ナノ治療コロイド金属組成物および方法
本発明は、治療化合物、医薬品、薬物、検出剤、核酸配列および生物学的因子を含む薬剤の送達系のための組成物および方法を含む。一般に、本発明のナノ治療組成物は、送達のために、コロイド金属を含むプラットフォーム、腫瘍壊死因子などの標的リガンド、ポリエチレングリコールなどのステルス剤、および１つまたは複数の診断または治療薬を含む。また本発明は、このようなナノ治療組成物の製造のためおよび癌の処置のための方法および組成物も含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００７年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／９７４３１０号、２００７年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／９８１９２０号、２００８年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／０６９１０８号、２００８年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／０６９９０５号、２００８年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／０４００２２号、２００８年４月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／１２３７９６号、２００８年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／１２４２９０号、および２００８年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／１２６８９９号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、全身的な薬剤の送達および特定の部位への薬剤の送達のための組成物および方法に関する。一般に、本発明は、コロイド金属組成物、ならびにこのような組成物の製造および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
必要な部位を追跡し、過度の副作用なしに治療反応を送達し得る特効薬を発見することは、治療的処置の長い間の目標となっている。この目標に到達するために多数のアプローチが試みられてきた。治療薬は、身体の細胞による差別的な処置のために、治療粒子の疎水性もしくは親水性または大きさなどの活性剤の相違点を利用するように設計されてきた。インサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）注射によって治療薬を身体の特定の部分または特定の細胞に送達し、治療薬の送達を制限する血液脳関門などの体の防御を使用するか、あるいは克服する治療が存在する。
【０００４】
治療薬を特定の組織または細胞へ特異的に導くために使用されている１つの方法は、治療薬と、特異的受容体の結合パートナーとの組み合わせに基づいた送達である。例えば、治療薬が細胞毒性または放射性であり、細胞受容体の結合パートナーと組み合わせられる場合、標的細胞と結合すると、細胞死を引き起こすか、あるいは細胞活性の遺伝子制御を妨害し得る。このタイプの送達デバイスは、処置すべき細胞型に特異的な受容体、受容体の有効な結合パートナー、および有効な治療薬を有することを必要とする。これらの問題のいくつかを克服するために分子遺伝学的操作が使用されている。
【０００５】
遺伝子配列の外来細胞への特異的な送達または内在性配列の過剰発現のための特異的な送達は、現在、非常に関心のある方法である。細胞内に遺伝子を挿入するために種々の技法が使用される。これらの技法には、沈殿、ウイルスベクター、マイクロピペットおよび遺伝子銃による直接挿入、ならびに細胞への核酸の暴露が含まれる。広く使用されている沈殿技法は、リン酸カルシウムを用いてＤＮＡを沈殿させ、不溶性粒子を形成する。目標は、全身性の細胞エンドサイトーシスによってこれらの粒子の少なくともいくつかが宿主細胞内に取り入れられることである。この結果、新しいまたは外来の遺伝子の発現が生じる。この技法は外来遺伝子の細胞内への侵入の効率が低く、その結果生じる遺伝子の発現の効率が低い。エンドサイトーシスのための特定の認識部位における信頼性は存在しないので、暴露された全ての細胞が外来遺伝子を取り入れることができるため、遺伝子の内部移行はどの細胞がトランスフェクトされるかに関して非特異的である。この技法はインビトロで広く使用されているが、標的細胞の選択の特異性の欠如および高度に分化した細胞による取り込み不良のために、インビボでのその使用は意図されない。さらに、インビボでのその使用は、沈殿した核酸が不溶性であることによって制限される。
【０００６】
同様の技法は、インビトロで細胞をトランスフェクトするためにＤＥＡＥ−デキストランの使用を含む。ＤＥＡＥ−デキストランは細胞にとって有害であり、やはり核酸の細胞内への非特異的な挿入をもたらす。この方法はインビボでは賢明でない。
【０００７】
細胞をトランスフェクトするため、または外来遺伝子の細胞への侵入を提供するためのその他の技法も制限されている。ベクターとしてのウイルスの使用は、インビトロおよびインビボでの外来遺伝子の細胞への導入のためにある程度の適用性を有する。ウイルスタンパク質の存在がインビボでの使用中に望ましくない効果を生じる危険は常に存在している。さらに、ウイルスベクターは、細胞内に輸送することができる外来遺伝子材料の大きさに関して制限され得る。ウイルスベクターの反復使用はレシピエントに免疫反応を起こし、ベクターを使用できる回数が制限される。
【０００８】
リポソーム封入核酸による外来遺伝子の送達も使用されている。リポソームは、核酸を含む様々な材料で充填され得る膜で囲まれた嚢である。リポソーム送達は、リポソームの充填が不均一であるために、細胞への均一な送達を提供しない。リポソームは、受容体の結合パートナーが含まれていれば特定の細胞型を標的にすることができるが、リポソームは破損の問題を抱えており、従って送達は特異的でない。
【０００９】
外来核酸を挿入するための強引な技法は、マイクロピペットまたは遺伝子銃により細胞膜を穿刺して、外来ＤＮＡを細胞内に挿入することを含む。これらの技法はいくつかの手順のためには上手く働くが、広範囲に適用可能ではない。これらは非常に労働集約的であり、非常に熟練したレシピエント細胞の操作を必要とする。これらは、インビボで上手く働く簡単な手順の技法ではない。電気的な方法を用いて細胞膜の透過性を変化させるエレクトロポレーションは、いくつかのインビトロ治療については細胞への遺伝子の挿入に成功している。
【００１０】
糖タンパク質の受容体の存在に頼った特定の細胞のためのＤＮＡの標的送達においていくつかの試みが成されてきた。送達系は、ＤＮＡに非共有結合されると共にリガンドに共有結合されたポリリジンなどのポリカチオンを使用した。ポリカチオンのリガンドへの共有結合のこのような使用は、細胞の内部移行メカニズムがいったん開始したら、送達系の解体を許さない。この大きい複合体の共有結合送達系は、核酸が細胞内で自然に見られる方法とはかなり異なる。
【００１１】
当業者に明白であるように、細網内皮系（ＲＥＳ、Ｐａｐｉｓｏｖ １９９８、Ｍｏｇｈｉｍｉ、１９９８およびＷｏｏｄｌｅ、１９９８）による食細胞クリアランス（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を免れることができる粒子送達系によって促進される固形腫瘍への癌治療を標的にすることが、長年にわたって切実に必要とされている。理想的な条件下では、このような送達系は腫瘍脈管構造を優先的に溢出させ、腫瘍微小環境内に蓄積し得る（Ｎａｆａｙａｓｕ １９９９、Ｍａｒｕｙａｍａ １９９９）。さらに、抗癌剤を腫瘍内だけに隔離することができる望ましい粒子送達系は、健康な器官内の薬物の蓄積も低減し得る（Ｐａｐｉｓｏｖ １９９８、Ｍｏｇｈｉｍｉ、１９９８およびＷｏｏｄｌｅ、１９９８、Ｎａｆａｙａｓｕ １９９９、Ｍａｒｕｙａｍａ １９９９）。その結果として、これらの送達系は癌治療の相対的効力または安全性を増大し、従って、薬物の治療指数を増大する働きをし得る。
【００１２】
粒子に基づく薬物送達の分野は、現在、２つの化学的に異なるコロイド粒子のリポソームおよび生分解性ポリマーに焦点が合わせられている（Ｍｕｅｌｌｅｒ ２０００、Ｊａｉｎ、１９９８、Ｒａｆｆｅｒｔｙ、１９９６、Ｏｇａｗａ １９９７、およびＭａｒｕｙａｍａ、１９９８）。いずれの送達系も活性薬物を被包する。薬物は、リポソームの場合には溶解するとき、あるいは生分解性ポリマーについては記載されるように崩壊するときに、粒子から放出される。
【００１３】
コロイド金ナノ粒子は、粒子に基づく腫瘍標的化薬物送達の分野における完全に新規の技術を表す。これらの粒子の合成は、最初に、１８５７年に塩化金およびクエン酸ナトリウムからＡｕ０のナノサイズの粒子を製造するための化学的方法を説明したＭｉｃｈａｅｌ Ｆａｒａｄａｙによって報告された（Ｆａｒａｄａｙ、１８５７）。１９５０年代、これらの粒子がタンパク質生物製剤をその活性を変更することなく結合し得るという発見によって、ハンドヘルド型免疫診断および病理組織診断におけるその使用のための道が切り開かれた（Ｃｈａｎｄｌｅｒ、２００１）。特に関連があるのは、肝臓癌および肉腫を処置するための、Ａｕ１９８から製造される放射性コロイド金ナノ粒子の使用である（Ｒｕｂｉｎ １９６４、Ｒｏｏｔ １９５４）。これらのナノ粒子の静脈内投与は、放射線暴露による薬物関連の毒性を生じる。しかしながら、粒子自体から実証可能な毒性は認められなかった。最近になって、金ナノ粒子は、ＤＮＡ診断およびバイオセンサーにおける使用のためのスキャフォールドに構築された（Ｍｉｒｋｉｎ １９９６）。
【００１４】
バイオナノテクノロジー（またはナノバイオテクノロジー）の新たな分野は、非常に敏感な診断および器官／腫瘍標的化治療の開発の可能性を提供する。例えば、診断の微細化は、正常および疾患の両方の状態における血液化学、ホルモンおよび成長因子のより完全なスナップショットを臨床医に提供できるだけでなく、彼らが推定上の治療法の効力を追跡できるようにもする［Ｋｏｅｈｎｅら、２００４］。その診断の進歩を補足すると、バイオナノテクノロジーは、主な例として、現在の癌治療の利益／リスク比の尺度である治療指数を増大させる見込みも有する［Ｐａｐｉｓｏｖら、１９９８、Ｍｏｇｈｉｍｉら、１９９８、Ｗｏｏｄｌｅ、１９９８、Ｎａｆａｙａｓｕら、１９９９、Ｍａｒｕｙａｍａら、１９９９］。実際に、材料化学および腫瘍生物学の混合は、固形腫瘍においてそれが必要とされているところでだけ活性剤を得るという腫瘍標的化薬物送達の念願の目標を達成する可能性を有する革新的なベクターの開発を導いている。それにもかかわらず、この目標を上手く達成するために、ナノ粒子送達系は、体内に自然に存在する生物学的バリア、ならびに腫瘍の成長および進行中に発生する生物学的バリアを克服しなければならない。このような自然のバリアには、細網内皮系によるクリアランス（大きさまたはオプソニン化による）、間質（腫瘍）液圧の増大を導く腫瘍血管新生、リガンド／受容体に基づくナノ治療ターゲティング、形成中に確立される腫瘍間質内のバリア：腫瘍内バリア、および固形腫瘍の細胞の不均一性が含まれるが、これらに限定されない。
【００１５】
上記の自然のバリアの問題への対処においていくらかの進歩が遂げられているが、まだ多数の課題が残っている。例えば、腫瘍標的薬物送達ベクターは、これらが血液中でオプソニン化され、細網内皮系（ＲＥＳ、すなわち、より大きい粒子はより小さい粒子よりも良く補体を活性化する）によって取り込まれる可能性を減少させるだけでなく、脾臓の赤色髄に存在する内皮間スリットの狭い領域におけるそのクリアランスも防止し得る「真の」または最適なナノメートルサイズにまだアプローチしていない。ＲＥＳの回避をさらに改善するために、現在入手可能なナノ粒子系の表面に親水性ポリマーがグラフトされ得ると考えられる。これらのナノ粒子ベクターが体全体を自由に循環すると、腫瘍新生脈管構造の固有の漏出性およびこれらのナノ粒子ベクターの表面における腫瘍特異性リガンドの存在のために、これらは受動的および能動的に固形腫瘍の中および周囲に隔離され得ると考えられる。しかしながら、このようなナノ粒子はまだ実用化できるほど有効に小さくなっていない。
【００１６】
また当業者は有効なナノ治療法の構築における最後の要素の必要性も理解しており、これは、固形腫瘍を含む癌細胞の不均一な集団に複合治療薬を有効に送達するベクターを開発する能力にある。その最も簡単なモデルでは、固形腫瘍は、腫瘍成長を促進するために一致した役割を果たす複数の細胞型を含有する器官とみなすことができる［ＳｐｒｅｍｕｌｌｉおよびＤｅｘｔｅｒ、１９８３、Ｄｅｘｔｅｒら、１９７８］。従って、治療的介入のために単一の細胞型を標的とする薬物は、不十分な抗腫瘍効果しか提供することができない。さらに、多くの場合、固形腫瘍細胞は、疾患の進行中に、そして／あるいは治療に応答して、連続した表現型を表す。その結果として、ナノ粒子送達系が固形腫瘍内にこれらを隔離する能力にかかわらず、単剤治療が悪性腫瘍内に存在する無数の細胞に対して有効であると立証されることはないと思われる。従って、この制限を克服するために、必要とされるのは、これらの固形腫瘍への道を見出さなければならないだけでなく、腫瘍成長を促進する多様な細胞集団を有効に破壊しなければならない次世代のナノ治療法である。
【００１７】
疾患または病態の処置のため、またはこのような部位の検出のために、特定の治療薬を身体内の特定の部位に送達するための簡単で効率的な送達系は現在得られていない。例えば、現在の癌の処置は、生物体全体に影響を与える、化学療法剤および他の生物活性因子（サイトカインなど）、ならびに免疫性因子の投与を含む。副作用には、器官の障害、味覚および感触などの感覚の喪失、ならびに脱毛が含まれる。このような治療は状態の処置を提供するが、副作用を処置するために多くの補助的な治療も必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
必要とされるのは、所望の細胞または部位に作用する薬剤の送達系のための組成物および方法である。これらの送達系は、検出剤および治療薬を含む全てのタイプの薬剤を特定の細胞へ送達するために使用され得る。同様に必要とされるのは、生物体全体に所望されない副作用を引き起こさない送達系である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、治療化合物、医薬品、薬物、プロドラッグ、検出剤、核酸配列および生物学的因子を含むがこれらに限定されない薬剤の送達系のための組成物および方法を含む。一般に、本発明は、多機能性ナノ治療法として、ナノ薬物を構築するためのプラットフォーム（コロイド金属ゾルなど）と、標的リガンド（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの腫瘍標的リガンド）と、ステルス剤（ｓｔｅａｌｔｈ ａｇｅｎｔ）（ナノ粒子薬物を水和させ、そしてそれにより細網内皮系（ＲＥＳ）によるその取り込みおよびクリアランスを防止するためのポリエチレングリコールなど）と、特定の実施形態では１つまたは複数の活性剤または薬物（パクリタキセルなど）とを本質的に含むこれらの送達またはベクター組成物を提供する。本発明はさらに、このようなコロイド金属ゾル組成物を製造するための方法および組成物を含む。
【００２０】
本発明では、前記ナノ治療法の循環中の加水分解転換を遅延する手段として、コロイド金ナノ粒子の使用が説明される。また金ナノ粒子は、疾患（すなわち、固形腫瘍）部位における治療または診断薬の蓄積を促進し、薬剤はそこでゆっくりその活性形態に転換される。
【００２１】
本発明の特定の実施形態では、コロイド金属ゾルは、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、シリカナノ粒子、鉄ナノ粒子、金／鉄ナノ粒子などの金属ハイブリッドナノ粒子、ナノシェル、金ナノシェル、銀ナノシェル、金ナノロッド、銀ナノロッド、金属ハイブリッドナノロッド、量子ドット、ナノクラスター、リポソーム、デンドリマー、金属／リポソーム粒子、金属／デンドリマーナノハイブリッドおよびカーボンナノチューブを含む。
【００２２】
代替の実施形態では、標的リガンドは、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。
【００２３】
本発明のさらに他の実施形態では、保護剤は、ＰＥＧ、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルデンプン）（登録商標）、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、またはｒＰＥＧを含むことができ、これらはどれも、元の形態で、チオール化されて、あるいは他に誘導体化されて使用され得る。本発明において使用することができるその他のＰＥＧ様の化合物としては、チオール化ポリオキシプロピレンポリマー、チオール化ブロックコポリマー、またはトリブロックコポリマー（ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンブロックを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明のナノ治療法またはベクター組成物は、固形腫瘍の検出または処置において特に有用である。本発明の好ましい組成物は、誘導体化ＰＥＧ、好ましくはチオール−ＰＥＧ、または誘導体化もしくはチオール化ＨＥＳ（登録商標）、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、誘導体化またはチオール化ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、ｒＰＥＧ、誘導体化またはチオール化ｒＰＥＧと会合されたコロイド金属ゾル、好ましくは金属金ゾルを含むベクターを含み、そして、ベクターの特異的な標的化に役立つか、あるいは治療効果を有するか、あるいは検出可能である１つまたは複数の薬剤も含む。
【００２５】
本発明は既知の方法（注射あるいは経口など）によって本発明の組成物を投与することによる送達方法を含み、ここで、組成物は特定の細胞または器官に送達される。１つの実施形態では、本発明は、癌または固形腫瘍などの疾患を、このような疾患の処置のために知られている薬剤を含む本発明の組成物を投与することによって処置するための方法を含む。別の実施形態は、コロイド金属粒子と会合された誘導体化ＰＥＧ、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）および抗癌剤を含むベクター組成物を含む。別の実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ベクター、リボザイム、ｓｉ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、センスオリゴヌクレオチド、および核酸などの遺伝子治療のために使用される薬剤を含む本発明の組成物を投与することによる遺伝子治療のための方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ナノ薬物を調製するために使用される混合装置の概略図である。
【図２】コロイド金へのＴＮＦの飽和結合を示すグラフである。
【図３】図３Ａは、ｃＡｕ−ＴＮＦの安全性に対するＴＮＦ：金の結合比の効果を示すグラフである。図３Ｂは、ｃＡｕ−ＴＮＦの安全性に対するＴＮＦ：金の結合比の効果を示すグラフである。図３Ｃは、ｃＡｕ−ＴＮＦおよび天然型ＴＮＦの抗腫瘍効力を示すチャートである。図３Ｄは、１時間後のＴＮＦ分布プロファイルを示すチャートである。図３Ｅは、８時間後のＴＮＦ分布プロファイルを示すチャートである。図３Ｆは、ＭＣ３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける天然型ＴＮＦおよびｃＡｕ−ＴＮＦベクターの薬物動態学的プロファイルのグラフである。
【図４】図４Ａは、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置したマウスの肝臓および脾臓を示す。図４Ｂは、ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置したマウスの肝臓および脾臓を示す。図４Ｃは、処置を行わないマウスの肝臓および脾臓を示す。
【図５】図５Ａは、種々の器官における金の分布を示すグラフである。図５Ｂは、ＴＮＦの薬物動態学的分析を示すグラフである。図５Ｃは、経時的な腫瘍内ＴＮＦ分布を示すグラフである。図５Ｄは、コロイド金ナノ薬物の異なる配合物について腫瘍内ＴＮＦ濃度を比較するチャートである。図５Ｅは、種々の器官におけるＴＮＦの分布を経時的に示すグラフである。図５Ｆは、種々の器官におけるＴＮＦの分布を経時的に示すグラフである。
【図６】図６Ａは、天然型ＴＮＦまたはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの安全性および効力を比較するグラフである。図６Ｂは、天然型ＴＮＦおよび２０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦの安全性および効力を比較するグラフである。図６Ｃは、天然型ＴＮＦおよび３０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦの安全性および効力を比較するグラフである。
【図７】複数の薬剤を有するベクターの概略図である。
【図８】ベクターを検出するための捕捉方法の実施形態の概略図である。
【図９】第２の薬剤の存在を示すＴＮＦ−およびＥＮＤ−捕捉ベクターを示すグラフである。
【図１０】第２の薬剤の存在を示すＴＮＦ−およびＥＮＤ−捕捉ベクターを示すグラフである。
【図１１】ＰｏｌｙＰｅｇ（登録商標）として知られるペグ化剤の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、薬剤の送達のための組成物および方法を含む。また本発明は、組成物の製造方法、ならびにインビトロおよびインビボにおける組成物の投与方法も含む。一般に、本発明は、以下の成分：標的分子、活性剤、ステルス剤（例えば、１つまたは複数のタイプのＰＥＧまたは他のタイプのステルス部分）検出剤、および統合分子のいずれかまたは全てと、単独または組み合わせて会合されたプラットフォームを形成する金属ゾル粒子を含むナノ治療組成物を意図する。
【００２８】
薬剤の送達は、特定の細胞または組織の検出または処置のために使用される。例えば、本発明は、固形腫瘍などの特定の組織を画像化するために使用される。薬剤の送達は、慢性および急性疾患、免疫系およびその他の生体系の維持および制御、感染症、ワクチン接種、ホルモン維持および制御、癌、固形腫瘍および血管新生状態、ならびに他の生理的障害を含むが、これらに限定されない生物学的状態の処置のために使用される。このような送達は特定の細胞または細胞型を標的としてもよいし、あるいは低レベルの薬剤放出または非毒性の形を可能にする方法では、送達はあまり特異的でなく身体に提供されてもよい。金属ゾル組成物の説明および使用は、米国特許第６２７４５５２号明細書、ならびに関連特許出願の、米国特許出願第０９／８０８８０９号明細書、０９／９３５０６２号明細書、０９／１８９７４８号明細書、０９／１８９６５７号明細書、および０９／８０３１２３号明細書、ならびに米国仮特許出願第６０／２８７３６３号明細書において教示されており、これらの全てはその全体が本明細書に援用される。また、米国仮特許出願第６０／２８７３６３号明細書、米国仮特許出願第６０／９７４３１０号明細書、米国仮特許出願第６１／０６９１０８号明細書、米国仮特許出願第６１／１２３７９６号明細書、米国仮特許出願第６０／９８１９２０号明細書、米国仮特許出願第６１／０４００２２号明細書、米国仮特許出願第６１／１２４２９０号明細書、および米国仮特許出願第６１／１２６８９９号明細書も、本出願の中にその全体が援用される。
【００２９】
本発明は、新規の多機能性ナノ治療法としてのコロイド金属および薬剤の送達のためのベクターを含む方法および組成物に関する。特に、好ましい組成物は、固形腫瘍における１つまたは複数のタイプのベクターの蓄積を含む処置または検出方法において使用される。本発明の多機能性ナノ治療法は、ナノ薬物を構築するためのプラットフォーム、標的リガンド、ステルス剤、および１つまたは複数の活性剤を含むベクター組成物を含む。プラットフォームは、通常、金ナノ粒子などのコロイド金属ゾルを含む。標的リガンドは、腫瘍部位を標的とするＴＮＦなどのリガンドでよい。
【００３０】
ナノ治療法の構成要素は、本明細書において特定の機能および目的に関して説明されるが、構成要素は容易に２つ以上の機能を果たし得ることに注意すべきである。例えば、以下でさらに議論されるように、金ナノ粒子は、ナノ治療薬を製造するためのプラットフォームの役割を果たすだけでなく、一連のプロドラッグの加水分解転換を防止するときには「ステルス／保護機能」に寄与する。特定の実施形態では、金粒子の存在に起因する独特の化学作用が、標的部位に到達するまで薬剤またはプロドラッグの活性化（または加水分解）を遅延させる。さらに、ＴＮＦは本明細書では標的剤として提供および議論されるが、ＴＮＦはナノ粒子の治療効力にも寄与する。
【００３１】
ステルスまたは保護剤は、ナノ薬物を、その標的に到達する前の吸収、消化または他の代謝活性から保護する薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、ステルス剤は、ＰＥＧまたはチオール化ＰＥＧを含む。
【００３２】
本発明の組成物および方法は様々な目的のために使用され得る。特定の実施形態では、組成物および方法は固形腫瘍を処置するために使用され、ＰＥＧ、好ましくは誘導体化ＰＥＧ、より好ましくは、チオール誘導体化ポリエチレングリコールを含むコロイド金属ゾル組成物を投与することを含む。
【００３３】
特定のどんな理論により束縛されることも望まないが、このような組成物の使用はベクター組成物の腫瘍への輸送および腫瘍内での蓄積をもたらすと考えられる。標的分子および活性剤の不在下では、誘導体化ＰＥＧコロイド金属ベクターは腫瘍へ輸送され、そこに隔離される。
【００３４】
最も好ましい投与経路は静脈内または経口であるが、本発明によって全ての投与方法が意図される。好ましくは静脈内または経口で投与されると、コロイドベクターは腫瘍内に見られる、あるいは腫瘍と会合される。
【００３５】
本発明の組成物は、好ましくは、コロイド金属ゾル、誘導体化化合物、および１つまたは複数の薬剤を含む。薬剤は治療的用途において使用することができる生物活性剤であってもよいし、あるいは薬剤は、検出方法において有用な薬剤であってもよい。好ましい実施形態では、１つまたは複数の薬剤はコロイド金属と混合、会合、または直接もしくは間接的に結合される。混合、会合および結合には、共有およびイオン結合、ならびに誘導体化ＰＥＧ、薬剤、およびその他の成分の相互の、そして金属ゾル粒子との長期間または短期間の会合を可能にするその他のより弱いまたはより強い会合が含まれる。
【００３６】
さらに別の実施形態では、組成物は、コロイド金属と混合、会合または結合された１つまたは複数の標的分子も含む。標的分子は、直接または間接的に金属粒子に結合させることができる。間接的な結合には、ポリリジンもしくは他の統合分子などの分子を介した結合、または、金属ゾルもしくは金属ゾルに結合した別の分子のいずれかと標的分子との両方に結合する分子の会合が含まれる。
【００３７】
プラットフォーム
どのコロイド金属も本発明において使用することができる。コロイド金属には、液体水中に分散された任意の水に不溶性の金属粒子または金属化合物、ヒドロゾルまたは金属ゾルが含まれる。コロイド金属は、周期表のＩＡ族、ＩＢ族、ＩＩＢ族およびＩＩＩＢ族の金属、ならびに遷移金属、特にＶＩＩＩ族の遷移金属から選択することができる。好ましい金属としては、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケルおよびカルシウムが挙げられる。また、その他の適切な金属には、以下の：リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、インジウム、スズ、タングステン、レニウム、白金、およびガドリニウムが、これらの種々の酸化状態の全てにおいて含まれる。金属は、好ましくは、適切な金属化合物から誘導されるイオン形態（例えば、Ａｌ３＋、Ｒｕ３＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｎｉ２＋およびＣａ２＋イオン）で提供される。また、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、シリカナノ粒子、鉄ナノ粒子、金／鉄ナノ粒子などの金属ハイブリッドナノ粒子、ナノシェル、金ナノシェル、銀ナノシェル、金ナノロッド、銀ナノロッド、金属ハイブリッドナノロッド、量子ドット、ナノクラスター、リポソーム、デンドリマー、金属／リポソーム粒子、金属／デンドリマーナノハイブリッドおよびカーボンナノチューブを含むがこれらに限定されない他のナノ粒子も、本発明においてプラットフォームとして使用するのに適している。
【００３８】
好ましい金属は、特にＡｕ３＋の形態の金である。コロイド金の特に好ましい形態はＨＡｕＣｌ４である。１つの実施形態では、コロイド金粒子は、適切な中性ｐＨにおいて負電荷を有する。この負電荷は、他の負に帯電した分子の誘引および付着を防止すると考えられる。対照的に、正に帯電した分子は、コロイド金粒子に引き付けられて結合する。コロイド金は、好ましいサイズは約１〜４０ｎｍの粒径であるが、様々な粒径を有する金粒子を含有するゾルの形態で使用される。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、ナノ粒子中の金は、分子全体のプラットフォームの役割を果たすだけでなく、薬物類似体またはプロドラッグなどの薬物／薬剤の血液中での転換を防止し、薬剤または薬物の活性形態への転換を容易にする。以下の理論により束縛されることは望まないが、ナノ粒子中の金は、このような類似体の活性薬物または薬剤への血液中での転換を防止する独特の化学作用に寄与すると考えられる。従って、金は、標的（すなわち、固形腫瘍）に到達するまで薬剤または薬物のその活性状態への転換を防止するので、ナノ治療法の安全性および効力に寄与する。さらに、以下に示されるように、ナノ治療法は医薬品を固形腫瘍内に隔離するだけでなく、時間をかけて薬物類似体が活性薬物に転換できるようにもする。その結果として、標的送達および時間をかけた活性薬物の生成のため、ナノ治療は、より低用量の薬物の使用を容易にすることによって薬物の安全性も改善する。金の存在は、薬物の全体的な安定性に寄与する。１つの特定の実施形態では、ナノ治療法は、プラットフォームとしての金、標的剤としてのＴＮＦ、ステルス剤としてのＰＥＧ、およびプロドラッグを含む。標的（通常は、腫瘍）に到達するまでプロドラッグのその活性形態への加水分解および転換が生じないので、このナノ治療法は非常に有効である。不活性剤の活性剤への遅延された加水分解または遅延された転換は、無差別の作用または効力の低下の可能性が最小限にされるので非常に望ましい。
【００４０】
別の好ましい金属は銀であり、特に、約０．１％〜０．００１％の間の濃度を有するナトリウムホウ酸塩緩衝液中、最も好ましくは約０．０１％の溶液中の銀である。好ましくは、このようなコロイド銀溶液の色は黄色であり、コロイド粒子は１〜４０ｎｍの範囲である。このような金属イオンは、複合体中に単独で存在してもよいし、あるいは他の無機イオンと共に存在してもよい。
【００４１】
標的リガンド／分子
標的分子も本発明の組成物の成分である。１つまたは複数の標的分子は、コロイド金属に直接または間接的に付着、結合または会合され得る。これらの標的分子は、特定の細胞または細胞型、特定の胚組織に由来する細胞、器官または組織に方向付けることができる。このような標的分子には、特定の細胞または細胞型に選択的に結合することができる任意の分子が含まれる。一般に、このような標的分子は結合対の一方のメンバーであり、従って、他方のメンバーに選択的に結合する。このような選択性は、細胞において自然に見られる構造体（細胞膜、核膜中に見られる受容体など）またはＤＮＡと会合された構造体に結合することによって達成することができる。結合対のメンバーは細胞、細胞型、組織または器官上に合成的に導入されてもよい。標的分子は、細胞膜中または細胞膜のない状態に見られる分子に結合し得る受容体または受容体の一部、リガンド、抗体、抗体断片、酵素、補因子、基質、および当業者に知られている他の結合対メンバーも含む。標的分子は複数のタイプの結合パートナーに結合できることもある。例えば、標的分子は、受容体または他の結合パートナーの類または群に結合してもよい。標的分子は、いくつかの酵素または酵素型に結合することができる酵素基質または補因子であってもよい。
【００４２】
標的分子の具体的な例としては、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−１β（「ＩＬ−１β」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−３（「ＩＬ−３」）、インターロイキン−４（「ＩＬ−４」）、インターロイキン−５（「ＩＬ−５」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキン−７（「ＩＬ−７」）、インターロイキン−８（「ＩＬ−８」）、インターロイキン−９（「ＩＬ−９」）、インターロイキン−１０（「ＩＬ−１０」）、インターロイキン−１１（「ＩＬ−１１」）、インターロイキン−１２（「ＩＬ−１２」）、インターロイキン−１３（「ＩＬ−１３」）、インターロイキン−１４（「ＩＬ−１４」）、インターロイキン−１５（「ＩＬ−１５」）、インターロイキン−１６（「ＩＬ−１６」）、インターロイキン−１７（「ＩＬ−１７」）、インターロイキン−１８（「ＩＬ−１８」）インターロイキン２１（「ＩＬ−２１」）、Ｂ７、リピドＡ、ホスホリパーゼＡ２、エンドトキシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＢおよびその他の毒素、Ｉ型インターフェロン、ＩＦＮγ、ＩＩ型インターフェロン、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」または「ＴＮＦα」）、トランスフォーミング成長因子−α（「ＴＧＦ−α」）、リンホトキシン、遊走阻止因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＣＳＦ」）、単球マクロファージＣＳＦ、顆粒球ＣＳＦ、血管上皮成長因子（「ＶＥＧＦ」）、血管新生因子、アンジオゲニン、トランスフォーミング成長因子−β（「ＴＧＦ−β」）、血液型の炭水化物部分、Ｒｈ因子、線維芽細胞成長因子、ならびに他の炎症および免疫調節タンパク質、ホルモン、例えば、成長ホルモン、インスリン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、および黄体形成ホルモン放出ホルモン、内分泌性ホルモン、細胞表面受容体、抗体、核酸、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、センス核酸、アンチセンス核酸、癌細胞特異的抗原、ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、および分子シャペロン、例えばＨＳＰ（熱ショックタンパク質）、変異体ｐ５３、チロシナーゼ、自己免疫抗原、受容体タンパク質、グルコース、グリコーゲン、リン脂質、およびモノクローナル、および／またはポリクローナル抗体、塩基性線維芽細胞成長因子、酵素、補因子、酵素基質免疫調節性分子（すなわち、ＣＤ４０Ｌ）、接着分子（ＩＣＡＭ）、血管および新生血管マーカー（ＣＤ３１およびＣＤ３４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、標的リガンドはＴＮＦを含む。標的リガンドとしてＴＮＦを有するナノ治療法は、ナノ粒子の体内分布を主に疾患部位に制限し、そしてこれらが同時に固形腫瘍内に存在する腫瘍細胞を攻撃するだけでなく腫瘍の成長を支持および促進する宿主ストローマ細胞も殺すのを可能にすることに貢献するので非常に有効である。従って、標的剤としてＴＮＦが使用される実施形態を含む特定の実施形態では、標的剤は、標的剤としての役割を果たすことに加えて、ナノ治療法の治療的価値にも寄与する。
【００４４】
本発明において使用される統合分子は、結合対のメンバーなどの特異的結合統合分子か、あまり特異的でなく結合する非特異的結合統合分子のいずれかであり得る。統合分子は、２つの実体を結合または会合させるための部位を提供するその機能によって定義される。一方の実体は金属ゾル粒子を含むことができ、他方の実体は１つまたは複数の活性剤、または１つもしくは複数の標的分子、あるいはこれらの両方または組み合わせを含むことができる。本発明の組成物は、１つまたは複数の統合分子を含むことができる。
【００４５】
非特異的結合統合分子の一例は、核酸の結合において有用なポリリジンまたはヒストンなどのポリカチオン性分子である。ポリカチオン性分子は当業者に知られており、ポリリジン、硫酸プロタミン、ヒストンまたはアシアロ糖タンパク質を含むが、これらに限定されない。また本発明は、１つまたは複数の実体の金属粒子への結合を提供する合成分子の使用も意図する。
【００４６】
特異的結合−統合分子は、本発明において使用することができる結合対の任意のメンバーを含む。このような結合対は当業者に知られており、抗体−抗原対、酵素−基質対、受容体−リガンド対、およびストレプトアビジン−ビオチンを含むが、これらに限定されない。このような既知の結合対に加えて、新規の結合対も具体的に設計され得る。結合対の特徴は、結合対の２つのメンバー間の結合である。結合パートナーの別の望ましい特徴は、対の一方のメンバーが薬剤または標的分子の１つまたは複数に結合することができるか、または結合しており、対の他方のメンバーが金属粒子に結合できることである。
【００４７】
ステルス剤
本明細書において使用される場合、「ステルス剤」は、本明細書において説明されるナノ治療粒子の表面に結合された場合に、循環中の粒子のオプソニン化、そしてそれに続く細網内皮系（ＲＥＳ）によるクリアランスを防止する化合物を指す。
【００４８】
ステルス剤は、その標的に到達するまで、ナノ治療薬を消化、吸収、オプソニン化、または他の代謝活性から保護するのに役立つ薬剤を含む。ステルス剤は、一般に、標的部位に到達するまで、ナノ治療薬を崩壊から保護する。例えば、チオール化ポリエチレングリコールはナノ粒子薬物を水和させ、その際に、細網内皮系（ＲＥＳ）によるその取り込みおよびクリアランスを防止する。
【００４９】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、ステルス剤として、グリコール化合物、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（当業者にはポリオキシエチレンまたはＰＯＥとしても知られている）、より好ましくは誘導体化ＰＥＧを含む。本発明は誘導体化ＰＥＧを含む組成物を含み、ＰＥＧは、５０００〜３００００（ダルトン）ＭＷである。誘導体化ＰＥＧ化合物は、ＳｕｎＢｉｏ（韓国ソウル）などの供給源から市販されている。ＰＥＧ化合物は、二官能性でも単官能性（メトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）など）でもよい。線状および分枝状ＰＥＧの活性化誘導体は、様々な分子量で入手可能である。本明細書において使用される場合、「誘導体化ＰＥＧ」または「ＰＥＧ誘導体」という用語は、官能基、化学物質の付加、または他のＰＥＧ基の付加のいずれかによって線状分子からの枝分れを提供するように変化されているポリエチレングリコール分子を意味する。このような誘導体化ＰＥＧは、生物活性化合物との結合、ポリマーグラフトの調製、または分子の誘導体化により提供されるその他の機能のために使用することができる。
【００５０】
ＰＥＧ誘導体の１つの種類は、一方または両方の末端に第１級アミノ基を有するポリエチレングリコール分子である。好ましい分子は、一方の末端にアミノ基を有するメトキシＰＥＧである。別の種類のＰＥＧ誘導体には、求電子的に活性化されたＰＥＧが含まれる。これらのＰＥＧは、ＰＥＧまたはメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）をタンパク質、リポソーム、可溶性および不溶性ポリマー、ならびに様々な分子に付着させるために使用される。求電子的に活性なＰＥＧ誘導体としては、ＰＥＧプロピオン酸のスクシンイミド、ＰＥＧブタン酸のスクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミドまたはアルデヒドに付着した複数のＰＥＧ、ｍＰＥＧダブルエステル（ｍＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳ）、ｍＰＥＧベンゾトリアゾールカーボネート、およびｍＰＥＧプロピオンアルデヒド、ｎｉＰＥＧアセトアルデヒドジエチルアセタールが挙げられる。
【００５１】
誘導体化ＰＥＧの好ましい種類には、チオール誘導体化ＰＥＧ、またはスルフヒドリル選択的ＰＥＧが含まれる。５０００〜４００００（ダルトン）ｍｗの分子量範囲を有する分枝状、フォーク状または線状ＰＥＧをＰＥＧ骨格として使用することができる。好ましいチオール誘導体化ＰＥＧには、チオール基が結合され得るマレイミド官能基を有するＰＥＧが含まれる。好ましいチオール−ＰＥＧは、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドであり、ＰＥＧ分子量は５０００〜４００００ダルトンである。
【００５２】
誘導体化ＰＥＧとしてのヘテロ官能性ＰＥＧの使用も本発明によって意図される。ＰＥＧのヘテロ官能性誘導体は一般構造Ｘ−ＰＥＧ−Ｙを有する。ＸおよびＹが結合能力を提供する官能基である場合、多くの異なる実体がＰＥＧ分子のいずれかまたは両方の末端に結合することができる。例えば、ビニルスルホンまたはマレイミドはＸであることが可能であり、ＮＨＳエステルはＹであり得る。検出方法のためには、Ｘおよび／またはＹは、蛍光分子、放射性分子、発光分子またはその他の検出可能な標識であり得る。ヘテロ官能性ＰＥＧまたは単官能性ＰＥＧは、ＰＥＧ−ビオチン、ＰＥＧ−抗体、ＰＥＧ−抗原、ＰＥＧ−受容体、ＰＥＧ−酵素またはＰＥＧ−酵素基質などの結合対の一方のメンバーと結合するために使用することができる。またＰＥＧは、ＰＥＧ−リン脂質などの脂質に結合することができる。
【００５３】
本発明におけるステルス剤として有用なペグ化剤の別の種類は、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｌｔｄ．（英国コベントリー）である。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）は、治療用タンパク質、ペプチドおよび小分子への結合のための新規のペグ化剤である。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）は、メタクリル酸ポリマー骨格上にＰＥＧの歯を有する櫛形ポリマーである。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）は、様々な分子量、ＰＥＧ鎖長、および結合末端基を有する。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）の構造は、（１）櫛の長さを決定するメタクリル酸骨格と、（２）櫛の各歯上のＰＥＧの量を決定するＰＥＧ鎖長と、（３）ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）と標的生体分子の間の結合部位を決定する活性末端基とによって変化され得る。
【００５４】
ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）の櫛様のアーキテクチャは、時間とともに容易に排泄される小さい単位に分解する構造体の特性を利用することによって、ＰＥＧ化への代替的アプローチを提供する。これは、より大きい分子量のＰＥＧ鎖の組織内の蓄積に関連する潜在的な毒物学的問題を回避しながら、高い総用量でのこれらの使用を可能にする。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）は、これらの循環中の存在を延長することによって生物学的分子の治療効果を高めるという点で従来のＰＥＧに類似している。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）は、従来のＰＥＧよりも、特定のペプチドの生物活性を大きく改善することができる。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）分子は、様々な治療分子のＰＥＧのための特定の要求に合わせることができる。これらは、リジンもしくはシステイン残基、またはＮ−末端アミンにおけるペプチドおよびタンパク質への安定な部位特異的共有結合のための選択された結合基によって合成することができる。
【００５５】
本発明のさらなる実施形態は、その他のＰＥＧ様の化合物を含むステルス剤を含み、例えば、チオール化ポリオキシプロピレンポリマー、チオール化ブロックコポリマー（ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンブロックを含むトリブロックコポリマーであるＰＬＵＲＯＮＩＣなど）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において有用なＰＬＵＲＯＮＩＣの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【化１】
【００５６】
ＰＬＵＲＯＮＩＣブロックポリマーの分子量は、限定されないが、１０００から１０００００ダルトンまで、より好ましくは２０００〜４００００ダルトンの間であり得る。
【００５７】
