バイオセンサーを用いたスクリーニング方法
【課題】 バイオセンサーに固定化した生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定するとともに、該物質が生理活性物質の生物学的活性に及ぼす影響を分析することによって、被験物質をスクリーニングする方法を提供すること。
【解決手段】 （１）生理活性物質を基板に固定化したバイオセンサーに被験物質を接触させることにより、該生理活性物質と相互作用する被験物質を表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析により検出する工程；及び
（２）該被験物質の存在下において該生理活性物質の生物学的活性の測定を行う工程：
を含む、被験物質のスクリーニング方法。
【解決手段】 （１）生理活性物質を基板に固定化したバイオセンサーに被験物質を接触させることにより、該生理活性物質と相互作用する被験物質を表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析により検出する工程；及び
（２）該被験物質の存在下において該生理活性物質の生物学的活性の測定を行う工程：
を含む、被験物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーを用いたスクリーニング方法に関する。より詳細には、本発明は、バイオセンサーに固定化した生理活性物質と相互作用する物質の検出または測定と、該生理活性物質の生物学的活性の測定の両方を行うことを特徴とする、被験物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析において一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。
【０００４】
上記の通り、従来の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定においては、測定チップに固定化された生理活性物質と相互作用する物質の検出または測定が行われていたが、該生理活性物質の生物学的活性の測定を行われていなかったため、生理活性物質と相互作用する物質が、該生理活性物質の生物学的活性に影響を及ぼすかどうかを分析することはできなかった。
【０００５】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号
【特許文献２】特開平９−２６４８４３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、バイオセンサーに固定化した生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定するとともに、該物質が生理活性物質の生物学的活性に及ぼす影響を分析することによって、被験物質をスクリーニングする方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、生理活性物質を基板に固定化したバイオセンサーを用いて該生理活性物質と相互作用する物質の検出または測定を行い、さらに該生理活性物質の生物学的活性の測定を行うことによって被験物質をスクリーニングすることで上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、（１）生理活性物質を基板に固定化したバイオセンサーに被験物質を接触させることにより、該生理活性物質と相互作用する被験物質を表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析により検出する工程；及び
（２）該被験物質の存在下において該生理活性物質の生物学的活性の測定を行う工程：
を含む、被験物質のスクリーニング方法が提供される。
【０００９】
好ましくは、１分子の生理活性物質に対し、１〜１０分子の被験物質が結合する。
好ましくは、表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析による複数の被験物質の検出を、並列検出で行う。
好ましくは、バイオセンサーへの生理活性物質の固定化と、該生理活性物質と相互作用する被験物質の検出とを異なる位置で行う。
【００１０】
好ましくは、結合量、結合定数、結合速度定数又は解離速度定数の何れかに基づいて、生理活性物質と相互作用する被験物質を表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析により検出する。
【００１１】
好ましくは、生理活性物質の生物学的活性は、レセプター活性量、酵素活性量、抗体活性、代謝活性量、膜電位、イオン放出量、又は遺伝子発現量の何れかである。
【００１２】
好ましくは、工程（１）の前にさらに、被験物質に対してバーチャルスクリーニングを実施し、スクリーニングに供する被験物質の数を低減する。
【００１３】
好ましくは、予め基準値が入力されているスクリーニング装置を用いてスクリーニングを自動的に行う。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のスクリーニング方法によれば、少量の蛋白質で結合と酵素反応の２種類の測定が可能である。また、本発明のスクリーニング方法によれば、活性測定することで結合した化合物が活性部位に対する結合であるか否かを判断することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明による被験物質のスクリーニング方法は、（１）生理活性物質を基板に固定化したバイオセンサーに被験物質を接触させることにより、該生理活性物質と相互作用する被験物質を表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析により検出する工程；及び（２）該被験物質の存在下において該生理活性物質の生物学的活性の測定を行う工程：を含むことを特徴とする。本発明では、生理活性物質と相互作用する物質の検出または測定と、該生理活性物質の生物学的活性の測定の両方を行うことにより、例えば、生理活性物質に結合した被験物質が生理活性物質の活性部位に結合したのかどうかを判断することが可能になり、被験物質が生理活性物質の生物学的活性に及ぼす影響を分析することができる。なお、ローカルプラズモン（局所的表面プラズモン）は、金属微粒子や金属針先端に存在するプラズモンである。その局在する領域は微粒子や針先端の広がり程度であり、光の波長より十分小さくすることができる。ローカルプラズモンの周波数は、微粒子の形状・金属原子の種類に強く依存するので、散乱スペクトルが微粒子毎に変化する。微粒子表面に生理活性物質（蛋白など）を固定しておき、散乱スペクトルの変化により生理活性物質と結合する被験物質を分析することができる。
【００１６】
本発明においては、生理活性物質は固相化されている。固相化の方法としては、公知の方法が用いられる。また、蛋白質などの生理活性物質の固相化を行うユニットと、固相化した生理活性物質と被験物質との相互作用測定を行うユニットとは分離されていることが好ましい。本発明のスクリーニングを行うための装置構成の一例を図１に示す。蛋白の固相化を行うユニットと、相互作用測定を行うユニットを分離することにより、測定処理能力が大幅に向上する。また、図１に示す通り、本発明では好ましくは、表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析による複数の被験物質の検出を、並列検出で行うことができる。
【００１７】
本発明でスクリーニングに供される被験物質の数は、１０００種以上であることが好ましく、１００００種以上であることがより好ましく、１０００００種以上であることがさらに好ましい。
【００１８】
本発明で用いる被験物質としては例えば、本明細書中以下に記載するような生理活性物質（リガンド）と相互作用する物質であれば特に限定されないが、低分子有機化合物、高分子化合物、ＤＮＡ等の核酸、蛋白質（抗体などを含む）、ペプチド又はその断片、糖、アミノ酸などが挙げられる。
【００１９】
本発明の好ましい態様では、予め基準値が入力されているスクリーニング装置を用いてスクリーニングを自動的に行うことができる。即ち、スクリーニング装置に予め、選択したい範囲の基準値（例えば、生理活性物質と相互作用する被験物質のスクリーニングにおいては結合量、結合定数、結合速度定数又は解離速度定数など；また、生理活性物質の生物学的活性においては、レセプター活性量、酵素活性量、代謝活性量、膜電位、イオン放出量、又は遺伝子発現量など）を入力しておき、その範囲に入る被験物質が自動選別されることが好ましい。選別された被験物質は、表示装置に視覚的に区別されるように表示されることが好ましい。視覚的な区別の方法は特に限定されないが、例えば、文字の大きさ、色、文字の点滅、文字の色、アンダーライン、枠で囲む、などの方法が挙げられる。
【００２０】
