バイオシリカ−接着タンパク質ナノコンポジット材料：合成及び歯科学への応用
本発明は、充填材として使用されるシリカ含有ナノコンポジット材料を合成するための、歯科学におけるシリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の応用に関する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
シリカは産業及び医学の分野で汎用されている。例えばガラス、セラミックス、塗料、粘着剤、及び触媒の製造に、分子篩の成分として、食品添加剤、担体、安定化剤（例えば歯磨き粉中の）として、及び半導体素子における絶縁体として広く使用されている。シリカはナノ（バイオ）テクノロジーにおいても重要な材料である。シリカの技術的生産では大抵、高温条件及び極端なｐＨが必要とされる。注目すべきは、或る特定の単細胞生物及び多細胞生物、例えば珪藻類、海綿動物、及び高等植物は、周囲の低温且つ低圧の中性に近いｐＨ条件下で、そのシリカ骨格を形成可能であることである。また、これらの生物の骨格要素は高い忠実度且つ高いコピー数で産生されるため、固有の特性を有する新規のバイオシリカの製造に関して、これらの生物及びその骨格形成の基礎にある機序が、興味をもたれている。
【０００２】
海棲海綿及び淡水海綿は、シリカ（バイオシリカ）を酵素的に合成する固有の能力を有する。この能力は、海綿動物を（ナノ）バイオテクノロジーに関して非常に興味深いものにしている。これまで使用されてきたシリカ（ガラス）の産生方法では高温、高圧、及び攻撃的な（aggressive）化学物質の存在が必要である。海綿動物は、シリカナノ構造を生物学的な環境に優しい条件下で、卓越した正確さ及び再現性をもって酵素（生体触媒）により合成することが可能である。
【０００３】
珪質海綿の骨格の主要素は針状の骨片であり、普通海綿綱（Demospongia）及び六放海綿綱（Hexactinellida）の綱（class）では、非晶質非結晶性シリカから成る。
【０００４】
骨片の形態学及び生合成における従来技術は、非特許文献１及び非特許文献２に記載されている。海綿骨片のオパールシリカは６％〜１３％の水を含有し、式（ＳｉＯ２）２〜５・Ｈ２Ｏに相当する（非特許文献３）。普通海綿の骨片形成は軸糸の周辺から始まり、その周囲にシリカが酵素的に沈着する。
【０００５】
シリカ形成生物におけるＳｉＯ２骨格の合成及び／又は分解に関する２つの酵素、及びその技術的応用は記載されている。
【０００６】
第１の酵素は、海綿骨片（骨針）の軸糸中に存在するシリカテインα（シリカテインとも呼ばれる）である（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。この酵素は、海棲珪質海綿であるスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）からクローニングされている（非特許文献４）。シリカテインは、有機ケイ素化合物（アルコキシシラン）から非晶質シリカ（ポリケイ酸、ポリケイ酸塩）を合成することが可能である（非特許文献５）。
【０００７】
シリカテインαの他に、さらなるシリカテイン、例えばシリカテインβ（特許文献４）及び淡水海綿由来の４種のシリカテインアイソフォーム（シリカテイン−ａ１〜４；特許文献５）が本発明者らによりクローニングされている。シリカテインは、表面への結合後もその触媒活性を保持している（非特許文献６）。
【０００８】
第２の酵素は、炭酸脱水酵素の群に属するシリカーゼ（silicase）である（特許文献６、特許文献７）。海棲海綿であるスベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）において最初に発見されたこの酵素は、遊離ケイ酸の形成下でシリカを溶解することが可能である（非特許文献７）。また、シリカーゼは可逆反応においてポリマーの合成を媒介し得る（特許文献８）。シリカテインと同様に、シリカーゼもナノテクノロジーに関して、例えば医学及びマイクロエレクトロニクスにおけるシリカマトリクスの改質に関して興味をもたれている。
【０００９】
シリカは骨及び軟骨の組織工学において、足場として使用される材料、例えば生物活性ガラス及び複合材料の重要な成分である（非特許文献８、非特許文献９）。生体適合性及び安定性は、これらの材料の適応性を決定する重要な特徴であり、これらの材料を外科（例えば、骨置換）及び歯科学における使用のために改良することの要求が高まっている。高分子シリカ及び他のシロキサン系材料の化学合成では典型的には、複合材料の成分として使用される有機分子に損傷を与え得る高温及び高圧等の過激な条件、並びに腐食性の化学物質の使用が必要とされる。しかしながら、珪質海綿動物はシリカ骨格をシリカテインの生体触媒活性を用いて、周囲（低温及び低圧）条件下で合成することが可能である。
【００１０】
シリカテイン及び１型コラーゲンでプレコートし、次いでシリカテインの基質のＴＥＯＳを用いてバイオシリカでコーティングすることにより修飾した培養皿上で増殖させた場合に、ヒト骨肉腫ＳａＯＳ−２細胞のミネラル化（リン酸カルシウムの形成）が、顕著に増大することを、本発明者らは示した（非特許文献１０、特許文献９）。その結果により、バイオシリカ修飾表面が生物活性であること、および、骨芽細胞機能を高めるために使用され得ることが示される。
【００１１】
組換えシリカ合成酵素（シリカテイン）の利用によって、生体分子に損傷を与えない温和な条件下でのシリカ含有生物活性表面の生合成に新たな道が開かれる。本発明者らはまた、新規のバイオ材料である海綿バイオシリカを持続的に産生する技術を考え出した。これは海綿プリモルフ（primmorph）培養（海綿細胞培養の特殊型；特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２）を確立することにより達成された。プリモルフのシリカ産生は、或る特定の添加剤により増大することができる（特許文献１３）。
【００１２】
接着タンパク質
イガイ由来の接着タンパク質は既知である（イガイ接着タンパク質、ＭＡＰｓ、例えばフットプロテイン１（foot protein 1）、Ｍｅｆｐ−１）。イガイは接着タンパク質から成る接着斑を介して金属、セラミックス、及びガラスの表面に付着することが可能である。これらの接着タンパク質は、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）を高い割合で含有する。ヨーロッパイガイ（Mytilus edulis）由来のＭｅｆｐ−１は、配列Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＨＰ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ−ＤＯＰＡ−Ｌｙｓを有するタンデム様反復デカペプチドを有する。表面への接着はカテコール酸素により媒介される。
【００１３】
接着タンパク質は、他の海洋生物、例えばナマコ類にも存在する。本発明者らは、ナマコ類であるニセクロナマコ（Holothuria forscali）のキュビエ器官の生化学的接着機序を初めて研究及び記載した（非特許文献１１、非特許文献１２）（図１）。また、本発明者らは、海綿動物もモノフェノールをジフェノールに変換するチロシナーゼを含有することを示した（非特許文献１３）（図２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０６０１ Methods, compositions, and biomimetic catalysts, such as silicateins and block copolypeptides, used to catalyze and spatially direct the polycondensation of silicon alkoxides, metal alkoxides, and their organic conjugates to make silica, polysiloxanes, polymetallo-oxanes, and mixed poly (silicon/ metallo) oxane materials under environmentally benign conditions. 発明者／出願人：Morse DE, Stucky GD, Deming TD, Cha J, Shimizu K, Zhou Y
【特許文献２】ＤＥ１００３７２７０（Ａ１） Silicatein-vermittelte Synthese von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung. 発明者／出願人：Mueller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schroeder HC
【特許文献３】ＥＰ１３２０６２４ Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicates and siloxanes and use thereof. 発明者／出願人：Mueller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schroeder HC、国内段階：ＵＳ２００３１３４３９１，ＮＯ２００３０４０７，日本特願２００２−５１６３３６，ＣＮ１４６０１１０Ｔ，カナダ２，４１４，６０２，オーストラリア２００１２８９７１３
【特許文献４】ＤＥ１０３５２４３３．９ Enzym- und Template-gesteuerte Synthese von Silica aus nicht-organischen Siliciumverbindungen sowie Aminosilanen und Silazanen und Verwendung. 出願人：University of Mainz. 発明者：Schwertner H, Mueller WEG, Schroeder HC
【特許文献５】ＤＥ１０２００６００１７５９．５ Kontrollierte Herstellung von Silber- und Gold-Nanopartikeln und Nanokristallen definierter Groesse und Form durch chirale Induktion mittels Silicatein. 出願人／発明者：Tremel W, Tahir MN, Mueller WEG. Schroeder HC
【特許文献６】ＤＥ１０２４６１８６ In vitro and in vivo degradation or synthesis of silicon dioxide and silicones, useful e.g. for treating silicosis or to prepare prosthetic materials, using a new silicase enzyme. 出願人：University of Mainz. 発明者：Mueller WEG, Krasko A, Schroeder HC
【特許文献７】ＰＣＴ／ＥＰ０３／１０９８３ Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms. 出願人：University of Mainz. 発明者：Mueller WEG, Krasko A, Schroeder HC
【特許文献８】ＤＥ１０３５２４３３．９ Enzymatische Synthese, Modifikation und Abbau von Silicium (IV)- und anderer Metall (IV)- Verbindungen. 出願人：University of Mainz. 発明者：Mueller WEG, Schwertner H, Schroeder HC
【特許文献９】ＤＥ１０２００４０２１２２９．５ Enzymatisches Verfahren zur Herstellung bioaktiver, Osteoblasten-stimulierender Oberflaechen und Verwendung. 出願人：University of Mainz. 発明者：Schwertner H, Mueller WEG, Schroeder HC
【特許文献１０】ＤＥ１９８２４３８４．７
【特許文献１１】ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３１２１
【特許文献１２】ＥＰ９９９５５２８８．８
【特許文献１３】ＥＰ０５０１２１６２．３ Selenium-enriched liquid media for the cultivation of siliceous sponges and for biogenic silica production. 出願人：University of Mainz. 発明者：Mueller WEG, Schroeder HC, Osinga R, Schwertner H
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Uriz et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:163-193
【非特許文献２】Mueller et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:195-221
【非特許文献３】Schwab & Shore (1971) Nature 232:501-502
【非特許文献４】Krasko et al. (2000) Eur J Biochem 267:4878-4887
【非特許文献５】Cha et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:361-365
【非特許文献６】Tahir et al. (2004) Chem Commun 2004:2848-2849
【非特許文献７】Schroeder et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:250-268
【非特許文献８】Hench and Wilson (1984) Science 226:630-636
【非特許文献９】Yamamuro et al. (1990) Handbook on Bioactive Ceramics, VoI I: Bioactive Glasses and Glass-Ceramics, CRC Press, Boca Raton, FL
【非特許文献１０】Schroeder et al. (2005) J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater 75B:387-392
【非特許文献１１】Mueller et al. (1972) Cytobiologie 5:335
【非特許文献１２】Mueller et al. (1976) Biochim Biophys Acta 433:684