ポリマーブロックは、触媒の存在下、高い温度および圧力におけるエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの縮合によって形成される。結合して各コポリマー中のポリマー鎖を形成するモノマー単位の数にはいくらかの統計的変動が存在する。与えられる分子量は各調製物中のコポリマー分子平均重量の概数であり、使用されるアッセイ方法論および較正基準に依存する。プロピレンオキシドおよびエチレンオキシドのブロックが必ずしも純粋である必要はないことは理解すべきである。全体の物理化学特性が実質的に変化されない限りは、少量のその他の材料を混合することができる。これらの製品の調製についてのより詳細な議論は、米国特許第２６７４６１９号明細書に見出される（参照によってその全体が本明細書に援用される）。（「Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｌｏｃｋ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ」、Ｓｃｈｍｏｌｋａ Ｉ．Ｒ．、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ Ｓｏｃ．、５４：１１０−１１６（１９７７年）および「Ｂｌｏｃｋ ａｎｄ Ｇｒａｆｔ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、第２巻、Ｒ．Ｊ．Ｃｅｒｅｓａ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７６年も参照されたい。
【００５８】
本発明には、好ましくはチオール基によって、官能基化されたポリオキシプロピレンポリマー（ＰＯＰ）が含まれる。ＰＬＵＲＯＮＩＣブロックポリマーの好ましい分子量は、２０００〜４００００ダルトンの間である。また、ＴＥＴＲＯＮＩＣ（ＰＥＯ／ＰＰＯまたはＰＥＯまたはＰＰＯ）コポリマー）、分枝状ＰＥＧ、および開示されるブロックポリマーの種々の組み合わせを含む分枝状ポリマーも本発明に含まれる。コロイド表面とポリマーとの間にリンカー分子が使用されてもよいことは理解される。
【００５９】
本発明のナノ治療法のために使用することができるさらに別のステルス剤は、以下の一般構造：
【化２】
を有するチオール化ポリ（ビニルピロリドン）ポリマー（ＰＶＰ）を含む。
【００６０】
Ｘは、ポリマーに付加されてチオール基のコロイド金属表面へのより優れた到達性を提供し得る任意のスペーサーアームの部位を示す。スペーサーアームは、以下の、プロピル基、アミノ酸、またはポリアミノ酸で構成され得るが、これらに限定されない。ＰＶＰポリマーの好ましい分子量は、およそ１０００〜１０００００ダルトンの間であり、より好ましくは５０００〜４００００ダルトンの間である。
【００６１】
本発明のために有用な別の可能なステルス剤は、ｒＰＥＧ（Ａｍｕｎｉｘ（カリフォルニア州マウンテンビュー））を含む。本明細書において使用される場合、ｒＰＥＧは、通常、３００〜６００アミノ酸非構造化タンパク質の尾部を現存の医薬用タンパク質へ遺伝子融合することを通常含む、組換えＰＥＧ化技術を指す。ｒＰＥＧのさらなる説明は、米国特許出願公開第２００８／００３９３４１Ａ１号明細書（参照によってその全体が本明細書に援用される）において見出すことができる。
【００６２】
代替の実施形態では、ナノ治療のために使用されるステルス剤は、ＨＥＳポリマーとして一般に知られているポリマーを含み、これは、非イオン性デンプン誘導体のヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）であり、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ，Ｉｎｃ．（独国バートホンブルグ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−ｋａｂｉ．ｃｏｍ／）によって得ることができる。ＨＥＳおよびＨＥＳ誘導体は、誘導体化および／またはチオール化され、そしてコロイド金ナノ粒子に結合され得る。
【００６３】
上記のステルス剤はいずれも、本発明のナノ治療組成物のためのこれらの使用に関連して、修飾、誘導体化（すなわち、チオール化）、アミノ化、または多アミノ化され得る。特定の実施形態では、ステルス剤は、金への結合を容易にするために単一の末端チオール基を有するポリマーを含むことが好ましいこともある。
【００６４】
薬剤
本発明の薬剤は、任意の化合物、化学物質、治療薬、医薬品、薬物、生物学的因子、生物学的分子（抗体、タンパク質、脂質、核酸または炭水化物など）の断片、核酸、抗体、タンパク質、脂質、栄養物、補因子、栄養補助食品、麻酔薬、検出剤、または体内で効果がある薬剤であり得る。このような検出剤および治療薬ならびにこれらの活性は当業者に知られている。
【００６５】
以下は、本発明において使用することができる薬剤のいくつかの非限定的な例である。本発明において使用することができる薬剤の１つの種類は、サイトカイン、成長因子、活性を有する大きい分子の断片、神経化学物質、および細胞通信分子を含むがこれらに限定されない生物学的因子を含む。このような薬剤の例としては、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−１β（「ＩＬ−１β」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−３（「ＩＬ−３」）、インターロイキン−４（「ＩＬ−４」）、インターロイキン−５（「ＩＬ−５」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキン−７（「ＩＬ−７」）、インターロイキン−８（「ＩＬ−８」）、インターロイキン−１０（「ＩＬ−１０」）、インターロイキン−１１（「ＩＬ−１１」）、インターロイキン−１２（「ＩＬ−１２」）、インターロイキン−１３（「ＩＬ−１３」）、インターロイキン−１５（「ＩＬ−１５」）、インターロイキン−１６（「ＩＬ−１６」）、インターロイキン−１７（「ＩＬ−１７」）、インターロイキン−１８（「ＩＬ−１８」）、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦα」）、トランスフォーミング成長因子−α（「ＴＧＦ−α」）、ｆｌＴ３、リンホトキシン、遊走阻止因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＣＳＦ」）、単球マクロファージＣＳＦ、顆粒球ＣＳＦ、血管上皮成長因子（「ＶＥＧＦ」）、アンジオゲニン、トランスフォーミング成長因子−β（「ＴＧＦ−β」）、線維芽細胞成長因子、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＧＡＢＡ、およびアセチルコリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
別の種類の薬剤はホルモンを含む。このようなホルモンの例としては、成長ホルモン、インスリン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、エストロゲン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、プロステロール（ｐｒｏｓｔｅｒｏｌ）、プロゲステロン、プロゲスチン、エストロン、その他の性ホルモン、ならびにホルモンの誘導体および類似体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
さらに別の種類の薬剤は医薬品を含む。本発明において任意の医薬品を使用することができる。例えば、ステロイドおよび非ステロイド抗炎症薬などの抗炎症薬、可溶性受容体、抗体、抗生物質、鎮痛薬、血管新生および抗血管新生薬、ならびにＣＯＸ−２阻害薬を本発明において使用することができる。化学療法剤は、本発明において特に重要である。このような薬剤の非限定的な例としては、タキソール、パクリタキセル、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、アシクロビル、シスプラチンおよびタクリンおよびこれらの類似体が挙げられる。
【００６８】
免疫療法剤も本発明において特に重要である。免疫療法剤の非限定的な例としては、ＡＺＴおよび他の誘導体化または修飾されたヌクレオチドなどの、炎症薬、生物学的因子、免疫調節タンパク質、ならびに免疫療法薬が挙げられる。小分子も本発明において薬剤として使用することができる。
【００６９】
別の種類の薬剤は、核酸に基づく物質を含む。このような材料の例としては、核酸、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、センス核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、ＤＮＡザイム、タンパク質／核酸組成物、ＳＮＰ、オリゴヌクレオチド、ベクター、ウイルス、プラスミド、トランスポゾン、および当業者に既知のその他の核酸構築物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明において使用することができるその他の薬剤としては、リピドＡ、ホスホリパーゼＡ２、エンドトキシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＢおよびその他の毒素、熱ショックタンパク質、血液型の炭水化物部分、Ｒｈ因子、細胞表面受容体、抗体、癌細胞特異的抗原、例えば、ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、およびＨＳＰ（熱ショックタンパク質）など、放射性金属または分子、検出剤、酵素および酵素補因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
特に重要なのは、隔離されたコロイド金属ベクターを視覚化または検出するために使用することができる染料または放射性物質などの検出剤である。蛍光、化学発光、感熱、不透明、ビーズ、磁性および振動材料も、本発明の組成物中のコロイド金属に会合または結合される検出可能な薬剤として使用するために意図される。
【００７２】
薬剤、および本発明の処置方法によって影響を受ける生物体のその他の例は、以下の表において見出される。この表は、他の薬剤（以下の薬剤の薬学的等価物など）が本発明によって意図されるという点で限定的ではない。
【００７３】
【表１】
【００７４】
付加的な治療薬は、以下の種類の薬剤の１つまたは複数を含み得る：葉酸の代謝拮抗薬（限定されないが、例えばアミノプテリン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド）、プリン代謝拮抗薬（限定されないが、例えばクラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン）、ピリミジン代謝拮抗薬（限定されないが、例えばシタラビン、デシタビン、フルオロウラシル／カペシタビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、エノシタビン、サパシタビン）、アルキル化剤、限定されないが、例えば窒素マスタード（限定されないが、例えばクロランブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ベンダムスチン、トロホスファミド、ウラムスチン）、ニトロソ尿素（限定されないが、例えばカルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、プレドニムスチン、ラニムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン）、白金アルキル化様薬剤（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ−ｌｉｋｅ ａｇｅｎｔ）（限定されないが、例えばカルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、四硝酸トリプラチン（Ｔｒｉｐｌａｔｉｎ ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）、サトラプラチン）、スルホン酸アルキル（限定されないが、例えばブスルファン、マンノスルファン、トレオスルファン）、ヒドラジン（限定されないが、例えばプロカルバジン）、トリアゼン（限定されないが、例えばダカルバジン、テモゾロミド）、アジリジン（限定されないが、例えばカルボコン、チオテパ、トリアジコン、トリエチレンメラミン）、紡錘体毒／有糸分裂阻害薬、限定されないが、例えばタキサン（ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、テセタキセル、イキサベピロンおよびエピチロン（ｅｐｉｔｈｉｌｏｎｅ）、ビンカアルカロイド（限定されないが、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシン、ビノレルビン）、細胞毒性／抗腫瘍性抗生物質、限定されないが、例えばアントラサイクリン（限定されないが、例えばアクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、ゾルビシン）、アントラセンジオン（限定されないが、例えばミトキサントロン、ピクサントロン）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に基づくもの、限定されないが、例えば（アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン）ヒドロキシ尿素、トポイソメラーゼ阻害薬（カンプトテカ属（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）に関連、限定されないが、例えばカンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ルビテカン（Ｒｕｂｉｔｅｃａｎ）、ベロテカン（Ｂｅｌｏｔｅｃａｎ））ポドフィルム（限定されないが、例えばエトポシド、テニポシド）、その他のもの（限定されないが、例えばアルトレタミン、アムサクリン、ベキサロテン、エストラムスチン、イロフルベン、トラベクテジン）、細胞に基づく治療薬（限定されないが、例えば受容体チロシンキナーゼなど（限定されない）に対するモノクローナル抗体、セツキシマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ、ＣＤ２０、限定されないが、例えばリツキシマブ、トシツモマブ、その他のもの、限定されないが、例えばアレムツズマブ、ベバシズマブ、エドレコロマブ、ゲムツズマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、アブシキシマブ、ダクリズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、パリビズマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト、ヒト化抗体およびファージディスプレイ抗体、サイトカインならびに細胞表面および可溶性受容体に対する完全ヒトモノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害薬、限定されないが、例えばアキシチニブ、ボスチニブ、セジラニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、ニロチニブ、セマキサニブ（Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデタニブ、サイクリン依存性キナーゼ阻害薬、限定されないが、例えばアルボシジブ（Ａｌｖｏｃｉｄｉｂ）、セリシクリブ（Ｓｅｌｉｃｉｃｌｉｂ）、ホルモンに基づく治療薬、限定されないが例えば、デキサメタゾン、フィナステリド、タモキシフェン、抗アンドロゲンに基づくホルモン治療薬、送達系、限定されないが、例えばウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、偽型ウイルス、レンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（エンベロープタンパク質、水疱性口内炎ウイルスからのＧ−タンパク質で被覆）、遺伝子治療薬を送達するように設計されたデンドリマー（サイトカイン（限定されないが、例えばＧＭＣＳＦ、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＦＮβ）のための遺伝子を導入するように設計されたものなど）、化学増感剤（ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）自殺遺伝子、限定されないが、例えばチミジンキナーゼ、ｐ５３、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどのセンスおよびアンチセンス治療薬（ｓｉＲＮＡを含む）、その他の治療薬、限定されないが、例えば融合タンパク質（限定されないが、例えばアフリベルセプト、デニロイキンジフチトクス）、抗炎症性治療薬、光増感剤、限定されないが、例えばアミノレブリン酸／アミノレブリン酸メチル、エファプロキシラル、ポルフィリン誘導体（ポルフィマーナトリウム、タラポルフィン、テモポルフィン、ベルテポルフィン）、レチノイド（アリトレチノイン、トレチノイン）、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ／ペガスパルガーゼ、アトラセンタン、ボルテゾミブ、カルモフール、セレコキシブ、デメコルチン、エレスクロモル、エルサミトルシン、エトグルシド、ロニダミン、ルカントン、マソプロコール、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトタン、オブリメルセン、オマセタキシン、シチマジーンセラデノベック、テガフール、ストラクトン、チアゾフリン、ティピファニブ、およびボリノスタット。
【００７５】
コロイド金ナノ粒子による結合プロドラッグ／不活性剤の安定化
推定上の医薬品成分プロドラッグの単なる結合が、循環中に分解から保護される概念が、本出願において記載される。次に、保護されたプロドラッグは、疾患（すなわち、固形腫瘍）の部位へのその送達中、保存される。疾患部位に到着すると、プロドラッグは、徐放性製剤に類似した活性薬物に持続的に転換される。
【００７６】
プロドラッグの金表面への結合は、インビトロおよび循環中の両方において、プロドラッグの活性薬物への加水分解転換を防止する。そして、固形腫瘍内では、金粒子がプロドラッグの腫瘍への送達を増強するだけでなく、経時的な活性剤の生成も提供することが観察される。事実上、データは、金ナノ薬物が、標的化送達系としての機能だけでなく、徐放性製剤としての機能も果たすことと一致する。
【００７７】
結合および送達
薬剤を金属ゾルに結合させるための一般的な方法は、以下の工程を含む。薬剤の溶液は、脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）などの緩衝液または溶媒中で形成される。適切な緩衝液または溶媒は、結合すべき薬剤に依存するであろう。所与の薬剤のために適切な緩衝液または溶媒の決定は、当業者の技能のレベル内である。最適な量の薬剤を金属ゾルに結合させるために必要なｐＨの決定は当業者に知られている。結合される薬剤の量は、ＥＬＩＳＡまたは分光光度法などの、タンパク質、治療薬または検出剤の決定の定量的方法によって決定することができる。本発明において統合分子が使用される場合、結合ｐＨおよび統合分子の飽和レベルも組成物の調製において考慮される。例えば、統合分子がストレプトアビジン−ビオチンなどの結合対のメンバーである場合、ストレプトアビジンまたはビオチンに対する結合ｐＨが決定され、結合されるストレプトアビジンまたはビオチンの濃度も決定することができる。
【００７８】
本発明の組成物の１つまたは複数の薬剤は、コロイド金属粒子に直接結合することもできるし、あるいは１つまたは複数の統合分子を介してコロイド金属に間接的に結合することもできる。本発明のコロイド金属ゾルを調製する１つの方法は、参照によって本明細書に援用されるＨｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ（１９７９）によって記載される方法を使用する。統合分子が使用される実施形態において、統合分子は金属ゾルと結合、混合または会合される。薬剤は、統合分子を金属と結合、混合または会合させる前に統合分子と結合、混合、または会合されてもよいし、あるいは統合分子を金属に結合した後で結合、混合または会合されてもよい。
【００７９】
ベクター組成物が統合分子を含む場合、薬剤は、当該技術分野において知られている従来の方法によって、統合分子として機能するビオチンなどの結合対のメンバーに結合され得る。ビオチン化された薬剤は、次に、統合分子のストレプトアビジンを含むコロイド金組成物に付加され得る。ビオチンはストレプトアビジンに特異的に結合し、コロイド金と活性剤との間に間接的な結合を提供する。
【００８０】
薬剤を金属ゾルに結合する１つの方法は以下の工程を含むが、明瞭にする目的のみで、この方法は、薬剤のＴＮＦを金属ゾルのコロイド金へ結合することに関して開示される。コロイド金ゾル中の粒子と、タンパク質溶液ＴＮＦとの間の相互作用を可能にする装置を使用した。装置の概略図は図１に示される。この装置は、混合チャンバを小さい容積に減少させることによって、結合していないコロイド金粒子と、結合すべきタンパク質のＴＮＦとの相互作用を最大にする。この装置は、大量の金ゾルと、大量のＴＮＦとの相互作用が小さい容積のＴ型コネクタにおいて生じることを可能にする。対照的に、少量のタンパク質を大量のコロイド金粒子に添加することは、金粒子への均一なタンパク質結合を保証するために好ましい方法ではない。また、少量のコロイド金を大量のタンパク質に添加するという反対の方法も好ましい方法ではない。コロイド金粒子およびタンパク質ＴＮＦは、物理的に、コロイド金粒子およびＴＮＦタンパク質を２つの大型リザーバーから引き出す単一のぜん動ポンプによってＴ型コネクタ内に押し込まれる。適切な混合をさらに保証するために、インラインミキサーがＴ型コネクタのすぐ下流に配置される。ミキサーはコロイド金粒子をＴＮＦと激しく混合し、これらは両方とも、約１Ｌ／分の好ましい流速でコネクタを通って流れる。
【００８１】
薬剤と混合する前に、金ゾルのｐＨは、１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ８〜９に調整される。高度に精製されて凍結乾燥された組換えヒトＴＮＦが再構成され、３ｍＭのＴｒｉｓ中に希釈される。ゾルまたはＴＮＦのいずれかをそのそれぞれのリザーバーに添加する前に、容器をＴ型コネクタへ接続する管がクランプで閉じられる。等量のコロイド金ゾルおよびＴＮＦ溶液が適切なリザーバーに添加される。溶液中の薬剤の好ましい濃度は、約０．０１〜１５μｇ／ｍｌの範囲であり、薬剤対金属ゾル粒子の比率に応じて変えることができる。溶液中のＴＮＦの好ましい濃度は、０．５〜４μｇ／ｍｌの範囲であり、ＴＮＦ−コロイド金組成物のためのＴＮＦの最も好ましい濃度は０．５μｇ／ｍｌである。
【００８２】
溶液がそのそれぞれのリザーバーに適切に装填されたら、ぜん動ポンプがオンにされ、薬剤溶液およびコロイド金溶液はＴ型コネクタ内に引き出され、インラインミキサーを通り、ぜん動ポンプを通って、捕集フラスコ内に入る。混合された溶液は捕集フラスコ内でさらに１時間攪拌されて、インキュベーションされる。
【００８３】
ＰＥＧ（誘導体化されていてもいなくても）などのステルス剤を含む組成物において、このような組成物を製造するための方法は以下の工程を含むが、明瞭にする目的のみで、この方法は、ＰＥＧチオールを金属ゾル組成物に添加することに関して開示される。任意のＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ組成物、または任意の大きさのＰＥＧ組成物、またはいくつかの異なるＰＥＧを含む組成物は、以下の工程を用いて製造することができる。上記で教示された１時間のインキュベーションに続いて、チオール誘導体化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液がコロイド金／ＴＮＦゾルに添加される。本発明は、任意の誘導体基を有する任意の大きさのＰＥＧの使用を意図するが、好ましい誘導体化ＰＥＧとしては、ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ／５０００、チオール−ＰＥＧ−チオール／３４００、ｍＰＥＧ−チオール５０００、およびｍＰＥＧチオール２００００（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。好ましいＰＥＧは、水中の１５０μｇ／ｍｌの濃度のｍＰＥＧ−チオール５０００（ｐＨ５〜８）である。従って、１０％ｖ／ｖのＰＥＧ溶液がコロイド金−ＴＮＦ溶液に添加される。金／ＴＮＦ／ＰＥＧ溶液は、さらに１時間インキュベートされる。
【００８４】
コロイド金／ＴＮＦ／ＰＥＧ溶液は、次に、５０Ｋ ＭＷＣＯダイアフィルトレーションカートリッジによって限外ろ過される。５０Ｋ残余分および透過液は、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦ濃度について測定され、金粒子に結合したＴＮＦの量が決定される。
【００８５】
本発明の組成物は、インビトロ系およびインビボ系で投与することができる。インビボ投与は、標的細胞への直接適用、または経口、直腸、経皮、眼、（硝子体内または前房内を含む）、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、気管内、および硬膜外を含む）投与に適した製剤を含むがこれらに限定されないこのような投与経路を含むことができる。好ましい方法は、経口または注射経路によって本発明のベクターを含む有効量の組成物を投与することを含む。
【００８６】
製剤は単位剤形において都合よく提供され、従来の製薬技術によって調製され得る。医薬製剤組成物は、金属ゾルベクターおよび医薬品キャリアまたは賦形剤に会合をもたらすことによって製造される。一般に、製剤は、組成物を液体キャリアもしくは微粉化固体キャリアまたはその両方と均一および密接に会合させ、次に必要であれば生成物を成形することによって調製される。
【００８７】
本発明の組成物の好ましい使用方法は、ベクターを腫瘍に導くことを含む。好ましいベクター組成物は、腫瘍もしくは生物体における治療効果または腫瘍の検出のために腫瘍に送達するために、金属ゾル粒子、薬剤、およびステルス剤または誘導体化ステルス剤（すなわち、ＰＥＧまたは誘導体化ＰＥＧ組成物）を含む。このようなベクター組成物は、さらに、標的および／または統合分子を含み得る。さらに他の好ましいベクター組成物は、腫瘍に放射治療を送達するために、金属ゾル粒子、放射性または細胞毒性の薬剤、およびＰＥＧまたは誘導体化ＰＥＧ組成物を含む。歴史的に、放射性コロイド金は、癌治療として、肝臓細胞によるコロイド金の予測される取り込みによって、主に肝臓癌の処置のために使用されていた。放射性コロイド金属粒子と組み合わせて誘導体化ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧチオールを含む組成物は、腫瘍を処置または同定するために使用される。あるいは、コロイド金属に結合されるタンパク質に結合した放射性部分を含み、そしてさらに誘導体化ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−チオールを含む（放射性ベクターを形成する）ベクター組成物は、腫瘍を処置するために使用される。本発明の放射性ベクター組成物は静脈注射されて腫瘍に輸送され、肝臓によって有意に取り込まれない。両方の組成物において、ＰＥＧチオールが放射性治療を腫瘍に集中させる能力は処置効力を増大させるが、処置の副作用を低減すると考えられる。
【００８８】
その他の好ましいベクター組成物は、腫瘍のインビボでの画像化および検出のために組成物を投与することを含む方法において使用するために、金属ゾル粒子およびＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ誘導体を含む。組成物はさらに、検出および画像化方法に役立つ薬剤を含み得る。たとえば、薬剤としては、放射性、放射線感受性、もしくは反応性（光または熱反応性など）の化合物、化学発光または発光剤、または検出目的で使用される他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。検出方法としては、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＣＡＴまたはＰＥＴスキャン、目視検査、比色分析、放射検出法、分光光度法、およびタンパク質、核酸、多糖類または他の生物剤検出方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明は、外来核酸または遺伝子材料を細胞内に送達するための方法において使用するための組成物を含む。外来遺伝子材料は、特定の細胞を認識することができる標的分子を用いて特定の細胞に導くか、あるいは、ＰＥＧまたは誘導体化ＰＥＧを含む組成物を用いて腫瘍に特異的に導くことができる。例えば、標的分子は細胞上の特異的受容体のための結合パートナーであり、結合した後、組成物全体は細胞内に取り込まれ得る。ベクター組成物の結合は、細胞内の二次メッセンジャー分子の活性化など、細胞の状態を変更する細胞メカニズムを活性化し得る。従って、異なる細胞型の混合物中では、外来核酸は選択された受容体を有する細胞に送達され、受容体を欠いている細胞は影響を受けない。
【００９０】
本発明は、薬剤の挿入または薬剤の適用のために、インビトロまたはインビボにおける特定の細胞のトランスフェクションのための組成物および方法を含む。このような組成物の１つの実施形態は、コロイド金属に結合されるポリカチオン（非特異的結合−統合分子）に結合した核酸を含む。本発明の好ましい実施形態は、細胞の受容体仲介によるエンドサイトーシスを用いてトランスフェクションを達成する標的化遺伝子送達ベクターを形成するために、標的分子および核酸剤を結合させることができるプラットフォームとしてコロイド金を含む。さらに好ましい実施形態では、標的分子はサイトカインであり、薬剤はＤＮＡまたはＲＮＡなどの遺伝子材料である。この実施形態は、遺伝子材料が結合または会合されるポリカチオンなどの統合分子を含んでもよい。
【００９１】
本発明において、方法は、トランスフェクションまたは治療効果のために、遺伝子送達ベクターの調製および標的化遺伝子送達ベクターの細胞への送達を含む。本発明では、組成物の核酸は内部移行されて検出剤としてまたは遺伝子治療効果のために使用されるか、あるいは核酸は細胞によって翻訳および発現され得ることが意図される。発現産物は当業者に知られている任意のものでよく、機能性タンパク質、細胞産物の産生、酵素活性、細胞産物の排出、細胞膜成分の産生、または核成分が含まれるが、これらに限定されない。標的細胞への送達方法は、細胞培養などによるインビトロ技法のために使用される方法、またはインビボ投与のために使用される方法のような方法であり得る。インビボ投与は、細胞への直接適用、またはヒト、動物、もしくは他の生物体のために使用されるような投与経路、好ましくは静脈内または経口投与を含み得る。また本発明は、本発明の組成物により改変された細胞、ならびにインビトロまたはインビボ方法におけるこのような細胞の他の細胞、組織または生物体への投与も意図する。
【００９２】
本発明は、特定の免疫成分へ向けられる組成物を用いて、特定の免疫細胞の同時または逐次的な標的化によって免疫応答を増強し、ワクチン効力を増大させるための組成物および方法を含む。組成物は、免疫細胞の画像化または検出のための方法において使用することもできる。これらの方法は免疫系に作用することができるベクター組成物を含み、以下の成分、標的分子、薬剤、統合分子、１つまたは複数のタイプのステルス剤（すなわち、ＰＥＧ）または誘導体化ステルス剤の少なくとも１つと会合されたコロイド金属が含まれる。組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（マクロファージおよび樹状細胞など）、およびリンパ球（Ｂ細胞およびＴ細胞など）を含むがこれらに限定されない細胞などの特定の免疫成分を含むこともでき、これらは、１つまたは複数の成分特異的免疫刺激剤によって作用されているか、あるいは個々に作用される。
【００９３】
成分特異的免疫刺激分子の例としては、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−３（「ＩＬ−３」）、インターロイキン−４（「ＩＬ−４」）、インターロイキン−５（「ＩＬ−５」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキン−７（「ＩＬ−７」）、インターロイキン−８（「ＩＬ−８」）、インターロイキン−１０（「ＩＬ−１０」）、インターロイキン−１１（「ＩＬ−１１」）、インターロイキン−１２（「ＩＬ−１２」）、インターロイキン−１３（「ＩＬ−１３」）、リピドＡ、ホスホリパーゼＡ２、エンドトキシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＢおよび他の毒素、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ−□」）、トランスフォーミング成長因子−β（「ＴＧＦ−β」）リンホトキシン、遊走阻止因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＣＳＦ」）、単球マクロファージＣＳＦ、顆粒球ＣＳＦ、血管上皮成長因子（「ＶＥＧＦ」）、アンジオゲニン、トランスフォーミング成長因子（「ＴＧＦ−□」）、熱ショックタンパク質、血液型の炭水化物部分、Ｒｈ因子、線維芽細胞成長因子、および他の炎症および免疫調節タンパク質、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、センス、アンチセンス、癌細胞特異的抗原、例えば、ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥなど、ｆｌｔ３リガンド／受容体系、分子および受容体のＢ７ファミリー、ＣＤ４０リガンド／受容体、免疫療法薬、例えば、ＡＺＴなど、ならびに血管新生および抗血管新生薬、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチン、および塩基性線維芽細胞成長因子、または血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
特に好ましい実施形態は、成分特異的免疫刺激剤と組み合わせて特異的抗原を含む薬剤を含むベクター組成物を用いて、免疫応答の活性化のための方法を提供する。本明細書で使用される場合、成分特異的免疫刺激剤は、ＢまたはＴ細胞などの免疫系の成分に特異的であり、成分が免疫応答における活性を有するような影響を成分に与えることができる薬剤を意味する。成分特異的免疫刺激剤は、免疫系のいくつかの異なる成分に影響を与えることができてもよく、この能力は、本発明の方法および組成物において使用され得る。薬剤は天然に存在してもよいし、あるいは分子生物学的技法またはタンパク質受容体操作によって産生または改変されることもできる。
【００９５】
免疫応答における成分の活性化は、免疫応答の他の成分の刺激または抑制をもたらし、疫系応答の全体の刺激または抑制を導くことができる。表現を容易にするために、本明細書では免疫成分の刺激が記載されているが、刺激、抑制、拒絶およびフィードバック活性を含むがこれらに限定されない免疫成分の全ての応答が、刺激という用語によって意図されることが理解される。
【００９６】
影響される免疫成分は複数の活性を有し、抑制および刺激の両方、またはフィードバック機構の開始もしくは抑制を導くこともできる。本発明は、本明細書中で詳述される免疫学的応答の例によって限定されるべきでないが、免疫系の全ての態様における成分特異的効果を意図する。
【００９７】
免疫系の成分のそれぞれの活性化は、同時、逐次、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。本発明の方法の１つの実施形態では、複数の成分特異的免疫刺激剤が同時に投与される。この方法では、免疫系は、成分特異的免疫刺激剤を含むベクター組成物をそれぞれが含有する複数の別個の調製物によって同時に刺激される。好ましくは、ベクター組成物は、コロイド金属に会合した成分特異的免疫刺激剤を含む。より好ましくは、組成物は、同一の大きさの粒子または種々の大きさの粒子のコロイド金属および抗原に会合した成分特異的免疫刺激剤を含む。最も好ましくは、組成物は、同一の大きさの粒子または種々の大きさの粒子のコロイド金属、抗原およびＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体に会合した成分特異的免疫刺激剤を含む。
【００９８】
成分特異的免疫刺激剤は、個々の免疫成分に対して特異的な刺激性上方制御効果を提供する。例えば、インターロイキン−１□（ＩＬ−１□）は、マクロファージを特異的に刺激するが、ＴＮＦ−□（腫瘍壊死因子α）およびＦｌｔ−３リガンドは樹状細胞を特異的に刺激する。熱殺菌マイコバクテリウム・ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）はＢ細胞の特異的な刺激因子であり、インターロイキン−２（ＩＬ−２）はＴ細胞の特異的な刺激因子である。このような成分特異的免疫刺激剤を含むベクター組成物は、それぞれ、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞の特異的な活性化を提供する。例えば、成分特異的免疫刺激剤ＩＬ−１□を含むベクター組成物が投与されると、マクロファージが活性化される。好ましい組成物は、コロイド金属と会合したＩＬ−１□であり、最も好ましい組成物は、コロイド金属および抗原と会合して、その抗原に特異的なマクロファージ応答を提供するＩＬ−１□である。ベクター組成物は、さらに、標的分子、統合分子、ＰＥＧまたは誘導体化ＰＥＧを含んでもよい。
【００９９】
免疫応答の多くの要素は、抗原に対する有効な免疫応答のために必要であり得る。同時刺激方法の実施形態は、１）マクロファージに対するＩＬ−１□、２）樹状細胞に対するＴＮＦ−αおよびＦｌｔ−３リガンド、３）Ｂ細胞に対するＩＬ−６、および４）Ｔ細胞に対するＩＬ−２を含む成分特異的免疫刺激剤の組成物の４つの別々の調製物を投与することである。それぞれの成分特異的免疫刺激剤ベクター組成物は、当業者に既知の任意の経路によって投与することができ、所望される免疫応答に応じて、全てが同じ経路を用いてもよいし、異なる経路を用いてもよい。
【０１００】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、個々の免疫成分は順次活性化される。例えば、この逐次的な活性化は、２つの相、プライマー相および免疫化相に分けることができる。プライマー相は、ＡＰＣ、好ましくはマクロファージおよび樹状細胞を刺激することを含み、免疫化相は、リンパ球、好ましくはＢ細胞およびＴ細胞を刺激することを含む。２つの相のそれぞれにおいて、個々の免疫成分の活性化は、同時でも逐次的でもよい。逐次的な活性化のために、活性化の好ましい方法は、マクロファージの活性化を生じた後に、樹状細胞の活性化、次にＢ細胞の活性化、そしてその次にＴ細胞の活性化を生じるベクター組成物の投与である。最も好ましい方法は、マクロファージおよび樹状細胞の同時活性化を生じた後に、Ｂ細胞およびＴ細胞の同時活性化を生じるベクター組成物の投与を含む、複合型の逐次的活性化である。これは、免疫系のいくつかの経路を開始するための、複数の成分特異的免疫刺激剤の方法および組成物の一例である。
【０１０１】
本発明の方法および組成物は、任意の型のワクチンの有効性を増強するために使用することができる。本発明の方法は、活性化のために特異的な免疫成分を標的とすることによってワクチンの有効性を増強する。コロイド金属および抗原と会合した成分特異的免疫刺激剤を少なくとも含むベクター組成物は、抗原と特異的な免疫成分（マクロファージ、ＢまたはＴ細胞など）との間の接触を増大させるために使用される。ワクチンが現在利用可能である疾患の例としては、コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、流行性耳下腺炎、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘−帯状疱疹、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）、および黄熱病が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０２】
所望の免疫応答を生じるために、抗原を免疫系に送達するための投与経路およびベクター組成物の組み合わせが使用される。また本発明は、免疫刺激性ベクター組成物の長期放出を提供し得るリポソーム、マイクロカプセル、またはミクロスフェアなどのパッケージング系の種々の組成物を含む方法および組成物も含む。これらのパッケージング系は、抗原を保持し、免疫系の活性化のために抗原をゆっくり放出するための内部貯蔵所として作用する。例えば、リポソームは、コロイド金属と結合または会合された抗原の薬剤および成分特異的免疫刺激剤を含むベクター組成物が充填され得る。さらなる組み合わせは、活性ワクチン候補であるウイルス粒子などの薬剤が埋め込まれるか、推定ワクチンのためのＤＮＡを含有するためにパッケージングされたコロイド金粒子である。またベクターは、サイトカイン、統合分子およびＰＥＧ誘導体、ＨＥＳ（登録商標）、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）またはｒＰＥＧなどの１つまたは複数の標的分子も含むことができ、ベクターは次に、ウイルスを特定の細胞に導くために使用される。さらに、２つ以上の潜在的なワクチン候補を標的とする融合タンパク質ワクチンを使用して、２つ以上の感染性微生物に対する保護を提供するベクター組成物ワクチンを提供し得る。また組成物は、材料をゆっくりと放出し得るポリエチレングリコールの付加によって化学修飾された免疫原を含み得る。
【０１０３】
金属粒子、および１つまたは複数の抗原および１つまたは複数の成分特異的免疫刺激剤を含む薬剤、および１つまたは複数の統合および標的分子、およびステルス剤（すなわち、ＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体、またはＨＥＳまたはＨＥＳの誘導体、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）またはＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）の誘導体、またはｒＰＥＧまたはｒＰＥＧの誘導体）を含む組成物は、リポソームまたは生分解性ポリマー内にパッケージングされ得る。ベクター組成物は、リポソームまたは生分解性ポリマーからゆっくり放出され、免疫系によって外来性として認識され、かつ成分特異的免疫刺激剤が方向付けられる特異的成分が、免疫系を活性化または抑制する。例えば、成分特異的免疫刺激剤の存在によって、免疫応答のカスケードがより急速に活性化され、免疫応答がより急速かつより特異的に生じる。
【０１０４】
本発明において意図されるその他の方法および組成物は、金属粒子ならびに抗原および成分特異的免疫刺激剤を含む薬剤の組成物の使用を含み、また統合および標的分子を含んでもよく、ここで、コロイド金属粒子は異なる大きさを有する。組成物はさらに、ＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体を含み得る。成分特異的免疫刺激剤の逐次的投与は、異なる大きさのコロイド金属粒子の使用によって、１用量の投与で達成され得る。１用量は複数の独立した成分特異的免疫刺激剤、抗原および異なる大きさまたは同じ大きさのコロイド金属粒子と会合され得る組み合わせを含む。従って、同時投与は免疫成分の逐次的な活性化を提供し、集団に対してより有効なワクチンおよびさらなる保護をもたらし得る。逐次的な活性化を有するこのような単一用量の投与のその他のタイプは、異なる大きさまたは同じ大きさのコロイド金属ベクター組成物、およびリポソームまたは生分解性ポリマーの組み合わせ、あるいは異なる大きさまたは同じ大きさのコロイド金属ベクター組成物が充填されたリポソームまたは生分解性ポリマーによって提供され得る。
【０１０５】
上記のようなワクチン接種系の使用は、１用量で投与され得るワクチンの提供において重要である。１用量の投与は、動物集団（家畜または動物の野生集団など）の処置において重要である。１用量の投与は、健康管理がほとんどなされていない集団（不十分な健康管理の貧困層、ホームレス、地方居住者または発展途上国の人々など）の処置において不可欠である。全ての国の多くの人々は、ワクチン接種などの予防タイプの健康管理を利用していない。結核などの感染症の再出現によって、１回だけ与えられても持続的に有効な保護を提供することができるワクチンに対する需要が高まっている。本発明の組成物および方法は、このような有効な保護を提供する。
【０１０６】
また、本発明の方法および組成物は、免疫応答の一部である成分を刺激または抑制することによって、免疫応答が生じる疾患を処置するために使用することもできる。このような疾患の例としては、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、ブルトン（Ｂｒｕｔｏｎ）症候群、癌（固形腫瘍および血液由来の腫瘍を含む）、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、後天性免疫不全症候群、移植片拒絶（腎臓、心臓、膵臓、肺、骨、および肝臓移植など）、グレーブス病、多腺性自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発性動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性エリテマトーデス、関節リュウマチ、血清反応陰性脊椎関節炎（ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｐｏｎｄｙｌａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ウェゲナー肉芽腫症、ヘルペス状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんま疹、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調証、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、および非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
