ニコチン中毒に対するワクチン
本発明は、ニコチン中毒に対して効果的なワクチンを生成するために適する担体と適切に接合することができる新規ニコチン誘導体の形態のハプテンを提供する。より具体的には、本発明は、以下の式（Ｉ）のニコチン誘導体に関する：また、本発明は、前述のニコチン誘導体由来のハプテン−担体接合体、及び前記ハプテン−担体接合体を含むワクチン組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニコチン中毒に対するワクチンを提供する。より具体的には、本発明は、ニコチン中毒に対する効果的なワクチンを産出するために適する担体と適切に接合することができる新規ニコチン誘導体の形態のハプテンを提供する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関によると、世界中に１０億人以上の喫煙者がいる。毎年約４００万人が、ガン、心臓疾患、及びその他喫煙に起因する病気のため死亡していると推定される。
【０００３】
タバコが中毒性化学物質であるニコチンを含有するため人々は喫煙を続けることが広く認められている。多くの禁煙方法が、事実、タバコ中毒者にパッチやガム等のタバコ以外のソースからニコチンを与えている。
【０００４】
別の禁煙方法では、ニコチンに対する抗体を生成することによって、免疫システムを刺激して、システムからニコチンを除去するワクチンを提供する。それにより、ニコチンワクチンの接種後、個人がタバコを喫煙すると、抗体はニコチンが脳に到達する前にシステムから除去する。結果として、ニコチンの期待される刺激的効果は体験されないか、著しく減少する。喫煙者は、ニコチンの刺激的効果の減少又は消失を体験するため、喫煙の欲求を喪失する。
【０００５】
禁煙方法において用いられるニコチンワクチンは、多数の特許文献に記載されている。
【０００６】
例えば、国際公開第９９／６１０５４号は、５−又は６−ニコチニル−リンカー−キャリアタンパク質を含むニコチン免疫原を記載している。
【０００７】
さらに、米国特許第６，２３２，０８２号は、担体が、３’位、４’位、又は５’位の位置でニコチン残基に結合されるニコチン−担体接合体を記載している。米国特許第６，２３２，０８２号のハプテンは、（ＣＨ２）ｎ−Ｚ部分（式中、Ｚは、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、又はＳＨである）で３’位、４’位、又は５’位の位置で誘導体化されたニコチン部分を含有する。これらハプテンは、ホモ二官能性架橋剤又はヘテロ二官能性架橋剤（homobifunctional or heterobifunctional cross-linker）を用いて担体タンパク質に接合されている。この文献中の式（Ｉ）において、ＸとＹはそれぞれ、ハプテン及び担体各々と架橋剤の結合の基を示す。しかしながら、前記米国特許に記載された免疫原性の研究では、免疫反応を高めるためフロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント（complete and incomplete Freund's adjuvant）が使用された。このアジュバントは、ヒトへの使用が許可されていない。
【０００８】
国際公開第２００４／０９１１６号は、Ｏ−スクシニル−トランス−３’−ヒドロキシメチルニコチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを合成するステップと、ニコチン誘導体をアミド結合の形成下Ｑβの表面でリシンと反応させるステップとを含む、ニコチン−Ｑβ−接合体を生産する方法を記載している。これら接合体の重大な欠点は、生体内での安定性に劣ることである。
【０００９】
国際公開第０２／４９６６７号は、コチニンが１、２、５、６、又は４’位の位置を通して担体と接合されるコチニン接合体を記載している。国際公開第０２／４９６６７号は、ガンマ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）を使用してハプテンがオボアルブミンと接合される、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨの基で誘導体化されたコチニン部分を含むハプテンの接合体を開示している。この国際出願では、コチニンが生体内でニコチンの作用を中和できることが観察されている。さらに、コチニンに対する免疫反応が、ニコチンの神経学的効果においてコチニンの抑制作用を減少することができ、それにより、被験者のニコチンへの渇望がより少なくなるという結果になるという仮説がたてられている。この仮説は、特に実験的証拠により立証されていないので、有望ではない。
【特許文献１】国際公開第９９／６１０５４号
【特許文献２】米国特許第６，２３２，０８２号
【特許文献３】国際公開第２００４／０９１１６号
【特許文献４】国際公開第０２／４９６６７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者は、非常に効果的なニコチンワクチンの製造に有利に使用することができる新規ハプテンを開発した。
【００１１】
本発明によるハプテンは、以下の式のニコチン誘導体である：
【００１２】
【化１】
【００１３】
（式中、５員環又は６員環のいずれかが、１個のＲ−ＳＨラジカルと置換され、ここで、ＲはＣＨ２−Ｙ−Ｚを表し：
Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、又はＮＨ−ＣＯを表し；
Ｚは、直鎖若しくは分岐のＣ１−Ｃ２２アルキレン、直鎖若しくは分岐のＣ２−Ｃ２２アルケニレン、又はポリアルキレングリコール部分を表す。）
【００１４】
前述のニコチン誘導体は、ニコチン中毒の治療、又は予防的治療に有利に使用できる免疫原性ニコチン−担体接合体を製造するために用いることができ、前記治療はニコチン中毒に罹患している、又はニコチン中毒になる危険のある個人へ接合体を投与することを含む。本発明のニコチン−担体接合体は、非常に安定性が高く、数ヶ月間、又は数年間でさえ免疫原性の効能を顕著に喪失せずに保存することができる。また、特にニコチン誘導体がサクシンイミド架橋剤によって接合体と結合された場合、及びニコチン誘導体と架橋剤がチオエーテル結合によって連結された場合に、本接合体の生体内での安定性が非常に高い。さらに、本ニコチン−担体接合体は、数ステップ以内の比較的単純な合成ステップを用いて製造することができ、明確に確立された接合体の製品を多量に産出する
【００１５】
したがって、本発明の１つの態様は、以下の式（Ｉ）のニコチン誘導体に関する。
【００１６】
【化２】
【００１７】
（式中、５員環又は６員環のいずれかが、１個のＲ−ＳＨラジカルと置換され、ここで、ＲはＣＨ２−Ｙ−Ｚを表し：
Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、又はＮＨ−ＣＯを表し；
Ｚは、直鎖若しくは分岐のＣ１−Ｃ２２アルキレン、直鎖若しくは分岐のＣ２−Ｃ２２アルケニレン、又はポリアルキレングリコール部分を表す。）
【００１８】
別の特に好ましい実施態様によると、式（Ｉ）では、Ｙは、ＮＨ又はＮＨ−ＣＯを表す。最も好ましくは、ＹはＮＨを表す。
【００１９】
さらに好ましい実施態様によると、式（Ｉ）のＺは、Ｃ１−Ｃ４アルキレンであり、最も好ましくは、エチレンである。
【００２０】
式（Ｉ）中のＲ−ＳＨ残基は、ニコチン分子の５員環の３’位、４’位、又は５’位の位置に結合していてもよい。好ましくは、Ｒは、３’位又は４’位の位置に結合され、最も好ましくは、前記５員環の３’位の位置に結合される。
【００２１】
別の特に好ましい実施態様によると、式（Ｉ）のニコチン誘導体は、Ｒ−ＳＨ残基でトランス置換される。別の特に好ましい実施態様によると、本発明のニコチン誘導体は、Ｌ−ニコチン誘導体である。
【００２２】
本発明の特に好ましいニコチン誘導体は、３’−（２−メルカプトエチルアミノメチル）ニコチン、３’−（３−メルカプトプロピオンアミドメチル）ニコチン、及び３’−（メルカプトアセトアミドメチル）ニコチンである。
【００２３】
本発明の別の態様は、以下の式（Ｉａ）によって表される、本発明のニコチン誘導体の前駆物質に関する。
【００２４】
【化３】
【００２５】
（式中、５員環又は６員環のいずれかが、１個のＲ−Ｓ−ＣＯ−Ｒ’部分で置換され、Ｒは上の定義と同じ意味であり、ここにおいて、Ｒ’−ＣＯは、低級アシル基を表し、好ましくは、１〜８個の炭素原子、より好ましくは、１〜６個の炭素原子、またより好ましくは、１〜５個の炭素原子を含む分岐又は直鎖のアシル基を表す。特に好ましい実施態様では、上記式のＲ’−ＣＯは、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、及びピバロイルから選択される低級アシルを表し、最も好ましくは、アセチル及びプロピオニルである。
【００２６】
本発明の特に好ましい実施態様では、上記前駆物質は、３’−（Ｓ−アセチルメルカプトアセトアミド−メチル）ニコチンである。これら前駆物質は、Ｓ−脱アセチル化とその後の接合により、好ましくは２ステップのワンポット法において、本発明の対応するニコチン誘導体接合体に簡単に変換することができる。適切なＳ−脱アセチル化反応は、一般的に当業者に知られている。加えて、発明者は、これらＳ−アセチルメルカプト化合物は、酸化、すなわち、ジスルフィド二量体の形成に対してかなり非感受性であることを確認した。そして、前駆物質は、対応するニコチン誘導体より、精製、保存の間の取扱いが、より便利であることを確認した。
【００２７】
本発明の別の態様は、以下の式（II）のハプテン−担体接合体に関する。
【００２８】
【化４】
【００２９】
（式中、５員環又は６員環のいずれかが１個のＲ−ＳＨラジカルで置換される；ｐは、１〜５００であり；Ｒは、式（Ｉ）に関する上述の定義と同じ意味である。）
【００３０】
本発明のハプテン−担体接合体で採用される担体は、ヒトにおいて安全に使用することができ、また本ニコチン誘導体と化学的に連結することができる、いかなる免疫原性の物質でもよい。好ましい実施態様では、担体は、免疫原性物質、ウィルス、ウィルス様粒子、タンパク質複合体、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）からなる群より選択される。特に好ましい実施態様によると、担体は、免疫原性タンパク質又はポリペプチドである。免疫原性タンパク質の特に適切な例は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヘモシアニン、アルブミン、非毒性変異ジフテリアトキソイドＣＲＭｌ９７、髄膜炎菌由来の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、非耐熱性大腸菌のＢサブユニット、緑膿菌由来の組換えエキソタンパク質Ａ（ｒＥＰＡ）、バクテリオファージＱｂの組換えコートタンパク質（coat protein）から組み立てたウィルス様粒子を含み、最も好ましい例は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヘモシアニン、アルブミン、非毒性変異ジフテリアトキソイドＣＲＭｌ９７、髄膜炎菌由来の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、非耐熱性大腸菌のＢサブユニット、及びバクテリオファージＱｂの組換えコートタンパク質から組み立てたウィルス様粒子である。本発明の好ましい実施態様では、ここで定義されたようなハプテン−担体接合体であって、担体がタンパク質で、ハプテン：タンパク質のモル比が１を超えるハプテン−担体接合体を提供する。