【非特許文献１３】Mueller et al. (2004) Micron 35:87
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、非晶質二酸化ケイ素（シリカ）、シロキサンの合成のための方法及び組換えシリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の使用、並びにこれらの化合物の修飾、並びに歯科学におけるそれらの医学的使用に関する。
【００１７】
シリカテイン配列（シリカ形成配列）及び絹フィブロイン配列を含む融合タンパク質、並びにこのような融合タンパク質をコードするｃＤＮＡが記載される。シリカテインは、歯科充填材として働くことのできる（バイオ）シリカの生体触媒形成に単独で、又はナノコンポジットの成分として使用される。絹フィブロインは、シリカテイン及びシリカテインにより形成されるシリカナノ粒子を歯のエナメル質、又は他の固体材料、例えば金属、プラスチック、及び複合材の表面に付着する接着タンパク質（「水中接着剤」）として使用される。シリカテインの幾つかの型及びアイソフォーム、例えばＰＣＲ法を用いてスベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）から単離される、シリカテインαポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、融合タンパク質を構築するのに使用することができる。関連ｃＤＮＡは他の海棲海綿、例えばGeodia cydonium、又は淡水海綿、例えばLubomirskia baicalensisから単離することができる。融合タンパク質又はその一部を、ヒトエナメル質由来ペプチド又はＤＯＰＡ含有ペプチド／タンパク質と組み合わせて、シリカ／ペプチド系ナノコンポジットをデザインすることができる。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、配列番号１に示される配列と少なくとも２５%の配列相同性、好ましくは同一性を示すシリカテインαドメインを含む融合タンパク質が使用される、シリカ（ケイ酸及び／又はケイ酸塩の縮合産物）、シリコーン、及び他の金属酸化物、並びにこれらの化合物の混合ポリマーをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで合成する手法である。
【００１９】
合成には、ケイ酸、モノアルコキシシラントリオール、モノアルコキシシランジオール、モノアルコキシシラノール、ジアルコキシシランジオール、ジアルコキシシラノール、トリアルコキシシラノール、テトラアルコキシシラン、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐シラントリオール、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐シランジオール、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐シラノール、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐モノアルコキシシランジオール、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐モノアルコキシシラノール、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐ジアルコキシシラノール、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐トリアルコキシシラン等の化合物を基質として使用することができる手法が用いられる。これらの化合物の規定の混合物を使用することにより、混合ポリマーを産生することができる。
【００２０】
本発明のさらに好適な態様によれば、融合タンパク質を他の分子、又はガラス、金属、金属酸化物、プラスチック、生体高分子、若しくは鋳型となる他の材料の表面に結合することにより、規定の２次元及び３次元構造を形成することができる。
【００２１】
本発明のさらに好適な態様によれば、ヒドロキシアパタイト（例えば、エナメル質）、シリカ又は金属酸化物を含有する構造又は表面を修飾する手法が提示され、それにおいて、配列番号１及び配列番号２に示される配列と少なくとも２５％の配列相同性、好ましくは同一性を有するシリカテイン及び／又は絹フィブロインドメインを含む融合タンパク質が修飾に使用される。
【００２２】
本発明のさらに好適な態様は、本明細書中に記載される手法を用いて得られた化合物又はシリカを含有する構造若しくは表面に関する。
【００２３】
本発明のさらに好適な態様は、配列番号１と一致するスベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）由来のシリカテインαの融合タンパク質、又はシリカテインαドメインのアミノ酸配列中で配列番号１に示される配列と少なくとも２５％の配列相同性、好ましくは同一性を有する相同ポリペプチド、又はその一部に関する。
【００２４】
「相同性」は、２つの配列をアライニング及び必要に応じてギャップ導入して最大の相同性％を達成した後の、対照配列シリカテインαドメインの残基と同一な候補アミノ酸配列中の残基の割合として定義される。アライメントの方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野で既知である。候補配列がこの定義に含まれるかを決定する目的に使用又は適応し得るコンピュータプログラムの一つは、Genentech, Incにより作成された「Ａｌｉｇｎ ２」である。
【００２５】
本発明のさらに好適な態様は、本特許出願に記載されるポリペプチドをコードする核酸、特に配列番号３及び配列番号４と一致する核酸に関する。核酸はＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの混合物であり得る。核酸の配列は少なくとも１つのイントロン及び／又はポリＡ配列を含み得る。
【００２６】
本発明のさらに好適な態様は（ａ）融合タンパク質（キメラタンパク質）構築物、又は（ｂ）分離タンパク質発現（プロテアーゼ切断部位）を有する構築物の形である核酸に関する。核酸はまた、合成的に産生され得る。必要な方法は従来技術の方法による。
【００２７】
本発明のさらに好適な態様は、本発明による核酸を含有するベクター、好ましくはプラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又は粒子、ナノ粒子、若しくはリポソームの形であるベクターに関する。さらに、これらのベクターは、好ましくはナノ粒子又はリポソームの形で、本発明による融合タンパク質を含むタンパク質の転移に使用することができる。
【００２８】
本発明のさらに好適な態様は、ベクターでトランスフェクトされたか、又は本発明による粒子により感染若しくは形質導入された宿主細胞である。この宿主細胞は、請求項１〜７に記載のポリペプチド又はその一部を発現することができる。任意の既知の宿主細胞生物、例えば酵母、真菌、海綿、細菌、ＣＨＯ細胞、又は昆虫細胞を使用することができる。
【００２９】
本出願でクレームされる融合タンパク質は、合成的に産生されるか、又は原核細胞又は真核細胞の抽出物又は溶解物中に存在することができる。細胞抽出物又は溶解物はｅｘ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｔｒｏで細胞、例えば組換え細菌細胞から調製することができる。
【００３０】
本出願でクレームされる融合タンパク質は、従来の方法を用いて精製することができ、したがって実質的に他のタンパク質を含み得ない。
【００３１】
融合タンパク質中に存在する接着タンパク質は、シリカテイン及びバイオシリカ構成要素の表面への制御された付着に使用することができる。
【００３２】
さらに、本発明による融合タンパク質又は核酸は、シリコーン及びシリコーンインプラントの代謝及び吸収の調節に使用することもできる。シリカテインは単量体シリコーン前駆体から高分子シリコーンを合成可能であり、したがって体細胞に取り込まれ得る単量体の除去に使用することができる。最終的に、本明細書中に記載される発明は、シリコーン及びシリコーンインプラントの代謝及び吸収を調節するために、本明細書中に記載される核酸による細胞のトランスフェクションに応用することができる。上述の応用の方法論は従来の方法であり、特定の要件に容易に適応させることができる。
【００３３】
また、ジフェノール含有タンパク質／ペプチド、特にＤＯＰＡ（３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）含有タンパク質／ペプチドは、水性環境で接着剤として働くことが知られている。本発明者らは海綿チロシナーゼをクローニングし、及び組換えタンパク質を発現させた。この酵素は、モノフェノール化合物を用いてジフェノールを合成する。組換え海綿酵素を用いて調製されるＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドは、シリカテイン／バイオシリカ構成要素を表面に結合するのに使用することができる。
【００３４】
特異的に修飾されたＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドの接着によって、表面をＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドのコーティングによる、異なる材料（金属、ガラス、プラスチック等）の表面上のパターンが作成され得る。
【００３５】
金属表面（チタン、チタン合金、又はＣｏＣｒ）並びにプラスチック及び複合材料から選択される表面を使用することができる。特にＦｅ（ＩＩＩ）及び他の金属イオンに対して強い結合親和性を有するカテコール酸素は、ＤＯＰＡ含有ペプチド及びタンパク質の表面への結合に重要である。
【００３６】
骨とインプラント（例えばＴｉ、Ｔｉ合金、又はＣｏＣｒから作られる金属インプラント）との間の安定した接続を作り出すことが主要な課題である。金属インプラントの「生物化（biologisation）」の一方法は、表面のＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドによるコーティングである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ナマコ類における生化学的接着機序の第１の説明図である。左：２つのキュビエ管（Cuvier tubuli）（Ａ：内筒、Ｂ：外筒）。右：パラフィンに接着するキュビエ管（Mueller and Zahn (1972) Cytobiologie 3: 335-351）。
【図２】海綿チロシナーゼによるモノフェノールのジフェノールへの変換（及びキノンへのさらなる酸化）の図である。
【図３】シリカテインαをコードするスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の図である。プライマーの構築に使用される配列には下線を引き、太字で示している。ＡＴＧ開始コドンには二重下線を引いている（配列番号５）。
【図４】シリカテインαをコードするスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列の図である。
【図５】プレコラーゲンＤをコードするムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis ）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の図である。プライマーの構築に使用される配列には下線を引き、太字で示している（配列番号６）。
【図６】プレコラーゲンＤをコードするムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis ）ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列の図である（配列番号７）。
【図７】絹フィブロインをコードするムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis ）ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列の図である（配列番号８）。
【図８】絹フィブロインをコードするムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis ）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列の図である。フォワードプライマー及びリバースプライマーの構築に使用される配列には下線を引き、太字で示している（配列番号９）。
【図９】ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（Invitrogen）のヌクレオチド配列の図である。
【図１０】絹フィブロインからシリカテインをエンテロキナーゼにより切断するために使用される、プロテアーゼ結合部位（エンテロキナーゼ認識部位）の図である。
【図１１】ＮｃｏＩによる消化後の、ｐＴｒｃＨｉｓ２ベクターの絹フィブロインｃＤＮＡの直前への、プロテアーゼ結合部位を有するシリカテイン遺伝子のクローニングの図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
組換えシリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の発現及び単離
組換えシリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の調製は、好ましくは大腸菌において行なわれる。酵母及び哺乳類細胞における組換えタンパク質の調製も可能であり、首尾よく行われている。ｃＤＮＡを適切なベクター、例えばｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（Invitrogen）にクローニングする。大腸菌の形質転換後、シリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の発現をＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド） によって誘導する（Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York）。シリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の発現及び組換えタンパク質の精製は、例えば組換えタンパク質中に存在するヒスチジンタグを用いて、適切なアフィニティーマトリクス、例えばＮｉ−ＮＴＡマトリクス上で行なうことができる（Skorokhod et al. (1997) Cell Mol Biol 43:509-519）。
【００３９】
２つの代替的構築物をシリカテインα−絹フィブロイン融合タンパク質発現に使用する。
【００４０】
