成する。ＰＯは、分子内に銅を含むと知られている。特に、昆虫のＰＯは、昆虫表皮の褐変（browning）及び硬化（sclerotization）、傷治癒のための傷部位からの体液漏出、及び侵入する病原菌に対する生体の保護のような防御メカニズムにおいて重要な役割を行うと考えられる。
【０００８】
昆虫の防御メカニズムと関連したｐｒｏ−ＰＯは、これまでの数十年間多くの研究者によって活発に研究されてきたが、１９９５年になって初めてキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、カイコガ（Bombyx mori）、タバコスズメガ（Manduca sexta）の三種の昆虫幼虫からのｐｒｏ−ＰＯが分離及び精製され、そのアミノ酸配列が究明されるまで、ｐｒｏ−ＰＯの分離、精製または配列分析が可能ではなかった[Saul S. et al, Archs. Insect Biochem. Physiol., 5, 1-11(1987); Fujimoto K. et al,, PNAS, 92, 7769-7773; Kawabata T. et al,, PNAS, 92, 7774-7778(1995)] 。
【０００９】
昆虫の先天性免疫システムに関連する天然のパターン認識蛋白質が同定され、ｐｒｏ−ＰＯカスケードにおけるそれらの生物学的機能が部分的に同定された[Girardin SE, et al. J Biol Chem. 278: 803283(2003); Hugot JP et al, Curr Opin Immunol. 15: 593597(2003)]。また、β−１，３−グルカン認識蛋白質がコウチュウ目に属するチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液から分離及び同定され、前記β−１，３−グルカン認識蛋白質と前記ｐｒｏ−ＰＯカスケードとの相関関係が報告された。また、β−１，３−グルカン認識蛋白質が韓国産のチョウセンクロコガネ（Holotrichia diomphalia）の幼虫の体液から分離及び同定され、β−１，３−グルカン認識蛋白質の生物学的機能が報告された[Lee MH, et al, J Biol Chem. 279(5):3218-27(2000); Zhang R et al, J Biol Chem. 278(43):42072-9.(2003)]。
【００１０】
最近、前記同定されたパターン認識蛋白質のうち、チョウセンクロコガネ幼虫の体液から分離されたＰＧＮ−認識蛋白質（ＰＧＲＰｓ）が、ＰＧＮではない、真菌のパターンであるβ−１，３−グルカンを特異的に認識し、ｐｒｏ−ＰＯカスケードを活性化させるということが報告された[Lee MH, et al, J Biol Chem. 279(5):3218-27(2000)]。かような結果は、天然のパターン認識蛋白質の分子メカニズム及びｐｒｏ−ＰＯカスケードの活性化メカニズムの相関関係がまだ明確に究明されていないということを示す。
【００１１】
チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液のｐｒｏ−ＰＯカスケードは、真菌のパターンであるβ−１，３−グルカンによって活性化されると報告された。また、β−１，３−グルカンを特異的に認識する蛋白質がチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液に存在することが発見された。かような結果は、真菌感染検出用の診断試薬の開発に対して新しい可能性を提示する[Zhang R et al, J Biol Chem. 278(43):42072-9(2003)]。
【００１２】
ＰＯ活性化のためのカスケード経路を含むＰＯ活性化システムは、病原菌あるいは外部物質の侵入またはホストの血液細胞の脱顆粒化に反応して活性化される内部因子によって容易に活性化され、ｐｒｏ−ＰＯをＰＯに変換させることによって、カテコールアミン類からメラニンを形成する。従って、前記ＰＯ活性化システムを誘発する（ＰＧＮ及びβ−１，３−グルカンのような）パターンを特異的に認識するパターン認識蛋白質を分離し難い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
前記の問題点の観点から、本発明者らは、ＰＧＮ−認識蛋白質と結合できるが、ＰＯ活性化の下位（subsequent）カスケードは活性化されられない合成ＰＧＮを利用し、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からフェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性化システムに関与するペプチドグリカン（ＰＧＮ）認識蛋白質の分離方法を開発した。
従って、本発明は、合成ＰＧＮを使用し、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からＰＧＮ認識蛋白質を分離する方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からＰＧＮ認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質分画を分離する方法を提供する。
本発明はまた、前記方法を使用して分離されたＰＧＮ認識蛋白質及び前記ＰＧＮ認識蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、前記ＰＧＮ認識蛋白質を含むＰＧＮ検出キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一様態によって、（ａ）下記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択された一つ以上の合成ＰＧＮが結合された樹脂でカラムを充填して親和性クロマトグラフィカラムを準備する段階と、（ｂ）チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用する段階と、（ｃ）移動相（mobile phase）を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用し、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離されたＰＧＮ認識蛋白質含有溶液を得る段階と、（ｄ）前記溶離された溶液からＰＧＮ認識蛋白質を精製する段階とを含む、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカン（ＰＧＮ）認識蛋白質を分離する方法が提供される：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
式中、Ｐｒはプロピルである。
【００１６】
本発明の他の様態によって、（ａ）前記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択された一つ以上の合成ＰＧＮが結合された樹脂でカラムを充填して親和性クロマトグラフィカラムを準備する段階と、（ｂ）チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用する段階と（ｃ）洗浄溶液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用し、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離されたＰＧＮ認識蛋白質を除外した他のパターン認識蛋白質の溶液を得る段階と、（ｄ）前記溶離された溶液からＰＧＮ認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質の分画を精製する段階とを含む、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からＰＧＮ認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質分画を分離する方法が提供される。
【００１７】
本発明のさらに他の様態によって、前記方法を使用して分離されたＰＧＮ認識蛋白質、及び前記ＰＧＮ認識蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドが提供される。
本発明のさらに他の様態によって、前記ＰＧＮ認識蛋白質を含むＰＧＮ検出キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の例示的具現例を示す下記添付図面を参照しつつ、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明は、合成ＰＧＮを使用してチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカン（ＰＧＮ）認識蛋白質を分離する方法を提供する。前記合成ＰＧＮは、下記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択され、化学式３の化合物がさらに望ましい：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
式中、Ｐｒはプロピルである。
【００１９】
前記合成ＰＧＮは、グラム陽性菌の天然ペプチドグリカンとその構造が類似している。前記合成ＰＧＮ及び天然のＰＧＮは、ＰＧＮ認識蛋白質に競争的に結合する。すなわち、前記合成ＰＧＮは、ＰＧＮ認識蛋白質に結合することは可能であるが、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性化のための下位（subsequent）カスケードを活性化させられない。従って、前記合成ＰＧＮは、天然のＰＧＮの競争的抑制剤として作用する。
【００２０】
本発明によるＰＧＮ認識蛋白質の分離方法は、前記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択された一つ以上の合成ＰＧＮの結合された樹脂でカラムを充填し、親和性クロマトグラフィカラムを準備する段階を含む。前記樹脂は、セファローズ、セファデックスなどであって、セファローズ樹脂が望ましい。
【００２１】
本発明によるＰＧＮ認識蛋白質の分離方法は、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液を前記で準備された親和性クロマトグラフィカラムに適用する段階を含む。この段階で、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液中のＰＧＮ認識蛋白質が前記親和性クロマトグラフィカラム内の合成ＰＧＮに結合される。
【００２２】
本発明によるＰＧＮ認識蛋白質の分離方法は、移動相（mobile phase）を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用し、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離されたペプチドグリカン認識蛋白質含有溶液を得る段階を含む。前記移動相は、ＥＤＴＡ及びＮａＣｌを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液であって、望ましくは、１Ｍ ＮａＣｌ及び３ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）でありうる。
【００２３】
本発明によるペプチドグリカン認識蛋白質分離方法は、前記溶離された溶液からＰＧＮ認識蛋白質を精製する段階を含む。すなわち、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離された溶液中の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥなどで分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるＰＧＮ認識蛋白質含有の分画を精製する。
【００２４】
前記ＰＧＮ認識蛋白質の精製は、当業界に公知された多様な精製方法、例えばサイズ排除（size-excluision）クロマトグラフィ、イオン濃度勾配クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィなどを使用して遂行することができる。ＰＧＮ認識蛋白質の精製効率を向上させるために、前記溶離された溶液は、前記精製前に濃縮させることができる。
本発明の一具現例によって、前記ＰＧＮ認識蛋白質の精製は、前記溶離された溶液のサイズ排除カラムクロマトグラフィ、イオン濃度勾配カラムクロマトグラフィ及びイオン交換カラムクロマトグラフィの順次的実行によって遂行されうる。このとき、前記サイズ排除カラムクロマトグラフィ、前記イオン濃度勾配カラムクロマトグラフィ及び前記イオン交換カラムクロマトグラフィは、それぞれトヨパール（Toyopearl）Ｈｗ５５Ｓカラム、ヒドロキシアパタイト（hydroxyapatite）カラム及びモノ−ＱＦＰＬＣカラム上で遂行されうる。
【００２５】
本発明はまた、（ａ）前記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択された一つ以上の合成ＰＧＮが結合された樹脂でカラムを充填して親和性クロマトグラフィカラムを準備する段階と、（ｂ）チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用する段階と、（ｃ）洗浄溶液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用し、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離されたＰＧＮ認識蛋白質を除外した他のパターン認識蛋白質の溶液を得る段階と、（ｄ）前記溶離された溶液からＰＧＮ認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質の分画を精製する段階とを含む、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からＰＧＮ認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質分画を分離する方法を提供する。
【００２６】
段階（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）は、前述のＰＧＮ認識蛋白質の分離方法の各段階と類似した方法で遂行されうる。段階（ｃ）で使われる前記洗浄溶液は、ＥＤＴＡ含有Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）であって、望ましくは、３ｍＭ ＥＤＴＡ含有の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）でありうる。
本発明はまた、前記ＰＧＮ認識蛋白質の分離方法を使用して分離されたＰＧＮ認識蛋白質を提供する。本発明の一具現例によって、前記ＰＧＮ認識蛋白質は、配列番号１のアミノ酸配列を有することができる。
【００２７】
本発明はまた、前記ＰＧＮ認識蛋白質を分離する方法をコーディングするポリヌクレオチドを提供する。本発明の一具現例によって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列を有することができる。
本発明はまた、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液から由来するＰＧＮ認識蛋白質を使用し、サンプル中のＰＧＮ検出用キットを提供する。
サンプル中のＰＧＮは、バクテリアの細胞壁から由来しうる。従って、前記キットを使用すれば、サンプル中のバクテリアの存在が迅速であって便利に検出されうる。本発明の他の一具現例によって、前記ＰＧＮ認識蛋白質は、配列番号１のアミノ酸配列を有することができる。
以下、実施例を介して本発明についてさらに詳細に説明する。下記実施例は、単に本発明について説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００２８】
実施例１：チャイロゴミムシダマシの幼虫の体液採取
チャイロゴミムシダマシの幼虫をソウル大公園の昆虫飼育室から得て飼育した。以下の実験に使用するために、幼虫が約２ｃｍを超える大きさに育つまで室温（２５℃）で麦ぬかとキャベツとを前記幼虫に食べさせた。
前記幼虫（平均重さ、０．１ｇ／幼虫）に対して氷上で低温麻酔を施した。２５Ｇ注射針が装着された５ｍｌ滅菌注射器に脱凝集緩衝液（ＮａＣｌ １５ｍＭ、クエン酸三ナトリウム８３ｍＭ、クエン酸２６ｍＭ及びＥＤＴＡ ２０ｍＭ；ｐＨ５．０）を充填した。
前記脱凝集緩衝液１．４ｍｌを滅菌されたエッペンドルフチューブに加え、注射針で幼虫の頭の第１節を刺し、前記幼虫から流出される体液を前記エッペンドルフチューブに入れた。１つのチューブ当たり１５の幼虫から流出された体液を集めた。
【００２９】
実施例２：天然ＰＧＮまたはβ−１，３−グルカンの準備
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びルテウス菌（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）由来のＰＧＮは、Ｆｌｕｋａ社から、β−１，３−グルカン（Curdlan）は、和光純薬工業株式会社（日本）から購入した。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＭ．ｌｕｔｅｕｓ由来のＰＧＮを超音波破砕した。このように得られた水溶性ＰＧＮを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で処理して１０％のＰＧＮ溶液を得て、反応溶液では、１μｇ ＰＧＮの含有量で使用した。
【００３０】
実施例３：合成ＰＧＮの製造
（１）アリル６−Ｏ−ベンジル−４−（３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−２−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニルアミノ）−β−Ｄ−グルコピラノシル）−３−Ｏ−（（Ｒ）−１−（エトキシカルボニル）エチル）−２−デオキシ−グルコピラノシド（化合物４）の製造
−１５℃で無水ジクロロメタン中に、Ｎ−Ｔｒｏｃ−グルコサミニルトリクロロアセトイミデート供与体（化合物２）（２６．０ｇ、３８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ムラミル受容体（化合物３）（１７．０ｇ、３０ｍｍｏｌ）及びメンブレン・スパニング４Ａファミリー（ＭＳ４Ａ）の混合物にトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）（３４０μｌ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。
【００３１】
【表１】
【００３２】
反応混合物を−１５℃で１０分間撹拌した。反応溶液を冷却されたＮａＨＣＯ３飽和水溶液（３０ｍＬ）でクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）し、ＣＨＣｌ３（２５０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａＨＣＯ３（６０ｍＬ）及び食塩水（６０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（６００ｇ、トルエン：ＥｔＯＡｃ＝１０：１）で精製し、標題の化合物（２９．０ｍｇ、８８％）を淡黄色固体で得た：
ESI-TOF-MS (positive) m/z 1119.2 [M + Na]+;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.45-7.29 (15H, m, (C6H5)-CH2-), 5.85-5.78 (1H, m, -CH2-CH=CH2), 5.57 (1H, s, Ph-CH=), 5.28-5.13 (3H, m, H-1, -CH2-CH=CH2), 4.89-4.59 (10H, m, CCl3-CH2-OCO-, CH3-CH2-OCO-, Ph-CH2-), 4.43-4.39 (1H, m, H-6'), 4.26-4.04 (5H, m, Lac-αH, Ph-CH2-, H-1'. -CH2-CH=CH2), 3.98-3,93 (2H, m, -CH2-CH=CH2, H-3), 3.77-3.56 (6H, m, H-2, H-4, H-4', H-6, H-6'), 3.43-3.41 (2H, m, H-2', H-5), 3.25-3.21 (2H, m, H-3, H-5'), 1.34-1.25 (6H, m, Lac-CH3, CH3-CH2-OCO).実測値: C, 51.42; H, 4.90; N, 2.60. C47H54Cl6N2O15として計算値: C, 51.33; H, 4,95; N, 2.55%。
【００３３】
（２）ジサッカライド１−Ｏ−トリクロロアセトイミデート（化合物１２）の製造