本発明においては、生理活性物質と相互作用する被験物質を選別する第一の工程と、第一の工程で選別された被験物質の存在下において生理活性物質の生物学的活性を測定する第二の工程によるスクリーニングを行う。第一の工程において、予め装置に入力された基準値の選別範囲に入る被験物質が自動選別され、それら選別された被験物質について自動的に第二の工程の測定が行われることが好ましい。さらには、第二の工程において、予め装置に入力された生物学的活性を反映する基準値（レセプター活性量、酵素活性量、代謝活性量、膜電位、イオン放出量、又は遺伝子発現量など）の選別範囲に入る被験物質が自動選別されることが好ましい。
【００２１】
さらに本発明では、上記した第一の工程の前にさらに、被験物質に対してバーチャルスクリーニングを実施し、スクリーニングに供する被験物質の数を低減することができる。
【００２２】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００２３】
本発明で用いるバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２４】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。
【００２５】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２６】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２７】
本発明において好ましくは、基板は、疎水性高分子化合物又はポリヒドロキシ高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜である。以下、疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物及び自己組織化膜について説明する。
【００２８】
疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００２９】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００３０】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００３１】
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００３２】
浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。
【００３３】
浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。
【００３４】
浸漬法のコーティング用溶剤は特に限定されず、疎水性高分子化合物の一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、２−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。
【００３５】
基板に接触させる疎水性高分子化合物の溶液は、疎水性高分子化合物が完全に溶解しても、疎水性高分子化合物の不溶解成分を含む懸濁液でもよい。液温は、疎水性高分子化合物の一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を疎水性高分子化合物の溶液に接触させている間に液温を変動させても良い。溶液の疎水性高分子化合物濃度に特に制限はないが、好ましくは０．０１％以上３０％以下、さらに好ましくは０．１％以上１０％以下である。
【００３６】
固体基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。
【００３７】
疎水性高分子化合物を含まない液としては、溶剤自身のＳＰ値（単位：(Ｊ／ｃｍ3)1/2）と疎水性高分子化合物のＳＰ値との差が、１以上２０以下であることが好ましく、３以上１５以下であることがさらに好ましい。ＳＰ値は、分子間の凝集エネルギー密度の平方根で表され、溶解度パラメーターとも呼ばれる。本発明では、ＳＰ値δは下記式で算出した。各官能基の凝集エネルギーＥｃｏｈとモル容積Ｖは、Ｆｅｄｏｒｓが規定した値を使用した（Ｒ．Ｆ．Ｆｅｄｏｒｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、１４（２）、Ｐ１４７、Ｐ４７２（１９７４））。
δ＝（ΣＥｃｏｈ／ΣＶ）1/2
例として、疎水性高分子化合物および溶剤のＳＰ値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（１：１）：２１.０に対する溶剤２−フェノキシエタノール：２５.３、ポリメチルメタクリレート：２０.３に対する溶剤アセトニトリル：２２.９、ポリスチレン：２１.６に対する溶剤トルエン：１８.７である。
【００３８】
基板を、疎水性高分子化合物を含まない液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間に液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。
【００３９】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは１オングストローム以上５０００オングストローム以下であり、特に好ましくは１０オングストローム以上３０００オングストローム以下である。
【００４０】
本発明で用いるポリヒドロキシ高分子化合物としては、例えば多糖類（例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロース）、または合成高分子化合物（例えばポリビニルアルコール）などを挙げることができる。本発明においては、多糖類が好ましく用いられ、デキストランが最も好ましい。
【００４１】
本発明においては、好ましくは、平均分子量１万以上２００万以下のポリヒドロキシ高分子化合物が用いられる。好ましくは２万以上２００万以下、さらに好ましくは３万以上１００万以下、最も好ましくは２０万以上８０万以下のポリヒドロキシ高分子化合物を用いることができる。
【００４２】
ポリヒドロキシ高分子化合物は、例えば塩基性条件下でブロモ酢酸と反応させることでカルボキシ化できる。反応条件の制御により、ポリヒドロキシ化合物が初期状態で含有するヒドロキシ基の一定の割合をカルボキシ化できる。本発明においては例えば、１〜９０％のヒドロキシ基をカルボキシ化することができる。なお、任意のポリヒドロキシ高分子化合物で表面被覆された表面について、例えば、以下の方法でカルボキシ化率を算出することができる。膜表面をジ−tert−ブチルカルボジイミド／ピリジン触媒を用いてトリフルオロエタノールで50℃、16時間、気相修飾し、ＥＳＣＡ（electron spectroscopy for chemical analysis）でトリフルオロエタノール由来のフッ素量を測定し、膜表面の酸素量との比率（以下、Ｆ／Ｏ値と呼ぶ）を算出する。全てのヒドロキシ基がカルボキシ化された場合の理論的なＦ／Ｏ値をカルボキシ化率１００％とし、任意の条件でカルボキシ化した時のＦ／Ｏ値を測定することで、その時のカルボキシ化率を算出することができる。
【００４３】
ポリヒドロキシ高分子化合物は有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1を介して金属膜に付着させることができる。有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1について詳細に説明する。
【００４４】
Ｘ1は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−SSR11Ｙ11、−SSR1Y1）、スルフィド（−SR11Ｙ11、−SR1Y1）、ジセレニド（−SeSeR11Ｙ11、−SeSeR1Y1）、セレニド（SeR11Ｙ11、−SeR1Y1）、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO2）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられる。
【００４５】
Ｒ1（とＲ11）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
【００４６】
Ｙ1とＹ11はポリヒドロキシ高分子化合物を結合させるための基である。Ｙ1とＹ11は好ましくは同一であり、ポリヒドロキシ高分子化合物に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。
【００４７】
有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1の具体例としては、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどが挙げられる。
【００４８】
チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。本発明では、例えば、自己組織化化合物として、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。
【００４９】
本発明で用いる基板はさらに、一般式（A）で表される化合物を基板に結合するためのリンカーを有していてもよい。