１．プロテアーゼ切断部位を有しない融合タンパク質の調製
シリカテインαポリペプチド及び絹フィブロインを有する融合タンパク質を調製するために、適切な発現ベクター（例えば、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯベクター；Invitrogen）を使用する。５'末端及び３'末端の両方に、例えばＮｃｏＩ制限部位を有するシリカテインα ｃＤＮＡを調製する。シリカテインα ｃＤＮＡの停止コドンを除去する。増幅には、ＰＣＲ−Ｔｅｃｈｎｉｋを使用し、それぞれの制限部位を有するプライマーを使用する。第２のタンパク質をコードするｃＤＮＡを調製する。そこでは、５'末端にシリカテインα ｃＤＮＡの３'末端と同じ制限部位（例では、ＮｃｏＩ）を使用し、及び３'末端にもＮｃｏＩ制限部位を使用する。
【００４１】
両方のｃＤＮＡを標準手法に従ってライゲーションし、精製し、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯベクターにライゲーションする。ライゲーションはヒスチジンタグの近くに行なわれる。例えば組換えタンパク質中に存在するヒスチジンタグを用いた融合タンパク質の発現及び精製は、適切なアフィニティーマトリクス、例えばＮｉ−ＮＴＡマトリクスを用いて行なうことができる（Skorokhod et al. (1997) Cell Mol Biol 43:509-519）。
【００４２】
２．分離発現（プロテアーゼ切断部位）
１の手法に対して代替的に、プロテアーゼ切断部位（例えば、エンテロキナーゼ部位）を、シリカテインαポリペプチドをコードするｃＤＮＡと、絹フィブロインをコードするｃＤＮＡとの間にクローニングすることができる。発現及び精製の後、融合タンパク質をタンパク質分解性切断する。その後、両タンパク質を分離する。
【００４３】
以下の例では、大腸菌におけるスベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）由来のシリカテインα遺伝子、及びムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）由来の絹フィブロイン遺伝子を含む融合タンパク質の発現が記載される。この例では、触媒活性ドメイン（短型シリカテイン）のみを含むシリカテイン挿入断片を使用するが、当該タンパク質の完全アミノ酸配列を含む挿入断片を使用することも可能である。
【００４４】
融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの構築に使用されるシリカテインｃＤＮＡを記載する。
【００４５】
スベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）由来のシリカテインα及びシリカテインβをコードするｃＤＮＡは、シリカテインαはＡＪ２７２０１３（非特許文献４）、シリカテインβはＡＪ５４７６３５、ＡＪ７８４２２７（Schroeder et al. (2004) Cell Tissue Res 316:271-280）である。シリカテインαをコードするスベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を図３に示す。シリカテインαをコードするスベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列は図４に示す。
【００４６】
ルボミルスキア・バイカレンシス（Lubomirskia baicalensis）由来のシリカテインａ１〜４をコードするｃＤＮＡは、シリカテインalphaはＡＪ８７２１８３、シリカテインａ２はＡＪ９６８９４５、シリカテインａ３はＡＪ９６８９４６、シリカテインａ４はＡＪ９６８９４７である（Wiens et al. (2006) Dev Genes Evol 216:229-242）。
【００４７】
プレコラーゲンＤをコードするムラサキイガイ（M. galloprovincialis ）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を図５に示す。プレコラーゲンＤをコードするムラサキイガイ（M. galloprovincialis ）ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列は図６に示す。
【００４８】
絹フィブロインをコードするムラサキイガイ（M. galloprovincialis ）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を図７及び図８に示す。
【００４９】
ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（Invitrogen）を融合タンパク質の産生に使用するが、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯのヌクレオチド配列については図９を参照されたい。他の発現ベクターも用いることができることは証明されている。
【００５０】
制限酵素ＮｃｏＩ（Ｃ↓ＣＡＴＧＧ）を使用した。この制限酵素は：
絹フィブロインｃＤＮＡに制限部位を有しない；
シリカテインα ｃＤＮＡに制限部位を有しない；
ｐＴｒｃＨｉｓ２ベクターに１つの制限部位を有する。
【００５１】
ＮｃｏＩによる消化のために、オーバーハングを含む以下のプライマーをシリカテインｃＤＮＡに使用する：
ＳｉｌｉＮｏｃ＿Ｆｏｒ１
ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＴＣ ＴＴＧ ＴＣＡ ＣＡＧ ＴＧＧ ＴＡＧ ＴＡＣ ＴＧ（配列番号１０）；
ＳｉｌｉＮｏｃ＿Ｒｅｖ１
ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＧＧ ＴＧＧ ＧＡＴ ＡＡＧ ＡＴＧ ＣＡＴ Ｃ（配列番号１１）。
【００５２】
第1の工程では、絹フィブロインをコードする配列を、以下の特定のプライマーを用いてｐｒｅ−ＣｏｌＤ ｃＤＮＡから単離する：
Ｓｉｌｋ Ｆ
５' ＧＧＴ ＧＧＡ ＣＴＣ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＣ ３'（配列番号１２）；
Ｓｉｌｋ ＨＩＳ Ｒ
５' ＡＴＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＴＴＴ ＧＴＧ ＡＴＡ ＧＣ ３'（配列番号１３）。
【００５３】
次に、絹フィブロインｃＤＮＡをベクターｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（Invitrogen）にクローニング（Ｔ／Ａクローニング）する。その後、細菌株ＢＬ２１を得られたプラスミドでトランスフェクトする。
【００５４】
シリカテインα配列については、オーバーハングを含む以下のリバースプライマーを、このオーバーハングをプロテアーゼ（エンテロキナーゼ）結合部位として使用するように構築する：
Ｓｉｌｉ＿Ｅｎｄｏ＿Ｒｅｖ
５' ＣＴＴ ＧＴＣ ＡＴＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ＴＡＧ ＧＧＴ ＧＧＧ ＡＴＡ ＡＧ ３'（配列番号１４）。
【００５５】
次の工程では、オーバーハングを含む以下のプライマーを構築する：
ＳｉｌｉＮｏｃ＿Ｆｏｒ１
５' ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＴＣ ＴＴＧ ＴＣＡ ＣＡＧ ＴＧＧ ＴＡＧ ＴＡＣ ＴＧ ３'（配列番号１５）；
ＳｉｌｉＮｏｃ＿Ｒｅｖ１
５' ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＣＴ ＴＧＴ ＣＡＴ ＣＧＴ ＣＡＴ ＣＴＡ ＧＧ ３'（配列番号１６）。
【００５６】
これらのオーバーハングは、制限酵素ＮｃｏＩの制限部位として使用される。ｐＴｒｃＨｉｓ２ベクターも、この酵素に対する制限部位を有する。これによりベクター及び増幅シリカテインで二重消化を行なうことができる。この消化の後、シリカテインをｐＴｒｃＨｉｓ２ベクターに、絹フィブロインの直前にクローニングする。
【００５７】
シリカテインを絹フィブロインから切断するために使用される、プロテアーゼ結合部位（エンテロキナーゼ認識部位）を図１０に示す。
【００５８】
ＮｃｏＩによる消化の後、プロテアーゼ結合部位を有するシリカテインｃＤＮＡをｐＴｒｃＨｉｓ２ベクターに、絹フィブロインｃＤＮＡの直前にクローニングする（図１１）。
【００５９】
大腸菌の形質転換後、シリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の発現は通常、ＩＰＴＧにより誘発され、３７℃で４時間又は６時間行なわれる（Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York）。得られた融合タンパク質を、例えばＮｉ−ＮＴＡマトリクス上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。シリカテインを絹フィブロインから分離するために、融合タンパク質をエンテロキナーゼにより切断する。次に、タンパク質を２−メルカプトエタノールの存在下でゲル電気泳動にかける。ゲル電気泳動は、０．１％ＮａＤｏｄＳＯ４を用いて１０％ポリアクリルアミドゲル上で行なうことができる（ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＰＡＧＥ）。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色する。切断、精製、及び続くＰＡＧＥの後、組換えシリカテインタンパク質及び絹フィブロインの短型が得られる。
【００６０】
抗体を用いたシリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の単離及び精製
シリカテインα−絹フィブロイン融合タンパク質は、アフィニティーマトリクス上でさらに精製することができる。アフィニティーマトリクスは、例えばシリカテインα特異抗体を固相（ＣＮＢｒ活性化セファロース又は他の適切な担体）上に固定化することにより調製することができる。標準方法に従って調製された、シリカテインαに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用することができる（Osterman (1984) Methods of Protein and Nucleic Acid Research Vol. ２; Springer-Verlag [Berlin]）。抗体のマトリクスへのカップリングは、メーカー（Pharmacia）の使用説明書に従って行なわれる。純粋なシリカテインα−絹フィブロイン融合タンパク質の溶出は、ｐＨ変化又はイオン強度の変化により行なわれる。
【００６１】
他のアフィニティーマトリクスも使用することができる。
【００６２】
シリカテイン活性の検出及びシリカの合成
組換えシリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の酵素活性を求めるために、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）の加水分解及び続く重合の後の重合し沈降したシリカの測定に基づく分析を用いる。
【００６３】
組換えシリカテインの酵素活性の測定は通常、以下のように行なわれる。融合タンパク質を酵素反応に適切な緩衝液、例えば５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）に対して一晩透析する。ｐＨが４．５〜１０．５の範囲の他の緩衝液も適切である。
【００６４】
融合タンパク質（１μｇ〜５０μｇ）を１ｍｌの適切な緩衝液、例えば５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）に溶解し、１ｍｌの１ｍＭ〜４．５ｍＭ ＴＥＯＳ溶液を補充する。酵素反応は室温で行なうことができる。典型的には、６０分のインキュベーション期間で、シリカテイン１００μｇにつき２００ｎｍｏｌの非晶質シリカが合成される。シリカ産物を遠心分離（１２０００×ｇ、１５分、＋４℃）により回収し、エタノールで洗浄し、風乾する。その後、沈殿を１Ｍ ＮａＯＨで加水分解する。溶解ケイ酸塩を次に、モリブデン酸塩に基づく分析、例えばケイ素分析（Merck）により定量的に測定する。
【００６５】
以下の基質を使用することができる：テトラアルコキシシラン、トリアルコキシシラノール、ジアルコキシシランジオール、モノアルコキシシラントリオール、ジアルコキシシラノール、モノアルコキシシランジオール、モノアルコキシシラノール、アルキル−、アリール−若しくはメタロトリアルコキシシラン、アルキル−、アリール−若しくはメタロシラノール、アルキル−、アリール−若しくはメタロシランジオール、アルキル−、アリール−若しくはメタロシラントリオール、アルキル−、アリール−若しくはメタロモノアルコキシシランジオール、アルキル−、アリール−若しくはメタロジアルコキシシラノール、又は他の金属酸化物 前駆体（ガリウム、ジルコニウム、又はチタンのアルコキシ化合物）。これらの基質の混合物もまた酵素によって使用される。したがって、混合ポリマーも産生され得る。
【００６６】
反応は温和な条件下で行なうことができる。したがって、本発明は省エネルギーで環境に無害な手法の導入に寄与している。
【００６７】
完全に再生され得るヒドロキシアパタイトの代わりにシリカを使用することの他の理由は、シリカがより耐酸性であり、ヒドロキシアパタイトが「天然の」エナメル質と同じくらい齲蝕を受けやすいことである。
【００６８】
シリカテイン−接着タンパク質融合タンパク質の組合せ
シリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質及びシリカテインにより産生される（バイオ）シリカは、以下と組み合せて使用することができる：
ａ）ヒトエナメル質由来ペプチド。これらのペプチドはシリカ／ペプチド系ナノコンポジットのデザインを可能にする。これらは副作用を引き起こす可能性がある樹脂単量体又は添加剤の浸出がなく、生体適合性である。
ｂ）ＤＯＰＡ含有ポリペプチド／タンパク質。これらのポリペプチド／タンパク質は、海綿チロシナーゼを用いて調製することができる。これらはシリカテイン／バイオシリカの表面結合のための接着剤として使用される。
【００６９】
（バイオ）シリカとエナメル質由来ペプチド／タンパク質の組合せ
エナメル質に由来するペプチドを使用する理由は、当該ペプチドがエナメル質において粘着をもたらし、シリカ複合体中で最高の粘着を生じ、空洞が引き起こされた虫歯のエナメル質辺縁へのシリカ系「ナノコンポジット」の最高の粘着作用を生じるためである。樹脂粘着剤の欠点は、「感水性（water sensible）」で、加水分解される傾向があることである。
【００７０】
（バイオ）シリカとＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドの組合せ
