トリグリセリドおよびＶＬＤＬの分泌を調節する方法および化合物
本発明はトリグリセリドおよびＶＬＤＬの血中濃度を低減させる自家食作用誘導化合物の使用および薬物の調製を提供する。本発明はまた、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、または糖尿病、インシュリン抵抗性、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、これらの組合せを治療するための自家食作用誘導化合物の使用を提供する。本発明は自家食作用を調節する化合物を同定する方法をさらに提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトリグリセリドおよびＶＬＤＬの分泌を調節する方法および化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高トリグリセリド血症は心血管疾患のリスクファクターあることが確認されている。高トリグリセリド血症は一般に２００ｍｇ／ｄＬを超える空腹時のトリグリセリド（ＴＧ）レベルであると定義される。ＴＧ血中濃度の上昇はＴＧ分泌上昇またはＴＧ分解低下のいずれかから生じるものと思われる。
【０００３】
肝は大きさおよび代謝経路が異質である超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の形態でＴＧを分泌する（ＰａｃｋａｒｄとＳｈｅｐｈｅｒｄ、１９９７年、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７号、３５４２〜３５５６）。ＶＬＤＬ粒子の各々はアポリポタンパク質（ａｐｏ）Ｂ１００の１つの複製および種々の量のＴＧを含んでいる（ＦｉｓｈｅｒとＧｉｎｓｂｅｒｇ、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７号、１７３７７〜１７３８０）。ラット肝癌ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞では、ＶＬＤＬの組み立てはｐｏｓｔ−小胞体（ＥＲ）区画において翻訳後に達成される（Ｔｒａｎら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７号、３１１８７〜３１２００）。その合成の後、ａｐｏＢ１００はＥＲを出て、小さな脂質と結合した膜結合形態のシス／メディアルゴルジ体を横断する。すなわち、ａｐｏＢ１００がディスタル−ゴルジ体に達するまでは、ａｐｏＢ１００と共に大きなＴＧを完全に組み立ててＶＬＤＬが形成されない（Ｔｒａｎら、２００２年）。ＥＲにおける脂質の乏しい始原のリポタンパク質粒子の形成は第１段階組み立てと呼ばれ、ｐｏｓｔ−ＥＲ区画内のＶＬＤＬへの大きなＴＧの取り込みは第２段階組み立てとして知られている（Ｒｕｓｔａｅｕｓら、１９９９年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．、１２９号、４６３Ｓ〜４６６Ｓ；Ｓｔｉｌｌｅｍａｒｋら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５号、１０５０６〜１０５１３）。第１段階組み立てに影響を及ぼす要因は、翻訳後修飾（例えば、ジスルフィド結合形成（Ｔｒａｎら、１９９８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７３号、７２４４〜７２５１）またはＮ結合型糖鎖合成（Ｖｕｋｍｉｒｉｃａら、２００２年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４３号、１４９６〜１５０７））によるか、またはａｐｏＢ１００とミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）（Ｄａｓｈｔｉら、２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１号、６９７８〜６９８７）との相互作用によるかのいずれかで、発生期のａｐｏＢ１００ポリペプチド鎖のフォールディングを支配することが多い。近年、第１段階組み立て障害を引き起こす、家族性低βリポタンパク症に関与する点変異Ｒ４６３Ｗが、ａｐｏＢのＭＴＰ結合領域内に同定された（Ｂｕｒｎｅｔｔら、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７８号、１３４４２〜１３４５２）。第１段階組み立ての減弱に関与する特徴には、新たに合成されるａｐｏＢ１００の細胞内分解の増加およびａｐｏＢ１００タンパク質の分泌の低下が挙げられる。ＥＲにおけるミスフォールドした新生ａｐｏＢ１００の分解は一般に、ユビキチン−プロテオソーム系によって媒介される（ＦｉｓｈｅｒとＧｉｎｓｂｅｒｇ、２００２年；Ｙａｏら、１９９７年、Ｊｉ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ、３８号、１９３７〜１９５３）。
【０００４】
他方、第２段階組み立てに影響を及ぼす要因は一般に脂質性である。実験的証拠からは、分泌経路に沿った膜のリン脂質組成は第２段階組み立ての重要な決定因子であることが次々と示唆されている。直接的（Ａｓｐら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５号、２６２８５〜２６２９２；Ｎｉｓｈｉｍａｋｉ（Ｍｏｇａｍｉ）ら、２００２年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、４３号、１０３５〜１０４５；Ｔｒａｎら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５号、２５０２３〜２５０３０）または間接的（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１号、１８４４５〜１８４５５；Ｗａｎｇら、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４号、２７７９３〜２７８００；ＹａｏとＶａｎｃｅ、１９８８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３号、２９９８〜３００４）にリン脂質を修飾する酵素の活性を改変することによって膜リン脂質組成を乱す薬剤を用いたこれまでの試験からは、そのようないくつかの要因が同定された。これらの酵素には、ＶＬＤＬ組み立てに許容的なミクロソーム膜環境を形成するオレオイル（１８：１（ｎ−９））鎖が補充された、ホスファチジルコリン（ＰＣ）種およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）種がある（Ｔｒａｎら、２０００年）。１８：１（ｎ−９）リッチなリン脂質種の形成は、肝細胞中のカルシウム依存性ホスホリパーゼＡ２（ｉＰＬＡ２）によって一部が媒介されるリン脂質リモデリング（すなわち、脱アリル化および再アリル化）を通して達成される（Ｔｒａｎら、２０００年）。これらのリン脂質の代謝回転も、ＴＧ合成（Ｔｒａｎら、２０００年）および膜の移動および融合において重要な役割を果たす１８：１（ｎ−９）−ホスファチジン酸および１８：１（ｎ−９）−ジグリセリドなどのシグナリング分子の形成（Ａｎｔｏｎｎｙら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２号、３０８４８〜３０８５１；Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｄｉｋら、１９９５年、Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．、１４６号、１〜１４）のための１８：１（ｎ−９）アシル鎖を提供する。ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞において、オレイン酸欠乏による膜リン脂質への１８：１（ｎ−９）の取り込みを制限し（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６年）ｉＰＬＡ２阻害によるリン脂質リモデリングを抑え（Ｔｒａｎら、２０００年）、およびＡＤＰリボシル化因子依存性ホスホリパーゼの阻害によってホスファチジン酸の形成を低下（Ｄ Ａｓｐら、２０００年）させれば、第２段階においてＶＬＤＬ組立体は変わらず低減されることになる。第２段階組み立ての障害の顕著な特徴は、Ｔｇの少ないａｐｏＢ１００を含む緻密なリポタンパク質（ＬｐＢ）の分泌である。分泌不能なＬｐＢは未だ不明な機序によって分解される運命にある。種々の条件下では、非プロテアソームおよびｐｏｓｔ−ＥＲ分解機序は、ａｐｏＢがＥＲを出た後に（すなわち第２段階組み立てで）、形成された異常なＬｐＢを除去すると仮定されてきた（Ｆｉｓｈｅｒら、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６号、２７８５５〜２７８６３；Ｐｈｕｎｇら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２号、３０６９３〜３０７０２；Ｗａｎｇら、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０号、２４９２４〜２４９３１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
今回、本発明者らは膜リン脂質の組成改変およびリモデリングにより、第２段階ＶＬＤＬ組み立てが阻害され、ｐｏｓｔ−ＥＲ分解が活性化されることを確認した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
今回、本発明者らは膜リン脂質の組成改変およびリモデリングにより、第２段階ＶＬＤＬ組み立てが阻害され、ｐｏｓｔ−ＥＲ分解が活性化されることを確認した。
【０００７】
本発明は、治療有効量の自家食作用誘導化合物を化合物を必要とする患者に投与するステップを含む、トリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低下させる方法を教示する。
【０００８】
本発明はトリグリセリドおよび／またはコレステロールの血中濃度を低下させるのに有用な医薬品を調製するための自家食作用誘導化合物の使用を教示する。
【０００９】
本発明は、治療有効量の自家食作用誘導化合物を該化合物を必要とする患者に投与するステップを含む、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せからなる群から選択される障害を治療または予防する方法を教示する。
【００１０】
本発明は、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せからなる群から選択される障害を治療または予防するのに有用な薬物を調製するための自家食作用誘導化合物の使用を教示する。
【００１１】
本発明の一実施形態では、自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、またはクラスＩＩＩのＰ１３’キナーゼであり得る。
【００１２】
本発明は（ａ）対照細胞培養系および試験細胞培養系を提供するステップと、（ｂ）前記試験細胞培養系の細胞に試験化合物を投与するステップと、（ｃ）前記対照細胞培養系および前記試験細胞培養系の自家食作用マーカーをアッセイするステップとを含み、前記対照細胞培養系と比較したときの前記試験細胞培養系の前記自家食作用マーカーの異常値は試験化合物が自家食作用を調節することを示す、自家食作用調節化合物を同定する方法を教示する。
【００１３】
本発明の一実施形態では、自家食作用マーカーはＥＲおよびゴルジ細胞画分中のＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体である。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、ＶＬＤＬ前駆体はＰＣ部分含有脂質である。該ＰＣ部分含有脂質は１８：１（ｎ−９）ＰＣであり得る。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態では、ＶＬＤＬ前駆体はＰＥ部分含有脂質である。該ＰＥ部分含有脂質は２０：５（ｎ−３）ＰＥであり得る。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態では、前記自家食作用マーカーは免疫蛍光法によってａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣ３の共存の程度を検出することによって決定される。
【００１７】
本発明は、（ａ）対照細胞培養系および試験細胞培養系を提供するステップと、（ｂ）前記試験細胞培養系の細胞に試験化合物を投与するステップと、（ｃ）前記対照細胞培養系および前記試験細胞培養系の自家食作用マーカーをアッセイするステップとを含み、前記対照細胞培養系と比較したときの前記試験細胞培養系の前記自家食作用マーカーの異常値は試験化合物が自家食作用を調節することを示す、自家食作用誘導化合物を同定する方法を教示する。
【００１８】
本発明の一実施形態では、前記自家食作用マーカーはＰＣ部分含有脂質である。該ＰＣ部分含有脂質は１８：１（ｎ−９）ＰＣであり得る。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態では、自家食作用マーカーはＰＥ部分含有脂質である。該ＰＥ部分含有脂質は２０：５（ｎ−３）ＰＥであり得る。
【００２０】
本発明の方法のいずれかの一実施形態では、細胞は肝細胞または肝癌細胞である。この細胞はヒトａｐｏＢ１００を発現するラット肝細胞またはヒトａｐｏＢ１００を発現するラット肝癌細胞であり得る。このラット肝癌細胞はＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞であり得る。該ａｐｏＢ１００は蛍光タンパク質またはテトラシステインなどのタグと融合し得る。
【００２１】
本発明は、トリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低減させるための、本発明の方法によって同定される自家食作用誘導化合物の使用を教示する。
【００２２】
本発明は、本発明の方法によって同定される自家食作用誘導化合物と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を教示する。
【００２３】
本発明は、本発明の方法によって同定される自家食作用誘導化合物と医薬的に許容される担体とを含む治療有効量の医薬組成物を投与するステップを含む、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せからなる群から選択される障害を治療または予防する方法を教示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
ｐｏｓｔ−ＥＲ分解を活性化すれば、ＴＧおよびＶＬＤＬ分泌は低下する。
【００２５】
本発明を特定の機構に限定するものではないが、ＴＧおよびＶＬＤＬ分泌は、自家食作用を促進して、脂質／リポタンパク質のｐｏｓｔ−ＥＲ分解を促進することによって調製することができると考えられる。本発明者らは膜リン脂質の組成改変およびリモデリングにより第２段階ＶＬＤＬ組み立てが阻害されることを確認した。特に、本発明者らは、膜ホスホチジルコリン（ＰＣ）／ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）比の改変はトリグリセリドの細胞内蓄積およびｐｏｓｔ−ＥＲ分解の活性化に関与することを確認した。
【００２６】
インビトロでのＴＧ分泌に対する阻害作用（ＬａｎｇとＤａｖｉｓ、１９９０年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１号、２０７９〜２０８６；ＷｏｎｇとＮｅｓｔｅｌ、１９８７年、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、６４号、１３９〜１４６）およびインビボでのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の血中ＴＧ低下作用（Ｈａｒｒｉｓ、１９９９年、Ｌｉｐｉｄｓ ３４ Ｓｕｐｐｌ．Ｓ２５７〜Ｓ２５８）が文書化されている。しかし、ＥＰＡの高トリグリセリド血症作用の機序については明らかになっておらず、議論の余地が残されている。
【００２７】
本発明者らはオレイン酸の作用とＥＰＡの作用とを比較することによって、第２段階ＶＬＤＬ組み立てに対する膜リン脂質リモデリングの影響を試験した。本発明者らは２０：５（ｎ−３）をリン脂質に取り込み、次にリモデリングを介してＴＧに取り込めば、第２段階ＶＬＤＬ組み立てに好ましくないリン脂質環境が生まれると仮定した。この仮説を試験するために、ａｐｏＢ１００の合成およびＥＲ出口がＥＰＡ処理による影響を受けない条件下でヒトａｐｏＢ１００を発現するＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞を培養した。本発明者らは、外来性脂肪酸によってリン脂質分子種を改変すれば、第２段階ＶＬＤＬ組み立て時にその合成および細胞内分布によって調製されるＴＧの補充に影響を及ぼすと共に、ｐｏｓｔ−ＥＲ分解区画の形成が同時に生じるように見えることを見出した。
【００２８】
本発明者は、ＶＬＤＬの第２段階組み立ては外来性脂肪酸の流入下で膜リン脂質リモデリング（すなわち脱アリル化／再アリル化）によって調節されることを見出した。ＶＬＤＬ組立体に関連するリン脂質リモデリングの重要な側面の１つは、（脱アシル化時に）放出されたアシル鎖をＴＧの合成において利用することにある。膜ＰＣへのオレイン酸の選択的取り込みは、ＰＣのグリセロ骨格のｓｎ−１およびｓｎ−２位におけるその存在のために、デノボ経路およびリモデリング経路の両方によって媒介されると考えられる。対照的に、膜リン脂質のそのｓｎ−２位へのＥＰＡの選択的取り込みおよびこの後のＰＣからＰＥへのそのＥＰＡの移動は、リモデリングプロセスの明らかな兆候である。ＥＰＡ取り込みのための選択的な行き先となるプールである細胞内Ｃａ２＋依存性ホスホリパーゼＡ２およびＰＥによって媒介される脱アシル化／再アシル化を介してリン脂質へ取り込まれるポリ不飽和酸の内因性が、近年、他の細胞型において明らかとなっている（Ｂａｌｓｉｎｄｅ。２００２年）。外来性脂肪酸が流入した時、リン脂質リモデリングから放出されるオレイン酸およびＥＰＡは両方共、ＴＧ合成にほとんど選択的に利用されない。しかし、本発明者らは、２０：５含有ＴＧは１８：１含有ＴＧに比べて分泌量が少ないことを見出し、このことは２０：５−ＴＧは非効率的にＶＬＤＬ組立体に利用されていることを示唆している。本発明者らは膜リン脂質の脱アシル化／再アシル化の内因性およびＰＣおよびＰＥへのオレイン酸およびＥＰＡの差別的取り込みによって、第２段階組み立てにおいて利用不可能で、有効に利用しても利用しなくてもよい異なったＴＧプールの形成がもたらされると考えている。
【００２９】
本発明者らは、膜のＰＣ／ＰＥ比を改変することは細胞質プールのＴＧの蓄積量およびｐｏｓｔ−ＥＲ分解の活性化に関与するものと断定した。異なるＴＧ種（すなわち、１８：１−ＴＧ／２０：５−ＴＧ）の形成の際のＰＣおよびＰＥのリモデリングの重要性に加えて、本発明者らはミクロソーム膜内のＰＣ／ＰＥ比の低下が第２段階ＶＬＤＬ組み立ての障害および細胞質プール内のＴＧの蓄積に関与することを見出した。ＰＣ／ＰＥ比の改変はマイクロソーム膜のＰＣまたはＰＥ含有量のいずれかを変えることによって達成することができると思われ、この改変は第２段階ＶＬＤＬ組み立ての効率の指標となり得る。本発明者らはＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞をオレイン酸処理したことがミクロソーム膜の、特にＥＲおよびディスタル−ゴルジ体のＰＣ含有量を増大させた（Ｗａｎｇら、１９９９年）と考えている。対照的に、ＥＰＡ処理すれば、ＶＬＤＬ組立体を効果的に阻害しているディスタル−ゴルジ体の膜内のＰＥ含有量は増大した（したがって、ＰＣ／ＰＥ比は低下した）。肝ＰＥレベルの上昇はＥＰＡ供給ラットに関しても報告されている（Ｋｏｔｋａｔら、１９９９年、Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ａ Ｍｏｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２２号、２８３〜２８９）。第２段階ＶＬＤＬ組み立て障害（ＨＤＬ分泌ではなくＶＬＤＬ分泌障害）に関与する肝ミクロソーム膜のＰＣ／ＰＥ比が低下することは、コリン欠乏症（Ｒｉｄｇｗａｙら、１９８９年）およびＰＥメチル化経路の阻害（Ｎｉｓｈｉｍａｋｉ（Ｍｏｇａｍｉ）ら、２００２年）（Ｎｏｇａら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７７号、４２３５８〜４２３６５）などのその他のモデルで観察されている。化学的阻害（Ｎｉｓｈｉｍａｋｉ（Ｍｏｇａｍｉ）ら、２００２年）またはマウス（Ｎｏｇａら、２００２年）を用いたＰＥメチルトランスフェラーゼの遺伝子破壊によるＰＥメチル化経路を介したＰＥからＰＣへの変換の崩壊は、ａｐｏＢ１００−ＶＬＤＬ分泌障害に関与したＰＣ／ＰＥ比が低下したことを示した。ＰＥメチル基転移酵素欠損動物の特にオスでは、肝ＰＥの上昇は肝ＴＧ蓄積量および血中ＴＧの減少に関与した。ラット初代肝細胞とは異なり、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞はＰＥメチル基転移酵素活性が乏しく（Ｃｕｉら、１９９５年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ、３１２号、９３９〜９４５）、外来性オレイン酸が培地に補給されなければＶＬＤＬを構築することはできない。外来性オレイン酸存在下のＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞におけるＶＬＤＬ組立体の修復の一部は、ＶＬＤＬ組立体に許容的なＰＣ／ＰＥ比の再確立（ＰＣ含有量の増大に起因する）によるものと思われる。ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞でのＰＥメチル基転移酵素の再構成によって、ａｐｏＢ１００−ＶＬＤＬにおけるＴＧ分泌量が増大し（ＤｅＬｏｎｇら、１９９９年）、肝細胞のメチル化経路によって合成された種に似た多様なＰＣ種が生成された（Ｎｏｇａら、２００２年）。膜リン脂質の非対象分布（Ｄａｌｅｋｅ、２００３年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４号、２３３〜２４２）（すなわち、特にゴルジ体のＶＬＤＬ組立体の部位では、内腔小頭にＰＣが多く、ミクロソーム膜の細胞質小頭にはＰＥが多い）はリモデリング中脂肪酸アシル鎖を受容および提供するそれらの固有特性と共に、代謝的に明らかに異なった２つのＴＧプールの形成に寄与する。その結果、ＥＰＡ処理で形成されたＴＧは、ＶＬＤＬ組立体は近付きにくいかもしれない細胞質プールにより多く蓄積された。異なる脂肪酸処理によって誘導されたＰＣ／ＰＥ比の改変と共にリン脂質リモデリングは、ＴＧ合成／分布およびＶＬＤＬ組立体に大きな影響を及ぼすと考えられる。
【００３０】
本発明者らは、ｐｏｓｔ−ＥＲ分解に関してディスタル−ゴルジ体の膜におけるＰＣ／ＰＥ比の改変の効果について試験した。自食胞形成のプロセス全体に関与する必須タンパク質の１つはＭａｐ１ＬＣ３であり、これは２つの形態、すなわち１８ｋＤａサイトゾル型および１６ｋＤａ膜結合型で存在する（Ｋａｂｅｙａら、２０００年）。この酵母相同体Ａｐｇ８／Ａｕｔ７ｐは、自食胞膜と結合するとＰＥと共役になる。したがって、膜結合型Ｍａｐ１ＬＣ３はＰＥ共役形態であると仮定されてきた（Ｉｃｈｉｍｕｒａら、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ、４０８号、４８８〜４９２）。自食胞形成は、「分離膜」と定義される膜構造体の形成と共に始まり、これは物質を徐々に包み込む、ＥＲ由来（Ｕｅｎｏら、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６号、１８９９５〜１８９９９）、トランスゴルジ体ネットワーク由来（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９０年、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３８号、５７３〜５８０）、および／または固有の、未同定の細胞内区画由来（Ｓｔｒｏｍｈａｕｇら１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３３５号、２１７〜２２４）であると仮定される。分離膜と液胞膜との間の融合によって自食胞が形成され、次にこの自食胞はリソソームと融合してオートファゴリソソームを形成し、その結果、内腔内容物が分解される（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９０年）。トランスゴルジ体近傍の二重膜構造に包まれた脂質／リポタンパク質を含む液胞のＴＥＭによる検出、および共焦点および蛍光顕微鏡による自家食作用マーカーＭａｐ１ＬＣ３およびＭＤＣの点状染色の増大の検出からはそれぞれ、自家食作用がＥＰＡ処理によって誘導されることが明らかに示されている。自食胞形成の本質的性質は、細胞生存に必須であるが（ＫｌｉｏｎｓｋｙとＥｍｒ、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０号、１７１７〜１７２１）、オレイン酸処理細胞および対照細胞両方でも検出されたように、ＥＰＡ処理における自家食作用の増加は、第２段階組み立ての機能障害の結果生じる、ディスタル−ゴルジ体中の蓄積された異常な脂質／リポタンパク質および／または細胞質中の脂質粒子の廃棄において重要な役割を果たすものと思われる。培養細胞における自食胞形成を、飢餓条件によって刺激することができるか（ＫｌｉｎｏｓｋｙとＥｍｒ、２０００年）、またはホスファチジルイノシチジル３−キナーゼの阻害剤である、ワートマニンまたは３−メチルアデニンによって阻害することができる（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１５２号、６５７〜６６８）。ａｐｏＢの非プロテアソーム分解はホスファチジルイノシチド３−キナーゼ阻害を受け易いという事実（Ｆｉｓｈｅｒら、２００１年；Ｐｈｕｎｇら、１９９７年）を考慮して、本発明者らは自家食作用はＶＬＤＬ組立体中のｐｏｓｔ−ＥＲ分解のためのミッシングリンクを表していると考えている。したがって第１段階組み立て中のａｐｏＢ分解はユビキチン−プロテアソーム経路によって媒介される（ＦｉｓｈｅｒとＧｉｎｓｂｅｒｇ、２００２年；Ｙａｏら、１９９７年）ことが知られているが、本発明者らは第２段階組み立ての障害から発生した異常な脂質／リポタンパク質は自家食作用によって少なくとも部分的には除去されると提唱する。代謝的にはっきりと区別できるＴＧプールのほか自食胞形成のリン脂質リモデリングと分布との関係を図１１に示している。
【００３１】
本発明者らは１８：１（ｎ−９）および２０：５（ｎ−３）アシル鎖を含む膜脂質はＶＬＤＬ組立体において重要であることを決定した。区画化された１８：１（ｎ−９）−ＴＧおよび２０：５（ｎ−３）−ＴＧプールはオレイン酸処理およびＥＰＡ処理が第２段階組み立てにどのように影響するかの違いを説明するが、膜リン脂質種の改変はＶＬＤＬ組立体に直接影響を及ぼす可能性もある。この分子種分析からは、ＥＰＡ処理によって、１８：１（ｎ−９）を含む膜結合ＰＣ種およびＰＥ種は著明に減少し、２０：５（ｎ−３）を含む種は著明に増加することが明らかになっている。本発明者らは、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞において、オレイン酸由来（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６年）またはｉＰＬＡ２の阻害（Ｔｒａｎら、２０００年）のいずれかによる、膜ＰＣおよびＰＥ中の１８：１（ｎ−９）アシル鎖の減少は第２段階ＶＬＤＬ組み立ての障害と密接に関係していることを実証した。両試験からは、オレイン酸はＶＬＤＬ組立体より先行するかまたはＶＬＤＬ組立体と同時に起こるＴＧ合成の基質として単に働くものではないことが示唆される。むしろ、ミクロソームリン脂質への１８：１（ｎ−９）アシル鎖の取り込みは、ＶＬＤＬへＴＧを効果的に大きく取り込むための膜プラットフォームを確立する。特に、ミクロソーム中の膜結合ａｐｏＢ１００は構築された／分泌されたＶＬＤＬの前駆体であるという膨大な証拠を考えれば、第２段階組み立てに適合する膜環境を確立することは重要である（Ｔｒａｎら、２００２年；Ｓｔｉｌｌｅｍａｒｋら、２０００年；ＨｅｂｂａｃｈｉとＧｉｂｂｏｎ、２００１年、Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．、４２号、１６０９〜１６１７；Ｒｕｓｔａｅｕｓら、１９９８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３号、５１９６〜５２０３）。この文脈により、膜動態力学に重要なホスファチジン酸およびジグリセリドなどの１８：１（ｎ−９）を含むその他の脂質（Ａｎｔｏｎｎｙら、１９９７年；Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｄｉｋら、１９９５年）も、第２段階組み立てプロセスを促進することが予想できる。
【００３２】
本発明者らはＥＰＡ処理細胞に１８：１（ｎ−９）含有ＰＣが著しく欠乏した状態のゴルジ体にＰＥが大量に蓄積されていることを観察した。これらの結果はまず、脂質ドナーおよび脂質受容体の組み立て中間体がＶＬＤＬ組立体部位にあることを明らかにしている。ＥＰＡ処理細胞のＴＥＭ形態計測解析データからは、ディスタル−ゴルジ体および液胞において元の脂質ドナー（Ｉ型）、中間脂質ドナー（ＩＩ型およびＩＩＩ型）、および新生リポタンパク質（ＩＶ型およびＶ型）と類似した異なるタイプの脂質／リポタンパク質粒子の存在が明らかとなった。膜結合ａｐｏＢ１００はＶＬＤＬの前駆物質であるので、第２段階組み立て障害は、ａｐｏＢ１００がディスタル−ゴルジ体の膜内に蓄積し、中間脂質／リポタンパク質粒子を収容した分解液胞の形成によって発現することは明らかである。ｐｏｓｔ−ＥＲ分解と第２段階ＶＬＤＬ組み立てとの間の均衡の一方または他方に向かう傾斜は、膜リン脂質種を改変することによって影響され得る。
【００３３】
したがって、本発明者らは、アポリポタンパク質Ｂならびに脂質およびリポタンパク質粒子のｐｏｓｔ−ＥＲ分解が生じる細胞内区画を同定し、特徴付けた。この区画の特徴は次のようなものである：
１．自家食作用経路の最近接（ｐｒｏｘｉｍａｌ−ｍｏｓｔ）で明確な区画はトランス−ゴルジ体近傍の液胞（ゴルジ体結合液胞ＧＡＶ）である。
【００３４】
２．ＧＡＶはリボシル化された小胞体と連続しているように見える大槽膜によって包まれている。これらの膜は自食されることになる物質の最初の隔絶に関与する「分離膜」に類似している。
【００３５】
３．ＧＡＶは脂質ドナー粒子および脂質受容体粒子の異なる成熟中間体を表すことが企てられた５種類の電子密度の高い粒子を含んでいる。同じ５種類の粒子は分泌経路（すなわち、小胞体およびゴルジ体）内にも観察されるが、その粒子は異なった粒子−粒子および粒子−膜関係を示す。
【００３６】
４．免疫蛍光試験に基づけば、Ｍａｐ１ＬＣ３（すべての自食構造体の、ただし最も強力な初期の自食構造体のマーカー）およびアポリポタンパク質Ｂ（超低密度リポタンパク質のタンパク質成分）はＧＡＶに共存している。
【００３７】
５．緻密な液胞は、自己蛍光薬モノダンシルカダベリンに反応するより進んだ分解内容物と共に、ＧＡＶ近傍に位置している。
【００３８】
医薬組成物および治療方法
自家食作用がＴＧおよびＶＬＤＬを調節するという本発明者らの発見を考えれば、本発明は、ＴＧおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を調節する自家食作用調節化合物の使用とＴＧおよび／またはＶＬＤＬの異常なレベルが特徴である疾患または障害の治療に有用な治療薬を調製するための自家食作用調節化合物の使用とを包含するものである。
【００３９】
（ＴＧおよびＶＬＤＬの血中濃度を低減させるのに有用な医薬組成物）
一態様では、本発明はトリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低減させるのに有用な医薬組成物製造用の自家食作用誘導化合物の使用を提供する。
【００４０】
トリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低減させるのに有用な本発明の医薬組成物は、自家食作用誘導化合物と、薬学的に許容できる担体を含む。「自家食作用誘導化合物」という用語は、自家食作用を、特にオートファゴソームのオートファゴリソソームへの熟成を促進することのできる有機小分子、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、および、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む核酸配列を包含する。
【００４１】
例えば、自家食作用阻害化合物は、自家食作用を阻害または下方制御するタンパク質の転写または発現を阻害するように設計されたアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。例えば、自家食作用誘導化合物は、自家食作用の公知の阻害剤であるＩ型ＰＩ３’キナーゼの転写または発現を阻害するアンチセンス配列であり得る。
【００４２】
自家食作用誘導化合物は自家食作用の誘導／開始を促進するタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子であり得る。例えば、自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、またはＩＩＩ型ＰＩ３’キナーゼなどの自家食作用アゴニストをコードする組換えＤＮＡ分子であり得る。
【００４３】
自家食作用誘導化合物は、自家食作用を阻害または下方制御するタンパク質を選択的に認識するか、または選択的にそのタンパク質に結合する抗体または抗体断片であり得る。例えば、自家食作用誘導化合物はＩ型ＰＩ３’キナーゼに結合する抗体であり得る。
【００４４】
自家食作用誘導化合物は自家食作用の誘導／開始を促進するタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子であり得る。例えば、この自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３（微小管結合タンパク質１Ｌ鎖３／ＬＣ３）、ＧＡＢＡＲＡＰ（γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ａ−受容体結合タンパク質）、ＧＡＴＥ１６（１６ｋＤａのゴルジ結合アデノシン三リン酸分解酵素エンハンサー）、およびＩＩＩ型ＰＩ３’キナーゼなどの自家食作用アゴニストをコードする組換えＤＮＡ分子であり得る。これらのタンパク質は酵母（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００３年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３５号、５５３〜５６１）および哺乳動物細胞における自家食作用の誘導／開始のためのアゴニストとして同定されている。先に示したタンパク質各々のイソ型を用いて本発明の医薬組成物を調製することができる。例えば、Ｍａｐ１ＬＣ３はラットでは２つのイソ型（ＩおよびＩＩ）で、ヒトＡ、Ｂ、およびＣでは３つのイソ型で存在する。
