トリインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２に対する新規な抗ウイルスペプチド
本発明は、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）に結合する融合ペプチドを保有する組換えファージに関する。このようなファージは、ウイルス上の結合部位に対して後者の抗体と競合することができるので、ファージは抗−ＡＩＶ抗体に代わる診断用試薬として有用である。直鎖状又は環状の立体配置のいずれかの、配列ＣＮＤＦＲＳＫＴＣを有する合成ペプチド、又は上記の前記ペプチドを保有する融合ファージは、孵化卵及びＭＤＣＫ細胞系においてＡＩＶ増殖を阻害した。したがって、これらはトリインフルエンザウイルスによって引き起こされるバードフルをコントロールし、治療し、根絶するための治療薬として用いられ得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）サブタイプＨ９Ｎ２に対して作用する、新規な抗ウイルスペプチド及び融合ファージに関する。より詳しくは、融合ファージは、ＡＩＶ Ｈ９Ｎ２に結合するその表面タンパク質Ｐ３上に配列ＣＮＤＦＲＳＫＴＣをディスプレイし、ＩＣ５０値は１０１３ｐｆｕ／１００μｌ未満である。直鎖状又は環状の立体配座のいずれかにおけるアミノ酸配列ＣＮＤＦＲＳＫＴＣを有する合成ペプチドは、約１００μＭ未満のＩＣ５０値でＡＩＶ Ｈ９Ｎ２の増殖を阻害した。
【背景技術】
【０００２】
トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）は、インフルエンザＡ及びＢ、並びにインフルエンザＣである２つの属を含んでいるオルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する（Ｌａｍｂ及びＫｒｕｇ、１９９６年）。これらのウイルスは、世界の家禽の間の罹患及び死滅の主たる原因である。これは一般用語でバードフル（ｂｉｒｄ ｆｌｕ）と呼ばれる最も危険な疾患の原因物質である（Ｗｅｂｓｔｅｒら、１９９２年）。これらのウイルスはヒトには感染しないが、ヒトの感染及び大流行の例はいくつか報告されている（ＣＤＣ、２００８年；Ｎｏｒｍｉｌｅ、２００４年；Ｐａｒｒｙ、２００４年）。インフルエンザＡウイルスは、脂質二重層で覆われており、８個の一本鎖の、分節化された、ネガティブ鎖のＲＮＡを含んでいる。ビリオンの表面上に存在する２個の糖タンパク質、すなわちヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）、並びに１個のイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）が存在する。これらの糖タンパク質はインフルエンザウイルスの主要な抗原決定基である。ＨＡタンパク質は、ウイルス感染における最初のステップを開始し、これは宿主細胞表面のシアル酸受容体へのウイルスの付着を伴う（Ｌａｍｂ及びＫｒｕｇ、１９９６年）。ＮＡタンパク質は、宿主細胞からの成熟ビリオンの放出に関与する（Ｐａｌｅｓｅら、１９７４年）。したがって、ウイルス−宿主の相互作用を研究するために、及びこのプロセスを阻害する分子を同定するためにも、特定のペプチド配列をディスプレイするバクテリオファージが、ファージディスプレイライブラリーを用いてトリインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２系統に対するその親和性によって選択された。
【０００３】
インフルエンザウイルスの感染を防ぐための好ましい主要な戦略は、感受性の集団間に毎年ワクチン接種をすることである。しかし、疾患及び伝播をコントロールするための包括的な取組みにおいて、抗ウイルス薬は重要な役割を果たしている（Ｈａｙｄｅｎ、２００６年）。治療及び予防のために認可されている２つのクラスの抗ウイルス薬が存在する。これらはアダマンタン誘導体（アマンタジン及びリマンタジン）、並びにノイラミニダーゼ阻害薬（ＮＡＩ；ザナミビル及びオセルタミビル）である。（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、２００３年）。これらアダマンタン誘導体は、インフルエンザＡウイルスのＭ２イオンチャネルタンパク質に結合し、その機能を阻止することによって作用し、それによって宿主細胞内でのウイルスの複製を防ぐ（Ｗａｎｇら、１９９３年）。Ｍ２タンパク質における単一の点突然変異により、アダマンタン耐性系統が出現している（Ｈａｙら、１９８６年）。これらの耐性ウイルスは、通常完全に病原性があり、伝染性である（Ｈａｙｄｅｎ、２００６年）。ＮＡＩはノイラミニダーゼタンパク質の酵素活性を阻害し、感染した宿主細胞からのウイルスの放出を防ぐ。しかし、ＮＡの活性部位における突然変異により、ＮＡＩ耐性系統も出現している（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、２００３年）。インフルエンザＡウイルスによる、両タイプの薬物に対する耐性の増大は、新規な薬物を同定する我々の必要性を強調するものである。
【０００４】
伝統的に、植物、海洋生物、真菌、又は他の微生物から得られた天然生成物からの化合物が、抗微生物薬又は抗ウイルス薬を同定するのに用いられる。最近、ファージディスプレイライブラリーなどのコンビナトリアルペプチドライブラリーが、同じ目的でペプチド化合物を同定するのにますます用いられている（Ｄｏｏｒｂａｒら、１９９４年）。バクテリオファージ上にディスプレイされるペプチドの広範な構造上の多様性により、ファージディスプレイライブラリーは、とりわけ特定の標的と相互作用する特定のリガンドの同定において、タンパク質タンパク質相互作用を研究するための重要なツールとなっている（Ｄｅｖｌｉｎら、１９９０年）。標的分子と相互作用する化合物がファージライブラリーから選択され、次いでスクリーニングのプロセスを用いて標的に対して機能的な効果を有するリード化合物が同定される。次いで、これらのリード化合物をその活性に対して最適化し、次いで候補の薬物が臨床試験に入る。
【０００５】
本発明者らは環状ペプチドのファージディスプレイライブラリーを用いて、インフルエンザＡウイルスＨ９Ｎ２と相互作用するペプチド分子を同定し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び卵内でその抗ウイルス活性を証明した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の一目的は、トリインフルエンザウイルスＡ Ｈ９Ｎ２に対する抗ウイルス活性を有する新規なペプチド及び融合ファージを提供することである。
【０００７】
本発明の別の一目的は、本発明による組換えファージ又は合成ペプチドを含む薬剤組成物を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに別の一目的は、本発明による組換えファージ又は合成ペプチドを含む診断用試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これらの目的は、トリインフルエンザウイルスＡ Ｈ９Ｎ２に結合し、ウイルスの増殖を阻害する融合ファージに由来する融合ペプチド又は合成ペプチドを保有する、単離され、精製された組換えファージによって達成される。
【００１０】