海棲海綿からクローニングされる組換えチロシナーゼ（非特許文献１３）が、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）単位を含有する接着ポリペプチド又はタンパク質を合成するために使用される。使用されるチロシン含有タンパク質及びペプチドの酵素によるヒドロキシル化は、記載の手法（Marumo and Waite (1986) Biochim Biophys Acta 872:98、Akemi Ooka and Garrell (2000) Biopolymers 57:92）に従って行なわれる。タンパク質又はペプチド中のチロシン残基のＤＯＰＡへの酵素によるヒドロキシル化における一つの問題は、チロシンヒドロキシル化後に形成されるＤＯＰＡのさらなる産物（特にドーパキノン）へのチロシナーゼ媒介酸化によって起こり得る。ドーパキノンは、リシン残基と架橋を形成することが可能である。ＤＯＰＡからの酸化産物の形成を低減するために、ヒドロキシル化中にアスコルビン酸を添加する。アスコルビン酸は、形成されるドーパキノン及びカテコールのさらなる酸化産物を減少させる。酵素は、低分子量ペプチドのヒドロキシル化中に、遠心分離／濾過（ミクロポアフィルタ）により除去する。アスコルビン酸を産物から逆相ＨＰＬＣにより分離する。
【００７１】
組換え海綿チロシナーゼを「ＧＳＴ Ｆｕｓｉｏｎｓ」システム（Amersham）を用いて調製する。得られたＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオン−セファロース４B上でアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを組換え海綿酵素から分離するために、融合タンパク質をトロンビンで切断する。チロシナーゼの酵素活性は、リン酸緩衝液中でＬ−チロシンを基質として用いて求める。チロシンのＬ−ＤＯＰＡ（３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）への変換を２８０ｎｍで測定する。
【００７２】
また、シリカテインは、モノフェノール（例えばチロシン残基）をジフェノールに変換する組換え海綿チロシナーゼを用いて修飾することができる。
【００７３】
得られた接着剤タンパク質は、高次構造の形成下で、バイオシリカから作られる（シリカテインにより合成される）構成要素を連結するために使用することができる。
【００７４】
シリカテインα−絹フィブロイン融合タンパク質の応用
本発明のさらなる態様は、以下のシリカテインα−絹フィブロイン融合タンパク質の応用である。
【００７５】
１）歯科材料の表面修飾への応用（生体適合性の改善、現在使用されている材料と比較して高い安定性及び空隙率）。
【００７６】
２）歯科用置換材料等の新規の歯科材料（複合材料）の調製への応用。
【００７７】
３）金属、金属酸化物、プラスチック、及び他の材料から作られる歯科材料のコーティングの調製、特にこれらの材料上の単分子層の調製（生物化；骨と歯科材料との間の安定した接続の形成）への応用。
【００７８】
４）シリカテイン及びバイオシリカ構成要素（シリカテインにより合成されるバイオシリカ粒子）の表面（金属、ガラス等）への付着のため、及び高次構造の形成下でバイオシリカ構成要素を連結するための、融合タンパク質中に存在する接着タンパク質（「水中接着剤」）の使用。
【００７９】
５）歯科学におけるフィラー粒子としてのバイオシリカの使用。バイオシリカは従来の材料と比べて、２つの利点を有する：１．組換え酵素（シリカテイン）又はバイオリアクター（プリモルフ）を用いて酵素的に生成することができるため、環境に無害に合成される。表面修飾はシリカーゼにより行なわれ得る。高いエネルギー又は攻撃的な化学物質の必要はない。
【００８０】
配列番号１：スベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）由来のシリカテインαポリペプチドのアミノ酸配列（ｒＳＩＬＩＣＡα＿ＳＵＢＤＯ）。
配列番号２：ムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis ）由来の絹フィブロインポリペプチドのアミノ酸配列（ｒＳＩＬＫＦＩＢ＿ＭＹＴＧＡ）。
配列番号３：シリカテインαポリペプチドをコードするスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）由来ｃＤＮＡの核酸配列。
配列番号４：絹フィブロインポリペプチドをコードするムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis ）由来ｃＤＮＡの核酸配列。
【背景技術】
【０００１】
シリカは産業及び医学の分野で汎用されている。例えばガラス、セラミックス、塗料、粘着剤、及び触媒の製造に、分子篩の成分として、食品添加剤、担体、安定化剤（例えば歯磨き粉中の）として、及び半導体素子における絶縁体として広く使用されている。シリカはナノ（バイオ）テクノロジーにおいても重要な材料である。シリカの技術的生産では大抵、高温条件及び極端なｐＨが必要とされる。注目すべきは、或る特定の単細胞生物及び多細胞生物、例えば珪藻類、海綿動物、及び高等植物は、周囲の低温且つ低圧の中性に近いｐＨ条件下で、そのシリカ骨格を形成可能であることである。また、これらの生物の骨格要素は高い忠実度且つ高いコピー数で産生されるため、固有の特性を有する新規のバイオシリカの製造に関して、これらの生物及びその骨格形成の基礎にある機序が、興味をもたれている。
【０００２】
海棲海綿及び淡水海綿は、シリカ（バイオシリカ）を酵素的に合成する固有の能力を有する。この能力は、海綿動物を（ナノ）バイオテクノロジーに関して非常に興味深いものにしている。これまで使用されてきたシリカ（ガラス）の産生方法では高温、高圧、及び攻撃的な（aggressive）化学物質の存在が必要である。海綿動物は、シリカナノ構造を生物学的な環境に優しい条件下で、卓越した正確さ及び再現性をもって酵素（生体触媒）により合成することが可能である。
【０００３】
珪質海綿の骨格の主要素は針状の骨片であり、普通海綿綱（Demospongia）及び六放海綿綱（Hexactinellida）の綱（class）では、非晶質非結晶性シリカから成る。
【０００４】
骨片の形態学及び生合成における従来技術は、非特許文献１及び非特許文献２に記載されている。海綿骨片のオパールシリカは６％〜１３％の水を含有し、式（ＳｉＯ２）２〜５・Ｈ２Ｏに相当する（非特許文献３）。普通海綿の骨片形成は軸糸の周辺から始まり、その周囲にシリカが酵素的に沈着する。
【０００５】
シリカ形成生物におけるＳｉＯ２骨格の合成及び／又は分解に関する２つの酵素、及びその技術的応用は記載されている。
【０００６】
第１の酵素は、海綿骨片（骨針）の軸糸中に存在するシリカテインα（シリカテインとも呼ばれる）である（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。この酵素は、海棲珪質海綿であるスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）からクローニングされている（非特許文献４）。シリカテインは、有機ケイ素化合物（アルコキシシラン）から非晶質シリカ（ポリケイ酸、ポリケイ酸塩）を合成することが可能である（非特許文献５）。
【０００７】
シリカテインαの他に、さらなるシリカテイン、例えばシリカテインβ（特許文献４）及び淡水海綿由来の４種のシリカテインアイソフォーム（シリカテイン−ａ１〜４；特許文献５）が本発明者らによりクローニングされている。シリカテインは、表面への結合後もその触媒活性を保持している（非特許文献６）。
【０００８】
第２の酵素は、炭酸脱水酵素の群に属するシリカーゼ（silicase）である（特許文献６、特許文献７）。海棲海綿であるスベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）において最初に発見されたこの酵素は、遊離ケイ酸の形成下でシリカを溶解することが可能である（非特許文献７）。また、シリカーゼは可逆反応においてポリマーの合成を媒介し得る（特許文献８）。シリカテインと同様に、シリカーゼもナノテクノロジーに関して、例えば医学及びマイクロエレクトロニクスにおけるシリカマトリクスの改質に関して興味をもたれている。
【０００９】
シリカは骨及び軟骨の組織工学において、足場として使用される材料、例えば生物活性ガラス及び複合材料の重要な成分である（非特許文献８、非特許文献９）。生体適合性及び安定性は、これらの材料の適応性を決定する重要な特徴であり、これらの材料を外科（例えば、骨置換）及び歯科学における使用のために改良することの要求が高まっている。高分子シリカ及び他のシロキサン系材料の化学合成では典型的には、複合材料の成分として使用される有機分子に損傷を与え得る高温及び高圧等の過激な条件、並びに腐食性の化学物質の使用が必要とされる。しかしながら、珪質海綿動物はシリカ骨格をシリカテインの生体触媒活性を用いて、周囲（低温及び低圧）条件下で合成することが可能である。
【００１０】
シリカテイン及び１型コラーゲンでプレコートし、次いでシリカテインの基質のＴＥＯＳを用いてバイオシリカでコーティングすることにより修飾した培養皿上で増殖させた場合に、ヒト骨肉腫ＳａＯＳ−２細胞のミネラル化（リン酸カルシウムの形成）が、顕著に増大することを、本発明者らは示した（非特許文献１０、特許文献９）。その結果により、バイオシリカ修飾表面が生物活性であること、および、骨芽細胞機能を高めるために使用され得ることが示される。
【００１１】
組換えシリカ合成酵素（シリカテイン）の利用によって、生体分子に損傷を与えない温和な条件下でのシリカ含有生物活性表面の生合成に新たな道が開かれる。本発明者らはまた、新規のバイオ材料である海綿バイオシリカを持続的に産生する技術を考え出した。これは海綿プリモルフ（primmorph）培養（海綿細胞培養の特殊型；特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２）を確立することにより達成された。プリモルフのシリカ産生は、或る特定の添加剤により増大することができる（特許文献１３）。
【００１２】
接着タンパク質
イガイ由来の接着タンパク質は既知である（イガイ接着タンパク質、ＭＡＰｓ、例えばフットプロテイン１（foot protein 1）、Ｍｅｆｐ−１）。イガイは接着タンパク質から成る接着斑を介して金属、セラミックス、及びガラスの表面に付着することが可能である。これらの接着タンパク質は、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）を高い割合で含有する。ヨーロッパイガイ（Mytilus edulis）由来のＭｅｆｐ−１は、配列Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＨＰ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ−ＤＯＰＡ−Ｌｙｓを有するタンデム様反復デカペプチドを有する。表面への接着はカテコール酸素により媒介される。
【００１３】
接着タンパク質は、他の海洋生物、例えばナマコ類にも存在する。本発明者らは、ナマコ類であるニセクロナマコ（Holothuria forscali）のキュビエ器官の生化学的接着機序を初めて研究及び記載した（非特許文献１１、非特許文献１２）（図１）。また、本発明者らは、海綿動物もモノフェノールをジフェノールに変換するチロシナーゼを含有することを示した（非特許文献１３）（図２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０６０１ Methods, compositions, and biomimetic catalysts, such as silicateins and block copolypeptides, used to catalyze and spatially direct the polycondensation of silicon alkoxides, metal alkoxides, and their organic conjugates to make silica, polysiloxanes, polymetallo-oxanes, and mixed poly (silicon/ metallo) oxane materials under environmentally benign conditions. 発明者／出願人：Morse DE, Stucky GD, Deming TD, Cha J, Shimizu K, Zhou Y
【特許文献２】ＤＥ１００３７２７０（Ａ１） Silicatein-vermittelte Synthese von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung. 発明者／出願人：Mueller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schroeder HC
【特許文献３】ＥＰ１３２０６２４ Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicates and siloxanes and use thereof. 発明者／出願人：Mueller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schroeder HC、国内段階：ＵＳ２００３１３４３９１，ＮＯ２００３０４０７，日本特願２００２−５１６３３６，ＣＮ１４６０１１０Ｔ，カナダ２，４１４，６０２，オーストラリア２００１２８９７１３
【特許文献４】ＤＥ１０３５２４３３．９ Enzym- und Template-gesteuerte Synthese von Silica aus nicht-organischen Siliciumverbindungen sowie Aminosilanen und Silazanen und Verwendung. 出願人：University of Mainz. 発明者：Schwertner H, Mueller WEG, Schroeder HC
【特許文献５】ＤＥ１０２００６００１７５９．５ Kontrollierte Herstellung von Silber- und Gold-Nanopartikeln und Nanokristallen definierter Groesse und Form durch chirale Induktion mittels Silicatein. 出願人／発明者：Tremel W, Tahir MN, Mueller WEG. Schroeder HC
【特許文献６】ＤＥ１０２４６１８６ In vitro and in vivo degradation or synthesis of silicon dioxide and silicones, useful e.g. for treating silicosis or to prepare prosthetic materials, using a new silicase enzyme. 出願人：University of Mainz. 発明者：Mueller WEG, Krasko A, Schroeder HC