【００４５】
別の場合には、自家食作用誘導化合物は、これに限らないがＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、およびＩＩＩ型ＰＩ３’キナーゼなどの自家食作用を促進するタンパク質であり得る。
【００４６】
Ｍａｐ１ＬＣ３およびその酵母類似体は自家食作用膜内のＰＥ部分に共有結合すると考えられる。このため、膜内のＰＥの量／濃度を変える化合物は、本発明の医薬組成物の調製用の自家食作用誘導化合物として有用である。この自家食作用誘導化合物はその他の抗高脂症薬または心血管作動薬を含む医薬組成物として調製され得る。
【００４７】
（ＴＧおよびＶＬＤＬの血中濃度を上昇させるのに有用な医薬組成物）
別の態様では、本発明はＴＧおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を上昇させるのに有用な医薬組成物の調製用の自家食作用阻害化合物の使用を提供する。本発明の医薬組成物は自家食作用阻害化合物と薬学的に許容できる担体とを含む。「自家食作用阻害化合物」という用語は、有機小分子、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、および自家食作用を完全にまたは部分的に阻害することのできるＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を含む核酸配列を包含するものである。
【００４８】
本発明の好適な実施形態では、自家食作用阻害化合物は自家食作用の公知の阻害剤であり、およびホスファチジルイノシトール３’キナーゼ（ＰＩ３’キナーゼ）を阻害する、ワートマニン、３−メチルアデニンまたはＬＹ２９４００２である。
【００４９】
ラパマイシンは自家食作用の公知の阻害剤であり、これを用いて本発明の医薬組成物を調製することができる。ラパマイシンはｍＴｏｒ（哺乳動物のラパマイシンン標的）およびＰＩ３’キナーゼと相同性のあるＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼの機能を阻害する大環状ラクトンである。Ｉ型ＰＩ３’キナーゼも公知の自家食作用アンタゴニストであり、本発明の医薬組成物を調製するための自家食作用阻害化合物として用いることができる。
【００５０】
（医薬組成物の調製および投与）
本発明の医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠剤化、微粒子化、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥手段を用いて、それ自身が公知の方法で製造することができる。
【００５１】
したがって、本発明に従って使用される医薬組成物は、該活性化合物を医薬的に使用することのできる製剤に処理するのを容易にする賦形剤および佐剤を含む１つまたは複数の医薬的に許容可能な担体を用いた従来の方法で調製され得る。適した剤形は選択される投与経路に左右される。
【００５２】
注入の場合、本発明の薬剤は水溶液として、好適には、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水などの生理学的に適合する緩衝液として調製され得る。経粘膜投与の場合、浸透される障壁に適した浸透剤が製剤に用いられる。そのような浸透剤は一般に当業者には知られている。
【００５３】
経口投与の場合、活性化合物と当業者にはよく公知の薬学的に許容できる担体とを組み合わせることによって容易に本化合物を調製することができる。このような担体は本発明の化合物を治療される患者が経口摂取するための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調製できるようにする。経口用の医薬的調製物は、錠剤または糖衣錠の芯を得るために、場合によって得られる混合物を磨り潰し、必要に応じて、適した佐剤を添加した後にその顆粒混合物を処理することによって、固体賦形剤として得ることができる。適した固体賦形剤は、特に、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールなどの糖：例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのナトリウムなどのセルロース調製物といった充填剤である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、あるいはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどの塩といった崩壊剤を添加してもよい。
【００５４】
糖衣剤の芯には適したコーティングを施す。この目的のために、濃縮砂糖水が使用されてよく、場合によってはこの砂糖水はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適した有機溶媒または溶媒混合液を含んでよい。識別のため、または活性化合物投与量の異なる組合せを区別するために、染料または顔料を錠剤または糖衣剤のコーティングに添加してもよい。
【００５５】
経口投与に使用できる医薬製剤には、ゼラチンから作られた押し込み型カプセルのほか、グリセロールまたはソルビトールといった、ゼラチンおよび可塑剤から作られた軟らかい密閉カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、乳糖などの充填剤、でんぷんなどの結合剤、および／または滑石またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合によっては安定剤などと混合した活性成分を含むことができる。軟カプセルでは、活性成分は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適した液体に溶解または懸濁されてよい。また、安定剤を添加することもできる。経口投与用のすべての製剤は、そのような投与に適した投与量にしなければならない。
【００５６】
口腔投与の場合、該組成物は従来の方法で調製された錠剤またはトローチ剤の形態であってよい。
【００５７】
吸入投与の場合、本発明に従って使用するための化合物は便宜的には、適した推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、または他の適したガスを用いて、加圧されたパックからのエアゾールスプレーまたは噴霧器の形態で届けられる。加圧エアロゾルの場合、計量装置は計量された量を届けるために弁を設けることによって決定することができる。例えば、吸入器または送気器に使用するゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、本化合物と乳糖またはデンプンなどの適した粉末基剤の粉末混合物を含んで調製することができる。
【００５８】
該化合物は、注入、例えば、ボーラス注入または持続注入による非経口投与用に調製されてよい。注入用製剤は、防腐剤を添加した状態で、単位投与形態で、例えば、アンプルまたは複数回投与用容器で提供されてよい。該組成物は油性または水性媒体を用いた懸濁剤、溶液、または乳剤などの形態を取ってよく、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの調製用薬剤を含んでもよい。
【００５９】
非経口投与用の医薬製剤には水溶性形態の活性化合物の水溶液がある。また、活性化合物の懸濁剤は適した油状の注入用懸濁剤として調製され得る。適した脂溶性の溶媒または媒体には、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、あるいはリポソームが挙げられる。水性の注入用懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁剤の粘度を上げる物質を含んでよい。場合によっては、該懸濁剤は、高濃縮液の調製を可能にするために化合物の可溶性を上げる適した安定剤または薬剤を含んでもよい。
【００６０】
別の場合には、該活性成分は、使用前に適した媒体、例えば、滅菌したパイロジェンフリー蒸留水と共に構成されるように粉末形態であってよい。
【００６１】
該化合物は、例えばカカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐薬用基剤を含む、坐薬または滞留浣腸などの直腸用組成物として調製することもできる。
【００６２】
上記調剤に加え、本化合物はデポー製剤として調製され得る。そのような長時間作用調剤は埋め込み（例えば、皮下または筋内）によって、または筋内投与によって投与され得る。したがって、例えば、本化合物は適した高分子材料または疎水性材料（例えば、許容できるオイルに溶かした乳剤として）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として調製することができる。
【００６３】
本発明の疎水性化合物用の医薬的担体は、ベンジルアルコール、無極性界面活性剤、水混和性有機高分子、および水相を含む共溶媒系である。当然、共溶媒系の比率はその可溶性および毒性を壊すことなく相当に変えることがきる。さらに、該共溶媒成分の独自性を変えることができる。
【００６４】
別の場合には、疎水性医薬化合物のための他の送達系を用いてよい。
【００６５】
リポソームおよび乳剤は疎水性薬剤用の送達媒体または担体のよく公知の例である。ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒を用いることもできるが、通常はより高い毒性という犠牲が伴う。あるいは、該化合物は、治療薬剤を含む固体の疎水性高分子の半透性基質などの徐放系を用いて送達されてよい。種々の徐放性物質が確立されており、当業者にはよく知られている。徐放性カプセルはその化学的性質に応じて、数週間から１００日間以上にわたって化合物を放出する。治療薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質を安定化させるための別の戦略を用いてよい。
【００６６】
該医薬組成物は適した固相またはゲル相の担体または賦形剤を含んでもよい。
【００６７】
そのような担体または賦形剤の例には、これに限らないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどの高分子が挙げられる。
【００６８】
本発明の化合物の多くは、医薬的に適合性のある対イオンを有する塩として提供することができる。医薬的に適合性のある塩はこれに限らないが塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩はこれに相当する遊離塩基である水性溶媒または他のプロトン性溶媒中ではさらに溶け易くなる。
【００６９】
適した投与経路には、例えば、経口、直腸、経粘膜、経皮、または腸管投与；筋内、皮下、骨髄内注入のほか、髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、経鼻、または眼球内注入などの非経口送達がある。
【００７０】
標的薬物送達系、例えば、病的細胞のための抗体でコーティングされたリポソームを用いて薬剤を投与してよい。このリポソームは細胞に向かい、その細胞によって選択的に取り込まれる。
【００７１】
該医薬組成物は一般に、特異的適応または複数の適応の治療または予防のための有効な量で投与される。最適な投与量は、各治療方法および指示のための標準的方法によって、その指示、その重篤度、投与経路、複雑な条件等を考慮した上で決定されるであろうことを理解されたい。治療において、または予防として、該活性薬剤は注入可能な組成物として、例えば、無菌水性分散剤として、好適には等張液として個人に投与することができる。さらに、治療有効投与量とは、係る疾患に関連する症状の改善をもたらすのに十分な化合物の量を指す。本出願の化合物の調製および投与のための方法は、Ｍａｃｋ．Ｅ．Ｗ．、１９９０年、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、第１３版にみることができる。哺乳動物、特にヒトに投与する場合、本活性剤の１日の投与量レベルは、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、典型的には０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであると想定される。どのような場合であっても、医師は個人に最も適し、その特定の個人の年齢、体重、および反応と共に変動する実際の投与量を決定する。上記投与量は平均的な症例の例である。当然、より多いかまたはより少ない投与量が良いという個々の例も考えられ、そのような投与量は本発明の範囲にある。
【００７２】
（治療方法）
本発明はトリグリセリドおよびＶＬＤＬの血中濃度を改変する自家食作用調節化合物の使用を包含する。
【００７３】
一態様では、本発明はトリグリセリドおよびＶＬＤＬの血中濃度を低下させる自家食作用誘導化合物の使用を提供する。別の態様では、本発明はトリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度の上昇から生じるか、またはそれに関連する障害を治療または予防する自家食作用誘導化合物の使用を提供する。
【００７４】
トリグリセリドおよびＶＬＤＬの血中濃度の低減およびトリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度の上昇から生じるか、またはそれに関連する障害の治療または予防は、治療有効量の自家食作用誘導化合物をそれを必要とする患者に投与することによって達成することができる。
【００７５】
自家食作用誘導化合物によって治療され得るまたは予防され得る疾患および障害は、これに限らないが、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せが挙げられる。一般に、自家食作用誘導化合物およびその医薬組成物は、ＴＧおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低減させる際に有益となろう疾患を有する患者を治療するのに有用である。
【００７６】
医薬的活性剤の「有効量」または「治療有効量」とは、所望の効果を提供する薬または薬剤の無毒性であるが、十分な量を意味する。本発明の併用療法では、併用療法の１つの成分の「有効量」は、併用療法の他方の成分と併用して使用されるときに所望の効果を提供するのに有効な化合物の量である。「有効」である量は、個人の年齢および一般条件、特定の活性剤または複数の活性剤、等に応じて患者毎に変わる。したがって、正確な「有効量」を指定できるとは限らない。しかし、どのような個々の場合においても、適した「有効」量は通常の実験を用いて当業者によって決定され得る。
【００７７】
本発明によって包含されるどの活性薬剤の治療有効量も、当業者には明白である多数の因子および本願明細書の開示を考慮して左右されよう。特にこれらの因子には、投与される化合物の同定、その調製、使用される投与経路、患者の性別、年齢および体重、治療されている状態の重篤度、および胃腸管、肝胆道系および腎臓系に影響を及ぼす合併症の存在が挙げられる。投与量および毒性を決定する方法は、一般には動物を対象に開始され、次いで、著明な動物毒性が認められない場合にはヒトを対象に開始される試験を用いて、当業者にはよく知られている。脂質レベルを監視することによって投与量の適切性を判断することができる。この投与量が治療後１〜１０週間で血中ＴＧおよび／またはＶＬＤＬレベルを改善しない場合、投与量を増やすことができる。
【００７８】
投与される自家食作用誘導化合物がＤＮＡまたはＲＮＡ配列などの核酸配列の形態である場合、従来の遺伝子治療アプローチを用いることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡ配列形態での自家食作用誘導化合物の小胞体は、これに限らないが、送達媒体としのリポソームの使用を含む、当業者に公知の方法を用いて達成することができる。末端の修飾、環状分子の形成、またはｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｎａｔｅおよびチオホスホリル修飾結合などの代替的結合の使用によるものなどの分解に対して抵抗性のある形態である場合には、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を用いてもよい。また、核酸分子がポリリシンまたはトランスフェリンと共役である場合、核酸の送達は促進輸送によるものであってよい。核酸はこれに限らないが、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ＡＡＶ、およびアデノウイルスを含む種々のウイルス担体の任意のものによって細胞内へ輸送されてよい。
【００７９】
有機小分子、薬理学的化合物または薬剤、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体断片の形態で自家食作用誘導化合物を投与する場合、従来の薬物療法を用いることができる。この活性成分は上記のような適した医薬的担体を用いて投与することができる。
【００８０】
本発明の好適な実施形態では、トリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度の上昇から生じるか、またはそれに随伴する疾患の予防治療は、治療有効量のＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、ＩＩＩ型Ｐ１３’キナーゼまたはこれらの組合せによって達成される。
【００８１】
したがって本発明の組成物によって治療可能な疾患には、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せが挙げられる。
【００８２】
自家食作用調節化合物を同定する方法および同定された化合物の使用
本発明は自家食作用を増強または阻害する核酸、タンパク質、化合物または薬理学的製剤をスクリーニングする方法を含む。細胞をベースに下細胞溶解物および／または精製酵素アッセイを用いてこれらの増強化合物または阻害化合物を同定することができる。本願明細書で使用するように、「試験化合物」という用語には、これに限らないが、小分子（例えば、有機小分子）、薬理学的化合物または薬剤、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体断片、およびＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む核酸配列が挙げられる。
【００８３】
一態様では、本発明は脂質の分解量および分泌量の変動をアッセイすることを伴う自家食作用調節化合物を同定する方法を提供する。本方法は（ａ）対照細胞培養系および試験細胞培養系を提供するステップと、（ｂ）前記試験細胞培養系の細胞に試験化合物を投与するステップと、（ｃ）前記対照細胞培養系および試験細胞培養系において自家食作用マーカーをアッセイするステップとを含み、前記対照細胞培養系と比較して前記試験細胞培養系における前記自家食作用マーカーの異常値が試験化合物が自家食作用を調節したことを示す。
【００８４】
本発明の一実施形態では、自家食作用マーカーはＶＬＤＬまたはＶＬＤＬ前駆体である。本発明の別の実施形態では、アッセイされたＶＬＤＬ前駆体はＰＣ部分含有脂質およびＰＥ部分含有脂質を含む。さらに好適な実施形態では、ＰＣ部分含有脂質は１８：１（ｎ−９）ＰＣであり、ＰＥ部分含有脂質は２０：５（ｎ−３）ＰＥである。
【００８５】
ＥＲおよびゴルジ細胞画分中および試験細胞培養用の培地中のＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体のレベルが未処理の対照細胞培地と比較して異常である場合、化合物は自家食作用モジュレーターであると肯定的に同定される。（１）ＥＲおよびゴルジ細胞画分中に観察されたＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体のレベルが未処理の対照細胞について観察されたレベルよりも高い場合、および（２）その細胞培地中のＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体のレベルが未処理の対照細胞について観察されたレベルよりも低い場合、試験化合物は自家食作用誘導剤であると同定される。逆に、（１）ＥＲおよびゴルジ細胞画分中に観察されたＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体のレベルが未処理の対照細胞について観察されたレベルよりも低い場合、（２）その細胞培地中のＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体のレベルが未処理の対照細胞について観察されたレベルよりも高い場合、試験化合物は自家食作用阻害剤であると同定される。
【００８６】
ＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体は、高速液体クロマトグラフィーなどの当業者に公知のクロマトグラフィー法、より好適には公知の質量分析法を用いてアッセイすることができる。
【００８７】
別の態様では、本発明は膜組成の変化の分析を伴う、自家食作用誘導化合物を同定する方法を提供する。本発明は（ａ）細胞培養系の細胞に試験化合物を投与するステップと、（ｂ）ＥＲ細胞画分およびゴルジ細胞画分におけるＰＣ部分含有脂質およびＰＥ部分含有脂質をアッセイするステップとを含む。未処理の対照試験細胞と比較してＰＣ部分含有脂質が減少し、ＰＥ部分含有脂質が上昇している場合、試験化合物は自家食作用誘導化合物であると同定される。本発明の一実施形態では、アッセイされるＰＣ部分含有脂質は１８：１（ｎ−９）ＰＥ部分含有脂質であり、アッセイされるＰＥ部分含有脂質は２０：５（ｎ−３）ＰＥである。このＰＥおよびＰＣ部分含有脂質は、公知の質量分析法を用いてアッセイすることができる。
【００８８】
別の実施形態では、自家食作用バイオマーカーはａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣである。このバイオマーカーを免疫蛍光測定法を用いてアッセイして、ａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣの共存の程度を決定することができる。未処理の対照細胞と比較して、ａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣ３の共存の程度が異常である場合、試験化合物は自家食作用モジュレーターであると同定される。共存の程度が未処理細胞で観察されるものより大きい場合、試験化合物は自家食作用誘導剤であると同定される。逆に、共存が存在しない場合または共存の程度が未処理細胞で観察されるものより小さい場合、試験化合物は自家食作用阻害剤であると同定される。
【００８９】
本発明の方法のいずれも実行するのに有用な細胞培養系は真菌または哺乳動物の細胞系を含む。本発明の一実施形態では、この細胞は肝細胞または肝癌細胞であり得る。この細胞はヒトａｐｏＢ１００タンパク質を安定して発現するラット肝細胞または肝癌細胞であることがさらに好ましい。発現されたａｐｏＢ１００タンパク質は該タンパク質の検出および測定を容易にする標識融合タンパク質であってよい。例えば、本発明の方法は蛍光タグが付けられたａｐｏＢ１００を発現するＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞を用いて実施することができる。このような安定した細胞系を用いて、初期のヒットの化学的誘導体をスクリーニングし、最適な投与量を滴定し、市販の分子のライブラリをスクリーニングすることができる。ａｐｏＢ１００融合タンパク質は、蛍光タグ以外に当該分野では公知の他のタグを用いて調製することもできる。例えば、ａｐｏＢ１００タンパク質はテトラ−システイン−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−（Ｘは任意のアミノ酸）で標識化することができる。テトラ−システイン標識化タンパク質は、テトラシステイン２砒素系検出方法を用いてアッセイすることができる（Ｚｈａｎｇら、２００２年、Ｎａｒ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３号、９０６〜９１８）。
【００９０】
本発明の方法を用いて同定された自家食作用誘導物質を用いてＴＧおよびＶＬＤＬの血中濃度を低減するのに有用な医薬組成物を調製することができる。このような同定された化合物は、これに限らないが、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せなどの、ＴＧおよびＶＬＤＬの血中濃度を低減させることから利益を受けるであろう疾患および障害を治療および予防するのにも有用であろう。
【００９１】
逆に、本発明の方法を用いて同定された自家食作用阻害剤を用いて、これらに限らないが過敏性腸症候群およびクローン病などのＴＧおよびＶＬＤＬの血中濃度の上昇から利益が得られるであろう疾患および障害を治療および予防するのに有用である医薬組成物を調製することができる。
【００９２】
本発明は本願明細書に記載の特定の方法、プロトコル、細胞系、および試薬に限るものではないことを理解されたい。一般に、以下に記載の細胞培養および分子遺伝学における試験手順は当該分野ではよく公知のものであり、よく用いられる。
【００９３】
組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、微生物培養、形質転換等のための標準的な方法が用いられる。一般に、酵素反応および精製ステップは製造業者の仕様に準拠して実施される。本発明の実施および試験においては本願明細書に記載のものと類似するかまたは同等であるどのような方法および材料も用いることができるが、選択された方法、装置、および材料を以下に記載する。
【００９４】
実施例試験手順
（材料）
グリセロール［１４Ｃ］トリオレイン酸（５７ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、［３Ｈ］グリセロール（１．１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、［１４Ｃ］オレイン酸（５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、［３５Ｓ］メチオニン／システイン（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、タンパク質Ａセファロース（商標）ＣＬ−４Ｂビーズ、およびＨＲＰ結合抗マウスまたは抗ラビットＩｇＧ抗体はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社から購入した。［３Ｈ］エイコサペンタエン酸（１５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入した。フィブロネクチン、モノダンシルカダベリン、およびオレイン酸はＳｉｇｍａ社から入手した。トリグリセリドおよびリン脂質標準液はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社から入手した。エイコサペンタエン酸（過酸化物を含まない）はＣａｙｍａｎ社から入手した。モノクローナル抗体抗ヒトａｐｏＢ抗体１Ｄ１はＲ．ＭｉｌｎｅおよびＹ．Ｍａｒｃｅｌ（オタワ心臓研究所）から提供を受けた。ポリクローナル抗ＭＴＰおよび抗ラットａｐｏＡＩ抗血清はＣ．Ｃ．Ｓｈｏｕｌｄｅｒｓ（ハマースミス病院、英国）およびＪ．Ｅ．Ｖａｎｃｅ（アルベルタ大学、カナダ）からそれぞれ提供を受けた。抗ラットＭａｐ１ＬＣ３抗血清はＡ．ＮａｒａおよびＴ．Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ（国立遺伝研究所、日本国、三島）の好意により提供を受けた。ヒトＬＤＬに対するポリクローナル抗血清は当研究所で作成した。プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび化学発光ブロッティング基質はＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社から購入した。培養プレートインサート（０．４μｍ、ＭＩＬＬＩＣＥＬＬ（商標）−ＣＭ、直径３０ｍｍ）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入した。
【００９５】
（細胞培養および脂肪酸の処理方法）
ヒトａｐｏＢ１００を安定して発現する形質転換ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞（ＭｃＬｅｏｄら、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９号、２８５２〜２８６２）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０％ウマ血清、および２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。規定通り、実験に先立って、２０％ＦＢＳ存在下で０．４ｍＭ脂肪酸で１６〜１８時間、この細胞を培養した。実験中、２０％ＦＢＳを含み、図の凡例に示した他の試薬を加えた新鮮培地に細胞を保管した。
【００９６】
（パルスチェイス試験）
ａｐｏＢの分泌効率を決定したパルスチェイス試験では、８０％の密集度で６０ｍｍの皿で細胞を培養し、０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡで１６時間、前培養した。［３５Ｓ］メチオニン／システイン（メチオニン１ｍｌで希釈した１００μＣｉ／ｍｌ、ならびに、２０％ＦＢＳおよび０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡを含む、システインを含まないＤＭＥＭ）で細胞を１時間標識し、追跡培地（２０％ＦＢＳおよび０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡを含むＤＭＥＭ）で指示された回数培養した。この培地で分泌され、および細胞に結合した３５ＳａｐｏＢ１００をヒトＬＤＬ由来のポリクローナル抗血清を用いて免疫沈降させ、記載（Ｔｒａｎら、２０００年）のようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィーによって解析した。異なる細胞下分画の膜および内腔内容物中のａｐｏＢ１００を決定したパルスチェイス試験では、［３５Ｓ］メチオニン／システイン（メチオニン４ｍｌで希釈した２００μＣｉ／ｍｌ、ならびに、２０％ＦＢＳおよび０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡを含む、システインを含まないＤＭＥＭ）で１００ｍｍの皿中の細胞を２０分間標識した。次いで、１５、３０、４５分間、この細胞を追跡培地で培養した。各追跡時間が終わると、培地を収集し、累積比率浮遊遠心分離（Ｗａｎｇら、１９９９年）にかけ、他のリポタンパク質（すなわち、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬ）からａｐｏＢ１００−ＶＬＤＬ１（Ｓｆ＞１００）およびａｐｏＢ１００−ＶＬＤＬ２（Ｓｆ２０〜１００）を分離させた。各画分の３５Ｓ−ａｐｏＢ１００を免疫沈降で回収した。また、各追跡時間が終わると、この標識した細胞を氷冷ホモジネート緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５０ｍＭショ糖、５ｍＭのＥＤＴＡ、およびセリン／システインプロテアーゼ阻害剤の混合物）中で捕獲し、２枚の１００ｍｍの皿の未標識の細胞と混合し、ボールベアリング式ホモジナイザーに１０回通過させることによって均質化し、以下に記載のような細胞下分画および炭酸処理に供した。
【００９７】
（細胞下分画）
３種類の細胞下分画（すなわち、ＥＲ画分１〜３；シス／メディアルゴルジ細胞画分４〜８；ディスタル−ゴルジ細胞画分９〜１５）は、これまでに記載されたような（Ｔｒａｎら、２００２年）ｐｏｓｔ−ｎｕｃｌｅａｒ浮遊物のＮｙｃｏｄｅｎｚ勾配遠心分離（ＨａｍｍｏｎｄとＨｅｌｅｎｉｕｓ、１９９４年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１２６号、４１〜５２；Ｒｉｃｋｗｏｏｄら、１９８２年。Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２３号、２３〜３１）を用いて細胞溶解物から得た。
【００９８】
（ａｐｏＢ１００結合膜およびミクロソームの内腔内容物の分析）
内腔内容物は、炭酸ナトリウム処理、その後遠心分離を行って膜から分離させた（Ｔｒａｎら、２００２年）。膜および内腔と結合している３５Ｓ標識化ａｐｏＢ１００は免疫沈降によって回収し、これまでに記載されたような（Ｔｒａｎら、２００２年）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィーによって解析した。
【００９９】
（競合酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ））
ＥＬＩＳＡプレートをヒトＬＤＬ（ＰＢＳで希釈した１ｍｇ／ｍｌ、１６時間４℃）でコーティングし、脱脂粉乳（ＰＢＳで希釈５％、２時間３７℃）で遮断し、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。連続希釈濃度のヒトＬＤＬおよび培地サンプルの存在下で、ａｐｏＢモノクローナル抗体１Ｄ１（１：６４，０００、１６時間４℃）でプレートを培養した。このプレートを洗浄し、ホースラディシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（１：１０，０００、２時間３７℃）で培養し、次に、ＥＬＩＳＡ用の液体基質系（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を添加した。この反応物をＯＤ６５５の分光光度計読取りによって比色分析法により定量化した。
【０１００】
（透過型電子顕微鏡）