本発明のベクター組成物は、成分特異的免疫刺激剤を含む薬剤を含む。組成物は、１つの成分特異的免疫刺激剤または複数の成分特異的免疫刺激剤を含み得る。ベクター組成物の好ましい実施形態は、コロイド金属と会合した成分特異的免疫刺激剤を含む薬剤を含む。より好ましい実施形態は、コロイド金属、および以下の、ＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体、またはＨＥＳまたはＨＥＳの誘導体、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）またはＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）の誘導体、またはｒＰＥＧまたはｒＰＥＧの誘導体、成分特異的免疫刺激剤（抗原、受容体分子、核酸、医薬品、化学療法薬、およびキャリアを含むがこれらに限定されない）の効果を特異的に標的化するための統合分子および標的分子の少なくとも１つに会合した、１つまたは複数の抗原および成分特異的免疫刺激剤を含む薬剤を含む組成物を含む。本発明の組成物は、任意の方法で免疫成分に送達され得る。１つの実施形態では、抗原および成分特異的免疫刺激剤を含む薬剤は、コロイド金属粒子が抗原および免疫刺激剤の両方に会合するような形で、コロイド金属に結合される。
【０１０８】
本発明は、種々の異なる送達プラットフォームまたはキャリアの組み合わせにおける、抗原および成分特異的免疫刺激剤などの薬剤の提示を含む。例えば、好ましい実施形態は、リポソームまたは生分解性ポリマーキャリア内で抗原および成分特異的免疫刺激剤などの薬剤に結合した金属コロイド粒子を含むベクター組成物の投与を含む。さらなる組み合わせは、ワクチン抗原であるか、あるいはワクチンのための抗原を産生する核酸を含有する生存可能なウイルス粒子であるウイルス粒子などの薬剤と会合したコロイド金粒子である。またベクター組成物は、ウイルスを特定の細胞に導くために使用されるサイトカインまたは選択される結合対メンバーなどの標的分子を含むことができ、さらに、本明細書において教示される統合分子またはＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体ＩＮＳＥＲＴ ＬＩＳＴＩＮＧなどの他の要素を含む。このような実施形態は、長期の応答のために抗原を免疫系にゆっくり放出するワクチン調製物を提供する。このタイプのワクチンは、１回のワクチン投与のために特に有利である。リポソームおよびマイクロカプセルを含むがこれらに限定されない全てのタイプのキャリアが本発明において意図される。
【０１０９】
毒性の低減およびワクチン投与
本発明は、因子が通常の濃度よりも高い濃度で存在しているときにヒトまたは動物に対して毒性である因子を投与するための組成物および方法を含む。一般に、本発明に従う組成物は、通常の濃度よりも高い濃度で薬剤が見出されるとヒトまたは動物に対して毒性である薬剤と組み合わせたコロイド金属の混合物であるか、あるいは遮蔽された形態よりも高い活性が可能である遮蔽されていない形態であるか、あるいは通常は見られない部位において見出されるベクター組成物を含む。ベクター組成物がヒトまたは動物に投与されると、コロイド金属ベクター組成物なしに薬剤が単独で提供される場合よりも、薬剤はヒトまたは動物に対して有害度が低いか、あるいは毒性が低いか、あるいは非毒性である。組成物は、場合により、水溶液、または賦形剤、緩衝剤、抗原安定剤、または滅菌キャリアなどの薬学的に許容可能なキャリアを含む。また、パラフィン油などの油が、場合により、組成物中に含まれてもよい。ベクター組成物は、さらに、ＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体を含むことができる。さらに、ベクター組成物は、ＨＥＳ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、ｒＰＥＧ、またはＨＥＳ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、ｒＰＥＧの誘導体、例えば、ＨＥＳ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、ｒＰＥＧのチオール化誘導体を含み得る。
【０１１０】
本発明の組成物は、注射されると毒性である薬剤に対してヒトまたは動物にワクチン接種するために使用することができる。さらに、本発明は、サイトカインまたは成長因子などの薬剤を含む組成物を投与することによって、サイトカインまたは成長因子で特定の疾患を処置するために使用することができる。薬剤をヒトまたは動物に投与する前に薬剤をコロイド金属と混合することによって、薬剤の毒性が低減または除去され、それにより、因子がその治療効果を発揮できるようになる。ベクター組成物中のコロイド金属とこのような薬剤との組み合わせは治療結果を維持または増大しながら毒性を低減し、それにより、より高濃度の薬剤が投与されるので、あるいは異なる薬剤の組み合わせの使用が可能になることによって、効力が改善される。従って、ベクター組成物中の薬剤と組み合わせてコロイド金属を使用すると、通常の濃度よりも高い濃度の薬剤の使用、あるいは通常はその毒性のためにヒトまたは動物に投与するために使用できない薬剤の投与が可能になる。好ましくは、ベクター組成物はさらに、１つまたは複数のタイプまたは大きさのＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体、またはＨＥＳまたはＨＥＳの誘導体、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）またはＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）の誘導体、またはｒＰＥＧまたはｒＰＥＧの誘導体を含む。
【０１１１】
本発明の１つの実施形態は、コロイド金属と会合した薬剤を含むベクター組成物を、ワクチン調製物として使用するための方法を含む。このようなワクチンの多数の利点の中には、通常は毒性の薬剤の毒性の低減がある。薬剤に対してワクチンとして使用されるベクター組成物は、任意の方法によって調製することができる。例えば、薬剤およびコロイド金属の混合物のベクター組成物は、好ましくは、適切な動物に注射される。例えば、約２〜５キログラムの体重のウサギは、コロイド金および薬剤、１ｍｇのサイトカイン、ＩＬ−１またはＩＬ−２のいずれかを含む組成物を２週間ごとに投与された後、顕著な副作用がなかった。薬剤は本発明に従って投与される場合には毒性でないので、抗原として機能できる最適な量の薬剤を動物に投与することができる。本発明に従うベクター組成物は単回用量で投与されてもよいし、あるいは適切な時間スケールにわたって間隔をあけて複数回用量で投与されてもよい。複数回用量は、二次免疫応答の発生において有用である。例えば、抗体価は、月に１回追加免疫を投与することによって維持される。
【０１１２】
ワクチン組成物はさらに、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、リポ多糖、モノホスホリルリピドＡ、ムラミルジペプチド、リピドＡを含有するリポソーム、ミョウバン、ムラミルトリペプチド−ホスファチジルエタノールアミン、キーホールリンペットヘモシアニンを含むがこれらに限定されない薬学的に許容可能なアジュバントを含んでもよい。動物のために好ましいアジュバントはフロイント不完全アジュバントであり、ヒトのために好ましいのはミョウバンであり、好ましくは、コロイド金属および活性剤を含む組成物によって１：１で希釈される。
【０１１３】
本発明の組成物の好ましい使用方法は、少なくとも１つの薬剤と混合されたコロイド金属を含む有効な量のベクター組成物をヒトまたは動物に投与することを含み、ここで、組成物は、薬剤の単独またはコロイド金属を含まない組成物中での投与と比較した場合に、ヒトまたは動物に投与される際により低毒性であるかまたは非毒性であり、あるいは副作用がより少ないかまたはより軽い。本発明に従うベクター組成物は、通常は毒性の物質に対してワクチンとして投与することもできるし、あるいは通常は毒性の薬剤の毒性が低減された治療剤であることもでき、それにより、より長い期間にわたってより多量の薬剤の投与が可能になる。
【０１１４】
これらの実施形態の実施において、組成物が投与される経路は重要ではないと考えられる。本発明に従って組成物が投与され得る経路には、皮下、筋肉内、腹腔内、経口、および静脈内経路を含むがこれらに限定されない既知の投与経路が含まれる。好ましい投与経路は静脈内である。別の好ましい投与経路は筋肉内である。
【０１１５】
例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）は腎臓癌の処置において有意な治療結果を示すことが知られている。しかしながら、ＩＬ−２の投与の毒性の副作用はかなりの数の患者の死をもたらす。対照的に、少なくともＩＬ−２およびコロイド金属を含むベクター組成物が投与される場合、毒性はほとんどまたは全く観察されず、レシピエントにおいて強力な免疫応答が生じる。ＩＬ−２治療のためにこれまで使用された用量は、７０ｋｇのヒトについて１日あたり約２１ｘ１０６ユニットのＩＬ−２（７０ｋｇのヒトについて１日３回、７ｘ１０６ユニットのＩＬ−２）であった。１ユニットは約５０ピコグラムに等しく、２ユニットは約０．１ナノグラムに等しいので、２０ｘ１０６ユニットは１ミリグラムに等しい。本発明の１つの実施形態では、ウサギに与えたＩＬ−２の量は、ウサギの体重３ｋｇにつき約１ｍｇである。実際には、本明細書に記載される薬剤の投与の効果の研究には、これまでヒトに与えられていた用量よりも２０倍を超えて多い用量が含まれていた。
【０１１６】
ＩＬ−２（１ｍｇ／３ｋｇの動物）を３日毎に２週間の間３匹のウサギに投与した別の実施形態では、動物は全て臨床的に病気であるように見え、動物のうちの２匹は、ＩＬ−２の明らかな毒性効果により死亡した。コロイド金を含むベクター組成物中で同じ用量のＩＬ−２を使用し、同じく２週間の間３匹のウサギに投与した場合には、毒性は観察されず、３匹全ての動物において有意な抗体応答が得られた。本明細書中で使用される「陽性抗体応答」は、直接ＥＬＩＳＡによって決定されるように、免疫化後の出血を予備免疫の出血と比較して、特異的抗体反応性の３〜４倍の増大として定義される。直接ＥＬＩＳＡは、ＩＬ−２をマイクロタイタープレート上に結合させ、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧによりプレート上のＩＬ−２に結合したＩｇＧの量を決定することによって行われる。従って、ＩＬ−２の生物学的効果が残存していると考えられる。毒性効果が最小限にされているので、より大きくより有効な免疫応答が必要とされる場合には、必要に応じてより高濃度のＩＬ−２を投与することができる。
【０１１７】
本発明は、１つまたは複数の薬剤およびコロイド金属を含むベクター組成物を投与することによって疾患を処置するための方法を含む。ベクター組成物は、さらに、ＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体を含むことができる。投与の後、薬剤はコロイド金属から放出されると理論付けられる。いずれの理論によっても束縛されることは望まないが、放出は単に循環時間の関数でなく、平衡速度論によっても制御されると考えられる。
【０１１８】
コロイド金属および少なくとも１つの薬剤を少なくとも含むベクター組成物を細胞と共に２５日間インキュベートしたときに、コロイド金属から薬剤のわずか５％しか放出されないことが観察された。従って、循環時間だけでは、薬剤がインビボで複合体から放出されるメカニズムを説明できないと理論付けられる。しかしながら、放出される薬剤の量は、部分的に、体内の複合体の濃度に関連することが分かっている。組成物の種々の希釈物を分析（ＣｙｔＥＬＩＳＡＴＭ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ＣｙｔＩｍｍｕｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）したときに、複合体のより薄い溶液は、著しく多い量の薬剤を放出することが分かった。例えば、複合体の１：１００希釈では薬剤は本質的に放出されなかったが、組成物の１：１００，０００希釈では、３５０００ｐｇを超える薬剤が放出された。
【０１１９】
従って、より多量の溶液中で組成物の濃度が低くなるほど、より多量の薬剤が放出される。組成物の濃度が高くなるほど、より少量の薬剤が放出される。従って、血液および細胞外流体によるインビボでの組成物の連続的な希釈のために、これまでに知られている方法によって投与できる用量よりも低用量の薬剤を患者に投与することによって同じ治療効果を達成することが可能であると理論付けられる。
【０１２０】
また、本発明の組成物から放出される薬剤の量は、コロイド金属に最初に結合される薬剤の量に関連することも理論付けられる。より多量の薬剤が最初に結合されたベクター組成物からインビボでより多くの薬剤が放出される。従って、当業者は、コロイド金属に最初に結合される薬剤の量を変化させることによって、送達される薬剤の量を制御し得る。
【０１２１】
これらの合わせた特性は、多量の薬剤をコロイド金属に結合させることができる方法を提供し、それにより、単独で投与される場合よりも薬剤の毒性が低くされる。次に、少量のベクター組成物を患者に投与することができ、複合体からの薬剤のゆっくりとした放出が得られる。これらの方法は、癌および免疫疾患などの疾患の処置のためのより長期間にわたる低用量の薬剤を提供する。
【０１２２】
本発明の組成物は、癌、固形腫瘍および白血病などの血液由来の癌の両方、関節リュウマチなどの自己免疫疾患、骨粗鬆症などのホルモン欠損症、先端巨大症などの分泌過多に起因するホルモン異常、敗血症性ショックなどの感染症、酵素欠損症（例えば、フェニルケトン尿症を生じるフェニルアラニンの代謝の不能）などの遺伝子疾患、ならびにＡＩＤＳなどの免疫不全疾患を含むがこれらに限定されない複数の疾患の処置のために有用である。
【０１２３】
本発明の方法は、現在使用されている治療的処置レジメンに加えて、ベクター組成物の投与を含む。好ましい方法は、慢性および急性疾患の処置、特に癌の処置のための治療薬の投与と同時に、ベクター組成物の投与を含む。例えば、薬剤のＴＮＦを含むベクター組成物は、抗血管新生タンパク質（エンドスタチンおよびアンジオスタチン、サリドマイド、タキソール、メルファラン、パクリタキセル、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、アシクロビル、シスプラチンおよびタクリンなど）などの既知の抗癌剤による化学療法的処置の前、最中、後に投与される。現在知られている癌の処置方法は全て、本発明において意図されており、ベクター組成物は、癌の有効な処置のために必要に応じて処置スケジュールの様々な時点で投与され得る。
【０１２４】
好ましい方法は、薬物耐性腫瘍、癌または新生物の処置を含む。これらの腫瘍は既知の抗癌薬および抗癌治療に対して耐性であり、このような薬剤の投薬量を増大させても、腫瘍の大きさまたは成長に対する効果はほとんどまたは全くない。このような薬物耐性腫瘍細胞のＴＮＦへの曝露が、これらの化学療法の抗癌効果に対してこれらの細胞を再感作させるという観察は、癌処置において知られている。ドキソルビシンなどのトポイソメラーゼＩＩを標的とする挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｖｅ）薬物と協同して、ＴＮＦがドキソルビシン腫瘍細胞死を回復させることを示す証拠が公表されている。また、インターフェロン（ＩＦＮ）は５−フルオロウラシルと協同して、５−フルオロウラシルの化学療法活性を増大させることが知られている。本発明は、このような薬物耐性腫瘍を処置するために使用することができる。好ましい方法は、コロイド金に結合されたＴＮＦおよび誘導体化ＰＥＧを有するベクターを含む組成物の投与を含む。無症状の用量のＴＮＦ−ｃＡｕ−ＰＴで患者を前処置することにより、腫瘍はＴＮＦベクターを隔離して、次の全身性化学療法に対して細胞を感作させる。このような化学療法剤としては、ドキソルビシン、他の介在化学療法剤、タキソール、５−フルオロウラシル、ミタキサントロン（ｍｉｔａｘａｎｔｒｏｎｅ）、ＶＭ−１６、エトポシド、ＶＭ−２６、テニポシド、および他の非介在化学療法剤が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、別の好ましい方法は、ＴＮＦおよび癌の処置に有効な少なくとも１つの他の薬剤を有するベクターを含む組成物の投与を含む。例えば、ＰＴ−ｃＡＵ（ＴＮＦ）ドキソルビシンベクターは、薬物耐性腫瘍または癌を有する患者に投与される。投与される量は、処置すべき腫瘍および患者の状態に依存する。ベクター組成物はより多量の化学療法剤の投与を可能にし、またベクターは腫瘍の薬物耐性特性も軽減する。
【０１２５】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明され、これらの実施例は、決してその範囲に制限を課すると解釈されてはならない。むしろ逆に、様々な他の実施形態、修正およびこれらの等価物を有し得る手段、そして本明細書の説明を読んだ後に、本発明の趣旨および／または添付の特許請求の範囲から逸脱することなくこれら自体を当業者に示唆し得る手段があり得ることは、明確に理解されるべきである。
【実施例】
【０１２６】
実施例１
コロイド金ゾルの調製
コロイド金は、クエン酸ナトリウムなどの薬剤によりクロロ金酸（Ａｕ＋３、ＨＡｕＣＵ４）を中性金（Ａｕ０）に還元することによって生成される。Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ （１９７９）によって記載される方法を適用して、３４ｎｍのコロイド金粒子を生成した。この方法は、コロイド金の生成のための簡単でスケーラブルな手順を提供した。簡単に言うと、４％の塩化金溶液（２３．０３％のストック、ｄｍｃ２、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）および１％のクエン酸ナトリウム溶液（ｗｔ／ｗｔ、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ、ケンタッキー州パリス）を脱イオンＨ２Ｏ（ＤＩＨ２Ｏ）中で作った。３．７５ｍｌの塩化金溶液を１．５ＬのＤＩＨ２Ｏに添加した。この溶液を激しく攪拌し、還流下でローリングボイル（ｒｏｌｌｉｎｇ ｂｏｉｌ）させた。６０ｍｌのクエン酸ナトリウムの添加によって、３４ｎｍのコロイド金粒子の形成を開始させた。以下に記載されるように、粒子の形成および成長の全プロセスの間、溶液を連続的に沸騰させ、撹拌した。
【０１２７】
塩化金へのクエン酸ナトリウムの添加により、最初の塩化金溶液の色の変化を特徴とする一連の還元反応が開始した。クエン酸ナトリウムを添加すると、塩化金溶液の色は黄金色から黒／青の中間色に変化した。反応の完了は、青／黒色から鮮紅色へのゾルの最終的な色の変化によって示された。最終的な色の変化の後、溶液を還流下でさらに４５分間連続的に撹拌し、沸騰させた。続いて、ゾルを室温まで冷却して、０．２２□ｍの硝酸セルロースフィルターによりろ過し、使用するまで室温で保存した。
【０１２８】
コロイド金粒子の形成は、核形成および粒子成長の２段階で起こる。クエン酸ナトリウムによるＡｕ＋３からＡｕ０への還元によって、粒子の核形成を開始させた。この工程は、鮮黄色から黒色への塩化金溶液の色変化によって特徴付けられる。遊離Ａｕ＋３のＡｕ０核上への連続的な層形成によって第２段階の粒子成長が促進される。粒径は、塩化金溶液に添加されるクエン酸の量に反比例し、一定量の塩化金に対してクエン酸ナトリウムの量を増大させると、より小さい粒子の形成が起こり、金溶液に対して添加されるクエン酸の量を減少させると、比較的大きい粒子の形成が起こる。
【０１２９】
核形成反応と同様に、コロイド金粒子の形成も溶液の色の変化と相関している。しかしながら、最初の反応とは違って、この第２の色変化は粒径に直接的に関係する。小さい粒子（すなわち、１２〜１７ｎｍ）が作られる場合、ゾルは色がオレンジ〜赤であり、中間の大きさの粒子（すなわち、２０〜４０ｎｍ）が作られる場合、ゾルは色が赤〜ワイン色に見え、そして大きい粒子（すなわち、６４〜９７ｎｍ）が作られる場合、ゾルは色が紫〜茶色に見える。反応物の激しい撹拌は、粒子の核生成および成長の両方にとって重要であった。プロセス中のどの工程においても、不適切な攪拌は、予測した直径よりも大きい不均一な粒子の形成をもたらした。
【０１３０】
コロイド金調製物のＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）およびデュアルアングル光散乱の照合によって、コロイド金調製物中の粒子の大きさが、その理論的な大きさの３４ｎｍに非常に近いことが明らかになった。粒子は、３４〜３６ｎｍの平均粒径および平均して０．１１の多分散性測定値を有する大きさで均一であった（表ＩＶ）。この状態で、コロイド金粒子は、それぞれの粒子の表面に存在する負の荷電によるその相互の静電反発力によって懸濁液内に留まった。塩溶液（すなわち、１％ｖ／ｖの最終濃度のＮａＣｌ）へこれらの裸の粒子を曝露すると、粒子は凝集されて、最終的には溶液から沈殿された。タンパク質（例えば、ＴＮＦ）または他の薬剤を粒子表面に結合させることによって、このプロセスを妨害または阻止した。
【０１３１】
実施例２
金属源
コロイド形成のための出発金反応物の供給源がコロイド金組成物に影響するかどうかを見るために、実験を実施した。塩化金は、２つの異なる商業的供給源：Ｄｅｇｕｓｓａ Ｍｅｔａｌｓ Ｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｃｅｒｄｅｃ（ｄｍｃ２）およびＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（以下シグマ社）から購入した。両方の金調製物を、汚染金属および他の物質の存在について分析した。これらの研究からの結果は表ＩＩに記載される。各調製物中の金濃度は報告された値の範囲内であったが、シグマ社製調製物がより高レベルのＭｇ、ＣａおよびＦｅを含有することは明らかである。
【０１３２】
【表２】
【０１３３】
粒子のＴＥＭによって、シグマ社製およびｄｍｃ２社製からの異なる塩化金源で製造された粒子の間のさらなる差異が明らかになった。コロイド金ゾルを上記のように製造し、ＴＥＭを使用して観察した。冷却後、１０ｍｌのゾルを遠心分離して、粒子を濃縮した。得られた上澄みを吸引によって除去し、穏やかな粉砕によってコロイド金ペレットを再懸濁した。標準的手順に従って、ペレットを透過型電子顕微鏡のために調製した。
【０１３４】
シグマ社製塩化金で製造した粒子は半透明であり、明白な条線を有する。条線は、上記で同定されたものなどの微量の汚染物の存在によるものであると報告されている。対照的に、ｄｍｃ２塩化金で製造した粒子は電子密度が高く、条線が非常に少ない。
【０１３５】
実施例３
シグマ社製およびｄｍｃ２社製の塩化金を用いたコロイド金ゾルの生成
上記のデータは、ｄｍｃ２社製の塩化金が、より低いレベルの汚染元素を含有することを示唆した。これら２つの定性的に異なる塩化金源の効果を決定するために、２つの異なる塩の源を用いてコロイド金ゾルを生成した。コロイド金粒子を形成するための手順は、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒによって最初に記載され、実施例１に記載された手順に従う。簡単に言うと、ｄｍｃ２社製およびシグマ社製ストック調製物から４％の塩化金の（水）溶液を作った。３．７５ｍｌの各溶液を、１．５Ｌの水をそれぞれが含有する個々のフラスコへ添加した。溶液をローリングボイルさせ、還流下で沸騰を続け、そして激しく攪拌した。２２．５ｍｌの１％クエン酸ナトリウム溶液を各フラスコへ添加した。十分に記載されたコロイド金の形成のプロセスが完了する（金から黒、鮮紅色への色の変化によって示される）まで、両フラスコ中の溶液を沸騰させ続けた。ゾルが鮮紅色に変化したら、一様に攪拌しながらさらに４５分間、還流下で沸騰させた。冷却後、０．２２□ｍのニトロセルロースフィルターによりゾルをろ過し、使用するまで室温で保存した。
【０１３６】
２つのゾルの定性的な比較は、標準的な実験室の分光光度計を用いてＵＶ／ＶＩＳ波長スキャンで作動させて行った。結果は、ゾルが最大吸光度を示す波長によって示されるように、ゾルの２つのバッチが同様の平均直径を有するコロイド金粒子を含有することを明らかにした。しかしながら、２つの調製物の間の最も顕著な相違は、ｄｍｃ２社製材料で製造したゾルがシグマ社製材料で製造したゾルの３倍の粒子数を有することであった。さらに、ｄｍｃ２社製調製物よりもシグマ社製調製物のほうが最大λの周囲の分布が広いことが明らかになり、Ｓｉｇｍａ塩を用いて生成された粒子が、ｄｍｃ２社製塩化金を用いて生成された粒子よりも不均一であることが示された。
【０１３７】
実施例４
コロイド金ゾルの分析的比較
Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒを用いる定量的な粒子のキャラクタリゼーションよって、上記の定性的な相違を確認した。これらの研究について、製造業者の指示書に従って、各金源からの粒子のサンプルを調製した。データは以下の表ＩＩおよび表ＩＩＩに示される。このデータによって、両調製物中の粒子はほぼ同じ大きさ（３４〜３７ｎｍ）であることが確認された。それにもかかわらず、ｄｍｃ２社製材料で製造したゾルは、シグマ社製材料で製造したゾルよりも３倍高い粒子密度を有する。さらに、シグマ社製塩化金調製物で製造した粒子は、ｄｍｃ２社製材料で製造した粒子よりも２．５倍不均一である（すなわち、その多分散性についてより大きな値を有する）（表ＩＶ）。
【０１３８】
【表３】
【０１３９】
【表４】
【０１４０】
実施例５
最適結合ｐＨの決定
タンパク質のコロイド金への結合は、コロイド金およびタンパク質溶液のｐＨに依存することが知られている。ＴＮＦのコロイド金ゾルへの最適結合ｐＨを経験的に決定した。この最適ｐＨは、ＴＮＦのコロイド金粒子への結合を可能にするが、塩誘発性（ＮａＣｌによる）の粒子の沈殿を妨害するｐＨであると定義した。裸のコロイド金粒子は、表面の正味の負電荷によって生じるその相互の静電反発力によって懸濁液中に保持される。塩溶液中に存在するカチオンは、通常は互いに反発する負に荷電したコロイド金粒子を引き付ける。この凝集／沈殿は、赤から紫（粒子が引き付けられたとき）、そして最終的には、粒子が最終的に溶液から析出する大きな凝集物を形成した場合の黒色への、コロイド金溶液の目に見える色の変化によって示される。タンパク質または他の安定剤の粒子表面への結合は、コロイド金粒子のこの塩誘発性の沈殿を妨害し得る。
【０１４１】
ＴＮＦのコロイド金への結合の最適ｐＨは、１ＮのＮａＯＨによりそのｐＨをｐＨ５〜１１（ｐＨ片を用いて決定）に調整した２ｍｌのアリコートの３４ｎｍのコロイド金ゾルを用いて決定した。ＴＮＦ（Ｋｎｏｌｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、均一になるまで精製）をｄｉＨ２Ｏ中で１ｍｇ／ｍｌの濃度に再構成し、さらに３ｍＭのＴＲＩＳ塩基中で１００μｇ／ｍｌまで希釈した。ＴＮＦの最適結合ｐＨを決定するために、ｌ００μｌの１００μｇ／ｍｌのＴＮＦストックを、ｐＨ調整されたコロイド金の種々のアリコートに添加した。ＴＮＦをコロイドと共に１５分間インキュベートした。続いて、１００μｌの１０％ＮａＣｌ溶液を各アリコートに添加し、粒子の沈殿を誘発した。最適結合ｐＨは、ＴＮＦをコロイド金粒子に結合させるが、塩による粒子の沈殿は防止されるｐＨであると定義した。
【０１４２】
実施例６
飽和結合研究
ｐＨ結合研究から得られたデータに基づいて、１ＮのＮａＯＨを用いて３４ｎｍのコロイド金ゾルのｐＨをｐＨ８に調整した。ゾルを１ｍｌのアリコートに分割し、これに、増加する量（０．５〜４μｇのＴＮＦ）の１００μｇのＴＮＦ／ｍｌ溶液を添加した。１５分間結合させた後、７５００ｒｐｍで１５分間サンプルを遠心分離した。上澄みの１０μｌのサンプルを、９９０μｌのＥＩＡアッセイ希釈剤（ＴＮＦ測定のための市販のＥＩＡキットの一部として提供される、ＣｙｔＩｍｍｕｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ロックビル）に添加した。上澄みの残りを吸引によって除去し、コロイド金ペレットをＰＥＧ１４５０／ｄｉＨ２Ｏ溶液（ｐＨ８）中でその最初の体積に再懸濁した。１０μｌの再懸濁ペレットを９９０μｌのＥＩＡアッセイ希釈剤に添加した。再構成ペレットおよび上澄み溶液を連続的に希釈し、市販の定量的ＥＩＡ（ＣｙｔＩｍｍｕｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ、メリーランド州ロックビル）によってＴＮＦ濃度について分析した。
【０１４３】
ｐＨ結合研究からのデータを用いて、５０ｍｌのコロイド金のｐＨを８．０〜９．０の間に調整した。このｐＨにおいて、ＴＮＦの一定体積のコロイド金への結合は飽和速度論を示した（図２）。図２に示されるように、０．５μｇのＴＮＦ／ｍｌの金ゾルでは、実質的に全てのＴＮＦがコロイド金粒子に結合され、上澄み中にはわずかな量（２〜５％）が遊離ＴＮＦとして存在した。このコロイド金−ＴＮＦ複合体は塩の存在下で沈殿し、この濃度のＴＮＦは、コロイド金粒子を十分にコーティングせず、ＴＮＦの飽和用量未満であることが示された。ＴＮＦ濃度を増大することによって、コロイド金粒子に結合されたＴＮＦの量は次第に増大し、上澄み中に測定される遊離ＴＮＦの量は比較的あまり変化しなかった。粒子結合ＴＮＦのこの増大は、塩誘発性の沈殿に対する粒子の安定性の増大に相応した。ＴＮＦによるコロイド金粒子の飽和は、粒子の表面上の全ての結合部位がＴＮＦにより結合されたときに生じた。コロイド金粒子の飽和は４μｇ／ｍｌの結合濃度で生じた（図２）。４μｇ／ｍｌを超える用量での結合は、上澄み中で測定される遊離ＴＮＦの量の増大をもたらした。
【０１４４】
図２には、ＴＮＦのコロイド金への飽和結合が示される。５０ｍｌの３４ｎｍのコロイド金ゾルのｐＨを、１ ＮａＯＨを用いて８に調整し、次に、１ｍｌのアリコートに分割した。増加する体積のストックＴＮＦ（３ｍＭのＴＲＩＳ中、１００μｇ／ｍｌ）溶液をアリコートに添加し、１５分間結合させた。サンプルを７５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水ミルク溶液（アッセイ希釈剤）中に、１０□ｌの上澄みのサンプルを希釈した。上澄みの残りを吸引により除去し、穏やかな粉砕によってコロイド金ペレットを再懸濁した。１０μｌの再懸濁ペレットをアッセイ希釈剤に希釈した。ペレットおよび上澄みサンプルの両方を連続的に希釈し、ＥＩＡ（ＣｙｔＩｍｍｕｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）によってＴＮＦ濃度を測定した。
【０１４５】
実施例７
種々のコロイド金ベクターのラージスケール製造
コロイド金−ＴＮＦ粒子（ベクターとも呼ばれる）のインビボ評価は、全ての製造手順のスケールアップを必要とした。コロイド金の大型（８Ｌ）バッチを上記のように製造した。コロイド金ゾルの製造手順は、８Ｌのコロイド金の製造に適合させた。還流装置（Ｋｏｎｔｅｓ Ｇｌａｓｓ、ニュージャージー州バインランド）を用いて、インビボの実験のために８Ｌのコロイド金を生成した。簡単に言うと、８ＬのｄｉＨ２Ｏをローリングボイルまで加熱した。１つのポートを介して２０ｍｌの塩化金を添加した後、３２０ｍｌのクエン酸ナトリウムを添加した。得られたゾルの色変化は、より少ない調製物で見られたものと同一であった。鮮紅色に達したら、ゾルを一晩冷却させ、次に上記のように滅菌ろ過した。
【０１４６】
ラージスケール量を用いて製造した粒子は、ベンチスケール法を用いて製造した粒子と本質的に同一であった。表Ｖを参照されたい。
【０１４７】
【表５】
【０１４８】
次に、コロイド粒子の均一なコーティングを達成しなければならなかった。コロイド金粒子とＴＮＦ分子との間の結合はほとんど瞬間的であることが分析により実証されたので、これは重要な検討事項であった。従って、濃縮したタンパク質溶液を大量の金に単に添加すると、ＴＮＦにより異なって被覆された粒子が生じ得る。粒子とＴＮＦ分子との相互作用を最適化するために、コロイド金ゾルとＴＮＦ溶液との間の完全な相互作用を可能にする装置を使用した。装置の概略図は図１に示される。装置は、各成分を小さい混合チャンバ（Ｔ型コネクタ）内に引き出すことによって、裸のコロイド金粒子とＴＮＦとの間の混合体積を減少させた。コロイド金粒子およびＴＮＦ溶液は、コロイド金粒子およびＴＮＦタンパク質を２つの大型リザーバーから引き出す単一のぜん動ポンプによってＴ型コネクタ内に物理的に引き出した。適切な混合をさらに保証するために、インラインミキサー（Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、イリノイ州バーノンヒルズ）をＴ型コネクタのすぐ下流に配置した。ミキサーはコロイド金粒子をＴＮＦと激しく混合し、これらは両方とも、約１Ｌ／分の流速でコネクタを通って流動した。
【０１４９】
混合の前に、１ＮのＮａＯＨを用いて金ゾルのｐＨをｐＨ８に調整し、組換えヒトＴＮＦを３ｍＭのＴｒｉｓ中で再構成および調製した。滅菌した閉鎖管系を用いて溶液をそのそれぞれの滅菌リザーバーに添加した。等量のコロイド金ゾルおよびＴＮＦ溶液を適切なリザーバーに添加した。金およびＴＮＦ溶液は等量で混合したので、各試験ベクターの開始ＴＮＦ濃度は、最終濃度の２倍であった。例えば、４Ｌの０．５μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦ溶液を作るために、２Ｌのコロイド金を金リザーバーに入れ、２Ｌの１μｇ／ｍｌＴＮＦ溶液をＴＮＦ容器に添加した。
【０１５０】
溶液をそのリザーバーに適切に装填したら、ぜん動ポンプを作動させ、ＴＮＦおよびコロイド金溶液をＴ型コネクタ内に引き出し、インラインミキサーを通り、ぜん動ポンプを通って、大型捕集フラスコ内に入れた。得られた混合物を捕集フラスコ内で１５分間攪拌した。この結合工程の後、配合物のそれぞれから１ｍｌのサンプルを採取し、塩の沈殿について試験した。１．０μｇ／ｍｌおよび４．０μｇ／ｍｌの調製物を以下に記載されるように処理し、第３の溶液、第２の０．５μｇ／ｍｌ調製物は、ｍＰＥＧ−チオール５０００（ｄｉＨ２Ｏ中の１５０□ｇ／ｍｌストックの１０％ｖ／ｖ添加）を１５□ｇ／ｍｌの最終濃度で添加することによって処理した。この第３の溶液、ＰＥＧ−チオール−コロイド金−ＴＮＦ（ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ）溶液をさらに１５分間インキュベートした。２つのその他のＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ配合物は、ＰＥＧ−チオールの２００００および３００００ＭＷ形態を用いて作った。これらの研究の間、ＰＥＧ−チオール／裸コロイド金または４□ｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターを含む比較のために付加的な対照を試験した。
【０１５１】
５００００ＭＷＣＯ ＢＩＯＭＡＸダイアフィルトレーションカートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、イリノイ州シカゴ）によるダイアフィルトレーションによって、各調製物中のコロイド金結合ＴＮＦを遊離ＴＮＦから分離した。透過液（すなわち、遊離ＴＮＦ）のアリコートを除去し、ＴＮＦ決定のために取り置いた。質量バランスの決定のために、透過液の総体積を測定した。ＴＮＦ結合コロイド金を含有する残余分を０．２２ミクロンのフィルタにより滅菌ろ過し、ＴＮＦ分析のために１０□ｌのアリコートを採取した。残余分の残りを保存のために−８０℃で凍結した。ＴＮＦ濃度の決定に続いて、天然型ＴＮＦの溶液を３ｍＭのＴｒｉｓ中で製造し、インビボ研究のための対照として使用した。
【０１５２】
実施例８
コロイド金ＴＮＦベクターの初期配合物
このシリーズの実験は、コロイド金ＴＮＦベクターのインビボ生物活性に対する種々のＴＮＦ：コロイド金の結合比の効果を決定するために設計した。ＴＮＦ結合対コロイド金飽和曲線から得られたデータに基づいて、コロイド金ＴＮＦベクターの３つの異なる配合物を製造した。１、２または４μｇのＴＮＦ／ｍｌのコロイド金溶液でＴＮＦを結合させることによって３つのベクターを生成させた。これらの３つのベクターは、塩の添加後にコロイドであり続ける能力が異なった。塩溶液を添加すると、１μｇ／ｍｌのベクターは即座に沈殿した（すなわち、コロイドの色が鮮紅色から黒色に変化した）。対照的に、２μｇ／ｍｌベクターの色は赤から紫色に変化し、コロイド金粒子の凝集が示された。最後に、４μｇ／ｍｌ調製物は塩の添加後も赤色のままであり、粒子がコロイドのままであり、相互作用しないことが示された。１および２μｇ／ｍｌベクター中の粒子のコロイド性質は、その塩への曝露によって変化されたが、正常なヒト血漿とインキュベートしたときにこれらは安定なままであった。これらのデータによって、血漿因子（可能性が最も高いのは、血液由来のタンパク質）は粒子に結合し、これを沈殿に対して即座に安定化することが示唆された。従って、これらのベクターを血液にさらすと、その沈殿が防止され、そのインビボでの調査が可能になる。
【０１５３】
３つのｃＡｕ−ＴＮＦベクターおよび天然型ＴＮＦの比較安全性の研究は、ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいて行った。天然型ＴＮＦの毒性プロファイルは用量依存性であった。５μｇの天然型ＴＮＦ／マウスは、注射の１〜２時間以内に、立毛および下痢を引き起こした。天然型ＴＮＦの用量を増大させると、より深刻な毒性が観測された。１５マイクログラムのＴＮＦ／マウスの用量では、動物の５０％が低体温および無応答になり、そして最終的には、２４時間以内に死亡した。以下の毒性評点スケール：０＝正常な活動、１＝立毛、２＝軟便、３＝嗜眠、４＝無応答、および５＝死亡を用いて、注射後の異なる時点でマウスをスコア化した。
【０１５４】
インビトロ生物検定法ではこれらの３つのｃＡｕ−ＴＮＦベクターは天然型ＴＮＦ調製物と生物学的に類似しているが、Ｃ５７／ＢＬ６−ＭＣ−３８腫瘍モデルにおいて、その毒性プロファイルは全く異なっていた。ＴＮＦの初期結合濃度を１．０から４．０μｇ／ｍｌに増大させると、ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの相対安全性が増大された（図３Ａ）。１５μｇの天然型ＴＮＦを注射したマウスは、５０％の死亡率を有した。１．０μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターの１５μｇの注射も、５０％の死亡率を生じた。対照的に、２．０μｇ／ｍｌで結合した１５μｇのｃＡｕ−ＴＮＦを受けたマウスは、２５％の低下した死亡率を有した。最後に、１５μｇの４．０μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦ調製物を注射したマウスはいずれも死亡しなかった。この最後の動物群は一時的な毒性だけを示し、これは、処置の８時間以内に消失した。
【０１５５】
図３Ａは、ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの安全性に対するＴＮＦ：金結合比の効果を示す。コロイド金粒子の相対的なＴＮＦ飽和度に基づいて、３つの異なるコロイド金ＴＮＦベクターを生成した。ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝４／群）に、１５μｇの天然型ＴＮＦ（金ベクターに結合していない）、または３つのｃＡｕ−ＴＮＦベクターのいずれかを静脈注射した。記載した毒性評点スケールを用いて、注射後の種々の時点でマウスをスコア化した。処置に対する生存パーセントは、天然型ＴＮＦ＝５０％、１μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター＝２５％、２□ｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター＝７５％および４□ｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター＝１００％であった。
【０１５６】
４．０μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターを用いる第２の用量上昇および安全性研究は、天然型ＴＮＦと比較したときに用量対用量ベースでこの組成物がより安全であることを示した（図３Ｂ）。マウス１匹あたり１２マイクログラムまたは２４マイクログラムのこのｃＡｕ−ＴＮＦベクターによる処置は、顕著な腫瘍の減少を生じた（図３Ｃ）。実際に、このｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、任意の所与の用量のＴＮＦの相対安全性を増大し、最大許容用量は処置効力を改善した。これらの安全性および効力データは、その安全性を改善しながら薬物の効力が保持されるので、このｃＡｕ−ＴＮＦベクターがＴＮＦの治療指数を有効に増大させることを示唆した。
【０１５７】
図３Ｂは、ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける天然型ＴＮＦおよび４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦ用量上昇および毒性を示す。ＭＣ−３８腫瘍化Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝４／群／用量）に、増大する用量の天然型ＴＮＦまたは４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターを静脈注射した。記載した毒性評点スケールを用いてマウスをスコア化した。６、１２、および２４μｇ／マウスにおける天然型ＴＮＦ処置を生き延びた動物のパーセントは、それぞれ１００％、７５％および０％であった。ｃＡｕ−ＴＮＦ処置を受けた動物は全て生き残った。＊ｐ≦０．０５。
【０１５８】
図３Ｃは、ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける天然型ＴＮＦおよび４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター抗腫瘍効力の比較を示す。図３Ｂに記載される種々の処置群の抗腫瘍応答は、処置の１０日後に３つの寸法（ＬｘＷｘＨ）の腫瘍測定値を決定することによって測定した。データは、種々の群について腫瘍体積の平均±ＳＥＭ（ｃｍ３）で示される。２４μｇの天然型ＴＮＦ処置を受けた動物は全て、処置の２４時間以内に死亡した。＊ｐ≦０．０５（未処置対照に対して）。
【０１５９】
これらのデータはｃＡｕ−ＴＮＦベクターのための好ましい組成を強く示唆し、次にこれを、その体内分布について試験した。時間が経つと、天然型ＴＮＦで処置した動物と、ｃＡｕ−ＴＮＦで処置した動物との間のＴＮＦの体内分布は異なった。注射の１時間後、天然型ＴＮＦを受けたマウスは、ｃＡｕ−ＴＮＦ処置マウスと比較して、腎臓中により高レベルのＴＮＦを有した（図３Ｄ）。対照的に、注射の８時間後には、コロイド金配合物を受けたマウスは、腫瘍中により高レベルのＴＮＦを有した（図３Ｅ）。従って、ｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、ＴＮＦの腫瘍への送達を標的化することによって安全性を改善し、効力を保持しているようであった。
【０１６０】
図３Ｄおよび３Ｅは、１５μｇの天然型ＴＮＦまたは４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターが静脈注射されたＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおけるＴＮＦ分布プロファイルの比較を示す。ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝４／群／処置／時点）に、１５μｇの天然型ＴＮＦまたは４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターを静脈注射した。注射の１時間（図３Ｄ）または８時間（図３Ｅ）後に動物群を屠殺し、器官を採取した。器官を−８０℃で急速凍結し、分析するまで保存した。１ｍｌのＰＢＳ（１ｍｇ／ｍｌのバシトラシンおよびＰＭＳＦを含有する）を添加することにより器官を急速解凍し、ポリトロン組織破壊機を用いてホモジナイズした。ホモジネートを５０００ｒｐｍｓで遠心分離し、上記のように、得られた上澄みをＴＮＦ濃度および総タンパク質について分析した。データは、１時点あたり４つの器官の平均±ＳＥＭで示される。
【０１６１】
動物の剖検は、このｃＡｕ−ＴＮＦベクターに関する潜在的な問題を明らかにした。ｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置マウスの肝臓および脾臓の劇的な黒色は、改善された安全性の一部が、これらの器官におけるベクターの取り込みおよびクリアランスによるものであり得ることの証拠となった。更なる研究によって、この取り込みが急速で、多くの場合、静脈注射の５分以内に生じることが明らかになった。これらの器官の目視検査は、これらの器官の黒色が、裸コロイド金粒子が塩にさらされたときに形成される黒色沈殿物と同じであることを示唆した。また、器官を採取する前に動物をヘパリン処置し、広範に潅流したので、これらの器官の黒色がこれらの器官内に捕捉された血液によるものであるとは考えにくい。これらのデータにより、ベクターの大部分がＲＥＳの成分によって迅速に除去され、ｃＡｕ−ＴＮＦベクターが最適化されないという結果を導くことが示唆された。
【０１６２】
