テロメアにより開始される細胞シグナル伝達の調節
【課題】テロメアにより開始される細胞シグナル伝達の調節を提供すること。
【解決手段】哺乳動物を、成長停止の不全、アポトーシスの不全または増殖老化の不全から保護するための、Ｍｒｅ１１調節因子、タンキラーゼ調節因子、ＤＮＡ損傷経路調節因子およびＭＲＮ複合体形成調節因子の使用。Ｍｒｅ１１の調節因子をスクリーニングするための方法が、本出願において、開示される。その方法は、（ａ）Ｍｒｅ１１に対する核酸基質の存在下で、候補調節因子をＭｒｅ１１とインビトロで接触させる工程；および（ｂ）その基質の加水分解を測定し、それにより、対照と比較してその基質の加水分解を変化させることによって調節因子を同定する工程、を包含する。
【解決手段】哺乳動物を、成長停止の不全、アポトーシスの不全または増殖老化の不全から保護するための、Ｍｒｅ１１調節因子、タンキラーゼ調節因子、ＤＮＡ損傷経路調節因子およびＭＲＮ複合体形成調節因子の使用。Ｍｒｅ１１の調節因子をスクリーニングするための方法が、本出願において、開示される。その方法は、（ａ）Ｍｒｅ１１に対する核酸基質の存在下で、候補調節因子をＭｒｅ１１とインビトロで接触させる工程；および（ｂ）その基質の加水分解を測定し、それにより、対照と比較してその基質の加水分解を変化させることによって調節因子を同定する工程、を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２００３年４月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１１３９３の一部係属出願であり、全文を本明細書に引用として援用する。
【０００２】
（発明の背景）
（１．技術分野）
本発明は、シグナル伝達経路の制御に関する。より詳しくは、本発明は、テロメア開始配列、アポトーシス、日焼けおよびＤＮＡ損傷反応の制御に関する。
【背景技術】
【０００３】
（２．従来技術）
人口が老齢化するに伴って、先進国世界では、ヒトの癌の頻度が増加している。癌のあるタイプと診断における症状の段階において、集中的な研究にもかかわらず近年の罹患率と死亡率は、十分に改善していない。癌が進行する間に、正常細胞とその組織特異性環境との相互作用が制御される方法の重要な態様である老化およびアポトーシスに対する耐性を含め、負の調節制御から、腫瘍細胞は、ますます独立するようになる。
【０００４】
細胞老化は、癌に対する重要な防御であることが示唆されている。多くの事実は、老化における染色体の３’末端を複製できないことで生じる進行性のテロメアの短縮またはテロメアの機能障害を意味する。生殖系列細胞およびほとんどの癌細胞では、ＴＴＡＧＧＧ反復を染色体の３’末端に付加する酵素複合体であるテロメラーゼによるテロメアの長さの維持に、不死が関連している。ＴＴＡＧＧＧの連結型反復であるテロメアは、近位テロメア二本鎖ＤＮＡで襞が付けられ、テロメア反復結合因子（ＴＲＦ）、特にＴＲＦ２で安定化された約１５０〜３００塩基の３’突出部を有する１本鎖ループ構造で終わっている。ＴＲＦ２のドミナントネガティブ型（ＴＲＦ２ＤＮ）の異所発現がテロメアループ構造を破壊し、３’突出部を露出させ、ＤＮＡ損傷応答を引き起こし、その結果、原発性繊維芽細胞と線維肉腫が老化する。
【０００５】
広範囲のＤＮＡ損傷またはある種の癌遺伝子の過剰発現により老化を急速に進めることができる。テロメアの長さを酵素的に維持するか、構築するテロメラーゼ逆転写酵素触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）の異所発現により老化を迂回することが可能で、それによりある種のヒト細胞タイプを不死化するが、これは複製老化のテロメア依存機構を強く示唆している。さらに、悪性細胞は、一般にＴＥＲＴを発現し、および／または通常の老化細胞より短いテロメアを有するにもかかわらず、細胞に老化反応を迂回させ、無限に増殖させる変異を含んでいる。しかしながら、ある腫瘍細胞は、様々な抗癌剤に反応して老化し、不死の獲得が必ずしもそのＤＮＡ損傷に対する基本的な細胞反応の欠如を意味するものでないことを示唆している。
【０００６】
ヒト細胞における老化は、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路に大いに依存している。腫瘍抑制因子ｐ５３は、様々な異なった刺激、例えばＤＮＡ損傷、転写または複製の脱制御、癌遺伝子形質転換、およびある種の化学療法剤で生じた微小管の脱制御を細胞増殖停止またはアポトーシスに変換することにより、細胞ストレス反応機構に鍵となる役割を果たす。活性化されると、ｐ５３は、細胞増殖停止またはプログラムされた細胞の自殺を引き起こし、一方でゲノムの安定性に重要な制御機構として働く。特に、ｐ５３は、細胞集団から遺伝的に損傷した細胞を除去することによりゲノムの安定性を制御し、その主な機能の一つは、腫瘍形成を阻止することである。
【０００７】
無傷の腫瘍抑制因子ｐＲｂ経路は、腫瘍生成を阻止するのに必要である。野生型ｐ５３を含まないｐＲｂ−／−腫瘍細胞では、ｐＲｂの導入が老化を誘導する。頚部癌細胞は、しばしば野生型ｐ５３およびｐＲｂ遺伝子を維持するが、ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７タンパク質は、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路をそれぞれ妨害する。ウイルスＥ２タンパク質の異所発現は、ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７遺伝子転写を抑制し、頚部癌腫細胞株に迅速で顕著な老化反応を誘導するが、これも癌細胞老化におけるｐ５３およびｐＲｂの重要な役割を確認するものである。
【０００８】
ｐ５３経路およびｐＲｂ経路のみを抑制することが、繊維芽細胞が複製老化を迂回するために十分ではない。実際、ＳＶ４０Ｔ抗原に感染したか、またはｐ５３経路およびｐＲｂ経路を抑制するアデノウイルスＥ１Ａ＋Ｅ１ＢまたはＨＰＶ Ｅ６＋Ｅ７の組み合わせを導入したヒト繊維芽細胞は、寿命が延長し、複製老化を逃れる。
【０００９】
ＤＮＡ中の二重鎖の切断は、哺乳動物細胞にとっては細胞毒性が非常に大きい。高度に保存されたＭＲＮ複合体が真核細胞中の二重鎖切断の修復に関与している。ＭＲＮ複合体は、二重鎖切断部位に、それが生成すると直ちに付着する。ＭＲＮ複合体はまた、テロメア反復結合因子（ＴＲＦ）に関連した細胞周期のＳ期中にテロメアに移動する。
【００１０】
ＭＲＮ複合体は、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮＢＳ（ｐ９５）で構成される。Ｍｒｅ１１／ｐ９５／Ｒａｄ５０複合体の一部としてのＭｒｅ１１は、細胞周期のＳ期中にテロメア３’突出ＤＮＡと会合する。Ｍｒｅ１１は、ＤＮＡ鎖の３’末端に優先的に作用するエキソヌクレアーゼである。Ｍｒｅ１１の活性は、ＡＴＰアーゼの１種であるＲａｄ５０との相互作用に依存すると信じられている。Ｎｂｓ１は、ＭＲＮ複合体の核局在化の他、二重鎖切断の部位におけるその会合に関与すると信じられている。
【００１１】
典型的には、癌は、正常または悪性を問わずすべての増殖細胞を非常に傷つける化学療法および放射線療法等のきわめて毒性の強い治療で処置される。このような治療の副作用には、リンパ系、造血系および腸上皮の重大な損傷の他、脱毛が含まれる。他の副作用には、脱毛が含まれる。より安全でより効果的な癌治療、特に正常であるが増殖性の細胞に対し悪性細胞を優先的に標的とすることによりこれらの副作用のいくつか、またはすべてを避ける別な治療法が常に必要とされ続けている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、Ｍｒｅ１１の調節因子のインビトロスクリーニング法であって、Ｍｒｅ１１に対する核酸基質の存在下で候補調節因子をインビトロでＭｒｅ１１と接触させ、基質の加水分解を測定する工程を有する方法に関する。コントロールと比較して基質核酸の加水分解を変化させることにより、調節因子を同定し得る。核酸基質は（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドであり得る。基質核酸の加水分解をＵＶ吸収、標識オリゴマーのゲル分析、または非沈殿性ヌクレオチド塩基の回収により測定し得る。
【００１３】
本発明はまた、Ｍｒｅ１１に特異的に結合する薬剤のインビトロスクリーニング法であって、候補薬剤をＭｒｅ１１に接触させ、候補薬剤が特異的にＭｒｅ１１に結合するか否かを決める工程を有する方法に関する。Ｍｒｅ１１は、固体支持体に付着してもよい。
【００１４】
本発明はまた、Ｍｒｅ１１の調節因子の細胞に基づくスクリーニング法であって、調節因子が細胞により取り込まれる条件下に候補調節因子とＭｒｅ１１を発現する細胞とを接触させ、細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、ＳＡ−ｂ−Ｇａｌ活性、およびｐ５３またはｐ９５のリン酸化を含むがそれらに限定されない細胞特性を測定する工程を含む方法に関する。コントロールと比較して特性を変えることにより調節因子を同定し得る。候補調節因子は、上記に同定したようにＭｒｅ１１に特異的に結合する薬剤でもよい。Ｍｒｅ１１は、エキソヌクレアーゼ活性を有し得る、Ｍｒｅ１１のフラグメント、ホモログ、アナログまたは改変体として発現されてもよい。
【００１５】
本発明はまた、タンキラーゼ調節因子のインビトロスクリーニング法であって、タンキラーゼに対する基質の存在下で候補調節因子をインビトロでタンキラーゼと接触させ、基質のリボシル化を測定する工程を有する方法に関する。コントロールと比較してリボシル化を変化させて調節因子を同定し得る。基質は、ＴＲＦであり得るペプチドまたはポリペプチドであり得る。基質のリボシル化をＵＶ吸収または基質の標識化により測定し得る。
【００１６】
本発明はまた、タンキラーゼに特異的に結合する薬剤のインビトロスクリーニング法であって、候補薬剤をタンキラーゼと接触させ、候補薬剤がタンキラーゼと特異的に結合するか否かを決定する方法に関する。タンキラーゼを固体支持体に付着させてもよい。
【００１７】
本発明はまた、タンキラーゼの調節因子の細胞に基づくスクリーニング法であって、調節因子が細胞に取り込まれる条件下で候補調節因子とタンキラーゼを発現する細胞とを接触させ、細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、ＳＡ−ｂ−Ｇａｌ活性、およびｐ５３リン酸化またはｐ９５リン酸化を含むがそれらに限定されない細胞特性を測定する工程を含む方法に関する。コントロールと比較して特性を変えることにより調節因子を同定し得る。候補調節因子は、上記のようなタンキラーゼと特異的に結合する薬剤であり得る。タンキラーゼは、リボシラーゼ活性を有し得る、タンキラーゼのフラグメント、ホモログ、アナログまたは改変体として発現されてもよい。
【００１８】
本発明はまた、ＭＲＮ複合体形成の調節因子のインビトロスクリーニング法であって、候補調節因子をインビトロでＭｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１と接触させ、ＭＲＮ複合体の形成を測定する工程を含む方法に関する。コントロールと比較してＭＲＮ複合体の形成を変化させることにより、調節因子を同定し得る。候補調節因子を核酸基質またはＭｒｅ１１のインヒビターの存在下でＭｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１と接触させ得る。核酸は（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドでよい。ＭＲＮ複合体の生成を遠心分離、共沈殿または非変性電気泳動により測定し得る。
【００１９】
本発明はまた、ＤＮＡ損傷経路の調節因子の細胞に基づくスクリーニング法であって、調節因子が細胞により取り込まれる条件下、オリゴヌクレオチドの存在下でＭｒｅ１１とタンキラーゼとを発現する細胞と候補調節因子とを接触させ、細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、ＳＡ−ｂ−Ｇａｌ活性、およびｐ５３リン酸化またはｐ９５リン酸化を含むがそれらに限定されない細胞特性を測定する工程を含む方法に関する。コントロールと比較して特性を変えることにより調節因子を同定し得る。オリゴヌクレオチドは（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。Ｍｒｅ１１は、エキソヌクレアーゼ活性を有し得る、Ｍｒｅ１１のフラグメント、ホモログ、アナログまたは改変体として発現されてもよい。タンキラーゼは、リボシラーゼ活性を有し得る、タンキラーゼのフラグメント、ホモログ、アナログまたは改変体として発現されてもよい。
【００２０】
上記の細胞に基づくスクリーニング法に使用された細胞は、癌細胞でもよい。上記の細胞に基づくスクリーニング法に使用された細胞は、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路によりテロメアを維持し得る。上記のインビトロおよび細胞に基づくスクリーニング法に記載された候補調節因子および薬剤は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンまたは有機低分子であってもよい。
【００２１】
本発明はまた、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物の使用に関する。アクチベーターを癌の治療、アポトーシス誘導、細胞老化誘導、日焼け阻害、細胞分化促進または免疫抑制促進に使用し得る。アクチベーターは（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し得るＭｒｅ１１のオリゴヌクレオチドアクチベーターでよい。最初の３’ヌクレオチド結合の約１〜約１０個を３’→５’ヌクレアーゼで加水分解し得る。
【００２２】
本発明はまた、Ｍｒｅ１１、タンキラーゼ、ＤＮＡ損傷経路またはＭＲＮ複合体形成のインヒビターを含む組成物の使用に関する。インヒビターをアポトーシス阻害、細胞老化阻害、生育促進、日焼け促進、細胞分化阻害、癌処置副作用減少に使用し得る。組成物を化学療法またはイオン化放射線と組み合わせて与えてもよい。インヒビターは（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し得るＭｒｅ１１のオリゴヌクレオチドインヒビターであってもよい。最初の３’ヌクレオチド結合の約０〜約１０までを３’→５’ヌクレアーゼで加水分解し得る。
・本発明はまた、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し、少なくとも１個の非加水分解性ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを有する組成物に関する。最初の３’ヌクレオチド結合の１から約１０までをＭｒｅ１１等の３’→５’ヌクレアーゼで加水分解し得る。オリゴヌクレオチドは、ＴＴＡＧＧＧと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。オリゴヌクレオチドは、配列ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧを有してもよい。非加水分解性結合は、ホスホロチオエートであってもよい。オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡであってもよい。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｍｒｅ１１の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）Ｍｒｅ１１に対する核酸基質の存在下で、候補調節因子をＭｒｅ１１とインビトロで接触させる工程；および
（ｂ）該基質の加水分解を測定し、それにより、対照と比較して該基質の加水分解を変化させることによって調節因子を同定する工程；
を包含する、方法。
（項目２）
前記核酸基質は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記核酸基質の加水分解を、ＵＶ吸収または放射性標識の放出により測定する、項目１に記載の方法。
（項目４）
Ｍｒｅ１１に特異的に結合する因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）候補因子をＭｒｅ１１と接触させる工程；および
（ｂ）候補因子はＭｒｅ１１と特異的に結合するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
（項目５）
Ｍｒｅ１１は、固体支持体に付着している、項目４に記載の方法。
（項目６）
Ｍｒｅ１１の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）Ｍｒｅ１１を発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）候補調節因子を、該調節因子が該細胞により取り込まれる条件下で該細胞と接触させる工程；および
（ｃ）細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性およびｐ５３リン酸化、ｐ９５リン酸化からなる群より選択される該細胞の特性を測定し、それによって、対照と比較して該特性を変化させることによって調節因子を同定する工程；
を含む、方法。
（項目７）
前記候補調節因子は、Ｍｒｅ１１に特異的に結合する、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記Ｍｒｅ１１は、Ｍｒｅ１１フラグメント、Ｍｒｅ１１ホモログ、Ｍｒｅ１１アナログまたはＭｒｅ１１改変体である、項目１〜７のうちのいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記Ｍｒｅ１１のフラグメント、Ｍｒｅ１１ホモログ、Ｍｒｅ１１アナログまたはＭｒｅ１１改変体は、エキソヌクレアーゼ活性を有する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞の特性は、細胞増殖である、項目６に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞の特性は、細胞の生存能力である、項目６に記載の方法。
（項目１２）
前記細胞の特性は、細胞形態である、項目６に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞の特性は、ＳＡ−β―Ｇａｌ活性である、項目６に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞の特性は、ｐ５３のリン酸化またはｐ９５のリン酸化である、項目６に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞は、癌細胞である、項目６〜７および９〜１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞は、癌細胞である、項目８に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
タンキラーゼの調節因子をスクリーニングする方法であって、該方法は、
（ａ）タンキラーゼに対する基質の存在下で、候補調節因子をタンキラーゼとインビトロで接触させる工程；および
（ｂ）該基質のリボシル化を測定し、それによって、対照と比較して該基質のリボシル化を変化させることによって、調節因子を同定する工程；
を包含する、方法。
（項目２４）
前記基質は、ペプチドまたはポリペプチドである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記基質は、ＴＲＦ１である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記基質のリボシル化を、ＵＶ吸収または前記基質の標識化により測定する、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
タンキラーゼに特異的に結合する因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）候補結合因子をタンキラーゼと接触させる工程；および
（ｂ）候補因子がタンキラーゼに特異的に結合するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
（項目２８）
タンキラーゼは、固体支持体に付着している、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
タンキラーゼの調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）タンキラーゼを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）候補調節因子を、該調節因子が細胞により取り込まれる条件下で該細胞と接触させる工程；および
（ｃ）細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性およびｐ５３リン酸化、ｐ９５リン酸化からなる群より選択される該細胞の特性を測定し、それによって、対照と比較して該特性を変化させることにより調節因子を同定する工程；
を包含する、方法。
（項目３０）
前記調節因子は、タンキラーゼに特異的に結合する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記タンキラーゼは、リボシル化活性を有する、タンキラーゼフラグメント、タンキラーゼホモログ、タンキラーゼアナログまたはタンキラーゼ改変体である、項目２３〜３０のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３２）
前記タンキラーゼフラグメント、タンキラーゼホモログ、タンキラーゼアナログまたはタンキラーゼ改変体は、リボシル化活性を有する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞の特性は、細胞増殖である、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記細胞の特性は、細胞生存能力である、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞の特性は、細胞形態である、項目２９に記載の方法。
（項目３６）
前記細胞の特性は、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性である、項目２９に記載の方法。
（項目３７）
前記細胞の特性は、ｐ５３のリン酸化またはｐ９５のリン酸化である、項目２９に記載の方法。
（項目３８）
前記細胞は、癌細胞である、項目２９〜３０および３２〜３７のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３９）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記細胞は、癌細胞である、項目３１に記載の方法。
（項目４１）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４５）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
ＭＲＮ複合体形成の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）候補調節因子を、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１とインビトロで接触させる工程；ならびに
（ｂ）ＭＲＮ複合体の形成を測定し、それによって、対照と比較して該ＭＲＮ複合体の形成を変化させることにより調節因子を同定する工程
を包含する、方法。
（項目４７）
核酸基質またはＭｒｅ１１インヒビターの存在下で、候補調節因子をＭｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１と接触させる、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記核酸は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
ＭＲＮ複合体の形成を、遠心分離、共沈殿または非変性電気泳動により測定する、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
ＤＮＡ損傷経路の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）Ｍｒｅ１１とタンキラーゼとを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）候補調節因子を、該調節因子が細胞に取り込まれる条件下で、オリゴヌクレオチドの存在下にて該細胞と接触させる工程；
（ｃ）細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性およびｐ５３リン酸化、ｐ９５リン酸化からなる群より選択される該細胞の特性を測定し、それによって、対照と比較して該特性を変化させることにより調節因子を同定する工程
を包含し、該オリゴヌクレオチドは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％の核酸配列同一性を有する、方法。
（項目５１）
前記Ｍｒｅ１１は、Ｍｒｅ１１フラグメント、Ｍｒｅ１１ホモログ、Ｍｒｅ１１アナログまたはＭｒｅ１１改変体である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記Ｍｒｅ１１の前記Ｍｒｅ１１フラグメント、Ｍｒｅ１１ホモログ、Ｍｒｅ１１アナログまたはＭｒｅ１１改変体は、エキソヌクレアーゼ活性を有する、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記タンキラーゼは、タンキラーゼフラグメント、タンキラーゼホモログ、タンキラーゼアナログまたはタンキラーゼ改変体である、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
前記タンキラーゼは、タンキラーゼフラグメント、タンキラーゼホモログ、タンキラーゼアナログまたはタンキラーゼ改変体は、リボシル化活性を有する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記細胞の特性は、細胞増殖である、項目５０に記載の方法。
（項目５６）
前記細胞の特性は、細胞生存能力である、項目５０に記載の方法。
（項目５７）
前記細胞の特性は、細胞形態である、項目５０に記載の方法。
（項目５８）
前記細胞の特性は、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性である、項目５０に記載の方法。
（項目５９）
前記細胞の特性は、ｐ５３リン酸化またはｐ９５リン酸化である、項目５０に記載の方法。
（項目６０）
前記細胞は、癌細胞である、項目５０〜５９のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目６１に記載の方法。
（項目６２）
前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、項目５０に記載の方法。
（項目６３）
癌を処置するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目６４）
アポトーシスを誘導するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目６５）
細胞老化を誘導するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目６６）
日焼けを阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、阻害法。
（項目６７）
細胞分化を促進するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目６８）
免疫抑制を促進するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目６９）