新規な抗ウイルス分子を同定するために、ジスルフィド拘束ランダムヘプタペプチド配列をディスプレイする組換えファージの集団を、ウイルスに対してスクリーニングした。次いで、融合ファージの表面上にディスプレイされたペプチドを、化学的に合成した。この単離されたペプチドはＮＤＦＲＳＫＴの配列を有し、ＩＣ５０値は１００〜Ｍ未満である。インフルエンザウイルスＡ Ｈ９Ｎ２に対する組換えファージの特異性は、抗体−ファージ競合アッセイによって証明され、このアッセイにおいてファージは、ウイルス表面タンパク質上の結合部位に対してポリクローナル抗体と競合することが可能であった。
【００１１】
本発明において、単離された配列の１つをベースにした合成ペプチドは、直鎖状又は環状の立体配置のいずれかにおいて（例えば合成ペプチドＣＮＤＦＲＳＫＴＣなど）、ＮＤＶの増殖を阻害することができ、それによって疾患及び感染の伝播を防ぐ。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
表１ ＡＩＶ Ｈ９Ｎ２に対する３ラウンドのバイオパニングから得たヘプタペプチド配列を示す表である。
表２ 合成ペプチド及び融合ファージの赤血球凝集阻害活性を示す表である。
【図１】特定のヘプタペプチド配列を保有する組換えファージとＡＩＶ Ｈ９Ｎ２に対するポリクローナル抗体との間の競合の結果を示す図である。
【図２】卵内の合成ペプチドでのＡＩＶ増殖の阻害を示す図である。
【図３】卵内の融合ファージでのＡＩＶ増殖の阻害を示す図である。
【図４】ｉｎ ｖｉｔｒｏの融合ファージでのＡＩＶ増殖の阻害を示す図である。
【図５】ｉｎ ｖｉｔｒｏのウイルス複製に対する融合ファージの効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（図及び表の詳細な説明）
表１は、ＡＩＶに対する４ラウンドのバイオパニングから得られたヘプタペプチド配列を示すものである。４ラウンドの選択及び増幅後、第２、第３、及び第４ラウンドから、それぞれ２０個、３５個、及び３５個の個々のクローンが配列決定された。
【００１４】
表２は、トリインフルエンザＨ９Ｎ２のヘマグルチネーション（ｈａｅｒｎａｇｇｌｕｔｉ ｎａｔｉｏｎ）活性に対する環状及び直鎖状ペプチドの阻害能力を示すものである。実験を３回繰り返して行った。＋の存在下、−の非存在下。
【００１５】
図１は、特定のヘプタペプチド配列を保有する組換えファージとＡＩＶに対するポリクローナル抗体との間の競合の結果を示すものである。ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）は融合ファージのＡＩＶとの会合を阻害し、ファージは抗体とある程度共通の結合部位を共有し得ることを示唆している。実験を３回繰り返して行い、エラーバーは平均の標準偏差を表す。シリーズ１−融合ファージ、シリーズ２−融合ファージとポリクローナル抗体。
【００１６】
図２は、ＡＩＶ Ｈ９Ｎ２増殖に対する卵内の合成ペプチドのＩＣ５０値の決定の結果を示すものである。ウイルスの成長の５０％を阻害するのに必要とされるペプチドの濃度を、様々な濃度のペプチドを用いて決定した。実験を３回繰り返して行い、エラーバーは平均の標準偏差を表す。
【００１７】
図３は、卵内のＡＩＶ Ｈ９Ｎ２ウイルス増殖に対する融合ファージＦＰ−Ｐ１のＩＣ５０値の結果を示すものである。実験を３回繰り返して行い、エラーバーは平均の標準偏差を表す。シリーズ１−融合ファージＦＰ−Ｐ１；シリーズ２−対照としての野生ファージ。
【００１８】
図４はｉｎ ｖｉｔｒｏの融合ファージＦＰ−Ｐ１の抗ウイルス活性の結果を示すものである。実験を３回繰り返して行い、エラーバーは平均の標準偏差を表す。シリーズ１−ＦＰ−Ｐ１；シリーズ２−対照としての野生ファージＭ１３。
【００１９】
図５は、ウイルス複製に対する融合ファージＦＰ−Ｐ１の効果の結果を示すものである。ＭＤＣＫ細胞に非処理の（０値）、又はＦＰ−ＰＩ処理したウイルスを接種し、ウイルス力価を上清７２ｈｐｉに対して決定した。シリーズ１−ＦＰ−Ｐ１；シリーズ２−対照としての野生ファージＭ１３。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載する記述は、様々なセクションに分割される以下の発明を実施するための形態とともにより完全に理解されよう。本発明に用いられる材料及び方法は、実施例において述べる。例１から５までは、本発明の必要条件である従来の材料及び方法である。
【００２１】
ファージディスプレイ技術の原理
ファージディスプレイ技術において、コートタンパク質をコードする遺伝子中に合成オリゴヌクレオチドを挿入することによって、ランダムペプチドが、通常、融合タンパク質としてバクテリオファージ分子の表面上にディスプレイされる。これら組換えファージの収集物はファージディスプレイライブラリーとして知られており、バイオパニングとして知られるｉｎ ｖｉｔｒｏの選択手順によって、標的に対する莫大な数のペプチド配列のスクリーニングが可能になっている（Ｐａｒｍｌｅｙら、１９８８年、及びＳｍｉｔｈら、１９９３年）。本発明において、用いた標的は、ＡＩＶ Ｈ９Ｎ２ウイルス粒子全体であり、用いたライブラリーは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から入手したジスルフィド拘束ライブラリーであった。この特定のライブラリーにおいて、ディスプレイされたペプチド分子に、ファージＭ１３のｇｐＩＩＩタンパク質に対するシステイン残基が隣接している。このシステイン残基が、還元剤の非存在下、ペプチドが固定の環状の形状を達成するのを助ける。このジスルフィド拘束ライブラリーは、その相互作用成分（天然のリガンド）が不連続の結合部位（配座エピトープ）を有する標的に有用であり（Ｈｏｅｓｓら、１９９４年）、結合部位では、アミノ酸がポリペプチドにおける様々な位置から運ばれて本質的な接触領域を形成する。その上、ジスルフィド拘束環状ペプチドライブラリーは、直鎖状ペプチドライブラリーよりもむしろ、高親和性リガンドを選択するのにより有用である（Ｏ’Ｎｅｉｌら、１９９２年；Ｇｈｏら、１９９７年）。
【００２２】
ＡＩＶに結合するペプチドの親和性選択
トリインフルエンザウイルスは、２種の表面糖タンパク質、すなわちヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含んでおり、これらは宿主細胞内へのウイルスの侵入、及び宿主細胞からのウイルスの退出を担っている。したがって、本発明者らは、表面タンパク質に結合する立体配置のリガンドを選択するためのウイルス粒子全体に対するジスルフィド拘束ライブラリーを用いることに決定した。図１は、これらのリガンドの選択に関与する主なステップを概要したものである。第１に、ウイルス粒子全体を、高結合性のマイクロタイタープレートウエルの表面に直接付着させた。次いで、ライブラリーをウエル中に加えて、組換えファージ粒子をウイルス粒子と結合させた。非結合のファージを洗い流し、結合しているファージを低ｐＨで溶出した。次いで、溶出したファージを、細菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で増幅し、増幅したファージを第２ラウンドのバイオパニングにおいて用いた。この手順を４回繰り返した。アフィニティ選択及び増幅を連続４ラウンド行った後、サブセットの選択されたファージを個々に成長させ、コア粒子に結合するペプチドのタイルアイデンティティ（ｔｉｌｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を、挿入を保有するタイル（ｔｉｌｅ）ｇｐＩＩＩ遺伝子を配列決定することによって得た。
