植物におけるアポリポタンパク質の産生法について記載する。1つの態様では本発明は、以下の段階を含む、植物におけるアポリポタンパク質の発現法を提供する：（a）使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に（i）植物細胞における発現を制御可能である核酸配列；および（ii）アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階；（b）キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階；ならびに植物細胞を、アポリポタンパク質を発現する種子をつけることが可能な成熟植物体に成長させる段階。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、植物におけるアポリポタンパク質の発現法：
（a）使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に（i）植物細胞における発現を制御可能である核酸配列；および（ii）アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階；
（b）キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階；ならびに
（c）植物細胞を、アポリポタンパク質を発現する成熟植物体に成長させる段階。
【請求項２】
核ゲノムへの組込み条件でキメラ核酸配列を植物細胞に導入する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
植物細胞が種子の細胞である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
植物細胞における発現を制御可能である核酸配列が、種子に好ましいプロモーターである、請求項1、2、または3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
種子に好ましいプロモーターがファゼオリンプロモーターである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
植物細胞における発現を制御可能である核酸配列が構成的プロモーターである、請求項1または2記載の方法。
【請求項７】
構成的プロモーターがユビキチンプロモーターである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
キメラ核酸コンストラクトが、アポリポタンパク質をコードする核酸配列と読み枠で連結された安定化ポリペプチドをコードする核酸配列を追加的に含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
安定化ポリペプチドが植物に特異的である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
安定化ポリペプチドが植物に特異的でない、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
植物に特異的な安定化ポリペプチドが、油体タンパク質、またはチオレドキシンもしくはこの断片である、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
油体タンパク質が、オレオシン、カレオシン（caleosin）、およびステロレオシン（steroleosin）からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
オレオシン、カレオシン、およびステロレオシンがシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に由来する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
チオレドキシンがSEQ ID NO：56である、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
植物に特異的でない安定化ポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質、または1本鎖抗体もしくはこの断片である、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
植物に特異的でない安定化ポリペプチドが、植物における最適な発現に最適化されたコドンである、請求項10記載の方法。
【請求項１７】
緑色蛍光タンパク質がSEQ ID NO：57である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
1本鎖抗体が、種子で発現されるアポリポタンパク質の精製を促進可能である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
1本鎖抗体が油体タンパク質と特異的に結合可能である、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
1本鎖抗体が、シロイヌナズナの18 kDaオレオシンと特異的に結合可能な1本鎖Fv抗体（D9scFv）である、請求項15記載の方法。
【請求項２１】
1本鎖抗体がSEQ ID NO：240である、請求項15記載の方法。
【請求項２２】
安定化ポリペプチドが、切断可能なリンカーを介してアポリポタンパク質に連結されている、請求項8記載の方法。
【請求項２３】
切断可能なリンカーが、キモシンのプロ配列である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
キモシンのプロ配列がSEQ ID NO：143である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
キメラ核酸配列が、アポリポタンパク質の、ERまたはER由来の貯蔵小胞への標的化可能とする標的化シグナルをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
ER由来の貯蔵小胞が油体であり、かつ標的化配列が油体タンパク質をコードする、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
標的化シグナルが、C末端にER保持モチーフを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
C末端のER保持モチーフがKDELである、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
キメラ核酸コンストラクトが、アポリポタンパク質のポリペプチドのアポプラストへの標的化を可能とするシグナルペプチドをコードする核酸配列を追加的に含む、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
シグナルペプチドがタバコの感染特異的タンパク質（PR-S）のシグナル配列である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
PR-Sのシグナル配列がSEQ ID NO：58である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
アポリポタンパク質をコードする核酸配列が、ヒトのアポリポタンパク質、ヒトのプロアポリポタンパク質、ブタのアポリポタンパク質、ブタのプロアポリポタンパク質、ウシのアポリポタンパク質、およびウシのプロアポリポタンパク質からなる核酸配列の群より選択される、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
アポリポタンパク質をコードする核酸配列が、植物のコドン使用に最適化されている、請求項1〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
以下の段階を含む、アポリポタンパク質を含む植物の種子を得る方法：
（a）使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に（i）植物の種子の細胞における発現を制御可能である核酸配列；および（ii）アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階；
（b）キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階；
（c）植物細胞を成熟植物体に成長させ；かつ種子がアポリポタンパク質を含む植物体から組織を得る段階；ならびに
（d）植物体から、アポリポタンパク質を含む種子を得る段階。
【請求項３５】
5'→3'の転写方向に以下を含むキメラ核酸配列を含む植物体：
（a）（b）に使用可能に連結された、植物における発現を制御可能な第1の核酸配列；
（b）亜ポリ歩タンパク質を含むアポリポタンパク質のポリペプチドをコードする第2の核酸配列。
【請求項３６】
キメラ核酸配列が植物の核ゲノムに組込まれている、請求項35記載の植物体。
【請求項３７】
使用する植物体がシロイヌナズナまたはベニバナの植物体である、請求項1〜36のいずれか一項記載の植物体。
【請求項３８】
5'→3'の転写方向に以下を含むキメラ核酸配列を含む植物の種子：
（a）（b）に使用可能に連結された、植物の種子における発現を制御可能な第1の核酸配列；
（b）アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする第2の核酸配列。
【請求項３９】
植物から得られるアポリポタンパク質を含む実質的に純粋な油体を含む組成物。
【請求項４０】
植物細胞における発現を制御可能な核酸を含む核酸配列に連結された、アポリポタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項４１】
植物細胞が種子の細胞である、請求項40記載の核酸配列。
【請求項４２】
植物細胞における発現を制御可能である核酸配列が、種子に好ましいプロモーターである、請求項41記載の核酸配列。
【請求項４３】
種子に好ましいプロモーターがファゼオリンプロモーターである、請求項43記載の核酸。
【請求項４４】
植物の種子における発現を制御可能である核酸配列が構成的プロモーターである、請求項43記載の核酸配列。
【請求項４５】
プロモーターがユビキチンプロモーターである、請求項44記載の核酸配列。
【請求項４６】
請求項1〜45のいずれか一項記載の核酸配列を含む、植物細胞における発現に適切な組換え発現ベクター。
【請求項４７】
以下の段階を含む、実質的に純粋なアポリポタンパク質を調製する方法：
（a）使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に（i）植物の種子の細胞における発現を制御可能である核酸配列；および（ii）アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階；
（b）キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階；
（c）植物細胞を成熟植物体に成長させる段階；および
（d）アポリポタンパク質を含む種子を植物体から得る段階；ならびに
（e）実質的に純粋なアポリポタンパク質を得るために、アポリポタンパク質を植物の種子の成分から分離する段階。
【請求項４８】
本質的に純粋なアポリポタンパク質を得るために、請求項1〜38のいずれか一項記載の調製された植物の使用。
【請求項４９】
植物体から得られる実質的に純粋なアポリポタンパク質を含む組成物。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図６】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５Ａ】

【図４５Ｂ】

【図４５Ｃ】

【図４５Ｄ】

【公表番号】特表２００７−５１０４２０（Ｐ２００７−５１０４２０Ａ）
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３８６２２（Ｐ２００６−５３８６２２）
【出願日】平成１６年１１月１５日（２００４．１１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００４／００１９６０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４７４５５
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【出願人】（５０２４５２８０８）セムバイオシス　ジェネティクス　インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】