無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中の化合物４（３．０ｇ、２．７ｍｍｏｌ）の溶液を脱気し、Ｈ２活性化された［Ｉｒ（ｃｏｄ）（ＭｅＰｈ２Ｐ）２］ＰＦ６（２３ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で窒素大気下で１時間撹拌した後、無水ＴＨＦ（３ｍＬ）中のＨ２活性化された［Ｉｒ（ｃｏｄ）（ＭｅＰｈ２Ｐ）２］ＰＦ６（２３ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を室温で窒素大気下で１時間撹拌し、ヨード（６９０ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）及び水（１０ｍＬ）を加えた。反応混合物をさらに１０分間撹拌し、Ｎａ２ＳＯ３水溶液（５％、１００ｍＬ）をすぐに加えた。得られた反応溶液をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ２水溶液（５％、５０ｍＬｘ２）、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬｘ２）、食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（１８０ｇ、トルエン：ＥｔＯＡｃ＝４：１）で精製し、標題の化合物（２．７２ｍｇ、９３％）を淡黄色固体で得た：
[α]D23 = +8.4 (c 1.00, CHCl3)；
ESI-MS (positive) m/z = 1079.0[M + Na]+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ= 7.54.7.27 (m, 15H, (C6H5)-CH2-), 5.60 (br.s, 1H, H-1), 5.57 (s, 1H, Ph-CH=), 4.89-4.60 (m, 8H, CCl3-CH2-OCO-, CH3-CH2-OCO-, Ph-CH2-), 4.43-4.39 (m, 1H, H-6'''), 4.31-3.91 (m, 4H, Ph-CH2-, H-1', Lac-αH), 3.95-3.91 (m, 1H, H-3), 3.82-3.63 (m, 6H, H-2, H-4, H-6, H-4', H-6'), 3.43-3.41 (m, 2H, H-2', H-5), 3.22-3.21 (m, 2H, H-3', H-5'), 1.35.1.27 (m, 6H, Lac-Me, CH3-CH2-OCO). 実測値: C, 51.68; H, 5.33; N, 2.35. C44H50Cl6N2O15として計算値: C, 51.24; H, 5.12; N, 2.54%。
【００３４】
（３）４’−Ｏ−ジサッカライド（化合物１３）の製造
化合物４（１．５ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ３ＣＮ（１３ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミンボラン（１５０ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）溶液を得た。ボラントリフルオライドジエチルエテレート（９６０ｍｇ、６．８０ｍｍｏｌ）を前記トリエチルアミンボラン溶液に０℃で滴加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、氷で冷却させた（ice-cooled）ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬ）でクエンチング（quenching）し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬｘ２）で抽出した。有機層を１０％クエン酸水溶液（１５ｍＬｘ４）、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１５０ｍＬ）及び食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（１８０ｇ、トルエン：ＥｔＯＡｃ＝４：１）で精製し、標題の化合物（１．１３ｇ、７３％）を無色固体で得た：
[α]D23 = +25.6 (c 1.00, CHCl3); ESI-TOF-MS (positive) m/z = 1121.6 [M + Na]+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ= 7.43-7.27 (15H,m,(C6H5)-CH2-), 5.85-5.79 (1H, m, -CH2-CH=CH2), 5.26-5.13 (3H, m, -CH2-CH=CH2, H-1), 4.86-4.50 (9H, m, CCl3-CH2-OCO-, CH3-CH2-OCO-, Ph-CH2-), 4.33-4.04 (5H, m, Ph-CH2-, Lac-αH, H-1', -CH2-CH=CH2), 3.97-3.57 (10H, m, -CH2-CH=CH2, H-3, H-4, H-6, H-3', H-4', H-6'), 3.46-3.36 (2H, m, H-2', H-5), 3.27-3.23 (1H, m, H-5'), 1.29-1,20 (6H, m, Lac-CH3, CH3-CH2-OCO). 実測値: C, 51.68; H, 5.33; N, 2.35. C47H56Cl6N2O15として計算値: C, 51.24; H, 5.12; N, 2.54%。
【００３５】
（４）完全に保護されたテトラサッカライド（化合物１４）の製造
−１５℃で、無水ジクロロメタン（７５ｍＬ）中の化合物１２（２．７ｇ、３８ｍｍｏｌ）、化合物１３（１．６５ｇ、３０ｍｍｏｌ）及びＭＳ４Ａの混合物にＴＭＳＯＴｆ（１８μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を−１５℃で１０分間撹拌した。反応溶液を氷で冷却させた（ice-cooled）ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬ）でクエンチング（quenching）し、ＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａＨＣＯ３（６０ｍＬｘ２）及び食塩水（６０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（３００ｇ、トルエン：ＥｔＯＡｃ＝１０：１）で精製し、標題の化合物（２．３３ｇ、７９％）を淡黄色固体で得た：
[α]D23 = -1.7 (c 1.00, CHCl3); ESI-TOF-MS (positive) m/z = 2159.0 [M + Na]+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.51-7.27 (30H, m, (C6H5)-CH2-), 5.86-5.76 (1H, m, -CH2-CH=CH2), 5.56 (1H, s, Ph-CH=), 5.25-4.98 (4H, m, -CH2-CH=CH2, Ph-CH2-, H-1), 4.88-4.33 (17H, m, CCl3-CH2-OCO-, CH3-CH2-OCO-, Ph-CH2-), 4.32-3.90 (12H, m, Ph-CH2-, Lac-αH, H-1'', H-1'', H-1''', H-6''', -CH2-CH=CH2), 3.87-3.01 (24H, m, Ph-CH2-, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-2', H-3', H-4', H-5', H-6', H-2'', H-3'', H-4'', H-5'', H-6'', H-2''', H-3''', H-4''', H-5''', H-6''' ), 1.32-1,27 (12H, m, Lac-CH3,CH3-CH2-OCO)。
【００３６】
（５）２−Ｎ−アセチル−テトラサッカライド（化合物２１）の製造
Ｚｎ−Ｃｕ（１ｇのＺｎから製造される）を化合物１４（１．０５ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）の酢酸溶液に加え、反応混合物を室温で１時間撹拌した。不溶性物質を濾過して除去し、濾液を真空濃縮した。残留溶媒をトルエン（５ｍＬｘ３）で共蒸発（co-evaporation）させて除去した。粗生成物をピリジン（７ｍＬ）及び無水酢酸（７ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、真空濃縮した。残留溶媒をトルエン（５ｍＬｘ３）と共に共蒸発させて除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（８０ｇ、ＣＨ３Ｃｌ：アセトン＝３：１）で精製し、標題の化合物（７５０ｍｇ、ｑｕａｎｔ．）を白色固体で得た：
[α]D23 = -7.4(c 1.00, CH3Cl); ESI-TOF-MS(positive) m/z=1609.2[M+H+], 1631.6[M+Na]+。
【００３７】
（６）遊離カルボン酸を有するテトラサッカライド（化合物２３）の製造
ＬｉＯＨ（２８ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を、化合物２１（１８０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）のジオキサン：ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（２：４：１、１．２ｍＬ）溶液に加え、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応溶液をＤｏｗｅｘ Ｈ＋（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ−ｘ８ ２００−４００メッシュＨ形態、ダウケミカル）で中和し、ＨＰ−２０カラム（２ｃｍｘ４０ｃｍ）に適用した。有機及び無機の塩をＨ２Ｏ（３００ｍＬ）で溶離して除去し、メタノールで溶離して標題化合物（１７０ｍｇ、ｑｕａｎｔ．）を白色固体で回収した：
ESI-TOF-MS(positive) m/z=1575.1[M+Na]+ 。
【００３８】
（７）保護されたテトラサッカライドジペプチド（化合物２５）の製造
ＷＳＣＩ・ＨＣｌ（３７ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４８μｌ、０．４７ｍｍｏｌ）を、化合物２３（１２２ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（３３．５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１４ｍＬ）溶液に０℃で加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈し、濾過して不溶性物質を除去した。濾液を濃縮し、ＣＨＣｌ３に溶解させた。得られたＣＨＣｌ３溶液を、クエン酸（１Ｍ、２０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）及び食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（２０ｇ、ＣＨＣｌ３：メタノール＝２０：１）で精製し、標題の化合物（１４３ｍｇ、８６％）を白色固体で得た：
ESI-TOF-MS (positive) m/z =2153.52[M + Na]+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ =7.52-7.15 (40H, m), 5.58 (1H, m), 5.57 (1H, s), 5.56-5.07 (6H, m), 4.86 (1H, d, J =12.3 Hz), 4.83 (1H, d, J =3.7Hz), 4.74(1H.dd, J =12.1 Hz), 4.66-4.57 (4H, m), 4.35-4.24 (8H, m), 4.09-3.92 (6H, m), 3.83-3.59 (12H, m), 3.53-3.43 (10H, m), 3.39-3.35 (1H, m), 3.34-3.20 (1H, m), 2.56-2.41 (4H, m), 2.17-2.03 (7H, m), 1.93 (3H, s), 1.88 (3H, s), 1.73 (3H, s), 1.57-1.53 (3H, m), 1.43 (1H, d, J =6.9 Hz), 1.37-1.33 (3H, m), 1.26 (1H, m). 実測値: C, 62.03; H, 6.63; N, 6.38. C113H138N10O31 ・3H20として計算値: C, 62.08; H, 6.64; N, 6.41%。
【００３９】
（８）テトラペプチド（化合物２７）の製造
標題の化合物を化合物２５の製造方法と類似した方法で製造した： ESI-TOF-MS(positive) m/z=1400.53[(M+2H)2+]。
【００４０】
（９）テトラサッカライドジペプチド（化合物３２、化学式１で表示される化合物）の製造
無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中の化合物２５（３００ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）溶液を脱気し、Ｈ２活性化された［Ｉｒ（ｃｏｄ）（ＭｅＰｈ２Ｐ）２］ＰＦ６（２３ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（３ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を室温で窒素大気下で１時間撹拌し、Ｈ２活性化された［Ｉｒ（ｃｏｄ）（ＭｅＰｈ２Ｐ）２］ＰＦ６（２３ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（３ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を室温で窒素大気下で１時間撹拌し、ヨード（３５ｍｇ、０．１４２ｍｍｏｌ）及び水（０．５ｍＬ）を加えた。反応混合物をさらに１０分間撹拌し、水性Ｎａ２ＳＯ３（５％、１００ｍＬ）でクエンチング（quenching）し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ２（５％、１０ｍＬｘ２）、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬｘ２）及び食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（２０ｇ、トルエン：ＥｔＯＡｃ＝５：１）で精製し、１−遊離されたテトラサッカライド（２６０ｍｇ、８８％）を淡黄色固体で得た： ESI-TOF-MS(positive) m/z=2113.6[M+Na]+ 。
【００４１】
酢酸中に存在する炭素上の水酸化パラジウム（１００ｍｇ）を１−遊離されたテトラサッカライド（８６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の酢酸（３ｍＬ）溶液に加え、反応混合物をＨ２（２０ａｔｍ）下で一日撹拌した。パラジウム触媒を濾過して除去して濾液を濃縮し、Ｈ２Ｏから凍結乾燥し、標題の化合物（３９ｍｇ、７０％）を白色固体で得た：
ESI-TOF-MS (positive) m/z = 685.3 [M-2H]2-; HRMS-ESI FT-ICR(negative): (M) C54H88N10O31としての計算値, 1372.561; 実測値1372.555; 1H NMR ((600 MHz, D2O): d = 5.16-5.15 (d, J = 3.0 Hz, 1H, H-1), 4.46-4.42 (m, 3H), 4.36-4.32 (m, 2H), 4.30-4.27 (m, 2H, iGln--CH), 4.26-4.19 (m, 2H), 3.86-3.30 (m, 24H), 2.31 (m, 4H, iGln-γ-CH2), 2.12-2.03 (m, 4H, iGln-β-CH2), 1.96-1.95 (s, 12H, NHC(O)CH3 X 4), 1.37-1.35 (m, 6H, Ala-β-CH3), 1.31-1.28 (m, 6H, Lac-β-CH3)。
【００４２】
（１０）テトラサッカライドトリペプチド（化合物３３、化学式２で表示される化合物）の製造
水酸化パラジウム（１００ｍｇ）の酢酸溶液を化合物２７（９５ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）の酢酸（３ｍＬ）溶液に加え、反応混合物をＨ２（２０ａｔｍ）下で一日撹拌した。反応の経過を薄膜クロマトグラフィ（ＴＬＣ）分析でモニターし、脱保護化が終了するまで水素化分解（hydrogenolysis）を持続した。パラジウム触媒をセライトパッド（cerite pad）を介して濾過して除去し、濾液を濃縮した。残渣をアセトニトリル−Ｈ２Ｏから凍結乾燥し、標題の化合物（３９ｍｇ、５０％）を白色粉末で得た：
ESI-TOF-MS (negative) m/z = 834.5 [M-2H]2-; HRMS-ESI FT-ICR (negative): (M) C69H118N14O33として計算値, 1670.798; 実測値, 1670.817; 1H NMR (500 MHz, D2O): δ= 4.86-4.80 (m, 1H, H-1) 4.46-4.40 (m, 3H), 4.36-4.05 (m, 8H, Lac-α-CH, Ala-α-CH, iGln-α-CH, Lys-α-CH), 3.86-3.30 (m, 26H), 3.00-2.90 (t, J = 11.4, 4H, Lys-ε-CH2), 2.37-2.31 (t, J = 9.5, 4H, iGln-γ-CH2), 2.09-2.0 (m, 4H, iGln-β-CH2), 2.02-1.81 (m, 18H, NHC(O)CH3 X 4, Lys-β-CH X 2, Lys-δ-CH X 2), 1.78-1.69 (m, 2H, Lys-δ-CH X 2), 1.58-1.70 (m, 4H, Lys-γ-CH2 X 2), 1.61-1.4 (m, 2H, Propyl CH3-CH2), 1.40-1.35 (m, 6H, Ala-β-CH3), 1.31-1.28 (m, 6H, Lac-β-CH3), 0.85-0.80 (t, J = 9.3, 3H, Propyl CH3)。
【００４３】
（１１）テトラサッカライドテトラペプチド（化合物３５、化学式３で表示される化合物）の製造
標題の化合物を化合物２７から化合物３３の製造方法と類似した方法で製造した：
ESI-TOF-MS (negative) m/z = 905.1 [M-2H]2-; HRMS-ESI FT-ICR (negative): (M) C75H128N16O35として計算値, 1812.873; 実測値, 1812.896; 1H NMR (500 MHz, D2O): δ= 4.86-4.80 (m, 1H, H-1), 4.46-4.40 (m, 3H), 4.36-3.95 (m, 10H, Lac-α-CH, Ala-α-CH, D-iGln-α-CH, Lys-α-CH), 3.86-3.30 (m, 26H), 3.00-2.90 (t, J = 7.5, 4H, Lys-ε-CH2), 2.40-2.31 (t, 4H, iGln-γ-CH2), 2.09-1.82 (m, 22H, iGln-β-CH2 X 2, NHC(O)CH3 X 4, Lys-β-CH2 X 2, Lys-δ-CH X 2), 1.78-1.4 (m, 8H, Lys-δ-CH X 2, Lys-γ-CH2 X 2, Propyl CH3-CH2), 1.40-1.22 (m, 12H, Ala-β-CH3 X 4, Lac-β-CH3 X 2), 0.85-0.80 (m, 3H, Propyl CH3)。
【００４４】
（１２）テトラサッカライドペンタペプチド（化合物３７、化学式４で表示される化合物）の製造
標題の化合物を化合物２７から化合物３３の製造方法と類似した方法で製造した：
ESI-TOF-MS (negative)m/z = 976.64 [M-2H]2-;;HRMSESI FT-ICR (negative): (M) C81H138N18O37として計算値, 1954.947; 実測値, 1954.939;1H NMR (500 MHz, D2O): δ = 4.86-4.80 (m, 1H, H-1), 4.46-4.40 (m, 3H), 4.36-4.0 (m, 12H, Lac-α-CH, Ala-α-CH, iGln-α-CH, Lys-α-CH), 3.86-3.30 (m, 26H), 2.95-2.91 (t, J = 7.5, 4H, Lys-ε-CH2), 2.40-2.31 (t, J = 7.0, 4H, iGln-γ-CH2), 2.09-1.82 (m, 22H, iGln-β-CH2 X 2, NHC(O)CH3 X 4, Lys-β-CH2 X 2, Lys-δ-CH X 2), 1.78-1.4 (m, 8H, Lys-δ-CH X 2, Lys-γ-CH2 X 2, Propyl CH3-CH2), 1.40-1.22 (m, 12H, Ala--CH3 X 6, Lac-β-CH3 X 2), 0.85-0.80 (m, 3H, Propyl CH3)。
【００４５】
実施例４：ＰＯ活性化に対する天然または合成ＰＧＮの影響評価