この仮説を支持するさらなる証拠は、天然型ＴＮＦと２つのｃＡｕ−ＴＮＦベクターとの間のＴＮＦレベルを比較する薬物動態学的な研究から得られた。予測に反して、４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターの投与は、天然型ＴＮＦよりも低い初期血清レベルを生じた（図３Ｆ）。ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを与えたマウスのＴＮＦレベルは、天然型ＴＮＦを受けた動物において測定されたよりも一貫して２〜５倍低かった。ＰＫにおけるこの相違は、０．５μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターを用いるとより顕著であり、ＴＮＦの血清レベルは、天然型調製物で見られるよりもほぼ１０倍低かった。ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを受けたマウスは、配合（すなわち、０．５または４．０μｇ／ｍｌ）に関係なく、天然型タンパク質を受けたマウスよりも低いＴＮＦの血液レベルを一貫して示した。まとめると、ベクターの体内分布およびＰＫデータは、このベクターが腫瘍を効果的に標的化するためには、ＲＥＳによる取り込みが著しく低減または除去されることが必要であることの証拠となった。
【０１６３】
図３Ｆは、ＭＣ３８−腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける天然型ＴＮＦまたは４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターの薬物動態学的プロファイルの比較を示す。ＭＣ−３８腫瘍負荷マウス（ｎ＝３／群／時点）に、１０μｇの天然型ＴＮＦまたは４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターのいずれかを静脈注射した。示された時点で、マウスに麻酔をして、眼窩後方の洞から採血した。血液サンプルを凝固させ、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。ＴＮＦのための市販のＥＩＡを用いて、得られた血清サンプルをＴＮＦ濃度について分析した。データは、１時点あたり３匹のマウスからの平均±ＳＥＭ血清濃度で示される。＊ｐ＜０．０５。
【０１６４】
実施例９
ＲＥＳによるクリアランスを回避し、固形腫瘍へのＴＮＦの送達を標的化するためのベクター
ＲＥＳによる外来の対象物の認識およびクリアランスは、他の薬剤キャリアと共に見られている。リポソームおよび生分解性ポリマーについて、この問題は、様々なＰＥＧ安定剤、ならびにポラキサマーおよびポラキサミンなどのブロックコポリマーを用いた表面改変よって対処された。リポソ−ム配合物中で使用されたもの（例えば、カーボワックス２０Ｍ、テトロニック４０７、プルロニック９０８）を含む複数の安定剤を４．０μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターに添加した。試薬はどれもＲＥＳによるベクターの取り込みを有効に妨害した。
【０１６５】
次に、１粒子あたりのＴＮＦ結合の量を減少させた。飽和用量未満（すなわち、０．５μｇ／ｍｌ）でＴＮＦをまずコロイド金粒子に結合させた。次に、チオール誘導体化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−チオール、ＭＷ＝５０００）を粒子に添加した。チオール基は、おそらくＴＮＦの分子間で粒子の表面に直接結合し得るので、この小さい線状のＰＥＧ−チオール試薬を選択した。ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいてこの新しいベクターを試験した。
【０１６６】
コロイド金結合ＴＮＦベクターのこの組成物は、ＴＮＦおよびさらなる薬剤を同じコロイド金粒子結合させることによって配合した。このベクターは、０．５μｇ／ｍｌの飽和用量未満でＴＮＦをまずコロイド金に結合させることによって形成した。次に、誘導体化ＰＥＧをベクターに添加した。誘導体化ＰＥＧは、チオール誘導体化ポリエチレングリコール（メトキシＰＥＧ−チオール、ＭＷ：５０００ダルトン、ＰＥＧ−チオール、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．、アラバマ州ハンツビル）であった。ＰＥＧ−チオールの最終濃度は１５μｇ／ｍｌであり、これをｄｉＨ２Ｏ中に１０ｘ濃度で添加した。チオール基はコロイド金粒子の表面に直接結合するので、チオール誘導体化ＰＥＧは、コロイド金ベクターのための良好な成分である。５０００ダルトンのチオール−ＰＥＧは、試験される第１のチオール誘導体化ＰＥＧであった。さらに、２００００および３００００ダルトンのＭＷを有するｍＰＥＧ−チオールを用いた効力実験を以下に記載されるように実行した。
【０１６７】
ＰＥＧ−チオール改変ｃＡｕ−ＴＮＦ（ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ）ベクターの投与後に見られる体内分布プロファイルは、これまでのｃＡｕ−ＴＮＦベクターで観察されるものとは異なっていた。この新しいベクターを用いると、肝臓および脾臓は、０．５および４．０μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター（図４Ｂ）で生じるように、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクター（図４Ａ）を視覚的に取り込まなかった。図４Ｃは未処置の肝臓および脾臓を示す。ベクターの投与の３０〜６０分以内に明るい赤／紫色のコロイド金粒子を得るので、ＭＣ−３８腫瘍におけるＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの明らかな蓄積は、ＲＥＳ取り込みの阻害と同様に顕著であった。研究の時間経過を通して隔離が継続し、腫瘍中のＴＮＦの蓄積およびＴＮＦの延長された血液残留時間と同時に起こった。
【０１６８】
０．５μｇ／ｍｌおよび４．０μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置後の肝臓および脾臓に蓄積した金の黒色とは異なり、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦの投与後に腫瘍に蓄積して観察される金の色は赤紫であった。循環における滞留の間、および腫瘍における蓄積の間、金粒子がコロイド状態のままであったことを示すのでこの相違は顕著である。興味深いことに、腫瘍部位の中および周囲におけるＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦの蓄積パターンは時間と共に変化した。ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦは、最初（すなわち、０〜２時間）は腫瘍中に単独で隔離された。時間が経つと、ベクターの染色はマウスの皮膚および腹側組織周囲において明らかであった。屠殺された動物の腫瘍の鈍的な切開（ｂｌｕｎｔ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）の間、これらの動物における腫瘍の外側の染色は、腫瘍細胞が初めに移植された皮膚層に制限されることが観察された。腫瘍が残された下側の筋肉には最小限の染色が存在していた。この観察は、抹消の染色が、腫瘍塊に血液を供給する血管、おそらく新しい血管におけるベクターの蓄積に起因し得ることを示唆した。現在、染色がこれらの血管における薬物の能動的な隔離を表すか、あるいはベクターでの腫瘍の飽和による受動的な蓄積を表すかは分かっていない。
【０１６９】
ＴＮＦによって生じる出血性応答を染色が反映するかどうかを決定するために、４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターまたは天然型ＴＮＦの１５マイクログラムの注射を受けたマウスの染色パターンを、同じ用量のＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを受けたマウスと比較した。４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置したマウスは、通常はＴＮＦの静脈内投与に続く腫瘍瘢痕の形成を示し始めた。同様の瘢痕パターンが天然型ＴＮＦ処置後に観察された。天然型ＴＮＦまたは４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置で観察される瘢痕染色のパターンは、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置後に観察される染色のパターンとは明らかに違っていた。ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの投与後に観察される染色パターンのさらなる証拠は、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に初めに結合されたＰＥＧ−チオールコロイド金粒子を受けたマウスから得られた。ＰＴ−ｃＡｕ−ＭＳＡベクターは、はるかに遅い速度ではあるが、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの染色と同様の腫瘍の染色を生じた。腫瘍の染色は、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ処置で観察された色と同様であった。しかしながら、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで観察される３０〜６０分の色の変化と比較して、腫瘍着色の変化は、処置の４時間後にしか明らかにならなかった。さらに、染色の強度は、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで観察された強度よりも低かった。
【０１７０】
図４は、ＰＥＧ−チオールベクターによるコロイド金ＴＮＦベクターのＲＥＳ媒介の取り込みの阻害を示す。ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、記載されたようなＴＮＦとＰＥＧ−チオールとの特定の比を用いて開発した。結合後、透析によってベクターを濃縮し、ＥＩＡによってＴＮＦ濃度について分析した。ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、１５マイクログラムのＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを静脈注射した。マウスを注射の５時間後に屠殺し、ヘパリン処置した生理食塩水で潅流した。肝臓（図の左側）および脾臓を写真撮影した。
【０１７１】
実施例１０
薬物動態学的なおよび分布分析
一般に、これらの実験は、上記のように生成した天然型ＴＮＦ、ｃＡｕ−ＴＮＦ（４□ｇ／ｍｌ）、またはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ、（０．５□ｇ／ｍｌ）ベクターを含む。研究に依存して、５〜２０マイクログラムの天然型またはｃＡｕ−ＴＮＦベクターの１つを、ＭＣ−３８腫瘍負荷マウスの尻尾静脈から静脈注射した。注射の５分、１８０分、および３６０分後に眼窩後方の洞からマウスを出血させて血液を凝血させ、得られた血清を採取し、そしてＥＩＡ（ＣｙｔＩｍｍｕｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）によるバッチＴＮＦ分析のために−２０℃で凍結させた。選択された時点で、種々の器官を採取し、急速凍結した。ＴＮＦ含有量を決定するために、器官を解凍し、ホモジナイズし、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上述のようにＴＮＦ濃度について、ならびに２８０ｎｍでのサンプルの吸光度を決定することによって総タンパク質について、上澄みを分析した。器官のＴＮＦ濃度を、総タンパク質について標準化した。
【０１７２】
Ａ．金分布
１５マイクログラムのＰＥＧ−チオール安定化０．５□ｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターの静脈注射後に、肝臓、肺、脾臓、脳および血液を含む種々の器官を、金元素の存在について試験した。マウスを注射６時間で屠殺し、血液を採取し、肝臓、脾臓および腫瘍を含む種々の器官を回収した。除去後、器官を王水（１部の濃硝酸に対して３部の濃ＨＣｌ）中で消化して、これらの器官中に存在する金を抽出した。２４時間にわたって抽出を実行し、その後、サンプルを３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。誘導結合プラズマ分光法によって器官全体の金濃度の存在について上澄みを分析した。結果は、器官全体の金濃度（ｐｐｍ）として図５Ａに報告される。この結果は、金の腫瘍内濃度が、肝臓で測定されるよりもほぼ２倍高く、脾臓で見られるよりもほぼ７倍高かったことを実証する。このパターンは、ベクターが他の器官と比較して腫瘍中に保持されたことを示唆するが、最も高いレベルの金がこれらの動物の循環中にまだ存在していることが観察された。
【０１７３】
図５Ａには、ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスの種々の器官における金分布が示される。誘導結合プラズマ分光法によって器官全体の金濃度の存在について上澄みを分析した。結果は、１器官あたり３匹のマウスについての器官全体の金濃度（ｐｐｍ）として報告される。＊ｐ＜０．０５（肝臓および脾臓に対して）、†ｐ＜０．０５（脾臓に対して）。
【０１７４】
Ｂ．ＴＮＦの分布および薬物動態学
腫瘍塊内のコロイド金の隔離は、循環中の薬物ベクターの長期の存在、ならびに腫瘍中のＴＮＦの能動的な蓄積によって平行された。誘導体化ＰＥＧを伴わないｃＡｕ−ＴＮＦベクターとは違って、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの注射は、研究の時間経過を通して循環中に高いレベルのＴＮＦをもたらした。天然型ＴＮＦによる注射の６時間後、ＴＮＦレベルは、５分で見られるレベルのわずか２％しかなかった（図５Ｂ）。対照的に、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを受けたマウスは、その最大の５分での値の約３０％であるＴＮＦ血液レベルを有した。この６時間の時点で、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ配合物で処置したマウス中の血液ＴＮＦレベルは、天然型ＴＮＦで処置したマウス中のレベルよりも２３倍高かった。
【０１７５】
図５Ｂは、ＴＮＦ薬物動態学的分析を示す。マウスは、注射の５分、１８０分および３６０分後に眼窩後方の洞から出血させた。血液サンプルを１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、ＥＩＡを用いて、得られた血清をＴＮＦ濃度について分析した。データは、１時点あたり３匹のマウスからの平均±ＳＥＭ血清ＴＮＦ濃度で示される（＊ｐ＜０．０５）。
【０１７６】
ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置した動物において、ＴＮＦは、腫瘍中に蓄積した。図５Ｃに示されるように、天然型ＴＮＦで処置したマウスにおいて観察されるＴＮＦの最大の腫瘍内濃度は、０．８ｎｇのＴＮＦ／ｍｇタンパク質であった。ピークの量は天然型ＴＮＦ投与の５分以内に見られ、６時間にわたって増大しなかった。対照的に、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置した動物は、時間とともに増大するＴＮＦの腫瘍内レベルを有していた。ＴＮＦは、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置した動物の腫瘍中に能動的に隔離された。この期間の最後までに、天然型ＴＮＦまたは４□ｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置したものと比較して、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置した動物の腫瘍中にほぼ１０倍多いＴＮＦが見られた（図５Ｄ）。
【０１７７】
図５Ｃには、腫瘍内ＴＮＦ分布が時間と共に示される。１５マイクログラムの天然型ＴＮＦまたはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの注射の５分、１８０分および３６０分後にマウスを屠殺した。腫瘍を取り出し、ＴＮＦおよび総タンパク質について分析した。データは、３匹のマウス／時点／処置群から、ｎｇＴＮＦ／ｍｇ総タンパク質で表される腫瘍ＴＮＦ濃度の平均±ＳＥＭで示される（Δｐ＜０．１、＊ｐ＜０．０５）。
【０１７８】
図５Ｄは、１５マイクログラムの４□ｇ／ｍｌｃＡｕ−ＴＮＦベクターまたはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターのいずれかを静脈注射した動物からの腫瘍内ＴＮＦ濃度の比較を示す。
【０１７９】
ＴＮＦは同じ期間にわたって肺、肝臓、および脳などの他の器官に蓄積しなかったので、ＭＣ−３８腫瘍塊におけるＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの蓄積は受動的な事象ではなく、あるいは単に循環中のベクターの延長された滞留時間の関数でもなかった。むしろ、これらの器官中のＴＮＦの存在は、血液において見られるものとパターンが類似していた。さらに、これらの標的化されていない器官における薬物の分布は、天然型ＴＮＦで見られるものと類似していた。結果として、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの投与から生じるＴＮＦの蓄積は、腫瘍に特異的である（図５Ｅおよび図５Ｆ）。
【０１８０】
図５ＥおよびＦは、天然型ＴＮＦ（図５Ｅ）またはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ（図５Ｆ）のいずれかを受けたＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスからの種々の器官におけるＴＮＦの分布を示す。この実施例で処置された動物からの肝臓、肺および脳を処置して、ＴＮＦおよびタンパク質濃度について分析した。データは、３匹のマウス／時点／注射した配合物から、器官内ＴＮＦ濃度の平均±ＳＥＭで示される。
【０１８１】
実施例１１
用量の上昇、毒性、および効力
天然型およびコロイド金結合ＴＮＦ調製物の安全性および効力を比較するためのモデルとして、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに結腸癌細胞株ＭＣ−３８を移植した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスの腹側表面の一部位に、１０５個のＭＣ−３８腫瘍細胞を移植した。三次元（ＬｘＷｘＨ）で腫瘍を測定して決定される場合に０．５ｃｍ３と測定される腫瘍が形成されるまで、細胞を増殖させた。ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝４〜９／群）に、増大する用量の天然型ＴＮＦ、ｃＡｕ−ＴＮＦベクター、またはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを静脈注射した。１群あたり４〜９匹で、マウスを９つの群に分けた。１つの群は未処置対照群としての役割を果たした。２つの群には７．５または１５マイクログラムのいずれかの天然型ＴＮＦを静脈注射した（図６Ａ）。２つ群に、７．５または１５マイクログラムのいずれかの２０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを静脈注射した（図６Ｂ）。２つの群には、７．５または１５マイクログラムのいずれかの３０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを静脈注射した（図６Ｃ）。腫瘍測定は、ＴＮＦ処置を生き延びた動物において処置後の種々の日数で行った。対応のあるｔ検定を用いて、種々の群の間の統計的差異を決定した。
【０１８２】
以下の毒性評点スケール：０＝正常な活動、１＝立毛、２＝軟便、３＝嗜眠、４＝無応答、および５＝死亡を用いて、注射後の異なる時点でマウスをスコア化した。２回の連続した採点時に４を記録した動物を屠殺した。種々のＴＮＦ処置によって誘発される腫瘍体積の減少をモニターすることによって処置効力を決定した。測定値を、種々の群内の各動物、および生理食塩水注射を受けた動物（未処置対照）の初期腫瘍体積と比較した。比較した。未処置対照は、その腫瘍体積が４ｃｍ３になったときに屠殺した。
【０１８３】
ＭＣ−３８腫瘍負荷マウスにおける容量上昇研究において、分子量５０００ダルトンのＰＥＧ−チオールを含む５Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを安全性および効力について試験した。４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターと同様、５Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、天然型ＴＮＦと比較したときに改善された安全性プロファイルを有した。マウス１匹あたり１５マイクログラムの天然型ＴＮＦの用量では、処置の２４時間以内に３３％（９匹のうち３匹）の動物が死亡した。さらに、７．５マイクログラムの天然型ＴＮＦは９匹の動物のうち１匹の死亡を生じた。対照的に、５Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターに結合させた７．５または１５マイクログラムのＴＮＦを受けた動物はどれも死亡しなかった。これらのベクター処置動物は、一時的な有害な臨床的効果を示しただけであった。１回の処置後には、天然型ＴＮＦと比較して、５Ｋ ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの抗腫瘍効力の目に見えるほどの違いは観察されなかった（図６Ａ）。これらの知見は、２回の実験で再現された。
【０１８４】
図６Ａは、天然型ＴＮＦまたはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの安全性および効力を比較するグラフである。未処置の対照に対して、７．５マイクログラムの用量の天然型ＴＮＦまたはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ処置については†ｐ＜０．０５であった。未処置の対照および７．５マイクログラムの用量の天然型およびＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦに対して、１５マイクログラムの用量の天然型またはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ処置については＊ｐ＜０．０５であった。
【０１８５】
ベクターの抗腫瘍効力に対するＰＥＧ−チオール鎖長の効果は、図６Ｂ〜Ｃに示される。最大ＴＮＦ用量（１５マイクログラム）では、天然型ＴＮＦと比較していずれのＴＮＦベクターの間にも全く差異が示されなかった。しかしながら、より低用量の７．５マイクログラムのＴＮＦではパターンが生じた。上記のように、５Ｋ ＰＥＧ−チオールは、天然型ＴＮＦと比較して、コロイド金ベクターの抗腫瘍効果をあまり改善しなかった。ＰＥＧ鎖長を２０Ｋに増大させることによって、腫瘍減少においてわずかな非統計的な改善が生じ（図６Ｂ）、３０Ｋまで増大させると、腫瘍縮小において顕著で統計的に有意な改善が得られた（図６Ｃ）。３０Ｋ ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターでは、このベクターを介して７．５マイクログラムの用量のＴＮＦで処置した動物は、１５マイクログラムの天然型ＴＮＦで処置した動物と同様のサイズの残存腫瘍を有した。１５マイクログラムの天然型ＴＮＦで処置した動物とは対照的に、７．５マイクログラムのＴＮＦを投与した３０Ｋ ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ処置動物は、毒性を全く経験しなかった。実際、３０Ｋ ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの単回注射は、より少ないＴＮＦを提供したが、２倍多い天然型ＴＮＦで見られるものと同じ最大の抗腫瘍縮小を誘発し、処置された被験体は処置を生き延びた。この腫瘍モデルにおいて、５Ｋまたは２０Ｋ ＰＥＧ−チオール−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターのいずれかの単回の注射は天然型ＴＮＦよりも安全であり、３０Ｋ ＰＥＧ−チオール−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、天然型分子よりも安全かつ有効であった。
【０１８６】
図６Ｂは、天然型ＴＮＦおよび２０Ｋ−ＰＴ−ｃＡＵ−ＴＮＦの安全性および効力を比較するグラフである。未処置対照に対して、７．５マイクログラムの用量の天然型ＴＮＦまたはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置のそれぞれについては†，§ｐ＜０．０５であった。７．５マイクログラムの２０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、７．５マイクログラムの天然型群と統計的に異ならなかった。未処置対照および７．５マイクログラムの天然型および２０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターに対して、１５マイクログラムの用量の天然型またはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ処置については＊ｐ＜０．０５であった。
【０１８７】
図６Ｃは、天然型ＴＮＦおよび３０Ｋ−ＰＴ−ｃＡＵ−ＴＮＦ安全性および効力を比較するグラフである。未処置対照に対して、７．５マイクログラムの用量の天然型ＴＮＦについては†ｐ＜０．０５。未処置対照および天然型ＴＮＦ群に対して、７．５マイクログラムの用量の３０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置については§ｐ＜０．０５。未処置対照および７．５マイクログラムの用量の天然型ＴＮＦに対して、１５マイクログラムの用量の天然型またはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置については＊ｐ＜０．０５。７．５マイクログラムの３０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦは、１５マイクログラムの天然型または３０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦと統計的に異ならなかった。
【０１８８】
実施例１２
コロイド金組成物の経口投与
ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの腫瘍隔離に対する投与経路の効果を試験した。ベクター調製物はこれまでの実施例に記載されるとおりである。簡単には、コロイド金は、上記のインライン混合装置を用いて０．５マイクログラム／ｍｌの濃度でＴＮＦに結合される。１５分間のインキュベーションの後、３００００ダルトンのＰＥＧ−チオール（ｐＨ８の水に溶解）が、１２．５マイクログラム／ｍｌの最終濃度で混合物に添加される。溶液を攪拌し、ダイアフィルトレーションにより直ちに処理する。残余分を滅菌ろ過し、−４０℃で貯蔵するためにアリコートに分ける。
【０１８９】
経口投与されたＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターが腫瘍部位へのＴＮＦおよび金の送達を標的化する能力を決定するためのモデルとして、ＭＣ３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ／６マウスを使用した。これらの研究のために、１ｍｇのペントバルビトールを用いてマウス（ｎ＝３）を麻酔した。動物を完全に鎮静させた後、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターに結合した２６マイクログラムのＴＮＦを経口カニューレから投与した。動物を回復させ、食物および水に自由にアクセスさせた。翌日、腫瘍が、コロイド金ベクターのよく知られた色の赤／青であることが観察された。これらのデータは、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの経口投与が腫瘍の処置のために使用可能であることを示す。
【０１９０】
実施例１３
コロイド金結合ＴＮＦベクターのインビトロ活性
Ｋｈａｂａｒ，Ｋ．Ｓ．、Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，Ｓ．、およびＡｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ａ．、ＷＥＨＩ−１３ ＶＡＲ；ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ＷＥＨＩ １６４ ｃｌｏｎｅ １３ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｏａｓｓａｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ ４６：１０７−１１０（１９９５）により記載されるＷＥＨＩ−１６４ ＴＮＦ生物検定法によって、天然型ＴＮＦおよびｃＡｕ−ＴＮＦベクターのインビトロでの活性を決定した。この生物検定法において、１０４個のＷＥＨＩ−１６４細胞を１２ウェルの組織培養クラスター中に蒔いた。１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で細胞を培養した。天然型ＴＮＦ、ならびにコロイド金１ｍｌあたり０．５、１、２および４マイクログラムのＴＮＦで調製した４つの異なるｃＡＵ−ＴＮＦベクターを、１ｍｇ／ｍｌ〜０．０００１ｍｇ／ｍｌの範囲のＴＮＦ最終濃度で、細胞と共に７日間インキュベートした。Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて７日目に細胞数を決定した。データは、３回のウェル／ＴＮＦ配合物についての細胞数の平均±ＳＥＭで示される。
【０１９１】
ＷＥＨＩ １６４生物検定法において、ｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、天然型ＴＮＦとモルベースで生物学的に等価であった。例えば、１２．５ｎｇの天然型ＴＮＦはＷＥＨＩ １６４細胞の増殖を５０％阻害するが、同じ１２．５ｎｇ用量の１．０、２．０および４．０マイクログラム／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦ調製物は、ＷＥＨＩ １６４細胞の増殖をそれぞれ、４７％、５５％、および５２％阻害した。
【０１９２】
実施例１４
抗血管新生薬の腫瘍標的化送達のためのＰＥＧ−チオールベクター
これらの実験はＰＴ−ｃＡＵ−ＴＮＦ−エンドスタチンベクターを使用し、ベクターは、２つの薬剤を含む。ＴＮＦは、治療薬エンドスタチン（ＥＮＤ）の腫瘍への送達のための標的機能を提供すると考えられた。また、標的において一度に、両方の薬剤が治療効果を提供し得ることも理論化される。ベクター組成物の一態様は、標的分子、治療分子およびＰＥＧの比率である。３つの実体は全て、コロイド金の同じ粒子上に見られる。このベクターの概略図は図７に示される。図７において、１はＥＮＤ分子など薬剤であり、２はコロイド金粒子であり、３は誘導体化ＰＥＧであり、そして４は、ＴＮＦ分子などの異なる薬剤または標的分子である。
【０１９３】
図１に記載される装置を用いて、コロイド金粒子と会合した誘導体化ＰＥＧ、ＴＮＦおよびエンドスタチン（ＥＮＤ）を含むＰＴ−ｃＡｕ（ＴＮＦ）−ＥＮＤベクターを製造した。ＰＴ−ｃＡｕ（ＴＮＦ）−ＥＮＤは３段階で製造した。第一に、非常に低い飽和質量未満のＴＮＦにおいてＴＮＦを金粒子と会合させた。０．５マイクログラム／ｍｌのＴＮＦの濃度で製造したＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターとは異なり、このベクターは、０．０５マイクログラム／ｍｌのＴＮＦ濃度で製造した。ＴＮＦ（３ｍＭのＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ＝１０）中に希釈）を０．１マイクログラム／ｍｌの濃度で装置の試薬ビンに添加した。装置内の第２のビンに等容量のコロイド金をｐＨ１０で充填した。上記のように、ぜん動ポンプの作動によって、ＴＮＦをコロイド金粒子に結合させた。コロイド金−ＴＮＦ溶液を１５分間インキュベートし、続いて、装置の金容器内に戻した。次に、試薬ビンに等容量のエンドスタチン（ＣＡＰＳ緩衝液中に０．１５〜０．３マイクログラム／ｍｌの濃度で希釈）を充填した。代替的な実施形態では、エンドスタチンは、金粒子への結合に役立つように、ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタートなどの薬剤を用いて、硫黄基の付加によって化学修飾され得る。
【０１９４】
ぜん動ポンプを作動して、コロイド金結合ＴＮＦおよびエンドスタチン溶液をＴ型コネクタに引き出した。溶液の完全な相互作用において、混合物を捕集ビン内でさらに１５分間インキュベートした。この段階で塩が粒子を沈降させる能力によって、ＰＥＧ−チオールのさらなる結合部位の存在を確認した。１５分間のインキュベーションの後、５Ｋ ＰＥＧ−チオールをｃＡｕ（ＴＮＦ）−ＥＮＤベクターに添加し、上記のようにダイアフィルトレーションにより濃縮した。
【０１９５】
同じ金の粒子に２つのタンパク質を結合させるための代替方法は、図１と同じ装置を使用することと、薬剤を同時に金に添加することとを含む。ＴＮＦおよびＥＮＤを結合装置の試薬チャンバに入れた。各タンパク質の濃度は、０．２５マイクログラム／ｍｌであり、結果として、１ｍｌの溶液は、０．５マイクログラムの総タンパク質を含有した。２つの薬剤組成物を金粒子に結合させた後、このコロイド金調製物も塩の存在下で沈殿させ、さらなる遊離結合部位がＰＥＧ−チオールとの結合に利用可能であることを示した。１５分間のインキュベーションの後、５Ｋ ＰＥＧ−チオールをｃＡｕ（ＴＮＦ）ＥＮＤベクターに添加し、続いて、上記のように処理した。
【０１９６】
ダイアフィルトレーションの後、それぞれのＥＩＡにおけるＴＮＦおよびＥＮＤ濃度について残余分を測定した。コロイド金の同じ粒子上のＥＮＤおよびＴＮＦの存在を確認するために、交差抗体の捕捉および検出アッセイを設計および使用した。このＥＩＡの概略図は図８に示される。図８において、Ａは、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼなどの標識化された結合パートナーであり、Ｂは、ビオチンなどの結合パートナーであり、Ｃは、ビオチン化抗ＥＮＤ抗体などの検出抗体であり、Ｄは、ＥＮＤ分子などの薬剤であり、Ｆはコロイド金粒子であり、Ｅは誘導体化ＰＥＧであり、そしてＧは、ＴＮＦ分子などの異なる薬剤または標的分子であり、Ｈは、抗ＴＮＦ抗体などの捕捉抗体であり、そしてＬは、ビーズまたはマイクロタイタープレートなどの支持体である。
【０１９７】
ＴＮＦまたはＥＮＤ捕捉抗体のいずれかで被覆されたＥＩＡプレートに、ＰＴ−ｃＡｕ（ＴＮＦ）−ＥＮＤベクターのサンプルを添加した。サンプルを捕捉抗体と共に３時間インキュベートした。インキュベーションの後に、プレートを洗浄し、ブロット乾燥した。ＴＮＦ捕捉サンプル上に存在する任意のＥＮＤを結合するために、ビオチン化ウサギ抗エンドスタチンポリクローナル抗体をウェルに添加した。３０分間のインキュベートの後、プレートを洗浄し、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いてビオチン化抗体の存在を検出した。エンドスタチン検出システムによる陽性の色シグナルの発生は、検出抗体が、ＴＮＦモノクローナル抗体により予め捕捉されたキメラベクターに結合したことを示した。図９を参照されたい。捕捉および検出抗体を逆転させ、適切な第２の検出システムを用いることによって、アッセイを使用して、ＥＮＤ捕捉された粒子上のＴＮＦの存在を検出した。図９を参照されたい。図９は、第２の薬剤の存在を示すＴＮＦ−およびＥＮＤ−捕捉ベクターを示すグラフである。
【０１９８】
これらの研究からのデータは表ＶＩに示される。表ＶＩにおいて分かるように、ベクターサンプルの残余分は、１７□ｇ／ｍｌのＴＮＦおよび２２□ｇ／ｍｌのＥＮＤを有した。また、これらの同じサンプルは交差抗体アッセイにおいて陽性シグナルを発生し、ＴＮＦおよびエンドスタチンの両方がコロイド金の同じ粒子上にあることが示唆された。（図９）。
【０１９９】
【表６】
【０２００】
図１０において、データは、静脈注射後に切除されたＭＣ−３８腫瘍中のＰＴ−ｃＡｕ（ＴＮＦ）−ＥＮＤベクターからのエンドスタチンおよびＴＮＦの検出を示している。これらのデータは、両方の分子が腫瘍組織中で検出されているので、ＰＴ−ｃＡｕ（ＴＮＦ）−ＥＮＤベクターが分解せずに腫瘍に達したことを示す。
【０２０１】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の指示対象を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」を含有するベクター組成物に対する言及は、そのような薬剤のモル量を意味する。
【０２０２】
本明細書中に開示される特定の組み合わせ、方法、および材料はいくらか変化し得るので、本発明は、このような組み合わせ、方法、および材料に限定されないことは理解されるべきである。また、本明細書中で使用される用語は特定の実施形態を説明するだけの目的で使用され、限定することは意図されないことも理解されるべきである。
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００７年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／９７４３１０号、２００７年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／９８１９２０号、２００８年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／０６９１０８号、２００８年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／０６９９０５号、２００８年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／０４００２２号、２００８年４月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／１２３７９６号、２００８年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／１２４２９０号、および２００８年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／１２６８９９号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、全身的な薬剤の送達および特定の部位への薬剤の送達のための組成物および方法に関する。一般に、本発明は、コロイド金属組成物、ならびにこのような組成物の製造および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
必要な部位を追跡し、過度の副作用なしに治療反応を送達し得る特効薬を発見することは、治療的処置の長い間の目標となっている。この目標に到達するために多数のアプローチが試みられてきた。治療薬は、身体の細胞による差別的な処置のために、治療粒子の疎水性もしくは親水性または大きさなどの活性剤の相違点を利用するように設計されてきた。インサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）注射によって治療薬を身体の特定の部分または特定の細胞に送達し、治療薬の送達を制限する血液脳関門などの体の防御を使用するか、あるいは克服する治療が存在する。
【０００４】
治療薬を特定の組織または細胞へ特異的に導くために使用されている１つの方法は、治療薬と、特異的受容体の結合パートナーとの組み合わせに基づいた送達である。例えば、治療薬が細胞毒性または放射性であり、細胞受容体の結合パートナーと組み合わせられる場合、標的細胞と結合すると、細胞死を引き起こすか、あるいは細胞活性の遺伝子制御を妨害し得る。このタイプの送達デバイスは、処置すべき細胞型に特異的な受容体、受容体の有効な結合パートナー、および有効な治療薬を有することを必要とする。これらの問題のいくつかを克服するために分子遺伝学的操作が使用されている。
【０００５】
遺伝子配列の外来細胞への特異的な送達または内在性配列の過剰発現のための特異的な送達は、現在、非常に関心のある方法である。細胞内に遺伝子を挿入するために種々の技法が使用される。これらの技法には、沈殿、ウイルスベクター、マイクロピペットおよび遺伝子銃による直接挿入、ならびに細胞への核酸の暴露が含まれる。広く使用されている沈殿技法は、リン酸カルシウムを用いてＤＮＡを沈殿させ、不溶性粒子を形成する。目標は、全身性の細胞エンドサイトーシスによってこれらの粒子の少なくともいくつかが宿主細胞内に取り入れられることである。この結果、新しいまたは外来の遺伝子の発現が生じる。この技法は外来遺伝子の細胞内への侵入の効率が低く、その結果生じる遺伝子の発現の効率が低い。エンドサイトーシスのための特定の認識部位における信頼性は存在しないので、暴露された全ての細胞が外来遺伝子を取り入れることができるため、遺伝子の内部移行はどの細胞がトランスフェクトされるかに関して非特異的である。この技法はインビトロで広く使用されているが、標的細胞の選択の特異性の欠如および高度に分化した細胞による取り込み不良のために、インビボでのその使用は意図されない。さらに、インビボでのその使用は、沈殿した核酸が不溶性であることによって制限される。
【０００６】
同様の技法は、インビトロで細胞をトランスフェクトするためにＤＥＡＥ−デキストランの使用を含む。ＤＥＡＥ−デキストランは細胞にとって有害であり、やはり核酸の細胞内への非特異的な挿入をもたらす。この方法はインビボでは賢明でない。
【０００７】
細胞をトランスフェクトするため、または外来遺伝子の細胞への侵入を提供するためのその他の技法も制限されている。ベクターとしてのウイルスの使用は、インビトロおよびインビボでの外来遺伝子の細胞への導入のためにある程度の適用性を有する。ウイルスタンパク質の存在がインビボでの使用中に望ましくない効果を生じる危険は常に存在している。さらに、ウイルスベクターは、細胞内に輸送することができる外来遺伝子材料の大きさに関して制限され得る。ウイルスベクターの反復使用はレシピエントに免疫反応を起こし、ベクターを使用できる回数が制限される。
【０００８】
リポソーム封入核酸による外来遺伝子の送達も使用されている。リポソームは、核酸を含む様々な材料で充填され得る膜で囲まれた嚢である。リポソーム送達は、リポソームの充填が不均一であるために、細胞への均一な送達を提供しない。リポソームは、受容体の結合パートナーが含まれていれば特定の細胞型を標的にすることができるが、リポソームは破損の問題を抱えており、従って送達は特異的でない。
【０００９】
外来核酸を挿入するための強引な技法は、マイクロピペットまたは遺伝子銃により細胞膜を穿刺して、外来ＤＮＡを細胞内に挿入することを含む。これらの技法はいくつかの手順のためには上手く働くが、広範囲に適用可能ではない。これらは非常に労働集約的であり、非常に熟練したレシピエント細胞の操作を必要とする。これらは、インビボで上手く働く簡単な手順の技法ではない。電気的な方法を用いて細胞膜の透過性を変化させるエレクトロポレーションは、いくつかのインビトロ治療については細胞への遺伝子の挿入に成功している。
【００１０】
糖タンパク質の受容体の存在に頼った特定の細胞のためのＤＮＡの標的送達においていくつかの試みが成されてきた。送達系は、ＤＮＡに非共有結合されると共にリガンドに共有結合されたポリリジンなどのポリカチオンを使用した。ポリカチオンのリガンドへの共有結合のこのような使用は、細胞の内部移行メカニズムがいったん開始したら、送達系の解体を許さない。この大きい複合体の共有結合送達系は、核酸が細胞内で自然に見られる方法とはかなり異なる。
【００１１】
当業者に明白であるように、細網内皮系（ＲＥＳ、Ｐａｐｉｓｏｖ １９９８、Ｍｏｇｈｉｍｉ、１９９８およびＷｏｏｄｌｅ、１９９８）による食細胞クリアランス（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を免れることができる粒子送達系によって促進される固形腫瘍への癌治療を標的にすることが、長年にわたって切実に必要とされている。理想的な条件下では、このような送達系は腫瘍脈管構造を優先的に溢出させ、腫瘍微小環境内に蓄積し得る（Ｎａｆａｙａｓｕ １９９９、Ｍａｒｕｙａｍａ １９９９）。さらに、抗癌剤を腫瘍内だけに隔離することができる望ましい粒子送達系は、健康な器官内の薬物の蓄積も低減し得る（Ｐａｐｉｓｏｖ １９９８、Ｍｏｇｈｉｍｉ、１９９８およびＷｏｏｄｌｅ、１９９８、Ｎａｆａｙａｓｕ １９９９、Ｍａｒｕｙａｍａ １９９９）。その結果として、これらの送達系は癌治療の相対的効力または安全性を増大し、従って、薬物の治療指数を増大する働きをし得る。
【００１２】
粒子に基づく薬物送達の分野は、現在、２つの化学的に異なるコロイド粒子のリポソームおよび生分解性ポリマーに焦点が合わせられている（Ｍｕｅｌｌｅｒ ２０００、Ｊａｉｎ、１９９８、Ｒａｆｆｅｒｔｙ、１９９６、Ｏｇａｗａ １９９７、およびＭａｒｕｙａｍａ、１９９８）。いずれの送達系も活性薬物を被包する。薬物は、リポソームの場合には溶解するとき、あるいは生分解性ポリマーについては記載されるように崩壊するときに、粒子から放出される。
【００１３】
