テアフラビンの酵素合成法
【課題】従来法より高効率でテアフラビンを得ることができるテアフラビンの製造方法を提供すること。
【解決手段】
ピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用させることによって従来法より高効率でテアフラビンを得ることができる。酵素反応条件（使用する酵素、酵素量、反応系濃度、反応ｐＨ、反応温度、反応時間）を調整することにより、カテコール型カテキン使用量の３５％以上をテアフラビンに変換することができる。
【解決手段】
ピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用させることによって従来法より高効率でテアフラビンを得ることができる。酵素反応条件（使用する酵素、酵素量、反応系濃度、反応ｐＨ、反応温度、反応時間）を調整することにより、カテコール型カテキン使用量の３５％以上をテアフラビンに変換することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原料使用量に対して高効率で簡便に各種テアフラビンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
紅茶は茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の葉を発酵することで製造され、世界中で飲用される。紅茶中には緑茶の代表的なポリフェノール成分であるカテキン類が酸化重合して生成した様々な重合ポリフェノールが多量に存在する。テアフラビン類はその中で最も知られている化合物であり、紅茶中には主に、テアフラビン（ＴＦ１、一般式（IV）のＲ１およびＲ２は水素原子）、テアフラビン ３−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ａ、一般式（IV）のＲ１はガロイル基、Ｒ２は水素原子）、テアフラビン ３’−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ｂ、一般式（IV）のＲ１は水素原子、Ｒ２はガロイル基）、テアフラビン ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（ＴＦ３、一般式（IV）のＲ１およびＲ２はガロイル基）の４種類が存在する。これら４種のテアフラビンの構造を一般式（IV）に示した。
【０００３】
【化４】
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示す）
【０００４】
上記した４種類のテアフラビンは、緑茶中に含まれるカテキン類が、茶葉中に存在する酵素（ポリフェノールオキシダーゼおよび／またはペルオキシダーゼ）を触媒として酸化されることにより生成する。ＴＦ１はエピガロカテキン（ＥＧＣ、一般式（Ｖ）のＲ３は水酸基、Ｒ４は水素原子）とエピカテキン（ＥＣ、一般式（Ｖ）のＲ３、Ｒ４はともに水素原子）、ＴＦ２Ａはエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ、一般式（Ｖ）のＲ３は水酸基、Ｒ４はガロイル基）とＥＣ、ＴＦ２ＢはＥＧＣとエピカテキンガレート（ＥＣｇ、一般式（Ｖ）のＲ３は水素原子、Ｒ４はガロイル基）、そしてＴＦ３は、ＥＧＣｇとＥＣｇからそれぞれ生成される。カテキン類の構造を一般式（Ｖ）に示した。
【０００５】
【化５】
（式中、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を示し、Ｒ４はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環の２位および３位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【０００６】
テアフラビンは紅茶中の赤色色素成分として飲用時の水色や渋味などに重要な役割を担う成分として知られてきたが、近年、その抗酸化活性や糖吸収抑制（非特許文献１、２）、抗菌活性（非特許文献３）など種々の生理活性を有することが明らかとなり、多くの研究がなされている。
【０００７】
テアフラビンを取得する方法としては、紅茶葉から抽出する方法、フェリシアン化カリウムを用いた化学的合成法（非特許文献４）、ペルオキシダーゼを用いた酵素的合成法（非特許文献５、特許文献１）、タンナーゼ処理した生茶葉のスラリーを発酵させてテアフラビンを豊富に含む茶抽出物を製造する方法（特許文献２）、ペルオキシダーゼ活性を有する植物細胞培養液を利用した合成法（特許文献３）、ポリフェノールオキシダーゼを用いて酵素的に合成する方法（特許文献４）などたくさんの手法が提案されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−５０４１６８号公報
【特許文献２】特開平１１−２２５６７２号公報
【特許文献３】特開２００７−１４３４６１号公報
【特許文献４】特開２００５−５２３２４２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｉｗａ Ｈｏｎｄａ， Ｙｕｋｉｈｉｋｏ Ｈａｒａ， Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，ｐｐ．１２３（１９９３）
【非特許文献２】Ｙｕｋｉｈｉｋｏ Ｈａｒａ， Ｍｉｗａ Ｈｏｎｄａ， Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，ｐｐ．１９３９（１９９０）
【非特許文献３】堀内 善信 他、感染症誌、６６、ｐｐ．５９９（１９９２）
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｎｏｒｉ Ｔａｋｉｎｏ， Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｉｍａｇａｗａ， Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７，ｐｐ．３１９−３２１（１９６３）
【非特許文献５】Ｓｈｅｎｇｍｉｎ Ｓａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，ｐｐ．４５９−４６７（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
テアフラビンの合成について記載された先行文献を検証すると、まず、紅茶葉から抽出する方法では、茶葉中に含まれるテアフラビン総量は茶葉重量に対して多くても１％程度と、その量は極微量であることから、多量のテアフラビンを紅茶葉から抽出し精製することは容易ではない。また、化学合成法ではテアフラビン生成以外の酸化反応物も多く生成してしまうため、使用した原料に対するテアフラビンの変換効率は低かった。
【００１１】
そこで、テアフラビンを簡便で原料使用量に対して高効率に合成する方法に関し、本発明者らは、まず、化学的な反応を用いた化学合成法よりも基質特異性を有する酵素を用いた方が、原料であるカテキン類をテアフラビンに高効率で変換する条件を見出せるだろうと考えた。
【００１２】
酵素を用いる従来法としては、ポリフェノールオキシダーゼを用いてＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２ＢおよびＴＦ３の混合物を合成する方法が特許文献４に開示されているが、テアフラビンの生成効率が低く、また、目的とするテアフラビン以外の酸化物も多く生成してしまうという欠点がある。さらに、テアフラビン混合物として生成するので、例えば、着色剤として利用しようとした場合に、色調が異なるＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２ＢおよびＴＦ３を所望の比率で混合することが難しい。また、各種テアフラビンの生理活性を比較しようとした場合や特定のテアフラビンの生理活性を調べようとした場合には、得られた混合物からテアフラビンを個別に分離精製する必要が生じ、操作が煩雑になるばかりか精製に長時間を要してしまう。
このように、テアフラビン混合物の形態ではその用途が大幅に制限を受けてしまうことから、各種テアフラビンを個別に生成する簡便な方法が求められている。
【００１３】
各種テアフラビンを個別に生成する方法としては、カテキン類にペルオキシダーゼを作用させる方法が特許文献１および非特許文献５に開示されているが、テアフラビンの収率が数％〜十数％と低く、テアフラビン以外の酸化物が多く生成してしまうために分離精製操作に時間と手間を要する。また、植物細胞培養物中のペルオキシダーゼを用いる方法が報告されているが（特許文献３）、テアフラビンの収率が低いといった欠点のほか、植物細胞を培養するのに手間と日数がかかるという問題がある。さらに、どちらの方法も過酸化水素を添加しなければならず、その操作にも細心の注意を払う必要があるため、簡便な酵素合成法とは言い難い。その他、タンナーゼ処理後の緑茶スラリーを酵素酸化する方法（特許文献２）では高変換効率でＴＦ１を得ることができるものの、酵素反応を２段階行う必要性があるばかりか、生成したＴＦ１を分離精製する操作が煩雑である。さらに、この方法ではＴＦ１以外のテアフラビン類への適用ができない。このように、各種テアフラビンを個別に生成する方法が種々考えられてはきたものの、変換効率や操作性、目的とするテアフラビンが制限されるといった問題点を抱えており、満足のいく方法ではなかった。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、各種テアフラビンを個別に酵素合成する方法において、原料であるカテキン類を効率よくテアフラビンに変換させることを特徴とする、高収率で簡便にテアフラビンを製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
そして上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、目的のテアフラビンの原料となるピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、それら２種類のカテキンをポリフェノールオキシダーゼとｐＨ４．０〜６．０の条件下で反応させるだけで、従来よりもはるかに効率よくカテコール型カテキンを各種テアフラビンへ変換できることを見出した。
【００１６】
即ち、請求項１記載の本発明は、一般式（Ｉ）で表されるピロガロール型カテキンと一般式（II）で表されるカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用させることを特徴とする一般式（III）で表されるテアフラビンの製造方法を提供するものである。
【００１７】
【化１】
（式中、Ｒ１はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環の２位および３位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【００１８】
【化２】
（式中、Ｒ２はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環の２位および３位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【００１９】
【化３】
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環のａ位、ｂ位、ｃ位およびｄ位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【００２０】
また、請求項２記載の本発明は、ポリフェノールオキシダーゼを（−）ＥＣに作用したときの減少速度（モル／分）と（−）ＥＧＣに作用したときの減少速度（モル／分）の比が以下に示す数値となるようなポリフェノールオキシダーゼを用いる請求項１に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。
＜数値比率＞
（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）≧３．５４
【００２１】
また、請求項３記載の本発明は、ポリフェノールオキシダーゼとしてチロシナーゼを用いる請求項２に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。
【００２２】
また、請求項４記載の本発明は、一般式（II）で表されるカテコール型カテキン１０マイクロモルに対してポリフェノールオキシダーゼを２０００〜７０００Ｕ作用させる請求項３に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。
【００２３】
また、請求項５記載の本発明は、一般式（II）で表されるカテコール型カテキン１ミリモルに対して反応系の総液量が１リットル以上である請求項４に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。
【００２４】
また、請求項６記載の本発明は、酵素反応の時間が１０〜３０分間である請求項５に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。
【００２５】
また、請求項７記載の本発明は、酵素反応のｐＨがｐＨ４．０〜５．５である請求項６に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。
【００２６】
本発明におけるピロガロール型カテキンとは、エピガロカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレートを代表とする一般式（Ｖ）のＲ３が水酸基である構造を有する化合物、カテコール型カテキンとは、エピカテキン、カテキン、エピカテキンガレート、カテキンガレートを代表とする一般式（Ｖ）のＲ３が水素原子である構造を有する化合物を意味する。
【００２７】
【化５】
（式中、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を示し、Ｒ４はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環の２位および３位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【００２８】
本発明におけるテアフラビンとは、テアフラビン（ＴＦ１）、テアフラビン ３−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ａ）、テアフラビン ３’−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ｂ）、テアフラビン ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（ＴＦ３）、ネオテアフラビン（（−）ＥＧＣと（＋）Ｃ）、ネオテアフラビン ３−Ｏ−ガレート（（−）ＥＧＣｇと（＋）Ｃ）、イソテアフラビン（（＋）ＧＣと（−）ＥＣ）、イソテアフラビン ３’−Ｏ−ガレート（（＋）ＧＣと（−）ＥＣｇ）を代表とする一般式（III）に示す構造を有する化合物を意味する。
【００２９】
【化３】
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環のａ位、ｂ位、ｃ位およびｄ位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【発明の効果】
【００３０】
本発明におけるテアフラビンの酵素合成法は、特別な装置を必要とせず、一般的な製造設備を利用して簡便でありながら、従来法と比較してはるかに効率よくカテコール型カテキンをテアフラビンに変換することができる。すなわち、テアフラビンを高効率で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】酵素使用量に対するＴＦ３生成量