【００２３】
高親和性の結合ファージを選択するために、選択のストリンジェンシーを、（ｉ）室温（２８℃）でバイオパニングを行い、（ｉｉ）速度に対して速いリガンドを選択するために結合の時間を１時間に短縮し（Ｋ０）、（ｉｉｉ）ウエルを徹底的に洗浄して（１０回）低親和性の結合ファージを除去し、（ｉｖ）バイオパニングを４ラウンド繰り返して高親和性結合クローンを濃縮することによって増大させた。第４ラウンドのパニングから分析されたファージの４７％は、融合ペプチド配列ＮＤＦＲＳＫＴを保有しており、１０．５％がＱＨＳＴＫＷＦモチーフを含んでおり、その後に各５％のＬＰＹＡＡＫＨ及びＩＬＧＤＫＶＧ、並びに他の非関連の配列が続く（表１）。ストレプトアビジン標的を、クローン全てにおいてＨＰＱ配列のコンセンサスモチーフを与える陽性対照として用いたが、これはＤｅｖｌｉｎら（１９９０年）によって報告されたものと良好に一致した。陰性対照として用いられたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）では、認識できるコンセンサス配列は観察されなかった。
【００２４】
本明細書で用いられる「融合ペプチド」の語は、一般的にバクテリオファージによってコードされ、ファージのコートタンパク質に物理的に連結しているアミノ酸配列を意味する。特許請求の融合ペプチドは、アミノ酸配列ＮＤＦＲＳＫＴ：（ｉ）特許請求のアミノ酸配列よりも短く、又は長いアミノ酸配列、（ｉｉ）アミノ酸配列における変形、とりわけ以下に記載するのと同じカテゴリー内のアミノ酸の置換、（ｉｉｉ）特許請求の融合ペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０％のホモロジーを共有するアミノ酸配列、及び（ｉｖ）直鎖状又は限定立体配置のいずれかを含んでいるが、これらに限定されない。
【００２５】
ＡＩＶは２種の表面糖タンパク質ＨＡ及びＮＡを所有し、これらはウイルスの脂質二重層膜から突出している。これらの糖タンパク質はそれぞれ宿主細胞内及び宿主細胞外へのウイルスの侵入及びウイルスの放出に不可欠である。配列ＮＤＦＲＳＫＴを保有するファージは溶液中のビリオンに結合するので、これらの配列は、ある程度、完全なビリオンと相互作用する宿主細胞の受容体上の領域に類似することがある。
【００２６】
ファージはＡＩＶ上の結合部位に対して抗体と競合する
表面糖タンパク質ＨＡ及びＮＡは、宿主における抗体の生成を誘発する２つの重要なタンパク質である。ファージ−抗体競合アッセイにおいて、ファージはミモトープの１つに結合することができ、したがってビリオンに対して産生された抗体の結合を阻害することができた。図１は、バイオパニング実験から選択された、ペプチドＮＤＦＲＳＫＴをディスプレイする組換えファージが、ＡＩＶ上の結合部位に対して抗体と競合できたことを示している。抗体の存在下、ウイルスでコーティングされたウエルに結合したファージの数は、ウイルス上の同じ結合部位に対するこれら２つの分子間の競合の結果として劇的に低下した。したがって、組換えファージ分子は、ＡＩＶ感染に対する潜在的な診断薬として働き得る。
【００２７】
卵内の合成ペプチド及び融合ファージの抗ウイルス活性
ＡＩＶは、孵化鶏卵の尿膜腔液中で容易に増殖させることができる。したがって、ウイルス及び増殖系により、ｉｎ ｖｉｖｏで特定の化合物又はペプチドの抗ウイルス活性を直接評価するための簡単なモデルが提供される。抗ウイルス化合物処理の前及び後に尿膜腔液中に存在するウイルスの量を、赤血球凝集力価によって決定する。環状又は直鎖状の形態いずれかの特許請求のペプチド、及びペプチドをディスプレイする融合ファージの注射により、尿膜腔液中のＡＩＶ力価は低減した（図２及び３）。環状ペプチドは、直鎖状ペプチドに対するよりも１００μＭ低いペプチド濃度でより高いＩＣ５０値を示した。さらに、環化により、エキソペプチダーゼによるペプチドの消化を避けることができる。このように、疾患を治療する、コントロールする、又は根絶するための治療薬として、本明細書において特許請求する合成ペプチドを用いることができる。
【００２８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの融合ファージの抗ウイルス活性
ＭＤＣＫ細胞系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのトリインフルエンザウイルスの増殖のための有効な媒体である。ウイルス増加に対する融合ファージのｉｎ ｖｉｔｒｏの抗ウイルス性質を、これらの細胞系において調べた。融合ファージ分子で処理する前及び後に、ウイルス複製の阻害を細胞の生存性によって間接的に調べた。細胞の生存性は、ファージ処理したウイルスに感染した後、非処理のウイルスに対して２倍近く増大した（図４）。ウイルス力価における低下を、上清の赤血球凝集試験によってさらに確認した（図５）。この実験により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで融合ファージ分子の抗ウイルス性質が証明された。
【実施例】
【００２９】
（例１）
ＡＩＶの増殖及び精製
増殖及び精製の方法は、それぞれＢｌａｓｋｏｖｉｋ及びＳｔｙｋ（１９６７年）、並びにＹｕｓｏｆｆら（１９９６年）から適用され、改変された。ＡＩＶサブタイプＨ９Ｎ２を、９日齢の特定の病原体フリーの孵化鶏卵中に注射した。３７℃でインキュベートして３日後、尿膜腔液を回収し、遠心分離（３０分、３５０００×ｇ、４℃）によって透明にした。透明にした上清から３０％〜６０％ショ糖勾配の超遠心（３．５時間、２８５０００×ｇ、４℃）によってウイルスを精製し、以下の試験に用いた。
【００３０】
（例２）
精製したＡＩＶのバイオパニング
ウイルスのタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（１９７６年）を用いて測定した。ＡＩＶ（１５μｇ／ｍｌ）をマイクロタイタープレートウエル上にコーティングした［Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ９．６）］。ストレプトアビジン及びＢＳＡを、それぞれ陽性対照及び陰性対照として用いた。実験は室温（約２５℃）で行った。ジスルフィド拘束７量体ファージディスプレイライブラリー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）からのファージを、ＴＢＳ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１１０μｌ］中Ｉ×１０１１ｐｆｕに希釈し、コーティングした各ウエル中に加えた。混合物を３０分間インキュベートした。ウエルをＴＢＳＴ ＪＢＳ＋０．１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ−２０で洗浄した。結合したファージをグリシン−ＨＣｌ［０．１Ｍ（ｐＨ２．２）；１００μｌ］で７〜８分間穏やかに揺り動かすことによって溶出し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［１Ｍ（ｐＨ９）；１１５μｌ］で中和した。産出量のｐｆｕを、溶出物（１０μｌ）を滴定することによって決定し、残りの溶出物を、３７℃で大腸菌系統ＥＲ２７３８（Ｆ’ＩａｃｌｑΔ（ＩａｃＺ）Ｍ）５ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ｚｚｆ：：ＴｎＩＯ（ＴｅｔＲ）／ｆｈｕＡ２ｓｕｐＥ ｔｈｉ Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Δ（ｈｓｄＭＳ−ｍｃｒＢ）５（ｒｋ−ｍｋ−ＭｃｒＢＣ−）｝中で増幅し、５時間振盪した。パニングのプロセスをさらなる３ラウンド繰り返した。
