トコトリエノールの予防的使用および治療的使用
トコトリエノールを含む治療薬剤および予防薬剤、ならびにトコトリエノールを含む治療薬剤および予防薬剤の使用の方法が、増大したグルタミン酸レベルに関連する脳卒中の発症、ならびにその他の障害および疾患の処置および予防、そしてリポキシゲナーゼ（例えば、酵素１２−リポキシゲナーゼ）の効果について、提供される。本発明に従って、リポキシゲナーゼ（例えば、酵素１２−リポキシゲナーゼ）の活性に関連する脳卒中、ならびにその他の障害および疾患の発症の処置および予防に対する、治療方法および予防方法が提供される。また本発明に従って、胎児および新生児の脳中のトコトリエノールの濃度の特異的な増加に対する方法が提供される。また本発明に従って、受胎能を改善させる方法、または受胎能を回復させる方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張）
本願は、２００３年８月８日出願の米国仮特許出願第６０／４９３，７６１号明細書の優先権を主張し、その全体を本明細書にて参考として援用する。
【０００２】
（連邦政府資金による研究に関する記載）
本研究は、少なくとも一部分において、米国国立衛生研究所の米国国立神経疾患脳卒中研究所からの助成金、ＲＯ１−ＮＳ４２６１７に支持された。本発明の特定の権利は政府が有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
脳卒中および他の形態の傷害によりもたらされる発症および損傷は、酵素１２−リポキシゲナーゼ（「１２−ＬＯＸ」）の活性によって媒介されると考えられる。１２−ＬＯＸは、傷害による焦点障害、ならびにパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇、および関連する状態による拡散障害の結果として生じるニューロンの死に反応し得るようである。１２−ＬＯＸの活性はまた、脳以外の組織における疾患（例えば、特定の皮膚癌（例えば黒色腫）；心臓傷害に起因する心臓の損傷；ならびに筋肉の変性およびＨＩＶ感染に関連するほかの障害）の発達に反応し得る。従って１２−ＬＯＸは、グルタミン酸誘導性細胞毒性に関連する疾患および障害を予防または処置するための抑制性因子に対する、潜在的な標的である。１２−ＬＯＸの活性を標的とし、そして阻害するための因子および方法が望ましい。
【０００４】
黒色腫および他の癌は、複雑な細胞機構および生化学的機構によって制御される。リポキシゲナーゼは、特定の癌に中心的な関与を有すると確認されている。１２−リポキシゲナーゼ（１２−ＬＯＸ）は、その代謝産物である１２（）−ヒドロキシエイコサテトラエン酸［１２（）−ＨＥＴＥ］を通して、実験的な黒色腫の侵襲および転移において中心的な役割を果たすことが立証され、そして１２−ＬＯＸの発現は、早期のヒト黒色腫発癌に重要であり得る。１２−ＬＯＸの発現は、ヒトメラニン細胞から良性かつ形成異常の母斑へ、そして悪性の転移性疾患への黒色腫の進行の間で研究された。１２−ＬＯＸの発現は通常のヒトの皮膚のメラニン細胞では低いことが決定され、そして複合母斑、形成異常母斑および黒色腫に見られるメラニン細胞では増加した発現が観察された。黒色腫は形成異常母斑に比べてより高いレベルの１２−ＬＯＸ発現を有し、そして１２−ＬＯＸ発現は複合母斑のメラニン細胞と形成異常母斑のメラニン細胞との間で顕著に異なった。これらのデータは、黒色腫系内での癌の進行について、１２−ＬＯＸが重要な新規のマーカーであり得ることを示唆し、そしてそれゆえ、黒色腫の化学防御のための有用なバイオマーカーおよび治療標的であり得る。
【０００５】
１２−ＬＯＸを含むリポキシゲナーゼはまた、神経性傷害および心臓の傷害を含む傷害の結果である心臓の細胞死に関係する。遍在的に発現される細胞質性ホスホリパーゼＡ（２）（ＰＬＡ（２））によるアラキドン酸の生成は、細胞の恒常性、炎症および腫瘍形成の制御に基本的な役割を有する。１２−ＬＯＸはアラキドン酸（Ｃ２０：４）から１２−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸への変換を触媒し、これはグルタチオンペルオキシダーゼによって次々に１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）に還元される。１２−ＬＯＸの活性化は、心臓の種々の病理に関係する。従って、１２−ＬＯＸに抑制的な効果を有する治療薬剤が、癌、ならびに１２−ＬＯＸに関与する他の障害および疾患の処置のために望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明に従って、リポキシゲナーゼ（例えば、酵素１２−リポキシゲナーゼ）の活性に関連する脳卒中、ならびにその他の障害および疾患の発症の処置および予防に対する、治療方法および予防方法が提供される。また本発明に従って、胎児および新生児の脳中のトコトリエノールの濃度の特異的な増加に対する方法が提供される。また本発明に従って、受胎能を改善させる方法、または受胎能を回復させる方法が提供される。
【０００７】
被験体内の１２−リポキシゲナーゼ媒介性の細胞毒性の阻害のための方法が提供され、上記方法は以下；１２−リポキシゲナーゼ媒介性細胞損傷の発達の危険性がある被験体に、生物学的有効量のトコトリエノールを投与する工程、を包含する。生物学的有効量のトコトリエノールは、１２−リポキシゲナーゼの活性を阻害する。上記方法は、ニューロン損傷、心臓組織損傷、外皮損傷、癌（例えば黒色腫）の発達、および筋肉組織損傷からなる群より選択される１２−リポキシゲナーゼ媒介性細胞損傷に対する保護に指向される。
【０００８】
また本発明に従うのは、神経性傷害を被る被験体を処置するための方法であり、これは以下；上記被験体に、生物学的有効量のトコトリエノールを投与する工程、を包含する。上記方法は特に、脳卒中および心臓傷害のような傷害の処置に有用である。
【０００９】
また本発明に従うのは、黒色腫の発達の危険性がある被験体中の黒色腫の発達を阻止するための方法であり、これは以下；上記被験体に、生物学的有効量のトコトリエノールを投与する工程、を包含する。
【００１０】
また本発明に従うのは、癌の予防および処置のための養生法であり、これは癌の予防および処置を必要とする被験体に、トコトリエノールおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的処方物を投与する工程を包含する。このような処置を必要とする個体または被験体は、環境曝露（例えば、太陽に）、または癌の発達に対する他の素因に起因する癌の発達の危険性があるか、あるいは癌と診断されたと考えられる。
【００１１】
また本発明に従うのは、胎児中のニューロンを保護するための方法であり、これは、上記胎児を妊娠している妊娠した女性に、少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を投与する工程を包含する。
【００１２】
また本発明に従うのは、少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を妊娠した女性に投与することにより、ヒトの胎児の脳中のトコトリエノールの濃度を高めるための方法であり、上記組成物は実質的にトコフェロールを含まない。
【００１３】
また本発明に従うのは、ヒトの乳児の脳中のトコトリエノールの濃度を高めるための方法である。いくつかの実施形態において、上記方法は、少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を泌乳中の女性に投与する工程、および上記泌乳中の女性から産生された乳を上記乳児に与える工程を包含する。
【００１４】
また本発明に従うのは、成人のヒト被験体の脳中のトコトリエノール濃度を高めるための方法であり、これは少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を上記被験体に投与する工程を包含し、ここで上記組成物は実質的にトコフェロールを含まず、そして上記組成物はトコフェロールを含む食物または補助食品なしで投与される。好ましい実施形態において、上記ヒトがトコフェロールを含む食品または補助食品を摂取した、少なくとも１時間半後および少なくとも１時間半前に、上記混合物が投与される。補助食品であるＴｏｃｏｍｉｎを用いて、良好な結果が得られている。
【００１５】
また本発明に従うのは、受胎能の改善を必要とする動物における受胎能の改善のための方法であり、これは上記動物に毎日少なくとも１種のトコトリエノールを臨床的有効量を投与する工程を包含する。好ましくは、上記トコトリエノールは、意図される受胎に先立って２週間〜約１６週間の期間、毎日投与される。より好ましくは、トコトリエノールは、意図される受胎に先立って少なくとも６〜８週間、毎日投与される。
【００１６】
本発明の方法に従って用いられる場合、トコトリエノール組成物は、必要に応じて、１用量あたり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇの単一用量または複数回用量で、被験体に毎日投与される。好ましくは、成人に対する用量は約６００ｍｇであり、そして一日あたり１〜３回投与される。投与の好ましい様式は、ゲルキャップの形態での経口的なものである。上記方法に従って用いられるトコトリエノールは、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノール、それらの誘導体、および１つ以上のそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、本方法に従う組成物は、実質的にトコフェロールを含まない。
【００１７】
また本発明に従うのは、機能的トコフェロール輸送タンパク質を欠く動物について、受胎能を回復させるための方法であって、上記動物にトコトリエノールを含む組成物を投与する工程を包含する。
【００１８】
また本発明に従うのは、一次培養物中のニューロンを維持するための方法であって、以下：動物から単離された少なくとも１つのニューロンを提供する工程；少なくとも１種のトコトリエノールを含む培養培地を提供する工程；および上記培養培地を含む容器中で、上記の少なくとも１つのニューロンを維持する工程、を包含する。
【００１９】
また本発明に従うのは、一次培養物中のニューロンを維持するための培養培地の形態における培養組成物であって、ここでこのような組成物は、少なくとも１種のトコトリエノールを含む。
【００２０】
本発明のさらなる特徴および利点は、続く記述中に部分的に示され、そして部分的にはその記述から明白であるが、または本発明の実行によって知り得る。本発明の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲に特に示した要素および組み合わせによって理解され、そして達成される。
【００２１】
上記の一般的な記述および以下の詳細な記述はいずれも、例示的かつ説明のためのものに過ぎず、特許請求の範囲に記載されるような本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（詳細な説明）
他に定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の本発明の説明に用いられる用語法は、特定の実施形態のみを記載するためであり、そして本発明を限定することを意図しない。本発明の記載および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「ある」および「その」は、文脈が明白に他を示さない限り、なお複数形を含むことを意図される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参考として援用される。
【００２３】
他に示さない限り、本明細書および特許請求の範囲中で用いられる成分の量、反応条件などを表す全ての数字は、全ての事例において用語「約」によって改変されるものとして理解されるべきである。従って、それと反対に示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値的パラメーターは近似値であり、本発明から得られるように求められた所望の性質に依存して変化し得る。最低限でも、そして上記特許請求の範囲に相当する原則の適用を制限することを企図しないように、それぞれの数値的パラメーターは、有意な数字の数および通常の丸めアプローチの観点から解釈されるべきである。
【００２４】
本発明の広い範囲を示す数値的範囲および数値的パラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら任意の数値は、本質的に、それらそれぞれの試験計測値に見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を固有に含む。本明細書全体にわたって与えられるそれぞれの数値的範囲は、このようなより広い数値的範囲中に含まれる、それぞれのより狭い数値的範囲を含み、これは、このようなより狭い数値的範囲が全て本明細書中に明白に記されるかのようである。
【００２５】
本明細書中で疾患に関連して用いられる場合、用語「処置」は広範に用いられ、そして上記疾患を治療する方法に限定されない。用語「処置」は、一つ以上の疾患の病理学的効果または症状の減少、あるいは一つ以上のこのような病理学的効果または症状の発症または進行の速度の低下に役立つ、任意の方法を含む。
【００２６】
本明細書中で用いられる場合、用語「ビタミンＥ」は、一般的に全てのトコフェロールおよびトコトリエノールを指し、トコフェロール、およびＲＲＲ−α−トコフェロールの生物学的活性を有するそれらの誘導体を含む。天然には、八つの物質がビタミンＥ活性を有することを見出されている：α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロールおよびδ−トコフェロール；ならびにα−トコトリエノール、βトコトリエノール、γトコトリエノールおよびδトコトリエノール。しばしば、用語ビタミンＥはα−トコフェロールと同意語として用いられるが、この言及は、本明細書中での用語ビタミンＥの意図された使用よりもより限定される。Ｄ−α−トコフェロール（ＲＲＲ−α−トコフェロール）が最も高いバイオアベイラビリティーを有し、そして全ての他のものが一般に比較される標準を示すが、それはビタミンＥの８つの天然の形態のうちの一つに過ぎない。以前はζ−トコフェロール、ε−トコフェロール、またはη−トコフェロールとして公知であったトコトリエノールは、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロールおよびδ−トコフェロールに共通である飽和フィチル尾部と対照的に、３ヶ所で不飽和であるイソプレノイド尾部を有する点を除いて、化学的にトコフェロールと類似する。α−トコフェロール、βトコフェロール、γトコフェロールおよびδトコフェロールは、トウモロコシ油、ダイズ油、およびオリーブ油で主に見受けられるが、トコトリエノールは、ヤシ油、米ぬか油、およびオオムギ油で特に豊富である。
【００２７】
本明細書中で用いられる場合、用語「トコトリエノール」は、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、およびδ−トコトリエノールを指し、これらは、ζ−トコフェロール、ε−トコフェロール、またはη−トコフェロールとして以前は公知であり、そして時々代替的に公知である。トコトリエノールは酸化条件下で高度に不安定であり、それゆえ、トコトリエノール調製物を低い酸化条件下に維持し、そして加熱を避けることが望ましい。好ましくは、医薬品または補助食品における使用のためのトコトリエノールは、真空の投薬ユニットに維持されるべきである。
【００２８】
トコトリエノールは、大部分が、ヤシ油、米ぬか油、および大麦に生じる。合成トコフェロールおよび天然トコフェロールは、市場で容易に入手可能であるが、天然トコトリエノールの供給は限られている。トコトリエノールが豊富である（８００〜１５００ｐｐｍ）粗製ヤシ油は、天然トコトリエノールの潜在的な供給源を提供する。Ｃａｒｏｔｅｃｈ，Ｍａｌａｙｓｉａは、革新的かつ新しい技術を用いて、有害な環境上の影響無しに抽出率を最大化する溶媒を使用することなく、粗製ヤシ油からトコトリエノールを抽出し得、そして濃縮し得る、世界で唯一の工場である。
【００２９】
トコトリエノールの別の潜在的な供給源は米ぬか油、およびその脂肪酸蒸留液由来である。しかし、粗製ヤシ油と異なり、米ぬか中のトコトリエノール含有量は非常に低く、総ビタミンＥ（トコフェロールおよびトコトリエノール）含有量の約４５〜５５％である。残りのビタミンＥはトコフェロールで占められる。ヤシ油は、総ビタミンＥの約７５〜８０％を占める、比較的高い濃度のトコトリエノールを含む点で独特である。疫学的研究から、トコトリエノールのコレステロール抑制性作用を、高濃度のトコフェロール、特にα−トコフェロールが弱らせることが示された。血中の総コレステロールの減少におけるトコトリエノールの最適な影響を有するために、このような、トコフェロールを低い含有量（総ビタミンＥの３０％未満）で有する調製物が好ましい。
【００３０】
食餌のトコトリエノールは、循環するヒトのリポタンパク質に取り込まれることが示されており、ここでは、対応するトコフェロール異性体と同程度に効率的に、ペルオキシラジカルと反応する（Ｓｕａｒｎａら、１９９３；ＳｅｒｂｉｎｏｖａおよびＰａｃｋｅｒ、１９９４）。食餌によるトコトリエノールの追加は、ヒトにおける頸動脈のアテローム性動脈硬化症の経過に有益に影響する（Ｔｏｍｅｏら、１９９５）。トコフェロールではなく、トコトリエノールのマイクロモーラー量は、コレステロール生合成に関与する肝臓性鍵酵素である、ヒドロキシ−３メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素の活性を抑制することが示されている（Ｐｅａｒｃｅら、１９９２；Ｐｅａｒｃｅら、１９９４）。トコトリエノールは、トコフェロールに比べて優れた抗酸化効果、遊離ラジカル除去効果を有する。これは恐らく、細胞膜の脂質層におけるトコトリエノールの分布がより良いことに起因する。トコトリエノールは、α−トコフェロールよりもより有益な効果を示すが、作用の正確な機構についてはほとんど分かっていない。
【００３１】
本発明の開示に先立って報告された研究の結果からは、トコフェロールおよびトコトリエノールの輸送、組織濃度、および相対的生物学的機能が、幾分異なり、そして恐らく無関係であるらしいことが示されている（Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ（１９９３年３月）２０２（３）：３５３−９を参照のこと）。α−トコフェロール輸送タンパク質（αＴＴＰ）は、家族性の隔絶したビタミンＥ欠乏の原因となる遺伝子の産物であるが、血漿のビタミンＥレベルを決定する上で重要な役割を果たす。トコトリエノールを含むビタミンＥアナログの、αＴＴＰによる認識に必要な構造的特性の検査が報告されており、ここで、インビトロにおける膜間の輸送について、未標識のビタミンＥアナログとα−［３Ｈ］トコフェロールとの競合を評価することによって、リガンド特異性が評価された（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １９９７年６月２日；４０９（１）：１０５−８を参照のこと）。種々のビタミンＥアナログに対するαＴＴＰの相対的親和性は、種々のトコフェロールの形態について測定された最も高い親和性と、トコトリエノールに対する相対的に低い親和性との競合の程度に基づいて決定された。ラットの再吸収−妊娠アッセイから得られた相対的親和性と公知の生物学的活性との間に、直線関係が存在することが示された。これらの結果は、αＴＴＰに対するビタミンＥアナログの親和性が、生物学的活性の重大な決定要因の一つであることを示す。前記、およびトコトリエノールおよびトコフェロールの活性に関して当該分野で公知の他の情報に基づき、ビタミンＥのこれらの形態が異なる機能を有し、そして異なる生物学的機構系に関与する証拠がある。
【００３２】
（１２−リポキシゲナーゼの阻害）
本明細書中に記載されるような、出願人の努力の結果から、１２−リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）経路がトコトリエノールに感受性であることが確認されている。グルタミン酸誘導性１２−ＬＯＸ活性が、ナノモーラー濃度のトコトリエノールに感受性であることを示す最初の証拠を、出願人は提示する。加えて、１２−ＬＯＸ欠乏性の一次皮質ニューロンが、グルタミン酸による攻撃に抵抗性であることを、出願人は示す。
【００３３】
本明細書中に開示されるように１２ＬＯＸは、脳卒中に関連付けられるが、トコトリエノールにより効率的に阻害され、トコトリエノールが細胞死に先立って投与される場合、１２−ＬＯＸ活性の神経変性効果は覆され得る。トコトリエノールは、脳卒中、パーキンソン病、ＡＬＳ、癲癇、ならびにその他の神経変性障害および傷害を含む、限局性傷害および散在性傷害の損傷効果に対する保護に用いられ得る。生理学的に関連する範囲に十分に含まれる濃度において、ＨＴ４および未成熟一次皮質ニューロン中でα−トコトリエノールは強い神経保護性質を示す。現在の結果は、グルタミン酸誘導性酸化的毒性を達成する上での１２−ＬＯＸの中心的な役割を確認し、そしてα−トコトリエノールを栄養に基づいた治療における期待できる手段として提供する。
【００３４】
（投薬量および投与）
上記トコトリエノール組成物は、傷害、癲癇、ＡＬＳ、パーキンソン病、ならびにその他の傷害および障害の結果としての脳卒中、およびその他の神経性損傷（限局的であれ散在性であれ）を罹患した、または罹患する危険性がある被験体に投与される。上記トコトリエノール組成物は、損傷の逆転、およびそれ以上の１２−ＬＯＸ媒介性損傷からの保護を達成するために十分な量を、好ましくは傷害の発症の前に、そして連続的に投与される。上記トコトリエノール組成物は、約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に投与される。より好ましくは、約１００ｍｇ〜８００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に調剤が与えられる。最も好ましくは、約６００ｍｇの投薬量が、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に提供される。好ましい送達の形態は、経口摂取のためのゲルキャップである。若年の被験体に対する投薬量は、一用量あたり約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲であり、より好ましくは一用量あたり約５０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲であり、最も好ましくは一用量あたり約３００ｍｇであり、一日あたり約１〜３用量の頻度である。
【００３５】
（黒色腫およびその他の癌の予防および処置）
１２−ＬＯＸは、黒色腫および特定のその他の癌に直接的に関連する。トコトリエノールは、１２−ＬＯＸの機能に阻害的な効果を有することが、本明細書中に開示される。従ってトコトリエノールは、黒色腫およびその他の癌の処置に対する薬学的因子として示される。
【００３６】
（投薬量および投与）
上記トコトリエノール組成物は、黒色腫およびその他の癌、特にリポキシゲナーゼ（例えば、１２−リポキシゲナーゼ）に関与する癌に罹患している、または罹患する危険性がある被験体に投与される。上記トコトリエノール組成物は、損傷の逆転、およびそれ以上の１２−ＬＯＸ媒介性損傷からの保護を達成するために十分な量を、好ましくは傷害の発症の前に、そして連続的に投与される。上記トコトリエノール組成物は、約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に投与される。より好ましくは、約１００ｍｇ〜８００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に調剤が与えられる。最も好ましくは、約６００ｍｇの投薬量が、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に提供される。好ましい送達の形態は、経口摂取のためのゲルキャップである。若年の被験体に対する投薬量は、一用量あたり約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲であり、より好ましくは一用量あたり約５０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲であり、最も好ましくは一用量あたり約３００ｍｇであり、一日あたり約１〜３用量の頻度である。
【００３７】
（心臓組織の保護）
（投薬量および投与）
上記トコトリエノール組成物は、リポキシゲナーゼ（例えば１２−リポキシゲナーゼ）に関与する、心臓の障害およびその他の傷害に罹患した、または罹患する危険性がある被験体に投与される。上記トコトリエノール組成物は、約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に投与される。より好ましくは、約１００ｍｇ〜８００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に調剤が与えられる。最も好ましくは、約６００ｍｇの投薬量が、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に提供される。好ましい送達の形態は、経口摂取のためのゲルキャップである。若年の被験体に対する投薬量は、一用量あたり約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲であり、より好ましくは一用量あたり約５０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲であり、最も好ましくは一用量あたり約３００ｍｇであり、一日あたり約１〜３用量の頻度である。
【００３８】
（胎児の脳組織、新生児の脳組織、および成人の脳組織の保護）
トコフェロールの形態のビタミンＥは、特定の形態の細胞性損傷に関連する胎児および新生児の状態を改善することが公知である。最近の科学的証拠から、トコトリエノールの形態のビタミンＥが、トコフェロールの細胞性影響と異なる細胞性影響を有することが示され；ニューロン細胞において、グルタミン酸誘導性神経毒性の予防に、トコトリエノールはトコフェロールより強力であることが示された。学術的文献に従って、食餌性のα−トコトリエノールは脳（胎児および母乳で育てた新生児の脳を含む）に到達しないことが示唆された。従って、胎児および新生児中のトコトリエノールレベルの効率的な亢進のための方法の確認が望ましい。
【００３９】
成人のヒトのための栄養補助食品は、長くにわたってビタミンＥを有し、それは主にａ−トコフェロールの形態であり、そして時折トコトリエノールの形態（代表的には、臨床的に有益であるレベルより十分に下に減少した量であるにもかかわらず）である。トコトリエノールがα−トコフェロールとは異なる利点を与えるという証拠が増加している。しかし、成人のヒトの脳中に有益なレベルのトコトリエノールを取り込み、そして維持することは、達成し難いという証拠もまたある。従って、成人のヒトの脳およびその他の重要な組織にトコトリエノールを効果的に取り込み得る方法および組成物が望まれる。