【図２】使用したＥＧＣｇ：ＥＣｇ比に対するＴＦ３生成量
【図３】反応系のｐＨに対するＴＦ３生成量
【図４】反応時間に伴うＴＦ３生成量
【図５】反応時間に伴うＴＦ３生成量
【図６】反応時間に伴うＴＦ３生成量
【図７】使用したＥＧＣ：ＥＣ比に対するＴＦ１生成量
【図８】反応系のｐＨに対するＴＦ１生成量
【図９】使用したＥＧＣｇ：ＥＣ比に対するＴＦ２Ａ生成量
【図１０】反応系のｐＨに対するＴＦ２Ａ生成量
【図１１】使用したＥＧＣ：ＥＣｇ比に対するＴＦ２Ｂ生成量
【図１２】反応系のｐＨに対するＴＦ２Ｂ生成量
【図１３】反応時間に伴うＴＦ３生成量
【図１４】反応時間に伴うＴＦ３異性体生成量
【図１５】（−）ＥＣに対する減少速度／（−）ＥＧＣに対する減少速度の比とＴＦ３への変換効率
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下において、本発明を詳細に説明する。
まず、本発明におけるテアフラビンの製造方法は、カテコール型カテキン使用量に対する各種テアフラビンへの変換効率が従来よりも顕著に高く、例えば、ＴＦ１の従来法の変換率は３０％程度、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２Ｂ、ＴＦ３の場合は数％程度であったところ、本発明におけるテアフラビンの生成効率は、カテコール型カテキン使用量の好ましくは３５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上である。詳細には、ＴＦ１の場合、カテコール型カテキン使用量の好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２Ｂの場合、カテコール型カテキン使用量の好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、ＴＦ３の場合、カテコール型カテキン使用量の好ましくは３５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上である。なお、この場合のカテコール型カテキン使用量とは、反応液に添加したカテコール型カテキン量を示す。
【００３３】
本発明におけるテアフラビンの製造法は、ピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用させることによって、従来法よりも効率よくカテコール型カテキンをテアフラビンに変換するものである。詳しくは、一般式（Ｉ）及び一般式（II）で表されるカテキン類を主原料とし、ｐＨ４．０〜６．０の緩衝液中でポリフェノールオキシダーゼを作用させることによって、一般式（III）で表される各種テアフラビンを得るものである。
【００３４】
本発明の基本的な態様は、一般式（I）のピロガロール型カテキンの一種と一般式（II）のカテコール型カテキンの一種を原料に用いてテアフラビンを得る方法である。
【００３５】
本発明におけるピロガロール型カテキンとは、エピガロカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレートを代表とする一般式（Ｉ）の構造を有する化合物、カテコール型カテキンとは、エピカテキン、カテキン、エピカテキンガレート、カテキンガレートを代表とする一般式（II）の構造を有する化合物を意味する。
【００３６】
また、本発明におけるテアフラビンとは、テアフラビン（ＴＦ１）、テアフラビン ３−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ａ）、テアフラビン ３’−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ｂ）、テアフラビン ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（ＴＦ３）、ネオテアフラビン、ネオテアフラビン ３−Ｏ−ガレート、イソテアフラビン、イソテアフラビン ３’−Ｏ−ガレートを代表とする一般式（III）に示す構造を有する化合物である。
【００３７】
また、原料として用いるカテキン類が高純度であるほど得られるテアフラビンの量は多く、さらに反応による副生成物の量が低下するため好ましい。
【００３８】
得られたテアフラビンは天然の赤色色素であるため食品や飲料の着色剤としてはもちろんのこと、抗酸化剤や抗菌剤として、あるいは、血糖上昇抑制剤、血圧上昇抑制剤、脂質代謝改善剤、抗ガン剤等の生理活性剤として、さらに、渋み添加剤等の風味改善剤としての応用が考えられる。
【００３９】
一般式（Ｉ）で表されるピロガロール型カテキンと一般式（II）で表されるカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用させるだけでも各種テアフラビンを高効率で得ることはできるが、ポリフェノールオキシダーゼを（−）ＥＣに作用したときの減少速度（モル／分）と、等量のポリフェノールオキシダーゼを（−）ＥＧＣに作用したときの減少速度（モル／分）の比が３．５４以上となるようなポリフェノールオキシダーゼを用いることでテアフラビンへの変換効率を上げることができる。この特徴を有するポリフェノールオキシダーゼとしてチロシナーゼ、特にマッシュルーム由来のチロシナーゼが挙げられるが、この特徴を示す酵素であれば何であっても良く、また２種以上のポリフェノールオキシダーゼの混合物でもよく、特に制限されない。ポリフェノールオキシダーゼの具体例としては、チロシナーゼ、ラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼなどが挙げられる。
酵素を作用させる方法は特に制限されないが、例えば市販の酵素粉末を直接反応系に添加する方法、あるいは酵素粉末を水で溶解後、反応系に添加する方法が挙げられる。
【００４０】
ピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンの使用モル比は３．５：１〜６：１であるが、より高い変換効率を得るためにはその使用モル比は４：１〜５．５：１が好ましく、より好ましくは４．５：１〜５：１である。カテコール型カテキンに対するピロガロール型カテキンの使用モル比が３．５未満であるとテアフラビンへの変換効率が低くなる。また、モル比が６を超えると高価な原料であるカテキンを多量に使用しなければならず経済的に不利となる上、副生成物の量も増加して分離精製操作が煩雑になり好ましくない。
【００４１】
また、本発明で使用するポリフェノールオキシダーゼは、（−）ＥＣに作用させたときの減少速度（モル／分）と（−）ＥＧＣに作用させたときの減少速度（モル／分）の比を３．５４以上にするとカテコール型カテキン使用量に対して少なくとも３５％以上がテアフラビンに変換されるが、より高い変換効率を得るためにはその比が望ましくは４．２以上、より望ましくは５．４以上、さらに望ましくは６．８以上、いっそう望ましくは８．６以上、最も望ましくは１１．２以上がよい。これらの数値を示すポリフェノールオキシダーゼを用いるとカテコール型カテキン使用量に対して少なくとも４０％以上、より望ましくは５０％以上、さらに望ましくは６０％以上、いっそう望ましくは７０％以上および最も望ましくは８０％以上の変換効率でテアフラビンが得られるため好適である。（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）の比が３．５４未満のポリフェノールオキシダーゼではテアフラビンへの変換効率が低下してしまうため好ましくない。例えば、この比が３．０のポリフェノールオキシダーゼを用いた場合テアフラビン生成量は減少し、ＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２ＢおよびＴＦ３の中で最も変換効率の低いＴＦ３ではその効率が３５％に満たない。
【００４２】
また、酵素反応のｐＨを４．０〜６．０、望ましくは４．５〜５．５、より望ましくは４．５〜５．０に調整するとカテコール型カテキン使用量に対して高い変換効率でテアフラビンが得られるため好ましい。ｐＨ４．０未満あるいはｐＨ６．０を超えるとテアフラビンへの変換効率が著しく低下してしまう。例えば、本発明で使用するポリフェノールオキシダーゼのうちチロシナーゼ（マッシュルーム由来）の至適ｐＨはｐＨ６〜７であるが、本発明法においては、チロシナーゼの至適ｐＨ６．５で酵素反応させるとテアフラビン生成量は著しく低減してしまう。
【００４３】
また、本発明で作用させる酵素量は、他の条件（原料となるカテキン組成比、酵素反応のｐＨ、反応液中のカテキン濃度、反応温度、反応時間など）に合わせテアフラビンへの変換効率が高くなるよう適宜決定すればよいが、通常は、使用するカテコール型カテキン１０マイクロモルに対して２０００〜７０００Ｕが好ましく、５０００〜７０００Ｕがより好ましい。好ましい範囲内では、例えば市販のＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを使用した場合、原料使用総重量／酵素使用重量の比が１／０．００１以上１／０．１未満となる。使用するカテコール型カテキン１０マイクロモルに対して２０００〜７０００Ｕの酵素を作用させるとテアフラビンへの変換効率は、カテコール型カテキン使用量の５０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上となる。なお、酵素単位１ＵはｐＨ６．５、２５℃の条件下で、３ｍＬの０．５ｍＭチロシン溶液の２８０ｎｍの吸光度を１分間に０．００１上昇させる酵素量を表す。
【００４４】
さらに、カテコール型カテキン１ミリモルに対して反応液総量を１リットル以上に調整するとカテコール型カテキンからテアフラビンに効率よく変換することができるため好ましい。
【００４５】
酵素反応時間は１０〜１８０分が好ましい。より好ましくは１０〜３０分、さらに好ましくは、４０℃の条件下で、２０〜３０分の反応を行うとカテコール型カテキン使用量に対して５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは８５％以上の変換効率でテアフラビンが得られ、反応にかかる時間が短縮されることから、操作が迅速となり好ましい。
【００４６】
上記のように、ピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用することによって得られたテアフラビンを、吸着樹脂などのカラムクロマトグラフィーを用いた分離法により精製すれば、より純度の高いテアフラビンの精製品を得ることができる。
【００４７】
吸着樹脂としては、吸着能力の高い合成吸着樹脂が好適である。具体的には、合成吸着樹脂を充填したカラムに、酵素反応後の溶液を通液し、テアフラビンを樹脂に吸着させ、有機溶媒を用いて目的のテアフラビンを樹脂より溶出し、精製テアフラビンを得る。この操作は通常、合成吸着樹脂を充填したカラムを用いて行うが、カラムを用いずにバッチ式で行うこともできる。
【００４８】
この際使用可能な合成吸着樹脂としては、スチレンジビニルベンゼン系、メタクリル系、スチレン系、修飾スチレン系、アクリル系、アミド系、デキストラン系、セルロース系、ポリビニル系等の樹脂が使用可能であり、市販品では、例えばスチレンジビニルベンゼン系のダイアイオンＨＰ−２０、ダイアイオンＨＰ−２１、ＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＣＨＰ５５Ａ、ＭＣＩＧＥＬ ＣＨＰ５５Ｙ、ＭＣＩＧＥＬ ＣＨＰ２０Ａ、ＭＣＩＧＥＬ ＣＨＰ２０Ｙ（以上、三菱化学（株）製）、アンバーライトＸＡＤ−２、アンバーライトＸＡＤ−４（以上、米国ローム・アンド・ハース社製）、メタクリル系のダイアイオンＨＰ−２ＭＧ（三菱化学（株）製）、スチレン系としてアンバーライトＸＡＤ−１６（米国ローム・アンド・ハース社製）、修飾スチレン系としてセパビーズｓｐ２０７（三菱化学（株）製）、アクリル系のダイアイオンＷＫ−２０（三菱化学（株）製）、アミド系のＸＡＤ−１１（米国ローム・アンド・ハース社製）、デキストラン系のＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ファルマシア社製）、セルロース系のＩＮＤＩＯＮ ＤＳ−３（フェニックスケミカルズ社製）、ポリビニル系のトヨパールＨＷ−４０（東ソー（株）製）等を挙げることができるがこれに限定されない。
【００４９】
また、他の吸着剤としてはシリカゲル系が使用可能であり、例えば市販品ではシリカゲル４０、シリカゲル６０（球状）（以上、関東化学（株）製）、シリカゲル中圧分取用（山善株式会社）等が挙げられ、ＯＤＳなどアルキル基が化学結合したタイプとしてクロマトレックス（富士シリシア化学（株）製）、オクタデシル中圧分取用（山善株式会社）等を挙げることが出来るが、これに限定されない。
【００５０】
溶出に用いる溶媒としては、水の他に例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、アセトニトリルなど、水と任意に混和する有機溶媒を用いることができる。
【００５１】
樹脂と溶出溶媒の組み合わせとしては、上記のものを任意に組み合わせて使用することができるが、飲料などの用途に供する場合は食品衛生法の観点から、特に親水性ビニルポリマー樹脂に吸着させた後、エタノール（含水しても良い）で溶出するのが好ましい。この溶出液を通常の方法で乾固、あるいは結晶化し、目的のテアフラビンを得ることができる。
【００５２】
テアフラビンのうち、ＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２ＢおよびＴＦ３の４成分は以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣ）を用いて定量分析することができる。定量分析には常法に従って調製した標準品を用いればよいが、市販されている各テアフラビン試薬（長良サイエンス株式会社製、和光純薬工業株式会社製など）を標準品として利用することもできる。
【００５３】
（テアフラビンの測定条件）
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＵＧ１２０ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ（粒子径３μｍ、ＳＨＩＳＥＩＤＯ）、移動相：（Ａ）超純水／リン酸＝１００／０．０５（Ｂ）アセトニトリル／酢酸エチル＝９８．５／１．５、（Ａ）８１％（Ｂ）１９％で０〜１３．３分まで保持、１３．３〜２６．６分で（Ｂ）１９％→２３％まで直線的にグラジエント溶出、その後、（Ａ）５０％（Ｂ）５０％で３分間カラム洗浄、初期条件で５分間平衡化。流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃、検出波長：２８０ｎｍ、注入量：２０μＬ。
【００５４】
カテキン類のうち、エピカテキン、カテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、エピカテキンガレート、カテキンガレート、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレートの８成分は以下の条件によりＨＰＬＣで定量分析することができる。定量分析には常法に従って調製した標準品を用いればよいが、市販されている各カテキン試薬（ＳＩＧＭＡ製、ナカライテスク株式会社製など）を標準品として利用することもできる。
【００５５】
（カテキン類の測定条件）