【００３１】
（例３）
ファージ滴定
ファージ滴定法を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）から適用した。
【００３２】
（例４）
選択されたファージの配列決定
４ラウンドのパニング全てからの単一のプラークを（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）ＬＢ平板（産出量の滴定において使用）から選択し、ＬＢ培地中成長させた。ファージの一本鎖ＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）によって記載されている通りに抽出した。挿入物の配列決定を、Ｆｉｒｓｔ Ｂａｓｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｄｎ Ｂｈｄ、クアラルンプールによるＡＢＩ自動化シーケンサーを用いて行った。
【００３３】
（例５）
抗体競合アッセイ
ウエルをＡＩＶ（１５μｇ／ｍｌ）でコーティングし、ＡＩＶに対して産生されたポリクローナル抗体（１：５００希釈；１００μｌ）を、一連の異なるファージ濃度で（１０９〜１０１３ｐｆｕ；１００μｌ）加えた。混合物を１時間インキュベートし、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水−Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）で６回洗浄した。結合しているファージを溶出し、上記に記載した通りに滴定した。
【００３４】
（例６）
卵内のＡＩＶ増殖の阻害におけるペプチド及び融合ファージのＩＣ５０の決定
９日齢の孵化鶏卵に、ＡＩＶ１００μｌ（８ＨＡ単位）、及び等体積の様々な濃度のペプチド（０．１μＭ〜１ｍＭ）、又は融合ファージ（１０８〜１０１３ｐｆｕ）を接種した。卵を３７℃でインキュベートした。各ペプチド濃度に対して卵３個を用いた。陽性対照にはＡＩＶだけを接種し、陰性対照にはウイルスをペプチド又はファージによって置き換えた。ペプチド（１００μｌ）を、別の３日間毎日、好適な卵中に注射した。４回目の注射の１日後、卵を一夜冷却し、尿膜腔液を回収した。次いで、Ｇｒａｃｅら（１９７３年）にしたがって尿膜腔液試料の赤血球凝集活性を決定した。
【００３５】
（例７）
ｉｎ ｖｉｔｒｏのＡＩＶ増殖の阻害における融合ファージのＩＣ５０の決定
ＭＤＣＫ細胞に、３７℃で１時間、培地単独、又はファージ処理（１０８〜１０１３ｐｆｕ／１００μｌ）若しくは非処理のウイルス（感染効率［ＭＯＩ］０．０５）を接種した。吸着後、単層を洗浄し、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＥＭＥＭ中でインキュベートした。細胞変性効果を光学顕微鏡によってモニターし、ＸＴＴ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ、米国）によって定量した。ウイルスの複製を評価するために、ＭＤＣＫ細胞にファージ処理したウイルス、又は非処理のウイルスを０．０５のＭＯＩで接種し、上清を７２ｈｐｉで回収し、ウイルス力価をＨＡ滴定によって決定した。ＩＣ５０値を、用量反応曲線を補間することによって推定した。
【００３６】
本発明を様々な、現在好ましい実施形態に関して上記に記載してきたが、当業者であれば多くの変形及び改変を行うことができることは明らかである。したがって、本発明は、本明細書に示す特定の実施形態に制限されるものと理解してはならず、むしろ、本明細書に添付する特許請求の範囲の範囲内にあるこのような変更及び改変全てを包含するものと理解されたい。
【００３７】
本明細書に開示する参照は全て、その全文が参照によって援用される。
【００３８】
【表１】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）サブタイプＨ９Ｎ２に対して作用する、新規な抗ウイルスペプチド及び融合ファージに関する。より詳しくは、融合ファージは、ＡＩＶ Ｈ９Ｎ２に結合するその表面タンパク質Ｐ３上に配列ＣＮＤＦＲＳＫＴＣをディスプレイし、ＩＣ５０値は１０１３ｐｆｕ／１００μｌ未満である。直鎖状又は環状の立体配座のいずれかにおけるアミノ酸配列ＣＮＤＦＲＳＫＴＣを有する合成ペプチドは、約１００μＭ未満のＩＣ５０値でＡＩＶ Ｈ９Ｎ２の増殖を阻害した。
【背景技術】
【０００２】
トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）は、インフルエンザＡ及びＢ、並びにインフルエンザＣである２つの属を含んでいるオルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する（Ｌａｍｂ及びＫｒｕｇ、１９９６年）。これらのウイルスは、世界の家禽の間の罹患及び死滅の主たる原因である。これは一般用語でバードフル（ｂｉｒｄ ｆｌｕ）と呼ばれる最も危険な疾患の原因物質である（Ｗｅｂｓｔｅｒら、１９９２年）。これらのウイルスはヒトには感染しないが、ヒトの感染及び大流行の例はいくつか報告されている（ＣＤＣ、２００８年；Ｎｏｒｍｉｌｅ、２００４年；Ｐａｒｒｙ、２００４年）。インフルエンザＡウイルスは、脂質二重層で覆われており、８個の一本鎖の、分節化された、ネガティブ鎖のＲＮＡを含んでいる。ビリオンの表面上に存在する２個の糖タンパク質、すなわちヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）、並びに１個のイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）が存在する。これらの糖タンパク質はインフルエンザウイルスの主要な抗原決定基である。ＨＡタンパク質は、ウイルス感染における最初のステップを開始し、これは宿主細胞表面のシアル酸受容体へのウイルスの付着を伴う（Ｌａｍｂ及びＫｒｕｇ、１９９６年）。ＮＡタンパク質は、宿主細胞からの成熟ビリオンの放出に関与する（Ｐａｌｅｓｅら、１９７４年）。したがって、ウイルス−宿主の相互作用を研究するために、及びこのプロセスを阻害する分子を同定するためにも、特定のペプチド配列をディスプレイするバクテリオファージが、ファージディスプレイライブラリーを用いてトリインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２系統に対するその親和性によって選択された。
【０００３】
インフルエンザウイルスの感染を防ぐための好ましい主要な戦略は、感受性の集団間に毎年ワクチン接種をすることである。しかし、疾患及び伝播をコントロールするための包括的な取組みにおいて、抗ウイルス薬は重要な役割を果たしている（Ｈａｙｄｅｎ、２００６年）。治療及び予防のために認可されている２つのクラスの抗ウイルス薬が存在する。これらはアダマンタン誘導体（アマンタジン及びリマンタジン）、並びにノイラミニダーゼ阻害薬（ＮＡＩ；ザナミビル及びオセルタミビル）である。（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、２００３年）。これらアダマンタン誘導体は、インフルエンザＡウイルスのＭ２イオンチャネルタンパク質に結合し、その機能を阻止することによって作用し、それによって宿主細胞内でのウイルスの複製を防ぐ（Ｗａｎｇら、１９９３年）。Ｍ２タンパク質における単一の点突然変異により、アダマンタン耐性系統が出現している（Ｈａｙら、１９８６年）。これらの耐性ウイルスは、通常完全に病原性があり、伝染性である（Ｈａｙｄｅｎ、２００６年）。ＮＡＩはノイラミニダーゼタンパク質の酵素活性を阻害し、感染した宿主細胞からのウイルスの放出を防ぐ。しかし、ＮＡの活性部位における突然変異により、ＮＡＩ耐性系統も出現している（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、２００３年）。インフルエンザＡウイルスによる、両タイプの薬物に対する耐性の増大は、新規な薬物を同定する我々の必要性を強調するものである。