【００４０】
妊娠の間のわずか２週間にわたるビタミンＥの欠乏した食餌の消費が、成人の脳のビタミンＥレベルに影響しない一方で、胎児の脳のビタミンＥレベルを実質的に低下させ、このことは妊娠の間の食餌中のこのビタミンの適切なレベルの重要性を強調する。妊娠した母親がトコトリエノールの栄養補助食品を供給される場合、成人の脳に比べて、胎児の脳によるより高いα−トコトリエノールの形態のビタミンＥの取り込みが観察される。このように、胎児の脳のトコトリエノールレベルは、母親の食餌のトコトリエノールの摂取と密接に関連する。この開示に基づき、食餌性のトコトリエノールが、胎児の脳に生物学的に有用である。胎児の脳に送達されるトコトリエノールだけでなく、食餌性トコトリエノールの物質に応答する遺伝子発現パターンは、妊娠食中のビタミンＥが、発達する胎児の脳の遺伝子発現性質に有利に影響を与えることを示唆する。
【００４１】
本明細書中で提供される開示はさらに、成人において、成人の脳に食餌的に補充された、または薬学的に補充されたトコトリエノールが、トコフェロールによって部分的に阻害されることを示す。これらの因子の特異な取り込みは、血液脳関門を横切る輸送のための共有されるキャリアに指向されると考えられる。トコトリエノールの取り込みは、実質的にトコフェロールを含まない、トコトリエノール組成物の食餌性および補助形態の投与を通して亢進され得る。
【００４２】
（投薬量および投与）
上記トコトリエノール組成物は、傷害、酸化的ストレスおよびグルタミン酸毒性、出生傷害または仮死に起因する神経性損傷を被った、またはそれらを被る危険性がある被験体（成人、妊婦および胎児、ならびに若年者を含む）に投与される。上記トコトリエノール組成物は、グルタミン酸、酸化的ストレス、および／または１２−ＬＯＸ媒介性損傷の効果の結果である損傷からの保護を達成するために十分な量を、好ましくは傷害の発症の前に、そして連続的に投与される。上記トコトリエノール組成物は、約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に投与される。より好ましくは、約１００ｍｇ〜８００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に調剤が与えられる。最も好ましくは、約６００ｍｇの投薬量が、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に提供される。好ましい送達の形態は、経口摂取のためのゲルキャップである。若年の被験体に対する投薬量は、一用量あたり約１〜１０００ｍｇの範囲であり、より好ましくは一用量あたり約５０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲であり、最も好ましくは一用量あたり約３００ｍｇであり、一日あたり約１〜３用量の頻度である。必要に応じて、若年者に投与される用量は、トコフェロールを欠き得る。
【００４３】
（受胎能を回復、または亢進するためのトコトリエノールによる処置）
多数の研究および製品が、不妊症のための処置の栄養に基づく養生法の一部として、トコフェロールの形態でのビタミンＥの使用を目的とする。しかし、トコフェロールおよび他の栄養性補助の効果が、細胞性損傷を起こす細胞上プロセスを阻害するに十分でないことの証拠がある。同様に、特定の個体は、組織中のトコフェロールの輸送および取り込みに必要な細胞性因子（すなわち、輸送タンパク質）を欠き、これらの特定の個体では、トコフェロールの有益な効果が失われている。従って、不妊症の根底にある原因は、しばしば、現在のトコフェロールの形態のビタミンＥを用いた栄養に基づいた処置および薬学的処置によっては、満足には対応されない。従って、不妊症の処置のための栄養に基づいた補助を提供する、代替の物質が望ましい。
【００４４】
トコトリエノールは、トコフェロールの吸収不全、あるいはトコフェロールの取り込みまたは利用可能性における他の機能不全の結果として崩壊した、受胎能の維持または回復のための食餌的養生法において、トコフェロールに代わって、またはトコフェロールの補助として用いられ得る。食餌性のトコトリエノールの効果は、受胎能に関連する組織（例えば、精巣上体または腹腔の脂肪、あるいは羊膜液）について、長く作用する。従って、トコトリエノールおよびトコフェロールの双方の共投与に関する、現行の食餌的養生法が望ましい。
【００４５】
（投薬量および投与）
上記トコトリエノール組成物は、トコフェロールの吸収不全、あるいはトコフェロールの取り込みまたは利用可能性における他の機能不全の結果としての、受胎能の崩壊を経験する被験体に投与される。上記トコトリエノール組成物は、約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に投与される。より好ましくは、約１００ｍｇ〜８００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に調剤が与えられる。最も好ましくは、約６００ｍｇの投薬量が、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に提供される。好ましい送達の形態は、経口摂取のためのゲルキャップである。好ましくは、意図する受胎に先立つ、少なくとも６〜８週間において、毎日処置が施される。
【００４６】
（トコフェロール輸送タンパク質（ＴＴＰ）ノックアウトマウスの繁殖を可能にするためのトコトリエノールの使用）
食餌的に、または薬学的に補われたトコフェロールの、腸から体の種々の部分への取り込み、および輸送は、ＴＴＰによって導かれる。哺乳動物におけるトコフェロールおよびトコトリエノールの重要な役割を理解し、そして識別するために、ＴＴＰの発現が除去されたノックアウトマウスが産生された。ＴＴＰの妨害は、これらのマウスにおける受胎能の欠如をもたらし、それは繁殖を不可能にし、従ってそれ以上の研究のための系の維持を不可能とする。本開示は、トコトリエノールの使用が、ＴＴＰノックアウトマウスにおけるＴＴＰ依存性不妊症の逆転をもたらすことの、最初の証拠を提供する。
【００４７】
（投与および投薬量）
上記トコトリエノール組成物は、約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成体の被験体に投与される。より好ましくは、約１ｍｇ〜５００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成体の被験体に経口調剤が与えられる。最も好ましくは、約５０ｍｇの投薬量が、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成体の被験体に提供される。好ましくは、意図する受胎に先立つ、少なくとも６〜８週間において、毎日処置が施される。
【００４８】
（脳細胞の培養における試薬としてのトコトリエノール）
一次ニューロンは、成人の組織および若年者の組織の双方から単離され、そして治療的な用途、および研究用の用途を含む、多数の用途がある。一次ニューロンの成功した培養物は、一次ニューロン移植の使用、および特定の神経変性疾患の処置に関連する臨床的計画の実行可能性に中心的に重要である。同様に、培養物中における一次ニューロンの確立および維持は、ニューロンの発達、分化、および刺激への応答に関連する実験の実行に必須である。これらの細胞は、その培養環境に対する極めて高い感受性に起因して、培養物中での維持が難しい。特に、より年をとった被験体から得た組織ほど、培養環境中でより損傷しやすく、そして死に易い。
【００４９】
トコトリエノールは、一次培養物中の脳細胞の維持に、約０．００１μＭ〜１００μＭの濃度で効果的に用いられ、より好ましくは０．０１μＭ〜１０μＭの範囲であり、最も好ましくは０．５μＭ〜２μＭの範囲である。約１μＭのトコトリエノール濃度によって、良好な結果が得られた。一次ニューロンは、生物学的研究にとって、潜在的な診断用途および治療用途にとって、そして薬物のスクリーニングにとって有用である。トコトリエノールを含む培養は、高齢の被験体に由来するニューロンについて特に有用である。なぜなら、これらの他の感受性細胞の培養物についての生存度を、上記神経保護効果が増加させるからである。トコトリエノールを含む培養はまた、ニューロンの用途における使用を意図した幹細胞にとって有用である。
【００５０】
（トコトリエノールの形態および投与）
本明細書中に用いられるように、用語「生物学的有効量」は、１２−ＬＯＸの活性を阻害するに十分な量である。要求されるトコトリエノールの量は、処置される状態の性質および重篤度、ならびに、被験体が受けた前処置の性質、および標的とされる欠陥または疾患の型に依存する。究極的には、用量は臨床的試行を用いて決定される。最初に臨床医は、動物の研究から導かれた用量を投与する。有効量は、上記トコトリエノール組成物の一回の投与によって達成され得る。あるいは有効量は、上記トコトリエノール組成物の被験体への複数回の投与によって達成される。用語「治療有効な」および「薬学的有効な」は、疾患の重篤度および発生の頻度の改善の目標を達成する一方で、代替の治療に概して関連する有害な副作用は回避する、上記トコトリエノール組成物の量を与えることを意図する。本明細書中に用いられる場合、用語「治療的有効量」および「薬学的有効量」は、被験体に有意な利益（すなわち、神経性傷害または心臓傷害に関連した疾患の症状の低下、あるいは腫瘍の大きさの縮小、腫瘍の増殖および／または運動性もしくは転移の阻止、阻害、および／あるいはアポトーシスの増加、および／あるいは腫瘍の存在に関連した症状の低下、および不妊症の場合には、妊娠能力の回復）を示すに十分な、上記トコトリエノール組成物の総活性量を意味する。
【００５１】
本発明に従う上記トコトリエノール組成物の初期用量は、一日あたり約１〜３回の頻度において、１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲である。本方法はトコトリエノールの使用に関連するが、明らかに、臨床的用途を広げる他の治療因子と併用し得る。投与の正確な用量および頻度が、本発明の方法において用いられる、投与される特定の化合物、処置される特定の状態、処置される状態の重篤度、特定の患者の年齢、体重、一般的な身体的状況、ならびに、当業者である投与する医師に周知である上記個体が取られ得る他の処方に依存することは、当業者にとって明白である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、上記トコトリエノール組成物は実質的にトコフェロールを含まない。本明細書において用いられる場合、「実質的に含まない」とは、１種以上のトコフェロール化合物を１重量％未満含む、１種以上のトコトリエノールを含む組成物を呼ぶ。好ましくは、上記組成物は０．５重量％未満の１種以上のトコフェロール化合物を含み、より好ましくは０．１重量％未満の１種以上のトコフェロール化合物を含み、最も好ましくは０．０１重量％未満の１種以上のトコフェロール化合物を含む。
【００５３】
トコトリエノールを含む組成物は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路および腹腔内経路を介して投与され得る。好ましくは上記組成物は、経口的または静脈内のいずれかによって投与され、そして最も好ましくは、上記組成物は経口的に投与される。
【００５４】
注射または局所的な適用による送達もまた用いられ得るが、トコトリエノールの処方物の予防的投与および治療的投与にとって、経口投与が主要な経路であることが想像される。適切な用量のトコトリエノールを含む薬学的組成物は、一般的に用いられる希釈剤、賦形剤、ビヒクル、および添加物（例えば、充填剤、増量剤、結合剤、キャリア、塩、保湿剤、崩壊剤、崩壊遅延剤、湿潤剤、懸濁剤、界面活性剤、潤滑剤など）と共に調製され得る。上記組成物は、種々の投薬形態（例えば、ゲル錠剤、溶液、懸濁液、乳濁液、注射剤（例えば、溶液、懸濁液））を有し得る。
【００５５】
通常の無毒性の個体キャリア（例えば、グルコース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロースまたはセルロース誘導体、カルボン酸ナトリウムおよびカルボン酸マグネシウム）中にトコトリエノールを含む個体の組成物。局所的（すなわち経皮的）使用のための処方物としては、公知のゲル、クリーム、油、および軟膏が挙げられる。脂肪酸原料中の処方物は、生体適合性を広げるために用いられ得る。さらに上記組成物は、着色料、保存料、芳香剤、香料、甘味料、および／またはその他の薬物を含み得る。注射剤、溶液、乳濁液、および懸濁液の形態のトコトリエノールは滅菌され、そして好ましくは血液と等張性である。このような形態は、当該分野で一般に用いられる希釈剤を用いて調製され得る；例えば、水、エタノール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシイソステアリルアルコール、およびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル。上記組成物は、等張溶液を調整するために必要な塩化ナトリウム、グルコースまたはグリセリン、ならびに通常の可溶化剤、緩衝液、および鎮静剤を含み得る。
【００５６】
乾燥充填カプセルとしても公知であるカプセルは、適切な大きさの嚥下可能な容器（代表的にはゼラチン製である）に上記組成物が含まれた、経口性の固形の投薬形態である。本発明の栄養補助的組成物を含むために適切な硬質な空のカプセルは、いくつかの原料（例えば、Ｔｉｓｈｃｏｎ Ｇｅｌ−Ｔｅｃ、２４１０Ｎ．Ｚｉｏｎ Ｒｄ．、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｍｄ．２１８０１）から利用可能である；上記カプセルは、二分されて供給され、そして種々の大きさで供給される。その大きさは代表的には番号で表され、範囲のより大きい端の０００から、範囲の最も小さい端の５の範囲である。上記カプセルの半分は適切な着色料によって着色され得、そしてそれぞれの半分にしたものは同じ色でも異なる色でもよい。
【００５７】
投薬形態の中で、本発明の方法に特に適切なのは、ソフトゼラチンカプセルである。従って、１ｍｇ〜１０００ｍｇのトコトリエノールが、適切な希釈剤（例えば、野菜油）と混合され、次いでソフトゼラチンカプセルに封入される。他の投薬形態としては、例えば、トコトリエノールがアルコール中に、賦形剤（例えば香料）と共に懸濁された、または溶解された、懸濁液が挙げられる。
【００５８】
注射によって投与される場合、適切なキャリアとしては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、および濃度増加因子および可溶化剤（例えば、グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびそれらの混合物）を含む溶液が挙げられるが、これらに限定されない。組織標的リポソームを含むリポソーム懸濁液もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして適切であり得る。これらは、当該分野で公知の方法に従って調製され得る。
【００５９】
本発明の化合物は、上記化合物を体からの迅速な排出から保護するキャリア（例えば、徐放性の処方物またはコーティング）と共に調製され得る。このようなキャリアは徐放性の処方物（例えば、インプラントおよびマイクロカプセルに入れた送達システム、ならびに、生分解性、生体適合性ポリマー（例えば、コラーゲン、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸など）であるが、これらに限定されない）を含む。このような処方物の調製のための方法は、当業者にとって公知である。
【実施例】
【００６０】
本発明は、以下の実施例を参照することでより良く理解され得、これらの実施例は例示に役立つが、本発明を限定するものではない。
【００６１】
（実施例１：トコトリエノール処方物＃１（ＴＯＣＯＭＩＮ（登録商標）（Ｃａｒｏｔｅｃｈ Ｓｄｎ．Ｂｈｄ．によって製造）））
【００６２】
【表１−１】
【００６３】
【表１−２】
（実施例２：培養物中のラットおよびＨＴ４ニューロンの保護）
α−トコトリエノールは、ｎＭ濃度において、グルタミン酸誘導性死からＨＴ４ニューロンを保護する；この保護は、α−トコトリエノールの抗酸化性とは独立する（Ｓｅｎら、２０００）。図１に参照されるように、一次ラット未成熟皮質ニューロン（Ａ〜Ｃ）またはＨＴ４（Ｄ）を、α−トコトリエノールで５分間処理するか、あるいは処理せず（示したように）、そしてグルタミン酸（１０ｍＭ；Ａ）；Ｌ−ホモシステイン酸（１ｍＭ；Ｂ）；またはブチオニンスルホキシイミン（０．１５ｍＭ；ＢＳＯ）のいずれかで２４時間刺激した。アラキドン酸（０．０５ｍＭ、Ｃ）は、ＢＳＯ誘導性の細胞死を強化した。ａ−トコトリエノールは、上記の神経毒の全てに対して総合的な保護を与えた。Ｄ、１００ｎＭのトコトリエノールは、グルタミン酸誘導性毒性を阻止しただけでなく、グルタミン酸処理した細胞が、グルタミン酸処理していない細胞に匹敵する速度で増殖するようにした。細胞は、グルタミン酸刺激の１２時間後、２４時間後、および３６時間後に計数した。Ａ：†、コントロールのグルタミン酸非処理群に比べて低い；＊、グルタミン酸処理群に比べて高い。Ｂ：†、コントロールのＬホモシステイン酸未処理群に比べて低い；＊、Ｌ−ホモシステイン酸処理群に比べて高い。Ｃ：†、対応するコントロールに比べて低い；＊、対応する、毒に刺激された群に比べて高い。Ｄ：†、対応する、コントロールの未処理群に比べて低い；＊、対応するグルタミン酸処理群に比べて高い。Ｐは０．０５未満。
【００６４】
ＨＴ４およびラットのニューロンについて行われた実験において、ｎＭ濃度のα−トコトリエノールは、標準的な神経毒（例えば、グルタミン酸、Ｌ−ホモシステイン酸、Ｌ−ブチオニン−［Ｓ，Ｒ］スルホキシイミン（ＢＳＯ）、ならびにＢＳＯとアラキドン酸との併用）により刺激された未成熟一次ニューロンを保護する（図１Ａ〜Ｃ）。
【００６５】
ＨＴ４ニューロンをグルタミン酸で刺激して行った実験から、ｎＭレベルのα−トコトリエノールが、細胞の生存の減少から保護するだけでなく、また培養物中のこれらの細胞の通常の増殖速度を維持することが明らかになり、このことは、インタクトな細胞機能を示唆する（図１Ｄ）。
【００６６】
βチューブリン、神経フィラメントの染色、および位相差顕微鏡による経時的検査から明白なように、グルタミン酸による一次ニューロンの刺激は、軸索樹状突起間の神経回路網の顕著な破壊をもたらす。図２に参照されるように、摂取の２４時間後に、細胞をグルタミン酸で刺激した。示された場合、グルタミン酸処理に先立って５分間、ニューロンをａトコトリエノール（２５０ｎＭ）またはＢＬ１５（２．５μＭ）のいずれかで前処理した。ａ〜ｈ、培養された神経回路網中の、ニューロン特異的なクラスIIIβ−チューブリン（位相差顕微鏡検査については、ｉ〜ｐを参照）。グルタミン酸処理の２４時間後、細胞を固定し、そして染色した。ａ、コントロール；ｂ、グルタミン酸；ｃ、α−トコトリエノール＋グルタミン酸；ｄ、ＢＬ１５＋グルタミン酸。ｅ〜ｈ、培養した神経回路網中の神経フィラメントの染色（位相差顕微鏡検査については、ｉ〜ｐを参照）。ｅ、コントロール；ｆ、グルタミン酸；ｇ、ａ−トコトリエノール＋グルタミン酸；ｈ、ＢＬ１５＋グルタミン酸。ｉ〜ｐ、標準（ガラスカバー片無しで（ｎｏｔ ｇｌａｓｓ ｃｏｖｅｒ−ｓｌｉｐ））培養条件下でグルタミン酸処理したニューロンの生細胞画像化。位相差画像を、グルタミン処理８時間後から、１８時間後に渡って１５分毎に一回収集した。フレームは、時間依存的な神経回路網の崩壊を示す。ｉ、グルタミン酸処理８時間後；ｊ、グルタミン酸処理１２時間後；ｋ、グルタミン酸処理１６時間後；およびｌ、グルタミン酸処理２６時間後。α−トコトリエノール（２５０ｎＭ）で前処理した、グルタミン酸刺激を受けたニューロンは崩壊に抵抗し、そして成長し続けた。ｍ、グルタミン酸処理２８時間後；ｎ、グルタミン酸処理３０時間後；ｏ、グルタミン酸処理３２時間後；そしてｐ、グルタミン酸処理３４時間後。２つ（ｉ〜ｌおよびｍ〜ｐ）の．ａｖｉ顕微鏡写真ビデオを、オンラインの刊行物に付属した。２００×の拡大率。
【００６７】
細胞のα−トコトリエノールによる前処理は、グルタミン酸誘導性神経崩壊を防ぐだけでなく、１０ｍＭのグルタミン酸があるにもかかわらずニューロンの成長を維持する（図２）。一次ニューロンにおけるグルタミン酸誘導性の構造変化に対する防御を、位相差顕微鏡による経時的な検査から観察した（図２）。標準の培養プレート中で増殖するニューロンを、ガラスカバー片上で増加させること無く、首尾良く画像化した。標準の培養条件下で、ニューロンおよびその軸索樹状突起間回路は、完全に運動能力がある。このことは、神経毒性のきっかけとなる上でグルタミン酸が効果的でない、トコトリエノール処理した細胞上の顕微鏡写真において、顕著に明白である（図２）。グルタミン酸処理したコントロールニューロンの経時的画像から、回路網の崩壊の前において細胞構造の運動における阻害が明らかとなった（データは示さず）。
【００６８】
（実施例３：培養物中の１２−ＬＯＸノックアウトマウスニューロン細胞の保護）
まず本発明者らは、本発明者らのモデルにおけるグルタミン酸誘導性死の遂行における１２−ＬＯＸの関与について試験した。本発明者らは、１２−ＬＯＸ特異的インヒビターであるバイカレインまたはＢＬ１５を用いることから始めた。図３に参照されるように、ＨＴ４ニューロンを、（Ａ）ａ−トコトリエノール（２５０ｎＭ）またはＢＵ５（２．５μＭ、１２−リポキシゲナーゼインヒビター）で５分間処理するか、あるいは処理せず、次いでグルタミン酸（１０ｍＭ）で刺激した。細胞の生存性を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除フローサイトメトリーアッセイを用いて決定した。ＰＩ−＝生存；ＰＩ＋＝死。ラット一次未成熟皮質ニューロン（Ｂ〜Ｄ）を、α−トコトリエノール（１００ｎＭ）またはＢＬ１５（２．５μＭ）で５分間処理するか、あるいは処理せず、そしてグルタミン酸（１０ｍＭ；Ｂ）；Ｌ−ホモシステイン酸（１ｍＭ；Ｃ）またはブチオニンスルホキシイミン（０．１５ｍＭ；ＢＳＯ；Ｄ）のいずれかで２４時間刺激した。アラキドン酸、５０μＭで２４時間。ＢＬ１５、バイカレイン ５，６，７−トリヒドロキシフラボン。μ−トコトリエノールおよびＢＬ１５の双方は、細胞性グルタチオン（ＧＳＨ；Ｅ）の減少にもかかわらず、グルタミン酸の刺激に対して、ニューロンを保護した。Ｂ〜Ｅ：†、対応するコントロール未処理群と比較して低い；＊、対応する毒物処理群と比較して高い。Ｐは０．０５未満。
【００６９】
ＢＬ１５で前処理した細胞は、ＨＴ４細胞のグルタミン酸誘導性死、および一次ニューロンのグルタミン酸誘導性死に対して、明白に保護した（図３ＡおよびＢ）。加えて、ＢＬ１５前処理は、Ｌホモシステイン酸またはＢＳＯに引き起こされる毒性に対して、一次ニューロンを保護した（図３ＣおよびＤ）。過去に本発明者らは、ｎＭのαトコトリエノールが、ＨＴ４細胞のグルタミン酸誘導性死に対して保護するが、グルタミン酸誘導性の細胞性ＧＳＨの減少は救わないことを報告した（２７）。同じように、グルタミン酸の毒性効果に対するＢＬ１５依存性保護は、グルタミン酸処理した一次ニューロン中の低下したＧＳＨレベルに関連した（図３Ｅ）。少数の重要な論文が、グルタミン酸誘導性の１２−ＬＯＸ活性化が、ニューロンの死の遂行に重要な役割を果たすことを支持する薬理学的な証拠を示したが、確証的な証拠は未だない。
【００７０】
（実施例４：トコトリエノールによる１２−リポキシゲナーゼの阻害）
ビタミンＥおよびそのアナログが、５−ＬＯＸの強力なインヒビターであることが公知である（３７）。この効果は、ビタミンＥの抗酸化性質とは独立する。ビタミンＥはまた、１５−ＬＯＸの酵素タンパク質と特異的に複合することで、１５−ＬＯＸを阻害することが公知である（３８）。グルタミン酸誘導性ニューロン死の遂行における、誘導性１２−ＬＯＸの中心的な役割が提唱されている（１６、２０）。従って本発明者らは、ビタミンＥαトコトリエノールが、１２−ＬＯＸ活性の阻害によって、グルタミン酸誘導性神経変性を保護するかどうか調べることを目指した。
【００７１】
グルタミン酸誘導性ニューロン死の遂行における、誘導性１２−ＬＯＸの中心的な役割が提唱されている（Ｌｉら、１９９７；Ｔａｎら、２００１）。図４に参照されるように、マウスの一次未成熟皮質ニューロン細胞（Ｃ５７ＢＬ／６、Ａ；Ｂ６．１２９Ｓ２−Ａ／ｏｘ１５ｔｍｌＦｕｎ、Ｂ）を、グルタミン酸（１０ｍＭ）で２４時間刺激した。細胞の生存性は、乳酸脱水素酵素アッセイによって評価した。処理の諸説は、図１の説明文に記される。α−トコトリエノール、１００ｎＭ。†、対応するコントロール未処理群に比較して低く、また、１２−リポキシゲナーゼ欠乏ニューロンにおける対応する群に比較して低い；＊、対応する毒物処理群に比較して高い。Ｐは０．０５未満。
【００７２】
１２−ＬＯＸ欠乏マウスから単離されたニューロンは、グルタミン酸誘導性死に抵抗性である（図４）。この著しい知見は、α−トコトリエノールを、ニューロン細胞中でのグルタミン酸誘導性１２−ＬＯＸ活性のインヒビターとして試験するという本発明者らの興味を強化した。図５に参照されるように、グルタミン酸処理したニューロン中の１２−リポキシゲナーゼ活性による産生物を、ＨＰＬＣに基づいた分析アプローチを用いて評価した。パネルＡは、ＨＥＴＥについての代表的なクロマトグラムを示し、ＨＥＴＥはリポキシゲナーゼ活性の主要な副産物である；パネルＢは、１２時間にわたるグルタミン酸処理が、１２−リポキシゲナーゼ活性の産物である１２（Ｓ）−ＨＥＴＥの、ＨＴ４ニューロン中におけるレベルの上昇をもたらした結果を示す。ＮＤ、検出されず。１２−ＬＯＸ活性の副産物である１２（Ｓ）−ＨＥＴＥは、基本的な培養条件ではＨＴ４細胞中に検出されなかったことが観察された（図５）。グルタミン酸処理は、細胞の１２（Ｓ）−ＨＥＴＥ含有量を顕著に上昇させた。しかし、このような上昇は、α−トコトリエノール処理された細胞では阻止された（図５）。この傾向の観察から、ＨＴ４細胞中における１２−ＬＯＸの過剰発現が、ＨＴ４細胞をグルタミン酸誘導性細胞毒性に敏感にするのかどうか、およびα−トコトリエノールがこのような毒性に対向し得るのかどうかという疑問につながった。
【００７３】