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ（粒子径５μｍ、関東化学）、移動相：（Ａ）超純水／リン酸／アセトニトリル＝１００／０．０５／２．５（Ｂ）超純水／リン酸／アセトニトリル／メタノール＝１００／０．０５／２．５／５０、（Ａ）１００％で０〜３分まで保持、３〜２５分で（Ｂ）０％→１００％まで直線的にグラジエント溶出、２５〜２６分で（Ａ）１００％に戻し、２６〜３０分まで（Ａ）１００％で平衡化、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出波長：２３０ｎｍ、注入量：１０μＬ。
【００５６】
本発明のポリフェノールオキシダーゼを（−）ＥＣに作用させたときおよび（−）ＥＧＣに作用させたときの減少速度（モル／分）を算出する方法は以下のとおりである。まず、ポリフェノールオキシダーゼの使用量は（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣの双方に対し、反応時間に伴って基質を直線的に消費しうる量とし、その量はポリフェノールオキシダーゼにより異なる。決定した一定量のポリフェノールオキシダーゼを０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で（−）ＥＣに作用させ、反応時間に対する（−）ＥＣの消費量（モル）をプロットする。このとき、（−）ＥＣ濃度を上昇させてもそれ以上傾きが増加しない最高基質濃度でのデータを用いる。次に（−）ＥＣに作用させたのと等量のポリフェノールオキシダーゼを０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で（−）ＥＧＣに作用させ、同じように反応時間に対する（−）ＥＧＣの消費量（モル）をプロットする。（−）ＥＣでの試験と同様に（−）ＥＧＣ濃度を上昇させてもそれ以上傾きが増加しない最高基質濃度でのデータを用いる。（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣそれぞれのプロットから傾き（モル／分）を算出する。
【００５７】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５８】
（酵素量の検討）
ＥＧＣｇ ４５マイクロモル（約２０．６ｍｇ）とＥＣｇ １０マイクロモル（約４．４ｍｇ）を５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。この溶液にＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを１０００、２０００、５０００、７０００、或いは１００００Ｕ添加し、４０℃で反応を行った。１０〜３０分まで適宜サンプリングを行い、全ての試料をＨＰＬＣ分析に供し、カテキン類とテアフラビンの測定を行った。カテキン類およびテアフラビンの分析法は以下に示したとおりであり、定量には三井農林（株）製のカテキン類標準品とテアフラビン標準品を用いた。酵素量に対するＴＦ３の生成量を図１および表１に示し、ＴＦ３生成量とＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表１に示した。なお、図表には、各酵素使用量でのＴＦ３生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００５９】
（カテキン類の測定方法）
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ（粒子径５μｍ、関東化学）、移動相：（Ａ）超純水／リン酸／アセトニトリル＝１００／０．０５／２．５（Ｂ）超純水／リン酸／アセトニトリル／メタノール＝１００／０．０５／２．５／５０、（Ａ）１００％で０〜３分まで保持、３〜２５分で（Ｂ）０％→１００％まで直線的にグラジエント溶出、２５〜２６分で（Ａ）１００％に戻し、２６〜３０分まで（Ａ）１００％で平衡化、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出波長：２３０ｎｍ、注入量：１０μＬ。
【００６０】
（テアフラビンの測定方法）
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＵＧ１２０ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ（粒子径３μｍ、ＳＨＩＳＥＩＤＯ）、移動相：（Ａ）超純水／リン酸＝１００／０．０５（Ｂ）アセトニトリル／酢酸エチル＝９８．５／１．５、（Ａ）８１％（Ｂ）１９％で０〜１３．３分まで保持、１３．３〜２６．６分で（Ｂ）１９％→２３％まで直線的にグラジエント溶出、その後、（Ａ）５０％（Ｂ）５０％で３分間カラム洗浄、初期条件で５分間平衡化。流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃、検出波長：２８０ｎｍ、注入量：２０μＬ。
【００６１】
【表１】
【００６２】
表１および図１より、用いた酵素量が多くなるにつれて、ＴＦ３生成量は増大し、ＥＣｇに対するＴＦ３への変換効率は高くなった。そして、使用酵素量が７０００Ｕ以上でＴＦ３の生成量および変換効率は最も高くなった。
【実施例２】
【００６３】
（使用するＥＧＣｇ：ＥＣｇ比の検討）
ＥＧＣｇ：ＥＣｇ比が１：１（１０マイクロモル：１０マイクロモル）、１．５：１（１５マイクロモル：１０マイクロモル）、２：１（２０マイクロモル：１０マイクロモル）、３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）、３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）、４：１（４０マイクロモル：１０マイクロモル）、４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）、６：１（６０マイクロモル：１０マイクロモル）および９：１（９０マイクロモル：１０マイクロモル）となるように５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。ＴＦ３生成量が最大となる反応時間を見出すために５分から６０分まで適宜サンプリングを行い、全試料をＨＰＬＣ分析に供し、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＥＧＣｇ：ＥＣｇ比に対するＴＦ３の生成量を図２および表２に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表２に示した。なお、図表には、各原料比におけるＴＦ３生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００６４】
【表２】
【００６５】
ＥＧＣｇをＥＣｇの３．５倍量以上使用した時、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３変換効率は８０％以上となり、ＥＧＣｇ：ＥＣｇが４．５：１の時にＴＦ３生成量、変換効率共に最大を示した。ＥＧＣｇ：ＥＣｇが９：１の時には、原料使用量が多くＴＦ３の変換効率も低下する傾向を示した。
【実施例３】
【００６６】
（反応ｐＨの検討）
８条件（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液を調製した。ＥＧＣｇおよびＥＣｇを４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、各緩衝液で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ３生成量を表３および図３に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表３に示した。なお、図表には、各ｐＨにおけるＴＦ３生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００６７】
【表３】
【００６８】
表３および図３に示したとおり、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲であれば、使用したＥＣｇの３５％以上が、ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣｇの７０％以上がＴＦ３に変換されることがわかった。一方、ｐＨ３．０およびｐＨ６．５以上ではＴＦ３生成量および変換効率は著しく低下した。
【実施例４】
【００６９】
（酵素反応時間の検討）
ＥＧＣｇ：ＥＣｇ比が３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）および４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）となるように５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供し、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。反応時間に伴うＴＦ３生成量を図４および表４に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表４に示した。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００７０】
【表４】
【００７１】
表４および図４に示したとおり、ＥＧＣｇ：ＥＣｇ比に関わらず、反応開始２０〜３０分後にはＥＣｇ使用量に対するＴＦ３の変換効率が最大となった。
【実施例５】
【００７２】
（酵素反応系の濃度の検討）
ＥＧＣｇおよびＥＣｇを３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。次に、その２倍量（６０マイクロモル：２０マイクロモル）および５倍量（１５０マイクロモル：５０マイクロモル）のＥＧＣｇとＥＣｇを５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。それぞれＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを７０００、１４０００、３５０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。５、１０、２０、および３０分後にサンプリングを行い、全試料をＨＰＬＣ分析に供し、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。反応時間に伴うＴＦ３生成量を図５および表５に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表５に示した。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００７３】
【表５】
【００７４】
表５および図５より、ＴＦ３生成量およびＴＦ３への変換効率が最も高かったのは、通常濃度の反応系（１０ｍＬに対してＥＧＣｇとＥＣｇを合わせて４０マイクロモル使用したもの、つまり、ＥＣｇ１ミリモルに対し反応系の総量が１Ｌであるもの）だった。
なお、上記試験におけるＥＧＣｇ：ＥＣｇのモル比を３．５：１、４：１、４．５：１及び６：１に変更し、上記と同様の方法で酵素反応溶液の濃度について検討した結果、ＴＦ３への変換効率は上記結果と同様通常濃度の反応系で最も高かった。
【実施例６】
【００７５】
（反応温度の検討）
ＥＧＣｇおよびＥＣｇを４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で４本の５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、それぞれ８℃、２５℃、４０℃および５０℃で酵素反応を行った。適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各反応温度での反応時間に伴うＴＦ３生成量を図６および表６に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表６に示した。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００７６】
【表６】
【００７７】
表６および図６に示したとおり、４０℃と２５℃で反応を行った時にＴＦ３の生成量が最大を示したが、４０℃では反応２０分以後で生成量が最大となったのに対し、２５℃では反応６０分以後で最大となった。５０℃では、２０分で生成量が最大に達したがその生成量は２５および４０℃に及ばなかった。８℃では生成量が最大になるまでの反応時間が長く、その生成量も他の温度と比較して低いものであった。
【実施例７】
【００７８】
（ＴＦ１での検証、原料比）
ＥＧＣおよびＥＣを１：１（１０マイクロモル：１０マイクロモル）、３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）、３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）、４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）、６：１（６０マイクロモル：１０マイクロモル）、９：１（９０マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０〜６０分の間に適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各ＥＧＣ：ＥＣ比でのＴＦ１生成量を図７および表７に示し、ＥＣ使用量に対するＴＦ１への変換効率を表７に示した。なお、図表には、ＴＦ１生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣに対する変換効率を示す。また、ＥＣ使用量とは反応液に添加したＥＣの量（モル）を示す。
【００７９】
【表７】
【００８０】
表７および図７に示したとおり、ＥＧＣをＥＣの３倍量以上使用した時、ＴＦ１の生成量が最大になり、ＥＣに対するＴＦ１への変換効率が９０％を超えた。
【実施例８】
【００８１】
（ＴＦ１での検証、反応ｐＨ）
８条件（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液を調製した。ＥＧＣおよびＥＣを３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、各緩衝液で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ１の生成量を表８および図８に示し、ＥＣ使用量に対するＴＦ１への変換効率を表８に示した。なお、図表には、ＴＦ１生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣに対する変換効率を示す。また、ＥＣ使用量とは反応液に添加したＥＣの量（モル）を示す。
【００８２】
【表８】
【００８３】
表８および図８に示したとおり、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲であれば、使用したＥＣの８０％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣの８９％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．０の範囲であれば、使用したＥＣの９２％以上がＴＦ１に変換されることがわかった。一方、ｐＨ３．０、６．５、および７．０では生成量および変換効率が著しく低下した。
【実施例９】
【００８４】
（ＴＦ２Ａでの検証、原料比）
