ヒストン脱アセチル化酵素を阻害するための化合物
【課題】ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）に関連した疾患、特に腫瘍や細胞増殖性疾患の予防・治療剤として有用な化合物および該化合物を含有する医薬組成物の提供。
【解決手段】下記式（Ｉ）によって表される化合物、およびそれを含有する医薬組成物。
［式中、Ｒ1〜Ｒ4はＯＨ、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、Ｏ−アルキルなどを、Ｒ5は、Ｃ4-16アルキルなどを、Ｒ6は、Ｃ2-12アルキルまたはＣ2-12アルケニルなどを、Ｒ7及びＲ8は水素、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ2などを示す］
【解決手段】下記式（Ｉ）によって表される化合物、およびそれを含有する医薬組成物。
［式中、Ｒ1〜Ｒ4はＯＨ、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、Ｏ−アルキルなどを、Ｒ5は、Ｃ4-16アルキルなどを、Ｒ6は、Ｃ2-12アルキルまたはＣ2-12アルケニルなどを、Ｒ7及びＲ8は水素、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ2などを示す］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）に関連した疾患、特に腫瘍や細胞増殖性疾患の予防剤または治療剤として有用な新規化合物に関する。本発明の化合物は神経突起伸長を促進する薬剤としての使用も可能である。本発明の化合物は特に抗神経変性疾患やヒト脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に対する薬剤として使用することが可能である。
【背景技術】
【０００２】
真核生物のＤＮＡは核内で高度に組織化、パッケージングされている。こうした組織化及びパッケージングは、コアヒストンであるＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４などのタンパク質がＤＮＡに付加し、ＤＮＡとともにクロマチンと呼ばれる複雑な構造を形成することによって行われる。コアヒストンの修飾はクロマチンの立体構造の変化にとって極めて重要である。アセチル化の程度は転写活性と関係しており、アセチル化によってクロマチンは開放型の立体構造をとり、転写装置がプロモーターにアクセスすることが可能となる。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）及びヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）は、コアヒストンタンパク質のアミノ末端付近に位置するリシンのε−アミノ基を選択的にアセチル化または脱アセチル化することによって転写に影響を及ぼす酵素である。ＨＤＡＣは１１種類（アイソフォーム）の酵素からなるファミリーであり、遺伝子の発現制御に関与していることから、癌などの多くの疾患におけるマスター調節因子として働くと考えられている。ＨＤＡＣの欠損は広範な癌との関連が指摘されてきた。ＨＤＡＣ酵素またはそのアイソフォームは多くの異なるタイプの癌と関連しているものと思われる。
【０００３】
固形及び血液悪性腫瘍の治療への応用が期待される新しい抗癌剤としてヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤が注目を浴びている。近年、多様な構造を有するＨＤＡＣ阻害剤が数多く発見されているが、これらは培養または動物モデルにおいて腫瘍細胞の増殖を阻害し、分化やアポトーシスを誘導するものである。ＨＤＡＣが阻害されるとアセチル化された核内ヒストンが腫瘍及び正常組織に蓄積することから、生体内でのＨＤＡＣ阻害剤の生物学的活性の代用マーカーとなる。ＨＤＡＣ阻害剤の遺伝子発現に対する作用は極めて選択性が高く、サイクリン依存型キナーゼ阻害剤であるｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１など特定の遺伝子の転写を活性化する一方で他の遺伝子の発現を抑制する。ＨＤＡＣの阻害によってヒストン以外にも、ｐ５３、ＧＡＴＡ−１及びエストロゲン受容体アルファなどの転写因子がアセチル化される。非ヒストンタンパク質のアセチル化の機能的な意義、ならびにＨＤＡＣ阻害剤が腫瘍細胞の増殖停止、細胞分化、及び／又はアポトーシスを誘導する詳細な機序は、現在、重点的な研究の対象となっている。現在臨床試験において効果が認められているＨＤＡＣ阻害剤は、新たな作用機序に基づく効果が期待される、分子を標的とする抗腫瘍剤である。
【０００４】
メディシナルリサーチレビュー誌（Medicinal Research Reviews, Vol. 26, No. 4, pp. 397-413, 2006）に掲載のレビュー論文によると、これまでに、短鎖脂肪酸、ヒドロキサム酸、ベンズアミド、環状ペプチドの、４つのＨＤＡＣ阻害剤のクラスが報告されている。ヒドロキサム酸系のハイブリッド極性化合物（ＨＰＣ）はＨＤＡＣの阻害剤であり、マイクロモル以下の濃度で細胞分化を誘導する（Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, No. 15, August 2, 2000, pp. 1210-1216）。米国特許第６，１７４，９０５号、欧州特許第０８４７９９２号、日本国特許第２５８８６３／９６号ならびに日本国特許出願第１０１３８９５７号の各明細書には、細胞分化を誘導し、ＨＤＡＣを阻害するベンズアミド誘導体が公開されている。国際公開第ＷＯ０１／３８３２２号パンフレットには、ＨＤＡＣ阻害剤として作用する更なる化合物が公開されている。Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ誌（2006, 120, pp. 101-110）には、ベンズアミドであるＭ３４４によって、ＳＭＡ患者由来の繊維芽細胞におけるＳＭＮ２タンパク質の発現が処置後６４時間後に最大で７倍にアップレギュレートされる報告がなされている。酪酸ナトリウムによって、脊髄及び延髄筋萎縮症のトランスジェニックマウスモデルにおける表現型の発現が改善することが報告されている（Human Molecular Genetics, 2004, Vol. 13, No. 11, pp. 1183-1192）。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンＡは、ＭＣＦ−７乳癌細胞においてサイクリンＤ１のユビキチン依存性分解を誘導することが示されている（Molecular Cancer 2006, 5:8; 当該論文は下記にて参照することができる（http://www.molecular-cancer.com/content/5/1/8））。米国特許第７，１６９，８０１号明細書には、式Ｚ−Ｑ−Ｌ−ＭまたはＺ−Ｌ−Ｍで表されるヒストンデアセチラーゼの阻害に用いることが可能な化合物が開示されている。米国特許第６，８８８，０２７号明細書には、ＰＸＤ１０１などのスルフォンアミド系ＨＤＡＣ阻害剤のファミリーが開示されている。欧州特許第ＥＰ１３０１１８４号明細書には、固形腫瘍の治療におけるバルプロ酸及びその誘導体のＨＤＡＣ阻害剤としての使用が開示されている。
【０００５】
しかしながら、癌の予防または治療用の新たなＨＤＡＣ阻害剤の開発が依然として望まれている。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の目的は下記式（Ｉ）にて表される化合物群、ならびに薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物を提供することにある。
【０００７】
【化１】
【０００８】
本発明の化合物は、神経突起伸長の促進剤、及びＨＤＡＣに関連した疾患、特に腫瘍や細胞増殖性疾患の予防剤または治療剤として有用である。本発明の化合物は特に抗神経変性疾患やヒト脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に対する薬剤として使用することが可能である。
【０００９】
本発明は、神経突起伸長の促進剤、及びＨＤＡＣに関連した疾患、特に腫瘍や細胞増殖性疾患の予防剤または治療剤として有用なプロポリン類に由来する新規化合物に関するものである。本発明の化合物は細胞の分化経路を介して癌細胞の増殖を阻害する作用を有する。本発明の化合物は特に抗神経変性疾患やヒト脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に対する薬剤として使用することが可能である。
【００１０】
〔本発明の化合物〕
すなわち、本発明は下記式（Ｉ）によって表される化合物：
【化１】
［式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、Ｏ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｓ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｎ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｏ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｓ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｎ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、アルキル、アルキレニル、アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、または、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個の環へテロ原子を含む飽和または不飽和の５〜１０員複素環基であるか；またはＲ1及びＲ2は共にジオキソランを形成し；
Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、Ｏ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｓ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｎ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｏ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｓ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｎ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、アルキル、アルキレニル、アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、または、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個の環へテロ原子を含む飽和または不飽和の５〜１０員複素環基であり；
Ｒ5は、Ｃ4-16アルキルまたはＣ4-16アルケニルであり（ただし該アルキルまたはアルケニルは非置換もしくは、１以上のＣ1-6アルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ、Ｎ3、ＮＨ2、ＣＨＯ、ＯＲ9、ＳＲ9、ＮＲ9またはＣＯＯＲ9によって置換される）；
Ｒ6は、Ｃ2-12アルキルまたはＣ2-12アルケニルであるか（ただし該アルキルまたはアルケニルは非置換もしくは、１以上のＣ1-6アルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ、Ｎ3、ＮＨ2、ＣＨＯ、ＯＲ9、ＳＲ9またはＮＲ9によって置換される）；またはＲ5及びＲ6の一方は水素、ハロゲンまたはＯＨであり、他方は非置換もしくは１以上のＣ1-6アルキル、ＯＨ、ＮＨ2、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯまたはＮ3によって置換されるＣ4-16アルキルまたはＣ4-16アルキレンであり；
Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ2、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、ＣＮ、ＮＯ、非置換またはＯＨ、ＮＨ2、ＣＯＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯまたはＣＨＯによって置換されたＣ1-6アルキル、＝Ｏ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルまたはＮ−アルキニルであるか、またはＲ7及びＲ8は共に二重結合、Ｃ3-6シクロアルキルまたはＮ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個のへテロ原子を含む５〜１０員の複素環基を形成し；
Ｒ9はフェニル、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ10またはベンジルであり；
Ｒ10はＯＨ、ＮＨＯＨ、ＮＨ2、Ｃ1-6アルキル、フェニルまたはベンジルである；（ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＯＨである場合、Ｒ5は、
【化２】
ではなく、かつＲ6は、
【化３】
またはＨのいずれでもない；またはＲ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＯＨであり、かつＲ5がＨである場合、Ｒ6は、
【化４】
または、
【化５】
のいずれでもない）］ならびに薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物に関する。
【００１１】
本明細書の文脈において「アルキル」なる語は、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖を意味する。アルキルは好ましくはＣ1-10アルキルである。好ましくはアルキルの炭素数は１〜８からなる群から選択される。より好ましいアルキルはＣ1-6アルキルまたはＣ1-4アルキルである。アルキル基の例としては、メチル（−ＣＨ3）、エチル（−ＣＨ2ＣＨ3）、プロピル（−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）、イソプロピル（−（ＣＨ3）2ＣＨ）及びブチル（−Ｃ4Ｈ9）が挙げられる。