図６に参照されるように、ＨＴ４細胞に、２時間のグルタミン酸処理を与えた。処理は、細胞質における１２−リポキシゲナーゼの減少（Ａ）、および膜における上昇（Ｂ）をもたらし、このことは、この酵素の細胞質から膜への流動を示唆した。パネル（Ｐａｎｅ）Ｃは、ＨＴ４細胞における１２−リポキシゲナーゼのうまくいった過剰発現を示す：パネルＤは、ａ−トコトリエノールによる、精製された１２−リポキシゲナーゼ活性の、用量依存的な阻害を示す。精製された１２−リポキシゲナーゼ（ブタ白血球；１０ユニット）を、［１４Ｃ］−アラキドン酸（２５μＭ）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。「材料および方法」に記載するように、アラキドン酸および１２−ＨＥＴＥを、薄層クロマトグラフィーを用いて分離した。本発明者らは、ＨＴ４細胞において、グルタミン酸による処理が、細胞質の１２−ＬＯＸタンパク質を細胞膜に移動させたことを観察した（図６ＡおよびＢ）。［１４Ｃ］−アラキドン酸の存在下における１２−ＬＯＸ活性の、薄層クロマトグラフィー解析から、α−トコトリエノールが、用量に依存して上記精製された酵素の活性を阻害したことが明らかになった（図６Ｄ）。
【００７４】
（実施例５ １２−ＬＯＸの三次元モデリング）
図７に参照されるように、１２−リポキシゲナーゼおよびα−トコトリエノールのドッキング解析の三次元モデリングを行った。Ａ、１２−リポキシゲナーゼの三次元構造。３００ＭＨｚ ＭＩＰＳ Ｒ５０００、ＯＳ ＩＲＩＸ リリース６．５におけるＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ０２上で、相同性モデルの構築を行った。１２−リポキシゲナーゼの理論的モデルを、Ｓｙｂｙｌ ＧｅｎｅＦｏｌｄモジュール（ｖ６．８、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて構築した。ＢおよびＣ、ａ−トコトリエノールドッキングの理論的モデル（二部位ＢおよびＣは、１０ヶ所の異なるドッキング部位を示した）。赤いアミノ酸残基は、Ｈｉｓ−３６０、Ｈｉｓ−３６５、Ｈｉｓ−５４０、およびＩｌｅ−６６３であり、隣接する鉄原子は太字で示され得る。Ｄ、１０ヶ所の異なるドッキング部位について、Ａｕｔｏｄｏｃｋが結合自由エネルギーを計算し、そして結合エネルギーの上昇する順に、それらを並び替える。リポキシゲナーゼのＮ末端ドメインは、八つの標準の逆平行βバレルを含み、その分子量は、遺伝的起源（哺乳動物または植物）によって異なる（Ｍｉｎｏｒら、１９９６）。理論的モデルについての大きさおよび構造の記載は、１ＹＧＥの結晶構造に一致する。哺乳動物種において、タンパク質のＣ末端は、酵素の触媒ドメインを形成し、約１８〜２２のらせん、および１つの逆平行β−バレルシートを含む。二つの長い中心らせんが活性部位で交差し、そして鉄リガンドに結合するためのヒスチジンを含む（Ｍｉｎｏｒら、１９９６）。これらのヒスチジンは、本発明者らの理論的モデルにおいて、３６０位、３６５位、および５４０位において観察された（図７Ａ）。末端のイソロイシンは、活性部位空洞の大きさを維持する上で重要な役割を果たす（Ｂｏｒｎｇｒａｂｅｒら、１９９９）。鉄原子活性中心のためのこの空洞はまた、理論的モデルの場合においても見られ得る。これは、二原子酸素添加反応および基質結合のための中心である（Ｇｉｌｌｍｏｒら、１９９７）。理論的モデルに観察され得る、３０種の溶媒空洞があり、最大の空洞の大きさは１２４Ｃｕ．Ａであり、これは活性部位の近傍に入る。理論的モデルについてのＰＲＯＣＨＥＣＫタンパク質幾何学的条件は、１ＹＧＥについて８８％であったのに比較して、見込まれる領域内の残基の８５％を計算した。残りの残基は、広く見込まれる領域に入る。１０ヶ所の異なるドッキング部位について、Ａｕｔｏｄｏｃｋが結合自由エネルギーを計算し、結合エネルギーの上昇する順にそれらを並べ替える（図７Ｄ）。ドッキングエネルギー（ｄｏｃｋｅｄ ｅｎｅｒｇｙ）を、結合自由エネルギーおよびリガンドの内部エネルギーから計算する。阻害定常は、引き続いてドッキングエネルギーと相関する。本発明者らは、活性部位に近い溶媒空洞の開口において、α−トコトリエノールが濃縮されることを見出した（図７ＢおよびＣ）。
【００７５】
（実施例２〜５についての材料および方法）
（材料）以下の材料は、示した供給源より得た。Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム塩；アラキドン酸；ジメチルスルホキシド；Ｌ−ブチオニン−［Ｓ，Ｒ］スルホキシミン；Ｌ−ホモシステイン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；バイカレイン；５，６，７，トリヒドロキシフラボン（ＢＬ１５；Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＭＩ）；トコトリエノール（ＢＡＳＦ、Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｃａｒｏｔｅｃｈ、Ｍａｌａｙｓｉａ）。細胞培養のためには、ダルベッコ改変イーグル培地、最小必須培地、ウシ胎仔血清、ならびにペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）；さらに培養皿（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いた。
【００７６】
（細胞培養）マウス海馬ＨＴ４細胞を、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったダルベッコ改変イーグル培地中で、３７℃において、９５％の空気および５％のＣＯ２を含む加湿空気中にて、増殖させた。ＨＴ４細胞は、Ｄ．Ｅ．Ｋｏｓｈｌａｎｄ Ｊｒ．博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）より提供された（Ｓｅｎら、２０００）。一次皮質ニューロン。ラット胎児の大脳皮質（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ；妊娠１７日目）、またはマウス胎児の大脳皮質（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、妊娠１４日目）から、記載されたように（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９０）、細胞を単離した。１２−ＬＯＸノックアウト研究のために、Ｂ６．１２９Ｓ２−Ａｌｏｘ１５ｔｍ１Ｆｕｎの胎児からニューロンを単離した（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＭＩ）。脳からの単離後、細胞を計数し、そして３５ｍｍのプレートあたり２〜３×１０６細胞の密度で、培養皿に播種した（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９０）。１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清、４０μＭのシステイン、および抗生物質（１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、０．２５μｔｇ／ｍｌのアンホテリシン）を補った最小必須培地（ＭＥＭ）中にて、細胞を培養した。培養物を、加湿インキュベーター中で、５％ＣＯ２および９５％空気中において、３７℃にて維持した。全ての実験は、プレーティング後２４時間に行った。
【００７７】
（神経毒性因子による処理）実験の直前に、培養物の培地を、血清および抗生物質を補った新鮮な培地と交換した。上記培地に、グルタミン酸（１０ｍＭ）を水溶液として加えた（Ｈａｎら、１９９７ａ；Ｓｅｎら、２０００；Ｔｉｒｏｓｈら、２０００）。グルタミン酸の添加に応じた、培地のｐＨの変化は観察されなかった。ニューロン細胞の死の誘導に用いられる他の因子は、直接関係のある図面の説明文に記載した。ビタミンＥ処理。α−トコトリエノールのストック溶液（作業用濃度の１０３倍）をエタノール中に調製した。それぞれのコントロールを、等体積（０．１％、ｖ／ｖ）のエタノールで処理した。それぞれの図面の説明文に示したグルタミン酸処理の５分前、または５分後のいずれかにおいて、α−トコトリエノールを培養皿に加えた。
【００７８】
（細胞生存度の決定）ＨＴ４細胞の生存度を、フローサイトメーターを用いたヨウ化プロピジウム排除アッセイを用いて、過去に本発明者らが記載したように決定した（Ｓｅｎら、２０００；Ｔｉｒｏｓｈら、２０００）。一次ニューロン培養物は、フローサイトメトリーの間に凝集する傾向があるので、これらの細胞の生存度を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）が提供するインビトロ毒性アッセイキット（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）を用いて、グルタミン酸処理２４時間後の細胞から培地中への乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の漏出を測定すること（Ｈａｎら、１９９７ａ）により、評価した。このプロトコールは、過去の報告（Ｈａｎら、１９９７ａ）に詳細が記載されている。手短に言えば、細胞の生存度を、以下の式を用いて決定した：生存度＝単層中の細胞のＬＤＨ活性／総ＬＤＨ活性（すなわち、単層中の細胞のＬＤＨ活性＋分離した細胞中のＬＤＨ活性＋細胞培養培地中のＬＤＨ活性）。
【００７９】
（１２−リポキシゲナーゼ発現）ＨＴ４において１２−ＬＯＸを過剰発現させるために、プラスミドｐｃＤＮＡ ３．１ １２−ＬＯＸ（ＲｅｓＧｅｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、またはＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を製品の指示書の通りに用いるｐｃＤＮＡ３．１を、細胞に一過的にトランスフェクトした。１２−ＬＯＸ発現のレベルを評価するために、トランスフェクション２４時間後にＨＴ４細胞を収集し、そしてＢＣＡタンパク質試薬を用いて、タンパク質濃度を決定した。還元条件下にて、ＮｕＰＡＧＥＴＭ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上で、サンプル（２０μｇタンパク質／レーン）を分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、そして１２−ＬＯＸポリクローナル抗血清（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）でプローブした。充填効率を評価するために、膜を剥ぎ取り、そして抗β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で再プローブした。
【００８０】
（細胞質調製）細胞（１．７×１０６）を、１４０×２０ｍｍプレートに播種した。１２〜１８時間後、細胞（サンプル毎に２×プレート）を氷冷ＰＢＳで洗浄し、そして皿から削ることで収集した。サンプルを７００ｇで回転させた（４℃、５分間）。１０ｍＭ、ｐＨ７．８のＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５％のグリセロール、１ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド、５μｇ／ｍｌのロイペプチン、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、および５μｇ／ｍｌのアンチパインを含む緩衝液（４００μｌ）を、上記細胞ペレットに加えた。サンプルを再懸濁し、そして１５分間氷中に保持した。１５分後、１０％のＮＰ４０を３０μｌをそれぞれのサンプルに加え、サンプルを３０秒間ボルテックスした。続いて、１４，０００ｇ、４℃にて２０分間、遠心分離した。上清細胞質を収集し、そして−８０℃にて保持した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質試薬を用いて決定した。
【００８１】
（総膜調製物）細胞（１．７×１０６）を、１４０×２０ｍｍプレートに播種した。１２〜１８時間後、細胞（サンプル毎に５プレート）を総膜調製物として収集した。総膜を、過去に記載された（Ｂａｓｈａｎら、１９９２）ように調製した。氷冷ＰＢＳで洗浄した後、細胞を削ることで収集した。サンプルを７００ｇで回転させた（４℃、１０分間）。２０ｍＭ、ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ−Ｎａ、２５０ｍＭのショ糖、２ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのアジ化ナトリウム、１００μＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド、１μＭのプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む緩衝液（１０ｍｌ）を、上記細胞ペレットに加えた。サンプルをモーター駆動ホモジナイザーを用いて、４℃にてホモジナイズした（１５ストローク）。次いでサンプルを７６０ｇで回転させた（４℃、３分間）。遠心分離後、上清を収集し、そして１９０，０００ｇで回転させた（４℃、１時間）。結果として生じる総膜ペレットを、上記の緩衝液に再懸濁し、そしてサンプルを−８０℃にて保存した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質試薬を用いて決定した。
【００８２】
（１２−リポキシゲナーゼ活性）トコトリエノールが直接的に１２−ＬＯＸ（１２−ＬＯＸ）の活性に影響を及ぼすかどうかを調査するために、１０ユニットの１２−ＬＯＸ（Ｂｉｏｍｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｓ Ｉｎｃ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）を、それぞれの図面の説明文に示すように、トコトリエノールと共に、またはトコトリエノール無しで、１５分間室温にてインキュベートした。反応混合物は、５０ｍＭ、ｐＨ７．４のＴｒｉｓＨＣｌ、および１ｍＭのＥＤＴＡを含んだ。１５分後、サンプル毎に２５μＭの［１−１４Ｃ］アラキドン酸を加えて、反応を開始した。サンプルを３７℃にて３０分間保持した。ジエチルエステル、メタノール、および１Ｍのクエン酸を、体積比で３０：４：１で含む、氷冷した停止溶液を２００μｌ加えることで、反応を停止した。混合した後、サンプルを遠心分離し、そしてエーテル抽出物をシリカゲル薄層プレートにスポットした。薄層クロマトグラフィーを、溶媒系（ジエチルエーテル、石油エーテル、および酢酸を体積比で８５：１５：０．１で含む）を用いて、−２０℃にて４５〜６０分間行った。プレート上の基質および生成物の放射活性の分配を、画像分析機器を用いて定量化した。
【００８３】
（グルタチオンアッセイ）グルタチオン（ＧＳＨ）を、ＨＰＬＣ−電量分析電極アレイ検出器（１２チャンネル付きＣｏｕｌａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ − ｍｏｄｅｌ ５６００；ＥＳＡ Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて検出した。グルタチオンアッセイのための、サンプル調製、移動相、およびカラムは、過去に記載された（Ｓｅｎら、２０００）。過去に報告した方法の改良として、本方法は、グルタチオンの検出のために電量分析電極アレイ検出器を導入した（Ｒｏｙら、２００２）。このシステムは、異なる酸化還元電位に、複数のチャンネルを用いる。グルタチオンを、以下の電位に設定したチャンネルにおいて検出した：Ｉ）６００ｍＶ、ＩＩ）７００ｍＶ；およびＩＩＩ）８００ｍＶ。８００ｍＶに設定したチャンネルに由来する信号を、定量化に用いた（Ｓｅｎら、２００２）。
【００８４】
（１２−ＨＥＴＥ検出）ＨＴ４細胞由来の１２−ヒドロキシ−エイコサテトラエン酸（ＨＥＴＥ）を、ＨＰＬＣ−ＵＶに基づいた方法（Ｅｂｅｒｈａｒｄら、２０００）を用いて検出した。
【００８５】
（免疫蛍光顕微鏡検査法）免疫蛍光顕微鏡検査法のために、ラット皮質ニューロンの一次培養物を、ポリ−Ｌ−リジンで前もってコーティングした３５ｍｍプレートにプレートした。２４時間後、細胞をα−トコトリエノールまたはＢＬ１５で５分間処理し、次いでグルタミン酸で刺激するか、またはグルタミン酸に曝露した。グルタミン酸への曝露の２４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、室温にて１０分間、４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、そして室温にて２０分間、ＰＢＳ−Ｔ（０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含んだＰＢＳ）で透過化処理した。次いで、サンプルを３回、ＰＢＳ−Ｔでリンスし、そして室温にて１時間ブロッキング（ＰＢＳ−Ｔ中に２％のＢＳＡ）を行った。ブロッキングの後、サンプルを、一次抗体｛抗−神経フィラメント２００（１：１００、Ｓｉｇｍａ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、またはニューロンのクラスＩＩＩβ−チューブリン（１：５００、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）｝と共に、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後（３回、それぞれ５分間）、サンプルを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８と結合体化したヤギ抗−マウス二次抗体またはヤギ抗−ウサギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と共に、室温にて４５分間インキュベートした。続いてＰＢＳで３回洗浄し、水溶性培地に組み込んだ。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡を用いて、蛍光画像を収集した。画像を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ３．１を用いて得た。
【００８６】
（生細胞の画像化）生細胞の画像化のために、ラット皮質ニューロンの一次培養物を、ポリ−Ｌ−リジンで前もってコーティングした３５ｍｍプレートにプレートした。生細胞の画像化を、８時間〜２６時間（１８時間の持続期間）グルタミン酸に曝露した未処理細胞について行った。なぜなら、これが、形態学的な変化が最も顕著である時間だからである。α−トコトリエノールで処理した細胞は、グルタミン酸に非感受性であった。健康な増殖のパターンを示すために、グルタミン酸処理の２６時間後〜３４時間後（８時間の持続期間）、これらの細胞を画像化した。ごく普通の培養プレート中での細胞増殖の画像化に適した、特殊化された位相差Ｚｅｉｓｓ光学レンズを用いて、１５分毎に１回ずつ、画像を収得した。上記顕微鏡に、上記段階を３７℃で、および培養インキュベーターのガス環境に匹敵するガス環境を維持するのに適切な付属物を取り付けた。画像を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ４．０を用いて、．ａｖｉビデオ形式に書き出した。
【００８７】
（１２−リポキシゲナーゼモデル）ホモロジーモデルの構築を、３００ＭＨｚ ＭＩＰＳ Ｒ５０００を内蔵したＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ０２、ＯＳ ＩＲＩＸリリース６．５において行った。１２−ＬＯＸの理論的モデルを、Ｓｙｂｙｌ ＧｅｎｅＦｏｌｄモジュール（ｖ６．８、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて構築した。このモジュールは、可能性のあるタンパク質アラインメントを探すために、ＲＳＣＢタンパク質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）に対するＢＬＡＳＴ検索を用いる。相同なタンパク質を同定するためのモジュールは、４つのスコア付け関数を用い、この関数としては、配列類似性、局所性相互作用、潜伏類似性（ｂｕｒｉａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）、および二次構造類似性が挙げられる。これらの性質は、組み合わせて「アラインメントスコア」として反映され、スコアが１，０００であることは、全てのスコア付け関数について完全なアラインメントを示す。血小板型１２−ＬＯＸについての標的配列を、ＮＣＢＩタンパク質データベースから取得した。ＢＬＡＳＴ検索から、ダイズの１−ＬＯＸ（ＰＤＢコード１ＹＧＥ）（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、１９７７）と、９７％の配列同一性、および９９９．９の「アラインメントスコア」が示され、このことは、上記標的配列と類似した折り畳みパターンを反映した。引き続いて、１ＹＧＥの構造を、Ｓｙｂｙｌ中の「骨格方法」オプションを用いたモデル構築のための鋳型タンパク質として用いた。分子力学計算を、定常誘電性関数（ε２．０）および８．ＯＡの非結合カットオフ距離を備えたＴｒｉｐｏｓ力場を用いて行った。ガスタイガー−ヒュッケル（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ−Ｈｕｃｋｅｌ）電荷を割り当てた後に、エネルギー収束勾配値０．０５ｋｃａｌ／ｍｏｌにて、最終構造のエネルギー最小化をした。タンパク質結合構造を、ＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ、１９９３）を用いて調べ、そして鋳型タンパク質構造１ＹＧＥと比較した。
【００８８】
（α−トコトリエノールの１２−リポキシゲナーゼへのドッキング）Ａｕｔｏｄｏｃｋ（ｖ３．０．５）（Ｍｏｒｒｉｓ、２００１）を用いて、リガンドの結合の研究を行った。Ａｕｔｏｄｏｃｋは３つのプログラム、Ａｕｔｏｔｏｒｓ、Ａｕｔｏｇｒｉｄ、およびＡｕｔｏｄｏｃｋの寄せ集めである（Ｇｏｏｄｓｅｌｌら、１９９６）。Ａｕｔｏｔｏｒｓは、リガンド座標の入力を促進し、ａｕｔｏｇｒｉｄは、分子座標に基づいた相互作用エネルギーの三次元格子を前もって計算し、そしてａｕｔｏｄｏｃｋは、ラマルク説遺伝的アルゴリズムを用いてドッキングシミュレーションを行う。リガンド分子であるα−トコトリエノールを、Ｓｙｂｙｌ−Ｓｋｅｔｃｈ Ｍｏｌｅｃｕｌｅオプションを用いて構築し、エネルギーを最小化し、そしてＭＯＰＡＣ電荷を割り当てた。次いで、ＡｕｔｏＤｏｃｋの標準の設定およびパラメーターを用いて、ドッキングを行った。理論的なモデルおよびドッキングについての図を、ＭＯＬＭＯＬ（ｖ２Ｋ．２）（ＭＯＬｅｃｕｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＭＯＬｅｃｕｌｅ ｄｉｓｐｌａｙ）ソフトウェアを用いて生成した。
【００８９】
（データ提示）棒グラフで示されるデータは、±標準偏差という結果を生じる。平均値間の相違の有意性を検定するために、スチューデントのｔ−検定を用いた。０．０５未満のｐは、平均値間の有意な相違として解釈される。
【００９０】
（実施例６：トコトリエノールは、１２−ＬＯＸ経路の活性化により誘導される心臓の細胞死を保護する）
遍在的に発現する細胞質性ホスホリパーゼＡ（２）（ＰＬＡ（２））によるアラキドン酸の生成は、細胞の恒常性、炎症、および腫瘍形成の制御に基本的な役割を有する。１２−リポキシゲナーゼ（１２−ＬＯ）は、アラキドン酸（Ｃ２０：４）から１２−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸への変換を触媒し、これは、グルタチオンペルオキシダーゼによって次々に１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）に還元される。本発明者らは、トコトリエノールが１２−ＬＯＸ経路の活性化を強力に阻害することを示した。１２−ＬＯＸの活性化は、心臓の種々の病理に関係する。この研究は、トコトリエノールが、１２−ＬＯＸ経路の活性化に対して心臓細胞を保護し得ることを導き、そして示した。
【００９１】
成体（５〜６週齢）のマウスの心室から単離した、一次心臓線維芽細胞（ＣＦ）を用いて、アッセイを行った。細胞を、５％Ｏ２条件下で培養した。単離から５日後、２５０ｎＭのトコトリエノールの存在下、または非存在下にて、２４時間、アラキドン酸（５０μＭ）＋ブチオニンスルホキシミンで細胞を処理した。Ｚｅｉｓｓ生細胞画像化顕微鏡を用いて、位相差画像化を行った。
【００９２】
図８に参照されるように、単離された心臓線維芽細胞を、単離の５日後に、２５０ｎＭのトコトリエノールの存在下、または非存在下にて、２４時間、アラキドン酸（ＡＡ）（５０μＭ）＋ブチオニンスルホキシミン（ＢＳ）で処理した。Ｚｅｉｓｓ生細胞画像化顕微鏡を用いて、位相差画像化を行った。２４時間後、ＡＡ（１２−ＬＯの基質）およびＢＳＯ（細胞性グルタチオン合成を阻害するとして公知）で処理した心臓細胞において、大規模な細胞死が観察された。細胞性グルタチオンの低下は、１２−ＬＯＸ経路の活性化のきっかけとして示唆された。トコトリエノールは、ＡＡ＋ＢＳＯによって誘導される細胞死を完全に阻止した（図８）。
【００９３】
（実施例７：胎児のラットの脳および成体の脳中のトコトリエノール濃度の亢進）
本明細書中に開示される結果は、発達中の胎児の脳中のビタミンＥ感受性遺伝子の、最初の全体的な評価を提供する。調査した８０００遺伝子の中で、１７遺伝子のみがビタミンＥを母親に与えた結果として、胎児の脳中での遺伝子発現のレベルの上昇を示し、一方で、３４種が発現の低下を示した。このことは、極めて特定の遺伝子のセットが、発達中の胎児の脳中のビタミンＥレベルに感受性であることを示す。
【００９４】
成体における主要なビタミンＥ欠乏の症状に基づいて、ビタミンＥが、神経の構造および機能を維持する上で中心的な役割を有することが示されてきた。しかし、脳へのビタミンＥの作用の分子的機序を系統的に評価する試みは成されていない。本発明者らのデータは、胎児の脳中のα−トコフェロールレベルが、母親の脳中で観察されるより幾重にも（ｍｕｌｔｉ−ｆｏｌｄ）低いことを示す。このデータは、胎児の脳中のα−トコフェロールレベルが、２１日齢のラットの脳のα−トコフェロールレベルに比べて、より低かったという過去の研究と合致する。さらに、ヒトにおいて、月満ちて産まれた新生児の血清α−トコフェロールレベルが、その母親の血清α−トコフェロールレベルに比べて、数倍低い（０．２１２±０．１２７ｍｇ／ｄｌ対１．１６０±０．５１３ｍｇ／ｄｌ）ことが公知である。本発明者らは以前に、α−トコフェロールに比べてトコトリエノールの方が、グルタミン酸誘導性変性に対するニューロン細胞の保護において著しく強力であることを示した。しかし、脳中の食餌性のトコトリエノールの有効性を示すインビボのデータは欠けていた。本研究は、妊娠中のＴＲＦの食餌的補充が、母親の脳および胎児の脳の双方の中におけるα−トコトリエノールの有意な向上につながることの、最初の証拠を提供する。食餌性のビタミンＥは腸内で吸収され、そしてリポタンパク質によって肝臓へ送達される。肝臓内で、α−トコフェロール画分はα−トコフェロール輸送タンパク質によって、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）に取り込まれ、次いで血流中に分泌される。最近の研究は、細胞選択性コレステリルエステルのリポタンパク質からの取り込みを媒介する、スカベンジャーレセプタークラスＢＩ型（ＳＲ−ＢＩ）が、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）から培養細胞へのα−トコフェロールの効果的な輸送を促進することを示す。さらに、ＳＲ−ＢＩ欠損変異マウスにおいて、コントロールの野生型動物に比較して、血漿中のα−トコフェロールレベルの顕著な上昇が見られ、このことは主に、変異マウスの異常に大きな血漿ＨＤＬ様粒子の、α−トコフェロール含量が上昇したことにほぼ起因した。器官および組織におけるトコトリエノールの取り込みおよび輸送の機構は、成人においてほとんど分かっておらず、胎児の組織においてはより一層分かっていない。