ＥＧＣｇおよびＥＣを１：１（１０マイクロモル：１０マイクロモル）、３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）、３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）、４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）、６：１（６０マイクロモル：１０マイクロモル）、９：１（９０マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０〜６０分の間に適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各ＥＧＣｇ：ＥＣ比でのＴＦ２Ａの生成量を図９および表９に示し、ＥＣ使用量に対するＴＦ２Ａへの変換効率を表９に示した。なお、図表には、ＴＦ２Ａ生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣに対する変換効率を示す。また、ＥＣ使用量とは反応液に添加したＥＣの量（モル）を示す。
【００８５】
【表９】
【００８６】
表９および図９に示したとおり、ＥＧＣｇをＥＣの３倍量以上使用した時、ＴＦ２Ａの生成量が最大になり、ＥＣに対するＴＦ２Ａへの変換効率が９０％以上となった。
【実施例１０】
【００８７】
（ＴＦ２Ａでの検証、反応ｐＨ）
８条件（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液を調製した。ＥＧＣｇおよびＥＣを３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、各緩衝液で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ２Ａの生成量を表１０および図１０に示し、ＥＣ使用量に対するＴＦ２Ａへの変換効率を表１０に示した。なお、図表には、ＴＦ２Ａ生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣに対する変換効率を示す。また、ＥＣ使用量とは反応液に添加したＥＣの量（モル）を示す。
【００８８】
【表１０】
【００８９】
表１０および図１０に示したとおり、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲であれば、使用したＥＣの５０％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣの８０％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．０の範囲では８５％以上がＴＦ２Ａに変換されることがわかった。
【実施例１１】
【００９０】
（ＴＦ２Ｂでの検証、原料比）
ＥＧＣおよびＥＣｇを１：１（１０マイクロモル：１０マイクロモル）、３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）、３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）、４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）、６：１（６０マイクロモル：１０マイクロモル）、９：１（９０マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０〜６０分の間に適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各ＥＧＣ：ＥＣｇ比でのＴＦ２Ｂの生成量を図１１および表１１に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ２Ｂへの変換効率を表１１に示した。なお、図表には、ＴＦ２Ｂ生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００９１】
【表１１】
【００９２】
表１１および図１１に示したとおり、ＥＧＣをＥＣｇの３倍量以上使用した時、ＴＦ２Ｂの生成量が最大となり、ＥＣｇに対するＴＦ２Ｂへの変換効率が９５％を超えた。
【実施例１２】
【００９３】
（ＴＦ２Ｂでの検証、反応ｐＨ）
８条件（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液を調製した。ＥＧＣおよびＥＣｇを３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、各緩衝液で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ２Ｂの生成量を表１２および図１２に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ２Ｂへの変換効率を表１２に示した。なお、図表には、ＴＦ２Ｂ生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００９４】
【表１２】
【００９５】
表１２および図１２に示したとおり、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲であれば、使用したＥＣｇの５５％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣｇの７５％以上が、ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣｇの９０％以上がＴＦ２Ｂに変換されることがわかった。
【実施例１３】
【００９６】
（スケールアップ）
ＥＧＣｇおよびＥＣｇを４．５：１（９００マイクロモル：２００マイクロモル，約３９８ｍｇ：約９２ｍｇ）の比で１リットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２００ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを１４００００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。５、１０、２０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各反応温度での反応時間に伴うＴＦ３生成量を図１３および表１３に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表１３に示した。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００９７】
【表１３】
【００９８】
表１３および図１３に示したとおり、２０倍にスケールアップした場合ＴＦ３への変換効率は８９％であり、これまでの実施例での同条件での結果を上回る数値が得られた。
【実施例１４】
【００９９】
（ＴＦ異性体での検証１）
ＧＣｇおよびＥＣｇを４．５：１（９００マイクロモル：２００マイクロモル，約４１３ｍｇ：約８８ｍｇ）の比で１リットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２００ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを１４００００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。５、１０、２０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビン異性体の測定を行った。なお、テアフラビン異性体は、仮にそれぞれのエピ体を標準品として定量を行った。各反応温度での反応時間に伴うＴＦ３異性体の生成量を図１４および表１４に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３異性体への変換効率を表１４に示した。ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【０１００】
【表１４】
【０１０１】
表１４および図１４に示したとおり、ＧＣｇとＥＣｇからもテアフラビンが生成することが確認された。この結果から、エピ体以外のカテキンを用いても高変換効率（７２％）でＴＦ３異性体が得られることがわかった。なお、この異性体は今まで報告されていない新規なテアフラビンである。
【実施例１５】
【０１０２】
（ＴＦ異性体での検証２）
表１５の組み合わせでそれぞれピロガロール型カテキン：カテコール型カテキンの比が４．５：１（１．３５マイクロモル：０．３マイクロモル）となるように２０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で４ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各２２０Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。２０分後に反応停止し、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビン異性体の測定を行った。なお、テアフラビン異性体は、仮にそれぞれのエピ体を標準品として定量を行った。各反応温度での反応時間に伴うＴＦ異性体の生成量と、カテコール型カテキン使用量に対するＴＦ異性体への変換効率を表１５に示した。なお、カテコール型カテキン使用量とは反応液に添加したカテコール型カテキンの量（モル）を示す。
【０１０３】
【表１５】
【０１０４】
表１５に示したとおり、テアフラビン異性体を高い変換効率で得ることが出来た。
【実施例１６】
【０１０５】
（（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣの減少速度の比とＴＦ３への変換効率）
（−）ＥＣ（３５〜８０マイクロモル）および（−）ＥＧＣ（５〜８０マイクロモル）に対し、酵素Ａから酵素Ｆの６種類のポリフェノールオキシダーゼをｐＨ５．０の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液中、４０℃で作用させた。ポリフェノールオキシダーゼの使用量は酵素の種類によって異なり、各酵素において（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣが反応時間とともに直線的に消費しうる量とした。基質量も酵素によって適宜調節し、単位時間あたりの基質減少量がそれぞれの酵素で最大となる最高濃度で試験を行った。適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して実施例１に記載の方法でカテキン類の測定を行い、酵素毎にそれぞれの基質に対しての反応時間に伴う消費量（モル）を求めた。各酵素における反応時間に伴う（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣ消費量（モル）をプロットし、傾き、すなわち減少速度（１分間の消費量）を求めてその比を算出した。各酵素の（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）の比を表１６に示した。
次に、ＥＧＣｇおよびＥＣｇを３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。上記Ａ〜Ｆの６種類のポリフェノールオキシダーゼを各適量使用し、４０℃で酵素反応を行った。使用量はそれぞれの酵素でＴＦ３が最大生成量となるように設定した。適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ３生成量およびＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表１６に示し、（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）の比とＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率の相関を図１５に示した。なお、図表には、ＴＦ３生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【０１０６】
【表１６】
【０１０７】
表１６および図１５より、減少速度の比（ＥＣの減少速度（モル／分）／ＥＧＣの減少速度（モル／分））が大きくなるほどＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率は高くなり、図１５に示したように、その傾きの比が３．５４以上であればＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率が３５％を超えるという結果が得られた。実際に、上記した減少速度の比が３．５４に満たない酵素Ｃ、酵素Ｄ、酵素Ｅおよび酵素ＦではＥＣｇに対するＴＦ３への変換効率が３５％に満たないのに対し、消費直線の傾きの比が３．５４を超えている酵素ＢおよびＡではＴＦ３への変換効率がそれぞれ４６．３％および８１．４％と高値で得られた。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
以上の通り、本発明により、特別な装置を必要とせず、一般的な設備を利用して簡便にカテコール型カテキン使用量に対して高変換効率でテアフラビンを製造することが出来る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原料使用量に対して高効率で簡便に各種テアフラビンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
紅茶は茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の葉を発酵することで製造され、世界中で飲用される。紅茶中には緑茶の代表的なポリフェノール成分であるカテキン類が酸化重合して生成した様々な重合ポリフェノールが多量に存在する。テアフラビン類はその中で最も知られている化合物であり、紅茶中には主に、テアフラビン（ＴＦ１、一般式（IV）のＲ１およびＲ２は水素原子）、テアフラビン ３−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ａ、一般式（IV）のＲ１はガロイル基、Ｒ２は水素原子）、テアフラビン ３’−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ｂ、一般式（IV）のＲ１は水素原子、Ｒ２はガロイル基）、テアフラビン ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（ＴＦ３、一般式（IV）のＲ１およびＲ２はガロイル基）の４種類が存在する。これら４種のテアフラビンの構造を一般式（IV）に示した。
【０００３】
【化４】
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示す）
【０００４】
上記した４種類のテアフラビンは、緑茶中に含まれるカテキン類が、茶葉中に存在する酵素（ポリフェノールオキシダーゼおよび／またはペルオキシダーゼ）を触媒として酸化されることにより生成する。ＴＦ１はエピガロカテキン（ＥＧＣ、一般式（Ｖ）のＲ３は水酸基、Ｒ４は水素原子）とエピカテキン（ＥＣ、一般式（Ｖ）のＲ３、Ｒ４はともに水素原子）、ＴＦ２Ａはエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ、一般式（Ｖ）のＲ３は水酸基、Ｒ４はガロイル基）とＥＣ、ＴＦ２ＢはＥＧＣとエピカテキンガレート（ＥＣｇ、一般式（Ｖ）のＲ３は水素原子、Ｒ４はガロイル基）、そしてＴＦ３は、ＥＧＣｇとＥＣｇからそれぞれ生成される。カテキン類の構造を一般式（Ｖ）に示した。
【０００５】
【化５】
（式中、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を示し、Ｒ４はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環の２位および３位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【０００６】