本実施例では、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液内でのＰＯの活性化に対する天然または合成ＰＧＮの影響を評価した。
ＰＯ活性を基質溶液（４−メチルカテコール、及び４−ヒドロキシプロリンエチルエステルのＨＣｌ溶液）を使用し、Pye分光光度測定法（Pye-spectrophotometric method）によって分析した。４−メチルカテコールは、ＰＯによってキノンに酸化され、これは、４−ヒドロキシプロリンエチルエステルＨＣｌ溶液との非酵素的反応によって、５２０ｎｍで最大の吸光度を有する安定した化合物である４−（４’−ヒドロキシル−２’−カルブエトキシ−１’−ピロリン）−５−メチル−ｏ−ベンゾキノンに転換される（図２参照）。
１０％β−１，３−グルカン溶液１０μｌ（１μｇ）、１０％Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＰＧＮ溶液１０μｌ（１μｇ）、１０％Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ ＰＧＮ溶液１０μｌ（１０ｎｇ）及び１０％合成ＰＧＮ（化学式１ないし４の化合物それぞれ）溶液１０μｌ（１μｇ）それぞれを、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液３０μｌ（蛋白質３５０μｇ）と共に３０℃で５分間インキュベートした。その後、４−メチルカテコール（２５０ｍＭ）４μｌ、４−ヒドロキシプロリンエチルエステルＨＣｌ溶液（６２．５ｍＭ）１６μｌ及び１Ｍ ＣａＣｌ２（１０ｍＭ）５μｌを加えた。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を最終容積が５００μｌになるように加えた。反応混合物を３０℃でインキュベートした後、反応混合物の吸光度を５２０ｎｍで測定した（図３参照）。
【００４６】
β−１，３−グルカン溶液、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＰＧＮ溶液、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ ＰＧＮ溶液は、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液中でＰＧＮ依存のｐｒｏ−ＰＯカスケードを活性化させたが、相対的に簡単な構造を有する合成ＰＧＮは、ＰＧＮ依存のｐｒｏ−ＰＯカスケードを活性化させられないことが発見された（図３参照）。
一方、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＰＧＮ １μｇ及び合成ＰＧＮ １μｇの存在下でＰＯ活性を測定した。ＰＧＮ活性の阻害程度は合成ＰＧＮによって異なるが、合成ＰＧＮは、ＰＧＮ依存のＰＯ活性を抑制することが発見された（図４参照）。特に、Ｎ−アセチルムラミン酸に４個のアミノ酸が連結された化学式３の化合物３５が天然のＰＧＮ依存のＰＯ活性の最も強力な競争的阻害剤として機能した。かような結果は、化学式３の合成ＰＧＮがチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液に存在するＰＧＮ認識蛋白質によって最適に認識されるということを示す。
また、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＰＧＮ １μｇ存在下で、化学式３の合成ＰＧＮを増加させつつ追加し（０．２、０．４、０．８及び１．５μｇ）、ＰＯ活性を測定した。ＰＯ活性が合成ＰＧＮ濃度依存の様相で阻害されることが発見された（図５参照）。
【００４７】
実施例５：アミダーゼ活性に対する天然または合成ＰＧＮの影響評価
１０％のグラム陽性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＰＧＮ溶液（最終濃度：１μｇ）１０μｌ及び１０％の合成ＰＧＮ（化学式３の化合物３５）溶液１０μlを、基質として４０μＭのトリプシンＭＣＡ（ｔ−ブチルオキシカルボニル−ベンジル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−セリル−Ｌ−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド；Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）存在下で３０℃でインキュベートした後、蛍光分光光度計（ＵＶ−１６０Ａモデル、（株）島津製作所）を使用し、３８０ｎｍ（励起波長）及び４６０ｎｍ（放射波長）で蛍光を測定した。
その結果、アミダーゼ活性がＰＯ活性と同じ阻害パターンを示すということが発見された（図６参照）。かような結果は、合成ＰＧＮが前記ＰＧＮ認識のみに関与するということを示す。
【００４８】
実施例６：チャイロゴミムシダマシ幼虫からのＰＧＮ認識蛋白質の精製
（１）合成ＰＧＮ結合カラムの準備
まず、ＣＮＢｒセファローズ４Ｂ樹脂を１ｍＭ ＨＣｌで活性化させた。その後、化学式３の合成ＰＧＮ２０ｍｇの結合緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ）（ｐＨ８．３）溶液を前記ＣＮＢｒセファローズ４Ｂ樹脂に適用した。得られた混合物を室温で１時間インキュベートし、ブロッキング緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液、ｐＨ８．０）と共に室温で２時間撹拌し、０．１Ｍアセテート緩衝液（ｐＨ４．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ）及び０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ）でそれぞれ３回洗浄し、ＰＧＮ結合のセファローズ４Ｂ樹脂を製造した。
合成ＰＧＮが前記ＣＮＢｒセファローズ４Ｂ樹脂に結合されているか否か確認するために、合成ＰＧＮ結合緩衝液溶液、及び前記結合緩衝液と前記ＣＮＢｒセファローズ４Ｂ樹脂との中で前記合成ＰＧＮ溶液をインキュベートした後で得られた溶液に対し、２１８ｎｍで吸光度測定を行い、吸光度低下率（％）を計算した。その結果、前記合成ＰＧＮ及び前記ＣＮＢｒセファローズ４Ｂ樹脂の結合反応によって、８９％の収率でＰＧＮ結合の樹脂が生成されることによって、ＰＧＮ（３２ｍｌ）結合カラムが製造された。
一方、合成ＰＧＮを使用していないことを除いては、前記と同じ方法で対照群カラムを製造した。
【００４９】
（２）２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質の分離及び精製
（ａ）合成ＰＧＮ結合カラムを使用した精製
０．５Ｍ ＤＦＰ溶液を抗凝集緩衝液（ｐＨ５．０）で採取されたチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液１６０ｍｌに最終濃度が２ｍＭになるように加えた。反応混合物を４℃で２時間インキュベートし、３ｍＭ ＥＤＴＡ含有の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）で５℃で１２時間透析した。
開放カラム（ψ３ｃｍｘ２５ｃｍ）をＰＧＮ結合セファローズ樹脂約３０ｍｌで充填し、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液の透析された溶液約１６０ｍｌを分当たり０．６ｍｌの流速でＰＧＮ結合カラムにローディングした。
前記ＰＧＮ結合カラムを３ｍＭ ＥＤＴＡ含有５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）で分当たり０．６ｍｌの流速で洗浄し、２８０ｎｍでの吸光度測定を介して、蛋白質が検出されなくなるまで、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び１Ｍ ＮａＣｌ含有の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を使用し、分当たり０．４ｍｌの流速で前記ＰＧＮ結合カラムから蛋白質を溶離させた。溶離された溶液中の蛋白質濃度を２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定し、蛋白質の純度及び含有量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
パススルー（pass-through）溶液及び１Ｍ ＮａＣｌ溶離溶液を前記ＰＧＮ結合カラムから得て、分子量カットオフサイズ１０，０００のメンブレンの装着された限外濾過キット（ultrafiltration kit、Ａｍｉｃｏｎ社）を使用して濃縮した。
【００５０】
透析前（図７のレーン１）及び透析後（図７のレーン２）のチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液、前記ＰＧＮ結合カラムからのパススルー溶液（図７のレーン３）、前記ＰＧＮ結合カラムからの１Ｍ ＮａＣｌ溶離溶液（図７のレーン４）、及び対照群カラムからの１Ｍ ＮａＣｌ溶離溶液（図７のレーン５）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。約２５μｇの蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングした。
対照群カラム及びＰＧＮ結合カラムの１Ｍ ＮａＣｌ溶離溶液中の蛋白質のゲルパターンを比較分析した。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、約２０ ｋＤａの蛋白質が前記ＰＧＮ結合カラムで溶離された溶液でのみ特異的に存在するということを示す（図７参照）。
【００５１】
（ｂ）トヨパールＨＷ５５Ｓ ＦＰＬＣカラムを使用した精製
（ａ）で前記ＰＧＮ結合カラムからの１Ｍ ＮａＣｌ溶離溶液を、分子量カットオフサイズ１０，０００のメンブレンの装着された限外濾過キット（ultrafiltration kit、Ａｍｉｃｏｎ社）を使用して濃縮し、濃縮されたサンプルを準備した。
ＦＰＬＣカラム（ψ１．０ｃｍｘ３０ｃｍ）をトヨパールＨＷ５５Ｓ樹脂で充填し、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ６．０）で、分当たり０．２ｍｌの流速で平衡化させた。
前記濃縮されたサンプルを、前記トヨパールＨＷ５５Ｓ ＦＰＬＣカラムにローディングし、各ピーク別に分画した。総分画物をプロファイルパターン（profile pattern）別に集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して蛋白質バンドのパターンを同定した。
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、前記分画が（ａ）の分画より、約８０％の他の蛋白質が除去された、さらに精製されたチャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質（すなわち、トランスメンブレンＰＧＮ認識蛋白質（Ｔｍ−ＰＧＲＰ））分画であることを示す。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果はまた、前記カラムからの前記チャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質の溶離が、ローディングからおよそ５５分後に始まるということを示す（図９参照）。前記よりさらに精製されたチャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質分画物を次の実験で使用した。
【００５２】
（ｃ）ヒドロキシアパタイト（hydroxyapatite）カラムを使用した精製
ＦＰＬＣカラム（ψ０．５ｃｍｘ１０ｃｍ）をリン酸基のイオン強度によって異なる分離効率を示すヒドロキシアパタイト（hydroxyapatite）樹脂で充填し、前記トヨパールＨＷ５５Ｓカラムから得た蛋白質分画を、前記ヒドロキシアパタイトカラムにローディングした。このとき、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を緩衝液Ａとして使用し、３００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を緩衝液Ｂとして使用した。前記緩衝液Ａ及びＢをリン酸塩の濃度勾配（１２０分で最大７５ｍＭ）によって、分当たり０．４ｍｌの流速で流した。ＰＧＮ依存のＰＯ活性を示す分画を集め、次の精製過程を行った。
トヨパールＨＷ５５Ｓカラムから得られた分画物のヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィの結果は、図１０に表した。
総分画物を溶離プロファイル（elution profile）のパターン別に分離及び回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して蛋白質のパターンを確認した。図１０から分かるように、Ｔｍ−ＰＧＲＰが約２４ｍＭリン酸イオンの濃度で溶離され始めた。約５４％の他の蛋白質が除去されたさらに精製されたＴｍ−ＰＧＲＰの分画物が得られ、次の精製過程で使用した。
【００５３】
（ｄ）モノ−Ｑ ＦＰＬＣカラムを使用した精製
前記ヒドロキシアパタイトカラムから分離した蛋白質からＰＧＮ認識蛋白質のみを精製するために、陰イオン交換樹脂であるモノ−Ｑ樹脂を利用し、モノ−Ｑ ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィを遂行した。緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５））及び緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ）を使用し、緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの濃度勾配によって、モノ−Ｑ ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィを遂行した。緩衝液Ｂの濃度を、次の通り順次に増加させた：最初の５分間０％、３０分間３０％、４５分間１００％。溶離された分画中の蛋白質濃度は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定して測定し、蛋白質の純度及び含有量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
ヒドロキシアパタイトカラムから得られた蛋白質分画に対するモノ−Ｑ ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィ溶離プロファイル（elution profile）は、図１１の通りである。全体分画物を溶離プロファイルのパターン別に分離及び回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して蛋白質バンドのパターンを決定した。図１１から分かるように、Ｔｍ−ＰＧＲＰが約１２０ｍＭのＮａＣｌで溶離され始めた。
【００５４】
実施例７：２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質のＮ末端部位及び３つの断片のアミノ酸配列決定
Ｎ末端配列分析のために、実施例６で精製された蛋白質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、転移緩衝液（ＣＡＰＳ １０ｍＭ、メタノール１０％）中で３００ｍＡの一定の電流で１時間電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレンに転移させた。
前記ＰＶＤＦメンブレンをＣＢＢ染色溶液（０．１％ＣＢＢ Ｒ−２５０、５０％メタノール）で染色し、脱色溶液（５０％メタノール、１０％酢酸）で脱色させ、水で数回洗浄し、減圧乾燥した。蛋白質バンドを切り、自動アミノ酸分析器に注入してＰＶＤＦメンブレン上で、ガス相（gas-phase）のアミノ酸配列分析を行った。
一方、実施例６で精製された蛋白質２５μｇを４５ｍＭ ＤＴＴで還元させ、１００ｍＭヨードアセトアミド（Iodoacetoamide）溶液でアルキル化した後、リシル−エンドペプチダーゼ（lysyl-endopeptidase）を加えた。反応混合物を３７℃で１２時間インキュベートし、ペプチド断片をＨＰＬＣ Ｃ１８カラムにローディングして精製した。精製されたペプチドのアミノ酸配列を自動アミノ酸分析器で決定した。
このようにして、電気泳動によって精製された２０ ｋＤａ蛋白質をＰＶＤＦメンブレンにブロッティングし、エドマン分解（Edman degradation）法によって、前記２０ ｋＤａ蛋白質のＮ末端部位（配列番号３、図８Ａ参照）及び３個の断片（配列番号４ないし６、図８Ｂ参照）のアミノ酸配列を決定した。
特に、ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔ分析結果は、前記２０ ｋＤａの蛋白質が多様な生物に存在する短いＰＧＮ認識蛋白質と高い配列相同性を有するということを示した。
【００５５】
実施例８：２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質のｃＤＮＡクローニング及び該ＰＧＮ認識蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドの配列分析
実施例８では、実施例７で得られた２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質の部分アミノ酸配列情報を基にしてデザインされたＤＮＡプローブを使用し、チャイロゴミムシダマシのｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。前記検索を一次スクリーニング及び二次スクリーニングに分け、前記スクリーニングはいずれも前記ＤＮＡプローブを使用してプラーク混成化（plaque hybridization）によって行った。
【００５６】
（１）ＤＮＡプローブの合成
精製された蛋白質をリシル−エンドペプチダーゼで消化させて得られたペプチド断片のうち、相対的に数が小さく、可能性のあるヌクレオチド配列を定義するアミノ酸配列を有するペプチド断片を選択した。選択されたペプチド断片を基に、５５−６５℃の適切なＴｍ（melting temperature）を有するヌクレオチド配列をＤＮＡプローブとして製作した。
前記ＤＮＡプローブをGenotech精製法（Genotech purification tool）で精製した。２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質のｃＤＮＡクローニングのために、配列番号７のヌクレオチド配列を有するＤＮＡプローブを使用した。
【００５７】
（２）宿主細胞の準備
ＬＢ／テトラサイクリンプレート上にＸＬ−１−ブルーストック（Blue stock）溶液５μｌを塗布し、３７℃で１２時間インキュベートした。ＬＢ／テトラサイクリンプレートから単一のコロニーをＬＢブロス（ｂｒｏｔｈ）５μｌ、２０％マルトーズ５０μｌ及び１Ｍ ＭｇＳＯ４ ５０μｌの混合物に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．５−１になるまで振蘯培養し、５００ ｘｇで１０分間遠心分離した。ＯＤ６００が０．５になるように沈殿物を１０ｍＭ ＭｇＳＯ４中に再懸濁した。
【００５８】
（３）レプリカ（Replica）の製造
チャイロゴミムシダマシ幼虫由来の増幅されたｃＤＮＡライブラリ・レプリカ（Replica）を１２個のプレートから取った（５，０００プラーク／プレート）。すなわち、ＸＬ−１−Blue（ＯＤ６００＝０．５）２００μｌを、５，０００プラークを生成するｃＤＮＡライブラリ溶液に加え、３７℃で１５分間振蘯培養した後、４８℃にあらかじめ加温した３．５ｍｌの軟寒天培地（top agar）と混合した。得られた混合物を迅速に数回撹拌した後、迅速にＮＺＹプレートに塗布した。前記ＮＺＹプレートを３７℃で１３時間培養してレプリカを取った。
前記ＮＺＹプレートを４℃で１時間放置して反応を終結させた。その後、コロニー／プラークスクリーンメンブレン（ＮＥＦ−９７８）を注意深く前記ＮＺＹプレートの上端に置き、注射針及び赤い油性ペンで標識した後、室温で５分間インキュベートした。第２のメンブレンを前記ＮＺＹプレートの上端に注意深く置き、黒色油性ペンで標識した後、１５分間インキュベートし、空気中で１時間以上放置して前記メンブレンを完全に乾燥させた。その後、メンブレンをアルカリ（０．５Ｎ ＮａＯＨ）で２分間処理し、５分間乾燥させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で中和させた後、空気中で乾燥させた。前記メンブレンを前記と同じ方法でアルカリで再び処理して中和させた後、メンブレンが完全に乾燥されるように室温で１時間以上放置した。その後、スクリーニングのために前記メンブレンを洗浄した。すなわち、前記メンブレンを洗浄緩衝液（３Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）に浸した後、ＳＤＳを完全に除去するために吸収紙で絞った。
【００５９】
（４）ＤＮＡプローブのキネーション（kination）