本発明で使用するリンカーの具体例としては下記式（４）で表される化合物が挙げられる。
Ｘ20―Ｌ20―Ｙ20 （４）
（式中、Ｘ20は、疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物又は自己組織化膜における官能基と反応しうる基を示し、Ｌ20は２価の連結基を示し、Ｙ20は一般式（A）で表される化合物と反応して共有結合を形成できる基を示す。）
【００５０】
式（４）において、Ｘ20は疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物又は自己組織化膜における官能基と反応しうる基を表し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ2、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。
【００５１】
ここでいう保護基とは、反応系内で脱保護して官能基を形成させる事のできる基であり、例えばアミノ基の保護基としては、tertブチルオキシカルボニル基（Boc）、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）、ニトロフェニルスルフェニル基（Nps）、ジチアスクシニル基（Dts）等が挙げられる。
【００５２】
また、水酸基の保護基としては、アシル基等が挙げられる。
ここでいう脱離基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、ハロゲン化アルキルカルボニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、ハロゲン化アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基等を挙げることができる。
また、脱離基としては、カルボン酸と既知の脱水縮合試薬（例えばカルボジイミド類）とＮ-ヒドロキシ化合物を組み合わせて生成されるエステル基も好ましく用いられる。
【００５３】
式（４）において、Ｌ20は２価の連結基を表し、Ｌの総原子数は、２〜１０００であることが好ましい。さらに、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアルキレンオキシ基、置換もしくは無置換のアリーレンオキシ基、もしくは式（４）のＸ20と別の分子のＹ20が結合し、構成が連続する２価の連結基であることが好ましい。
【００５４】
式（４）において、Ｙ20は一般式（A）で表される化合物と反応して共有結合を形成できる基を表し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ2、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。
保護基、脱離基は、前述のものと同様なものを用いることができる。
【００５５】
本発明におけるバイオセンサーにおいては、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味であり、さらに具体的には、「基板上にコーティングした疎水性高分子化合物中の基板から最も遠い側」という意味である。
【００５６】
上記のようにして得られたセンサー用基板は、上記の一般式（A）中の官能基であるＹを介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００５７】
バイオセンサーに固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用し、かつそれ自体が何らかの生理活性を有する物質であれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。上記の中でもタンパク質が好ましく、酵素が特に好ましい。
【００５８】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００５９】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００６０】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
【００６１】
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
【００６２】
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００６３】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
【００６４】
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
【００６５】
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００６６】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する被験物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００６７】
本発明では好ましくは、１分子の生理活性物質に対し、１〜１０分子の被験物質が結合することができる。
【００６８】
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００６９】
本発明の好ましい態様によれば、バイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００７０】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００７１】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００７２】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００７３】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００７４】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００７５】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００７６】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００７７】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００７８】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００７９】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００８０】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００８１】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００８２】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００８３】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００８４】
本発明で用いるバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【００８５】
さらに、本発明の測定方法においては、上記のように表面プラズモン共鳴分析等の手法により生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定するとともに、該生理活性物質の生物学的活性の測定を行う。
【００８６】
本発明で言う生物学的活性としては、酵素活性、抗体活性、レセプター活性、代謝活性量、膜電位、イオン放出量、又は遺伝子発現量等がある。
【００８７】
酵素とは、食物の消化をはじめ体の中で起こるいろいろな化学反応をスムーズに進める触媒の作用を持っているタンパク質の総称である。触媒とは、一般に化学反応を効率よく進めるための仲立ちの働きをもつものを言う。
【００８８】
酵素活性の測定原理については蛋白質、酵素の基礎実験法（堀尾武一、山下仁平）第ＩＶ章に記載されている。また、検出方法としては （１）分光学的測定法、（２）蛍光法 （３）電極法、（４）発光法等があり、例えば新生化学実験講座 タンパク質 Ｖ、酵素免疫測定法 第３版、エンザイムイムノアッセイ 生化学実験法等に記載されている方法等も使用することができる。
【００８９】
例えば、蛍光法により酵素活性を測定する場合には、酵素に特異的な基質（酵素による分解物のみが蛍光を発する基質）を反応させ、分解物の蛍光測定を行うころにより酵素活性を測定することができる。
【００９０】