前記アクチベーターは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有するＭｒｅ１１のオリゴヌクレオチドアクチベーターであり、少なくとも最初のｘ個の３’−ヌクレオチド結合は、３’→５’ヌクレアーゼにより加水分解可能であり、ここで、ｎ＝１〜２０であり、ｘは、約１〜約１０である、項目６３〜６８のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目７０）
アポトーシスを阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、阻害法。
（項目７１）
細胞老化を阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目７２）
成長を促進するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目７３）
日焼けを促進するための法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目７４）
細胞分化を阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目７５）
癌処置の副作用を低減するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目７６）
前記組成物を、化学療法またはイオン化放射線と組み合わせて与える、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記インヒビターは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有するＭｒｅ１１のオリゴヌクレオチドインヒビターであり、少なくとも最初のｘ個の３’−ヌクレオチド結合は、３’→５’ヌクレアーゼにより加水分解可能であり、ｎ＝１〜２０であり、ｘは、約０〜約１０である、項目７０〜７６に記載の方法。
（項目７８）
（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドと、少なくとも１個の非加水分解性ヌクレオチド間結合とを有する組成物であって、少なくとも最初のｘ個の３’−ヌクレオチド結合は、３’→５’ヌクレアーゼにより加水分解可能であり、ｎ＝１〜２０であり、ｘは、約０〜約１０である、組成物。
（項目７９）
前記３’→５’ヌクレアーゼは、Ｍｒｅ１１である、項目７８に記載の組成物。
（項目８０）
前記オリゴヌクレオチドは、ＴＴＡＧＧＧと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する、項目７８に記載の組成物。
（項目８１）
前記オリゴヌクレオチドは、配列ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧを有する、項目８０に記載の組成物。
（項目８２）
前記非加水分解性結合は、ホスホロチオエートである、項目７８に記載の組成物。
（項目８３）
前記オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡである、項目７８に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１Ａ〜１Ｈは、希釈剤（図１Ａおよび１Ｅ）；４０μＭの１１マー−１ ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号２：図１Ｂおよび１Ｆ）；４０μＭの１１マー−２ ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ（配列番号３：図１Ｃおよび１１Ｇ）；４０μＭの１１マー−３ ｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ（配列番号４：図１Ｄおよび１Ｈ）で処理したプロピジウムイオダイド染色Ｊｕｒｋａｔ細胞（不死化Ｔリンパ球）のＦＡＣＳ分析を示す。分析前４８時間（図１Ａ〜１Ｄ）または７２時間（図１Ｅ〜１Ｈ）にＪｕｒｋａｔ細胞を言及した試薬で４８時間処理した。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、以下の細胞への添加についての蛍光活性化細胞分類の結果を示すグラフである：図２Ａ、希釈剤；図２Ｂ、０．４μＭの１１マー−１；図２Ｃ、０．４μＭの１１マー−１−Ｓ；図２Ｄ、希釈剤；図２Ｅ、４０μＭの１１マー−１；図２Ｆ、４０μＭの１１マー−１−Ｓ。
【図３】図３Ａ〜３Ｇは、以下の細胞への添加についての蛍光活性化細胞分類の結果を示すグラフである：図３Ａ、希釈剤；図３Ｂ、１０μＭの１１マー−１；図３Ｃ、１０μＭの１１マー−１および１μＭの１１マー−１−Ｓ；図３Ｄ、１０μＭの１１マー−１および５μＭの１１マー−１−Ｓ；図３Ｅ、１０μＭの１１マー−１および１０μＭの１１マー−１−Ｓ；図３Ｆ、２０μＭの１１マー−１−Ｓ；図３Ｇ、１０μＭの１１マー−１−Ｓ。
【図４】図４は、希釈剤、ｐＴｐＴまたはｐＴｓｐＴで処理した細胞のメラニン含有量（ｐｇ／細胞）を示す棒グラフである。
【図５】図５は、希釈剤、１１マー−１または１１マー−１−Ｓで処理した細胞のメラニン含有量（ｐｇ／細胞）を示す棒グラフである。
【図６】図６は、偽処理（照射なし、オリゴヌクレオチドなし）、または紫外線（ＵＶ）処理、または照射なしでｐＴｓｐＴ投与、またはＵＶを照射しｐＴｓｐＴを投与した細胞のメラニン含有量（ｐｇ／細胞）を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ホスホロチオエート結合で合成した、ヌクレオチド配列の配列番号２のオリゴヌクレオチドのダイアグラムである。
【図８】図８は、図７に示す、β−ガラクトシダーゼ活性に対する細胞染色陽性で示される、正常新生児ヒト繊維芽細胞の培養物で老化を生じるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド１、２、３および４の効果の試験の結果を示す棒グラフである。オリゴヌクレオチド「１１−１」は、全体がホスホジエステル結合で合成された配列番号２で処理された繊維芽細胞培養物を示す。「ディル（Ｄｉｌ）」は、オリゴヌクレオチドを含まない希釈剤で処理された繊維芽細胞培養物を示す。
【図９】図９〜１１は、ダウンレギュレーションＭｒｅ１１タンパク質レベルがＴ−オリゴの反応を妨害することを示す。
【図１０】図９〜１１は、ダウンレギュレーションＭｒｅ１１タンパク質レベルがＴ−オリゴの反応を妨害することを示す。
【図１１】図９〜１１は、ダウンレギュレーションＭｒｅ１１タンパク質レベルがＴ−オリゴの反応を妨害することを示す。
【図１２Ａ】図１２は、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路の双方がヒト繊維芽細胞におけるＴ−オリゴ誘導老化に寄与することを示す。図１２ａ：ｐ５３ＤＤおよびｃｄｋ４Ｒ２４Ｃ発現のイムノブロット解析。３０μｇの全タンパク質を用い、全ｐ５３およびｃｄｋ４に対しプローブしたウェスタンブロットによるタンパク質分析のために細胞を集めた。レーン１、２、３および４は、それぞれ、Ｒ２Ｆ、Ｒ２Ｆ（ｐ５３ＤＤ）、Ｒ２Ｆ（ｃｄｋ４Ｒ２４Ｃ）、およびＲ２Ｆ（ｐ５３ＤＤ／ｃｄｋ４Ｒ２４Ｃ）繊維芽細胞由来のタンパク質試料を含む。ローディングコントロールとしてβ−アクチンを用いた。
【図１２Ｂ】図１２は、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路の双方がヒト繊維芽細胞におけるＴ−オリゴ誘導老化に寄与することを示す。図１２ｂ：ｐ５３経路およびｐＲｂ経路のＴ−オリゴ誘導ＳＡ−β−Ｇａｌ活性への寄与。Ｒ２Ｆ繊維芽細胞および誘導された被形質導入体を希釈剤または４０μＭのＴ−オリゴで１週間処理し、次いでＳＡ−β−Ｇａｌ活性を分析した。
【図１２Ｃ】図１２は、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路の双方がヒト繊維芽細胞におけるＴ−オリゴ誘導老化に寄与することを示す。図１２ｃ：ＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞の定量分析。ＳＡ−β−Ｇａｌ活性を発現する細胞を計数し、培養物中の全細胞の百分率として提示した。３回の独立の実験それぞれからの、３個の代表的視野から平均と標準偏差を計算した。
【図１３Ａ】図１３は、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞のＴ−オリゴへの暴露が老化を誘導することを示す。図１３ａ：Ｔ−オリゴへの暴露がＳＡ−β−Ｇａｌ活性を増加する。ＨＴ−１０８０細胞を希釈剤のみ、または４０μＭのＴ−オリゴ、または相補コントロールオリゴで４日間処理し、次いで染色しＳＡ−β−Ｇａｌ活性を分析した。
【図１３Ｂ】図１３は、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞のＴ−オリゴへの暴露が老化を誘導することを示す。図１３ｂ：ＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞の定量分析。ＳＡ−β−Ｇａｌ活性を発現する細胞を計数し、培養物中の全細胞の百分率として表した。平均値と標準偏差を３回の独立の実験それぞれからの３つの代表的視野から計算した。
【図１３Ｃ】図１３は、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞のＴ−オリゴへの暴露が老化を誘導することを示す。図１３ｃ：細胞増殖に対するＴ−オリゴの効果。細胞を図１２中のように４日間処理し、ＢｒｄＵ取り込みによりＤＮＡ合成を分析した。
【図１３Ｄ】図１３は、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞のＴ−オリゴへの暴露が老化を誘導することを示す。図１３ｄ：ＢｒｄＵ取り込みの定量分析。暗黒色核は、核ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵを示す。ＢｒｄＵ陽性細胞を計算し、培養物中の全細胞の百分率として表した。平均値と標準偏差を３回の独立の実験それぞれからの３つの代表的視野から計算した。
【図１３Ｅ】図１３は、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞のＴ−オリゴへの暴露が老化を誘導することを示す。図１３ｅ：ｐＲｂリン酸化に対するＴ−オリゴの効果。細胞を図１３ａ中の様に処理し、３０μｇの全タンパク質を用い、ｐＲｂ−ｓｅｒ７８０＊、ｓｅｒ７９５＊およびｓｅｒ８０７／８１１＊（それぞれセリン７８０、セリン７９５およびセリン８０７／８１１でリン酸化したｐＲｂ）に対しプローブしてウェスタンブロットによるタンパク質分析のために集めた。レーンＤ、ＴおよびＣは、希釈剤、Ｔ−オリゴおよび相補オリゴそれぞれで処理した細胞由来のタンパク質試料を含む。β−アクチンをローディングコントロールとして使用した。
【図１４Ａ】図１４は、Ｔ−オリゴ除去のヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞中の老化表現型に対する持続効果を示す。並行培養物を図１３ａに記載のように処理した。次いで細胞をＰＢＳで一回洗浄し、それ以上処理せず完全培地を２４時間または４８時間再供給した。図１４ａ：ＳＡ−β−Ｇａｌ活性。細胞をＳＡ−β−Ｇａｌ活性に対して染色した。
【図１４Ｂ】図１４は、Ｔ−オリゴ除去のヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞中の老化表現型に対する持続効果を示す。並行培養物を図１３ａに記載のように処理した。次いで細胞をＰＢＳで一回洗浄し、それ以上処理せず完全培地を２４時間または４８時間再供給した。図１４ｂ：細胞周期停止。ＢｒｄＵの取り込みを分析した。
【図１４Ｃ】図１４は、Ｔ−オリゴ除去のヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞中の老化表現型に対する持続効果を示す。並行培養物を図１３ａに記載のように処理した。次いで細胞をＰＢＳで一回洗浄し、それ以上処理せず完全培地を２４時間または４８時間再供給した。図１４ｃ：ｐＲｂのリン酸化および活性化。図１３ｅに記載のように免疫ブロット分析を行った。
【図１５Ａ】図１５は、ヒト線維芽細胞肉腫ＨＴ−１０８０細胞のクローン形成能に対するＴ−オリゴへ長時間暴露した効果を示す。細胞を希釈剤、４０μＭのＴ−オリゴまたは相補オリゴで１週間処理し、分析した。図１５ａ：染色皿の外観。
【図１５Ｂ】図１５は、ヒト線維芽細胞肉腫ＨＴ−１０８０細胞のクローン形成能に対するＴ−オリゴへ長時間暴露した効果を示す。細胞を希釈剤、４０μＭのＴ−オリゴまたは相補オリゴで１週間処理し、分析した。図１５ｂ：クローン形成能の定量。３回培養物のコロニーを計数し、希釈剤処理コントロールの百分率としてプロットした。
【図１６】図１６は、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞におけるテロメア平均長さ（ＭＴＬ）に対するＴ−オリゴの効果を示す。細胞を図１３ａに記載するように処理した。レーン１、２および３は、希釈剤（Ｄ）、Ｔ−オリゴ（Ｔ）または相補オリゴ（Ｃ）で処理した細胞由来のゲノムＤＮＡを含む。レーン４および５は、高分子量（Ｈ）および低分子量（Ｌ）標準テロメアＤＮＡを含む。
【図１７】図１７は、Ｔ−オリゴおよびＴＲＦＤＮが同じ経路を経由するＤＮＡ損傷反応を開始することを示す。グラフは、希釈剤コントロールを１００％とした、ウェスタンブロットの濃度計読み取り値を示す。図９ｆ：レーン１、希釈剤、ＧＦＰ；レーン２：希釈剤ＴＲＦ２ＤＮ；レーン３：３ＡＢ、ＧＦＰ；レーン４：３ＡＢ、ＴＲＦ２ＤＮ；レーン５：ＩＱ、ＧＦＰ；レーン６：ＩＱ、ＴＲＦ２ＤＮ。
【図１８】図１８は、Ｔ−オリゴの効果がテロメアに依存しないことを示す。図１８ａ：細胞周期の各期における細胞の百分率と標準偏差が各条件の３回の培養から計算された、３回の実験の代表的な実験の一つ由来のＦＡＣＳグラフ。図１８ｂ：ホスホｐ９５／Ｎｂｓ１に対して特異的な抗体を用いたウェスタンブロット。レーン１、２および３は、それぞれ希釈剤、１１マー−１または１１マー−２で処理した細胞由来のタンパク質を含んだ。コントロール細胞を１０ＧｙのＩＲで照射（＋）するか、偽照射（−）した（３時間）。
【図１９】図１９は、タンキラーゼタンパク質レベルのダウンレギュレーションがＴ−オリゴ反応を妨害することを示す。上のパネルは、濃度計の読み取り値、下のパネルは、ウェスタンブロットを示す。
【図２０】図２０は、Ｔ−オリゴがセリン３７で上のｐ５３のリン酸化を生じることを示す。希釈剤または４０μＭで示された時間処理後、ｐ５３ホスホセリン３７特異性抗体を用いて正常新生児細胞に対しウェスタンブロット分析を行った。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、３’テロメア突出配列のＭｒｅ１１媒介加水分解が、老化、日焼けおよびアポトーシス等のＤＮＡ損傷に対する細胞の保護反応に重要なシグナル伝達カスケードを開始するという発見に基づいている。理論に制約されず、本発明者らは、ＵＶ照射、ＤＮＡに対する酸化損傷等のＤＮＡ損傷、またはＤＮＡに対する発癌性付加物の生成、または加齢に関連するテロメアの短縮が、ＴＴＡＧＧＧの反復を有する３’突出配列を露出するテロメアループを不安定化すると信じている。次いでテロメア関連タンパク質が配列依存の方法で突出部に付着し、Ｍｒｅ１１／ｐ９５／Ｒａｄ５０複合体に対する「アンカー」として作用する。Ｍｒｅ１１は、次に３’末端からテロメア突出部を加水分解し始め、Ｒａｄ５０ ＡＴＰアーゼの活性化を引き起こす。Ｒａｄ５０の活性化は、リン酸化によるタンキラーゼの活性化、ある種の空間配置の変化、または他の機構をもたらし、次いでＡＴＭおよび多分ＡＴＲ等の他のキナーゼを活性化する。ＡＴＭは、次にｐ９５、およびｐ５３等の他のＤＮＡ損傷反応エフェクターをリン酸化し、最終的に細胞周期停止の生物的終点、遺伝子誘導、アポトーシスおよび／または老化をもたらす。
【００２５】
提案されたシグナル伝達経路におけるＭｒｅ１１およびタンキラーゼの役割に基づいて、Ｍｒｅ１１、タンキラーゼ、ＤＮＡ損傷経路またはＭＲＮ複合体形成のアクチベーターは、ＤＮＡ損傷またはテロメアループ破壊の存在にかかわらずＤＮＡ損傷反応経路を活性化すると期待される。これは、テロメアホモログオリゴヌクレオチド（Ｔ−オリゴ）がＭｒｅ１１の基質となり、ＤＮＡ損傷またはテロメアループ破壊がなくてもアポトーシス、老化または増殖の停止をもたらすことを示す本明細書中の実施例で示されている。
【００２６】
同様に、Ｍｒｅ１１、タンキラーゼ、ＤＮＡ損傷経路またはＭＲＮ複合体形成のインヒビターは、ＤＮＡ損傷またはテロメアループ破壊があってもシグナル伝達経路を阻害すると期待される。これは、アポトーシスおよび増殖停止が、以下によるＤＮＡ損傷およびテロメアループ破壊を生じる条件下で阻害されることを示す本明細書中の実施例で示されている：（ｉ）Ｍｒｅ１１の拮抗剤として作用する非加水分解性Ｔ−オリゴ、（ｉｉ）Ｍｒｅ１１タンパク質レベルのＲＮＡｉ媒介減少；および（ｉｉｉ）タンキラーゼタンパク質レベルのＲＮＡｉ媒介減少。
【００２７】
本発明の製品、組成物および方法を開示し説明する前に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、制限的であることを意図するものではないことを理解する必要がある。明細書および付属のクレームで使用される場合、単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、そうでないと文脈で明瞭に示されない限り複数の参照対象を含むことに注意しなければならない。
【００２８】
本出願を通じて、特許または刊行物を引用する場合、本発明が所属する分野の技術水準をより完全に説明するためにこれらの刊行物の全文の開示を本出願に引用して援用する。
【００２９】
（１．定義）
本明細書で用いる用語「アクチベーター」とは、タンパク質を活性化する、またはタンパク質の活性を増加する任意の物質を意味する。
【００３０】
本明細書で用いる用語「投与」とは、ある調節因子の投薬量を説明するために用いられた場合、１回の投薬量または複数回の投薬量の薬剤を意味する。
【００３１】
本明細書で用いる用語「アナログ」とは、ペプチドまたはポリペプチドに対する意味で使用された場合、１個またはそれより多くの非標準アミノ酸または通常のアミノ酸のセットからの他の構造的変化を有するペプチドまたはポリペプチドを意味し、オリゴヌクレオチドに対する意味で使用された場合、ホスホジエステルヌクレオチド間結合以外の１個またはそれより多くのヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３２】
本明細書で用いる用語「抗体」とは、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥの抗体、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含め、そのフラグメントもしくは誘導体、および１本鎖抗体、二重特異性抗体、二特異性抗体、二価抗体およびそれらの誘導体を意味する。抗体は、所望のエピトープまたはそのエピトープ由来の配列に対し十分な結合特異性を示す、モノクローン抗体、ポリクローン抗体、親和性精製抗体またはそれらの混合物であってもよい。抗体は、キメラ抗体でもよい。１個またはそれより多くの当該分野で公知の化学物質、ペプチドまたはポリペプチド種の付着で抗体を誘導体化してもよい。抗体を化合物部分と結合してもよい。
【００３３】
本明細書で用いる用語「アポトーシス」とは、細胞質の細胞小器官の完全性を保ちながら細胞容積の漸進的な縮小；光学顕微鏡または電子顕微鏡で観察したクロマチンの凝縮（すなわち核凝縮）；および／または遠心沈降分析で決定したヌクレオソームサイズフラグメントへのＤＮＡ開裂を含むが、それらに限定されない、細胞死のある形式を意味する。食細胞による無傷の細胞フラグメント（アポトーシス体）の飲み込みを伴う、細胞の膜の完全性が失われた場合（例えば、膜の小疱形成）に細胞死が生じる。
【００３４】
本明細書で用いる用語「癌の処置」とは、化学療法および放射線療法を含むがそれらに限定されない、当該分野で公知の任意の処置を意味する。
【００３５】
本明細書で用いる用語「との組み合わせ」とは、調節因子の投与およびその他の処置を説明するために使用された場合、調節因子をその他の処置の前に、その他の処置と共に、またはその他の処置の後であるいはそれらの組合せで投与し得ることを意味する。
【００３６】
本明細書で用いる用語「誘導体」とは、ペプチドまたはポリペプチドの状況に用いられた場合、１次構造（アミノ酸およびアミノ酸アナログ）以外が異なったペプチドまたはポリペプチドを意味し；オリゴヌクレオチドの状況に用いられた場合、ヌクレオチド配列以外の異なったオリゴヌクレオチドを意味する。例えば、ペプチドまたはポリペプチドの誘導体は、翻訳後修飾の１形式であるグリコシル化がされていることによって異なっていてもよい。例えば、ペプチドまたはポリペプチドが異種系中での発現のためにグリコシル化パターンを示してもよい。少なくとも１つの生物活性が維持される場合、これらのペプチドまたはポリペプチドは、本発明による誘導体である。その他の誘導体には、共有結合で修飾されたＮまたはＣ末端を有する融合ペプチドまたは融合ポリペプチド、ＰＥＧ化ペプチドまたはポリペプチド、脂質部分と会合したペプチドまたはポリペプチド、アルキル化ペプチドまたはポリペプチド、アミノ酸側鎖官能基を経由して他のペプチド、ポリペプチドまたは化合物に結合したペプチドまたはポリペプチド、および当技術で理解されると思われるその他の修飾が含まれるが、それらに限定されない。
【００３７】
本明細書で用いる用語「フラグメント」とは、ペプチドまたはポリペプチドの状況で用いられた場合、好ましくは長さで約５〜約３００個のアミノ酸、より好ましくは長さで約８〜約５０個のアミノ酸の任意のペプチドまたはポリペプチドのフラグメントを意味し；オリゴヌクレオチドの状況で用いられた場合、好ましくは長さで約２〜約２５０個のヌクレオチド、より好ましくは長さで約２〜約２０個のヌクレオチドの任意のオリゴヌクレオチドのフラグメントを意味する。ペプチドまたはポリペプチドフラグメントの代表的な例は、長さで８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のアミノ酸である。オリゴヌクレオチドフラグメントの代表的な例は、長さで２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドである。
【００３８】
本明細書で用いる用語「ホモログ」とは、ペプチドまたはポリペプチドの状況で用いられた場合、共通の進化の祖先を共有するか、それに対し少なくとも５０％の同一性を有するペプチドまたはポリペプチドを意味し；オリゴヌクレオチドの状況で用いられた場合、共通の進化の祖先を共有するか、それに対し少なくとも５０％の同一性を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３９】
本明細書で用いる用語「阻害」とは、タンパク質の活性を言及する場合、酵素の活性を阻止、抑制、抑止または除去することを意味する。
【００４０】
本明細書で用いる用語「処置」または「処置する」とは、哺乳動物をある病状から保護することを指す場合、その病状を予防、抑制、抑止または除去することを意味する。病状を予防することには、その病状を発症する前に本発明の組成物を哺乳動物に投与することが含まれる。病状を抑制することには、病状の誘発後であるがその臨床症状が現れる前に哺乳動物に本発明の組成物を投与することが含まれる。病状を抑止することには、病状を低減するか、または悪化することを予防するように、病状の臨床症状が現れた後に本発明の組成物を哺乳動物に投与することが含まれる。病状を除去することには、哺乳動物がその病状をもはや発症しないように、病状の臨床症状が現れた後に本発明の組成物を哺乳動物に投与することが含まれる。
【００４１】
本明細書で用いる用語「改変体」とは、ペプチドまたはポリペプチドの状況で用いられた場合、アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を維持するペプチドまたはポリペプチドを意味し、オリゴヌクレオチドの状況で用いられた場合、ヌクレオチドの挿入、欠失または保存的置換によりヌクレオチド配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を維持するオリゴヌクレオチドを意味する。本発明の目的では、「生物活性」には特異的抗体に結合する能力が含まれるが、それに限定されない。
【００４２】
（２．調節因子）
（ａ．Ｍｒｅ１１の調節因子）
本発明は、Ｍｒｅ１１活性の調節因子に関する。調節因子は、Ｍｒｅ１１活性を誘導または増加し得る。調節因子はまた、Ｍｒｅ１１活性を阻害または減少し得る。調節因子は、人工的に合成された化合物、または天然に存在する化合物であってよい。調節因子は、低分子量化合物、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドもしくはペプチド、またはそれらのフラグメント、アナログ、ホモログ、改変体もしくは誘導体であってよい。
【００４３】
オリゴヌクレオチド調節因子は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝約１〜約３３３）と少なくとも約５０％〜約１００％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、１本鎖、２本鎖、またはその組み合わせを含み得る形態のものであり得るが、それらに制限されない。オリゴヌクレオチドは、約２〜約２０００ヌクレオチドであることが好ましく、約２〜約２００ヌクレオチドの１本鎖３’末端を有することがより好ましい。オリゴヌクレオチドは、ＥＳＴであってもよい。オリゴヌクレオチドのアナログ、誘導体、フラグメント、ホモログまたは改変体も具体的に考えられる。
【００４４】
実施例に示されるように、本発明のあるオリゴヌクレオチドは、増殖の阻害および細胞中のアポトーシスの誘導を生じるが、本発明の他のオリゴヌクレオチドは、生育停止の阻害およびアポトーシスの阻害を生じる。オリゴヌクレオチドの活性のこの違いは、３’加水分解性ヌクレオチド間結合の数に依存性であった。３’加水分解性ヌクレオチド間結合の数を変えることにより、オリゴヌクレオチドの効果が変化した。
【００４５】
理論に制約されず、本発明者らは、オリゴヌクレオチドがＭＲＮ複合体で認識され、３’エキソヌクレアーゼＭｒｅ１１に対する基質となると信じている。その結果、３’非加水分解性ヌクレオチド間結合を有する基質オリゴヌクレオチドがＭｒｅ１１の拮抗剤またはインヒビターとして作用する。Ｍｒｅ１１活性のレベルを決定する他の因子には、３’非加水分解性ヌクレオチド間結合の全濃度、塩基配列およびＧ含有量が含まれるが、それらに限定されない。
【００４６】
（ｉ）ヌクレオチド間結合が生理学的条件下でＭｒｅ１１により加水分解性であるホスホジエステル結合またはそのアナログである場合、および（ｉｉ）その結合に対して３’側にあるすべてのヌクレオチド間結合も加水分解性である場合。その結合に対して３’である加水分解性ヌクレオチド間結合の数にかかわらず、ヌクレオチド間結合が生理学的条件下でＭｒｅ１１により非加水分解性である場合、ヌクレオチド間結合は、本発明の目的では、非加水分解性と考えられる。非加水分解性ヌクレオチド間結合の代表例には、ホスホロチオエート結合およびペプチド核酸結合（ＰＮＡ）が含まれるが、それらに限定されない。
【００４７】
本発明のある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、加水分解性ヌクレオチド間結合を有する。オリゴヌクレオチドは、約１〜約２００個の加水分解性ヌクレオチド間結合を有し得る。オリゴヌクレオチドはまた、非加水分解性ヌクレオチド間結合を有し得る。オリゴヌクレオチドは、約０〜約１９９個の非加水分解性ヌクレオチド間結合を有してもよい。
【００４８】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、非加水分解性結合を有する。オリゴヌクレオチドは、約１〜約２００個の非加水分解性ヌクレオチド間結合を有し得る。オリゴヌクレオチドはまた、加水分解性ヌクレオチド間結合を有してもよい、オリゴヌクレオチドは、約０〜約５個の加水分解性ヌクレオチド間結合を有する。好ましいオリゴヌクレオチドは、本明細書、および本明細書に引用して援用する、２００２年４月１２日出願の同時係属中の米国特許出願第１０／１２２，６３０号に記載のＴ−オリゴである。