テアフラビンは紅茶中の赤色色素成分として飲用時の水色や渋味などに重要な役割を担う成分として知られてきたが、近年、その抗酸化活性や糖吸収抑制（非特許文献１、２）、抗菌活性（非特許文献３）など種々の生理活性を有することが明らかとなり、多くの研究がなされている。
【０００７】
テアフラビンを取得する方法としては、紅茶葉から抽出する方法、フェリシアン化カリウムを用いた化学的合成法（非特許文献４）、ペルオキシダーゼを用いた酵素的合成法（非特許文献５、特許文献１）、タンナーゼ処理した生茶葉のスラリーを発酵させてテアフラビンを豊富に含む茶抽出物を製造する方法（特許文献２）、ペルオキシダーゼ活性を有する植物細胞培養液を利用した合成法（特許文献３）、ポリフェノールオキシダーゼを用いて酵素的に合成する方法（特許文献４）などたくさんの手法が提案されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−５０４１６８号公報
【特許文献２】特開平１１−２２５６７２号公報
【特許文献３】特開２００７−１４３４６１号公報
【特許文献４】特開２００５−５２３２４２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｉｗａ Ｈｏｎｄａ， Ｙｕｋｉｈｉｋｏ Ｈａｒａ， Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，ｐｐ．１２３（１９９３）
【非特許文献２】Ｙｕｋｉｈｉｋｏ Ｈａｒａ， Ｍｉｗａ Ｈｏｎｄａ， Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，ｐｐ．１９３９（１９９０）
【非特許文献３】堀内 善信 他、感染症誌、６６、ｐｐ．５９９（１９９２）
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｎｏｒｉ Ｔａｋｉｎｏ， Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｉｍａｇａｗａ， Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７，ｐｐ．３１９−３２１（１９６３）
【非特許文献５】Ｓｈｅｎｇｍｉｎ Ｓａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，ｐｐ．４５９−４６７（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
テアフラビンの合成について記載された先行文献を検証すると、まず、紅茶葉から抽出する方法では、茶葉中に含まれるテアフラビン総量は茶葉重量に対して多くても１％程度と、その量は極微量であることから、多量のテアフラビンを紅茶葉から抽出し精製することは容易ではない。また、化学合成法ではテアフラビン生成以外の酸化反応物も多く生成してしまうため、使用した原料に対するテアフラビンの変換効率は低かった。
【００１１】
そこで、テアフラビンを簡便で原料使用量に対して高効率に合成する方法に関し、本発明者らは、まず、化学的な反応を用いた化学合成法よりも基質特異性を有する酵素を用いた方が、原料であるカテキン類をテアフラビンに高効率で変換する条件を見出せるだろうと考えた。
【００１２】
酵素を用いる従来法としては、ポリフェノールオキシダーゼを用いてＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２ＢおよびＴＦ３の混合物を合成する方法が特許文献４に開示されているが、テアフラビンの生成効率が低く、また、目的とするテアフラビン以外の酸化物も多く生成してしまうという欠点がある。さらに、テアフラビン混合物として生成するので、例えば、着色剤として利用しようとした場合に、色調が異なるＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２ＢおよびＴＦ３を所望の比率で混合することが難しい。また、各種テアフラビンの生理活性を比較しようとした場合や特定のテアフラビンの生理活性を調べようとした場合には、得られた混合物からテアフラビンを個別に分離精製する必要が生じ、操作が煩雑になるばかりか精製に長時間を要してしまう。
このように、テアフラビン混合物の形態ではその用途が大幅に制限を受けてしまうことから、各種テアフラビンを個別に生成する簡便な方法が求められている。
【００１３】
各種テアフラビンを個別に生成する方法としては、カテキン類にペルオキシダーゼを作用させる方法が特許文献１および非特許文献５に開示されているが、テアフラビンの収率が数％〜十数％と低く、テアフラビン以外の酸化物が多く生成してしまうために分離精製操作に時間と手間を要する。また、植物細胞培養物中のペルオキシダーゼを用いる方法が報告されているが（特許文献３）、テアフラビンの収率が低いといった欠点のほか、植物細胞を培養するのに手間と日数がかかるという問題がある。さらに、どちらの方法も過酸化水素を添加しなければならず、その操作にも細心の注意を払う必要があるため、簡便な酵素合成法とは言い難い。その他、タンナーゼ処理後の緑茶スラリーを酵素酸化する方法（特許文献２）では高変換効率でＴＦ１を得ることができるものの、酵素反応を２段階行う必要性があるばかりか、生成したＴＦ１を分離精製する操作が煩雑である。さらに、この方法ではＴＦ１以外のテアフラビン類への適用ができない。このように、各種テアフラビンを個別に生成する方法が種々考えられてはきたものの、変換効率や操作性、目的とするテアフラビンが制限されるといった問題点を抱えており、満足のいく方法ではなかった。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、各種テアフラビンを個別に酵素合成する方法において、原料であるカテキン類を効率よくテアフラビンに変換させることを特徴とする、高収率で簡便にテアフラビンを製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
そして上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、目的のテアフラビンの原料となるピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、それら２種類のカテキンをポリフェノールオキシダーゼとｐＨ４．０〜６．０の条件下で反応させるだけで、従来よりもはるかに効率よくカテコール型カテキンを各種テアフラビンへ変換できることを見出した。
【００１６】
即ち、請求項１記載の本発明は、一般式（Ｉ）で表されるピロガロール型カテキンと一般式（II）で表されるカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用させることを特徴とする一般式（III）で表されるテアフラビンの製造方法を提供するものである。
【００１７】
【化１】
（式中、Ｒ１はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環の２位および３位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【００１８】
【化２】
（式中、Ｒ２はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環の２位および３位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【００１９】
【化３】
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環のａ位、ｂ位、ｃ位およびｄ位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【００２０】
また、請求項２記載の本発明は、ポリフェノールオキシダーゼを（−）ＥＣに作用したときの減少速度（モル／分）と（−）ＥＧＣに作用したときの減少速度（モル／分）の比が以下に示す数値となるようなポリフェノールオキシダーゼを用いる請求項１に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。
＜数値比率＞
（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）≧３．５４
【００２１】
また、請求項３記載の本発明は、ポリフェノールオキシダーゼとしてチロシナーゼを用いる請求項２に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。
【００２２】
また、請求項４記載の本発明は、一般式（II）で表されるカテコール型カテキン１０マイクロモルに対してポリフェノールオキシダーゼを２０００〜７０００Ｕ作用させる請求項３に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。
【００２３】
また、請求項５記載の本発明は、一般式（II）で表されるカテコール型カテキン１ミリモルに対して反応系の総液量が１リットル以上である請求項４に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。
【００２４】
また、請求項６記載の本発明は、酵素反応の時間が１０〜３０分間である請求項５に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。
【００２５】
また、請求項７記載の本発明は、酵素反応のｐＨがｐＨ４．０〜５．５である請求項６に記載のテアフラビンの製造方法を提供するものである。
【００２６】
本発明におけるピロガロール型カテキンとは、エピガロカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレートを代表とする一般式（Ｖ）のＲ３が水酸基である構造を有する化合物、カテコール型カテキンとは、エピカテキン、カテキン、エピカテキンガレート、カテキンガレートを代表とする一般式（Ｖ）のＲ３が水素原子である構造を有する化合物を意味する。
【００２７】
【化５】
（式中、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を示し、Ｒ４はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環の２位および３位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【００２８】
本発明におけるテアフラビンとは、テアフラビン（ＴＦ１）、テアフラビン ３−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ａ）、テアフラビン ３’−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ｂ）、テアフラビン ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（ＴＦ３）、ネオテアフラビン（（−）ＥＧＣと（＋）Ｃ）、ネオテアフラビン ３−Ｏ−ガレート（（−）ＥＧＣｇと（＋）Ｃ）、イソテアフラビン（（＋）ＧＣと（−）ＥＣ）、イソテアフラビン ３’−Ｏ−ガレート（（＋）ＧＣと（−）ＥＣｇ）を代表とする一般式（III）に示す構造を有する化合物を意味する。
【００２９】
【化３】
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環のａ位、ｂ位、ｃ位およびｄ位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【発明の効果】
【００３０】
本発明におけるテアフラビンの酵素合成法は、特別な装置を必要とせず、一般的な製造設備を利用して簡便でありながら、従来法と比較してはるかに効率よくカテコール型カテキンをテアフラビンに変換することができる。すなわち、テアフラビンを高効率で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】酵素使用量に対するＴＦ３生成量
【図２】使用したＥＧＣｇ：ＥＣｇ比に対するＴＦ３生成量
【図３】反応系のｐＨに対するＴＦ３生成量
【図４】反応時間に伴うＴＦ３生成量
【図５】反応時間に伴うＴＦ３生成量
【図６】反応時間に伴うＴＦ３生成量
【図７】使用したＥＧＣ：ＥＣ比に対するＴＦ１生成量
【図８】反応系のｐＨに対するＴＦ１生成量
【図９】使用したＥＧＣｇ：ＥＣ比に対するＴＦ２Ａ生成量
【図１０】反応系のｐＨに対するＴＦ２Ａ生成量
【図１１】使用したＥＧＣ：ＥＣｇ比に対するＴＦ２Ｂ生成量
【図１２】反応系のｐＨに対するＴＦ２Ｂ生成量
【図１３】反応時間に伴うＴＦ３生成量
【図１４】反応時間に伴うＴＦ３異性体生成量
【図１５】（−）ＥＣに対する減少速度／（−）ＥＧＣに対する減少速度の比とＴＦ３への変換効率
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下において、本発明を詳細に説明する。
まず、本発明におけるテアフラビンの製造方法は、カテコール型カテキン使用量に対する各種テアフラビンへの変換効率が従来よりも顕著に高く、例えば、ＴＦ１の従来法の変換率は３０％程度、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２Ｂ、ＴＦ３の場合は数％程度であったところ、本発明におけるテアフラビンの生成効率は、カテコール型カテキン使用量の好ましくは３５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上である。詳細には、ＴＦ１の場合、カテコール型カテキン使用量の好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２Ｂの場合、カテコール型カテキン使用量の好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、ＴＦ３の場合、カテコール型カテキン使用量の好ましくは３５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上である。なお、この場合のカテコール型カテキン使用量とは、反応液に添加したカテコール型カテキン量を示す。
【００３３】
本発明におけるテアフラビンの製造法は、ピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用させることによって、従来法よりも効率よくカテコール型カテキンをテアフラビンに変換するものである。詳しくは、一般式（Ｉ）及び一般式（II）で表されるカテキン類を主原料とし、ｐＨ４．０〜６．０の緩衝液中でポリフェノールオキシダーゼを作用させることによって、一般式（III）で表される各種テアフラビンを得るものである。
【００３４】
本発明の基本的な態様は、一般式（I）のピロガロール型カテキンの一種と一般式（II）のカテコール型カテキンの一種を原料に用いてテアフラビンを得る方法である。
【００３５】
本発明におけるピロガロール型カテキンとは、エピガロカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレートを代表とする一般式（Ｉ）の構造を有する化合物、カテコール型カテキンとは、エピカテキン、カテキン、エピカテキンガレート、カテキンガレートを代表とする一般式（II）の構造を有する化合物を意味する。
【００３６】
また、本発明におけるテアフラビンとは、テアフラビン（ＴＦ１）、テアフラビン ３−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ａ）、テアフラビン ３’−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ｂ）、テアフラビン ３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（ＴＦ３）、ネオテアフラビン、ネオテアフラビン ３−Ｏ−ガレート、イソテアフラビン、イソテアフラビン ３’−Ｏ−ガレートを代表とする一般式（III）に示す構造を有する化合物である。