分光学的測定法により酵素活性を測定する場合には、基質と生成物との間に分光学的性質の差があることを利用して、その時間的変化を測定し、酵素反応の初速度を求めることで酵素活性を測定することができる。
電極法により酵素活性を測定する場合には、自動滴定装置を利用した方法で、酵素反応を含めて化学反応に伴って生成される酸あるいは塩基による試料溶液のｐＨ変化を電気的に検出することで酵素活性を測定することができる。
発光法により酵素活性を測定する場合には、抗体ないし抗原に酵素標識しておき、抗原抗体反応後、酵素に特異的な化学発光基質（酵素による分解物のみが化学発光する基質）を反応させ、分解物の化学発光測定することで酵素活性を測定することができる。
【００９１】
抗体活性を測定する場合には、ELISA用プラスチックプレートの各穴の内壁に目的抗原を結合させ、そこに測定したい抗体を含む被検物を加えて反応させる。抗体は固相の抗原に結合する。その結合量は、被検物中の抗体量が多いほど多くなる。さらに、酵素標識した抗免疫イムノグロブリン抗体をさせる。標識抗体は、固相に結合している抗体に結合する。標識抗体の結合量は抗体が多いほど多くなる。未反応の標識抗体を除去し、その酵素の作用を受けて発色するような基質を加える。基質は酵素量に応じて発色するから結合している酵素標識抗体が多いほど強い色調を呈する。この溶液の色の強さを比色計で測定することで被検物の抗体量を知ることができる。既知量の抗体を段階希釈したものそれぞれについて測定しておけば、その値と比較することで被検物中の抗体量を定量化できる。
【００９２】
レセプター活性を測定する場合には、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させた後に、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体（例えば、検出のための酵素で標識した抗体など）とを接触させて抗原抗体反応を行い、これにより結合した抗体の存在を検出することにより、検体中のリガンドまたはレセプターを検出すことができる。
【００９３】
代謝活性量、膜電位、イオン放出量、及び遺伝子発現量の測定も全て公知の方法により行うことができる。
【００９４】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９５】
実施例１：アフィニティ−による化合物の選別
図１に記載のスクリーニング用SPRシステムを用いて、リガンドの固定、化合物の結合測定および化合物の選別を行った。
（１）センサチップの作製
金膜の厚さが500オングストロームになるように金を蒸着した1cm(1cmのカバーガラスをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、スピンコート機（MODEL ASS-303、ABLE製）にセットし1000rpmにて回転させ、金蒸着カバーガラス中央にポリメチルメタクリレートのメチルエチルケトン溶液（2mg/ml）を50μｌ滴下し、2分後に回転を止めた。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、ポリメタクリル酸メチル膜の厚さは200オングストロームであった。このサンプルをPMMA表面チップと呼ぶ。このPMMA表面チップをNaOH水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間浸漬した後、水で3回洗浄した。このサンプルをPMMA/COOH表面チップと呼ぶ。このPMMA/COOH表面チップを１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液２ｍｌに６０分浸漬した後、α-アミノ-ポリエチレンオキシ-ω-カルボン酸（平均分子量5000）水溶液（１0mM）２ｍｌに１６時間浸漬した。最後に水で５回洗浄した。得られたセンサーチップを以下で用いた。
【００９６】
（２）トリプシンの固定化
上記（１）で作製したセンサチップに、１−エチルー２，３ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、２０分間静置後、10mM CaCl2 含有ＨＢＳ−Ｎバッファーで洗浄した。次にトリプシン（１ｍｇ/ｍｌ、10mM CaCl2 含有ＨＢＳ−Ｎバッファー）を添加し、３０分間静置後、10mM CaCl2 含有ＨＢＳ−Ｎバッファーで洗浄した。
【００９７】
更に、エタノールアミン・HCl溶液（１Ｍ，pH8.5）測定チップに添加後、ＨＢＳ−Ｎバッファー（ビアコア社製）で洗浄した。
以上の操作により、トリプシンをセンサチップ表面に共有結合で固定した。
【００９８】
（２）化合物の結合検出
トリプシンを固定したセンサチップをＨＢＳ−Ｎバッファーで洗浄後、SPRリーダー部で、それぞれロイペプチン溶液（２μM）、ニトロフラントイン溶液（２μM）、キモスタチン溶液（２μM）を添加し、１０分間静置後、共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量をトリプシンに対する各化合物の結合量とした。
【００９９】
（３）化合物の選別
表１に示すように、結合が観測されたロイペプチンとニトロフラントインを選別した。
【０１００】
実施例２：生物学的活性による化合物の選別
トリプシンを固定したセンサチップ結合量を用いて、上記化合物の存在下でトリプシンの酵素活性測定を行った。具体的には、トリプシンに特異的な基質（ベンゾイルーＬ−アルギニンー４メチルクマリンー７アミド 以下Bz-Arg-MCAと表記する；（株）ペルチド研究所）を反応させ分解物の蛍光測定を行った。
【０１０１】
（１）Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡの反応
実施例１の（２）で作成したトリプシンを固定したセンサチップ結合量を用いて、それぞれロイペプチン溶液（４μＭ）と０．２ｍＭ Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡの１：１混合液、ニトロフラントイン溶液（４μＭ）+０．２ｍＭ Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡの混合液、０．１ｍＭ Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡ溶液を添加し、１０，３０，６０，１２０分間反応させた。
【０１０２】
（２）蛍光測定
各時間の蛍光測定をＢＭＧＬａｂＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＦＬＵＯstar 測定装置を使用し（Excitation380nm,Emission460nm）蛍光測定を行った。
【０１０３】
（３）化合物の選別
表１に示すように、トリプシンの酵素活性を阻害したロイペプチンを選別した。
【０１０４】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、本発明のスクリーニング方法を行うためのＳＰＲシステムの一例を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーを用いたスクリーニング方法に関する。より詳細には、本発明は、バイオセンサーに固定化した生理活性物質と相互作用する物質の検出または測定と、該生理活性物質の生物学的活性の測定の両方を行うことを特徴とする、被験物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析において一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。
【０００４】
上記の通り、従来の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定においては、測定チップに固定化された生理活性物質と相互作用する物質の検出または測定が行われていたが、該生理活性物質の生物学的活性の測定を行われていなかったため、生理活性物質と相互作用する物質が、該生理活性物質の生物学的活性に影響を及ぼすかどうかを分析することはできなかった。
【０００５】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号
【特許文献２】特開平９−２６４８４３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、バイオセンサーに固定化した生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定するとともに、該物質が生理活性物質の生物学的活性に及ぼす影響を分析することによって、被験物質をスクリーニングする方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、生理活性物質を基板に固定化したバイオセンサーを用いて該生理活性物質と相互作用する物質の検出または測定を行い、さらに該生理活性物質の生物学的活性の測定を行うことによって被験物質をスクリーニングすることで上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、（１）生理活性物質を基板に固定化したバイオセンサーに被験物質を接触させることにより、該生理活性物質と相互作用する被験物質を表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析により検出する工程；及び