陽性クローンのスクリーニングのためのＤＮＡプローブを次の通り表示した：蒸溜水（milli−Ｑ、autoclave）２１μｌ、１０Ｘキナーゼ緩衝液１８μｌ、ＤＮＡプローブ９μｌ（６００ｐＭ）、γ−３２Ｐ−ｄＡＴＰ ９０μｌ（約０．９ ｍＣｉ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（１０ユニット／μｌ）１２μｌ（４０ユニット）をボルテックシングした後、スピンダウンさせた。
前記反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、７０℃のウォーターバス中で１０分間熱処理した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ（２０μｇ／μｌ）１０μｌを加え、前記プローブをセファローズＧ−５０カラム上で精製し、放射性同位元素が標識されたプローブのみを選択的に取った。
【００６０】
（５）予備混成化
６０℃にあらかじめ加温した予備混成化（prehybridization）溶液３０ｍｌを、メンブレンと共にビニールバッグに入れ、完全に脱気した後で密封し、６０℃で５時間インキュベートした。前記予備混成化溶液は、２０ＸＳＳＣ溶液２２．５ｍｌ、５０Ｘデンハーツ（Denhart’s）溶液３０ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌ ｓｓｓｓＤＮＡ １．５ｍｌの混合物に蒸溜水を加え、全体体積を１５０ｍｌとして製造した。
【００６１】
（６）混成化
予備混成化が終了した後、前記メンブレンをビニールバッグから取り出した。γ−３２Ｐ−ＡＴＰ−標識されたＤＮＡプローブ溶液を混成化溶液３０ｍｌに加えた（５ｎｇ ＤＮＡ／ｍｌ）。前記反応混合物を、メンブレンと共にビニールバッグに入れて脱気した後で密封した後、Ｔｍ−５℃で恒温槽で一日インキュベートした。前記ＤＮＡプローブのＴｍは、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）との水素結合を２℃にし、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）との結合を４℃にしてＤＮＡのＴｍを計算する方法であるイタクラ法則（Itakura’s rule）を利用して選定した。
前記混成化溶液は、２０ＸＳＳＣ溶液３０ｍｌ、５０Ｘ denhart’s溶液３０ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ ｓｓｓｓＤＮＡ０．７５ｍｌの混合物に蒸溜水を加えて全体体積を１５０ｍｌにして製造した。
混成化後、メンブレンをビニールバッグから取り出し、３０℃であらかじめ加温した洗浄溶液（３Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）で５分ずつ３回洗浄し、５５℃で５分間同じ洗浄液で１、２回洗浄した。その後、メンブレン上の放射線量をフィルタ当たり４００ｃｐｍほどに維持しつつ、前記メンブレンをワットマン社の３ＭＭ濾過紙上に付け、カセットに装着した。前記メンブレン上にＸ線フィルムを固定し、カセットを−７５℃で約１２時間インキュベートした後、室温で解凍させた。暗室でＸ線フィルムをメンブレンから剥がし出して現像した。Ｘ線フィルムを前記メンブレンに整列させ、Ｘ線フィルム上にレプリカを表示した。
【００６２】
（７）陽性クローンの選択
２枚のメンブレンに対するオートラジオグラフィ（autoradiography）標識を互いに整列させ、オーバーレイ（overlay）分析を行った。２枚のメンブレンで共通して検出される陽性シグナルを選択し、一次陽性クローンとして判定した。４℃に保管されたマスタープレート（master plate）上に陽性プラークをリスクリーン（rescreen）し、単一の陽性プラークを選択した。
【００６３】
（８）二次スクリーニング
一次スクリーニングによって選択された単一の陽性プラークをＬＢ液体培地で１０倍ずつ３段階で希釈した。前記希釈液１μｌを３μｌのＣＨＣｌ３含有ＳＭ緩衝液１ｍｌに入れた後、ＮＺＹプレート上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。プレート当たり１００個ほどのプラークを含有したプレートをマスタープレートとして使用した。前記マスタープレートに対し、レプリカプレーティング、ＤＮＡ固定化、プラーク混成化、及び陽性プラーク選択を前記一次スクリーニングと同じ方法で行った。二次スクリーニングにより、一次スクリーニングによって選択された前記陽性クローンが正確であることを確認した。
【００６４】
（９）ファージミド（Phagemid）の製造
二次スクリーニングによって検証された２０ ｋＤａ蛋白質の陽性クローンの力価を計算し、２Ｘ１０５個のプラークを生成すると予想される量を算出した。これを基に、ＸＬ−１−Blue（ＯＤ６００＝１．０）２００μｌ、二次スクリーニングによって確認された陽性プラークを含む溶液（２Ｘ１０５ファージ）２００μｌ、及びＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（helperphage）１μｌを５０ｍｌファルコンチューブ（falcon tube）に入れ、３７℃で１５分間インキュベートした。３ｍｌのＬＢブロスを加え、得られた懸濁液を３７℃で３時間振蘯培養した後、７０℃で２０分間熱処理し、１，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。上澄み液を１５ｍｌファルコンチューブに入れ、４℃で保管した。
【００６５】
（１０）ファージミド（Phagemid）の培養
２０ ｋＤａの蛋白質の遺伝子を含有するファージミド（phagemid）を精製するために、アンピシリン耐性部位（ampicillin resistant region）を含んでいないＳＯＬＲ細胞に対し、アンピシリン耐性部位を含むファージミドに形質転換させ、ＬＢ／アンピシリンプレートで育てた。これについて詳細に説明すれば、次の通りである。
ＳＯＬＲ細胞（ＯＤ６００＝１．０）２００μｌにＬＢブロスで１，０００倍希釈したファージミド１０μｌ及び１００μｌをそれぞれ加え、３７℃で１５分間振蘯培養した。それぞれの培養液アリコット（aliquot）５０μｌをＬＢ／アンピシリンプレートに塗布して３７℃で１２時間培養した。前記プレートから単一コロニーを取り、ＬＢブロス５ｍｌとアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）１０μｌとを含有する５０ｍｌファルコンチューブ上にローディングし、３７℃で１２時間培養した。
【００６６】
（１１）ファージミドの分離、精製及び同定
（１０）で製造された培養液を、ＤＮＡ精製キット（Miniprep kit、Quiagen社）でメーカの指示（specification）によって精製し、対象になる蛋白質の遺伝子を含有するファージミドを得た。このように得られたファージミドの純度を確認するために、ファージミドＤＮＡ０．５μｇ、ＥｃｏＲＩ ０．５μｌ（７．５Ｕ）、ＸｈｏＩ ０．５μｌ（６Ｕ）及び１０ＸＨ緩衝液１μｌを混合し、三次蒸溜水を前記混合物に加え、総体積を１０μｌにした。反応混合物を３７℃で１時間培養し、６Ｘローディング緩衝液３μｌと混合した。反応溶液アリコット１０μｌを１．５％アガロースゲル電気泳動で分析した。前記ゲルを臭化エチジウム溶液（１６０μｇ／１００ｍｌ）に１０分間浸した後、水で数回洗浄した。ＵＶ下で示されるバンドから抽出したファージミドＤＮＡの純度及び濃度を確認した。
【００６７】
（１２）ＤＮＡ配列分析のためのＰＣＲ
（１１）で得られた２０ ｋＤａ蛋白質の遺伝子を含有するファージミドＤＮＡ １μｇに三次蒸溜水を加え、総体積を１０μｌにした。ファージミドＤＮＡの３’及び５’末端と結合できるユニバーサルプライマー（universal primer）であるＴ３（配列番号：８）とＴ７（配列番号：９）とを含むPerkin Elmer社のローダミンterminator cycle sequencing ready reaction mixtureを含むＤＮＡシーケンシングキットを使用し、ＤＮＡ配列分析溶液（最終濃度３．２ｐｍｏｌｅ／μｌ）８μｌと、前記で得られた溶液とを混合した。ミネラルオイル（mineral oil）を滴加し、ＰＣＲを次の通り行った：９６℃で３０秒、５０℃で１５秒、６０℃で４分の２４サイクル。その後、スピンカラム（spin column）でＤＮＡサンプルを精製し、スピードバック（speed-vac）上で乾燥させた後、（脱イオン化ホルムアミド：ブルーデキストラン＝５：１）溶液３μｌに溶かし、９５℃で２分間熱処理した後、自動配列分析器にローディングした。
【００６８】
（１３）２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質のＤＮＡ配列分析
Sangerが開発したジデオキシ・チェーン・ターミネーション（dideoxy chain termination）法によって、市販されているＤＮＡ配列分析キット（Perkin Elmer社のローダミンterminator cycle sequencing ready reaction）を使用し、２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質のＤＮＡ配列分析を行った。前記配列分析の結果、チャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列を有すると確認された。
【００６９】
（１４）２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質の遺伝子配列及びアミノ酸配列の分析
一次スクリーニング後、２０個のプレートいずれでも陽性プラークが生成された。二次スクリーニング後、１５個の陽性クローンを得た。１．５％アガロースゲル電気泳動を行った結果、１５個の陽性クローンのうち三種の２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質の遺伝子を含有するということを確認した。それら３個のクローンの配列分析結果、前記クローンが実施例７で先に決定された部分アミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含有するということを確認した。前記ｃＤＮＡクローンそれぞれは、シグナルペプチド（signal peptide）から停止コドン（stop codon）までの１８８個のアミノ酸に該当する５６４個のヌクレオチドオープンリーディングフレーム（nucleotide open reading frame）と同定された（図１２参照）。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性化システムを示す概要図である。
【図２】ＰＯ活性測定のためのパイ分光光度分析法（Pye-spectrophotometric assay）の原理を示す図面である。
【図３】ＰＯ活性に対する天然ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、ベータ−１，３−グルカン及び合成ペプチドグリカンの効果を示すグラフである。
【図４】合成ＰＧＮによる天然ＰＧＮ依存性ＰＯ活性の阻害程度を示すグラフである。
【図５】合成ＰＧＮの濃度に対し、天然ＰＧＮ依存性ＰＯ活性の阻害程度を示すグラフである。
【図６】合成ＰＧＮの濃度に対し、アミダーゼ活性の阻害程度を示すグラフである。
【図７】透析前後のチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液、そして合成ＰＧＮが結合されたカラム及び対照群カラムから溶離された溶液を使用して行われた、硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示すイメージである。
【図８】エドマン分解（Edman degradation）を使用して決定された、合成ＰＧＮ結合カラムから溶離された２０ ｋＤａの蛋白質のＮ末端部位（Ａ）及び３個の断片（Ｂ）のアミノ酸配列を示す図面である。
【図９】トヨパールＨＷ５５Ｓカラムクロマトグラフィによるチャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質の溶離プロファイル（elution profile）を示すグラフである。
【図１０】ヒドロキシアパタイト（hydroxyapatite）カラムクロマトグラフィによるチャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質の溶離プロファイルを示すグラフである。
【図１１】モノ−Ｑ−ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィによるチャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質の溶離プロファイルを示すグラフである。
【図１２】２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質をコーディングするｃＤＮＡの配列及び前記ｃＤＮＡから発現されるアミノ酸配列を示す図面である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成ペプチドグリカンを利用し、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカンを認識する蛋白質（以下ペプチドグリカン認識蛋白質と略称する）を分離する方法、該方法により分離されたペプチドグリカン認識蛋白質、該ペプチドグリカン認識蛋白質をコーディングするポリヌクレオチド、及び該ペプチドグリカン認識蛋白質を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの生物体は、病原菌や寄生虫のような外部の有害環境因子から常に攻撃を受けているが、免疫システムによって前記外部の有害環境因子に対して自身を防御できる。免疫システムは、外部の異物を認識する方法によって、先天性（innate）と後天性（adaptive）との免疫システムに区分される。先天性免疫システムのみを有している無脊椎動物と異なり、人間のような脊椎動物は、先天性免疫システム及び後天性免疫システムをいずれも有している。脊椎動物でのみ観察される後天性免疫システムは、体内に侵入した有害異物（いわゆる抗原）それぞれの構造を認識し、抗原に特異的な抗体を選択的に生成することによって、持続的な免疫反応を誘導する記憶依存性免疫システムである。一方、脊椎動物及び無脊椎動物いずれでも観察される先天性免疫システムは、病原菌に共通して存在する要素（すなわち、パターン）を認識して迅速に反応する記憶非依存性免疫システムである。何年か前まででも、前記先天性免疫システムは、後天性免疫システムが抗体を生成するまで侵入した外部物質から生体を一次的に防御する、後天性免疫システムほど特異的ではなく、かつあまり発達していない防御メカニズムであると認識されてきた。
【０００３】
しかし、分子レベルで免疫システムについての活発な研究が最近数年間行われてきており、先天性免疫システムは、後天性免疫システムの活性化にも重要な役割を行うということが明らかになり、先天性免疫システムの重要性が認識されている[Carroll, M. C. et al, Curr. Opin. Immunol. 10, 36-48(1998); Ruslan, M. et al, Cell 91, 295-298(1997)]。
かような事実は、先天性免疫システムの調節が後天性免疫システムにおいて変化を引き起こし得ることを示唆する。従って、先天性免疫システムに対する新しい概念的アプローチが疾病の治療及び新薬の開発側面で要求される。最近、先天性免疫システムが多くの国内外研究者らによって分子レベルで活発に研究されている[Medzhitov, R. et al, Nature 388, 394-397(1997)]。
【０００４】
先天性免疫システムに対する研究は、主に先天性免疫システムを有する無脊椎動物を使用して行われてきた。特に、昆虫が先天性免疫システムに対する多くの研究で使われてきた。分子レベルでの最近の研究結果は、昆虫及び人間における先天性免疫系間に類似性が存在するということを示し、従って先天性免疫システムに対する研究が多様な昆虫を使用して活発に進められている[Medzhitov, R. et al,(1997) Nature 388, 394-397(1997); Hultmark, D. (1994), Nature 367, 116-117(1994); Wasserman, S. A. Mol. Biol. Cell. 4, 767-771(1993))]。
【０００５】
昆虫の免疫システムは、細胞性免疫反応と体液性免疫反応とに分けられる。体液性免疫反応は、外部物質の侵入に対応し、体液で抗菌性蛋白質の分泌、侵入した外部物質における特定糖を認識するレクチンの誘導、メラニン生成等に関連すると知られているプロ・フェノールオキシダーゼ（以下、ｐｒｏ−ＰＯと称する）の活性化などを含む。
【０００６】
昆虫でのｐｒｏ−ＰＯ活性化システムにかかわる研究結果によれば、セリンプロテイナーゼ（serine proteinase）阻害剤がフェノールオキシダーゼ（ＰＯ）の活性を選択的に抑制するということが明らかになった[Ashida, M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 113, 562-568(1983)]。ｐｒｏ−ＰＯは、セリンプロテイナーゼ性質を有するｐｒｏ−ＰＯ活性化因子（ＰＰＡＦｓ）によって媒介されるｐｒｏ−ＰＯカスケードによって活性化されるということが報告されている[Aspan A. et al, Insect Biochem., 21, 363-373(1991)]。また、前記ＰＰＡＦｓによって媒介されるｐｒｏ−ＰＯカスケードは、真菌細胞壁の構成成分であるベータ−１，３−グルカン[Kwon, T. H. et al, Mol. Cells. 7, 90-97(1997); Saul, S. et al, Archs. Insect Biochem. Physiol. 7, 91-103(1988); Ashida, M., Bombyxi mori, Insect Biochem. 11, 57-65(1981)]、または細菌細胞壁の構成成分であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）及びペプチドグリカン（ＰＧＮ）[Saul, S. et al, Archs. Insect Biochem. Physiol. 7, 91-103(1988); Ashida, M., Bombyxi mori, Insect Biochem. 11, 57-65(1981); Pye, A. E., Nature 251, 610-613(1974)]などの、いわゆるパターン（pattern）によって開始されるということが報告されている。
【０００７】
一般的にＰＯは、不活性の前酵素（チモーゲン）として存在する。ＰＯが活性化されれば、ＰＯは、ジフェノールのキノンへの酸化を触媒してメラニンを生成する。ＰＯは、分子内に銅を含むと知られている。特に、昆虫のＰＯは、昆虫表皮の褐変（browning）及び硬化（sclerotization）、傷治癒のための傷部位からの体液漏出、及び侵入する病原菌に対する生体の保護のような防御メカニズムにおいて重要な役割を行うと考えられる。
【０００８】
昆虫の防御メカニズムと関連したｐｒｏ−ＰＯは、これまでの数十年間多くの研究者によって活発に研究されてきたが、１９９５年になって初めてキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、カイコガ（Bombyx mori）、タバコスズメガ（Manduca sexta）の三種の昆虫幼虫からのｐｒｏ−ＰＯが分離及び精製され、そのアミノ酸配列が究明されるまで、ｐｒｏ−ＰＯの分離、精製または配列分析が可能ではなかった[Saul S. et al, Archs. Insect Biochem. Physiol., 5, 1-11(1987); Fujimoto K. et al,, PNAS, 92, 7769-7773; Kawabata T. et al,, PNAS, 92, 7774-7778(1995)] 。
【０００９】
昆虫の先天性免疫システムに関連する天然のパターン認識蛋白質が同定され、ｐｒｏ−ＰＯカスケードにおけるそれらの生物学的機能が部分的に同定された[Girardin SE, et al. J Biol Chem. 278: 803283(2003); Hugot JP et al, Curr Opin Immunol. 15: 593597(2003)]。また、β−１，３−グルカン認識蛋白質がコウチュウ目に属するチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液から分離及び同定され、前記β−１，３−グルカン認識蛋白質と前記ｐｒｏ−ＰＯカスケードとの相関関係が報告された。また、β−１，３−グルカン認識蛋白質が韓国産のチョウセンクロコガネ（Holotrichia diomphalia）の幼虫の体液から分離及び同定され、β−１，３−グルカン認識蛋白質の生物学的機能が報告された[Lee MH, et al, J Biol Chem. 279(5):3218-27(2000); Zhang R et al, J Biol Chem. 278(43):42072-9.(2003)]。
【００１０】