通常の培養培地においてフィブロネクチンで事前にコーティングしたＭＩＬＬＩＣＥＬＬ（商標）−ＣＭインサート膜上で細胞を２０時間培養し、２０％ＦＢＳおよび０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡを含む新鮮ＤＭＥＭを用いてさらに４時間培養した。これまでに記載したように（Ｔｒａｎら、２００２年）透過型電子顕微鏡用にこのサンプルを処理した。単一および連続した薄片（銀／金干渉色）をＨｉｔａｃｈｉ Ｈ−７０００透過型電子顕微鏡で可視化し、負の倍率で取り込んだ（８，０００〜１２０，０００倍）。パノラマ式チリングを用いて広い領域を取り込んだ。これまでに記載された方法（Ｔｈｏｒｎｅ−Ｔｊｏｍｓｌａｎｄら、１９９８年、Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．、２５０号、３８１〜３９６）によって、７枚の連続像（正の倍率＝７０，０００倍）からゴルジ体領域から３Ｄモデルを作成し、次のような改変を行った。この連続領域をＩｍａｃ ７００ＭＨｚ Ｇ４コンピュータのＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．５へスキャンした。物体の輪郭作成および分離の前に、基準マーカーによる連続的な断片の位置合わせを行った。ＳＧＩ−ＯＳ ２上のＳｙｎｕにおいて繋ぎ合わせおよび体積レンダリングを行い、ＭａｃｈｉｎｔｏｓｈプラットフォームでＰｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて画像キャプチャを行った。リポタンパク質粒子と脂質液滴との組合せを表す電子密度が高い粒子の直径を、ＥＰＡ処理細胞からの無作為に選択された４０個のゴルジ体領域において測定した。負の倍率は４０，０００倍とし、ポジ画像はさらに３倍に拡大した。デジタル式測径器を用いて、測定はポジ画像から行った［所要範囲（正で０〜１５０ｍｍ）の技術仕様：最大解像度＝０．０１ｍｍ；精度＝０．０２ｍｍ；再現性＝０．０１ｍｍ］。本発明者らのシステムの精度は、２つの電子密度が高い粒子各々（直径２０ｎｍおよび４０ｎｍ）の直径を４０回測定することによって検証した。変換された平均測定値のＳＤは≦１ｎｍであった。ゴルジ体を選択し、シス−トランス極性を確立し、脂質／リポタンパク質粒子を測定するための基準は記載（Ｔｒａｎら、２００２年）されたようなものとした。内腔のゴルジ体小頭に直接並んでいる場合、または、内腔の場合とは異なり、膜がゴルジ体小頭から分岐している場合、脂質／リポタンパク質粒子を膜結合していると分類した。
【０１０１】
（免疫細胞化学）
フィブリノネクチンで事前にコーティングされたカバースリップ上に２４時間置き、２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで希釈した０．４ｍＭオレイン酸およびＥＰＡで４時間培養し、ＰＢＳで希釈した３％パラホルムアルデヒドで固定した。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳで希釈した１０％ＦＢＳ）中で１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３０分間透過処理し、一次抗体、すなわちヒトａｐｏＢ用のモノクローナル抗体１Ｄ１（１：１０００）およびラットＭａｐ１ＬＣ３用のポリクローナル抗体（１：２００）で１時間精査した。次いで、二次抗体（１：２００）の、すなわち、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８（緑色）と共役であるヤギ抗マウスＩｇＧおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４（赤色）と共役であるヤギ抗ウサギＩｇＧの混合物と共に１時間培養した。ＳｌｏｗＦａｄｅ ＡｎｔｉＦａｄｅキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いてカバースリップをスライドガラスの上に設置し、この画像をＭＲＣ−１０２４レーザー走査型共焦点イメージングシステムによって取り込んだ。
【０１０２】
（モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）標識）
マイクロウェル皿（ＭａｔＴｅｋ社）底のポリ−ｄ−リシンでコーティングしたガラスの上に細胞を２４時間載せ、２０％血清を含むＤＭＥＭで希釈した０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡで４時間培養した。次いで、細胞をＤＭＥＭで希釈した０．０５ｍＭのＭＤＣで３７℃、１０分間培養した（Ｂｉｅｄｅｒｂｉｃｋ、１９９５年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、６６号、３〜１４；ＭｕｎａｆｏとＣｏｌｏｍｂｏ、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．、１１４号、３６１９〜３６２９）。培養後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。固定後、細胞をＰＢＳで４回洗浄し、１２ビットＩＭＡＧＯ ＳＶＧＡ ＣＣＤカメラおよびＴｉｌｌ ＰｏｌｙｃｈｒｏｍｅＩＶ モノクロメータを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０倒立顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡によって分析した。フラーフィルターセット（Ｔ．Ｉ．Ｌ．Ｌ． Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ ＧｍｂＨ社）を用いてＭＤＣを３８０ｎｍで抽出した。ＴｉｌｌＶｉｓＩＯＮソフトウェア、ｖｅｒｓｉｏｎ４．０を用いてこの画像を処理した。
【０１０３】
（タンデム質量分析）
ＤＭＥＭ（２０％ＦＢＳ±０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡ）に細胞を１６時間保管し、新鮮培地（２０％ＦＢＳ±０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡ）を用いてさらに２時間再度培養した。ＥＲ（Ｎｙｃｏｄｅｎｚ画分１〜３）、シス／メディアルゴルジ体（画分４〜８）、およびディスタル−ゴルジ体（画分９〜１５）からの膜調製物および内腔調製物を、８枚の１００ｍｍ皿から貯蔵された細胞から抽出した。内部基準のように、２３０ピコモルのジミリストイル（１４：０−１４：０）ＰＣおよび１１０ピコモルのジパルミトイル（１６：０−１６：０）ＰＥ存在下で、クロロホルム／メタノール／酢酸／飽和塩化ナトリウム／Ｈ２Ｏ（体積比４：２：０．１：１：２）を用いてサンプルから脂質を抽出した。脂質抽出物の部分標本をタンデム質量分析に適用し、先に記載されたような（Ｔｒａｎら、２００２年；ＤｅＬｏｎｇら、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４号、２９６８３〜２９６８８）陰イオンモードで娘イオン分析によって、ＰＣおよびＰＥの分子種（すなわち、脂肪酸組成）を決定した。各分子種のピークの下の統合された面積を内部基準の面積と比較することによって定量化した。
【０１０４】
（その他のアッセイ）
変形例（Ｗａｎｇら、１９９９年）と共に、公開されている方法（Ｗｅｔｔｅｒａｕら、１９９２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８号、９９９〜１００１）に従ってＭＴＰのＴＧ転移活性を決定した。このホスファチド酸ホスフォヒドロラーゼ活性を確立された方法（Ｊａｍａｌら、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６号、２９８８〜２９９６）によって決定した。先に記載（Ｔｒａｎら、２０００年）されているように、ＴＬＣによって脂質の抽出および分析を行った。ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いてタンパク質を決定した。
【実施例１】
【０１０５】
ＥＰＡ処理によってＴＧ分泌量は低減される
オレイン酸またはＥＰＡで１６時間事前処理した細胞を［３５Ｓ］メチオニン／システインで３０分間標識し、正常培地（追跡）で１時間培養した。馴化培地（図１Ａ）またはミクロソームの内腔内容物（図１Ｂ）を比率浮遊遠心分離に供した。各画分の［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００を免疫沈降させ、ＳＤＳ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、フルオログラフィーによって可視化した。図１Ａおよび１Ｂの上部パネルは４回以上行った試験の代表的なフルオログラムであり、同様の結果が得られた。アスタリスクでマークした帯はＳＤＳ存在下では不溶性の［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００種を表している。図１Ａおよび１Ｂの下部パネルは、定量化した、各画分における（不溶性の種を含む）［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００種に関連する放射活性を示している。図１Ａおよび１Ｂの上部パネルに示したような「ＨＤＬ」は、浮遊密度が血漿ＨＤＬのものと似ているＬｐＢを指している。
【０１０６】
ヒト（Ｆｉｓｈｅｒら、１９９８年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、３９号：３８８〜４０１；Ｈｓｕら、２０００年、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７１号：２８〜３５；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９８６年、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、６１号：１２９〜１３４）およびサル（Ｐａｒｋｓら、１９８９年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、３０号：１５３５〜１５４４；Ｐａｒｋｓら、１９９０年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、３１号：４５５〜４６６）を対象にしたこれまでの試験から、ＥＰＡ処理によって血漿ＶＬＤＬ−ａｐｏＢ１００およびＶＬＤＬ−ＴＧ濃度は低減されることが明らかとなった。血中脂質が正常なヒト被験者および高脂血症ヒト被験者では、魚油食によって血漿ＴＧおよびＶＬＤＬ−ａｐｏＢは低下したが、ＬＤＬ−ａｐｏＢおよびＬＤＬ−コレステロールは上昇し、総血漿ａｐｏＢ濃度は変化しなかった（Ｎｅｓｔｅｌら、１９８４年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、７４号：８２〜８９；Ｆｉｓｈｅｒら、１９９８年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、３９号：３８８〜４０１）。内臓型肥満のヒトでは、ｎ−３脂肪酸補給によって、ＶＬＤＬ−ａｐｏＢ生産速度は２９％低下した（Ｃｈａｎら、２００３年、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７７号：３００〜３０７）。これらのデータは魚油の特異的標的はおそらく、大きくＴＧの濃度が高いａｐｏＢ含有リポタンパク質（ＬｐＢ）の組み立てである。ＥＰＡ処理を行えば、ＶＬＤＬの第２段階組み立てに阻害作用に影響を及ぼすかもしれないと仮定し、モデルとしてヒトａｐｏＢ１００形質転換ＭｃＡ−ＲＨ７７７７を用いてこの仮説を検証した。ＶＬＤＬの組み立てと分泌に関係のある一時的および空間的事象をオレイン酸処理条件とＥＰＡ処理条件との間で比較した。以下に記載のすべての実験においては、新しく合成されたａｐｏＢ１００のプロテアソーム媒介の細胞内分解を最小化し、および外来性のオレイン酸誘導ＶＬＤＬ組み立てを促進するために２０％血清を補給した培地で細胞を培養した（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１号：１８４４５〜１３４５５）。［３５Ｓ］アミノ酸で細胞を３０分間パルス標識し、（炭酸処理後に）その培地へと分泌されたかまたはミクロソームの内腔内に存在するかのいずれかであるリポタンパク質と結合したａｐｏＢ１００結合タンパク質を、１時間の追跡終了時に決定した。３０分のパルス終了時にａｐｏＢ１００へ取り込まれた［３５Ｓ］の量は、オレイン酸処理細胞とＥＰＡ処理細胞との間で同じであった（データは示さず）。１時間の追跡終了時、ＥＰＡ処理によって、その培地のＶＬＤＬ（ＶＬＤＬ１およびＶＬＤＬ２）中の［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００は（オレイン酸処理に比して５０％）減少し（図１Ａ）、ミクロソーム内腔の高密度の画分［例えば、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）およびＬＤＬ）］中の［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００は（６倍）増加した（図１Ｂ）。内腔のＶＬＤＬ結合ａｐｏＢ１００におけるオレイン酸処理細胞とＥＰＡ処理細胞との違いは分泌されたＶＬＤＬ（図１Ｂ）のものよりも著しいものではなく、このことは一部のＶＬＤＬを構築する能力がＥＰＡ処理細胞には保持されていたことを示している。
【０１０７】
ＥＰＡ処理細胞のミクロソーム内腔（および培地においても）では、ＳＤＳサンプル緩衝液に不溶であった［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００種の著明な上昇が認められたことは予想外であった（図１ＡおよびＢでアスタリスクで示した帯）。遅延している帯は、ヒトａｐｏＢを認識する抗体１Ｄ１と反応している（データは示さず）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に６％尿素を含んでいたために、ａｐｏＢ１００凝集を除去することはできなかった（データは示さず）。水溶性抗酸化物（例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン）または脂溶性抗酸化物（例えば、α−トコフェロール）のいずれかでサンプルを処理しても、ａｐｏＢ１００凝集を阻止できなかった（データは示さず）。ＥＰＡ処理細胞のミクロソーム内腔および培地において検出された明らかに凝集したこれらのａｐｏＢ１００種の性質は不明である。これらのａｐｏＢ１００種は、分泌経路内に蓄積した組み立て中間体を表すことができる（以下に示す）。分泌された［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の総量（すなわち、凝集した種を含む全画分中の［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の合計）を定量化したところ、ＥＰＡ処理細胞とオレイン酸処理細胞との間に同じような分泌が認められることが明らかとなった。さらに、競合ＥＬＩＳＡ法によってａｐｏＢ１００タンパク質を定量化したところ、１６時間インキュベーション後に培地に蓄積したａｐｏＢ１００タンパク質の量は、オレイン酸処理細胞と比較した場合にＥＰＡ処理細胞からは僅かに減少していたが（オレイン酸、２．７４±０．４８；ＥＰＡ、２．５±０．４３μｇ／ｍｌ）、その差は統計学的に有意なものには達しなかったことが明らかとなった（ｐ＞０．０５、ｎ＝３）。脂質を［３Ｈ］グリセロールで代謝標識したところ、ＥＰＡ処理細胞からの［３Ｈ］グリセロール標識ＴＧの分泌が５０％減少したが、細胞ＴＧへの［３Ｈ］グリセロールの取り込みはオレイン酸処理細胞よりもＥＰＡ処理細胞において高いことが明らかとなった。分泌されたＰＣへの［３Ｈ］グリセロールの取り込みは影響を受けなかった（表Ｉ）。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
これに加えて、これらの細胞培養試験のデータはインビボ試験（Ｎｅｓｔｅｌら、１９８４年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７４号：８２〜８９）と一致しており、ＥＰＡ処理によって、ＴＧの分泌は低下するが、分泌されたａｐｏＢ１００の量においてはごく僅かな低下であることを示している。
【実施例２】
【０１１０】
ＥＰＡ処理はａｐｏＢ１００のｐｏｓｔ−ＥＲ分解を促進する
オレイン酸およびＥＰＡで事前処理した細胞を［３５Ｓ］メチオニン／システインで１時間標識し、３時間まで追跡した。オレイン酸およびＥＰＡはパルスおよび追跡培地の両方に存在した。全細胞溶解物（図２Ａ）または馴化培地（図２Ｂ）からの［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００を免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、フルオログラフィーで可視化した。［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００に関連する放射活性を定量化した。図２Ａ〜２Ｂの上のパネルに示したように、データは１時間のパルス終了後の［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００に関連する放射活性の絶対量として表している。図２Ａ〜２Ｂの上部パネルに示したように、データは１時間のパルス終了後の３５Ｓ−ａｐｏＢ１００に関連する初期の数の％として表している。図２Ｃおよび２Ｄに示すように、細胞（図２Ｃ）および培地（図２Ｄ）の［３５Ｓ］−ａｐｏＡ−Ｉに関連する放射活性を同様に定量化した。この試験を繰り返し行ったところ、同様の結果が得られた。
【０１１１】
ＶＬＤＬ１粒子は総ＴＧの８０％を超えて担持しているが、オレイン酸処理されたＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞から分泌された総ａｐｏＢ１００については担持しているのは１０％未満であることがこれまでに明らかとなっている（Ｗａｎｇら、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４号：２７７９３−２７８００）。したがって、ｎ−３脂肪酸処理はＶＬＤＬ画分中のａｐｏＢ１００を選択的に減少させることが報告されているため（ＦｉｓｈｅｒとＧｉｎｓｂｅｒｇ、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：１７３７７〜１７３８０）、上記パルス（３０分）追跡（６０分）の試験はａｐｏＢ１００の分泌量の減少および翻訳後の分解量の増加を検出することはできなかったかもしれないという可能性を検討した。次の試験セットでは、ａｐｏＢ１００の［３５Ｓ］標識化を最大化し、および潜在的な翻訳後の分解を検証できるようにするために、パルス標識期間を１時間まで延長した。これらの条件下では、ＥＰＡ処理細胞（９．４３×１０４ｃｐｍ／皿）において１時間のパルス終了時にａｐｏＢ１００へ取り込まれた［３５Ｓ］の量は、オレイン酸処理細胞（６．４０×１０４ｃｐｍ／皿）の場合よりも約４０％大きかった（図２Ａ上）。１時間のパルス終了時にａｐｏＢ１００の標識が高くなっているのは、新しく合成されたａｐｏＢ１００の細胞内蓄積量が増加したことおよび／または分泌障害であることを反映しているものと考えられる。３時間の追跡終了時、ＥＰＡ処理細胞中の細胞結合［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の量はオレイン酸処理細胞の細胞結合［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の量に匹敵するレベルまで減少したが（図２Ａ上）、１時間のパルス後に観察された過剰な細胞結合［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００は追跡中に培地内で回復されなかったことが顕著であった（図２Ｂ上）。追跡終了時に分泌された代謝標識した全［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の比率を測定するものである分泌効率は、ＯＡ処理細胞に比してＥＰＡ処理細胞では６０％〜４０％まで減少した（図２Ｂ下）。追跡終了時の細胞結合［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００もオレイン酸処理に比して僅かに低かった（図２Ａ下）。同試験では、ａｐｏＡ−Ｉの合成または分泌はＥＰＡ処理による影響を比較的受けなかった（図２Ｃおよび２Ｄ）。これらの動態試験は、ＥＰＡ処理細胞ＭｃＡ−ＲＨ７７７７では、新しく合成されたａｐｏＢ１００部分は最初は細胞内に保持され、次いでプロテアソーム媒介のＥＲ分解よりは速くない機序を介して分解される。さらには、ＥＰＡ処理細胞中のａｐｏＢ１００の分解は、先に報告されたｐｏｓｔ−ＥＲ機序に類似する緩徐なプロセスを通して同様に達成される（ＦｉｓｈｅｒとＧｉｎｓｂｅｒｇ、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：１７３７７〜１７３８０）。
【実施例３】
【０１１２】
ＥＰＡ処理はＥＲまたはｐｒｏｘｉｍａｌゴルジ体を通って運ばれるａｐｏＢ１００に影響を及ぼさない
オレイン酸またはＥＰＡで事前処理した細胞を［３５Ｓ］メチオニン／システインで２０分間パルス標識し、０〜４５分間追跡した。細胞下分画をＮｙｃｏｄｅｎｚ勾配遠心分離によって分画し、ＥＲ、シス／メディアルゴルジ体、およびディスタル−ゴルジ体の膜（図３Ａ、種々の追跡時間による）および内腔内容物（図３Ｂ、４５分間の追跡後）を炭酸ナトリウムによって分離し、その後超遠心分離にかけた。３５Ｓ−ａｐｏＢ１００を免疫沈降させ、「実験手順」に記載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィーによって分解した。図３Ｂの下部パネルに示すように、アスタリスクでマークした帯はＳＤＳ存在下で不溶性である３５Ｓ−ＡｐｏＢ１００種を表す。
【０１１３】
近年の試験から、ａｐｏＢ１００のＥＲ出口はＶＬＤＬ組み立てにおいて重要な段階を表すことがあきらかとなった（Ｇｕｓａｒｏｖａら、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８号：４８０５１〜４８０５８）。パルス中にＥＰＡ処理細胞で発生するａｐｏＢ１００の蓄積量が改変されたａｐｏＢ１００出口かまたはそのＥＲ−ゴルジ体輸送に起因するものかどうかを決定するために、パルスチェイス分析を細胞下分画試験と組み合わせた。本発明者らはＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞では、新しく合成されたａｐｏＢ１００は主にＥＲ／ゴルジ体区画の膜に結合していたことを明らかにした（Ｔｒａｎら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：３１１８７〜３１２００）。膜結合［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００がＥＲを出たときの割合（４回の追跡時間点（すなわち、０、１５、３０、および４５分）から算出）は、オレイン酸処理細胞の場合（合計／分の−０．５９±０．１７％）よりもＥＰＡ処理細胞では高かった（合計／分の−１．２９±０．３８％）（ｐ＜０．０５）（図３Ａ上のパネル）。同様に、ディスタル−ゴルジ体中に現れた膜結合［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の割合は、オレイン酸処理細胞の場合（合計／分の０．３９±０．１１％）よりもＥＰＡ処理細胞では有意に高かった（合計／分の０．８３±０．１０％）（ｐ＜０．０５）（図３Ａ下部パネル）。シス／メディアルゴルジ体を通過した［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の割合は、２つの処理間で類似した（図３Ａ中間のパネル）。したがって、本発明者のデータによってＥＲ出口の障害もｐｒｏｘｉｍａｌ−ゴルジ体をゆっくりと通過することも１時間のパルス終了時にＥＰＡ処理細胞にａｐｏＢ１００の細胞蓄積があることを説明するものではないという証拠が得られる。
【０１１４】
４５分の追跡終了時、ＥＰＡ処理細胞のディスタル−ゴルジ体（炭酸塩で処理後）の内腔画分において［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の著しい蓄積を伴って、［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の増加がディスタル−ゴルジ体膜（図３Ａ）で検出され、その［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の大半はＩＤＬ／ＬＤＬ画分に結合していた（図３Ｂ）。このようにディスタル−ゴルジ体膜および内腔にａｐｏＢ１００が蓄積していることは、ＥＰＡ処理細胞において１時間のパルス後にａｐｏＢ１００が細胞内に蓄積することを少なくとも部分的に裏付けるものである（図１Ａ上部パネル）。これらの所見はＥＰＡ処理細胞において組み立ての中間体が増加していることを示唆している。ＶＬＤＬ組み立て障害がＥＰＡ処理細胞におけるＭＴＰ媒介ＴＧ移動のＴＧ合成の減衰に起因するものであるということを除外すれば、ＥＰＡ処理はホスファチド酸ホスフォヒドロラーゼ−１またはＭＴＰの活性に影響を及ぼさなかった（データは示さず）。したがって、この結果はＥＰＡがディスタル−ゴルジ体内および／またはディスタル−ゴルジ体の下流におけるＶＬＤＬ分泌にその阻害作用を及ぼす可能性があることを示している。
【実施例４】
【０１１５】
ＥＰＡ処理細胞のシスゴルジおよびトランスゴルジ内の粒子の大きさの分布
図４Ａおよび４Ｂに示すように、この棒グラフはゴルジ球形嚢１〜３（シスゴルジ）（Ａ）および球形嚢４〜６（トランスゴルジ）＋ＴＧＮ（Ｂ）内に貯蔵された粒子の直径を示している。図４Ｃに示すように、同定された５つの粒子型、すなわちＩ〜Ｖ型（分類スキーム用、図５Ｄを参照）について、棒グラフのＸ軸上の値を用いて、粒子径の範囲（薄い括弧）および平均径の値（目盛）±１ＳＤ（厚い括弧）をグラフにした。
【０１１６】
遠位の分泌区画内のリポタンパク質粒子および脂質粒子をＴＥＭによって分析し、第２段階のＶＬＤＬ組み立ての障害が形態学的に改変されたＶＬＤＬ組み立て中間体に関連するかどうかを決定した。ＶＬＤＬの組み立ておよび分泌を刺激するために、ＭｃＡｒｄｌｅ細胞は外来性オレイン酸で処理された。平均径が４０±１７ｎｍのリポタンパク質は、ゴルジ球形嚢４〜６（すなわち、ゴルジ体のｔｒａｎｓ側）およびトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）内で観察された（Ｔｒａｎら、２００２．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：２５０２３〜２５０３０）。ＥＰＡ処理細胞では、これらの＞８０ｎｍの粒子の集団がゴルジ体およびＴＧＮのシス（球形嚢１〜３）およびトランス−末端（球形嚢４〜６）の両方で増加した（図４Ａ〜Ｂ、棒グラフ）［ゴルジ球形嚢のシス−トランス極性の詳細な同定には以下の図４Ａの凡例を参照のこと］。著しい数のこれらの＞８０ｎｍの粒子は、さらに高い倍率のときを含む、粒子がインシチュでゴルジ体（図５Ａ〜Ｃ）において観察されるときにはっきりとわかる形態学的特徴に基づいて、Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ型（図４Ｃ）のいずれかとして特徴付けられる粒子から構成されていた。
【実施例５】
【０１１７】
ゴルジ体および関連する液胞において同定された５種類の脂質／リポタンパク質
図Ａ、ＢおよびＣに示したゴルジ層板は４つの球形嚢を有している（１〜４の印を付けた）。球形嚢１は特徴的な穿孔を有する（矢じり）。トランスゴルジ体ネットワーク（ＴＧＮ）をパネルＡおよびＢに示し、パネルＣには大槽膜（点線）によって部分的に包まれた大きなトランスゴルジ体結合液胞（ＧＡＶ）を示している。Ｉ〜Ｖで示した５種類の粒子はＴＧＮを含む、ゴルジ体およびＧＡＶに存在する。５種類の粒子のさらに高倍率の画像をパネルＤに示している。Ｉ〜ＩＩＩ型粒子の想像上のタンパク質の外殻（括弧）およびコア（白のアスタリスク）が、それらの間にあるリン脂質のように示されている（矢印）。ＩＩ型粒子では、物質の薄いストランドが、コアとリン脂質単層との間の細孔（小さいアスタリスク）にわたって存在している（矢印）。ＩＶ型粒子（白抜きやじり）およびＶ型粒子はそれぞれ、ＨＤＬサイズの構造体およびＶＬＤＬサイズの構造体を表している。パネルＡでは、球形嚢１および３にある２つのＩＶ型粒子（白抜き矢印）は膜結合しているが、ＴＧＮのＩＶ型粒子（黒の矢印）の１つは腔内であることに留意されたい。ゴルジ球形嚢では、Ｉ〜Ｖ型粒子は単独であるいは対（パネルＢの四角）になって発生するが、ＧＡＶではこの粒子はクラスター（パネスＣの四角）として観察されることが多く、これは高倍率の写真（Ｅ）ではいくつかのＩＶ型およびＶ型粒子に取り囲まれた単独のＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ型粒子から構成されている（それぞれ左、真中、右のパネル）。
【０１１８】
この形態学的所見に基づき、さらに高い倍率（図５Ｄ）のときを含む、粒子がインシチュでゴルジ体（図５Ａ〜Ｃ）において観察されるときにはっきりとわかる特徴的な形態学的特徴に基づいて、＞７５ｎｍの粒子のかなりの割合をＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ型（図４下部）として分類した。Ｉ〜ＩＩＩ型形態の粒子も細胞質内脂質の液滴の集団内の管状の滑らかなＥＲ、および細胞質において観察された（図示せず）。ＥＰＡ処理細胞のシス−ｍｏｓｔゴルジ球形嚢におけるＩ型粒子の平均的大きさ（１００ｎｍ）は、細胞質脂質液滴（０．１〜５０μｍ）について測定した範囲の下端にあり（ＭｕｒｐｈｙとＶａｎｃｅ、１９９９年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２４号：１０９〜１１５）、その形態（図５Ｄ、上部パネル）は細胞質脂質液滴のものと類似し、大きさに関係なくリン脂質単層およびタンパク質性の暈によって囲まれた電子密度が高いＴＧ芯を有していた（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ−Ｍａｃｋｉｅら、１９９５年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、３６号：１２１１〜１２２６）。したがって、Ｉ型粒子は、ＨＲＰ免疫細胞化学によりａｐｏＢに対して反応しないＳＥＲにおいて検出された粒子などのａｐｏＢを含まない脂質粒子に相当すると思われる（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９７６年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６９号：２４１〜２６３）。ＩＩおよびＩＩＩ型粒子はそれぞれ部分的な芯または芯がないことを示しており（図５Ｄ、上部パネル）、部分的または完全に脱脂された脂質粒子に相当する。分泌経路における脂質粒子の蓄積量は、以下に記載の脂質分割試験と矛盾しないものである。これらのデータは脂質液滴はＥＰＡ処理細胞のゴルジ体内に蓄積されるという形態学的証拠を提供している。ＩＶ型粒子（図５Ｄ、真中のパネル）は小さなＬｐＢ粒子と同様の大きさ（図４）を有する（＜２５ｎｍ：ＳｈｅｌｎｅｓｓとＳｅｌｌｅｒｓ、２００１年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．、１２号：１５１〜１５７）。ゴルジ体中で最も多くの粒子を表すＶ型粒子（図５Ｄ、下部パネル）は、ラット肝の分泌経路におけるａｐｏＢ反応性ＶＬＤＬ粒子およびラット肝のゴルジ細胞画分から分離されたＶＬＤＬ粒子（ｄ＜１．００６ｇ／ｍｌ）の大きさに相当する大きさ（２５〜７５ｎｍ；図４）を有していた（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９７６．Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．６９：２４１−２６３）（Ｖｅｒｋａｄｅら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４９９０−２４９９６）。ＥＰＡ処理細胞のＶ型細胞はオレイン酸処理細胞において検出されたリポタンパク質粒子（４０ｎｍ；Ｔｒａｎら、２００２年Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：３１１８７〜３１２００）よりも平均して大きかった（５４．５ｎｍ）。大きくなったｄ＜１．００６ｇ／ｍｌのＶＬＤＬ粒子（４６．１ｎｍ）もコリン欠損ラット肝の内腔から分離された（Ｖｅｒｋａｄｅら、１９９３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８号：２４９９０〜２４９９６）。
【０１１９】
したがって、ＶＬＤＬ組み立て障害はリポタンパク質の形態が大きくなった（図５Ｄ、下部パネル）著しい数の粒子（図４、Ｖ型）が生成されたことに関係している。ａｐｏＢ１００を含む完全に補充されたアポリポタンパク質を含むかどうかは未だ決定されていない。凝集したａｐｏＢ１００種がどのようにこれらの粒子に結合するかどうかも依然として解明されていない。
【０１２０】
電子密度の高い粒子の大半がシスゴルジおよびトランスゴルジの内腔では膜結合であったオレイン酸処理細胞の場合（Ｔｒａｎら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：３１１８７〜３１２００）とは異なり、ＥＰＡ処理細胞では、同定された５種類の粒子型のうちの４種（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ型）はゴルジ体を通して著しい膜結合を保持していた（表ＩＩ）。より小さいＩＶ型粒子のみが主に、シスゴルジ体およびトランスゴルジの内腔において膜結合していた（図５Ａ、表ＩＩ）。したがって、ａｐｏＢ１００はディスタル−ゴルジ体膜中に蓄積する（図３Ａ、下部パネル）という所見と合わせたＴＥＭデータからは、トランスゴルジで検出されたａｐｏＢ１００およびより大きなリポタンパク質サイズの粒子の両方について膜結合は増加したことが示唆される。
【０１２１】
表ＩＩはＥＰＡ処理細胞のゴルジ体中の粒子の膜結合の割合をまとめたものである。
【０１２２】
【表２】
【実施例６】
【０１２３】
トランスゴルジ結合液胞への脂質／リポタンパク質粒子の金属イオン封鎖
２つのゴルジ層板（ＧＡ１、ＧＡ２）はそれぞれ４個および５個の球形嚢（１〜４または５で印を付けた）からなる（パネルＡ）。球形嚢１は重なっているＥＲと密接に結合しており、特徴的な穿孔（矢じり）を有し、したがって、ゴルジ体のシス末端を表している。電子密度が高い粒子（短い黒の矢印）がゴルジ体のほかＴＧＮおよび分泌小胞（ＳＶ）に存在している。同様の粒子（長い黒矢印）が、大槽膜（点線）で包まれたＧＡＶに認められる（小さい黒のアスタリスク）。この大槽膜はリボソーム（黒の矢じり）結合ＥＲと連なっている。ゴルジ体からさらに離れて位置する大きな液胞（大きな黒のアスタリスク）は、高密度の分解内容物を含む。スケールバーは１μｍを表す。
【０１２４】