【００１２】
本明細書の文脈において「アルケニル」なる語は、直鎖及び分枝鎖の不飽和炭化水素基を意味する（不飽和結合は二重結合としてのみ存在する）。本発明においてはアルケニルは１以上の二重結合を含む。アルケニルはＣ2-16アルケニルであることが好ましい。より好ましくはアルケニルの炭素数は２〜１２からなる群から選択される。アルケニル基の例としては、エテニル（−ＣＨ＝ＣＨ2）、プロペニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ3または−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）、ブテニル（−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ3、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ3または−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）、−ＣＨ2ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ3、及び−ＣＨ2−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ3）−ＣＨ3が挙げられる。
【００１３】
本明細書の文脈において「アルキニル」なる語は、直鎖及び分枝鎖の不飽和炭化水素基を意味する（不飽和結合は三重結合としてのみ存在する）。好ましくはアルキニルの炭素数は２〜８からなる群から選択される。より好ましいアルキニルはＣ2-6アルキニルまたはＣ2-4アルキニルである。アルキニル基の例としてはプロピニル（例、−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ）が挙げられる。
【００１４】
本明細書の文脈において「シクロアルキル」なる語は、脂環式環（飽和炭素環）を意味する。好ましくはシクロアルキルの炭素数は３〜８からなる群から選択される。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルが挙げられる。
【００１５】
本明細書の文脈において「不飽和の５〜１０員単環式または２環式基」なる語は、不飽和かつ５〜１０員の単環式または２環式（縮合環など）環系を意味し、その例としてはフェニル及びナフチルが挙げられる。
【００１６】
本明細書の文脈において「Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個の環へテロ原子を含む飽和または不飽和の５〜１０員複素環基」なる語は、ニトロ、ヒドロキシル、オキソ、ハロゲン、カルボキシル、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルカルボニル、Ｃ1-6アルコキシカルボニル及びフェニルから選択される少なくとも１個の置換基によってそれぞれが置換されていてもよい窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも１個の環へテロ原子を含む飽和または不飽和の５〜１０員複素環系を意味する。複素環基の例としては、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロイル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チエニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなどが含まれる。
【００１７】
本明細書の文脈において「ハロゲン」なる語は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を意味する。
【００１８】
本明細書の文脈における「薬学的に許容される塩」なる語には、有機及び無機の酸及び塩基と形成される塩が含まれる。薬学的に許容される酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸などの無機酸、ならびに、クエン酸、酒石酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、琥珀酸、蓚酸、蟻酸、フマル酸、マレイン酸、オキザロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸及びイセチオン酸などの有機酸が挙げられる。薬学的に許容される塩基塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩やマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、及び１級、２級、及び３級アミン塩などの有機塩基との塩が挙げられる。
【００１９】
本明細書の文脈において「プロドラッグ」なる語は、血中で加水分解されることなどによって体内で薬理作用を有する活性型に変換される化合物を意味する。
【００２０】
本明細書の文脈において「溶媒和物」なる語は、本発明の化合物と溶媒とからなる複合体であって、本発明の化合物と溶媒とが反応しているか、これらが沈殿または析出される複合体を意味する。
【００２１】
本明細書の文脈において「立体異性体」なる語は、結合する原子は同じであるが原子の空間的配置が異なる異性体分子を指す。
【００２２】
本明細書の文脈において「エナンチオマー」なる語は、左手と右手が「同じ」であるけれども反対であるように、互いに重ね合わせることのできない鏡像関係にある立体異性体を指す。
【００２３】
本発明の式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ1-6アルキル、ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ1-6アルキル、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルであるか、またはＲ1とＲ2とは互いにジオキサレンを形成する。より好ましくはＲ1及びＲ2はそれぞれ独立して、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ3、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルである。
【００２４】
本発明の式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立して、ＯＨ、ＯＣ1-6アルキル、ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ1-6アルキル、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルである。より好ましくはＲ3及びＲ4はそれぞれ独立して、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ3、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルである。
【００２５】
本発明の式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、好ましくはＲ5は下式のいずれかである。
【００２６】
【化２】
【００２７】
【化５】
【００２８】
【化８】
【００２９】
【化９】
【００３０】
【化１０】
【化１５】
または、
【化１７】
本発明の式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、好ましくはＲ6は下式のいずれかである。
【化１８】
【化１９】
【００３１】
【化２３】
【００３２】
【化２９】
【００３３】
【化３０】
または
【化３１】
【００３４】
本発明によれば、本発明の式（Ｉ）で表される好ましい化合物は、
【００３５】
【化３２】
【００３６】
【化３３】
【００３７】
【化３４】
【００３８】
【化３５】
【００３９】
【化３６】
【００４０】
【化３７】
【００４１】
【化３８】
【００４２】
【化３９】
【００４３】
【化４０】
【００４４】
【化４１】
【００４５】
【化４２】
【００４６】
【化４３】
【００４７】
【化４４】
【００４８】
【化４５】
【００４９】
【化４６】
【００５０】
【化４７】
【００５１】
【化４８】
【００５２】
【化４９】
【００５３】
【化５０】
及び
【化５１】
からなる群から選択される。
【００５４】
本発明は更に、式（Ｉ）の化合物にもとづく下式（ＩＩ）で表される立体異性体に関する。
【００５５】
【化５７】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は式（Ｉ）と同様に定義される。）
【００５６】
本発明のより好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は下式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）で表されるものである。
【００５７】
【化３２】
【００５８】
【化４８】
（ＩＶ）
【００５９】
【化５１】
（Ｖ）
【００６０】
【化５２】
（ＶＩ）
【００６１】
本発明によれば、式（Ｉ）の化合物はＨＤＡＣを阻害する作用を有することからヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）に関連する疾患の予防剤または治療剤として使用することが可能である。更に本発明の化合物は、ラットＣ６グリオーマ、ヒト神経膠芽腫、ヒト乳癌細胞、ヒト白血病細胞及びヒトメラノーマ細胞などの複数の癌細胞系列の増殖を著しく阻害する。癌細胞の増殖を阻害する機序は、細胞の分化経路、特に誘導分化ならびにｐ２１やサイクリンＢ１などにみられるような細胞周期調節遺伝子の発現の調節を介したものと考えられる。更に本発明の式（Ｉ）の化合物は、神経幹細胞のニューロン分化を媒介することから抗神経変性疾患に対する薬剤として使用することが可能である。
【００６２】
本発明の化合物を治療目的で使用する場合、投与される用量は、用いられる化合物、投与形態、望ましい治療法、及び対象となる疾患に応じて無論異なる。式（Ｉ）の化合物の日用量は、１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲でよい。本発明は、ＨＤＡＣを阻害する方法、患者の腫瘍または細胞増殖性疾患、神経変性疾患及びヒト脊髄性筋萎縮症を治療する方法、ならびに神経突起伸長を促進する方法を提供するものであって、本発明の化合物の治療上の有効量を患者に投与することからなる方法を提供するものである。
【００６３】
〔本発明の式（Ｉ）の化合物の一般的合成法〕
本発明の化合物はいずれの従来法によって調製してもよい。これらの化合物の好適な合成法は実施例において述べる。一般的に式（Ｉ）の化合物は、以下に述べる合成スキームのいずれかにしたがって調製することができる。
【００６４】
【化５８】
（スキーム１）
【００６５】
【化５９】
（スキーム２）
【００６６】
【化６０】
（スキーム３）
【００６７】
【化６１】
（スキーム４）
【００６８】
【化６２】
（スキーム５）
【００６９】
【化６３】
（スキーム６）
【００７０】
【化６４】
（スキーム７）
【００７１】
【化６５】
（スキーム８）
【００７２】
【化６６】
（スキーム９）
【００７３】
式（Ｉ）の化合物のＲ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4のメチル化は、以下の手順で行うことができる。すなわち、反応物であるＫ2ＣＯ3とアセトンをＭｅ2ＳＯ4（ＤＭＳ）と混合し、溶液を加熱攪拌する。得られた溶液を一定時間、制御雰囲気下（例、Ｎ2下）で還流し、有機溶媒を除去した後、残渣を特定の有機溶液に溶解してこれを水で洗い、減圧下で有機層を蒸発させてから生成物をシリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン＝１：４）で精製する。
【００７４】
Ｒ5またはＲ6への二重結合の付加は、以下の手順で行うことができる。すなわち、反応物のＴＨＦ溶液を氷浴中、Ｈ2ＳＯ4に加えた後、溶液を一定時間攪拌してから水で希釈する。得られた混合物を適当な有機溶液（例、ＣＨ2Ｃｌ2）で抽出し、有機層を合わせて減圧下で蒸発させ、得られた残渣をシリカゲルカラム（０〜３％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）で精製する。
【００７５】
化合物６ａ〜ｅ及び７ａ〜ｅの調製法をスキーム１及びスキーム２として示した。プロポリンＧは、当該技術分野では周知のプロポリン誘導体であり、適当な反応条件下で、メチル化、アセチル化、位置選択的なメチル化、及びベンジル化を行うことによって化合物２〜５をそれぞれ生成する。次いで化合物１〜５を酸の存在下で水和することで標的化合物であるジヒドロフラボン６ａ〜ｅをそれぞれ得る。化合物１〜５をヨードベンゼンジアセタートで酸化した後、酸の存在下で水和することで対応する各フラボン７ａ〜ｅを得る。
【００７６】
化合物１０ａ〜ｅ及び１２ａ〜ｅはスキーム３に示したように調製した。化合物１〜５を水素化ホウ素ナトリウムで還元し、脱水反応を行うことによって対応する化合物９ａ〜ｅを得た。化合物９ａ〜ｅを酸存在下で水和することにより標的化合物である１０ａ〜ｅをそれぞれ得た。化合物９ａ〜ｅをＭＣＰＢＡでエポキシ化することによってエポキシド１１ａ〜ｅが得られ、次いでメチルアミン、エチルアミン、及びべンジルアミンなどの対応するアミンを用いた求核反応によって標的化合物である１２ａ〜ｅをそれぞれ得た。
【００７７】
化合物１４〜１７はスキーム４に示したようにして合成した。化合物１０ｂを光延反応させることにより所望のアジド１３が得られ、次いでナトリウム反応を行ってこのアジドを３級アミン１４に変換した。化合物１０ｂの三臭化リンによる臭素化、フェノールチオール（ＰｈＳＨ）によるチオール化、及び塩化チオニルによる塩素化によって臭化物１５、チオールエーテル１７、及び塩化物１６をそれぞれ得た。
【００７８】
化合物１８ａ〜ｄ及び１９ａ〜ｄはスキーム５に示したようにして合成した。化合物１０ｂを、アセチル、プロピオニル、ベンゾイル及びイソブチリルなどの対応した塩化アシルでアシル化することにより化合物１８ａ〜ｄをそれぞれ得た。化合物１０ｂを、ヨウ化メチル、エチル、ベンジル、及びイソプロピルなどの対応したヨウ化アルキルでアルキル化することにより化合物１９ａ〜ｄをそれぞれ得た。
【００７９】