【００３７】
また、原料として用いるカテキン類が高純度であるほど得られるテアフラビンの量は多く、さらに反応による副生成物の量が低下するため好ましい。
【００３８】
得られたテアフラビンは天然の赤色色素であるため食品や飲料の着色剤としてはもちろんのこと、抗酸化剤や抗菌剤として、あるいは、血糖上昇抑制剤、血圧上昇抑制剤、脂質代謝改善剤、抗ガン剤等の生理活性剤として、さらに、渋み添加剤等の風味改善剤としての応用が考えられる。
【００３９】
一般式（Ｉ）で表されるピロガロール型カテキンと一般式（II）で表されるカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用させるだけでも各種テアフラビンを高効率で得ることはできるが、ポリフェノールオキシダーゼを（−）ＥＣに作用したときの減少速度（モル／分）と、等量のポリフェノールオキシダーゼを（−）ＥＧＣに作用したときの減少速度（モル／分）の比が３．５４以上となるようなポリフェノールオキシダーゼを用いることでテアフラビンへの変換効率を上げることができる。この特徴を有するポリフェノールオキシダーゼとしてチロシナーゼ、特にマッシュルーム由来のチロシナーゼが挙げられるが、この特徴を示す酵素であれば何であっても良く、また２種以上のポリフェノールオキシダーゼの混合物でもよく、特に制限されない。ポリフェノールオキシダーゼの具体例としては、チロシナーゼ、ラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼなどが挙げられる。
酵素を作用させる方法は特に制限されないが、例えば市販の酵素粉末を直接反応系に添加する方法、あるいは酵素粉末を水で溶解後、反応系に添加する方法が挙げられる。
【００４０】
ピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンの使用モル比は３．５：１〜６：１であるが、より高い変換効率を得るためにはその使用モル比は４：１〜５．５：１が好ましく、より好ましくは４．５：１〜５：１である。カテコール型カテキンに対するピロガロール型カテキンの使用モル比が３．５未満であるとテアフラビンへの変換効率が低くなる。また、モル比が６を超えると高価な原料であるカテキンを多量に使用しなければならず経済的に不利となる上、副生成物の量も増加して分離精製操作が煩雑になり好ましくない。
【００４１】
また、本発明で使用するポリフェノールオキシダーゼは、（−）ＥＣに作用させたときの減少速度（モル／分）と（−）ＥＧＣに作用させたときの減少速度（モル／分）の比を３．５４以上にするとカテコール型カテキン使用量に対して少なくとも３５％以上がテアフラビンに変換されるが、より高い変換効率を得るためにはその比が望ましくは４．２以上、より望ましくは５．４以上、さらに望ましくは６．８以上、いっそう望ましくは８．６以上、最も望ましくは１１．２以上がよい。これらの数値を示すポリフェノールオキシダーゼを用いるとカテコール型カテキン使用量に対して少なくとも４０％以上、より望ましくは５０％以上、さらに望ましくは６０％以上、いっそう望ましくは７０％以上および最も望ましくは８０％以上の変換効率でテアフラビンが得られるため好適である。（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）の比が３．５４未満のポリフェノールオキシダーゼではテアフラビンへの変換効率が低下してしまうため好ましくない。例えば、この比が３．０のポリフェノールオキシダーゼを用いた場合テアフラビン生成量は減少し、ＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２ＢおよびＴＦ３の中で最も変換効率の低いＴＦ３ではその効率が３５％に満たない。
【００４２】
また、酵素反応のｐＨを４．０〜６．０、望ましくは４．５〜５．５、より望ましくは４．５〜５．０に調整するとカテコール型カテキン使用量に対して高い変換効率でテアフラビンが得られるため好ましい。ｐＨ４．０未満あるいはｐＨ６．０を超えるとテアフラビンへの変換効率が著しく低下してしまう。例えば、本発明で使用するポリフェノールオキシダーゼのうちチロシナーゼ（マッシュルーム由来）の至適ｐＨはｐＨ６〜７であるが、本発明法においては、チロシナーゼの至適ｐＨ６．５で酵素反応させるとテアフラビン生成量は著しく低減してしまう。
【００４３】
また、本発明で作用させる酵素量は、他の条件（原料となるカテキン組成比、酵素反応のｐＨ、反応液中のカテキン濃度、反応温度、反応時間など）に合わせテアフラビンへの変換効率が高くなるよう適宜決定すればよいが、通常は、使用するカテコール型カテキン１０マイクロモルに対して２０００〜７０００Ｕが好ましく、５０００〜７０００Ｕがより好ましい。好ましい範囲内では、例えば市販のＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを使用した場合、原料使用総重量／酵素使用重量の比が１／０．００１以上１／０．１未満となる。使用するカテコール型カテキン１０マイクロモルに対して２０００〜７０００Ｕの酵素を作用させるとテアフラビンへの変換効率は、カテコール型カテキン使用量の５０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上となる。なお、酵素単位１ＵはｐＨ６．５、２５℃の条件下で、３ｍＬの０．５ｍＭチロシン溶液の２８０ｎｍの吸光度を１分間に０．００１上昇させる酵素量を表す。
【００４４】
さらに、カテコール型カテキン１ミリモルに対して反応液総量を１リットル以上に調整するとカテコール型カテキンからテアフラビンに効率よく変換することができるため好ましい。
【００４５】
酵素反応時間は１０〜１８０分が好ましい。より好ましくは１０〜３０分、さらに好ましくは、４０℃の条件下で、２０〜３０分の反応を行うとカテコール型カテキン使用量に対して５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは８５％以上の変換効率でテアフラビンが得られ、反応にかかる時間が短縮されることから、操作が迅速となり好ましい。
【００４６】
上記のように、ピロガロール型カテキンとカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用することによって得られたテアフラビンを、吸着樹脂などのカラムクロマトグラフィーを用いた分離法により精製すれば、より純度の高いテアフラビンの精製品を得ることができる。
【００４７】
吸着樹脂としては、吸着能力の高い合成吸着樹脂が好適である。具体的には、合成吸着樹脂を充填したカラムに、酵素反応後の溶液を通液し、テアフラビンを樹脂に吸着させ、有機溶媒を用いて目的のテアフラビンを樹脂より溶出し、精製テアフラビンを得る。この操作は通常、合成吸着樹脂を充填したカラムを用いて行うが、カラムを用いずにバッチ式で行うこともできる。
【００４８】
この際使用可能な合成吸着樹脂としては、スチレンジビニルベンゼン系、メタクリル系、スチレン系、修飾スチレン系、アクリル系、アミド系、デキストラン系、セルロース系、ポリビニル系等の樹脂が使用可能であり、市販品では、例えばスチレンジビニルベンゼン系のダイアイオンＨＰ−２０、ダイアイオンＨＰ−２１、ＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＣＨＰ５５Ａ、ＭＣＩＧＥＬ ＣＨＰ５５Ｙ、ＭＣＩＧＥＬ ＣＨＰ２０Ａ、ＭＣＩＧＥＬ ＣＨＰ２０Ｙ（以上、三菱化学（株）製）、アンバーライトＸＡＤ−２、アンバーライトＸＡＤ−４（以上、米国ローム・アンド・ハース社製）、メタクリル系のダイアイオンＨＰ−２ＭＧ（三菱化学（株）製）、スチレン系としてアンバーライトＸＡＤ−１６（米国ローム・アンド・ハース社製）、修飾スチレン系としてセパビーズｓｐ２０７（三菱化学（株）製）、アクリル系のダイアイオンＷＫ−２０（三菱化学（株）製）、アミド系のＸＡＤ−１１（米国ローム・アンド・ハース社製）、デキストラン系のＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ファルマシア社製）、セルロース系のＩＮＤＩＯＮ ＤＳ−３（フェニックスケミカルズ社製）、ポリビニル系のトヨパールＨＷ−４０（東ソー（株）製）等を挙げることができるがこれに限定されない。
【００４９】
また、他の吸着剤としてはシリカゲル系が使用可能であり、例えば市販品ではシリカゲル４０、シリカゲル６０（球状）（以上、関東化学（株）製）、シリカゲル中圧分取用（山善株式会社）等が挙げられ、ＯＤＳなどアルキル基が化学結合したタイプとしてクロマトレックス（富士シリシア化学（株）製）、オクタデシル中圧分取用（山善株式会社）等を挙げることが出来るが、これに限定されない。
【００５０】
溶出に用いる溶媒としては、水の他に例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、アセトニトリルなど、水と任意に混和する有機溶媒を用いることができる。
【００５１】
樹脂と溶出溶媒の組み合わせとしては、上記のものを任意に組み合わせて使用することができるが、飲料などの用途に供する場合は食品衛生法の観点から、特に親水性ビニルポリマー樹脂に吸着させた後、エタノール（含水しても良い）で溶出するのが好ましい。この溶出液を通常の方法で乾固、あるいは結晶化し、目的のテアフラビンを得ることができる。
【００５２】
テアフラビンのうち、ＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２ＢおよびＴＦ３の４成分は以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣ）を用いて定量分析することができる。定量分析には常法に従って調製した標準品を用いればよいが、市販されている各テアフラビン試薬（長良サイエンス株式会社製、和光純薬工業株式会社製など）を標準品として利用することもできる。
【００５３】
（テアフラビンの測定条件）
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＵＧ１２０ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ（粒子径３μｍ、ＳＨＩＳＥＩＤＯ）、移動相：（Ａ）超純水／リン酸＝１００／０．０５（Ｂ）アセトニトリル／酢酸エチル＝９８．５／１．５、（Ａ）８１％（Ｂ）１９％で０〜１３．３分まで保持、１３．３〜２６．６分で（Ｂ）１９％→２３％まで直線的にグラジエント溶出、その後、（Ａ）５０％（Ｂ）５０％で３分間カラム洗浄、初期条件で５分間平衡化。流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃、検出波長：２８０ｎｍ、注入量：２０μＬ。
【００５４】
カテキン類のうち、エピカテキン、カテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、エピカテキンガレート、カテキンガレート、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレートの８成分は以下の条件によりＨＰＬＣで定量分析することができる。定量分析には常法に従って調製した標準品を用いればよいが、市販されている各カテキン試薬（ＳＩＧＭＡ製、ナカライテスク株式会社製など）を標準品として利用することもできる。
【００５５】
（カテキン類の測定条件）
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ（粒子径５μｍ、関東化学）、移動相：（Ａ）超純水／リン酸／アセトニトリル＝１００／０．０５／２．５（Ｂ）超純水／リン酸／アセトニトリル／メタノール＝１００／０．０５／２．５／５０、（Ａ）１００％で０〜３分まで保持、３〜２５分で（Ｂ）０％→１００％まで直線的にグラジエント溶出、２５〜２６分で（Ａ）１００％に戻し、２６〜３０分まで（Ａ）１００％で平衡化、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出波長：２３０ｎｍ、注入量：１０μＬ。
【００５６】
本発明のポリフェノールオキシダーゼを（−）ＥＣに作用させたときおよび（−）ＥＧＣに作用させたときの減少速度（モル／分）を算出する方法は以下のとおりである。まず、ポリフェノールオキシダーゼの使用量は（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣの双方に対し、反応時間に伴って基質を直線的に消費しうる量とし、その量はポリフェノールオキシダーゼにより異なる。決定した一定量のポリフェノールオキシダーゼを０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で（−）ＥＣに作用させ、反応時間に対する（−）ＥＣの消費量（モル）をプロットする。このとき、（−）ＥＣ濃度を上昇させてもそれ以上傾きが増加しない最高基質濃度でのデータを用いる。次に（−）ＥＣに作用させたのと等量のポリフェノールオキシダーゼを０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で（−）ＥＧＣに作用させ、同じように反応時間に対する（−）ＥＧＣの消費量（モル）をプロットする。（−）ＥＣでの試験と同様に（−）ＥＧＣ濃度を上昇させてもそれ以上傾きが増加しない最高基質濃度でのデータを用いる。（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣそれぞれのプロットから傾き（モル／分）を算出する。
【００５７】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５８】
（酵素量の検討）
ＥＧＣｇ ４５マイクロモル（約２０．６ｍｇ）とＥＣｇ １０マイクロモル（約４．４ｍｇ）を５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。この溶液にＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを１０００、２０００、５０００、７０００、或いは１００００Ｕ添加し、４０℃で反応を行った。１０〜３０分まで適宜サンプリングを行い、全ての試料をＨＰＬＣ分析に供し、カテキン類とテアフラビンの測定を行った。カテキン類およびテアフラビンの分析法は以下に示したとおりであり、定量には三井農林（株）製のカテキン類標準品とテアフラビン標準品を用いた。酵素量に対するＴＦ３の生成量を図１および表１に示し、ＴＦ３生成量とＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表１に示した。なお、図表には、各酵素使用量でのＴＦ３生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００５９】
（カテキン類の測定方法）
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ（粒子径５μｍ、関東化学）、移動相：（Ａ）超純水／リン酸／アセトニトリル＝１００／０．０５／２．５（Ｂ）超純水／リン酸／アセトニトリル／メタノール＝１００／０．０５／２．５／５０、（Ａ）１００％で０〜３分まで保持、３〜２５分で（Ｂ）０％→１００％まで直線的にグラジエント溶出、２５〜２６分で（Ａ）１００％に戻し、２６〜３０分まで（Ａ）１００％で平衡化、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出波長：２３０ｎｍ、注入量：１０μＬ。