パネルＢは大槽膜（点線）によってゴルジ体のｔｒａｎｓ末端（ＧＡ）近傍でＧＡＶ（黒のアスタリスク）が包み込まれているのを示している。球形の粒子（黒の矢印）はＧＡＶ内に存在する。芽（白の矢印）、およびいくつかの小さな小嚢および細管を含んでいる陥入部（白の矢印は、ＧＡＶの１つに結合している）。黒の矢じりは微小管を表す。スケールバーは０．４μｍである。
【０１２５】
パネルＣの上部は、電子密度の高い粒子を含むＧＡＶ（小さな黒のアスタリスク）とこれらの粒子を含まない高密度の分解性液胞（大きな黒のアスタリスク）との間には密接に結合し、明らかに融合していることを示す（白の矢じり）。この画像の真中は電子密度の高い粒子（矢印）を含み、および陥入部分に小嚢／細管（小さな白のアスタリスク）を有するＧＡＶ（小さな黒のアスタリスク）を示している。
【０１２６】
パネルＤは２つのゴルジ体層板（シス−ｍｏｓｔゴルジ球形嚢、黄色；球形嚢２〜５、灰色；ＴＧＮ／ＳＶ、オレンジ色）およびこのゴルジ体層板の間にあるＧＡＶの集団（中間の青）の３Ｄモデルを示している。これらの液胞のいくつかはそれらの境界膜に陥入部分があることを示しており、小嚢／細管（紺青色）を収容している。隣接する粒子含有ＧＡＶの間の同型の融合は（パネルＣの異質の融合とは異なり）対になって向き合う矢じりで示されている。電子密度の高い粒子を含む膨らんだ部分（薄青）はトランスゴルジ球形嚢に連なっている；この連続性は、観察者に最も近い２つの膨らんだ部分のための区画（二重矢印）内にあることは明白である。シス−球形嚢の穿孔部分を白の矢じりで示している。
【０１２７】
パネルＥはパネルＤからの下方のゴルジ体層板を示しており、Ｘ軸に沿って１８０度回転させ、大槽膜（赤）を含むようにモデル化されたものである。トランスゴルジ体をわかり難くした粒子が満たされたＧＡＶ（中間の青）はこのモデルには含んでいない。赤道観で観察された２個のＧＡＶ（＊１、＊２）はそれらの周縁に沿って大槽膜に結合されている。「極観」で観察された他の２個のＧＡＶ（＊３、＊４）は大槽膜に包まれている。この大槽膜（赤）も（白色の点線）脂質／リポタンパク質を含む、トランスゴルジ液胞に直接連なっている膨張部（薄青）を包み込んでいる（二重矢印はあるセクション内にはっきり見える連続性を示す。１本矢印はセクション間にある連続性を同じく示す）。
【０１２８】
ＥＰＡ処理細胞では、大きくて少なくとも一部が組み立てられたリポタンパク質は、ＰＩ３キナーゼの阻害を受け易い機序によってｐｏｓｔ−ＥＲ区画において分解されるために選択的に標的にされたことがこれまでに報告されている（Ｆｉｓｈｅｒら、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６号：２７８５５〜２７８６３）。パルスチェイス試験（図３）は、ＥＰＡ処理細胞中のディスタル−ゴルジ体のある事象において、またはディスタル−ゴルジ体の下流側において、１時間後（図２Ａ）にａｐｏＢ１００の細胞内蓄積量が増加したこと、および３時間の追跡中（図２Ｂ）の培地にはこの蓄積されたａｐｏＢ１００の回復がないこともさらに説明することができることを指摘している。データが示すようにａｐｏＢ１００の分解が緩徐に生じるなら、ａｐｏＢ１００含有リポタンパク質組み立ての前駆物質および／または生成物は細胞内で分解を行う区画においてＴＥＭによって検出可能であると仮定された。
【０１２９】
分泌を行う区画（ゴルジ体、ＴＧＮ、および分泌小胞；図５Ａ、５Ｂ）で同定された５種類の電子密度の高い粒子（Ｉ〜Ｖ型）はすべて、ＧＡＶ集団でも同定されたことは明らかである（図５Ｃ）。
【０１３０】
分泌小嚢とは異なり、ＧＡＶはリボソームが結合したＥＲ（図６Ａ、矢じり）との連続性を示す大槽膜（点線、図６Ａ）によって包まれていた。この大槽膜の構成は自家食作用の初期相中に形成された「分離膜」の構成と似たものであった（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５２号：６５７〜６６８）。自家食作用は細胞が細胞質タンパク質およびオルガネラを自食胞の形成を通して分解されるためにリソソームまたは液胞まで運ぶＰＩ３キナーゼ依存性のプロセスである（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５２号：６５７〜６６８０）。自食胞形成中、ＥＲ、ＴＧＮ、またはデノボで合成された「ｐｈａｇｏｐｈｏｒｅ」膜由来の二重膜構造の分離膜は、標的とする膜または分子を隔離し、包み込む。この分離膜が閉じられることによって自食胞が形成されることになる。この試験で観察されたＧＡＶは複数の芽（図６Ｂ、白の矢印）および／または小嚢／細管（図６Ｂ、Ｃ、白のアスタリスク）を収容した陥入部分を有しており、このことはオートファゴソームからオートファゴリソソームへの転換中に後期エンドソームおよび／またはリソソームと共に発生する融合を想起させる（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５２号：６５７〜６６８）。ＧＡＶとゴルジ体領域（図６Ａ、Ｃ）近傍に位置する大きな分解液胞との間にはっきりとした融合の輪郭（図６Ｃ）が検出されたことは、ＧＡＶを分解経路と関連付け、また異型融合が生じることから自家食作用と矛盾しなかった（ＲｅｇｇｉｏｒｉとＫｌｉｏｎｓｋｙ、２００２年、Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｃｅｌｌ、１号：１１〜２１）。
【０１３１】
ＧＡＶ区画ならびにゴルジ体および分泌小嚢とのその関係の程度を３Ｄ連続切片モデルにさらに表した（図６Ｄ、６Ｅ）。このモデルおよび本発明者らの連続切片のライブラリでは、トランスゴルジ球形嚢の粒子が満たされた膨らんだ部分（図６Ｅ、薄青）は、ＧＡＶ（＊３〜４）を封入している膜（赤）と連なった大槽膜（白の点線）に包まれていた。このことにより粒子が満たされたＧＡＶはトランスゴルジから発生する可能性が高まる。
【０１３２】
次に、ＧＡＶがリポタンパク質代謝において機能していることを確認するために、ＧＡＶの粒子内容物をゴルジ体およびＴＧＮの内容物と比較した。ＧＡＶにおける５種類の粒子の相対的発生（Ｉ：ＩＩ：ＩＩＩ：ＩＶ：Ｖ＝１２％：２％：１１％：５％：７０％；ｎ＝２２１）は、トランスゴルジ体液球形嚢４〜６＋ＴＧＮ／分泌胞におけるものとほぼ同じであり（Ｉ：ＩＩ：ＩＩＩ：ＩＶ：Ｖ＝１２％：４％：１３％：５％：６６％；ｎ＝２８４）、これは特定の粒子型のＧＡＶへの選別が生じなかったこととを示唆している。すべての粒子型をＧＡＶに隔離することは、この細胞小器官がリポタンパク質代謝において重要な役割を担っていることを裏付けるものである。ゴルジ体対ＧＡＶにおいて粒子−内容物が類似していることは、自家食作用性分解が典型的には「大きな」分解区画であることと一致している（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００３年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３５号：５５３〜５６１）。しかし、ＧＡＶへと隔離された粒子は、分泌経路における結合と比べて、粒子−粒子結合が変えられていることを示した。ゴルジ体では、粒子は単独か、または対になった配置で検出されたが（１個のＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ型粒子および１個のＩＶまたはＶ型粒子、図５Ｂ）、ＧＡＶの粒子はクラスター化していることが多く見受けられた（複数のＩＶまたはＶ型粒子によって取り囲まれた１つのＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ型粒子；図５Ｃ、Ｅ）。
【０１３３】
また、ＧＡＶの粒子は分泌経路における結合に比べて、膜結合が大きく変えられていた。Ｉ−ＩＩＩ型およびＶ型はすべて、ゴルジ体、ＴＧＮ／ＳＶの場合よりも、ＧＡＶでは膜結合は少なかった（表ＩＩ）。粒子−粒子結合および粒子−膜結合の変化の重要性は不明であるが、これらの所見によってＧＡＶは分泌区画とは明確に異なった細胞区画を含んでいることを裏付けることができる。
【０１３４】
このように、ＴＥＭによってＧＡＶの区画が同定され、この区画はいくつかの形態学的基準（ＥＲとの周囲の関係、後生的な分解液胞との融合性、「多量の」隔離された含有物）によって自食胞と似ており、またリポタンパク質／脂質型粒子を隔離している。
【実施例７】
【０１３５】
ａｐｏＢおよびＭａｐ１ＬＣ３の免疫蛍光局在化
事前処理無し（対照群）の細胞、オレイン酸またはＥＰＡで事前処理した細胞を透過処理し、抗ヒトａｐｏＢ抗体（ａｐｏＢ）および抗ラットＭａｐ１ＬＣ３抗体（Ｍａｐ１ＬＣ３）でそれぞれ染色した。ａｐｏＢ用の二次抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８（緑）と共役させ、Ｍａｐ１ＬＣ３用の二次抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４（赤）と共役させた。図７のマージ画像の円はオレイン酸処理またはＥＰＡ処理細胞中のａｐｏＢリッチ領域へのＭａｐ１ＬＣ３の再分布を示している。図７の矢じりはＭａｐ１ＬＣ３およびａｐｏＢの共存を示している（挿入図に拡大している）。図７のスケールバーは１０μｍである。
【０１３６】
ＧＡＶが自食胞に対応し、およびリポタンパク質組立体の前駆物質および／または生成物を隔離することを裏付けるために、間接二重免疫系蛍光試験を行ってａｐｏＢ１００とＭａｐ１ＬＣ３との間の共存の可能性を確立した。ＰＩ３キナーゼ依存性プロセスを介して細胞質から分離膜へと補充されるＭａｐ１ＬＣ３を含む、ある群のＡＴＧ（自家食作用）遺伝子産物が自食胞形成中に必要とされた（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１５２号：６５７〜６６８；Ｋａｂｅｙａら、２０００年、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９号：５７２０〜５７２８）。対照群と比較して、Ｍａｐ１ＬＣ３およびａｐｏＢ１００の部分的共存を用いてａｐｏＢ１００が高濃度の周囲領域へのＭａｐ１ＬＣ３染色の浸透を強化することによって、図示（図７）のように、ＥＰＡおよびオレイン酸処理は自家食作用を誘導した。ａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣ３の共存はオレイン酸処理細胞よりもＥＰＡ処理細胞において顕著であった。
【実施例８】
【０１３７】
ＥＰＡ処理は自家食作用を増強する
図８Ａは対照のオレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞のモノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）標識を示している。スケールバーは１０μｍである。
【０１３８】
図８Ｂは対照のオレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞のＴＥＭ画像である。大きな矢印はゴルジ体近傍の高密度の液胞を示す（ＧＡ；斑点）。小さな矢印はオレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞のゴルジ体領域内の高密度の小さな液胞を示す。（Ｎ）は細胞画を表し、（Ｌ）は脂質液滴を表す。
【０１３９】
同量のＥＰＡまたはオレイン酸（０．４ｍＭ）で処理した細胞では、オートファゴリソソームの特異的マーカーであるＭＤＣと反応する高密度の液胞の巨大化によって実証されるように、オートファゴリソソームの形成もオレイン酸処理細胞よりもＥＰＡ処理細胞において顕著であった（Ｂｉｅｄｅｒｂｉｃｋら、１９９５年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．、６６号：３〜１４）（図８Ａ）。ＥＰＡ処理細胞中のＭＤＣに反応する液胞の大きさおよび分布は、ＴＥＭによって可視化されたように、ゴルジ体領域の外部に位置する高密度の分解液胞の分布と似ている（図８Ｂ、矢印）。ＴＥＭおよび免疫細胞化学のデータは共に、ＥＰＡ処理が自家食作用を増強すること、および脂質粒子とリポタンパク質粒子の割合は分泌経路から自食性分解区画へと転換されていることを示唆している。
【実施例９】
【０１４０】
１８：１（ｎ−９）ＴＧはＶＬＤＬの組み立ておよび分泌に利用される
細胞を［１４Ｃ］オレイン酸で２時間標識し、０．４ｍＭの外来性オレイン酸の存在下または不存在下で１時間、２時間、および４時間追跡した（図９Ａおよび９Ｂ、上部パネル）。同じく、細胞を［３Ｈ］ＥＰＡで２時間標識し、０．４ｍＭのＥＰＡの存在下または不存在下で最高４時間まで追跡した（図９Ａおよび９Ｂ、下部パネル）。各追跡時間に、細胞（図９Ａ）および培地（図９Ｂ）それぞれからすべての脂質を抽出し、ＴＬＣによって分析し、ＰＣ、ＰＥ、ＴＧおよび遊離脂肪酸（ＦＦＡ）に関連する放射活性をシンチレーション計測法によって定量化した。２時間の標識終了時に取り込まれた総放射活性の割合としてデータを示した（［１４Ｃ］オレイン酸標識細胞中には２．４×１０６および［３Ｈ］ＥＰＡ標識細胞中には６．１×１０５ｃｐｍ）。この結果は独立した２つの試験の平均値であり、エラーバーは偏差の範囲を示す。
【０１４１】
本発明者らのこれまでの研究は、リン脂質リモデリングを介して合成されたＴＧは第２段階ＶＬＤＬ組み立て中に利用されることを示唆している（Ｔｒａｎら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：３１１８７から３１２００）。ＥＰＡ処理がＶＬＤＬ組み立てを損なう機序を洞察するために、本発明者らはリン脂質リモデリングを介するＴＧ合成をオレイン酸処理細胞とＥＰＡ処理細胞との間で比較した。細胞を［１４Ｃ］オレイン酸または［３Ｈ］ＥＰＡで２時間標識し、それぞれ未標識の外来性オレイン酸またはＥＰＡの存在下で４時間まで追跡した。２時間の標識終了時（すなわち、追跡は０時間）、ＰＣ、ＰＥ、およびＴＧは、［１４Ｃ］オレイン酸処理細胞中の［１４Ｃ］で標識されたすべての細胞脂質の５３％、８％、および２７％をそれぞれ占め（図９Ａ、上部パネル）、ＥＰＡ処理細胞中の［３Ｈ］で標識されたすべての細胞脂質の４８％、３６％、および３％をそれぞれ占めた（図９Ａ、下部パネル）。したがって、［１４Ｃ］オレイン酸は主としてＰＣおよびＴＧへと取り込まれたが、［３Ｈ］ＥＰＡはＴＧではなくＰＣおよびＰＥへと取り込まれた。追跡中、［１４Ｃ］オレイン酸で標識したＰＣおよびＰＥの数は、外来性オレイン酸下存在では比較的一定であり（図９Ａ、上部パネルの黒丸）、これはこれまでの観察（Ｔｒａｎら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５号：２５０２３〜２５０３０）と一致するものであり、基本条件下（すなわち、外来性オレイン酸は存在しない）ではリン脂質の代謝回転の率は低いことを示している。対照的に、外来性オレイン酸処理は、［１４Ｃ］オレイン酸で標識したＰＣの代謝回転およびＴＧへの１８：１（ｎ−９）アシル鎖の移動を刺激した（図９Ａ、上部パネルの白抜きの丸）。
【０１４２】
［３Ｈ］ＥＰＡ標識細胞では、追跡中、ＰＣに結合する数は付随するＰＥの増加と共に減少し（図９Ａ、下部パネルの黒三角）、先に示されているように（Ｂａｌｓｉｎｄｅ、２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３６４号：６９５〜７０２）、このことはＰＣからＰＥへの２０：５（ｎ−３）アシル鎖の移動が基本条件（すなわち、外来性ＥＰＡがない）下で生じたことを示している。外来性ＥＰＡを追跡培地に添加したところ［３Ｈ］ＥＰＡ標識したＰＣおよびＰＥの両方の代謝回転が刺激され、ＰＣおよびＰＥ由来の２０：５（ｎ−３）アシル鎖は、４時間の追跡終了時の細胞における［３Ｈ］ＥＰＡの総放射活性の〜３０％を占めるＴＧへと移動した（図９Ａ、下部パネルの白三角）。外来性脂肪酸によって誘導されたリン脂質のリモデリングも、培地への遊離［１４Ｃ］オレイン酸または［３Ｈ］ＥＰＡの放出により明らかであった（図９Ｂの右パネルの白丸および白三角）。したがって、リン脂質のリモデリング中、個々のリン脂質の脱アシル化由来の１８：１（ｎ−９）および２０：５（ｎ−３）アシル鎖がＴＧ合成に利用される。追跡中、［１４Ｃ］オレイン酸−ＴＧまたは［３Ｈ］ＥＰＡ−ＴＧの分泌の間には著しい差が観察された。［１４Ｃ］オレイン酸−ＴＧが分泌され、その分泌はさらに外来性オレイン酸によって刺激されたが、［３Ｈ］ＥＰＡ−ＴＧは外来性ＥＰＡの有無に関わらず分泌されなかった（図９Ｂ、左パネル）。これらの結果は１８：１（ｎ−９）−ＴＧがＶＬＤＬの組み立ておよび分泌に利用されたが、２０：５（ｎ−３）ＴＧは利用されなかったことを示唆している。
【実施例１０】
【０１４３】
ＰＥリモデリングを介して合成されたＴＧは細胞質へ選択的にシャントされる
細胞を［１４Ｃ］オレイン酸で２時間標識し、０．４ｍＭのオレイン酸の不存在下（図１０Ａの白い棒グラフ）または存在下（図１０Ａの黒い棒グラフ）で４時間追跡した。細胞を［３Ｈ］ＥＰＡで２時間標識し、０．４ｍＭのＥＰＡの不存在下（図１０Ｂの白い棒グラフ）または存在下（図１０Ｂの黒い棒グラフ）で４時間追跡した。この細胞を均質化し、細胞内区画（すなわち、細胞質、ミクロソーム膜、およびミクロソーム内腔）を分画し、各画分から脂質を抽出し、ＴＬＣによって分解し、シンチレーション計測法によって定量化した。データは複製の平均値であり、２時間の標識終了時に取り込まれた総放射活性の割合で表している。偏差の範囲（図示せず）は平均値の５％未満であった。
【０１４４】
オレイン酸処理細胞とＥＰＡ処理細胞との間のＶＬＤＬ分泌のための１８：１（ｎ−９）−ＴＧおよび２０：５（ｎ−３）−ＴＧの利用の違いは、ＶＬＤＬ組み立てが利用可能な１８：１（ｎ−９）−ＴＧおよび２０：５（ｎ−３）−ＴＧの区画化の違いを反映していると思われる。ミクロソーム膜上でＰＣおよびＰＥが非対称的（すなわち、内腔側ではＰＣがリッチで、細胞質側ではＰＥがリッチである）に分布していることは、ＥＰＡおよびオレイン酸処理されるとＰＣ／ＰＥ比が変化することと共に、ＴＧが異なるプール（例えば、貯蔵用の細胞質プールおよびＶＬＤＬ組み立て用のミクロソームプール）へ分割化され得ると仮定される。
【０１４５】
この仮説を検証するために、放射線標識した脂質の細胞内分布を、［１４Ｃ］オレイン酸または［３Ｈ］ＥＰＡでそれぞれパルス標識した２群の細胞間で対比させ、培地±オレイン酸（図１０Ａ）またはＥＰＡ（図１０Ｂ）で追跡した。追跡終了時、［１４Ｃ］オレイン酸の大半はＰＣに結合していたが、［３Ｈ］ＥＰＡの大半はミクロソーム膜のＰＥおよびＰＣに結合していた（図１０Ａ、Ｂの真中の２つのパネル）。追跡中に外来性のオレイン酸またはＥＰＡを添加したところ、膜リン脂質に結合した［１４Ｃ］オレイン酸または［３Ｈ］ＥＰＡの減少および細胞質ＴＧに結合した［１４Ｃ］オレイン酸または［３Ｈ］ＥＰＡの増加が生じた（上部パネル）。細胞質ＴＧの増加の程度は１８：１（ｎ−９）−ＴＧよりも２０：５（ｎ−３）−ＴＧで一層大きかった。細胞を［３Ｈ］グリセロールでパルス標識し、次いでオレイン酸またはＥＰＡのいずれかの存在下で追跡した別の試験では、細胞質［３Ｈ］グリセロール−ＴＧの増加も、オレイン酸処理細胞よりもＥＰＡ処理細胞においてより顕著であった（データは示さず）。したがって、［３Ｈ］ＥＰＡ標識ＰＥリモデリングを介して合成されたＴＧは細胞質へと選択的にシャントされる。しかし、［１４Ｃ］オレイン酸標識ＴＧおよび［３Ｈ］ＥＰＡ標識ＴＧは、追跡中ミクロソーム内腔が増加したことを示し（下部パネル）、この追跡では、ＴＥＭによるゴルジ体中の脂質型液滴の検出と共に、ＥＰＡ処理細胞におけるＶＬＤＬ組み立て障害はＴＧがＶＬＤＬ組み立て部位で利用できないという結果のためだけではないことを示している。
【実施例１１】
【０１４６】
オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞における細胞下小器官の膜中のＰＣおよびＰＥ含有量
オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞における細胞下小器官の膜中のＰＣおよびＰＥ含有量を表ＩＩＩにまとめて示す。
【０１４７】
【表３】
【０１４８】
酵母ではＰＥによるＡｐｇ８／Ａｕｔ７（Ｍａｐ１ＬＣ３の相同分子種）の脂質化は自家食作用性の膜の最初の組み立てにとって不可欠であることが示されている（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１５２号：６５７〜６６８）。細胞内膜に結合したＰＣおよびＰＥの含有量および組成に対するＥＰＡおよびオレイン酸処理の効果を、タンデム質量分析を用いて決定した。ＥＰＡ処理細胞では総ＰＥ質量は８５％だけ増加し、ディスタル−ゴルジ体およびＥＲではそれぞれ１７０％および１１６％の増加が生じた（表ＩＩＩ）。総ＰＣ質量は未処理の対象群に比してＥＰＡ処理による影響を受けなかったが、オレイン酸処理細胞よりも低かった。
【０１４９】
オレイン酸処理では総ＰＥ質量には緩やかな増加（２９％）がみられ、これは主にＥＲで生じた（７２％）。細胞内ミクロソームに結合した総ＰＣ質量はオレイン酸処理によって５６％増加した。この増加の大半はＥＲ（８２％）およびディスタル−ゴルジ体（７３％）で生じた（表ＩＩＩ）。したがって、ＥＰＡはＰＥ含有量を大幅に増加させた。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】Ａは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞の馴化培地において観察されたａｐｏＢ１００結合リポタンパク質の密度分布を示すグラフである。上部パネルは代表的なフルオログラムから構成されている。下部パネルは各画分に関連する［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００の分布を示す折れ線グラフである。Ｂは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞から得られたミクロソームの内腔含有物において観察されたａｐｏＢ１００結合リポタンパク質密度分布を示すグラフである。上部パネルは代表的なフルオログラムから構成されている。下部パネルは各画分に関連する［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００の分布を示す折れ線グラフである。
【図２】Ａは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞の総細胞溶解物からのａｐｏＢ１００に関するパルスチェイス分析を示す折れ線グラフである。上部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００に関連する放射活性の絶対量としてデータを表している。下部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００に関連する初期カウント値の割合としてデータを表している。Ｂは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞からの馴化培地からのａｐｏＢ１００に関するパルスチェイス分析を示す折れ線グラフである。上部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００に関連する放射活性の絶対量としてデータを表している。下部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００に関連する初期カウント値の割合としてデータを表している。Ｃは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞の総細胞溶解物からのａｐｏＡ−１に関するパルスチェイス分析を示す折れ線グラフである。上部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＡ−１に関連する放射活性の絶対量としてデータを表している。下部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＡ１に関連する初期カウント値の割合としてデータを表している。Ｄは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞からの馴化培地からのａｐｏＡ−１に関するパルスチェイス分析を示す折れ線グラフである。上部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＡ−１に関連する放射活性の絶対量としてデータを表している。下部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００に関連する初期カウント値の割合としてデータを表している。
【図３】Ａは、２０分のパルス終了時のオレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞に関する、ＥＲ（上部パネル）、シス／メディアルゴルジ体（真中のパネル）およびディスタル−ゴルジ体（下部パネル）においてやり取りされた膜結合ａｐｏＢ１００を比較したものを示す折れ線グラフである。Ｂは、２０分のパルスおよび４５分の追跡終了後のオレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞からのＥＲ、シス／メディアルゴルジ体、およびディスタル−ゴルジ体の内腔画分に関する、ａｐｏＢ１００の免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィー分析の結果を示すグラフである。
【図４】Ａは、ゴルジ球形嚢１〜３（シスゴルジ体）内に貯蔵された粒子の直径を示す棒グラフである。Ｂは、ゴルジ球形嚢４〜６（トランスゴルジ）＋ＴＧＮ内に貯蔵された粒子の直径を示す棒グラフである。Ｃは、Ｉ〜Ｖ型粒子の粒径範囲を示すグラフである。
【図５】Ａ〜Ｅは、ゴルジ体および関連する液胞において同定された５種類の脂質／リポタンパク質粒子を示す透過型電子顕微鏡写真である。
【図６】Ａ〜Ｅは、ＥＰＡ処理細胞のトランスゴルジ領域の脂質／リポタンパク質含有液胞の形成を示す透過型電子顕微鏡写真である。
【図７】抗ヒトａｐｏＢ１００抗体および抗ラットＭａｐ１ＬＣ３抗体でブロットした、未処理の細胞、オレイン酸処理細胞、およびＥＰＡ処理細胞の免疫蛍光顕微鏡分析の結果を示す写真である。マージ画像の矢じりはａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣ３の共存を示している。
【図８】モノダンシルカダベリンで標識した、未処理の細胞、オレイン酸処理細胞、およびＥＰＡ処理細胞の免疫蛍光顕微鏡分析の結果を示す写真である。
【図９】Ａは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞からの細胞溶解物に関する、ＰＣ、ＰＥ、およびＴＧ脂質中の［１４Ｃ］オレイン酸（上部パネル）および［３Ｈ］ＥＰＡ（下部パネル）の分布を示す折れ線グラフである。Ｂは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞に関する、［１４Ｃ］オレイン酸（上部パネル）および（［３Ｈ］ＥＰＡ（下部パネル）で標識したＴＧおよびＦＦＡの分泌を示す折れ線グラフである。
【図１０】Ａは、細胞質（上部パネル）、ミクロソーム膜（中間パネル）、およびミクロソーム内腔（下部パネル）間の［１４Ｃ］オレイン酸で標識したＰＣ、ＰＥ、およびＴＧの分布を示す棒グラフである。Ｂは、細胞質（上部パネル）、ミクロソーム膜（中間パネル）、およびミクロソーム内腔（下部パネル）間の［３Ｈ］ＥＰＡで標識したＰＣ、ＰＥ、およびＴＧの分布を示す棒グラフである。Ｃは、ＰＣ（上部）およびＰＥ（下部）への［１４Ｃ］オレイン酸および［３Ｈ］ＥＰＡの取り込みを示す折れ線グラフである。
【図１１】リン脂質のリモデリング／代謝回転と代謝的に区別された、ＴＧプールの分布との間の関係を示す略図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はトリグリセリドおよびＶＬＤＬの分泌を調節する方法および化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高トリグリセリド血症は心血管疾患のリスクファクターあることが確認されている。高トリグリセリド血症は一般に２００ｍｇ／ｄＬを超える空腹時のトリグリセリド（ＴＧ）レベルであると定義される。ＴＧ血中濃度の上昇はＴＧ分泌上昇またはＴＧ分解低下のいずれかから生じるものと思われる。
【０００３】
肝は大きさおよび代謝経路が異質である超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の形態でＴＧを分泌する（ＰａｃｋａｒｄとＳｈｅｐｈｅｒｄ、１９９７年、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７号、３５４２〜３５５６）。ＶＬＤＬ粒子の各々はアポリポタンパク質（ａｐｏ）Ｂ１００の１つの複製および種々の量のＴＧを含んでいる（ＦｉｓｈｅｒとＧｉｎｓｂｅｒｇ、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７号、１７３７７〜１７３８０）。ラット肝癌ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞では、ＶＬＤＬの組み立てはｐｏｓｔ−小胞体（ＥＲ）区画において翻訳後に達成される（Ｔｒａｎら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７号、３１１８７〜３１２００）。その合成の後、ａｐｏＢ１００はＥＲを出て、小さな脂質と結合した膜結合形態のシス／メディアルゴルジ体を横断する。すなわち、ａｐｏＢ１００がディスタル−ゴルジ体に達するまでは、ａｐｏＢ１００と共に大きなＴＧを完全に組み立ててＶＬＤＬが形成されない（Ｔｒａｎら、２００２年）。ＥＲにおける脂質の乏しい始原のリポタンパク質粒子の形成は第１段階組み立てと呼ばれ、ｐｏｓｔ−ＥＲ区画内のＶＬＤＬへの大きなＴＧの取り込みは第２段階組み立てとして知られている（Ｒｕｓｔａｅｕｓら、１９９９年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．、１２９号、４６３Ｓ〜４６６Ｓ；Ｓｔｉｌｌｅｍａｒｋら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５号、１０５０６〜１０５１３）。第１段階組み立てに影響を及ぼす要因は、翻訳後修飾（例えば、ジスルフィド結合形成（Ｔｒａｎら、１９９８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７３号、７２４４〜７２５１）またはＮ結合型糖鎖合成（Ｖｕｋｍｉｒｉｃａら、２００２年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４３号、１４９６〜１５０７））によるか、またはａｐｏＢ１００とミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）（Ｄａｓｈｔｉら、２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１号、６９７８〜６９８７）との相互作用によるかのいずれかで、発生期のａｐｏＢ１００ポリペプチド鎖のフォールディングを支配することが多い。近年、第１段階組み立て障害を引き起こす、家族性低βリポタンパク症に関与する点変異Ｒ４６３Ｗが、ａｐｏＢのＭＴＰ結合領域内に同定された（Ｂｕｒｎｅｔｔら、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７８号、１３４４２〜１３４５２）。第１段階組み立ての減弱に関与する特徴には、新たに合成されるａｐｏＢ１００の細胞内分解の増加およびａｐｏＢ１００タンパク質の分泌の低下が挙げられる。ＥＲにおけるミスフォールドした新生ａｐｏＢ１００の分解は一般に、ユビキチン−プロテオソーム系によって媒介される（ＦｉｓｈｅｒとＧｉｎｓｂｅｒｇ、２００２年；Ｙａｏら、１９９７年、Ｊｉ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ、３８号、１９３７〜１９５３）。
【０００４】
他方、第２段階組み立てに影響を及ぼす要因は一般に脂質性である。実験的証拠からは、分泌経路に沿った膜のリン脂質組成は第２段階組み立ての重要な決定因子であることが次々と示唆されている。直接的（Ａｓｐら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５号、２６２８５〜２６２９２；Ｎｉｓｈｉｍａｋｉ（Ｍｏｇａｍｉ）ら、２００２年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、４３号、１０３５〜１０４５；Ｔｒａｎら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５号、２５０２３〜２５０３０）または間接的（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１号、１８４４５〜１８４５５；Ｗａｎｇら、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４号、２７７９３〜２７８００；ＹａｏとＶａｎｃｅ、１９８８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３号、２９９８〜３００４）にリン脂質を修飾する酵素の活性を改変することによって膜リン脂質組成を乱す薬剤を用いたこれまでの試験からは、そのようないくつかの要因が同定された。これらの酵素には、ＶＬＤＬ組み立てに許容的なミクロソーム膜環境を形成するオレオイル（１８：１（ｎ−９））鎖が補充された、ホスファチジルコリン（ＰＣ）種およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）種がある（Ｔｒａｎら、２０００年）。１８：１（ｎ−９）リッチなリン脂質種の形成は、肝細胞中のカルシウム依存性ホスホリパーゼＡ２（ｉＰＬＡ２）によって一部が媒介されるリン脂質リモデリング（すなわち、脱アリル化および再アリル化）を通して達成される（Ｔｒａｎら、２０００年）。これらのリン脂質の代謝回転も、ＴＧ合成（Ｔｒａｎら、２０００年）および膜の移動および融合において重要な役割を果たす１８：１（ｎ−９）−ホスファチジン酸および１８：１（ｎ−９）−ジグリセリドなどのシグナリング分子の形成（Ａｎｔｏｎｎｙら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２号、３０８４８〜３０８５１；Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｄｉｋら、１９９５年、Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．、１４６号、１〜１４）のための１８：１（ｎ−９）アシル鎖を提供する。ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞において、オレイン酸欠乏による膜リン脂質への１８：１（ｎ−９）の取り込みを制限し（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６年）ｉＰＬＡ２阻害によるリン脂質リモデリングを抑え（Ｔｒａｎら、２０００年）、およびＡＤＰリボシル化因子依存性ホスホリパーゼの阻害によってホスファチジン酸の形成を低下（Ｄ Ａｓｐら、２０００年）させれば、第２段階においてＶＬＤＬ組立体は変わらず低減されることになる。第２段階組み立ての障害の顕著な特徴は、Ｔｇの少ないａｐｏＢ１００を含む緻密なリポタンパク質（ＬｐＢ）の分泌である。分泌不能なＬｐＢは未だ不明な機序によって分解される運命にある。種々の条件下では、非プロテアソームおよびｐｏｓｔ−ＥＲ分解機序は、ａｐｏＢがＥＲを出た後に（すなわち第２段階組み立てで）、形成された異常なＬｐＢを除去すると仮定されてきた（Ｆｉｓｈｅｒら、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６号、２７８５５〜２７８６３；Ｐｈｕｎｇら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２号、３０６９３〜３０７０２；Ｗａｎｇら、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０号、２４９２４〜２４９３１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