【００４９】
（ｂ．タンキラーゼの調節因子）
本発明はまた、タンキラーゼ活性調節因子に関する。この調節因子は、タンキラーゼ活性を誘導し得る。この調節因子はまた、タンキラーゼ活性を阻害し得る。調節因子は、人工的に合成した化合物、または天然に存在する化合物であり得る。調節因子は、低分子量化合物、ポリペプチドもしくはペプチド、またはそれらのフラグメント、アナログ、ホモログ、改変体もしくは誘導体であってもよい。
【００５０】
（ｃ．ＤＮＡ損傷経路の調節因子）
本発明はまた、ＤＮＡ損傷経路の調節因子に関する。調節因子は、ＤＮＡ損傷経路を誘発し得る。この調節因子は、また、ＤＮＡ損傷経路を阻害し得る。調節因子は、人工的に合成した化合物、または天然に存在する化合物である。調節因子は、低分子量化合物、ポリペプチドもしくはペプチド、またはそれらのフラグメント、アナログ、ホモログ、改変体もしくは誘導体であってもよい。
【００５１】
（ｄ．ＭＲＮ複合体形成の調節因子）
本発明はまた、ＭＲＮ複合体形成の調節因子に関する。調節因子は、ＭＲＮ複合体の形成を誘発し得る。この調節因子はまた、ＭＲＮ複合体の形成を阻害し得る。調節因子は、人工的に合成した化合物、または天然に存在する化合物である。調節因子は、低分子量化合物、ポリペプチドもしくはペプチド、またはそれらのフラグメント、アナログ、ホモログ、改変体もしくは誘導体であってもよい。
【００５２】
（３．組成物）
本発明はまた、上記のような調節因子を有する組成物に関する。この組成物は、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含み得る。組成物はまた、タンキラーゼアクチベーターを含み得る。組成物はまた、Ｍｒｅ１１のインヒビターを含み得る。組成物はまた、タンキラーゼのインヒビターを含み得る。組成物はまた、１種より多くの本発明の調節因子を含み得る。組成物はまた、別な治療薬と共に１種またはそれより多くの調節因子を含み得る。
【００５３】
本発明のある実施形態では、組成物は、本発明のオリゴヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチドは、加水分解性ヌクレオチド間結合または非加水分解性ヌクレオチド間結合、またはその組み合わせを有してもよい。好ましい実施形態では、このオリゴヌクレオチドはＭｒｅ１１のアクチベーターである。別の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｍｒｅ１１のインヒビターである。上記のように、オリゴヌクレオチドの活性を調節して、加水分解性ヌクレオチド間結合の全濃度に基づきＭｒｅ１１を誘導または阻害し得る。
【００５４】
（ａ．処方）
本発明の組成物は、通常の方法で配合された錠剤または菓子錠剤の状態である。例えば、経口投与用の錠剤およびカプセルは、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤および湿潤剤を含むがそれらに限定されない通常の賦形剤を含み得る。結合剤には、シロップ、アカシアガム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントガム、澱粉糊およびポリビニルピロリドンが含まれるが、それらに限定されない。充填剤には、ラクトース、糖、微結晶性セルロース、トウモロコシ澱粉、燐酸カルシウムおよびソルビトールが含まれるが、それらに限定されない。滑沢剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコールおよびシリカが含まれるが、それらに限定されない。崩壊剤には、馬鈴薯澱粉およびナトリウム澱粉グリコレートが含まれるが、それらに限定されない。湿潤剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれるが、それらに限定されない。錠剤は、当該分野で周知の方法に従ってコーティングされ得る。
【００５５】
本発明の組成物は、水性または油性の懸濁液、溶液、乳化物、シロップおよびエリキシルを含むがそれらに限定されない液体配合物であってもよい。組成物はまた、使用前に水または他の適当なビヒクルで構成するための乾燥製品として配合してもよい。このような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび保存剤を含むがそれらに限定されない添加物を含んでもよい。懸濁剤には、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および水素化食用油が含まれるが、それらに限定されない。乳化剤には、レシチン、ソルビタンモノオレエートおよびアカシアガムが含まれるが、それらに限定されない。非水性ビヒクルには、食用油、アーモンド油、分別ココナッツ油、油性エステル、プロピレングリコールおよびエチルアルコールが含まれるが、それらに限定されない。保存剤には、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルおよびソルビン酸が含まれるが、それらに限定されない。
【００５６】
本発明の組成物は、座薬としても調合されてもよく、ココアバターまたはグリセリドを含むがそれらに限定されない座薬ベースを含み得る。本発明の組成物はまた、吸入用に調合されてもよく、乾燥粉末として投与し得る溶液、懸濁液または乳化物を含むが、それらに限定されない形状であってもよく、またはジクロロジフルオロメタンもしくはトリクロロフルオロメタン等の推進剤を用いるエアゾールの形状であってもよい。本発明の組成物はまた、クリーム、軟膏、ローション、ペースト、医用硬膏、パッチまたは膜を含むがそれらに限定されない水性または非水性ビヒクルを含む経皮調製物として調合してもよい。
【００５７】
本発明の組成物はまた、注射または連続注入を含むがそれらに限定されない方法による非経口投与用に調合し得る。注射用の処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳化物の形状であってもよく、懸濁剤、安定化剤および分散剤を含むがそれらに限定されない調合剤を含み得る。滅菌無パイロジェン水を含むがそれに限定されない適当なビヒクルで再構成するための粉末形状の組成物を提供してもよい。
【００５８】
本発明の組成物は、移植または筋肉内注射で投与し得る貯蔵調製物として調合してもよい。組成物は、適当なポリマー材料または疎水性材料（例えば受容し得る油中の乳化物として）、イオン交換樹脂を用いるか、または難溶性誘導体として（例えば難溶性塩として）調合し得る。
【００５９】
本発明の組成物はまた、リポソーム調製物として調合してもよい。リポソーム調製物は、関連する細胞または角質層に侵入し、細胞膜と融合してリポソームの内容物を細胞内に送達するリポソームを含むことができる。例えば、Ｙａｒｏｓｈの米国特許第５，０７７，２１１、Ｒｅｄｚｉｎｉａｋらの米国特許第４，６２１，０２３、またはＲｅｄｚｉｎｉａｋらの米国特許第４，５０８，７０３号に記載されたもののようなリポソームを使用できる。皮膚の病状を標的とすることを意図する本発明の組成物を、哺乳動物の皮膚をＵＶまたは酸化的損傷を生じる薬剤に暴露前、暴露中または暴露後に投与することができる。その他の適当な処方にニオソームを用いることができる。ニオソームは、膜の大部分が非イオン性脂質からなっており、その一部の形態は角質層を横切って化合物を輸送するに有効な、リポソームに似た脂質ビヒクルである。
【００６０】
（４．処置法）
（ａ．Ｍｒｅ１１アクチベーター、タンキラーゼアクチベーター、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターまたはＭＲＮ複合体形成アクチベーター）
Ｍｒｅ１１、タンキラーゼ、ＤＮＡ損傷経路またはＭＲＮ複合体形成の活性を誘導または増加する本発明の調節因子を単独で、または他の処置と組み合わせて、増殖停止、アポトーシスまたは増殖老化の不全に関連する病状の処置に使用し得る。このような病状の代表例には、癌および例えば乾癬におけるケラチン細胞または繊維芽細胞肥大性瘢痕およびケロイド、またはある種の自己免疫障害の症例におけるリンパ球サブセット等の正常粋を超える細胞の良性増殖等の過剰増殖疾患が含まれるが、それらに限定されない。これらの方法で処置される癌の形式は、様々な形で現れ、例えば頚部癌、リンパ腫、骨肉腫、メラノーマ、および皮膚に生じる他の癌、および白血病等の体の様々な細胞型および器官に生じる。この治療が目指す癌細胞のタイプはまた、乳房、肺、肝臓、前立腺、膵臓、卵巣、膀胱、子宮、結腸、脳、食道、胃および胸腺でもある。調節因子はまた日焼けの阻害、細胞分化の促進および免疫抑制に使用し得る。
【００６１】
本発明のある実施形態では、加水分解性ヌクレオチド間結合を有する本発明のオリゴヌクレオチドを、処置を必要とする患者にオリゴヌクレオチドを投与することにより、増殖停止、アポトーシスまたは増殖老化の不全に関連する病状の処置に使用する。オリゴヌクレオチドは、非加水分解性ヌクレオチド間結合を有してもよい。上記で議論したように、オリゴヌクレオチドの活性を調節して、加水分解性ヌクレオチド間結合の合計濃度に基づいて増殖停止またはアポトーシスを誘導し得る。オリゴヌクレオチドを本発明の調節因子、または他の処置と組み合わせて投与してもよい。
【００６２】
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドを頚部癌、リンパ腫、骨肉種、メラノーマ、皮膚癌、白血病、乳癌、肺癌、肝癌、前立腺癌、膵臓癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮癌、直腸癌、脳腫瘍、食道癌、胃癌および胸腺癌でなる群から選ばれる癌の処置に使用する。
【００６３】
Ｔ−オリゴは、免疫抑制の公知の調節因子であるＴＮＦ−αおよびＩＬ１０の上方制御により、マウスモデルにおけるＵＶ照射と同様な有効性でアレルギー性接触過敏症の誘導または誘発を防止することが可能である。従って、Ｍｒｅ１１の局所または全身アクチベーターは、例えば乾癬または湿疹等のリンパ球媒介皮膚疾患の他、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、紅斑性狼瘡等のリンパ球媒介全身性疾患、および多くの他の疾患の処置におけるステロイド療法に取って代わり得る。
【００６４】
（ｂ．Ｍｒｅ１１、タンキラーゼ、ＤＮＡ損傷経路またはＭＲＮ複合体形成のインヒビター）
Ｍｒｅ１１、タンキラーゼ、ＤＮＡ損傷経路またはＭＲＮ複合体形成の活性を阻害または減少する本発明の調節因子は、単独または他の処置と組み合わせて使用されて、増殖停止、アポトーシスまたは増殖老化に関連する病状を処置し得る。このような病状の代表例にはＵＶ照射への暴露、および正常組織に対する化学療法および放射線療法等の癌処置の副作用、または日光に暴露された正常皮膚における日焼け反応の促進が含まれるが、それに制限されない。細胞分化を阻害するためにも調節因子を使用し得る。
【００６５】
他の実施形態では、非加水分解性ヌクレオチド間結合を有する本発明のオリゴヌクレオチドが、このオリゴヌクレオチドをそのような処置を必要とする患者に投与することにより、増殖停止またはアポトーシスに関連する病状を処置するために使用される。このオリゴヌクレオチドは、加水分解性ヌクレオチド間結合も含み得る。上記に議論したように、オリゴヌクレオチドの活性を調節して、加水分解性ヌクレオチド間結合の合計濃度に基づき増殖停止またはアポトーシスを阻害し得る。オリゴヌクレオチドを本発明の調節因子または他の処置と組み合わせて投与してもよい。
【００６６】
ある好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドがＵＶ照射への暴露、ならびに化学療法および放射線療法等の癌処置の副作用でなる群から選ばれた病状を処置するために使用される。
【００６７】
（ｃ．投与）
本発明の組成物を経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、経吸入、経頬の投与、またその組み合わせを含むがそれらに限定されない任意の方法で投与し得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、腹膜内、皮下、筋肉内、腱鞘内、および骨関節内を含むがそれらに限定されない。
【００６８】
（ｄ．投薬量）
治療に使用するに必要な組成物の治療有効量は、治療する病状の性質、活性を必要とする時間の長さ、および患者の年齢と状態によって変化し、最終的には、担当医によって決定される。しかしながら、一般に成人の治療に用いられる投薬量は、典型的には、１日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。投薬量は、１日当たり約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇでもよい。所望の投薬量は、１回の用量で投薬されるか、適当な間隔で投与される複数回の用量、例えば１日あたり２回、３回、４回またはそれより多くの部分用量として便利に投与され得る。複数回の投薬が望ましいか、必要である。
【００６９】
調節因子の投薬量は、約１μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２５μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１７５μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４２５μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、４７５μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５２５μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、５７５μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６２５μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、６７５μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７２５μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、７７５μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８２５μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、８７５μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９２５μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、９７５μｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇを含むが、それらに限定されない任意の投薬量であってもよい。
【００７０】
（５．スクリーニング法）
本発明はまた、Ｍｒｅ１１活性の調節因子を同定するスクリーニング法に関する。本発明はまた、タンキラーゼ活性の調節因子を同定するスクリーニング法に関する。本発明は、さらにＭＲＮ複合体形成の調節因子を同定するスクリーニング法に関する。さらに、本発明は、ＤＮＡ損傷経路の調節因子を同定するスクリーニング法に関する。スクリーニング法をインビトロ、細胞ベース、遺伝的およびインビボ分析を含むがそれらに限定されない種々のフォーマットで実行し得る。
【００７１】
Ｍｒｅ１１調節因子またはタンキラーゼ調節因子を、場合に応じてＭｒｅ１１またはタンキラーゼに特異的に結合する物質をスクリーニングすることにより同定し得る。免疫沈澱およびアフィニティークロマトグラフィーを含むがそれらに限定されない多くの標準技術を用いて、当業者は、特異的結合物質をインビトロで同定し得る。また、酵母２−ハイブリッドおよびファージディスプレイを含むがそれらに限定されない多くの標準技術を用いる遺伝的スクリーニングを用いて、当業者はまた、特異的結合物質を同定し得る。また、Ｍｒｅ１１またはタンキラーゼをチップ（例えばガラス、プラスチックまたはシリコン）等の固相支持体に付着させることを含むがそれに限定されない高スループット法を用いて当業者はまた、特異的結合物質を同定し得る。
【００７２】
Ｍｒｅ１１調節因子またはタンキラーゼ調節因子をまた、場合に応じてＭｒｅ１１またはタンキラーゼの活性を調節する物質についてインビトロでスクリーニングすることにより同定し得る。場合に応じて、Ｍｒｅ１１またはタンキラーゼを予想される調節因子と接触させ、予想される調節因子がＭｒｅ１１またはタンキラーゼの活性を変化させるかどうかを決定することにより、調節因子を同定し得る。Ｍｒｅ１１の核酸基質の加水分解を測定することにより、Ｍｒｅ１１の活性を決定し得る。核酸基質の加水分解をＵＶ吸収の測定、および好ましくは、標識オリゴのゲル分析または非沈殿性ヌクレオチド塩基の回収を含むがそれらに限定されない方法により決定し得る。タンキラーゼの活性を、ＴＲＦ１を含むがそれに限定されないペプチドまたはポリペプチドのリン酸化を測定することにより決定し得る。
【００７３】
Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１を組み合わせ、コントロールと比較してＭＲＮ複合体形成に対する候補調節因子の効果を測定することにより、ＭＲＮ複合体形成の調節因子をインビトロで同定し得る。遠心分離、共沈殿および非変性電気泳動を含むがそれらに限定されない当業者に公知の多くの標準技術を用いてＭＲＮ複合体の形成を測定し得る。
【００７４】
細胞ベース分析でＭｒｅ１１またはタンキラーゼの活性を調節する物質をスクリーニングすることにより、Ｍｒｅ１１調節因子またはタンキラーゼ調節因子を同定し得る。ＤＮＡ損傷経路の調節因子も同様に同定し得る。細胞を疑わしい調節因子と接触させ、疑わしい調節因子がアポトーシス、老化、またはｐ５３またはｐ９５のリン酸化のレベルを変化させるかどうかを決定して、調節因子を同定し得る。上記で議論したように、候補調節因子は、Ｍｒｅ１１またはタンキラーゼと特異的に結合する物質であってもよい。アポトーシスの調節をＦＡＣＳ分析におけるサブＧ０／Ｇ１ピークのサイズの測定、ＴＵＮＥＬ分析、ＤＮＡラダー分析、アネキシン分析、またはＥＬＩＳＡ分析を含むがそれらに限定されない方法により測定し得る。老化に関連するβ−ガラクトシダーゼ活性の測定、または細胞収量の増加不能またはｐＲｂリン酸化不能またはマイトジェン刺激後の３Ｈ−チミジンの取り込み不能を測定することにより、老化の調節を決定し得る。ゲルシフトアッセイにより、ｐ５３プロモーター駆動ＣＡＴまたはルシフェラーゼコンストラクト読み出しにより、またはｐ２１等のｐ５３−制御遺伝子生成物の誘導により、セリン１５またはセリン３７におけるｐ５３のリン酸化を測定することにより、ｐ５３活性の調節を決定し得る。ウェスタンブロット分析におけるｐ９５バンドの移動により、またはＳ期停止を検出するためのＦＡＣＳ分析により、セリン３４３におけるｐ９５のリン酸化を測定することによりｐ９５活性の調節を決定し得る。また、インビボ腫瘍形成を調節する物質をスクリーニングすることにより、Ｍｒｅ１１調節因子またはタンキラーゼ調節因子を同定し得る。
【００７５】
細胞ベース分析で任意の細胞を使用し得る。本発明で使用するための細胞には、哺乳動物細胞が含まれることが好ましく、ヒトおよびヒト以外の霊長類細胞が含まれることがより好ましい。適当な細胞の代表例には、初代（正常）ヒト皮膚繊維芽細胞、上皮ケラチン細胞、メラニン形成細胞、および対応する不死化細胞株または形質転換細胞株；および初代マウス細胞株、不死化マウス細胞株または形質転換マウス細胞株が含まれるがそれらに限定されない。タンパク質リン酸化の量を比色分析、発光分析、蛍光分析およびウェスタンブロットを含むがそれらに限定されない当業界の標準技術により測定し得る。
【００７６】
予期される調節因子を混合等により細胞に添加する条件は、アポトーシスまたはシグナル伝達を妨害する他の調節化合物が基本的に存在しない場合、細胞がアポトーシスまたはシグナル伝達を受け得る条件である。有効な条件には、細胞増殖を可能にする、適当な媒体、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれるが、それらに限定されない。適当な媒体は、典型的には、成長因子および同化可能炭素、窒素および燐源の他、適当な塩、ミネラル、金属、およびビタミン等の他の栄養物を含む固体または液体の媒体であり、細胞がアポトーシスまたはシグナル伝達を示し得るように細胞を培養できる有効媒体を含む。例えば、哺乳動物細胞では、媒体は１０％のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地を含み得る。
【００７７】
各細胞を組織培養フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、およびペトリプレートを含むがそれらに限定されない様々な容器中で培養し得る。培養を細胞に対して適当な温度、ｐＨおよび二酸化炭素含有量で行う。このような培養条件も当業者の範囲内である。
【００７８】
予期される調節因子を細胞に加える方法には、エレクトロポーレーション、ミクロインジェクション、細胞発現（すなわち裸の核酸分子、組み換えウイルス、レトロウイルス発現ベクターおよびアデノウイルス発現を含めた発現系を用いる）、因子の培地への添加、イオン対形成因子の使用、および細胞を透過性にするための洗剤の使用が含まれる。
【００７９】
候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＤＮＡフラグメント、ＲＮＡおよびＲＮＡフラグメント等を含むポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン等の天然に存在する分子；またはペプチド模倣物等の天然に存在する分子のアナログまたは誘導体；ならびに「低分子」有機化合物等の天然に存在しない分子等でよい。用語「低分子有機化合物」は、一般的に分子量約１０００以下、好ましくは、約５００以下を有する有機化合物を指す。
【００８０】
候補調節因子は、コンビナトリアルケミストリー技術、発酵法、植物および細胞抽出法等を含むがそれらに限定されない手段で調製され得る、または得られ得るライブラリー（すなわち化合物のコレクション）中に存在し得る。コンビナトリアルライブラリーの作成法は、周知である。例えばＥ．Ｒ．Ｆｅｌｄｅｒ、Ｃｈｉｍｉａ、１９９４、４８、５１２−５４１；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４、３７、１２３３−１２５１；Ｒ．Ａ．Ｇｏｕｇｈｔｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１９９３、９、２３５−２３９；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１、３５４、８４−８６；Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１、３５４、８２−８４；Ｃａｒｅｌｌら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９５、３、１７１−１８３；Ｍａｄｄｅｎら、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ、２、２６９−２８２；Ｃｗｉｒｌａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０、８７、６３７８−６３８２；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、５３８１−５３８３；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４、３７、１３８５−１４０１；Ｌｅｂｌら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、１９９５、３７、１７７−１９８；およびそれらの中に引用された参考文献参照。
【００８１】
本発明は、以下の非制限的実施例に示された多様な局面を有する。
【実施例】
【００８２】
（実施例１）
（オリゴヌクレオチドがアポトーシスを誘発し得る）
テロメア突出反復配列（ＴＴＡＧＧＧ；配列番号１）に相同のオリゴヌクレオチド、配列（１１マー−１：ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号２）のオリゴヌクレオチド、この配列に相補性のオリゴヌクレオチド（１１マー−２：ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ；配列番号３）、およびテロメア配列に関係しないオリゴヌクレオチド（１１マー−３：ｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ；配列番号４）を、テロメア破壊に応じてアポトーシスを行うと報告されているヒトＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞の培養物に添加した。コントロール細胞が２５〜３０％であるのと比較して、４８時間以内に、４０μＭの配列番号５で処理した細胞の５０％がＳ期に集積し（ｐ＜０．０００３、ノンペアｔ検定、図１Ａ〜１Ｄ参照）、コントロールが２〜３％であるのと比較して、７２時間でこれらの細胞の１３％がサブＧ０／Ｇ１含有率で決定してアポトーシス性であった（ｐ＜０．００７、ノンペアｔ検定、図１Ｅ〜１Ｈ参照）。コントロールが３〜５％であるのと比較して、９６時間で、１１マー−１処理細胞の２０±３％がアポトーシス性であった（ｐ＜０．０００１、ノンペアｔ検定）。その無二の効果の説明として１１マー−１の優先的な取り込みを排除するため、Ｊｕｒｋａｔ細胞を３’末端にフルオレセインホスホルアミダイトで標識したオリゴヌクレオチドで処理し、次いで共焦点顕微鏡法およびＦＡＣＳ分析に供した。細胞の蛍光強度は、４時間および２４時間において全ての処理後で同じであった。ウェスタン分析は、１１マー−１添加後の２４時間でｐ５３が増加したが、１１マー−２または１１マー−３では増加せず、Ｅ２Ｆ１転写因子のレベルが同時に増加したことを示した。この因子は、アポトーシスの誘導でｐ５３と協力し、ヒト繊維芽細胞でｐ５３に依存して老化表現型を誘導する他、Ｓ期チェックポイントを制御することが知られている。
【００８３】
（実施例２）
（テロメア突出ホモログ１１マー−１のホスホロチオエートバージョンは、アポトーシスを誘導しない）
ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞の培養物を希釈剤、１１マー−１（配列番号１）またはホスホロチオエート１１マー−１（１１マー−１−Ｓ）のいずれかで９６時間処理し、細胞を集めＦＡＣＳ分析用に処理した。０．４μＭ（図２Ａ〜２Ｃ）および４０μＭ（図２Ｄ〜２Ｆ）の２種類の濃度のオリゴヌクレオチドを試験した。０．４μＭでは、いずれのオリゴヌクレオチドも予期されたＪｕｒｋａｔ細胞の対数的に増殖する細胞周期プロフィールに影響しなかった。４０μＭでは、１１マー−１は、サブＧ０／Ｇ１ピークで示される広範囲のアポトーシスを誘導したが、１１マー−１−Ｓは、影響しなかった。
【００８４】
（実施例３）
（１１マー−１のホスホロチオエートバージョンは、ホスフェート骨格１１マー−１によるＳ期停止の誘導を妨害する）
ケラチン細胞株の培養物（ＳＳＣ１２Ｆ、１００，０００細胞／３８ｃｍ２）を１１マー−１（配列番号２）のみ、または濃度を増加させた１１マー−１−Ｓの存在下で、１１マー−１により４８時間処理した。実施例１で先に示したように、１１マー−１は、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦａｃＳｃａｎ）で示されるＳ期停止を誘導した。コントロールである希釈剤で処理した細胞が２６％であるのと比較して、細胞の４３％がＳ期であった。しかしながら、ホスホロチオエート１１マー−１の濃度を増加してこれらの培養物に加えると、停止した細胞の数は、より少なかった（図３Ａ〜３Ｇ）。この停止の完全な阻害が１１マー−１：１１マー−１−Ｓの比が２：１である場合に見られた。１１マー−１−Ｓ自体は、Ｓ期停止を誘導しなかった。
【００８５】
（実施例４）
（テロメアオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート型は、構成的色素沈着およびＵＶ誘導色素沈着を誘導し、メラニン生成を刺激しない）
Ｓ９１マウスメラニン細胞の培養物（１００，０００細胞／３８ｃｍ２）を１００μＭのｐＴｐＴまたはホスホロチオエートｐＴｐＴ（ｐＴｓｐＴ）（図４）、または４０μＭの１１マー−１またはホスホロチオエート１１マー−１（１１マー−１−Ｓ）（図５）で６日間処理し、細胞を集め計数し、メラニン含有量を分析した。ｐＴｐＴおよび１１マー−１は、これらの細胞中でメラニン生成を刺激したが（それぞれ図４および図５）、ｐＴｓｐＴおよび１１マー−１−Ｓは、刺激しなかった（それぞれ図４および図５）。さらに、ｐＴｓｐＴ（図４）および１１マー−１−Ｓ（図５）は、これらの細胞中の構成的色素沈着を減少させた。このことは、テロメア修復／複製中にこの配列を慢性的に暴露するとメラニン生成に対する定常的な低いレベルのシグナルを提供し得、このシグナルがｐＴｓｐＴおよび１１マー−１−Ｓで妨害されることを示唆している。
【００８６】
（実施例５）
（ホスホロチオエートｐＴｓｐＴは、ＵＶ誘発メラニン生成を阻害する）
Ｓ９１細胞の２重の培養物（１００，０００細胞／３９ｃｍ２）を偽照射、またはリサーチラジオメータ（モデルＩＬ１７００Ａ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ、Ｎｗｅｂｕｒｙｐｏｒｔ、ＭＡ）を用いる２８５±５ｎｍで計測して、１ｋＷキセノンアークソーラーシミュレーター（ＸＭＮ１０００−２１、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ、Ａｚｕｚａ、ＣＡ）からの５ｍＪ／ｃｍ２の太陽シミュレーション光で照射した。枚の偽照射プレートに１００μＭのｐＴｓｐＴを追加し、２種の照射培養物も同様にｐＴｓｐＴで処理した。１週間後、細胞を集めて計数し、細胞ペレットを１ＮのＮａＯＨに溶解し４７５ｎｍの光学濃度を測定してメラニン含量を分析した。ＵＶ照射によりこれらの細胞中のメラニン含有量は、２倍になった。しかしながら、この反応は、ｐＴｓｐＴを加えることにより妨害された（図６）。さらに、図４および５に示したデータと同様、これらの細胞の構成的色素沈着がｐＴｓｐＴにより偽照射培養物中で減少した。
【００８７】
（実施例６）
（活性には、Ｔ−オリゴの加水分解が必要である）
配列番号２に基づくオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド１を完全にホスホロチオエート骨格で合成した。オリゴヌクレオチド２は、各末端に２個のホスホロチオエート結合を有し、中央の他の結合は、ホスホジエステル結合であった。オリゴヌクレオチド３は、５’末端に２個のホスホロチオエート結合を有し（５’末端をブロック）、残りの結合は、ホスホジエステル結合であった。オリゴヌクレオチド４は、３’末端に２個のホスホロチオエート結合を有し（３’末端をブロック）、残りの結合は、ホスホジエステル結合であった。図７参照。
【００８８】
これらのオリゴヌクレオチドを正常新生児繊維芽細胞の培養物に加えた。４８時間後、細胞を集め、ウェスタンブロットによりｐ５３セリン１５リン酸化およびｐ９５／Ｎｂｓ１リン酸化を分析した。他の培養物をオリゴヌクレオチドの存在下で１週間放置し、次いで細胞を老化関連β−ガラクトシダーゼ活性について染色した（ＳＡ−β−Ｇａｌ）。β−ガラクトシダーゼ陽性細胞を計数し、全細胞の％として表した（図８）。
【００８９】
ヌクレアーゼが接近し得る３’末端を有するオリゴヌクレオチドは、ｐ５３およびｐ９５／Ｎｂｓ１リン酸化等の「初期」反応刺激で、最も効果的であった。しかしながら、ヌクレアーゼが接近し得る５’末端を有するオリゴヌクレオチドも１週間後に老化表現型を誘導し得るが、４８時間でリン酸化反応を誘導せず、３’→５’ヌクレアーゼ感受性が老化誘導活性に好ましいことを示唆している。
【００９０】
（実施例７）
（Ｍｒｅ１１タンパク質レベルのダウンレギュレーションは、Ｔ−オリゴの反応を妨害する）
正常ヒト新生児繊維芽細胞を１０ピコモルのＭｒｅ１１ ｓｉＲＮＡまたは１０ピコモルのコントロール（発現したヒト配列中に相同性が見出されない）のいずれかで処理した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの日に培養皿は、約６０％の密集であった。製造業者によって供給されるプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクション混合物を細胞に５時間作用させ、次いで新鮮な培地のみに交換した。翌日、トランスフェクションプロトコールを繰り返した。翌日、二重培養物をＴ−オリゴまたは負コントロールとしての希釈剤のみで処理した。４８時間後に細胞を集め、ホスホｐ９５セリン３４３特異性抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、Ｍｒｅ１１特異性抗体（ＧｎｅｎＴｅｘ、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）、ホスホロｐ５３セリン１５特異性抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびトータルｐ５３特異性抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてウェスタンブロットによりタンパク質を分析した（図９）。Ｈｅｌａ細胞溶解物をＭｒｅ１１に対する正のコントロールとして用いた。１０ＧｙＩＲに暴露、または偽照射し、１時間後に集めた正常繊維芽細胞をｐ５３およびｐ９５／Ｎｂｓ１リン酸化に対する正のコントロールとした。濃度計でオートラジオグラフを分析し、Ｔ−オリゴ試料に対する値を希釈剤処理試料に対する値として表した（図１０および図１１）。ローディングに関して補正後、ＭＲＥ１１レベルが有意に減少した細胞では、Ｔ−オリゴに対するホスホｐ５３反応が減少し、ホスホｐ９５／Ｎｂｓ１反応がないことが明らかである。
【００９１】
（実施例８）
（ｐ５３経路およびｐＲｂ経路双方の不活性化がＲ２Ｆ繊維芽細胞でＴ−オリゴ誘導老化を逃れるために必要である）
（オリゴヌクレオチド）
２種のＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用した。１つは、テロメア突出部に相同（Ｔ−オリゴ：ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号２）であり、もう１つは、それに相補性（ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ；配列番号３）であり、負のコントロールとして用いた。これらのオリゴは、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｔｅｘａｓ）により合成された。オリゴヌクレオチドを以前に記載のように調製した（Ｅｌｌｅｒら、［２００３］テロメア３’突出特異性ＤＮＡによるｐ９５／Ｎｂｓ−１媒介Ｓ期チェックポイントの誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐ９５／Ｎｂｓ−１−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓ−Ｐｈａｓｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｙ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ３’ｏｖｅｒｈａｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ）、Ｆａｓｅｂ Ｊ１７，１５２−１６２）。
【００９２】
（細胞源および培養）
Ｒ２Ｆ新生児皮膚繊維芽細胞、および誘導されたｐ５３ＤＤ、ｃｄｋ４Ｒ２４Ｃおよびｐ５３ＤＤ／ｃｄｋＲ２４Ｃ形質導入体（Ｊａｍｅｓ Ｇ．Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ博士（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）からの寛大な贈り物）は、機能性ｐ５３経路、ｐＲｂ経路および双方の経路がそれぞれ欠けている。
【００９３】
（老化関連β−ガラクトシダーゼ染色）
細胞を希釈剤のみ、４０μＭのＴ−オリゴまたは４０μＭの相補性オリゴで１週間、液を取り替えないで１回処理した。次いで細胞を２％ホルムアルデヒド／０．２％グルタルアルデヒド中で３〜５分固定し、文献記載（Ｄｉｍｒｉら、［１９９５］培養物およびインビボでの老化皮膚中で老化ヒト細胞を同定するバイオマーカー（Ａ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｔｈａｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ Ａｇｉｎｇ Ｓｋｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２，９３６３−９３６７）通りに３７℃（大気中のＣＯ２）で終夜、新鮮な老化関連β−Ｇａｌ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）染色液でインキュベーションした。
【００９４】
（ウェスタンブロット分析および抗体）
以前に記載（Ｅｌｌｅｒら、［１９９６］ＤＮＡ損傷がメラニン形成を促進する（ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３，１０８７−１０９２）されているようにウェスタンブロット分析を行った。以下の抗体を使用した：ＤＯ−１（Ａｂ−６）抗ｐ５３（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、抗ホスホｐ５３（ｓｅｒ１５）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、抗ホスホｐＲｂ（ｓｅｒ７８０、ｓｅｒ７９５、ｓｅｒ８０７／８１１）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、抗ｃｄｋ４（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）および抗アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）。
【００９５】
（クローン形成性分析）
ヒト繊維芽細胞を希釈剤のみ、４０μＭのＴ−オリゴまたは４０μＭの相補性オリゴで１週間処理し、トリプシン処理を行って計数した。３００個の細胞を６０ｍｍの培養皿中に３連で接種し、完全培地中で週に２回培地を交換して２週間インキュベーションした。次いで細胞を１００％メタノール中で５分間固定した。メタノールを除去し、培養皿を水で短時間濯いだ。コロニーをＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）メチレンブルー溶液中で１０分間染色し、再度水で１回洗浄し計数した。
【００９６】
（ＢｒｄＵ取り込み分析）
Ｐｅｒｍａｎｏｘチャンバースライド上で培養したＨＴ−１０８０線維肉腫細胞を希釈剤、４０μＭのＴ−オリゴおよび４０μＭの相補性オリゴで４日間処理し、製造業者が提供するプロトコールに従って５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識および検出キットＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてＤＮＡ合成を分析した。簡単に言えば、細胞をＢｒｄＵで１時間標識し、固定して抗ＢｒｄＵモノクローン抗体でインキュベーションした。抗マウスＩｇアルカリホスファターゼとインキュベーション後、光学顕微鏡で発色反応を検出した。
【００９７】
（テロメアの長さ）
ＨＴ−１０８０繊維肉腫細胞を希釈剤、４０μＭのＴ−オリゴまたは４０μＭの相補性オリゴで４日間処理し、次いでＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡを単離した。製造業者が提供するプロトコールに従い、Ｔｅｌｏ ＴＴＡＧＧＧ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ Ｌｅｎｇｔｈ Ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてテロメア長を決定した。簡単に言えば、１μｇの精製ゲノムＤＮＡをＨｉｎｆ１／Ｒｓａ１で消化し、０．８％アガロースゲルでＤＮＡフラグメントを分離し、次いでサザンブロットのためにナイロン膜上に移し、テロメア反復に特異的なジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識プローブとハイブリダイズし、抗ＤＩＧアルカリホスファターゼでインキュベーションした。末端制限フラグメント（ＴＲＦ）を化学発光で検出した。露光したＸ−線フィルムを濃度計で走査して平均ＴＲＦ長を計算し、先に記載（Ｈａｒｌｅｙら、［１９９０］ヒト繊維芽細胞の老化中にテロメアが短縮する（Ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ Ｓｈｏｒｔｅｎ ｄｕｒｉｎｇ Ａｇｅｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、Ｎａｔｕｒｅ、３４５，４５８−４６０）されたように計算した。
【００９８】
（結果）
老化繊維芽細胞は、特徴的に大きく平坦な形態を示し、老化関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）活性の増加を示す。ＴＲＦ２ＤＮの異所発現は、テロメアループ構造を破壊し、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路を活性化することにより正常なヒト繊維芽細胞における老化を誘導する。ＴＲＦ２ＤＮ誘導老化を阻止するためには、ヒト細胞中のｐ５３経路およびｐＲｂ経路の双方を妨害することが必要である。
【００９９】
ｐ５３経路および／またはｐＲｂ経路が欠失するように遺伝子操作された細胞株をＴ−オリゴ誘導老化に関与するシグナル伝達経路を分析するために使用した。ｐ５３の転写トランス活性化ドメインが欠失し、内因性野生型ｐ５３タンパク質に結合し不活性化するドミナントネガティブ変異体ｐ５３（ｐ５３ＤＤ）の異所発現により、ｐ５３経路の不活性化を行った。ｐ５３の転写標的であるｐ２１／ＳＤＩ１タンパク質は、ｐ５３ＤＤを発現するように形質導入されたＲ２Ｆ繊維芽細胞中では、検出レベル未満であった（データ示さず）。ｐ１６を結合できないｐ１６不感性変異体ｃｄｋ４（ｃｄｋ４Ｒ２４Ｃ）の異所発現により、ｐＲｂ経路の破壊を行い、そのｐＲｂタンパク質の制御を破壊した。双方の経路の抑制を双方の変異体（ｐ５３ＤＤ／ｃｄｋ４Ｒ２４Ｃ）の異所発現により行った。ｐ５３ＤＤおよびｃｄｋ４Ｒ２４Ｃの発現をウェスタンブロットで確認し、ｐ５３とｃｄｋ４タンパク質の過剰発現をそれぞれ示した（図１２ａ）が、これは、ヒトケラチン細胞がこれらの変異体で形質導入されるという以前の報告と一致している。
【０１００】
細胞を希釈剤または４０μＭのＴ−オリゴで１週間処理し、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性を分析した。正常新生児包皮繊維芽細胞親株（Ｒ２Ｆ）を正のコントロールとして用いた。予期されるように、Ｔ−オリゴ処理Ｒ２Ｆ繊維芽細胞は、希釈剤処理コントロール細胞と比較して大きく広がった形態とＳＡ−β−Ｇａｌ活性の増大を示した（それぞれ６５±７％および８±１％のＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞、ｐ＜０．０１：図１２ｂおよび１２ｃ）。同様に、ｐ５３ＤＤ Ｒ２Ｆ繊維芽細胞では、Ｔ−オリゴへの１週間の暴露により、Ｔ−オリゴ処理Ｒ２Ｆ繊維芽細胞は、希釈剤処理細胞と比較して大きく広がった形態とＳＡ−β−Ｇａｌ活性の増大を示し（それぞれ４５±４％および６±２％のＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞、ｐ＜０．０１：図１２ｂおよび１２ｃ）、ｐ５３経路のみの不活性化は、Ｔ−オリゴ誘導老化の抑制に不十分であることを示している。Ｔ−オリゴは、ｃｄｋ４Ｒ２４ＣＲ２Ｆ繊維芽細胞中に、希釈剤処理細胞と比較して老化表現型を誘導し（それぞれ６０±５％および７±３％、ＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞、ｐ＜０．０１：図１２ｂおよび１２ｃ）、ｐＲｂ経路のみを弱めることもＴ−オリゴ誘導老化の抑制に十分でないことを示している。しかしながら、Ｒ２Ｆ繊維芽細胞がｐ５３ＤＤとｃｄｋ４Ｒ２４Ｃとの双方を発現するように形質導入された場合、Ｔ−オリゴは、希釈剤処理細胞と比較して老化表現型を誘導することができず（それぞれ７±１％および５±２％、ｐ＞０．０５：図１２ｂおよび１２ｃ）、ｐ５３経路とｐＲｂ経路の双方を弱めることがヒト繊維芽細胞中でＴ−オリゴ誘導老化を完全に抑制するために必要であること示している。従って、Ｔ−オリゴ誘導老化の条件は、ＴＲＦ２ＤＮにより誘導される連続継代培養または老化後の複製老化の条件と同じである。
【０１０１】
（実施例９）
（ｐ５３経路およびｐＲｂ経路双方の不活性化は、ＨＴ−１０８０細胞中のＴ−オリゴ誘導老化を逃れるために必要である）
ＴＲＦ２ＤＮは、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞で老化表現型を誘導すると報告されている。テロメア３’突出ＤＮＡ（Ｔ−オリゴ）への暴露もこれらの細胞中で老化を誘導するか否かを決定するため、ＨＴ−１０８０細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を希釈剤単独、Ｔ−オリゴまたはコントロールとしての相補性オリゴで４日間処理し、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性を評価した。Ｔ−オリゴ処理細胞のみが広がった形態とＳＡ−β−Ｇａｌ活性の増加を示した（図１３ａ）。Ｔ−オリゴ処理培養物は、希釈剤または相補コントロールオリゴ処理培養物より多いＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞を含んでいた（それぞれ８０±７％、３±２％および６±３％、ｐ＜０．０１；図１３ｂ）。また、ＢｒｄＵの取り込みの顕著な減少で示されるように、希釈剤でもコントロールオリゴ処理細胞でもなく、Ｔ−オリゴ処理細胞のみが増殖しなかった（それぞれ７±２％、９０±８％および８５±１０％、ｐ＜０．０１；図１３ｃおよび１３ｄ）。
【０１０２】
（実施例１０）
（テロメアオリゴヌクレオチドがｐＲｂのリン酸化を阻止する）
ＨＴ−１０８０細胞は、機能性ｐＲｂを有することが知られているが、ｐ５３経路は、ｐ１６が欠失する結果としてそれが欠けている。本発明者らは、次に、ＨＴ−１０８０細胞におけるそのリン酸化を阻止することによりＴ−オリゴ処理がｐＲｂを活性化するか否かを調べた。ウェスタンブロット分析により、Ｔ−オリゴに反応してセリン７８０、セリン７９５およびセリン８０７／８１１上でｐＲｂリン酸化が著しく選択的に減少することが分かった（図１３ｅ）。興味あることに、ｐ１６が欠失する腫瘍中では、ｐＲｂは、無傷で機能性であることが多い。これらの細胞中では、ｃｄｋ４の脱制御は、ｐＲｂ過剰リン酸化をもたらし、際限のない細胞増殖と腫瘍形成が行われる。ｃｄｋ２でなくＣｄｋ４の活性化がセリン７８０およびセリン７９５上でｐＲｂをきわめて効率的にリン酸化する。従って、この発見は、Ｔ−オリゴがｐ１６のない場合に、多分他のＩＮＫ４ファミリーメンバーの誘導によりｃｄｋ４活性を阻害することを示唆しており、ｐＲｂ制御の複雑なネットワーク中でｐ１６が必須の役割でないことを示し、またｐＲｂが絶対的な下流エフェクターであると単純にみなすことができないことを示唆している。
【０１０３】
（実施例１１）
（テロメアオリゴヌクレオチドの効果は、可逆的でない）
Ｔ−オリゴを除くことが線維肉腫細胞の老化表現型を反転するか否かを試験するため、ＨＴ−１０８０細胞の並行培養物を希釈剤または４０μＭのＴ−オリゴまたは４０μＭの相補コントロールオリゴで４日間処理した。次いでオリゴヌクレオチド処理をそれ以上行わず、細胞に新鮮な完全培地を与えた。１および２日後に、Ｔ−オリゴ前処理細胞は、大きくなった形態とＳＡ−β−Ｇａｌ活性の増加をまだ示し（図１４ａ）、ＤＮＡ合成を再開しなかった（図１４ｂ）。ウェスタン分析も、ｐＲｂタンパク質がＴ−オリゴ前処理細胞中で活性な阻害状態に維持されていることを示していた（図１４ｃ）。
【０１０４】
Ｔ−オリゴ処理の細胞増殖に対する長期効果を決めるため、ＨＴ−１０８０ヒト線維肉腫細胞を希釈剤のみ、４０μＭのＴ−オリゴまたは４０μＭの相補コントロールオリゴのいずれかで１週間処理し、次いで同じ数の細胞を再プレーティングし、それ以上処理せずに培地を週２回、２週間交換し、次いでメチレンブルーで染色した（図１５ａ）。相補オリゴ処理細胞と比較して（希釈剤で処理したコントロールの９０．５±９．４％）、Ｔ−オリゴで前処理した細胞のクローン形成能は、ほとんど完全に抑制された（希釈剤で処理したコントロールの５．７±１．９％、ｐ＜０．０１；図１５ｂ）。これらのデータは、この悪性細胞株におけるＴ−オリゴ誘導老化が可逆的でないことを示している。
【０１０５】
（実施例１２）
（テロメアオリゴヌクレオチドの平均テロメア長さに対する効果）
ＨＴ−１０８０細胞における平均テロメア長さ（ＭＴＬ）に対するＴ−オリゴの影響を決定するため、老化表現型が容易に観察された時間に相当する、Ｔ−オリゴで４日間処理した細胞を分析した。希釈剤処理（５．６１ｋｂ）または相補オリゴ処理コントロール（５．５１ｋｂ）と比較して、Ｔ−オリゴは、ＭＴＬ（５．５６ｋｂ）を変えなかった（図１６）。計算されたＭＴＬにおける１００ｂｐ未満の差は、実験変動の範囲内であり、有意ではない。これは、ＴＲＦ２ＤＮによるテロメアの破壊後に見られたように、１週間までの繊維芽細胞のＴ−オリゴによる処理は、テロメア３’突出部の分解をもたらさないという観察と一致している（データ示さず）。テロメアループの破壊は、ＭＴＬの急速な短縮と３’突出部の消化を生じることが知られているので、Ｔ−オリゴがＭＴＬに影響せず、または３’突出部の消化を生じずに類似または同一のシグナル伝達を開始すると言う事実は、テロメアループ破壊がなくても、すなわちＤＮＡ損傷がなくても、Ｔ−オリゴが３’突出配列の露出を真似ることを示している。
【０１０６】
（実施例１３）
（Ｔ−オリゴ反応にＰＡＲＰ活性が必要である）
Ｔ−オリゴに反応するＰＡＲＰの役割を調べるため、４０μＭのＴ−オリゴまたはコントロールとしての等量の希釈剤を加える前に、２種の異なったＰＡＲＰインヒビターである３−アミノベンズアミド（３ＡＢ、２．５ｍＭ）または１，５−ジヒドロキシキノリン（ＩＱ、１００μＭ）の一つで２時間、繊維芽細胞を前処理した。Ｔ−オリゴまたは希釈剤（Ｄ）を添加してから４時間後、各インヒビターの追加用量を細胞に与えた。繊維芽細胞を３ＡＢおよびＴ−オリゴで処理し、次いで４８時間後にウェスタンブロット用に細胞を集めた。全ｐ５３、ｐ２１およびｐ５３セリン１５のリン酸化（ｐ５３活性化を示す）のＴ−オリゴ誘発アップレギュレーションは、すべて、３ＡＢの存在下で減少した（図１７Ａ）。
【０１０７】
ＩＱで前処理した繊維芽細胞も、Ｔ−オリゴの添加後１６、２０、２４時間で全ｐ５３およびセリン１５上のリン酸化ｐ５３の誘導を同様に示した（データ示さず）。全ｐ５３、ｐ５３ホスホセリン１５およびｐ２１のＴ−オリゴ媒介誘導の妨害に対するＩＱの影響は、Ｔ−オリゴ添加後４８時間を通して持続残留した。これらのデータは、Ｔ−オリゴに対するｐ５３反応が上流のＰＡＲＰ活性を必要とすることを示している。
【０１０８】
（実施例１４）
（ＰＡＲＰインヒビターがｐ５３活性化およびＴＲＦ２ＤＮによる誘導を阻止する）
新生児繊維芽細胞をＡｄＴＲＦ２ＤＮまたは負のコントロールとしてのＡｄＧＦＰで処理した。感染の２時間前に、細胞を希釈剤、３ＡＢ（２．５ｍＭ）またはＩＱ（１００μＭ）で処理した。３日後、ｃ−ｍｙｃ−タグＴＲＦ２ＤＮ（感染を確認するため）、ｐ５３セリン１５リン酸化およびｐ２１誘導に関するウェスタン分析のために細胞を集めた。図１７Ｆのレーン２をレーン４および６と比較すると、３ＡＢおよびＩＱの双方がＴＲＦ２ＤＮに反応してｐ５３リン酸化とｐ２１誘導とを減少させたことを示す。
【０１０９】
（実施例１５）
（Ｔ−オリゴの効果は、テロメラーゼに依存しない）
Ｓａｏｓ−２細胞は、報告によれば、テロメラーゼ陰性であるがＡＬＴ経路によりテロメアを維持する骨肉種細胞株である。Ｓａｏｓ−２細胞株を希釈剤または４０μＭの指定されたオリゴヌクレオチドで処理し、ＦＡＣＳ分析のために４８時間後に細胞を集めた。相同ヌクレオチドのみが細胞のＳ期停止を生じた（図１８ａ）。さらに、テロメア突出オリゴヌクレオチドは、ＩＲによる他にｐ９５／Ｎｂｓ１のリン酸化を誘導した（図１８ｂ）。この結果は、テロメア陰性細胞中のＴ−オリゴの効果がテロメア陽性悪性細胞株中の反応と同じであることを示す。
【０１１０】
（実施例１６）
（ＰＡＲＰタンキラーゼタンパク質レベルのダウンレギュレーションがＴ−オリゴの反応を妨害する）
ヒト繊維芽細胞のペア培養物をタンキラーゼｓｉＲＮＡ、非特異性ｓｉＲＮＡ（コントロール）で１回処理するか、第２コントロールとして模擬トランスフェクトした。２日後、タンキラーゼｓｉＲＮＡ処理細胞中のタンキラーゼレベルが顕著に減少した時点で、培養物に１１マー−１（ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号２）または相補配列１１マー−２を補充した。さらに２４時間後、細胞を集め、セリン３４３でのｐ９５リン酸化に特異的な抗体を用いてウェスタンブロットのために加工し、活性化ＡＴＭキナーゼによるｐ９５修飾を示した。フィルムを濃度測定に供し、各グループの細胞に対する希釈剤コントロールを任意の単位で１．０とした（図１９）。予期されたように、正常なタンキラーゼレベルを有する細胞では、Ｔ−オリゴ処理細胞は、リン酸化ｐ９５の量が２倍であったが、コントロールオリゴ処理細胞または希釈剤処理細胞中の増加は、わずか３０〜４０％であった。しかしながら、タンキラーゼノックダウン群では、１１−マー−１処理細胞は、ｐ９５リン酸化の増加を示さなかった（コントロールの１．０および１．３に対してレベル１．１）。これらのデータは、テロメア関連ＰＡＲＰであるタンキラーゼが、ＡＴＭ活性化とそれに続くｐ９５修飾（リン酸化）を引き起こし、処理細胞のＳ期停止（Ｅｌｌｅｒら、ＦＡＳＥＢ Ｊ、２００３）を生じるＴ−オリゴシグナルを形質導入するために必要であることを示している。
【０１１１】
（実施例１７）
（Ｔ−オリゴは、ｐ５３の非ＡＴＭ媒介リン酸化を生じる）
正常新生児繊維芽細胞を希釈剤または４０μＭ（１１マー−１）で４、６、８、１９、２４および４８時間処理し、ｐ５３ホスホセリン３７特異性抗体を用いるウェスタンブロット分析のために集めた。偽およびＩＲ照射（１０Ｇｙ）繊維芽細胞をそれぞれ陰性コントロールおよび陽性コントロールとして使用した。ウェスタンブロットにおいてｐ５３セリン３７に対応するバンド強度の増加が早くも８時間で検出され、４８時間では、希釈剤（Ｄ）処理試料と比較してＴ−オリゴ（Ｔ）処理試料中できわめて顕著であった。
【０１１２】
上記に示すように、Ｔ−オリゴは、セリン１５上でｐ５３のリン酸化を生じる。セリン１５におけるｐ５３のリン酸化は、ＡＴＭにより媒介される。図２０は、Ｔ−オリゴがセリン３７上のｐ５３のリン酸化も生じることを示している。セリン３７におけるｐ５３のリン酸化は、ＡＴＭ関連（ＡＴＲ）キナーゼまたはＤＮＡ−ＰＫキナーゼのいずれかで媒介されるが、ＡＴＭにより媒介されることは、知られていない。従って、ｐ５３セリン３７の実証は、経路活性化のまた別なマーカーであり、これらのキナーゼのうちの１つまたは両方がＭｒｅ１１活性化の下流標的である。さらに、Ｍｒｅ１１経路を活性化する治療効果の多くは、擬似ＵＶ的であり、ＵＶは、ＡＴＲとＤＮＡ−ＰＫの双方を活性化するがＡＴＭを活性化しないことが知られている。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２００３年４月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１１３９３の一部係属出願であり、全文を本明細書に引用として援用する。
【０００２】
（発明の背景）