化合物２２はスキーム６に示したようにして合成した。化合物６ｂの３級アルコールを水素化ナトリウム条件下でブロモ酢酸エチルと反応させることによって化合物２０を得た。化合物２０を塩基存在下で加水分解することにより化合物２１が得られ、次いでヒドロキシアミンと反応させることによってヒドロキサム酸２２を得た。
【００８０】
ヒドロキサム酸２８ａ〜ｅはスキーム７に示したようにして調製した。化合物１を酸性条件下でオルト蟻酸トリメチルと反応させることによりアセトニド２３を得、次いでメチル、イソプロピル及びベンジルなどのヨウ化アルキルによるアルキル化か、塩化ベンゾイル及び無水酢酸によるアセチル化によって化合物２４ａ〜ｅをそれぞれ得た。化合物２４ａ〜ｅの２種類の末端オレフィンを酸存在下で水和反応させることにより化合物２５ａ〜ｅを得、次いでブロモ酢酸エチルと反応させることによって化合物２６ａ〜ｅを得た。化合物２６ａ〜ｅを塩基存在下で加水分解することにより化合物２７ａ〜ｅを得、次いでヒドロキシアミンと反応させることでヒドロキサム酸２８ａ〜ｅをそれぞれ得た。
【００８１】
〔本発明の医薬組成物〕
式（Ｉ）の化合物ならびに薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物はそれ自体でも使用可能であるが、一般的には式（Ｉ）の化合物／塩／溶媒和物（有効成分）を薬学的に許容される補助剤、希釈剤または担体と組み合わせた医薬組成物として投与される。投与形態に応じ、医薬組成物は、１０〜３０ｗｔ％（重量パーセント）、より好ましくは３０〜５０ｗｔ％、更に好ましくは５０〜７０ｗｔ％、更により好ましくは７０〜１００ｗｔ％の有効成分を含有する（重量％はすべて全組成物に対して）。更に本発明の医薬組成物は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）に関連した疾患の他の予防剤または治療剤を含有していてもよい。
【００８２】
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、散剤や顆粒剤による経口投与溶液や懸濁液による非経口投与、皮下投与、坐剤による直腸内投与、経皮投与によって全身的に投与することが可能である。
【００８３】
本発明の化合物ならびに医薬組成物はＨＤＡＣ阻害剤であり、細胞内に長期にわたって保持され、ヒストンＨ４のアセチル化を継続的に誘導する。本発明の化合物ならびに医薬組成物は細胞及び神経幹細胞の分化を誘導するＨＤＡＣ阻害剤である。更に本発明の化合物は、ＨＤＡＣ活性を大きく阻害する。本発明の化合物は細胞のＳ期及びＧ２／Ｍ期を用量依存的に大幅に短縮し、癌細胞の形態を変化させる。したがって本発明の化合物によって腫瘍や細胞増殖性疾患を治療することが可能である。更に本発明の化合物によって神経突起伸長を促進し、神経変性疾患やヒト脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療することが可能である。
【００８４】
〔実施例〕
以下、実施例で本発明の化合物の好ましい合成法及び使用法を説明する。
【００８５】
実施例１：３'４'５，７−テトラメチル−プロポリンＧ（２）の調製
プロポリンＧ（化合物１，５ｇ，１０．１６ｍｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（１６．２７ｇ，１１７．８９ｍｍｏｌ）及びアセトン（２８０ｍＬ）の混合物にＭｅ2ＳＯ4（１５．７６ｍＬ，１２６ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を窒素雰囲気下で２４時間、加熱還流した。有機溶媒を除去し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（８０ｍＬ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（４０ｍＬｘ３）で洗った。ＣＨ2Ｃｌ2層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン＝１：６）で精製して化合物２（４．００ｇ，７２％）を得た。
【００８６】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.26 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.86 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.27 (1H, s), 5.50 (1H, dd, J=2.5, 13.5 Hz), 5.14-5.11 (1H, m), 5.11-5.10 (1H, m), 5.02-4.99 (1H, m), 3.87 (3H, s), 3.83 (3H, s), 3.79 (6H, s), 3.50 (1H, dd, J=6.6, 15.2 Hz), 3.43 (1H, dd, J=5.8, 15.2 Hz), 3.00 (1H, dd, J=13.5, 16.7 Hz) , 2.68 (1H, dd, J=2.6, 16.7 Hz), 2.00-1.92 (2H, m), 1.75 (3H, s), 1.70 (3H, s), 1.65 (3H, s), 1.60 (3H, s), 1.52 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 189.4 (s), 164.0 (s), 163.3 (s), 159.6 (s), 153.0 (s), 147.2 (s), 135.6 (s), 134.2 (s), 131.5 (s), 131.3 (s), 129.8 (s), 124.1 (d), 122.8 (d), 122.7 (d), 122.1 (d), 118.2 (s), 110.3 (d), 108.7 (s), 95.6 (d), 75.9 (d), 61.8 (q), 60.7 (q), 55.7 (q), 55.7 (q), 45.1 (t), 39.6 (t), 26.6 (t), 25.7 (q), 25.6 (q), 24.9 (t), 22.0 (t), 17.7 (q), 17.6 (q), 16.3 (q); HREIMS C34H44O6 (M)として計算値：548.3142, 実測値：548.3140.
【００８７】
実施例２：６−（２−ヒドロキシ−２−メチルブチル）−２'−（７−ヒドロキシ−３，７−ジメチルオクト−２−エニル）−３’，４’，５，７−テトラメトキシフラバノン（６ｂ）の調製
氷浴中、化合物２（７ｇ，１２．７７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１７０ｍｌ）に、４９％Ｈ2ＳＯ4（１４０ｍＬ）を加えた。全量を加えた後、反応溶液を室温で８時間攪拌し、Ｈ2Ｏで希釈した。この反応溶液をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬｘ３）で抽出した。有機層を合わせてＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１〜１：３）で精製して純粋な油状物６ｂを得た（２．３０ｇ，３４％）。
【００８８】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.27 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.87 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.28 (1H, d, J=2.6 Hz), 5.49 (1H, dd, J=2.4, 13.6 Hz), 5.05 (1H, t, J=6.0 Hz), 3.87 (3H, s), 3.84 (3H, s), 3.79 (6H, s), 3.52 (1H, dd, J=5.5, 15.2 Hz), 3.43 (1H, dd, J=7.6, 15.2 Hz), 2.97 (1H, dd, J=8.0, 16.7 Hz), 2.70-2.59 (3H, m), 1.93 92H, t, J=6.4 Hz), 1.65 (3H, s), 1.64-1.60 (2H, m), 1.41-1.32 (4H, m), 1.25 (6H, s), 1.15 (3H, s), 1.14 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) 189.4 (s), 164.0 (s), 163.3 (s), 159.6 (s), 153.0 (s), 147.2 (s), 135.6 (s), 134.2 (s), 131.5 (s), 131.3 (s), 129.8 (s), 124.1 (d), 122.8 (d), 122.7 (d), 122.1 (d), 118.2 (s), 110.3 (d), 108.7 (s), 95.6 (d), 75.9 (d), 61.8 (q), 60.7 (q), 55.7 (q), 55.7 (q), 45.1 (t), 39.6 (t), 26.6 (t), 25.7 (q), 25.6 (q), 24.9 (t), 22.0 (t), 17.7 (q), 17.6 (q), 16.3 (q); HREIMS C34H48O8 (M)として計算値：584.3338, 実測値：584.3344.
【００８９】
実施例３：６−ゲラニル−３’，４’，５，７−テトラメトキシフラバノン（３０）の調製
化合物２９（プロポリンＣ，１２８ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（４３１ｍｇ，３．１ｍｍｏｌ）及びアセトン（１５ｍＬ）の混合物にＭｅ2ＳＯ4（０．２５ｍＬ，２．４８ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を窒素雰囲気下で２４時間、加熱還流した。有機溶媒を除去した後、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（５０ｍＬｘ３）で洗った。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン＝１：４）で精製して化合物３３（１０７ｍｇ，７２％）を得た。
【００９０】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3), 6.99-6.97 (2H, m), 6.88 (1H, d, J=8.8 Hz), 6.31 (1H, s), 5.33 (1H, dd, J=2.8, 13.3 Hz), 5.11 (1H, td, J=1, 6.9 Hz), 5.04(1H, td, J=1.3, 5.5 Hz), 3.90 (3H, s, OMe), 3.88 (3H, s, OMe), 3.81 (3H, s, OMe), 3.80 (3H, s, OMe), 3.34 (1H, dd, J=7.2, 14.1 Hz), 3.26 (1H, dd, J=7.2, 14.1Hz), 3.02 (1H, dd, J=13.3, 16.7 Hz), 2.74 (1H, dd, J=2.8, 16.7 Hz), 2.04-2.00 (2H, m), 1.96-1.92 (2H, m), 1.74 (3H, s), 1.62 (3H, s), 1.55 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) ,189.1 (s), 164.1 (s), 163.0 (s), 159.4 (s), 149.5 (s), 149.4 (s), 131.3, 131.2 (s), 124.4 (d), 122.9 (d), 118.9 (d), 109.5 (d), 108.9 (s), 95.7 (d), 79.2 (q), 61.9 (q), 56.1 (q), 56.0 (q), 55.9 (q), 45.6 (t), 39.8 (t), 26.7 (t), 25.7 (s), 22.0 (t), 17.7 (q), 16.1 (q); HREIMS C29H36O6 (M)として計算値：480.2510, 実測値：480.2511.
【００９１】
実施例４：６−（２，６−ジヒドロキシ−２，６−ジメチル−オクチル）−３’，４’，５，７−テトラメトキシフラバノン（３１）の調製
氷浴中、化合物３０（８０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（６ｍｌ）に、４９％Ｈ2ＳＯ4（４ｍＬ）を加えた。全量を加えた後、反応溶液を室温で８時間攪拌し、Ｈ2Ｏで希釈した。この反応溶液をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬｘ３）で抽出した。有機層を合わせてＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（０〜３％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）で精製して純粋な油状物３１を得た（４４ｍｇ，５０％）。
【００９２】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.99-6.97 (2H, m), 6.88 (1H, d, J=8.8 Hz), 6.31 (1H, s), 5.33 (1H, dd, J=2.8, 13.3 Hz), 3.90 (3H, s, OMe), 3.88 (3H, s, OMe), 3.84 (3H, s, OMe), 3.82 (3H, s, OMe), 3.02 (1H, dd, J=13.3, 16 Hz), 2.75 (1H, dd, J=2.8, 16Hz), 2.62-2.58 (2H, m), 1.63-1.59 (7H, m), 1.49-1.48 (2H, m), 1.23 (3H, s), 1.22 (3H, s), 1.21 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) 189.1 (s), 164.1 (s), 163.0 (s), 159.4 (s), 149.5 (s), 149.4 (s), 131.2 (s), 119.0 (d), 118.9 (d), 111.3 (d), 109.5 (d), 108.9 (s), 95.8 (d), 72.9 (s), 71.1 (s), 62.1 (q), 56.0 (q), 55.9 (q), 45.5 (t), 44.5 (t), 42.3 (t), 42.1 (t), 41.5 (t), 29.4 (q), 29.3 (q), 26.9 (q), 26.8 (q), 18.8 (t), 17.5 (t); HREIMS (M-18)として計算値：498.2602, 実測値：498.2610.