（２）該被験物質の存在下において該生理活性物質の生物学的活性の測定を行う工程：
を含む、被験物質のスクリーニング方法が提供される。
【０００９】
好ましくは、１分子の生理活性物質に対し、１〜１０分子の被験物質が結合する。
好ましくは、表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析による複数の被験物質の検出を、並列検出で行う。
好ましくは、バイオセンサーへの生理活性物質の固定化と、該生理活性物質と相互作用する被験物質の検出とを異なる位置で行う。
【００１０】
好ましくは、結合量、結合定数、結合速度定数又は解離速度定数の何れかに基づいて、生理活性物質と相互作用する被験物質を表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析により検出する。
【００１１】
好ましくは、生理活性物質の生物学的活性は、レセプター活性量、酵素活性量、抗体活性、代謝活性量、膜電位、イオン放出量、又は遺伝子発現量の何れかである。
【００１２】
好ましくは、工程（１）の前にさらに、被験物質に対してバーチャルスクリーニングを実施し、スクリーニングに供する被験物質の数を低減する。
【００１３】
好ましくは、予め基準値が入力されているスクリーニング装置を用いてスクリーニングを自動的に行う。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のスクリーニング方法によれば、少量の蛋白質で結合と酵素反応の２種類の測定が可能である。また、本発明のスクリーニング方法によれば、活性測定することで結合した化合物が活性部位に対する結合であるか否かを判断することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明による被験物質のスクリーニング方法は、（１）生理活性物質を基板に固定化したバイオセンサーに被験物質を接触させることにより、該生理活性物質と相互作用する被験物質を表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析により検出する工程；及び（２）該被験物質の存在下において該生理活性物質の生物学的活性の測定を行う工程：を含むことを特徴とする。本発明では、生理活性物質と相互作用する物質の検出または測定と、該生理活性物質の生物学的活性の測定の両方を行うことにより、例えば、生理活性物質に結合した被験物質が生理活性物質の活性部位に結合したのかどうかを判断することが可能になり、被験物質が生理活性物質の生物学的活性に及ぼす影響を分析することができる。なお、ローカルプラズモン（局所的表面プラズモン）は、金属微粒子や金属針先端に存在するプラズモンである。その局在する領域は微粒子や針先端の広がり程度であり、光の波長より十分小さくすることができる。ローカルプラズモンの周波数は、微粒子の形状・金属原子の種類に強く依存するので、散乱スペクトルが微粒子毎に変化する。微粒子表面に生理活性物質（蛋白など）を固定しておき、散乱スペクトルの変化により生理活性物質と結合する被験物質を分析することができる。
【００１６】
本発明においては、生理活性物質は固相化されている。固相化の方法としては、公知の方法が用いられる。また、蛋白質などの生理活性物質の固相化を行うユニットと、固相化した生理活性物質と被験物質との相互作用測定を行うユニットとは分離されていることが好ましい。本発明のスクリーニングを行うための装置構成の一例を図１に示す。蛋白の固相化を行うユニットと、相互作用測定を行うユニットを分離することにより、測定処理能力が大幅に向上する。また、図１に示す通り、本発明では好ましくは、表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析による複数の被験物質の検出を、並列検出で行うことができる。
【００１７】
本発明でスクリーニングに供される被験物質の数は、１０００種以上であることが好ましく、１００００種以上であることがより好ましく、１０００００種以上であることがさらに好ましい。
【００１８】
本発明で用いる被験物質としては例えば、本明細書中以下に記載するような生理活性物質（リガンド）と相互作用する物質であれば特に限定されないが、低分子有機化合物、高分子化合物、ＤＮＡ等の核酸、蛋白質（抗体などを含む）、ペプチド又はその断片、糖、アミノ酸などが挙げられる。
【００１９】
本発明の好ましい態様では、予め基準値が入力されているスクリーニング装置を用いてスクリーニングを自動的に行うことができる。即ち、スクリーニング装置に予め、選択したい範囲の基準値（例えば、生理活性物質と相互作用する被験物質のスクリーニングにおいては結合量、結合定数、結合速度定数又は解離速度定数など；また、生理活性物質の生物学的活性においては、レセプター活性量、酵素活性量、代謝活性量、膜電位、イオン放出量、又は遺伝子発現量など）を入力しておき、その範囲に入る被験物質が自動選別されることが好ましい。選別された被験物質は、表示装置に視覚的に区別されるように表示されることが好ましい。視覚的な区別の方法は特に限定されないが、例えば、文字の大きさ、色、文字の点滅、文字の色、アンダーライン、枠で囲む、などの方法が挙げられる。
【００２０】
本発明においては、生理活性物質と相互作用する被験物質を選別する第一の工程と、第一の工程で選別された被験物質の存在下において生理活性物質の生物学的活性を測定する第二の工程によるスクリーニングを行う。第一の工程において、予め装置に入力された基準値の選別範囲に入る被験物質が自動選別され、それら選別された被験物質について自動的に第二の工程の測定が行われることが好ましい。さらには、第二の工程において、予め装置に入力された生物学的活性を反映する基準値（レセプター活性量、酵素活性量、代謝活性量、膜電位、イオン放出量、又は遺伝子発現量など）の選別範囲に入る被験物質が自動選別されることが好ましい。
【００２１】
さらに本発明では、上記した第一の工程の前にさらに、被験物質に対してバーチャルスクリーニングを実施し、スクリーニングに供する被験物質の数を低減することができる。
【００２２】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００２３】
本発明で用いるバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２４】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。
【００２５】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２６】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２７】
本発明において好ましくは、基板は、疎水性高分子化合物又はポリヒドロキシ高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜である。以下、疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物及び自己組織化膜について説明する。
【００２８】
疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００２９】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００３０】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００３１】
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００３２】
浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。
【００３３】
浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。
【００３４】
浸漬法のコーティング用溶剤は特に限定されず、疎水性高分子化合物の一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、２−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。
【００３５】
基板に接触させる疎水性高分子化合物の溶液は、疎水性高分子化合物が完全に溶解しても、疎水性高分子化合物の不溶解成分を含む懸濁液でもよい。液温は、疎水性高分子化合物の一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を疎水性高分子化合物の溶液に接触させている間に液温を変動させても良い。溶液の疎水性高分子化合物濃度に特に制限はないが、好ましくは０．０１％以上３０％以下、さらに好ましくは０．１％以上１０％以下である。
【００３６】