（１．技術分野）
本発明は、シグナル伝達経路の制御に関する。より詳しくは、本発明は、テロメア開始配列、アポトーシス、日焼けおよびＤＮＡ損傷反応の制御に関する。
【背景技術】
【０００３】
（２．従来技術）
人口が老齢化するに伴って、先進国世界では、ヒトの癌の頻度が増加している。癌のあるタイプと診断における症状の段階において、集中的な研究にもかかわらず近年の罹患率と死亡率は、十分に改善していない。癌が進行する間に、正常細胞とその組織特異性環境との相互作用が制御される方法の重要な態様である老化およびアポトーシスに対する耐性を含め、負の調節制御から、腫瘍細胞は、ますます独立するようになる。
【０００４】
細胞老化は、癌に対する重要な防御であることが示唆されている。多くの事実は、老化における染色体の３’末端を複製できないことで生じる進行性のテロメアの短縮またはテロメアの機能障害を意味する。生殖系列細胞およびほとんどの癌細胞では、ＴＴＡＧＧＧ反復を染色体の３’末端に付加する酵素複合体であるテロメラーゼによるテロメアの長さの維持に、不死が関連している。ＴＴＡＧＧＧの連結型反復であるテロメアは、近位テロメア二本鎖ＤＮＡで襞が付けられ、テロメア反復結合因子（ＴＲＦ）、特にＴＲＦ２で安定化された約１５０〜３００塩基の３’突出部を有する１本鎖ループ構造で終わっている。ＴＲＦ２のドミナントネガティブ型（ＴＲＦ２ＤＮ）の異所発現がテロメアループ構造を破壊し、３’突出部を露出させ、ＤＮＡ損傷応答を引き起こし、その結果、原発性繊維芽細胞と線維肉腫が老化する。
【０００５】
広範囲のＤＮＡ損傷またはある種の癌遺伝子の過剰発現により老化を急速に進めることができる。テロメアの長さを酵素的に維持するか、構築するテロメラーゼ逆転写酵素触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）の異所発現により老化を迂回することが可能で、それによりある種のヒト細胞タイプを不死化するが、これは複製老化のテロメア依存機構を強く示唆している。さらに、悪性細胞は、一般にＴＥＲＴを発現し、および／または通常の老化細胞より短いテロメアを有するにもかかわらず、細胞に老化反応を迂回させ、無限に増殖させる変異を含んでいる。しかしながら、ある腫瘍細胞は、様々な抗癌剤に反応して老化し、不死の獲得が必ずしもそのＤＮＡ損傷に対する基本的な細胞反応の欠如を意味するものでないことを示唆している。
【０００６】
ヒト細胞における老化は、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路に大いに依存している。腫瘍抑制因子ｐ５３は、様々な異なった刺激、例えばＤＮＡ損傷、転写または複製の脱制御、癌遺伝子形質転換、およびある種の化学療法剤で生じた微小管の脱制御を細胞増殖停止またはアポトーシスに変換することにより、細胞ストレス反応機構に鍵となる役割を果たす。活性化されると、ｐ５３は、細胞増殖停止またはプログラムされた細胞の自殺を引き起こし、一方でゲノムの安定性に重要な制御機構として働く。特に、ｐ５３は、細胞集団から遺伝的に損傷した細胞を除去することによりゲノムの安定性を制御し、その主な機能の一つは、腫瘍形成を阻止することである。
【０００７】
無傷の腫瘍抑制因子ｐＲｂ経路は、腫瘍生成を阻止するのに必要である。野生型ｐ５３を含まないｐＲｂ−／−腫瘍細胞では、ｐＲｂの導入が老化を誘導する。頚部癌細胞は、しばしば野生型ｐ５３およびｐＲｂ遺伝子を維持するが、ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７タンパク質は、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路をそれぞれ妨害する。ウイルスＥ２タンパク質の異所発現は、ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７遺伝子転写を抑制し、頚部癌腫細胞株に迅速で顕著な老化反応を誘導するが、これも癌細胞老化におけるｐ５３およびｐＲｂの重要な役割を確認するものである。
【０００８】
ｐ５３経路およびｐＲｂ経路のみを抑制することが、繊維芽細胞が複製老化を迂回するために十分ではない。実際、ＳＶ４０Ｔ抗原に感染したか、またはｐ５３経路およびｐＲｂ経路を抑制するアデノウイルスＥ１Ａ＋Ｅ１ＢまたはＨＰＶ Ｅ６＋Ｅ７の組み合わせを導入したヒト繊維芽細胞は、寿命が延長し、複製老化を逃れる。
【０００９】
ＤＮＡ中の二重鎖の切断は、哺乳動物細胞にとっては細胞毒性が非常に大きい。高度に保存されたＭＲＮ複合体が真核細胞中の二重鎖切断の修復に関与している。ＭＲＮ複合体は、二重鎖切断部位に、それが生成すると直ちに付着する。ＭＲＮ複合体はまた、テロメア反復結合因子（ＴＲＦ）に関連した細胞周期のＳ期中にテロメアに移動する。
【００１０】
ＭＲＮ複合体は、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮＢＳ（ｐ９５）で構成される。Ｍｒｅ１１／ｐ９５／Ｒａｄ５０複合体の一部としてのＭｒｅ１１は、細胞周期のＳ期中にテロメア３’突出ＤＮＡと会合する。Ｍｒｅ１１は、ＤＮＡ鎖の３’末端に優先的に作用するエキソヌクレアーゼである。Ｍｒｅ１１の活性は、ＡＴＰアーゼの１種であるＲａｄ５０との相互作用に依存すると信じられている。Ｎｂｓ１は、ＭＲＮ複合体の核局在化の他、二重鎖切断の部位におけるその会合に関与すると信じられている。
【００１１】
典型的には、癌は、正常または悪性を問わずすべての増殖細胞を非常に傷つける化学療法および放射線療法等のきわめて毒性の強い治療で処置される。このような治療の副作用には、リンパ系、造血系および腸上皮の重大な損傷の他、脱毛が含まれる。他の副作用には、脱毛が含まれる。より安全でより効果的な癌治療、特に正常であるが増殖性の細胞に対し悪性細胞を優先的に標的とすることによりこれらの副作用のいくつか、またはすべてを避ける別な治療法が常に必要とされ続けている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、Ｍｒｅ１１の調節因子のインビトロスクリーニング法であって、Ｍｒｅ１１に対する核酸基質の存在下で候補調節因子をインビトロでＭｒｅ１１と接触させ、基質の加水分解を測定する工程を有する方法に関する。コントロールと比較して基質核酸の加水分解を変化させることにより、調節因子を同定し得る。核酸基質は（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドであり得る。基質核酸の加水分解をＵＶ吸収、標識オリゴマーのゲル分析、または非沈殿性ヌクレオチド塩基の回収により測定し得る。
【００１３】
本発明はまた、Ｍｒｅ１１に特異的に結合する薬剤のインビトロスクリーニング法であって、候補薬剤をＭｒｅ１１に接触させ、候補薬剤が特異的にＭｒｅ１１に結合するか否かを決める工程を有する方法に関する。Ｍｒｅ１１は、固体支持体に付着してもよい。
【００１４】
本発明はまた、Ｍｒｅ１１の調節因子の細胞に基づくスクリーニング法であって、調節因子が細胞により取り込まれる条件下に候補調節因子とＭｒｅ１１を発現する細胞とを接触させ、細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、ＳＡ−ｂ−Ｇａｌ活性、およびｐ５３またはｐ９５のリン酸化を含むがそれらに限定されない細胞特性を測定する工程を含む方法に関する。コントロールと比較して特性を変えることにより調節因子を同定し得る。候補調節因子は、上記に同定したようにＭｒｅ１１に特異的に結合する薬剤でもよい。Ｍｒｅ１１は、エキソヌクレアーゼ活性を有し得る、Ｍｒｅ１１のフラグメント、ホモログ、アナログまたは改変体として発現されてもよい。
【００１５】
本発明はまた、タンキラーゼ調節因子のインビトロスクリーニング法であって、タンキラーゼに対する基質の存在下で候補調節因子をインビトロでタンキラーゼと接触させ、基質のリボシル化を測定する工程を有する方法に関する。コントロールと比較してリボシル化を変化させて調節因子を同定し得る。基質は、ＴＲＦであり得るペプチドまたはポリペプチドであり得る。基質のリボシル化をＵＶ吸収または基質の標識化により測定し得る。
【００１６】
本発明はまた、タンキラーゼに特異的に結合する薬剤のインビトロスクリーニング法であって、候補薬剤をタンキラーゼと接触させ、候補薬剤がタンキラーゼと特異的に結合するか否かを決定する方法に関する。タンキラーゼを固体支持体に付着させてもよい。
【００１７】
本発明はまた、タンキラーゼの調節因子の細胞に基づくスクリーニング法であって、調節因子が細胞に取り込まれる条件下で候補調節因子とタンキラーゼを発現する細胞とを接触させ、細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、ＳＡ−ｂ−Ｇａｌ活性、およびｐ５３リン酸化またはｐ９５リン酸化を含むがそれらに限定されない細胞特性を測定する工程を含む方法に関する。コントロールと比較して特性を変えることにより調節因子を同定し得る。候補調節因子は、上記のようなタンキラーゼと特異的に結合する薬剤であり得る。タンキラーゼは、リボシラーゼ活性を有し得る、タンキラーゼのフラグメント、ホモログ、アナログまたは改変体として発現されてもよい。
【００１８】
本発明はまた、ＭＲＮ複合体形成の調節因子のインビトロスクリーニング法であって、候補調節因子をインビトロでＭｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１と接触させ、ＭＲＮ複合体の形成を測定する工程を含む方法に関する。コントロールと比較してＭＲＮ複合体の形成を変化させることにより、調節因子を同定し得る。候補調節因子を核酸基質またはＭｒｅ１１のインヒビターの存在下でＭｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１と接触させ得る。核酸は（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドでよい。ＭＲＮ複合体の生成を遠心分離、共沈殿または非変性電気泳動により測定し得る。
【００１９】
本発明はまた、ＤＮＡ損傷経路の調節因子の細胞に基づくスクリーニング法であって、調節因子が細胞により取り込まれる条件下、オリゴヌクレオチドの存在下でＭｒｅ１１とタンキラーゼとを発現する細胞と候補調節因子とを接触させ、細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、ＳＡ−ｂ−Ｇａｌ活性、およびｐ５３リン酸化またはｐ９５リン酸化を含むがそれらに限定されない細胞特性を測定する工程を含む方法に関する。コントロールと比較して特性を変えることにより調節因子を同定し得る。オリゴヌクレオチドは（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。Ｍｒｅ１１は、エキソヌクレアーゼ活性を有し得る、Ｍｒｅ１１のフラグメント、ホモログ、アナログまたは改変体として発現されてもよい。タンキラーゼは、リボシラーゼ活性を有し得る、タンキラーゼのフラグメント、ホモログ、アナログまたは改変体として発現されてもよい。
【００２０】
上記の細胞に基づくスクリーニング法に使用された細胞は、癌細胞でもよい。上記の細胞に基づくスクリーニング法に使用された細胞は、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路によりテロメアを維持し得る。上記のインビトロおよび細胞に基づくスクリーニング法に記載された候補調節因子および薬剤は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンまたは有機低分子であってもよい。
【００２１】
本発明はまた、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物の使用に関する。アクチベーターを癌の治療、アポトーシス誘導、細胞老化誘導、日焼け阻害、細胞分化促進または免疫抑制促進に使用し得る。アクチベーターは（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し得るＭｒｅ１１のオリゴヌクレオチドアクチベーターでよい。最初の３’ヌクレオチド結合の約１〜約１０個を３’→５’ヌクレアーゼで加水分解し得る。
【００２２】
本発明はまた、Ｍｒｅ１１、タンキラーゼ、ＤＮＡ損傷経路またはＭＲＮ複合体形成のインヒビターを含む組成物の使用に関する。インヒビターをアポトーシス阻害、細胞老化阻害、生育促進、日焼け促進、細胞分化阻害、癌処置副作用減少に使用し得る。組成物を化学療法またはイオン化放射線と組み合わせて与えてもよい。インヒビターは（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し得るＭｒｅ１１のオリゴヌクレオチドインヒビターであってもよい。最初の３’ヌクレオチド結合の約０〜約１０までを３’→５’ヌクレアーゼで加水分解し得る。
・本発明はまた、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し、少なくとも１個の非加水分解性ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを有する組成物に関する。最初の３’ヌクレオチド結合の１から約１０までをＭｒｅ１１等の３’→５’ヌクレアーゼで加水分解し得る。オリゴヌクレオチドは、ＴＴＡＧＧＧと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。オリゴヌクレオチドは、配列ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧを有してもよい。非加水分解性結合は、ホスホロチオエートであってもよい。オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡであってもよい。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｍｒｅ１１の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）Ｍｒｅ１１に対する核酸基質の存在下で、候補調節因子をＭｒｅ１１とインビトロで接触させる工程；および
（ｂ）該基質の加水分解を測定し、それにより、対照と比較して該基質の加水分解を変化させることによって調節因子を同定する工程；
を包含する、方法。
（項目２）
前記核酸基質は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記核酸基質の加水分解を、ＵＶ吸収または放射性標識の放出により測定する、項目１に記載の方法。
（項目４）
Ｍｒｅ１１に特異的に結合する因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）候補因子をＭｒｅ１１と接触させる工程；および
（ｂ）候補因子はＭｒｅ１１と特異的に結合するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
（項目５）
Ｍｒｅ１１は、固体支持体に付着している、項目４に記載の方法。
（項目６）
Ｍｒｅ１１の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）Ｍｒｅ１１を発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）候補調節因子を、該調節因子が該細胞により取り込まれる条件下で該細胞と接触させる工程；および
（ｃ）細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性およびｐ５３リン酸化、ｐ９５リン酸化からなる群より選択される該細胞の特性を測定し、それによって、対照と比較して該特性を変化させることによって調節因子を同定する工程；
を含む、方法。
（項目７）
前記候補調節因子は、Ｍｒｅ１１に特異的に結合する、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記Ｍｒｅ１１は、Ｍｒｅ１１フラグメント、Ｍｒｅ１１ホモログ、Ｍｒｅ１１アナログまたはＭｒｅ１１改変体である、項目１〜７のうちのいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記Ｍｒｅ１１のフラグメント、Ｍｒｅ１１ホモログ、Ｍｒｅ１１アナログまたはＭｒｅ１１改変体は、エキソヌクレアーゼ活性を有する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞の特性は、細胞増殖である、項目６に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞の特性は、細胞の生存能力である、項目６に記載の方法。
（項目１２）
前記細胞の特性は、細胞形態である、項目６に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞の特性は、ＳＡ−β―Ｇａｌ活性である、項目６に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞の特性は、ｐ５３のリン酸化またはｐ９５のリン酸化である、項目６に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞は、癌細胞である、項目６〜７および９〜１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞は、癌細胞である、項目８に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
タンキラーゼの調節因子をスクリーニングする方法であって、該方法は、
（ａ）タンキラーゼに対する基質の存在下で、候補調節因子をタンキラーゼとインビトロで接触させる工程；および
（ｂ）該基質のリボシル化を測定し、それによって、対照と比較して該基質のリボシル化を変化させることによって、調節因子を同定する工程；
を包含する、方法。
（項目２４）
前記基質は、ペプチドまたはポリペプチドである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記基質は、ＴＲＦ１である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記基質のリボシル化を、ＵＶ吸収または前記基質の標識化により測定する、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
タンキラーゼに特異的に結合する因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）候補結合因子をタンキラーゼと接触させる工程；および
（ｂ）候補因子がタンキラーゼに特異的に結合するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
（項目２８）
タンキラーゼは、固体支持体に付着している、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
タンキラーゼの調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）タンキラーゼを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）候補調節因子を、該調節因子が細胞により取り込まれる条件下で該細胞と接触させる工程；および
（ｃ）細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性およびｐ５３リン酸化、ｐ９５リン酸化からなる群より選択される該細胞の特性を測定し、それによって、対照と比較して該特性を変化させることにより調節因子を同定する工程；
を包含する、方法。
（項目３０）
前記調節因子は、タンキラーゼに特異的に結合する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記タンキラーゼは、リボシル化活性を有する、タンキラーゼフラグメント、タンキラーゼホモログ、タンキラーゼアナログまたはタンキラーゼ改変体である、項目２３〜３０のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３２）
前記タンキラーゼフラグメント、タンキラーゼホモログ、タンキラーゼアナログまたはタンキラーゼ改変体は、リボシル化活性を有する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞の特性は、細胞増殖である、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記細胞の特性は、細胞生存能力である、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞の特性は、細胞形態である、項目２９に記載の方法。
（項目３６）
前記細胞の特性は、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性である、項目２９に記載の方法。
（項目３７）
前記細胞の特性は、ｐ５３のリン酸化またはｐ９５のリン酸化である、項目２９に記載の方法。
（項目３８）
前記細胞は、癌細胞である、項目２９〜３０および３２〜３７のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３９）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記細胞は、癌細胞である、項目３１に記載の方法。
（項目４１）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４５）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
ＭＲＮ複合体形成の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）候補調節因子を、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１とインビトロで接触させる工程；ならびに
（ｂ）ＭＲＮ複合体の形成を測定し、それによって、対照と比較して該ＭＲＮ複合体の形成を変化させることにより調節因子を同定する工程
を包含する、方法。
（項目４７）
核酸基質またはＭｒｅ１１インヒビターの存在下で、候補調節因子をＭｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１と接触させる、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記核酸は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
ＭＲＮ複合体の形成を、遠心分離、共沈殿または非変性電気泳動により測定する、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
ＤＮＡ損傷経路の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）Ｍｒｅ１１とタンキラーゼとを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）候補調節因子を、該調節因子が細胞に取り込まれる条件下で、オリゴヌクレオチドの存在下にて該細胞と接触させる工程；
（ｃ）細胞増殖、細胞生存能力、細胞形態、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性およびｐ５３リン酸化、ｐ９５リン酸化からなる群より選択される該細胞の特性を測定し、それによって、対照と比較して該特性を変化させることにより調節因子を同定する工程
を包含し、該オリゴヌクレオチドは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１〜２０）と少なくとも５０％の核酸配列同一性を有する、方法。
（項目５１）
前記Ｍｒｅ１１は、Ｍｒｅ１１フラグメント、Ｍｒｅ１１ホモログ、Ｍｒｅ１１アナログまたはＭｒｅ１１改変体である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記Ｍｒｅ１１の前記Ｍｒｅ１１フラグメント、Ｍｒｅ１１ホモログ、Ｍｒｅ１１アナログまたはＭｒｅ１１改変体は、エキソヌクレアーゼ活性を有する、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記タンキラーゼは、タンキラーゼフラグメント、タンキラーゼホモログ、タンキラーゼアナログまたはタンキラーゼ改変体である、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
前記タンキラーゼは、タンキラーゼフラグメント、タンキラーゼホモログ、タンキラーゼアナログまたはタンキラーゼ改変体は、リボシル化活性を有する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記細胞の特性は、細胞増殖である、項目５０に記載の方法。
（項目５６）
前記細胞の特性は、細胞生存能力である、項目５０に記載の方法。
（項目５７）
前記細胞の特性は、細胞形態である、項目５０に記載の方法。
（項目５８）
前記細胞の特性は、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性である、項目５０に記載の方法。
（項目５９）
前記細胞の特性は、ｐ５３リン酸化またはｐ９５リン酸化である、項目５０に記載の方法。
（項目６０）
前記細胞は、癌細胞である、項目５０〜５９のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
前記細胞のテロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素またはＡＬＴ経路により維持される、項目６１に記載の方法。
（項目６２）
前記候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、および有機低分子からなる群より選択される、項目５０に記載の方法。
（項目６３）
癌を処置するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目６４）
アポトーシスを誘導するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目６５）
細胞老化を誘導するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目６６）
日焼けを阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、阻害法。
（項目６７）
細胞分化を促進するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目６８）
免疫抑制を促進するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目６９）
前記アクチベーターは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有するＭｒｅ１１のオリゴヌクレオチドアクチベーターであり、少なくとも最初のｘ個の３’−ヌクレオチド結合は、３’→５’ヌクレアーゼにより加水分解可能であり、ここで、ｎ＝１〜２０であり、ｘは、約１〜約１０である、項目６３〜６８のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目７０）
アポトーシスを阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、阻害法。
（項目７１）
細胞老化を阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目７２）
成長を促進するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目７３）
日焼けを促進するための法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目７４）
細胞分化を阻害するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目７５）
癌処置の副作用を低減するための方法であって、該方法は、