【００９３】
実施例５：プロポリンＡ（３３）の調製
氷浴中、プロポリンＤ（化合物３２，１００ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（６ｍｌ）に、４９％Ｈ2ＳＯ4（４ｍＬ）を加えた。全量を加えた後、反応溶液を室温で８時間攪拌し、Ｈ2Ｏで希釈した。この反応溶液をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬｘ３）で抽出した。有機層を合わせてＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（０〜３％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）で精製して純粋な油状物３３を得た（４２ｍｇ，４０％）。
【００９４】
1H-NMR (400 MHz, MeOD) 6.87 (1H, d, J=8.4 Hz), 6.71 (1H, d, J=8.4 Hz), 5.88 (2H, dd, J=1.9, 3.3 Hz), 5.47 (1H, dd, J=2.6, 13 Hz), 5.12 (1H, dd, J=5.7, 6.7 Hz), 3.47 (2H, d, J=6.6 Hz), 3.10 (1H, dd, J=13.4, 17 Hz) , 2.60 (1H, dd, J=2.7, 17.1 Hz), 1.94 (1H, dd, J=6.6, 13.4 Hz), 1.64 (1H, d, J=0.5 Hz), 1.43-1.41 (2H, m), 1.37-1.34 (2H, m), 1.13 (3H, s), 1.12 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) ,198.2 (s), 168.5 (s), 168.4 (s), 165.5 (s), 165.4 (s), 165.2 (s), 146.5 (s), 144.5 (s), 135.8 (s), 129.7 (s), 128.2 (s), 124.7 (d), 118.7 (d), 113.6 (d), 103.2 (s), 97.1 (d), 96.2 (d),77.8 (d), 71.5 (s), 44.3 (t), 43.7 (t), 41.2 (t), 29.2 (q), 29.1 (q), 25.4 (t), 23.7 (t), 16.2 (t).
【００９５】
実施例６：３'，４'，５，７−テトラアセチルプロポリンＤ（３４）
プロポリンＤ（化合物３２，１２４ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（４ｍＬ）に無水酢酸（２ｍＬ）を加え、この反応溶液を室温で６時間攪拌した。反応溶液にＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）を加え、０．１Ｎ ＨＣｌ（１０ｍＬｘ３）で洗った。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ＣＨ2Ｃｌ2）で精製して純粋な油状物３４（１３９ｍｇ，８０％）を得た。
【００９６】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 7.49 (1H, d, J=8.6 Hz), 7.18 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.72 (1H, d, J=2.2 Hz), 6.53 (1H, d, J=2.2 Hz), 5.60 (1H, dd, J=2.5, 13.8 Hz), 5.01 (1H, td, J=5.3, 4.6 Hz), 4.94 (1H, td, J=1.0, 5.8 Hz), 3.35 (1H, dd, J=7.1, 15.7 Hz), 3.26 (1H, dd, J=5.3, 15.5 Hz) , 2.98 (1H, dd, J=13.8, 16.8 Hz), 2.36 (3H, s), 2.27 (6H, s), 2.26 (s, 3H), 2.02-1.91 (5H, m), 1.64 (3H, s), 1.62 (3H, s), 1.55 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) ,188.8 (s), 169.2 (s), 168.1 (s), 168.0 (s), 167.9 (s), 163.2 (s), 155.9 (s), 151.3 (s), 142.8 (s), 140.9 (s), 137.0 (s), 135.2 (s), 133.5 (s), 131.6 (s), 124.5 (d), 123.9 (d), 121.6 (d), 120.7 (d), 111.6 (s), 110.7 (d), 109.0 (d), 76.1 (d), 44.8 (t), 39.4 (t), 26.5 (t), 25.6 (t), 25.5 (q), 21.1 (q), 21.0 (q), 20.7 (q), 20.3 (q),17.7 (q), 16.3 (q).
【００９７】
実施例７：３'，４'，５，７−テトラメチルプロポリンＤ（３５）
化合物３２（１２８ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（４３１ｍｇ，３．１ｍｍｏｌ）及びアセトン（１５ｍＬ）の混合物にＭｅ2ＳＯ4（０．２５ｍＬ，２．４８ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を窒素雰囲気下で２４時間、加熱還流した。有機溶媒を除去した後、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（５０ｍＬｘ３）で洗った。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン＝１：４）で精製して化合物３５（１０７ｍｇ，７２％）を得た。
【００９８】
H-NMR (400 MHz, CDCl3) 7.26 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.85 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.10 (1H, d, J=2.3 Hz), 6.07 (1H, d, J=2.3 Hz), 5.34 (1H, dd, J=2.6, 13.5 Hz), 5.04 (1H, td, J=5.3, 4.6 Hz), 4.99 (1H, td, J=1.0, 5.8 Hz), 3.88 (3H, s), 3.86 (3H, s) , 3.80 (3H, s), 3.74 (3H, s), 3.46 (1H, dd, J=6.6, 15.2 Hz), 3.44 (1H, dd, J=5.8, 15.2 Hz), 3.02 (1H, dd, J=13.5, 16.5 Hz), 2.69 (1H, dd, J=2.6, 16.5 Hz), 2.00-1.97 (2H, m), 1.94-1.92 (2H, m), 1.65 (3H, s), 1.60 (3H, s), 1.52 (3H, s).
【００９９】
実施例８：３'，４'，７−Ｏ−トリメチルプロポリンＧ（４）
【０１００】
【化４８】
【０１０１】
プロポリンＧ（２．３０ｇ，２．７５ｍｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（１．９４ｇ，１３．９９ｍｍｏｌ）及びアセトン（８０ｍＬ）の混合物にＭｅ2ＳＯ4（２．１７ｍＬ，１７．３５ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を０．５時間攪拌した後、窒素雰囲気下で６時間加熱還流した。有機溶媒を除去した後、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍＬ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（４０ｍＬｘ３）で洗った。ＣＨ2Ｃｌ2層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン＝１：８）で精製して化合物４（９５４ｍｇ，６５％）を得た。
【０１０２】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.06 (1H, s), 7.26 (1H, d, J=8.4 Hz), 6.86 (1H, d, J=8.4 Hz), 6.03 (1H, s), 5.50 (1H, dd, J=2.4, 13.4 Hz), 5.17-5.14 (1H, m), 5.04-5.00 (2H, m), 3.87 (3H, s), 3.79 (3H, s), 3.79 (6H, s), 3.46-3.45 (2H, m), 3.25-3.23 (2H, m), 3.05 (1H, dd, J=13.5, 16.7 Hz) , 2.70 (1H, dd, J=2.6, 16.7 Hz), 2.02-1.94 (7H, m), 1.75 (3H, s), 1.67 (3H, s), 1.66 (3H, s), 1.61 (3H, s), 1.58 (3H, s)
【０１０３】
実施例９：６−（２−ヒドロキシ−２−メチルブチル）−２'−（７−ヒドロキシ−３，７−ジメチルオクト−２−エニル）−５−ヒドロキシ−３'，４'，７−トリメトキシフラバノン（６ｄ）
【０１０４】
【化４９】
【０１０５】
氷浴中、化合物４（５３０ｍｇ，０，９９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１５ｍｌ）に、４９％Ｈ2ＳＯ4（１０ｍＬ）を加えた。全量を加えた後、反応溶液を室温で８時間攪拌し、Ｈ2Ｏで希釈した。この反応溶液をＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬｘ３）で抽出した。有機層を合わせてＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１）で精製して純粋な油状物６ｄを得た（１９１ｍｇ，３４％）。
【０１０６】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.06 (1H, brs), 7.27 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.86 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.05 (1H, s), 5.50 (1H, dd, J=2.6, 13.6 Hz), 5.03 (1H, t, J=6.2 Hz), 3.87 (3H, s), 3.80 (6H, s), 3.48 (1H, dd, J=5.5, 15.2 Hz), 3.42 (1H, dd, J=6.1, 15.2 Hz), 3.06 (1H, dd, J=13.6, 17.1 Hz), 2.70(1H, dd, J=2.7, 17.1 Hz), 2.65-2.61 (2H, m), 1.95-1.92(2H, m), 1.65 (3H, s), 1.41-1.35 (5H, m), 1.26 (6H, s), 1.15 (3H, s), 1.14 (3H, s).