【００３１】
本免疫接合体のスペーサー（spacer）は、共有結合的にニコチン誘導体を担体に連結する。ハプテンと担体（特にタンパク質／ポリペプチド成分）を架橋するために使用することができるスペーサーは、当技術分野で周知である。好ましくは、本発明では、スペーサーはヘテロ二官能性架橋剤の残基であり、特にスクシンイミジル架橋剤であり、例えば：
− Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート、
− Ｎ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、
− Ｎ−（ε−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、
− Ｎ−（Ｎ−マレイミジルプロピオニル）−９−アミノ−４、７−ジオキサノナオイックアシド Ｎ−スクシンイミドエステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ２−マレイミド）、又は
− Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）であり、架橋剤は、スルフヒドリル反応担体を生成するため担体を変性させるのに使用される。第２ステップでは、ニコチン誘導体は、免疫接合体を生成するためスルフヒドリル反応タンパク質と結合され、ここにおいて、ヘテロ二官能性架橋剤由来のスペーサーが、ニコチン誘導体を担体と結合させる。好ましい実施態様によると、本接合体では、ハプテンとスペーサーが、チオエーテル結合により結合される。チオエーテル結合により結合されたハプテンとスペーサーの接合体は、生体内での安定性が高いという有利な点を示す。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、ワクチン組成物、特にニコチン中毒の予防又は治療方法において使用されるワクチン組成物の調製において上で定義したハプテン−担体接合体の使用に関し、上記方法は、治療有効量のハプテン−担体接合体を投与することを含む。本発明の接合体は、生体内の条件で非常に安定しているという有利な点を示す。さらに、本ハプテン−担体接合体は、明確に定義された形に調製することができ、好ましくない副作用のリスクを効果的に最小限に抑制できることを意味する。
【００３３】
適切な投与方法は、皮下投与、筋内投与、経粘膜投与、及び静脈内投与を含む。最も好ましくは、ワクチン組成物は、皮下投与、又は筋内投与される。
【００３４】
ニコチンの中毒作用は、ニコチンの血液脳関門を通過する能力と関連すると信じられている。本発明のニコチン中毒の治療又は予防方法は、ニコチンの血液脳関門の通過を防止することによる。特に、ニコチンハプテン−担体接合体の人への投与は、ニコチンに対する抗体を当人の血流中に生成させる。当人が喫煙すると、血液中のニコチンは、循環する抗ニコチン抗体により結合され、ニコチンの脳への到達を抑止することになる。そのため、抗体は、脳で発生する生理学的及び心理学的なニコチンの作用を抑止する。喫煙者は、これら作用の減少及び消失を体験するため、喫煙への欲求を喪失する。本発明のニコチンハプテン−担体接合体を接種した後、無煙タバコを使用した場合にも、同様の治療効果が期待される。加えて、本発明の接合体と抗体は、末梢神経系を刺激するニコチンの能力に影響を与えることにより効果を発揮することができる。
【００３５】
本発明の接合体は、ニコチン中毒の治療と予防に適している。ニコチン中毒を治療するためには、本発明のニコチン−担体接合体をニコチン中毒に罹患している人に投与する。ニコチン中毒を予防するためには、ニコチン中毒に罹る危険のある人を、本発明による接合体で治療する。
【００３６】
本発明のワクチン組成物は、それに対する免疫反応を誘発するために十分な量の、少なくとも１つのニコチンハプテン−担体接合体を含む。本発明のニコチンハプテン担体接合体の初回接種は、ニコチンに特異な高力価の抗体を作る。ニコチン中毒の治療が必要な人に投与する接合体の治療有効量は、当業者により容易に決定される。適切な投薬量は、１〜１０００μｇ／回（dose）の範囲である。一般的に、人が外来抗原に対して抗体を作るためには、１〜数週間かかる。血液中の抗体の生成は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（radioimmunoassay）、表面プラズマ共鳴（surface plasma resonance）、及びウエスタンブロッティング法等の当業者に周知の技術を用いてモニターすることができる。治療有効性も、血圧等、ニコチンの様々な身体的作用を評価することによってモニターすることができる。
【００３７】
本発明の免疫原性接合体の初回接種は、１又は複数回の接合体のその後の「追加接種（booster）」の投与が続いてもよいと理解される。そのような追加接種は、本発明のニコチンハプテン−担体接合体に対する抗体の生成を増加させることになる。
【００３８】
本発明のワクチン組成物は、少なくとも１つのアドジュバントを含有してもよい。本発明において使用されるアドジュバントは、担体タンパク質の効果が阻害されないように選択される。本発明において使用されるアドジュバントは、ヒトにとって生理学的に許容されるものであって、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、種々の界面活性剤（特に、マンニチルオレイン酸）が鉱油と組み合わされたモンタナイド（登録商標）（Montanide）等のオイル／界面活性剤ベースのエマルションアドジュバント、ＭＦ５９（登録商標）等のスクアレン含有エマルション、モノホスホリルリピドＡ（monophosphoryl lipid A）、又はネイセリア変異体リポポリサッカライド（Neisseriae mutant lipopolysaccharide）（国際出願ＰＣＴ／ＮＬ９８／００６３号に記載の通り）を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明のワクチン組成物は、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤を任意に含有してもよい。適切な賦形剤は、滅菌水、食塩水、及び緩衝液を含む。好ましい実施態様によると、ワクチン組成物は、薬学的に許容されるｐＨの含水食塩水に可溶化された本発明のハプテン−担体接合体を含む。あるいは、ワクチン組成物は、ハプテン−担体接合体の縣濁液を含む。
【００４０】
加えて、ワクチン組成物は、分散媒、被覆剤、マイクロスフィア（microspheres）、リポソーム、マイクロカプセル、脂質、界面活性剤、滑剤、防腐剤及び安定剤等の、少なくとも１つの助剤を任意で含有してもよい。
【００４１】
本発明のワクチン組成物は、好ましくは滅菌されている。さらに、この組成物は、微生物の侵入及び増殖に対して防御する成分を含有してもよい。
【００４２】
ワクチン組成物は、即時に投与ができる状態の殺菌した水性液体の形態に製造されることが好ましい。
【００４３】
本発明によるニコチン誘導体は、タンパク質−タンパク質接合体を産出しない合成ルートを用いて、担体と有利に結合することができる。そのようなタンパク質−タンパク質接合体は、ワクチン組成物の溶解性と同様に効能にもまた不利に影響するため、本発明の別の態様は、本発明によるハプテン−担体接合体及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン組成物であって、タンパク質−タンパク質接合体を含有しないワクチン組成物に関する。
【００４４】
本発明は、さらに以下の実施例によって説明される。
【実施例１】
【００４５】
トランス−３’−ニコチン−Ｎ−（２−メルカプトエチル）カルボキサミド（１）は、以下のように合成された：
Ｎ，Ｎ’−ビス−（トランス−４’−コチニニルカルボニル）シスタミン（Ａ）
１．００ｇ（４．５４ｍｍｏｌ）のトランス−４’−コチニンカルボン酸、０．４５ｇ（２．００ｍｍｏｌ）のシスタミン二塩酸塩、及び０．６８ｇ（４．４４ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合液を、２５ｍｌの乾燥したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから２回濃縮した。残留物を、２５ｍｌの乾燥したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、０．８０ｍｌ（４．５９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン及び０．６８ｍｌ（４．３９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを添加した。混合液を室温で攪拌した。２０時間後、４ｍｌ（０．２ｍｏｌ）の水を添加し、１時間攪拌を続けた。その後、混合液を真空で濃縮した。残留物は、１００ｍｌの０．５ＭのＫＨＳＯ４に取り込み、クロロホルム（３×２５ｍｌ）で洗浄した。固体のＮａ２ＣＯ３．Ｈ２Ｏ（８．０ｇ）を徐々に水層に添加し、そしてクロロホルム（３×２５ｍｌ）で抽出した。有機層は結合し、乾燥され（ＭｇＳＯ４）、ろ過、濃縮して、シロップとしての化合物Ａを生成し、次のステップでは、精製せずに使用した。
【００４６】
クロロホルム中の化合物Ａの小サンプルを、トリフルオロ酢酸で酸性化し、その後濃縮した。残留物を、メタノール（２×１０ｍｌ）から濃縮した；１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）、d８．８４−８．８６（ｍ、２×２Ｈ）、８．５９−８．６４（ｍ、２×１Ｈ）、８．１７（ｄｄ、２×１Ｈ）、５．１４（ｄ、２×１Ｈ）、３．４５−３．８５（ｍ、２×２Ｈ）、３．１７−３．２４（ｍ、２×１Ｈ）、２．９３−３．０２（ｍ、２×１Ｈ）、２．７６−２．８６（ｍ、２×３Ｈ）、２．７１（ｓ、２×３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）、d１８０．０、１７６．４、１４９．２、１４５．５、１４３．９、１４２．９、１３１．８、６８．０、５０．１、４１．６、４０．１、３７．５、３２．０。イオンスプレー質量分析：ＭＨ＋（発見／計算）５７７／５７７。