そのような処置を必要とする被験体に、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含む組成物、タンキラーゼアクチベーターを含む組成物、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターを含む組成物、またはＭＲＮ複合体形成アクチベーターを含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目７６）
前記組成物を、化学療法またはイオン化放射線と組み合わせて与える、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記インヒビターは、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有するＭｒｅ１１のオリゴヌクレオチドインヒビターであり、少なくとも最初のｘ個の３’−ヌクレオチド結合は、３’→５’ヌクレアーゼにより加水分解可能であり、ｎ＝１〜２０であり、ｘは、約０〜約１０である、項目７０〜７６に記載の方法。
（項目７８）
（ＴＴＡＧＧＧ）ｎと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドと、少なくとも１個の非加水分解性ヌクレオチド間結合とを有する組成物であって、少なくとも最初のｘ個の３’−ヌクレオチド結合は、３’→５’ヌクレアーゼにより加水分解可能であり、ｎ＝１〜２０であり、ｘは、約０〜約１０である、組成物。
（項目７９）
前記３’→５’ヌクレアーゼは、Ｍｒｅ１１である、項目７８に記載の組成物。
（項目８０）
前記オリゴヌクレオチドは、ＴＴＡＧＧＧと少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する、項目７８に記載の組成物。
（項目８１）
前記オリゴヌクレオチドは、配列ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧを有する、項目８０に記載の組成物。
（項目８２）
前記非加水分解性結合は、ホスホロチオエートである、項目７８に記載の組成物。
（項目８３）
前記オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡである、項目７８に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１Ａ〜１Ｈは、希釈剤（図１Ａおよび１Ｅ）；４０μＭの１１マー−１ ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号２：図１Ｂおよび１Ｆ）；４０μＭの１１マー−２ ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ（配列番号３：図１Ｃおよび１１Ｇ）；４０μＭの１１マー−３ ｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ（配列番号４：図１Ｄおよび１Ｈ）で処理したプロピジウムイオダイド染色Ｊｕｒｋａｔ細胞（不死化Ｔリンパ球）のＦＡＣＳ分析を示す。分析前４８時間（図１Ａ〜１Ｄ）または７２時間（図１Ｅ〜１Ｈ）にＪｕｒｋａｔ細胞を言及した試薬で４８時間処理した。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、以下の細胞への添加についての蛍光活性化細胞分類の結果を示すグラフである：図２Ａ、希釈剤；図２Ｂ、０．４μＭの１１マー−１；図２Ｃ、０．４μＭの１１マー−１−Ｓ；図２Ｄ、希釈剤；図２Ｅ、４０μＭの１１マー−１；図２Ｆ、４０μＭの１１マー−１−Ｓ。
【図３】図３Ａ〜３Ｇは、以下の細胞への添加についての蛍光活性化細胞分類の結果を示すグラフである：図３Ａ、希釈剤；図３Ｂ、１０μＭの１１マー−１；図３Ｃ、１０μＭの１１マー−１および１μＭの１１マー−１−Ｓ；図３Ｄ、１０μＭの１１マー−１および５μＭの１１マー−１−Ｓ；図３Ｅ、１０μＭの１１マー−１および１０μＭの１１マー−１−Ｓ；図３Ｆ、２０μＭの１１マー−１−Ｓ；図３Ｇ、１０μＭの１１マー−１−Ｓ。
【図４】図４は、希釈剤、ｐＴｐＴまたはｐＴｓｐＴで処理した細胞のメラニン含有量（ｐｇ／細胞）を示す棒グラフである。
【図５】図５は、希釈剤、１１マー−１または１１マー−１−Ｓで処理した細胞のメラニン含有量（ｐｇ／細胞）を示す棒グラフである。
【図６】図６は、偽処理（照射なし、オリゴヌクレオチドなし）、または紫外線（ＵＶ）処理、または照射なしでｐＴｓｐＴ投与、またはＵＶを照射しｐＴｓｐＴを投与した細胞のメラニン含有量（ｐｇ／細胞）を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ホスホロチオエート結合で合成した、ヌクレオチド配列の配列番号２のオリゴヌクレオチドのダイアグラムである。
【図８】図８は、図７に示す、β−ガラクトシダーゼ活性に対する細胞染色陽性で示される、正常新生児ヒト繊維芽細胞の培養物で老化を生じるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド１、２、３および４の効果の試験の結果を示す棒グラフである。オリゴヌクレオチド「１１−１」は、全体がホスホジエステル結合で合成された配列番号２で処理された繊維芽細胞培養物を示す。「ディル（Ｄｉｌ）」は、オリゴヌクレオチドを含まない希釈剤で処理された繊維芽細胞培養物を示す。
【図９】図９〜１１は、ダウンレギュレーションＭｒｅ１１タンパク質レベルがＴ−オリゴの反応を妨害することを示す。
【図１０】図９〜１１は、ダウンレギュレーションＭｒｅ１１タンパク質レベルがＴ−オリゴの反応を妨害することを示す。
【図１１】図９〜１１は、ダウンレギュレーションＭｒｅ１１タンパク質レベルがＴ−オリゴの反応を妨害することを示す。
【図１２Ａ】図１２は、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路の双方がヒト繊維芽細胞におけるＴ−オリゴ誘導老化に寄与することを示す。図１２ａ：ｐ５３ＤＤおよびｃｄｋ４Ｒ２４Ｃ発現のイムノブロット解析。３０μｇの全タンパク質を用い、全ｐ５３およびｃｄｋ４に対しプローブしたウェスタンブロットによるタンパク質分析のために細胞を集めた。レーン１、２、３および４は、それぞれ、Ｒ２Ｆ、Ｒ２Ｆ（ｐ５３ＤＤ）、Ｒ２Ｆ（ｃｄｋ４Ｒ２４Ｃ）、およびＲ２Ｆ（ｐ５３ＤＤ／ｃｄｋ４Ｒ２４Ｃ）繊維芽細胞由来のタンパク質試料を含む。ローディングコントロールとしてβ−アクチンを用いた。
【図１２Ｂ】図１２は、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路の双方がヒト繊維芽細胞におけるＴ−オリゴ誘導老化に寄与することを示す。図１２ｂ：ｐ５３経路およびｐＲｂ経路のＴ−オリゴ誘導ＳＡ−β−Ｇａｌ活性への寄与。Ｒ２Ｆ繊維芽細胞および誘導された被形質導入体を希釈剤または４０μＭのＴ−オリゴで１週間処理し、次いでＳＡ−β−Ｇａｌ活性を分析した。
【図１２Ｃ】図１２は、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路の双方がヒト繊維芽細胞におけるＴ−オリゴ誘導老化に寄与することを示す。図１２ｃ：ＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞の定量分析。ＳＡ−β−Ｇａｌ活性を発現する細胞を計数し、培養物中の全細胞の百分率として提示した。３回の独立の実験それぞれからの、３個の代表的視野から平均と標準偏差を計算した。
【図１３Ａ】図１３は、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞のＴ−オリゴへの暴露が老化を誘導することを示す。図１３ａ：Ｔ−オリゴへの暴露がＳＡ−β−Ｇａｌ活性を増加する。ＨＴ−１０８０細胞を希釈剤のみ、または４０μＭのＴ−オリゴ、または相補コントロールオリゴで４日間処理し、次いで染色しＳＡ−β−Ｇａｌ活性を分析した。
【図１３Ｂ】図１３は、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞のＴ−オリゴへの暴露が老化を誘導することを示す。図１３ｂ：ＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞の定量分析。ＳＡ−β−Ｇａｌ活性を発現する細胞を計数し、培養物中の全細胞の百分率として表した。平均値と標準偏差を３回の独立の実験それぞれからの３つの代表的視野から計算した。
【図１３Ｃ】図１３は、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞のＴ−オリゴへの暴露が老化を誘導することを示す。図１３ｃ：細胞増殖に対するＴ−オリゴの効果。細胞を図１２中のように４日間処理し、ＢｒｄＵ取り込みによりＤＮＡ合成を分析した。
【図１３Ｄ】図１３は、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞のＴ−オリゴへの暴露が老化を誘導することを示す。図１３ｄ：ＢｒｄＵ取り込みの定量分析。暗黒色核は、核ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵを示す。ＢｒｄＵ陽性細胞を計算し、培養物中の全細胞の百分率として表した。平均値と標準偏差を３回の独立の実験それぞれからの３つの代表的視野から計算した。
【図１３Ｅ】図１３は、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞のＴ−オリゴへの暴露が老化を誘導することを示す。図１３ｅ：ｐＲｂリン酸化に対するＴ−オリゴの効果。細胞を図１３ａ中の様に処理し、３０μｇの全タンパク質を用い、ｐＲｂ−ｓｅｒ７８０＊、ｓｅｒ７９５＊およびｓｅｒ８０７／８１１＊（それぞれセリン７８０、セリン７９５およびセリン８０７／８１１でリン酸化したｐＲｂ）に対しプローブしてウェスタンブロットによるタンパク質分析のために集めた。レーンＤ、ＴおよびＣは、希釈剤、Ｔ−オリゴおよび相補オリゴそれぞれで処理した細胞由来のタンパク質試料を含む。β−アクチンをローディングコントロールとして使用した。
【図１４Ａ】図１４は、Ｔ−オリゴ除去のヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞中の老化表現型に対する持続効果を示す。並行培養物を図１３ａに記載のように処理した。次いで細胞をＰＢＳで一回洗浄し、それ以上処理せず完全培地を２４時間または４８時間再供給した。図１４ａ：ＳＡ−β−Ｇａｌ活性。細胞をＳＡ−β−Ｇａｌ活性に対して染色した。
【図１４Ｂ】図１４は、Ｔ−オリゴ除去のヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞中の老化表現型に対する持続効果を示す。並行培養物を図１３ａに記載のように処理した。次いで細胞をＰＢＳで一回洗浄し、それ以上処理せず完全培地を２４時間または４８時間再供給した。図１４ｂ：細胞周期停止。ＢｒｄＵの取り込みを分析した。
【図１４Ｃ】図１４は、Ｔ−オリゴ除去のヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞中の老化表現型に対する持続効果を示す。並行培養物を図１３ａに記載のように処理した。次いで細胞をＰＢＳで一回洗浄し、それ以上処理せず完全培地を２４時間または４８時間再供給した。図１４ｃ：ｐＲｂのリン酸化および活性化。図１３ｅに記載のように免疫ブロット分析を行った。
【図１５Ａ】図１５は、ヒト線維芽細胞肉腫ＨＴ−１０８０細胞のクローン形成能に対するＴ−オリゴへ長時間暴露した効果を示す。細胞を希釈剤、４０μＭのＴ−オリゴまたは相補オリゴで１週間処理し、分析した。図１５ａ：染色皿の外観。
【図１５Ｂ】図１５は、ヒト線維芽細胞肉腫ＨＴ−１０８０細胞のクローン形成能に対するＴ−オリゴへ長時間暴露した効果を示す。細胞を希釈剤、４０μＭのＴ−オリゴまたは相補オリゴで１週間処理し、分析した。図１５ｂ：クローン形成能の定量。３回培養物のコロニーを計数し、希釈剤処理コントロールの百分率としてプロットした。
【図１６】図１６は、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞におけるテロメア平均長さ（ＭＴＬ）に対するＴ−オリゴの効果を示す。細胞を図１３ａに記載するように処理した。レーン１、２および３は、希釈剤（Ｄ）、Ｔ−オリゴ（Ｔ）または相補オリゴ（Ｃ）で処理した細胞由来のゲノムＤＮＡを含む。レーン４および５は、高分子量（Ｈ）および低分子量（Ｌ）標準テロメアＤＮＡを含む。
【図１７】図１７は、Ｔ−オリゴおよびＴＲＦＤＮが同じ経路を経由するＤＮＡ損傷反応を開始することを示す。グラフは、希釈剤コントロールを１００％とした、ウェスタンブロットの濃度計読み取り値を示す。図９ｆ：レーン１、希釈剤、ＧＦＰ；レーン２：希釈剤ＴＲＦ２ＤＮ；レーン３：３ＡＢ、ＧＦＰ；レーン４：３ＡＢ、ＴＲＦ２ＤＮ；レーン５：ＩＱ、ＧＦＰ；レーン６：ＩＱ、ＴＲＦ２ＤＮ。
【図１８】図１８は、Ｔ−オリゴの効果がテロメアに依存しないことを示す。図１８ａ：細胞周期の各期における細胞の百分率と標準偏差が各条件の３回の培養から計算された、３回の実験の代表的な実験の一つ由来のＦＡＣＳグラフ。図１８ｂ：ホスホｐ９５／Ｎｂｓ１に対して特異的な抗体を用いたウェスタンブロット。レーン１、２および３は、それぞれ希釈剤、１１マー−１または１１マー−２で処理した細胞由来のタンパク質を含んだ。コントロール細胞を１０ＧｙのＩＲで照射（＋）するか、偽照射（−）した（３時間）。
【図１９】図１９は、タンキラーゼタンパク質レベルのダウンレギュレーションがＴ−オリゴ反応を妨害することを示す。上のパネルは、濃度計の読み取り値、下のパネルは、ウェスタンブロットを示す。
【図２０】図２０は、Ｔ−オリゴがセリン３７で上のｐ５３のリン酸化を生じることを示す。希釈剤または４０μＭで示された時間処理後、ｐ５３ホスホセリン３７特異性抗体を用いて正常新生児細胞に対しウェスタンブロット分析を行った。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、３’テロメア突出配列のＭｒｅ１１媒介加水分解が、老化、日焼けおよびアポトーシス等のＤＮＡ損傷に対する細胞の保護反応に重要なシグナル伝達カスケードを開始するという発見に基づいている。理論に制約されず、本発明者らは、ＵＶ照射、ＤＮＡに対する酸化損傷等のＤＮＡ損傷、またはＤＮＡに対する発癌性付加物の生成、または加齢に関連するテロメアの短縮が、ＴＴＡＧＧＧの反復を有する３’突出配列を露出するテロメアループを不安定化すると信じている。次いでテロメア関連タンパク質が配列依存の方法で突出部に付着し、Ｍｒｅ１１／ｐ９５／Ｒａｄ５０複合体に対する「アンカー」として作用する。Ｍｒｅ１１は、次に３’末端からテロメア突出部を加水分解し始め、Ｒａｄ５０ ＡＴＰアーゼの活性化を引き起こす。Ｒａｄ５０の活性化は、リン酸化によるタンキラーゼの活性化、ある種の空間配置の変化、または他の機構をもたらし、次いでＡＴＭおよび多分ＡＴＲ等の他のキナーゼを活性化する。ＡＴＭは、次にｐ９５、およびｐ５３等の他のＤＮＡ損傷反応エフェクターをリン酸化し、最終的に細胞周期停止の生物的終点、遺伝子誘導、アポトーシスおよび／または老化をもたらす。
【００２５】
提案されたシグナル伝達経路におけるＭｒｅ１１およびタンキラーゼの役割に基づいて、Ｍｒｅ１１、タンキラーゼ、ＤＮＡ損傷経路またはＭＲＮ複合体形成のアクチベーターは、ＤＮＡ損傷またはテロメアループ破壊の存在にかかわらずＤＮＡ損傷反応経路を活性化すると期待される。これは、テロメアホモログオリゴヌクレオチド（Ｔ−オリゴ）がＭｒｅ１１の基質となり、ＤＮＡ損傷またはテロメアループ破壊がなくてもアポトーシス、老化または増殖の停止をもたらすことを示す本明細書中の実施例で示されている。
【００２６】
同様に、Ｍｒｅ１１、タンキラーゼ、ＤＮＡ損傷経路またはＭＲＮ複合体形成のインヒビターは、ＤＮＡ損傷またはテロメアループ破壊があってもシグナル伝達経路を阻害すると期待される。これは、アポトーシスおよび増殖停止が、以下によるＤＮＡ損傷およびテロメアループ破壊を生じる条件下で阻害されることを示す本明細書中の実施例で示されている：（ｉ）Ｍｒｅ１１の拮抗剤として作用する非加水分解性Ｔ−オリゴ、（ｉｉ）Ｍｒｅ１１タンパク質レベルのＲＮＡｉ媒介減少；および（ｉｉｉ）タンキラーゼタンパク質レベルのＲＮＡｉ媒介減少。
【００２７】
本発明の製品、組成物および方法を開示し説明する前に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、制限的であることを意図するものではないことを理解する必要がある。明細書および付属のクレームで使用される場合、単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、そうでないと文脈で明瞭に示されない限り複数の参照対象を含むことに注意しなければならない。
【００２８】
本出願を通じて、特許または刊行物を引用する場合、本発明が所属する分野の技術水準をより完全に説明するためにこれらの刊行物の全文の開示を本出願に引用して援用する。
【００２９】
（１．定義）
本明細書で用いる用語「アクチベーター」とは、タンパク質を活性化する、またはタンパク質の活性を増加する任意の物質を意味する。
【００３０】
本明細書で用いる用語「投与」とは、ある調節因子の投薬量を説明するために用いられた場合、１回の投薬量または複数回の投薬量の薬剤を意味する。
【００３１】
本明細書で用いる用語「アナログ」とは、ペプチドまたはポリペプチドに対する意味で使用された場合、１個またはそれより多くの非標準アミノ酸または通常のアミノ酸のセットからの他の構造的変化を有するペプチドまたはポリペプチドを意味し、オリゴヌクレオチドに対する意味で使用された場合、ホスホジエステルヌクレオチド間結合以外の１個またはそれより多くのヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３２】
本明細書で用いる用語「抗体」とは、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥの抗体、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含め、そのフラグメントもしくは誘導体、および１本鎖抗体、二重特異性抗体、二特異性抗体、二価抗体およびそれらの誘導体を意味する。抗体は、所望のエピトープまたはそのエピトープ由来の配列に対し十分な結合特異性を示す、モノクローン抗体、ポリクローン抗体、親和性精製抗体またはそれらの混合物であってもよい。抗体は、キメラ抗体でもよい。１個またはそれより多くの当該分野で公知の化学物質、ペプチドまたはポリペプチド種の付着で抗体を誘導体化してもよい。抗体を化合物部分と結合してもよい。
【００３３】
本明細書で用いる用語「アポトーシス」とは、細胞質の細胞小器官の完全性を保ちながら細胞容積の漸進的な縮小；光学顕微鏡または電子顕微鏡で観察したクロマチンの凝縮（すなわち核凝縮）；および／または遠心沈降分析で決定したヌクレオソームサイズフラグメントへのＤＮＡ開裂を含むが、それらに限定されない、細胞死のある形式を意味する。食細胞による無傷の細胞フラグメント（アポトーシス体）の飲み込みを伴う、細胞の膜の完全性が失われた場合（例えば、膜の小疱形成）に細胞死が生じる。
【００３４】
本明細書で用いる用語「癌の処置」とは、化学療法および放射線療法を含むがそれらに限定されない、当該分野で公知の任意の処置を意味する。
【００３５】
本明細書で用いる用語「との組み合わせ」とは、調節因子の投与およびその他の処置を説明するために使用された場合、調節因子をその他の処置の前に、その他の処置と共に、またはその他の処置の後であるいはそれらの組合せで投与し得ることを意味する。
【００３６】
本明細書で用いる用語「誘導体」とは、ペプチドまたはポリペプチドの状況に用いられた場合、１次構造（アミノ酸およびアミノ酸アナログ）以外が異なったペプチドまたはポリペプチドを意味し；オリゴヌクレオチドの状況に用いられた場合、ヌクレオチド配列以外の異なったオリゴヌクレオチドを意味する。例えば、ペプチドまたはポリペプチドの誘導体は、翻訳後修飾の１形式であるグリコシル化がされていることによって異なっていてもよい。例えば、ペプチドまたはポリペプチドが異種系中での発現のためにグリコシル化パターンを示してもよい。少なくとも１つの生物活性が維持される場合、これらのペプチドまたはポリペプチドは、本発明による誘導体である。その他の誘導体には、共有結合で修飾されたＮまたはＣ末端を有する融合ペプチドまたは融合ポリペプチド、ＰＥＧ化ペプチドまたはポリペプチド、脂質部分と会合したペプチドまたはポリペプチド、アルキル化ペプチドまたはポリペプチド、アミノ酸側鎖官能基を経由して他のペプチド、ポリペプチドまたは化合物に結合したペプチドまたはポリペプチド、および当技術で理解されると思われるその他の修飾が含まれるが、それらに限定されない。
【００３７】
本明細書で用いる用語「フラグメント」とは、ペプチドまたはポリペプチドの状況で用いられた場合、好ましくは長さで約５〜約３００個のアミノ酸、より好ましくは長さで約８〜約５０個のアミノ酸の任意のペプチドまたはポリペプチドのフラグメントを意味し；オリゴヌクレオチドの状況で用いられた場合、好ましくは長さで約２〜約２５０個のヌクレオチド、より好ましくは長さで約２〜約２０個のヌクレオチドの任意のオリゴヌクレオチドのフラグメントを意味する。ペプチドまたはポリペプチドフラグメントの代表的な例は、長さで８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のアミノ酸である。オリゴヌクレオチドフラグメントの代表的な例は、長さで２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドである。
【００３８】
本明細書で用いる用語「ホモログ」とは、ペプチドまたはポリペプチドの状況で用いられた場合、共通の進化の祖先を共有するか、それに対し少なくとも５０％の同一性を有するペプチドまたはポリペプチドを意味し；オリゴヌクレオチドの状況で用いられた場合、共通の進化の祖先を共有するか、それに対し少なくとも５０％の同一性を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３９】
本明細書で用いる用語「阻害」とは、タンパク質の活性を言及する場合、酵素の活性を阻止、抑制、抑止または除去することを意味する。
【００４０】
本明細書で用いる用語「処置」または「処置する」とは、哺乳動物をある病状から保護することを指す場合、その病状を予防、抑制、抑止または除去することを意味する。病状を予防することには、その病状を発症する前に本発明の組成物を哺乳動物に投与することが含まれる。病状を抑制することには、病状の誘発後であるがその臨床症状が現れる前に哺乳動物に本発明の組成物を投与することが含まれる。病状を抑止することには、病状を低減するか、または悪化することを予防するように、病状の臨床症状が現れた後に本発明の組成物を哺乳動物に投与することが含まれる。病状を除去することには、哺乳動物がその病状をもはや発症しないように、病状の臨床症状が現れた後に本発明の組成物を哺乳動物に投与することが含まれる。
【００４１】
本明細書で用いる用語「改変体」とは、ペプチドまたはポリペプチドの状況で用いられた場合、アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を維持するペプチドまたはポリペプチドを意味し、オリゴヌクレオチドの状況で用いられた場合、ヌクレオチドの挿入、欠失または保存的置換によりヌクレオチド配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を維持するオリゴヌクレオチドを意味する。本発明の目的では、「生物活性」には特異的抗体に結合する能力が含まれるが、それに限定されない。
【００４２】
（２．調節因子）
（ａ．Ｍｒｅ１１の調節因子）
本発明は、Ｍｒｅ１１活性の調節因子に関する。調節因子は、Ｍｒｅ１１活性を誘導または増加し得る。調節因子はまた、Ｍｒｅ１１活性を阻害または減少し得る。調節因子は、人工的に合成された化合物、または天然に存在する化合物であってよい。調節因子は、低分子量化合物、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドもしくはペプチド、またはそれらのフラグメント、アナログ、ホモログ、改変体もしくは誘導体であってよい。
【００４３】
オリゴヌクレオチド調節因子は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（ｎ＝約１〜約３３３）と少なくとも約５０％〜約１００％のヌクレオチド配列同一性を有するオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、１本鎖、２本鎖、またはその組み合わせを含み得る形態のものであり得るが、それらに制限されない。オリゴヌクレオチドは、約２〜約２０００ヌクレオチドであることが好ましく、約２〜約２００ヌクレオチドの１本鎖３’末端を有することがより好ましい。オリゴヌクレオチドは、ＥＳＴであってもよい。オリゴヌクレオチドのアナログ、誘導体、フラグメント、ホモログまたは改変体も具体的に考えられる。
【００４４】
実施例に示されるように、本発明のあるオリゴヌクレオチドは、増殖の阻害および細胞中のアポトーシスの誘導を生じるが、本発明の他のオリゴヌクレオチドは、生育停止の阻害およびアポトーシスの阻害を生じる。オリゴヌクレオチドの活性のこの違いは、３’加水分解性ヌクレオチド間結合の数に依存性であった。３’加水分解性ヌクレオチド間結合の数を変えることにより、オリゴヌクレオチドの効果が変化した。
【００４５】
理論に制約されず、本発明者らは、オリゴヌクレオチドがＭＲＮ複合体で認識され、３’エキソヌクレアーゼＭｒｅ１１に対する基質となると信じている。その結果、３’非加水分解性ヌクレオチド間結合を有する基質オリゴヌクレオチドがＭｒｅ１１の拮抗剤またはインヒビターとして作用する。Ｍｒｅ１１活性のレベルを決定する他の因子には、３’非加水分解性ヌクレオチド間結合の全濃度、塩基配列およびＧ含有量が含まれるが、それらに限定されない。
【００４６】
（ｉ）ヌクレオチド間結合が生理学的条件下でＭｒｅ１１により加水分解性であるホスホジエステル結合またはそのアナログである場合、および（ｉｉ）その結合に対して３’側にあるすべてのヌクレオチド間結合も加水分解性である場合。その結合に対して３’である加水分解性ヌクレオチド間結合の数にかかわらず、ヌクレオチド間結合が生理学的条件下でＭｒｅ１１により非加水分解性である場合、ヌクレオチド間結合は、本発明の目的では、非加水分解性と考えられる。非加水分解性ヌクレオチド間結合の代表例には、ホスホロチオエート結合およびペプチド核酸結合（ＰＮＡ）が含まれるが、それらに限定されない。
【００４７】
本発明のある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、加水分解性ヌクレオチド間結合を有する。オリゴヌクレオチドは、約１〜約２００個の加水分解性ヌクレオチド間結合を有し得る。オリゴヌクレオチドはまた、非加水分解性ヌクレオチド間結合を有し得る。オリゴヌクレオチドは、約０〜約１９９個の非加水分解性ヌクレオチド間結合を有してもよい。
【００４８】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、非加水分解性結合を有する。オリゴヌクレオチドは、約１〜約２００個の非加水分解性ヌクレオチド間結合を有し得る。オリゴヌクレオチドはまた、加水分解性ヌクレオチド間結合を有してもよい、オリゴヌクレオチドは、約０〜約５個の加水分解性ヌクレオチド間結合を有する。好ましいオリゴヌクレオチドは、本明細書、および本明細書に引用して援用する、２００２年４月１２日出願の同時係属中の米国特許出願第１０／１２２，６３０号に記載のＴ−オリゴである。
【００４９】
（ｂ．タンキラーゼの調節因子）
本発明はまた、タンキラーゼ活性調節因子に関する。この調節因子は、タンキラーゼ活性を誘導し得る。この調節因子はまた、タンキラーゼ活性を阻害し得る。調節因子は、人工的に合成した化合物、または天然に存在する化合物であり得る。調節因子は、低分子量化合物、ポリペプチドもしくはペプチド、またはそれらのフラグメント、アナログ、ホモログ、改変体もしくは誘導体であってもよい。
【００５０】
（ｃ．ＤＮＡ損傷経路の調節因子）
本発明はまた、ＤＮＡ損傷経路の調節因子に関する。調節因子は、ＤＮＡ損傷経路を誘発し得る。この調節因子は、また、ＤＮＡ損傷経路を阻害し得る。調節因子は、人工的に合成した化合物、または天然に存在する化合物である。調節因子は、低分子量化合物、ポリペプチドもしくはペプチド、またはそれらのフラグメント、アナログ、ホモログ、改変体もしくは誘導体であってもよい。
