本発明は、試料中の１つまたは複数の標的検体、例えば生体分子の存否を検出するためのスクリーニング方法、組成物およびキットに関する。特に、本発明は、溶液中の多数のタンパク質構造体または他の標的検体を検出するための生化学バーコードとしてレポータオリゴヌクレオチドを利用する方法に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）該特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）場合によってはレポータ標識で標識される複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子からなる少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、該微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、該標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を該捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した該特異的結合相補体に対する特定の該標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｄ）該標的検体と、該検体に対する該微粒子検出プローブに結合した該特異的結合相補体との結合を可能にし、該捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｅ）場合によって、該捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
ｆ）該試料中の特定の標的検体の存在を示す該ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップと、からなる方法。
【請求項２】
前記標的検体は、タンパク質またはハプテンであり、その特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体からなる抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的検体は、核酸分子である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
それぞれのＤＮＡバーコードは、検出可能なレポータ基で標識される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出可能なレポータ基は、蛍光体、発色団、酸化還元基、電気特性を有する基、放射性基、触媒基またはラマン標識からなる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
微粒子を複数のＤＮＡバーコードで標識する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標的検体を固定した後で、前記捕獲基体を微粒子検出プローブに接触させる前に捕獲基体を洗浄するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記検出ステップの前で、前記分離および洗浄ステップの後に、
ａ）前記ＤＮＡバーコードを前記微粒子検出プローブから剥離させるのに有効な条件を複合体に施すステップと、
ｂ）前記検出の前に、場合によって、該ＤＮＡバーコードを増幅させるステップと、をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検出前に、剥離されたＤＮＡバーコードを基体に固定する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡバーコードを前記微粒子に直接結合させる請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
化学剥離剤によって、前記ＤＮＡバーコードを前記微粒子検出プローブから剥離させる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記微粒子は、それに結合したオリゴヌクレオチドをさらに備え、前記ＤＮＡバーコードは、該微粒子に結合した該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対してハイブリダイズされる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡバーコードを脱ハイブリダイゼーションによって剥離させる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記捕獲基体は、磁性基体である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記分離は、前記磁性基体に磁界を受けさせることからなる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離および洗浄ステップの後で、前記検出ステップの前に、前記ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を複合体に施すステップをさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分離は、濾過、沈降、浮揚または流動からなる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記濾過ステップは、ＤＮＡバーコードを含まない試料成分を除去する膜からなる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記微粒子は、ポリマー、ガラス、金属、半導体またはセラミックである請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリマーは、ポリスチレンからなる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記特異的結合対は、抗体および抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記特異的結合対は、受容体またはリガンドである請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記特異的結合対は、酵素および競合阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記特異的結合対は、薬物および標的分子である請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記特異的結合対は、少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドの２つの鎖である請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＤＮＡバーコードはビオチン化されている請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡバーコードは放射活性標識されている請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡバーコードは蛍光標識されている請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的は、３つ以上の結合部位を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも２種類の微粒子検出プローブを提供し、第１の種類のプローブは、前記標的検体上の第１の結合部位に対する特異的結合相補部分を有し、第２の種類のプローブは、
前記標的検体上の第２の結合部位に対する特異的結合相補部分を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
複数の微粒子検出プローブを提供し、それぞれの種類のプローブは、前記標的検体上の異なる結合部位に対する特異的結合相補部分を有する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記特異的結合相補体および標的検体は、特異的結合対の構成要素である請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
特異的結合対の構成要素は、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍に特異的なエピトープからなるペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、部分、成分または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、前記物質のいずれかの代謝物質または抗体からなる請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、哺乳類ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、ならびに天然および合成核酸からなる請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的検体は核酸であり、前記特異的結合相補体はオリゴヌクレオチドである請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的検体は、タンパク質またはハプテンであり、前記特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体からなる抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的検体は、ゲノムＤＮＡ試料からの配列であり、前記特異的結合相補体はオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは、該ゲノム配列の少なくとも一部に相補的である配列を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ゲノムＤＮＡは、真核、細菌、真菌またはウイルスＤＮＡである請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的検体は、エピソームＤＮＡ試料からの配列であり、前記特異的結合相補体はオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは、該エピソームＤＮＡ配列の少なくとも一部に相補的である配列を有する請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記特異的結合相補体および標的検体は、抗体−リガンド対の構成要素である請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