【００４７】
トランス−４’−コチニン−Ｎ−（２−メルカプトエチル）カルボキサミド（Ｂ）
化合物Ａ（約２ｍｍｏｌ、遊離塩基）を、２０ｍｌのメタノールに溶解し、濃縮した。残留物を、２０ｍｌのメタノール／水、９９／１、体積／体積に再溶解し、０．６０ｇ（２．１０ｍｍｏｌ）のトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を添加した。混合液を室温で３時間攪拌し、その間ホスフィンが次第に溶解した。そして、混合液を１００ｍｌのクロロホルムで希釈し、５０ｍｌの１ＭのＮａＨＣＯ３で洗浄した。水層をクロロホルム（２×２５ｍｌ）で抽出した。結合した有機層を５０ｍｌの１ＭのＮａＨＣＯ３でもう一度洗浄し、再度水層をクロロホルム（２×２５ｍｌ）で抽出した。有機層を結合させ、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過した。ろ液を濃縮して、ＴＬＣ及びＨＰＬＣで測定し、約９７％純度のシロップとしてのＢを生成した。
【００４８】
ＨＰＬＣ分析は、以下の装備で操作されるWater Alliance 2695 HPLCを使用して実施された。
カラム：Ｃ１８、２．１×１５０ｍｍ、３μｍ（Waters BioSuite PA-A）
流量：０．２ｍｌ／分、紫外線検出器のスプリッター
溶離液Ａ：水、０．１％ＴＦＡ
溶離液Ｂ：アセトニトリル、０．０８％ＴＦＡ
勾配（Gradient）：２０分間で溶離液Ｂにおいて、５％〜６７％
検出：紫外線−Waters PDA 996：２５４ｎｍ；質量−Micromass Quattro Micro API:ES+
【００４９】
イオンスプレー質量分析：ＭＨ＋（発見／計算）２８０／２８０。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）、d８．６１（ｄｄ、１Ｈ）、８．５２（ｄ、１Ｈ）、７．５８（ｄｔ、１Ｈ）、７．３４−７．３９（ｍ、１Ｈ）、６．０４（ｂｒ、１Ｈ）、４．７７（ｄｄ、１Ｈ）、３．３３−３．５０（ｍ、２Ｈ）、２．７２−２．８８（ｍ、３Ｈ）、２．６０−２．６６（ｍ、２Ｈ）、２．６５（ｓ、３Ｈ）。１．２６（ｔ、１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）、d１７３．２、１７０．８、１５０．２、１４８．７、１３５．３、１３４．６、１２４．３、６５．０、４８．６、４２．６、３４．６、２８．６、２４．６。
【００５０】
トランス−３’−（２−メルカプトエチルアミノメチル）ニコチン（１）：
加工されていない化合物Ｂ（約２ｍｍｏｌ）を乾燥したテトラヒドロフラン（２×５ｍｌ）から濃縮して、１０ｍｌの乾燥したテトラヒドロフランに溶解した。この溶液を、窒素雰囲気下、テトラヒドロフラン中の１０ｍｌの１Ｍのボラン−テトラヒドロフラン錯体に徐々に添加した。この反応混合液を、室温で２０時間攪拌した。乾燥したメタノール（５ｍｌ）を添加し、混合液を濃縮した。残留物は乾燥したメタノール（３×１０ｍｌ）から濃縮して、１０ｍｌの１ＮのＨＣｌに溶解した。その後、５０ｍｌの１ＭのＮａＨＣＯ３を徐々に添加して、混合液をクロロホルム（３×２５ｍｌ）で抽出した。有機層を結合し、乾燥（ＭｇＳＯ４）及びろ過した。トリフルオロ酢酸（０．４５ｍｌ、６ｍｍｏｌ）をろ液に添加して、その後濃縮した。残留物をメタノール（２×１０ｍｌ）から濃縮し、さらにＨＰＬＣを用いて精製した。
【実施例２】
【００５１】
免疫接合体の調製は、J. W. Drijfhout and P. Hoogerhout: "Methods of preparing peptide-carrier conjugates"In: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (W. C. Chan and P. D. White eds.), Oxford University Press, 2000, pp. 229-241中に記載の方法を用い、実施例１で記載したチオール含有のハプテンから開始する。
【００５２】
原料
・担体：破傷風トキソイド（ＴＴｄ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。
・架橋剤：Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート、Ｎ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、Ｎ−（Ｎ−マレイミジルプロピオニル）−９−アミノ−４、７−ジオキサノナオイックアシドＮ−スクシンイミドエステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ２−マレイミド）、及びＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）。
【００５３】
ｐＨ８の０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液に、ＴＴｄ用には濃度３．０ｍｇ／ｍｌで、及びＢＳＡ用には濃度３．０ｍｇ／ｍｌで、担体を溶解した。架橋剤を新たに、濃度０．２０Ｍ又は８０ｍＭで、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解した。５０μｌの一定分量の０．２０Ｍの架橋剤を１．７５ｍｌのＴＴｄ溶液に添加し、一方で、５０μｌの８０ｍＭの架橋剤を１．７５ｍｌのＢＳＡ溶液に添加した。これら溶液は混合して、室温で１時間放置した。そして、ｐＨ６の５ｍＭのＥＤＴＡ（ヘリウムで脱気された）を含有する０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化されたＰＤ−１０（登録商標）カラムに反応液を加えた。溶出は、同じ緩衝液で行われた。変性タンパク質は、３．０ｍｌの量で採取され、直ちにチオール含有ハプテンの接合に使用される。
【００５４】
精製されたチオール含有ハプテン（トリフルオロ酢酸）（３〜４μｍｏｌ）を２５０μｌの水に溶解して、ｐＨ６の５ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液中の、２．０ｍｌの新たに調製されたスルフヒドリル反応担体の溶液に添加した。溶液を混合して、室温で１６〜２４時間放置した。そして、ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化されたＰＤ−１０（登録商標）カラムに、反応混合液を加えた。溶出は、同じ緩衝液で行われた。免疫接合体（約３．５ｍｇ）は、３．５ｍｌの量で採取して、ワクチンの調製をするまで２〜８℃で保存した。
【００５５】
チオール含有ハプテンとピリジルジチオプロピオニル変性タンパク質から調製された接合体は、ハプテン／タンパク質モル比が、ＴＴｄ及びＢＳＡにおいて、それぞれ約６０及び３０を示した。
【実施例３】
【００５６】
ワクチン及び予防接種
ＰＢＳ、ｐＨ７中のリン酸アルミニウム（０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌ）の縣濁液と共に化合物１、ブロモアセチル化されたＴＴｄ、及び（ブロモアセトアミド）プロピオニル化されたＴＴｄから調製された接合体の原液（１ｍｇ／ｍｌ）を適切に希釈することによって、ワクチンを調製した。単純（plain）ＰＢＳは偽ワクチンを得るためにリン酸アルミニウム縣濁液で希釈した。８匹のマウスのグループに、０日目と２８日目に０．３ｍｌのＰＢＳ中に５０μｇの免疫接合体と７５μｇのＡｌＰＯ４とを含有するワクチン組成物を接種した。血清は、４２日目に採取して、使用するまで−２０℃で保存した。
【実施例４】
【００５７】
抗体力価
実施例３の血清中の抗体力価は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。ＮＨＳ−ＰＥＧ２−マレイミド架橋剤を用いて調製した実施例２のハプテン−ＢＳＡ接合体を、被覆抗原（coating antigen）として使用した。ニコチン、コチニン、又はアセチルコリンは、抑制ＥＬＩＳＡ（inhibition ELISA）における阻害剤として使用した。
【００５８】
検証された接合体は、マウスに十分な抗体力価を誘発することが確認された。感応性はニコチン特異である。抗体はコチニン又はアセチルコリンと顕著に交差反応しない。
【実施例５】
【００５９】
トランス−３’−（３−メルカプトプロピオンアミドメチル）ニコチン（２）を以下のとおり合成した：
９０ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ）の３’−アミノメチルニコチン（Pentel et al. 2000）、０．４２ｇ（２．０ｍｍｏｌ）の３、３’−ジチオジプロピオン酸、及び１４４ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）のヒドロキシベンゾトリアゾール水和物の混合液を５ｍｌの乾燥したＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドから２回濃縮し、５ｍｌの乾燥したＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに再溶解し、そして１５５μｌ（１．０ｍｍｏｌ）のＮ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを添加した。この反応混合液を室温で一晩攪拌した。その後、１００μｌの水を添加し、１時間攪拌を続けた。最後に、０．４３ｇ（１．５ｍｍｏｌ）のトリス−カルボキシエチルホスフィン塩酸塩を添加し、さらに３時間攪拌を続けた。この反応混合液を濃縮した。残留物を１０ｍｌ、０．５ＭのＫＨＳＯ４に取り込み、クロロホルム（４×３ｍｌ）で洗浄した。固形Ｎａ２ＣＯ３を徐々に加えて、水層を中和し、クロロホルム（４×３ｍｌ）で抽出した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過及び濃縮して、２を主要製品（ＭＨ＋＝２７９．９）として生成した。純粋化合物は分取ＨＰＬＣ（preparative HPLC）によって得られた。
【実施例６】
【００６０】
トランス−３’−（Ｓ−アセチルメルカプトアセトアミドメチル）ニコチン（前駆物質３）を以下のように調製した：