固体基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。
【００３７】
疎水性高分子化合物を含まない液としては、溶剤自身のＳＰ値（単位：(Ｊ／ｃｍ3)1/2）と疎水性高分子化合物のＳＰ値との差が、１以上２０以下であることが好ましく、３以上１５以下であることがさらに好ましい。ＳＰ値は、分子間の凝集エネルギー密度の平方根で表され、溶解度パラメーターとも呼ばれる。本発明では、ＳＰ値δは下記式で算出した。各官能基の凝集エネルギーＥｃｏｈとモル容積Ｖは、Ｆｅｄｏｒｓが規定した値を使用した（Ｒ．Ｆ．Ｆｅｄｏｒｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、１４（２）、Ｐ１４７、Ｐ４７２（１９７４））。
δ＝（ΣＥｃｏｈ／ΣＶ）1/2
例として、疎水性高分子化合物および溶剤のＳＰ値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（１：１）：２１.０に対する溶剤２−フェノキシエタノール：２５.３、ポリメチルメタクリレート：２０.３に対する溶剤アセトニトリル：２２.９、ポリスチレン：２１.６に対する溶剤トルエン：１８.７である。
【００３８】
基板を、疎水性高分子化合物を含まない液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間に液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。
【００３９】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは１オングストローム以上５０００オングストローム以下であり、特に好ましくは１０オングストローム以上３０００オングストローム以下である。
【００４０】
本発明で用いるポリヒドロキシ高分子化合物としては、例えば多糖類（例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロース）、または合成高分子化合物（例えばポリビニルアルコール）などを挙げることができる。本発明においては、多糖類が好ましく用いられ、デキストランが最も好ましい。
【００４１】
本発明においては、好ましくは、平均分子量１万以上２００万以下のポリヒドロキシ高分子化合物が用いられる。好ましくは２万以上２００万以下、さらに好ましくは３万以上１００万以下、最も好ましくは２０万以上８０万以下のポリヒドロキシ高分子化合物を用いることができる。
【００４２】
ポリヒドロキシ高分子化合物は、例えば塩基性条件下でブロモ酢酸と反応させることでカルボキシ化できる。反応条件の制御により、ポリヒドロキシ化合物が初期状態で含有するヒドロキシ基の一定の割合をカルボキシ化できる。本発明においては例えば、１〜９０％のヒドロキシ基をカルボキシ化することができる。なお、任意のポリヒドロキシ高分子化合物で表面被覆された表面について、例えば、以下の方法でカルボキシ化率を算出することができる。膜表面をジ−tert−ブチルカルボジイミド／ピリジン触媒を用いてトリフルオロエタノールで50℃、16時間、気相修飾し、ＥＳＣＡ（electron spectroscopy for chemical analysis）でトリフルオロエタノール由来のフッ素量を測定し、膜表面の酸素量との比率（以下、Ｆ／Ｏ値と呼ぶ）を算出する。全てのヒドロキシ基がカルボキシ化された場合の理論的なＦ／Ｏ値をカルボキシ化率１００％とし、任意の条件でカルボキシ化した時のＦ／Ｏ値を測定することで、その時のカルボキシ化率を算出することができる。
【００４３】
ポリヒドロキシ高分子化合物は有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1を介して金属膜に付着させることができる。有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1について詳細に説明する。
【００４４】
Ｘ1は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−SSR11Ｙ11、−SSR1Y1）、スルフィド（−SR11Ｙ11、−SR1Y1）、ジセレニド（−SeSeR11Ｙ11、−SeSeR1Y1）、セレニド（SeR11Ｙ11、−SeR1Y1）、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO2）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられる。
【００４５】
Ｒ1（とＲ11）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
【００４６】
Ｙ1とＹ11はポリヒドロキシ高分子化合物を結合させるための基である。Ｙ1とＹ11は好ましくは同一であり、ポリヒドロキシ高分子化合物に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。
【００４７】
有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1の具体例としては、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどが挙げられる。
【００４８】
チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。本発明では、例えば、自己組織化化合物として、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。
【００４９】
本発明で用いる基板はさらに、一般式（A）で表される化合物を基板に結合するためのリンカーを有していてもよい。
本発明で使用するリンカーの具体例としては下記式（４）で表される化合物が挙げられる。
Ｘ20―Ｌ20―Ｙ20 （４）
（式中、Ｘ20は、疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物又は自己組織化膜における官能基と反応しうる基を示し、Ｌ20は２価の連結基を示し、Ｙ20は一般式（A）で表される化合物と反応して共有結合を形成できる基を示す。）
【００５０】
式（４）において、Ｘ20は疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物又は自己組織化膜における官能基と反応しうる基を表し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ2、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。
【００５１】
ここでいう保護基とは、反応系内で脱保護して官能基を形成させる事のできる基であり、例えばアミノ基の保護基としては、tertブチルオキシカルボニル基（Boc）、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）、ニトロフェニルスルフェニル基（Nps）、ジチアスクシニル基（Dts）等が挙げられる。
【００５２】
また、水酸基の保護基としては、アシル基等が挙げられる。
ここでいう脱離基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、ハロゲン化アルキルカルボニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、ハロゲン化アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基等を挙げることができる。
また、脱離基としては、カルボン酸と既知の脱水縮合試薬（例えばカルボジイミド類）とＮ-ヒドロキシ化合物を組み合わせて生成されるエステル基も好ましく用いられる。
【００５３】
式（４）において、Ｌ20は２価の連結基を表し、Ｌの総原子数は、２〜１０００であることが好ましい。さらに、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアルキレンオキシ基、置換もしくは無置換のアリーレンオキシ基、もしくは式（４）のＸ20と別の分子のＹ20が結合し、構成が連続する２価の連結基であることが好ましい。
【００５４】
式（４）において、Ｙ20は一般式（A）で表される化合物と反応して共有結合を形成できる基を表し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ2、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。
保護基、脱離基は、前述のものと同様なものを用いることができる。
【００５５】
本発明におけるバイオセンサーにおいては、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味であり、さらに具体的には、「基板上にコーティングした疎水性高分子化合物中の基板から最も遠い側」という意味である。
【００５６】