コロイド金ナノ粒子は、粒子に基づく腫瘍標的化薬物送達の分野における完全に新規の技術を表す。これらの粒子の合成は、最初に、１８５７年に塩化金およびクエン酸ナトリウムからＡｕ０のナノサイズの粒子を製造するための化学的方法を説明したＭｉｃｈａｅｌ Ｆａｒａｄａｙによって報告された（Ｆａｒａｄａｙ、１８５７）。１９５０年代、これらの粒子がタンパク質生物製剤をその活性を変更することなく結合し得るという発見によって、ハンドヘルド型免疫診断および病理組織診断におけるその使用のための道が切り開かれた（Ｃｈａｎｄｌｅｒ、２００１）。特に関連があるのは、肝臓癌および肉腫を処置するための、Ａｕ１９８から製造される放射性コロイド金ナノ粒子の使用である（Ｒｕｂｉｎ １９６４、Ｒｏｏｔ １９５４）。これらのナノ粒子の静脈内投与は、放射線暴露による薬物関連の毒性を生じる。しかしながら、粒子自体から実証可能な毒性は認められなかった。最近になって、金ナノ粒子は、ＤＮＡ診断およびバイオセンサーにおける使用のためのスキャフォールドに構築された（Ｍｉｒｋｉｎ １９９６）。
【００１４】
バイオナノテクノロジー（またはナノバイオテクノロジー）の新たな分野は、非常に敏感な診断および器官／腫瘍標的化治療の開発の可能性を提供する。例えば、診断の微細化は、正常および疾患の両方の状態における血液化学、ホルモンおよび成長因子のより完全なスナップショットを臨床医に提供できるだけでなく、彼らが推定上の治療法の効力を追跡できるようにもする［Ｋｏｅｈｎｅら、２００４］。その診断の進歩を補足すると、バイオナノテクノロジーは、主な例として、現在の癌治療の利益／リスク比の尺度である治療指数を増大させる見込みも有する［Ｐａｐｉｓｏｖら、１９９８、Ｍｏｇｈｉｍｉら、１９９８、Ｗｏｏｄｌｅ、１９９８、Ｎａｆａｙａｓｕら、１９９９、Ｍａｒｕｙａｍａら、１９９９］。実際に、材料化学および腫瘍生物学の混合は、固形腫瘍においてそれが必要とされているところでだけ活性剤を得るという腫瘍標的化薬物送達の念願の目標を達成する可能性を有する革新的なベクターの開発を導いている。それにもかかわらず、この目標を上手く達成するために、ナノ粒子送達系は、体内に自然に存在する生物学的バリア、ならびに腫瘍の成長および進行中に発生する生物学的バリアを克服しなければならない。このような自然のバリアには、細網内皮系によるクリアランス（大きさまたはオプソニン化による）、間質（腫瘍）液圧の増大を導く腫瘍血管新生、リガンド／受容体に基づくナノ治療ターゲティング、形成中に確立される腫瘍間質内のバリア：腫瘍内バリア、および固形腫瘍の細胞の不均一性が含まれるが、これらに限定されない。
【００１５】
上記の自然のバリアの問題への対処においていくらかの進歩が遂げられているが、まだ多数の課題が残っている。例えば、腫瘍標的薬物送達ベクターは、これらが血液中でオプソニン化され、細網内皮系（ＲＥＳ、すなわち、より大きい粒子はより小さい粒子よりも良く補体を活性化する）によって取り込まれる可能性を減少させるだけでなく、脾臓の赤色髄に存在する内皮間スリットの狭い領域におけるそのクリアランスも防止し得る「真の」または最適なナノメートルサイズにまだアプローチしていない。ＲＥＳの回避をさらに改善するために、現在入手可能なナノ粒子系の表面に親水性ポリマーがグラフトされ得ると考えられる。これらのナノ粒子ベクターが体全体を自由に循環すると、腫瘍新生脈管構造の固有の漏出性およびこれらのナノ粒子ベクターの表面における腫瘍特異性リガンドの存在のために、これらは受動的および能動的に固形腫瘍の中および周囲に隔離され得ると考えられる。しかしながら、このようなナノ粒子はまだ実用化できるほど有効に小さくなっていない。
【００１６】
また当業者は有効なナノ治療法の構築における最後の要素の必要性も理解しており、これは、固形腫瘍を含む癌細胞の不均一な集団に複合治療薬を有効に送達するベクターを開発する能力にある。その最も簡単なモデルでは、固形腫瘍は、腫瘍成長を促進するために一致した役割を果たす複数の細胞型を含有する器官とみなすことができる［ＳｐｒｅｍｕｌｌｉおよびＤｅｘｔｅｒ、１９８３、Ｄｅｘｔｅｒら、１９７８］。従って、治療的介入のために単一の細胞型を標的とする薬物は、不十分な抗腫瘍効果しか提供することができない。さらに、多くの場合、固形腫瘍細胞は、疾患の進行中に、そして／あるいは治療に応答して、連続した表現型を表す。その結果として、ナノ粒子送達系が固形腫瘍内にこれらを隔離する能力にかかわらず、単剤治療が悪性腫瘍内に存在する無数の細胞に対して有効であると立証されることはないと思われる。従って、この制限を克服するために、必要とされるのは、これらの固形腫瘍への道を見出さなければならないだけでなく、腫瘍成長を促進する多様な細胞集団を有効に破壊しなければならない次世代のナノ治療法である。
【００１７】
疾患または病態の処置のため、またはこのような部位の検出のために、特定の治療薬を身体内の特定の部位に送達するための簡単で効率的な送達系は現在得られていない。例えば、現在の癌の処置は、生物体全体に影響を与える、化学療法剤および他の生物活性因子（サイトカインなど）、ならびに免疫性因子の投与を含む。副作用には、器官の障害、味覚および感触などの感覚の喪失、ならびに脱毛が含まれる。このような治療は状態の処置を提供するが、副作用を処置するために多くの補助的な治療も必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
必要とされるのは、所望の細胞または部位に作用する薬剤の送達系のための組成物および方法である。これらの送達系は、検出剤および治療薬を含む全てのタイプの薬剤を特定の細胞へ送達するために使用され得る。同様に必要とされるのは、生物体全体に所望されない副作用を引き起こさない送達系である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、治療化合物、医薬品、薬物、プロドラッグ、検出剤、核酸配列および生物学的因子を含むがこれらに限定されない薬剤の送達系のための組成物および方法を含む。一般に、本発明は、多機能性ナノ治療法として、ナノ薬物を構築するためのプラットフォーム（コロイド金属ゾルなど）と、標的リガンド（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの腫瘍標的リガンド）と、ステルス剤（ｓｔｅａｌｔｈ ａｇｅｎｔ）（ナノ粒子薬物を水和させ、そしてそれにより細網内皮系（ＲＥＳ）によるその取り込みおよびクリアランスを防止するためのポリエチレングリコールなど）と、特定の実施形態では１つまたは複数の活性剤または薬物（パクリタキセルなど）とを本質的に含むこれらの送達またはベクター組成物を提供する。本発明はさらに、このようなコロイド金属ゾル組成物を製造するための方法および組成物を含む。
【００２０】
本発明では、前記ナノ治療法の循環中の加水分解転換を遅延する手段として、コロイド金ナノ粒子の使用が説明される。また金ナノ粒子は、疾患（すなわち、固形腫瘍）部位における治療または診断薬の蓄積を促進し、薬剤はそこでゆっくりその活性形態に転換される。
【００２１】
本発明の特定の実施形態では、コロイド金属ゾルは、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、シリカナノ粒子、鉄ナノ粒子、金／鉄ナノ粒子などの金属ハイブリッドナノ粒子、ナノシェル、金ナノシェル、銀ナノシェル、金ナノロッド、銀ナノロッド、金属ハイブリッドナノロッド、量子ドット、ナノクラスター、リポソーム、デンドリマー、金属／リポソーム粒子、金属／デンドリマーナノハイブリッドおよびカーボンナノチューブを含む。
【００２２】
代替の実施形態では、標的リガンドは、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。
【００２３】
本発明のさらに他の実施形態では、保護剤は、ＰＥＧ、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルデンプン）（登録商標）、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、またはｒＰＥＧを含むことができ、これらはどれも、元の形態で、チオール化されて、あるいは他に誘導体化されて使用され得る。本発明において使用することができるその他のＰＥＧ様の化合物としては、チオール化ポリオキシプロピレンポリマー、チオール化ブロックコポリマー、またはトリブロックコポリマー（ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンブロックを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明のナノ治療法またはベクター組成物は、固形腫瘍の検出または処置において特に有用である。本発明の好ましい組成物は、誘導体化ＰＥＧ、好ましくはチオール−ＰＥＧ、または誘導体化もしくはチオール化ＨＥＳ（登録商標）、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、誘導体化またはチオール化ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、ｒＰＥＧ、誘導体化またはチオール化ｒＰＥＧと会合されたコロイド金属ゾル、好ましくは金属金ゾルを含むベクターを含み、そして、ベクターの特異的な標的化に役立つか、あるいは治療効果を有するか、あるいは検出可能である１つまたは複数の薬剤も含む。
【００２５】
本発明は既知の方法（注射あるいは経口など）によって本発明の組成物を投与することによる送達方法を含み、ここで、組成物は特定の細胞または器官に送達される。１つの実施形態では、本発明は、癌または固形腫瘍などの疾患を、このような疾患の処置のために知られている薬剤を含む本発明の組成物を投与することによって処置するための方法を含む。別の実施形態は、コロイド金属粒子と会合された誘導体化ＰＥＧ、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）および抗癌剤を含むベクター組成物を含む。別の実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ベクター、リボザイム、ｓｉ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、センスオリゴヌクレオチド、および核酸などの遺伝子治療のために使用される薬剤を含む本発明の組成物を投与することによる遺伝子治療のための方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ナノ薬物を調製するために使用される混合装置の概略図である。
【図２】コロイド金へのＴＮＦの飽和結合を示すグラフである。
【図３】図３Ａは、ｃＡｕ−ＴＮＦの安全性に対するＴＮＦ：金の結合比の効果を示すグラフである。図３Ｂは、ｃＡｕ−ＴＮＦの安全性に対するＴＮＦ：金の結合比の効果を示すグラフである。図３Ｃは、ｃＡｕ−ＴＮＦおよび天然型ＴＮＦの抗腫瘍効力を示すチャートである。図３Ｄは、１時間後のＴＮＦ分布プロファイルを示すチャートである。図３Ｅは、８時間後のＴＮＦ分布プロファイルを示すチャートである。図３Ｆは、ＭＣ３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける天然型ＴＮＦおよびｃＡｕ−ＴＮＦベクターの薬物動態学的プロファイルのグラフである。
【図４】図４Ａは、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置したマウスの肝臓および脾臓を示す。図４Ｂは、ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置したマウスの肝臓および脾臓を示す。図４Ｃは、処置を行わないマウスの肝臓および脾臓を示す。
【図５】図５Ａは、種々の器官における金の分布を示すグラフである。図５Ｂは、ＴＮＦの薬物動態学的分析を示すグラフである。図５Ｃは、経時的な腫瘍内ＴＮＦ分布を示すグラフである。図５Ｄは、コロイド金ナノ薬物の異なる配合物について腫瘍内ＴＮＦ濃度を比較するチャートである。図５Ｅは、種々の器官におけるＴＮＦの分布を経時的に示すグラフである。図５Ｆは、種々の器官におけるＴＮＦの分布を経時的に示すグラフである。
【図６】図６Ａは、天然型ＴＮＦまたはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの安全性および効力を比較するグラフである。図６Ｂは、天然型ＴＮＦおよび２０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦの安全性および効力を比較するグラフである。図６Ｃは、天然型ＴＮＦおよび３０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦの安全性および効力を比較するグラフである。
【図７】複数の薬剤を有するベクターの概略図である。
【図８】ベクターを検出するための捕捉方法の実施形態の概略図である。
【図９】第２の薬剤の存在を示すＴＮＦ−およびＥＮＤ−捕捉ベクターを示すグラフである。
【図１０】第２の薬剤の存在を示すＴＮＦ−およびＥＮＤ−捕捉ベクターを示すグラフである。
【図１１】ＰｏｌｙＰｅｇ（登録商標）として知られるペグ化剤の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、薬剤の送達のための組成物および方法を含む。また本発明は、組成物の製造方法、ならびにインビトロおよびインビボにおける組成物の投与方法も含む。一般に、本発明は、以下の成分：標的分子、活性剤、ステルス剤（例えば、１つまたは複数のタイプのＰＥＧまたは他のタイプのステルス部分）検出剤、および統合分子のいずれかまたは全てと、単独または組み合わせて会合されたプラットフォームを形成する金属ゾル粒子を含むナノ治療組成物を意図する。
【００２８】
薬剤の送達は、特定の細胞または組織の検出または処置のために使用される。例えば、本発明は、固形腫瘍などの特定の組織を画像化するために使用される。薬剤の送達は、慢性および急性疾患、免疫系およびその他の生体系の維持および制御、感染症、ワクチン接種、ホルモン維持および制御、癌、固形腫瘍および血管新生状態、ならびに他の生理的障害を含むが、これらに限定されない生物学的状態の処置のために使用される。このような送達は特定の細胞または細胞型を標的としてもよいし、あるいは低レベルの薬剤放出または非毒性の形を可能にする方法では、送達はあまり特異的でなく身体に提供されてもよい。金属ゾル組成物の説明および使用は、米国特許第６２７４５５２号明細書、ならびに関連特許出願の、米国特許出願第０９／８０８８０９号明細書、０９／９３５０６２号明細書、０９／１８９７４８号明細書、０９／１８９６５７号明細書、および０９／８０３１２３号明細書、ならびに米国仮特許出願第６０／２８７３６３号明細書において教示されており、これらの全てはその全体が本明細書に援用される。また、米国仮特許出願第６０／２８７３６３号明細書、米国仮特許出願第６０／９７４３１０号明細書、米国仮特許出願第６１／０６９１０８号明細書、米国仮特許出願第６１／１２３７９６号明細書、米国仮特許出願第６０／９８１９２０号明細書、米国仮特許出願第６１／０４００２２号明細書、米国仮特許出願第６１／１２４２９０号明細書、および米国仮特許出願第６１／１２６８９９号明細書も、本出願の中にその全体が援用される。
【００２９】
本発明は、新規の多機能性ナノ治療法としてのコロイド金属および薬剤の送達のためのベクターを含む方法および組成物に関する。特に、好ましい組成物は、固形腫瘍における１つまたは複数のタイプのベクターの蓄積を含む処置または検出方法において使用される。本発明の多機能性ナノ治療法は、ナノ薬物を構築するためのプラットフォーム、標的リガンド、ステルス剤、および１つまたは複数の活性剤を含むベクター組成物を含む。プラットフォームは、通常、金ナノ粒子などのコロイド金属ゾルを含む。標的リガンドは、腫瘍部位を標的とするＴＮＦなどのリガンドでよい。
【００３０】
ナノ治療法の構成要素は、本明細書において特定の機能および目的に関して説明されるが、構成要素は容易に２つ以上の機能を果たし得ることに注意すべきである。例えば、以下でさらに議論されるように、金ナノ粒子は、ナノ治療薬を製造するためのプラットフォームの役割を果たすだけでなく、一連のプロドラッグの加水分解転換を防止するときには「ステルス／保護機能」に寄与する。特定の実施形態では、金粒子の存在に起因する独特の化学作用が、標的部位に到達するまで薬剤またはプロドラッグの活性化（または加水分解）を遅延させる。さらに、ＴＮＦは本明細書では標的剤として提供および議論されるが、ＴＮＦはナノ粒子の治療効力にも寄与する。
【００３１】
ステルスまたは保護剤は、ナノ薬物を、その標的に到達する前の吸収、消化または他の代謝活性から保護する薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、ステルス剤は、ＰＥＧまたはチオール化ＰＥＧを含む。
【００３２】
本発明の組成物および方法は様々な目的のために使用され得る。特定の実施形態では、組成物および方法は固形腫瘍を処置するために使用され、ＰＥＧ、好ましくは誘導体化ＰＥＧ、より好ましくは、チオール誘導体化ポリエチレングリコールを含むコロイド金属ゾル組成物を投与することを含む。
【００３３】
特定のどんな理論により束縛されることも望まないが、このような組成物の使用はベクター組成物の腫瘍への輸送および腫瘍内での蓄積をもたらすと考えられる。標的分子および活性剤の不在下では、誘導体化ＰＥＧコロイド金属ベクターは腫瘍へ輸送され、そこに隔離される。
【００３４】
最も好ましい投与経路は静脈内または経口であるが、本発明によって全ての投与方法が意図される。好ましくは静脈内または経口で投与されると、コロイドベクターは腫瘍内に見られる、あるいは腫瘍と会合される。
【００３５】
本発明の組成物は、好ましくは、コロイド金属ゾル、誘導体化化合物、および１つまたは複数の薬剤を含む。薬剤は治療的用途において使用することができる生物活性剤であってもよいし、あるいは薬剤は、検出方法において有用な薬剤であってもよい。好ましい実施形態では、１つまたは複数の薬剤はコロイド金属と混合、会合、または直接もしくは間接的に結合される。混合、会合および結合には、共有およびイオン結合、ならびに誘導体化ＰＥＧ、薬剤、およびその他の成分の相互の、そして金属ゾル粒子との長期間または短期間の会合を可能にするその他のより弱いまたはより強い会合が含まれる。
【００３６】
さらに別の実施形態では、組成物は、コロイド金属と混合、会合または結合された１つまたは複数の標的分子も含む。標的分子は、直接または間接的に金属粒子に結合させることができる。間接的な結合には、ポリリジンもしくは他の統合分子などの分子を介した結合、または、金属ゾルもしくは金属ゾルに結合した別の分子のいずれかと標的分子との両方に結合する分子の会合が含まれる。
【００３７】
プラットフォーム
どのコロイド金属も本発明において使用することができる。コロイド金属には、液体水中に分散された任意の水に不溶性の金属粒子または金属化合物、ヒドロゾルまたは金属ゾルが含まれる。コロイド金属は、周期表のＩＡ族、ＩＢ族、ＩＩＢ族およびＩＩＩＢ族の金属、ならびに遷移金属、特にＶＩＩＩ族の遷移金属から選択することができる。好ましい金属としては、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケルおよびカルシウムが挙げられる。また、その他の適切な金属には、以下の：リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、インジウム、スズ、タングステン、レニウム、白金、およびガドリニウムが、これらの種々の酸化状態の全てにおいて含まれる。金属は、好ましくは、適切な金属化合物から誘導されるイオン形態（例えば、Ａｌ３＋、Ｒｕ３＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｎｉ２＋およびＣａ２＋イオン）で提供される。また、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、シリカナノ粒子、鉄ナノ粒子、金／鉄ナノ粒子などの金属ハイブリッドナノ粒子、ナノシェル、金ナノシェル、銀ナノシェル、金ナノロッド、銀ナノロッド、金属ハイブリッドナノロッド、量子ドット、ナノクラスター、リポソーム、デンドリマー、金属／リポソーム粒子、金属／デンドリマーナノハイブリッドおよびカーボンナノチューブを含むがこれらに限定されない他のナノ粒子も、本発明においてプラットフォームとして使用するのに適している。
【００３８】
好ましい金属は、特にＡｕ３＋の形態の金である。コロイド金の特に好ましい形態はＨＡｕＣｌ４である。１つの実施形態では、コロイド金粒子は、適切な中性ｐＨにおいて負電荷を有する。この負電荷は、他の負に帯電した分子の誘引および付着を防止すると考えられる。対照的に、正に帯電した分子は、コロイド金粒子に引き付けられて結合する。コロイド金は、好ましいサイズは約１〜４０ｎｍの粒径であるが、様々な粒径を有する金粒子を含有するゾルの形態で使用される。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、ナノ粒子中の金は、分子全体のプラットフォームの役割を果たすだけでなく、薬物類似体またはプロドラッグなどの薬物／薬剤の血液中での転換を防止し、薬剤または薬物の活性形態への転換を容易にする。以下の理論により束縛されることは望まないが、ナノ粒子中の金は、このような類似体の活性薬物または薬剤への血液中での転換を防止する独特の化学作用に寄与すると考えられる。従って、金は、標的（すなわち、固形腫瘍）に到達するまで薬剤または薬物のその活性状態への転換を防止するので、ナノ治療法の安全性および効力に寄与する。さらに、以下に示されるように、ナノ治療法は医薬品を固形腫瘍内に隔離するだけでなく、時間をかけて薬物類似体が活性薬物に転換できるようにもする。その結果として、標的送達および時間をかけた活性薬物の生成のため、ナノ治療は、より低用量の薬物の使用を容易にすることによって薬物の安全性も改善する。金の存在は、薬物の全体的な安定性に寄与する。１つの特定の実施形態では、ナノ治療法は、プラットフォームとしての金、標的剤としてのＴＮＦ、ステルス剤としてのＰＥＧ、およびプロドラッグを含む。標的（通常は、腫瘍）に到達するまでプロドラッグのその活性形態への加水分解および転換が生じないので、このナノ治療法は非常に有効である。不活性剤の活性剤への遅延された加水分解または遅延された転換は、無差別の作用または効力の低下の可能性が最小限にされるので非常に望ましい。
【００４０】
別の好ましい金属は銀であり、特に、約０．１％〜０．００１％の間の濃度を有するナトリウムホウ酸塩緩衝液中、最も好ましくは約０．０１％の溶液中の銀である。好ましくは、このようなコロイド銀溶液の色は黄色であり、コロイド粒子は１〜４０ｎｍの範囲である。このような金属イオンは、複合体中に単独で存在してもよいし、あるいは他の無機イオンと共に存在してもよい。
【００４１】
標的リガンド／分子
標的分子も本発明の組成物の成分である。１つまたは複数の標的分子は、コロイド金属に直接または間接的に付着、結合または会合され得る。これらの標的分子は、特定の細胞または細胞型、特定の胚組織に由来する細胞、器官または組織に方向付けることができる。このような標的分子には、特定の細胞または細胞型に選択的に結合することができる任意の分子が含まれる。一般に、このような標的分子は結合対の一方のメンバーであり、従って、他方のメンバーに選択的に結合する。このような選択性は、細胞において自然に見られる構造体（細胞膜、核膜中に見られる受容体など）またはＤＮＡと会合された構造体に結合することによって達成することができる。結合対のメンバーは細胞、細胞型、組織または器官上に合成的に導入されてもよい。標的分子は、細胞膜中または細胞膜のない状態に見られる分子に結合し得る受容体または受容体の一部、リガンド、抗体、抗体断片、酵素、補因子、基質、および当業者に知られている他の結合対メンバーも含む。標的分子は複数のタイプの結合パートナーに結合できることもある。例えば、標的分子は、受容体または他の結合パートナーの類または群に結合してもよい。標的分子は、いくつかの酵素または酵素型に結合することができる酵素基質または補因子であってもよい。
【００４２】
標的分子の具体的な例としては、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−１β（「ＩＬ−１β」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−３（「ＩＬ−３」）、インターロイキン−４（「ＩＬ−４」）、インターロイキン−５（「ＩＬ−５」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキン−７（「ＩＬ−７」）、インターロイキン−８（「ＩＬ−８」）、インターロイキン−９（「ＩＬ−９」）、インターロイキン−１０（「ＩＬ−１０」）、インターロイキン−１１（「ＩＬ−１１」）、インターロイキン−１２（「ＩＬ−１２」）、インターロイキン−１３（「ＩＬ−１３」）、インターロイキン−１４（「ＩＬ−１４」）、インターロイキン−１５（「ＩＬ−１５」）、インターロイキン−１６（「ＩＬ−１６」）、インターロイキン−１７（「ＩＬ−１７」）、インターロイキン−１８（「ＩＬ−１８」）インターロイキン２１（「ＩＬ−２１」）、Ｂ７、リピドＡ、ホスホリパーゼＡ２、エンドトキシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＢおよびその他の毒素、Ｉ型インターフェロン、ＩＦＮγ、ＩＩ型インターフェロン、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」または「ＴＮＦα」）、トランスフォーミング成長因子−α（「ＴＧＦ−α」）、リンホトキシン、遊走阻止因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＣＳＦ」）、単球マクロファージＣＳＦ、顆粒球ＣＳＦ、血管上皮成長因子（「ＶＥＧＦ」）、血管新生因子、アンジオゲニン、トランスフォーミング成長因子−β（「ＴＧＦ−β」）、血液型の炭水化物部分、Ｒｈ因子、線維芽細胞成長因子、ならびに他の炎症および免疫調節タンパク質、ホルモン、例えば、成長ホルモン、インスリン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、および黄体形成ホルモン放出ホルモン、内分泌性ホルモン、細胞表面受容体、抗体、核酸、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、センス核酸、アンチセンス核酸、癌細胞特異的抗原、ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、および分子シャペロン、例えばＨＳＰ（熱ショックタンパク質）、変異体ｐ５３、チロシナーゼ、自己免疫抗原、受容体タンパク質、グルコース、グリコーゲン、リン脂質、およびモノクローナル、および／またはポリクローナル抗体、塩基性線維芽細胞成長因子、酵素、補因子、酵素基質免疫調節性分子（すなわち、ＣＤ４０Ｌ）、接着分子（ＩＣＡＭ）、血管および新生血管マーカー（ＣＤ３１およびＣＤ３４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、標的リガンドはＴＮＦを含む。標的リガンドとしてＴＮＦを有するナノ治療法は、ナノ粒子の体内分布を主に疾患部位に制限し、そしてこれらが同時に固形腫瘍内に存在する腫瘍細胞を攻撃するだけでなく腫瘍の成長を支持および促進する宿主ストローマ細胞も殺すのを可能にすることに貢献するので非常に有効である。従って、標的剤としてＴＮＦが使用される実施形態を含む特定の実施形態では、標的剤は、標的剤としての役割を果たすことに加えて、ナノ治療法の治療的価値にも寄与する。
【００４４】
本発明において使用される統合分子は、結合対のメンバーなどの特異的結合統合分子か、あまり特異的でなく結合する非特異的結合統合分子のいずれかであり得る。統合分子は、２つの実体を結合または会合させるための部位を提供するその機能によって定義される。一方の実体は金属ゾル粒子を含むことができ、他方の実体は１つまたは複数の活性剤、または１つもしくは複数の標的分子、あるいはこれらの両方または組み合わせを含むことができる。本発明の組成物は、１つまたは複数の統合分子を含むことができる。
【００４５】
非特異的結合統合分子の一例は、核酸の結合において有用なポリリジンまたはヒストンなどのポリカチオン性分子である。ポリカチオン性分子は当業者に知られており、ポリリジン、硫酸プロタミン、ヒストンまたはアシアロ糖タンパク質を含むが、これらに限定されない。また本発明は、１つまたは複数の実体の金属粒子への結合を提供する合成分子の使用も意図する。
【００４６】
特異的結合−統合分子は、本発明において使用することができる結合対の任意のメンバーを含む。このような結合対は当業者に知られており、抗体−抗原対、酵素−基質対、受容体−リガンド対、およびストレプトアビジン−ビオチンを含むが、これらに限定されない。このような既知の結合対に加えて、新規の結合対も具体的に設計され得る。結合対の特徴は、結合対の２つのメンバー間の結合である。結合パートナーの別の望ましい特徴は、対の一方のメンバーが薬剤または標的分子の１つまたは複数に結合することができるか、または結合しており、対の他方のメンバーが金属粒子に結合できることである。
【００４７】
ステルス剤
本明細書において使用される場合、「ステルス剤」は、本明細書において説明されるナノ治療粒子の表面に結合された場合に、循環中の粒子のオプソニン化、そしてそれに続く細網内皮系（ＲＥＳ）によるクリアランスを防止する化合物を指す。
【００４８】
ステルス剤は、その標的に到達するまで、ナノ治療薬を消化、吸収、オプソニン化、または他の代謝活性から保護するのに役立つ薬剤を含む。ステルス剤は、一般に、標的部位に到達するまで、ナノ治療薬を崩壊から保護する。例えば、チオール化ポリエチレングリコールはナノ粒子薬物を水和させ、その際に、細網内皮系（ＲＥＳ）によるその取り込みおよびクリアランスを防止する。
【００４９】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、ステルス剤として、グリコール化合物、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（当業者にはポリオキシエチレンまたはＰＯＥとしても知られている）、より好ましくは誘導体化ＰＥＧを含む。本発明は誘導体化ＰＥＧを含む組成物を含み、ＰＥＧは、５０００〜３００００（ダルトン）ＭＷである。誘導体化ＰＥＧ化合物は、ＳｕｎＢｉｏ（韓国ソウル）などの供給源から市販されている。ＰＥＧ化合物は、二官能性でも単官能性（メトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）など）でもよい。線状および分枝状ＰＥＧの活性化誘導体は、様々な分子量で入手可能である。本明細書において使用される場合、「誘導体化ＰＥＧ」または「ＰＥＧ誘導体」という用語は、官能基、化学物質の付加、または他のＰＥＧ基の付加のいずれかによって線状分子からの枝分れを提供するように変化されているポリエチレングリコール分子を意味する。このような誘導体化ＰＥＧは、生物活性化合物との結合、ポリマーグラフトの調製、または分子の誘導体化により提供されるその他の機能のために使用することができる。
【００５０】
ＰＥＧ誘導体の１つの種類は、一方または両方の末端に第１級アミノ基を有するポリエチレングリコール分子である。好ましい分子は、一方の末端にアミノ基を有するメトキシＰＥＧである。別の種類のＰＥＧ誘導体には、求電子的に活性化されたＰＥＧが含まれる。これらのＰＥＧは、ＰＥＧまたはメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）をタンパク質、リポソーム、可溶性および不溶性ポリマー、ならびに様々な分子に付着させるために使用される。求電子的に活性なＰＥＧ誘導体としては、ＰＥＧプロピオン酸のスクシンイミド、ＰＥＧブタン酸のスクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミドまたはアルデヒドに付着した複数のＰＥＧ、ｍＰＥＧダブルエステル（ｍＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳ）、ｍＰＥＧベンゾトリアゾールカーボネート、およびｍＰＥＧプロピオンアルデヒド、ｎｉＰＥＧアセトアルデヒドジエチルアセタールが挙げられる。
【００５１】
誘導体化ＰＥＧの好ましい種類には、チオール誘導体化ＰＥＧ、またはスルフヒドリル選択的ＰＥＧが含まれる。５０００〜４００００（ダルトン）ｍｗの分子量範囲を有する分枝状、フォーク状または線状ＰＥＧをＰＥＧ骨格として使用することができる。好ましいチオール誘導体化ＰＥＧには、チオール基が結合され得るマレイミド官能基を有するＰＥＧが含まれる。好ましいチオール−ＰＥＧは、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドであり、ＰＥＧ分子量は５０００〜４００００ダルトンである。
【００５２】
誘導体化ＰＥＧとしてのヘテロ官能性ＰＥＧの使用も本発明によって意図される。ＰＥＧのヘテロ官能性誘導体は一般構造Ｘ−ＰＥＧ−Ｙを有する。ＸおよびＹが結合能力を提供する官能基である場合、多くの異なる実体がＰＥＧ分子のいずれかまたは両方の末端に結合することができる。例えば、ビニルスルホンまたはマレイミドはＸであることが可能であり、ＮＨＳエステルはＹであり得る。検出方法のためには、Ｘおよび／またはＹは、蛍光分子、放射性分子、発光分子またはその他の検出可能な標識であり得る。ヘテロ官能性ＰＥＧまたは単官能性ＰＥＧは、ＰＥＧ−ビオチン、ＰＥＧ−抗体、ＰＥＧ−抗原、ＰＥＧ−受容体、ＰＥＧ−酵素またはＰＥＧ−酵素基質などの結合対の一方のメンバーと結合するために使用することができる。またＰＥＧは、ＰＥＧ−リン脂質などの脂質に結合することができる。
【００５３】
本発明におけるステルス剤として有用なペグ化剤の別の種類は、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｌｔｄ．（英国コベントリー）である。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）は、治療用タンパク質、ペプチドおよび小分子への結合のための新規のペグ化剤である。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）は、メタクリル酸ポリマー骨格上にＰＥＧの歯を有する櫛形ポリマーである。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）は、様々な分子量、ＰＥＧ鎖長、および結合末端基を有する。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）の構造は、（１）櫛の長さを決定するメタクリル酸骨格と、（２）櫛の各歯上のＰＥＧの量を決定するＰＥＧ鎖長と、（３）ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）と標的生体分子の間の結合部位を決定する活性末端基とによって変化され得る。
【００５４】
ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）の櫛様のアーキテクチャは、時間とともに容易に排泄される小さい単位に分解する構造体の特性を利用することによって、ＰＥＧ化への代替的アプローチを提供する。これは、より大きい分子量のＰＥＧ鎖の組織内の蓄積に関連する潜在的な毒物学的問題を回避しながら、高い総用量でのこれらの使用を可能にする。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）は、これらの循環中の存在を延長することによって生物学的分子の治療効果を高めるという点で従来のＰＥＧに類似している。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）は、従来のＰＥＧよりも、特定のペプチドの生物活性を大きく改善することができる。ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）分子は、様々な治療分子のＰＥＧのための特定の要求に合わせることができる。これらは、リジンもしくはシステイン残基、またはＮ−末端アミンにおけるペプチドおよびタンパク質への安定な部位特異的共有結合のための選択された結合基によって合成することができる。
【００５５】
本発明のさらなる実施形態は、その他のＰＥＧ様の化合物を含むステルス剤を含み、例えば、チオール化ポリオキシプロピレンポリマー、チオール化ブロックコポリマー（ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンブロックを含むトリブロックコポリマーであるＰＬＵＲＯＮＩＣなど）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において有用なＰＬＵＲＯＮＩＣの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【化１】
【００５６】
ＰＬＵＲＯＮＩＣブロックポリマーの分子量は、限定されないが、１０００から１０００００ダルトンまで、より好ましくは２０００〜４００００ダルトンの間であり得る。
【００５７】
ポリマーブロックは、触媒の存在下、高い温度および圧力におけるエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの縮合によって形成される。結合して各コポリマー中のポリマー鎖を形成するモノマー単位の数にはいくらかの統計的変動が存在する。与えられる分子量は各調製物中のコポリマー分子平均重量の概数であり、使用されるアッセイ方法論および較正基準に依存する。プロピレンオキシドおよびエチレンオキシドのブロックが必ずしも純粋である必要はないことは理解すべきである。全体の物理化学特性が実質的に変化されない限りは、少量のその他の材料を混合することができる。これらの製品の調製についてのより詳細な議論は、米国特許第２６７４６１９号明細書に見出される（参照によってその全体が本明細書に援用される）。（「Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｌｏｃｋ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ」、Ｓｃｈｍｏｌｋａ Ｉ．Ｒ．、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ Ｓｏｃ．、５４：１１０−１１６（１９７７年）および「Ｂｌｏｃｋ ａｎｄ Ｇｒａｆｔ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、第２巻、Ｒ．Ｊ．Ｃｅｒｅｓａ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７６年も参照されたい。
【００５８】
本発明には、好ましくはチオール基によって、官能基化されたポリオキシプロピレンポリマー（ＰＯＰ）が含まれる。ＰＬＵＲＯＮＩＣブロックポリマーの好ましい分子量は、２０００〜４００００ダルトンの間である。また、ＴＥＴＲＯＮＩＣ（ＰＥＯ／ＰＰＯまたはＰＥＯまたはＰＰＯ）コポリマー）、分枝状ＰＥＧ、および開示されるブロックポリマーの種々の組み合わせを含む分枝状ポリマーも本発明に含まれる。コロイド表面とポリマーとの間にリンカー分子が使用されてもよいことは理解される。
【００５９】
本発明のナノ治療法のために使用することができるさらに別のステルス剤は、以下の一般構造：
【化２】
を有するチオール化ポリ（ビニルピロリドン）ポリマー（ＰＶＰ）を含む。
【００６０】
Ｘは、ポリマーに付加されてチオール基のコロイド金属表面へのより優れた到達性を提供し得る任意のスペーサーアームの部位を示す。スペーサーアームは、以下の、プロピル基、アミノ酸、またはポリアミノ酸で構成され得るが、これらに限定されない。ＰＶＰポリマーの好ましい分子量は、およそ１０００〜１０００００ダルトンの間であり、より好ましくは５０００〜４００００ダルトンの間である。
【００６１】
本発明のために有用な別の可能なステルス剤は、ｒＰＥＧ（Ａｍｕｎｉｘ（カリフォルニア州マウンテンビュー））を含む。本明細書において使用される場合、ｒＰＥＧは、通常、３００〜６００アミノ酸非構造化タンパク質の尾部を現存の医薬用タンパク質へ遺伝子融合することを通常含む、組換えＰＥＧ化技術を指す。ｒＰＥＧのさらなる説明は、米国特許出願公開第２００８／００３９３４１Ａ１号明細書（参照によってその全体が本明細書に援用される）において見出すことができる。
【００６２】
代替の実施形態では、ナノ治療のために使用されるステルス剤は、ＨＥＳポリマーとして一般に知られているポリマーを含み、これは、非イオン性デンプン誘導体のヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）であり、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ，Ｉｎｃ．（独国バートホンブルグ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−ｋａｂｉ．ｃｏｍ／）によって得ることができる。ＨＥＳおよびＨＥＳ誘導体は、誘導体化および／またはチオール化され、そしてコロイド金ナノ粒子に結合され得る。
【００６３】
上記のステルス剤はいずれも、本発明のナノ治療組成物のためのこれらの使用に関連して、修飾、誘導体化（すなわち、チオール化）、アミノ化、または多アミノ化され得る。特定の実施形態では、ステルス剤は、金への結合を容易にするために単一の末端チオール基を有するポリマーを含むことが好ましいこともある。
【００６４】
薬剤
本発明の薬剤は、任意の化合物、化学物質、治療薬、医薬品、薬物、生物学的因子、生物学的分子（抗体、タンパク質、脂質、核酸または炭水化物など）の断片、核酸、抗体、タンパク質、脂質、栄養物、補因子、栄養補助食品、麻酔薬、検出剤、または体内で効果がある薬剤であり得る。このような検出剤および治療薬ならびにこれらの活性は当業者に知られている。
【００６５】
以下は、本発明において使用することができる薬剤のいくつかの非限定的な例である。本発明において使用することができる薬剤の１つの種類は、サイトカイン、成長因子、活性を有する大きい分子の断片、神経化学物質、および細胞通信分子を含むがこれらに限定されない生物学的因子を含む。このような薬剤の例としては、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−１β（「ＩＬ−１β」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−３（「ＩＬ−３」）、インターロイキン−４（「ＩＬ−４」）、インターロイキン−５（「ＩＬ−５」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキン−７（「ＩＬ−７」）、インターロイキン−８（「ＩＬ−８」）、インターロイキン−１０（「ＩＬ−１０」）、インターロイキン−１１（「ＩＬ−１１」）、インターロイキン−１２（「ＩＬ−１２」）、インターロイキン−１３（「ＩＬ−１３」）、インターロイキン−１５（「ＩＬ−１５」）、インターロイキン−１６（「ＩＬ−１６」）、インターロイキン−１７（「ＩＬ−１７」）、インターロイキン−１８（「ＩＬ−１８」）、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦα」）、トランスフォーミング成長因子−α（「ＴＧＦ−α」）、ｆｌＴ３、リンホトキシン、遊走阻止因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＣＳＦ」）、単球マクロファージＣＳＦ、顆粒球ＣＳＦ、血管上皮成長因子（「ＶＥＧＦ」）、アンジオゲニン、トランスフォーミング成長因子−β（「ＴＧＦ−β」）、線維芽細胞成長因子、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＧＡＢＡ、およびアセチルコリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
別の種類の薬剤はホルモンを含む。このようなホルモンの例としては、成長ホルモン、インスリン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、エストロゲン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、プロステロール（ｐｒｏｓｔｅｒｏｌ）、プロゲステロン、プロゲスチン、エストロン、その他の性ホルモン、ならびにホルモンの誘導体および類似体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
さらに別の種類の薬剤は医薬品を含む。本発明において任意の医薬品を使用することができる。例えば、ステロイドおよび非ステロイド抗炎症薬などの抗炎症薬、可溶性受容体、抗体、抗生物質、鎮痛薬、血管新生および抗血管新生薬、ならびにＣＯＸ−２阻害薬を本発明において使用することができる。化学療法剤は、本発明において特に重要である。このような薬剤の非限定的な例としては、タキソール、パクリタキセル、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、アシクロビル、シスプラチンおよびタクリンおよびこれらの類似体が挙げられる。
【００６８】
免疫療法剤も本発明において特に重要である。免疫療法剤の非限定的な例としては、ＡＺＴおよび他の誘導体化または修飾されたヌクレオチドなどの、炎症薬、生物学的因子、免疫調節タンパク質、ならびに免疫療法薬が挙げられる。小分子も本発明において薬剤として使用することができる。
【００６９】
別の種類の薬剤は、核酸に基づく物質を含む。このような材料の例としては、核酸、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、センス核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、ＤＮＡザイム、タンパク質／核酸組成物、ＳＮＰ、オリゴヌクレオチド、ベクター、ウイルス、プラスミド、トランスポゾン、および当業者に既知のその他の核酸構築物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明において使用することができるその他の薬剤としては、リピドＡ、ホスホリパーゼＡ２、エンドトキシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＢおよびその他の毒素、熱ショックタンパク質、血液型の炭水化物部分、Ｒｈ因子、細胞表面受容体、抗体、癌細胞特異的抗原、例えば、ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、およびＨＳＰ（熱ショックタンパク質）など、放射性金属または分子、検出剤、酵素および酵素補因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