【００９５】
ＨＯ−３は、胎児の脳中で上方制御される、わずかなビタミンＥ感受性遺伝子の一つであった。ＨＯのアイソザイムである、ＨＯ−１、ＨＯ−２、ＨＯ−３は、ＮＯ合成酵素の酸化を含む、ヘム分子の異性体特異的酸化を触媒する公知の機能を有する、熱ショックタンパク質３２タンパク質の同族である。ＨＯ−１は高度に誘導性であるが、ＨＯ−２およびＨＯ−３は構成的に発現する。これらのタンパク質は、細胞性防御機構において中心的な役割を果たす。ＨＯ活性は、等モル量のＣＯ、ビリベルジン、および遊離の鉄の生成が原因である。ＨＯに関する最近の知見からは、これらのタンパク質が、ＮＯにとって細胞内の「吸い込み系」として役立ち得ることが示唆される。ＬＩＮＥ１は、別のビタミンＥ感受性転写物として同定された。ＬＩＮＥ−１、または分散型反復のＬ１ファミリーは、哺乳動物ゲノムの少なくとも１０％を占める。他の生物体のゲノム中の、他の分散性の反復ＤＮＡファミリーと同様にＬ１は、一連の重複的遺伝子転移現象によって、ゲノムに渡って分散され、そして増幅される。ゲノム中のＬ１配列のコピー数が大きいので、ほとんどの細胞のＲＮＡ集団において、Ｌ１は豊富に示される。しかし、Ｌ１を含むほとんどの転写物は偶然の転写の結果であり、Ｌ１のレトロ転移の中間体ではない。Ｌ１を含む転写物（その多くは切断され、そして再編成される）の、この高いバックグラウンドは、活性のＬ１エレメントにコードされた転写物の識別を困難にする。ＡｐｏＢ ｍＲＮＡは、Ｅ−胎児群に比較してＥ＋群においてより低かった一番上の候補の１つであった。ＡｐｏＢは、リポタンパク質の代謝の中で中心的な役割を果たし、そして血漿中で２種類のアイソフォーム、ａｐｏＢ−１００およびａｐｏＢ−４８、として存在する。高レベルのａｐｏＢおよびＬＤＬコレステロールは、冠状動脈心臓疾患の危険の増加に関連してきた。初期の研究から、ＴＲＦの投与（１００ｍｇ／日）が、血清のａｐｏＢを減少させることが示された。トコフェロールは、細胞中のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性を阻害することが示された。ＰＫＣ制御塩素イオンチャンネルは、Ｅ＋群において抑制された遺伝子の１つであった。
【００９６】
母親ラットおよび胎児ラットの脳中のトコフェロールのレベルを決定した。図９に参照されるように、妊娠中のラット（３日目）にランダムに、（ｉ）Ｅ＋群−α−トコフェロールが豊富である標準ラット飼料を与えた。加えてこの群に２週間の間、ビタミンＥを除去したトウモロコシ油に懸濁したＴＲＦを、毎日胃管栄養法によって補充した；および（ｉｉ）Ｅ−群−ビタミンＥの欠乏した食餌を与え、そしてビタミンＥを除去したトウモロコシ油を同体積補充した。妊娠１７日目に、脳を収集し、そしてＨＰＬＣを用いてビタミンＥ解析を行った。０．０５未満の＊Ｐは、Ｅ＋群と比較して顕著に異なることを意味する。０．０５未満の＃Ｐは、母親の脳と比較して顕著に異なることを意味する。ｎ．ｄ．は、検出されないことを意味する。胎児の脳中のα−トコフェロールレベルは、母親の脳中で観察されたα−トコフェロールレベルよりも複数倍低かった（図９Ａ）。Ｅ＋群と比較して、妊娠中わずか２週間ビタミンＥの欠乏した食餌を与えることは、成体の母親の脳中のα−トコフェロールレベルを顕著に低下させなかった。しかし、同様の条件下において、Ｅ−群の母親由来の胎児は、Ｅ＋群由来の胎児に比べて、顕著に低い脳中のα−トコフェロールレベルを有していた（図９Ａ）。
【００９７】
Ｅ−群の母親および胎児の脳中において、α−トコトリエノールは検出限界を下回った。妊娠中、母親に２週間ＴＲＦを経口補充したことは、母親および胎児の脳へのα−トコトリエノールの送達をもたらした。重要なことに、胎児の脳中のトコトリエノールの取り込みは、母親の脳中のトコトリエノールの取り込みに比べて、顕著に高かった（図９Ｂ）。興味深いことに、妊娠食中における短期間のビタミンＥ欠乏は、子供の生命的パラメーター（例えば、体重または一般的な健康）に影響を与えなかった（出願人の公開しない知見）。
【００９８】
（実施例８：トランスクリプトームプロファイリング）Ｅ＋群およびＥ−群由来の、発達中の胎児の脳のトランスクリプトームを、Ｕ３４Ａラットゲノム高密度オリゴヌクレオチドＧｅｎｅＣｈｉｐアレイを用いて比較した。このアレイは、約７０００の全長配列、および約１０００のＥＳＴ集団を解析する。双方の群から入手可能な全ての複製に由来する生のデータを用いて、全てで６つのペアワイズ比較（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）を生成した。異なる形で発現した全ての遺伝子の平均（６つのペアワイズ比較）倍数変化を計算した。データは、遺伝子の大部分は変化しないままであったことを示した（図１０）。ビタミンＥ−群に比較してビタミンＥ＋群において、全部で６４５遺伝子（７．３％）が上方制御された。その内４１６遺伝子が、２倍以上の規模に増加した。反対に１５２遺伝子（１．７％）が下方制御され、その内７４遺伝子が２倍以上低くなった（図１０）。本明細書中に記載したｔ−検定解析を用いると、ビタミンＥを補充された群に比べて、ビタミンＥを欠乏した群において、全部で１４４遺伝子が顕著に変化した（Ｐ＜０．０５）ことが観察された。ビタミンＥ感受性遺伝子の明らかな図示に対する中心の中央値に従って、データを調整した（図１１Ａ、Ｂ）。次に、ペアワイズ比較において一致が５０％を超えた遺伝子を、特にその遺伝子が重複したプローブセットで検出された場合に、選択した。データ解析のこのアプローチを用いて、Ｅ−群に比較してＥ＋群において、全部で１９プローブセットが上方制御されていることが分かり、そして３４プローブセットが抑制されていることが分かった（図１２および図１３）。図１２に参照されるのは、その母親が妊娠中の２週間にビタミンＥ＋の食餌およびビタミンＥ−の食餌を与えられた、個体の胎児から得られた脳についての６つペアワイズ比較。ペアワイズ比較において一致が５０％を超える遺伝子を、特にその遺伝子が重複したプローブセットで検出された場合に、選択した。説明が得られなかったＥＳＴは除いた。図１３に参照されるのは、その母親が妊娠中の２週間にビタミンＥ＋の食餌およびビタミンＥ−の食餌を与えられた、個体の胎児から得られた脳についての６つのペアワイズ比較。ペアワイズ比較において一致が５０％を超える遺伝子を、特にその遺伝子が重複したプローブセットで検出された場合に、選択した。説明が得られなかったＥＳＴは除いた。
【００９９】
（実施例９：ＲＴ−ＰＣＲを用いたＧｅｎｅＣｈｉｐデータの確認）ＧｅｎｅＣｈｉｐアプローチによって同定された、選択されたビタミンＥ感受性遺伝子を、従来の半定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて検証した（図１４）。図１４に参照されるように、発現レベルをＲＴ−ＰＣＲを用いて独立して決定した。ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ解析を用いて、Ｅ−群に比べてＥ＋群において異なる形で発現するとして同定された以下の遺伝子を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて検証した：ＨＯ−３、サイクリンＤ１、ＨＭＧ２、ＮＯＰＰ１４０、およびＧＡＰＤＨ。ＰＣＲ産物のバンド強度を定量化し、そしてそれぞれの遺伝子についての、Ｅ−群に比べたＥ＋群における倍数変化を計算した（塗りつぶした棒）。比較のために、ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ解析（１つ以上のプローブセット）を用いた特定の遺伝子の発現において観察された倍数変化もまたプロットした（中空の棒、および影付きの棒）。上方制御された遺伝子の内、ＨＯ−３を標的とする２つのプローブセットが、それぞれ３．９倍、および３．１倍に増加した（図１４）。反対に、マスピン（ｍａｓｐｉｎ）遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）遺伝子、およびＧタンパク質β１サブユニット（ｒＧｂ１）遺伝子の発現は、食餌性のビタミンＥに応じて高度に（３倍〜５倍）抑制された。ＰＣＲ産物のバンド強度を定量化し、そしてそれぞれの遺伝子についての、Ｅ−群に比べたＥ＋群における倍数変化を計算した。Ｅ＋群対Ｅ−群で上方制御された遺伝子について、ＧｅｎｅＣｈｉｐアプローチまたはＲＴ−ＰＣＲアプローチの双方を用いて、倍数変化が検出されたことを示すデータを比較した（図１４）。ＧＡＰＤＨについて、マイクロアレイデータおよびＲＴ−ＰＣＲデータの双方が、Ｅ−群に比べてＥ＋群において発現の減少を示した。しかし、ＧＡＰＤＨ発現の倍数変化は、ＲＴ−ＰＣＲデータに比べて、マイクロアレイデータにおいてより高かった（図１４）。
【０１００】
（実施例７〜９についての材料と方法）
妊娠した（３日）ラット（１０週齢；Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）をランダムに以下の２つの群に分けた：（ｉ）Ｅ＋群−α−トコフェロールが豊富な（約２００ｎｍｏｌ／ｇ食餌）、標準ラット飼料を与えた。加えて、この群は２週間の間、ビタミンＥを除去したトウモロコシ油（Ｈａｒｌａｎ）に懸濁したトコトリエノールの豊富な画分（ＴＲＦ）を、毎日の胃管栄養法によって補充した。妊娠したラットに、体重１ｋｇあたり、１ｇのＴＲＦを含む１１０ｍｇのα−トコフェロールおよび１１９ｍｇのα−トコトリエノールの混合物を与えた。ＴＲＦは、Ｃａｒｏｔｅｃｈ Ｓｄｎ Ｂｈｄ（Ｐｅｒａｋ、Ｍａｌａｙｓｉａ）から提供されるＴｏｃｏｍｉｎ（登録商標）５０％の形で提供した。；（ｉｉ）Ｅ−群−ビタミンＥの欠乏した食餌（ＴＤ８８１６３、Ｈａｒｌａｎ；α−トコフェロール／トコトリエノールのレベルは検出限界以下）を与え、そして同じ体積の、ビタミンＥを除去したトウモロコシ油を補充した。全てのラットを、２２±２℃で、１２時間：１２時間の暗所：明所サイクルでの標準条件下で維持した。全ての動物のプロトコールは、Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ、ＵＳＡのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＬＡＣＵＣ）によって承認された。サンプル収集。妊娠１７日目に、それぞれのラットの体重を記録した。ラットを殺した。母親の脳および胎児の脳を取り除き、ｐＨ７．４の氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、そして液体窒素中で急冷した。サンプルは−８０℃で短時間保存した。
【０１０１】
（ビタミンＥ抽出および解析）母親の脳および胎児の脳からのビタミンＥの抽出および解析を、ＨＰＬＣ電量分析電極アレイ検出器（１２チャンネル付きＣｏｕｌａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ − ｍｏｄｅｌ ５６００；ＥＳＡ Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、過去に記載されたように行った［１３］。このシステムは、異なる酸化還元電位に複数のチャンネルを用いる。α−トコフェロールおよびα−トコトリエノール、γ−トコフェロールおよびγ−トコトリエノール、ならびにδ−トコフェロールおよびδ−トコトリエノールを、それぞれ２００ｍＶ、３００ｍＶ、および４００ｍＶに設定したチャンネルで検出した。
【０１０２】
（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐプローブアレイ解析）液体Ｎ２中で胎児の脳を粉砕することで全ＲＮＡを抽出し、つづいて、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて抽出した［１４および１５］。ＲＮＡのさらなる洗浄を、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。過去に記載されたプロトコールに従って、マイクロアレイハイブリダイゼーションのために、標的を調製した［１４］。サンプルの品質を評価するために、サンプルをＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｔｅｓｔ−２アレイに、４５℃にて１６時間ハイブリダイズした。申し分のないサンプルを、Ｒａｔ Ｇｅｎｏｍｅアレイ（Ｕ３４Ａ）とハイブリダイズした。このアレイを洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで染色し、次いで本発明者らの施設のＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて走査した。
【０１０３】
生のデータを収集し、そしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ４．０（ＭＡＳ）ソフトウェアおよびＤａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ Ｔｏｏｌ ２．０（ＤＭＴ）ソフトウェアを用いて解析した。以下の２つのアプローチを、異なる形で発現した遺伝子を同定するために使用した：（ｉ）ＭＡＳにおける比較解析を用いて、Ｅ＋群およびＥ−群の双方の複製から、６つのペアワイズ比較を生成した。上方制御された遺伝子、または下方制御された遺伝子の双方について、平均倍数変化を計算した。ペアワイズ比較において一致が５０％を超える遺伝子を、特にその遺伝子が重複するプローブセットで検出された場合に、選択した；（ｉｉ）ＤＭＴを用いてＴ−検定を行い、そしてＥ−群と比較してＥ＋群において顕著に（Ｐ＜０．０５）変化した（増加または減少）遺伝子を選択した。選択した遺伝子の平均差分値を、Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ＴｒｅｅＶｉｅｗソフトウェアにロードした［１６］。ビタミンＥ感受性遺伝子の明らかな図示に対する中心の中央値に従って、データを調整した。
【０１０４】
（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ））ヘムオキシゲナーゼ３（ＨＯ−３）、サイクリンＤ１、高移動度群タンパク質２（ＨＭＧ２）、核リンタンパク質ｐ１３０（ＮＯＰＰ１４０）、およびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡの発現レベルを、過去に記載したように、ＲＴ−ＰＣＲを用いて独立に決定した［１７］。手短に言うと、全ＲＮＡ（１μｇ）を、オリゴ−ｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを用いて、ｃＤＮＡに転写した。ＲＴ−生成ｃＤＮＡを、表１に記載した遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応産物を、０．２５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲル中で、電気泳動した。このゲルを、紫外線徹照の条件下で、デジタル形式で画像化した。バンド強度の定量化を、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅソフトウェアに基づくＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行った。
表１．ＲＴ−ＰＣＲについて用いたプライマー
【０１０５】
【表２】
（実施例１０：トコトリエノール処方物＃２）
食餌あたりの量％ １日あたりの値
ビタミンＥ……………………………………９８．８ｉｕ ３２９％
混合トコフェロール
代表的な分配：
γ−トコフェロール………………………２１０．０ｍｇ
δ−トコフェロール…………………………７８．４ｍｇ
α−トコフェロール…………………………６６．３ｍｇ
β−トコフェロール……………………………３．５ｍｇ
Ｔｏｃｏｍｉｎ（登録商標）全範囲天然トコトリエノール複合体
代表的な分配：
γ−トコトリエノール………………………３５．５ｍｇ
α−トコトリエノール………………………１８．５ｍｇ
δ−トコトリエノール…………………………９．３ｍｇ。
【０１０６】
全ての特許、特許出願（および、その結果発行された任意の特許、および、対応する、公開された外国特許出願）、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の受入番号ならびに関連するデータ、そして本記載を通して言及された刊行物の開示は、これによって本明細書中に参考として援用される。しかし、本明細書中に参考として援用された任意の文書が、本発明を教え、または開示することは、明白に認められない。
【０１０７】
本明細書を通して与えられるあらゆる最大数的限界は、あらゆるより低い数的限界を含むことが理解されるべきであり、それは、このようなより低い数的限界が明白に本明細書中に記載されているかのようである。本明細書を通して与えられるあらゆる最低数的限界は、あらゆるより高い数的限界を含み、それは、このようなより高い数的限界が明白に本明細書中に記載されているかのようである。本明細書を通して与えられるあらゆる数的範囲は、このようなより広い数的範囲内に収まる、あらゆるより狭い数的範囲を含み、それは、このようなより狭い数的範囲が全て、明白に本明細書中に記載されているかのようである。
【０１０８】
対象の本発明の特定の実施形態が記載される一方で、対象の本発明の種々の変化および改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることが、当業者にとって明白である。加えて、本発明が、そのある特定の実施形態と結びついて記載された一方で、これは例示の手段であり、および限定の手段ではなく、そして本発明は、先行技術が許容する限り広く解釈されるべき、添付の請求項によって定義されることが理解されるべきである。
【０１０９】
本発明の他の実施形態は、本明細書の考慮、および本明細書中に開示された本発明の実行から、当業者に明白である。本発明の範囲および精神が添付の特許請求の範囲によって示されると共に、本明細書および実施例は例示的にのみ見なされることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
本明細書に取り込まれ、その一部を構成する、添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を例証し、そして記述と共に本発明の原理の説明に役立つ。
【図１】図１は、α−トコトリエノールによるニューロンの生存度の減少に対する保護を示す。
【図２−１】図２は、ラットの一次皮質ニューロンのグルタミン酸誘導性変性、およびα−トコトリエノールおよびＢＬ１５による保護の画像化を示す。
【図２−２】図２は、ラットの一次皮質ニューロンのグルタミン酸誘導性変性、およびα−トコトリエノールおよびＢＬ１５による保護の画像化を示す。
【図２−３】図２は、ラットの一次皮質ニューロンのグルタミン酸誘導性変性、およびα−トコトリエノールおよびＢＬ１５による保護の画像化を示す。
【図２−４】図２は、ラットの一次皮質ニューロンのグルタミン酸誘導性変性、およびα−トコトリエノールおよびＢＬ１５による保護の画像化を示す。
【図３】図３は、ＨＴ４および一次未成熟皮質ニューロン（Ｂ〜Ｄ）のグルタミン酸誘導性死に対する保護を与える１２−リポキシゲナーゼの薬理学的阻害を示す。
【図４】図４は、１２−リポキシゲナーゼノックアウトマウスから単離された一次未成熟皮質ニューロンが、グルタミン酸誘導性死に抵抗性であることを示す。
【図５】図５は、グルタミン酸処理したニューロン中の１２−リポキシゲナーゼ活性の生成物を示す。
【図６】図６は、１２−リポキシゲナーゼの効果：過剰発現、局在、およびα−トコトリエノールへの感度、を示す。
【図７】図７は、１２−リポキシゲナーゼおよびα−トコトリエノールのドッキング解析の三次元モデル化を示す。
【図８】図８は、トコトリエノールの、１２−ＬＯＸの活性からの心臓細胞の保護を示す。
【図９】胎児のラットの脳および母親のラットの脳中のビタミンＥレベル。
【図１０】Ｅ＋群およびＥ−群において異なる形で発現された遺伝子の平均倍数変化の範囲。
【図１１−１】Ｅ＋群の胎児の脳中で異なる形で発現された遺伝子を図示した集団イメージ。
【図１１−２】Ｅ＋群の胎児の脳中で区別をつけて発現された遺伝子を図示した集団イメージ。
【図１２】Ｅ＋群の胎児の脳中で上方制御された遺伝子。
【図１３】Ｅ＋群の胎児の脳中で下方制御された遺伝子。
【図１４】ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ発現解析のＲＴ−ＰＣＲ確認。
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張）
本願は、２００３年８月８日出願の米国仮特許出願第６０／４９３，７６１号明細書の優先権を主張し、その全体を本明細書にて参考として援用する。
【０００２】
（連邦政府資金による研究に関する記載）
本研究は、少なくとも一部分において、米国国立衛生研究所の米国国立神経疾患脳卒中研究所からの助成金、ＲＯ１−ＮＳ４２６１７に支持された。本発明の特定の権利は政府が有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
脳卒中および他の形態の傷害によりもたらされる発症および損傷は、酵素１２−リポキシゲナーゼ（「１２−ＬＯＸ」）の活性によって媒介されると考えられる。１２−ＬＯＸは、傷害による焦点障害、ならびにパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇、および関連する状態による拡散障害の結果として生じるニューロンの死に反応し得るようである。１２−ＬＯＸの活性はまた、脳以外の組織における疾患（例えば、特定の皮膚癌（例えば黒色腫）；心臓傷害に起因する心臓の損傷；ならびに筋肉の変性およびＨＩＶ感染に関連するほかの障害）の発達に反応し得る。従って１２−ＬＯＸは、グルタミン酸誘導性細胞毒性に関連する疾患および障害を予防または処置するための抑制性因子に対する、潜在的な標的である。１２−ＬＯＸの活性を標的とし、そして阻害するための因子および方法が望ましい。
【０００４】
黒色腫および他の癌は、複雑な細胞機構および生化学的機構によって制御される。リポキシゲナーゼは、特定の癌に中心的な関与を有すると確認されている。１２−リポキシゲナーゼ（１２−ＬＯＸ）は、その代謝産物である１２（）−ヒドロキシエイコサテトラエン酸［１２（）−ＨＥＴＥ］を通して、実験的な黒色腫の侵襲および転移において中心的な役割を果たすことが立証され、そして１２−ＬＯＸの発現は、早期のヒト黒色腫発癌に重要であり得る。１２−ＬＯＸの発現は、ヒトメラニン細胞から良性かつ形成異常の母斑へ、そして悪性の転移性疾患への黒色腫の進行の間で研究された。１２−ＬＯＸの発現は通常のヒトの皮膚のメラニン細胞では低いことが決定され、そして複合母斑、形成異常母斑および黒色腫に見られるメラニン細胞では増加した発現が観察された。黒色腫は形成異常母斑に比べてより高いレベルの１２−ＬＯＸ発現を有し、そして１２−ＬＯＸ発現は複合母斑のメラニン細胞と形成異常母斑のメラニン細胞との間で顕著に異なった。これらのデータは、黒色腫系内での癌の進行について、１２−ＬＯＸが重要な新規のマーカーであり得ることを示唆し、そしてそれゆえ、黒色腫の化学防御のための有用なバイオマーカーおよび治療標的であり得る。
【０００５】
１２−ＬＯＸを含むリポキシゲナーゼはまた、神経性傷害および心臓の傷害を含む傷害の結果である心臓の細胞死に関係する。遍在的に発現される細胞質性ホスホリパーゼＡ（２）（ＰＬＡ（２））によるアラキドン酸の生成は、細胞の恒常性、炎症および腫瘍形成の制御に基本的な役割を有する。１２−ＬＯＸはアラキドン酸（Ｃ２０：４）から１２−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸への変換を触媒し、これはグルタチオンペルオキシダーゼによって次々に１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）に還元される。１２−ＬＯＸの活性化は、心臓の種々の病理に関係する。従って、１２−ＬＯＸに抑制的な効果を有する治療薬剤が、癌、ならびに１２−ＬＯＸに関与する他の障害および疾患の処置のために望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明に従って、リポキシゲナーゼ（例えば、酵素１２−リポキシゲナーゼ）の活性に関連する脳卒中、ならびにその他の障害および疾患の発症の処置および予防に対する、治療方法および予防方法が提供される。また本発明に従って、胎児および新生児の脳中のトコトリエノールの濃度の特異的な増加に対する方法が提供される。また本発明に従って、受胎能を改善させる方法、または受胎能を回復させる方法が提供される。
【０００７】
被験体内の１２−リポキシゲナーゼ媒介性の細胞毒性の阻害のための方法が提供され、上記方法は以下；１２−リポキシゲナーゼ媒介性細胞損傷の発達の危険性がある被験体に、生物学的有効量のトコトリエノールを投与する工程、を包含する。生物学的有効量のトコトリエノールは、１２−リポキシゲナーゼの活性を阻害する。上記方法は、ニューロン損傷、心臓組織損傷、外皮損傷、癌（例えば黒色腫）の発達、および筋肉組織損傷からなる群より選択される１２−リポキシゲナーゼ媒介性細胞損傷に対する保護に指向される。
【０００８】
また本発明に従うのは、神経性傷害を被る被験体を処置するための方法であり、これは以下；上記被験体に、生物学的有効量のトコトリエノールを投与する工程、を包含する。上記方法は特に、脳卒中および心臓傷害のような傷害の処置に有用である。
【０００９】
また本発明に従うのは、黒色腫の発達の危険性がある被験体中の黒色腫の発達を阻止するための方法であり、これは以下；上記被験体に、生物学的有効量のトコトリエノールを投与する工程、を包含する。
【００１０】
また本発明に従うのは、癌の予防および処置のための養生法であり、これは癌の予防および処置を必要とする被験体に、トコトリエノールおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的処方物を投与する工程を包含する。このような処置を必要とする個体または被験体は、環境曝露（例えば、太陽に）、または癌の発達に対する他の素因に起因する癌の発達の危険性があるか、あるいは癌と診断されたと考えられる。