【０００４】
伝統的に、植物、海洋生物、真菌、又は他の微生物から得られた天然生成物からの化合物が、抗微生物薬又は抗ウイルス薬を同定するのに用いられる。最近、ファージディスプレイライブラリーなどのコンビナトリアルペプチドライブラリーが、同じ目的でペプチド化合物を同定するのにますます用いられている（Ｄｏｏｒｂａｒら、１９９４年）。バクテリオファージ上にディスプレイされるペプチドの広範な構造上の多様性により、ファージディスプレイライブラリーは、とりわけ特定の標的と相互作用する特定のリガンドの同定において、タンパク質タンパク質相互作用を研究するための重要なツールとなっている（Ｄｅｖｌｉｎら、１９９０年）。標的分子と相互作用する化合物がファージライブラリーから選択され、次いでスクリーニングのプロセスを用いて標的に対して機能的な効果を有するリード化合物が同定される。次いで、これらのリード化合物をその活性に対して最適化し、次いで候補の薬物が臨床試験に入る。
【０００５】
本発明者らは環状ペプチドのファージディスプレイライブラリーを用いて、インフルエンザＡウイルスＨ９Ｎ２と相互作用するペプチド分子を同定し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び卵内でその抗ウイルス活性を証明した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の一目的は、トリインフルエンザウイルスＡ Ｈ９Ｎ２に対する抗ウイルス活性を有する新規なペプチド及び融合ファージを提供することである。
【０００７】
本発明の別の一目的は、本発明による組換えファージ又は合成ペプチドを含む薬剤組成物を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに別の一目的は、本発明による組換えファージ又は合成ペプチドを含む診断用試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これらの目的は、トリインフルエンザウイルスＡ Ｈ９Ｎ２に結合し、ウイルスの増殖を阻害する融合ファージに由来する融合ペプチド又は合成ペプチドを保有する、単離され、精製された組換えファージによって達成される。
【００１０】
新規な抗ウイルス分子を同定するために、ジスルフィド拘束ランダムヘプタペプチド配列をディスプレイする組換えファージの集団を、ウイルスに対してスクリーニングした。次いで、融合ファージの表面上にディスプレイされたペプチドを、化学的に合成した。この単離されたペプチドはＮＤＦＲＳＫＴの配列を有し、ＩＣ５０値は１００〜Ｍ未満である。インフルエンザウイルスＡ Ｈ９Ｎ２に対する組換えファージの特異性は、抗体−ファージ競合アッセイによって証明され、このアッセイにおいてファージは、ウイルス表面タンパク質上の結合部位に対してポリクローナル抗体と競合することが可能であった。
【００１１】
本発明において、単離された配列の１つをベースにした合成ペプチドは、直鎖状又は環状の立体配置のいずれかにおいて（例えば合成ペプチドＣＮＤＦＲＳＫＴＣなど）、ＮＤＶの増殖を阻害することができ、それによって疾患及び感染の伝播を防ぐ。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
表１ ＡＩＶ Ｈ９Ｎ２に対する３ラウンドのバイオパニングから得たヘプタペプチド配列を示す表である。
表２ 合成ペプチド及び融合ファージの赤血球凝集阻害活性を示す表である。
【図１】特定のヘプタペプチド配列を保有する組換えファージとＡＩＶ Ｈ９Ｎ２に対するポリクローナル抗体との間の競合の結果を示す図である。
【図２】卵内の合成ペプチドでのＡＩＶ増殖の阻害を示す図である。
【図３】卵内の融合ファージでのＡＩＶ増殖の阻害を示す図である。
【図４】ｉｎ ｖｉｔｒｏの融合ファージでのＡＩＶ増殖の阻害を示す図である。
【図５】ｉｎ ｖｉｔｒｏのウイルス複製に対する融合ファージの効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（図及び表の詳細な説明）
表１は、ＡＩＶに対する４ラウンドのバイオパニングから得られたヘプタペプチド配列を示すものである。４ラウンドの選択及び増幅後、第２、第３、及び第４ラウンドから、それぞれ２０個、３５個、及び３５個の個々のクローンが配列決定された。
【００１４】
表２は、トリインフルエンザＨ９Ｎ２のヘマグルチネーション（ｈａｅｒｎａｇｇｌｕｔｉ ｎａｔｉｏｎ）活性に対する環状及び直鎖状ペプチドの阻害能力を示すものである。実験を３回繰り返して行った。＋の存在下、−の非存在下。
【００１５】
図１は、特定のヘプタペプチド配列を保有する組換えファージとＡＩＶに対するポリクローナル抗体との間の競合の結果を示すものである。ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）は融合ファージのＡＩＶとの会合を阻害し、ファージは抗体とある程度共通の結合部位を共有し得ることを示唆している。実験を３回繰り返して行い、エラーバーは平均の標準偏差を表す。シリーズ１−融合ファージ、シリーズ２−融合ファージとポリクローナル抗体。
【００１６】
図２は、ＡＩＶ Ｈ９Ｎ２増殖に対する卵内の合成ペプチドのＩＣ５０値の決定の結果を示すものである。ウイルスの成長の５０％を阻害するのに必要とされるペプチドの濃度を、様々な濃度のペプチドを用いて決定した。実験を３回繰り返して行い、エラーバーは平均の標準偏差を表す。
【００１７】
図３は、卵内のＡＩＶ Ｈ９Ｎ２ウイルス増殖に対する融合ファージＦＰ−Ｐ１のＩＣ５０値の結果を示すものである。実験を３回繰り返して行い、エラーバーは平均の標準偏差を表す。シリーズ１−融合ファージＦＰ−Ｐ１；シリーズ２−対照としての野生ファージ。
【００１８】
図４はｉｎ ｖｉｔｒｏの融合ファージＦＰ−Ｐ１の抗ウイルス活性の結果を示すものである。実験を３回繰り返して行い、エラーバーは平均の標準偏差を表す。シリーズ１−ＦＰ−Ｐ１；シリーズ２−対照としての野生ファージＭ１３。
【００１９】
図５は、ウイルス複製に対する融合ファージＦＰ−Ｐ１の効果の結果を示すものである。ＭＤＣＫ細胞に非処理の（０値）、又はＦＰ−ＰＩ処理したウイルスを接種し、ウイルス力価を上清７２ｈｐｉに対して決定した。シリーズ１−ＦＰ−Ｐ１；シリーズ２−対照としての野生ファージＭ１３。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載する記述は、様々なセクションに分割される以下の発明を実施するための形態とともにより完全に理解されよう。本発明に用いられる材料及び方法は、実施例において述べる。例１から５までは、本発明の必要条件である従来の材料及び方法である。
【００２１】
ファージディスプレイ技術の原理