最近、前記同定されたパターン認識蛋白質のうち、チョウセンクロコガネ幼虫の体液から分離されたＰＧＮ−認識蛋白質（ＰＧＲＰｓ）が、ＰＧＮではない、真菌のパターンであるβ−１，３−グルカンを特異的に認識し、ｐｒｏ−ＰＯカスケードを活性化させるということが報告された[Lee MH, et al, J Biol Chem. 279(5):3218-27(2000)]。かような結果は、天然のパターン認識蛋白質の分子メカニズム及びｐｒｏ−ＰＯカスケードの活性化メカニズムの相関関係がまだ明確に究明されていないということを示す。
【００１１】
チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液のｐｒｏ−ＰＯカスケードは、真菌のパターンであるβ−１，３−グルカンによって活性化されると報告された。また、β−１，３−グルカンを特異的に認識する蛋白質がチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液に存在することが発見された。かような結果は、真菌感染検出用の診断試薬の開発に対して新しい可能性を提示する[Zhang R et al, J Biol Chem. 278(43):42072-9(2003)]。
【００１２】
ＰＯ活性化のためのカスケード経路を含むＰＯ活性化システムは、病原菌あるいは外部物質の侵入またはホストの血液細胞の脱顆粒化に反応して活性化される内部因子によって容易に活性化され、ｐｒｏ−ＰＯをＰＯに変換させることによって、カテコールアミン類からメラニンを形成する。従って、前記ＰＯ活性化システムを誘発する（ＰＧＮ及びβ−１，３−グルカンのような）パターンを特異的に認識するパターン認識蛋白質を分離し難い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
前記の問題点の観点から、本発明者らは、ＰＧＮ−認識蛋白質と結合できるが、ＰＯ活性化の下位（subsequent）カスケードは活性化されられない合成ＰＧＮを利用し、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からフェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性化システムに関与するペプチドグリカン（ＰＧＮ）認識蛋白質の分離方法を開発した。
従って、本発明は、合成ＰＧＮを使用し、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からＰＧＮ認識蛋白質を分離する方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からＰＧＮ認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質分画を分離する方法を提供する。
本発明はまた、前記方法を使用して分離されたＰＧＮ認識蛋白質及び前記ＰＧＮ認識蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、前記ＰＧＮ認識蛋白質を含むＰＧＮ検出キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一様態によって、（ａ）下記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択された一つ以上の合成ＰＧＮが結合された樹脂でカラムを充填して親和性クロマトグラフィカラムを準備する段階と、（ｂ）チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用する段階と、（ｃ）移動相（mobile phase）を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用し、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離されたＰＧＮ認識蛋白質含有溶液を得る段階と、（ｄ）前記溶離された溶液からＰＧＮ認識蛋白質を精製する段階とを含む、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカン（ＰＧＮ）認識蛋白質を分離する方法が提供される：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
式中、Ｐｒはプロピルである。
【００１６】
本発明の他の様態によって、（ａ）前記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択された一つ以上の合成ＰＧＮが結合された樹脂でカラムを充填して親和性クロマトグラフィカラムを準備する段階と、（ｂ）チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用する段階と（ｃ）洗浄溶液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用し、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離されたＰＧＮ認識蛋白質を除外した他のパターン認識蛋白質の溶液を得る段階と、（ｄ）前記溶離された溶液からＰＧＮ認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質の分画を精製する段階とを含む、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からＰＧＮ認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質分画を分離する方法が提供される。
【００１７】
本発明のさらに他の様態によって、前記方法を使用して分離されたＰＧＮ認識蛋白質、及び前記ＰＧＮ認識蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドが提供される。
本発明のさらに他の様態によって、前記ＰＧＮ認識蛋白質を含むＰＧＮ検出キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の例示的具現例を示す下記添付図面を参照しつつ、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明は、合成ＰＧＮを使用してチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカン（ＰＧＮ）認識蛋白質を分離する方法を提供する。前記合成ＰＧＮは、下記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択され、化学式３の化合物がさらに望ましい：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
式中、Ｐｒはプロピルである。
【００１９】
前記合成ＰＧＮは、グラム陽性菌の天然ペプチドグリカンとその構造が類似している。前記合成ＰＧＮ及び天然のＰＧＮは、ＰＧＮ認識蛋白質に競争的に結合する。すなわち、前記合成ＰＧＮは、ＰＧＮ認識蛋白質に結合することは可能であるが、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性化のための下位（subsequent）カスケードを活性化させられない。従って、前記合成ＰＧＮは、天然のＰＧＮの競争的抑制剤として作用する。
【００２０】
本発明によるＰＧＮ認識蛋白質の分離方法は、前記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択された一つ以上の合成ＰＧＮの結合された樹脂でカラムを充填し、親和性クロマトグラフィカラムを準備する段階を含む。前記樹脂は、セファローズ、セファデックスなどであって、セファローズ樹脂が望ましい。
【００２１】
本発明によるＰＧＮ認識蛋白質の分離方法は、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液を前記で準備された親和性クロマトグラフィカラムに適用する段階を含む。この段階で、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液中のＰＧＮ認識蛋白質が前記親和性クロマトグラフィカラム内の合成ＰＧＮに結合される。
【００２２】
本発明によるＰＧＮ認識蛋白質の分離方法は、移動相（mobile phase）を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用し、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離されたペプチドグリカン認識蛋白質含有溶液を得る段階を含む。前記移動相は、ＥＤＴＡ及びＮａＣｌを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液であって、望ましくは、１Ｍ ＮａＣｌ及び３ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）でありうる。
【００２３】
本発明によるペプチドグリカン認識蛋白質分離方法は、前記溶離された溶液からＰＧＮ認識蛋白質を精製する段階を含む。すなわち、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離された溶液中の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥなどで分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるＰＧＮ認識蛋白質含有の分画を精製する。
【００２４】
前記ＰＧＮ認識蛋白質の精製は、当業界に公知された多様な精製方法、例えばサイズ排除（size-excluision）クロマトグラフィ、イオン濃度勾配クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィなどを使用して遂行することができる。ＰＧＮ認識蛋白質の精製効率を向上させるために、前記溶離された溶液は、前記精製前に濃縮させることができる。
本発明の一具現例によって、前記ＰＧＮ認識蛋白質の精製は、前記溶離された溶液のサイズ排除カラムクロマトグラフィ、イオン濃度勾配カラムクロマトグラフィ及びイオン交換カラムクロマトグラフィの順次的実行によって遂行されうる。このとき、前記サイズ排除カラムクロマトグラフィ、前記イオン濃度勾配カラムクロマトグラフィ及び前記イオン交換カラムクロマトグラフィは、それぞれトヨパール（Toyopearl）Ｈｗ５５Ｓカラム、ヒドロキシアパタイト（hydroxyapatite）カラム及びモノ−ＱＦＰＬＣカラム上で遂行されうる。
【００２５】
本発明はまた、（ａ）前記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択された一つ以上の合成ＰＧＮが結合された樹脂でカラムを充填して親和性クロマトグラフィカラムを準備する段階と、（ｂ）チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用する段階と、（ｃ）洗浄溶液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用し、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離されたＰＧＮ認識蛋白質を除外した他のパターン認識蛋白質の溶液を得る段階と、（ｄ）前記溶離された溶液からＰＧＮ認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質の分画を精製する段階とを含む、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からＰＧＮ認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質分画を分離する方法を提供する。
【００２６】
段階（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）は、前述のＰＧＮ認識蛋白質の分離方法の各段階と類似した方法で遂行されうる。段階（ｃ）で使われる前記洗浄溶液は、ＥＤＴＡ含有Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）であって、望ましくは、３ｍＭ ＥＤＴＡ含有の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）でありうる。
本発明はまた、前記ＰＧＮ認識蛋白質の分離方法を使用して分離されたＰＧＮ認識蛋白質を提供する。本発明の一具現例によって、前記ＰＧＮ認識蛋白質は、配列番号１のアミノ酸配列を有することができる。
【００２７】
本発明はまた、前記ＰＧＮ認識蛋白質を分離する方法をコーディングするポリヌクレオチドを提供する。本発明の一具現例によって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列を有することができる。
本発明はまた、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液から由来するＰＧＮ認識蛋白質を使用し、サンプル中のＰＧＮ検出用キットを提供する。
サンプル中のＰＧＮは、バクテリアの細胞壁から由来しうる。従って、前記キットを使用すれば、サンプル中のバクテリアの存在が迅速であって便利に検出されうる。本発明の他の一具現例によって、前記ＰＧＮ認識蛋白質は、配列番号１のアミノ酸配列を有することができる。
以下、実施例を介して本発明についてさらに詳細に説明する。下記実施例は、単に本発明について説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００２８】
実施例１：チャイロゴミムシダマシの幼虫の体液採取
チャイロゴミムシダマシの幼虫をソウル大公園の昆虫飼育室から得て飼育した。以下の実験に使用するために、幼虫が約２ｃｍを超える大きさに育つまで室温（２５℃）で麦ぬかとキャベツとを前記幼虫に食べさせた。
前記幼虫（平均重さ、０．１ｇ／幼虫）に対して氷上で低温麻酔を施した。２５Ｇ注射針が装着された５ｍｌ滅菌注射器に脱凝集緩衝液（ＮａＣｌ １５ｍＭ、クエン酸三ナトリウム８３ｍＭ、クエン酸２６ｍＭ及びＥＤＴＡ ２０ｍＭ；ｐＨ５．０）を充填した。
前記脱凝集緩衝液１．４ｍｌを滅菌されたエッペンドルフチューブに加え、注射針で幼虫の頭の第１節を刺し、前記幼虫から流出される体液を前記エッペンドルフチューブに入れた。１つのチューブ当たり１５の幼虫から流出された体液を集めた。
【００２９】
実施例２：天然ＰＧＮまたはβ−１，３−グルカンの準備
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びルテウス菌（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）由来のＰＧＮは、Ｆｌｕｋａ社から、β−１，３−グルカン（Curdlan）は、和光純薬工業株式会社（日本）から購入した。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＭ．ｌｕｔｅｕｓ由来のＰＧＮを超音波破砕した。このように得られた水溶性ＰＧＮを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で処理して１０％のＰＧＮ溶液を得て、反応溶液では、１μｇ ＰＧＮの含有量で使用した。
【００３０】
実施例３：合成ＰＧＮの製造
（１）アリル６−Ｏ−ベンジル−４−（３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−２−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニルアミノ）−β−Ｄ−グルコピラノシル）−３−Ｏ−（（Ｒ）−１−（エトキシカルボニル）エチル）−２−デオキシ−グルコピラノシド（化合物４）の製造
−１５℃で無水ジクロロメタン中に、Ｎ−Ｔｒｏｃ−グルコサミニルトリクロロアセトイミデート供与体（化合物２）（２６．０ｇ、３８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ムラミル受容体（化合物３）（１７．０ｇ、３０ｍｍｏｌ）及びメンブレン・スパニング４Ａファミリー（ＭＳ４Ａ）の混合物にトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）（３４０μｌ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。
【００３１】
【表１】
【００３２】
反応混合物を−１５℃で１０分間撹拌した。反応溶液を冷却されたＮａＨＣＯ３飽和水溶液（３０ｍＬ）でクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）し、ＣＨＣｌ３（２５０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａＨＣＯ３（６０ｍＬ）及び食塩水（６０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（６００ｇ、トルエン：ＥｔＯＡｃ＝１０：１）で精製し、標題の化合物（２９．０ｍｇ、８８％）を淡黄色固体で得た：
ESI-TOF-MS (positive) m/z 1119.2 [M + Na]+;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.45-7.29 (15H, m, (C6H5)-CH2-), 5.85-5.78 (1H, m, -CH2-CH=CH2), 5.57 (1H, s, Ph-CH=), 5.28-5.13 (3H, m, H-1, -CH2-CH=CH2), 4.89-4.59 (10H, m, CCl3-CH2-OCO-, CH3-CH2-OCO-, Ph-CH2-), 4.43-4.39 (1H, m, H-6'), 4.26-4.04 (5H, m, Lac-αH, Ph-CH2-, H-1'. -CH2-CH=CH2), 3.98-3,93 (2H, m, -CH2-CH=CH2, H-3), 3.77-3.56 (6H, m, H-2, H-4, H-4', H-6, H-6'), 3.43-3.41 (2H, m, H-2', H-5), 3.25-3.21 (2H, m, H-3, H-5'), 1.34-1.25 (6H, m, Lac-CH3, CH3-CH2-OCO).実測値: C, 51.42; H, 4.90; N, 2.60. C47H54Cl6N2O15として計算値: C, 51.33; H, 4,95; N, 2.55%。
【００３３】
（２）ジサッカライド１−Ｏ−トリクロロアセトイミデート（化合物１２）の製造
無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中の化合物４（３．０ｇ、２．７ｍｍｏｌ）の溶液を脱気し、Ｈ２活性化された［Ｉｒ（ｃｏｄ）（ＭｅＰｈ２Ｐ）２］ＰＦ６（２３ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で窒素大気下で１時間撹拌した後、無水ＴＨＦ（３ｍＬ）中のＨ２活性化された［Ｉｒ（ｃｏｄ）（ＭｅＰｈ２Ｐ）２］ＰＦ６（２３ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を室温で窒素大気下で１時間撹拌し、ヨード（６９０ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）及び水（１０ｍＬ）を加えた。反応混合物をさらに１０分間撹拌し、Ｎａ２ＳＯ３水溶液（５％、１００ｍＬ）をすぐに加えた。得られた反応溶液をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ２水溶液（５％、５０ｍＬｘ２）、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬｘ２）、食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（１８０ｇ、トルエン：ＥｔＯＡｃ＝４：１）で精製し、標題の化合物（２．７２ｍｇ、９３％）を淡黄色固体で得た：
[α]D23 = +8.4 (c 1.00, CHCl3)；
ESI-MS (positive) m/z = 1079.0[M + Na]+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ= 7.54.7.27 (m, 15H, (C6H5)-CH2-), 5.60 (br.s, 1H, H-1), 5.57 (s, 1H, Ph-CH=), 4.89-4.60 (m, 8H, CCl3-CH2-OCO-, CH3-CH2-OCO-, Ph-CH2-), 4.43-4.39 (m, 1H, H-6'''), 4.31-3.91 (m, 4H, Ph-CH2-, H-1', Lac-αH), 3.95-3.91 (m, 1H, H-3), 3.82-3.63 (m, 6H, H-2, H-4, H-6, H-4', H-6'), 3.43-3.41 (m, 2H, H-2', H-5), 3.22-3.21 (m, 2H, H-3', H-5'), 1.35.1.27 (m, 6H, Lac-Me, CH3-CH2-OCO). 実測値: C, 51.68; H, 5.33; N, 2.35. C44H50Cl6N2O15として計算値: C, 51.24; H, 5.12; N, 2.54%。
【００３４】
（３）４’−Ｏ−ジサッカライド（化合物１３）の製造