上記のようにして得られたセンサー用基板は、上記の一般式（A）中の官能基であるＹを介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００５７】
バイオセンサーに固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用し、かつそれ自体が何らかの生理活性を有する物質であれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。上記の中でもタンパク質が好ましく、酵素が特に好ましい。
【００５８】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００５９】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００６０】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
【００６１】
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
【００６２】
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００６３】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
【００６４】
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
【００６５】
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００６６】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する被験物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００６７】
本発明では好ましくは、１分子の生理活性物質に対し、１〜１０分子の被験物質が結合することができる。
【００６８】
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００６９】
本発明の好ましい態様によれば、バイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００７０】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００７１】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００７２】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００７３】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００７４】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００７５】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００７６】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００７７】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００７８】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００７９】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００８０】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００８１】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００８２】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００８３】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００８４】
本発明で用いるバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【００８５】
さらに、本発明の測定方法においては、上記のように表面プラズモン共鳴分析等の手法により生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定するとともに、該生理活性物質の生物学的活性の測定を行う。
【００８６】
本発明で言う生物学的活性としては、酵素活性、抗体活性、レセプター活性、代謝活性量、膜電位、イオン放出量、又は遺伝子発現量等がある。
【００８７】
酵素とは、食物の消化をはじめ体の中で起こるいろいろな化学反応をスムーズに進める触媒の作用を持っているタンパク質の総称である。触媒とは、一般に化学反応を効率よく進めるための仲立ちの働きをもつものを言う。
【００８８】
酵素活性の測定原理については蛋白質、酵素の基礎実験法（堀尾武一、山下仁平）第ＩＶ章に記載されている。また、検出方法としては （１）分光学的測定法、（２）蛍光法 （３）電極法、（４）発光法等があり、例えば新生化学実験講座 タンパク質 Ｖ、酵素免疫測定法 第３版、エンザイムイムノアッセイ 生化学実験法等に記載されている方法等も使用することができる。
【００８９】
例えば、蛍光法により酵素活性を測定する場合には、酵素に特異的な基質（酵素による分解物のみが蛍光を発する基質）を反応させ、分解物の蛍光測定を行うころにより酵素活性を測定することができる。
【００９０】
分光学的測定法により酵素活性を測定する場合には、基質と生成物との間に分光学的性質の差があることを利用して、その時間的変化を測定し、酵素反応の初速度を求めることで酵素活性を測定することができる。
電極法により酵素活性を測定する場合には、自動滴定装置を利用した方法で、酵素反応を含めて化学反応に伴って生成される酸あるいは塩基による試料溶液のｐＨ変化を電気的に検出することで酵素活性を測定することができる。
発光法により酵素活性を測定する場合には、抗体ないし抗原に酵素標識しておき、抗原抗体反応後、酵素に特異的な化学発光基質（酵素による分解物のみが化学発光する基質）を反応させ、分解物の化学発光測定することで酵素活性を測定することができる。
【００９１】
抗体活性を測定する場合には、ELISA用プラスチックプレートの各穴の内壁に目的抗原を結合させ、そこに測定したい抗体を含む被検物を加えて反応させる。抗体は固相の抗原に結合する。その結合量は、被検物中の抗体量が多いほど多くなる。さらに、酵素標識した抗免疫イムノグロブリン抗体をさせる。標識抗体は、固相に結合している抗体に結合する。標識抗体の結合量は抗体が多いほど多くなる。未反応の標識抗体を除去し、その酵素の作用を受けて発色するような基質を加える。基質は酵素量に応じて発色するから結合している酵素標識抗体が多いほど強い色調を呈する。この溶液の色の強さを比色計で測定することで被検物の抗体量を知ることができる。既知量の抗体を段階希釈したものそれぞれについて測定しておけば、その値と比較することで被検物中の抗体量を定量化できる。
【００９２】
レセプター活性を測定する場合には、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させた後に、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体（例えば、検出のための酵素で標識した抗体など）とを接触させて抗原抗体反応を行い、これにより結合した抗体の存在を検出することにより、検体中のリガンドまたはレセプターを検出すことができる。
【００９３】
代謝活性量、膜電位、イオン放出量、及び遺伝子発現量の測定も全て公知の方法により行うことができる。
【００９４】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９５】
実施例１：アフィニティ−による化合物の選別
図１に記載のスクリーニング用SPRシステムを用いて、リガンドの固定、化合物の結合測定および化合物の選別を行った。
（１）センサチップの作製
金膜の厚さが500オングストロームになるように金を蒸着した1cm(1cmのカバーガラスをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、スピンコート機（MODEL ASS-303、ABLE製）にセットし1000rpmにて回転させ、金蒸着カバーガラス中央にポリメチルメタクリレートのメチルエチルケトン溶液（2mg/ml）を50μｌ滴下し、2分後に回転を止めた。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、ポリメタクリル酸メチル膜の厚さは200オングストロームであった。このサンプルをPMMA表面チップと呼ぶ。このPMMA表面チップをNaOH水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間浸漬した後、水で3回洗浄した。このサンプルをPMMA/COOH表面チップと呼ぶ。このPMMA/COOH表面チップを１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液２ｍｌに６０分浸漬した後、α-アミノ-ポリエチレンオキシ-ω-カルボン酸（平均分子量5000）水溶液（１0mM）２ｍｌに１６時間浸漬した。最後に水で５回洗浄した。得られたセンサーチップを以下で用いた。