特に重要なのは、隔離されたコロイド金属ベクターを視覚化または検出するために使用することができる染料または放射性物質などの検出剤である。蛍光、化学発光、感熱、不透明、ビーズ、磁性および振動材料も、本発明の組成物中のコロイド金属に会合または結合される検出可能な薬剤として使用するために意図される。
【００７２】
薬剤、および本発明の処置方法によって影響を受ける生物体のその他の例は、以下の表において見出される。この表は、他の薬剤（以下の薬剤の薬学的等価物など）が本発明によって意図されるという点で限定的ではない。
【００７３】
【表１】
【００７４】
付加的な治療薬は、以下の種類の薬剤の１つまたは複数を含み得る：葉酸の代謝拮抗薬（限定されないが、例えばアミノプテリン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド）、プリン代謝拮抗薬（限定されないが、例えばクラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン）、ピリミジン代謝拮抗薬（限定されないが、例えばシタラビン、デシタビン、フルオロウラシル／カペシタビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、エノシタビン、サパシタビン）、アルキル化剤、限定されないが、例えば窒素マスタード（限定されないが、例えばクロランブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ベンダムスチン、トロホスファミド、ウラムスチン）、ニトロソ尿素（限定されないが、例えばカルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、プレドニムスチン、ラニムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン）、白金アルキル化様薬剤（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ−ｌｉｋｅ ａｇｅｎｔ）（限定されないが、例えばカルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、四硝酸トリプラチン（Ｔｒｉｐｌａｔｉｎ ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）、サトラプラチン）、スルホン酸アルキル（限定されないが、例えばブスルファン、マンノスルファン、トレオスルファン）、ヒドラジン（限定されないが、例えばプロカルバジン）、トリアゼン（限定されないが、例えばダカルバジン、テモゾロミド）、アジリジン（限定されないが、例えばカルボコン、チオテパ、トリアジコン、トリエチレンメラミン）、紡錘体毒／有糸分裂阻害薬、限定されないが、例えばタキサン（ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、テセタキセル、イキサベピロンおよびエピチロン（ｅｐｉｔｈｉｌｏｎｅ）、ビンカアルカロイド（限定されないが、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシン、ビノレルビン）、細胞毒性／抗腫瘍性抗生物質、限定されないが、例えばアントラサイクリン（限定されないが、例えばアクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、ゾルビシン）、アントラセンジオン（限定されないが、例えばミトキサントロン、ピクサントロン）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に基づくもの、限定されないが、例えば（アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン）ヒドロキシ尿素、トポイソメラーゼ阻害薬（カンプトテカ属（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）に関連、限定されないが、例えばカンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ルビテカン（Ｒｕｂｉｔｅｃａｎ）、ベロテカン（Ｂｅｌｏｔｅｃａｎ））ポドフィルム（限定されないが、例えばエトポシド、テニポシド）、その他のもの（限定されないが、例えばアルトレタミン、アムサクリン、ベキサロテン、エストラムスチン、イロフルベン、トラベクテジン）、細胞に基づく治療薬（限定されないが、例えば受容体チロシンキナーゼなど（限定されない）に対するモノクローナル抗体、セツキシマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ、ＣＤ２０、限定されないが、例えばリツキシマブ、トシツモマブ、その他のもの、限定されないが、例えばアレムツズマブ、ベバシズマブ、エドレコロマブ、ゲムツズマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、アブシキシマブ、ダクリズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、パリビズマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト、ヒト化抗体およびファージディスプレイ抗体、サイトカインならびに細胞表面および可溶性受容体に対する完全ヒトモノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害薬、限定されないが、例えばアキシチニブ、ボスチニブ、セジラニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、ニロチニブ、セマキサニブ（Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデタニブ、サイクリン依存性キナーゼ阻害薬、限定されないが、例えばアルボシジブ（Ａｌｖｏｃｉｄｉｂ）、セリシクリブ（Ｓｅｌｉｃｉｃｌｉｂ）、ホルモンに基づく治療薬、限定されないが例えば、デキサメタゾン、フィナステリド、タモキシフェン、抗アンドロゲンに基づくホルモン治療薬、送達系、限定されないが、例えばウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、偽型ウイルス、レンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（エンベロープタンパク質、水疱性口内炎ウイルスからのＧ−タンパク質で被覆）、遺伝子治療薬を送達するように設計されたデンドリマー（サイトカイン（限定されないが、例えばＧＭＣＳＦ、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＦＮβ）のための遺伝子を導入するように設計されたものなど）、化学増感剤（ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）自殺遺伝子、限定されないが、例えばチミジンキナーゼ、ｐ５３、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどのセンスおよびアンチセンス治療薬（ｓｉＲＮＡを含む）、その他の治療薬、限定されないが、例えば融合タンパク質（限定されないが、例えばアフリベルセプト、デニロイキンジフチトクス）、抗炎症性治療薬、光増感剤、限定されないが、例えばアミノレブリン酸／アミノレブリン酸メチル、エファプロキシラル、ポルフィリン誘導体（ポルフィマーナトリウム、タラポルフィン、テモポルフィン、ベルテポルフィン）、レチノイド（アリトレチノイン、トレチノイン）、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ／ペガスパルガーゼ、アトラセンタン、ボルテゾミブ、カルモフール、セレコキシブ、デメコルチン、エレスクロモル、エルサミトルシン、エトグルシド、ロニダミン、ルカントン、マソプロコール、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトタン、オブリメルセン、オマセタキシン、シチマジーンセラデノベック、テガフール、ストラクトン、チアゾフリン、ティピファニブ、およびボリノスタット。
【００７５】
コロイド金ナノ粒子による結合プロドラッグ／不活性剤の安定化
推定上の医薬品成分プロドラッグの単なる結合が、循環中に分解から保護される概念が、本出願において記載される。次に、保護されたプロドラッグは、疾患（すなわち、固形腫瘍）の部位へのその送達中、保存される。疾患部位に到着すると、プロドラッグは、徐放性製剤に類似した活性薬物に持続的に転換される。
【００７６】
プロドラッグの金表面への結合は、インビトロおよび循環中の両方において、プロドラッグの活性薬物への加水分解転換を防止する。そして、固形腫瘍内では、金粒子がプロドラッグの腫瘍への送達を増強するだけでなく、経時的な活性剤の生成も提供することが観察される。事実上、データは、金ナノ薬物が、標的化送達系としての機能だけでなく、徐放性製剤としての機能も果たすことと一致する。
【００７７】
結合および送達
薬剤を金属ゾルに結合させるための一般的な方法は、以下の工程を含む。薬剤の溶液は、脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）などの緩衝液または溶媒中で形成される。適切な緩衝液または溶媒は、結合すべき薬剤に依存するであろう。所与の薬剤のために適切な緩衝液または溶媒の決定は、当業者の技能のレベル内である。最適な量の薬剤を金属ゾルに結合させるために必要なｐＨの決定は当業者に知られている。結合される薬剤の量は、ＥＬＩＳＡまたは分光光度法などの、タンパク質、治療薬または検出剤の決定の定量的方法によって決定することができる。本発明において統合分子が使用される場合、結合ｐＨおよび統合分子の飽和レベルも組成物の調製において考慮される。例えば、統合分子がストレプトアビジン−ビオチンなどの結合対のメンバーである場合、ストレプトアビジンまたはビオチンに対する結合ｐＨが決定され、結合されるストレプトアビジンまたはビオチンの濃度も決定することができる。
【００７８】
本発明の組成物の１つまたは複数の薬剤は、コロイド金属粒子に直接結合することもできるし、あるいは１つまたは複数の統合分子を介してコロイド金属に間接的に結合することもできる。本発明のコロイド金属ゾルを調製する１つの方法は、参照によって本明細書に援用されるＨｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ（１９７９）によって記載される方法を使用する。統合分子が使用される実施形態において、統合分子は金属ゾルと結合、混合または会合される。薬剤は、統合分子を金属と結合、混合または会合させる前に統合分子と結合、混合、または会合されてもよいし、あるいは統合分子を金属に結合した後で結合、混合または会合されてもよい。
【００７９】
ベクター組成物が統合分子を含む場合、薬剤は、当該技術分野において知られている従来の方法によって、統合分子として機能するビオチンなどの結合対のメンバーに結合され得る。ビオチン化された薬剤は、次に、統合分子のストレプトアビジンを含むコロイド金組成物に付加され得る。ビオチンはストレプトアビジンに特異的に結合し、コロイド金と活性剤との間に間接的な結合を提供する。
【００８０】
薬剤を金属ゾルに結合する１つの方法は以下の工程を含むが、明瞭にする目的のみで、この方法は、薬剤のＴＮＦを金属ゾルのコロイド金へ結合することに関して開示される。コロイド金ゾル中の粒子と、タンパク質溶液ＴＮＦとの間の相互作用を可能にする装置を使用した。装置の概略図は図１に示される。この装置は、混合チャンバを小さい容積に減少させることによって、結合していないコロイド金粒子と、結合すべきタンパク質のＴＮＦとの相互作用を最大にする。この装置は、大量の金ゾルと、大量のＴＮＦとの相互作用が小さい容積のＴ型コネクタにおいて生じることを可能にする。対照的に、少量のタンパク質を大量のコロイド金粒子に添加することは、金粒子への均一なタンパク質結合を保証するために好ましい方法ではない。また、少量のコロイド金を大量のタンパク質に添加するという反対の方法も好ましい方法ではない。コロイド金粒子およびタンパク質ＴＮＦは、物理的に、コロイド金粒子およびＴＮＦタンパク質を２つの大型リザーバーから引き出す単一のぜん動ポンプによってＴ型コネクタ内に押し込まれる。適切な混合をさらに保証するために、インラインミキサーがＴ型コネクタのすぐ下流に配置される。ミキサーはコロイド金粒子をＴＮＦと激しく混合し、これらは両方とも、約１Ｌ／分の好ましい流速でコネクタを通って流れる。
【００８１】
薬剤と混合する前に、金ゾルのｐＨは、１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ８〜９に調整される。高度に精製されて凍結乾燥された組換えヒトＴＮＦが再構成され、３ｍＭのＴｒｉｓ中に希釈される。ゾルまたはＴＮＦのいずれかをそのそれぞれのリザーバーに添加する前に、容器をＴ型コネクタへ接続する管がクランプで閉じられる。等量のコロイド金ゾルおよびＴＮＦ溶液が適切なリザーバーに添加される。溶液中の薬剤の好ましい濃度は、約０．０１〜１５μｇ／ｍｌの範囲であり、薬剤対金属ゾル粒子の比率に応じて変えることができる。溶液中のＴＮＦの好ましい濃度は、０．５〜４μｇ／ｍｌの範囲であり、ＴＮＦ−コロイド金組成物のためのＴＮＦの最も好ましい濃度は０．５μｇ／ｍｌである。
【００８２】
溶液がそのそれぞれのリザーバーに適切に装填されたら、ぜん動ポンプがオンにされ、薬剤溶液およびコロイド金溶液はＴ型コネクタ内に引き出され、インラインミキサーを通り、ぜん動ポンプを通って、捕集フラスコ内に入る。混合された溶液は捕集フラスコ内でさらに１時間攪拌されて、インキュベーションされる。
【００８３】
ＰＥＧ（誘導体化されていてもいなくても）などのステルス剤を含む組成物において、このような組成物を製造するための方法は以下の工程を含むが、明瞭にする目的のみで、この方法は、ＰＥＧチオールを金属ゾル組成物に添加することに関して開示される。任意のＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ組成物、または任意の大きさのＰＥＧ組成物、またはいくつかの異なるＰＥＧを含む組成物は、以下の工程を用いて製造することができる。上記で教示された１時間のインキュベーションに続いて、チオール誘導体化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液がコロイド金／ＴＮＦゾルに添加される。本発明は、任意の誘導体基を有する任意の大きさのＰＥＧの使用を意図するが、好ましい誘導体化ＰＥＧとしては、ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ／５０００、チオール−ＰＥＧ−チオール／３４００、ｍＰＥＧ−チオール５０００、およびｍＰＥＧチオール２００００（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。好ましいＰＥＧは、水中の１５０μｇ／ｍｌの濃度のｍＰＥＧ−チオール５０００（ｐＨ５〜８）である。従って、１０％ｖ／ｖのＰＥＧ溶液がコロイド金−ＴＮＦ溶液に添加される。金／ＴＮＦ／ＰＥＧ溶液は、さらに１時間インキュベートされる。
【００８４】
コロイド金／ＴＮＦ／ＰＥＧ溶液は、次に、５０Ｋ ＭＷＣＯダイアフィルトレーションカートリッジによって限外ろ過される。５０Ｋ残余分および透過液は、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦ濃度について測定され、金粒子に結合したＴＮＦの量が決定される。
【００８５】
本発明の組成物は、インビトロ系およびインビボ系で投与することができる。インビボ投与は、標的細胞への直接適用、または経口、直腸、経皮、眼、（硝子体内または前房内を含む）、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、気管内、および硬膜外を含む）投与に適した製剤を含むがこれらに限定されないこのような投与経路を含むことができる。好ましい方法は、経口または注射経路によって本発明のベクターを含む有効量の組成物を投与することを含む。
【００８６】
製剤は単位剤形において都合よく提供され、従来の製薬技術によって調製され得る。医薬製剤組成物は、金属ゾルベクターおよび医薬品キャリアまたは賦形剤に会合をもたらすことによって製造される。一般に、製剤は、組成物を液体キャリアもしくは微粉化固体キャリアまたはその両方と均一および密接に会合させ、次に必要であれば生成物を成形することによって調製される。
【００８７】
本発明の組成物の好ましい使用方法は、ベクターを腫瘍に導くことを含む。好ましいベクター組成物は、腫瘍もしくは生物体における治療効果または腫瘍の検出のために腫瘍に送達するために、金属ゾル粒子、薬剤、およびステルス剤または誘導体化ステルス剤（すなわち、ＰＥＧまたは誘導体化ＰＥＧ組成物）を含む。このようなベクター組成物は、さらに、標的および／または統合分子を含み得る。さらに他の好ましいベクター組成物は、腫瘍に放射治療を送達するために、金属ゾル粒子、放射性または細胞毒性の薬剤、およびＰＥＧまたは誘導体化ＰＥＧ組成物を含む。歴史的に、放射性コロイド金は、癌治療として、肝臓細胞によるコロイド金の予測される取り込みによって、主に肝臓癌の処置のために使用されていた。放射性コロイド金属粒子と組み合わせて誘導体化ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧチオールを含む組成物は、腫瘍を処置または同定するために使用される。あるいは、コロイド金属に結合されるタンパク質に結合した放射性部分を含み、そしてさらに誘導体化ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−チオールを含む（放射性ベクターを形成する）ベクター組成物は、腫瘍を処置するために使用される。本発明の放射性ベクター組成物は静脈注射されて腫瘍に輸送され、肝臓によって有意に取り込まれない。両方の組成物において、ＰＥＧチオールが放射性治療を腫瘍に集中させる能力は処置効力を増大させるが、処置の副作用を低減すると考えられる。
【００８８】
その他の好ましいベクター組成物は、腫瘍のインビボでの画像化および検出のために組成物を投与することを含む方法において使用するために、金属ゾル粒子およびＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ誘導体を含む。組成物はさらに、検出および画像化方法に役立つ薬剤を含み得る。たとえば、薬剤としては、放射性、放射線感受性、もしくは反応性（光または熱反応性など）の化合物、化学発光または発光剤、または検出目的で使用される他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。検出方法としては、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＣＡＴまたはＰＥＴスキャン、目視検査、比色分析、放射検出法、分光光度法、およびタンパク質、核酸、多糖類または他の生物剤検出方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明は、外来核酸または遺伝子材料を細胞内に送達するための方法において使用するための組成物を含む。外来遺伝子材料は、特定の細胞を認識することができる標的分子を用いて特定の細胞に導くか、あるいは、ＰＥＧまたは誘導体化ＰＥＧを含む組成物を用いて腫瘍に特異的に導くことができる。例えば、標的分子は細胞上の特異的受容体のための結合パートナーであり、結合した後、組成物全体は細胞内に取り込まれ得る。ベクター組成物の結合は、細胞内の二次メッセンジャー分子の活性化など、細胞の状態を変更する細胞メカニズムを活性化し得る。従って、異なる細胞型の混合物中では、外来核酸は選択された受容体を有する細胞に送達され、受容体を欠いている細胞は影響を受けない。
【００９０】
本発明は、薬剤の挿入または薬剤の適用のために、インビトロまたはインビボにおける特定の細胞のトランスフェクションのための組成物および方法を含む。このような組成物の１つの実施形態は、コロイド金属に結合されるポリカチオン（非特異的結合−統合分子）に結合した核酸を含む。本発明の好ましい実施形態は、細胞の受容体仲介によるエンドサイトーシスを用いてトランスフェクションを達成する標的化遺伝子送達ベクターを形成するために、標的分子および核酸剤を結合させることができるプラットフォームとしてコロイド金を含む。さらに好ましい実施形態では、標的分子はサイトカインであり、薬剤はＤＮＡまたはＲＮＡなどの遺伝子材料である。この実施形態は、遺伝子材料が結合または会合されるポリカチオンなどの統合分子を含んでもよい。
【００９１】
本発明において、方法は、トランスフェクションまたは治療効果のために、遺伝子送達ベクターの調製および標的化遺伝子送達ベクターの細胞への送達を含む。本発明では、組成物の核酸は内部移行されて検出剤としてまたは遺伝子治療効果のために使用されるか、あるいは核酸は細胞によって翻訳および発現され得ることが意図される。発現産物は当業者に知られている任意のものでよく、機能性タンパク質、細胞産物の産生、酵素活性、細胞産物の排出、細胞膜成分の産生、または核成分が含まれるが、これらに限定されない。標的細胞への送達方法は、細胞培養などによるインビトロ技法のために使用される方法、またはインビボ投与のために使用される方法のような方法であり得る。インビボ投与は、細胞への直接適用、またはヒト、動物、もしくは他の生物体のために使用されるような投与経路、好ましくは静脈内または経口投与を含み得る。また本発明は、本発明の組成物により改変された細胞、ならびにインビトロまたはインビボ方法におけるこのような細胞の他の細胞、組織または生物体への投与も意図する。
【００９２】
本発明は、特定の免疫成分へ向けられる組成物を用いて、特定の免疫細胞の同時または逐次的な標的化によって免疫応答を増強し、ワクチン効力を増大させるための組成物および方法を含む。組成物は、免疫細胞の画像化または検出のための方法において使用することもできる。これらの方法は免疫系に作用することができるベクター組成物を含み、以下の成分、標的分子、薬剤、統合分子、１つまたは複数のタイプのステルス剤（すなわち、ＰＥＧ）または誘導体化ステルス剤の少なくとも１つと会合されたコロイド金属が含まれる。組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（マクロファージおよび樹状細胞など）、およびリンパ球（Ｂ細胞およびＴ細胞など）を含むがこれらに限定されない細胞などの特定の免疫成分を含むこともでき、これらは、１つまたは複数の成分特異的免疫刺激剤によって作用されているか、あるいは個々に作用される。
【００９３】
成分特異的免疫刺激分子の例としては、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−３（「ＩＬ−３」）、インターロイキン−４（「ＩＬ−４」）、インターロイキン−５（「ＩＬ−５」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキン−７（「ＩＬ−７」）、インターロイキン−８（「ＩＬ−８」）、インターロイキン−１０（「ＩＬ−１０」）、インターロイキン−１１（「ＩＬ−１１」）、インターロイキン−１２（「ＩＬ−１２」）、インターロイキン−１３（「ＩＬ−１３」）、リピドＡ、ホスホリパーゼＡ２、エンドトキシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＢおよび他の毒素、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ−□」）、トランスフォーミング成長因子−β（「ＴＧＦ−β」）リンホトキシン、遊走阻止因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＣＳＦ」）、単球マクロファージＣＳＦ、顆粒球ＣＳＦ、血管上皮成長因子（「ＶＥＧＦ」）、アンジオゲニン、トランスフォーミング成長因子（「ＴＧＦ−□」）、熱ショックタンパク質、血液型の炭水化物部分、Ｒｈ因子、線維芽細胞成長因子、および他の炎症および免疫調節タンパク質、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、センス、アンチセンス、癌細胞特異的抗原、例えば、ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥなど、ｆｌｔ３リガンド／受容体系、分子および受容体のＢ７ファミリー、ＣＤ４０リガンド／受容体、免疫療法薬、例えば、ＡＺＴなど、ならびに血管新生および抗血管新生薬、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチン、および塩基性線維芽細胞成長因子、または血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
特に好ましい実施形態は、成分特異的免疫刺激剤と組み合わせて特異的抗原を含む薬剤を含むベクター組成物を用いて、免疫応答の活性化のための方法を提供する。本明細書で使用される場合、成分特異的免疫刺激剤は、ＢまたはＴ細胞などの免疫系の成分に特異的であり、成分が免疫応答における活性を有するような影響を成分に与えることができる薬剤を意味する。成分特異的免疫刺激剤は、免疫系のいくつかの異なる成分に影響を与えることができてもよく、この能力は、本発明の方法および組成物において使用され得る。薬剤は天然に存在してもよいし、あるいは分子生物学的技法またはタンパク質受容体操作によって産生または改変されることもできる。
【００９５】
免疫応答における成分の活性化は、免疫応答の他の成分の刺激または抑制をもたらし、疫系応答の全体の刺激または抑制を導くことができる。表現を容易にするために、本明細書では免疫成分の刺激が記載されているが、刺激、抑制、拒絶およびフィードバック活性を含むがこれらに限定されない免疫成分の全ての応答が、刺激という用語によって意図されることが理解される。
【００９６】
影響される免疫成分は複数の活性を有し、抑制および刺激の両方、またはフィードバック機構の開始もしくは抑制を導くこともできる。本発明は、本明細書中で詳述される免疫学的応答の例によって限定されるべきでないが、免疫系の全ての態様における成分特異的効果を意図する。
【００９７】
免疫系の成分のそれぞれの活性化は、同時、逐次、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。本発明の方法の１つの実施形態では、複数の成分特異的免疫刺激剤が同時に投与される。この方法では、免疫系は、成分特異的免疫刺激剤を含むベクター組成物をそれぞれが含有する複数の別個の調製物によって同時に刺激される。好ましくは、ベクター組成物は、コロイド金属に会合した成分特異的免疫刺激剤を含む。より好ましくは、組成物は、同一の大きさの粒子または種々の大きさの粒子のコロイド金属および抗原に会合した成分特異的免疫刺激剤を含む。最も好ましくは、組成物は、同一の大きさの粒子または種々の大きさの粒子のコロイド金属、抗原およびＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体に会合した成分特異的免疫刺激剤を含む。
【００９８】
成分特異的免疫刺激剤は、個々の免疫成分に対して特異的な刺激性上方制御効果を提供する。例えば、インターロイキン−１□（ＩＬ−１□）は、マクロファージを特異的に刺激するが、ＴＮＦ−□（腫瘍壊死因子α）およびＦｌｔ−３リガンドは樹状細胞を特異的に刺激する。熱殺菌マイコバクテリウム・ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）はＢ細胞の特異的な刺激因子であり、インターロイキン−２（ＩＬ−２）はＴ細胞の特異的な刺激因子である。このような成分特異的免疫刺激剤を含むベクター組成物は、それぞれ、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞の特異的な活性化を提供する。例えば、成分特異的免疫刺激剤ＩＬ−１□を含むベクター組成物が投与されると、マクロファージが活性化される。好ましい組成物は、コロイド金属と会合したＩＬ−１□であり、最も好ましい組成物は、コロイド金属および抗原と会合して、その抗原に特異的なマクロファージ応答を提供するＩＬ−１□である。ベクター組成物は、さらに、標的分子、統合分子、ＰＥＧまたは誘導体化ＰＥＧを含んでもよい。
【００９９】
免疫応答の多くの要素は、抗原に対する有効な免疫応答のために必要であり得る。同時刺激方法の実施形態は、１）マクロファージに対するＩＬ−１□、２）樹状細胞に対するＴＮＦ−αおよびＦｌｔ−３リガンド、３）Ｂ細胞に対するＩＬ−６、および４）Ｔ細胞に対するＩＬ−２を含む成分特異的免疫刺激剤の組成物の４つの別々の調製物を投与することである。それぞれの成分特異的免疫刺激剤ベクター組成物は、当業者に既知の任意の経路によって投与することができ、所望される免疫応答に応じて、全てが同じ経路を用いてもよいし、異なる経路を用いてもよい。
【０１００】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、個々の免疫成分は順次活性化される。例えば、この逐次的な活性化は、２つの相、プライマー相および免疫化相に分けることができる。プライマー相は、ＡＰＣ、好ましくはマクロファージおよび樹状細胞を刺激することを含み、免疫化相は、リンパ球、好ましくはＢ細胞およびＴ細胞を刺激することを含む。２つの相のそれぞれにおいて、個々の免疫成分の活性化は、同時でも逐次的でもよい。逐次的な活性化のために、活性化の好ましい方法は、マクロファージの活性化を生じた後に、樹状細胞の活性化、次にＢ細胞の活性化、そしてその次にＴ細胞の活性化を生じるベクター組成物の投与である。最も好ましい方法は、マクロファージおよび樹状細胞の同時活性化を生じた後に、Ｂ細胞およびＴ細胞の同時活性化を生じるベクター組成物の投与を含む、複合型の逐次的活性化である。これは、免疫系のいくつかの経路を開始するための、複数の成分特異的免疫刺激剤の方法および組成物の一例である。
【０１０１】
本発明の方法および組成物は、任意の型のワクチンの有効性を増強するために使用することができる。本発明の方法は、活性化のために特異的な免疫成分を標的とすることによってワクチンの有効性を増強する。コロイド金属および抗原と会合した成分特異的免疫刺激剤を少なくとも含むベクター組成物は、抗原と特異的な免疫成分（マクロファージ、ＢまたはＴ細胞など）との間の接触を増大させるために使用される。ワクチンが現在利用可能である疾患の例としては、コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、流行性耳下腺炎、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘−帯状疱疹、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）、および黄熱病が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０２】
所望の免疫応答を生じるために、抗原を免疫系に送達するための投与経路およびベクター組成物の組み合わせが使用される。また本発明は、免疫刺激性ベクター組成物の長期放出を提供し得るリポソーム、マイクロカプセル、またはミクロスフェアなどのパッケージング系の種々の組成物を含む方法および組成物も含む。これらのパッケージング系は、抗原を保持し、免疫系の活性化のために抗原をゆっくり放出するための内部貯蔵所として作用する。例えば、リポソームは、コロイド金属と結合または会合された抗原の薬剤および成分特異的免疫刺激剤を含むベクター組成物が充填され得る。さらなる組み合わせは、活性ワクチン候補であるウイルス粒子などの薬剤が埋め込まれるか、推定ワクチンのためのＤＮＡを含有するためにパッケージングされたコロイド金粒子である。またベクターは、サイトカイン、統合分子およびＰＥＧ誘導体、ＨＥＳ（登録商標）、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）またはｒＰＥＧなどの１つまたは複数の標的分子も含むことができ、ベクターは次に、ウイルスを特定の細胞に導くために使用される。さらに、２つ以上の潜在的なワクチン候補を標的とする融合タンパク質ワクチンを使用して、２つ以上の感染性微生物に対する保護を提供するベクター組成物ワクチンを提供し得る。また組成物は、材料をゆっくりと放出し得るポリエチレングリコールの付加によって化学修飾された免疫原を含み得る。
【０１０３】
金属粒子、および１つまたは複数の抗原および１つまたは複数の成分特異的免疫刺激剤を含む薬剤、および１つまたは複数の統合および標的分子、およびステルス剤（すなわち、ＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体、またはＨＥＳまたはＨＥＳの誘導体、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）またはＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）の誘導体、またはｒＰＥＧまたはｒＰＥＧの誘導体）を含む組成物は、リポソームまたは生分解性ポリマー内にパッケージングされ得る。ベクター組成物は、リポソームまたは生分解性ポリマーからゆっくり放出され、免疫系によって外来性として認識され、かつ成分特異的免疫刺激剤が方向付けられる特異的成分が、免疫系を活性化または抑制する。例えば、成分特異的免疫刺激剤の存在によって、免疫応答のカスケードがより急速に活性化され、免疫応答がより急速かつより特異的に生じる。
【０１０４】
本発明において意図されるその他の方法および組成物は、金属粒子ならびに抗原および成分特異的免疫刺激剤を含む薬剤の組成物の使用を含み、また統合および標的分子を含んでもよく、ここで、コロイド金属粒子は異なる大きさを有する。組成物はさらに、ＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体を含み得る。成分特異的免疫刺激剤の逐次的投与は、異なる大きさのコロイド金属粒子の使用によって、１用量の投与で達成され得る。１用量は複数の独立した成分特異的免疫刺激剤、抗原および異なる大きさまたは同じ大きさのコロイド金属粒子と会合され得る組み合わせを含む。従って、同時投与は免疫成分の逐次的な活性化を提供し、集団に対してより有効なワクチンおよびさらなる保護をもたらし得る。逐次的な活性化を有するこのような単一用量の投与のその他のタイプは、異なる大きさまたは同じ大きさのコロイド金属ベクター組成物、およびリポソームまたは生分解性ポリマーの組み合わせ、あるいは異なる大きさまたは同じ大きさのコロイド金属ベクター組成物が充填されたリポソームまたは生分解性ポリマーによって提供され得る。
【０１０５】
上記のようなワクチン接種系の使用は、１用量で投与され得るワクチンの提供において重要である。１用量の投与は、動物集団（家畜または動物の野生集団など）の処置において重要である。１用量の投与は、健康管理がほとんどなされていない集団（不十分な健康管理の貧困層、ホームレス、地方居住者または発展途上国の人々など）の処置において不可欠である。全ての国の多くの人々は、ワクチン接種などの予防タイプの健康管理を利用していない。結核などの感染症の再出現によって、１回だけ与えられても持続的に有効な保護を提供することができるワクチンに対する需要が高まっている。本発明の組成物および方法は、このような有効な保護を提供する。
【０１０６】
また、本発明の方法および組成物は、免疫応答の一部である成分を刺激または抑制することによって、免疫応答が生じる疾患を処置するために使用することもできる。このような疾患の例としては、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、ブルトン（Ｂｒｕｔｏｎ）症候群、癌（固形腫瘍および血液由来の腫瘍を含む）、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、後天性免疫不全症候群、移植片拒絶（腎臓、心臓、膵臓、肺、骨、および肝臓移植など）、グレーブス病、多腺性自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発性動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性エリテマトーデス、関節リュウマチ、血清反応陰性脊椎関節炎（ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｐｏｎｄｙｌａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ウェゲナー肉芽腫症、ヘルペス状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんま疹、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調証、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、および非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
本発明のベクター組成物は、成分特異的免疫刺激剤を含む薬剤を含む。組成物は、１つの成分特異的免疫刺激剤または複数の成分特異的免疫刺激剤を含み得る。ベクター組成物の好ましい実施形態は、コロイド金属と会合した成分特異的免疫刺激剤を含む薬剤を含む。より好ましい実施形態は、コロイド金属、および以下の、ＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体、またはＨＥＳまたはＨＥＳの誘導体、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）またはＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）の誘導体、またはｒＰＥＧまたはｒＰＥＧの誘導体、成分特異的免疫刺激剤（抗原、受容体分子、核酸、医薬品、化学療法薬、およびキャリアを含むがこれらに限定されない）の効果を特異的に標的化するための統合分子および標的分子の少なくとも１つに会合した、１つまたは複数の抗原および成分特異的免疫刺激剤を含む薬剤を含む組成物を含む。本発明の組成物は、任意の方法で免疫成分に送達され得る。１つの実施形態では、抗原および成分特異的免疫刺激剤を含む薬剤は、コロイド金属粒子が抗原および免疫刺激剤の両方に会合するような形で、コロイド金属に結合される。
【０１０８】
本発明は、種々の異なる送達プラットフォームまたはキャリアの組み合わせにおける、抗原および成分特異的免疫刺激剤などの薬剤の提示を含む。例えば、好ましい実施形態は、リポソームまたは生分解性ポリマーキャリア内で抗原および成分特異的免疫刺激剤などの薬剤に結合した金属コロイド粒子を含むベクター組成物の投与を含む。さらなる組み合わせは、ワクチン抗原であるか、あるいはワクチンのための抗原を産生する核酸を含有する生存可能なウイルス粒子であるウイルス粒子などの薬剤と会合したコロイド金粒子である。またベクター組成物は、ウイルスを特定の細胞に導くために使用されるサイトカインまたは選択される結合対メンバーなどの標的分子を含むことができ、さらに、本明細書において教示される統合分子またはＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体ＩＮＳＥＲＴ ＬＩＳＴＩＮＧなどの他の要素を含む。このような実施形態は、長期の応答のために抗原を免疫系にゆっくり放出するワクチン調製物を提供する。このタイプのワクチンは、１回のワクチン投与のために特に有利である。リポソームおよびマイクロカプセルを含むがこれらに限定されない全てのタイプのキャリアが本発明において意図される。
【０１０９】
毒性の低減およびワクチン投与
本発明は、因子が通常の濃度よりも高い濃度で存在しているときにヒトまたは動物に対して毒性である因子を投与するための組成物および方法を含む。一般に、本発明に従う組成物は、通常の濃度よりも高い濃度で薬剤が見出されるとヒトまたは動物に対して毒性である薬剤と組み合わせたコロイド金属の混合物であるか、あるいは遮蔽された形態よりも高い活性が可能である遮蔽されていない形態であるか、あるいは通常は見られない部位において見出されるベクター組成物を含む。ベクター組成物がヒトまたは動物に投与されると、コロイド金属ベクター組成物なしに薬剤が単独で提供される場合よりも、薬剤はヒトまたは動物に対して有害度が低いか、あるいは毒性が低いか、あるいは非毒性である。組成物は、場合により、水溶液、または賦形剤、緩衝剤、抗原安定剤、または滅菌キャリアなどの薬学的に許容可能なキャリアを含む。また、パラフィン油などの油が、場合により、組成物中に含まれてもよい。ベクター組成物は、さらに、ＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体を含むことができる。さらに、ベクター組成物は、ＨＥＳ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、ｒＰＥＧ、またはＨＥＳ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、ｒＰＥＧの誘導体、例えば、ＨＥＳ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、ｒＰＥＧのチオール化誘導体を含み得る。
【０１１０】
本発明の組成物は、注射されると毒性である薬剤に対してヒトまたは動物にワクチン接種するために使用することができる。さらに、本発明は、サイトカインまたは成長因子などの薬剤を含む組成物を投与することによって、サイトカインまたは成長因子で特定の疾患を処置するために使用することができる。薬剤をヒトまたは動物に投与する前に薬剤をコロイド金属と混合することによって、薬剤の毒性が低減または除去され、それにより、因子がその治療効果を発揮できるようになる。ベクター組成物中のコロイド金属とこのような薬剤との組み合わせは治療結果を維持または増大しながら毒性を低減し、それにより、より高濃度の薬剤が投与されるので、あるいは異なる薬剤の組み合わせの使用が可能になることによって、効力が改善される。従って、ベクター組成物中の薬剤と組み合わせてコロイド金属を使用すると、通常の濃度よりも高い濃度の薬剤の使用、あるいは通常はその毒性のためにヒトまたは動物に投与するために使用できない薬剤の投与が可能になる。好ましくは、ベクター組成物はさらに、１つまたは複数のタイプまたは大きさのＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体、またはＨＥＳまたはＨＥＳの誘導体、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）またはＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）の誘導体、またはｒＰＥＧまたはｒＰＥＧの誘導体を含む。
【０１１１】
本発明の１つの実施形態は、コロイド金属と会合した薬剤を含むベクター組成物を、ワクチン調製物として使用するための方法を含む。このようなワクチンの多数の利点の中には、通常は毒性の薬剤の毒性の低減がある。薬剤に対してワクチンとして使用されるベクター組成物は、任意の方法によって調製することができる。例えば、薬剤およびコロイド金属の混合物のベクター組成物は、好ましくは、適切な動物に注射される。例えば、約２〜５キログラムの体重のウサギは、コロイド金および薬剤、１ｍｇのサイトカイン、ＩＬ−１またはＩＬ−２のいずれかを含む組成物を２週間ごとに投与された後、顕著な副作用がなかった。薬剤は本発明に従って投与される場合には毒性でないので、抗原として機能できる最適な量の薬剤を動物に投与することができる。本発明に従うベクター組成物は単回用量で投与されてもよいし、あるいは適切な時間スケールにわたって間隔をあけて複数回用量で投与されてもよい。複数回用量は、二次免疫応答の発生において有用である。例えば、抗体価は、月に１回追加免疫を投与することによって維持される。
【０１１２】
ワクチン組成物はさらに、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、リポ多糖、モノホスホリルリピドＡ、ムラミルジペプチド、リピドＡを含有するリポソーム、ミョウバン、ムラミルトリペプチド−ホスファチジルエタノールアミン、キーホールリンペットヘモシアニンを含むがこれらに限定されない薬学的に許容可能なアジュバントを含んでもよい。動物のために好ましいアジュバントはフロイント不完全アジュバントであり、ヒトのために好ましいのはミョウバンであり、好ましくは、コロイド金属および活性剤を含む組成物によって１：１で希釈される。
【０１１３】
本発明の組成物の好ましい使用方法は、少なくとも１つの薬剤と混合されたコロイド金属を含む有効な量のベクター組成物をヒトまたは動物に投与することを含み、ここで、組成物は、薬剤の単独またはコロイド金属を含まない組成物中での投与と比較した場合に、ヒトまたは動物に投与される際により低毒性であるかまたは非毒性であり、あるいは副作用がより少ないかまたはより軽い。本発明に従うベクター組成物は、通常は毒性の物質に対してワクチンとして投与することもできるし、あるいは通常は毒性の薬剤の毒性が低減された治療剤であることもでき、それにより、より長い期間にわたってより多量の薬剤の投与が可能になる。
【０１１４】
これらの実施形態の実施において、組成物が投与される経路は重要ではないと考えられる。本発明に従って組成物が投与され得る経路には、皮下、筋肉内、腹腔内、経口、および静脈内経路を含むがこれらに限定されない既知の投与経路が含まれる。好ましい投与経路は静脈内である。別の好ましい投与経路は筋肉内である。