化合物４（１．５ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ３ＣＮ（１３ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミンボラン（１５０ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）溶液を得た。ボラントリフルオライドジエチルエテレート（９６０ｍｇ、６．８０ｍｍｏｌ）を前記トリエチルアミンボラン溶液に０℃で滴加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、氷で冷却させた（ice-cooled）ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬ）でクエンチング（quenching）し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬｘ２）で抽出した。有機層を１０％クエン酸水溶液（１５ｍＬｘ４）、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１５０ｍＬ）及び食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（１８０ｇ、トルエン：ＥｔＯＡｃ＝４：１）で精製し、標題の化合物（１．１３ｇ、７３％）を無色固体で得た：
[α]D23 = +25.6 (c 1.00, CHCl3); ESI-TOF-MS (positive) m/z = 1121.6 [M + Na]+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ= 7.43-7.27 (15H,m,(C6H5)-CH2-), 5.85-5.79 (1H, m, -CH2-CH=CH2), 5.26-5.13 (3H, m, -CH2-CH=CH2, H-1), 4.86-4.50 (9H, m, CCl3-CH2-OCO-, CH3-CH2-OCO-, Ph-CH2-), 4.33-4.04 (5H, m, Ph-CH2-, Lac-αH, H-1', -CH2-CH=CH2), 3.97-3.57 (10H, m, -CH2-CH=CH2, H-3, H-4, H-6, H-3', H-4', H-6'), 3.46-3.36 (2H, m, H-2', H-5), 3.27-3.23 (1H, m, H-5'), 1.29-1,20 (6H, m, Lac-CH3, CH3-CH2-OCO). 実測値: C, 51.68; H, 5.33; N, 2.35. C47H56Cl6N2O15として計算値: C, 51.24; H, 5.12; N, 2.54%。
【００３５】
（４）完全に保護されたテトラサッカライド（化合物１４）の製造
−１５℃で、無水ジクロロメタン（７５ｍＬ）中の化合物１２（２．７ｇ、３８ｍｍｏｌ）、化合物１３（１．６５ｇ、３０ｍｍｏｌ）及びＭＳ４Ａの混合物にＴＭＳＯＴｆ（１８μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を−１５℃で１０分間撹拌した。反応溶液を氷で冷却させた（ice-cooled）ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬ）でクエンチング（quenching）し、ＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａＨＣＯ３（６０ｍＬｘ２）及び食塩水（６０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（３００ｇ、トルエン：ＥｔＯＡｃ＝１０：１）で精製し、標題の化合物（２．３３ｇ、７９％）を淡黄色固体で得た：
[α]D23 = -1.7 (c 1.00, CHCl3); ESI-TOF-MS (positive) m/z = 2159.0 [M + Na]+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.51-7.27 (30H, m, (C6H5)-CH2-), 5.86-5.76 (1H, m, -CH2-CH=CH2), 5.56 (1H, s, Ph-CH=), 5.25-4.98 (4H, m, -CH2-CH=CH2, Ph-CH2-, H-1), 4.88-4.33 (17H, m, CCl3-CH2-OCO-, CH3-CH2-OCO-, Ph-CH2-), 4.32-3.90 (12H, m, Ph-CH2-, Lac-αH, H-1'', H-1'', H-1''', H-6''', -CH2-CH=CH2), 3.87-3.01 (24H, m, Ph-CH2-, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-2', H-3', H-4', H-5', H-6', H-2'', H-3'', H-4'', H-5'', H-6'', H-2''', H-3''', H-4''', H-5''', H-6''' ), 1.32-1,27 (12H, m, Lac-CH3,CH3-CH2-OCO)。
【００３６】
（５）２−Ｎ−アセチル−テトラサッカライド（化合物２１）の製造
Ｚｎ−Ｃｕ（１ｇのＺｎから製造される）を化合物１４（１．０５ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）の酢酸溶液に加え、反応混合物を室温で１時間撹拌した。不溶性物質を濾過して除去し、濾液を真空濃縮した。残留溶媒をトルエン（５ｍＬｘ３）で共蒸発（co-evaporation）させて除去した。粗生成物をピリジン（７ｍＬ）及び無水酢酸（７ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、真空濃縮した。残留溶媒をトルエン（５ｍＬｘ３）と共に共蒸発させて除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（８０ｇ、ＣＨ３Ｃｌ：アセトン＝３：１）で精製し、標題の化合物（７５０ｍｇ、ｑｕａｎｔ．）を白色固体で得た：
[α]D23 = -7.4(c 1.00, CH3Cl); ESI-TOF-MS(positive) m/z=1609.2[M+H+], 1631.6[M+Na]+。
【００３７】
（６）遊離カルボン酸を有するテトラサッカライド（化合物２３）の製造
ＬｉＯＨ（２８ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を、化合物２１（１８０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）のジオキサン：ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（２：４：１、１．２ｍＬ）溶液に加え、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応溶液をＤｏｗｅｘ Ｈ＋（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ−ｘ８ ２００−４００メッシュＨ形態、ダウケミカル）で中和し、ＨＰ−２０カラム（２ｃｍｘ４０ｃｍ）に適用した。有機及び無機の塩をＨ２Ｏ（３００ｍＬ）で溶離して除去し、メタノールで溶離して標題化合物（１７０ｍｇ、ｑｕａｎｔ．）を白色固体で回収した：
ESI-TOF-MS(positive) m/z=1575.1[M+Na]+ 。
【００３８】
（７）保護されたテトラサッカライドジペプチド（化合物２５）の製造
ＷＳＣＩ・ＨＣｌ（３７ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４８μｌ、０．４７ｍｍｏｌ）を、化合物２３（１２２ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（３３．５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１４ｍＬ）溶液に０℃で加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈し、濾過して不溶性物質を除去した。濾液を濃縮し、ＣＨＣｌ３に溶解させた。得られたＣＨＣｌ３溶液を、クエン酸（１Ｍ、２０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）及び食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（２０ｇ、ＣＨＣｌ３：メタノール＝２０：１）で精製し、標題の化合物（１４３ｍｇ、８６％）を白色固体で得た：
ESI-TOF-MS (positive) m/z =2153.52[M + Na]+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ =7.52-7.15 (40H, m), 5.58 (1H, m), 5.57 (1H, s), 5.56-5.07 (6H, m), 4.86 (1H, d, J =12.3 Hz), 4.83 (1H, d, J =3.7Hz), 4.74(1H.dd, J =12.1 Hz), 4.66-4.57 (4H, m), 4.35-4.24 (8H, m), 4.09-3.92 (6H, m), 3.83-3.59 (12H, m), 3.53-3.43 (10H, m), 3.39-3.35 (1H, m), 3.34-3.20 (1H, m), 2.56-2.41 (4H, m), 2.17-2.03 (7H, m), 1.93 (3H, s), 1.88 (3H, s), 1.73 (3H, s), 1.57-1.53 (3H, m), 1.43 (1H, d, J =6.9 Hz), 1.37-1.33 (3H, m), 1.26 (1H, m). 実測値: C, 62.03; H, 6.63; N, 6.38. C113H138N10O31 ・3H20として計算値: C, 62.08; H, 6.64; N, 6.41%。
【００３９】
（８）テトラペプチド（化合物２７）の製造
標題の化合物を化合物２５の製造方法と類似した方法で製造した： ESI-TOF-MS(positive) m/z=1400.53[(M+2H)2+]。
【００４０】
（９）テトラサッカライドジペプチド（化合物３２、化学式１で表示される化合物）の製造
無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中の化合物２５（３００ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）溶液を脱気し、Ｈ２活性化された［Ｉｒ（ｃｏｄ）（ＭｅＰｈ２Ｐ）２］ＰＦ６（２３ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（３ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を室温で窒素大気下で１時間撹拌し、Ｈ２活性化された［Ｉｒ（ｃｏｄ）（ＭｅＰｈ２Ｐ）２］ＰＦ６（２３ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（３ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を室温で窒素大気下で１時間撹拌し、ヨード（３５ｍｇ、０．１４２ｍｍｏｌ）及び水（０．５ｍＬ）を加えた。反応混合物をさらに１０分間撹拌し、水性Ｎａ２ＳＯ３（５％、１００ｍＬ）でクエンチング（quenching）し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ２（５％、１０ｍＬｘ２）、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬｘ２）及び食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（２０ｇ、トルエン：ＥｔＯＡｃ＝５：１）で精製し、１−遊離されたテトラサッカライド（２６０ｍｇ、８８％）を淡黄色固体で得た： ESI-TOF-MS(positive) m/z=2113.6[M+Na]+ 。
【００４１】
酢酸中に存在する炭素上の水酸化パラジウム（１００ｍｇ）を１−遊離されたテトラサッカライド（８６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の酢酸（３ｍＬ）溶液に加え、反応混合物をＨ２（２０ａｔｍ）下で一日撹拌した。パラジウム触媒を濾過して除去して濾液を濃縮し、Ｈ２Ｏから凍結乾燥し、標題の化合物（３９ｍｇ、７０％）を白色固体で得た：
ESI-TOF-MS (positive) m/z = 685.3 [M-2H]2-; HRMS-ESI FT-ICR(negative): (M) C54H88N10O31としての計算値, 1372.561; 実測値1372.555; 1H NMR ((600 MHz, D2O): d = 5.16-5.15 (d, J = 3.0 Hz, 1H, H-1), 4.46-4.42 (m, 3H), 4.36-4.32 (m, 2H), 4.30-4.27 (m, 2H, iGln--CH), 4.26-4.19 (m, 2H), 3.86-3.30 (m, 24H), 2.31 (m, 4H, iGln-γ-CH2), 2.12-2.03 (m, 4H, iGln-β-CH2), 1.96-1.95 (s, 12H, NHC(O)CH3 X 4), 1.37-1.35 (m, 6H, Ala-β-CH3), 1.31-1.28 (m, 6H, Lac-β-CH3)。
【００４２】
（１０）テトラサッカライドトリペプチド（化合物３３、化学式２で表示される化合物）の製造
水酸化パラジウム（１００ｍｇ）の酢酸溶液を化合物２７（９５ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）の酢酸（３ｍＬ）溶液に加え、反応混合物をＨ２（２０ａｔｍ）下で一日撹拌した。反応の経過を薄膜クロマトグラフィ（ＴＬＣ）分析でモニターし、脱保護化が終了するまで水素化分解（hydrogenolysis）を持続した。パラジウム触媒をセライトパッド（cerite pad）を介して濾過して除去し、濾液を濃縮した。残渣をアセトニトリル−Ｈ２Ｏから凍結乾燥し、標題の化合物（３９ｍｇ、５０％）を白色粉末で得た：
ESI-TOF-MS (negative) m/z = 834.5 [M-2H]2-; HRMS-ESI FT-ICR (negative): (M) C69H118N14O33として計算値, 1670.798; 実測値, 1670.817; 1H NMR (500 MHz, D2O): δ= 4.86-4.80 (m, 1H, H-1) 4.46-4.40 (m, 3H), 4.36-4.05 (m, 8H, Lac-α-CH, Ala-α-CH, iGln-α-CH, Lys-α-CH), 3.86-3.30 (m, 26H), 3.00-2.90 (t, J = 11.4, 4H, Lys-ε-CH2), 2.37-2.31 (t, J = 9.5, 4H, iGln-γ-CH2), 2.09-2.0 (m, 4H, iGln-β-CH2), 2.02-1.81 (m, 18H, NHC(O)CH3 X 4, Lys-β-CH X 2, Lys-δ-CH X 2), 1.78-1.69 (m, 2H, Lys-δ-CH X 2), 1.58-1.70 (m, 4H, Lys-γ-CH2 X 2), 1.61-1.4 (m, 2H, Propyl CH3-CH2), 1.40-1.35 (m, 6H, Ala-β-CH3), 1.31-1.28 (m, 6H, Lac-β-CH3), 0.85-0.80 (t, J = 9.3, 3H, Propyl CH3)。
【００４３】
（１１）テトラサッカライドテトラペプチド（化合物３５、化学式３で表示される化合物）の製造
標題の化合物を化合物２７から化合物３３の製造方法と類似した方法で製造した：
ESI-TOF-MS (negative) m/z = 905.1 [M-2H]2-; HRMS-ESI FT-ICR (negative): (M) C75H128N16O35として計算値, 1812.873; 実測値, 1812.896; 1H NMR (500 MHz, D2O): δ= 4.86-4.80 (m, 1H, H-1), 4.46-4.40 (m, 3H), 4.36-3.95 (m, 10H, Lac-α-CH, Ala-α-CH, D-iGln-α-CH, Lys-α-CH), 3.86-3.30 (m, 26H), 3.00-2.90 (t, J = 7.5, 4H, Lys-ε-CH2), 2.40-2.31 (t, 4H, iGln-γ-CH2), 2.09-1.82 (m, 22H, iGln-β-CH2 X 2, NHC(O)CH3 X 4, Lys-β-CH2 X 2, Lys-δ-CH X 2), 1.78-1.4 (m, 8H, Lys-δ-CH X 2, Lys-γ-CH2 X 2, Propyl CH3-CH2), 1.40-1.22 (m, 12H, Ala-β-CH3 X 4, Lac-β-CH3 X 2), 0.85-0.80 (m, 3H, Propyl CH3)。
【００４４】
（１２）テトラサッカライドペンタペプチド（化合物３７、化学式４で表示される化合物）の製造
標題の化合物を化合物２７から化合物３３の製造方法と類似した方法で製造した：
ESI-TOF-MS (negative)m/z = 976.64 [M-2H]2-;;HRMSESI FT-ICR (negative): (M) C81H138N18O37として計算値, 1954.947; 実測値, 1954.939;1H NMR (500 MHz, D2O): δ = 4.86-4.80 (m, 1H, H-1), 4.46-4.40 (m, 3H), 4.36-4.0 (m, 12H, Lac-α-CH, Ala-α-CH, iGln-α-CH, Lys-α-CH), 3.86-3.30 (m, 26H), 2.95-2.91 (t, J = 7.5, 4H, Lys-ε-CH2), 2.40-2.31 (t, J = 7.0, 4H, iGln-γ-CH2), 2.09-1.82 (m, 22H, iGln-β-CH2 X 2, NHC(O)CH3 X 4, Lys-β-CH2 X 2, Lys-δ-CH X 2), 1.78-1.4 (m, 8H, Lys-δ-CH X 2, Lys-γ-CH2 X 2, Propyl CH3-CH2), 1.40-1.22 (m, 12H, Ala--CH3 X 6, Lac-β-CH3 X 2), 0.85-0.80 (m, 3H, Propyl CH3)。
【００４５】
実施例４：ＰＯ活性化に対する天然または合成ＰＧＮの影響評価
本実施例では、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液内でのＰＯの活性化に対する天然または合成ＰＧＮの影響を評価した。
ＰＯ活性を基質溶液（４−メチルカテコール、及び４−ヒドロキシプロリンエチルエステルのＨＣｌ溶液）を使用し、Pye分光光度測定法（Pye-spectrophotometric method）によって分析した。４−メチルカテコールは、ＰＯによってキノンに酸化され、これは、４−ヒドロキシプロリンエチルエステルＨＣｌ溶液との非酵素的反応によって、５２０ｎｍで最大の吸光度を有する安定した化合物である４−（４’−ヒドロキシル−２’−カルブエトキシ−１’−ピロリン）−５−メチル−ｏ−ベンゾキノンに転換される（図２参照）。
１０％β−１，３−グルカン溶液１０μｌ（１μｇ）、１０％Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＰＧＮ溶液１０μｌ（１μｇ）、１０％Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ ＰＧＮ溶液１０μｌ（１０ｎｇ）及び１０％合成ＰＧＮ（化学式１ないし４の化合物それぞれ）溶液１０μｌ（１μｇ）それぞれを、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液３０μｌ（蛋白質３５０μｇ）と共に３０℃で５分間インキュベートした。その後、４−メチルカテコール（２５０ｍＭ）４μｌ、４−ヒドロキシプロリンエチルエステルＨＣｌ溶液（６２．５ｍＭ）１６μｌ及び１Ｍ ＣａＣｌ２（１０ｍＭ）５μｌを加えた。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を最終容積が５００μｌになるように加えた。反応混合物を３０℃でインキュベートした後、反応混合物の吸光度を５２０ｎｍで測定した（図３参照）。
【００４６】
β−１，３−グルカン溶液、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＰＧＮ溶液、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ ＰＧＮ溶液は、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液中でＰＧＮ依存のｐｒｏ−ＰＯカスケードを活性化させたが、相対的に簡単な構造を有する合成ＰＧＮは、ＰＧＮ依存のｐｒｏ−ＰＯカスケードを活性化させられないことが発見された（図３参照）。