【００５１】
（ｄ．ＭＲＮ複合体形成の調節因子）
本発明はまた、ＭＲＮ複合体形成の調節因子に関する。調節因子は、ＭＲＮ複合体の形成を誘発し得る。この調節因子はまた、ＭＲＮ複合体の形成を阻害し得る。調節因子は、人工的に合成した化合物、または天然に存在する化合物である。調節因子は、低分子量化合物、ポリペプチドもしくはペプチド、またはそれらのフラグメント、アナログ、ホモログ、改変体もしくは誘導体であってもよい。
【００５２】
（３．組成物）
本発明はまた、上記のような調節因子を有する組成物に関する。この組成物は、Ｍｒｅ１１アクチベーターを含み得る。組成物はまた、タンキラーゼアクチベーターを含み得る。組成物はまた、Ｍｒｅ１１のインヒビターを含み得る。組成物はまた、タンキラーゼのインヒビターを含み得る。組成物はまた、１種より多くの本発明の調節因子を含み得る。組成物はまた、別な治療薬と共に１種またはそれより多くの調節因子を含み得る。
【００５３】
本発明のある実施形態では、組成物は、本発明のオリゴヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチドは、加水分解性ヌクレオチド間結合または非加水分解性ヌクレオチド間結合、またはその組み合わせを有してもよい。好ましい実施形態では、このオリゴヌクレオチドはＭｒｅ１１のアクチベーターである。別の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｍｒｅ１１のインヒビターである。上記のように、オリゴヌクレオチドの活性を調節して、加水分解性ヌクレオチド間結合の全濃度に基づきＭｒｅ１１を誘導または阻害し得る。
【００５４】
（ａ．処方）
本発明の組成物は、通常の方法で配合された錠剤または菓子錠剤の状態である。例えば、経口投与用の錠剤およびカプセルは、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤および湿潤剤を含むがそれらに限定されない通常の賦形剤を含み得る。結合剤には、シロップ、アカシアガム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントガム、澱粉糊およびポリビニルピロリドンが含まれるが、それらに限定されない。充填剤には、ラクトース、糖、微結晶性セルロース、トウモロコシ澱粉、燐酸カルシウムおよびソルビトールが含まれるが、それらに限定されない。滑沢剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコールおよびシリカが含まれるが、それらに限定されない。崩壊剤には、馬鈴薯澱粉およびナトリウム澱粉グリコレートが含まれるが、それらに限定されない。湿潤剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれるが、それらに限定されない。錠剤は、当該分野で周知の方法に従ってコーティングされ得る。
【００５５】
本発明の組成物は、水性または油性の懸濁液、溶液、乳化物、シロップおよびエリキシルを含むがそれらに限定されない液体配合物であってもよい。組成物はまた、使用前に水または他の適当なビヒクルで構成するための乾燥製品として配合してもよい。このような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび保存剤を含むがそれらに限定されない添加物を含んでもよい。懸濁剤には、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および水素化食用油が含まれるが、それらに限定されない。乳化剤には、レシチン、ソルビタンモノオレエートおよびアカシアガムが含まれるが、それらに限定されない。非水性ビヒクルには、食用油、アーモンド油、分別ココナッツ油、油性エステル、プロピレングリコールおよびエチルアルコールが含まれるが、それらに限定されない。保存剤には、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルおよびソルビン酸が含まれるが、それらに限定されない。
【００５６】
本発明の組成物は、座薬としても調合されてもよく、ココアバターまたはグリセリドを含むがそれらに限定されない座薬ベースを含み得る。本発明の組成物はまた、吸入用に調合されてもよく、乾燥粉末として投与し得る溶液、懸濁液または乳化物を含むが、それらに限定されない形状であってもよく、またはジクロロジフルオロメタンもしくはトリクロロフルオロメタン等の推進剤を用いるエアゾールの形状であってもよい。本発明の組成物はまた、クリーム、軟膏、ローション、ペースト、医用硬膏、パッチまたは膜を含むがそれらに限定されない水性または非水性ビヒクルを含む経皮調製物として調合してもよい。
【００５７】
本発明の組成物はまた、注射または連続注入を含むがそれらに限定されない方法による非経口投与用に調合し得る。注射用の処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳化物の形状であってもよく、懸濁剤、安定化剤および分散剤を含むがそれらに限定されない調合剤を含み得る。滅菌無パイロジェン水を含むがそれに限定されない適当なビヒクルで再構成するための粉末形状の組成物を提供してもよい。
【００５８】
本発明の組成物は、移植または筋肉内注射で投与し得る貯蔵調製物として調合してもよい。組成物は、適当なポリマー材料または疎水性材料（例えば受容し得る油中の乳化物として）、イオン交換樹脂を用いるか、または難溶性誘導体として（例えば難溶性塩として）調合し得る。
【００５９】
本発明の組成物はまた、リポソーム調製物として調合してもよい。リポソーム調製物は、関連する細胞または角質層に侵入し、細胞膜と融合してリポソームの内容物を細胞内に送達するリポソームを含むことができる。例えば、Ｙａｒｏｓｈの米国特許第５，０７７，２１１、Ｒｅｄｚｉｎｉａｋらの米国特許第４，６２１，０２３、またはＲｅｄｚｉｎｉａｋらの米国特許第４，５０８，７０３号に記載されたもののようなリポソームを使用できる。皮膚の病状を標的とすることを意図する本発明の組成物を、哺乳動物の皮膚をＵＶまたは酸化的損傷を生じる薬剤に暴露前、暴露中または暴露後に投与することができる。その他の適当な処方にニオソームを用いることができる。ニオソームは、膜の大部分が非イオン性脂質からなっており、その一部の形態は角質層を横切って化合物を輸送するに有効な、リポソームに似た脂質ビヒクルである。
【００６０】
（４．処置法）
（ａ．Ｍｒｅ１１アクチベーター、タンキラーゼアクチベーター、ＤＮＡ損傷経路アクチベーターまたはＭＲＮ複合体形成アクチベーター）
Ｍｒｅ１１、タンキラーゼ、ＤＮＡ損傷経路またはＭＲＮ複合体形成の活性を誘導または増加する本発明の調節因子を単独で、または他の処置と組み合わせて、増殖停止、アポトーシスまたは増殖老化の不全に関連する病状の処置に使用し得る。このような病状の代表例には、癌および例えば乾癬におけるケラチン細胞または繊維芽細胞肥大性瘢痕およびケロイド、またはある種の自己免疫障害の症例におけるリンパ球サブセット等の正常粋を超える細胞の良性増殖等の過剰増殖疾患が含まれるが、それらに限定されない。これらの方法で処置される癌の形式は、様々な形で現れ、例えば頚部癌、リンパ腫、骨肉腫、メラノーマ、および皮膚に生じる他の癌、および白血病等の体の様々な細胞型および器官に生じる。この治療が目指す癌細胞のタイプはまた、乳房、肺、肝臓、前立腺、膵臓、卵巣、膀胱、子宮、結腸、脳、食道、胃および胸腺でもある。調節因子はまた日焼けの阻害、細胞分化の促進および免疫抑制に使用し得る。
【００６１】
本発明のある実施形態では、加水分解性ヌクレオチド間結合を有する本発明のオリゴヌクレオチドを、処置を必要とする患者にオリゴヌクレオチドを投与することにより、増殖停止、アポトーシスまたは増殖老化の不全に関連する病状の処置に使用する。オリゴヌクレオチドは、非加水分解性ヌクレオチド間結合を有してもよい。上記で議論したように、オリゴヌクレオチドの活性を調節して、加水分解性ヌクレオチド間結合の合計濃度に基づいて増殖停止またはアポトーシスを誘導し得る。オリゴヌクレオチドを本発明の調節因子、または他の処置と組み合わせて投与してもよい。
【００６２】
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドを頚部癌、リンパ腫、骨肉種、メラノーマ、皮膚癌、白血病、乳癌、肺癌、肝癌、前立腺癌、膵臓癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮癌、直腸癌、脳腫瘍、食道癌、胃癌および胸腺癌でなる群から選ばれる癌の処置に使用する。
【００６３】
Ｔ−オリゴは、免疫抑制の公知の調節因子であるＴＮＦ−αおよびＩＬ１０の上方制御により、マウスモデルにおけるＵＶ照射と同様な有効性でアレルギー性接触過敏症の誘導または誘発を防止することが可能である。従って、Ｍｒｅ１１の局所または全身アクチベーターは、例えば乾癬または湿疹等のリンパ球媒介皮膚疾患の他、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、紅斑性狼瘡等のリンパ球媒介全身性疾患、および多くの他の疾患の処置におけるステロイド療法に取って代わり得る。
【００６４】
（ｂ．Ｍｒｅ１１、タンキラーゼ、ＤＮＡ損傷経路またはＭＲＮ複合体形成のインヒビター）
Ｍｒｅ１１、タンキラーゼ、ＤＮＡ損傷経路またはＭＲＮ複合体形成の活性を阻害または減少する本発明の調節因子は、単独または他の処置と組み合わせて使用されて、増殖停止、アポトーシスまたは増殖老化に関連する病状を処置し得る。このような病状の代表例にはＵＶ照射への暴露、および正常組織に対する化学療法および放射線療法等の癌処置の副作用、または日光に暴露された正常皮膚における日焼け反応の促進が含まれるが、それに制限されない。細胞分化を阻害するためにも調節因子を使用し得る。
【００６５】
他の実施形態では、非加水分解性ヌクレオチド間結合を有する本発明のオリゴヌクレオチドが、このオリゴヌクレオチドをそのような処置を必要とする患者に投与することにより、増殖停止またはアポトーシスに関連する病状を処置するために使用される。このオリゴヌクレオチドは、加水分解性ヌクレオチド間結合も含み得る。上記に議論したように、オリゴヌクレオチドの活性を調節して、加水分解性ヌクレオチド間結合の合計濃度に基づき増殖停止またはアポトーシスを阻害し得る。オリゴヌクレオチドを本発明の調節因子または他の処置と組み合わせて投与してもよい。
【００６６】
ある好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドがＵＶ照射への暴露、ならびに化学療法および放射線療法等の癌処置の副作用でなる群から選ばれた病状を処置するために使用される。
【００６７】
（ｃ．投与）
本発明の組成物を経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、経吸入、経頬の投与、またその組み合わせを含むがそれらに限定されない任意の方法で投与し得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、腹膜内、皮下、筋肉内、腱鞘内、および骨関節内を含むがそれらに限定されない。
【００６８】
（ｄ．投薬量）
治療に使用するに必要な組成物の治療有効量は、治療する病状の性質、活性を必要とする時間の長さ、および患者の年齢と状態によって変化し、最終的には、担当医によって決定される。しかしながら、一般に成人の治療に用いられる投薬量は、典型的には、１日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。投薬量は、１日当たり約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇでもよい。所望の投薬量は、１回の用量で投薬されるか、適当な間隔で投与される複数回の用量、例えば１日あたり２回、３回、４回またはそれより多くの部分用量として便利に投与され得る。複数回の投薬が望ましいか、必要である。
【００６９】
調節因子の投薬量は、約１μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２５μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１７５μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４２５μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、４７５μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５２５μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、５７５μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６２５μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、６７５μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７２５μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、７７５μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８２５μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、８７５μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９２５μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、９７５μｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇを含むが、それらに限定されない任意の投薬量であってもよい。
【００７０】
（５．スクリーニング法）
本発明はまた、Ｍｒｅ１１活性の調節因子を同定するスクリーニング法に関する。本発明はまた、タンキラーゼ活性の調節因子を同定するスクリーニング法に関する。本発明は、さらにＭＲＮ複合体形成の調節因子を同定するスクリーニング法に関する。さらに、本発明は、ＤＮＡ損傷経路の調節因子を同定するスクリーニング法に関する。スクリーニング法をインビトロ、細胞ベース、遺伝的およびインビボ分析を含むがそれらに限定されない種々のフォーマットで実行し得る。
【００７１】
Ｍｒｅ１１調節因子またはタンキラーゼ調節因子を、場合に応じてＭｒｅ１１またはタンキラーゼに特異的に結合する物質をスクリーニングすることにより同定し得る。免疫沈澱およびアフィニティークロマトグラフィーを含むがそれらに限定されない多くの標準技術を用いて、当業者は、特異的結合物質をインビトロで同定し得る。また、酵母２−ハイブリッドおよびファージディスプレイを含むがそれらに限定されない多くの標準技術を用いる遺伝的スクリーニングを用いて、当業者はまた、特異的結合物質を同定し得る。また、Ｍｒｅ１１またはタンキラーゼをチップ（例えばガラス、プラスチックまたはシリコン）等の固相支持体に付着させることを含むがそれに限定されない高スループット法を用いて当業者はまた、特異的結合物質を同定し得る。
【００７２】
Ｍｒｅ１１調節因子またはタンキラーゼ調節因子をまた、場合に応じてＭｒｅ１１またはタンキラーゼの活性を調節する物質についてインビトロでスクリーニングすることにより同定し得る。場合に応じて、Ｍｒｅ１１またはタンキラーゼを予想される調節因子と接触させ、予想される調節因子がＭｒｅ１１またはタンキラーゼの活性を変化させるかどうかを決定することにより、調節因子を同定し得る。Ｍｒｅ１１の核酸基質の加水分解を測定することにより、Ｍｒｅ１１の活性を決定し得る。核酸基質の加水分解をＵＶ吸収の測定、および好ましくは、標識オリゴのゲル分析または非沈殿性ヌクレオチド塩基の回収を含むがそれらに限定されない方法により決定し得る。タンキラーゼの活性を、ＴＲＦ１を含むがそれに限定されないペプチドまたはポリペプチドのリン酸化を測定することにより決定し得る。
【００７３】
Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１を組み合わせ、コントロールと比較してＭＲＮ複合体形成に対する候補調節因子の効果を測定することにより、ＭＲＮ複合体形成の調節因子をインビトロで同定し得る。遠心分離、共沈殿および非変性電気泳動を含むがそれらに限定されない当業者に公知の多くの標準技術を用いてＭＲＮ複合体の形成を測定し得る。
【００７４】
細胞ベース分析でＭｒｅ１１またはタンキラーゼの活性を調節する物質をスクリーニングすることにより、Ｍｒｅ１１調節因子またはタンキラーゼ調節因子を同定し得る。ＤＮＡ損傷経路の調節因子も同様に同定し得る。細胞を疑わしい調節因子と接触させ、疑わしい調節因子がアポトーシス、老化、またはｐ５３またはｐ９５のリン酸化のレベルを変化させるかどうかを決定して、調節因子を同定し得る。上記で議論したように、候補調節因子は、Ｍｒｅ１１またはタンキラーゼと特異的に結合する物質であってもよい。アポトーシスの調節をＦＡＣＳ分析におけるサブＧ０／Ｇ１ピークのサイズの測定、ＴＵＮＥＬ分析、ＤＮＡラダー分析、アネキシン分析、またはＥＬＩＳＡ分析を含むがそれらに限定されない方法により測定し得る。老化に関連するβ−ガラクトシダーゼ活性の測定、または細胞収量の増加不能またはｐＲｂリン酸化不能またはマイトジェン刺激後の３Ｈ−チミジンの取り込み不能を測定することにより、老化の調節を決定し得る。ゲルシフトアッセイにより、ｐ５３プロモーター駆動ＣＡＴまたはルシフェラーゼコンストラクト読み出しにより、またはｐ２１等のｐ５３−制御遺伝子生成物の誘導により、セリン１５またはセリン３７におけるｐ５３のリン酸化を測定することにより、ｐ５３活性の調節を決定し得る。ウェスタンブロット分析におけるｐ９５バンドの移動により、またはＳ期停止を検出するためのＦＡＣＳ分析により、セリン３４３におけるｐ９５のリン酸化を測定することによりｐ９５活性の調節を決定し得る。また、インビボ腫瘍形成を調節する物質をスクリーニングすることにより、Ｍｒｅ１１調節因子またはタンキラーゼ調節因子を同定し得る。
【００７５】
細胞ベース分析で任意の細胞を使用し得る。本発明で使用するための細胞には、哺乳動物細胞が含まれることが好ましく、ヒトおよびヒト以外の霊長類細胞が含まれることがより好ましい。適当な細胞の代表例には、初代（正常）ヒト皮膚繊維芽細胞、上皮ケラチン細胞、メラニン形成細胞、および対応する不死化細胞株または形質転換細胞株；および初代マウス細胞株、不死化マウス細胞株または形質転換マウス細胞株が含まれるがそれらに限定されない。タンパク質リン酸化の量を比色分析、発光分析、蛍光分析およびウェスタンブロットを含むがそれらに限定されない当業界の標準技術により測定し得る。
【００７６】
予期される調節因子を混合等により細胞に添加する条件は、アポトーシスまたはシグナル伝達を妨害する他の調節化合物が基本的に存在しない場合、細胞がアポトーシスまたはシグナル伝達を受け得る条件である。有効な条件には、細胞増殖を可能にする、適当な媒体、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれるが、それらに限定されない。適当な媒体は、典型的には、成長因子および同化可能炭素、窒素および燐源の他、適当な塩、ミネラル、金属、およびビタミン等の他の栄養物を含む固体または液体の媒体であり、細胞がアポトーシスまたはシグナル伝達を示し得るように細胞を培養できる有効媒体を含む。例えば、哺乳動物細胞では、媒体は１０％のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地を含み得る。
【００７７】
各細胞を組織培養フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、およびペトリプレートを含むがそれらに限定されない様々な容器中で培養し得る。培養を細胞に対して適当な温度、ｐＨおよび二酸化炭素含有量で行う。このような培養条件も当業者の範囲内である。
【００７８】
予期される調節因子を細胞に加える方法には、エレクトロポーレーション、ミクロインジェクション、細胞発現（すなわち裸の核酸分子、組み換えウイルス、レトロウイルス発現ベクターおよびアデノウイルス発現を含めた発現系を用いる）、因子の培地への添加、イオン対形成因子の使用、および細胞を透過性にするための洗剤の使用が含まれる。
【００７９】
候補調節因子は、糖質、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＤＮＡフラグメント、ＲＮＡおよびＲＮＡフラグメント等を含むポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン等の天然に存在する分子；またはペプチド模倣物等の天然に存在する分子のアナログまたは誘導体；ならびに「低分子」有機化合物等の天然に存在しない分子等でよい。用語「低分子有機化合物」は、一般的に分子量約１０００以下、好ましくは、約５００以下を有する有機化合物を指す。
【００８０】
候補調節因子は、コンビナトリアルケミストリー技術、発酵法、植物および細胞抽出法等を含むがそれらに限定されない手段で調製され得る、または得られ得るライブラリー（すなわち化合物のコレクション）中に存在し得る。コンビナトリアルライブラリーの作成法は、周知である。例えばＥ．Ｒ．Ｆｅｌｄｅｒ、Ｃｈｉｍｉａ、１９９４、４８、５１２−５４１；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４、３７、１２３３−１２５１；Ｒ．Ａ．Ｇｏｕｇｈｔｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１９９３、９、２３５−２３９；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１、３５４、８４−８６；Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１、３５４、８２−８４；Ｃａｒｅｌｌら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９５、３、１７１−１８３；Ｍａｄｄｅｎら、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ、２、２６９−２８２；Ｃｗｉｒｌａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０、８７、６３７８−６３８２；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、５３８１−５３８３；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４、３７、１３８５−１４０１；Ｌｅｂｌら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、１９９５、３７、１７７−１９８；およびそれらの中に引用された参考文献参照。
【００８１】
本発明は、以下の非制限的実施例に示された多様な局面を有する。
【実施例】
【００８２】
（実施例１）
（オリゴヌクレオチドがアポトーシスを誘発し得る）
テロメア突出反復配列（ＴＴＡＧＧＧ；配列番号１）に相同のオリゴヌクレオチド、配列（１１マー−１：ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号２）のオリゴヌクレオチド、この配列に相補性のオリゴヌクレオチド（１１マー−２：ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ；配列番号３）、およびテロメア配列に関係しないオリゴヌクレオチド（１１マー−３：ｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ；配列番号４）を、テロメア破壊に応じてアポトーシスを行うと報告されているヒトＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞の培養物に添加した。コントロール細胞が２５〜３０％であるのと比較して、４８時間以内に、４０μＭの配列番号５で処理した細胞の５０％がＳ期に集積し（ｐ＜０．０００３、ノンペアｔ検定、図１Ａ〜１Ｄ参照）、コントロールが２〜３％であるのと比較して、７２時間でこれらの細胞の１３％がサブＧ０／Ｇ１含有率で決定してアポトーシス性であった（ｐ＜０．００７、ノンペアｔ検定、図１Ｅ〜１Ｈ参照）。コントロールが３〜５％であるのと比較して、９６時間で、１１マー−１処理細胞の２０±３％がアポトーシス性であった（ｐ＜０．０００１、ノンペアｔ検定）。その無二の効果の説明として１１マー−１の優先的な取り込みを排除するため、Ｊｕｒｋａｔ細胞を３’末端にフルオレセインホスホルアミダイトで標識したオリゴヌクレオチドで処理し、次いで共焦点顕微鏡法およびＦＡＣＳ分析に供した。細胞の蛍光強度は、４時間および２４時間において全ての処理後で同じであった。ウェスタン分析は、１１マー−１添加後の２４時間でｐ５３が増加したが、１１マー−２または１１マー−３では増加せず、Ｅ２Ｆ１転写因子のレベルが同時に増加したことを示した。この因子は、アポトーシスの誘導でｐ５３と協力し、ヒト繊維芽細胞でｐ５３に依存して老化表現型を誘導する他、Ｓ期チェックポイントを制御することが知られている。
【００８３】
（実施例２）
（テロメア突出ホモログ１１マー−１のホスホロチオエートバージョンは、アポトーシスを誘導しない）
ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞の培養物を希釈剤、１１マー−１（配列番号１）またはホスホロチオエート１１マー−１（１１マー−１−Ｓ）のいずれかで９６時間処理し、細胞を集めＦＡＣＳ分析用に処理した。０．４μＭ（図２Ａ〜２Ｃ）および４０μＭ（図２Ｄ〜２Ｆ）の２種類の濃度のオリゴヌクレオチドを試験した。０．４μＭでは、いずれのオリゴヌクレオチドも予期されたＪｕｒｋａｔ細胞の対数的に増殖する細胞周期プロフィールに影響しなかった。４０μＭでは、１１マー−１は、サブＧ０／Ｇ１ピークで示される広範囲のアポトーシスを誘導したが、１１マー−１−Ｓは、影響しなかった。
【００８４】
（実施例３）
（１１マー−１のホスホロチオエートバージョンは、ホスフェート骨格１１マー−１によるＳ期停止の誘導を妨害する）
ケラチン細胞株の培養物（ＳＳＣ１２Ｆ、１００，０００細胞／３８ｃｍ２）を１１マー−１（配列番号２）のみ、または濃度を増加させた１１マー−１−Ｓの存在下で、１１マー−１により４８時間処理した。実施例１で先に示したように、１１マー−１は、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦａｃＳｃａｎ）で示されるＳ期停止を誘導した。コントロールである希釈剤で処理した細胞が２６％であるのと比較して、細胞の４３％がＳ期であった。しかしながら、ホスホロチオエート１１マー−１の濃度を増加してこれらの培養物に加えると、停止した細胞の数は、より少なかった（図３Ａ〜３Ｇ）。この停止の完全な阻害が１１マー−１：１１マー−１−Ｓの比が２：１である場合に見られた。１１マー−１−Ｓ自体は、Ｓ期停止を誘導しなかった。
【００８５】
（実施例４）
（テロメアオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート型は、構成的色素沈着およびＵＶ誘導色素沈着を誘導し、メラニン生成を刺激しない）
Ｓ９１マウスメラニン細胞の培養物（１００，０００細胞／３８ｃｍ２）を１００μＭのｐＴｐＴまたはホスホロチオエートｐＴｐＴ（ｐＴｓｐＴ）（図４）、または４０μＭの１１マー−１またはホスホロチオエート１１マー−１（１１マー−１−Ｓ）（図５）で６日間処理し、細胞を集め計数し、メラニン含有量を分析した。ｐＴｐＴおよび１１マー−１は、これらの細胞中でメラニン生成を刺激したが（それぞれ図４および図５）、ｐＴｓｐＴおよび１１マー−１−Ｓは、刺激しなかった（それぞれ図４および図５）。さらに、ｐＴｓｐＴ（図４）および１１マー−１−Ｓ（図５）は、これらの細胞中の構成的色素沈着を減少させた。このことは、テロメア修復／複製中にこの配列を慢性的に暴露するとメラニン生成に対する定常的な低いレベルのシグナルを提供し得、このシグナルがｐＴｓｐＴおよび１１マー−１−Ｓで妨害されることを示唆している。