【００１１】
また本発明に従うのは、胎児中のニューロンを保護するための方法であり、これは、上記胎児を妊娠している妊娠した女性に、少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を投与する工程を包含する。
【００１２】
また本発明に従うのは、少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を妊娠した女性に投与することにより、ヒトの胎児の脳中のトコトリエノールの濃度を高めるための方法であり、上記組成物は実質的にトコフェロールを含まない。
【００１３】
また本発明に従うのは、ヒトの乳児の脳中のトコトリエノールの濃度を高めるための方法である。いくつかの実施形態において、上記方法は、少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を泌乳中の女性に投与する工程、および上記泌乳中の女性から産生された乳を上記乳児に与える工程を包含する。
【００１４】
また本発明に従うのは、成人のヒト被験体の脳中のトコトリエノール濃度を高めるための方法であり、これは少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を上記被験体に投与する工程を包含し、ここで上記組成物は実質的にトコフェロールを含まず、そして上記組成物はトコフェロールを含む食物または補助食品なしで投与される。好ましい実施形態において、上記ヒトがトコフェロールを含む食品または補助食品を摂取した、少なくとも１時間半後および少なくとも１時間半前に、上記混合物が投与される。補助食品であるＴｏｃｏｍｉｎを用いて、良好な結果が得られている。
【００１５】
また本発明に従うのは、受胎能の改善を必要とする動物における受胎能の改善のための方法であり、これは上記動物に毎日少なくとも１種のトコトリエノールを臨床的有効量を投与する工程を包含する。好ましくは、上記トコトリエノールは、意図される受胎に先立って２週間〜約１６週間の期間、毎日投与される。より好ましくは、トコトリエノールは、意図される受胎に先立って少なくとも６〜８週間、毎日投与される。
【００１６】
本発明の方法に従って用いられる場合、トコトリエノール組成物は、必要に応じて、１用量あたり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇの単一用量または複数回用量で、被験体に毎日投与される。好ましくは、成人に対する用量は約６００ｍｇであり、そして一日あたり１〜３回投与される。投与の好ましい様式は、ゲルキャップの形態での経口的なものである。上記方法に従って用いられるトコトリエノールは、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノール、それらの誘導体、および１つ以上のそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、本方法に従う組成物は、実質的にトコフェロールを含まない。
【００１７】
また本発明に従うのは、機能的トコフェロール輸送タンパク質を欠く動物について、受胎能を回復させるための方法であって、上記動物にトコトリエノールを含む組成物を投与する工程を包含する。
【００１８】
また本発明に従うのは、一次培養物中のニューロンを維持するための方法であって、以下：動物から単離された少なくとも１つのニューロンを提供する工程；少なくとも１種のトコトリエノールを含む培養培地を提供する工程；および上記培養培地を含む容器中で、上記の少なくとも１つのニューロンを維持する工程、を包含する。
【００１９】
また本発明に従うのは、一次培養物中のニューロンを維持するための培養培地の形態における培養組成物であって、ここでこのような組成物は、少なくとも１種のトコトリエノールを含む。
【００２０】
本発明のさらなる特徴および利点は、続く記述中に部分的に示され、そして部分的にはその記述から明白であるが、または本発明の実行によって知り得る。本発明の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲に特に示した要素および組み合わせによって理解され、そして達成される。
【００２１】
上記の一般的な記述および以下の詳細な記述はいずれも、例示的かつ説明のためのものに過ぎず、特許請求の範囲に記載されるような本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（詳細な説明）
他に定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の本発明の説明に用いられる用語法は、特定の実施形態のみを記載するためであり、そして本発明を限定することを意図しない。本発明の記載および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「ある」および「その」は、文脈が明白に他を示さない限り、なお複数形を含むことを意図される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参考として援用される。
【００２３】
他に示さない限り、本明細書および特許請求の範囲中で用いられる成分の量、反応条件などを表す全ての数字は、全ての事例において用語「約」によって改変されるものとして理解されるべきである。従って、それと反対に示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値的パラメーターは近似値であり、本発明から得られるように求められた所望の性質に依存して変化し得る。最低限でも、そして上記特許請求の範囲に相当する原則の適用を制限することを企図しないように、それぞれの数値的パラメーターは、有意な数字の数および通常の丸めアプローチの観点から解釈されるべきである。
【００２４】
本発明の広い範囲を示す数値的範囲および数値的パラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら任意の数値は、本質的に、それらそれぞれの試験計測値に見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を固有に含む。本明細書全体にわたって与えられるそれぞれの数値的範囲は、このようなより広い数値的範囲中に含まれる、それぞれのより狭い数値的範囲を含み、これは、このようなより狭い数値的範囲が全て本明細書中に明白に記されるかのようである。
【００２５】
本明細書中で疾患に関連して用いられる場合、用語「処置」は広範に用いられ、そして上記疾患を治療する方法に限定されない。用語「処置」は、一つ以上の疾患の病理学的効果または症状の減少、あるいは一つ以上のこのような病理学的効果または症状の発症または進行の速度の低下に役立つ、任意の方法を含む。
【００２６】
本明細書中で用いられる場合、用語「ビタミンＥ」は、一般的に全てのトコフェロールおよびトコトリエノールを指し、トコフェロール、およびＲＲＲ−α−トコフェロールの生物学的活性を有するそれらの誘導体を含む。天然には、八つの物質がビタミンＥ活性を有することを見出されている：α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロールおよびδ−トコフェロール；ならびにα−トコトリエノール、βトコトリエノール、γトコトリエノールおよびδトコトリエノール。しばしば、用語ビタミンＥはα−トコフェロールと同意語として用いられるが、この言及は、本明細書中での用語ビタミンＥの意図された使用よりもより限定される。Ｄ−α−トコフェロール（ＲＲＲ−α−トコフェロール）が最も高いバイオアベイラビリティーを有し、そして全ての他のものが一般に比較される標準を示すが、それはビタミンＥの８つの天然の形態のうちの一つに過ぎない。以前はζ−トコフェロール、ε−トコフェロール、またはη−トコフェロールとして公知であったトコトリエノールは、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロールおよびδ−トコフェロールに共通である飽和フィチル尾部と対照的に、３ヶ所で不飽和であるイソプレノイド尾部を有する点を除いて、化学的にトコフェロールと類似する。α−トコフェロール、βトコフェロール、γトコフェロールおよびδトコフェロールは、トウモロコシ油、ダイズ油、およびオリーブ油で主に見受けられるが、トコトリエノールは、ヤシ油、米ぬか油、およびオオムギ油で特に豊富である。
【００２７】
本明細書中で用いられる場合、用語「トコトリエノール」は、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、およびδ−トコトリエノールを指し、これらは、ζ−トコフェロール、ε−トコフェロール、またはη−トコフェロールとして以前は公知であり、そして時々代替的に公知である。トコトリエノールは酸化条件下で高度に不安定であり、それゆえ、トコトリエノール調製物を低い酸化条件下に維持し、そして加熱を避けることが望ましい。好ましくは、医薬品または補助食品における使用のためのトコトリエノールは、真空の投薬ユニットに維持されるべきである。
【００２８】
トコトリエノールは、大部分が、ヤシ油、米ぬか油、および大麦に生じる。合成トコフェロールおよび天然トコフェロールは、市場で容易に入手可能であるが、天然トコトリエノールの供給は限られている。トコトリエノールが豊富である（８００〜１５００ｐｐｍ）粗製ヤシ油は、天然トコトリエノールの潜在的な供給源を提供する。Ｃａｒｏｔｅｃｈ，Ｍａｌａｙｓｉａは、革新的かつ新しい技術を用いて、有害な環境上の影響無しに抽出率を最大化する溶媒を使用することなく、粗製ヤシ油からトコトリエノールを抽出し得、そして濃縮し得る、世界で唯一の工場である。
【００２９】
トコトリエノールの別の潜在的な供給源は米ぬか油、およびその脂肪酸蒸留液由来である。しかし、粗製ヤシ油と異なり、米ぬか中のトコトリエノール含有量は非常に低く、総ビタミンＥ（トコフェロールおよびトコトリエノール）含有量の約４５〜５５％である。残りのビタミンＥはトコフェロールで占められる。ヤシ油は、総ビタミンＥの約７５〜８０％を占める、比較的高い濃度のトコトリエノールを含む点で独特である。疫学的研究から、トコトリエノールのコレステロール抑制性作用を、高濃度のトコフェロール、特にα−トコフェロールが弱らせることが示された。血中の総コレステロールの減少におけるトコトリエノールの最適な影響を有するために、このような、トコフェロールを低い含有量（総ビタミンＥの３０％未満）で有する調製物が好ましい。
【００３０】
食餌のトコトリエノールは、循環するヒトのリポタンパク質に取り込まれることが示されており、ここでは、対応するトコフェロール異性体と同程度に効率的に、ペルオキシラジカルと反応する（Ｓｕａｒｎａら、１９９３；ＳｅｒｂｉｎｏｖａおよびＰａｃｋｅｒ、１９９４）。食餌によるトコトリエノールの追加は、ヒトにおける頸動脈のアテローム性動脈硬化症の経過に有益に影響する（Ｔｏｍｅｏら、１９９５）。トコフェロールではなく、トコトリエノールのマイクロモーラー量は、コレステロール生合成に関与する肝臓性鍵酵素である、ヒドロキシ−３メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素の活性を抑制することが示されている（Ｐｅａｒｃｅら、１９９２；Ｐｅａｒｃｅら、１９９４）。トコトリエノールは、トコフェロールに比べて優れた抗酸化効果、遊離ラジカル除去効果を有する。これは恐らく、細胞膜の脂質層におけるトコトリエノールの分布がより良いことに起因する。トコトリエノールは、α−トコフェロールよりもより有益な効果を示すが、作用の正確な機構についてはほとんど分かっていない。
【００３１】
本発明の開示に先立って報告された研究の結果からは、トコフェロールおよびトコトリエノールの輸送、組織濃度、および相対的生物学的機能が、幾分異なり、そして恐らく無関係であるらしいことが示されている（Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ（１９９３年３月）２０２（３）：３５３−９を参照のこと）。α−トコフェロール輸送タンパク質（αＴＴＰ）は、家族性の隔絶したビタミンＥ欠乏の原因となる遺伝子の産物であるが、血漿のビタミンＥレベルを決定する上で重要な役割を果たす。トコトリエノールを含むビタミンＥアナログの、αＴＴＰによる認識に必要な構造的特性の検査が報告されており、ここで、インビトロにおける膜間の輸送について、未標識のビタミンＥアナログとα−［３Ｈ］トコフェロールとの競合を評価することによって、リガンド特異性が評価された（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １９９７年６月２日；４０９（１）：１０５−８を参照のこと）。種々のビタミンＥアナログに対するαＴＴＰの相対的親和性は、種々のトコフェロールの形態について測定された最も高い親和性と、トコトリエノールに対する相対的に低い親和性との競合の程度に基づいて決定された。ラットの再吸収−妊娠アッセイから得られた相対的親和性と公知の生物学的活性との間に、直線関係が存在することが示された。これらの結果は、αＴＴＰに対するビタミンＥアナログの親和性が、生物学的活性の重大な決定要因の一つであることを示す。前記、およびトコトリエノールおよびトコフェロールの活性に関して当該分野で公知の他の情報に基づき、ビタミンＥのこれらの形態が異なる機能を有し、そして異なる生物学的機構系に関与する証拠がある。
【００３２】
（１２−リポキシゲナーゼの阻害）
本明細書中に記載されるような、出願人の努力の結果から、１２−リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）経路がトコトリエノールに感受性であることが確認されている。グルタミン酸誘導性１２−ＬＯＸ活性が、ナノモーラー濃度のトコトリエノールに感受性であることを示す最初の証拠を、出願人は提示する。加えて、１２−ＬＯＸ欠乏性の一次皮質ニューロンが、グルタミン酸による攻撃に抵抗性であることを、出願人は示す。
【００３３】
本明細書中に開示されるように１２ＬＯＸは、脳卒中に関連付けられるが、トコトリエノールにより効率的に阻害され、トコトリエノールが細胞死に先立って投与される場合、１２−ＬＯＸ活性の神経変性効果は覆され得る。トコトリエノールは、脳卒中、パーキンソン病、ＡＬＳ、癲癇、ならびにその他の神経変性障害および傷害を含む、限局性傷害および散在性傷害の損傷効果に対する保護に用いられ得る。生理学的に関連する範囲に十分に含まれる濃度において、ＨＴ４および未成熟一次皮質ニューロン中でα−トコトリエノールは強い神経保護性質を示す。現在の結果は、グルタミン酸誘導性酸化的毒性を達成する上での１２−ＬＯＸの中心的な役割を確認し、そしてα−トコトリエノールを栄養に基づいた治療における期待できる手段として提供する。
【００３４】
（投薬量および投与）
上記トコトリエノール組成物は、傷害、癲癇、ＡＬＳ、パーキンソン病、ならびにその他の傷害および障害の結果としての脳卒中、およびその他の神経性損傷（限局的であれ散在性であれ）を罹患した、または罹患する危険性がある被験体に投与される。上記トコトリエノール組成物は、損傷の逆転、およびそれ以上の１２−ＬＯＸ媒介性損傷からの保護を達成するために十分な量を、好ましくは傷害の発症の前に、そして連続的に投与される。上記トコトリエノール組成物は、約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に投与される。より好ましくは、約１００ｍｇ〜８００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に調剤が与えられる。最も好ましくは、約６００ｍｇの投薬量が、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に提供される。好ましい送達の形態は、経口摂取のためのゲルキャップである。若年の被験体に対する投薬量は、一用量あたり約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲であり、より好ましくは一用量あたり約５０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲であり、最も好ましくは一用量あたり約３００ｍｇであり、一日あたり約１〜３用量の頻度である。
【００３５】
（黒色腫およびその他の癌の予防および処置）
１２−ＬＯＸは、黒色腫および特定のその他の癌に直接的に関連する。トコトリエノールは、１２−ＬＯＸの機能に阻害的な効果を有することが、本明細書中に開示される。従ってトコトリエノールは、黒色腫およびその他の癌の処置に対する薬学的因子として示される。
【００３６】
（投薬量および投与）
上記トコトリエノール組成物は、黒色腫およびその他の癌、特にリポキシゲナーゼ（例えば、１２−リポキシゲナーゼ）に関与する癌に罹患している、または罹患する危険性がある被験体に投与される。上記トコトリエノール組成物は、損傷の逆転、およびそれ以上の１２−ＬＯＸ媒介性損傷からの保護を達成するために十分な量を、好ましくは傷害の発症の前に、そして連続的に投与される。上記トコトリエノール組成物は、約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に投与される。より好ましくは、約１００ｍｇ〜８００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に調剤が与えられる。最も好ましくは、約６００ｍｇの投薬量が、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に提供される。好ましい送達の形態は、経口摂取のためのゲルキャップである。若年の被験体に対する投薬量は、一用量あたり約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲であり、より好ましくは一用量あたり約５０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲であり、最も好ましくは一用量あたり約３００ｍｇであり、一日あたり約１〜３用量の頻度である。
【００３７】
（心臓組織の保護）
（投薬量および投与）
上記トコトリエノール組成物は、リポキシゲナーゼ（例えば１２−リポキシゲナーゼ）に関与する、心臓の障害およびその他の傷害に罹患した、または罹患する危険性がある被験体に投与される。上記トコトリエノール組成物は、約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に投与される。より好ましくは、約１００ｍｇ〜８００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に調剤が与えられる。最も好ましくは、約６００ｍｇの投薬量が、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に提供される。好ましい送達の形態は、経口摂取のためのゲルキャップである。若年の被験体に対する投薬量は、一用量あたり約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲であり、より好ましくは一用量あたり約５０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲であり、最も好ましくは一用量あたり約３００ｍｇであり、一日あたり約１〜３用量の頻度である。
【００３８】
（胎児の脳組織、新生児の脳組織、および成人の脳組織の保護）
トコフェロールの形態のビタミンＥは、特定の形態の細胞性損傷に関連する胎児および新生児の状態を改善することが公知である。最近の科学的証拠から、トコトリエノールの形態のビタミンＥが、トコフェロールの細胞性影響と異なる細胞性影響を有することが示され；ニューロン細胞において、グルタミン酸誘導性神経毒性の予防に、トコトリエノールはトコフェロールより強力であることが示された。学術的文献に従って、食餌性のα−トコトリエノールは脳（胎児および母乳で育てた新生児の脳を含む）に到達しないことが示唆された。従って、胎児および新生児中のトコトリエノールレベルの効率的な亢進のための方法の確認が望ましい。
【００３９】
成人のヒトのための栄養補助食品は、長くにわたってビタミンＥを有し、それは主にａ−トコフェロールの形態であり、そして時折トコトリエノールの形態（代表的には、臨床的に有益であるレベルより十分に下に減少した量であるにもかかわらず）である。トコトリエノールがα−トコフェロールとは異なる利点を与えるという証拠が増加している。しかし、成人のヒトの脳中に有益なレベルのトコトリエノールを取り込み、そして維持することは、達成し難いという証拠もまたある。従って、成人のヒトの脳およびその他の重要な組織にトコトリエノールを効果的に取り込み得る方法および組成物が望まれる。
【００４０】
妊娠の間のわずか２週間にわたるビタミンＥの欠乏した食餌の消費が、成人の脳のビタミンＥレベルに影響しない一方で、胎児の脳のビタミンＥレベルを実質的に低下させ、このことは妊娠の間の食餌中のこのビタミンの適切なレベルの重要性を強調する。妊娠した母親がトコトリエノールの栄養補助食品を供給される場合、成人の脳に比べて、胎児の脳によるより高いα−トコトリエノールの形態のビタミンＥの取り込みが観察される。このように、胎児の脳のトコトリエノールレベルは、母親の食餌のトコトリエノールの摂取と密接に関連する。この開示に基づき、食餌性のトコトリエノールが、胎児の脳に生物学的に有用である。胎児の脳に送達されるトコトリエノールだけでなく、食餌性トコトリエノールの物質に応答する遺伝子発現パターンは、妊娠食中のビタミンＥが、発達する胎児の脳の遺伝子発現性質に有利に影響を与えることを示唆する。
【００４１】
本明細書中で提供される開示はさらに、成人において、成人の脳に食餌的に補充された、または薬学的に補充されたトコトリエノールが、トコフェロールによって部分的に阻害されることを示す。これらの因子の特異な取り込みは、血液脳関門を横切る輸送のための共有されるキャリアに指向されると考えられる。トコトリエノールの取り込みは、実質的にトコフェロールを含まない、トコトリエノール組成物の食餌性および補助形態の投与を通して亢進され得る。
【００４２】
（投薬量および投与）
上記トコトリエノール組成物は、傷害、酸化的ストレスおよびグルタミン酸毒性、出生傷害または仮死に起因する神経性損傷を被った、またはそれらを被る危険性がある被験体（成人、妊婦および胎児、ならびに若年者を含む）に投与される。上記トコトリエノール組成物は、グルタミン酸、酸化的ストレス、および／または１２−ＬＯＸ媒介性損傷の効果の結果である損傷からの保護を達成するために十分な量を、好ましくは傷害の発症の前に、そして連続的に投与される。上記トコトリエノール組成物は、約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に投与される。より好ましくは、約１００ｍｇ〜８００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に調剤が与えられる。最も好ましくは、約６００ｍｇの投薬量が、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に提供される。好ましい送達の形態は、経口摂取のためのゲルキャップである。若年の被験体に対する投薬量は、一用量あたり約１〜１０００ｍｇの範囲であり、より好ましくは一用量あたり約５０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲であり、最も好ましくは一用量あたり約３００ｍｇであり、一日あたり約１〜３用量の頻度である。必要に応じて、若年者に投与される用量は、トコフェロールを欠き得る。
【００４３】
（受胎能を回復、または亢進するためのトコトリエノールによる処置）
多数の研究および製品が、不妊症のための処置の栄養に基づく養生法の一部として、トコフェロールの形態でのビタミンＥの使用を目的とする。しかし、トコフェロールおよび他の栄養性補助の効果が、細胞性損傷を起こす細胞上プロセスを阻害するに十分でないことの証拠がある。同様に、特定の個体は、組織中のトコフェロールの輸送および取り込みに必要な細胞性因子（すなわち、輸送タンパク質）を欠き、これらの特定の個体では、トコフェロールの有益な効果が失われている。従って、不妊症の根底にある原因は、しばしば、現在のトコフェロールの形態のビタミンＥを用いた栄養に基づいた処置および薬学的処置によっては、満足には対応されない。従って、不妊症の処置のための栄養に基づいた補助を提供する、代替の物質が望ましい。
【００４４】
トコトリエノールは、トコフェロールの吸収不全、あるいはトコフェロールの取り込みまたは利用可能性における他の機能不全の結果として崩壊した、受胎能の維持または回復のための食餌的養生法において、トコフェロールに代わって、またはトコフェロールの補助として用いられ得る。食餌性のトコトリエノールの効果は、受胎能に関連する組織（例えば、精巣上体または腹腔の脂肪、あるいは羊膜液）について、長く作用する。従って、トコトリエノールおよびトコフェロールの双方の共投与に関する、現行の食餌的養生法が望ましい。
【００４５】
（投薬量および投与）
上記トコトリエノール組成物は、トコフェロールの吸収不全、あるいはトコフェロールの取り込みまたは利用可能性における他の機能不全の結果としての、受胎能の崩壊を経験する被験体に投与される。上記トコトリエノール組成物は、約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に投与される。より好ましくは、約１００ｍｇ〜８００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に調剤が与えられる。最も好ましくは、約６００ｍｇの投薬量が、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成人の被験体に提供される。好ましい送達の形態は、経口摂取のためのゲルキャップである。好ましくは、意図する受胎に先立つ、少なくとも６〜８週間において、毎日処置が施される。
【００４６】
（トコフェロール輸送タンパク質（ＴＴＰ）ノックアウトマウスの繁殖を可能にするためのトコトリエノールの使用）
食餌的に、または薬学的に補われたトコフェロールの、腸から体の種々の部分への取り込み、および輸送は、ＴＴＰによって導かれる。哺乳動物におけるトコフェロールおよびトコトリエノールの重要な役割を理解し、そして識別するために、ＴＴＰの発現が除去されたノックアウトマウスが産生された。ＴＴＰの妨害は、これらのマウスにおける受胎能の欠如をもたらし、それは繁殖を不可能にし、従ってそれ以上の研究のための系の維持を不可能とする。本開示は、トコトリエノールの使用が、ＴＴＰノックアウトマウスにおけるＴＴＰ依存性不妊症の逆転をもたらすことの、最初の証拠を提供する。
【００４７】