【０１０７】
実施例１０：他の化合物
以下の２化合物を上述の方法にしたがって調製した。
【０１０８】
【化５０】
【０１０９】
【化５１】
（ＮＢＭ−ＨＤ−２）
【０１１０】
実施例１１：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−１）による癌細胞増殖の阻害
【化６７】
【０１１１】
癌細胞系列であるラットＣ６グリオーマ細胞を、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）中で３７℃、５％ＣＯ2、相対湿度９５％の条件で培養した。各実験で細胞は６穴プレートに３×１０5細胞／ウェルの細胞密度で播種した。２４時間後に、細胞を異なる濃度のＮＢＭ−ＨＤ−１（明細書中の式（ＩＩＩ）の化合物）で処理した。４８時間後に細胞を観察、計数した。図１の結果に示されるように、ＮＢＭ−ＨＤ−１はラットＣ６グリオーマ細胞の増殖を停止させた。Ｃ６グリオーマ細胞を２．５μｇ／ｍＬ（図１（Ａ）−ｂ）、５μｇ／ｍＬ（図１（Ａ）−ｃ）、及び１０μｇ／ｍＬ（図１（Ａ）−ｄ）のＮＢＭ−ＨＤ−１の存在下で４８時間培養することにより、細胞密度はコントロール（図１（Ａ）−ａ）と比較して顕著に低下した。細胞計数の結果によっても同様の傾向が示された（図１（Ｂ））。上記の結果はＮＢＭ−ＨＤ−１が用量依存的にＣ６グリオーマ細胞の増殖を阻害する作用を有することを示すものである。
【０１１２】
１×１０6個のラットＣ６グリオーマ細胞を異なる濃度のＮＢＭ−ＨＤ−１（０μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬ）で７２時間処理した。処理細胞をトリプシン処理して集めた。この細胞を２００μＬ ＰＢＳに再懸濁し、冷たい１００％エタノール８００μＬを加えることで固定した。得られた細胞を−２０℃で一晩固定した。遠心により細胞ペレットを集め、１ｍＬの低張緩衝液（０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳ溶液、１μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ）に再懸濁し、３７℃で３０分培養した。次いで細胞ペレットに１ｍＬのＰＩ溶液（５０μｇ／ｍＬ）を加えた。この混合物を４℃で３０分静置した。細胞のＤＮＡ量をＦＡＣＳｃａｎサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により調べた（図２）。図２の結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−１が細胞周期をＧ０／Ｇ１期で停止するように用量依存的に調節することによりＣ６グリオーマの細胞増殖を顕著に阻害することを示している。
【０１１３】
実施例１２：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−１）による癌細胞の細胞増殖の阻害及び分化誘導
ラットＣ６グリオーマ細胞についてｍＲＮＡの発現に関連する細胞周期をＲＴ−ＰＣＲにより調べた。製造者の指示にしたがってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、処理Ｃ６細胞から全ＲＮＡを単離した。ＲｅｖｅｒＴｒａ−ＰｌｕｓＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて５００ｎｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを作成した。ＧＡＰＤＨを内部コントロールとして用い、細胞周期の複数の遺伝子を調べるためのプライマーを用いたＰＣＲによってＲＴ産物（１μｌ）を増幅した。この結果を図３に示した。図３の結果に示されるとおり、ＮＢＭ−ＨＤ−１は幾つかの細胞周期調節因子の発現を調節する作用を示した。この結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−１が用量依存的にサイクリンＤ１及びサイクリンＢ１の発現を低減させることを示すものである。これに対し、ｐ２１の発現量は増加した。
【０１１４】
Ｃ６グリオーマ細胞を１０μｇ／ｍＬのＮＢＭ−ＨＤ−１と２４時間培養した後、固定し、公知の免疫蛍光染色法によって調べた。グリア細胞の染色はグリア特異的なＧＦＡＰ抗体（ＳＩＧＭＡ）を一次抗体として用い、蛍光標識したウサギ免疫グロブリン（ＳＩＧＭＡ）を一次抗体に結合する二次抗体として用いて行った。ＧＦＡＰ抗体陽性の細胞は特定の光源によって励起されることで蛍光を発する。更に細胞核をＤＡＰＩで染色した。染色の結果を図４（Ａ）に示した。図４（Ａ）に示されるように、ＮＢＭ−ＨＤ−１はＣ６グリオーマ癌細胞でＧＦＡＰの発現を誘導する。１０μｇ／ｍＬのＮＢＭ−ＨＤ−１で処理した細胞の写真ではコントロール群と比較してより多くのＧＦＡＰタンパク質が検出された。図４（Ａ）の中央の列はＤＡＰＩ染色した細胞の写真である。
【０１１５】
ＧＦＡＰのｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲによって調べた。図４（Ｂ）の結果は、ＧＦＡＰの発現量が用量依存的に増加したことを示している。これらの結果によれば、ＧＦＡＰの発現量が増加したことからＮＢＭ−ＨＤ−１がＣ６グリオーマ癌細胞の細胞分化を誘導することが示される。
【０１１６】
実施例１３：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−１）で処理した癌細胞における過剰アセチル化ヒストンの蓄積量の増加
細胞ライセート中の過剰アセチル化ヒストンＨ４の蓄積量を、ウエスタンブロット及びアセチル化ヒストンＨ４に対する抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いて調べた。Ｃ６グリオーマ細胞は１０ｃｍの培養皿毎に１×１０6個の細胞密度で播種した。２４時間後に細胞を１０μｇ／ｍＬのＮＢＭ−ＨＤ−１または４ｍＭの酪酸ナトリウムで数時間処理した。全細胞ライセートを変性用ＳＤＳサンプルバッファーを用い、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離することによって調製した。図５に示したように、酪酸ナトリウム及びＮＢＭ−ＨＤ−１のいずれにおいても過剰アセチル化ヒストンＨ４の蓄積量の増加が見られた。アセチル化ヒストンは非処理のＣ６グリオーマ細胞ではほとんど検出されなかった。４ｍＭの酪酸ナトリウムで２時間処理した細胞ではアセチル化ヒストンＨ４の量は増加した。この後、培地から酪酸ナトリウムを除去した。６時間後、アセチル化ヒストンＨ４の量は減少した。ＮＢＭ−ＨＤ−１で２時間処理した細胞ではアセチル化ヒストンＨ４の蓄積量は増加した。ＮＢＭ−ＨＤ−１の除去後、アセチル化ヒストンＨ４の量は時間とともに増加した。化合物の除去から６時間後にヒストンのアセチル化レベルは最も高くなった。これらの結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−１が、酪酸ナトリウムと同様、ＨＤＡＣ阻害剤であることを示すものである。ＮＢＭ−ＨＤ−１は酪酸ナトリウムよりも疎水性が高いことから、ＮＢＭ−ＨＤ−１は酪酸ナトリウムよりも長時間にわたって細胞内に留まり、ヒストンＨ４のアセチル化を継続的に誘導すると考えられる。
【０１１７】
実施例１４：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−１）によるＨＤＡＣ活性の阻害
Ｃ６グリオーマ細胞を異なる用量のＮＢＭ−ＨＤ−１及び酪酸ナトリウム（ＳＢ）で処理した。２４時間後に細胞を収集し、製造者の指示にしたがってＮｕｃＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて核タンパク質を抽出した。ＨＤＡＣ活性アッセイキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いてこれらの抽出物のＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチル化酵素）阻害活性について調べた。先ず、アセチル化されたリジン側鎖を有するＨＤＡＣの蛍光定量的基質を、抽出した核タンパク質とインキュベートした。この基質は脱アセチル化によって感受性が高くなることから、第２の工程でリジン検出剤で処理することによってフルオロフォアを生成する。このフルオロフォアは蛍光プレートリーダーによって容易に分析することができる。図６に示すように、ＮＢＭ−ＨＤ−１はＣ６グリオーマ細胞のＨＤＡＣ活性を阻害した。ＨＤＡＣの阻害は癌細胞の分化の誘導との関連が示唆されている。この実験ではＨＤＡＣ阻害活性を示すことで知られる化合物である酪酸ナトリウムをポジティブコントロールとして用いた。蛍光単位の低い値は、実験群でのＨＤＡＣ阻害活性が高いことを示している。実験結果からＮＢＭ−ＨＤ−１はＨＤＡＣ活性を顕著に阻害することが示された。
【０１１８】
実施例１５：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−１）による癌細胞のＨＤＡＣ活性の阻害及び形態の変化
ヒト神経膠芽腫細胞ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧを、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）、１００ｍｈ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で３７℃、５％ＣＯ2、相対湿度９５％の条件で培養した。各実験で細胞は６穴プレートに３×１０5細胞／ウェルの細胞密度で播種した。２４時間後に、細胞を異なる濃度のＮＢＭ−ＨＤ−１及び４ｍＭの酪酸ナトリウムで処理した。７２時間後に細胞を観察、計数した。図７に示されるようにＮＢＭ−ＨＤ−１は０５ＭＧ細胞の増殖を著しく阻害し、細胞の形態を変化させた。０５ＭＧ細胞（図７（Ａ））を２．５μｇ／ｍＬ（図７（Ａ）−ｂ）、５μｇ／ｍＬ（図７（Ａ）−ｃ）、及び１０μｇ／ｍＬ（図７（Ａ）−ｄ）のＮＢＭ−ＨＤ−１の存在下で７２時間培養することにより、細胞密度はコントロール（図７（Ａ）−ａ）と比較して大幅に低下した。実験群の０５ＭＧ細胞はコントロール群の細胞よりも長い形態に変化した。細胞計数の結果（図７（Ｂ））は、ＮＢＭ−ＨＤ−１は酪酸ナトリウムと同様、０５ＭＧ細胞の増殖を阻害したことを示している。これらの結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−１が用量依存的に０５ＭＧ細胞の増殖を阻害し、０５ＭＧ癌細胞の形態の変化を引き起こすことを示すものである。
【０１１９】
乳癌細胞ＭＣＦ−７を、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）中で３７℃、５％ＣＯ2、相対湿度９５％の条件で培養した。細胞は６穴プレートに３×１０5細胞／ウェルの細胞密度で播種した。２４時間後に、細胞を異なる濃度の化合物ＮＢＭ−ＨＤ−１及びポジティブコントロールとして４ｍＭの酪酸ナトリウムで処理した。４８時間後に細胞を観察し、９６時間後に計数した。図８に示されるようにＮＢＭ−ＨＤ−１はＭＣＦ−７癌細胞の増殖を著しく阻害し、細胞の形態を変化させた。図８（Ａ）に示されるように、細胞を２．５μｇ／ｍＬ（図８（Ａ）−ｂ）、５μｇ／ｍＬ（図８（Ａ）−ｃ）、及び１０μｇ／ｍＬ（図８（Ａ）−ｄ）のＮＢＭ−ＨＤ−１の存在下で４８時間培養することにより、ＭＣＦ−７細胞の細胞密度はコントロール（図８（Ａ）−ａ）と比較して大幅に低下した。実験群のＭＣＦ−７細胞の形態はコントロール群の細胞と比較して変化した。図８（Ｂ）は、４ｍＭの酪酸ナトリウムによってＭＣＦ−７細胞の増殖が阻害されたことを示す。細胞計数の結果（図８（Ｂ））は、ＮＢＭ−ＨＤ−１は酪酸ナトリウムと同様、細胞の増殖を阻害したことを示している。これらの結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−１が用量依存的にＭＣＦ−７細胞の増殖を阻害し、その形態変化を引き起こすことを示すものである。
【０１２０】
１００ｍｍの培養皿中でＭＣＦ−７癌細胞を異なる濃度（０，２．５，５及び１０μｇ／ｍＬ）のＮＢＭ−ＨＤ−１または４ｍＭの酪酸ナトリウムで７２時間処理した。実施例８で述べた工程にしたがってサンプルを調製した。次いで細胞のＤＮＡをＦＡＣＳｃａｎサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により調べた。図９に示されるように、ＮＢＭ−ＨＤ−１は細胞周期がＧ０／Ｇ１期で停止するように用量依存的に調節することによりＭＣＦ−７細胞の細胞増殖を顕著に阻害することを示している。Ｇ０／Ｇ１期の細胞の比率は７４．４６から９２．５５へと用量依存的に高くなっている。更に、ＮＢＭ−ＨＤ−１によって細胞周期のＳ期及びＧ２／Ｍ期が用量依存的にいずれも大幅に短縮することが示された。
【０１２１】
ｐ２１のｍＲＮＡ発現に関連する細胞周期をＲＴ−ＰＣＲにより調べた。処理ＭＣＦ−７細胞から全ＲＮＡを単離してＲＴ反応に用いた。ｃＤＮＡ（１μｌ）をテンプレートとしてＰＣＲによりｐ２１遺伝子を増幅した。ＧＡＰＤＨを内部コントロールとして用いた。図１０に示されるように、ＮＢＭ−ＨＤ−１はＭＣＦ−７癌細胞におけるｐ２１のｍＲＮＡの発現量を増加させた。この実験では、ＭＣＦ−７細胞を異なる用量のＮＢＭ−ＨＤ−１で２４時間処理した。実験結果はＮＢＭ−ＨＤ−１が用量依存的にｐ２１の発現を誘導することを示すものである。