【００８６】
（実施例５）
（ホスホロチオエートｐＴｓｐＴは、ＵＶ誘発メラニン生成を阻害する）
Ｓ９１細胞の２重の培養物（１００，０００細胞／３９ｃｍ２）を偽照射、またはリサーチラジオメータ（モデルＩＬ１７００Ａ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ、Ｎｗｅｂｕｒｙｐｏｒｔ、ＭＡ）を用いる２８５±５ｎｍで計測して、１ｋＷキセノンアークソーラーシミュレーター（ＸＭＮ１０００−２１、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ、Ａｚｕｚａ、ＣＡ）からの５ｍＪ／ｃｍ２の太陽シミュレーション光で照射した。枚の偽照射プレートに１００μＭのｐＴｓｐＴを追加し、２種の照射培養物も同様にｐＴｓｐＴで処理した。１週間後、細胞を集めて計数し、細胞ペレットを１ＮのＮａＯＨに溶解し４７５ｎｍの光学濃度を測定してメラニン含量を分析した。ＵＶ照射によりこれらの細胞中のメラニン含有量は、２倍になった。しかしながら、この反応は、ｐＴｓｐＴを加えることにより妨害された（図６）。さらに、図４および５に示したデータと同様、これらの細胞の構成的色素沈着がｐＴｓｐＴにより偽照射培養物中で減少した。
【００８７】
（実施例６）
（活性には、Ｔ−オリゴの加水分解が必要である）
配列番号２に基づくオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド１を完全にホスホロチオエート骨格で合成した。オリゴヌクレオチド２は、各末端に２個のホスホロチオエート結合を有し、中央の他の結合は、ホスホジエステル結合であった。オリゴヌクレオチド３は、５’末端に２個のホスホロチオエート結合を有し（５’末端をブロック）、残りの結合は、ホスホジエステル結合であった。オリゴヌクレオチド４は、３’末端に２個のホスホロチオエート結合を有し（３’末端をブロック）、残りの結合は、ホスホジエステル結合であった。図７参照。
【００８８】
これらのオリゴヌクレオチドを正常新生児繊維芽細胞の培養物に加えた。４８時間後、細胞を集め、ウェスタンブロットによりｐ５３セリン１５リン酸化およびｐ９５／Ｎｂｓ１リン酸化を分析した。他の培養物をオリゴヌクレオチドの存在下で１週間放置し、次いで細胞を老化関連β−ガラクトシダーゼ活性について染色した（ＳＡ−β−Ｇａｌ）。β−ガラクトシダーゼ陽性細胞を計数し、全細胞の％として表した（図８）。
【００８９】
ヌクレアーゼが接近し得る３’末端を有するオリゴヌクレオチドは、ｐ５３およびｐ９５／Ｎｂｓ１リン酸化等の「初期」反応刺激で、最も効果的であった。しかしながら、ヌクレアーゼが接近し得る５’末端を有するオリゴヌクレオチドも１週間後に老化表現型を誘導し得るが、４８時間でリン酸化反応を誘導せず、３’→５’ヌクレアーゼ感受性が老化誘導活性に好ましいことを示唆している。
【００９０】
（実施例７）
（Ｍｒｅ１１タンパク質レベルのダウンレギュレーションは、Ｔ−オリゴの反応を妨害する）
正常ヒト新生児繊維芽細胞を１０ピコモルのＭｒｅ１１ ｓｉＲＮＡまたは１０ピコモルのコントロール（発現したヒト配列中に相同性が見出されない）のいずれかで処理した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの日に培養皿は、約６０％の密集であった。製造業者によって供給されるプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクション混合物を細胞に５時間作用させ、次いで新鮮な培地のみに交換した。翌日、トランスフェクションプロトコールを繰り返した。翌日、二重培養物をＴ−オリゴまたは負コントロールとしての希釈剤のみで処理した。４８時間後に細胞を集め、ホスホｐ９５セリン３４３特異性抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、Ｍｒｅ１１特異性抗体（ＧｎｅｎＴｅｘ、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）、ホスホロｐ５３セリン１５特異性抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびトータルｐ５３特異性抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてウェスタンブロットによりタンパク質を分析した（図９）。Ｈｅｌａ細胞溶解物をＭｒｅ１１に対する正のコントロールとして用いた。１０ＧｙＩＲに暴露、または偽照射し、１時間後に集めた正常繊維芽細胞をｐ５３およびｐ９５／Ｎｂｓ１リン酸化に対する正のコントロールとした。濃度計でオートラジオグラフを分析し、Ｔ−オリゴ試料に対する値を希釈剤処理試料に対する値として表した（図１０および図１１）。ローディングに関して補正後、ＭＲＥ１１レベルが有意に減少した細胞では、Ｔ−オリゴに対するホスホｐ５３反応が減少し、ホスホｐ９５／Ｎｂｓ１反応がないことが明らかである。
【００９１】
（実施例８）
（ｐ５３経路およびｐＲｂ経路双方の不活性化がＲ２Ｆ繊維芽細胞でＴ−オリゴ誘導老化を逃れるために必要である）
（オリゴヌクレオチド）
２種のＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用した。１つは、テロメア突出部に相同（Ｔ−オリゴ：ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号２）であり、もう１つは、それに相補性（ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ；配列番号３）であり、負のコントロールとして用いた。これらのオリゴは、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｔｅｘａｓ）により合成された。オリゴヌクレオチドを以前に記載のように調製した（Ｅｌｌｅｒら、［２００３］テロメア３’突出特異性ＤＮＡによるｐ９５／Ｎｂｓ−１媒介Ｓ期チェックポイントの誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐ９５／Ｎｂｓ−１−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓ−Ｐｈａｓｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｙ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ３’ｏｖｅｒｈａｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ）、Ｆａｓｅｂ Ｊ１７，１５２−１６２）。
【００９２】
（細胞源および培養）
Ｒ２Ｆ新生児皮膚繊維芽細胞、および誘導されたｐ５３ＤＤ、ｃｄｋ４Ｒ２４Ｃおよびｐ５３ＤＤ／ｃｄｋＲ２４Ｃ形質導入体（Ｊａｍｅｓ Ｇ．Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ博士（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）からの寛大な贈り物）は、機能性ｐ５３経路、ｐＲｂ経路および双方の経路がそれぞれ欠けている。
【００９３】
（老化関連β−ガラクトシダーゼ染色）
細胞を希釈剤のみ、４０μＭのＴ−オリゴまたは４０μＭの相補性オリゴで１週間、液を取り替えないで１回処理した。次いで細胞を２％ホルムアルデヒド／０．２％グルタルアルデヒド中で３〜５分固定し、文献記載（Ｄｉｍｒｉら、［１９９５］培養物およびインビボでの老化皮膚中で老化ヒト細胞を同定するバイオマーカー（Ａ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｔｈａｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ Ａｇｉｎｇ Ｓｋｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２，９３６３−９３６７）通りに３７℃（大気中のＣＯ２）で終夜、新鮮な老化関連β−Ｇａｌ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）染色液でインキュベーションした。
【００９４】
（ウェスタンブロット分析および抗体）
以前に記載（Ｅｌｌｅｒら、［１９９６］ＤＮＡ損傷がメラニン形成を促進する（ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３，１０８７−１０９２）されているようにウェスタンブロット分析を行った。以下の抗体を使用した：ＤＯ−１（Ａｂ−６）抗ｐ５３（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、抗ホスホｐ５３（ｓｅｒ１５）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、抗ホスホｐＲｂ（ｓｅｒ７８０、ｓｅｒ７９５、ｓｅｒ８０７／８１１）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、抗ｃｄｋ４（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）および抗アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）。
【００９５】
（クローン形成性分析）
ヒト繊維芽細胞を希釈剤のみ、４０μＭのＴ−オリゴまたは４０μＭの相補性オリゴで１週間処理し、トリプシン処理を行って計数した。３００個の細胞を６０ｍｍの培養皿中に３連で接種し、完全培地中で週に２回培地を交換して２週間インキュベーションした。次いで細胞を１００％メタノール中で５分間固定した。メタノールを除去し、培養皿を水で短時間濯いだ。コロニーをＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）メチレンブルー溶液中で１０分間染色し、再度水で１回洗浄し計数した。
【００９６】
（ＢｒｄＵ取り込み分析）
Ｐｅｒｍａｎｏｘチャンバースライド上で培養したＨＴ−１０８０線維肉腫細胞を希釈剤、４０μＭのＴ−オリゴおよび４０μＭの相補性オリゴで４日間処理し、製造業者が提供するプロトコールに従って５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識および検出キットＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてＤＮＡ合成を分析した。簡単に言えば、細胞をＢｒｄＵで１時間標識し、固定して抗ＢｒｄＵモノクローン抗体でインキュベーションした。抗マウスＩｇアルカリホスファターゼとインキュベーション後、光学顕微鏡で発色反応を検出した。
【００９７】
（テロメアの長さ）
ＨＴ−１０８０繊維肉腫細胞を希釈剤、４０μＭのＴ−オリゴまたは４０μＭの相補性オリゴで４日間処理し、次いでＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡを単離した。製造業者が提供するプロトコールに従い、Ｔｅｌｏ ＴＴＡＧＧＧ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ Ｌｅｎｇｔｈ Ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてテロメア長を決定した。簡単に言えば、１μｇの精製ゲノムＤＮＡをＨｉｎｆ１／Ｒｓａ１で消化し、０．８％アガロースゲルでＤＮＡフラグメントを分離し、次いでサザンブロットのためにナイロン膜上に移し、テロメア反復に特異的なジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識プローブとハイブリダイズし、抗ＤＩＧアルカリホスファターゼでインキュベーションした。末端制限フラグメント（ＴＲＦ）を化学発光で検出した。露光したＸ−線フィルムを濃度計で走査して平均ＴＲＦ長を計算し、先に記載（Ｈａｒｌｅｙら、［１９９０］ヒト繊維芽細胞の老化中にテロメアが短縮する（Ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ Ｓｈｏｒｔｅｎ ｄｕｒｉｎｇ Ａｇｅｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、Ｎａｔｕｒｅ、３４５，４５８−４６０）されたように計算した。
【００９８】
（結果）
老化繊維芽細胞は、特徴的に大きく平坦な形態を示し、老化関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）活性の増加を示す。ＴＲＦ２ＤＮの異所発現は、テロメアループ構造を破壊し、ｐ５３経路およびｐＲｂ経路を活性化することにより正常なヒト繊維芽細胞における老化を誘導する。ＴＲＦ２ＤＮ誘導老化を阻止するためには、ヒト細胞中のｐ５３経路およびｐＲｂ経路の双方を妨害することが必要である。
【００９９】
ｐ５３経路および／またはｐＲｂ経路が欠失するように遺伝子操作された細胞株をＴ−オリゴ誘導老化に関与するシグナル伝達経路を分析するために使用した。ｐ５３の転写トランス活性化ドメインが欠失し、内因性野生型ｐ５３タンパク質に結合し不活性化するドミナントネガティブ変異体ｐ５３（ｐ５３ＤＤ）の異所発現により、ｐ５３経路の不活性化を行った。ｐ５３の転写標的であるｐ２１／ＳＤＩ１タンパク質は、ｐ５３ＤＤを発現するように形質導入されたＲ２Ｆ繊維芽細胞中では、検出レベル未満であった（データ示さず）。ｐ１６を結合できないｐ１６不感性変異体ｃｄｋ４（ｃｄｋ４Ｒ２４Ｃ）の異所発現により、ｐＲｂ経路の破壊を行い、そのｐＲｂタンパク質の制御を破壊した。双方の経路の抑制を双方の変異体（ｐ５３ＤＤ／ｃｄｋ４Ｒ２４Ｃ）の異所発現により行った。ｐ５３ＤＤおよびｃｄｋ４Ｒ２４Ｃの発現をウェスタンブロットで確認し、ｐ５３とｃｄｋ４タンパク質の過剰発現をそれぞれ示した（図１２ａ）が、これは、ヒトケラチン細胞がこれらの変異体で形質導入されるという以前の報告と一致している。
【０１００】
細胞を希釈剤または４０μＭのＴ−オリゴで１週間処理し、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性を分析した。正常新生児包皮繊維芽細胞親株（Ｒ２Ｆ）を正のコントロールとして用いた。予期されるように、Ｔ−オリゴ処理Ｒ２Ｆ繊維芽細胞は、希釈剤処理コントロール細胞と比較して大きく広がった形態とＳＡ−β−Ｇａｌ活性の増大を示した（それぞれ６５±７％および８±１％のＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞、ｐ＜０．０１：図１２ｂおよび１２ｃ）。同様に、ｐ５３ＤＤ Ｒ２Ｆ繊維芽細胞では、Ｔ−オリゴへの１週間の暴露により、Ｔ−オリゴ処理Ｒ２Ｆ繊維芽細胞は、希釈剤処理細胞と比較して大きく広がった形態とＳＡ−β−Ｇａｌ活性の増大を示し（それぞれ４５±４％および６±２％のＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞、ｐ＜０．０１：図１２ｂおよび１２ｃ）、ｐ５３経路のみの不活性化は、Ｔ−オリゴ誘導老化の抑制に不十分であることを示している。Ｔ−オリゴは、ｃｄｋ４Ｒ２４ＣＲ２Ｆ繊維芽細胞中に、希釈剤処理細胞と比較して老化表現型を誘導し（それぞれ６０±５％および７±３％、ＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞、ｐ＜０．０１：図１２ｂおよび１２ｃ）、ｐＲｂ経路のみを弱めることもＴ−オリゴ誘導老化の抑制に十分でないことを示している。しかしながら、Ｒ２Ｆ繊維芽細胞がｐ５３ＤＤとｃｄｋ４Ｒ２４Ｃとの双方を発現するように形質導入された場合、Ｔ−オリゴは、希釈剤処理細胞と比較して老化表現型を誘導することができず（それぞれ７±１％および５±２％、ｐ＞０．０５：図１２ｂおよび１２ｃ）、ｐ５３経路とｐＲｂ経路の双方を弱めることがヒト繊維芽細胞中でＴ−オリゴ誘導老化を完全に抑制するために必要であること示している。従って、Ｔ−オリゴ誘導老化の条件は、ＴＲＦ２ＤＮにより誘導される連続継代培養または老化後の複製老化の条件と同じである。
【０１０１】
（実施例９）
（ｐ５３経路およびｐＲｂ経路双方の不活性化は、ＨＴ−１０８０細胞中のＴ−オリゴ誘導老化を逃れるために必要である）
ＴＲＦ２ＤＮは、ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞で老化表現型を誘導すると報告されている。テロメア３’突出ＤＮＡ（Ｔ−オリゴ）への暴露もこれらの細胞中で老化を誘導するか否かを決定するため、ＨＴ−１０８０細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を希釈剤単独、Ｔ−オリゴまたはコントロールとしての相補性オリゴで４日間処理し、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性を評価した。Ｔ−オリゴ処理細胞のみが広がった形態とＳＡ−β−Ｇａｌ活性の増加を示した（図１３ａ）。Ｔ−オリゴ処理培養物は、希釈剤または相補コントロールオリゴ処理培養物より多いＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞を含んでいた（それぞれ８０±７％、３±２％および６±３％、ｐ＜０．０１；図１３ｂ）。また、ＢｒｄＵの取り込みの顕著な減少で示されるように、希釈剤でもコントロールオリゴ処理細胞でもなく、Ｔ−オリゴ処理細胞のみが増殖しなかった（それぞれ７±２％、９０±８％および８５±１０％、ｐ＜０．０１；図１３ｃおよび１３ｄ）。
【０１０２】
（実施例１０）
（テロメアオリゴヌクレオチドがｐＲｂのリン酸化を阻止する）
ＨＴ−１０８０細胞は、機能性ｐＲｂを有することが知られているが、ｐ５３経路は、ｐ１６が欠失する結果としてそれが欠けている。本発明者らは、次に、ＨＴ−１０８０細胞におけるそのリン酸化を阻止することによりＴ−オリゴ処理がｐＲｂを活性化するか否かを調べた。ウェスタンブロット分析により、Ｔ−オリゴに反応してセリン７８０、セリン７９５およびセリン８０７／８１１上でｐＲｂリン酸化が著しく選択的に減少することが分かった（図１３ｅ）。興味あることに、ｐ１６が欠失する腫瘍中では、ｐＲｂは、無傷で機能性であることが多い。これらの細胞中では、ｃｄｋ４の脱制御は、ｐＲｂ過剰リン酸化をもたらし、際限のない細胞増殖と腫瘍形成が行われる。ｃｄｋ２でなくＣｄｋ４の活性化がセリン７８０およびセリン７９５上でｐＲｂをきわめて効率的にリン酸化する。従って、この発見は、Ｔ−オリゴがｐ１６のない場合に、多分他のＩＮＫ４ファミリーメンバーの誘導によりｃｄｋ４活性を阻害することを示唆しており、ｐＲｂ制御の複雑なネットワーク中でｐ１６が必須の役割でないことを示し、またｐＲｂが絶対的な下流エフェクターであると単純にみなすことができないことを示唆している。
【０１０３】
（実施例１１）
（テロメアオリゴヌクレオチドの効果は、可逆的でない）
Ｔ−オリゴを除くことが線維肉腫細胞の老化表現型を反転するか否かを試験するため、ＨＴ−１０８０細胞の並行培養物を希釈剤または４０μＭのＴ−オリゴまたは４０μＭの相補コントロールオリゴで４日間処理した。次いでオリゴヌクレオチド処理をそれ以上行わず、細胞に新鮮な完全培地を与えた。１および２日後に、Ｔ−オリゴ前処理細胞は、大きくなった形態とＳＡ−β−Ｇａｌ活性の増加をまだ示し（図１４ａ）、ＤＮＡ合成を再開しなかった（図１４ｂ）。ウェスタン分析も、ｐＲｂタンパク質がＴ−オリゴ前処理細胞中で活性な阻害状態に維持されていることを示していた（図１４ｃ）。
【０１０４】
Ｔ−オリゴ処理の細胞増殖に対する長期効果を決めるため、ＨＴ−１０８０ヒト線維肉腫細胞を希釈剤のみ、４０μＭのＴ−オリゴまたは４０μＭの相補コントロールオリゴのいずれかで１週間処理し、次いで同じ数の細胞を再プレーティングし、それ以上処理せずに培地を週２回、２週間交換し、次いでメチレンブルーで染色した（図１５ａ）。相補オリゴ処理細胞と比較して（希釈剤で処理したコントロールの９０．５±９．４％）、Ｔ−オリゴで前処理した細胞のクローン形成能は、ほとんど完全に抑制された（希釈剤で処理したコントロールの５．７±１．９％、ｐ＜０．０１；図１５ｂ）。これらのデータは、この悪性細胞株におけるＴ−オリゴ誘導老化が可逆的でないことを示している。
【０１０５】
（実施例１２）
（テロメアオリゴヌクレオチドの平均テロメア長さに対する効果）
ＨＴ−１０８０細胞における平均テロメア長さ（ＭＴＬ）に対するＴ−オリゴの影響を決定するため、老化表現型が容易に観察された時間に相当する、Ｔ−オリゴで４日間処理した細胞を分析した。希釈剤処理（５．６１ｋｂ）または相補オリゴ処理コントロール（５．５１ｋｂ）と比較して、Ｔ−オリゴは、ＭＴＬ（５．５６ｋｂ）を変えなかった（図１６）。計算されたＭＴＬにおける１００ｂｐ未満の差は、実験変動の範囲内であり、有意ではない。これは、ＴＲＦ２ＤＮによるテロメアの破壊後に見られたように、１週間までの繊維芽細胞のＴ−オリゴによる処理は、テロメア３’突出部の分解をもたらさないという観察と一致している（データ示さず）。テロメアループの破壊は、ＭＴＬの急速な短縮と３’突出部の消化を生じることが知られているので、Ｔ−オリゴがＭＴＬに影響せず、または３’突出部の消化を生じずに類似または同一のシグナル伝達を開始すると言う事実は、テロメアループ破壊がなくても、すなわちＤＮＡ損傷がなくても、Ｔ−オリゴが３’突出配列の露出を真似ることを示している。
【０１０６】
（実施例１３）
（Ｔ−オリゴ反応にＰＡＲＰ活性が必要である）
Ｔ−オリゴに反応するＰＡＲＰの役割を調べるため、４０μＭのＴ−オリゴまたはコントロールとしての等量の希釈剤を加える前に、２種の異なったＰＡＲＰインヒビターである３−アミノベンズアミド（３ＡＢ、２．５ｍＭ）または１，５−ジヒドロキシキノリン（ＩＱ、１００μＭ）の一つで２時間、繊維芽細胞を前処理した。Ｔ−オリゴまたは希釈剤（Ｄ）を添加してから４時間後、各インヒビターの追加用量を細胞に与えた。繊維芽細胞を３ＡＢおよびＴ−オリゴで処理し、次いで４８時間後にウェスタンブロット用に細胞を集めた。全ｐ５３、ｐ２１およびｐ５３セリン１５のリン酸化（ｐ５３活性化を示す）のＴ−オリゴ誘発アップレギュレーションは、すべて、３ＡＢの存在下で減少した（図１７Ａ）。
【０１０７】
ＩＱで前処理した繊維芽細胞も、Ｔ−オリゴの添加後１６、２０、２４時間で全ｐ５３およびセリン１５上のリン酸化ｐ５３の誘導を同様に示した（データ示さず）。全ｐ５３、ｐ５３ホスホセリン１５およびｐ２１のＴ−オリゴ媒介誘導の妨害に対するＩＱの影響は、Ｔ−オリゴ添加後４８時間を通して持続残留した。これらのデータは、Ｔ−オリゴに対するｐ５３反応が上流のＰＡＲＰ活性を必要とすることを示している。
【０１０８】
（実施例１４）
（ＰＡＲＰインヒビターがｐ５３活性化およびＴＲＦ２ＤＮによる誘導を阻止する）
新生児繊維芽細胞をＡｄＴＲＦ２ＤＮまたは負のコントロールとしてのＡｄＧＦＰで処理した。感染の２時間前に、細胞を希釈剤、３ＡＢ（２．５ｍＭ）またはＩＱ（１００μＭ）で処理した。３日後、ｃ−ｍｙｃ−タグＴＲＦ２ＤＮ（感染を確認するため）、ｐ５３セリン１５リン酸化およびｐ２１誘導に関するウェスタン分析のために細胞を集めた。図１７Ｆのレーン２をレーン４および６と比較すると、３ＡＢおよびＩＱの双方がＴＲＦ２ＤＮに反応してｐ５３リン酸化とｐ２１誘導とを減少させたことを示す。
【０１０９】
（実施例１５）
（Ｔ−オリゴの効果は、テロメラーゼに依存しない）
Ｓａｏｓ−２細胞は、報告によれば、テロメラーゼ陰性であるがＡＬＴ経路によりテロメアを維持する骨肉種細胞株である。Ｓａｏｓ−２細胞株を希釈剤または４０μＭの指定されたオリゴヌクレオチドで処理し、ＦＡＣＳ分析のために４８時間後に細胞を集めた。相同ヌクレオチドのみが細胞のＳ期停止を生じた（図１８ａ）。さらに、テロメア突出オリゴヌクレオチドは、ＩＲによる他にｐ９５／Ｎｂｓ１のリン酸化を誘導した（図１８ｂ）。この結果は、テロメア陰性細胞中のＴ−オリゴの効果がテロメア陽性悪性細胞株中の反応と同じであることを示す。
【０１１０】
（実施例１６）
（ＰＡＲＰタンキラーゼタンパク質レベルのダウンレギュレーションがＴ−オリゴの反応を妨害する）
ヒト繊維芽細胞のペア培養物をタンキラーゼｓｉＲＮＡ、非特異性ｓｉＲＮＡ（コントロール）で１回処理するか、第２コントロールとして模擬トランスフェクトした。２日後、タンキラーゼｓｉＲＮＡ処理細胞中のタンキラーゼレベルが顕著に減少した時点で、培養物に１１マー−１（ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号２）または相補配列１１マー−２を補充した。さらに２４時間後、細胞を集め、セリン３４３でのｐ９５リン酸化に特異的な抗体を用いてウェスタンブロットのために加工し、活性化ＡＴＭキナーゼによるｐ９５修飾を示した。フィルムを濃度測定に供し、各グループの細胞に対する希釈剤コントロールを任意の単位で１．０とした（図１９）。予期されたように、正常なタンキラーゼレベルを有する細胞では、Ｔ−オリゴ処理細胞は、リン酸化ｐ９５の量が２倍であったが、コントロールオリゴ処理細胞または希釈剤処理細胞中の増加は、わずか３０〜４０％であった。しかしながら、タンキラーゼノックダウン群では、１１−マー−１処理細胞は、ｐ９５リン酸化の増加を示さなかった（コントロールの１．０および１．３に対してレベル１．１）。これらのデータは、テロメア関連ＰＡＲＰであるタンキラーゼが、ＡＴＭ活性化とそれに続くｐ９５修飾（リン酸化）を引き起こし、処理細胞のＳ期停止（Ｅｌｌｅｒら、ＦＡＳＥＢ Ｊ、２００３）を生じるＴ−オリゴシグナルを形質導入するために必要であることを示している。
【０１１１】
（実施例１７）
（Ｔ−オリゴは、ｐ５３の非ＡＴＭ媒介リン酸化を生じる）
正常新生児繊維芽細胞を希釈剤または４０μＭ（１１マー−１）で４、６、８、１９、２４および４８時間処理し、ｐ５３ホスホセリン３７特異性抗体を用いるウェスタンブロット分析のために集めた。偽およびＩＲ照射（１０Ｇｙ）繊維芽細胞をそれぞれ陰性コントロールおよび陽性コントロールとして使用した。ウェスタンブロットにおいてｐ５３セリン３７に対応するバンド強度の増加が早くも８時間で検出され、４８時間では、希釈剤（Ｄ）処理試料と比較してＴ−オリゴ（Ｔ）処理試料中できわめて顕著であった。
【０１１２】
上記に示すように、Ｔ−オリゴは、セリン１５上でｐ５３のリン酸化を生じる。セリン１５におけるｐ５３のリン酸化は、ＡＴＭにより媒介される。図２０は、Ｔ−オリゴがセリン３７上のｐ５３のリン酸化も生じることを示している。セリン３７におけるｐ５３のリン酸化は、ＡＴＭ関連（ＡＴＲ）キナーゼまたはＤＮＡ−ＰＫキナーゼのいずれかで媒介されるが、ＡＴＭにより媒介されることは、知られていない。従って、ｐ５３セリン３７の実証は、経路活性化のまた別なマーカーであり、これらのキナーゼのうちの１つまたは両方がＭｒｅ１１活性化の下流標的である。さらに、Ｍｒｅ１１経路を活性化する治療効果の多くは、擬似ＵＶ的であり、ＵＶは、ＡＴＲとＤＮＡ−ＰＫの双方を活性化するがＡＴＭを活性化しないことが知られている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書および図面に記載される発明。
【請求項１】
本明細書および図面に記載される発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２０１１−１０３８８９（Ｐ２０１１−１０３８８９Ａ）
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８１（Ｐ２０１１−１８１）
【出願日】平成２３年１月４日（２０１１．１．４）
【分割の表示】特願２００６−５０８５９９（Ｐ２００６−５０８５９９）の分割
【原出願日】平成１６年１月１４日（２００４．１．１４）
【出願人】（３０１０６９８５６）トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ (15)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月４日（２０１１．１．４）
【分割の表示】特願２００６−５０８５９９（Ｐ２００６−５０８５９９）の分割
【原出願日】平成１６年１月１４日（２００４．１．１４）
【出願人】（３０１０６９８５６）トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ (15)
【Ｆターム（参考）】
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