【特許文献７】ＰＣＴ／ＥＰ０３／１０９８３ Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms. 出願人：University of Mainz. 発明者：Mueller WEG, Krasko A, Schroeder HC
【特許文献８】ＤＥ１０３５２４３３．９ Enzymatische Synthese, Modifikation und Abbau von Silicium (IV)- und anderer Metall (IV)- Verbindungen. 出願人：University of Mainz. 発明者：Mueller WEG, Schwertner H, Schroeder HC
【特許文献９】ＤＥ１０２００４０２１２２９．５ Enzymatisches Verfahren zur Herstellung bioaktiver, Osteoblasten-stimulierender Oberflaechen und Verwendung. 出願人：University of Mainz. 発明者：Schwertner H, Mueller WEG, Schroeder HC
【特許文献１０】ＤＥ１９８２４３８４．７
【特許文献１１】ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３１２１
【特許文献１２】ＥＰ９９９５５２８８．８
【特許文献１３】ＥＰ０５０１２１６２．３ Selenium-enriched liquid media for the cultivation of siliceous sponges and for biogenic silica production. 出願人：University of Mainz. 発明者：Mueller WEG, Schroeder HC, Osinga R, Schwertner H
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Uriz et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:163-193
【非特許文献２】Mueller et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:195-221
【非特許文献３】Schwab & Shore (1971) Nature 232:501-502
【非特許文献４】Krasko et al. (2000) Eur J Biochem 267:4878-4887
【非特許文献５】Cha et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:361-365
【非特許文献６】Tahir et al. (2004) Chem Commun 2004:2848-2849
【非特許文献７】Schroeder et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:250-268
【非特許文献８】Hench and Wilson (1984) Science 226:630-636
【非特許文献９】Yamamuro et al. (1990) Handbook on Bioactive Ceramics, VoI I: Bioactive Glasses and Glass-Ceramics, CRC Press, Boca Raton, FL
【非特許文献１０】Schroeder et al. (2005) J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater 75B:387-392
【非特許文献１１】Mueller et al. (1972) Cytobiologie 5:335
【非特許文献１２】Mueller et al. (1976) Biochim Biophys Acta 433:684
【非特許文献１３】Mueller et al. (2004) Micron 35:87
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、非晶質二酸化ケイ素（シリカ）、シロキサンの合成のための方法及び組換えシリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の使用、並びにこれらの化合物の修飾、並びに歯科学におけるそれらの医学的使用に関する。
【００１７】
シリカテイン配列（シリカ形成配列）及び絹フィブロイン配列を含む融合タンパク質、並びにこのような融合タンパク質をコードするｃＤＮＡが記載される。シリカテインは、歯科充填材として働くことのできる（バイオ）シリカの生体触媒形成に単独で、又はナノコンポジットの成分として使用される。絹フィブロインは、シリカテイン及びシリカテインにより形成されるシリカナノ粒子を歯のエナメル質、又は他の固体材料、例えば金属、プラスチック、及び複合材の表面に付着する接着タンパク質（「水中接着剤」）として使用される。シリカテインの幾つかの型及びアイソフォーム、例えばＰＣＲ法を用いてスベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）から単離される、シリカテインαポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、融合タンパク質を構築するのに使用することができる。関連ｃＤＮＡは他の海棲海綿、例えばGeodia cydonium、又は淡水海綿、例えばLubomirskia baicalensisから単離することができる。融合タンパク質又はその一部を、ヒトエナメル質由来ペプチド又はＤＯＰＡ含有ペプチド／タンパク質と組み合わせて、シリカ／ペプチド系ナノコンポジットをデザインすることができる。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、配列番号１に示される配列と少なくとも２５%の配列相同性、好ましくは同一性を示すシリカテインαドメインを含む融合タンパク質が使用される、シリカ（ケイ酸及び／又はケイ酸塩の縮合産物）、シリコーン、及び他の金属酸化物、並びにこれらの化合物の混合ポリマーをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで合成する手法である。
【００１９】
合成には、ケイ酸、モノアルコキシシラントリオール、モノアルコキシシランジオール、モノアルコキシシラノール、ジアルコキシシランジオール、ジアルコキシシラノール、トリアルコキシシラノール、テトラアルコキシシラン、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐シラントリオール、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐シランジオール、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐シラノール、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐モノアルコキシシランジオール、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐モノアルコキシシラノール、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐ジアルコキシシラノール、アルキル‐、アリール‐若しくはメタロ‐トリアルコキシシラン等の化合物を基質として使用することができる手法が用いられる。これらの化合物の規定の混合物を使用することにより、混合ポリマーを産生することができる。
【００２０】
本発明のさらに好適な態様によれば、融合タンパク質を他の分子、又はガラス、金属、金属酸化物、プラスチック、生体高分子、若しくは鋳型となる他の材料の表面に結合することにより、規定の２次元及び３次元構造を形成することができる。
【００２１】
本発明のさらに好適な態様によれば、ヒドロキシアパタイト（例えば、エナメル質）、シリカ又は金属酸化物を含有する構造又は表面を修飾する手法が提示され、それにおいて、配列番号１及び配列番号２に示される配列と少なくとも２５％の配列相同性、好ましくは同一性を有するシリカテイン及び／又は絹フィブロインドメインを含む融合タンパク質が修飾に使用される。
【００２２】
本発明のさらに好適な態様は、本明細書中に記載される手法を用いて得られた化合物又はシリカを含有する構造若しくは表面に関する。
【００２３】
本発明のさらに好適な態様は、配列番号１と一致するスベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）由来のシリカテインαの融合タンパク質、又はシリカテインαドメインのアミノ酸配列中で配列番号１に示される配列と少なくとも２５％の配列相同性、好ましくは同一性を有する相同ポリペプチド、又はその一部に関する。
【００２４】
「相同性」は、２つの配列をアライニング及び必要に応じてギャップ導入して最大の相同性％を達成した後の、対照配列シリカテインαドメインの残基と同一な候補アミノ酸配列中の残基の割合として定義される。アライメントの方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野で既知である。候補配列がこの定義に含まれるかを決定する目的に使用又は適応し得るコンピュータプログラムの一つは、Genentech, Incにより作成された「Ａｌｉｇｎ ２」である。
【００２５】
本発明のさらに好適な態様は、本特許出願に記載されるポリペプチドをコードする核酸、特に配列番号３及び配列番号４と一致する核酸に関する。核酸はＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの混合物であり得る。核酸の配列は少なくとも１つのイントロン及び／又はポリＡ配列を含み得る。
【００２６】
本発明のさらに好適な態様は（ａ）融合タンパク質（キメラタンパク質）構築物、又は（ｂ）分離タンパク質発現（プロテアーゼ切断部位）を有する構築物の形である核酸に関する。核酸はまた、合成的に産生され得る。必要な方法は従来技術の方法による。
【００２７】
本発明のさらに好適な態様は、本発明による核酸を含有するベクター、好ましくはプラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又は粒子、ナノ粒子、若しくはリポソームの形であるベクターに関する。さらに、これらのベクターは、好ましくはナノ粒子又はリポソームの形で、本発明による融合タンパク質を含むタンパク質の転移に使用することができる。
【００２８】
本発明のさらに好適な態様は、ベクターでトランスフェクトされたか、又は本発明による粒子により感染若しくは形質導入された宿主細胞である。この宿主細胞は、請求項１〜７に記載のポリペプチド又はその一部を発現することができる。任意の既知の宿主細胞生物、例えば酵母、真菌、海綿、細菌、ＣＨＯ細胞、又は昆虫細胞を使用することができる。
【００２９】
本出願でクレームされる融合タンパク質は、合成的に産生されるか、又は原核細胞又は真核細胞の抽出物又は溶解物中に存在することができる。細胞抽出物又は溶解物はｅｘ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｔｒｏで細胞、例えば組換え細菌細胞から調製することができる。
【００３０】
本出願でクレームされる融合タンパク質は、従来の方法を用いて精製することができ、したがって実質的に他のタンパク質を含み得ない。
【００３１】
融合タンパク質中に存在する接着タンパク質は、シリカテイン及びバイオシリカ構成要素の表面への制御された付着に使用することができる。
【００３２】
さらに、本発明による融合タンパク質又は核酸は、シリコーン及びシリコーンインプラントの代謝及び吸収の調節に使用することもできる。シリカテインは単量体シリコーン前駆体から高分子シリコーンを合成可能であり、したがって体細胞に取り込まれ得る単量体の除去に使用することができる。最終的に、本明細書中に記載される発明は、シリコーン及びシリコーンインプラントの代謝及び吸収を調節するために、本明細書中に記載される核酸による細胞のトランスフェクションに応用することができる。上述の応用の方法論は従来の方法であり、特定の要件に容易に適応させることができる。
【００３３】
また、ジフェノール含有タンパク質／ペプチド、特にＤＯＰＡ（３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）含有タンパク質／ペプチドは、水性環境で接着剤として働くことが知られている。本発明者らは海綿チロシナーゼをクローニングし、及び組換えタンパク質を発現させた。この酵素は、モノフェノール化合物を用いてジフェノールを合成する。組換え海綿酵素を用いて調製されるＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドは、シリカテイン／バイオシリカ構成要素を表面に結合するのに使用することができる。
【００３４】
特異的に修飾されたＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドの接着によって、表面をＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドのコーティングによる、異なる材料（金属、ガラス、プラスチック等）の表面上のパターンが作成され得る。
【００３５】
金属表面（チタン、チタン合金、又はＣｏＣｒ）並びにプラスチック及び複合材料から選択される表面を使用することができる。特にＦｅ（ＩＩＩ）及び他の金属イオンに対して強い結合親和性を有するカテコール酸素は、ＤＯＰＡ含有ペプチド及びタンパク質の表面への結合に重要である。
【００３６】
骨とインプラント（例えばＴｉ、Ｔｉ合金、又はＣｏＣｒから作られる金属インプラント）との間の安定した接続を作り出すことが主要な課題である。金属インプラントの「生物化（biologisation）」の一方法は、表面のＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドによるコーティングである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ナマコ類における生化学的接着機序の第１の説明図である。左：２つのキュビエ管（Cuvier tubuli）（Ａ：内筒、Ｂ：外筒）。右：パラフィンに接着するキュビエ管（Mueller and Zahn (1972) Cytobiologie 3: 335-351）。
【図２】海綿チロシナーゼによるモノフェノールのジフェノールへの変換（及びキノンへのさらなる酸化）の図である。