【０１１５】
例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）は腎臓癌の処置において有意な治療結果を示すことが知られている。しかしながら、ＩＬ−２の投与の毒性の副作用はかなりの数の患者の死をもたらす。対照的に、少なくともＩＬ−２およびコロイド金属を含むベクター組成物が投与される場合、毒性はほとんどまたは全く観察されず、レシピエントにおいて強力な免疫応答が生じる。ＩＬ−２治療のためにこれまで使用された用量は、７０ｋｇのヒトについて１日あたり約２１ｘ１０６ユニットのＩＬ−２（７０ｋｇのヒトについて１日３回、７ｘ１０６ユニットのＩＬ−２）であった。１ユニットは約５０ピコグラムに等しく、２ユニットは約０．１ナノグラムに等しいので、２０ｘ１０６ユニットは１ミリグラムに等しい。本発明の１つの実施形態では、ウサギに与えたＩＬ−２の量は、ウサギの体重３ｋｇにつき約１ｍｇである。実際には、本明細書に記載される薬剤の投与の効果の研究には、これまでヒトに与えられていた用量よりも２０倍を超えて多い用量が含まれていた。
【０１１６】
ＩＬ−２（１ｍｇ／３ｋｇの動物）を３日毎に２週間の間３匹のウサギに投与した別の実施形態では、動物は全て臨床的に病気であるように見え、動物のうちの２匹は、ＩＬ−２の明らかな毒性効果により死亡した。コロイド金を含むベクター組成物中で同じ用量のＩＬ−２を使用し、同じく２週間の間３匹のウサギに投与した場合には、毒性は観察されず、３匹全ての動物において有意な抗体応答が得られた。本明細書中で使用される「陽性抗体応答」は、直接ＥＬＩＳＡによって決定されるように、免疫化後の出血を予備免疫の出血と比較して、特異的抗体反応性の３〜４倍の増大として定義される。直接ＥＬＩＳＡは、ＩＬ−２をマイクロタイタープレート上に結合させ、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧによりプレート上のＩＬ−２に結合したＩｇＧの量を決定することによって行われる。従って、ＩＬ−２の生物学的効果が残存していると考えられる。毒性効果が最小限にされているので、より大きくより有効な免疫応答が必要とされる場合には、必要に応じてより高濃度のＩＬ−２を投与することができる。
【０１１７】
本発明は、１つまたは複数の薬剤およびコロイド金属を含むベクター組成物を投与することによって疾患を処置するための方法を含む。ベクター組成物は、さらに、ＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体を含むことができる。投与の後、薬剤はコロイド金属から放出されると理論付けられる。いずれの理論によっても束縛されることは望まないが、放出は単に循環時間の関数でなく、平衡速度論によっても制御されると考えられる。
【０１１８】
コロイド金属および少なくとも１つの薬剤を少なくとも含むベクター組成物を細胞と共に２５日間インキュベートしたときに、コロイド金属から薬剤のわずか５％しか放出されないことが観察された。従って、循環時間だけでは、薬剤がインビボで複合体から放出されるメカニズムを説明できないと理論付けられる。しかしながら、放出される薬剤の量は、部分的に、体内の複合体の濃度に関連することが分かっている。組成物の種々の希釈物を分析（ＣｙｔＥＬＩＳＡＴＭ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ＣｙｔＩｍｍｕｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）したときに、複合体のより薄い溶液は、著しく多い量の薬剤を放出することが分かった。例えば、複合体の１：１００希釈では薬剤は本質的に放出されなかったが、組成物の１：１００，０００希釈では、３５０００ｐｇを超える薬剤が放出された。
【０１１９】
従って、より多量の溶液中で組成物の濃度が低くなるほど、より多量の薬剤が放出される。組成物の濃度が高くなるほど、より少量の薬剤が放出される。従って、血液および細胞外流体によるインビボでの組成物の連続的な希釈のために、これまでに知られている方法によって投与できる用量よりも低用量の薬剤を患者に投与することによって同じ治療効果を達成することが可能であると理論付けられる。
【０１２０】
また、本発明の組成物から放出される薬剤の量は、コロイド金属に最初に結合される薬剤の量に関連することも理論付けられる。より多量の薬剤が最初に結合されたベクター組成物からインビボでより多くの薬剤が放出される。従って、当業者は、コロイド金属に最初に結合される薬剤の量を変化させることによって、送達される薬剤の量を制御し得る。
【０１２１】
これらの合わせた特性は、多量の薬剤をコロイド金属に結合させることができる方法を提供し、それにより、単独で投与される場合よりも薬剤の毒性が低くされる。次に、少量のベクター組成物を患者に投与することができ、複合体からの薬剤のゆっくりとした放出が得られる。これらの方法は、癌および免疫疾患などの疾患の処置のためのより長期間にわたる低用量の薬剤を提供する。
【０１２２】
本発明の組成物は、癌、固形腫瘍および白血病などの血液由来の癌の両方、関節リュウマチなどの自己免疫疾患、骨粗鬆症などのホルモン欠損症、先端巨大症などの分泌過多に起因するホルモン異常、敗血症性ショックなどの感染症、酵素欠損症（例えば、フェニルケトン尿症を生じるフェニルアラニンの代謝の不能）などの遺伝子疾患、ならびにＡＩＤＳなどの免疫不全疾患を含むがこれらに限定されない複数の疾患の処置のために有用である。
【０１２３】
本発明の方法は、現在使用されている治療的処置レジメンに加えて、ベクター組成物の投与を含む。好ましい方法は、慢性および急性疾患の処置、特に癌の処置のための治療薬の投与と同時に、ベクター組成物の投与を含む。例えば、薬剤のＴＮＦを含むベクター組成物は、抗血管新生タンパク質（エンドスタチンおよびアンジオスタチン、サリドマイド、タキソール、メルファラン、パクリタキセル、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、アシクロビル、シスプラチンおよびタクリンなど）などの既知の抗癌剤による化学療法的処置の前、最中、後に投与される。現在知られている癌の処置方法は全て、本発明において意図されており、ベクター組成物は、癌の有効な処置のために必要に応じて処置スケジュールの様々な時点で投与され得る。
【０１２４】
好ましい方法は、薬物耐性腫瘍、癌または新生物の処置を含む。これらの腫瘍は既知の抗癌薬および抗癌治療に対して耐性であり、このような薬剤の投薬量を増大させても、腫瘍の大きさまたは成長に対する効果はほとんどまたは全くない。このような薬物耐性腫瘍細胞のＴＮＦへの曝露が、これらの化学療法の抗癌効果に対してこれらの細胞を再感作させるという観察は、癌処置において知られている。ドキソルビシンなどのトポイソメラーゼＩＩを標的とする挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｖｅ）薬物と協同して、ＴＮＦがドキソルビシン腫瘍細胞死を回復させることを示す証拠が公表されている。また、インターフェロン（ＩＦＮ）は５−フルオロウラシルと協同して、５−フルオロウラシルの化学療法活性を増大させることが知られている。本発明は、このような薬物耐性腫瘍を処置するために使用することができる。好ましい方法は、コロイド金に結合されたＴＮＦおよび誘導体化ＰＥＧを有するベクターを含む組成物の投与を含む。無症状の用量のＴＮＦ−ｃＡｕ−ＰＴで患者を前処置することにより、腫瘍はＴＮＦベクターを隔離して、次の全身性化学療法に対して細胞を感作させる。このような化学療法剤としては、ドキソルビシン、他の介在化学療法剤、タキソール、５−フルオロウラシル、ミタキサントロン（ｍｉｔａｘａｎｔｒｏｎｅ）、ＶＭ−１６、エトポシド、ＶＭ−２６、テニポシド、および他の非介在化学療法剤が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、別の好ましい方法は、ＴＮＦおよび癌の処置に有効な少なくとも１つの他の薬剤を有するベクターを含む組成物の投与を含む。例えば、ＰＴ−ｃＡＵ（ＴＮＦ）ドキソルビシンベクターは、薬物耐性腫瘍または癌を有する患者に投与される。投与される量は、処置すべき腫瘍および患者の状態に依存する。ベクター組成物はより多量の化学療法剤の投与を可能にし、またベクターは腫瘍の薬物耐性特性も軽減する。
【０１２５】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明され、これらの実施例は、決してその範囲に制限を課すると解釈されてはならない。むしろ逆に、様々な他の実施形態、修正およびこれらの等価物を有し得る手段、そして本明細書の説明を読んだ後に、本発明の趣旨および／または添付の特許請求の範囲から逸脱することなくこれら自体を当業者に示唆し得る手段があり得ることは、明確に理解されるべきである。
【実施例】
【０１２６】
実施例１
コロイド金ゾルの調製
コロイド金は、クエン酸ナトリウムなどの薬剤によりクロロ金酸（Ａｕ＋３、ＨＡｕＣＵ４）を中性金（Ａｕ０）に還元することによって生成される。Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ （１９７９）によって記載される方法を適用して、３４ｎｍのコロイド金粒子を生成した。この方法は、コロイド金の生成のための簡単でスケーラブルな手順を提供した。簡単に言うと、４％の塩化金溶液（２３．０３％のストック、ｄｍｃ２、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）および１％のクエン酸ナトリウム溶液（ｗｔ／ｗｔ、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ、ケンタッキー州パリス）を脱イオンＨ２Ｏ（ＤＩＨ２Ｏ）中で作った。３．７５ｍｌの塩化金溶液を１．５ＬのＤＩＨ２Ｏに添加した。この溶液を激しく攪拌し、還流下でローリングボイル（ｒｏｌｌｉｎｇ ｂｏｉｌ）させた。６０ｍｌのクエン酸ナトリウムの添加によって、３４ｎｍのコロイド金粒子の形成を開始させた。以下に記載されるように、粒子の形成および成長の全プロセスの間、溶液を連続的に沸騰させ、撹拌した。
【０１２７】
塩化金へのクエン酸ナトリウムの添加により、最初の塩化金溶液の色の変化を特徴とする一連の還元反応が開始した。クエン酸ナトリウムを添加すると、塩化金溶液の色は黄金色から黒／青の中間色に変化した。反応の完了は、青／黒色から鮮紅色へのゾルの最終的な色の変化によって示された。最終的な色の変化の後、溶液を還流下でさらに４５分間連続的に撹拌し、沸騰させた。続いて、ゾルを室温まで冷却して、０．２２□ｍの硝酸セルロースフィルターによりろ過し、使用するまで室温で保存した。
【０１２８】
コロイド金粒子の形成は、核形成および粒子成長の２段階で起こる。クエン酸ナトリウムによるＡｕ＋３からＡｕ０への還元によって、粒子の核形成を開始させた。この工程は、鮮黄色から黒色への塩化金溶液の色変化によって特徴付けられる。遊離Ａｕ＋３のＡｕ０核上への連続的な層形成によって第２段階の粒子成長が促進される。粒径は、塩化金溶液に添加されるクエン酸の量に反比例し、一定量の塩化金に対してクエン酸ナトリウムの量を増大させると、より小さい粒子の形成が起こり、金溶液に対して添加されるクエン酸の量を減少させると、比較的大きい粒子の形成が起こる。
【０１２９】
核形成反応と同様に、コロイド金粒子の形成も溶液の色の変化と相関している。しかしながら、最初の反応とは違って、この第２の色変化は粒径に直接的に関係する。小さい粒子（すなわち、１２〜１７ｎｍ）が作られる場合、ゾルは色がオレンジ〜赤であり、中間の大きさの粒子（すなわち、２０〜４０ｎｍ）が作られる場合、ゾルは色が赤〜ワイン色に見え、そして大きい粒子（すなわち、６４〜９７ｎｍ）が作られる場合、ゾルは色が紫〜茶色に見える。反応物の激しい撹拌は、粒子の核生成および成長の両方にとって重要であった。プロセス中のどの工程においても、不適切な攪拌は、予測した直径よりも大きい不均一な粒子の形成をもたらした。
【０１３０】
コロイド金調製物のＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）およびデュアルアングル光散乱の照合によって、コロイド金調製物中の粒子の大きさが、その理論的な大きさの３４ｎｍに非常に近いことが明らかになった。粒子は、３４〜３６ｎｍの平均粒径および平均して０．１１の多分散性測定値を有する大きさで均一であった（表ＩＶ）。この状態で、コロイド金粒子は、それぞれの粒子の表面に存在する負の荷電によるその相互の静電反発力によって懸濁液内に留まった。塩溶液（すなわち、１％ｖ／ｖの最終濃度のＮａＣｌ）へこれらの裸の粒子を曝露すると、粒子は凝集されて、最終的には溶液から沈殿された。タンパク質（例えば、ＴＮＦ）または他の薬剤を粒子表面に結合させることによって、このプロセスを妨害または阻止した。
【０１３１】
実施例２
金属源
コロイド形成のための出発金反応物の供給源がコロイド金組成物に影響するかどうかを見るために、実験を実施した。塩化金は、２つの異なる商業的供給源：Ｄｅｇｕｓｓａ Ｍｅｔａｌｓ Ｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｃｅｒｄｅｃ（ｄｍｃ２）およびＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（以下シグマ社）から購入した。両方の金調製物を、汚染金属および他の物質の存在について分析した。これらの研究からの結果は表ＩＩに記載される。各調製物中の金濃度は報告された値の範囲内であったが、シグマ社製調製物がより高レベルのＭｇ、ＣａおよびＦｅを含有することは明らかである。
【０１３２】
【表２】
【０１３３】
粒子のＴＥＭによって、シグマ社製およびｄｍｃ２社製からの異なる塩化金源で製造された粒子の間のさらなる差異が明らかになった。コロイド金ゾルを上記のように製造し、ＴＥＭを使用して観察した。冷却後、１０ｍｌのゾルを遠心分離して、粒子を濃縮した。得られた上澄みを吸引によって除去し、穏やかな粉砕によってコロイド金ペレットを再懸濁した。標準的手順に従って、ペレットを透過型電子顕微鏡のために調製した。
【０１３４】
シグマ社製塩化金で製造した粒子は半透明であり、明白な条線を有する。条線は、上記で同定されたものなどの微量の汚染物の存在によるものであると報告されている。対照的に、ｄｍｃ２塩化金で製造した粒子は電子密度が高く、条線が非常に少ない。
【０１３５】
実施例３
シグマ社製およびｄｍｃ２社製の塩化金を用いたコロイド金ゾルの生成
上記のデータは、ｄｍｃ２社製の塩化金が、より低いレベルの汚染元素を含有することを示唆した。これら２つの定性的に異なる塩化金源の効果を決定するために、２つの異なる塩の源を用いてコロイド金ゾルを生成した。コロイド金粒子を形成するための手順は、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒによって最初に記載され、実施例１に記載された手順に従う。簡単に言うと、ｄｍｃ２社製およびシグマ社製ストック調製物から４％の塩化金の（水）溶液を作った。３．７５ｍｌの各溶液を、１．５Ｌの水をそれぞれが含有する個々のフラスコへ添加した。溶液をローリングボイルさせ、還流下で沸騰を続け、そして激しく攪拌した。２２．５ｍｌの１％クエン酸ナトリウム溶液を各フラスコへ添加した。十分に記載されたコロイド金の形成のプロセスが完了する（金から黒、鮮紅色への色の変化によって示される）まで、両フラスコ中の溶液を沸騰させ続けた。ゾルが鮮紅色に変化したら、一様に攪拌しながらさらに４５分間、還流下で沸騰させた。冷却後、０．２２□ｍのニトロセルロースフィルターによりゾルをろ過し、使用するまで室温で保存した。
【０１３６】
２つのゾルの定性的な比較は、標準的な実験室の分光光度計を用いてＵＶ／ＶＩＳ波長スキャンで作動させて行った。結果は、ゾルが最大吸光度を示す波長によって示されるように、ゾルの２つのバッチが同様の平均直径を有するコロイド金粒子を含有することを明らかにした。しかしながら、２つの調製物の間の最も顕著な相違は、ｄｍｃ２社製材料で製造したゾルがシグマ社製材料で製造したゾルの３倍の粒子数を有することであった。さらに、ｄｍｃ２社製調製物よりもシグマ社製調製物のほうが最大λの周囲の分布が広いことが明らかになり、Ｓｉｇｍａ塩を用いて生成された粒子が、ｄｍｃ２社製塩化金を用いて生成された粒子よりも不均一であることが示された。
【０１３７】
実施例４
コロイド金ゾルの分析的比較
Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒを用いる定量的な粒子のキャラクタリゼーションよって、上記の定性的な相違を確認した。これらの研究について、製造業者の指示書に従って、各金源からの粒子のサンプルを調製した。データは以下の表ＩＩおよび表ＩＩＩに示される。このデータによって、両調製物中の粒子はほぼ同じ大きさ（３４〜３７ｎｍ）であることが確認された。それにもかかわらず、ｄｍｃ２社製材料で製造したゾルは、シグマ社製材料で製造したゾルよりも３倍高い粒子密度を有する。さらに、シグマ社製塩化金調製物で製造した粒子は、ｄｍｃ２社製材料で製造した粒子よりも２．５倍不均一である（すなわち、その多分散性についてより大きな値を有する）（表ＩＶ）。
【０１３８】
【表３】
【０１３９】
【表４】
【０１４０】
実施例５
最適結合ｐＨの決定
タンパク質のコロイド金への結合は、コロイド金およびタンパク質溶液のｐＨに依存することが知られている。ＴＮＦのコロイド金ゾルへの最適結合ｐＨを経験的に決定した。この最適ｐＨは、ＴＮＦのコロイド金粒子への結合を可能にするが、塩誘発性（ＮａＣｌによる）の粒子の沈殿を妨害するｐＨであると定義した。裸のコロイド金粒子は、表面の正味の負電荷によって生じるその相互の静電反発力によって懸濁液中に保持される。塩溶液中に存在するカチオンは、通常は互いに反発する負に荷電したコロイド金粒子を引き付ける。この凝集／沈殿は、赤から紫（粒子が引き付けられたとき）、そして最終的には、粒子が最終的に溶液から析出する大きな凝集物を形成した場合の黒色への、コロイド金溶液の目に見える色の変化によって示される。タンパク質または他の安定剤の粒子表面への結合は、コロイド金粒子のこの塩誘発性の沈殿を妨害し得る。
【０１４１】
ＴＮＦのコロイド金への結合の最適ｐＨは、１ＮのＮａＯＨによりそのｐＨをｐＨ５〜１１（ｐＨ片を用いて決定）に調整した２ｍｌのアリコートの３４ｎｍのコロイド金ゾルを用いて決定した。ＴＮＦ（Ｋｎｏｌｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、均一になるまで精製）をｄｉＨ２Ｏ中で１ｍｇ／ｍｌの濃度に再構成し、さらに３ｍＭのＴＲＩＳ塩基中で１００μｇ／ｍｌまで希釈した。ＴＮＦの最適結合ｐＨを決定するために、ｌ００μｌの１００μｇ／ｍｌのＴＮＦストックを、ｐＨ調整されたコロイド金の種々のアリコートに添加した。ＴＮＦをコロイドと共に１５分間インキュベートした。続いて、１００μｌの１０％ＮａＣｌ溶液を各アリコートに添加し、粒子の沈殿を誘発した。最適結合ｐＨは、ＴＮＦをコロイド金粒子に結合させるが、塩による粒子の沈殿は防止されるｐＨであると定義した。
【０１４２】
実施例６
飽和結合研究
ｐＨ結合研究から得られたデータに基づいて、１ＮのＮａＯＨを用いて３４ｎｍのコロイド金ゾルのｐＨをｐＨ８に調整した。ゾルを１ｍｌのアリコートに分割し、これに、増加する量（０．５〜４μｇのＴＮＦ）の１００μｇのＴＮＦ／ｍｌ溶液を添加した。１５分間結合させた後、７５００ｒｐｍで１５分間サンプルを遠心分離した。上澄みの１０μｌのサンプルを、９９０μｌのＥＩＡアッセイ希釈剤（ＴＮＦ測定のための市販のＥＩＡキットの一部として提供される、ＣｙｔＩｍｍｕｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ロックビル）に添加した。上澄みの残りを吸引によって除去し、コロイド金ペレットをＰＥＧ１４５０／ｄｉＨ２Ｏ溶液（ｐＨ８）中でその最初の体積に再懸濁した。１０μｌの再懸濁ペレットを９９０μｌのＥＩＡアッセイ希釈剤に添加した。再構成ペレットおよび上澄み溶液を連続的に希釈し、市販の定量的ＥＩＡ（ＣｙｔＩｍｍｕｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ、メリーランド州ロックビル）によってＴＮＦ濃度について分析した。
【０１４３】
ｐＨ結合研究からのデータを用いて、５０ｍｌのコロイド金のｐＨを８．０〜９．０の間に調整した。このｐＨにおいて、ＴＮＦの一定体積のコロイド金への結合は飽和速度論を示した（図２）。図２に示されるように、０．５μｇのＴＮＦ／ｍｌの金ゾルでは、実質的に全てのＴＮＦがコロイド金粒子に結合され、上澄み中にはわずかな量（２〜５％）が遊離ＴＮＦとして存在した。このコロイド金−ＴＮＦ複合体は塩の存在下で沈殿し、この濃度のＴＮＦは、コロイド金粒子を十分にコーティングせず、ＴＮＦの飽和用量未満であることが示された。ＴＮＦ濃度を増大することによって、コロイド金粒子に結合されたＴＮＦの量は次第に増大し、上澄み中に測定される遊離ＴＮＦの量は比較的あまり変化しなかった。粒子結合ＴＮＦのこの増大は、塩誘発性の沈殿に対する粒子の安定性の増大に相応した。ＴＮＦによるコロイド金粒子の飽和は、粒子の表面上の全ての結合部位がＴＮＦにより結合されたときに生じた。コロイド金粒子の飽和は４μｇ／ｍｌの結合濃度で生じた（図２）。４μｇ／ｍｌを超える用量での結合は、上澄み中で測定される遊離ＴＮＦの量の増大をもたらした。
【０１４４】
図２には、ＴＮＦのコロイド金への飽和結合が示される。５０ｍｌの３４ｎｍのコロイド金ゾルのｐＨを、１ ＮａＯＨを用いて８に調整し、次に、１ｍｌのアリコートに分割した。増加する体積のストックＴＮＦ（３ｍＭのＴＲＩＳ中、１００μｇ／ｍｌ）溶液をアリコートに添加し、１５分間結合させた。サンプルを７５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水ミルク溶液（アッセイ希釈剤）中に、１０□ｌの上澄みのサンプルを希釈した。上澄みの残りを吸引により除去し、穏やかな粉砕によってコロイド金ペレットを再懸濁した。１０μｌの再懸濁ペレットをアッセイ希釈剤に希釈した。ペレットおよび上澄みサンプルの両方を連続的に希釈し、ＥＩＡ（ＣｙｔＩｍｍｕｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）によってＴＮＦ濃度を測定した。
【０１４５】
実施例７
種々のコロイド金ベクターのラージスケール製造
コロイド金−ＴＮＦ粒子（ベクターとも呼ばれる）のインビボ評価は、全ての製造手順のスケールアップを必要とした。コロイド金の大型（８Ｌ）バッチを上記のように製造した。コロイド金ゾルの製造手順は、８Ｌのコロイド金の製造に適合させた。還流装置（Ｋｏｎｔｅｓ Ｇｌａｓｓ、ニュージャージー州バインランド）を用いて、インビボの実験のために８Ｌのコロイド金を生成した。簡単に言うと、８ＬのｄｉＨ２Ｏをローリングボイルまで加熱した。１つのポートを介して２０ｍｌの塩化金を添加した後、３２０ｍｌのクエン酸ナトリウムを添加した。得られたゾルの色変化は、より少ない調製物で見られたものと同一であった。鮮紅色に達したら、ゾルを一晩冷却させ、次に上記のように滅菌ろ過した。
【０１４６】
ラージスケール量を用いて製造した粒子は、ベンチスケール法を用いて製造した粒子と本質的に同一であった。表Ｖを参照されたい。
【０１４７】
【表５】
【０１４８】
次に、コロイド粒子の均一なコーティングを達成しなければならなかった。コロイド金粒子とＴＮＦ分子との間の結合はほとんど瞬間的であることが分析により実証されたので、これは重要な検討事項であった。従って、濃縮したタンパク質溶液を大量の金に単に添加すると、ＴＮＦにより異なって被覆された粒子が生じ得る。粒子とＴＮＦ分子との相互作用を最適化するために、コロイド金ゾルとＴＮＦ溶液との間の完全な相互作用を可能にする装置を使用した。装置の概略図は図１に示される。装置は、各成分を小さい混合チャンバ（Ｔ型コネクタ）内に引き出すことによって、裸のコロイド金粒子とＴＮＦとの間の混合体積を減少させた。コロイド金粒子およびＴＮＦ溶液は、コロイド金粒子およびＴＮＦタンパク質を２つの大型リザーバーから引き出す単一のぜん動ポンプによってＴ型コネクタ内に物理的に引き出した。適切な混合をさらに保証するために、インラインミキサー（Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、イリノイ州バーノンヒルズ）をＴ型コネクタのすぐ下流に配置した。ミキサーはコロイド金粒子をＴＮＦと激しく混合し、これらは両方とも、約１Ｌ／分の流速でコネクタを通って流動した。
【０１４９】
混合の前に、１ＮのＮａＯＨを用いて金ゾルのｐＨをｐＨ８に調整し、組換えヒトＴＮＦを３ｍＭのＴｒｉｓ中で再構成および調製した。滅菌した閉鎖管系を用いて溶液をそのそれぞれの滅菌リザーバーに添加した。等量のコロイド金ゾルおよびＴＮＦ溶液を適切なリザーバーに添加した。金およびＴＮＦ溶液は等量で混合したので、各試験ベクターの開始ＴＮＦ濃度は、最終濃度の２倍であった。例えば、４Ｌの０．５μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦ溶液を作るために、２Ｌのコロイド金を金リザーバーに入れ、２Ｌの１μｇ／ｍｌＴＮＦ溶液をＴＮＦ容器に添加した。
【０１５０】
溶液をそのリザーバーに適切に装填したら、ぜん動ポンプを作動させ、ＴＮＦおよびコロイド金溶液をＴ型コネクタ内に引き出し、インラインミキサーを通り、ぜん動ポンプを通って、大型捕集フラスコ内に入れた。得られた混合物を捕集フラスコ内で１５分間攪拌した。この結合工程の後、配合物のそれぞれから１ｍｌのサンプルを採取し、塩の沈殿について試験した。１．０μｇ／ｍｌおよび４．０μｇ／ｍｌの調製物を以下に記載されるように処理し、第３の溶液、第２の０．５μｇ／ｍｌ調製物は、ｍＰＥＧ−チオール５０００（ｄｉＨ２Ｏ中の１５０□ｇ／ｍｌストックの１０％ｖ／ｖ添加）を１５□ｇ／ｍｌの最終濃度で添加することによって処理した。この第３の溶液、ＰＥＧ−チオール−コロイド金−ＴＮＦ（ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ）溶液をさらに１５分間インキュベートした。２つのその他のＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ配合物は、ＰＥＧ−チオールの２００００および３００００ＭＷ形態を用いて作った。これらの研究の間、ＰＥＧ−チオール／裸コロイド金または４□ｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターを含む比較のために付加的な対照を試験した。
【０１５１】
５００００ＭＷＣＯ ＢＩＯＭＡＸダイアフィルトレーションカートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、イリノイ州シカゴ）によるダイアフィルトレーションによって、各調製物中のコロイド金結合ＴＮＦを遊離ＴＮＦから分離した。透過液（すなわち、遊離ＴＮＦ）のアリコートを除去し、ＴＮＦ決定のために取り置いた。質量バランスの決定のために、透過液の総体積を測定した。ＴＮＦ結合コロイド金を含有する残余分を０．２２ミクロンのフィルタにより滅菌ろ過し、ＴＮＦ分析のために１０□ｌのアリコートを採取した。残余分の残りを保存のために−８０℃で凍結した。ＴＮＦ濃度の決定に続いて、天然型ＴＮＦの溶液を３ｍＭのＴｒｉｓ中で製造し、インビボ研究のための対照として使用した。
【０１５２】
実施例８
コロイド金ＴＮＦベクターの初期配合物
このシリーズの実験は、コロイド金ＴＮＦベクターのインビボ生物活性に対する種々のＴＮＦ：コロイド金の結合比の効果を決定するために設計した。ＴＮＦ結合対コロイド金飽和曲線から得られたデータに基づいて、コロイド金ＴＮＦベクターの３つの異なる配合物を製造した。１、２または４μｇのＴＮＦ／ｍｌのコロイド金溶液でＴＮＦを結合させることによって３つのベクターを生成させた。これらの３つのベクターは、塩の添加後にコロイドであり続ける能力が異なった。塩溶液を添加すると、１μｇ／ｍｌのベクターは即座に沈殿した（すなわち、コロイドの色が鮮紅色から黒色に変化した）。対照的に、２μｇ／ｍｌベクターの色は赤から紫色に変化し、コロイド金粒子の凝集が示された。最後に、４μｇ／ｍｌ調製物は塩の添加後も赤色のままであり、粒子がコロイドのままであり、相互作用しないことが示された。１および２μｇ／ｍｌベクター中の粒子のコロイド性質は、その塩への曝露によって変化されたが、正常なヒト血漿とインキュベートしたときにこれらは安定なままであった。これらのデータによって、血漿因子（可能性が最も高いのは、血液由来のタンパク質）は粒子に結合し、これを沈殿に対して即座に安定化することが示唆された。従って、これらのベクターを血液にさらすと、その沈殿が防止され、そのインビボでの調査が可能になる。
【０１５３】
３つのｃＡｕ−ＴＮＦベクターおよび天然型ＴＮＦの比較安全性の研究は、ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいて行った。天然型ＴＮＦの毒性プロファイルは用量依存性であった。５μｇの天然型ＴＮＦ／マウスは、注射の１〜２時間以内に、立毛および下痢を引き起こした。天然型ＴＮＦの用量を増大させると、より深刻な毒性が観測された。１５マイクログラムのＴＮＦ／マウスの用量では、動物の５０％が低体温および無応答になり、そして最終的には、２４時間以内に死亡した。以下の毒性評点スケール：０＝正常な活動、１＝立毛、２＝軟便、３＝嗜眠、４＝無応答、および５＝死亡を用いて、注射後の異なる時点でマウスをスコア化した。
【０１５４】
インビトロ生物検定法ではこれらの３つのｃＡｕ−ＴＮＦベクターは天然型ＴＮＦ調製物と生物学的に類似しているが、Ｃ５７／ＢＬ６−ＭＣ−３８腫瘍モデルにおいて、その毒性プロファイルは全く異なっていた。ＴＮＦの初期結合濃度を１．０から４．０μｇ／ｍｌに増大させると、ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの相対安全性が増大された（図３Ａ）。１５μｇの天然型ＴＮＦを注射したマウスは、５０％の死亡率を有した。１．０μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターの１５μｇの注射も、５０％の死亡率を生じた。対照的に、２．０μｇ／ｍｌで結合した１５μｇのｃＡｕ−ＴＮＦを受けたマウスは、２５％の低下した死亡率を有した。最後に、１５μｇの４．０μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦ調製物を注射したマウスはいずれも死亡しなかった。この最後の動物群は一時的な毒性だけを示し、これは、処置の８時間以内に消失した。
【０１５５】
図３Ａは、ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの安全性に対するＴＮＦ：金結合比の効果を示す。コロイド金粒子の相対的なＴＮＦ飽和度に基づいて、３つの異なるコロイド金ＴＮＦベクターを生成した。ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝４／群）に、１５μｇの天然型ＴＮＦ（金ベクターに結合していない）、または３つのｃＡｕ−ＴＮＦベクターのいずれかを静脈注射した。記載した毒性評点スケールを用いて、注射後の種々の時点でマウスをスコア化した。処置に対する生存パーセントは、天然型ＴＮＦ＝５０％、１μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター＝２５％、２□ｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター＝７５％および４□ｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター＝１００％であった。
【０１５６】
４．０μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターを用いる第２の用量上昇および安全性研究は、天然型ＴＮＦと比較したときに用量対用量ベースでこの組成物がより安全であることを示した（図３Ｂ）。マウス１匹あたり１２マイクログラムまたは２４マイクログラムのこのｃＡｕ−ＴＮＦベクターによる処置は、顕著な腫瘍の減少を生じた（図３Ｃ）。実際に、このｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、任意の所与の用量のＴＮＦの相対安全性を増大し、最大許容用量は処置効力を改善した。これらの安全性および効力データは、その安全性を改善しながら薬物の効力が保持されるので、このｃＡｕ−ＴＮＦベクターがＴＮＦの治療指数を有効に増大させることを示唆した。
【０１５７】
図３Ｂは、ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける天然型ＴＮＦおよび４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦ用量上昇および毒性を示す。ＭＣ−３８腫瘍化Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝４／群／用量）に、増大する用量の天然型ＴＮＦまたは４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターを静脈注射した。記載した毒性評点スケールを用いてマウスをスコア化した。６、１２、および２４μｇ／マウスにおける天然型ＴＮＦ処置を生き延びた動物のパーセントは、それぞれ１００％、７５％および０％であった。ｃＡｕ−ＴＮＦ処置を受けた動物は全て生き残った。＊ｐ≦０．０５。
【０１５８】
図３Ｃは、ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける天然型ＴＮＦおよび４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター抗腫瘍効力の比較を示す。図３Ｂに記載される種々の処置群の抗腫瘍応答は、処置の１０日後に３つの寸法（ＬｘＷｘＨ）の腫瘍測定値を決定することによって測定した。データは、種々の群について腫瘍体積の平均±ＳＥＭ（ｃｍ３）で示される。２４μｇの天然型ＴＮＦ処置を受けた動物は全て、処置の２４時間以内に死亡した。＊ｐ≦０．０５（未処置対照に対して）。
【０１５９】
これらのデータはｃＡｕ−ＴＮＦベクターのための好ましい組成を強く示唆し、次にこれを、その体内分布について試験した。時間が経つと、天然型ＴＮＦで処置した動物と、ｃＡｕ−ＴＮＦで処置した動物との間のＴＮＦの体内分布は異なった。注射の１時間後、天然型ＴＮＦを受けたマウスは、ｃＡｕ−ＴＮＦ処置マウスと比較して、腎臓中により高レベルのＴＮＦを有した（図３Ｄ）。対照的に、注射の８時間後には、コロイド金配合物を受けたマウスは、腫瘍中により高レベルのＴＮＦを有した（図３Ｅ）。従って、ｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、ＴＮＦの腫瘍への送達を標的化することによって安全性を改善し、効力を保持しているようであった。
【０１６０】
図３Ｄおよび３Ｅは、１５μｇの天然型ＴＮＦまたは４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターが静脈注射されたＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおけるＴＮＦ分布プロファイルの比較を示す。ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝４／群／処置／時点）に、１５μｇの天然型ＴＮＦまたは４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターを静脈注射した。注射の１時間（図３Ｄ）または８時間（図３Ｅ）後に動物群を屠殺し、器官を採取した。器官を−８０℃で急速凍結し、分析するまで保存した。１ｍｌのＰＢＳ（１ｍｇ／ｍｌのバシトラシンおよびＰＭＳＦを含有する）を添加することにより器官を急速解凍し、ポリトロン組織破壊機を用いてホモジナイズした。ホモジネートを５０００ｒｐｍｓで遠心分離し、上記のように、得られた上澄みをＴＮＦ濃度および総タンパク質について分析した。データは、１時点あたり４つの器官の平均±ＳＥＭで示される。
【０１６１】
動物の剖検は、このｃＡｕ−ＴＮＦベクターに関する潜在的な問題を明らかにした。ｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置マウスの肝臓および脾臓の劇的な黒色は、改善された安全性の一部が、これらの器官におけるベクターの取り込みおよびクリアランスによるものであり得ることの証拠となった。更なる研究によって、この取り込みが急速で、多くの場合、静脈注射の５分以内に生じることが明らかになった。これらの器官の目視検査は、これらの器官の黒色が、裸コロイド金粒子が塩にさらされたときに形成される黒色沈殿物と同じであることを示唆した。また、器官を採取する前に動物をヘパリン処置し、広範に潅流したので、これらの器官の黒色がこれらの器官内に捕捉された血液によるものであるとは考えにくい。これらのデータにより、ベクターの大部分がＲＥＳの成分によって迅速に除去され、ｃＡｕ−ＴＮＦベクターが最適化されないという結果を導くことが示唆された。
【０１６２】
この仮説を支持するさらなる証拠は、天然型ＴＮＦと２つのｃＡｕ−ＴＮＦベクターとの間のＴＮＦレベルを比較する薬物動態学的な研究から得られた。予測に反して、４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターの投与は、天然型ＴＮＦよりも低い初期血清レベルを生じた（図３Ｆ）。ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを与えたマウスのＴＮＦレベルは、天然型ＴＮＦを受けた動物において測定されたよりも一貫して２〜５倍低かった。ＰＫにおけるこの相違は、０．５μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターを用いるとより顕著であり、ＴＮＦの血清レベルは、天然型調製物で見られるよりもほぼ１０倍低かった。ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを受けたマウスは、配合（すなわち、０．５または４．０μｇ／ｍｌ）に関係なく、天然型タンパク質を受けたマウスよりも低いＴＮＦの血液レベルを一貫して示した。まとめると、ベクターの体内分布およびＰＫデータは、このベクターが腫瘍を効果的に標的化するためには、ＲＥＳによる取り込みが著しく低減または除去されることが必要であることの証拠となった。
【０１６３】
図３Ｆは、ＭＣ３８−腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける天然型ＴＮＦまたは４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターの薬物動態学的プロファイルの比較を示す。ＭＣ−３８腫瘍負荷マウス（ｎ＝３／群／時点）に、１０μｇの天然型ＴＮＦまたは４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターのいずれかを静脈注射した。示された時点で、マウスに麻酔をして、眼窩後方の洞から採血した。血液サンプルを凝固させ、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。ＴＮＦのための市販のＥＩＡを用いて、得られた血清サンプルをＴＮＦ濃度について分析した。データは、１時点あたり３匹のマウスからの平均±ＳＥＭ血清濃度で示される。＊ｐ＜０．０５。
【０１６４】
実施例９
ＲＥＳによるクリアランスを回避し、固形腫瘍へのＴＮＦの送達を標的化するためのベクター
ＲＥＳによる外来の対象物の認識およびクリアランスは、他の薬剤キャリアと共に見られている。リポソームおよび生分解性ポリマーについて、この問題は、様々なＰＥＧ安定剤、ならびにポラキサマーおよびポラキサミンなどのブロックコポリマーを用いた表面改変よって対処された。リポソ−ム配合物中で使用されたもの（例えば、カーボワックス２０Ｍ、テトロニック４０７、プルロニック９０８）を含む複数の安定剤を４．０μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターに添加した。試薬はどれもＲＥＳによるベクターの取り込みを有効に妨害した。
【０１６５】
次に、１粒子あたりのＴＮＦ結合の量を減少させた。飽和用量未満（すなわち、０．５μｇ／ｍｌ）でＴＮＦをまずコロイド金粒子に結合させた。次に、チオール誘導体化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−チオール、ＭＷ＝５０００）を粒子に添加した。チオール基は、おそらくＴＮＦの分子間で粒子の表面に直接結合し得るので、この小さい線状のＰＥＧ−チオール試薬を選択した。ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいてこの新しいベクターを試験した。
【０１６６】
コロイド金結合ＴＮＦベクターのこの組成物は、ＴＮＦおよびさらなる薬剤を同じコロイド金粒子結合させることによって配合した。このベクターは、０．５μｇ／ｍｌの飽和用量未満でＴＮＦをまずコロイド金に結合させることによって形成した。次に、誘導体化ＰＥＧをベクターに添加した。誘導体化ＰＥＧは、チオール誘導体化ポリエチレングリコール（メトキシＰＥＧ−チオール、ＭＷ：５０００ダルトン、ＰＥＧ−チオール、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．、アラバマ州ハンツビル）であった。ＰＥＧ−チオールの最終濃度は１５μｇ／ｍｌであり、これをｄｉＨ２Ｏ中に１０ｘ濃度で添加した。チオール基はコロイド金粒子の表面に直接結合するので、チオール誘導体化ＰＥＧは、コロイド金ベクターのための良好な成分である。５０００ダルトンのチオール−ＰＥＧは、試験される第１のチオール誘導体化ＰＥＧであった。さらに、２００００および３００００ダルトンのＭＷを有するｍＰＥＧ−チオールを用いた効力実験を以下に記載されるように実行した。
【０１６７】
ＰＥＧ−チオール改変ｃＡｕ−ＴＮＦ（ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ）ベクターの投与後に見られる体内分布プロファイルは、これまでのｃＡｕ−ＴＮＦベクターで観察されるものとは異なっていた。この新しいベクターを用いると、肝臓および脾臓は、０．５および４．０μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター（図４Ｂ）で生じるように、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクター（図４Ａ）を視覚的に取り込まなかった。図４Ｃは未処置の肝臓および脾臓を示す。ベクターの投与の３０〜６０分以内に明るい赤／紫色のコロイド金粒子を得るので、ＭＣ−３８腫瘍におけるＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの明らかな蓄積は、ＲＥＳ取り込みの阻害と同様に顕著であった。研究の時間経過を通して隔離が継続し、腫瘍中のＴＮＦの蓄積およびＴＮＦの延長された血液残留時間と同時に起こった。
【０１６８】
０．５μｇ／ｍｌおよび４．０μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置後の肝臓および脾臓に蓄積した金の黒色とは異なり、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦの投与後に腫瘍に蓄積して観察される金の色は赤紫であった。循環における滞留の間、および腫瘍における蓄積の間、金粒子がコロイド状態のままであったことを示すのでこの相違は顕著である。興味深いことに、腫瘍部位の中および周囲におけるＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦの蓄積パターンは時間と共に変化した。ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦは、最初（すなわち、０〜２時間）は腫瘍中に単独で隔離された。時間が経つと、ベクターの染色はマウスの皮膚および腹側組織周囲において明らかであった。屠殺された動物の腫瘍の鈍的な切開（ｂｌｕｎｔ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）の間、これらの動物における腫瘍の外側の染色は、腫瘍細胞が初めに移植された皮膚層に制限されることが観察された。腫瘍が残された下側の筋肉には最小限の染色が存在していた。この観察は、抹消の染色が、腫瘍塊に血液を供給する血管、おそらく新しい血管におけるベクターの蓄積に起因し得ることを示唆した。現在、染色がこれらの血管における薬物の能動的な隔離を表すか、あるいはベクターでの腫瘍の飽和による受動的な蓄積を表すかは分かっていない。
【０１６９】
ＴＮＦによって生じる出血性応答を染色が反映するかどうかを決定するために、４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターまたは天然型ＴＮＦの１５マイクログラムの注射を受けたマウスの染色パターンを、同じ用量のＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを受けたマウスと比較した。４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置したマウスは、通常はＴＮＦの静脈内投与に続く腫瘍瘢痕の形成を示し始めた。同様の瘢痕パターンが天然型ＴＮＦ処置後に観察された。天然型ＴＮＦまたは４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置で観察される瘢痕染色のパターンは、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置後に観察される染色のパターンとは明らかに違っていた。ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの投与後に観察される染色パターンのさらなる証拠は、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に初めに結合されたＰＥＧ−チオールコロイド金粒子を受けたマウスから得られた。ＰＴ−ｃＡｕ−ＭＳＡベクターは、はるかに遅い速度ではあるが、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの染色と同様の腫瘍の染色を生じた。腫瘍の染色は、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ処置で観察された色と同様であった。しかしながら、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで観察される３０〜６０分の色の変化と比較して、腫瘍着色の変化は、処置の４時間後にしか明らかにならなかった。さらに、染色の強度は、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで観察された強度よりも低かった。