９０ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ）の３’−アミノメチルニコチン（Pentel et al. 2000）を５ｍｌのアセトニトリルに溶解し、１４４ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）のヒドロキシベンゾトリアゾール水和物及び１６５ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェニルＳ−アセチルメルカプト酢酸を添加した。２時間後、７７μｌ（１．０ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸を添加し、反応混合液を濃縮した。３’−（Ｓ−アセチルメルカプトアセトアミドメチル）ニコチンは分取ＨＰＬＣによって精製し、質量分光分析によるとＭＨ＋＝３０８．０を示した。精製した化合物は、接合において使用するまで−２０℃で保存した。化合物３を、３’−（Ｓ−アセチルメルカプトアセトアミドメチル）ニコチンからヒドロキシルアミン等でのＳ−脱アセチル化により生成した。３が中間分離せずにニコチン接合体を生成するためには、スルフヒドリル反応タンパク質の存在下において脱アセチル化を行うことが最も都合よかった（Drijfhout and Hoogerhout 2000）。
【実施例７】
【００６１】
本発明のワクチンは、実施例２及び３に記載の方法に従って、化合物１、２、及び３の破傷風トキソイド接合体から調製した。それぞれのワクチンは、０日目と２８日目に、０．３ｍｌのＰＢＳ中に５０μｇの免疫接合体と７５μｇのＡｌＰＯ４とを含有するワクチン組成物を８匹のマウスのグループに予防接種することによって検証した。血清を４２日目に採取し、血清の抗体力価は、直接ＥＬＩＳＡにより、ハプテン−ＢＳＡ接合体の相同体を使用して測定した。続いて、４つのグループのマウスから採取した血清を、直接ＥＬＩＳＡにより、ハプテン１−ＢＳＡ接合体（「１−ＢＳＡ」）で検証した。ハプテン１−ＢＳＡ接合体で、ニコチンとアセチルコリンそれぞれを使用した抑制ＥＬＩＳＡは、ニコチンの結合親和性及び４つのグループのマウスから採取した血清の抗ニコチン抗体の特異性を評価するために用いた。
【００６２】
直接ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートのウェルは、ＰＢＳ中のハプテン−ＢＳＡ接合体（０．５μｇ／ｍｌ）の溶液１００μｌを、室温にて一晩インキュベートした。プレートを０．０４％のＴｗｅｅｎ８０を含有する水道水で洗浄した。ウェルは、３７℃で６０分間、ＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ８０で、１００μｌのそれぞれの血清の連続希釈をインキュベートした。プレートを０．０４％のＴｗｅｅｎ８０含有の水道水で洗浄し、ウェルを、３７℃で６０分間、ＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ８０で、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識のヤギ抗マウスＩｇＧの１：５，０００希釈の溶液１００μｌをインキュベートした。プレートを０．０４％のＴｗｅｅｎ８０含有の水道水で再洗浄した。基質の溶液は、９６％エタノール中１００μｌの３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（１０ｍｇ／ｍｌ）と４μｌの３０％の過酸化水素を１０ｍｌの０．１１Ｍの酢酸ナトリウム／クエン酸緩衝液、ｐＨ５．５に連続的に添加して新たに調製した。それぞれのウェルは、室温で１０分間、１００μｌの基質溶液をインキュベートした。最後に、反応は１００μｌの２Ｍの硫酸を添加することによって急冷され、４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。力価は最大吸光度の５０％（ＯＤ５０）で血清逆希釈率の対数として計算した。
【００６３】
抑制ＥＬＩＳＡ
各々のグループからの８匹のマウスの血清の等分量を混合し、ＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ８０で１：４００，０００に希釈した。阻害剤（ニコチン、コチニン、又はアセチルコリン）を１：４００，０００に希釈したプール血清中に１０−１Ｍの濃度で溶解した。阻害剤の１０倍段階希釈物（１０−１２Ｍまで）を、一定の１：４００，０００血清希釈物で作成した。
【００６４】
プレートをハプテン−ＢＳＡ接合体で被覆し、上述のように洗浄した。第２のステップでは、ウェルは、３７℃で６０分間、１００μｌの阻害剤溶液をインキュベートした。その後、０．０４％のＴｗｅｅｎ８０を含有する水道水で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧのインキュベーションの後、基質を上記のとおり操作した。力価は最大吸光度の５０％（ＯＤ５０）で阻害剤濃度（モル／Ｌ）の負の１０対数として計算した。ＯＤ（４５０ｎｍ）が阻害剤濃度（モル／Ｌ）の負の１０対数に対して示されるグラフから、ＩＣ５０の値が判定された。
【００６５】
結果
ハプテン−ＢＳＡ接合体の相同体で直接ＥＬＩＳＡにより測定した血清の平均抗体力価を表１に示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
１−ＢＳＡ接合体被覆における直接ＥＬＩＳＡによって測定した血清の平均抗体力価を表２に示す。
【００６８】
【表２】
【００６９】
阻害剤としてのニコチン被覆の１−ＢＳＡ接合体における抑制ＥＬＩＳＡの結果を、ＯＤ（４５０ｎｍ）が阻害剤濃度（モル／Ｌ）の負の１０対数に対して示されるグラフが描かれる図１に示す。
【００７０】
１−ＢＳＡにおいて、ニコチンＩＣ５０が、ハプテン１接合体を接種したマウスからの抗体において最大であり、ハプテン３接合体を接種したマウスからの抗体において最少であることをグラフは示す。
【００７１】
阻害剤としてのアセチルコリン被覆の１−ＢＳＡ接合体における抑制ＥＬＩＳＡの結果を、ＯＤ（４５０ｎｍ）が阻害剤濃度（モル／Ｌ）の負の１０対数に対して示されるグラフが描かれる図２に示す。
【００７２】
アセチルコリンを使用した抑制ＥＬＩＳＡの結果は、ニコチン抗体結合が特異的であることを示す。
【００７３】
これらの結果に基づき、本発明による破傷風トキソイド担体とのハプテン１、２、及び３の接合体は、マウスにおける抗ニコチン抗体反応を誘発することに適切に使用することができ、そのため、ニコチン中毒の治療、又は予防的治療に適したワクチンを提供することができると結論した。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
なし
【図１】
【図２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニコチン中毒に対するワクチンを提供する。より具体的には、本発明は、ニコチン中毒に対する効果的なワクチンを産出するために適する担体と適切に接合することができる新規ニコチン誘導体の形態のハプテンを提供する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関によると、世界中に１０億人以上の喫煙者がいる。毎年約４００万人が、ガン、心臓疾患、及びその他喫煙に起因する病気のため死亡していると推定される。
【０００３】
タバコが中毒性化学物質であるニコチンを含有するため人々は喫煙を続けることが広く認められている。多くの禁煙方法が、事実、タバコ中毒者にパッチやガム等のタバコ以外のソースからニコチンを与えている。
【０００４】
別の禁煙方法では、ニコチンに対する抗体を生成することによって、免疫システムを刺激して、システムからニコチンを除去するワクチンを提供する。それにより、ニコチンワクチンの接種後、個人がタバコを喫煙すると、抗体はニコチンが脳に到達する前にシステムから除去する。結果として、ニコチンの期待される刺激的効果は体験されないか、著しく減少する。喫煙者は、ニコチンの刺激的効果の減少又は消失を体験するため、喫煙の欲求を喪失する。
【０００５】
禁煙方法において用いられるニコチンワクチンは、多数の特許文献に記載されている。
【０００６】
例えば、国際公開第９９／６１０５４号は、５−又は６−ニコチニル−リンカー−キャリアタンパク質を含むニコチン免疫原を記載している。
【０００７】
さらに、米国特許第６，２３２，０８２号は、担体が、３’位、４’位、又は５’位の位置でニコチン残基に結合されるニコチン−担体接合体を記載している。米国特許第６，２３２，０８２号のハプテンは、（ＣＨ２）ｎ−Ｚ部分（式中、Ｚは、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、又はＳＨである）で３’位、４’位、又は５’位の位置で誘導体化されたニコチン部分を含有する。これらハプテンは、ホモ二官能性架橋剤又はヘテロ二官能性架橋剤（homobifunctional or heterobifunctional cross-linker）を用いて担体タンパク質に接合されている。この文献中の式（Ｉ）において、ＸとＹはそれぞれ、ハプテン及び担体各々と架橋剤の結合の基を示す。しかしながら、前記米国特許に記載された免疫原性の研究では、免疫反応を高めるためフロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント（complete and incomplete Freund's adjuvant）が使用された。このアジュバントは、ヒトへの使用が許可されていない。
【０００８】
国際公開第２００４／０９１１６号は、Ｏ−スクシニル−トランス−３’−ヒドロキシメチルニコチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを合成するステップと、ニコチン誘導体をアミド結合の形成下Ｑβの表面でリシンと反応させるステップとを含む、ニコチン−Ｑβ−接合体を生産する方法を記載している。これら接合体の重大な欠点は、生体内での安定性に劣ることである。
【０００９】
国際公開第０２／４９６６７号は、コチニンが１、２、５、６、又は４’位の位置を通して担体と接合されるコチニン接合体を記載している。国際公開第０２／４９６６７号は、ガンマ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）を使用してハプテンがオボアルブミンと接合される、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨの基で誘導体化されたコチニン部分を含むハプテンの接合体を開示している。この国際出願では、コチニンが生体内でニコチンの作用を中和できることが観察されている。さらに、コチニンに対する免疫反応が、ニコチンの神経学的効果においてコチニンの抑制作用を減少することができ、それにより、被験者のニコチンへの渇望がより少なくなるという結果になるという仮説がたてられている。この仮説は、特に実験的証拠により立証されていないので、有望ではない。