【０１２２】
細胞ライセート中の過剰アセチル化されたヒストンＨ４の蓄積量を、ウエスタンブロット及びアセチル化ヒストンＨ４に結合する抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いて調べた。ＭＣＦ−７細胞は１０ｃｍの培養皿毎に１×１０6個の細胞密度で播種した。２４時間後に細胞を１０μｇ／ｍＬのＮＢＭ−ＨＤ−１または４ｍＭの酪酸ナトリウムで数時間処理した。過剰アセチル化されたヒストンＨ４に対する特異的抗体を用いてヒストンのアセチル化度を調べることによってＮＢＭ−ＨＤ−１によるＨＤＡＣの阻害を調べた。酪酸ナトリウムをポジティブコントロールとして用いた。図１１に示されるように、ＭＣＦ−７細胞における結果はＣ６グリオーマ細胞と同様であった。
【０１２３】
実施例１６：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−１）による神経突起伸長の促進
Ｂ−２７を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）にペニシリンＧ、ストレプトマイシン、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミンを加えることによってＮＣＳ（神経幹細胞）及び皮質ニューロン用の培地を調製した。麻酔下の妊娠１７日目のＷｉｓｔａｒ系ラットの腹腔内の胎嚢から胎児を摘出した。胎児から脳組織を取り出し、０．１％トリプシン溶液で２５℃で３分間処理した。ＰＢＳ溶液で３回洗浄した後、細胞をピペッティングして解離させた。得られた溶液を７０μｍナイロン製セルストレイナー（Ｆａｌｃｏｎ）に通過させて脳細胞を含んだ濾液を得た。この濾液を１０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を吸引除去した。得られたペレットを上記で調製した培地に再懸濁した。得られた懸濁液はＮＣＳを含んでいた。
【０１２４】
懸濁液から得た細胞を３０μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした６穴プレートに７５細胞／ｍｍ2の密度で播種した。この細胞を３７℃、５％ＣＯ2、相対湿度９５％の条件で培養した。培地には０．６３μｇ／ｍＬのＮＢＭ−ＨＤ−１を加え、１μｌのＤＭＳＯを含む培地をコントロールとして用いた。培養後の分化した細胞は皮質ニューロンと呼ばれる。
【０１２５】
６日間の培養後、細胞を生きたまま顕微鏡で観察した。６つの視野におけるニューロンの神経突起の長さを測定して平均をとった。図１２に示されるようにＮＢＭ−ＨＤ−１は神経突起伸長を促進した。図１２では、実験群（図１２（Ａ）−ｂ）の神経突起の長さはコントロール群（図１２（Ａ）−ａ）と比較して長くなっている。神経突起の長さを測定した結果、実験群の神経突起の平均の長さは比較群よりも長いことが示された（図１２（Ｂ））。
【０１２６】
実施例１７：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−２）による癌細胞増殖の阻害
ＭＣＦ−７癌細胞を６穴プレートに３×１０5細胞／ウェルの細胞密度で播種した。２４時間後に、細胞を異なる濃度の化合物ＮＢＭ−ＨＤ−２及びポジティブコントロールとして４ｍＭの酪酸ナトリウムで処理した。細胞を７２時間後に観察、計数した。図１３に示されるように、ＮＢＭ−ＨＤ−２はＭＣＦ−７癌細胞の増殖を著しく阻害し、細胞の形態を変化させた。図１３（Ａ）に示されるように、細胞を２．５μｇ／ｍＬ（図１３（Ａ）−ｃ）、５μｇ／ｍＬ（図１３（Ａ）−ｄ）、７．５μｇ／ｍＬ（図１３（Ａ）−ｅ）、及び１０μｇ／ｍＬ（図１３（Ａ）−ｆ）のＮＢＭ−ＨＤ−２の存在下で７２時間培養することにより、ＭＣＦ−７細胞の細胞密度はコントロール（図１３（Ａ）−ａ）と比較して大幅に低下した。実験群のＭＣＦ−７細胞の形態はコントロール群の細胞と比較して変化した。図１３（Ａ）は、４ｍＭの酪酸ナトリウムによってＭＣＦ−７細胞の増殖が阻害されたことを示す。細胞計数の結果（図１３（Ｂ））は、ＮＢＭ−ＨＤ−２は酪酸ナトリウムと同様、細胞の増殖を阻害したことを示している。これらの結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−２が用量依存的にＭＣＦ−７癌細胞の増殖を阻害し、その形態変化を引き起こすことを示すものである。
【０１２７】
実施例１８：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−３）による癌細胞増殖の阻害
ＭＣＦ−７癌細胞を６穴プレートに３×１０5細胞／ウェルの細胞密度で播種した。２４時間後に、細胞を異なる濃度の化合物ＮＢＭ−ＨＤ−３及びポジティブコントロールとして４ｍＭの酪酸ナトリウムで処理した。細胞を７２時間後に観察、計数した。図１４に示されるように、ＮＢＭ−ＨＤ−３はＭＣＦ−７癌細胞の増殖を著しく阻害し、細胞の形態を変化させた。図１４（Ａ）に示されるように、細胞を２．５μｇ／ｍＬ（図１４（Ａ）−ｃ）、５μｇ／ｍＬ（図１４（Ａ）−ｄ）、７．５μｇ／ｍＬ（図１４（Ａ）−ｅ）、及び１０μｇ／ｍＬ（図１４（Ａ）−ｆ）のＮＢＭ−ＨＤ−３の存在下で７２時間培養することにより、ＭＣＦ−７細胞の細胞密度はコントロール（図１４（Ａ）−ａ）と比較して大幅に低下した。実験群のＭＣＦ−７細胞の形態はコントロール群の細胞と比較して変化した。図１４（Ａ）は、４ｍＭの酪酸ナトリウムによってＭＣＦ−７細胞の増殖が阻害されたことを示す。細胞計数の結果（図１４（Ｂ））は、ＮＢＭ−ＨＤ−３は酪酸ナトリウムと同様、細胞の増殖を阻害したことを示している。これらの結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−３が用量依存的にＭＣＦ−７癌細胞の増殖を阻害し、その形態変化を引き起こすことを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】異なる濃度のＮＢＭ−ＨＤ−１で処理したラットグリオーマＣ６細胞の顕微鏡写真を示す。
【図２】ＦＡＣＳｃａｎサイトメトリーによって分析したラットグリオーマＣ６細胞のＤＮＡ含量を示す。
【図３】異なる用量のＮＢＭ−ＨＤ−１で処理したラットグリオーマＣ６細胞の細胞周期における各遺伝子の電気泳動像を示す。
【図４】ＮＢＭ−ＨＤ−１で処理したラットグリオーマＣ６細胞の免疫蛍光染色写真及びＲＴ−ＰＣＲデータを示す。
【図５】ＮＢＭ−ＨＤ−１及び酪酸ナトリウムで処理したラットグリオーマＣ６細胞のウェスタンブロット像を示す。
【図６】ＮＢＭ−ＨＤ−１及び酪酸ナトリウムで処理したラットグリオーマＣ６細胞におけるＨＤＡＣの相対的な活性阻害を示す。
【図７】異なる用量のＮＢＭ−ＨＤ−１で処理したヒト神経膠芽腫細胞ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧの顕微鏡写真を示す。
【図８】異なる用量のＮＢＭ−ＨＤ−１で処理したヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７の顕微鏡写真を示す。
【図９】ＮＢＭ−ＨＤ−１による用量依存的な調節によって細胞周期がＧ０／Ｇ１期で停止することによってＭＣＦ−７細胞の増殖が著しく阻害された結果を示す。
【図１０】ＮＢＭ−ＨＤ−１が用量依存的にｐ２１WAF1/CIP1遺伝子の発現を増大させた結果を示す。
【図１１】ＮＢＭ−ＨＤ−１で処理したＭＣＦ−７細胞のウェスタンブロット像を示す。
【図１２】ＮＢＭ−ＨＤ−１で処理した皮質ニューロンの神経突起伸長の顕微鏡写真を示す。
【図１３】異なる濃度のＮＢＭ−ＨＤ−２で処理したヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞の顕微鏡写真を示す。
【図１４】異なる濃度のＮＢＭ−ＨＤ−３で処理したヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞の顕微鏡写真を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）に関連した疾患、特に腫瘍や細胞増殖性疾患の予防剤または治療剤として有用な新規化合物に関する。本発明の化合物は神経突起伸長を促進する薬剤としての使用も可能である。本発明の化合物は特に抗神経変性疾患やヒト脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に対する薬剤として使用することが可能である。
【背景技術】
【０００２】
真核生物のＤＮＡは核内で高度に組織化、パッケージングされている。こうした組織化及びパッケージングは、コアヒストンであるＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４などのタンパク質がＤＮＡに付加し、ＤＮＡとともにクロマチンと呼ばれる複雑な構造を形成することによって行われる。コアヒストンの修飾はクロマチンの立体構造の変化にとって極めて重要である。アセチル化の程度は転写活性と関係しており、アセチル化によってクロマチンは開放型の立体構造をとり、転写装置がプロモーターにアクセスすることが可能となる。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）及びヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）は、コアヒストンタンパク質のアミノ末端付近に位置するリシンのε−アミノ基を選択的にアセチル化または脱アセチル化することによって転写に影響を及ぼす酵素である。ＨＤＡＣは１１種類（アイソフォーム）の酵素からなるファミリーであり、遺伝子の発現制御に関与していることから、癌などの多くの疾患におけるマスター調節因子として働くと考えられている。ＨＤＡＣの欠損は広範な癌との関連が指摘されてきた。ＨＤＡＣ酵素またはそのアイソフォームは多くの異なるタイプの癌と関連しているものと思われる。
【０００３】
固形及び血液悪性腫瘍の治療への応用が期待される新しい抗癌剤としてヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤が注目を浴びている。近年、多様な構造を有するＨＤＡＣ阻害剤が数多く発見されているが、これらは培養または動物モデルにおいて腫瘍細胞の増殖を阻害し、分化やアポトーシスを誘導するものである。ＨＤＡＣが阻害されるとアセチル化された核内ヒストンが腫瘍及び正常組織に蓄積することから、生体内でのＨＤＡＣ阻害剤の生物学的活性の代用マーカーとなる。ＨＤＡＣ阻害剤の遺伝子発現に対する作用は極めて選択性が高く、サイクリン依存型キナーゼ阻害剤であるｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１など特定の遺伝子の転写を活性化する一方で他の遺伝子の発現を抑制する。ＨＤＡＣの阻害によってヒストン以外にも、ｐ５３、ＧＡＴＡ−１及びエストロゲン受容体アルファなどの転写因子がアセチル化される。非ヒストンタンパク質のアセチル化の機能的な意義、ならびにＨＤＡＣ阻害剤が腫瘍細胞の増殖停止、細胞分化、及び／又はアポトーシスを誘導する詳細な機序は、現在、重点的な研究の対象となっている。現在臨床試験において効果が認められているＨＤＡＣ阻害剤は、新たな作用機序に基づく効果が期待される、分子を標的とする抗腫瘍剤である。
【０００４】
メディシナルリサーチレビュー誌（Medicinal Research Reviews, Vol. 26, No. 4, pp. 397-413, 2006）に掲載のレビュー論文によると、これまでに、短鎖脂肪酸、ヒドロキサム酸、ベンズアミド、環状ペプチドの、４つのＨＤＡＣ阻害剤のクラスが報告されている。ヒドロキサム酸系のハイブリッド極性化合物（ＨＰＣ）はＨＤＡＣの阻害剤であり、マイクロモル以下の濃度で細胞分化を誘導する（Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, No. 15, August 2, 2000, pp. 1210-1216）。米国特許第６，１７４，９０５号、欧州特許第０８４７９９２号、日本国特許第２５８８６３／９６号ならびに日本国特許出願第１０１３８９５７号の各明細書には、細胞分化を誘導し、ＨＤＡＣを阻害するベンズアミド誘導体が公開されている。国際公開第ＷＯ０１／３８３２２号パンフレットには、ＨＤＡＣ阻害剤として作用する更なる化合物が公開されている。Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ誌（2006, 120, pp. 101-110）には、ベンズアミドであるＭ３４４によって、ＳＭＡ患者由来の繊維芽細胞におけるＳＭＮ２タンパク質の発現が処置後６４時間後に最大で７倍にアップレギュレートされる報告がなされている。酪酸ナトリウムによって、脊髄及び延髄筋萎縮症のトランスジェニックマウスモデルにおける表現型の発現が改善することが報告されている（Human Molecular Genetics, 2004, Vol. 13, No. 11, pp. 1183-1192）。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンＡは、ＭＣＦ−７乳癌細胞においてサイクリンＤ１のユビキチン依存性分解を誘導することが示されている（Molecular Cancer 2006, 5:8; 当該論文は下記にて参照することができる（http://www.molecular-cancer.com/content/5/1/8））。米国特許第７，１６９，８０１号明細書には、式Ｚ−Ｑ−Ｌ−ＭまたはＺ−Ｌ−Ｍで表されるヒストンデアセチラーゼの阻害に用いることが可能な化合物が開示されている。米国特許第６，８８８，０２７号明細書には、ＰＸＤ１０１などのスルフォンアミド系ＨＤＡＣ阻害剤のファミリーが開示されている。欧州特許第ＥＰ１３０１１８４号明細書には、固形腫瘍の治療におけるバルプロ酸及びその誘導体のＨＤＡＣ阻害剤としての使用が開示されている。