【０１７０】
図４は、ＰＥＧ−チオールベクターによるコロイド金ＴＮＦベクターのＲＥＳ媒介の取り込みの阻害を示す。ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、記載されたようなＴＮＦとＰＥＧ−チオールとの特定の比を用いて開発した。結合後、透析によってベクターを濃縮し、ＥＩＡによってＴＮＦ濃度について分析した。ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、１５マイクログラムのＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを静脈注射した。マウスを注射の５時間後に屠殺し、ヘパリン処置した生理食塩水で潅流した。肝臓（図の左側）および脾臓を写真撮影した。
【０１７１】
実施例１０
薬物動態学的なおよび分布分析
一般に、これらの実験は、上記のように生成した天然型ＴＮＦ、ｃＡｕ−ＴＮＦ（４□ｇ／ｍｌ）、またはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ、（０．５□ｇ／ｍｌ）ベクターを含む。研究に依存して、５〜２０マイクログラムの天然型またはｃＡｕ−ＴＮＦベクターの１つを、ＭＣ−３８腫瘍負荷マウスの尻尾静脈から静脈注射した。注射の５分、１８０分、および３６０分後に眼窩後方の洞からマウスを出血させて血液を凝血させ、得られた血清を採取し、そしてＥＩＡ（ＣｙｔＩｍｍｕｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）によるバッチＴＮＦ分析のために−２０℃で凍結させた。選択された時点で、種々の器官を採取し、急速凍結した。ＴＮＦ含有量を決定するために、器官を解凍し、ホモジナイズし、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上述のようにＴＮＦ濃度について、ならびに２８０ｎｍでのサンプルの吸光度を決定することによって総タンパク質について、上澄みを分析した。器官のＴＮＦ濃度を、総タンパク質について標準化した。
【０１７２】
Ａ．金分布
１５マイクログラムのＰＥＧ−チオール安定化０．５□ｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターの静脈注射後に、肝臓、肺、脾臓、脳および血液を含む種々の器官を、金元素の存在について試験した。マウスを注射６時間で屠殺し、血液を採取し、肝臓、脾臓および腫瘍を含む種々の器官を回収した。除去後、器官を王水（１部の濃硝酸に対して３部の濃ＨＣｌ）中で消化して、これらの器官中に存在する金を抽出した。２４時間にわたって抽出を実行し、その後、サンプルを３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。誘導結合プラズマ分光法によって器官全体の金濃度の存在について上澄みを分析した。結果は、器官全体の金濃度（ｐｐｍ）として図５Ａに報告される。この結果は、金の腫瘍内濃度が、肝臓で測定されるよりもほぼ２倍高く、脾臓で見られるよりもほぼ７倍高かったことを実証する。このパターンは、ベクターが他の器官と比較して腫瘍中に保持されたことを示唆するが、最も高いレベルの金がこれらの動物の循環中にまだ存在していることが観察された。
【０１７３】
図５Ａには、ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスの種々の器官における金分布が示される。誘導結合プラズマ分光法によって器官全体の金濃度の存在について上澄みを分析した。結果は、１器官あたり３匹のマウスについての器官全体の金濃度（ｐｐｍ）として報告される。＊ｐ＜０．０５（肝臓および脾臓に対して）、†ｐ＜０．０５（脾臓に対して）。
【０１７４】
Ｂ．ＴＮＦの分布および薬物動態学
腫瘍塊内のコロイド金の隔離は、循環中の薬物ベクターの長期の存在、ならびに腫瘍中のＴＮＦの能動的な蓄積によって平行された。誘導体化ＰＥＧを伴わないｃＡｕ−ＴＮＦベクターとは違って、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの注射は、研究の時間経過を通して循環中に高いレベルのＴＮＦをもたらした。天然型ＴＮＦによる注射の６時間後、ＴＮＦレベルは、５分で見られるレベルのわずか２％しかなかった（図５Ｂ）。対照的に、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを受けたマウスは、その最大の５分での値の約３０％であるＴＮＦ血液レベルを有した。この６時間の時点で、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ配合物で処置したマウス中の血液ＴＮＦレベルは、天然型ＴＮＦで処置したマウス中のレベルよりも２３倍高かった。
【０１７５】
図５Ｂは、ＴＮＦ薬物動態学的分析を示す。マウスは、注射の５分、１８０分および３６０分後に眼窩後方の洞から出血させた。血液サンプルを１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、ＥＩＡを用いて、得られた血清をＴＮＦ濃度について分析した。データは、１時点あたり３匹のマウスからの平均±ＳＥＭ血清ＴＮＦ濃度で示される（＊ｐ＜０．０５）。
【０１７６】
ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置した動物において、ＴＮＦは、腫瘍中に蓄積した。図５Ｃに示されるように、天然型ＴＮＦで処置したマウスにおいて観察されるＴＮＦの最大の腫瘍内濃度は、０．８ｎｇのＴＮＦ／ｍｇタンパク質であった。ピークの量は天然型ＴＮＦ投与の５分以内に見られ、６時間にわたって増大しなかった。対照的に、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置した動物は、時間とともに増大するＴＮＦの腫瘍内レベルを有していた。ＴＮＦは、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置した動物の腫瘍中に能動的に隔離された。この期間の最後までに、天然型ＴＮＦまたは４□ｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置したものと比較して、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターで処置した動物の腫瘍中にほぼ１０倍多いＴＮＦが見られた（図５Ｄ）。
【０１７７】
図５Ｃには、腫瘍内ＴＮＦ分布が時間と共に示される。１５マイクログラムの天然型ＴＮＦまたはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの注射の５分、１８０分および３６０分後にマウスを屠殺した。腫瘍を取り出し、ＴＮＦおよび総タンパク質について分析した。データは、３匹のマウス／時点／処置群から、ｎｇＴＮＦ／ｍｇ総タンパク質で表される腫瘍ＴＮＦ濃度の平均±ＳＥＭで示される（Δｐ＜０．１、＊ｐ＜０．０５）。
【０１７８】
図５Ｄは、１５マイクログラムの４□ｇ／ｍｌｃＡｕ−ＴＮＦベクターまたはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターのいずれかを静脈注射した動物からの腫瘍内ＴＮＦ濃度の比較を示す。
【０１７９】
ＴＮＦは同じ期間にわたって肺、肝臓、および脳などの他の器官に蓄積しなかったので、ＭＣ−３８腫瘍塊におけるＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの蓄積は受動的な事象ではなく、あるいは単に循環中のベクターの延長された滞留時間の関数でもなかった。むしろ、これらの器官中のＴＮＦの存在は、血液において見られるものとパターンが類似していた。さらに、これらの標的化されていない器官における薬物の分布は、天然型ＴＮＦで見られるものと類似していた。結果として、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの投与から生じるＴＮＦの蓄積は、腫瘍に特異的である（図５Ｅおよび図５Ｆ）。
【０１８０】
図５ＥおよびＦは、天然型ＴＮＦ（図５Ｅ）またはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ（図５Ｆ）のいずれかを受けたＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウスからの種々の器官におけるＴＮＦの分布を示す。この実施例で処置された動物からの肝臓、肺および脳を処置して、ＴＮＦおよびタンパク質濃度について分析した。データは、３匹のマウス／時点／注射した配合物から、器官内ＴＮＦ濃度の平均±ＳＥＭで示される。
【０１８１】
実施例１１
用量の上昇、毒性、および効力
天然型およびコロイド金結合ＴＮＦ調製物の安全性および効力を比較するためのモデルとして、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに結腸癌細胞株ＭＣ−３８を移植した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスの腹側表面の一部位に、１０５個のＭＣ−３８腫瘍細胞を移植した。三次元（ＬｘＷｘＨ）で腫瘍を測定して決定される場合に０．５ｃｍ３と測定される腫瘍が形成されるまで、細胞を増殖させた。ＭＣ−３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝４〜９／群）に、増大する用量の天然型ＴＮＦ、ｃＡｕ−ＴＮＦベクター、またはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを静脈注射した。１群あたり４〜９匹で、マウスを９つの群に分けた。１つの群は未処置対照群としての役割を果たした。２つの群には７．５または１５マイクログラムのいずれかの天然型ＴＮＦを静脈注射した（図６Ａ）。２つ群に、７．５または１５マイクログラムのいずれかの２０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを静脈注射した（図６Ｂ）。２つの群には、７．５または１５マイクログラムのいずれかの３０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを静脈注射した（図６Ｃ）。腫瘍測定は、ＴＮＦ処置を生き延びた動物において処置後の種々の日数で行った。対応のあるｔ検定を用いて、種々の群の間の統計的差異を決定した。
【０１８２】
以下の毒性評点スケール：０＝正常な活動、１＝立毛、２＝軟便、３＝嗜眠、４＝無応答、および５＝死亡を用いて、注射後の異なる時点でマウスをスコア化した。２回の連続した採点時に４を記録した動物を屠殺した。種々のＴＮＦ処置によって誘発される腫瘍体積の減少をモニターすることによって処置効力を決定した。測定値を、種々の群内の各動物、および生理食塩水注射を受けた動物（未処置対照）の初期腫瘍体積と比較した。比較した。未処置対照は、その腫瘍体積が４ｃｍ３になったときに屠殺した。
【０１８３】
ＭＣ−３８腫瘍負荷マウスにおける容量上昇研究において、分子量５０００ダルトンのＰＥＧ−チオールを含む５Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターを安全性および効力について試験した。４μｇ／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦベクターと同様、５Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、天然型ＴＮＦと比較したときに改善された安全性プロファイルを有した。マウス１匹あたり１５マイクログラムの天然型ＴＮＦの用量では、処置の２４時間以内に３３％（９匹のうち３匹）の動物が死亡した。さらに、７．５マイクログラムの天然型ＴＮＦは９匹の動物のうち１匹の死亡を生じた。対照的に、５Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターに結合させた７．５または１５マイクログラムのＴＮＦを受けた動物はどれも死亡しなかった。これらのベクター処置動物は、一時的な有害な臨床的効果を示しただけであった。１回の処置後には、天然型ＴＮＦと比較して、５Ｋ ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの抗腫瘍効力の目に見えるほどの違いは観察されなかった（図６Ａ）。これらの知見は、２回の実験で再現された。
【０１８４】
図６Ａは、天然型ＴＮＦまたはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの安全性および効力を比較するグラフである。未処置の対照に対して、７．５マイクログラムの用量の天然型ＴＮＦまたはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ処置については†ｐ＜０．０５であった。未処置の対照および７．５マイクログラムの用量の天然型およびＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦに対して、１５マイクログラムの用量の天然型またはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ処置については＊ｐ＜０．０５であった。
【０１８５】
ベクターの抗腫瘍効力に対するＰＥＧ−チオール鎖長の効果は、図６Ｂ〜Ｃに示される。最大ＴＮＦ用量（１５マイクログラム）では、天然型ＴＮＦと比較していずれのＴＮＦベクターの間にも全く差異が示されなかった。しかしながら、より低用量の７．５マイクログラムのＴＮＦではパターンが生じた。上記のように、５Ｋ ＰＥＧ−チオールは、天然型ＴＮＦと比較して、コロイド金ベクターの抗腫瘍効果をあまり改善しなかった。ＰＥＧ鎖長を２０Ｋに増大させることによって、腫瘍減少においてわずかな非統計的な改善が生じ（図６Ｂ）、３０Ｋまで増大させると、腫瘍縮小において顕著で統計的に有意な改善が得られた（図６Ｃ）。３０Ｋ ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターでは、このベクターを介して７．５マイクログラムの用量のＴＮＦで処置した動物は、１５マイクログラムの天然型ＴＮＦで処置した動物と同様のサイズの残存腫瘍を有した。１５マイクログラムの天然型ＴＮＦで処置した動物とは対照的に、７．５マイクログラムのＴＮＦを投与した３０Ｋ ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ処置動物は、毒性を全く経験しなかった。実際、３０Ｋ ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの単回注射は、より少ないＴＮＦを提供したが、２倍多い天然型ＴＮＦで見られるものと同じ最大の抗腫瘍縮小を誘発し、処置された被験体は処置を生き延びた。この腫瘍モデルにおいて、５Ｋまたは２０Ｋ ＰＥＧ−チオール−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターのいずれかの単回の注射は天然型ＴＮＦよりも安全であり、３０Ｋ ＰＥＧ−チオール−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、天然型分子よりも安全かつ有効であった。
【０１８６】
図６Ｂは、天然型ＴＮＦおよび２０Ｋ−ＰＴ−ｃＡＵ−ＴＮＦの安全性および効力を比較するグラフである。未処置対照に対して、７．５マイクログラムの用量の天然型ＴＮＦまたはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置のそれぞれについては†，§ｐ＜０．０５であった。７．５マイクログラムの２０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、７．５マイクログラムの天然型群と統計的に異ならなかった。未処置対照および７．５マイクログラムの天然型および２０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターに対して、１５マイクログラムの用量の天然型またはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦ処置については＊ｐ＜０．０５であった。
【０１８７】
図６Ｃは、天然型ＴＮＦおよび３０Ｋ−ＰＴ−ｃＡＵ−ＴＮＦ安全性および効力を比較するグラフである。未処置対照に対して、７．５マイクログラムの用量の天然型ＴＮＦについては†ｐ＜０．０５。未処置対照および天然型ＴＮＦ群に対して、７．５マイクログラムの用量の３０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置については§ｐ＜０．０５。未処置対照および７．５マイクログラムの用量の天然型ＴＮＦに対して、１５マイクログラムの用量の天然型またはＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクター処置については＊ｐ＜０．０５。７．５マイクログラムの３０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦは、１５マイクログラムの天然型または３０Ｋ−ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦと統計的に異ならなかった。
【０１８８】
実施例１２
コロイド金組成物の経口投与
ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの腫瘍隔離に対する投与経路の効果を試験した。ベクター調製物はこれまでの実施例に記載されるとおりである。簡単には、コロイド金は、上記のインライン混合装置を用いて０．５マイクログラム／ｍｌの濃度でＴＮＦに結合される。１５分間のインキュベーションの後、３００００ダルトンのＰＥＧ−チオール（ｐＨ８の水に溶解）が、１２．５マイクログラム／ｍｌの最終濃度で混合物に添加される。溶液を攪拌し、ダイアフィルトレーションにより直ちに処理する。残余分を滅菌ろ過し、−４０℃で貯蔵するためにアリコートに分ける。
【０１８９】
経口投与されたＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターが腫瘍部位へのＴＮＦおよび金の送達を標的化する能力を決定するためのモデルとして、ＭＣ３８腫瘍負荷Ｃ５７／ＢＬ／６マウスを使用した。これらの研究のために、１ｍｇのペントバルビトールを用いてマウス（ｎ＝３）を麻酔した。動物を完全に鎮静させた後、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターに結合した２６マイクログラムのＴＮＦを経口カニューレから投与した。動物を回復させ、食物および水に自由にアクセスさせた。翌日、腫瘍が、コロイド金ベクターのよく知られた色の赤／青であることが観察された。これらのデータは、ＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターの経口投与が腫瘍の処置のために使用可能であることを示す。
【０１９０】
実施例１３
コロイド金結合ＴＮＦベクターのインビトロ活性
Ｋｈａｂａｒ，Ｋ．Ｓ．、Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，Ｓ．、およびＡｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ａ．、ＷＥＨＩ−１３ ＶＡＲ；ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ＷＥＨＩ １６４ ｃｌｏｎｅ １３ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｏａｓｓａｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ ４６：１０７−１１０（１９９５）により記載されるＷＥＨＩ−１６４ ＴＮＦ生物検定法によって、天然型ＴＮＦおよびｃＡｕ−ＴＮＦベクターのインビトロでの活性を決定した。この生物検定法において、１０４個のＷＥＨＩ−１６４細胞を１２ウェルの組織培養クラスター中に蒔いた。１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で細胞を培養した。天然型ＴＮＦ、ならびにコロイド金１ｍｌあたり０．５、１、２および４マイクログラムのＴＮＦで調製した４つの異なるｃＡＵ−ＴＮＦベクターを、１ｍｇ／ｍｌ〜０．０００１ｍｇ／ｍｌの範囲のＴＮＦ最終濃度で、細胞と共に７日間インキュベートした。Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて７日目に細胞数を決定した。データは、３回のウェル／ＴＮＦ配合物についての細胞数の平均±ＳＥＭで示される。
【０１９１】
ＷＥＨＩ １６４生物検定法において、ｃＡｕ−ＴＮＦベクターは、天然型ＴＮＦとモルベースで生物学的に等価であった。例えば、１２．５ｎｇの天然型ＴＮＦはＷＥＨＩ １６４細胞の増殖を５０％阻害するが、同じ１２．５ｎｇ用量の１．０、２．０および４．０マイクログラム／ｍｌのｃＡｕ−ＴＮＦ調製物は、ＷＥＨＩ １６４細胞の増殖をそれぞれ、４７％、５５％、および５２％阻害した。
【０１９２】
実施例１４
抗血管新生薬の腫瘍標的化送達のためのＰＥＧ−チオールベクター
これらの実験はＰＴ−ｃＡＵ−ＴＮＦ−エンドスタチンベクターを使用し、ベクターは、２つの薬剤を含む。ＴＮＦは、治療薬エンドスタチン（ＥＮＤ）の腫瘍への送達のための標的機能を提供すると考えられた。また、標的において一度に、両方の薬剤が治療効果を提供し得ることも理論化される。ベクター組成物の一態様は、標的分子、治療分子およびＰＥＧの比率である。３つの実体は全て、コロイド金の同じ粒子上に見られる。このベクターの概略図は図７に示される。図７において、１はＥＮＤ分子など薬剤であり、２はコロイド金粒子であり、３は誘導体化ＰＥＧであり、そして４は、ＴＮＦ分子などの異なる薬剤または標的分子である。
【０１９３】
図１に記載される装置を用いて、コロイド金粒子と会合した誘導体化ＰＥＧ、ＴＮＦおよびエンドスタチン（ＥＮＤ）を含むＰＴ−ｃＡｕ（ＴＮＦ）−ＥＮＤベクターを製造した。ＰＴ−ｃＡｕ（ＴＮＦ）−ＥＮＤは３段階で製造した。第一に、非常に低い飽和質量未満のＴＮＦにおいてＴＮＦを金粒子と会合させた。０．５マイクログラム／ｍｌのＴＮＦの濃度で製造したＰＴ−ｃＡｕ−ＴＮＦベクターとは異なり、このベクターは、０．０５マイクログラム／ｍｌのＴＮＦ濃度で製造した。ＴＮＦ（３ｍＭのＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ＝１０）中に希釈）を０．１マイクログラム／ｍｌの濃度で装置の試薬ビンに添加した。装置内の第２のビンに等容量のコロイド金をｐＨ１０で充填した。上記のように、ぜん動ポンプの作動によって、ＴＮＦをコロイド金粒子に結合させた。コロイド金−ＴＮＦ溶液を１５分間インキュベートし、続いて、装置の金容器内に戻した。次に、試薬ビンに等容量のエンドスタチン（ＣＡＰＳ緩衝液中に０．１５〜０．３マイクログラム／ｍｌの濃度で希釈）を充填した。代替的な実施形態では、エンドスタチンは、金粒子への結合に役立つように、ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタートなどの薬剤を用いて、硫黄基の付加によって化学修飾され得る。
【０１９４】
ぜん動ポンプを作動して、コロイド金結合ＴＮＦおよびエンドスタチン溶液をＴ型コネクタに引き出した。溶液の完全な相互作用において、混合物を捕集ビン内でさらに１５分間インキュベートした。この段階で塩が粒子を沈降させる能力によって、ＰＥＧ−チオールのさらなる結合部位の存在を確認した。１５分間のインキュベーションの後、５Ｋ ＰＥＧ−チオールをｃＡｕ（ＴＮＦ）−ＥＮＤベクターに添加し、上記のようにダイアフィルトレーションにより濃縮した。
【０１９５】
同じ金の粒子に２つのタンパク質を結合させるための代替方法は、図１と同じ装置を使用することと、薬剤を同時に金に添加することとを含む。ＴＮＦおよびＥＮＤを結合装置の試薬チャンバに入れた。各タンパク質の濃度は、０．２５マイクログラム／ｍｌであり、結果として、１ｍｌの溶液は、０．５マイクログラムの総タンパク質を含有した。２つの薬剤組成物を金粒子に結合させた後、このコロイド金調製物も塩の存在下で沈殿させ、さらなる遊離結合部位がＰＥＧ−チオールとの結合に利用可能であることを示した。１５分間のインキュベーションの後、５Ｋ ＰＥＧ−チオールをｃＡｕ（ＴＮＦ）ＥＮＤベクターに添加し、続いて、上記のように処理した。
【０１９６】
ダイアフィルトレーションの後、それぞれのＥＩＡにおけるＴＮＦおよびＥＮＤ濃度について残余分を測定した。コロイド金の同じ粒子上のＥＮＤおよびＴＮＦの存在を確認するために、交差抗体の捕捉および検出アッセイを設計および使用した。このＥＩＡの概略図は図８に示される。図８において、Ａは、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼなどの標識化された結合パートナーであり、Ｂは、ビオチンなどの結合パートナーであり、Ｃは、ビオチン化抗ＥＮＤ抗体などの検出抗体であり、Ｄは、ＥＮＤ分子などの薬剤であり、Ｆはコロイド金粒子であり、Ｅは誘導体化ＰＥＧであり、そしてＧは、ＴＮＦ分子などの異なる薬剤または標的分子であり、Ｈは、抗ＴＮＦ抗体などの捕捉抗体であり、そしてＬは、ビーズまたはマイクロタイタープレートなどの支持体である。
【０１９７】
ＴＮＦまたはＥＮＤ捕捉抗体のいずれかで被覆されたＥＩＡプレートに、ＰＴ−ｃＡｕ（ＴＮＦ）−ＥＮＤベクターのサンプルを添加した。サンプルを捕捉抗体と共に３時間インキュベートした。インキュベーションの後に、プレートを洗浄し、ブロット乾燥した。ＴＮＦ捕捉サンプル上に存在する任意のＥＮＤを結合するために、ビオチン化ウサギ抗エンドスタチンポリクローナル抗体をウェルに添加した。３０分間のインキュベートの後、プレートを洗浄し、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いてビオチン化抗体の存在を検出した。エンドスタチン検出システムによる陽性の色シグナルの発生は、検出抗体が、ＴＮＦモノクローナル抗体により予め捕捉されたキメラベクターに結合したことを示した。図９を参照されたい。捕捉および検出抗体を逆転させ、適切な第２の検出システムを用いることによって、アッセイを使用して、ＥＮＤ捕捉された粒子上のＴＮＦの存在を検出した。図９を参照されたい。図９は、第２の薬剤の存在を示すＴＮＦ−およびＥＮＤ−捕捉ベクターを示すグラフである。
【０１９８】
これらの研究からのデータは表ＶＩに示される。表ＶＩにおいて分かるように、ベクターサンプルの残余分は、１７□ｇ／ｍｌのＴＮＦおよび２２□ｇ／ｍｌのＥＮＤを有した。また、これらの同じサンプルは交差抗体アッセイにおいて陽性シグナルを発生し、ＴＮＦおよびエンドスタチンの両方がコロイド金の同じ粒子上にあることが示唆された。（図９）。
【０１９９】
【表６】
【０２００】
図１０において、データは、静脈注射後に切除されたＭＣ−３８腫瘍中のＰＴ−ｃＡｕ（ＴＮＦ）−ＥＮＤベクターからのエンドスタチンおよびＴＮＦの検出を示している。これらのデータは、両方の分子が腫瘍組織中で検出されているので、ＰＴ−ｃＡｕ（ＴＮＦ）−ＥＮＤベクターが分解せずに腫瘍に達したことを示す。
【０２０１】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の指示対象を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」を含有するベクター組成物に対する言及は、そのような薬剤のモル量を意味する。
【０２０２】
本明細書中に開示される特定の組み合わせ、方法、および材料はいくらか変化し得るので、本発明は、このような組み合わせ、方法、および材料に限定されないことは理解されるべきである。また、本明細書中で使用される用語は特定の実施形態を説明するだけの目的で使用され、限定することは意図されないことも理解されるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラットフォーム、少なくとも１つの標的剤、少なくとも１つのステルス剤、および少なくとも１つの治療薬または診断薬を含む組成物。
【請求項２】
前記プラットフォームが、コロイド金属ナノ粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、シリカナノ粒子、鉄ナノ粒子、金／鉄ナノ粒子などの金属ハイブリッドナノ粒子、ナノシェル、金ナノシェル、銀ナノシェル、金ナノロッド、銀ナノロッド、金属ハイブリッドナノロッド、量子ドット、ナノクラスター、リポソーム、デンドリマー、金属／リポソーム粒子、金属／デンドリマーナノハイブリッド、およびカーボンナノチューブを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記コロイド金属が、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケルおよびカルシウムリチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、インジウム、スズ、タングステン、レニウム、白金、またはガドリニウムを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記標的剤が、細胞膜中または細胞膜がない状態に見られる分子に結合し得る受容体もしくは受容体の一部、リガンド、抗体、抗体断片、酵素、補因子、または基質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記標的剤が、腫瘍壊死因子、インターロイキン、成長因子、ホルモン、補因子、酵素基質、免疫調節性分子、抗体、接着分子、血管マーカー、新生血管マーカー、分子シャペロン、または熱ショックタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ステルス剤が、ポリエチレングリコール、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、ポリオキシプロピレンポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ｒＰＥＧ、またはヒドロキシエチルデンプン、親水性薬剤およびポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ステルス剤が、変性、誘導体化、チオール化、アミノ化、または多アミノ化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記治療薬または診断薬が、化学物質、治療薬、医薬品、薬物、生物学的因子、生物学的分子の断片、例えば、抗体、タンパク質、脂質、核酸または炭水化物などの断片、核酸、抗体、タンパク質、脂質、栄養物、補因子、ウイルス、栄養補助食品、麻酔薬、検出剤、および体内で効果がある薬剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記治療薬または診断薬が、サイトカイン、成長因子、神経化学物質、細胞通信分子、ホルモン、医薬品、抗炎症薬、抗体、化学療法薬、または免疫療法剤、核酸に基づく物質、イメージング系、染料、および放射性物質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記治療薬または診断薬が、チオール、アミンまたはマルチアミン部分により変性されていてもよい、タキソール、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、アシクロビル、シスプラチン、エポチロン、ゲムシタビン、メルファラン、５−ＦＵまたはそのプロドラッグ形態、タクリンおよびその類似体、ならびにガドリニウム／ガドリニウムキレート剤を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記治療薬または診断薬が、タキソール、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、アシクロビル、シスプラチン、エポチロン、ゲムシタビン、メルファラン、５−ＦＵまたはそのプロドラッグ形態、およびタクリンを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
被験者における生理学的効果のために薬剤を標的部位に送達する方法であって、プラットフォーム、少なくとも１つの標的剤、少なくとも１つのステルス剤、および少なくとも１つの治療薬または診断薬を含む組成物を前記被験者に投与することを含む方法。
【請求項１３】
前記プラットフォームが、コロイド金属ナノ粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、シリカナノ粒子、鉄ナノ粒子、金／鉄ナノ粒子などの金属ハイブリッドナノ粒子、ナノシェル、金ナノシェル、銀ナノシェル、金ナノロッド、銀ナノロッド、金属ハイブリッドナノロッド、量子ドット、ナノクラスター、リポソーム、デンドリマー、金属／リポソーム粒子、金属／デンドリマーナノハイブリッドおよびカーボンナノチューブを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的剤が、腫瘍壊死因子、インターロイキン、成長因子、ホルモン、補因子、酵素基質、免疫調節性分子、抗体、接着分子、血管マーカー、新生血管マーカー、分子シャペロン、または熱ショックタンパク質を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ステルス剤が、ポリエチレングリコール、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、ポリオキシプロピレンポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ｒＰＥＧ、またはヒドロキシエチルデンプンを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステルス剤が、変性、誘導体化、チオール化、アミノ化、または多アミノ化されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療薬または診断薬が、化学物質、治療薬、医薬品、薬物、生物学的因子、生物学的分子の断片、例えば、抗体、タンパク質、脂質、核酸または炭水化物などの断片、核酸、抗体、タンパク質、脂質、栄養物、補因子、栄養補助食品、麻酔薬、検出剤および体内で効果がある薬剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記生理学的効果が、特定の細胞または組織の検出または処置、特定の組織のイメージング、固形腫瘍のイメージング、生物学的状態の処置、慢性および急性疾患の処置、免疫系の維持および制御、感染症の処置、ワクチン接種、ホルモン維持および制御、癌の処置、固形腫瘍の処置、血液由来の腫瘍の処置、根底にある骨髄新生物の処置、ならびに血管新生状態を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療薬または診断薬が、活性薬物に転換されるプロドラッグであり得る、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療薬または診断薬が、ガドリニウムまたは同様の造影剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的部位が、腫瘍、感染性部位、疾患部位、機能不全部位または炎症関節である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
プラットフォーム、少なくとも１つの標的剤、少なくとも１つのステルス剤、および少なくとも１つの治療薬または診断薬を含む組成物。
【請求項２】
前記プラットフォームが、コロイド金属ナノ粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、シリカナノ粒子、鉄ナノ粒子、金／鉄ナノ粒子などの金属ハイブリッドナノ粒子、ナノシェル、金ナノシェル、銀ナノシェル、金ナノロッド、銀ナノロッド、金属ハイブリッドナノロッド、量子ドット、ナノクラスター、リポソーム、デンドリマー、金属／リポソーム粒子、金属／デンドリマーナノハイブリッド、およびカーボンナノチューブを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記コロイド金属が、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケルおよびカルシウムリチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、インジウム、スズ、タングステン、レニウム、白金、またはガドリニウムを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記標的剤が、細胞膜中または細胞膜がない状態に見られる分子に結合し得る受容体もしくは受容体の一部、リガンド、抗体、抗体断片、酵素、補因子、または基質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記標的剤が、腫瘍壊死因子、インターロイキン、成長因子、ホルモン、補因子、酵素基質、免疫調節性分子、抗体、接着分子、血管マーカー、新生血管マーカー、分子シャペロン、または熱ショックタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ステルス剤が、ポリエチレングリコール、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、ポリオキシプロピレンポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ｒＰＥＧ、またはヒドロキシエチルデンプン、親水性薬剤およびポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ステルス剤が、変性、誘導体化、チオール化、アミノ化、または多アミノ化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記治療薬または診断薬が、化学物質、治療薬、医薬品、薬物、生物学的因子、生物学的分子の断片、例えば、抗体、タンパク質、脂質、核酸または炭水化物などの断片、核酸、抗体、タンパク質、脂質、栄養物、補因子、ウイルス、栄養補助食品、麻酔薬、検出剤、および体内で効果がある薬剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記治療薬または診断薬が、サイトカイン、成長因子、神経化学物質、細胞通信分子、ホルモン、医薬品、抗炎症薬、抗体、化学療法薬、または免疫療法剤、核酸に基づく物質、イメージング系、染料、および放射性物質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記治療薬または診断薬が、チオール、アミンまたはマルチアミン部分により変性されていてもよい、タキソール、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、アシクロビル、シスプラチン、エポチロン、ゲムシタビン、メルファラン、５−ＦＵまたはそのプロドラッグ形態、タクリンおよびその類似体、ならびにガドリニウム／ガドリニウムキレート剤を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記治療薬または診断薬が、タキソール、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、アシクロビル、シスプラチン、エポチロン、ゲムシタビン、メルファラン、５−ＦＵまたはそのプロドラッグ形態、およびタクリンを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
被験者における生理学的効果のために薬剤を標的部位に送達する方法であって、プラットフォーム、少なくとも１つの標的剤、少なくとも１つのステルス剤、および少なくとも１つの治療薬または診断薬を含む組成物を前記被験者に投与することを含む方法。
【請求項１３】
前記プラットフォームが、コロイド金属ナノ粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、シリカナノ粒子、鉄ナノ粒子、金／鉄ナノ粒子などの金属ハイブリッドナノ粒子、ナノシェル、金ナノシェル、銀ナノシェル、金ナノロッド、銀ナノロッド、金属ハイブリッドナノロッド、量子ドット、ナノクラスター、リポソーム、デンドリマー、金属／リポソーム粒子、金属／デンドリマーナノハイブリッドおよびカーボンナノチューブを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的剤が、腫瘍壊死因子、インターロイキン、成長因子、ホルモン、補因子、酵素基質、免疫調節性分子、抗体、接着分子、血管マーカー、新生血管マーカー、分子シャペロン、または熱ショックタンパク質を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ステルス剤が、ポリエチレングリコール、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、ポリオキシプロピレンポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ｒＰＥＧ、またはヒドロキシエチルデンプンを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステルス剤が、変性、誘導体化、チオール化、アミノ化、または多アミノ化されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療薬または診断薬が、化学物質、治療薬、医薬品、薬物、生物学的因子、生物学的分子の断片、例えば、抗体、タンパク質、脂質、核酸または炭水化物などの断片、核酸、抗体、タンパク質、脂質、栄養物、補因子、栄養補助食品、麻酔薬、検出剤および体内で効果がある薬剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記生理学的効果が、特定の細胞または組織の検出または処置、特定の組織のイメージング、固形腫瘍のイメージング、生物学的状態の処置、慢性および急性疾患の処置、免疫系の維持および制御、感染症の処置、ワクチン接種、ホルモン維持および制御、癌の処置、固形腫瘍の処置、血液由来の腫瘍の処置、根底にある骨髄新生物の処置、ならびに血管新生状態を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療薬または診断薬が、活性薬物に転換されるプロドラッグであり得る、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療薬または診断薬が、ガドリニウムまたは同様の造影剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的部位が、腫瘍、感染性部位、疾患部位、機能不全部位または炎症関節である、請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３ａ−ｂ】
【図３ｃ−ｄ】
【図３ｅ−ｆ】
【図４】
【図５ａ−ｂ】
【図５ｃ−ｄ】
【図５ｅ−ｆ】
【図６ａ−ｂ】
【図６ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３ａ−ｂ】
【図３ｃ−ｄ】
【図３ｅ−ｆ】
【図４】
【図５ａ−ｂ】
【図５ｃ−ｄ】
【図５ｅ−ｆ】
【図６ａ−ｂ】
【図６ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１１−５２０７６９（Ｐ２０１１−５２０７６９Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２６０４６（Ｐ２０１０−５２６０４６）
【出願日】平成２０年９月２２日（２００８．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７７２３９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３９５０２
【国際公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（５０６１８６４００）サイトイミューン サイエンシズ インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２２日（２００８．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７７２３９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３９５０２
【国際公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（５０６１８６４００）サイトイミューン サイエンシズ インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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