一方、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＰＧＮ １μｇ及び合成ＰＧＮ １μｇの存在下でＰＯ活性を測定した。ＰＧＮ活性の阻害程度は合成ＰＧＮによって異なるが、合成ＰＧＮは、ＰＧＮ依存のＰＯ活性を抑制することが発見された（図４参照）。特に、Ｎ−アセチルムラミン酸に４個のアミノ酸が連結された化学式３の化合物３５が天然のＰＧＮ依存のＰＯ活性の最も強力な競争的阻害剤として機能した。かような結果は、化学式３の合成ＰＧＮがチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液に存在するＰＧＮ認識蛋白質によって最適に認識されるということを示す。
また、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＰＧＮ １μｇ存在下で、化学式３の合成ＰＧＮを増加させつつ追加し（０．２、０．４、０．８及び１．５μｇ）、ＰＯ活性を測定した。ＰＯ活性が合成ＰＧＮ濃度依存の様相で阻害されることが発見された（図５参照）。
【００４７】
実施例５：アミダーゼ活性に対する天然または合成ＰＧＮの影響評価
１０％のグラム陽性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＰＧＮ溶液（最終濃度：１μｇ）１０μｌ及び１０％の合成ＰＧＮ（化学式３の化合物３５）溶液１０μlを、基質として４０μＭのトリプシンＭＣＡ（ｔ−ブチルオキシカルボニル−ベンジル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−セリル−Ｌ−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド；Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）存在下で３０℃でインキュベートした後、蛍光分光光度計（ＵＶ−１６０Ａモデル、（株）島津製作所）を使用し、３８０ｎｍ（励起波長）及び４６０ｎｍ（放射波長）で蛍光を測定した。
その結果、アミダーゼ活性がＰＯ活性と同じ阻害パターンを示すということが発見された（図６参照）。かような結果は、合成ＰＧＮが前記ＰＧＮ認識のみに関与するということを示す。
【００４８】
実施例６：チャイロゴミムシダマシ幼虫からのＰＧＮ認識蛋白質の精製
（１）合成ＰＧＮ結合カラムの準備
まず、ＣＮＢｒセファローズ４Ｂ樹脂を１ｍＭ ＨＣｌで活性化させた。その後、化学式３の合成ＰＧＮ２０ｍｇの結合緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ）（ｐＨ８．３）溶液を前記ＣＮＢｒセファローズ４Ｂ樹脂に適用した。得られた混合物を室温で１時間インキュベートし、ブロッキング緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液、ｐＨ８．０）と共に室温で２時間撹拌し、０．１Ｍアセテート緩衝液（ｐＨ４．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ）及び０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ）でそれぞれ３回洗浄し、ＰＧＮ結合のセファローズ４Ｂ樹脂を製造した。
合成ＰＧＮが前記ＣＮＢｒセファローズ４Ｂ樹脂に結合されているか否か確認するために、合成ＰＧＮ結合緩衝液溶液、及び前記結合緩衝液と前記ＣＮＢｒセファローズ４Ｂ樹脂との中で前記合成ＰＧＮ溶液をインキュベートした後で得られた溶液に対し、２１８ｎｍで吸光度測定を行い、吸光度低下率（％）を計算した。その結果、前記合成ＰＧＮ及び前記ＣＮＢｒセファローズ４Ｂ樹脂の結合反応によって、８９％の収率でＰＧＮ結合の樹脂が生成されることによって、ＰＧＮ（３２ｍｌ）結合カラムが製造された。
一方、合成ＰＧＮを使用していないことを除いては、前記と同じ方法で対照群カラムを製造した。
【００４９】
（２）２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質の分離及び精製
（ａ）合成ＰＧＮ結合カラムを使用した精製
０．５Ｍ ＤＦＰ溶液を抗凝集緩衝液（ｐＨ５．０）で採取されたチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液１６０ｍｌに最終濃度が２ｍＭになるように加えた。反応混合物を４℃で２時間インキュベートし、３ｍＭ ＥＤＴＡ含有の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）で５℃で１２時間透析した。
開放カラム（ψ３ｃｍｘ２５ｃｍ）をＰＧＮ結合セファローズ樹脂約３０ｍｌで充填し、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液の透析された溶液約１６０ｍｌを分当たり０．６ｍｌの流速でＰＧＮ結合カラムにローディングした。
前記ＰＧＮ結合カラムを３ｍＭ ＥＤＴＡ含有５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）で分当たり０．６ｍｌの流速で洗浄し、２８０ｎｍでの吸光度測定を介して、蛋白質が検出されなくなるまで、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び１Ｍ ＮａＣｌ含有の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）を使用し、分当たり０．４ｍｌの流速で前記ＰＧＮ結合カラムから蛋白質を溶離させた。溶離された溶液中の蛋白質濃度を２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定し、蛋白質の純度及び含有量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
パススルー（pass-through）溶液及び１Ｍ ＮａＣｌ溶離溶液を前記ＰＧＮ結合カラムから得て、分子量カットオフサイズ１０，０００のメンブレンの装着された限外濾過キット（ultrafiltration kit、Ａｍｉｃｏｎ社）を使用して濃縮した。
【００５０】
透析前（図７のレーン１）及び透析後（図７のレーン２）のチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液、前記ＰＧＮ結合カラムからのパススルー溶液（図７のレーン３）、前記ＰＧＮ結合カラムからの１Ｍ ＮａＣｌ溶離溶液（図７のレーン４）、及び対照群カラムからの１Ｍ ＮａＣｌ溶離溶液（図７のレーン５）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。約２５μｇの蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングした。
対照群カラム及びＰＧＮ結合カラムの１Ｍ ＮａＣｌ溶離溶液中の蛋白質のゲルパターンを比較分析した。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、約２０ ｋＤａの蛋白質が前記ＰＧＮ結合カラムで溶離された溶液でのみ特異的に存在するということを示す（図７参照）。
【００５１】
（ｂ）トヨパールＨＷ５５Ｓ ＦＰＬＣカラムを使用した精製
（ａ）で前記ＰＧＮ結合カラムからの１Ｍ ＮａＣｌ溶離溶液を、分子量カットオフサイズ１０，０００のメンブレンの装着された限外濾過キット（ultrafiltration kit、Ａｍｉｃｏｎ社）を使用して濃縮し、濃縮されたサンプルを準備した。
ＦＰＬＣカラム（ψ１．０ｃｍｘ３０ｃｍ）をトヨパールＨＷ５５Ｓ樹脂で充填し、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ６．０）で、分当たり０．２ｍｌの流速で平衡化させた。
前記濃縮されたサンプルを、前記トヨパールＨＷ５５Ｓ ＦＰＬＣカラムにローディングし、各ピーク別に分画した。総分画物をプロファイルパターン（profile pattern）別に集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して蛋白質バンドのパターンを同定した。
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、前記分画が（ａ）の分画より、約８０％の他の蛋白質が除去された、さらに精製されたチャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質（すなわち、トランスメンブレンＰＧＮ認識蛋白質（Ｔｍ−ＰＧＲＰ））分画であることを示す。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果はまた、前記カラムからの前記チャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質の溶離が、ローディングからおよそ５５分後に始まるということを示す（図９参照）。前記よりさらに精製されたチャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質分画物を次の実験で使用した。
【００５２】
（ｃ）ヒドロキシアパタイト（hydroxyapatite）カラムを使用した精製
ＦＰＬＣカラム（ψ０．５ｃｍｘ１０ｃｍ）をリン酸基のイオン強度によって異なる分離効率を示すヒドロキシアパタイト（hydroxyapatite）樹脂で充填し、前記トヨパールＨＷ５５Ｓカラムから得た蛋白質分画を、前記ヒドロキシアパタイトカラムにローディングした。このとき、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を緩衝液Ａとして使用し、３００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を緩衝液Ｂとして使用した。前記緩衝液Ａ及びＢをリン酸塩の濃度勾配（１２０分で最大７５ｍＭ）によって、分当たり０．４ｍｌの流速で流した。ＰＧＮ依存のＰＯ活性を示す分画を集め、次の精製過程を行った。
トヨパールＨＷ５５Ｓカラムから得られた分画物のヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィの結果は、図１０に表した。
総分画物を溶離プロファイル（elution profile）のパターン別に分離及び回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して蛋白質のパターンを確認した。図１０から分かるように、Ｔｍ−ＰＧＲＰが約２４ｍＭリン酸イオンの濃度で溶離され始めた。約５４％の他の蛋白質が除去されたさらに精製されたＴｍ−ＰＧＲＰの分画物が得られ、次の精製過程で使用した。
【００５３】
（ｄ）モノ−Ｑ ＦＰＬＣカラムを使用した精製
前記ヒドロキシアパタイトカラムから分離した蛋白質からＰＧＮ認識蛋白質のみを精製するために、陰イオン交換樹脂であるモノ−Ｑ樹脂を利用し、モノ−Ｑ ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィを遂行した。緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５））及び緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ）を使用し、緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの濃度勾配によって、モノ−Ｑ ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィを遂行した。緩衝液Ｂの濃度を、次の通り順次に増加させた：最初の５分間０％、３０分間３０％、４５分間１００％。溶離された分画中の蛋白質濃度は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定して測定し、蛋白質の純度及び含有量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
ヒドロキシアパタイトカラムから得られた蛋白質分画に対するモノ−Ｑ ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィ溶離プロファイル（elution profile）は、図１１の通りである。全体分画物を溶離プロファイルのパターン別に分離及び回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して蛋白質バンドのパターンを決定した。図１１から分かるように、Ｔｍ−ＰＧＲＰが約１２０ｍＭのＮａＣｌで溶離され始めた。
【００５４】
実施例７：２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質のＮ末端部位及び３つの断片のアミノ酸配列決定
Ｎ末端配列分析のために、実施例６で精製された蛋白質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、転移緩衝液（ＣＡＰＳ １０ｍＭ、メタノール１０％）中で３００ｍＡの一定の電流で１時間電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレンに転移させた。
前記ＰＶＤＦメンブレンをＣＢＢ染色溶液（０．１％ＣＢＢ Ｒ−２５０、５０％メタノール）で染色し、脱色溶液（５０％メタノール、１０％酢酸）で脱色させ、水で数回洗浄し、減圧乾燥した。蛋白質バンドを切り、自動アミノ酸分析器に注入してＰＶＤＦメンブレン上で、ガス相（gas-phase）のアミノ酸配列分析を行った。
一方、実施例６で精製された蛋白質２５μｇを４５ｍＭ ＤＴＴで還元させ、１００ｍＭヨードアセトアミド（Iodoacetoamide）溶液でアルキル化した後、リシル−エンドペプチダーゼ（lysyl-endopeptidase）を加えた。反応混合物を３７℃で１２時間インキュベートし、ペプチド断片をＨＰＬＣ Ｃ１８カラムにローディングして精製した。精製されたペプチドのアミノ酸配列を自動アミノ酸分析器で決定した。
このようにして、電気泳動によって精製された２０ ｋＤａ蛋白質をＰＶＤＦメンブレンにブロッティングし、エドマン分解（Edman degradation）法によって、前記２０ ｋＤａ蛋白質のＮ末端部位（配列番号３、図８Ａ参照）及び３個の断片（配列番号４ないし６、図８Ｂ参照）のアミノ酸配列を決定した。
特に、ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔ分析結果は、前記２０ ｋＤａの蛋白質が多様な生物に存在する短いＰＧＮ認識蛋白質と高い配列相同性を有するということを示した。
【００５５】
実施例８：２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質のｃＤＮＡクローニング及び該ＰＧＮ認識蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドの配列分析
実施例８では、実施例７で得られた２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質の部分アミノ酸配列情報を基にしてデザインされたＤＮＡプローブを使用し、チャイロゴミムシダマシのｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。前記検索を一次スクリーニング及び二次スクリーニングに分け、前記スクリーニングはいずれも前記ＤＮＡプローブを使用してプラーク混成化（plaque hybridization）によって行った。
【００５６】
（１）ＤＮＡプローブの合成
精製された蛋白質をリシル−エンドペプチダーゼで消化させて得られたペプチド断片のうち、相対的に数が小さく、可能性のあるヌクレオチド配列を定義するアミノ酸配列を有するペプチド断片を選択した。選択されたペプチド断片を基に、５５−６５℃の適切なＴｍ（melting temperature）を有するヌクレオチド配列をＤＮＡプローブとして製作した。
前記ＤＮＡプローブをGenotech精製法（Genotech purification tool）で精製した。２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質のｃＤＮＡクローニングのために、配列番号７のヌクレオチド配列を有するＤＮＡプローブを使用した。
【００５７】
（２）宿主細胞の準備
ＬＢ／テトラサイクリンプレート上にＸＬ−１−ブルーストック（Blue stock）溶液５μｌを塗布し、３７℃で１２時間インキュベートした。ＬＢ／テトラサイクリンプレートから単一のコロニーをＬＢブロス（ｂｒｏｔｈ）５μｌ、２０％マルトーズ５０μｌ及び１Ｍ ＭｇＳＯ４ ５０μｌの混合物に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．５−１になるまで振蘯培養し、５００ ｘｇで１０分間遠心分離した。ＯＤ６００が０．５になるように沈殿物を１０ｍＭ ＭｇＳＯ４中に再懸濁した。
【００５８】
（３）レプリカ（Replica）の製造
チャイロゴミムシダマシ幼虫由来の増幅されたｃＤＮＡライブラリ・レプリカ（Replica）を１２個のプレートから取った（５，０００プラーク／プレート）。すなわち、ＸＬ−１−Blue（ＯＤ６００＝０．５）２００μｌを、５，０００プラークを生成するｃＤＮＡライブラリ溶液に加え、３７℃で１５分間振蘯培養した後、４８℃にあらかじめ加温した３．５ｍｌの軟寒天培地（top agar）と混合した。得られた混合物を迅速に数回撹拌した後、迅速にＮＺＹプレートに塗布した。前記ＮＺＹプレートを３７℃で１３時間培養してレプリカを取った。
前記ＮＺＹプレートを４℃で１時間放置して反応を終結させた。その後、コロニー／プラークスクリーンメンブレン（ＮＥＦ−９７８）を注意深く前記ＮＺＹプレートの上端に置き、注射針及び赤い油性ペンで標識した後、室温で５分間インキュベートした。第２のメンブレンを前記ＮＺＹプレートの上端に注意深く置き、黒色油性ペンで標識した後、１５分間インキュベートし、空気中で１時間以上放置して前記メンブレンを完全に乾燥させた。その後、メンブレンをアルカリ（０．５Ｎ ＮａＯＨ）で２分間処理し、５分間乾燥させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で中和させた後、空気中で乾燥させた。前記メンブレンを前記と同じ方法でアルカリで再び処理して中和させた後、メンブレンが完全に乾燥されるように室温で１時間以上放置した。その後、スクリーニングのために前記メンブレンを洗浄した。すなわち、前記メンブレンを洗浄緩衝液（３Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）に浸した後、ＳＤＳを完全に除去するために吸収紙で絞った。
【００５９】
（４）ＤＮＡプローブのキネーション（kination）
陽性クローンのスクリーニングのためのＤＮＡプローブを次の通り表示した：蒸溜水（milli−Ｑ、autoclave）２１μｌ、１０Ｘキナーゼ緩衝液１８μｌ、ＤＮＡプローブ９μｌ（６００ｐＭ）、γ−３２Ｐ−ｄＡＴＰ ９０μｌ（約０．９ ｍＣｉ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（１０ユニット／μｌ）１２μｌ（４０ユニット）をボルテックシングした後、スピンダウンさせた。
前記反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、７０℃のウォーターバス中で１０分間熱処理した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ（２０μｇ／μｌ）１０μｌを加え、前記プローブをセファローズＧ−５０カラム上で精製し、放射性同位元素が標識されたプローブのみを選択的に取った。
【００６０】
（５）予備混成化
６０℃にあらかじめ加温した予備混成化（prehybridization）溶液３０ｍｌを、メンブレンと共にビニールバッグに入れ、完全に脱気した後で密封し、６０℃で５時間インキュベートした。前記予備混成化溶液は、２０ＸＳＳＣ溶液２２．５ｍｌ、５０Ｘデンハーツ（Denhart’s）溶液３０ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌ ｓｓｓｓＤＮＡ １．５ｍｌの混合物に蒸溜水を加え、全体体積を１５０ｍｌとして製造した。
【００６１】
（６）混成化
予備混成化が終了した後、前記メンブレンをビニールバッグから取り出した。γ−３２Ｐ−ＡＴＰ−標識されたＤＮＡプローブ溶液を混成化溶液３０ｍｌに加えた（５ｎｇ ＤＮＡ／ｍｌ）。前記反応混合物を、メンブレンと共にビニールバッグに入れて脱気した後で密封した後、Ｔｍ−５℃で恒温槽で一日インキュベートした。前記ＤＮＡプローブのＴｍは、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）との水素結合を２℃にし、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）との結合を４℃にしてＤＮＡのＴｍを計算する方法であるイタクラ法則（Itakura’s rule）を利用して選定した。
前記混成化溶液は、２０ＸＳＳＣ溶液３０ｍｌ、５０Ｘ denhart’s溶液３０ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ ｓｓｓｓＤＮＡ０．７５ｍｌの混合物に蒸溜水を加えて全体体積を１５０ｍｌにして製造した。