今回、本発明者らは膜リン脂質の組成改変およびリモデリングにより、第２段階ＶＬＤＬ組み立てが阻害され、ｐｏｓｔ−ＥＲ分解が活性化されることを確認した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
今回、本発明者らは膜リン脂質の組成改変およびリモデリングにより、第２段階ＶＬＤＬ組み立てが阻害され、ｐｏｓｔ−ＥＲ分解が活性化されることを確認した。
【０００７】
本発明は、治療有効量の自家食作用誘導化合物を化合物を必要とする患者に投与するステップを含む、トリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低下させる方法を教示する。
【０００８】
本発明はトリグリセリドおよび／またはコレステロールの血中濃度を低下させるのに有用な医薬品を調製するための自家食作用誘導化合物の使用を教示する。
【０００９】
本発明は、治療有効量の自家食作用誘導化合物を該化合物を必要とする患者に投与するステップを含む、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せからなる群から選択される障害を治療または予防する方法を教示する。
【００１０】
本発明は、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せからなる群から選択される障害を治療または予防するのに有用な薬物を調製するための自家食作用誘導化合物の使用を教示する。
【００１１】
本発明の一実施形態では、自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、またはクラスＩＩＩのＰ１３’キナーゼであり得る。
【００１２】
本発明は（ａ）対照細胞培養系および試験細胞培養系を提供するステップと、（ｂ）前記試験細胞培養系の細胞に試験化合物を投与するステップと、（ｃ）前記対照細胞培養系および前記試験細胞培養系の自家食作用マーカーをアッセイするステップとを含み、前記対照細胞培養系と比較したときの前記試験細胞培養系の前記自家食作用マーカーの異常値は試験化合物が自家食作用を調節することを示す、自家食作用調節化合物を同定する方法を教示する。
【００１３】
本発明の一実施形態では、自家食作用マーカーはＥＲおよびゴルジ細胞画分中のＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体である。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、ＶＬＤＬ前駆体はＰＣ部分含有脂質である。該ＰＣ部分含有脂質は１８：１（ｎ−９）ＰＣであり得る。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態では、ＶＬＤＬ前駆体はＰＥ部分含有脂質である。該ＰＥ部分含有脂質は２０：５（ｎ−３）ＰＥであり得る。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態では、前記自家食作用マーカーは免疫蛍光法によってａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣ３の共存の程度を検出することによって決定される。
【００１７】
本発明は、（ａ）対照細胞培養系および試験細胞培養系を提供するステップと、（ｂ）前記試験細胞培養系の細胞に試験化合物を投与するステップと、（ｃ）前記対照細胞培養系および前記試験細胞培養系の自家食作用マーカーをアッセイするステップとを含み、前記対照細胞培養系と比較したときの前記試験細胞培養系の前記自家食作用マーカーの異常値は試験化合物が自家食作用を調節することを示す、自家食作用誘導化合物を同定する方法を教示する。
【００１８】
本発明の一実施形態では、前記自家食作用マーカーはＰＣ部分含有脂質である。該ＰＣ部分含有脂質は１８：１（ｎ−９）ＰＣであり得る。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態では、自家食作用マーカーはＰＥ部分含有脂質である。該ＰＥ部分含有脂質は２０：５（ｎ−３）ＰＥであり得る。
【００２０】
本発明の方法のいずれかの一実施形態では、細胞は肝細胞または肝癌細胞である。この細胞はヒトａｐｏＢ１００を発現するラット肝細胞またはヒトａｐｏＢ１００を発現するラット肝癌細胞であり得る。このラット肝癌細胞はＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞であり得る。該ａｐｏＢ１００は蛍光タンパク質またはテトラシステインなどのタグと融合し得る。
【００２１】
本発明は、トリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低減させるための、本発明の方法によって同定される自家食作用誘導化合物の使用を教示する。
【００２２】
本発明は、本発明の方法によって同定される自家食作用誘導化合物と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を教示する。
【００２３】
本発明は、本発明の方法によって同定される自家食作用誘導化合物と医薬的に許容される担体とを含む治療有効量の医薬組成物を投与するステップを含む、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せからなる群から選択される障害を治療または予防する方法を教示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
ｐｏｓｔ−ＥＲ分解を活性化すれば、ＴＧおよびＶＬＤＬ分泌は低下する。
【００２５】
本発明を特定の機構に限定するものではないが、ＴＧおよびＶＬＤＬ分泌は、自家食作用を促進して、脂質／リポタンパク質のｐｏｓｔ−ＥＲ分解を促進することによって調製することができると考えられる。本発明者らは膜リン脂質の組成改変およびリモデリングにより第２段階ＶＬＤＬ組み立てが阻害されることを確認した。特に、本発明者らは、膜ホスホチジルコリン（ＰＣ）／ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）比の改変はトリグリセリドの細胞内蓄積およびｐｏｓｔ−ＥＲ分解の活性化に関与することを確認した。
【００２６】
インビトロでのＴＧ分泌に対する阻害作用（ＬａｎｇとＤａｖｉｓ、１９９０年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１号、２０７９〜２０８６；ＷｏｎｇとＮｅｓｔｅｌ、１９８７年、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、６４号、１３９〜１４６）およびインビボでのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の血中ＴＧ低下作用（Ｈａｒｒｉｓ、１９９９年、Ｌｉｐｉｄｓ ３４ Ｓｕｐｐｌ．Ｓ２５７〜Ｓ２５８）が文書化されている。しかし、ＥＰＡの高トリグリセリド血症作用の機序については明らかになっておらず、議論の余地が残されている。
【００２７】
本発明者らはオレイン酸の作用とＥＰＡの作用とを比較することによって、第２段階ＶＬＤＬ組み立てに対する膜リン脂質リモデリングの影響を試験した。本発明者らは２０：５（ｎ−３）をリン脂質に取り込み、次にリモデリングを介してＴＧに取り込めば、第２段階ＶＬＤＬ組み立てに好ましくないリン脂質環境が生まれると仮定した。この仮説を試験するために、ａｐｏＢ１００の合成およびＥＲ出口がＥＰＡ処理による影響を受けない条件下でヒトａｐｏＢ１００を発現するＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞を培養した。本発明者らは、外来性脂肪酸によってリン脂質分子種を改変すれば、第２段階ＶＬＤＬ組み立て時にその合成および細胞内分布によって調製されるＴＧの補充に影響を及ぼすと共に、ｐｏｓｔ−ＥＲ分解区画の形成が同時に生じるように見えることを見出した。
【００２８】
本発明者は、ＶＬＤＬの第２段階組み立ては外来性脂肪酸の流入下で膜リン脂質リモデリング（すなわち脱アリル化／再アリル化）によって調節されることを見出した。ＶＬＤＬ組立体に関連するリン脂質リモデリングの重要な側面の１つは、（脱アシル化時に）放出されたアシル鎖をＴＧの合成において利用することにある。膜ＰＣへのオレイン酸の選択的取り込みは、ＰＣのグリセロ骨格のｓｎ−１およびｓｎ−２位におけるその存在のために、デノボ経路およびリモデリング経路の両方によって媒介されると考えられる。対照的に、膜リン脂質のそのｓｎ−２位へのＥＰＡの選択的取り込みおよびこの後のＰＣからＰＥへのそのＥＰＡの移動は、リモデリングプロセスの明らかな兆候である。ＥＰＡ取り込みのための選択的な行き先となるプールである細胞内Ｃａ２＋依存性ホスホリパーゼＡ２およびＰＥによって媒介される脱アシル化／再アシル化を介してリン脂質へ取り込まれるポリ不飽和酸の内因性が、近年、他の細胞型において明らかとなっている（Ｂａｌｓｉｎｄｅ。２００２年）。外来性脂肪酸が流入した時、リン脂質リモデリングから放出されるオレイン酸およびＥＰＡは両方共、ＴＧ合成にほとんど選択的に利用されない。しかし、本発明者らは、２０：５含有ＴＧは１８：１含有ＴＧに比べて分泌量が少ないことを見出し、このことは２０：５−ＴＧは非効率的にＶＬＤＬ組立体に利用されていることを示唆している。本発明者らは膜リン脂質の脱アシル化／再アシル化の内因性およびＰＣおよびＰＥへのオレイン酸およびＥＰＡの差別的取り込みによって、第２段階組み立てにおいて利用不可能で、有効に利用しても利用しなくてもよい異なったＴＧプールの形成がもたらされると考えている。
【００２９】
本発明者らは、膜のＰＣ／ＰＥ比を改変することは細胞質プールのＴＧの蓄積量およびｐｏｓｔ−ＥＲ分解の活性化に関与するものと断定した。異なるＴＧ種（すなわち、１８：１−ＴＧ／２０：５−ＴＧ）の形成の際のＰＣおよびＰＥのリモデリングの重要性に加えて、本発明者らはミクロソーム膜内のＰＣ／ＰＥ比の低下が第２段階ＶＬＤＬ組み立ての障害および細胞質プール内のＴＧの蓄積に関与することを見出した。ＰＣ／ＰＥ比の改変はマイクロソーム膜のＰＣまたはＰＥ含有量のいずれかを変えることによって達成することができると思われ、この改変は第２段階ＶＬＤＬ組み立ての効率の指標となり得る。本発明者らはＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞をオレイン酸処理したことがミクロソーム膜の、特にＥＲおよびディスタル−ゴルジ体のＰＣ含有量を増大させた（Ｗａｎｇら、１９９９年）と考えている。対照的に、ＥＰＡ処理すれば、ＶＬＤＬ組立体を効果的に阻害しているディスタル−ゴルジ体の膜内のＰＥ含有量は増大した（したがって、ＰＣ／ＰＥ比は低下した）。肝ＰＥレベルの上昇はＥＰＡ供給ラットに関しても報告されている（Ｋｏｔｋａｔら、１９９９年、Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ａ Ｍｏｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２２号、２８３〜２８９）。第２段階ＶＬＤＬ組み立て障害（ＨＤＬ分泌ではなくＶＬＤＬ分泌障害）に関与する肝ミクロソーム膜のＰＣ／ＰＥ比が低下することは、コリン欠乏症（Ｒｉｄｇｗａｙら、１９８９年）およびＰＥメチル化経路の阻害（Ｎｉｓｈｉｍａｋｉ（Ｍｏｇａｍｉ）ら、２００２年）（Ｎｏｇａら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７７号、４２３５８〜４２３６５）などのその他のモデルで観察されている。化学的阻害（Ｎｉｓｈｉｍａｋｉ（Ｍｏｇａｍｉ）ら、２００２年）またはマウス（Ｎｏｇａら、２００２年）を用いたＰＥメチルトランスフェラーゼの遺伝子破壊によるＰＥメチル化経路を介したＰＥからＰＣへの変換の崩壊は、ａｐｏＢ１００−ＶＬＤＬ分泌障害に関与したＰＣ／ＰＥ比が低下したことを示した。ＰＥメチル基転移酵素欠損動物の特にオスでは、肝ＰＥの上昇は肝ＴＧ蓄積量および血中ＴＧの減少に関与した。ラット初代肝細胞とは異なり、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞はＰＥメチル基転移酵素活性が乏しく（Ｃｕｉら、１９９５年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ、３１２号、９３９〜９４５）、外来性オレイン酸が培地に補給されなければＶＬＤＬを構築することはできない。外来性オレイン酸存在下のＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞におけるＶＬＤＬ組立体の修復の一部は、ＶＬＤＬ組立体に許容的なＰＣ／ＰＥ比の再確立（ＰＣ含有量の増大に起因する）によるものと思われる。ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞でのＰＥメチル基転移酵素の再構成によって、ａｐｏＢ１００−ＶＬＤＬにおけるＴＧ分泌量が増大し（ＤｅＬｏｎｇら、１９９９年）、肝細胞のメチル化経路によって合成された種に似た多様なＰＣ種が生成された（Ｎｏｇａら、２００２年）。膜リン脂質の非対象分布（Ｄａｌｅｋｅ、２００３年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４号、２３３〜２４２）（すなわち、特にゴルジ体のＶＬＤＬ組立体の部位では、内腔小頭にＰＣが多く、ミクロソーム膜の細胞質小頭にはＰＥが多い）はリモデリング中脂肪酸アシル鎖を受容および提供するそれらの固有特性と共に、代謝的に明らかに異なった２つのＴＧプールの形成に寄与する。その結果、ＥＰＡ処理で形成されたＴＧは、ＶＬＤＬ組立体は近付きにくいかもしれない細胞質プールにより多く蓄積された。異なる脂肪酸処理によって誘導されたＰＣ／ＰＥ比の改変と共にリン脂質リモデリングは、ＴＧ合成／分布およびＶＬＤＬ組立体に大きな影響を及ぼすと考えられる。
【００３０】
本発明者らは、ｐｏｓｔ−ＥＲ分解に関してディスタル−ゴルジ体の膜におけるＰＣ／ＰＥ比の改変の効果について試験した。自食胞形成のプロセス全体に関与する必須タンパク質の１つはＭａｐ１ＬＣ３であり、これは２つの形態、すなわち１８ｋＤａサイトゾル型および１６ｋＤａ膜結合型で存在する（Ｋａｂｅｙａら、２０００年）。この酵母相同体Ａｐｇ８／Ａｕｔ７ｐは、自食胞膜と結合するとＰＥと共役になる。したがって、膜結合型Ｍａｐ１ＬＣ３はＰＥ共役形態であると仮定されてきた（Ｉｃｈｉｍｕｒａら、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ、４０８号、４８８〜４９２）。自食胞形成は、「分離膜」と定義される膜構造体の形成と共に始まり、これは物質を徐々に包み込む、ＥＲ由来（Ｕｅｎｏら、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６号、１８９９５〜１８９９９）、トランスゴルジ体ネットワーク由来（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９０年、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３８号、５７３〜５８０）、および／または固有の、未同定の細胞内区画由来（Ｓｔｒｏｍｈａｕｇら１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３３５号、２１７〜２２４）であると仮定される。分離膜と液胞膜との間の融合によって自食胞が形成され、次にこの自食胞はリソソームと融合してオートファゴリソソームを形成し、その結果、内腔内容物が分解される（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９０年）。トランスゴルジ体近傍の二重膜構造に包まれた脂質／リポタンパク質を含む液胞のＴＥＭによる検出、および共焦点および蛍光顕微鏡による自家食作用マーカーＭａｐ１ＬＣ３およびＭＤＣの点状染色の増大の検出からはそれぞれ、自家食作用がＥＰＡ処理によって誘導されることが明らかに示されている。自食胞形成の本質的性質は、細胞生存に必須であるが（ＫｌｉｏｎｓｋｙとＥｍｒ、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０号、１７１７〜１７２１）、オレイン酸処理細胞および対照細胞両方でも検出されたように、ＥＰＡ処理における自家食作用の増加は、第２段階組み立ての機能障害の結果生じる、ディスタル−ゴルジ体中の蓄積された異常な脂質／リポタンパク質および／または細胞質中の脂質粒子の廃棄において重要な役割を果たすものと思われる。培養細胞における自食胞形成を、飢餓条件によって刺激することができるか（ＫｌｉｎｏｓｋｙとＥｍｒ、２０００年）、またはホスファチジルイノシチジル３−キナーゼの阻害剤である、ワートマニンまたは３−メチルアデニンによって阻害することができる（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１５２号、６５７〜６６８）。ａｐｏＢの非プロテアソーム分解はホスファチジルイノシチド３−キナーゼ阻害を受け易いという事実（Ｆｉｓｈｅｒら、２００１年；Ｐｈｕｎｇら、１９９７年）を考慮して、本発明者らは自家食作用はＶＬＤＬ組立体中のｐｏｓｔ−ＥＲ分解のためのミッシングリンクを表していると考えている。したがって第１段階組み立て中のａｐｏＢ分解はユビキチン−プロテアソーム経路によって媒介される（ＦｉｓｈｅｒとＧｉｎｓｂｅｒｇ、２００２年；Ｙａｏら、１９９７年）ことが知られているが、本発明者らは第２段階組み立ての障害から発生した異常な脂質／リポタンパク質は自家食作用によって少なくとも部分的には除去されると提唱する。代謝的にはっきりと区別できるＴＧプールのほか自食胞形成のリン脂質リモデリングと分布との関係を図１１に示している。
【００３１】
本発明者らは１８：１（ｎ−９）および２０：５（ｎ−３）アシル鎖を含む膜脂質はＶＬＤＬ組立体において重要であることを決定した。区画化された１８：１（ｎ−９）−ＴＧおよび２０：５（ｎ−３）−ＴＧプールはオレイン酸処理およびＥＰＡ処理が第２段階組み立てにどのように影響するかの違いを説明するが、膜リン脂質種の改変はＶＬＤＬ組立体に直接影響を及ぼす可能性もある。この分子種分析からは、ＥＰＡ処理によって、１８：１（ｎ−９）を含む膜結合ＰＣ種およびＰＥ種は著明に減少し、２０：５（ｎ−３）を含む種は著明に増加することが明らかになっている。本発明者らは、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞において、オレイン酸由来（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６年）またはｉＰＬＡ２の阻害（Ｔｒａｎら、２０００年）のいずれかによる、膜ＰＣおよびＰＥ中の１８：１（ｎ−９）アシル鎖の減少は第２段階ＶＬＤＬ組み立ての障害と密接に関係していることを実証した。両試験からは、オレイン酸はＶＬＤＬ組立体より先行するかまたはＶＬＤＬ組立体と同時に起こるＴＧ合成の基質として単に働くものではないことが示唆される。むしろ、ミクロソームリン脂質への１８：１（ｎ−９）アシル鎖の取り込みは、ＶＬＤＬへＴＧを効果的に大きく取り込むための膜プラットフォームを確立する。特に、ミクロソーム中の膜結合ａｐｏＢ１００は構築された／分泌されたＶＬＤＬの前駆体であるという膨大な証拠を考えれば、第２段階組み立てに適合する膜環境を確立することは重要である（Ｔｒａｎら、２００２年；Ｓｔｉｌｌｅｍａｒｋら、２０００年；ＨｅｂｂａｃｈｉとＧｉｂｂｏｎ、２００１年、Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．、４２号、１６０９〜１６１７；Ｒｕｓｔａｅｕｓら、１９９８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３号、５１９６〜５２０３）。この文脈により、膜動態力学に重要なホスファチジン酸およびジグリセリドなどの１８：１（ｎ−９）を含むその他の脂質（Ａｎｔｏｎｎｙら、１９９７年；Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｄｉｋら、１９９５年）も、第２段階組み立てプロセスを促進することが予想できる。
【００３２】
本発明者らはＥＰＡ処理細胞に１８：１（ｎ−９）含有ＰＣが著しく欠乏した状態のゴルジ体にＰＥが大量に蓄積されていることを観察した。これらの結果はまず、脂質ドナーおよび脂質受容体の組み立て中間体がＶＬＤＬ組立体部位にあることを明らかにしている。ＥＰＡ処理細胞のＴＥＭ形態計測解析データからは、ディスタル−ゴルジ体および液胞において元の脂質ドナー（Ｉ型）、中間脂質ドナー（ＩＩ型およびＩＩＩ型）、および新生リポタンパク質（ＩＶ型およびＶ型）と類似した異なるタイプの脂質／リポタンパク質粒子の存在が明らかとなった。膜結合ａｐｏＢ１００はＶＬＤＬの前駆物質であるので、第２段階組み立て障害は、ａｐｏＢ１００がディスタル−ゴルジ体の膜内に蓄積し、中間脂質／リポタンパク質粒子を収容した分解液胞の形成によって発現することは明らかである。ｐｏｓｔ−ＥＲ分解と第２段階ＶＬＤＬ組み立てとの間の均衡の一方または他方に向かう傾斜は、膜リン脂質種を改変することによって影響され得る。
【００３３】
したがって、本発明者らは、アポリポタンパク質Ｂならびに脂質およびリポタンパク質粒子のｐｏｓｔ−ＥＲ分解が生じる細胞内区画を同定し、特徴付けた。この区画の特徴は次のようなものである：
１．自家食作用経路の最近接（ｐｒｏｘｉｍａｌ−ｍｏｓｔ）で明確な区画はトランス−ゴルジ体近傍の液胞（ゴルジ体結合液胞ＧＡＶ）である。
【００３４】
２．ＧＡＶはリボシル化された小胞体と連続しているように見える大槽膜によって包まれている。これらの膜は自食されることになる物質の最初の隔絶に関与する「分離膜」に類似している。
【００３５】
３．ＧＡＶは脂質ドナー粒子および脂質受容体粒子の異なる成熟中間体を表すことが企てられた５種類の電子密度の高い粒子を含んでいる。同じ５種類の粒子は分泌経路（すなわち、小胞体およびゴルジ体）内にも観察されるが、その粒子は異なった粒子−粒子および粒子−膜関係を示す。
【００３６】
４．免疫蛍光試験に基づけば、Ｍａｐ１ＬＣ３（すべての自食構造体の、ただし最も強力な初期の自食構造体のマーカー）およびアポリポタンパク質Ｂ（超低密度リポタンパク質のタンパク質成分）はＧＡＶに共存している。
【００３７】
５．緻密な液胞は、自己蛍光薬モノダンシルカダベリンに反応するより進んだ分解内容物と共に、ＧＡＶ近傍に位置している。
【００３８】
医薬組成物および治療方法
自家食作用がＴＧおよびＶＬＤＬを調節するという本発明者らの発見を考えれば、本発明は、ＴＧおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を調節する自家食作用調節化合物の使用とＴＧおよび／またはＶＬＤＬの異常なレベルが特徴である疾患または障害の治療に有用な治療薬を調製するための自家食作用調節化合物の使用とを包含するものである。
【００３９】
（ＴＧおよびＶＬＤＬの血中濃度を低減させるのに有用な医薬組成物）
一態様では、本発明はトリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低減させるのに有用な医薬組成物製造用の自家食作用誘導化合物の使用を提供する。
【００４０】
トリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低減させるのに有用な本発明の医薬組成物は、自家食作用誘導化合物と、薬学的に許容できる担体を含む。「自家食作用誘導化合物」という用語は、自家食作用を、特にオートファゴソームのオートファゴリソソームへの熟成を促進することのできる有機小分子、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、および、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む核酸配列を包含する。
【００４１】
例えば、自家食作用阻害化合物は、自家食作用を阻害または下方制御するタンパク質の転写または発現を阻害するように設計されたアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。例えば、自家食作用誘導化合物は、自家食作用の公知の阻害剤であるＩ型ＰＩ３’キナーゼの転写または発現を阻害するアンチセンス配列であり得る。
【００４２】
自家食作用誘導化合物は自家食作用の誘導／開始を促進するタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子であり得る。例えば、自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、またはＩＩＩ型ＰＩ３’キナーゼなどの自家食作用アゴニストをコードする組換えＤＮＡ分子であり得る。
【００４３】
自家食作用誘導化合物は、自家食作用を阻害または下方制御するタンパク質を選択的に認識するか、または選択的にそのタンパク質に結合する抗体または抗体断片であり得る。例えば、自家食作用誘導化合物はＩ型ＰＩ３’キナーゼに結合する抗体であり得る。
【００４４】
自家食作用誘導化合物は自家食作用の誘導／開始を促進するタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子であり得る。例えば、この自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３（微小管結合タンパク質１Ｌ鎖３／ＬＣ３）、ＧＡＢＡＲＡＰ（γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ａ−受容体結合タンパク質）、ＧＡＴＥ１６（１６ｋＤａのゴルジ結合アデノシン三リン酸分解酵素エンハンサー）、およびＩＩＩ型ＰＩ３’キナーゼなどの自家食作用アゴニストをコードする組換えＤＮＡ分子であり得る。これらのタンパク質は酵母（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００３年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３５号、５５３〜５６１）および哺乳動物細胞における自家食作用の誘導／開始のためのアゴニストとして同定されている。先に示したタンパク質各々のイソ型を用いて本発明の医薬組成物を調製することができる。例えば、Ｍａｐ１ＬＣ３はラットでは２つのイソ型（ＩおよびＩＩ）で、ヒトＡ、Ｂ、およびＣでは３つのイソ型で存在する。
【００４５】
別の場合には、自家食作用誘導化合物は、これに限らないがＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、およびＩＩＩ型ＰＩ３’キナーゼなどの自家食作用を促進するタンパク質であり得る。
【００４６】
Ｍａｐ１ＬＣ３およびその酵母類似体は自家食作用膜内のＰＥ部分に共有結合すると考えられる。このため、膜内のＰＥの量／濃度を変える化合物は、本発明の医薬組成物の調製用の自家食作用誘導化合物として有用である。この自家食作用誘導化合物はその他の抗高脂症薬または心血管作動薬を含む医薬組成物として調製され得る。
【００４７】
（ＴＧおよびＶＬＤＬの血中濃度を上昇させるのに有用な医薬組成物）
別の態様では、本発明はＴＧおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を上昇させるのに有用な医薬組成物の調製用の自家食作用阻害化合物の使用を提供する。本発明の医薬組成物は自家食作用阻害化合物と薬学的に許容できる担体とを含む。「自家食作用阻害化合物」という用語は、有機小分子、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、および自家食作用を完全にまたは部分的に阻害することのできるＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を含む核酸配列を包含するものである。
【００４８】
本発明の好適な実施形態では、自家食作用阻害化合物は自家食作用の公知の阻害剤であり、およびホスファチジルイノシトール３’キナーゼ（ＰＩ３’キナーゼ）を阻害する、ワートマニン、３−メチルアデニンまたはＬＹ２９４００２である。
【００４９】
ラパマイシンは自家食作用の公知の阻害剤であり、これを用いて本発明の医薬組成物を調製することができる。ラパマイシンはｍＴｏｒ（哺乳動物のラパマイシンン標的）およびＰＩ３’キナーゼと相同性のあるＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼの機能を阻害する大環状ラクトンである。Ｉ型ＰＩ３’キナーゼも公知の自家食作用アンタゴニストであり、本発明の医薬組成物を調製するための自家食作用阻害化合物として用いることができる。
【００５０】
（医薬組成物の調製および投与）
本発明の医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠剤化、微粒子化、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥手段を用いて、それ自身が公知の方法で製造することができる。
【００５１】
したがって、本発明に従って使用される医薬組成物は、該活性化合物を医薬的に使用することのできる製剤に処理するのを容易にする賦形剤および佐剤を含む１つまたは複数の医薬的に許容可能な担体を用いた従来の方法で調製され得る。適した剤形は選択される投与経路に左右される。
【００５２】
注入の場合、本発明の薬剤は水溶液として、好適には、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水などの生理学的に適合する緩衝液として調製され得る。経粘膜投与の場合、浸透される障壁に適した浸透剤が製剤に用いられる。そのような浸透剤は一般に当業者には知られている。
【００５３】
経口投与の場合、活性化合物と当業者にはよく公知の薬学的に許容できる担体とを組み合わせることによって容易に本化合物を調製することができる。このような担体は本発明の化合物を治療される患者が経口摂取するための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調製できるようにする。経口用の医薬的調製物は、錠剤または糖衣錠の芯を得るために、場合によって得られる混合物を磨り潰し、必要に応じて、適した佐剤を添加した後にその顆粒混合物を処理することによって、固体賦形剤として得ることができる。適した固体賦形剤は、特に、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールなどの糖：例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのナトリウムなどのセルロース調製物といった充填剤である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、あるいはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどの塩といった崩壊剤を添加してもよい。
【００５４】
糖衣剤の芯には適したコーティングを施す。この目的のために、濃縮砂糖水が使用されてよく、場合によってはこの砂糖水はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適した有機溶媒または溶媒混合液を含んでよい。識別のため、または活性化合物投与量の異なる組合せを区別するために、染料または顔料を錠剤または糖衣剤のコーティングに添加してもよい。
【００５５】
経口投与に使用できる医薬製剤には、ゼラチンから作られた押し込み型カプセルのほか、グリセロールまたはソルビトールといった、ゼラチンおよび可塑剤から作られた軟らかい密閉カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、乳糖などの充填剤、でんぷんなどの結合剤、および／または滑石またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合によっては安定剤などと混合した活性成分を含むことができる。軟カプセルでは、活性成分は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適した液体に溶解または懸濁されてよい。また、安定剤を添加することもできる。経口投与用のすべての製剤は、そのような投与に適した投与量にしなければならない。
【００５６】
口腔投与の場合、該組成物は従来の方法で調製された錠剤またはトローチ剤の形態であってよい。
【００５７】
吸入投与の場合、本発明に従って使用するための化合物は便宜的には、適した推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、または他の適したガスを用いて、加圧されたパックからのエアゾールスプレーまたは噴霧器の形態で届けられる。加圧エアロゾルの場合、計量装置は計量された量を届けるために弁を設けることによって決定することができる。例えば、吸入器または送気器に使用するゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、本化合物と乳糖またはデンプンなどの適した粉末基剤の粉末混合物を含んで調製することができる。
【００５８】
該化合物は、注入、例えば、ボーラス注入または持続注入による非経口投与用に調製されてよい。注入用製剤は、防腐剤を添加した状態で、単位投与形態で、例えば、アンプルまたは複数回投与用容器で提供されてよい。該組成物は油性または水性媒体を用いた懸濁剤、溶液、または乳剤などの形態を取ってよく、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの調製用薬剤を含んでもよい。
【００５９】