【図３】シリカテインαをコードするスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の図である。プライマーの構築に使用される配列には下線を引き、太字で示している。ＡＴＧ開始コドンには二重下線を引いている（配列番号５）。
【図４】シリカテインαをコードするスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列の図である。
【図５】プレコラーゲンＤをコードするムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis ）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の図である。プライマーの構築に使用される配列には下線を引き、太字で示している（配列番号６）。
【図６】プレコラーゲンＤをコードするムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis ）ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列の図である（配列番号７）。
【図７】絹フィブロインをコードするムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis ）ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列の図である（配列番号８）。
【図８】絹フィブロインをコードするムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis ）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列の図である。フォワードプライマー及びリバースプライマーの構築に使用される配列には下線を引き、太字で示している（配列番号９）。
【図９】ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（Invitrogen）のヌクレオチド配列の図である。
【図１０】絹フィブロインからシリカテインをエンテロキナーゼにより切断するために使用される、プロテアーゼ結合部位（エンテロキナーゼ認識部位）の図である。
【図１１】ＮｃｏＩによる消化後の、ｐＴｒｃＨｉｓ２ベクターの絹フィブロインｃＤＮＡの直前への、プロテアーゼ結合部位を有するシリカテイン遺伝子のクローニングの図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
組換えシリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の発現及び単離
組換えシリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の調製は、好ましくは大腸菌において行なわれる。酵母及び哺乳類細胞における組換えタンパク質の調製も可能であり、首尾よく行われている。ｃＤＮＡを適切なベクター、例えばｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（Invitrogen）にクローニングする。大腸菌の形質転換後、シリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の発現をＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド） によって誘導する（Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York）。シリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の発現及び組換えタンパク質の精製は、例えば組換えタンパク質中に存在するヒスチジンタグを用いて、適切なアフィニティーマトリクス、例えばＮｉ−ＮＴＡマトリクス上で行なうことができる（Skorokhod et al. (1997) Cell Mol Biol 43:509-519）。
【００３９】
２つの代替的構築物をシリカテインα−絹フィブロイン融合タンパク質発現に使用する。
【００４０】
１．プロテアーゼ切断部位を有しない融合タンパク質の調製
シリカテインαポリペプチド及び絹フィブロインを有する融合タンパク質を調製するために、適切な発現ベクター（例えば、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯベクター；Invitrogen）を使用する。５'末端及び３'末端の両方に、例えばＮｃｏＩ制限部位を有するシリカテインα ｃＤＮＡを調製する。シリカテインα ｃＤＮＡの停止コドンを除去する。増幅には、ＰＣＲ−Ｔｅｃｈｎｉｋを使用し、それぞれの制限部位を有するプライマーを使用する。第２のタンパク質をコードするｃＤＮＡを調製する。そこでは、５'末端にシリカテインα ｃＤＮＡの３'末端と同じ制限部位（例では、ＮｃｏＩ）を使用し、及び３'末端にもＮｃｏＩ制限部位を使用する。
【００４１】
両方のｃＤＮＡを標準手法に従ってライゲーションし、精製し、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯベクターにライゲーションする。ライゲーションはヒスチジンタグの近くに行なわれる。例えば組換えタンパク質中に存在するヒスチジンタグを用いた融合タンパク質の発現及び精製は、適切なアフィニティーマトリクス、例えばＮｉ−ＮＴＡマトリクスを用いて行なうことができる（Skorokhod et al. (1997) Cell Mol Biol 43:509-519）。
【００４２】
２．分離発現（プロテアーゼ切断部位）
１の手法に対して代替的に、プロテアーゼ切断部位（例えば、エンテロキナーゼ部位）を、シリカテインαポリペプチドをコードするｃＤＮＡと、絹フィブロインをコードするｃＤＮＡとの間にクローニングすることができる。発現及び精製の後、融合タンパク質をタンパク質分解性切断する。その後、両タンパク質を分離する。
【００４３】
以下の例では、大腸菌におけるスベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）由来のシリカテインα遺伝子、及びムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）由来の絹フィブロイン遺伝子を含む融合タンパク質の発現が記載される。この例では、触媒活性ドメイン（短型シリカテイン）のみを含むシリカテイン挿入断片を使用するが、当該タンパク質の完全アミノ酸配列を含む挿入断片を使用することも可能である。
【００４４】
融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの構築に使用されるシリカテインｃＤＮＡを記載する。
【００４５】
スベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）由来のシリカテインα及びシリカテインβをコードするｃＤＮＡは、シリカテインαはＡＪ２７２０１３（非特許文献４）、シリカテインβはＡＪ５４７６３５、ＡＪ７８４２２７（Schroeder et al. (2004) Cell Tissue Res 316:271-280）である。シリカテインαをコードするスベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を図３に示す。シリカテインαをコードするスベリテス・ドムンクラ（S. domuncula）ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列は図４に示す。
【００４６】
ルボミルスキア・バイカレンシス（Lubomirskia baicalensis）由来のシリカテインａ１〜４をコードするｃＤＮＡは、シリカテインalphaはＡＪ８７２１８３、シリカテインａ２はＡＪ９６８９４５、シリカテインａ３はＡＪ９６８９４６、シリカテインａ４はＡＪ９６８９４７である（Wiens et al. (2006) Dev Genes Evol 216:229-242）。
【００４７】
プレコラーゲンＤをコードするムラサキイガイ（M. galloprovincialis ）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を図５に示す。プレコラーゲンＤをコードするムラサキイガイ（M. galloprovincialis ）ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列は図６に示す。
【００４８】
絹フィブロインをコードするムラサキイガイ（M. galloprovincialis ）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を図７及び図８に示す。
【００４９】
ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（Invitrogen）を融合タンパク質の産生に使用するが、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯのヌクレオチド配列については図９を参照されたい。他の発現ベクターも用いることができることは証明されている。
【００５０】
制限酵素ＮｃｏＩ（Ｃ↓ＣＡＴＧＧ）を使用した。この制限酵素は：
絹フィブロインｃＤＮＡに制限部位を有しない；
シリカテインα ｃＤＮＡに制限部位を有しない；
ｐＴｒｃＨｉｓ２ベクターに１つの制限部位を有する。
【００５１】
ＮｃｏＩによる消化のために、オーバーハングを含む以下のプライマーをシリカテインｃＤＮＡに使用する：
ＳｉｌｉＮｏｃ＿Ｆｏｒ１
ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＴＣ ＴＴＧ ＴＣＡ ＣＡＧ ＴＧＧ ＴＡＧ ＴＡＣ ＴＧ（配列番号１０）；
ＳｉｌｉＮｏｃ＿Ｒｅｖ１
ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＧＧ ＴＧＧ ＧＡＴ ＡＡＧ ＡＴＧ ＣＡＴ Ｃ（配列番号１１）。
【００５２】
第1の工程では、絹フィブロインをコードする配列を、以下の特定のプライマーを用いてｐｒｅ−ＣｏｌＤ ｃＤＮＡから単離する：
Ｓｉｌｋ Ｆ
５' ＧＧＴ ＧＧＡ ＣＴＣ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＣ ３'（配列番号１２）；
Ｓｉｌｋ ＨＩＳ Ｒ
５' ＡＴＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＴＴＴ ＧＴＧ ＡＴＡ ＧＣ ３'（配列番号１３）。
【００５３】
次に、絹フィブロインｃＤＮＡをベクターｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（Invitrogen）にクローニング（Ｔ／Ａクローニング）する。その後、細菌株ＢＬ２１を得られたプラスミドでトランスフェクトする。
【００５４】
シリカテインα配列については、オーバーハングを含む以下のリバースプライマーを、このオーバーハングをプロテアーゼ（エンテロキナーゼ）結合部位として使用するように構築する：
Ｓｉｌｉ＿Ｅｎｄｏ＿Ｒｅｖ
５' ＣＴＴ ＧＴＣ ＡＴＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ＴＡＧ ＧＧＴ ＧＧＧ ＡＴＡ ＡＧ ３'（配列番号１４）。
【００５５】
次の工程では、オーバーハングを含む以下のプライマーを構築する：
ＳｉｌｉＮｏｃ＿Ｆｏｒ１
５' ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＴＣ ＴＴＧ ＴＣＡ ＣＡＧ ＴＧＧ ＴＡＧ ＴＡＣ ＴＧ ３'（配列番号１５）；
ＳｉｌｉＮｏｃ＿Ｒｅｖ１
５' ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＣＴ ＴＧＴ ＣＡＴ ＣＧＴ ＣＡＴ ＣＴＡ ＧＧ ３'（配列番号１６）。
【００５６】
これらのオーバーハングは、制限酵素ＮｃｏＩの制限部位として使用される。ｐＴｒｃＨｉｓ２ベクターも、この酵素に対する制限部位を有する。これによりベクター及び増幅シリカテインで二重消化を行なうことができる。この消化の後、シリカテインをｐＴｒｃＨｉｓ２ベクターに、絹フィブロインの直前にクローニングする。
【００５７】
シリカテインを絹フィブロインから切断するために使用される、プロテアーゼ結合部位（エンテロキナーゼ認識部位）を図１０に示す。
【００５８】
ＮｃｏＩによる消化の後、プロテアーゼ結合部位を有するシリカテインｃＤＮＡをｐＴｒｃＨｉｓ２ベクターに、絹フィブロインｃＤＮＡの直前にクローニングする（図１１）。
【００５９】
大腸菌の形質転換後、シリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の発現は通常、ＩＰＴＧにより誘発され、３７℃で４時間又は６時間行なわれる（Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York）。得られた融合タンパク質を、例えばＮｉ−ＮＴＡマトリクス上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。シリカテインを絹フィブロインから分離するために、融合タンパク質をエンテロキナーゼにより切断する。次に、タンパク質を２−メルカプトエタノールの存在下でゲル電気泳動にかける。ゲル電気泳動は、０．１％ＮａＤｏｄＳＯ４を用いて１０％ポリアクリルアミドゲル上で行なうことができる（ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＰＡＧＥ）。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色する。切断、精製、及び続くＰＡＧＥの後、組換えシリカテインタンパク質及び絹フィブロインの短型が得られる。
【００６０】
抗体を用いたシリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の単離及び精製
シリカテインα−絹フィブロイン融合タンパク質は、アフィニティーマトリクス上でさらに精製することができる。アフィニティーマトリクスは、例えばシリカテインα特異抗体を固相（ＣＮＢｒ活性化セファロース又は他の適切な担体）上に固定化することにより調製することができる。標準方法に従って調製された、シリカテインαに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用することができる（Osterman (1984) Methods of Protein and Nucleic Acid Research Vol. ２; Springer-Verlag [Berlin]）。抗体のマトリクスへのカップリングは、メーカー（Pharmacia）の使用説明書に従って行なわれる。純粋なシリカテインα−絹フィブロイン融合タンパク質の溶出は、ｐＨ変化又はイオン強度の変化により行なわれる。
【００６１】
他のアフィニティーマトリクスも使用することができる。