ファージディスプレイ技術において、コートタンパク質をコードする遺伝子中に合成オリゴヌクレオチドを挿入することによって、ランダムペプチドが、通常、融合タンパク質としてバクテリオファージ分子の表面上にディスプレイされる。これら組換えファージの収集物はファージディスプレイライブラリーとして知られており、バイオパニングとして知られるｉｎ ｖｉｔｒｏの選択手順によって、標的に対する莫大な数のペプチド配列のスクリーニングが可能になっている（Ｐａｒｍｌｅｙら、１９８８年、及びＳｍｉｔｈら、１９９３年）。本発明において、用いた標的は、ＡＩＶ Ｈ９Ｎ２ウイルス粒子全体であり、用いたライブラリーは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から入手したジスルフィド拘束ライブラリーであった。この特定のライブラリーにおいて、ディスプレイされたペプチド分子に、ファージＭ１３のｇｐＩＩＩタンパク質に対するシステイン残基が隣接している。このシステイン残基が、還元剤の非存在下、ペプチドが固定の環状の形状を達成するのを助ける。このジスルフィド拘束ライブラリーは、その相互作用成分（天然のリガンド）が不連続の結合部位（配座エピトープ）を有する標的に有用であり（Ｈｏｅｓｓら、１９９４年）、結合部位では、アミノ酸がポリペプチドにおける様々な位置から運ばれて本質的な接触領域を形成する。その上、ジスルフィド拘束環状ペプチドライブラリーは、直鎖状ペプチドライブラリーよりもむしろ、高親和性リガンドを選択するのにより有用である（Ｏ’Ｎｅｉｌら、１９９２年；Ｇｈｏら、１９９７年）。
【００２２】
ＡＩＶに結合するペプチドの親和性選択
トリインフルエンザウイルスは、２種の表面糖タンパク質、すなわちヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含んでおり、これらは宿主細胞内へのウイルスの侵入、及び宿主細胞からのウイルスの退出を担っている。したがって、本発明者らは、表面タンパク質に結合する立体配置のリガンドを選択するためのウイルス粒子全体に対するジスルフィド拘束ライブラリーを用いることに決定した。図１は、これらのリガンドの選択に関与する主なステップを概要したものである。第１に、ウイルス粒子全体を、高結合性のマイクロタイタープレートウエルの表面に直接付着させた。次いで、ライブラリーをウエル中に加えて、組換えファージ粒子をウイルス粒子と結合させた。非結合のファージを洗い流し、結合しているファージを低ｐＨで溶出した。次いで、溶出したファージを、細菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で増幅し、増幅したファージを第２ラウンドのバイオパニングにおいて用いた。この手順を４回繰り返した。アフィニティ選択及び増幅を連続４ラウンド行った後、サブセットの選択されたファージを個々に成長させ、コア粒子に結合するペプチドのタイルアイデンティティ（ｔｉｌｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を、挿入を保有するタイル（ｔｉｌｅ）ｇｐＩＩＩ遺伝子を配列決定することによって得た。
【００２３】
高親和性の結合ファージを選択するために、選択のストリンジェンシーを、（ｉ）室温（２８℃）でバイオパニングを行い、（ｉｉ）速度に対して速いリガンドを選択するために結合の時間を１時間に短縮し（Ｋ０）、（ｉｉｉ）ウエルを徹底的に洗浄して（１０回）低親和性の結合ファージを除去し、（ｉｖ）バイオパニングを４ラウンド繰り返して高親和性結合クローンを濃縮することによって増大させた。第４ラウンドのパニングから分析されたファージの４７％は、融合ペプチド配列ＮＤＦＲＳＫＴを保有しており、１０．５％がＱＨＳＴＫＷＦモチーフを含んでおり、その後に各５％のＬＰＹＡＡＫＨ及びＩＬＧＤＫＶＧ、並びに他の非関連の配列が続く（表１）。ストレプトアビジン標的を、クローン全てにおいてＨＰＱ配列のコンセンサスモチーフを与える陽性対照として用いたが、これはＤｅｖｌｉｎら（１９９０年）によって報告されたものと良好に一致した。陰性対照として用いられたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）では、認識できるコンセンサス配列は観察されなかった。
【００２４】
本明細書で用いられる「融合ペプチド」の語は、一般的にバクテリオファージによってコードされ、ファージのコートタンパク質に物理的に連結しているアミノ酸配列を意味する。特許請求の融合ペプチドは、アミノ酸配列ＮＤＦＲＳＫＴ：（ｉ）特許請求のアミノ酸配列よりも短く、又は長いアミノ酸配列、（ｉｉ）アミノ酸配列における変形、とりわけ以下に記載するのと同じカテゴリー内のアミノ酸の置換、（ｉｉｉ）特許請求の融合ペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０％のホモロジーを共有するアミノ酸配列、及び（ｉｖ）直鎖状又は限定立体配置のいずれかを含んでいるが、これらに限定されない。
【００２５】
ＡＩＶは２種の表面糖タンパク質ＨＡ及びＮＡを所有し、これらはウイルスの脂質二重層膜から突出している。これらの糖タンパク質はそれぞれ宿主細胞内及び宿主細胞外へのウイルスの侵入及びウイルスの放出に不可欠である。配列ＮＤＦＲＳＫＴを保有するファージは溶液中のビリオンに結合するので、これらの配列は、ある程度、完全なビリオンと相互作用する宿主細胞の受容体上の領域に類似することがある。
【００２６】
ファージはＡＩＶ上の結合部位に対して抗体と競合する
表面糖タンパク質ＨＡ及びＮＡは、宿主における抗体の生成を誘発する２つの重要なタンパク質である。ファージ−抗体競合アッセイにおいて、ファージはミモトープの１つに結合することができ、したがってビリオンに対して産生された抗体の結合を阻害することができた。図１は、バイオパニング実験から選択された、ペプチドＮＤＦＲＳＫＴをディスプレイする組換えファージが、ＡＩＶ上の結合部位に対して抗体と競合できたことを示している。抗体の存在下、ウイルスでコーティングされたウエルに結合したファージの数は、ウイルス上の同じ結合部位に対するこれら２つの分子間の競合の結果として劇的に低下した。したがって、組換えファージ分子は、ＡＩＶ感染に対する潜在的な診断薬として働き得る。
【００２７】
卵内の合成ペプチド及び融合ファージの抗ウイルス活性
ＡＩＶは、孵化鶏卵の尿膜腔液中で容易に増殖させることができる。したがって、ウイルス及び増殖系により、ｉｎ ｖｉｖｏで特定の化合物又はペプチドの抗ウイルス活性を直接評価するための簡単なモデルが提供される。抗ウイルス化合物処理の前及び後に尿膜腔液中に存在するウイルスの量を、赤血球凝集力価によって決定する。環状又は直鎖状の形態いずれかの特許請求のペプチド、及びペプチドをディスプレイする融合ファージの注射により、尿膜腔液中のＡＩＶ力価は低減した（図２及び３）。環状ペプチドは、直鎖状ペプチドに対するよりも１００μＭ低いペプチド濃度でより高いＩＣ５０値を示した。さらに、環化により、エキソペプチダーゼによるペプチドの消化を避けることができる。このように、疾患を治療する、コントロールする、又は根絶するための治療薬として、本明細書において特許請求する合成ペプチドを用いることができる。
【００２８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの融合ファージの抗ウイルス活性