非経口投与用の医薬製剤には水溶性形態の活性化合物の水溶液がある。また、活性化合物の懸濁剤は適した油状の注入用懸濁剤として調製され得る。適した脂溶性の溶媒または媒体には、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、あるいはリポソームが挙げられる。水性の注入用懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁剤の粘度を上げる物質を含んでよい。場合によっては、該懸濁剤は、高濃縮液の調製を可能にするために化合物の可溶性を上げる適した安定剤または薬剤を含んでもよい。
【００６０】
別の場合には、該活性成分は、使用前に適した媒体、例えば、滅菌したパイロジェンフリー蒸留水と共に構成されるように粉末形態であってよい。
【００６１】
該化合物は、例えばカカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐薬用基剤を含む、坐薬または滞留浣腸などの直腸用組成物として調製することもできる。
【００６２】
上記調剤に加え、本化合物はデポー製剤として調製され得る。そのような長時間作用調剤は埋め込み（例えば、皮下または筋内）によって、または筋内投与によって投与され得る。したがって、例えば、本化合物は適した高分子材料または疎水性材料（例えば、許容できるオイルに溶かした乳剤として）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として調製することができる。
【００６３】
本発明の疎水性化合物用の医薬的担体は、ベンジルアルコール、無極性界面活性剤、水混和性有機高分子、および水相を含む共溶媒系である。当然、共溶媒系の比率はその可溶性および毒性を壊すことなく相当に変えることがきる。さらに、該共溶媒成分の独自性を変えることができる。
【００６４】
別の場合には、疎水性医薬化合物のための他の送達系を用いてよい。
【００６５】
リポソームおよび乳剤は疎水性薬剤用の送達媒体または担体のよく公知の例である。ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒を用いることもできるが、通常はより高い毒性という犠牲が伴う。あるいは、該化合物は、治療薬剤を含む固体の疎水性高分子の半透性基質などの徐放系を用いて送達されてよい。種々の徐放性物質が確立されており、当業者にはよく知られている。徐放性カプセルはその化学的性質に応じて、数週間から１００日間以上にわたって化合物を放出する。治療薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質を安定化させるための別の戦略を用いてよい。
【００６６】
該医薬組成物は適した固相またはゲル相の担体または賦形剤を含んでもよい。
【００６７】
そのような担体または賦形剤の例には、これに限らないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどの高分子が挙げられる。
【００６８】
本発明の化合物の多くは、医薬的に適合性のある対イオンを有する塩として提供することができる。医薬的に適合性のある塩はこれに限らないが塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩はこれに相当する遊離塩基である水性溶媒または他のプロトン性溶媒中ではさらに溶け易くなる。
【００６９】
適した投与経路には、例えば、経口、直腸、経粘膜、経皮、または腸管投与；筋内、皮下、骨髄内注入のほか、髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、経鼻、または眼球内注入などの非経口送達がある。
【００７０】
標的薬物送達系、例えば、病的細胞のための抗体でコーティングされたリポソームを用いて薬剤を投与してよい。このリポソームは細胞に向かい、その細胞によって選択的に取り込まれる。
【００７１】
該医薬組成物は一般に、特異的適応または複数の適応の治療または予防のための有効な量で投与される。最適な投与量は、各治療方法および指示のための標準的方法によって、その指示、その重篤度、投与経路、複雑な条件等を考慮した上で決定されるであろうことを理解されたい。治療において、または予防として、該活性薬剤は注入可能な組成物として、例えば、無菌水性分散剤として、好適には等張液として個人に投与することができる。さらに、治療有効投与量とは、係る疾患に関連する症状の改善をもたらすのに十分な化合物の量を指す。本出願の化合物の調製および投与のための方法は、Ｍａｃｋ．Ｅ．Ｗ．、１９９０年、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、第１３版にみることができる。哺乳動物、特にヒトに投与する場合、本活性剤の１日の投与量レベルは、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、典型的には０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであると想定される。どのような場合であっても、医師は個人に最も適し、その特定の個人の年齢、体重、および反応と共に変動する実際の投与量を決定する。上記投与量は平均的な症例の例である。当然、より多いかまたはより少ない投与量が良いという個々の例も考えられ、そのような投与量は本発明の範囲にある。
【００７２】
（治療方法）
本発明はトリグリセリドおよびＶＬＤＬの血中濃度を改変する自家食作用調節化合物の使用を包含する。
【００７３】
一態様では、本発明はトリグリセリドおよびＶＬＤＬの血中濃度を低下させる自家食作用誘導化合物の使用を提供する。別の態様では、本発明はトリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度の上昇から生じるか、またはそれに関連する障害を治療または予防する自家食作用誘導化合物の使用を提供する。
【００７４】
トリグリセリドおよびＶＬＤＬの血中濃度の低減およびトリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度の上昇から生じるか、またはそれに関連する障害の治療または予防は、治療有効量の自家食作用誘導化合物をそれを必要とする患者に投与することによって達成することができる。
【００７５】
自家食作用誘導化合物によって治療され得るまたは予防され得る疾患および障害は、これに限らないが、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せが挙げられる。一般に、自家食作用誘導化合物およびその医薬組成物は、ＴＧおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低減させる際に有益となろう疾患を有する患者を治療するのに有用である。
【００７６】
医薬的活性剤の「有効量」または「治療有効量」とは、所望の効果を提供する薬または薬剤の無毒性であるが、十分な量を意味する。本発明の併用療法では、併用療法の１つの成分の「有効量」は、併用療法の他方の成分と併用して使用されるときに所望の効果を提供するのに有効な化合物の量である。「有効」である量は、個人の年齢および一般条件、特定の活性剤または複数の活性剤、等に応じて患者毎に変わる。したがって、正確な「有効量」を指定できるとは限らない。しかし、どのような個々の場合においても、適した「有効」量は通常の実験を用いて当業者によって決定され得る。
【００７７】
本発明によって包含されるどの活性薬剤の治療有効量も、当業者には明白である多数の因子および本願明細書の開示を考慮して左右されよう。特にこれらの因子には、投与される化合物の同定、その調製、使用される投与経路、患者の性別、年齢および体重、治療されている状態の重篤度、および胃腸管、肝胆道系および腎臓系に影響を及ぼす合併症の存在が挙げられる。投与量および毒性を決定する方法は、一般には動物を対象に開始され、次いで、著明な動物毒性が認められない場合にはヒトを対象に開始される試験を用いて、当業者にはよく知られている。脂質レベルを監視することによって投与量の適切性を判断することができる。この投与量が治療後１〜１０週間で血中ＴＧおよび／またはＶＬＤＬレベルを改善しない場合、投与量を増やすことができる。
【００７８】
投与される自家食作用誘導化合物がＤＮＡまたはＲＮＡ配列などの核酸配列の形態である場合、従来の遺伝子治療アプローチを用いることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡ配列形態での自家食作用誘導化合物の小胞体は、これに限らないが、送達媒体としのリポソームの使用を含む、当業者に公知の方法を用いて達成することができる。末端の修飾、環状分子の形成、またはｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｎａｔｅおよびチオホスホリル修飾結合などの代替的結合の使用によるものなどの分解に対して抵抗性のある形態である場合には、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を用いてもよい。また、核酸分子がポリリシンまたはトランスフェリンと共役である場合、核酸の送達は促進輸送によるものであってよい。核酸はこれに限らないが、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ＡＡＶ、およびアデノウイルスを含む種々のウイルス担体の任意のものによって細胞内へ輸送されてよい。
【００７９】
有機小分子、薬理学的化合物または薬剤、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体断片の形態で自家食作用誘導化合物を投与する場合、従来の薬物療法を用いることができる。この活性成分は上記のような適した医薬的担体を用いて投与することができる。
【００８０】
本発明の好適な実施形態では、トリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度の上昇から生じるか、またはそれに随伴する疾患の予防治療は、治療有効量のＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、ＩＩＩ型Ｐ１３’キナーゼまたはこれらの組合せによって達成される。
【００８１】
したがって本発明の組成物によって治療可能な疾患には、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せが挙げられる。
【００８２】
自家食作用調節化合物を同定する方法および同定された化合物の使用
本発明は自家食作用を増強または阻害する核酸、タンパク質、化合物または薬理学的製剤をスクリーニングする方法を含む。細胞をベースに下細胞溶解物および／または精製酵素アッセイを用いてこれらの増強化合物または阻害化合物を同定することができる。本願明細書で使用するように、「試験化合物」という用語には、これに限らないが、小分子（例えば、有機小分子）、薬理学的化合物または薬剤、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体断片、およびＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む核酸配列が挙げられる。
【００８３】
一態様では、本発明は脂質の分解量および分泌量の変動をアッセイすることを伴う自家食作用調節化合物を同定する方法を提供する。本方法は（ａ）対照細胞培養系および試験細胞培養系を提供するステップと、（ｂ）前記試験細胞培養系の細胞に試験化合物を投与するステップと、（ｃ）前記対照細胞培養系および試験細胞培養系において自家食作用マーカーをアッセイするステップとを含み、前記対照細胞培養系と比較して前記試験細胞培養系における前記自家食作用マーカーの異常値が試験化合物が自家食作用を調節したことを示す。
【００８４】
本発明の一実施形態では、自家食作用マーカーはＶＬＤＬまたはＶＬＤＬ前駆体である。本発明の別の実施形態では、アッセイされたＶＬＤＬ前駆体はＰＣ部分含有脂質およびＰＥ部分含有脂質を含む。さらに好適な実施形態では、ＰＣ部分含有脂質は１８：１（ｎ−９）ＰＣであり、ＰＥ部分含有脂質は２０：５（ｎ−３）ＰＥである。
【００８５】
ＥＲおよびゴルジ細胞画分中および試験細胞培養用の培地中のＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体のレベルが未処理の対照細胞培地と比較して異常である場合、化合物は自家食作用モジュレーターであると肯定的に同定される。（１）ＥＲおよびゴルジ細胞画分中に観察されたＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体のレベルが未処理の対照細胞について観察されたレベルよりも高い場合、および（２）その細胞培地中のＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体のレベルが未処理の対照細胞について観察されたレベルよりも低い場合、試験化合物は自家食作用誘導剤であると同定される。逆に、（１）ＥＲおよびゴルジ細胞画分中に観察されたＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体のレベルが未処理の対照細胞について観察されたレベルよりも低い場合、（２）その細胞培地中のＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体のレベルが未処理の対照細胞について観察されたレベルよりも高い場合、試験化合物は自家食作用阻害剤であると同定される。
【００８６】
ＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体は、高速液体クロマトグラフィーなどの当業者に公知のクロマトグラフィー法、より好適には公知の質量分析法を用いてアッセイすることができる。
【００８７】
別の態様では、本発明は膜組成の変化の分析を伴う、自家食作用誘導化合物を同定する方法を提供する。本発明は（ａ）細胞培養系の細胞に試験化合物を投与するステップと、（ｂ）ＥＲ細胞画分およびゴルジ細胞画分におけるＰＣ部分含有脂質およびＰＥ部分含有脂質をアッセイするステップとを含む。未処理の対照試験細胞と比較してＰＣ部分含有脂質が減少し、ＰＥ部分含有脂質が上昇している場合、試験化合物は自家食作用誘導化合物であると同定される。本発明の一実施形態では、アッセイされるＰＣ部分含有脂質は１８：１（ｎ−９）ＰＥ部分含有脂質であり、アッセイされるＰＥ部分含有脂質は２０：５（ｎ−３）ＰＥである。このＰＥおよびＰＣ部分含有脂質は、公知の質量分析法を用いてアッセイすることができる。
【００８８】
別の実施形態では、自家食作用バイオマーカーはａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣである。このバイオマーカーを免疫蛍光測定法を用いてアッセイして、ａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣの共存の程度を決定することができる。未処理の対照細胞と比較して、ａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣ３の共存の程度が異常である場合、試験化合物は自家食作用モジュレーターであると同定される。共存の程度が未処理細胞で観察されるものより大きい場合、試験化合物は自家食作用誘導剤であると同定される。逆に、共存が存在しない場合または共存の程度が未処理細胞で観察されるものより小さい場合、試験化合物は自家食作用阻害剤であると同定される。
【００８９】
本発明の方法のいずれも実行するのに有用な細胞培養系は真菌または哺乳動物の細胞系を含む。本発明の一実施形態では、この細胞は肝細胞または肝癌細胞であり得る。この細胞はヒトａｐｏＢ１００タンパク質を安定して発現するラット肝細胞または肝癌細胞であることがさらに好ましい。発現されたａｐｏＢ１００タンパク質は該タンパク質の検出および測定を容易にする標識融合タンパク質であってよい。例えば、本発明の方法は蛍光タグが付けられたａｐｏＢ１００を発現するＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞を用いて実施することができる。このような安定した細胞系を用いて、初期のヒットの化学的誘導体をスクリーニングし、最適な投与量を滴定し、市販の分子のライブラリをスクリーニングすることができる。ａｐｏＢ１００融合タンパク質は、蛍光タグ以外に当該分野では公知の他のタグを用いて調製することもできる。例えば、ａｐｏＢ１００タンパク質はテトラ−システイン−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−（Ｘは任意のアミノ酸）で標識化することができる。テトラ−システイン標識化タンパク質は、テトラシステイン２砒素系検出方法を用いてアッセイすることができる（Ｚｈａｎｇら、２００２年、Ｎａｒ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３号、９０６〜９１８）。
【００９０】
本発明の方法を用いて同定された自家食作用誘導物質を用いてＴＧおよびＶＬＤＬの血中濃度を低減するのに有用な医薬組成物を調製することができる。このような同定された化合物は、これに限らないが、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せなどの、ＴＧおよびＶＬＤＬの血中濃度を低減させることから利益を受けるであろう疾患および障害を治療および予防するのにも有用であろう。
【００９１】
逆に、本発明の方法を用いて同定された自家食作用阻害剤を用いて、これらに限らないが過敏性腸症候群およびクローン病などのＴＧおよびＶＬＤＬの血中濃度の上昇から利益が得られるであろう疾患および障害を治療および予防するのに有用である医薬組成物を調製することができる。
【００９２】
本発明は本願明細書に記載の特定の方法、プロトコル、細胞系、および試薬に限るものではないことを理解されたい。一般に、以下に記載の細胞培養および分子遺伝学における試験手順は当該分野ではよく公知のものであり、よく用いられる。
【００９３】
組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、微生物培養、形質転換等のための標準的な方法が用いられる。一般に、酵素反応および精製ステップは製造業者の仕様に準拠して実施される。本発明の実施および試験においては本願明細書に記載のものと類似するかまたは同等であるどのような方法および材料も用いることができるが、選択された方法、装置、および材料を以下に記載する。
【００９４】
実施例試験手順
（材料）
グリセロール［１４Ｃ］トリオレイン酸（５７ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、［３Ｈ］グリセロール（１．１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、［１４Ｃ］オレイン酸（５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、［３５Ｓ］メチオニン／システイン（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、タンパク質Ａセファロース（商標）ＣＬ−４Ｂビーズ、およびＨＲＰ結合抗マウスまたは抗ラビットＩｇＧ抗体はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社から購入した。［３Ｈ］エイコサペンタエン酸（１５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入した。フィブロネクチン、モノダンシルカダベリン、およびオレイン酸はＳｉｇｍａ社から入手した。トリグリセリドおよびリン脂質標準液はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社から入手した。エイコサペンタエン酸（過酸化物を含まない）はＣａｙｍａｎ社から入手した。モノクローナル抗体抗ヒトａｐｏＢ抗体１Ｄ１はＲ．ＭｉｌｎｅおよびＹ．Ｍａｒｃｅｌ（オタワ心臓研究所）から提供を受けた。ポリクローナル抗ＭＴＰおよび抗ラットａｐｏＡＩ抗血清はＣ．Ｃ．Ｓｈｏｕｌｄｅｒｓ（ハマースミス病院、英国）およびＪ．Ｅ．Ｖａｎｃｅ（アルベルタ大学、カナダ）からそれぞれ提供を受けた。抗ラットＭａｐ１ＬＣ３抗血清はＡ．ＮａｒａおよびＴ．Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ（国立遺伝研究所、日本国、三島）の好意により提供を受けた。ヒトＬＤＬに対するポリクローナル抗血清は当研究所で作成した。プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび化学発光ブロッティング基質はＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社から購入した。培養プレートインサート（０．４μｍ、ＭＩＬＬＩＣＥＬＬ（商標）−ＣＭ、直径３０ｍｍ）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入した。
【００９５】
（細胞培養および脂肪酸の処理方法）
ヒトａｐｏＢ１００を安定して発現する形質転換ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞（ＭｃＬｅｏｄら、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９号、２８５２〜２８６２）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０％ウマ血清、および２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。規定通り、実験に先立って、２０％ＦＢＳ存在下で０．４ｍＭ脂肪酸で１６〜１８時間、この細胞を培養した。実験中、２０％ＦＢＳを含み、図の凡例に示した他の試薬を加えた新鮮培地に細胞を保管した。
【００９６】
（パルスチェイス試験）
ａｐｏＢの分泌効率を決定したパルスチェイス試験では、８０％の密集度で６０ｍｍの皿で細胞を培養し、０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡで１６時間、前培養した。［３５Ｓ］メチオニン／システイン（メチオニン１ｍｌで希釈した１００μＣｉ／ｍｌ、ならびに、２０％ＦＢＳおよび０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡを含む、システインを含まないＤＭＥＭ）で細胞を１時間標識し、追跡培地（２０％ＦＢＳおよび０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡを含むＤＭＥＭ）で指示された回数培養した。この培地で分泌され、および細胞に結合した３５ＳａｐｏＢ１００をヒトＬＤＬ由来のポリクローナル抗血清を用いて免疫沈降させ、記載（Ｔｒａｎら、２０００年）のようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィーによって解析した。異なる細胞下分画の膜および内腔内容物中のａｐｏＢ１００を決定したパルスチェイス試験では、［３５Ｓ］メチオニン／システイン（メチオニン４ｍｌで希釈した２００μＣｉ／ｍｌ、ならびに、２０％ＦＢＳおよび０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡを含む、システインを含まないＤＭＥＭ）で１００ｍｍの皿中の細胞を２０分間標識した。次いで、１５、３０、４５分間、この細胞を追跡培地で培養した。各追跡時間が終わると、培地を収集し、累積比率浮遊遠心分離（Ｗａｎｇら、１９９９年）にかけ、他のリポタンパク質（すなわち、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬ）からａｐｏＢ１００−ＶＬＤＬ１（Ｓｆ＞１００）およびａｐｏＢ１００−ＶＬＤＬ２（Ｓｆ２０〜１００）を分離させた。各画分の３５Ｓ−ａｐｏＢ１００を免疫沈降で回収した。また、各追跡時間が終わると、この標識した細胞を氷冷ホモジネート緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５０ｍＭショ糖、５ｍＭのＥＤＴＡ、およびセリン／システインプロテアーゼ阻害剤の混合物）中で捕獲し、２枚の１００ｍｍの皿の未標識の細胞と混合し、ボールベアリング式ホモジナイザーに１０回通過させることによって均質化し、以下に記載のような細胞下分画および炭酸処理に供した。
【００９７】
（細胞下分画）
３種類の細胞下分画（すなわち、ＥＲ画分１〜３；シス／メディアルゴルジ細胞画分４〜８；ディスタル−ゴルジ細胞画分９〜１５）は、これまでに記載されたような（Ｔｒａｎら、２００２年）ｐｏｓｔ−ｎｕｃｌｅａｒ浮遊物のＮｙｃｏｄｅｎｚ勾配遠心分離（ＨａｍｍｏｎｄとＨｅｌｅｎｉｕｓ、１９９４年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１２６号、４１〜５２；Ｒｉｃｋｗｏｏｄら、１９８２年。Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２３号、２３〜３１）を用いて細胞溶解物から得た。
【００９８】
（ａｐｏＢ１００結合膜およびミクロソームの内腔内容物の分析）
内腔内容物は、炭酸ナトリウム処理、その後遠心分離を行って膜から分離させた（Ｔｒａｎら、２００２年）。膜および内腔と結合している３５Ｓ標識化ａｐｏＢ１００は免疫沈降によって回収し、これまでに記載されたような（Ｔｒａｎら、２００２年）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィーによって解析した。
【００９９】
（競合酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ））
ＥＬＩＳＡプレートをヒトＬＤＬ（ＰＢＳで希釈した１ｍｇ／ｍｌ、１６時間４℃）でコーティングし、脱脂粉乳（ＰＢＳで希釈５％、２時間３７℃）で遮断し、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。連続希釈濃度のヒトＬＤＬおよび培地サンプルの存在下で、ａｐｏＢモノクローナル抗体１Ｄ１（１：６４，０００、１６時間４℃）でプレートを培養した。このプレートを洗浄し、ホースラディシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（１：１０，０００、２時間３７℃）で培養し、次に、ＥＬＩＳＡ用の液体基質系（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を添加した。この反応物をＯＤ６５５の分光光度計読取りによって比色分析法により定量化した。
【０１００】
（透過型電子顕微鏡）
通常の培養培地においてフィブロネクチンで事前にコーティングしたＭＩＬＬＩＣＥＬＬ（商標）−ＣＭインサート膜上で細胞を２０時間培養し、２０％ＦＢＳおよび０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡを含む新鮮ＤＭＥＭを用いてさらに４時間培養した。これまでに記載したように（Ｔｒａｎら、２００２年）透過型電子顕微鏡用にこのサンプルを処理した。単一および連続した薄片（銀／金干渉色）をＨｉｔａｃｈｉ Ｈ−７０００透過型電子顕微鏡で可視化し、負の倍率で取り込んだ（８，０００〜１２０，０００倍）。パノラマ式チリングを用いて広い領域を取り込んだ。これまでに記載された方法（Ｔｈｏｒｎｅ−Ｔｊｏｍｓｌａｎｄら、１９９８年、Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．、２５０号、３８１〜３９６）によって、７枚の連続像（正の倍率＝７０，０００倍）からゴルジ体領域から３Ｄモデルを作成し、次のような改変を行った。この連続領域をＩｍａｃ ７００ＭＨｚ Ｇ４コンピュータのＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．５へスキャンした。物体の輪郭作成および分離の前に、基準マーカーによる連続的な断片の位置合わせを行った。ＳＧＩ−ＯＳ ２上のＳｙｎｕにおいて繋ぎ合わせおよび体積レンダリングを行い、ＭａｃｈｉｎｔｏｓｈプラットフォームでＰｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて画像キャプチャを行った。リポタンパク質粒子と脂質液滴との組合せを表す電子密度が高い粒子の直径を、ＥＰＡ処理細胞からの無作為に選択された４０個のゴルジ体領域において測定した。負の倍率は４０，０００倍とし、ポジ画像はさらに３倍に拡大した。デジタル式測径器を用いて、測定はポジ画像から行った［所要範囲（正で０〜１５０ｍｍ）の技術仕様：最大解像度＝０．０１ｍｍ；精度＝０．０２ｍｍ；再現性＝０．０１ｍｍ］。本発明者らのシステムの精度は、２つの電子密度が高い粒子各々（直径２０ｎｍおよび４０ｎｍ）の直径を４０回測定することによって検証した。変換された平均測定値のＳＤは≦１ｎｍであった。ゴルジ体を選択し、シス−トランス極性を確立し、脂質／リポタンパク質粒子を測定するための基準は記載（Ｔｒａｎら、２００２年）されたようなものとした。内腔のゴルジ体小頭に直接並んでいる場合、または、内腔の場合とは異なり、膜がゴルジ体小頭から分岐している場合、脂質／リポタンパク質粒子を膜結合していると分類した。
【０１０１】
（免疫細胞化学）
フィブリノネクチンで事前にコーティングされたカバースリップ上に２４時間置き、２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで希釈した０．４ｍＭオレイン酸およびＥＰＡで４時間培養し、ＰＢＳで希釈した３％パラホルムアルデヒドで固定した。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳで希釈した１０％ＦＢＳ）中で１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３０分間透過処理し、一次抗体、すなわちヒトａｐｏＢ用のモノクローナル抗体１Ｄ１（１：１０００）およびラットＭａｐ１ＬＣ３用のポリクローナル抗体（１：２００）で１時間精査した。次いで、二次抗体（１：２００）の、すなわち、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８（緑色）と共役であるヤギ抗マウスＩｇＧおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４（赤色）と共役であるヤギ抗ウサギＩｇＧの混合物と共に１時間培養した。ＳｌｏｗＦａｄｅ ＡｎｔｉＦａｄｅキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いてカバースリップをスライドガラスの上に設置し、この画像をＭＲＣ−１０２４レーザー走査型共焦点イメージングシステムによって取り込んだ。
【０１０２】
（モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）標識）
マイクロウェル皿（ＭａｔＴｅｋ社）底のポリ−ｄ−リシンでコーティングしたガラスの上に細胞を２４時間載せ、２０％血清を含むＤＭＥＭで希釈した０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡで４時間培養した。次いで、細胞をＤＭＥＭで希釈した０．０５ｍＭのＭＤＣで３７℃、１０分間培養した（Ｂｉｅｄｅｒｂｉｃｋ、１９９５年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、６６号、３〜１４；ＭｕｎａｆｏとＣｏｌｏｍｂｏ、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．、１１４号、３６１９〜３６２９）。培養後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。固定後、細胞をＰＢＳで４回洗浄し、１２ビットＩＭＡＧＯ ＳＶＧＡ ＣＣＤカメラおよびＴｉｌｌ ＰｏｌｙｃｈｒｏｍｅＩＶ モノクロメータを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０倒立顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡によって分析した。フラーフィルターセット（Ｔ．Ｉ．Ｌ．Ｌ． Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ ＧｍｂＨ社）を用いてＭＤＣを３８０ｎｍで抽出した。ＴｉｌｌＶｉｓＩＯＮソフトウェア、ｖｅｒｓｉｏｎ４．０を用いてこの画像を処理した。
【０１０３】
（タンデム質量分析）
ＤＭＥＭ（２０％ＦＢＳ±０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡ）に細胞を１６時間保管し、新鮮培地（２０％ＦＢＳ±０．４ｍＭオレイン酸またはＥＰＡ）を用いてさらに２時間再度培養した。ＥＲ（Ｎｙｃｏｄｅｎｚ画分１〜３）、シス／メディアルゴルジ体（画分４〜８）、およびディスタル−ゴルジ体（画分９〜１５）からの膜調製物および内腔調製物を、８枚の１００ｍｍ皿から貯蔵された細胞から抽出した。内部基準のように、２３０ピコモルのジミリストイル（１４：０−１４：０）ＰＣおよび１１０ピコモルのジパルミトイル（１６：０−１６：０）ＰＥ存在下で、クロロホルム／メタノール／酢酸／飽和塩化ナトリウム／Ｈ２Ｏ（体積比４：２：０．１：１：２）を用いてサンプルから脂質を抽出した。脂質抽出物の部分標本をタンデム質量分析に適用し、先に記載されたような（Ｔｒａｎら、２００２年；ＤｅＬｏｎｇら、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４号、２９６８３〜２９６８８）陰イオンモードで娘イオン分析によって、ＰＣおよびＰＥの分子種（すなわち、脂肪酸組成）を決定した。各分子種のピークの下の統合された面積を内部基準の面積と比較することによって定量化した。
【０１０４】
（その他のアッセイ）
変形例（Ｗａｎｇら、１９９９年）と共に、公開されている方法（Ｗｅｔｔｅｒａｕら、１９９２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８号、９９９〜１００１）に従ってＭＴＰのＴＧ転移活性を決定した。このホスファチド酸ホスフォヒドロラーゼ活性を確立された方法（Ｊａｍａｌら、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６号、２９８８〜２９９６）によって決定した。先に記載（Ｔｒａｎら、２０００年）されているように、ＴＬＣによって脂質の抽出および分析を行った。ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いてタンパク質を決定した。
【実施例１】
【０１０５】
ＥＰＡ処理によってＴＧ分泌量は低減される