【０００５】
しかしながら、癌の予防または治療用の新たなＨＤＡＣ阻害剤の開発が依然として望まれている。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の目的は下記式（Ｉ）にて表される化合物群、ならびに薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物を提供することにある。
【０００７】
【化１】
【０００８】
本発明の化合物は、神経突起伸長の促進剤、及びＨＤＡＣに関連した疾患、特に腫瘍や細胞増殖性疾患の予防剤または治療剤として有用である。本発明の化合物は特に抗神経変性疾患やヒト脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に対する薬剤として使用することが可能である。
【０００９】
本発明は、神経突起伸長の促進剤、及びＨＤＡＣに関連した疾患、特に腫瘍や細胞増殖性疾患の予防剤または治療剤として有用なプロポリン類に由来する新規化合物に関するものである。本発明の化合物は細胞の分化経路を介して癌細胞の増殖を阻害する作用を有する。本発明の化合物は特に抗神経変性疾患やヒト脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に対する薬剤として使用することが可能である。
【００１０】
〔本発明の化合物〕
すなわち、本発明は下記式（Ｉ）によって表される化合物：
【化１】
［式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、Ｏ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｓ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｎ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｏ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｓ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｎ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、アルキル、アルキレニル、アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、または、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個の環へテロ原子を含む飽和または不飽和の５〜１０員複素環基であるか；またはＲ1及びＲ2は共にジオキソランを形成し；
Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、Ｏ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｓ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｎ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｏ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｓ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｎ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、アルキル、アルキレニル、アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、または、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個の環へテロ原子を含む飽和または不飽和の５〜１０員複素環基であり；
Ｒ5は、Ｃ4-16アルキルまたはＣ4-16アルケニルであり（ただし該アルキルまたはアルケニルは非置換もしくは、１以上のＣ1-6アルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ、Ｎ3、ＮＨ2、ＣＨＯ、ＯＲ9、ＳＲ9、ＮＲ9またはＣＯＯＲ9によって置換される）；
Ｒ6は、Ｃ2-12アルキルまたはＣ2-12アルケニルであるか（ただし該アルキルまたはアルケニルは非置換もしくは、１以上のＣ1-6アルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ、Ｎ3、ＮＨ2、ＣＨＯ、ＯＲ9、ＳＲ9またはＮＲ9によって置換される）；またはＲ5及びＲ6の一方は水素、ハロゲンまたはＯＨであり、他方は非置換もしくは１以上のＣ1-6アルキル、ＯＨ、ＮＨ2、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯまたはＮ3によって置換されるＣ4-16アルキルまたはＣ4-16アルキレンであり；
Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ2、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、ＣＮ、ＮＯ、非置換またはＯＨ、ＮＨ2、ＣＯＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯまたはＣＨＯによって置換されたＣ1-6アルキル、＝Ｏ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルまたはＮ−アルキニルであるか、またはＲ7及びＲ8は共に二重結合、Ｃ3-6シクロアルキルまたはＮ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個のへテロ原子を含む５〜１０員の複素環基を形成し；
Ｒ9はフェニル、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ10またはベンジルであり；
Ｒ10はＯＨ、ＮＨＯＨ、ＮＨ2、Ｃ1-6アルキル、フェニルまたはベンジルである；（ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＯＨである場合、Ｒ5は、
【化２】
ではなく、かつＲ6は、
【化３】
またはＨのいずれでもない；またはＲ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＯＨであり、かつＲ5がＨである場合、Ｒ6は、
【化４】
または、
【化５】
のいずれでもない）］ならびに薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物に関する。
【００１１】
本明細書の文脈において「アルキル」なる語は、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖を意味する。アルキルは好ましくはＣ1-10アルキルである。好ましくはアルキルの炭素数は１〜８からなる群から選択される。より好ましいアルキルはＣ1-6アルキルまたはＣ1-4アルキルである。アルキル基の例としては、メチル（−ＣＨ3）、エチル（−ＣＨ2ＣＨ3）、プロピル（−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）、イソプロピル（−（ＣＨ3）2ＣＨ）及びブチル（−Ｃ4Ｈ9）が挙げられる。
【００１２】
本明細書の文脈において「アルケニル」なる語は、直鎖及び分枝鎖の不飽和炭化水素基を意味する（不飽和結合は二重結合としてのみ存在する）。本発明においてはアルケニルは１以上の二重結合を含む。アルケニルはＣ2-16アルケニルであることが好ましい。より好ましくはアルケニルの炭素数は２〜１２からなる群から選択される。アルケニル基の例としては、エテニル（−ＣＨ＝ＣＨ2）、プロペニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ3または−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）、ブテニル（−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ3、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ3または−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）、−ＣＨ2ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ3、及び−ＣＨ2−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ3）−ＣＨ3が挙げられる。
【００１３】
本明細書の文脈において「アルキニル」なる語は、直鎖及び分枝鎖の不飽和炭化水素基を意味する（不飽和結合は三重結合としてのみ存在する）。好ましくはアルキニルの炭素数は２〜８からなる群から選択される。より好ましいアルキニルはＣ2-6アルキニルまたはＣ2-4アルキニルである。アルキニル基の例としてはプロピニル（例、−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ）が挙げられる。
【００１４】
本明細書の文脈において「シクロアルキル」なる語は、脂環式環（飽和炭素環）を意味する。好ましくはシクロアルキルの炭素数は３〜８からなる群から選択される。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルが挙げられる。
【００１５】
本明細書の文脈において「不飽和の５〜１０員単環式または２環式基」なる語は、不飽和かつ５〜１０員の単環式または２環式（縮合環など）環系を意味し、その例としてはフェニル及びナフチルが挙げられる。
【００１６】
本明細書の文脈において「Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個の環へテロ原子を含む飽和または不飽和の５〜１０員複素環基」なる語は、ニトロ、ヒドロキシル、オキソ、ハロゲン、カルボキシル、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルカルボニル、Ｃ1-6アルコキシカルボニル及びフェニルから選択される少なくとも１個の置換基によってそれぞれが置換されていてもよい窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも１個の環へテロ原子を含む飽和または不飽和の５〜１０員複素環系を意味する。複素環基の例としては、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロイル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チエニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなどが含まれる。
【００１７】
本明細書の文脈において「ハロゲン」なる語は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を意味する。
【００１８】
本明細書の文脈における「薬学的に許容される塩」なる語には、有機及び無機の酸及び塩基と形成される塩が含まれる。薬学的に許容される酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸などの無機酸、ならびに、クエン酸、酒石酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、琥珀酸、蓚酸、蟻酸、フマル酸、マレイン酸、オキザロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸及びイセチオン酸などの有機酸が挙げられる。薬学的に許容される塩基塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩やマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、及び１級、２級、及び３級アミン塩などの有機塩基との塩が挙げられる。
【００１９】
本明細書の文脈において「プロドラッグ」なる語は、血中で加水分解されることなどによって体内で薬理作用を有する活性型に変換される化合物を意味する。
【００２０】