【特許文献１】国際公開第９９／６１０５４号
【特許文献２】米国特許第６，２３２，０８２号
【特許文献３】国際公開第２００４／０９１１６号
【特許文献４】国際公開第０２／４９６６７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者は、非常に効果的なニコチンワクチンの製造に有利に使用することができる新規ハプテンを開発した。
【００１１】
本発明によるハプテンは、以下の式のニコチン誘導体である：
【００１２】
【化１】
【００１３】
（式中、５員環又は６員環のいずれかが、１個のＲ−ＳＨラジカルと置換され、ここで、ＲはＣＨ２−Ｙ−Ｚを表し：
Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、又はＮＨ−ＣＯを表し；
Ｚは、直鎖若しくは分岐のＣ１−Ｃ２２アルキレン、直鎖若しくは分岐のＣ２−Ｃ２２アルケニレン、又はポリアルキレングリコール部分を表す。）
【００１４】
前述のニコチン誘導体は、ニコチン中毒の治療、又は予防的治療に有利に使用できる免疫原性ニコチン−担体接合体を製造するために用いることができ、前記治療はニコチン中毒に罹患している、又はニコチン中毒になる危険のある個人へ接合体を投与することを含む。本発明のニコチン−担体接合体は、非常に安定性が高く、数ヶ月間、又は数年間でさえ免疫原性の効能を顕著に喪失せずに保存することができる。また、特にニコチン誘導体がサクシンイミド架橋剤によって接合体と結合された場合、及びニコチン誘導体と架橋剤がチオエーテル結合によって連結された場合に、本接合体の生体内での安定性が非常に高い。さらに、本ニコチン−担体接合体は、数ステップ以内の比較的単純な合成ステップを用いて製造することができ、明確に確立された接合体の製品を多量に産出する
【００１５】
したがって、本発明の１つの態様は、以下の式（Ｉ）のニコチン誘導体に関する。
【００１６】
【化２】
【００１７】
（式中、５員環又は６員環のいずれかが、１個のＲ−ＳＨラジカルと置換され、ここで、ＲはＣＨ２−Ｙ−Ｚを表し：
Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、又はＮＨ−ＣＯを表し；
Ｚは、直鎖若しくは分岐のＣ１−Ｃ２２アルキレン、直鎖若しくは分岐のＣ２−Ｃ２２アルケニレン、又はポリアルキレングリコール部分を表す。）
【００１８】
別の特に好ましい実施態様によると、式（Ｉ）では、Ｙは、ＮＨ又はＮＨ−ＣＯを表す。最も好ましくは、ＹはＮＨを表す。
【００１９】
さらに好ましい実施態様によると、式（Ｉ）のＺは、Ｃ１−Ｃ４アルキレンであり、最も好ましくは、エチレンである。
【００２０】
式（Ｉ）中のＲ−ＳＨ残基は、ニコチン分子の５員環の３’位、４’位、又は５’位の位置に結合していてもよい。好ましくは、Ｒは、３’位又は４’位の位置に結合され、最も好ましくは、前記５員環の３’位の位置に結合される。
【００２１】
別の特に好ましい実施態様によると、式（Ｉ）のニコチン誘導体は、Ｒ−ＳＨ残基でトランス置換される。別の特に好ましい実施態様によると、本発明のニコチン誘導体は、Ｌ−ニコチン誘導体である。
【００２２】
本発明の特に好ましいニコチン誘導体は、３’−（２−メルカプトエチルアミノメチル）ニコチン、３’−（３−メルカプトプロピオンアミドメチル）ニコチン、及び３’−（メルカプトアセトアミドメチル）ニコチンである。
【００２３】
本発明の別の態様は、以下の式（Ｉａ）によって表される、本発明のニコチン誘導体の前駆物質に関する。
【００２４】
【化３】
【００２５】
（式中、５員環又は６員環のいずれかが、１個のＲ−Ｓ−ＣＯ−Ｒ’部分で置換され、Ｒは上の定義と同じ意味であり、ここにおいて、Ｒ’−ＣＯは、低級アシル基を表し、好ましくは、１〜８個の炭素原子、より好ましくは、１〜６個の炭素原子、またより好ましくは、１〜５個の炭素原子を含む分岐又は直鎖のアシル基を表す。特に好ましい実施態様では、上記式のＲ’−ＣＯは、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、及びピバロイルから選択される低級アシルを表し、最も好ましくは、アセチル及びプロピオニルである。
【００２６】
本発明の特に好ましい実施態様では、上記前駆物質は、３’−（Ｓ−アセチルメルカプトアセトアミド−メチル）ニコチンである。これら前駆物質は、Ｓ−脱アセチル化とその後の接合により、好ましくは２ステップのワンポット法において、本発明の対応するニコチン誘導体接合体に簡単に変換することができる。適切なＳ−脱アセチル化反応は、一般的に当業者に知られている。加えて、発明者は、これらＳ−アセチルメルカプト化合物は、酸化、すなわち、ジスルフィド二量体の形成に対してかなり非感受性であることを確認した。そして、前駆物質は、対応するニコチン誘導体より、精製、保存の間の取扱いが、より便利であることを確認した。
【００２７】
本発明の別の態様は、以下の式（II）のハプテン−担体接合体に関する。
【００２８】
【化４】
【００２９】
（式中、５員環又は６員環のいずれかが１個のＲ−ＳＨラジカルで置換される；ｐは、１〜５００であり；Ｒは、式（Ｉ）に関する上述の定義と同じ意味である。）
【００３０】
本発明のハプテン−担体接合体で採用される担体は、ヒトにおいて安全に使用することができ、また本ニコチン誘導体と化学的に連結することができる、いかなる免疫原性の物質でもよい。好ましい実施態様では、担体は、免疫原性物質、ウィルス、ウィルス様粒子、タンパク質複合体、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）からなる群より選択される。特に好ましい実施態様によると、担体は、免疫原性タンパク質又はポリペプチドである。免疫原性タンパク質の特に適切な例は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヘモシアニン、アルブミン、非毒性変異ジフテリアトキソイドＣＲＭｌ９７、髄膜炎菌由来の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、非耐熱性大腸菌のＢサブユニット、緑膿菌由来の組換えエキソタンパク質Ａ（ｒＥＰＡ）、バクテリオファージＱｂの組換えコートタンパク質（coat protein）から組み立てたウィルス様粒子を含み、最も好ましい例は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヘモシアニン、アルブミン、非毒性変異ジフテリアトキソイドＣＲＭｌ９７、髄膜炎菌由来の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、非耐熱性大腸菌のＢサブユニット、及びバクテリオファージＱｂの組換えコートタンパク質から組み立てたウィルス様粒子である。本発明の好ましい実施態様では、ここで定義されたようなハプテン−担体接合体であって、担体がタンパク質で、ハプテン：タンパク質のモル比が１を超えるハプテン−担体接合体を提供する。
【００３１】
本免疫接合体のスペーサー（spacer）は、共有結合的にニコチン誘導体を担体に連結する。ハプテンと担体（特にタンパク質／ポリペプチド成分）を架橋するために使用することができるスペーサーは、当技術分野で周知である。好ましくは、本発明では、スペーサーはヘテロ二官能性架橋剤の残基であり、特にスクシンイミジル架橋剤であり、例えば：
− Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート、
− Ｎ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、
− Ｎ−（ε−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、
− Ｎ−（Ｎ−マレイミジルプロピオニル）−９−アミノ−４、７−ジオキサノナオイックアシド Ｎ−スクシンイミドエステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ２−マレイミド）、又は
− Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）であり、架橋剤は、スルフヒドリル反応担体を生成するため担体を変性させるのに使用される。第２ステップでは、ニコチン誘導体は、免疫接合体を生成するためスルフヒドリル反応タンパク質と結合され、ここにおいて、ヘテロ二官能性架橋剤由来のスペーサーが、ニコチン誘導体を担体と結合させる。好ましい実施態様によると、本接合体では、ハプテンとスペーサーが、チオエーテル結合により結合される。チオエーテル結合により結合されたハプテンとスペーサーの接合体は、生体内での安定性が高いという有利な点を示す。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、ワクチン組成物、特にニコチン中毒の予防又は治療方法において使用されるワクチン組成物の調製において上で定義したハプテン−担体接合体の使用に関し、上記方法は、治療有効量のハプテン−担体接合体を投与することを含む。本発明の接合体は、生体内の条件で非常に安定しているという有利な点を示す。さらに、本ハプテン−担体接合体は、明確に定義された形に調製することができ、好ましくない副作用のリスクを効果的に最小限に抑制できることを意味する。
【００３３】
適切な投与方法は、皮下投与、筋内投与、経粘膜投与、及び静脈内投与を含む。最も好ましくは、ワクチン組成物は、皮下投与、又は筋内投与される。
【００３４】
ニコチンの中毒作用は、ニコチンの血液脳関門を通過する能力と関連すると信じられている。本発明のニコチン中毒の治療又は予防方法は、ニコチンの血液脳関門の通過を防止することによる。特に、ニコチンハプテン−担体接合体の人への投与は、ニコチンに対する抗体を当人の血流中に生成させる。当人が喫煙すると、血液中のニコチンは、循環する抗ニコチン抗体により結合され、ニコチンの脳への到達を抑止することになる。そのため、抗体は、脳で発生する生理学的及び心理学的なニコチンの作用を抑止する。喫煙者は、これら作用の減少及び消失を体験するため、喫煙への欲求を喪失する。本発明のニコチンハプテン−担体接合体を接種した後、無煙タバコを使用した場合にも、同様の治療効果が期待される。加えて、本発明の接合体と抗体は、末梢神経系を刺激するニコチンの能力に影響を与えることにより効果を発揮することができる。
【００３５】
本発明の接合体は、ニコチン中毒の治療と予防に適している。ニコチン中毒を治療するためには、本発明のニコチン−担体接合体をニコチン中毒に罹患している人に投与する。ニコチン中毒を予防するためには、ニコチン中毒に罹る危険のある人を、本発明による接合体で治療する。
【００３６】