オレイン酸またはＥＰＡで１６時間事前処理した細胞を［３５Ｓ］メチオニン／システインで３０分間標識し、正常培地（追跡）で１時間培養した。馴化培地（図１Ａ）またはミクロソームの内腔内容物（図１Ｂ）を比率浮遊遠心分離に供した。各画分の［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００を免疫沈降させ、ＳＤＳ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、フルオログラフィーによって可視化した。図１Ａおよび１Ｂの上部パネルは４回以上行った試験の代表的なフルオログラムであり、同様の結果が得られた。アスタリスクでマークした帯はＳＤＳ存在下では不溶性の［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００種を表している。図１Ａおよび１Ｂの下部パネルは、定量化した、各画分における（不溶性の種を含む）［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００種に関連する放射活性を示している。図１Ａおよび１Ｂの上部パネルに示したような「ＨＤＬ」は、浮遊密度が血漿ＨＤＬのものと似ているＬｐＢを指している。
【０１０６】
ヒト（Ｆｉｓｈｅｒら、１９９８年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、３９号：３８８〜４０１；Ｈｓｕら、２０００年、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７１号：２８〜３５；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９８６年、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、６１号：１２９〜１３４）およびサル（Ｐａｒｋｓら、１９８９年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、３０号：１５３５〜１５４４；Ｐａｒｋｓら、１９９０年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、３１号：４５５〜４６６）を対象にしたこれまでの試験から、ＥＰＡ処理によって血漿ＶＬＤＬ−ａｐｏＢ１００およびＶＬＤＬ−ＴＧ濃度は低減されることが明らかとなった。血中脂質が正常なヒト被験者および高脂血症ヒト被験者では、魚油食によって血漿ＴＧおよびＶＬＤＬ−ａｐｏＢは低下したが、ＬＤＬ−ａｐｏＢおよびＬＤＬ−コレステロールは上昇し、総血漿ａｐｏＢ濃度は変化しなかった（Ｎｅｓｔｅｌら、１９８４年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、７４号：８２〜８９；Ｆｉｓｈｅｒら、１９９８年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、３９号：３８８〜４０１）。内臓型肥満のヒトでは、ｎ−３脂肪酸補給によって、ＶＬＤＬ−ａｐｏＢ生産速度は２９％低下した（Ｃｈａｎら、２００３年、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．、７７号：３００〜３０７）。これらのデータは魚油の特異的標的はおそらく、大きくＴＧの濃度が高いａｐｏＢ含有リポタンパク質（ＬｐＢ）の組み立てである。ＥＰＡ処理を行えば、ＶＬＤＬの第２段階組み立てに阻害作用に影響を及ぼすかもしれないと仮定し、モデルとしてヒトａｐｏＢ１００形質転換ＭｃＡ−ＲＨ７７７７を用いてこの仮説を検証した。ＶＬＤＬの組み立てと分泌に関係のある一時的および空間的事象をオレイン酸処理条件とＥＰＡ処理条件との間で比較した。以下に記載のすべての実験においては、新しく合成されたａｐｏＢ１００のプロテアソーム媒介の細胞内分解を最小化し、および外来性のオレイン酸誘導ＶＬＤＬ組み立てを促進するために２０％血清を補給した培地で細胞を培養した（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１号：１８４４５〜１３４５５）。［３５Ｓ］アミノ酸で細胞を３０分間パルス標識し、（炭酸処理後に）その培地へと分泌されたかまたはミクロソームの内腔内に存在するかのいずれかであるリポタンパク質と結合したａｐｏＢ１００結合タンパク質を、１時間の追跡終了時に決定した。３０分のパルス終了時にａｐｏＢ１００へ取り込まれた［３５Ｓ］の量は、オレイン酸処理細胞とＥＰＡ処理細胞との間で同じであった（データは示さず）。１時間の追跡終了時、ＥＰＡ処理によって、その培地のＶＬＤＬ（ＶＬＤＬ１およびＶＬＤＬ２）中の［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００は（オレイン酸処理に比して５０％）減少し（図１Ａ）、ミクロソーム内腔の高密度の画分［例えば、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）およびＬＤＬ）］中の［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００は（６倍）増加した（図１Ｂ）。内腔のＶＬＤＬ結合ａｐｏＢ１００におけるオレイン酸処理細胞とＥＰＡ処理細胞との違いは分泌されたＶＬＤＬ（図１Ｂ）のものよりも著しいものではなく、このことは一部のＶＬＤＬを構築する能力がＥＰＡ処理細胞には保持されていたことを示している。
【０１０７】
ＥＰＡ処理細胞のミクロソーム内腔（および培地においても）では、ＳＤＳサンプル緩衝液に不溶であった［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００種の著明な上昇が認められたことは予想外であった（図１ＡおよびＢでアスタリスクで示した帯）。遅延している帯は、ヒトａｐｏＢを認識する抗体１Ｄ１と反応している（データは示さず）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に６％尿素を含んでいたために、ａｐｏＢ１００凝集を除去することはできなかった（データは示さず）。水溶性抗酸化物（例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン）または脂溶性抗酸化物（例えば、α−トコフェロール）のいずれかでサンプルを処理しても、ａｐｏＢ１００凝集を阻止できなかった（データは示さず）。ＥＰＡ処理細胞のミクロソーム内腔および培地において検出された明らかに凝集したこれらのａｐｏＢ１００種の性質は不明である。これらのａｐｏＢ１００種は、分泌経路内に蓄積した組み立て中間体を表すことができる（以下に示す）。分泌された［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の総量（すなわち、凝集した種を含む全画分中の［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の合計）を定量化したところ、ＥＰＡ処理細胞とオレイン酸処理細胞との間に同じような分泌が認められることが明らかとなった。さらに、競合ＥＬＩＳＡ法によってａｐｏＢ１００タンパク質を定量化したところ、１６時間インキュベーション後に培地に蓄積したａｐｏＢ１００タンパク質の量は、オレイン酸処理細胞と比較した場合にＥＰＡ処理細胞からは僅かに減少していたが（オレイン酸、２．７４±０．４８；ＥＰＡ、２．５±０．４３μｇ／ｍｌ）、その差は統計学的に有意なものには達しなかったことが明らかとなった（ｐ＞０．０５、ｎ＝３）。脂質を［３Ｈ］グリセロールで代謝標識したところ、ＥＰＡ処理細胞からの［３Ｈ］グリセロール標識ＴＧの分泌が５０％減少したが、細胞ＴＧへの［３Ｈ］グリセロールの取り込みはオレイン酸処理細胞よりもＥＰＡ処理細胞において高いことが明らかとなった。分泌されたＰＣへの［３Ｈ］グリセロールの取り込みは影響を受けなかった（表Ｉ）。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
これに加えて、これらの細胞培養試験のデータはインビボ試験（Ｎｅｓｔｅｌら、１９８４年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７４号：８２〜８９）と一致しており、ＥＰＡ処理によって、ＴＧの分泌は低下するが、分泌されたａｐｏＢ１００の量においてはごく僅かな低下であることを示している。
【実施例２】
【０１１０】
ＥＰＡ処理はａｐｏＢ１００のｐｏｓｔ−ＥＲ分解を促進する
オレイン酸およびＥＰＡで事前処理した細胞を［３５Ｓ］メチオニン／システインで１時間標識し、３時間まで追跡した。オレイン酸およびＥＰＡはパルスおよび追跡培地の両方に存在した。全細胞溶解物（図２Ａ）または馴化培地（図２Ｂ）からの［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００を免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、フルオログラフィーで可視化した。［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００に関連する放射活性を定量化した。図２Ａ〜２Ｂの上のパネルに示したように、データは１時間のパルス終了後の［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００に関連する放射活性の絶対量として表している。図２Ａ〜２Ｂの上部パネルに示したように、データは１時間のパルス終了後の３５Ｓ−ａｐｏＢ１００に関連する初期の数の％として表している。図２Ｃおよび２Ｄに示すように、細胞（図２Ｃ）および培地（図２Ｄ）の［３５Ｓ］−ａｐｏＡ−Ｉに関連する放射活性を同様に定量化した。この試験を繰り返し行ったところ、同様の結果が得られた。
【０１１１】
ＶＬＤＬ１粒子は総ＴＧの８０％を超えて担持しているが、オレイン酸処理されたＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞から分泌された総ａｐｏＢ１００については担持しているのは１０％未満であることがこれまでに明らかとなっている（Ｗａｎｇら、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４号：２７７９３−２７８００）。したがって、ｎ−３脂肪酸処理はＶＬＤＬ画分中のａｐｏＢ１００を選択的に減少させることが報告されているため（ＦｉｓｈｅｒとＧｉｎｓｂｅｒｇ、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：１７３７７〜１７３８０）、上記パルス（３０分）追跡（６０分）の試験はａｐｏＢ１００の分泌量の減少および翻訳後の分解量の増加を検出することはできなかったかもしれないという可能性を検討した。次の試験セットでは、ａｐｏＢ１００の［３５Ｓ］標識化を最大化し、および潜在的な翻訳後の分解を検証できるようにするために、パルス標識期間を１時間まで延長した。これらの条件下では、ＥＰＡ処理細胞（９．４３×１０４ｃｐｍ／皿）において１時間のパルス終了時にａｐｏＢ１００へ取り込まれた［３５Ｓ］の量は、オレイン酸処理細胞（６．４０×１０４ｃｐｍ／皿）の場合よりも約４０％大きかった（図２Ａ上）。１時間のパルス終了時にａｐｏＢ１００の標識が高くなっているのは、新しく合成されたａｐｏＢ１００の細胞内蓄積量が増加したことおよび／または分泌障害であることを反映しているものと考えられる。３時間の追跡終了時、ＥＰＡ処理細胞中の細胞結合［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の量はオレイン酸処理細胞の細胞結合［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の量に匹敵するレベルまで減少したが（図２Ａ上）、１時間のパルス後に観察された過剰な細胞結合［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００は追跡中に培地内で回復されなかったことが顕著であった（図２Ｂ上）。追跡終了時に分泌された代謝標識した全［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の比率を測定するものである分泌効率は、ＯＡ処理細胞に比してＥＰＡ処理細胞では６０％〜４０％まで減少した（図２Ｂ下）。追跡終了時の細胞結合［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００もオレイン酸処理に比して僅かに低かった（図２Ａ下）。同試験では、ａｐｏＡ−Ｉの合成または分泌はＥＰＡ処理による影響を比較的受けなかった（図２Ｃおよび２Ｄ）。これらの動態試験は、ＥＰＡ処理細胞ＭｃＡ−ＲＨ７７７７では、新しく合成されたａｐｏＢ１００部分は最初は細胞内に保持され、次いでプロテアソーム媒介のＥＲ分解よりは速くない機序を介して分解される。さらには、ＥＰＡ処理細胞中のａｐｏＢ１００の分解は、先に報告されたｐｏｓｔ−ＥＲ機序に類似する緩徐なプロセスを通して同様に達成される（ＦｉｓｈｅｒとＧｉｎｓｂｅｒｇ、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：１７３７７〜１７３８０）。
【実施例３】
【０１１２】
ＥＰＡ処理はＥＲまたはｐｒｏｘｉｍａｌゴルジ体を通って運ばれるａｐｏＢ１００に影響を及ぼさない
オレイン酸またはＥＰＡで事前処理した細胞を［３５Ｓ］メチオニン／システインで２０分間パルス標識し、０〜４５分間追跡した。細胞下分画をＮｙｃｏｄｅｎｚ勾配遠心分離によって分画し、ＥＲ、シス／メディアルゴルジ体、およびディスタル−ゴルジ体の膜（図３Ａ、種々の追跡時間による）および内腔内容物（図３Ｂ、４５分間の追跡後）を炭酸ナトリウムによって分離し、その後超遠心分離にかけた。３５Ｓ−ａｐｏＢ１００を免疫沈降させ、「実験手順」に記載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィーによって分解した。図３Ｂの下部パネルに示すように、アスタリスクでマークした帯はＳＤＳ存在下で不溶性である３５Ｓ−ＡｐｏＢ１００種を表す。
【０１１３】
近年の試験から、ａｐｏＢ１００のＥＲ出口はＶＬＤＬ組み立てにおいて重要な段階を表すことがあきらかとなった（Ｇｕｓａｒｏｖａら、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８号：４８０５１〜４８０５８）。パルス中にＥＰＡ処理細胞で発生するａｐｏＢ１００の蓄積量が改変されたａｐｏＢ１００出口かまたはそのＥＲ−ゴルジ体輸送に起因するものかどうかを決定するために、パルスチェイス分析を細胞下分画試験と組み合わせた。本発明者らはＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞では、新しく合成されたａｐｏＢ１００は主にＥＲ／ゴルジ体区画の膜に結合していたことを明らかにした（Ｔｒａｎら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：３１１８７〜３１２００）。膜結合［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００がＥＲを出たときの割合（４回の追跡時間点（すなわち、０、１５、３０、および４５分）から算出）は、オレイン酸処理細胞の場合（合計／分の−０．５９±０．１７％）よりもＥＰＡ処理細胞では高かった（合計／分の−１．２９±０．３８％）（ｐ＜０．０５）（図３Ａ上のパネル）。同様に、ディスタル−ゴルジ体中に現れた膜結合［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の割合は、オレイン酸処理細胞の場合（合計／分の０．３９±０．１１％）よりもＥＰＡ処理細胞では有意に高かった（合計／分の０．８３±０．１０％）（ｐ＜０．０５）（図３Ａ下部パネル）。シス／メディアルゴルジ体を通過した［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の割合は、２つの処理間で類似した（図３Ａ中間のパネル）。したがって、本発明者のデータによってＥＲ出口の障害もｐｒｏｘｉｍａｌ−ゴルジ体をゆっくりと通過することも１時間のパルス終了時にＥＰＡ処理細胞にａｐｏＢ１００の細胞蓄積があることを説明するものではないという証拠が得られる。
【０１１４】
４５分の追跡終了時、ＥＰＡ処理細胞のディスタル−ゴルジ体（炭酸塩で処理後）の内腔画分において［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の著しい蓄積を伴って、［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の増加がディスタル−ゴルジ体膜（図３Ａ）で検出され、その［３５Ｓ］−ａｐｏＢ１００の大半はＩＤＬ／ＬＤＬ画分に結合していた（図３Ｂ）。このようにディスタル−ゴルジ体膜および内腔にａｐｏＢ１００が蓄積していることは、ＥＰＡ処理細胞において１時間のパルス後にａｐｏＢ１００が細胞内に蓄積することを少なくとも部分的に裏付けるものである（図１Ａ上部パネル）。これらの所見はＥＰＡ処理細胞において組み立ての中間体が増加していることを示唆している。ＶＬＤＬ組み立て障害がＥＰＡ処理細胞におけるＭＴＰ媒介ＴＧ移動のＴＧ合成の減衰に起因するものであるということを除外すれば、ＥＰＡ処理はホスファチド酸ホスフォヒドロラーゼ−１またはＭＴＰの活性に影響を及ぼさなかった（データは示さず）。したがって、この結果はＥＰＡがディスタル−ゴルジ体内および／またはディスタル−ゴルジ体の下流におけるＶＬＤＬ分泌にその阻害作用を及ぼす可能性があることを示している。
【実施例４】
【０１１５】
ＥＰＡ処理細胞のシスゴルジおよびトランスゴルジ内の粒子の大きさの分布
図４Ａおよび４Ｂに示すように、この棒グラフはゴルジ球形嚢１〜３（シスゴルジ）（Ａ）および球形嚢４〜６（トランスゴルジ）＋ＴＧＮ（Ｂ）内に貯蔵された粒子の直径を示している。図４Ｃに示すように、同定された５つの粒子型、すなわちＩ〜Ｖ型（分類スキーム用、図５Ｄを参照）について、棒グラフのＸ軸上の値を用いて、粒子径の範囲（薄い括弧）および平均径の値（目盛）±１ＳＤ（厚い括弧）をグラフにした。
【０１１６】
遠位の分泌区画内のリポタンパク質粒子および脂質粒子をＴＥＭによって分析し、第２段階のＶＬＤＬ組み立ての障害が形態学的に改変されたＶＬＤＬ組み立て中間体に関連するかどうかを決定した。ＶＬＤＬの組み立ておよび分泌を刺激するために、ＭｃＡｒｄｌｅ細胞は外来性オレイン酸で処理された。平均径が４０±１７ｎｍのリポタンパク質は、ゴルジ球形嚢４〜６（すなわち、ゴルジ体のｔｒａｎｓ側）およびトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）内で観察された（Ｔｒａｎら、２００２．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：２５０２３〜２５０３０）。ＥＰＡ処理細胞では、これらの＞８０ｎｍの粒子の集団がゴルジ体およびＴＧＮのシス（球形嚢１〜３）およびトランス−末端（球形嚢４〜６）の両方で増加した（図４Ａ〜Ｂ、棒グラフ）［ゴルジ球形嚢のシス−トランス極性の詳細な同定には以下の図４Ａの凡例を参照のこと］。著しい数のこれらの＞８０ｎｍの粒子は、さらに高い倍率のときを含む、粒子がインシチュでゴルジ体（図５Ａ〜Ｃ）において観察されるときにはっきりとわかる形態学的特徴に基づいて、Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ型（図４Ｃ）のいずれかとして特徴付けられる粒子から構成されていた。
【実施例５】
【０１１７】
ゴルジ体および関連する液胞において同定された５種類の脂質／リポタンパク質
図Ａ、ＢおよびＣに示したゴルジ層板は４つの球形嚢を有している（１〜４の印を付けた）。球形嚢１は特徴的な穿孔を有する（矢じり）。トランスゴルジ体ネットワーク（ＴＧＮ）をパネルＡおよびＢに示し、パネルＣには大槽膜（点線）によって部分的に包まれた大きなトランスゴルジ体結合液胞（ＧＡＶ）を示している。Ｉ〜Ｖで示した５種類の粒子はＴＧＮを含む、ゴルジ体およびＧＡＶに存在する。５種類の粒子のさらに高倍率の画像をパネルＤに示している。Ｉ〜ＩＩＩ型粒子の想像上のタンパク質の外殻（括弧）およびコア（白のアスタリスク）が、それらの間にあるリン脂質のように示されている（矢印）。ＩＩ型粒子では、物質の薄いストランドが、コアとリン脂質単層との間の細孔（小さいアスタリスク）にわたって存在している（矢印）。ＩＶ型粒子（白抜きやじり）およびＶ型粒子はそれぞれ、ＨＤＬサイズの構造体およびＶＬＤＬサイズの構造体を表している。パネルＡでは、球形嚢１および３にある２つのＩＶ型粒子（白抜き矢印）は膜結合しているが、ＴＧＮのＩＶ型粒子（黒の矢印）の１つは腔内であることに留意されたい。ゴルジ球形嚢では、Ｉ〜Ｖ型粒子は単独であるいは対（パネルＢの四角）になって発生するが、ＧＡＶではこの粒子はクラスター（パネスＣの四角）として観察されることが多く、これは高倍率の写真（Ｅ）ではいくつかのＩＶ型およびＶ型粒子に取り囲まれた単独のＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ型粒子から構成されている（それぞれ左、真中、右のパネル）。
【０１１８】
この形態学的所見に基づき、さらに高い倍率（図５Ｄ）のときを含む、粒子がインシチュでゴルジ体（図５Ａ〜Ｃ）において観察されるときにはっきりとわかる特徴的な形態学的特徴に基づいて、＞７５ｎｍの粒子のかなりの割合をＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ型（図４下部）として分類した。Ｉ〜ＩＩＩ型形態の粒子も細胞質内脂質の液滴の集団内の管状の滑らかなＥＲ、および細胞質において観察された（図示せず）。ＥＰＡ処理細胞のシス−ｍｏｓｔゴルジ球形嚢におけるＩ型粒子の平均的大きさ（１００ｎｍ）は、細胞質脂質液滴（０．１〜５０μｍ）について測定した範囲の下端にあり（ＭｕｒｐｈｙとＶａｎｃｅ、１９９９年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２４号：１０９〜１１５）、その形態（図５Ｄ、上部パネル）は細胞質脂質液滴のものと類似し、大きさに関係なくリン脂質単層およびタンパク質性の暈によって囲まれた電子密度が高いＴＧ芯を有していた（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ−Ｍａｃｋｉｅら、１９９５年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、３６号：１２１１〜１２２６）。したがって、Ｉ型粒子は、ＨＲＰ免疫細胞化学によりａｐｏＢに対して反応しないＳＥＲにおいて検出された粒子などのａｐｏＢを含まない脂質粒子に相当すると思われる（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９７６年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６９号：２４１〜２６３）。ＩＩおよびＩＩＩ型粒子はそれぞれ部分的な芯または芯がないことを示しており（図５Ｄ、上部パネル）、部分的または完全に脱脂された脂質粒子に相当する。分泌経路における脂質粒子の蓄積量は、以下に記載の脂質分割試験と矛盾しないものである。これらのデータは脂質液滴はＥＰＡ処理細胞のゴルジ体内に蓄積されるという形態学的証拠を提供している。ＩＶ型粒子（図５Ｄ、真中のパネル）は小さなＬｐＢ粒子と同様の大きさ（図４）を有する（＜２５ｎｍ：ＳｈｅｌｎｅｓｓとＳｅｌｌｅｒｓ、２００１年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．、１２号：１５１〜１５７）。ゴルジ体中で最も多くの粒子を表すＶ型粒子（図５Ｄ、下部パネル）は、ラット肝の分泌経路におけるａｐｏＢ反応性ＶＬＤＬ粒子およびラット肝のゴルジ細胞画分から分離されたＶＬＤＬ粒子（ｄ＜１．００６ｇ／ｍｌ）の大きさに相当する大きさ（２５〜７５ｎｍ；図４）を有していた（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９７６．Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．６９：２４１−２６３）（Ｖｅｒｋａｄｅら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４９９０−２４９９６）。ＥＰＡ処理細胞のＶ型細胞はオレイン酸処理細胞において検出されたリポタンパク質粒子（４０ｎｍ；Ｔｒａｎら、２００２年Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：３１１８７〜３１２００）よりも平均して大きかった（５４．５ｎｍ）。大きくなったｄ＜１．００６ｇ／ｍｌのＶＬＤＬ粒子（４６．１ｎｍ）もコリン欠損ラット肝の内腔から分離された（Ｖｅｒｋａｄｅら、１９９３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８号：２４９９０〜２４９９６）。
【０１１９】
したがって、ＶＬＤＬ組み立て障害はリポタンパク質の形態が大きくなった（図５Ｄ、下部パネル）著しい数の粒子（図４、Ｖ型）が生成されたことに関係している。ａｐｏＢ１００を含む完全に補充されたアポリポタンパク質を含むかどうかは未だ決定されていない。凝集したａｐｏＢ１００種がどのようにこれらの粒子に結合するかどうかも依然として解明されていない。
【０１２０】
電子密度の高い粒子の大半がシスゴルジおよびトランスゴルジの内腔では膜結合であったオレイン酸処理細胞の場合（Ｔｒａｎら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：３１１８７〜３１２００）とは異なり、ＥＰＡ処理細胞では、同定された５種類の粒子型のうちの４種（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ型）はゴルジ体を通して著しい膜結合を保持していた（表ＩＩ）。より小さいＩＶ型粒子のみが主に、シスゴルジ体およびトランスゴルジの内腔において膜結合していた（図５Ａ、表ＩＩ）。したがって、ａｐｏＢ１００はディスタル−ゴルジ体膜中に蓄積する（図３Ａ、下部パネル）という所見と合わせたＴＥＭデータからは、トランスゴルジで検出されたａｐｏＢ１００およびより大きなリポタンパク質サイズの粒子の両方について膜結合は増加したことが示唆される。
【０１２１】
表ＩＩはＥＰＡ処理細胞のゴルジ体中の粒子の膜結合の割合をまとめたものである。
【０１２２】
【表２】
【実施例６】
【０１２３】
トランスゴルジ結合液胞への脂質／リポタンパク質粒子の金属イオン封鎖
２つのゴルジ層板（ＧＡ１、ＧＡ２）はそれぞれ４個および５個の球形嚢（１〜４または５で印を付けた）からなる（パネルＡ）。球形嚢１は重なっているＥＲと密接に結合しており、特徴的な穿孔（矢じり）を有し、したがって、ゴルジ体のシス末端を表している。電子密度が高い粒子（短い黒の矢印）がゴルジ体のほかＴＧＮおよび分泌小胞（ＳＶ）に存在している。同様の粒子（長い黒矢印）が、大槽膜（点線）で包まれたＧＡＶに認められる（小さい黒のアスタリスク）。この大槽膜はリボソーム（黒の矢じり）結合ＥＲと連なっている。ゴルジ体からさらに離れて位置する大きな液胞（大きな黒のアスタリスク）は、高密度の分解内容物を含む。スケールバーは１μｍを表す。
【０１２４】
パネルＢは大槽膜（点線）によってゴルジ体のｔｒａｎｓ末端（ＧＡ）近傍でＧＡＶ（黒のアスタリスク）が包み込まれているのを示している。球形の粒子（黒の矢印）はＧＡＶ内に存在する。芽（白の矢印）、およびいくつかの小さな小嚢および細管を含んでいる陥入部（白の矢印は、ＧＡＶの１つに結合している）。黒の矢じりは微小管を表す。スケールバーは０．４μｍである。
【０１２５】
パネルＣの上部は、電子密度の高い粒子を含むＧＡＶ（小さな黒のアスタリスク）とこれらの粒子を含まない高密度の分解性液胞（大きな黒のアスタリスク）との間には密接に結合し、明らかに融合していることを示す（白の矢じり）。この画像の真中は電子密度の高い粒子（矢印）を含み、および陥入部分に小嚢／細管（小さな白のアスタリスク）を有するＧＡＶ（小さな黒のアスタリスク）を示している。
【０１２６】
パネルＤは２つのゴルジ体層板（シス−ｍｏｓｔゴルジ球形嚢、黄色；球形嚢２〜５、灰色；ＴＧＮ／ＳＶ、オレンジ色）およびこのゴルジ体層板の間にあるＧＡＶの集団（中間の青）の３Ｄモデルを示している。これらの液胞のいくつかはそれらの境界膜に陥入部分があることを示しており、小嚢／細管（紺青色）を収容している。隣接する粒子含有ＧＡＶの間の同型の融合は（パネルＣの異質の融合とは異なり）対になって向き合う矢じりで示されている。電子密度の高い粒子を含む膨らんだ部分（薄青）はトランスゴルジ球形嚢に連なっている；この連続性は、観察者に最も近い２つの膨らんだ部分のための区画（二重矢印）内にあることは明白である。シス−球形嚢の穿孔部分を白の矢じりで示している。
【０１２７】
パネルＥはパネルＤからの下方のゴルジ体層板を示しており、Ｘ軸に沿って１８０度回転させ、大槽膜（赤）を含むようにモデル化されたものである。トランスゴルジ体をわかり難くした粒子が満たされたＧＡＶ（中間の青）はこのモデルには含んでいない。赤道観で観察された２個のＧＡＶ（＊１、＊２）はそれらの周縁に沿って大槽膜に結合されている。「極観」で観察された他の２個のＧＡＶ（＊３、＊４）は大槽膜に包まれている。この大槽膜（赤）も（白色の点線）脂質／リポタンパク質を含む、トランスゴルジ液胞に直接連なっている膨張部（薄青）を包み込んでいる（二重矢印はあるセクション内にはっきり見える連続性を示す。１本矢印はセクション間にある連続性を同じく示す）。
【０１２８】
ＥＰＡ処理細胞では、大きくて少なくとも一部が組み立てられたリポタンパク質は、ＰＩ３キナーゼの阻害を受け易い機序によってｐｏｓｔ−ＥＲ区画において分解されるために選択的に標的にされたことがこれまでに報告されている（Ｆｉｓｈｅｒら、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６号：２７８５５〜２７８６３）。パルスチェイス試験（図３）は、ＥＰＡ処理細胞中のディスタル−ゴルジ体のある事象において、またはディスタル−ゴルジ体の下流側において、１時間後（図２Ａ）にａｐｏＢ１００の細胞内蓄積量が増加したこと、および３時間の追跡中（図２Ｂ）の培地にはこの蓄積されたａｐｏＢ１００の回復がないこともさらに説明することができることを指摘している。データが示すようにａｐｏＢ１００の分解が緩徐に生じるなら、ａｐｏＢ１００含有リポタンパク質組み立ての前駆物質および／または生成物は細胞内で分解を行う区画においてＴＥＭによって検出可能であると仮定された。
【０１２９】
分泌を行う区画（ゴルジ体、ＴＧＮ、および分泌小胞；図５Ａ、５Ｂ）で同定された５種類の電子密度の高い粒子（Ｉ〜Ｖ型）はすべて、ＧＡＶ集団でも同定されたことは明らかである（図５Ｃ）。
【０１３０】
分泌小嚢とは異なり、ＧＡＶはリボソームが結合したＥＲ（図６Ａ、矢じり）との連続性を示す大槽膜（点線、図６Ａ）によって包まれていた。この大槽膜の構成は自家食作用の初期相中に形成された「分離膜」の構成と似たものであった（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５２号：６５７〜６６８）。自家食作用は細胞が細胞質タンパク質およびオルガネラを自食胞の形成を通して分解されるためにリソソームまたは液胞まで運ぶＰＩ３キナーゼ依存性のプロセスである（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５２号：６５７〜６６８０）。自食胞形成中、ＥＲ、ＴＧＮ、またはデノボで合成された「ｐｈａｇｏｐｈｏｒｅ」膜由来の二重膜構造の分離膜は、標的とする膜または分子を隔離し、包み込む。この分離膜が閉じられることによって自食胞が形成されることになる。この試験で観察されたＧＡＶは複数の芽（図６Ｂ、白の矢印）および／または小嚢／細管（図６Ｂ、Ｃ、白のアスタリスク）を収容した陥入部分を有しており、このことはオートファゴソームからオートファゴリソソームへの転換中に後期エンドソームおよび／またはリソソームと共に発生する融合を想起させる（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５２号：６５７〜６６８）。ＧＡＶとゴルジ体領域（図６Ａ、Ｃ）近傍に位置する大きな分解液胞との間にはっきりとした融合の輪郭（図６Ｃ）が検出されたことは、ＧＡＶを分解経路と関連付け、また異型融合が生じることから自家食作用と矛盾しなかった（ＲｅｇｇｉｏｒｉとＫｌｉｏｎｓｋｙ、２００２年、Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｃｅｌｌ、１号：１１〜２１）。
【０１３１】
ＧＡＶ区画ならびにゴルジ体および分泌小嚢とのその関係の程度を３Ｄ連続切片モデルにさらに表した（図６Ｄ、６Ｅ）。このモデルおよび本発明者らの連続切片のライブラリでは、トランスゴルジ球形嚢の粒子が満たされた膨らんだ部分（図６Ｅ、薄青）は、ＧＡＶ（＊３〜４）を封入している膜（赤）と連なった大槽膜（白の点線）に包まれていた。このことにより粒子が満たされたＧＡＶはトランスゴルジから発生する可能性が高まる。
【０１３２】
次に、ＧＡＶがリポタンパク質代謝において機能していることを確認するために、ＧＡＶの粒子内容物をゴルジ体およびＴＧＮの内容物と比較した。ＧＡＶにおける５種類の粒子の相対的発生（Ｉ：ＩＩ：ＩＩＩ：ＩＶ：Ｖ＝１２％：２％：１１％：５％：７０％；ｎ＝２２１）は、トランスゴルジ体液球形嚢４〜６＋ＴＧＮ／分泌胞におけるものとほぼ同じであり（Ｉ：ＩＩ：ＩＩＩ：ＩＶ：Ｖ＝１２％：４％：１３％：５％：６６％；ｎ＝２８４）、これは特定の粒子型のＧＡＶへの選別が生じなかったこととを示唆している。すべての粒子型をＧＡＶに隔離することは、この細胞小器官がリポタンパク質代謝において重要な役割を担っていることを裏付けるものである。ゴルジ体対ＧＡＶにおいて粒子−内容物が類似していることは、自家食作用性分解が典型的には「大きな」分解区画であることと一致している（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００３年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３５号：５５３〜５６１）。しかし、ＧＡＶへと隔離された粒子は、分泌経路における結合と比べて、粒子−粒子結合が変えられていることを示した。ゴルジ体では、粒子は単独か、または対になった配置で検出されたが（１個のＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ型粒子および１個のＩＶまたはＶ型粒子、図５Ｂ）、ＧＡＶの粒子はクラスター化していることが多く見受けられた（複数のＩＶまたはＶ型粒子によって取り囲まれた１つのＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ型粒子；図５Ｃ、Ｅ）。
【０１３３】
また、ＧＡＶの粒子は分泌経路における結合に比べて、膜結合が大きく変えられていた。Ｉ−ＩＩＩ型およびＶ型はすべて、ゴルジ体、ＴＧＮ／ＳＶの場合よりも、ＧＡＶでは膜結合は少なかった（表ＩＩ）。粒子−粒子結合および粒子−膜結合の変化の重要性は不明であるが、これらの所見によってＧＡＶは分泌区画とは明確に異なった細胞区画を含んでいることを裏付けることができる。
【０１３４】
このように、ＴＥＭによってＧＡＶの区画が同定され、この区画はいくつかの形態学的基準（ＥＲとの周囲の関係、後生的な分解液胞との融合性、「多量の」隔離された含有物）によって自食胞と似ており、またリポタンパク質／脂質型粒子を隔離している。
【実施例７】
【０１３５】
ａｐｏＢおよびＭａｐ１ＬＣ３の免疫蛍光局在化