【００６０】
（テアフラビンの測定方法）
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＵＧ１２０ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ（粒子径３μｍ、ＳＨＩＳＥＩＤＯ）、移動相：（Ａ）超純水／リン酸＝１００／０．０５（Ｂ）アセトニトリル／酢酸エチル＝９８．５／１．５、（Ａ）８１％（Ｂ）１９％で０〜１３．３分まで保持、１３．３〜２６．６分で（Ｂ）１９％→２３％まで直線的にグラジエント溶出、その後、（Ａ）５０％（Ｂ）５０％で３分間カラム洗浄、初期条件で５分間平衡化。流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃、検出波長：２８０ｎｍ、注入量：２０μＬ。
【００６１】
【表１】
【００６２】
表１および図１より、用いた酵素量が多くなるにつれて、ＴＦ３生成量は増大し、ＥＣｇに対するＴＦ３への変換効率は高くなった。そして、使用酵素量が７０００Ｕ以上でＴＦ３の生成量および変換効率は最も高くなった。
【実施例２】
【００６３】
（使用するＥＧＣｇ：ＥＣｇ比の検討）
ＥＧＣｇ：ＥＣｇ比が１：１（１０マイクロモル：１０マイクロモル）、１．５：１（１５マイクロモル：１０マイクロモル）、２：１（２０マイクロモル：１０マイクロモル）、３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）、３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）、４：１（４０マイクロモル：１０マイクロモル）、４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）、６：１（６０マイクロモル：１０マイクロモル）および９：１（９０マイクロモル：１０マイクロモル）となるように５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。ＴＦ３生成量が最大となる反応時間を見出すために５分から６０分まで適宜サンプリングを行い、全試料をＨＰＬＣ分析に供し、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＥＧＣｇ：ＥＣｇ比に対するＴＦ３の生成量を図２および表２に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表２に示した。なお、図表には、各原料比におけるＴＦ３生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００６４】
【表２】
【００６５】
ＥＧＣｇをＥＣｇの３．５倍量以上使用した時、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３変換効率は８０％以上となり、ＥＧＣｇ：ＥＣｇが４．５：１の時にＴＦ３生成量、変換効率共に最大を示した。ＥＧＣｇ：ＥＣｇが９：１の時には、原料使用量が多くＴＦ３の変換効率も低下する傾向を示した。
【実施例３】
【００６６】
（反応ｐＨの検討）
８条件（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液を調製した。ＥＧＣｇおよびＥＣｇを４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、各緩衝液で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ３生成量を表３および図３に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表３に示した。なお、図表には、各ｐＨにおけるＴＦ３生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００６７】
【表３】
【００６８】
表３および図３に示したとおり、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲であれば、使用したＥＣｇの３５％以上が、ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣｇの７０％以上がＴＦ３に変換されることがわかった。一方、ｐＨ３．０およびｐＨ６．５以上ではＴＦ３生成量および変換効率は著しく低下した。
【実施例４】
【００６９】
（酵素反応時間の検討）
ＥＧＣｇ：ＥＣｇ比が３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）および４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）となるように５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供し、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。反応時間に伴うＴＦ３生成量を図４および表４に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表４に示した。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００７０】
【表４】
【００７１】
表４および図４に示したとおり、ＥＧＣｇ：ＥＣｇ比に関わらず、反応開始２０〜３０分後にはＥＣｇ使用量に対するＴＦ３の変換効率が最大となった。
【実施例５】
【００７２】
（酵素反応系の濃度の検討）
ＥＧＣｇおよびＥＣｇを３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。次に、その２倍量（６０マイクロモル：２０マイクロモル）および５倍量（１５０マイクロモル：５０マイクロモル）のＥＧＣｇとＥＣｇを５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。それぞれＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを７０００、１４０００、３５０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。５、１０、２０、および３０分後にサンプリングを行い、全試料をＨＰＬＣ分析に供し、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。反応時間に伴うＴＦ３生成量を図５および表５に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表５に示した。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００７３】
【表５】
【００７４】
表５および図５より、ＴＦ３生成量およびＴＦ３への変換効率が最も高かったのは、通常濃度の反応系（１０ｍＬに対してＥＧＣｇとＥＣｇを合わせて４０マイクロモル使用したもの、つまり、ＥＣｇ１ミリモルに対し反応系の総量が１Ｌであるもの）だった。
なお、上記試験におけるＥＧＣｇ：ＥＣｇのモル比を３．５：１、４：１、４．５：１及び６：１に変更し、上記と同様の方法で酵素反応溶液の濃度について検討した結果、ＴＦ３への変換効率は上記結果と同様通常濃度の反応系で最も高かった。
【実施例６】
【００７５】
（反応温度の検討）
ＥＧＣｇおよびＥＣｇを４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で４本の５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、それぞれ８℃、２５℃、４０℃および５０℃で酵素反応を行った。適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各反応温度での反応時間に伴うＴＦ３生成量を図６および表６に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表６に示した。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００７６】
【表６】
【００７７】
表６および図６に示したとおり、４０℃と２５℃で反応を行った時にＴＦ３の生成量が最大を示したが、４０℃では反応２０分以後で生成量が最大となったのに対し、２５℃では反応６０分以後で最大となった。５０℃では、２０分で生成量が最大に達したがその生成量は２５および４０℃に及ばなかった。８℃では生成量が最大になるまでの反応時間が長く、その生成量も他の温度と比較して低いものであった。
【実施例７】
【００７８】
（ＴＦ１での検証、原料比）
ＥＧＣおよびＥＣを１：１（１０マイクロモル：１０マイクロモル）、３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）、３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）、４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）、６：１（６０マイクロモル：１０マイクロモル）、９：１（９０マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０〜６０分の間に適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各ＥＧＣ：ＥＣ比でのＴＦ１生成量を図７および表７に示し、ＥＣ使用量に対するＴＦ１への変換効率を表７に示した。なお、図表には、ＴＦ１生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣに対する変換効率を示す。また、ＥＣ使用量とは反応液に添加したＥＣの量（モル）を示す。
【００７９】
【表７】
【００８０】
表７および図７に示したとおり、ＥＧＣをＥＣの３倍量以上使用した時、ＴＦ１の生成量が最大になり、ＥＣに対するＴＦ１への変換効率が９０％を超えた。
【実施例８】
【００８１】
（ＴＦ１での検証、反応ｐＨ）
８条件（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液を調製した。ＥＧＣおよびＥＣを３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、各緩衝液で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ１の生成量を表８および図８に示し、ＥＣ使用量に対するＴＦ１への変換効率を表８に示した。なお、図表には、ＴＦ１生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣに対する変換効率を示す。また、ＥＣ使用量とは反応液に添加したＥＣの量（モル）を示す。
【００８２】
【表８】
【００８３】
表８および図８に示したとおり、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲であれば、使用したＥＣの８０％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣの８９％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．０の範囲であれば、使用したＥＣの９２％以上がＴＦ１に変換されることがわかった。一方、ｐＨ３．０、６．５、および７．０では生成量および変換効率が著しく低下した。
【実施例９】
【００８４】
（ＴＦ２Ａでの検証、原料比）
ＥＧＣｇおよびＥＣを１：１（１０マイクロモル：１０マイクロモル）、３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）、３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）、４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）、６：１（６０マイクロモル：１０マイクロモル）、９：１（９０マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０〜６０分の間に適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各ＥＧＣｇ：ＥＣ比でのＴＦ２Ａの生成量を図９および表９に示し、ＥＣ使用量に対するＴＦ２Ａへの変換効率を表９に示した。なお、図表には、ＴＦ２Ａ生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣに対する変換効率を示す。また、ＥＣ使用量とは反応液に添加したＥＣの量（モル）を示す。
【００８５】
【表９】
【００８６】
表９および図９に示したとおり、ＥＧＣｇをＥＣの３倍量以上使用した時、ＴＦ２Ａの生成量が最大になり、ＥＣに対するＴＦ２Ａへの変換効率が９０％以上となった。
【実施例１０】
【００８７】
（ＴＦ２Ａでの検証、反応ｐＨ）
８条件（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液を調製した。ＥＧＣｇおよびＥＣを３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、各緩衝液で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ２Ａの生成量を表１０および図１０に示し、ＥＣ使用量に対するＴＦ２Ａへの変換効率を表１０に示した。なお、図表には、ＴＦ２Ａ生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣに対する変換効率を示す。また、ＥＣ使用量とは反応液に添加したＥＣの量（モル）を示す。
【００８８】
【表１０】
【００８９】
表１０および図１０に示したとおり、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲であれば、使用したＥＣの５０％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣの８０％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．０の範囲では８５％以上がＴＦ２Ａに変換されることがわかった。
【実施例１１】
【００９０】
（ＴＦ２Ｂでの検証、原料比）
ＥＧＣおよびＥＣｇを１：１（１０マイクロモル：１０マイクロモル）、３：１（３０マイクロモル：１０マイクロモル）、３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）、４．５：１（４５マイクロモル：１０マイクロモル）、６：１（６０マイクロモル：１０マイクロモル）、９：１（９０マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０〜６０分の間に適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各ＥＧＣ：ＥＣｇ比でのＴＦ２Ｂの生成量を図１１および表１１に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ２Ｂへの変換効率を表１１に示した。なお、図表には、ＴＦ２Ｂ生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００９１】
【表１１】
【００９２】
表１１および図１１に示したとおり、ＥＧＣをＥＣｇの３倍量以上使用した時、ＴＦ２Ｂの生成量が最大となり、ＥＣｇに対するＴＦ２Ｂへの変換効率が９５％を超えた。
【実施例１２】
【００９３】
（ＴＦ２Ｂでの検証、反応ｐＨ）