本発明のワクチン組成物は、それに対する免疫反応を誘発するために十分な量の、少なくとも１つのニコチンハプテン−担体接合体を含む。本発明のニコチンハプテン担体接合体の初回接種は、ニコチンに特異な高力価の抗体を作る。ニコチン中毒の治療が必要な人に投与する接合体の治療有効量は、当業者により容易に決定される。適切な投薬量は、１〜１０００μｇ／回（dose）の範囲である。一般的に、人が外来抗原に対して抗体を作るためには、１〜数週間かかる。血液中の抗体の生成は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（radioimmunoassay）、表面プラズマ共鳴（surface plasma resonance）、及びウエスタンブロッティング法等の当業者に周知の技術を用いてモニターすることができる。治療有効性も、血圧等、ニコチンの様々な身体的作用を評価することによってモニターすることができる。
【００３７】
本発明の免疫原性接合体の初回接種は、１又は複数回の接合体のその後の「追加接種（booster）」の投与が続いてもよいと理解される。そのような追加接種は、本発明のニコチンハプテン−担体接合体に対する抗体の生成を増加させることになる。
【００３８】
本発明のワクチン組成物は、少なくとも１つのアドジュバントを含有してもよい。本発明において使用されるアドジュバントは、担体タンパク質の効果が阻害されないように選択される。本発明において使用されるアドジュバントは、ヒトにとって生理学的に許容されるものであって、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、種々の界面活性剤（特に、マンニチルオレイン酸）が鉱油と組み合わされたモンタナイド（登録商標）（Montanide）等のオイル／界面活性剤ベースのエマルションアドジュバント、ＭＦ５９（登録商標）等のスクアレン含有エマルション、モノホスホリルリピドＡ（monophosphoryl lipid A）、又はネイセリア変異体リポポリサッカライド（Neisseriae mutant lipopolysaccharide）（国際出願ＰＣＴ／ＮＬ９８／００６３号に記載の通り）を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明のワクチン組成物は、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤を任意に含有してもよい。適切な賦形剤は、滅菌水、食塩水、及び緩衝液を含む。好ましい実施態様によると、ワクチン組成物は、薬学的に許容されるｐＨの含水食塩水に可溶化された本発明のハプテン−担体接合体を含む。あるいは、ワクチン組成物は、ハプテン−担体接合体の縣濁液を含む。
【００４０】
加えて、ワクチン組成物は、分散媒、被覆剤、マイクロスフィア（microspheres）、リポソーム、マイクロカプセル、脂質、界面活性剤、滑剤、防腐剤及び安定剤等の、少なくとも１つの助剤を任意で含有してもよい。
【００４１】
本発明のワクチン組成物は、好ましくは滅菌されている。さらに、この組成物は、微生物の侵入及び増殖に対して防御する成分を含有してもよい。
【００４２】
ワクチン組成物は、即時に投与ができる状態の殺菌した水性液体の形態に製造されることが好ましい。
【００４３】
本発明によるニコチン誘導体は、タンパク質−タンパク質接合体を産出しない合成ルートを用いて、担体と有利に結合することができる。そのようなタンパク質−タンパク質接合体は、ワクチン組成物の溶解性と同様に効能にもまた不利に影響するため、本発明の別の態様は、本発明によるハプテン−担体接合体及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン組成物であって、タンパク質−タンパク質接合体を含有しないワクチン組成物に関する。
【００４４】
本発明は、さらに以下の実施例によって説明される。
【実施例１】
【００４５】
トランス−３’−ニコチン−Ｎ−（２−メルカプトエチル）カルボキサミド（１）は、以下のように合成された：
Ｎ，Ｎ’−ビス−（トランス−４’−コチニニルカルボニル）シスタミン（Ａ）
１．００ｇ（４．５４ｍｍｏｌ）のトランス−４’−コチニンカルボン酸、０．４５ｇ（２．００ｍｍｏｌ）のシスタミン二塩酸塩、及び０．６８ｇ（４．４４ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合液を、２５ｍｌの乾燥したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから２回濃縮した。残留物を、２５ｍｌの乾燥したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、０．８０ｍｌ（４．５９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン及び０．６８ｍｌ（４．３９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを添加した。混合液を室温で攪拌した。２０時間後、４ｍｌ（０．２ｍｏｌ）の水を添加し、１時間攪拌を続けた。その後、混合液を真空で濃縮した。残留物は、１００ｍｌの０．５ＭのＫＨＳＯ４に取り込み、クロロホルム（３×２５ｍｌ）で洗浄した。固体のＮａ２ＣＯ３．Ｈ２Ｏ（８．０ｇ）を徐々に水層に添加し、そしてクロロホルム（３×２５ｍｌ）で抽出した。有機層は結合し、乾燥され（ＭｇＳＯ４）、ろ過、濃縮して、シロップとしての化合物Ａを生成し、次のステップでは、精製せずに使用した。
【００４６】
クロロホルム中の化合物Ａの小サンプルを、トリフルオロ酢酸で酸性化し、その後濃縮した。残留物を、メタノール（２×１０ｍｌ）から濃縮した；１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）、d８．８４−８．８６（ｍ、２×２Ｈ）、８．５９−８．６４（ｍ、２×１Ｈ）、８．１７（ｄｄ、２×１Ｈ）、５．１４（ｄ、２×１Ｈ）、３．４５−３．８５（ｍ、２×２Ｈ）、３．１７−３．２４（ｍ、２×１Ｈ）、２．９３−３．０２（ｍ、２×１Ｈ）、２．７６−２．８６（ｍ、２×３Ｈ）、２．７１（ｓ、２×３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）、d１８０．０、１７６．４、１４９．２、１４５．５、１４３．９、１４２．９、１３１．８、６８．０、５０．１、４１．６、４０．１、３７．５、３２．０。イオンスプレー質量分析：ＭＨ＋（発見／計算）５７７／５７７。
【００４７】
トランス−４’−コチニン−Ｎ−（２−メルカプトエチル）カルボキサミド（Ｂ）
化合物Ａ（約２ｍｍｏｌ、遊離塩基）を、２０ｍｌのメタノールに溶解し、濃縮した。残留物を、２０ｍｌのメタノール／水、９９／１、体積／体積に再溶解し、０．６０ｇ（２．１０ｍｍｏｌ）のトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を添加した。混合液を室温で３時間攪拌し、その間ホスフィンが次第に溶解した。そして、混合液を１００ｍｌのクロロホルムで希釈し、５０ｍｌの１ＭのＮａＨＣＯ３で洗浄した。水層をクロロホルム（２×２５ｍｌ）で抽出した。結合した有機層を５０ｍｌの１ＭのＮａＨＣＯ３でもう一度洗浄し、再度水層をクロロホルム（２×２５ｍｌ）で抽出した。有機層を結合させ、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過した。ろ液を濃縮して、ＴＬＣ及びＨＰＬＣで測定し、約９７％純度のシロップとしてのＢを生成した。
【００４８】
ＨＰＬＣ分析は、以下の装備で操作されるWater Alliance 2695 HPLCを使用して実施された。
カラム：Ｃ１８、２．１×１５０ｍｍ、３μｍ（Waters BioSuite PA-A）
流量：０．２ｍｌ／分、紫外線検出器のスプリッター
溶離液Ａ：水、０．１％ＴＦＡ
溶離液Ｂ：アセトニトリル、０．０８％ＴＦＡ
勾配（Gradient）：２０分間で溶離液Ｂにおいて、５％〜６７％
検出：紫外線−Waters PDA 996：２５４ｎｍ；質量−Micromass Quattro Micro API:ES+
【００４９】
イオンスプレー質量分析：ＭＨ＋（発見／計算）２８０／２８０。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）、d８．６１（ｄｄ、１Ｈ）、８．５２（ｄ、１Ｈ）、７．５８（ｄｔ、１Ｈ）、７．３４−７．３９（ｍ、１Ｈ）、６．０４（ｂｒ、１Ｈ）、４．７７（ｄｄ、１Ｈ）、３．３３−３．５０（ｍ、２Ｈ）、２．７２−２．８８（ｍ、３Ｈ）、２．６０−２．６６（ｍ、２Ｈ）、２．６５（ｓ、３Ｈ）。１．２６（ｔ、１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）、d１７３．２、１７０．８、１５０．２、１４８．７、１３５．３、１３４．６、１２４．３、６５．０、４８．６、４２．６、３４．６、２８．６、２４．６。
【００５０】
トランス−３’−（２−メルカプトエチルアミノメチル）ニコチン（１）：
加工されていない化合物Ｂ（約２ｍｍｏｌ）を乾燥したテトラヒドロフラン（２×５ｍｌ）から濃縮して、１０ｍｌの乾燥したテトラヒドロフランに溶解した。この溶液を、窒素雰囲気下、テトラヒドロフラン中の１０ｍｌの１Ｍのボラン−テトラヒドロフラン錯体に徐々に添加した。この反応混合液を、室温で２０時間攪拌した。乾燥したメタノール（５ｍｌ）を添加し、混合液を濃縮した。残留物は乾燥したメタノール（３×１０ｍｌ）から濃縮して、１０ｍｌの１ＮのＨＣｌに溶解した。その後、５０ｍｌの１ＭのＮａＨＣＯ３を徐々に添加して、混合液をクロロホルム（３×２５ｍｌ）で抽出した。有機層を結合し、乾燥（ＭｇＳＯ４）及びろ過した。トリフルオロ酢酸（０．４５ｍｌ、６ｍｍｏｌ）をろ液に添加して、その後濃縮した。残留物をメタノール（２×１０ｍｌ）から濃縮し、さらにＨＰＬＣを用いて精製した。
【実施例２】
【００５１】
免疫接合体の調製は、J. W. Drijfhout and P. Hoogerhout: "Methods of preparing peptide-carrier conjugates"In: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (W. C. Chan and P. D. White eds.), Oxford University Press, 2000, pp. 229-241中に記載の方法を用い、実施例１で記載したチオール含有のハプテンから開始する。
【００５２】
原料
・担体：破傷風トキソイド（ＴＴｄ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。