事前処理無し（対照群）の細胞、オレイン酸またはＥＰＡで事前処理した細胞を透過処理し、抗ヒトａｐｏＢ抗体（ａｐｏＢ）および抗ラットＭａｐ１ＬＣ３抗体（Ｍａｐ１ＬＣ３）でそれぞれ染色した。ａｐｏＢ用の二次抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８（緑）と共役させ、Ｍａｐ１ＬＣ３用の二次抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４（赤）と共役させた。図７のマージ画像の円はオレイン酸処理またはＥＰＡ処理細胞中のａｐｏＢリッチ領域へのＭａｐ１ＬＣ３の再分布を示している。図７の矢じりはＭａｐ１ＬＣ３およびａｐｏＢの共存を示している（挿入図に拡大している）。図７のスケールバーは１０μｍである。
【０１３６】
ＧＡＶが自食胞に対応し、およびリポタンパク質組立体の前駆物質および／または生成物を隔離することを裏付けるために、間接二重免疫系蛍光試験を行ってａｐｏＢ１００とＭａｐ１ＬＣ３との間の共存の可能性を確立した。ＰＩ３キナーゼ依存性プロセスを介して細胞質から分離膜へと補充されるＭａｐ１ＬＣ３を含む、ある群のＡＴＧ（自家食作用）遺伝子産物が自食胞形成中に必要とされた（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１５２号：６５７〜６６８；Ｋａｂｅｙａら、２０００年、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９号：５７２０〜５７２８）。対照群と比較して、Ｍａｐ１ＬＣ３およびａｐｏＢ１００の部分的共存を用いてａｐｏＢ１００が高濃度の周囲領域へのＭａｐ１ＬＣ３染色の浸透を強化することによって、図示（図７）のように、ＥＰＡおよびオレイン酸処理は自家食作用を誘導した。ａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣ３の共存はオレイン酸処理細胞よりもＥＰＡ処理細胞において顕著であった。
【実施例８】
【０１３７】
ＥＰＡ処理は自家食作用を増強する
図８Ａは対照のオレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞のモノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）標識を示している。スケールバーは１０μｍである。
【０１３８】
図８Ｂは対照のオレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞のＴＥＭ画像である。大きな矢印はゴルジ体近傍の高密度の液胞を示す（ＧＡ；斑点）。小さな矢印はオレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞のゴルジ体領域内の高密度の小さな液胞を示す。（Ｎ）は細胞画を表し、（Ｌ）は脂質液滴を表す。
【０１３９】
同量のＥＰＡまたはオレイン酸（０．４ｍＭ）で処理した細胞では、オートファゴリソソームの特異的マーカーであるＭＤＣと反応する高密度の液胞の巨大化によって実証されるように、オートファゴリソソームの形成もオレイン酸処理細胞よりもＥＰＡ処理細胞において顕著であった（Ｂｉｅｄｅｒｂｉｃｋら、１９９５年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．、６６号：３〜１４）（図８Ａ）。ＥＰＡ処理細胞中のＭＤＣに反応する液胞の大きさおよび分布は、ＴＥＭによって可視化されたように、ゴルジ体領域の外部に位置する高密度の分解液胞の分布と似ている（図８Ｂ、矢印）。ＴＥＭおよび免疫細胞化学のデータは共に、ＥＰＡ処理が自家食作用を増強すること、および脂質粒子とリポタンパク質粒子の割合は分泌経路から自食性分解区画へと転換されていることを示唆している。
【実施例９】
【０１４０】
１８：１（ｎ−９）ＴＧはＶＬＤＬの組み立ておよび分泌に利用される
細胞を［１４Ｃ］オレイン酸で２時間標識し、０．４ｍＭの外来性オレイン酸の存在下または不存在下で１時間、２時間、および４時間追跡した（図９Ａおよび９Ｂ、上部パネル）。同じく、細胞を［３Ｈ］ＥＰＡで２時間標識し、０．４ｍＭのＥＰＡの存在下または不存在下で最高４時間まで追跡した（図９Ａおよび９Ｂ、下部パネル）。各追跡時間に、細胞（図９Ａ）および培地（図９Ｂ）それぞれからすべての脂質を抽出し、ＴＬＣによって分析し、ＰＣ、ＰＥ、ＴＧおよび遊離脂肪酸（ＦＦＡ）に関連する放射活性をシンチレーション計測法によって定量化した。２時間の標識終了時に取り込まれた総放射活性の割合としてデータを示した（［１４Ｃ］オレイン酸標識細胞中には２．４×１０６および［３Ｈ］ＥＰＡ標識細胞中には６．１×１０５ｃｐｍ）。この結果は独立した２つの試験の平均値であり、エラーバーは偏差の範囲を示す。
【０１４１】
本発明者らのこれまでの研究は、リン脂質リモデリングを介して合成されたＴＧは第２段階ＶＬＤＬ組み立て中に利用されることを示唆している（Ｔｒａｎら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７号：３１１８７から３１２００）。ＥＰＡ処理がＶＬＤＬ組み立てを損なう機序を洞察するために、本発明者らはリン脂質リモデリングを介するＴＧ合成をオレイン酸処理細胞とＥＰＡ処理細胞との間で比較した。細胞を［１４Ｃ］オレイン酸または［３Ｈ］ＥＰＡで２時間標識し、それぞれ未標識の外来性オレイン酸またはＥＰＡの存在下で４時間まで追跡した。２時間の標識終了時（すなわち、追跡は０時間）、ＰＣ、ＰＥ、およびＴＧは、［１４Ｃ］オレイン酸処理細胞中の［１４Ｃ］で標識されたすべての細胞脂質の５３％、８％、および２７％をそれぞれ占め（図９Ａ、上部パネル）、ＥＰＡ処理細胞中の［３Ｈ］で標識されたすべての細胞脂質の４８％、３６％、および３％をそれぞれ占めた（図９Ａ、下部パネル）。したがって、［１４Ｃ］オレイン酸は主としてＰＣおよびＴＧへと取り込まれたが、［３Ｈ］ＥＰＡはＴＧではなくＰＣおよびＰＥへと取り込まれた。追跡中、［１４Ｃ］オレイン酸で標識したＰＣおよびＰＥの数は、外来性オレイン酸下存在では比較的一定であり（図９Ａ、上部パネルの黒丸）、これはこれまでの観察（Ｔｒａｎら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５号：２５０２３〜２５０３０）と一致するものであり、基本条件下（すなわち、外来性オレイン酸は存在しない）ではリン脂質の代謝回転の率は低いことを示している。対照的に、外来性オレイン酸処理は、［１４Ｃ］オレイン酸で標識したＰＣの代謝回転およびＴＧへの１８：１（ｎ−９）アシル鎖の移動を刺激した（図９Ａ、上部パネルの白抜きの丸）。
【０１４２】
［３Ｈ］ＥＰＡ標識細胞では、追跡中、ＰＣに結合する数は付随するＰＥの増加と共に減少し（図９Ａ、下部パネルの黒三角）、先に示されているように（Ｂａｌｓｉｎｄｅ、２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３６４号：６９５〜７０２）、このことはＰＣからＰＥへの２０：５（ｎ−３）アシル鎖の移動が基本条件（すなわち、外来性ＥＰＡがない）下で生じたことを示している。外来性ＥＰＡを追跡培地に添加したところ［３Ｈ］ＥＰＡ標識したＰＣおよびＰＥの両方の代謝回転が刺激され、ＰＣおよびＰＥ由来の２０：５（ｎ−３）アシル鎖は、４時間の追跡終了時の細胞における［３Ｈ］ＥＰＡの総放射活性の〜３０％を占めるＴＧへと移動した（図９Ａ、下部パネルの白三角）。外来性脂肪酸によって誘導されたリン脂質のリモデリングも、培地への遊離［１４Ｃ］オレイン酸または［３Ｈ］ＥＰＡの放出により明らかであった（図９Ｂの右パネルの白丸および白三角）。したがって、リン脂質のリモデリング中、個々のリン脂質の脱アシル化由来の１８：１（ｎ−９）および２０：５（ｎ−３）アシル鎖がＴＧ合成に利用される。追跡中、［１４Ｃ］オレイン酸−ＴＧまたは［３Ｈ］ＥＰＡ−ＴＧの分泌の間には著しい差が観察された。［１４Ｃ］オレイン酸−ＴＧが分泌され、その分泌はさらに外来性オレイン酸によって刺激されたが、［３Ｈ］ＥＰＡ−ＴＧは外来性ＥＰＡの有無に関わらず分泌されなかった（図９Ｂ、左パネル）。これらの結果は１８：１（ｎ−９）−ＴＧがＶＬＤＬの組み立ておよび分泌に利用されたが、２０：５（ｎ−３）ＴＧは利用されなかったことを示唆している。
【実施例１０】
【０１４３】
ＰＥリモデリングを介して合成されたＴＧは細胞質へ選択的にシャントされる
細胞を［１４Ｃ］オレイン酸で２時間標識し、０．４ｍＭのオレイン酸の不存在下（図１０Ａの白い棒グラフ）または存在下（図１０Ａの黒い棒グラフ）で４時間追跡した。細胞を［３Ｈ］ＥＰＡで２時間標識し、０．４ｍＭのＥＰＡの不存在下（図１０Ｂの白い棒グラフ）または存在下（図１０Ｂの黒い棒グラフ）で４時間追跡した。この細胞を均質化し、細胞内区画（すなわち、細胞質、ミクロソーム膜、およびミクロソーム内腔）を分画し、各画分から脂質を抽出し、ＴＬＣによって分解し、シンチレーション計測法によって定量化した。データは複製の平均値であり、２時間の標識終了時に取り込まれた総放射活性の割合で表している。偏差の範囲（図示せず）は平均値の５％未満であった。
【０１４４】
オレイン酸処理細胞とＥＰＡ処理細胞との間のＶＬＤＬ分泌のための１８：１（ｎ−９）−ＴＧおよび２０：５（ｎ−３）−ＴＧの利用の違いは、ＶＬＤＬ組み立てが利用可能な１８：１（ｎ−９）−ＴＧおよび２０：５（ｎ−３）−ＴＧの区画化の違いを反映していると思われる。ミクロソーム膜上でＰＣおよびＰＥが非対称的（すなわち、内腔側ではＰＣがリッチで、細胞質側ではＰＥがリッチである）に分布していることは、ＥＰＡおよびオレイン酸処理されるとＰＣ／ＰＥ比が変化することと共に、ＴＧが異なるプール（例えば、貯蔵用の細胞質プールおよびＶＬＤＬ組み立て用のミクロソームプール）へ分割化され得ると仮定される。
【０１４５】
この仮説を検証するために、放射線標識した脂質の細胞内分布を、［１４Ｃ］オレイン酸または［３Ｈ］ＥＰＡでそれぞれパルス標識した２群の細胞間で対比させ、培地±オレイン酸（図１０Ａ）またはＥＰＡ（図１０Ｂ）で追跡した。追跡終了時、［１４Ｃ］オレイン酸の大半はＰＣに結合していたが、［３Ｈ］ＥＰＡの大半はミクロソーム膜のＰＥおよびＰＣに結合していた（図１０Ａ、Ｂの真中の２つのパネル）。追跡中に外来性のオレイン酸またはＥＰＡを添加したところ、膜リン脂質に結合した［１４Ｃ］オレイン酸または［３Ｈ］ＥＰＡの減少および細胞質ＴＧに結合した［１４Ｃ］オレイン酸または［３Ｈ］ＥＰＡの増加が生じた（上部パネル）。細胞質ＴＧの増加の程度は１８：１（ｎ−９）−ＴＧよりも２０：５（ｎ−３）−ＴＧで一層大きかった。細胞を［３Ｈ］グリセロールでパルス標識し、次いでオレイン酸またはＥＰＡのいずれかの存在下で追跡した別の試験では、細胞質［３Ｈ］グリセロール−ＴＧの増加も、オレイン酸処理細胞よりもＥＰＡ処理細胞においてより顕著であった（データは示さず）。したがって、［３Ｈ］ＥＰＡ標識ＰＥリモデリングを介して合成されたＴＧは細胞質へと選択的にシャントされる。しかし、［１４Ｃ］オレイン酸標識ＴＧおよび［３Ｈ］ＥＰＡ標識ＴＧは、追跡中ミクロソーム内腔が増加したことを示し（下部パネル）、この追跡では、ＴＥＭによるゴルジ体中の脂質型液滴の検出と共に、ＥＰＡ処理細胞におけるＶＬＤＬ組み立て障害はＴＧがＶＬＤＬ組み立て部位で利用できないという結果のためだけではないことを示している。
【実施例１１】
【０１４６】
オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞における細胞下小器官の膜中のＰＣおよびＰＥ含有量
オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞における細胞下小器官の膜中のＰＣおよびＰＥ含有量を表ＩＩＩにまとめて示す。
【０１４７】
【表３】
【０１４８】
酵母ではＰＥによるＡｐｇ８／Ａｕｔ７（Ｍａｐ１ＬＣ３の相同分子種）の脂質化は自家食作用性の膜の最初の組み立てにとって不可欠であることが示されている（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１５２号：６５７〜６６８）。細胞内膜に結合したＰＣおよびＰＥの含有量および組成に対するＥＰＡおよびオレイン酸処理の効果を、タンデム質量分析を用いて決定した。ＥＰＡ処理細胞では総ＰＥ質量は８５％だけ増加し、ディスタル−ゴルジ体およびＥＲではそれぞれ１７０％および１１６％の増加が生じた（表ＩＩＩ）。総ＰＣ質量は未処理の対象群に比してＥＰＡ処理による影響を受けなかったが、オレイン酸処理細胞よりも低かった。
【０１４９】
オレイン酸処理では総ＰＥ質量には緩やかな増加（２９％）がみられ、これは主にＥＲで生じた（７２％）。細胞内ミクロソームに結合した総ＰＣ質量はオレイン酸処理によって５６％増加した。この増加の大半はＥＲ（８２％）およびディスタル−ゴルジ体（７３％）で生じた（表ＩＩＩ）。したがって、ＥＰＡはＰＥ含有量を大幅に増加させた。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】Ａは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞の馴化培地において観察されたａｐｏＢ１００結合リポタンパク質の密度分布を示すグラフである。上部パネルは代表的なフルオログラムから構成されている。下部パネルは各画分に関連する［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００の分布を示す折れ線グラフである。Ｂは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞から得られたミクロソームの内腔含有物において観察されたａｐｏＢ１００結合リポタンパク質密度分布を示すグラフである。上部パネルは代表的なフルオログラムから構成されている。下部パネルは各画分に関連する［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００の分布を示す折れ線グラフである。
【図２】Ａは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞の総細胞溶解物からのａｐｏＢ１００に関するパルスチェイス分析を示す折れ線グラフである。上部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００に関連する放射活性の絶対量としてデータを表している。下部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００に関連する初期カウント値の割合としてデータを表している。Ｂは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞からの馴化培地からのａｐｏＢ１００に関するパルスチェイス分析を示す折れ線グラフである。上部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００に関連する放射活性の絶対量としてデータを表している。下部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００に関連する初期カウント値の割合としてデータを表している。Ｃは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞の総細胞溶解物からのａｐｏＡ−１に関するパルスチェイス分析を示す折れ線グラフである。上部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＡ−１に関連する放射活性の絶対量としてデータを表している。下部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＡ１に関連する初期カウント値の割合としてデータを表している。Ｄは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞からの馴化培地からのａｐｏＡ−１に関するパルスチェイス分析を示す折れ線グラフである。上部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＡ−１に関連する放射活性の絶対量としてデータを表している。下部グラフは１時間のパルス終了時に［３５Ｓ］ａｐｏＢ１００に関連する初期カウント値の割合としてデータを表している。
【図３】Ａは、２０分のパルス終了時のオレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞に関する、ＥＲ（上部パネル）、シス／メディアルゴルジ体（真中のパネル）およびディスタル−ゴルジ体（下部パネル）においてやり取りされた膜結合ａｐｏＢ１００を比較したものを示す折れ線グラフである。Ｂは、２０分のパルスおよび４５分の追跡終了後のオレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞からのＥＲ、シス／メディアルゴルジ体、およびディスタル−ゴルジ体の内腔画分に関する、ａｐｏＢ１００の免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィー分析の結果を示すグラフである。
【図４】Ａは、ゴルジ球形嚢１〜３（シスゴルジ体）内に貯蔵された粒子の直径を示す棒グラフである。Ｂは、ゴルジ球形嚢４〜６（トランスゴルジ）＋ＴＧＮ内に貯蔵された粒子の直径を示す棒グラフである。Ｃは、Ｉ〜Ｖ型粒子の粒径範囲を示すグラフである。
【図５】Ａ〜Ｅは、ゴルジ体および関連する液胞において同定された５種類の脂質／リポタンパク質粒子を示す透過型電子顕微鏡写真である。
【図６】Ａ〜Ｅは、ＥＰＡ処理細胞のトランスゴルジ領域の脂質／リポタンパク質含有液胞の形成を示す透過型電子顕微鏡写真である。
【図７】抗ヒトａｐｏＢ１００抗体および抗ラットＭａｐ１ＬＣ３抗体でブロットした、未処理の細胞、オレイン酸処理細胞、およびＥＰＡ処理細胞の免疫蛍光顕微鏡分析の結果を示す写真である。マージ画像の矢じりはａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣ３の共存を示している。
【図８】モノダンシルカダベリンで標識した、未処理の細胞、オレイン酸処理細胞、およびＥＰＡ処理細胞の免疫蛍光顕微鏡分析の結果を示す写真である。
【図９】Ａは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞からの細胞溶解物に関する、ＰＣ、ＰＥ、およびＴＧ脂質中の［１４Ｃ］オレイン酸（上部パネル）および［３Ｈ］ＥＰＡ（下部パネル）の分布を示す折れ線グラフである。Ｂは、オレイン酸処理細胞およびＥＰＡ処理細胞に関する、［１４Ｃ］オレイン酸（上部パネル）および（［３Ｈ］ＥＰＡ（下部パネル）で標識したＴＧおよびＦＦＡの分泌を示す折れ線グラフである。
【図１０】Ａは、細胞質（上部パネル）、ミクロソーム膜（中間パネル）、およびミクロソーム内腔（下部パネル）間の［１４Ｃ］オレイン酸で標識したＰＣ、ＰＥ、およびＴＧの分布を示す棒グラフである。Ｂは、細胞質（上部パネル）、ミクロソーム膜（中間パネル）、およびミクロソーム内腔（下部パネル）間の［３Ｈ］ＥＰＡで標識したＰＣ、ＰＥ、およびＴＧの分布を示す棒グラフである。Ｃは、ＰＣ（上部）およびＰＥ（下部）への［１４Ｃ］オレイン酸および［３Ｈ］ＥＰＡの取り込みを示す折れ線グラフである。
【図１１】リン脂質のリモデリング／代謝回転と代謝的に区別された、ＴＧプールの分布との間の関係を示す略図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の自家食作用誘導化合物を該化合物を必要とする患者に投与するステップを含む、トリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低下させる方法。
【請求項２】
自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、およびクラスＩＩＩのＰ１３’キナーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トリグリセリドおよび／またはコレステロールの血中濃度を低下させるのに有用な薬物を調製するための自家食作用誘導化合物の使用。
【請求項４】
自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、およびクラスＩＩＩのＰ１３’キナーゼからなる群から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
治療有効量の自家食作用誘導化合物を該化合物を必要とする患者に投与するステップを含む、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せからなる群から選択される障害を治療または予防する方法。
【請求項６】
自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、およびクラスＩＩＩのＰ１３’キナーゼからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せからなる群から選択される障害を治療または予防するのに有用な薬物を調製するための自家食作用誘導化合物の使用。
【請求項８】
自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、およびクラスＩＩＩのＰ１３’キナーゼからなる群から選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
（ａ）対照細胞培養系および試験細胞培養系を提供するステップと、
（ｂ）前記試験細胞培養系の細胞に試験化合物を投与するステップと、
（ｃ）前記対照細胞培養系および前記試験細胞培養系の自家食作用マーカーをアッセイするステップとを含み、
前記対照細胞培養系と比較したときの前記試験細胞培養系の前記自家食作用マーカーの異常値は試験化合物が自家食作用を調節することを示す、自家食作用調節化合物を同定する方法。
【請求項１０】
前記自家食作用マーカーはＥＲおよびゴルジ細胞画分中のＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＶＬＤＬ前駆体はＰＣ部分含有脂質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＣ部分含有脂質は１８：１（ｎ−９）ＰＣである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＶＬＤＬ前駆体はＰＥ部分含有脂質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＥ部分含有脂質は２０：５（ｎ−３）ＰＥである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記自家食作用マーカーは免疫蛍光法によってａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣ３の共存の程度を検出することによって決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）対照細胞培養系および試験細胞培養系を提供するステップと、
（ｂ）前記試験細胞培養系の細胞に試験化合物を投与するステップと、
（ｃ）前記対照細胞培養系および前記試験細胞培養系の自家食作用マーカーをアッセイするステップとを含み、
前記対照細胞培養系と比較したときの前記試験細胞培養系の前記自家食作用マーカーの異常値は試験化合物が自家食作用を調節することを示す、自家食作用誘導化合物を同定する方法。
【請求項１７】
前記自家食作用マーカーは、ＥＲおよびゴルジ細胞画分中のＰＣ部分含有脂質およびＰＥ部分含有脂質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＣ部分含有脂質は１８：１（ｎ−９）ＰＣである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＰＥ部分含有脂質は２０：５（ｎ−３）ＰＥである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記自家食作用マーカーは免疫蛍光法によってａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣ３の共存の程度を検出することによって決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
細胞は肝細胞または肝癌細胞である、請求項９から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
肝細胞はヒトａｐｏＢ１００を発現するラット肝細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
肝癌細胞はヒトａｐｏＢ１００を発現するラット肝癌細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ラット肝癌細胞はＭｃＡ−ＲＨ−７７７７細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ａｐｏＢ１００タンパク質はタグと融合する、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
タグは蛍光タンパク質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
タグは配列Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（Ｘは任意のアミノ酸）を有するテトラ−システインである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
トリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低下させるのに有用な薬物を調製するための、請求項１６から２７のいずれか一項によって同定される自家食作用誘導化合物の使用。
【請求項２９】
請求項１６から２７のいずれか一項の方法によって同定される自家食作用誘導化合物と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項３０】
治療有効量の請求項２５に記載の自家食作用誘導化合物を該化合物を必要とする患者に投与するステップを含む、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せからなる群から選択される障害を治療または予防する方法。
【請求項１】
治療有効量の自家食作用誘導化合物を該化合物を必要とする患者に投与するステップを含む、トリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低下させる方法。
【請求項２】
自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、およびクラスＩＩＩのＰ１３’キナーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トリグリセリドおよび／またはコレステロールの血中濃度を低下させるのに有用な薬物を調製するための自家食作用誘導化合物の使用。
【請求項４】
自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、およびクラスＩＩＩのＰ１３’キナーゼからなる群から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
治療有効量の自家食作用誘導化合物を該化合物を必要とする患者に投与するステップを含む、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せからなる群から選択される障害を治療または予防する方法。
【請求項６】
自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、およびクラスＩＩＩのＰ１３’キナーゼからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せからなる群から選択される障害を治療または予防するのに有用な薬物を調製するための自家食作用誘導化合物の使用。
【請求項８】
自家食作用誘導化合物はＭａｐ１ＬＣ３、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＴＥ１６、およびクラスＩＩＩのＰ１３’キナーゼからなる群から選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
（ａ）対照細胞培養系および試験細胞培養系を提供するステップと、
（ｂ）前記試験細胞培養系の細胞に試験化合物を投与するステップと、
（ｃ）前記対照細胞培養系および前記試験細胞培養系の自家食作用マーカーをアッセイするステップとを含み、
前記対照細胞培養系と比較したときの前記試験細胞培養系の前記自家食作用マーカーの異常値は試験化合物が自家食作用を調節することを示す、自家食作用調節化合物を同定する方法。
【請求項１０】
前記自家食作用マーカーはＥＲおよびゴルジ細胞画分中のＶＬＤＬおよびＶＬＤＬ前駆体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＶＬＤＬ前駆体はＰＣ部分含有脂質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＣ部分含有脂質は１８：１（ｎ−９）ＰＣである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＶＬＤＬ前駆体はＰＥ部分含有脂質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＥ部分含有脂質は２０：５（ｎ−３）ＰＥである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記自家食作用マーカーは免疫蛍光法によってａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣ３の共存の程度を検出することによって決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）対照細胞培養系および試験細胞培養系を提供するステップと、
（ｂ）前記試験細胞培養系の細胞に試験化合物を投与するステップと、
（ｃ）前記対照細胞培養系および前記試験細胞培養系の自家食作用マーカーをアッセイするステップとを含み、
前記対照細胞培養系と比較したときの前記試験細胞培養系の前記自家食作用マーカーの異常値は試験化合物が自家食作用を調節することを示す、自家食作用誘導化合物を同定する方法。
【請求項１７】
前記自家食作用マーカーは、ＥＲおよびゴルジ細胞画分中のＰＣ部分含有脂質およびＰＥ部分含有脂質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＣ部分含有脂質は１８：１（ｎ−９）ＰＣである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＰＥ部分含有脂質は２０：５（ｎ−３）ＰＥである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記自家食作用マーカーは免疫蛍光法によってａｐｏＢ１００およびＭａｐ１ＬＣ３の共存の程度を検出することによって決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
細胞は肝細胞または肝癌細胞である、請求項９から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
肝細胞はヒトａｐｏＢ１００を発現するラット肝細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
肝癌細胞はヒトａｐｏＢ１００を発現するラット肝癌細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ラット肝癌細胞はＭｃＡ−ＲＨ−７７７７細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ａｐｏＢ１００タンパク質はタグと融合する、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
タグは蛍光タンパク質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
タグは配列Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（Ｘは任意のアミノ酸）を有するテトラ−システインである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
トリグリセリドおよび／またはＶＬＤＬの血中濃度を低下させるのに有用な薬物を調製するための、請求項１６から２７のいずれか一項によって同定される自家食作用誘導化合物の使用。
【請求項２９】
請求項１６から２７のいずれか一項の方法によって同定される自家食作用誘導化合物と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項３０】
治療有効量の請求項２５に記載の自家食作用誘導化合物を該化合物を必要とする患者に投与するステップを含む、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、高リポタンパク血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、心筋虚血、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、再狭窄、糖尿病、インシュリン抵抗性、代謝症候群、腎疾患、血液透析、Ｉ型糖原病、多嚢胞性卵巣症候群、二次性高トリグリセリド血症、またはこれらの組合せからなる群から選択される障害を治療または予防する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００７−５１３８９１（Ｐ２００７−５１３８９１Ａ）
【公表日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４３３３８（Ｐ２００６−５４３３３８）
【出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００４／００２１１９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６０４９
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５０６１９８５４０）ザ・ユニバーシテイ・オブ・マニトバ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００４／００２１１９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６０４９
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５０６１９８５４０）ザ・ユニバーシテイ・オブ・マニトバ (1)
【Ｆターム（参考）】
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