（投与および投薬量）
上記トコトリエノール組成物は、約１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成体の被験体に投与される。より好ましくは、約１ｍｇ〜５００ｍｇの範囲において、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成体の被験体に経口調剤が与えられる。最も好ましくは、約５０ｍｇの投薬量が、一日あたり約２〜３用量の頻度で、成体の被験体に提供される。好ましくは、意図する受胎に先立つ、少なくとも６〜８週間において、毎日処置が施される。
【００４８】
（脳細胞の培養における試薬としてのトコトリエノール）
一次ニューロンは、成人の組織および若年者の組織の双方から単離され、そして治療的な用途、および研究用の用途を含む、多数の用途がある。一次ニューロンの成功した培養物は、一次ニューロン移植の使用、および特定の神経変性疾患の処置に関連する臨床的計画の実行可能性に中心的に重要である。同様に、培養物中における一次ニューロンの確立および維持は、ニューロンの発達、分化、および刺激への応答に関連する実験の実行に必須である。これらの細胞は、その培養環境に対する極めて高い感受性に起因して、培養物中での維持が難しい。特に、より年をとった被験体から得た組織ほど、培養環境中でより損傷しやすく、そして死に易い。
【００４９】
トコトリエノールは、一次培養物中の脳細胞の維持に、約０．００１μＭ〜１００μＭの濃度で効果的に用いられ、より好ましくは０．０１μＭ〜１０μＭの範囲であり、最も好ましくは０．５μＭ〜２μＭの範囲である。約１μＭのトコトリエノール濃度によって、良好な結果が得られた。一次ニューロンは、生物学的研究にとって、潜在的な診断用途および治療用途にとって、そして薬物のスクリーニングにとって有用である。トコトリエノールを含む培養は、高齢の被験体に由来するニューロンについて特に有用である。なぜなら、これらの他の感受性細胞の培養物についての生存度を、上記神経保護効果が増加させるからである。トコトリエノールを含む培養はまた、ニューロンの用途における使用を意図した幹細胞にとって有用である。
【００５０】
（トコトリエノールの形態および投与）
本明細書中に用いられるように、用語「生物学的有効量」は、１２−ＬＯＸの活性を阻害するに十分な量である。要求されるトコトリエノールの量は、処置される状態の性質および重篤度、ならびに、被験体が受けた前処置の性質、および標的とされる欠陥または疾患の型に依存する。究極的には、用量は臨床的試行を用いて決定される。最初に臨床医は、動物の研究から導かれた用量を投与する。有効量は、上記トコトリエノール組成物の一回の投与によって達成され得る。あるいは有効量は、上記トコトリエノール組成物の被験体への複数回の投与によって達成される。用語「治療有効な」および「薬学的有効な」は、疾患の重篤度および発生の頻度の改善の目標を達成する一方で、代替の治療に概して関連する有害な副作用は回避する、上記トコトリエノール組成物の量を与えることを意図する。本明細書中に用いられる場合、用語「治療的有効量」および「薬学的有効量」は、被験体に有意な利益（すなわち、神経性傷害または心臓傷害に関連した疾患の症状の低下、あるいは腫瘍の大きさの縮小、腫瘍の増殖および／または運動性もしくは転移の阻止、阻害、および／あるいはアポトーシスの増加、および／あるいは腫瘍の存在に関連した症状の低下、および不妊症の場合には、妊娠能力の回復）を示すに十分な、上記トコトリエノール組成物の総活性量を意味する。
【００５１】
本発明に従う上記トコトリエノール組成物の初期用量は、一日あたり約１〜３回の頻度において、１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲である。本方法はトコトリエノールの使用に関連するが、明らかに、臨床的用途を広げる他の治療因子と併用し得る。投与の正確な用量および頻度が、本発明の方法において用いられる、投与される特定の化合物、処置される特定の状態、処置される状態の重篤度、特定の患者の年齢、体重、一般的な身体的状況、ならびに、当業者である投与する医師に周知である上記個体が取られ得る他の処方に依存することは、当業者にとって明白である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、上記トコトリエノール組成物は実質的にトコフェロールを含まない。本明細書において用いられる場合、「実質的に含まない」とは、１種以上のトコフェロール化合物を１重量％未満含む、１種以上のトコトリエノールを含む組成物を呼ぶ。好ましくは、上記組成物は０．５重量％未満の１種以上のトコフェロール化合物を含み、より好ましくは０．１重量％未満の１種以上のトコフェロール化合物を含み、最も好ましくは０．０１重量％未満の１種以上のトコフェロール化合物を含む。
【００５３】
トコトリエノールを含む組成物は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路および腹腔内経路を介して投与され得る。好ましくは上記組成物は、経口的または静脈内のいずれかによって投与され、そして最も好ましくは、上記組成物は経口的に投与される。
【００５４】
注射または局所的な適用による送達もまた用いられ得るが、トコトリエノールの処方物の予防的投与および治療的投与にとって、経口投与が主要な経路であることが想像される。適切な用量のトコトリエノールを含む薬学的組成物は、一般的に用いられる希釈剤、賦形剤、ビヒクル、および添加物（例えば、充填剤、増量剤、結合剤、キャリア、塩、保湿剤、崩壊剤、崩壊遅延剤、湿潤剤、懸濁剤、界面活性剤、潤滑剤など）と共に調製され得る。上記組成物は、種々の投薬形態（例えば、ゲル錠剤、溶液、懸濁液、乳濁液、注射剤（例えば、溶液、懸濁液））を有し得る。
【００５５】
通常の無毒性の個体キャリア（例えば、グルコース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロースまたはセルロース誘導体、カルボン酸ナトリウムおよびカルボン酸マグネシウム）中にトコトリエノールを含む個体の組成物。局所的（すなわち経皮的）使用のための処方物としては、公知のゲル、クリーム、油、および軟膏が挙げられる。脂肪酸原料中の処方物は、生体適合性を広げるために用いられ得る。さらに上記組成物は、着色料、保存料、芳香剤、香料、甘味料、および／またはその他の薬物を含み得る。注射剤、溶液、乳濁液、および懸濁液の形態のトコトリエノールは滅菌され、そして好ましくは血液と等張性である。このような形態は、当該分野で一般に用いられる希釈剤を用いて調製され得る；例えば、水、エタノール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシイソステアリルアルコール、およびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル。上記組成物は、等張溶液を調整するために必要な塩化ナトリウム、グルコースまたはグリセリン、ならびに通常の可溶化剤、緩衝液、および鎮静剤を含み得る。
【００５６】
乾燥充填カプセルとしても公知であるカプセルは、適切な大きさの嚥下可能な容器（代表的にはゼラチン製である）に上記組成物が含まれた、経口性の固形の投薬形態である。本発明の栄養補助的組成物を含むために適切な硬質な空のカプセルは、いくつかの原料（例えば、Ｔｉｓｈｃｏｎ Ｇｅｌ−Ｔｅｃ、２４１０Ｎ．Ｚｉｏｎ Ｒｄ．、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｍｄ．２１８０１）から利用可能である；上記カプセルは、二分されて供給され、そして種々の大きさで供給される。その大きさは代表的には番号で表され、範囲のより大きい端の０００から、範囲の最も小さい端の５の範囲である。上記カプセルの半分は適切な着色料によって着色され得、そしてそれぞれの半分にしたものは同じ色でも異なる色でもよい。
【００５７】
投薬形態の中で、本発明の方法に特に適切なのは、ソフトゼラチンカプセルである。従って、１ｍｇ〜１０００ｍｇのトコトリエノールが、適切な希釈剤（例えば、野菜油）と混合され、次いでソフトゼラチンカプセルに封入される。他の投薬形態としては、例えば、トコトリエノールがアルコール中に、賦形剤（例えば香料）と共に懸濁された、または溶解された、懸濁液が挙げられる。
【００５８】
注射によって投与される場合、適切なキャリアとしては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、および濃度増加因子および可溶化剤（例えば、グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびそれらの混合物）を含む溶液が挙げられるが、これらに限定されない。組織標的リポソームを含むリポソーム懸濁液もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして適切であり得る。これらは、当該分野で公知の方法に従って調製され得る。
【００５９】
本発明の化合物は、上記化合物を体からの迅速な排出から保護するキャリア（例えば、徐放性の処方物またはコーティング）と共に調製され得る。このようなキャリアは徐放性の処方物（例えば、インプラントおよびマイクロカプセルに入れた送達システム、ならびに、生分解性、生体適合性ポリマー（例えば、コラーゲン、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸など）であるが、これらに限定されない）を含む。このような処方物の調製のための方法は、当業者にとって公知である。
【実施例】
【００６０】
本発明は、以下の実施例を参照することでより良く理解され得、これらの実施例は例示に役立つが、本発明を限定するものではない。
【００６１】
（実施例１：トコトリエノール処方物＃１（ＴＯＣＯＭＩＮ（登録商標）（Ｃａｒｏｔｅｃｈ Ｓｄｎ．Ｂｈｄ．によって製造）））
【００６２】
【表１−１】
【００６３】
【表１−２】
（実施例２：培養物中のラットおよびＨＴ４ニューロンの保護）
α−トコトリエノールは、ｎＭ濃度において、グルタミン酸誘導性死からＨＴ４ニューロンを保護する；この保護は、α−トコトリエノールの抗酸化性とは独立する（Ｓｅｎら、２０００）。図１に参照されるように、一次ラット未成熟皮質ニューロン（Ａ〜Ｃ）またはＨＴ４（Ｄ）を、α−トコトリエノールで５分間処理するか、あるいは処理せず（示したように）、そしてグルタミン酸（１０ｍＭ；Ａ）；Ｌ−ホモシステイン酸（１ｍＭ；Ｂ）；またはブチオニンスルホキシイミン（０．１５ｍＭ；ＢＳＯ）のいずれかで２４時間刺激した。アラキドン酸（０．０５ｍＭ、Ｃ）は、ＢＳＯ誘導性の細胞死を強化した。ａ−トコトリエノールは、上記の神経毒の全てに対して総合的な保護を与えた。Ｄ、１００ｎＭのトコトリエノールは、グルタミン酸誘導性毒性を阻止しただけでなく、グルタミン酸処理した細胞が、グルタミン酸処理していない細胞に匹敵する速度で増殖するようにした。細胞は、グルタミン酸刺激の１２時間後、２４時間後、および３６時間後に計数した。Ａ：†、コントロールのグルタミン酸非処理群に比べて低い；＊、グルタミン酸処理群に比べて高い。Ｂ：†、コントロールのＬホモシステイン酸未処理群に比べて低い；＊、Ｌ−ホモシステイン酸処理群に比べて高い。Ｃ：†、対応するコントロールに比べて低い；＊、対応する、毒に刺激された群に比べて高い。Ｄ：†、対応する、コントロールの未処理群に比べて低い；＊、対応するグルタミン酸処理群に比べて高い。Ｐは０．０５未満。
【００６４】
ＨＴ４およびラットのニューロンについて行われた実験において、ｎＭ濃度のα−トコトリエノールは、標準的な神経毒（例えば、グルタミン酸、Ｌ−ホモシステイン酸、Ｌ−ブチオニン−［Ｓ，Ｒ］スルホキシイミン（ＢＳＯ）、ならびにＢＳＯとアラキドン酸との併用）により刺激された未成熟一次ニューロンを保護する（図１Ａ〜Ｃ）。
【００６５】
ＨＴ４ニューロンをグルタミン酸で刺激して行った実験から、ｎＭレベルのα−トコトリエノールが、細胞の生存の減少から保護するだけでなく、また培養物中のこれらの細胞の通常の増殖速度を維持することが明らかになり、このことは、インタクトな細胞機能を示唆する（図１Ｄ）。
【００６６】
βチューブリン、神経フィラメントの染色、および位相差顕微鏡による経時的検査から明白なように、グルタミン酸による一次ニューロンの刺激は、軸索樹状突起間の神経回路網の顕著な破壊をもたらす。図２に参照されるように、摂取の２４時間後に、細胞をグルタミン酸で刺激した。示された場合、グルタミン酸処理に先立って５分間、ニューロンをａトコトリエノール（２５０ｎＭ）またはＢＬ１５（２．５μＭ）のいずれかで前処理した。ａ〜ｈ、培養された神経回路網中の、ニューロン特異的なクラスIIIβ−チューブリン（位相差顕微鏡検査については、ｉ〜ｐを参照）。グルタミン酸処理の２４時間後、細胞を固定し、そして染色した。ａ、コントロール；ｂ、グルタミン酸；ｃ、α−トコトリエノール＋グルタミン酸；ｄ、ＢＬ１５＋グルタミン酸。ｅ〜ｈ、培養した神経回路網中の神経フィラメントの染色（位相差顕微鏡検査については、ｉ〜ｐを参照）。ｅ、コントロール；ｆ、グルタミン酸；ｇ、ａ−トコトリエノール＋グルタミン酸；ｈ、ＢＬ１５＋グルタミン酸。ｉ〜ｐ、標準（ガラスカバー片無しで（ｎｏｔ ｇｌａｓｓ ｃｏｖｅｒ−ｓｌｉｐ））培養条件下でグルタミン酸処理したニューロンの生細胞画像化。位相差画像を、グルタミン処理８時間後から、１８時間後に渡って１５分毎に一回収集した。フレームは、時間依存的な神経回路網の崩壊を示す。ｉ、グルタミン酸処理８時間後；ｊ、グルタミン酸処理１２時間後；ｋ、グルタミン酸処理１６時間後；およびｌ、グルタミン酸処理２６時間後。α−トコトリエノール（２５０ｎＭ）で前処理した、グルタミン酸刺激を受けたニューロンは崩壊に抵抗し、そして成長し続けた。ｍ、グルタミン酸処理２８時間後；ｎ、グルタミン酸処理３０時間後；ｏ、グルタミン酸処理３２時間後；そしてｐ、グルタミン酸処理３４時間後。２つ（ｉ〜ｌおよびｍ〜ｐ）の．ａｖｉ顕微鏡写真ビデオを、オンラインの刊行物に付属した。２００×の拡大率。
【００６７】
細胞のα−トコトリエノールによる前処理は、グルタミン酸誘導性神経崩壊を防ぐだけでなく、１０ｍＭのグルタミン酸があるにもかかわらずニューロンの成長を維持する（図２）。一次ニューロンにおけるグルタミン酸誘導性の構造変化に対する防御を、位相差顕微鏡による経時的な検査から観察した（図２）。標準の培養プレート中で増殖するニューロンを、ガラスカバー片上で増加させること無く、首尾良く画像化した。標準の培養条件下で、ニューロンおよびその軸索樹状突起間回路は、完全に運動能力がある。このことは、神経毒性のきっかけとなる上でグルタミン酸が効果的でない、トコトリエノール処理した細胞上の顕微鏡写真において、顕著に明白である（図２）。グルタミン酸処理したコントロールニューロンの経時的画像から、回路網の崩壊の前において細胞構造の運動における阻害が明らかとなった（データは示さず）。
【００６８】
（実施例３：培養物中の１２−ＬＯＸノックアウトマウスニューロン細胞の保護）
まず本発明者らは、本発明者らのモデルにおけるグルタミン酸誘導性死の遂行における１２−ＬＯＸの関与について試験した。本発明者らは、１２−ＬＯＸ特異的インヒビターであるバイカレインまたはＢＬ１５を用いることから始めた。図３に参照されるように、ＨＴ４ニューロンを、（Ａ）ａ−トコトリエノール（２５０ｎＭ）またはＢＵ５（２．５μＭ、１２−リポキシゲナーゼインヒビター）で５分間処理するか、あるいは処理せず、次いでグルタミン酸（１０ｍＭ）で刺激した。細胞の生存性を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除フローサイトメトリーアッセイを用いて決定した。ＰＩ−＝生存；ＰＩ＋＝死。ラット一次未成熟皮質ニューロン（Ｂ〜Ｄ）を、α−トコトリエノール（１００ｎＭ）またはＢＬ１５（２．５μＭ）で５分間処理するか、あるいは処理せず、そしてグルタミン酸（１０ｍＭ；Ｂ）；Ｌ−ホモシステイン酸（１ｍＭ；Ｃ）またはブチオニンスルホキシイミン（０．１５ｍＭ；ＢＳＯ；Ｄ）のいずれかで２４時間刺激した。アラキドン酸、５０μＭで２４時間。ＢＬ１５、バイカレイン ５，６，７−トリヒドロキシフラボン。μ−トコトリエノールおよびＢＬ１５の双方は、細胞性グルタチオン（ＧＳＨ；Ｅ）の減少にもかかわらず、グルタミン酸の刺激に対して、ニューロンを保護した。Ｂ〜Ｅ：†、対応するコントロール未処理群と比較して低い；＊、対応する毒物処理群と比較して高い。Ｐは０．０５未満。
【００６９】
ＢＬ１５で前処理した細胞は、ＨＴ４細胞のグルタミン酸誘導性死、および一次ニューロンのグルタミン酸誘導性死に対して、明白に保護した（図３ＡおよびＢ）。加えて、ＢＬ１５前処理は、Ｌホモシステイン酸またはＢＳＯに引き起こされる毒性に対して、一次ニューロンを保護した（図３ＣおよびＤ）。過去に本発明者らは、ｎＭのαトコトリエノールが、ＨＴ４細胞のグルタミン酸誘導性死に対して保護するが、グルタミン酸誘導性の細胞性ＧＳＨの減少は救わないことを報告した（２７）。同じように、グルタミン酸の毒性効果に対するＢＬ１５依存性保護は、グルタミン酸処理した一次ニューロン中の低下したＧＳＨレベルに関連した（図３Ｅ）。少数の重要な論文が、グルタミン酸誘導性の１２−ＬＯＸ活性化が、ニューロンの死の遂行に重要な役割を果たすことを支持する薬理学的な証拠を示したが、確証的な証拠は未だない。
【００７０】
（実施例４：トコトリエノールによる１２−リポキシゲナーゼの阻害）
ビタミンＥおよびそのアナログが、５−ＬＯＸの強力なインヒビターであることが公知である（３７）。この効果は、ビタミンＥの抗酸化性質とは独立する。ビタミンＥはまた、１５−ＬＯＸの酵素タンパク質と特異的に複合することで、１５−ＬＯＸを阻害することが公知である（３８）。グルタミン酸誘導性ニューロン死の遂行における、誘導性１２−ＬＯＸの中心的な役割が提唱されている（１６、２０）。従って本発明者らは、ビタミンＥαトコトリエノールが、１２−ＬＯＸ活性の阻害によって、グルタミン酸誘導性神経変性を保護するかどうか調べることを目指した。
【００７１】
グルタミン酸誘導性ニューロン死の遂行における、誘導性１２−ＬＯＸの中心的な役割が提唱されている（Ｌｉら、１９９７；Ｔａｎら、２００１）。図４に参照されるように、マウスの一次未成熟皮質ニューロン細胞（Ｃ５７ＢＬ／６、Ａ；Ｂ６．１２９Ｓ２−Ａ／ｏｘ１５ｔｍｌＦｕｎ、Ｂ）を、グルタミン酸（１０ｍＭ）で２４時間刺激した。細胞の生存性は、乳酸脱水素酵素アッセイによって評価した。処理の諸説は、図１の説明文に記される。α−トコトリエノール、１００ｎＭ。†、対応するコントロール未処理群に比較して低く、また、１２−リポキシゲナーゼ欠乏ニューロンにおける対応する群に比較して低い；＊、対応する毒物処理群に比較して高い。Ｐは０．０５未満。
【００７２】
１２−ＬＯＸ欠乏マウスから単離されたニューロンは、グルタミン酸誘導性死に抵抗性である（図４）。この著しい知見は、α−トコトリエノールを、ニューロン細胞中でのグルタミン酸誘導性１２−ＬＯＸ活性のインヒビターとして試験するという本発明者らの興味を強化した。図５に参照されるように、グルタミン酸処理したニューロン中の１２−リポキシゲナーゼ活性による産生物を、ＨＰＬＣに基づいた分析アプローチを用いて評価した。パネルＡは、ＨＥＴＥについての代表的なクロマトグラムを示し、ＨＥＴＥはリポキシゲナーゼ活性の主要な副産物である；パネルＢは、１２時間にわたるグルタミン酸処理が、１２−リポキシゲナーゼ活性の産物である１２（Ｓ）−ＨＥＴＥの、ＨＴ４ニューロン中におけるレベルの上昇をもたらした結果を示す。ＮＤ、検出されず。１２−ＬＯＸ活性の副産物である１２（Ｓ）−ＨＥＴＥは、基本的な培養条件ではＨＴ４細胞中に検出されなかったことが観察された（図５）。グルタミン酸処理は、細胞の１２（Ｓ）−ＨＥＴＥ含有量を顕著に上昇させた。しかし、このような上昇は、α−トコトリエノール処理された細胞では阻止された（図５）。この傾向の観察から、ＨＴ４細胞中における１２−ＬＯＸの過剰発現が、ＨＴ４細胞をグルタミン酸誘導性細胞毒性に敏感にするのかどうか、およびα−トコトリエノールがこのような毒性に対向し得るのかどうかという疑問につながった。
【００７３】
図６に参照されるように、ＨＴ４細胞に、２時間のグルタミン酸処理を与えた。処理は、細胞質における１２−リポキシゲナーゼの減少（Ａ）、および膜における上昇（Ｂ）をもたらし、このことは、この酵素の細胞質から膜への流動を示唆した。パネル（Ｐａｎｅ）Ｃは、ＨＴ４細胞における１２−リポキシゲナーゼのうまくいった過剰発現を示す：パネルＤは、ａ−トコトリエノールによる、精製された１２−リポキシゲナーゼ活性の、用量依存的な阻害を示す。精製された１２−リポキシゲナーゼ（ブタ白血球；１０ユニット）を、［１４Ｃ］−アラキドン酸（２５μＭ）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。「材料および方法」に記載するように、アラキドン酸および１２−ＨＥＴＥを、薄層クロマトグラフィーを用いて分離した。本発明者らは、ＨＴ４細胞において、グルタミン酸による処理が、細胞質の１２−ＬＯＸタンパク質を細胞膜に移動させたことを観察した（図６ＡおよびＢ）。［１４Ｃ］−アラキドン酸の存在下における１２−ＬＯＸ活性の、薄層クロマトグラフィー解析から、α−トコトリエノールが、用量に依存して上記精製された酵素の活性を阻害したことが明らかになった（図６Ｄ）。
【００７４】
（実施例５ １２−ＬＯＸの三次元モデリング）
図７に参照されるように、１２−リポキシゲナーゼおよびα−トコトリエノールのドッキング解析の三次元モデリングを行った。Ａ、１２−リポキシゲナーゼの三次元構造。３００ＭＨｚ ＭＩＰＳ Ｒ５０００、ＯＳ ＩＲＩＸ リリース６．５におけるＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ０２上で、相同性モデルの構築を行った。１２−リポキシゲナーゼの理論的モデルを、Ｓｙｂｙｌ ＧｅｎｅＦｏｌｄモジュール（ｖ６．８、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて構築した。ＢおよびＣ、ａ−トコトリエノールドッキングの理論的モデル（二部位ＢおよびＣは、１０ヶ所の異なるドッキング部位を示した）。赤いアミノ酸残基は、Ｈｉｓ−３６０、Ｈｉｓ−３６５、Ｈｉｓ−５４０、およびＩｌｅ−６６３であり、隣接する鉄原子は太字で示され得る。Ｄ、１０ヶ所の異なるドッキング部位について、Ａｕｔｏｄｏｃｋが結合自由エネルギーを計算し、そして結合エネルギーの上昇する順に、それらを並び替える。リポキシゲナーゼのＮ末端ドメインは、八つの標準の逆平行βバレルを含み、その分子量は、遺伝的起源（哺乳動物または植物）によって異なる（Ｍｉｎｏｒら、１９９６）。理論的モデルについての大きさおよび構造の記載は、１ＹＧＥの結晶構造に一致する。哺乳動物種において、タンパク質のＣ末端は、酵素の触媒ドメインを形成し、約１８〜２２のらせん、および１つの逆平行β−バレルシートを含む。二つの長い中心らせんが活性部位で交差し、そして鉄リガンドに結合するためのヒスチジンを含む（Ｍｉｎｏｒら、１９９６）。これらのヒスチジンは、本発明者らの理論的モデルにおいて、３６０位、３６５位、および５４０位において観察された（図７Ａ）。末端のイソロイシンは、活性部位空洞の大きさを維持する上で重要な役割を果たす（Ｂｏｒｎｇｒａｂｅｒら、１９９９）。鉄原子活性中心のためのこの空洞はまた、理論的モデルの場合においても見られ得る。これは、二原子酸素添加反応および基質結合のための中心である（Ｇｉｌｌｍｏｒら、１９９７）。理論的モデルに観察され得る、３０種の溶媒空洞があり、最大の空洞の大きさは１２４Ｃｕ．Ａであり、これは活性部位の近傍に入る。理論的モデルについてのＰＲＯＣＨＥＣＫタンパク質幾何学的条件は、１ＹＧＥについて８８％であったのに比較して、見込まれる領域内の残基の８５％を計算した。残りの残基は、広く見込まれる領域に入る。１０ヶ所の異なるドッキング部位について、Ａｕｔｏｄｏｃｋが結合自由エネルギーを計算し、結合エネルギーの上昇する順にそれらを並べ替える（図７Ｄ）。ドッキングエネルギー（ｄｏｃｋｅｄ ｅｎｅｒｇｙ）を、結合自由エネルギーおよびリガンドの内部エネルギーから計算する。阻害定常は、引き続いてドッキングエネルギーと相関する。本発明者らは、活性部位に近い溶媒空洞の開口において、α−トコトリエノールが濃縮されることを見出した（図７ＢおよびＣ）。
【００７５】
（実施例２〜５についての材料および方法）
（材料）以下の材料は、示した供給源より得た。Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム塩；アラキドン酸；ジメチルスルホキシド；Ｌ−ブチオニン−［Ｓ，Ｒ］スルホキシミン；Ｌ−ホモシステイン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；バイカレイン；５，６，７，トリヒドロキシフラボン（ＢＬ１５；Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＭＩ）；トコトリエノール（ＢＡＳＦ、Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｃａｒｏｔｅｃｈ、Ｍａｌａｙｓｉａ）。細胞培養のためには、ダルベッコ改変イーグル培地、最小必須培地、ウシ胎仔血清、ならびにペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）；さらに培養皿（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いた。
【００７６】
（細胞培養）マウス海馬ＨＴ４細胞を、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったダルベッコ改変イーグル培地中で、３７℃において、９５％の空気および５％のＣＯ２を含む加湿空気中にて、増殖させた。ＨＴ４細胞は、Ｄ．Ｅ．Ｋｏｓｈｌａｎｄ Ｊｒ．博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）より提供された（Ｓｅｎら、２０００）。一次皮質ニューロン。ラット胎児の大脳皮質（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ；妊娠１７日目）、またはマウス胎児の大脳皮質（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、妊娠１４日目）から、記載されたように（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９０）、細胞を単離した。１２−ＬＯＸノックアウト研究のために、Ｂ６．１２９Ｓ２−Ａｌｏｘ１５ｔｍ１Ｆｕｎの胎児からニューロンを単離した（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＭＩ）。脳からの単離後、細胞を計数し、そして３５ｍｍのプレートあたり２〜３×１０６細胞の密度で、培養皿に播種した（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９０）。１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清、４０μＭのシステイン、および抗生物質（１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、０．２５μｔｇ／ｍｌのアンホテリシン）を補った最小必須培地（ＭＥＭ）中にて、細胞を培養した。培養物を、加湿インキュベーター中で、５％ＣＯ２および９５％空気中において、３７℃にて維持した。全ての実験は、プレーティング後２４時間に行った。