【００６２】
シリカテイン活性の検出及びシリカの合成
組換えシリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質の酵素活性を求めるために、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）の加水分解及び続く重合の後の重合し沈降したシリカの測定に基づく分析を用いる。
【００６３】
組換えシリカテインの酵素活性の測定は通常、以下のように行なわれる。融合タンパク質を酵素反応に適切な緩衝液、例えば５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）に対して一晩透析する。ｐＨが４．５〜１０．５の範囲の他の緩衝液も適切である。
【００６４】
融合タンパク質（１μｇ〜５０μｇ）を１ｍｌの適切な緩衝液、例えば５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）に溶解し、１ｍｌの１ｍＭ〜４．５ｍＭ ＴＥＯＳ溶液を補充する。酵素反応は室温で行なうことができる。典型的には、６０分のインキュベーション期間で、シリカテイン１００μｇにつき２００ｎｍｏｌの非晶質シリカが合成される。シリカ産物を遠心分離（１２０００×ｇ、１５分、＋４℃）により回収し、エタノールで洗浄し、風乾する。その後、沈殿を１Ｍ ＮａＯＨで加水分解する。溶解ケイ酸塩を次に、モリブデン酸塩に基づく分析、例えばケイ素分析（Merck）により定量的に測定する。
【００６５】
以下の基質を使用することができる：テトラアルコキシシラン、トリアルコキシシラノール、ジアルコキシシランジオール、モノアルコキシシラントリオール、ジアルコキシシラノール、モノアルコキシシランジオール、モノアルコキシシラノール、アルキル−、アリール−若しくはメタロトリアルコキシシラン、アルキル−、アリール−若しくはメタロシラノール、アルキル−、アリール−若しくはメタロシランジオール、アルキル−、アリール−若しくはメタロシラントリオール、アルキル−、アリール−若しくはメタロモノアルコキシシランジオール、アルキル−、アリール−若しくはメタロジアルコキシシラノール、又は他の金属酸化物 前駆体（ガリウム、ジルコニウム、又はチタンのアルコキシ化合物）。これらの基質の混合物もまた酵素によって使用される。したがって、混合ポリマーも産生され得る。
【００６６】
反応は温和な条件下で行なうことができる。したがって、本発明は省エネルギーで環境に無害な手法の導入に寄与している。
【００６７】
完全に再生され得るヒドロキシアパタイトの代わりにシリカを使用することの他の理由は、シリカがより耐酸性であり、ヒドロキシアパタイトが「天然の」エナメル質と同じくらい齲蝕を受けやすいことである。
【００６８】
シリカテイン−接着タンパク質融合タンパク質の組合せ
シリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質及びシリカテインにより産生される（バイオ）シリカは、以下と組み合せて使用することができる：
ａ）ヒトエナメル質由来ペプチド。これらのペプチドはシリカ／ペプチド系ナノコンポジットのデザインを可能にする。これらは副作用を引き起こす可能性がある樹脂単量体又は添加剤の浸出がなく、生体適合性である。
ｂ）ＤＯＰＡ含有ポリペプチド／タンパク質。これらのポリペプチド／タンパク質は、海綿チロシナーゼを用いて調製することができる。これらはシリカテイン／バイオシリカの表面結合のための接着剤として使用される。
【００６９】
（バイオ）シリカとエナメル質由来ペプチド／タンパク質の組合せ
エナメル質に由来するペプチドを使用する理由は、当該ペプチドがエナメル質において粘着をもたらし、シリカ複合体中で最高の粘着を生じ、空洞が引き起こされた虫歯のエナメル質辺縁へのシリカ系「ナノコンポジット」の最高の粘着作用を生じるためである。樹脂粘着剤の欠点は、「感水性（water sensible）」で、加水分解される傾向があることである。
【００７０】
（バイオ）シリカとＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドの組合せ
海棲海綿からクローニングされる組換えチロシナーゼ（非特許文献１３）が、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）単位を含有する接着ポリペプチド又はタンパク質を合成するために使用される。使用されるチロシン含有タンパク質及びペプチドの酵素によるヒドロキシル化は、記載の手法（Marumo and Waite (1986) Biochim Biophys Acta 872:98、Akemi Ooka and Garrell (2000) Biopolymers 57:92）に従って行なわれる。タンパク質又はペプチド中のチロシン残基のＤＯＰＡへの酵素によるヒドロキシル化における一つの問題は、チロシンヒドロキシル化後に形成されるＤＯＰＡのさらなる産物（特にドーパキノン）へのチロシナーゼ媒介酸化によって起こり得る。ドーパキノンは、リシン残基と架橋を形成することが可能である。ＤＯＰＡからの酸化産物の形成を低減するために、ヒドロキシル化中にアスコルビン酸を添加する。アスコルビン酸は、形成されるドーパキノン及びカテコールのさらなる酸化産物を減少させる。酵素は、低分子量ペプチドのヒドロキシル化中に、遠心分離／濾過（ミクロポアフィルタ）により除去する。アスコルビン酸を産物から逆相ＨＰＬＣにより分離する。
【００７１】
組換え海綿チロシナーゼを「ＧＳＴ Ｆｕｓｉｏｎｓ」システム（Amersham）を用いて調製する。得られたＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオン−セファロース４B上でアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを組換え海綿酵素から分離するために、融合タンパク質をトロンビンで切断する。チロシナーゼの酵素活性は、リン酸緩衝液中でＬ−チロシンを基質として用いて求める。チロシンのＬ−ＤＯＰＡ（３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）への変換を２８０ｎｍで測定する。
【００７２】
また、シリカテインは、モノフェノール（例えばチロシン残基）をジフェノールに変換する組換え海綿チロシナーゼを用いて修飾することができる。
【００７３】
得られた接着剤タンパク質は、高次構造の形成下で、バイオシリカから作られる（シリカテインにより合成される）構成要素を連結するために使用することができる。
【００７４】
シリカテインα−絹フィブロイン融合タンパク質の応用
本発明のさらなる態様は、以下のシリカテインα−絹フィブロイン融合タンパク質の応用である。
【００７５】
１）歯科材料の表面修飾への応用（生体適合性の改善、現在使用されている材料と比較して高い安定性及び空隙率）。
【００７６】
２）歯科用置換材料等の新規の歯科材料（複合材料）の調製への応用。
【００７７】
３）金属、金属酸化物、プラスチック、及び他の材料から作られる歯科材料のコーティングの調製、特にこれらの材料上の単分子層の調製（生物化；骨と歯科材料との間の安定した接続の形成）への応用。
【００７８】
４）シリカテイン及びバイオシリカ構成要素（シリカテインにより合成されるバイオシリカ粒子）の表面（金属、ガラス等）への付着のため、及び高次構造の形成下でバイオシリカ構成要素を連結するための、融合タンパク質中に存在する接着タンパク質（「水中接着剤」）の使用。
【００７９】
５）歯科学におけるフィラー粒子としてのバイオシリカの使用。バイオシリカは従来の材料と比べて、２つの利点を有する：１．組換え酵素（シリカテイン）又はバイオリアクター（プリモルフ）を用いて酵素的に生成することができるため、環境に無害に合成される。表面修飾はシリカーゼにより行なわれ得る。高いエネルギー又は攻撃的な化学物質の必要はない。
【００８０】
配列番号１：スベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）由来のシリカテインαポリペプチドのアミノ酸配列（ｒＳＩＬＩＣＡα＿ＳＵＢＤＯ）。
配列番号２：ムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis ）由来の絹フィブロインポリペプチドのアミノ酸配列（ｒＳＩＬＫＦＩＢ＿ＭＹＴＧＡ）。
配列番号３：シリカテインαポリペプチドをコードするスベリテス・ドムンクラ（Suberites domuncula）由来ｃＤＮＡの核酸配列。
配列番号４：絹フィブロインポリペプチドをコードするムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis ）由来ｃＤＮＡの核酸配列。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカ合成酵素及び接着タンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記シリカ合成酵素と前記接着タンパク質との間にプロテアーゼ切断部位を含有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記シリカ合成酵素がシリカテインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記シリカ合成酵素がシリカテインαである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記接着タンパク質が絹フィブロインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記シリカ合成酵素と前記接着タンパク質との間にプロテアーゼ切断部位を含有する、請求項３、４、又は５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼ切断部位である、請求項２、３、４、５、又は６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質を合成する方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、ナノコンポジット材料。
【請求項１１】
適切な添加剤及び補助剤と共に、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を含む、ナノコンポジット材料。
【請求項１２】
適切な希釈溶液又は担体物質と共に、１つ又は複数の成分がデポー化合物の形で、又は前駆体として存在する、請求項１０又は１１に記載のナノコンポジット材料。
【請求項１３】
さらなる化合物と正に相互作用し、且つリン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト）沈殿、エナメル細胞動員を調節し、且つ抗菌活性を示す付加的な生物活性を有する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のナノコンポジット材料。
【請求項１４】
これらの融合タンパク質及びナノコンポジット材料を使用することにより、二酸化ケイ素（ケイ酸又はケイ酸塩の縮合産物；シリカとも呼ばれる）、シリコーン、及び酸化チタン（チタニア）、酸化ジルコニウム（ジルコニア）、酸化鉄、及び酸化バナジウムを含む他の金属酸化物、並びに混合ポリマーをｉｎ ｖｉｔｒｏ又は非ヒトｉｎ ｖｉｖｏで合成する方法。
【請求項１５】
二酸化ケイ素（ケイ酸又はケイ酸塩の縮合産物；シリカとも呼ばれる）、シリコーン、及び酸化チタン（チタニア）、酸化ジルコニウム（ジルコニア）、酸化鉄、及び酸化バナジウムを含む他の金属酸化物、並びに混合ポリマーをｉｎ ｖｉｔｒｏ又は非ヒトｉｎ ｖｉｖｏで合成する方法であって、配列番号２に示される配列と少なくとも２５％の配列類似性を示す接着タンパク質ドメインを含む融合タンパク質が使用される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は非ヒトｉｎ ｖｉｖｏで合成する方法。
【請求項１６】
二酸化ケイ素（ケイ酸又はケイ酸塩の縮合産物；シリカとも呼ばれる）、シリコーン、及び酸化チタン（チタニア）、酸化ジルコニウム（ジルコニア）、酸化鉄、及び酸化バナジウムを含む他の金属酸化物、並びに混合ポリマーをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで合成する方法であって、配列番号１に示される配列と少なくとも２５％の配列類似性を示すシリカテインドメインを含む融合タンパク質が使用される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで合成する方法。
【請求項１７】
ケイ酸、ケイ酸塩、モノアルコキシシラントリオール、モノアルコキシシランジオール、モノアルコキシシラノール、ジアルコキシシランジオール、ジアルコキシシラノール、トリアルコキシシラノール、テトラアルコキシシラン、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−シラントリオール、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−シランジオール、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−シラノール、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−モノアルコキシシランジオール、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−モノアルコキシシラノール、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−ジアルコキシシラノール、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−トリアルコキシシラン、又は他の金属酸化物前駆体化合物が合成の基質として使用される、請求項１４〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
規定の組成の混合ポリマーが、前記化合物の規定の混合物を用いて産生される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ガラス、金属、金属酸化物、プラスチック、生体高分子、又は鋳型として使用される他の材料への前記融合タンパク質の表面結合により、規定の２次元及び３次元構造が産生される、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
組換え海綿チロシナーゼを用いて、ＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドを製造する方法。
【請求項２１】
ＤＯＰＡ含有ポリペプチドを用いて、シリカテイン／バイオシリカ構成要素を表面（金属表面、プラスチック表面、又は複合材料の表面）に結合させる方法。
【請求項２２】