・架橋剤：Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート、Ｎ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、Ｎ−（Ｎ−マレイミジルプロピオニル）−９−アミノ−４、７−ジオキサノナオイックアシドＮ−スクシンイミドエステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ２−マレイミド）、及びＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）。
【００５３】
ｐＨ８の０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液に、ＴＴｄ用には濃度３．０ｍｇ／ｍｌで、及びＢＳＡ用には濃度３．０ｍｇ／ｍｌで、担体を溶解した。架橋剤を新たに、濃度０．２０Ｍ又は８０ｍＭで、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解した。５０μｌの一定分量の０．２０Ｍの架橋剤を１．７５ｍｌのＴＴｄ溶液に添加し、一方で、５０μｌの８０ｍＭの架橋剤を１．７５ｍｌのＢＳＡ溶液に添加した。これら溶液は混合して、室温で１時間放置した。そして、ｐＨ６の５ｍＭのＥＤＴＡ（ヘリウムで脱気された）を含有する０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化されたＰＤ−１０（登録商標）カラムに反応液を加えた。溶出は、同じ緩衝液で行われた。変性タンパク質は、３．０ｍｌの量で採取され、直ちにチオール含有ハプテンの接合に使用される。
【００５４】
精製されたチオール含有ハプテン（トリフルオロ酢酸）（３〜４μｍｏｌ）を２５０μｌの水に溶解して、ｐＨ６の５ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液中の、２．０ｍｌの新たに調製されたスルフヒドリル反応担体の溶液に添加した。溶液を混合して、室温で１６〜２４時間放置した。そして、ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化されたＰＤ−１０（登録商標）カラムに、反応混合液を加えた。溶出は、同じ緩衝液で行われた。免疫接合体（約３．５ｍｇ）は、３．５ｍｌの量で採取して、ワクチンの調製をするまで２〜８℃で保存した。
【００５５】
チオール含有ハプテンとピリジルジチオプロピオニル変性タンパク質から調製された接合体は、ハプテン／タンパク質モル比が、ＴＴｄ及びＢＳＡにおいて、それぞれ約６０及び３０を示した。
【実施例３】
【００５６】
ワクチン及び予防接種
ＰＢＳ、ｐＨ７中のリン酸アルミニウム（０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌ）の縣濁液と共に化合物１、ブロモアセチル化されたＴＴｄ、及び（ブロモアセトアミド）プロピオニル化されたＴＴｄから調製された接合体の原液（１ｍｇ／ｍｌ）を適切に希釈することによって、ワクチンを調製した。単純（plain）ＰＢＳは偽ワクチンを得るためにリン酸アルミニウム縣濁液で希釈した。８匹のマウスのグループに、０日目と２８日目に０．３ｍｌのＰＢＳ中に５０μｇの免疫接合体と７５μｇのＡｌＰＯ４とを含有するワクチン組成物を接種した。血清は、４２日目に採取して、使用するまで−２０℃で保存した。
【実施例４】
【００５７】
抗体力価
実施例３の血清中の抗体力価は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。ＮＨＳ−ＰＥＧ２−マレイミド架橋剤を用いて調製した実施例２のハプテン−ＢＳＡ接合体を、被覆抗原（coating antigen）として使用した。ニコチン、コチニン、又はアセチルコリンは、抑制ＥＬＩＳＡ（inhibition ELISA）における阻害剤として使用した。
【００５８】
検証された接合体は、マウスに十分な抗体力価を誘発することが確認された。感応性はニコチン特異である。抗体はコチニン又はアセチルコリンと顕著に交差反応しない。
【実施例５】
【００５９】
トランス−３’−（３−メルカプトプロピオンアミドメチル）ニコチン（２）を以下のとおり合成した：
９０ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ）の３’−アミノメチルニコチン（Pentel et al. 2000）、０．４２ｇ（２．０ｍｍｏｌ）の３、３’−ジチオジプロピオン酸、及び１４４ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）のヒドロキシベンゾトリアゾール水和物の混合液を５ｍｌの乾燥したＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドから２回濃縮し、５ｍｌの乾燥したＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに再溶解し、そして１５５μｌ（１．０ｍｍｏｌ）のＮ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを添加した。この反応混合液を室温で一晩攪拌した。その後、１００μｌの水を添加し、１時間攪拌を続けた。最後に、０．４３ｇ（１．５ｍｍｏｌ）のトリス−カルボキシエチルホスフィン塩酸塩を添加し、さらに３時間攪拌を続けた。この反応混合液を濃縮した。残留物を１０ｍｌ、０．５ＭのＫＨＳＯ４に取り込み、クロロホルム（４×３ｍｌ）で洗浄した。固形Ｎａ２ＣＯ３を徐々に加えて、水層を中和し、クロロホルム（４×３ｍｌ）で抽出した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過及び濃縮して、２を主要製品（ＭＨ＋＝２７９．９）として生成した。純粋化合物は分取ＨＰＬＣ（preparative HPLC）によって得られた。
【実施例６】
【００６０】
トランス−３’−（Ｓ−アセチルメルカプトアセトアミドメチル）ニコチン（前駆物質３）を以下のように調製した：
９０ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ）の３’−アミノメチルニコチン（Pentel et al. 2000）を５ｍｌのアセトニトリルに溶解し、１４４ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）のヒドロキシベンゾトリアゾール水和物及び１６５ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェニルＳ−アセチルメルカプト酢酸を添加した。２時間後、７７μｌ（１．０ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸を添加し、反応混合液を濃縮した。３’−（Ｓ−アセチルメルカプトアセトアミドメチル）ニコチンは分取ＨＰＬＣによって精製し、質量分光分析によるとＭＨ＋＝３０８．０を示した。精製した化合物は、接合において使用するまで−２０℃で保存した。化合物３を、３’−（Ｓ−アセチルメルカプトアセトアミドメチル）ニコチンからヒドロキシルアミン等でのＳ−脱アセチル化により生成した。３が中間分離せずにニコチン接合体を生成するためには、スルフヒドリル反応タンパク質の存在下において脱アセチル化を行うことが最も都合よかった（Drijfhout and Hoogerhout 2000）。
【実施例７】
【００６１】
本発明のワクチンは、実施例２及び３に記載の方法に従って、化合物１、２、及び３の破傷風トキソイド接合体から調製した。それぞれのワクチンは、０日目と２８日目に、０．３ｍｌのＰＢＳ中に５０μｇの免疫接合体と７５μｇのＡｌＰＯ４とを含有するワクチン組成物を８匹のマウスのグループに予防接種することによって検証した。血清を４２日目に採取し、血清の抗体力価は、直接ＥＬＩＳＡにより、ハプテン−ＢＳＡ接合体の相同体を使用して測定した。続いて、４つのグループのマウスから採取した血清を、直接ＥＬＩＳＡにより、ハプテン１−ＢＳＡ接合体（「１−ＢＳＡ」）で検証した。ハプテン１−ＢＳＡ接合体で、ニコチンとアセチルコリンそれぞれを使用した抑制ＥＬＩＳＡは、ニコチンの結合親和性及び４つのグループのマウスから採取した血清の抗ニコチン抗体の特異性を評価するために用いた。
【００６２】
直接ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートのウェルは、ＰＢＳ中のハプテン−ＢＳＡ接合体（０．５μｇ／ｍｌ）の溶液１００μｌを、室温にて一晩インキュベートした。プレートを０．０４％のＴｗｅｅｎ８０を含有する水道水で洗浄した。ウェルは、３７℃で６０分間、ＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ８０で、１００μｌのそれぞれの血清の連続希釈をインキュベートした。プレートを０．０４％のＴｗｅｅｎ８０含有の水道水で洗浄し、ウェルを、３７℃で６０分間、ＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ８０で、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識のヤギ抗マウスＩｇＧの１：５，０００希釈の溶液１００μｌをインキュベートした。プレートを０．０４％のＴｗｅｅｎ８０含有の水道水で再洗浄した。基質の溶液は、９６％エタノール中１００μｌの３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（１０ｍｇ／ｍｌ）と４μｌの３０％の過酸化水素を１０ｍｌの０．１１Ｍの酢酸ナトリウム／クエン酸緩衝液、ｐＨ５．５に連続的に添加して新たに調製した。それぞれのウェルは、室温で１０分間、１００μｌの基質溶液をインキュベートした。最後に、反応は１００μｌの２Ｍの硫酸を添加することによって急冷され、４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。力価は最大吸光度の５０％（ＯＤ５０）で血清逆希釈率の対数として計算した。
【００６３】
抑制ＥＬＩＳＡ
各々のグループからの８匹のマウスの血清の等分量を混合し、ＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ８０で１：４００，０００に希釈した。阻害剤（ニコチン、コチニン、又はアセチルコリン）を１：４００，０００に希釈したプール血清中に１０−１Ｍの濃度で溶解した。阻害剤の１０倍段階希釈物（１０−１２Ｍまで）を、一定の１：４００，０００血清希釈物で作成した。
【００６４】