混成化後、メンブレンをビニールバッグから取り出し、３０℃であらかじめ加温した洗浄溶液（３Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）で５分ずつ３回洗浄し、５５℃で５分間同じ洗浄液で１、２回洗浄した。その後、メンブレン上の放射線量をフィルタ当たり４００ｃｐｍほどに維持しつつ、前記メンブレンをワットマン社の３ＭＭ濾過紙上に付け、カセットに装着した。前記メンブレン上にＸ線フィルムを固定し、カセットを−７５℃で約１２時間インキュベートした後、室温で解凍させた。暗室でＸ線フィルムをメンブレンから剥がし出して現像した。Ｘ線フィルムを前記メンブレンに整列させ、Ｘ線フィルム上にレプリカを表示した。
【００６２】
（７）陽性クローンの選択
２枚のメンブレンに対するオートラジオグラフィ（autoradiography）標識を互いに整列させ、オーバーレイ（overlay）分析を行った。２枚のメンブレンで共通して検出される陽性シグナルを選択し、一次陽性クローンとして判定した。４℃に保管されたマスタープレート（master plate）上に陽性プラークをリスクリーン（rescreen）し、単一の陽性プラークを選択した。
【００６３】
（８）二次スクリーニング
一次スクリーニングによって選択された単一の陽性プラークをＬＢ液体培地で１０倍ずつ３段階で希釈した。前記希釈液１μｌを３μｌのＣＨＣｌ３含有ＳＭ緩衝液１ｍｌに入れた後、ＮＺＹプレート上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。プレート当たり１００個ほどのプラークを含有したプレートをマスタープレートとして使用した。前記マスタープレートに対し、レプリカプレーティング、ＤＮＡ固定化、プラーク混成化、及び陽性プラーク選択を前記一次スクリーニングと同じ方法で行った。二次スクリーニングにより、一次スクリーニングによって選択された前記陽性クローンが正確であることを確認した。
【００６４】
（９）ファージミド（Phagemid）の製造
二次スクリーニングによって検証された２０ ｋＤａ蛋白質の陽性クローンの力価を計算し、２Ｘ１０５個のプラークを生成すると予想される量を算出した。これを基に、ＸＬ−１−Blue（ＯＤ６００＝１．０）２００μｌ、二次スクリーニングによって確認された陽性プラークを含む溶液（２Ｘ１０５ファージ）２００μｌ、及びＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（helperphage）１μｌを５０ｍｌファルコンチューブ（falcon tube）に入れ、３７℃で１５分間インキュベートした。３ｍｌのＬＢブロスを加え、得られた懸濁液を３７℃で３時間振蘯培養した後、７０℃で２０分間熱処理し、１，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。上澄み液を１５ｍｌファルコンチューブに入れ、４℃で保管した。
【００６５】
（１０）ファージミド（Phagemid）の培養
２０ ｋＤａの蛋白質の遺伝子を含有するファージミド（phagemid）を精製するために、アンピシリン耐性部位（ampicillin resistant region）を含んでいないＳＯＬＲ細胞に対し、アンピシリン耐性部位を含むファージミドに形質転換させ、ＬＢ／アンピシリンプレートで育てた。これについて詳細に説明すれば、次の通りである。
ＳＯＬＲ細胞（ＯＤ６００＝１．０）２００μｌにＬＢブロスで１，０００倍希釈したファージミド１０μｌ及び１００μｌをそれぞれ加え、３７℃で１５分間振蘯培養した。それぞれの培養液アリコット（aliquot）５０μｌをＬＢ／アンピシリンプレートに塗布して３７℃で１２時間培養した。前記プレートから単一コロニーを取り、ＬＢブロス５ｍｌとアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）１０μｌとを含有する５０ｍｌファルコンチューブ上にローディングし、３７℃で１２時間培養した。
【００６６】
（１１）ファージミドの分離、精製及び同定
（１０）で製造された培養液を、ＤＮＡ精製キット（Miniprep kit、Quiagen社）でメーカの指示（specification）によって精製し、対象になる蛋白質の遺伝子を含有するファージミドを得た。このように得られたファージミドの純度を確認するために、ファージミドＤＮＡ０．５μｇ、ＥｃｏＲＩ ０．５μｌ（７．５Ｕ）、ＸｈｏＩ ０．５μｌ（６Ｕ）及び１０ＸＨ緩衝液１μｌを混合し、三次蒸溜水を前記混合物に加え、総体積を１０μｌにした。反応混合物を３７℃で１時間培養し、６Ｘローディング緩衝液３μｌと混合した。反応溶液アリコット１０μｌを１．５％アガロースゲル電気泳動で分析した。前記ゲルを臭化エチジウム溶液（１６０μｇ／１００ｍｌ）に１０分間浸した後、水で数回洗浄した。ＵＶ下で示されるバンドから抽出したファージミドＤＮＡの純度及び濃度を確認した。
【００６７】
（１２）ＤＮＡ配列分析のためのＰＣＲ
（１１）で得られた２０ ｋＤａ蛋白質の遺伝子を含有するファージミドＤＮＡ １μｇに三次蒸溜水を加え、総体積を１０μｌにした。ファージミドＤＮＡの３’及び５’末端と結合できるユニバーサルプライマー（universal primer）であるＴ３（配列番号：８）とＴ７（配列番号：９）とを含むPerkin Elmer社のローダミンterminator cycle sequencing ready reaction mixtureを含むＤＮＡシーケンシングキットを使用し、ＤＮＡ配列分析溶液（最終濃度３．２ｐｍｏｌｅ／μｌ）８μｌと、前記で得られた溶液とを混合した。ミネラルオイル（mineral oil）を滴加し、ＰＣＲを次の通り行った：９６℃で３０秒、５０℃で１５秒、６０℃で４分の２４サイクル。その後、スピンカラム（spin column）でＤＮＡサンプルを精製し、スピードバック（speed-vac）上で乾燥させた後、（脱イオン化ホルムアミド：ブルーデキストラン＝５：１）溶液３μｌに溶かし、９５℃で２分間熱処理した後、自動配列分析器にローディングした。
【００６８】
（１３）２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質のＤＮＡ配列分析
Sangerが開発したジデオキシ・チェーン・ターミネーション（dideoxy chain termination）法によって、市販されているＤＮＡ配列分析キット（Perkin Elmer社のローダミンterminator cycle sequencing ready reaction）を使用し、２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質のＤＮＡ配列分析を行った。前記配列分析の結果、チャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列を有すると確認された。
【００６９】
（１４）２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質の遺伝子配列及びアミノ酸配列の分析
一次スクリーニング後、２０個のプレートいずれでも陽性プラークが生成された。二次スクリーニング後、１５個の陽性クローンを得た。１．５％アガロースゲル電気泳動を行った結果、１５個の陽性クローンのうち三種の２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質の遺伝子を含有するということを確認した。それら３個のクローンの配列分析結果、前記クローンが実施例７で先に決定された部分アミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含有するということを確認した。前記ｃＤＮＡクローンそれぞれは、シグナルペプチド（signal peptide）から停止コドン（stop codon）までの１８８個のアミノ酸に該当する５６４個のヌクレオチドオープンリーディングフレーム（nucleotide open reading frame）と同定された（図１２参照）。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性化システムを示す概要図である。
【図２】ＰＯ活性測定のためのパイ分光光度分析法（Pye-spectrophotometric assay）の原理を示す図面である。
【図３】ＰＯ活性に対する天然ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、ベータ−１，３−グルカン及び合成ペプチドグリカンの効果を示すグラフである。
【図４】合成ＰＧＮによる天然ＰＧＮ依存性ＰＯ活性の阻害程度を示すグラフである。
【図５】合成ＰＧＮの濃度に対し、天然ＰＧＮ依存性ＰＯ活性の阻害程度を示すグラフである。
【図６】合成ＰＧＮの濃度に対し、アミダーゼ活性の阻害程度を示すグラフである。
【図７】透析前後のチャイロゴミムシダマシ幼虫の体液、そして合成ＰＧＮが結合されたカラム及び対照群カラムから溶離された溶液を使用して行われた、硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示すイメージである。
【図８】エドマン分解（Edman degradation）を使用して決定された、合成ＰＧＮ結合カラムから溶離された２０ ｋＤａの蛋白質のＮ末端部位（Ａ）及び３個の断片（Ｂ）のアミノ酸配列を示す図面である。
【図９】トヨパールＨＷ５５Ｓカラムクロマトグラフィによるチャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質の溶離プロファイル（elution profile）を示すグラフである。
【図１０】ヒドロキシアパタイト（hydroxyapatite）カラムクロマトグラフィによるチャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質の溶離プロファイルを示すグラフである。
【図１１】モノ−Ｑ−ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィによるチャイロゴミムシダマシ幼虫のＰＧＮ認識蛋白質の溶離プロファイルを示すグラフである。
【図１２】２０ ｋＤａのＰＧＮ認識蛋白質をコーディングするｃＤＮＡの配列及び前記ｃＤＮＡから発現されるアミノ酸配列を示す図面である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）下記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択された一つ以上の合成ペプチドグリカンが結合された樹脂でカラムを充填して親和性クロマトグラフィカラムを準備する段階と、（ｂ）チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用する段階と、（ｃ）移動相（mobile phase）を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用し、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離されたペプチドグリカン認識蛋白質含有溶液を得る段階と、（ｄ）前記溶離された溶液からペプチドグリカン認識蛋白質を精製する段階とを含む、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカン認識蛋白質を分離する方法：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
式中、Ｐｒはプロピルである。
【請求項２】
前記合成ペプチドグリカンが化学式３で表示される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｃ）の前記移動相がＮａＣｌ及びＥＤＴＡを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｄ）が前記溶離された溶液のサイズ排除カラムクロマトグラフィ、イオン濃度勾配カラムクロマトグラフィ及びイオン交換カラムクロマトグラフィを順に遂行することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サイズ排除カラムクロマトグラフィがトヨパールＨｗ５５Ｓ ＦＰＬＣカラム上で遂行されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記イオン濃度勾配カラムクロマトグラフィがヒドロキシアパタイトカラム上で遂行されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記イオン交換カラムクロマトグラフィがモノ−ＱＦＰＬＣカラム上で遂行されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）下記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択された一つ以上の合成ペプチドグリカンが結合された樹脂でカラムを充填して親和性クロマトグラフィカラムを準備する段階と、（ｂ）チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用する段階と、（ｃ）洗浄溶液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用し、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離されたペプチドグリカン認識蛋白質を除外した他のパターン認識蛋白質の溶液を得る段階と、（ｄ）前記溶離された溶液からペプチドグリカン認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質の分画を精製する段階とを含む、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカン認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質分画を分離する方法：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
式中、Ｐｒはプロピルである。
【請求項９】
請求項１から請求項７のうちいずれか１項に記載の方法により分離されたペプチドグリカン認識蛋白質。
【請求項１０】
配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項９に記載のペプチドグリカン認識蛋白質。
【請求項１１】
請求項９に記載のペプチドグリカン認識蛋白質をコーディングするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号２のヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１から請求項７のうちいずれか１項に記載の方法により分離されたペプチドグリカン認識蛋白質を含むペプチドグリカン検出用キット。
【請求項１４】
前記ペプチドグリカン認識蛋白質が配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１３に記載のペプチドグリカン検出用キット。
【請求項１】
（ａ）下記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択された一つ以上の合成ペプチドグリカンが結合された樹脂でカラムを充填して親和性クロマトグラフィカラムを準備する段階と、（ｂ）チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用する段階と、（ｃ）移動相（mobile phase）を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用し、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離されたペプチドグリカン認識蛋白質含有溶液を得る段階と、（ｄ）前記溶離された溶液からペプチドグリカン認識蛋白質を精製する段階とを含む、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカン認識蛋白質を分離する方法：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
式中、Ｐｒはプロピルである。
【請求項２】
前記合成ペプチドグリカンが化学式３で表示される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｃ）の前記移動相がＮａＣｌ及びＥＤＴＡを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｄ）が前記溶離された溶液のサイズ排除カラムクロマトグラフィ、イオン濃度勾配カラムクロマトグラフィ及びイオン交換カラムクロマトグラフィを順に遂行することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サイズ排除カラムクロマトグラフィがトヨパールＨｗ５５Ｓ ＦＰＬＣカラム上で遂行されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記イオン濃度勾配カラムクロマトグラフィがヒドロキシアパタイトカラム上で遂行されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記イオン交換カラムクロマトグラフィがモノ−ＱＦＰＬＣカラム上で遂行されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）下記化学式１ないし４で表示される化合物からなる群から選択された一つ以上の合成ペプチドグリカンが結合された樹脂でカラムを充填して親和性クロマトグラフィカラムを準備する段階と、（ｂ）チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用する段階と、（ｃ）洗浄溶液を前記親和性クロマトグラフィカラムに適用し、前記親和性クロマトグラフィカラムから溶離されたペプチドグリカン認識蛋白質を除外した他のパターン認識蛋白質の溶液を得る段階と、（ｄ）前記溶離された溶液からペプチドグリカン認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質の分画を精製する段階とを含む、チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカン認識蛋白質を除外したパターン認識蛋白質分画を分離する方法：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
式中、Ｐｒはプロピルである。
【請求項９】
請求項１から請求項７のうちいずれか１項に記載の方法により分離されたペプチドグリカン認識蛋白質。
【請求項１０】
配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項９に記載のペプチドグリカン認識蛋白質。
【請求項１１】
請求項９に記載のペプチドグリカン認識蛋白質をコーディングするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号２のヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１から請求項７のうちいずれか１項に記載の方法により分離されたペプチドグリカン認識蛋白質を含むペプチドグリカン検出用キット。
【請求項１４】
前記ペプチドグリカン認識蛋白質が配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１３に記載のペプチドグリカン検出用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００９−５２４４１３（Ｐ２００９−５２４４１３Ａ）
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５０２０８（Ｐ２００８−５５０２０８）
【出願日】平成１８年１月１３日（２００６．１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／０００１５４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８１０６７
【国際公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５００３０９９１９）ユーハン・コーポレイション (16)
【氏名又は名称原語表記】ＹＵＨＡＮ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月１３日（２００６．１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／０００１５４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８１０６７
【国際公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５００３０９９１９）ユーハン・コーポレイション (16)
【氏名又は名称原語表記】ＹＵＨＡＮ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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