前記請求項に記載の方法を用いて得られる歯科充填材。
【請求項２３】
（ａ）融合タンパク質（キメラタンパク質）構築物、又は（ｂ）分離タンパク質発現（プロテアーゼ切断部位）を有する構築物の形である、請求項８に記載の核酸。
【請求項２４】
前記核酸がＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの混合物を表す、請求項２３に記載の核酸。
【請求項２５】
前記核酸の配列が少なくとも１つのイントロン及び／又はポリＡ配列を含む、請求項８、２３、又は２４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２６】
前記核酸が合成的に産生される、請求項８及び請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２７】
好ましくはプラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、若しくはナノ粒子、又はリポソームの形である、請求項８及び請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２８】
好ましくはナノ粒子又はリポソームの形である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、ベクター。
【請求項２９】
請求項８及び請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクトされたか、又は請求項８及び請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の粒子により感染若しくは形質導入された宿主細胞。
【請求項３０】
請求項１〜７に記載のポリペプチド又はその一部を発現する、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが合成的に産生される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが原核細胞又は真核細胞の抽出物又は溶解物中に存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが精製され、実質的に他のタンパク質を含まない、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
シリコーンインプラントにおけるシリコーン及びシリコーン単量体の吸収の調節のための、前記請求項に記載のポリペプチド、核酸、又はナノコンポジット材料の使用。
【請求項３５】
シリコーンインプラントにおけるシリコーン及びシリコーン単量体の吸収を調節するために、細胞をトランスフェクションするための前記請求項に記載の核酸の使用。
【請求項３６】
金属、金属酸化物、プラスチック、及び他の材料のコーティング、特にこれらの材料上の単分子層の形成としての、シリカテインにより酵素的に産生されたシリカ、又は他の金属酸化物、及び接着タンパク質の使用。
【請求項３７】
シリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質と、生体適合性ヒトエナメル質由来ペプチド／タンパク質との組合せ（シリカ／ペプチド系ナノコンポジット）の使用。
【請求項３８】
シリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質と、ＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドとの組合せの使用。
【請求項３９】
歯科学におけるフィラー粒子としての、シリカテインを用いて生成される（バイオ）シリカの使用。
【請求項１】
シリカ合成酵素及び接着タンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記シリカ合成酵素と前記接着タンパク質との間にプロテアーゼ切断部位を含有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記シリカ合成酵素がシリカテインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記シリカ合成酵素がシリカテインαである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記接着タンパク質が絹フィブロインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記シリカ合成酵素と前記接着タンパク質との間にプロテアーゼ切断部位を含有する、請求項３、４、又は５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼ切断部位である、請求項２、３、４、５、又は６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質を合成する方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、ナノコンポジット材料。
【請求項１１】
適切な添加剤及び補助剤と共に、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を含む、ナノコンポジット材料。
【請求項１２】
適切な希釈溶液又は担体物質と共に、１つ又は複数の成分がデポー化合物の形で、又は前駆体として存在する、請求項１０又は１１に記載のナノコンポジット材料。
【請求項１３】
さらなる化合物と正に相互作用し、且つリン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト）沈殿、エナメル細胞動員を調節し、且つ抗菌活性を示す付加的な生物活性を有する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のナノコンポジット材料。
【請求項１４】
これらの融合タンパク質及びナノコンポジット材料を使用することにより、二酸化ケイ素（ケイ酸又はケイ酸塩の縮合産物；シリカとも呼ばれる）、シリコーン、及び酸化チタン（チタニア）、酸化ジルコニウム（ジルコニア）、酸化鉄、及び酸化バナジウムを含む他の金属酸化物、並びに混合ポリマーをｉｎ ｖｉｔｒｏ又は非ヒトｉｎ ｖｉｖｏで合成する方法。
【請求項１５】
二酸化ケイ素（ケイ酸又はケイ酸塩の縮合産物；シリカとも呼ばれる）、シリコーン、及び酸化チタン（チタニア）、酸化ジルコニウム（ジルコニア）、酸化鉄、及び酸化バナジウムを含む他の金属酸化物、並びに混合ポリマーをｉｎ ｖｉｔｒｏ又は非ヒトｉｎ ｖｉｖｏで合成する方法であって、配列番号２に示される配列と少なくとも２５％の配列類似性を示す接着タンパク質ドメインを含む融合タンパク質が使用される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は非ヒトｉｎ ｖｉｖｏで合成する方法。
【請求項１６】
二酸化ケイ素（ケイ酸又はケイ酸塩の縮合産物；シリカとも呼ばれる）、シリコーン、及び酸化チタン（チタニア）、酸化ジルコニウム（ジルコニア）、酸化鉄、及び酸化バナジウムを含む他の金属酸化物、並びに混合ポリマーをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで合成する方法であって、配列番号１に示される配列と少なくとも２５％の配列類似性を示すシリカテインドメインを含む融合タンパク質が使用される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで合成する方法。
【請求項１７】
ケイ酸、ケイ酸塩、モノアルコキシシラントリオール、モノアルコキシシランジオール、モノアルコキシシラノール、ジアルコキシシランジオール、ジアルコキシシラノール、トリアルコキシシラノール、テトラアルコキシシラン、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−シラントリオール、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−シランジオール、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−シラノール、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−モノアルコキシシランジオール、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−モノアルコキシシラノール、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−ジアルコキシシラノール、アルキル−、アリール−若しくはメタロ−トリアルコキシシラン、又は他の金属酸化物前駆体化合物が合成の基質として使用される、請求項１４〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
規定の組成の混合ポリマーが、前記化合物の規定の混合物を用いて産生される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ガラス、金属、金属酸化物、プラスチック、生体高分子、又は鋳型として使用される他の材料への前記融合タンパク質の表面結合により、規定の２次元及び３次元構造が産生される、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
組換え海綿チロシナーゼを用いて、ＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドを製造する方法。
【請求項２１】
ＤＯＰＡ含有ポリペプチドを用いて、シリカテイン／バイオシリカ構成要素を表面（金属表面、プラスチック表面、又は複合材料の表面）に結合させる方法。
【請求項２２】
前記請求項に記載の方法を用いて得られる歯科充填材。
【請求項２３】
（ａ）融合タンパク質（キメラタンパク質）構築物、又は（ｂ）分離タンパク質発現（プロテアーゼ切断部位）を有する構築物の形である、請求項８に記載の核酸。
【請求項２４】
前記核酸がＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの混合物を表す、請求項２３に記載の核酸。
【請求項２５】
前記核酸の配列が少なくとも１つのイントロン及び／又はポリＡ配列を含む、請求項８、２３、又は２４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２６】
前記核酸が合成的に産生される、請求項８及び請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２７】
好ましくはプラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、若しくはナノ粒子、又はリポソームの形である、請求項８及び請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２８】
好ましくはナノ粒子又はリポソームの形である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、ベクター。
【請求項２９】
請求項８及び請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクトされたか、又は請求項８及び請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の粒子により感染若しくは形質導入された宿主細胞。
【請求項３０】
請求項１〜７に記載のポリペプチド又はその一部を発現する、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが合成的に産生される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが原核細胞又は真核細胞の抽出物又は溶解物中に存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが精製され、実質的に他のタンパク質を含まない、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
シリコーンインプラントにおけるシリコーン及びシリコーン単量体の吸収の調節のための、前記請求項に記載のポリペプチド、核酸、又はナノコンポジット材料の使用。
【請求項３５】
シリコーンインプラントにおけるシリコーン及びシリコーン単量体の吸収を調節するために、細胞をトランスフェクションするための前記請求項に記載の核酸の使用。
【請求項３６】
金属、金属酸化物、プラスチック、及び他の材料のコーティング、特にこれらの材料上の単分子層の形成としての、シリカテインにより酵素的に産生されたシリカ、又は他の金属酸化物、及び接着タンパク質の使用。
【請求項３７】
シリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質と、生体適合性ヒトエナメル質由来ペプチド／タンパク質との組合せ（シリカ／ペプチド系ナノコンポジット）の使用。
【請求項３８】
シリカテイン−絹フィブロイン融合タンパク質と、ＤＯＰＡ含有タンパク質及びペプチドとの組合せの使用。
【請求項３９】
歯科学におけるフィラー粒子としての、シリカテインを用いて生成される（バイオ）シリカの使用。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１】
【公表番号】特表２０１０−５０１１６８（Ｐ２０１０−５０１１６８Ａ）
【公表日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２４９５７（Ｐ２００９−５２４９５７）
【出願日】平成１９年８月２１日（２００７．８．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００７３６３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２２７７４
【国際公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【出願人】（５０９０５２１０４）ナノテクマリン ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２１日（２００７．８．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００７３６３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２２７７４
【国際公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【出願人】（５０９０５２１０４）ナノテクマリン ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
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