【００９６】
（２）トリプシンの固定化
上記（１）で作製したセンサチップに、１−エチルー２，３ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、２０分間静置後、10mM CaCl2 含有ＨＢＳ−Ｎバッファーで洗浄した。次にトリプシン（１ｍｇ/ｍｌ、10mM CaCl2 含有ＨＢＳ−Ｎバッファー）を添加し、３０分間静置後、10mM CaCl2 含有ＨＢＳ−Ｎバッファーで洗浄した。
【００９７】
更に、エタノールアミン・HCl溶液（１Ｍ，pH8.5）測定チップに添加後、ＨＢＳ−Ｎバッファー（ビアコア社製）で洗浄した。
以上の操作により、トリプシンをセンサチップ表面に共有結合で固定した。
【００９８】
（２）化合物の結合検出
トリプシンを固定したセンサチップをＨＢＳ−Ｎバッファーで洗浄後、SPRリーダー部で、それぞれロイペプチン溶液（２μM）、ニトロフラントイン溶液（２μM）、キモスタチン溶液（２μM）を添加し、１０分間静置後、共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量をトリプシンに対する各化合物の結合量とした。
【００９９】
（３）化合物の選別
表１に示すように、結合が観測されたロイペプチンとニトロフラントインを選別した。
【０１００】
実施例２：生物学的活性による化合物の選別
トリプシンを固定したセンサチップ結合量を用いて、上記化合物の存在下でトリプシンの酵素活性測定を行った。具体的には、トリプシンに特異的な基質（ベンゾイルーＬ−アルギニンー４メチルクマリンー７アミド 以下Bz-Arg-MCAと表記する；（株）ペルチド研究所）を反応させ分解物の蛍光測定を行った。
【０１０１】
（１）Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡの反応
実施例１の（２）で作成したトリプシンを固定したセンサチップ結合量を用いて、それぞれロイペプチン溶液（４μＭ）と０．２ｍＭ Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡの１：１混合液、ニトロフラントイン溶液（４μＭ）+０．２ｍＭ Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡの混合液、０．１ｍＭ Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡ溶液を添加し、１０，３０，６０，１２０分間反応させた。
【０１０２】
（２）蛍光測定
各時間の蛍光測定をＢＭＧＬａｂＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＦＬＵＯstar 測定装置を使用し（Excitation380nm,Emission460nm）蛍光測定を行った。
【０１０３】
（３）化合物の選別
表１に示すように、トリプシンの酵素活性を阻害したロイペプチンを選別した。
【０１０４】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、本発明のスクリーニング方法を行うためのＳＰＲシステムの一例を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）生理活性物質を基板に固定化したバイオセンサーに被験物質を接触させることにより、該生理活性物質と相互作用する被験物質を表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析により検出する工程；及び
（２）該被験物質の存在下において該生理活性物質の生物学的活性の測定を行う工程：
を含む、被験物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
１分子の生理活性物質に対し、１〜１０分子の被験物質が結合する、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析による複数の被験物質の検出を、並列検出で行う、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
バイオセンサーへの生理活性物質の固定化と、該生理活性物質と相互作用する被験物質の検出とを異なる位置で行う、請求項１から３の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
結合量、結合定数、結合速度定数又は解離速度定数の何れかに基づいて、生理活性物質と相互作用する被験物質を表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析により検出する、請求項１から４の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
生理活性物質の生物学的活性が、レセプター活性量、酵素活性量、抗体活性、代謝活性量、膜電位、イオン放出量、又は遺伝子発現量の何れかである、請求項１から５の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
工程（１）の前にさらに、被験物質に対してバーチャルスクリーニングを実施し、スクリーニングに供する被験物質の数を低減する、請求項１から６の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
予め基準値が入力されているスクリーニング装置を用いてスクリーニングを自動的に行う、請求項１から７の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
（１）生理活性物質を基板に固定化したバイオセンサーに被験物質を接触させることにより、該生理活性物質と相互作用する被験物質を表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析により検出する工程；及び
（２）該被験物質の存在下において該生理活性物質の生物学的活性の測定を行う工程：
を含む、被験物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
１分子の生理活性物質に対し、１〜１０分子の被験物質が結合する、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析による複数の被験物質の検出を、並列検出で行う、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
バイオセンサーへの生理活性物質の固定化と、該生理活性物質と相互作用する被験物質の検出とを異なる位置で行う、請求項１から３の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
結合量、結合定数、結合速度定数又は解離速度定数の何れかに基づいて、生理活性物質と相互作用する被験物質を表面プラズモン共鳴分析又はローカルプラズモン共鳴分析により検出する、請求項１から４の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
生理活性物質の生物学的活性が、レセプター活性量、酵素活性量、抗体活性、代謝活性量、膜電位、イオン放出量、又は遺伝子発現量の何れかである、請求項１から５の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
工程（１）の前にさらに、被験物質に対してバーチャルスクリーニングを実施し、スクリーニングに供する被験物質の数を低減する、請求項１から６の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
予め基準値が入力されているスクリーニング装置を用いてスクリーニングを自動的に行う、請求項１から７の何れかに記載のスクリーニング方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−９０９４８（Ｐ２００６−９０９４８Ａ）
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２７９３５８（Ｐ２００４−２７９３５８）
【出願日】平成１６年９月２７日（２００４．９．２７）
【出願人】（０００００５２０１）富士写真フイルム株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２７日（２００４．９．２７）
【出願人】（０００００５２０１）富士写真フイルム株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
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