プレートをハプテン−ＢＳＡ接合体で被覆し、上述のように洗浄した。第２のステップでは、ウェルは、３７℃で６０分間、１００μｌの阻害剤溶液をインキュベートした。その後、０．０４％のＴｗｅｅｎ８０を含有する水道水で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧのインキュベーションの後、基質を上記のとおり操作した。力価は最大吸光度の５０％（ＯＤ５０）で阻害剤濃度（モル／Ｌ）の負の１０対数として計算した。ＯＤ（４５０ｎｍ）が阻害剤濃度（モル／Ｌ）の負の１０対数に対して示されるグラフから、ＩＣ５０の値が判定された。
【００６５】
結果
ハプテン−ＢＳＡ接合体の相同体で直接ＥＬＩＳＡにより測定した血清の平均抗体力価を表１に示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
１−ＢＳＡ接合体被覆における直接ＥＬＩＳＡによって測定した血清の平均抗体力価を表２に示す。
【００６８】
【表２】
【００６９】
阻害剤としてのニコチン被覆の１−ＢＳＡ接合体における抑制ＥＬＩＳＡの結果を、ＯＤ（４５０ｎｍ）が阻害剤濃度（モル／Ｌ）の負の１０対数に対して示されるグラフが描かれる図１に示す。
【００７０】
１−ＢＳＡにおいて、ニコチンＩＣ５０が、ハプテン１接合体を接種したマウスからの抗体において最大であり、ハプテン３接合体を接種したマウスからの抗体において最少であることをグラフは示す。
【００７１】
阻害剤としてのアセチルコリン被覆の１−ＢＳＡ接合体における抑制ＥＬＩＳＡの結果を、ＯＤ（４５０ｎｍ）が阻害剤濃度（モル／Ｌ）の負の１０対数に対して示されるグラフが描かれる図２に示す。
【００７２】
アセチルコリンを使用した抑制ＥＬＩＳＡの結果は、ニコチン抗体結合が特異的であることを示す。
【００７３】
これらの結果に基づき、本発明による破傷風トキソイド担体とのハプテン１、２、及び３の接合体は、マウスにおける抗ニコチン抗体反応を誘発することに適切に使用することができ、そのため、ニコチン中毒の治療、又は予防的治療に適したワクチンを提供することができると結論した。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
なし
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有するニコチン誘導体であって：
【化１】
式中、５員環又は６員環のいずれかが、１個のＲ−ＳＨラジカルで置換され、ここで、ＲはＣＨ２−Ｙ−Ｚを表し：
Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、又はＮＨ−ＣＯを表し；また
Ｚは、直鎖若しくは分岐のＣ１〜Ｃ２２アルキレン、直鎖若しくは分岐のＣ２〜Ｃ２２アルケニレン、又は、ポリアルキレングリコール部分を表す。
【請求項２】
ＹがＮＨ、又はＮＨ−ＣＯを表す、請求項１に記載のニコチン誘導体。
【請求項３】
ＹがＮＨを表す、請求項１又は２に記載のニコチン誘導体。
【請求項４】
ＺがＣ１〜Ｃ４アルキレン、好ましくはエチレンを表す、請求項１〜３のいずれかに記載のニコチン誘導体。
【請求項５】
Ｒが３’位又は４’位の位置に結合され、好ましくは５員環の３’位の位置に結合される、請求項１〜４のいずれかに記載のニコチン誘導体。
【請求項６】
誘導体が３’−（２−メルカプトエチルアミノメチル）−ニコチンである、請求項１〜５のいずれかに記載のニコチン誘導体。
【請求項７】
誘導体が３’−（３−メルカプトプロピオンアミドメチル）−ニコチンである、請求項１〜５のいずれかに記載のニコチン誘導体。
【請求項８】
誘導体が３’−（メルカプトアセトアミドメチル）−ニコチンである、請求項１〜５のいずれかに記載のニコチン誘導体。
【請求項９】
以下の式で表されるニコチン誘導体前駆物質であって：
【化２】
式中、５員環又は６員環のいずれかが、１個のＲ−Ｓ−ＣＯ−Ｒ’部分で置換され、Ｒは請求項１〜５のいずれかの定義と同じ意味であり、ここにおいて、Ｒ’−ＣＯは、低級アシル基を表す。
【請求項１０】
前駆物質が３’−（Ｓ−アセチルメルカプトアセトアミドメチル）ニコチンである、請求項９に記載のニコチン誘導体前駆物質。
【請求項１１】
以下の式をもつハプテン−担体接合体であって：
【化３】
式中、５員環又は６員環のいずれかが、１個のＲ−ＳＨラジカルで置換され；ｐは、１〜５００であり；Ｒは、請求項１の記載と同じ意味をもつ。
【請求項１２】
担体が、免疫原性物質、ウィルス、ウィルス様粒子、タンパク質複合体、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）からなる群より選択される、請求項１１に記載のハプテン−担体接合体。
【請求項１３】
担体が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヘモシアニン、アルブミン、非毒性変異ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、髄膜炎菌由来の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、易熱性大腸菌のＢサブユニット、緑膿菌由来の組換えエキソタンパク質Ａ（ｒＥＰＡ）、及びバクテリオファージＱｂの組換えコートタンパク質から構築したウィルス様粒子からなる群より選択されるタンパク質である、請求項１２に記載のハプテン−担体接合体。
【請求項１４】
ニコチン中毒の予防及び治療方法において使用されるワクチン組成物の調製におけるハプテン−担体接合体の使用であって、前記方法が治療有効量の請求項１１〜１３のいずれかに記載のハプテン−担体接合体を投与することを含む、ハプテン−担体接合体の使用。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれかに記載のハプテン−担体接合体と薬学的に許容される賦形剤とを含むワクチン組成物であって、タンパク質−タンパク質接合体を含有しないワクチン組成物。
【請求項１】
以下の式を有するニコチン誘導体であって：
【化１】
式中、５員環又は６員環のいずれかが、１個のＲ−ＳＨラジカルで置換され、ここで、ＲはＣＨ２−Ｙ−Ｚを表し：
Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、又はＮＨ−ＣＯを表し；また
Ｚは、直鎖若しくは分岐のＣ１〜Ｃ２２アルキレン、直鎖若しくは分岐のＣ２〜Ｃ２２アルケニレン、又は、ポリアルキレングリコール部分を表す。
【請求項２】
ＹがＮＨ、又はＮＨ−ＣＯを表す、請求項１に記載のニコチン誘導体。
【請求項３】
ＹがＮＨを表す、請求項１又は２に記載のニコチン誘導体。
【請求項４】
ＺがＣ１〜Ｃ４アルキレン、好ましくはエチレンを表す、請求項１〜３のいずれかに記載のニコチン誘導体。
【請求項５】
Ｒが３’位又は４’位の位置に結合され、好ましくは５員環の３’位の位置に結合される、請求項１〜４のいずれかに記載のニコチン誘導体。
【請求項６】
誘導体が３’−（２−メルカプトエチルアミノメチル）−ニコチンである、請求項１〜５のいずれかに記載のニコチン誘導体。
【請求項７】
誘導体が３’−（３−メルカプトプロピオンアミドメチル）−ニコチンである、請求項１〜５のいずれかに記載のニコチン誘導体。
【請求項８】
誘導体が３’−（メルカプトアセトアミドメチル）−ニコチンである、請求項１〜５のいずれかに記載のニコチン誘導体。
【請求項９】
以下の式で表されるニコチン誘導体前駆物質であって：
【化２】
式中、５員環又は６員環のいずれかが、１個のＲ−Ｓ−ＣＯ−Ｒ’部分で置換され、Ｒは請求項１〜５のいずれかの定義と同じ意味であり、ここにおいて、Ｒ’−ＣＯは、低級アシル基を表す。
【請求項１０】
前駆物質が３’−（Ｓ−アセチルメルカプトアセトアミドメチル）ニコチンである、請求項９に記載のニコチン誘導体前駆物質。
【請求項１１】
以下の式をもつハプテン−担体接合体であって：
【化３】
式中、５員環又は６員環のいずれかが、１個のＲ−ＳＨラジカルで置換され；ｐは、１〜５００であり；Ｒは、請求項１の記載と同じ意味をもつ。
【請求項１２】
担体が、免疫原性物質、ウィルス、ウィルス様粒子、タンパク質複合体、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）からなる群より選択される、請求項１１に記載のハプテン−担体接合体。
【請求項１３】
担体が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヘモシアニン、アルブミン、非毒性変異ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、髄膜炎菌由来の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、易熱性大腸菌のＢサブユニット、緑膿菌由来の組換えエキソタンパク質Ａ（ｒＥＰＡ）、及びバクテリオファージＱｂの組換えコートタンパク質から構築したウィルス様粒子からなる群より選択されるタンパク質である、請求項１２に記載のハプテン−担体接合体。
【請求項１４】
ニコチン中毒の予防及び治療方法において使用されるワクチン組成物の調製におけるハプテン−担体接合体の使用であって、前記方法が治療有効量の請求項１１〜１３のいずれかに記載のハプテン−担体接合体を投与することを含む、ハプテン−担体接合体の使用。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれかに記載のハプテン−担体接合体と薬学的に許容される賦形剤とを含むワクチン組成物であって、タンパク質−タンパク質接合体を含有しないワクチン組成物。
【公表番号】特表２００９−５３４３７７（Ｐ２００９−５３４３７７Ａ）
【公表日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０６４３３（Ｐ２００９−５０６４３３）
【出願日】平成１９年４月２０日（２００７．４．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０５０１７３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２３４００
【国際公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【出願人】（５０６２１９５９１）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２０日（２００７．４．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０５０１７３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２３４００
【国際公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【出願人】（５０６２１９５９１）
【Ｆターム（参考）】
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