【００７７】
（神経毒性因子による処理）実験の直前に、培養物の培地を、血清および抗生物質を補った新鮮な培地と交換した。上記培地に、グルタミン酸（１０ｍＭ）を水溶液として加えた（Ｈａｎら、１９９７ａ；Ｓｅｎら、２０００；Ｔｉｒｏｓｈら、２０００）。グルタミン酸の添加に応じた、培地のｐＨの変化は観察されなかった。ニューロン細胞の死の誘導に用いられる他の因子は、直接関係のある図面の説明文に記載した。ビタミンＥ処理。α−トコトリエノールのストック溶液（作業用濃度の１０３倍）をエタノール中に調製した。それぞれのコントロールを、等体積（０．１％、ｖ／ｖ）のエタノールで処理した。それぞれの図面の説明文に示したグルタミン酸処理の５分前、または５分後のいずれかにおいて、α−トコトリエノールを培養皿に加えた。
【００７８】
（細胞生存度の決定）ＨＴ４細胞の生存度を、フローサイトメーターを用いたヨウ化プロピジウム排除アッセイを用いて、過去に本発明者らが記載したように決定した（Ｓｅｎら、２０００；Ｔｉｒｏｓｈら、２０００）。一次ニューロン培養物は、フローサイトメトリーの間に凝集する傾向があるので、これらの細胞の生存度を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）が提供するインビトロ毒性アッセイキット（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）を用いて、グルタミン酸処理２４時間後の細胞から培地中への乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の漏出を測定すること（Ｈａｎら、１９９７ａ）により、評価した。このプロトコールは、過去の報告（Ｈａｎら、１９９７ａ）に詳細が記載されている。手短に言えば、細胞の生存度を、以下の式を用いて決定した：生存度＝単層中の細胞のＬＤＨ活性／総ＬＤＨ活性（すなわち、単層中の細胞のＬＤＨ活性＋分離した細胞中のＬＤＨ活性＋細胞培養培地中のＬＤＨ活性）。
【００７９】
（１２−リポキシゲナーゼ発現）ＨＴ４において１２−ＬＯＸを過剰発現させるために、プラスミドｐｃＤＮＡ ３．１ １２−ＬＯＸ（ＲｅｓＧｅｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、またはＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を製品の指示書の通りに用いるｐｃＤＮＡ３．１を、細胞に一過的にトランスフェクトした。１２−ＬＯＸ発現のレベルを評価するために、トランスフェクション２４時間後にＨＴ４細胞を収集し、そしてＢＣＡタンパク質試薬を用いて、タンパク質濃度を決定した。還元条件下にて、ＮｕＰＡＧＥＴＭ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上で、サンプル（２０μｇタンパク質／レーン）を分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、そして１２−ＬＯＸポリクローナル抗血清（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）でプローブした。充填効率を評価するために、膜を剥ぎ取り、そして抗β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で再プローブした。
【００８０】
（細胞質調製）細胞（１．７×１０６）を、１４０×２０ｍｍプレートに播種した。１２〜１８時間後、細胞（サンプル毎に２×プレート）を氷冷ＰＢＳで洗浄し、そして皿から削ることで収集した。サンプルを７００ｇで回転させた（４℃、５分間）。１０ｍＭ、ｐＨ７．８のＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５％のグリセロール、１ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド、５μｇ／ｍｌのロイペプチン、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、および５μｇ／ｍｌのアンチパインを含む緩衝液（４００μｌ）を、上記細胞ペレットに加えた。サンプルを再懸濁し、そして１５分間氷中に保持した。１５分後、１０％のＮＰ４０を３０μｌをそれぞれのサンプルに加え、サンプルを３０秒間ボルテックスした。続いて、１４，０００ｇ、４℃にて２０分間、遠心分離した。上清細胞質を収集し、そして−８０℃にて保持した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質試薬を用いて決定した。
【００８１】
（総膜調製物）細胞（１．７×１０６）を、１４０×２０ｍｍプレートに播種した。１２〜１８時間後、細胞（サンプル毎に５プレート）を総膜調製物として収集した。総膜を、過去に記載された（Ｂａｓｈａｎら、１９９２）ように調製した。氷冷ＰＢＳで洗浄した後、細胞を削ることで収集した。サンプルを７００ｇで回転させた（４℃、１０分間）。２０ｍＭ、ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ−Ｎａ、２５０ｍＭのショ糖、２ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのアジ化ナトリウム、１００μＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド、１μＭのプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む緩衝液（１０ｍｌ）を、上記細胞ペレットに加えた。サンプルをモーター駆動ホモジナイザーを用いて、４℃にてホモジナイズした（１５ストローク）。次いでサンプルを７６０ｇで回転させた（４℃、３分間）。遠心分離後、上清を収集し、そして１９０，０００ｇで回転させた（４℃、１時間）。結果として生じる総膜ペレットを、上記の緩衝液に再懸濁し、そしてサンプルを−８０℃にて保存した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質試薬を用いて決定した。
【００８２】
（１２−リポキシゲナーゼ活性）トコトリエノールが直接的に１２−ＬＯＸ（１２−ＬＯＸ）の活性に影響を及ぼすかどうかを調査するために、１０ユニットの１２−ＬＯＸ（Ｂｉｏｍｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｓ Ｉｎｃ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）を、それぞれの図面の説明文に示すように、トコトリエノールと共に、またはトコトリエノール無しで、１５分間室温にてインキュベートした。反応混合物は、５０ｍＭ、ｐＨ７．４のＴｒｉｓＨＣｌ、および１ｍＭのＥＤＴＡを含んだ。１５分後、サンプル毎に２５μＭの［１−１４Ｃ］アラキドン酸を加えて、反応を開始した。サンプルを３７℃にて３０分間保持した。ジエチルエステル、メタノール、および１Ｍのクエン酸を、体積比で３０：４：１で含む、氷冷した停止溶液を２００μｌ加えることで、反応を停止した。混合した後、サンプルを遠心分離し、そしてエーテル抽出物をシリカゲル薄層プレートにスポットした。薄層クロマトグラフィーを、溶媒系（ジエチルエーテル、石油エーテル、および酢酸を体積比で８５：１５：０．１で含む）を用いて、−２０℃にて４５〜６０分間行った。プレート上の基質および生成物の放射活性の分配を、画像分析機器を用いて定量化した。
【００８３】
（グルタチオンアッセイ）グルタチオン（ＧＳＨ）を、ＨＰＬＣ−電量分析電極アレイ検出器（１２チャンネル付きＣｏｕｌａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ − ｍｏｄｅｌ ５６００；ＥＳＡ Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて検出した。グルタチオンアッセイのための、サンプル調製、移動相、およびカラムは、過去に記載された（Ｓｅｎら、２０００）。過去に報告した方法の改良として、本方法は、グルタチオンの検出のために電量分析電極アレイ検出器を導入した（Ｒｏｙら、２００２）。このシステムは、異なる酸化還元電位に、複数のチャンネルを用いる。グルタチオンを、以下の電位に設定したチャンネルにおいて検出した：Ｉ）６００ｍＶ、ＩＩ）７００ｍＶ；およびＩＩＩ）８００ｍＶ。８００ｍＶに設定したチャンネルに由来する信号を、定量化に用いた（Ｓｅｎら、２００２）。
【００８４】
（１２−ＨＥＴＥ検出）ＨＴ４細胞由来の１２−ヒドロキシ−エイコサテトラエン酸（ＨＥＴＥ）を、ＨＰＬＣ−ＵＶに基づいた方法（Ｅｂｅｒｈａｒｄら、２０００）を用いて検出した。
【００８５】
（免疫蛍光顕微鏡検査法）免疫蛍光顕微鏡検査法のために、ラット皮質ニューロンの一次培養物を、ポリ−Ｌ−リジンで前もってコーティングした３５ｍｍプレートにプレートした。２４時間後、細胞をα−トコトリエノールまたはＢＬ１５で５分間処理し、次いでグルタミン酸で刺激するか、またはグルタミン酸に曝露した。グルタミン酸への曝露の２４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、室温にて１０分間、４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、そして室温にて２０分間、ＰＢＳ−Ｔ（０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含んだＰＢＳ）で透過化処理した。次いで、サンプルを３回、ＰＢＳ−Ｔでリンスし、そして室温にて１時間ブロッキング（ＰＢＳ−Ｔ中に２％のＢＳＡ）を行った。ブロッキングの後、サンプルを、一次抗体｛抗−神経フィラメント２００（１：１００、Ｓｉｇｍａ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、またはニューロンのクラスＩＩＩβ−チューブリン（１：５００、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）｝と共に、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後（３回、それぞれ５分間）、サンプルを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８と結合体化したヤギ抗−マウス二次抗体またはヤギ抗−ウサギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と共に、室温にて４５分間インキュベートした。続いてＰＢＳで３回洗浄し、水溶性培地に組み込んだ。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡を用いて、蛍光画像を収集した。画像を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ３．１を用いて得た。
【００８６】
（生細胞の画像化）生細胞の画像化のために、ラット皮質ニューロンの一次培養物を、ポリ−Ｌ−リジンで前もってコーティングした３５ｍｍプレートにプレートした。生細胞の画像化を、８時間〜２６時間（１８時間の持続期間）グルタミン酸に曝露した未処理細胞について行った。なぜなら、これが、形態学的な変化が最も顕著である時間だからである。α−トコトリエノールで処理した細胞は、グルタミン酸に非感受性であった。健康な増殖のパターンを示すために、グルタミン酸処理の２６時間後〜３４時間後（８時間の持続期間）、これらの細胞を画像化した。ごく普通の培養プレート中での細胞増殖の画像化に適した、特殊化された位相差Ｚｅｉｓｓ光学レンズを用いて、１５分毎に１回ずつ、画像を収得した。上記顕微鏡に、上記段階を３７℃で、および培養インキュベーターのガス環境に匹敵するガス環境を維持するのに適切な付属物を取り付けた。画像を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ４．０を用いて、．ａｖｉビデオ形式に書き出した。
【００８７】
（１２−リポキシゲナーゼモデル）ホモロジーモデルの構築を、３００ＭＨｚ ＭＩＰＳ Ｒ５０００を内蔵したＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ０２、ＯＳ ＩＲＩＸリリース６．５において行った。１２−ＬＯＸの理論的モデルを、Ｓｙｂｙｌ ＧｅｎｅＦｏｌｄモジュール（ｖ６．８、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて構築した。このモジュールは、可能性のあるタンパク質アラインメントを探すために、ＲＳＣＢタンパク質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）に対するＢＬＡＳＴ検索を用いる。相同なタンパク質を同定するためのモジュールは、４つのスコア付け関数を用い、この関数としては、配列類似性、局所性相互作用、潜伏類似性（ｂｕｒｉａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）、および二次構造類似性が挙げられる。これらの性質は、組み合わせて「アラインメントスコア」として反映され、スコアが１，０００であることは、全てのスコア付け関数について完全なアラインメントを示す。血小板型１２−ＬＯＸについての標的配列を、ＮＣＢＩタンパク質データベースから取得した。ＢＬＡＳＴ検索から、ダイズの１−ＬＯＸ（ＰＤＢコード１ＹＧＥ）（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、１９７７）と、９７％の配列同一性、および９９９．９の「アラインメントスコア」が示され、このことは、上記標的配列と類似した折り畳みパターンを反映した。引き続いて、１ＹＧＥの構造を、Ｓｙｂｙｌ中の「骨格方法」オプションを用いたモデル構築のための鋳型タンパク質として用いた。分子力学計算を、定常誘電性関数（ε２．０）および８．ＯＡの非結合カットオフ距離を備えたＴｒｉｐｏｓ力場を用いて行った。ガスタイガー−ヒュッケル（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ−Ｈｕｃｋｅｌ）電荷を割り当てた後に、エネルギー収束勾配値０．０５ｋｃａｌ／ｍｏｌにて、最終構造のエネルギー最小化をした。タンパク質結合構造を、ＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ、１９９３）を用いて調べ、そして鋳型タンパク質構造１ＹＧＥと比較した。
【００８８】
（α−トコトリエノールの１２−リポキシゲナーゼへのドッキング）Ａｕｔｏｄｏｃｋ（ｖ３．０．５）（Ｍｏｒｒｉｓ、２００１）を用いて、リガンドの結合の研究を行った。Ａｕｔｏｄｏｃｋは３つのプログラム、Ａｕｔｏｔｏｒｓ、Ａｕｔｏｇｒｉｄ、およびＡｕｔｏｄｏｃｋの寄せ集めである（Ｇｏｏｄｓｅｌｌら、１９９６）。Ａｕｔｏｔｏｒｓは、リガンド座標の入力を促進し、ａｕｔｏｇｒｉｄは、分子座標に基づいた相互作用エネルギーの三次元格子を前もって計算し、そしてａｕｔｏｄｏｃｋは、ラマルク説遺伝的アルゴリズムを用いてドッキングシミュレーションを行う。リガンド分子であるα−トコトリエノールを、Ｓｙｂｙｌ−Ｓｋｅｔｃｈ Ｍｏｌｅｃｕｌｅオプションを用いて構築し、エネルギーを最小化し、そしてＭＯＰＡＣ電荷を割り当てた。次いで、ＡｕｔｏＤｏｃｋの標準の設定およびパラメーターを用いて、ドッキングを行った。理論的なモデルおよびドッキングについての図を、ＭＯＬＭＯＬ（ｖ２Ｋ．２）（ＭＯＬｅｃｕｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＭＯＬｅｃｕｌｅ ｄｉｓｐｌａｙ）ソフトウェアを用いて生成した。
【００８９】
（データ提示）棒グラフで示されるデータは、±標準偏差という結果を生じる。平均値間の相違の有意性を検定するために、スチューデントのｔ−検定を用いた。０．０５未満のｐは、平均値間の有意な相違として解釈される。
【００９０】
（実施例６：トコトリエノールは、１２−ＬＯＸ経路の活性化により誘導される心臓の細胞死を保護する）
遍在的に発現する細胞質性ホスホリパーゼＡ（２）（ＰＬＡ（２））によるアラキドン酸の生成は、細胞の恒常性、炎症、および腫瘍形成の制御に基本的な役割を有する。１２−リポキシゲナーゼ（１２−ＬＯ）は、アラキドン酸（Ｃ２０：４）から１２−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸への変換を触媒し、これは、グルタチオンペルオキシダーゼによって次々に１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）に還元される。本発明者らは、トコトリエノールが１２−ＬＯＸ経路の活性化を強力に阻害することを示した。１２−ＬＯＸの活性化は、心臓の種々の病理に関係する。この研究は、トコトリエノールが、１２−ＬＯＸ経路の活性化に対して心臓細胞を保護し得ることを導き、そして示した。
【００９１】
成体（５〜６週齢）のマウスの心室から単離した、一次心臓線維芽細胞（ＣＦ）を用いて、アッセイを行った。細胞を、５％Ｏ２条件下で培養した。単離から５日後、２５０ｎＭのトコトリエノールの存在下、または非存在下にて、２４時間、アラキドン酸（５０μＭ）＋ブチオニンスルホキシミンで細胞を処理した。Ｚｅｉｓｓ生細胞画像化顕微鏡を用いて、位相差画像化を行った。
【００９２】
図８に参照されるように、単離された心臓線維芽細胞を、単離の５日後に、２５０ｎＭのトコトリエノールの存在下、または非存在下にて、２４時間、アラキドン酸（ＡＡ）（５０μＭ）＋ブチオニンスルホキシミン（ＢＳ）で処理した。Ｚｅｉｓｓ生細胞画像化顕微鏡を用いて、位相差画像化を行った。２４時間後、ＡＡ（１２−ＬＯの基質）およびＢＳＯ（細胞性グルタチオン合成を阻害するとして公知）で処理した心臓細胞において、大規模な細胞死が観察された。細胞性グルタチオンの低下は、１２−ＬＯＸ経路の活性化のきっかけとして示唆された。トコトリエノールは、ＡＡ＋ＢＳＯによって誘導される細胞死を完全に阻止した（図８）。
【００９３】
（実施例７：胎児のラットの脳および成体の脳中のトコトリエノール濃度の亢進）
本明細書中に開示される結果は、発達中の胎児の脳中のビタミンＥ感受性遺伝子の、最初の全体的な評価を提供する。調査した８０００遺伝子の中で、１７遺伝子のみがビタミンＥを母親に与えた結果として、胎児の脳中での遺伝子発現のレベルの上昇を示し、一方で、３４種が発現の低下を示した。このことは、極めて特定の遺伝子のセットが、発達中の胎児の脳中のビタミンＥレベルに感受性であることを示す。
【００９４】
成体における主要なビタミンＥ欠乏の症状に基づいて、ビタミンＥが、神経の構造および機能を維持する上で中心的な役割を有することが示されてきた。しかし、脳へのビタミンＥの作用の分子的機序を系統的に評価する試みは成されていない。本発明者らのデータは、胎児の脳中のα−トコフェロールレベルが、母親の脳中で観察されるより幾重にも（ｍｕｌｔｉ−ｆｏｌｄ）低いことを示す。このデータは、胎児の脳中のα−トコフェロールレベルが、２１日齢のラットの脳のα−トコフェロールレベルに比べて、より低かったという過去の研究と合致する。さらに、ヒトにおいて、月満ちて産まれた新生児の血清α−トコフェロールレベルが、その母親の血清α−トコフェロールレベルに比べて、数倍低い（０．２１２±０．１２７ｍｇ／ｄｌ対１．１６０±０．５１３ｍｇ／ｄｌ）ことが公知である。本発明者らは以前に、α−トコフェロールに比べてトコトリエノールの方が、グルタミン酸誘導性変性に対するニューロン細胞の保護において著しく強力であることを示した。しかし、脳中の食餌性のトコトリエノールの有効性を示すインビボのデータは欠けていた。本研究は、妊娠中のＴＲＦの食餌的補充が、母親の脳および胎児の脳の双方の中におけるα−トコトリエノールの有意な向上につながることの、最初の証拠を提供する。食餌性のビタミンＥは腸内で吸収され、そしてリポタンパク質によって肝臓へ送達される。肝臓内で、α−トコフェロール画分はα−トコフェロール輸送タンパク質によって、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）に取り込まれ、次いで血流中に分泌される。最近の研究は、細胞選択性コレステリルエステルのリポタンパク質からの取り込みを媒介する、スカベンジャーレセプタークラスＢＩ型（ＳＲ−ＢＩ）が、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）から培養細胞へのα−トコフェロールの効果的な輸送を促進することを示す。さらに、ＳＲ−ＢＩ欠損変異マウスにおいて、コントロールの野生型動物に比較して、血漿中のα−トコフェロールレベルの顕著な上昇が見られ、このことは主に、変異マウスの異常に大きな血漿ＨＤＬ様粒子の、α−トコフェロール含量が上昇したことにほぼ起因した。器官および組織におけるトコトリエノールの取り込みおよび輸送の機構は、成人においてほとんど分かっておらず、胎児の組織においてはより一層分かっていない。
【００９５】
ＨＯ−３は、胎児の脳中で上方制御される、わずかなビタミンＥ感受性遺伝子の一つであった。ＨＯのアイソザイムである、ＨＯ−１、ＨＯ−２、ＨＯ−３は、ＮＯ合成酵素の酸化を含む、ヘム分子の異性体特異的酸化を触媒する公知の機能を有する、熱ショックタンパク質３２タンパク質の同族である。ＨＯ−１は高度に誘導性であるが、ＨＯ−２およびＨＯ−３は構成的に発現する。これらのタンパク質は、細胞性防御機構において中心的な役割を果たす。ＨＯ活性は、等モル量のＣＯ、ビリベルジン、および遊離の鉄の生成が原因である。ＨＯに関する最近の知見からは、これらのタンパク質が、ＮＯにとって細胞内の「吸い込み系」として役立ち得ることが示唆される。ＬＩＮＥ１は、別のビタミンＥ感受性転写物として同定された。ＬＩＮＥ−１、または分散型反復のＬ１ファミリーは、哺乳動物ゲノムの少なくとも１０％を占める。他の生物体のゲノム中の、他の分散性の反復ＤＮＡファミリーと同様にＬ１は、一連の重複的遺伝子転移現象によって、ゲノムに渡って分散され、そして増幅される。ゲノム中のＬ１配列のコピー数が大きいので、ほとんどの細胞のＲＮＡ集団において、Ｌ１は豊富に示される。しかし、Ｌ１を含むほとんどの転写物は偶然の転写の結果であり、Ｌ１のレトロ転移の中間体ではない。Ｌ１を含む転写物（その多くは切断され、そして再編成される）の、この高いバックグラウンドは、活性のＬ１エレメントにコードされた転写物の識別を困難にする。ＡｐｏＢ ｍＲＮＡは、Ｅ−胎児群に比較してＥ＋群においてより低かった一番上の候補の１つであった。ＡｐｏＢは、リポタンパク質の代謝の中で中心的な役割を果たし、そして血漿中で２種類のアイソフォーム、ａｐｏＢ−１００およびａｐｏＢ−４８、として存在する。高レベルのａｐｏＢおよびＬＤＬコレステロールは、冠状動脈心臓疾患の危険の増加に関連してきた。初期の研究から、ＴＲＦの投与（１００ｍｇ／日）が、血清のａｐｏＢを減少させることが示された。トコフェロールは、細胞中のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性を阻害することが示された。ＰＫＣ制御塩素イオンチャンネルは、Ｅ＋群において抑制された遺伝子の１つであった。
【００９６】
母親ラットおよび胎児ラットの脳中のトコフェロールのレベルを決定した。図９に参照されるように、妊娠中のラット（３日目）にランダムに、（ｉ）Ｅ＋群−α−トコフェロールが豊富である標準ラット飼料を与えた。加えてこの群に２週間の間、ビタミンＥを除去したトウモロコシ油に懸濁したＴＲＦを、毎日胃管栄養法によって補充した；および（ｉｉ）Ｅ−群−ビタミンＥの欠乏した食餌を与え、そしてビタミンＥを除去したトウモロコシ油を同体積補充した。妊娠１７日目に、脳を収集し、そしてＨＰＬＣを用いてビタミンＥ解析を行った。０．０５未満の＊Ｐは、Ｅ＋群と比較して顕著に異なることを意味する。０．０５未満の＃Ｐは、母親の脳と比較して顕著に異なることを意味する。ｎ．ｄ．は、検出されないことを意味する。胎児の脳中のα−トコフェロールレベルは、母親の脳中で観察されたα−トコフェロールレベルよりも複数倍低かった（図９Ａ）。Ｅ＋群と比較して、妊娠中わずか２週間ビタミンＥの欠乏した食餌を与えることは、成体の母親の脳中のα−トコフェロールレベルを顕著に低下させなかった。しかし、同様の条件下において、Ｅ−群の母親由来の胎児は、Ｅ＋群由来の胎児に比べて、顕著に低い脳中のα−トコフェロールレベルを有していた（図９Ａ）。
【００９７】
Ｅ−群の母親および胎児の脳中において、α−トコトリエノールは検出限界を下回った。妊娠中、母親に２週間ＴＲＦを経口補充したことは、母親および胎児の脳へのα−トコトリエノールの送達をもたらした。重要なことに、胎児の脳中のトコトリエノールの取り込みは、母親の脳中のトコトリエノールの取り込みに比べて、顕著に高かった（図９Ｂ）。興味深いことに、妊娠食中における短期間のビタミンＥ欠乏は、子供の生命的パラメーター（例えば、体重または一般的な健康）に影響を与えなかった（出願人の公開しない知見）。
【００９８】
（実施例８：トランスクリプトームプロファイリング）Ｅ＋群およびＥ−群由来の、発達中の胎児の脳のトランスクリプトームを、Ｕ３４Ａラットゲノム高密度オリゴヌクレオチドＧｅｎｅＣｈｉｐアレイを用いて比較した。このアレイは、約７０００の全長配列、および約１０００のＥＳＴ集団を解析する。双方の群から入手可能な全ての複製に由来する生のデータを用いて、全てで６つのペアワイズ比較（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）を生成した。異なる形で発現した全ての遺伝子の平均（６つのペアワイズ比較）倍数変化を計算した。データは、遺伝子の大部分は変化しないままであったことを示した（図１０）。ビタミンＥ−群に比較してビタミンＥ＋群において、全部で６４５遺伝子（７．３％）が上方制御された。その内４１６遺伝子が、２倍以上の規模に増加した。反対に１５２遺伝子（１．７％）が下方制御され、その内７４遺伝子が２倍以上低くなった（図１０）。本明細書中に記載したｔ−検定解析を用いると、ビタミンＥを補充された群に比べて、ビタミンＥを欠乏した群において、全部で１４４遺伝子が顕著に変化した（Ｐ＜０．０５）ことが観察された。ビタミンＥ感受性遺伝子の明らかな図示に対する中心の中央値に従って、データを調整した（図１１Ａ、Ｂ）。次に、ペアワイズ比較において一致が５０％を超えた遺伝子を、特にその遺伝子が重複したプローブセットで検出された場合に、選択した。データ解析のこのアプローチを用いて、Ｅ−群に比較してＥ＋群において、全部で１９プローブセットが上方制御されていることが分かり、そして３４プローブセットが抑制されていることが分かった（図１２および図１３）。図１２に参照されるのは、その母親が妊娠中の２週間にビタミンＥ＋の食餌およびビタミンＥ−の食餌を与えられた、個体の胎児から得られた脳についての６つペアワイズ比較。ペアワイズ比較において一致が５０％を超える遺伝子を、特にその遺伝子が重複したプローブセットで検出された場合に、選択した。説明が得られなかったＥＳＴは除いた。図１３に参照されるのは、その母親が妊娠中の２週間にビタミンＥ＋の食餌およびビタミンＥ−の食餌を与えられた、個体の胎児から得られた脳についての６つのペアワイズ比較。ペアワイズ比較において一致が５０％を超える遺伝子を、特にその遺伝子が重複したプローブセットで検出された場合に、選択した。説明が得られなかったＥＳＴは除いた。