８条件（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５およびｐＨ７．０）の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液を調製した。ＥＧＣおよびＥＣｇを３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、各緩衝液で１０ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各７０００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。１０、２０、３０、４５、６０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ２Ｂの生成量を表１２および図１２に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ２Ｂへの変換効率を表１２に示した。なお、図表には、ＴＦ２Ｂ生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００９４】
【表１２】
【００９５】
表１２および図１２に示したとおり、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲であれば、使用したＥＣｇの５５％以上が、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣｇの７５％以上が、ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５の範囲であれば、使用したＥＣｇの９０％以上がＴＦ２Ｂに変換されることがわかった。
【実施例１３】
【００９６】
（スケールアップ）
ＥＧＣｇおよびＥＣｇを４．５：１（９００マイクロモル：２００マイクロモル，約３９８ｍｇ：約９２ｍｇ）の比で１リットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２００ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを１４００００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。５、１０、２０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。各反応温度での反応時間に伴うＴＦ３生成量を図１３および表１３に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表１３に示した。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【００９７】
【表１３】
【００９８】
表１３および図１３に示したとおり、２０倍にスケールアップした場合ＴＦ３への変換効率は８９％であり、これまでの実施例での同条件での結果を上回る数値が得られた。
【実施例１４】
【００９９】
（ＴＦ異性体での検証１）
ＧＣｇおよびＥＣｇを４．５：１（９００マイクロモル：２００マイクロモル，約４１３ｍｇ：約８８ｍｇ）の比で１リットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２００ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを１４００００Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。５、１０、２０分後にサンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビン異性体の測定を行った。なお、テアフラビン異性体は、仮にそれぞれのエピ体を標準品として定量を行った。各反応温度での反応時間に伴うＴＦ３異性体の生成量を図１４および表１４に示し、ＥＣｇ使用量に対するＴＦ３異性体への変換効率を表１４に示した。ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【０１００】
【表１４】
【０１０１】
表１４および図１４に示したとおり、ＧＣｇとＥＣｇからもテアフラビンが生成することが確認された。この結果から、エピ体以外のカテキンを用いても高変換効率（７２％）でＴＦ３異性体が得られることがわかった。なお、この異性体は今まで報告されていない新規なテアフラビンである。
【実施例１５】
【０１０２】
（ＴＦ異性体での検証２）
表１５の組み合わせでそれぞれピロガロール型カテキン：カテコール型カテキンの比が４．５：１（１．３５マイクロモル：０．３マイクロモル）となるように２０ミリリットルの三角フラスコに入れ、それぞれ０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で４ミリリットルにした。ＳＩＧＭＡ製のチロシナーゼを各２２０Ｕ使用し、４０℃で酵素反応を行った。２０分後に反応停止し、全試料をＨＰＬＣ分析に供して、実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビン異性体の測定を行った。なお、テアフラビン異性体は、仮にそれぞれのエピ体を標準品として定量を行った。各反応温度での反応時間に伴うＴＦ異性体の生成量と、カテコール型カテキン使用量に対するＴＦ異性体への変換効率を表１５に示した。なお、カテコール型カテキン使用量とは反応液に添加したカテコール型カテキンの量（モル）を示す。
【０１０３】
【表１５】
【０１０４】
表１５に示したとおり、テアフラビン異性体を高い変換効率で得ることが出来た。
【実施例１６】
【０１０５】
（（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣの減少速度の比とＴＦ３への変換効率）
（−）ＥＣ（３５〜８０マイクロモル）および（−）ＥＧＣ（５〜８０マイクロモル）に対し、酵素Ａから酵素Ｆの６種類のポリフェノールオキシダーゼをｐＨ５．０の０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液中、４０℃で作用させた。ポリフェノールオキシダーゼの使用量は酵素の種類によって異なり、各酵素において（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣが反応時間とともに直線的に消費しうる量とした。基質量も酵素によって適宜調節し、単位時間あたりの基質減少量がそれぞれの酵素で最大となる最高濃度で試験を行った。適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して実施例１に記載の方法でカテキン類の測定を行い、酵素毎にそれぞれの基質に対しての反応時間に伴う消費量（モル）を求めた。各酵素における反応時間に伴う（−）ＥＣおよび（−）ＥＧＣ消費量（モル）をプロットし、傾き、すなわち減少速度（１分間の消費量）を求めてその比を算出した。各酵素の（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）の比を表１６に示した。
次に、ＥＧＣｇおよびＥＣｇを３．５：１（３５マイクロモル：１０マイクロモル）の比で５０ミリリットルの三角フラスコに入れ、０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ミリリットルにした。上記Ａ〜Ｆの６種類のポリフェノールオキシダーゼを各適量使用し、４０℃で酵素反応を行った。使用量はそれぞれの酵素でＴＦ３が最大生成量となるように設定した。適宜サンプリングし、全試料をＨＰＬＣ分析に供して実施例１に記載の方法でカテキン類とテアフラビンの測定を行った。ＴＦ３生成量およびＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率を表１６に示し、（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）の比とＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率の相関を図１５に示した。なお、図表には、ＴＦ３生成量が最大となるときの反応時間の値を用い、そのときのＥＣｇに対する変換効率を示す。また、ＥＣｇ使用量とは反応液に添加したＥＣｇの量（モル）を示す。
【０１０６】
【表１６】
【０１０７】
表１６および図１５より、減少速度の比（ＥＣの減少速度（モル／分）／ＥＧＣの減少速度（モル／分））が大きくなるほどＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率は高くなり、図１５に示したように、その傾きの比が３．５４以上であればＥＣｇ使用量に対するＴＦ３への変換効率が３５％を超えるという結果が得られた。実際に、上記した減少速度の比が３．５４に満たない酵素Ｃ、酵素Ｄ、酵素Ｅおよび酵素ＦではＥＣｇに対するＴＦ３への変換効率が３５％に満たないのに対し、消費直線の傾きの比が３．５４を超えている酵素ＢおよびＡではＴＦ３への変換効率がそれぞれ４６．３％および８１．４％と高値で得られた。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
以上の通り、本発明により、特別な装置を必要とせず、一般的な設備を利用して簡便にカテコール型カテキン使用量に対して高変換効率でテアフラビンを製造することが出来る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（I）で表されるピロガロール型カテキンと一般式（II）で表されるカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用させることを特徴とする一般式（III）で表されるテアフラビンの製造方法。
【化１】
（式中、Ｒ１はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環の２位および３位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【化２】
（式中、Ｒ２はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環の２位および３位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【化３】
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環のａ位、ｂ位、ｃ位およびｄ位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【請求項２】
ポリフェノールオキシダーゼを（−）エピカテキン（（−）ＥＣ）に作用させたときの減少速度（モル／分）と（−）エピガロカテキン（（−）ＥＧＣ）に作用させたときの減少速度（モル／分）の比が、以下に示す数値となるようなポリフェノールオキシダーゼを用いる請求項１に記載のテアフラビンの製造方法。
＜数値比率＞
（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）≧３．５４
【請求項３】
ポリフェノールオキシダーゼとしてチロシナーゼを用いる請求項２に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項４】
一般式（II）で表されるカテコール型カテキン１０マイクロモルに対してポリフェノールオキシダーゼを２０００〜７０００Ｕ作用させる請求項３に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項５】
一般式（II）で表されるカテコール型カテキン１ミリモルに対して反応系の総液量が１リットル以上である請求項４に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項６】
酵素反応の時間が１０〜３０分間である請求項５に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項７】
酵素反応のｐＨが４．０〜５．５である請求項６に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項１】
一般式（I）で表されるピロガロール型カテキンと一般式（II）で表されるカテコール型カテキンをモル比３．５：１〜６：１で使用し、ポリフェノールオキシダーゼをｐＨ４．０〜６．０で作用させることを特徴とする一般式（III）で表されるテアフラビンの製造方法。
【化１】
（式中、Ｒ１はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環の２位および３位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【化２】
（式中、Ｒ２はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環の２位および３位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【化３】
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子又はガロイル基を示し、ベンゾピラン環のａ位、ｂ位、ｃ位およびｄ位の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい）
【請求項２】
ポリフェノールオキシダーゼを（−）エピカテキン（（−）ＥＣ）に作用させたときの減少速度（モル／分）と（−）エピガロカテキン（（−）ＥＧＣ）に作用させたときの減少速度（モル／分）の比が、以下に示す数値となるようなポリフェノールオキシダーゼを用いる請求項１に記載のテアフラビンの製造方法。
＜数値比率＞
（−）ＥＣの減少速度（モル／分）／（−）ＥＧＣの減少速度（モル／分）≧３．５４
【請求項３】
ポリフェノールオキシダーゼとしてチロシナーゼを用いる請求項２に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項４】
一般式（II）で表されるカテコール型カテキン１０マイクロモルに対してポリフェノールオキシダーゼを２０００〜７０００Ｕ作用させる請求項３に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項５】
一般式（II）で表されるカテコール型カテキン１ミリモルに対して反応系の総液量が１リットル以上である請求項４に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項６】
酵素反応の時間が１０〜３０分間である請求項５に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項７】
酵素反応のｐＨが４．０〜５．５である請求項６に記載のテアフラビンの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１０−３５５４８（Ｐ２０１０−３５５４８Ａ）
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１０４１６６（Ｐ２００９−１０４１６６）
【出願日】平成２１年４月２２日（２００９．４．２２）
【出願人】（３０３０４４７１２）三井農林株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２２日（２００９．４．２２）
【出願人】（３０３０４４７１２）三井農林株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
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