その第１の結合部位に加えて、第２の結合部位を含めるように前記標的検体を修飾した請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）該特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）蛍光標識した複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子からなる少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、該微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、該標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を該捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した該特異的結合相補体に対する特定の該標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｄ）場合によって、該捕獲基体を洗浄して、未結合材料を除去するステップと、
ｅ）該標的検体と、検体に対する該微粒子検出プローブに結合した該特異的結合相補体との結合を可能にし、該捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｆ）場合によって、該捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
ｇ）該試料中の特定の標的検体の存在を示す該ＤＮＡバーコードからの蛍光シグナルの存在を検出するステップと、からなる方法。
【請求項４３】
それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）該特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）蛍光標識した複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子からなる少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、該微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、該標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を該捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した該特異的結合相補体に対する特定の該標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｄ）場合によって、該捕獲基体を洗浄して、未結合材料を除去するステップと、
ｅ）該標的検体と、検体に対する該微粒子検出プローブに結合した該特異的結合相補体との結合を可能にし、該捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｆ）場合によって、該捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
ｇ）分離、洗浄された該捕獲基体に、該ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を施すステップと、
ｈ）該試料中の特定の標的検体の存在を示す該ＤＮＡバーコードの蛍光シグナルの存在を検出するステップと、からなる方法。
【請求項４４】
それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）該特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップ
と、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）レポータ標識からなる複数のＤＮＡバーコードとが結合した微粒子からなる少なくとも１種類の微粒子検出プローブを提供するステップであって、該微粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、該標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を該捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した該特異的結合相補体に対する特定の該標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｄ）場合によって、該捕獲基体を洗浄して、未結合材料を除去するステップと、
ｅ）該標的検体と、検体に対する該微粒子検出プローブに結合した該特異的結合相補体との結合を可能にし、該捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の微粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｆ）場合によって、該捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の微粒子検出プローブを除去するステップと、
ｇ）分離、洗浄された該捕獲基体に、該ＤＮＡバーコードを剥離させるのに有効な条件を施すステップと、
ｈ）該試料中の特定の標的検体の存在を示す該ＤＮＡバーコードのレポータ標識の存在を検出するステップと、からなる方法。
【請求項４５】
それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法であって、
ａ）該特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
ｂ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）場合によってはレポータ標識で標識される複数のＤＮＡバーコードとが結合した粒子からなる少なくとも１種類の粒子検出プローブを提供するステップであって、該粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、該標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｃ）標的検体を該捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した該特異的結合相補体に対する特定の該標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｄ）場合によって、該捕獲基体を洗浄して、未結合材料を除去するステップと、
ｅ）該標的検体と、検体に対する該粒子検出プローブに結合した該特異的結合相補体との結合を可能にし、該捕獲基体上の標的検体の存在下で複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｆ）場合によって、該捕獲基体を分離し、洗浄して、未結合の粒子検出プローブを除去するステップと、
ｇ）化学剥離剤によって、該ＤＮＡバーコードを該粒子検出プローブから剥離させるステップと、
ｈ）該試料中の特定の標的検体の存在を示す該ＤＮＡバーコードの存在を検出するステップとからなる方法。
【請求項４６】
前記粒子は、ナノ粒子または微粒子である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
それぞれが試料中の特異的結合相補体との特異的結合相互作用のための少なくとも２つの結合部位を有する、試料中の１つまたは複数の標的検体の存在を検出するための方法で
あって、
ａ）該特定の標的検体の少なくとも第１の結合部位に結合する特定の標的検体の少なくとも１つの特異的結合相補体が結合した、該試料から分離可能な少なくとも１種類の捕獲基体を提供するステップと、
ｂ）標的検体を該捕獲基体上に固定するように、捕獲基体に結合した該特異的結合相補体に対する特定の該標的検体の結合を可能にするのに有効な条件下で、標的検体を含有すると思われる試料に捕獲基体を接触させるステップと、
ｃ）場合によって、該捕獲基体、およびそれに結合した標的検体を、該試料から分離するステップと、
ｄ）（ｉ）特定の標的検体に対する少なくとも１つの特異的結合相補体と、（ｉｉ）場合によってレポータ標識で標識される複数のオリゴヌクレオチドとが結合した粒子からなる少なくとも１種類の粒子検出プローブを提供するステップであって、該粒子検出プローブに結合した特異的結合相補体は、該標的検体の少なくとも第２の結合部位に結合するステップと、
ｅ）該標的検体と、検体に対する該粒子検出プローブに結合した該特異的結合相補体との結合を可能にし、該捕獲基体上の標的検体の存在下で、標的検体、捕獲基体および粒子検出プローブを備えた複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも１種類の粒子検出プローブに、固定された標的検体を接触させるステップと、
ｆ）場合によって、未結合の粒子検出プローブから該複合体を分離するステップと、
ｇ）該試料中の特定の標的検体の存在を示す該複合体の存在を検出するステップと、からなる方法。
【請求項４８】
２つ以上の標的検体の第１の結合部位に対応する前記特異的結合相補体を同じ基体に結合させる請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記基体に結合する１つの標的検体の第１の結合部位に対応する前記特異的結合相補体を、異なる標的検体の第１の結合部位に対応する特異的結合相補体である該基体の異なる物理的領域に局在化させる請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記検出前に、前記オリゴヌクレオチドを前記検出プローブから剥離させる請求項４９に記載の方法。

【図３】

【図４】

【図５】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図８Ｄ】

【図９】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１１】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【公表番号】特表２００７−５３７４５０（Ｐ２００７−５３７４５０Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１３３２８（Ｐ２００７−５１３３２８）
【出願日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１６５４５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７８２８９
【国際公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【出願人】（５０１２１６０１２）ナノスフェアー　インコーポレイテッド (15)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＯＳＰＨＥＲＥ　ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】