【００９９】
（実施例９：ＲＴ−ＰＣＲを用いたＧｅｎｅＣｈｉｐデータの確認）ＧｅｎｅＣｈｉｐアプローチによって同定された、選択されたビタミンＥ感受性遺伝子を、従来の半定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて検証した（図１４）。図１４に参照されるように、発現レベルをＲＴ−ＰＣＲを用いて独立して決定した。ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ解析を用いて、Ｅ−群に比べてＥ＋群において異なる形で発現するとして同定された以下の遺伝子を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて検証した：ＨＯ−３、サイクリンＤ１、ＨＭＧ２、ＮＯＰＰ１４０、およびＧＡＰＤＨ。ＰＣＲ産物のバンド強度を定量化し、そしてそれぞれの遺伝子についての、Ｅ−群に比べたＥ＋群における倍数変化を計算した（塗りつぶした棒）。比較のために、ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ解析（１つ以上のプローブセット）を用いた特定の遺伝子の発現において観察された倍数変化もまたプロットした（中空の棒、および影付きの棒）。上方制御された遺伝子の内、ＨＯ−３を標的とする２つのプローブセットが、それぞれ３．９倍、および３．１倍に増加した（図１４）。反対に、マスピン（ｍａｓｐｉｎ）遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）遺伝子、およびＧタンパク質β１サブユニット（ｒＧｂ１）遺伝子の発現は、食餌性のビタミンＥに応じて高度に（３倍〜５倍）抑制された。ＰＣＲ産物のバンド強度を定量化し、そしてそれぞれの遺伝子についての、Ｅ−群に比べたＥ＋群における倍数変化を計算した。Ｅ＋群対Ｅ−群で上方制御された遺伝子について、ＧｅｎｅＣｈｉｐアプローチまたはＲＴ−ＰＣＲアプローチの双方を用いて、倍数変化が検出されたことを示すデータを比較した（図１４）。ＧＡＰＤＨについて、マイクロアレイデータおよびＲＴ−ＰＣＲデータの双方が、Ｅ−群に比べてＥ＋群において発現の減少を示した。しかし、ＧＡＰＤＨ発現の倍数変化は、ＲＴ−ＰＣＲデータに比べて、マイクロアレイデータにおいてより高かった（図１４）。
【０１００】
（実施例７〜９についての材料と方法）
妊娠した（３日）ラット（１０週齢；Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）をランダムに以下の２つの群に分けた：（ｉ）Ｅ＋群−α−トコフェロールが豊富な（約２００ｎｍｏｌ／ｇ食餌）、標準ラット飼料を与えた。加えて、この群は２週間の間、ビタミンＥを除去したトウモロコシ油（Ｈａｒｌａｎ）に懸濁したトコトリエノールの豊富な画分（ＴＲＦ）を、毎日の胃管栄養法によって補充した。妊娠したラットに、体重１ｋｇあたり、１ｇのＴＲＦを含む１１０ｍｇのα−トコフェロールおよび１１９ｍｇのα−トコトリエノールの混合物を与えた。ＴＲＦは、Ｃａｒｏｔｅｃｈ Ｓｄｎ Ｂｈｄ（Ｐｅｒａｋ、Ｍａｌａｙｓｉａ）から提供されるＴｏｃｏｍｉｎ（登録商標）５０％の形で提供した。；（ｉｉ）Ｅ−群−ビタミンＥの欠乏した食餌（ＴＤ８８１６３、Ｈａｒｌａｎ；α−トコフェロール／トコトリエノールのレベルは検出限界以下）を与え、そして同じ体積の、ビタミンＥを除去したトウモロコシ油を補充した。全てのラットを、２２±２℃で、１２時間：１２時間の暗所：明所サイクルでの標準条件下で維持した。全ての動物のプロトコールは、Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ、ＵＳＡのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＬＡＣＵＣ）によって承認された。サンプル収集。妊娠１７日目に、それぞれのラットの体重を記録した。ラットを殺した。母親の脳および胎児の脳を取り除き、ｐＨ７．４の氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、そして液体窒素中で急冷した。サンプルは−８０℃で短時間保存した。
【０１０１】
（ビタミンＥ抽出および解析）母親の脳および胎児の脳からのビタミンＥの抽出および解析を、ＨＰＬＣ電量分析電極アレイ検出器（１２チャンネル付きＣｏｕｌａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ − ｍｏｄｅｌ ５６００；ＥＳＡ Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、過去に記載されたように行った［１３］。このシステムは、異なる酸化還元電位に複数のチャンネルを用いる。α−トコフェロールおよびα−トコトリエノール、γ−トコフェロールおよびγ−トコトリエノール、ならびにδ−トコフェロールおよびδ−トコトリエノールを、それぞれ２００ｍＶ、３００ｍＶ、および４００ｍＶに設定したチャンネルで検出した。
【０１０２】
（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐプローブアレイ解析）液体Ｎ２中で胎児の脳を粉砕することで全ＲＮＡを抽出し、つづいて、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて抽出した［１４および１５］。ＲＮＡのさらなる洗浄を、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。過去に記載されたプロトコールに従って、マイクロアレイハイブリダイゼーションのために、標的を調製した［１４］。サンプルの品質を評価するために、サンプルをＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｔｅｓｔ−２アレイに、４５℃にて１６時間ハイブリダイズした。申し分のないサンプルを、Ｒａｔ Ｇｅｎｏｍｅアレイ（Ｕ３４Ａ）とハイブリダイズした。このアレイを洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで染色し、次いで本発明者らの施設のＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて走査した。
【０１０３】
生のデータを収集し、そしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ４．０（ＭＡＳ）ソフトウェアおよびＤａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ Ｔｏｏｌ ２．０（ＤＭＴ）ソフトウェアを用いて解析した。以下の２つのアプローチを、異なる形で発現した遺伝子を同定するために使用した：（ｉ）ＭＡＳにおける比較解析を用いて、Ｅ＋群およびＥ−群の双方の複製から、６つのペアワイズ比較を生成した。上方制御された遺伝子、または下方制御された遺伝子の双方について、平均倍数変化を計算した。ペアワイズ比較において一致が５０％を超える遺伝子を、特にその遺伝子が重複するプローブセットで検出された場合に、選択した；（ｉｉ）ＤＭＴを用いてＴ−検定を行い、そしてＥ−群と比較してＥ＋群において顕著に（Ｐ＜０．０５）変化した（増加または減少）遺伝子を選択した。選択した遺伝子の平均差分値を、Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ＴｒｅｅＶｉｅｗソフトウェアにロードした［１６］。ビタミンＥ感受性遺伝子の明らかな図示に対する中心の中央値に従って、データを調整した。
【０１０４】
（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ））ヘムオキシゲナーゼ３（ＨＯ−３）、サイクリンＤ１、高移動度群タンパク質２（ＨＭＧ２）、核リンタンパク質ｐ１３０（ＮＯＰＰ１４０）、およびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡの発現レベルを、過去に記載したように、ＲＴ−ＰＣＲを用いて独立に決定した［１７］。手短に言うと、全ＲＮＡ（１μｇ）を、オリゴ−ｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを用いて、ｃＤＮＡに転写した。ＲＴ−生成ｃＤＮＡを、表１に記載した遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応産物を、０．２５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲル中で、電気泳動した。このゲルを、紫外線徹照の条件下で、デジタル形式で画像化した。バンド強度の定量化を、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅソフトウェアに基づくＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行った。
表１．ＲＴ−ＰＣＲについて用いたプライマー
【０１０５】
【表２】
（実施例１０：トコトリエノール処方物＃２）
食餌あたりの量％ １日あたりの値
ビタミンＥ……………………………………９８．８ｉｕ ３２９％
混合トコフェロール
代表的な分配：
γ−トコフェロール………………………２１０．０ｍｇ
δ−トコフェロール…………………………７８．４ｍｇ
α−トコフェロール…………………………６６．３ｍｇ
β−トコフェロール……………………………３．５ｍｇ
Ｔｏｃｏｍｉｎ（登録商標）全範囲天然トコトリエノール複合体
代表的な分配：
γ−トコトリエノール………………………３５．５ｍｇ
α−トコトリエノール………………………１８．５ｍｇ
δ−トコトリエノール…………………………９．３ｍｇ。
【０１０６】
全ての特許、特許出願（および、その結果発行された任意の特許、および、対応する、公開された外国特許出願）、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の受入番号ならびに関連するデータ、そして本記載を通して言及された刊行物の開示は、これによって本明細書中に参考として援用される。しかし、本明細書中に参考として援用された任意の文書が、本発明を教え、または開示することは、明白に認められない。
【０１０７】
本明細書を通して与えられるあらゆる最大数的限界は、あらゆるより低い数的限界を含むことが理解されるべきであり、それは、このようなより低い数的限界が明白に本明細書中に記載されているかのようである。本明細書を通して与えられるあらゆる最低数的限界は、あらゆるより高い数的限界を含み、それは、このようなより高い数的限界が明白に本明細書中に記載されているかのようである。本明細書を通して与えられるあらゆる数的範囲は、このようなより広い数的範囲内に収まる、あらゆるより狭い数的範囲を含み、それは、このようなより狭い数的範囲が全て、明白に本明細書中に記載されているかのようである。
【０１０８】
対象の本発明の特定の実施形態が記載される一方で、対象の本発明の種々の変化および改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることが、当業者にとって明白である。加えて、本発明が、そのある特定の実施形態と結びついて記載された一方で、これは例示の手段であり、および限定の手段ではなく、そして本発明は、先行技術が許容する限り広く解釈されるべき、添付の請求項によって定義されることが理解されるべきである。
【０１０９】
本発明の他の実施形態は、本明細書の考慮、および本明細書中に開示された本発明の実行から、当業者に明白である。本発明の範囲および精神が添付の特許請求の範囲によって示されると共に、本明細書および実施例は例示的にのみ見なされることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
本明細書に取り込まれ、その一部を構成する、添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を例証し、そして記述と共に本発明の原理の説明に役立つ。
【図１】図１は、α−トコトリエノールによるニューロンの生存度の減少に対する保護を示す。
【図２−１】図２は、ラットの一次皮質ニューロンのグルタミン酸誘導性変性、およびα−トコトリエノールおよびＢＬ１５による保護の画像化を示す。
【図２−２】図２は、ラットの一次皮質ニューロンのグルタミン酸誘導性変性、およびα−トコトリエノールおよびＢＬ１５による保護の画像化を示す。
【図２−３】図２は、ラットの一次皮質ニューロンのグルタミン酸誘導性変性、およびα−トコトリエノールおよびＢＬ１５による保護の画像化を示す。
【図２−４】図２は、ラットの一次皮質ニューロンのグルタミン酸誘導性変性、およびα−トコトリエノールおよびＢＬ１５による保護の画像化を示す。
【図３】図３は、ＨＴ４および一次未成熟皮質ニューロン（Ｂ〜Ｄ）のグルタミン酸誘導性死に対する保護を与える１２−リポキシゲナーゼの薬理学的阻害を示す。
【図４】図４は、１２−リポキシゲナーゼノックアウトマウスから単離された一次未成熟皮質ニューロンが、グルタミン酸誘導性死に抵抗性であることを示す。
【図５】図５は、グルタミン酸処理したニューロン中の１２−リポキシゲナーゼ活性の生成物を示す。
【図６】図６は、１２−リポキシゲナーゼの効果：過剰発現、局在、およびα−トコトリエノールへの感度、を示す。
【図７】図７は、１２−リポキシゲナーゼおよびα−トコトリエノールのドッキング解析の三次元モデル化を示す。
【図８】図８は、トコトリエノールの、１２−ＬＯＸの活性からの心臓細胞の保護を示す。
【図９】胎児のラットの脳および母親のラットの脳中のビタミンＥレベル。
【図１０】Ｅ＋群およびＥ−群において異なる形で発現された遺伝子の平均倍数変化の範囲。
【図１１−１】Ｅ＋群の胎児の脳中で異なる形で発現された遺伝子を図示した集団イメージ。
【図１１−２】Ｅ＋群の胎児の脳中で区別をつけて発現された遺伝子を図示した集団イメージ。
【図１２】Ｅ＋群の胎児の脳中で上方制御された遺伝子。
【図１３】Ｅ＋群の胎児の脳中で下方制御された遺伝子。
【図１４】ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ発現解析のＲＴ−ＰＣＲ確認。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体中の１２−リポキシゲナーゼ媒介性細胞毒性を阻害するための方法であって、以下；
生物学的有効量のトコトリエノールを該被験体に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記被験体が、ニューロン損傷、心臓組織損傷、外皮損傷、筋肉組織損傷、またはそれらの組み合わせが進展する危険性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記トコトリエノールが、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノール、それらの誘導体、および１つ以上のそれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項４】
毎日投与される前記トコトリエノール組成物の量が約６００ｍｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が実質的にトコフェロールを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
傷害を被る被験体を処置するための方法であって、以下；
該被験体に、生物学的有効量のトコトリエノールを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項７】
前記傷害が脳卒中である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記傷害が心臓の傷害である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
癌の予防または処置のための治療養生法であって、癌の予防または処置を必要とする被験体に、トコトリエノールおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬理学的有効量の薬学的処方物を投与する工程を包含する、治療養生法。
【請求項１０】
前記被験体が黒色腫が進展する危険性がある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
胎児のニューロンを保護するための方法であって、該胎児を妊娠している妊娠中の女性に、少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
ヒト被験体の脳中のトコトリエノール濃度を高めるための方法であって、該被験体に、少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項１３】
前記組成物が実質的にトコフェロールを含まず、そしてトコフェロールを含む食品または補助食品なしで投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、前記ヒトがトコフェロールを含む食品または補助食品を摂取する少なくとも１時間半後、および少なくとも１時間半前に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物がＴｏｃｏｍｉｎ（登録商標）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の方法であって、前記ヒト被験体が乳児であり、そして前記組成物が、少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を投与された女性から得られる乳または乳抽出物である、方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の方法であって、前記トコトリエノールが、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノール、それらの誘導体、および１つ以上のそれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
毎日投与される前記トコトリエノール組成物の量が、約６００ｍｇである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
受胎能を必要とする動物において受胎能を改善するための方法であって、該動物に、少なくとも１種のトコトリエノールの有効量を、毎日少なくとも２ヶ月間投与する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
毎日投与される前記トコトリエノール組成物の量が、約６００ｍｇである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験体における、前記トコフェロール輸送タンパク質をコードする遺伝子の発現が妨げられる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
培養物中のニューロンを維持するための方法であって、該ニューロンを、少なくとも１種のトコトリエノールを含む培地に接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１】
被験体中の１２−リポキシゲナーゼ媒介性細胞毒性を阻害するための方法であって、以下；
生物学的有効量のトコトリエノールを該被験体に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記被験体が、ニューロン損傷、心臓組織損傷、外皮損傷、筋肉組織損傷、またはそれらの組み合わせが進展する危険性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記トコトリエノールが、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノール、それらの誘導体、および１つ以上のそれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項４】
毎日投与される前記トコトリエノール組成物の量が約６００ｍｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が実質的にトコフェロールを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
傷害を被る被験体を処置するための方法であって、以下；
該被験体に、生物学的有効量のトコトリエノールを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項７】
前記傷害が脳卒中である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記傷害が心臓の傷害である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
癌の予防または処置のための治療養生法であって、癌の予防または処置を必要とする被験体に、トコトリエノールおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬理学的有効量の薬学的処方物を投与する工程を包含する、治療養生法。
【請求項１０】
前記被験体が黒色腫が進展する危険性がある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
胎児のニューロンを保護するための方法であって、該胎児を妊娠している妊娠中の女性に、少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
ヒト被験体の脳中のトコトリエノール濃度を高めるための方法であって、該被験体に、少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項１３】
前記組成物が実質的にトコフェロールを含まず、そしてトコフェロールを含む食品または補助食品なしで投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、前記ヒトがトコフェロールを含む食品または補助食品を摂取する少なくとも１時間半後、および少なくとも１時間半前に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物がＴｏｃｏｍｉｎ（登録商標）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の方法であって、前記ヒト被験体が乳児であり、そして前記組成物が、少なくとも１種のトコトリエノールを含む組成物を投与された女性から得られる乳または乳抽出物である、方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の方法であって、前記トコトリエノールが、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノール、それらの誘導体、および１つ以上のそれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
毎日投与される前記トコトリエノール組成物の量が、約６００ｍｇである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
受胎能を必要とする動物において受胎能を改善するための方法であって、該動物に、少なくとも１種のトコトリエノールの有効量を、毎日少なくとも２ヶ月間投与する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
毎日投与される前記トコトリエノール組成物の量が、約６００ｍｇである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験体における、前記トコフェロール輸送タンパク質をコードする遺伝子の発現が妨げられる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
培養物中のニューロンを維持するための方法であって、該ニューロンを、少なくとも１種のトコトリエノールを含む培地に接触させる工程を包含する、方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図７】
【図８】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５０１８４６（Ｐ２００７−５０１８４６Ａ）
【公表日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２３２７２（Ｐ２００６−５２３２７２）
【出願日】平成１６年８月９日（２００４．８．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２５７２５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１３９１１
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０４３２５２８７）ザ オハイオ ステート ユニバーシティー リサーチ ファウンデーション (24)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月９日（２００４．８．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２５７２５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１３９１１
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０４３２５２８７）ザ オハイオ ステート ユニバーシティー リサーチ ファウンデーション (24)
【Ｆターム（参考）】
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