ＭＤＣＫ細胞系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのトリインフルエンザウイルスの増殖のための有効な媒体である。ウイルス増加に対する融合ファージのｉｎ ｖｉｔｒｏの抗ウイルス性質を、これらの細胞系において調べた。融合ファージ分子で処理する前及び後に、ウイルス複製の阻害を細胞の生存性によって間接的に調べた。細胞の生存性は、ファージ処理したウイルスに感染した後、非処理のウイルスに対して２倍近く増大した（図４）。ウイルス力価における低下を、上清の赤血球凝集試験によってさらに確認した（図５）。この実験により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで融合ファージ分子の抗ウイルス性質が証明された。
【実施例】
【００２９】
（例１）
ＡＩＶの増殖及び精製
増殖及び精製の方法は、それぞれＢｌａｓｋｏｖｉｋ及びＳｔｙｋ（１９６７年）、並びにＹｕｓｏｆｆら（１９９６年）から適用され、改変された。ＡＩＶサブタイプＨ９Ｎ２を、９日齢の特定の病原体フリーの孵化鶏卵中に注射した。３７℃でインキュベートして３日後、尿膜腔液を回収し、遠心分離（３０分、３５０００×ｇ、４℃）によって透明にした。透明にした上清から３０％〜６０％ショ糖勾配の超遠心（３．５時間、２８５０００×ｇ、４℃）によってウイルスを精製し、以下の試験に用いた。
【００３０】
（例２）
精製したＡＩＶのバイオパニング
ウイルスのタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（１９７６年）を用いて測定した。ＡＩＶ（１５μｇ／ｍｌ）をマイクロタイタープレートウエル上にコーティングした［Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ９．６）］。ストレプトアビジン及びＢＳＡを、それぞれ陽性対照及び陰性対照として用いた。実験は室温（約２５℃）で行った。ジスルフィド拘束７量体ファージディスプレイライブラリー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）からのファージを、ＴＢＳ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１１０μｌ］中Ｉ×１０１１ｐｆｕに希釈し、コーティングした各ウエル中に加えた。混合物を３０分間インキュベートした。ウエルをＴＢＳＴ ＪＢＳ＋０．１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ−２０で洗浄した。結合したファージをグリシン−ＨＣｌ［０．１Ｍ（ｐＨ２．２）；１００μｌ］で７〜８分間穏やかに揺り動かすことによって溶出し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［１Ｍ（ｐＨ９）；１１５μｌ］で中和した。産出量のｐｆｕを、溶出物（１０μｌ）を滴定することによって決定し、残りの溶出物を、３７℃で大腸菌系統ＥＲ２７３８（Ｆ’ＩａｃｌｑΔ（ＩａｃＺ）Ｍ）５ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ｚｚｆ：：ＴｎＩＯ（ＴｅｔＲ）／ｆｈｕＡ２ｓｕｐＥ ｔｈｉ Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Δ（ｈｓｄＭＳ−ｍｃｒＢ）５（ｒｋ−ｍｋ−ＭｃｒＢＣ−）｝中で増幅し、５時間振盪した。パニングのプロセスをさらなる３ラウンド繰り返した。
【００３１】
（例３）
ファージ滴定
ファージ滴定法を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）から適用した。
【００３２】
（例４）
選択されたファージの配列決定
４ラウンドのパニング全てからの単一のプラークを（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）ＬＢ平板（産出量の滴定において使用）から選択し、ＬＢ培地中成長させた。ファージの一本鎖ＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）によって記載されている通りに抽出した。挿入物の配列決定を、Ｆｉｒｓｔ Ｂａｓｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｄｎ Ｂｈｄ、クアラルンプールによるＡＢＩ自動化シーケンサーを用いて行った。
【００３３】
（例５）
抗体競合アッセイ
ウエルをＡＩＶ（１５μｇ／ｍｌ）でコーティングし、ＡＩＶに対して産生されたポリクローナル抗体（１：５００希釈；１００μｌ）を、一連の異なるファージ濃度で（１０９〜１０１３ｐｆｕ；１００μｌ）加えた。混合物を１時間インキュベートし、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水−Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）で６回洗浄した。結合しているファージを溶出し、上記に記載した通りに滴定した。
【００３４】
（例６）
卵内のＡＩＶ増殖の阻害におけるペプチド及び融合ファージのＩＣ５０の決定
９日齢の孵化鶏卵に、ＡＩＶ１００μｌ（８ＨＡ単位）、及び等体積の様々な濃度のペプチド（０．１μＭ〜１ｍＭ）、又は融合ファージ（１０８〜１０１３ｐｆｕ）を接種した。卵を３７℃でインキュベートした。各ペプチド濃度に対して卵３個を用いた。陽性対照にはＡＩＶだけを接種し、陰性対照にはウイルスをペプチド又はファージによって置き換えた。ペプチド（１００μｌ）を、別の３日間毎日、好適な卵中に注射した。４回目の注射の１日後、卵を一夜冷却し、尿膜腔液を回収した。次いで、Ｇｒａｃｅら（１９７３年）にしたがって尿膜腔液試料の赤血球凝集活性を決定した。
【００３５】
（例７）
ｉｎ ｖｉｔｒｏのＡＩＶ増殖の阻害における融合ファージのＩＣ５０の決定
ＭＤＣＫ細胞に、３７℃で１時間、培地単独、又はファージ処理（１０８〜１０１３ｐｆｕ／１００μｌ）若しくは非処理のウイルス（感染効率［ＭＯＩ］０．０５）を接種した。吸着後、単層を洗浄し、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＥＭＥＭ中でインキュベートした。細胞変性効果を光学顕微鏡によってモニターし、ＸＴＴ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ、米国）によって定量した。ウイルスの複製を評価するために、ＭＤＣＫ細胞にファージ処理したウイルス、又は非処理のウイルスを０．０５のＭＯＩで接種し、上清を７２ｈｐｉで回収し、ウイルス力価をＨＡ滴定によって決定した。ＩＣ５０値を、用量反応曲線を補間することによって推定した。
【００３６】
本発明を様々な、現在好ましい実施形態に関して上記に記載してきたが、当業者であれば多くの変形及び改変を行うことができることは明らかである。したがって、本発明は、本明細書に示す特定の実施形態に制限されるものと理解してはならず、むしろ、本明細書に添付する特許請求の範囲の範囲内にあるこのような変更及び改変全てを包含するものと理解されたい。
【００３７】
本明細書に開示する参照は全て、その全文が参照によって援用される。
【００３８】
【表１】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリインフルエンザウイルスに結合し、ウイルスの増殖を阻害する融合ペプチドを保有する、単離され、精製された組換えファージ。
【請求項２】
融合ペプチドが配列ＮＤＦＲＳＫＴ及びそれに関連する他のアミノ酸配列である、請求項１に記載の組換えファージ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載した融合ペプチドに由来するアミノ酸配列を含む合成ペプチド。
【請求項４】
ウイルスに結合することによってＡＩＶの増殖を阻害する、請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが配列ＣＮＤＦＲＳＫＴＣ又はそれに関連する配列を有する、請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが１００μＭ未満のＩＣ５０値を有する、請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項７】
請求項１及び２のいずれか一項に記載の組換えファージを含む薬剤組成物。
【請求項８】
請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチドを含む薬剤組成物。
【請求項９】
請求項１及び２のいずれか一項に記載の組換えファージを含む診断用試薬。
【請求項１０】
請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチドを含む診断用試薬。
【請求項１１】
請求項１及び２のいずれか一項に記載の組換えファージを含むワクチン。
【請求項１２】
請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチドを含むワクチン。
【請求項１３】
トリインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２表面糖タンパク質ＨＡ及びＮＡに結合する、請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【請求項１４】
トリインフルエンザウイルスに感染している個体（ヒト／動物又はトリ）を治療するための方法であって、請求項１及び２のいずれか一項に記載の組換えファージの治療有効量を前記個体に投与することを含む上記方法。
【請求項１５】
組換えファージの融合ペプチドが、ＮＤＦＲＳＫＴ又はそれに由来するあらゆる他のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
トリインフルエンザウイルスに感染している個体（ヒト／動物又はトリ）を治療するための方法であって、請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチドの治療有効量、及び薬学的に許容される担体を前記個体に投与することを含む上記方法。
【請求項１７】
合成ペプチドが、アミノ酸配列ＮＤＦＲＳＫＴ又はそれに由来するあらゆる他のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
トリインフルエンザウイルスに結合し、ウイルスの増殖を阻害する融合ペプチドを保有する、単離され、精製された組換えファージ。
【請求項２】
融合ペプチドが配列ＮＤＦＲＳＫＴ及びそれに関連する他のアミノ酸配列である、請求項１に記載の組換えファージ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載した融合ペプチドに由来するアミノ酸配列を含む合成ペプチド。
【請求項４】
ウイルスに結合することによってＡＩＶの増殖を阻害する、請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが配列ＣＮＤＦＲＳＫＴＣ又はそれに関連する配列を有する、請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが１００μＭ未満のＩＣ５０値を有する、請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項７】
請求項１及び２のいずれか一項に記載の組換えファージを含む薬剤組成物。
【請求項８】
請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチドを含む薬剤組成物。
【請求項９】
請求項１及び２のいずれか一項に記載の組換えファージを含む診断用試薬。
【請求項１０】
請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチドを含む診断用試薬。
【請求項１１】
請求項１及び２のいずれか一項に記載の組換えファージを含むワクチン。
【請求項１２】
請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチドを含むワクチン。
【請求項１３】
トリインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２表面糖タンパク質ＨＡ及びＮＡに結合する、請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【請求項１４】
トリインフルエンザウイルスに感染している個体（ヒト／動物又はトリ）を治療するための方法であって、請求項１及び２のいずれか一項に記載の組換えファージの治療有効量を前記個体に投与することを含む上記方法。
【請求項１５】
組換えファージの融合ペプチドが、ＮＤＦＲＳＫＴ又はそれに由来するあらゆる他のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
トリインフルエンザウイルスに感染している個体（ヒト／動物又はトリ）を治療するための方法であって、請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチドの治療有効量、及び薬学的に許容される担体を前記個体に投与することを含む上記方法。
【請求項１７】
合成ペプチドが、アミノ酸配列ＮＤＦＲＳＫＴ又はそれに由来するあらゆる他のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５２２５６１（Ｐ２０１１−５２２５６１Ａ）
【公表日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１３４３６（Ｐ２０１１−５１３４３６）
【出願日】平成２１年６月１０日（２００９．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＹ２００９／００００７１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５１３１３
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５０５２９１４１３）ユニバーシティー プトラ マレーシア (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１０日（２００９．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＹ２００９／００００７１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５１３１３
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５０５２９１４１３）ユニバーシティー プトラ マレーシア (11)
【Ｆターム（参考）】
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