本明細書の文脈において「溶媒和物」なる語は、本発明の化合物と溶媒とからなる複合体であって、本発明の化合物と溶媒とが反応しているか、これらが沈殿または析出される複合体を意味する。
【００２１】
本明細書の文脈において「立体異性体」なる語は、結合する原子は同じであるが原子の空間的配置が異なる異性体分子を指す。
【００２２】
本明細書の文脈において「エナンチオマー」なる語は、左手と右手が「同じ」であるけれども反対であるように、互いに重ね合わせることのできない鏡像関係にある立体異性体を指す。
【００２３】
本発明の式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ1-6アルキル、ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ1-6アルキル、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルであるか、またはＲ1とＲ2とは互いにジオキサレンを形成する。より好ましくはＲ1及びＲ2はそれぞれ独立して、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ3、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルである。
【００２４】
本発明の式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立して、ＯＨ、ＯＣ1-6アルキル、ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ1-6アルキル、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルである。より好ましくはＲ3及びＲ4はそれぞれ独立して、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ3、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルである。
【００２５】
本発明の式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、好ましくはＲ5は下式のいずれかである。
【００２６】
【化２】
【００２７】
【化５】
【００２８】
【化８】
【００２９】
【化９】
【００３０】
【化１０】
【化１５】
または、
【化１７】
本発明の式（Ｉ）の化合物の一実施形態では、好ましくはＲ6は下式のいずれかである。
【化１８】
【化１９】
【００３１】
【化２３】
【００３２】
【化２９】
【００３３】
【化３０】
または
【化３１】
【００３４】
本発明によれば、本発明の式（Ｉ）で表される好ましい化合物は、
【００３５】
【化３２】
【００３６】
【化３３】
【００３７】
【化３４】
【００３８】
【化３５】
【００３９】
【化３６】
【００４０】
【化３７】
【００４１】
【化３８】
【００４２】
【化３９】
【００４３】
【化４０】
【００４４】
【化４１】
【００４５】
【化４２】
【００４６】
【化４３】
【００４７】
【化４４】
【００４８】
【化４５】
【００４９】
【化４６】
【００５０】
【化４７】
【００５１】
【化４８】
【００５２】
【化４９】
【００５３】
【化５０】
及び
【化５１】
からなる群から選択される。
【００５４】
本発明は更に、式（Ｉ）の化合物にもとづく下式（ＩＩ）で表される立体異性体に関する。
【００５５】
【化５７】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は式（Ｉ）と同様に定義される。）
【００５６】
本発明のより好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は下式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）で表されるものである。
【００５７】
【化３２】
【００５８】
【化４８】
（ＩＶ）
【００５９】
【化５１】
（Ｖ）
【００６０】
【化５２】
（ＶＩ）
【００６１】
本発明によれば、式（Ｉ）の化合物はＨＤＡＣを阻害する作用を有することからヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）に関連する疾患の予防剤または治療剤として使用することが可能である。更に本発明の化合物は、ラットＣ６グリオーマ、ヒト神経膠芽腫、ヒト乳癌細胞、ヒト白血病細胞及びヒトメラノーマ細胞などの複数の癌細胞系列の増殖を著しく阻害する。癌細胞の増殖を阻害する機序は、細胞の分化経路、特に誘導分化ならびにｐ２１やサイクリンＢ１などにみられるような細胞周期調節遺伝子の発現の調節を介したものと考えられる。更に本発明の式（Ｉ）の化合物は、神経幹細胞のニューロン分化を媒介することから抗神経変性疾患に対する薬剤として使用することが可能である。
【００６２】
本発明の化合物を治療目的で使用する場合、投与される用量は、用いられる化合物、投与形態、望ましい治療法、及び対象となる疾患に応じて無論異なる。式（Ｉ）の化合物の日用量は、１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲でよい。本発明は、ＨＤＡＣを阻害する方法、患者の腫瘍または細胞増殖性疾患、神経変性疾患及びヒト脊髄性筋萎縮症を治療する方法、ならびに神経突起伸長を促進する方法を提供するものであって、本発明の化合物の治療上の有効量を患者に投与することからなる方法を提供するものである。
【００６３】
〔本発明の式（Ｉ）の化合物の一般的合成法〕
本発明の化合物はいずれの従来法によって調製してもよい。これらの化合物の好適な合成法は実施例において述べる。一般的に式（Ｉ）の化合物は、以下に述べる合成スキームのいずれかにしたがって調製することができる。
【００６４】
【化５８】
（スキーム１）
【００６５】
【化５９】
（スキーム２）
【００６６】
【化６０】
（スキーム３）
【００６７】
【化６１】
（スキーム４）
【００６８】
【化６２】
（スキーム５）
【００６９】
【化６３】
（スキーム６）
【００７０】
【化６４】
（スキーム７）
【００７１】
【化６５】
（スキーム８）
【００７２】
【化６６】
（スキーム９）
【００７３】
式（Ｉ）の化合物のＲ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4のメチル化は、以下の手順で行うことができる。すなわち、反応物であるＫ2ＣＯ3とアセトンをＭｅ2ＳＯ4（ＤＭＳ）と混合し、溶液を加熱攪拌する。得られた溶液を一定時間、制御雰囲気下（例、Ｎ2下）で還流し、有機溶媒を除去した後、残渣を特定の有機溶液に溶解してこれを水で洗い、減圧下で有機層を蒸発させてから生成物をシリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン＝１：４）で精製する。
【００７４】
Ｒ5またはＲ6への二重結合の付加は、以下の手順で行うことができる。すなわち、反応物のＴＨＦ溶液を氷浴中、Ｈ2ＳＯ4に加えた後、溶液を一定時間攪拌してから水で希釈する。得られた混合物を適当な有機溶液（例、ＣＨ2Ｃｌ2）で抽出し、有機層を合わせて減圧下で蒸発させ、得られた残渣をシリカゲルカラム（０〜３％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）で精製する。
【００７５】
化合物６ａ〜ｅ及び７ａ〜ｅの調製法をスキーム１及びスキーム２として示した。プロポリンＧは、当該技術分野では周知のプロポリン誘導体であり、適当な反応条件下で、メチル化、アセチル化、位置選択的なメチル化、及びベンジル化を行うことによって化合物２〜５をそれぞれ生成する。次いで化合物１〜５を酸の存在下で水和することで標的化合物であるジヒドロフラボン６ａ〜ｅをそれぞれ得る。化合物１〜５をヨードベンゼンジアセタートで酸化した後、酸の存在下で水和することで対応する各フラボン７ａ〜ｅを得る。
【００７６】
化合物１０ａ〜ｅ及び１２ａ〜ｅはスキーム３に示したように調製した。化合物１〜５を水素化ホウ素ナトリウムで還元し、脱水反応を行うことによって対応する化合物９ａ〜ｅを得た。化合物９ａ〜ｅを酸存在下で水和することにより標的化合物である１０ａ〜ｅをそれぞれ得た。化合物９ａ〜ｅをＭＣＰＢＡでエポキシ化することによってエポキシド１１ａ〜ｅが得られ、次いでメチルアミン、エチルアミン、及びべンジルアミンなどの対応するアミンを用いた求核反応によって標的化合物である１２ａ〜ｅをそれぞれ得た。
【００７７】
化合物１４〜１７はスキーム４に示したようにして合成した。化合物１０ｂを光延反応させることにより所望のアジド１３が得られ、次いでナトリウム反応を行ってこのアジドを３級アミン１４に変換した。化合物１０ｂの三臭化リンによる臭素化、フェノールチオール（ＰｈＳＨ）によるチオール化、及び塩化チオニルによる塩素化によって臭化物１５、チオールエーテル１７、及び塩化物１６をそれぞれ得た。
【００７８】
化合物１８ａ〜ｄ及び１９ａ〜ｄはスキーム５に示したようにして合成した。化合物１０ｂを、アセチル、プロピオニル、ベンゾイル及びイソブチリルなどの対応した塩化アシルでアシル化することにより化合物１８ａ〜ｄをそれぞれ得た。化合物１０ｂを、ヨウ化メチル、エチル、ベンジル、及びイソプロピルなどの対応したヨウ化アルキルでアルキル化することにより化合物１９ａ〜ｄをそれぞれ得た。
【００７９】
化合物２２はスキーム６に示したようにして合成した。化合物６ｂの３級アルコールを水素化ナトリウム条件下でブロモ酢酸エチルと反応させることによって化合物２０を得た。化合物２０を塩基存在下で加水分解することにより化合物２１が得られ、次いでヒドロキシアミンと反応させることによってヒドロキサム酸２２を得た。
【００８０】
ヒドロキサム酸２８ａ〜ｅはスキーム７に示したようにして調製した。化合物１を酸性条件下でオルト蟻酸トリメチルと反応させることによりアセトニド２３を得、次いでメチル、イソプロピル及びベンジルなどのヨウ化アルキルによるアルキル化か、塩化ベンゾイル及び無水酢酸によるアセチル化によって化合物２４ａ〜ｅをそれぞれ得た。化合物２４ａ〜ｅの２種類の末端オレフィンを酸存在下で水和反応させることにより化合物２５ａ〜ｅを得、次いでブロモ酢酸エチルと反応させることによって化合物２６ａ〜ｅを得た。化合物２６ａ〜ｅを塩基存在下で加水分解することにより化合物２７ａ〜ｅを得、次いでヒドロキシアミンと反応させることでヒドロキサム酸２８ａ〜ｅをそれぞれ得た。
【００８１】
〔本発明の医薬組成物〕
式（Ｉ）の化合物ならびに薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物はそれ自体でも使用可能であるが、一般的には式（Ｉ）の化合物／塩／溶媒和物（有効成分）を薬学的に許容される補助剤、希釈剤または担体と組み合わせた医薬組成物として投与される。投与形態に応じ、医薬組成物は、１０〜３０ｗｔ％（重量パーセント）、より好ましくは３０〜５０ｗｔ％、更に好ましくは５０〜７０ｗｔ％、更により好ましくは７０〜１００ｗｔ％の有効成分を含有する（重量％はすべて全組成物に対して）。更に本発明の医薬組成物は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）に関連した疾患の他の予防剤または治療剤を含有していてもよい。
【００８２】
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、散剤や顆粒剤による経口投与溶液や懸濁液による非経口投与、皮下投与、坐剤による直腸内投与、経皮投与によって全身的に投与することが可能である。
【００８３】
本発明の化合物ならびに医薬組成物はＨＤＡＣ阻害剤であり、細胞内に長期にわたって保持され、ヒストンＨ４のアセチル化を継続的に誘導する。本発明の化合物ならびに医薬組成物は細胞及び神経幹細胞の分化を誘導するＨＤＡＣ阻害剤である。更に本発明の化合物は、ＨＤＡＣ活性を大きく阻害する。本発明の化合物は細胞のＳ期及びＧ２／Ｍ期を用量依存的に大幅に短縮し、癌細胞の形態を変化させる。したがって本発明の化合物によって腫瘍や細胞増殖性疾患を治療することが可能である。更に本発明の化合物によって神経突起伸長を促進し、神経変性疾患やヒト脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療することが可能である。
【００８４】
〔実施例〕
以下、実施例で本発明の化合物の好ましい合成法及び使用法を説明する。
【００８５】
実施例１：３'４'５，７−テトラメチル−プロポリンＧ（２）の調製
プロポリンＧ（化合物１，５ｇ，１０．１６ｍｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（１６．２７ｇ，１１７．８９ｍｍｏｌ）及びアセトン（２８０ｍＬ）の混合物にＭｅ2ＳＯ4（１５．７６ｍＬ，１２６ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を窒素雰囲気下で２４時間、加熱還流した。有機溶媒を除去し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（８０ｍＬ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（４０ｍＬｘ３）で洗った。ＣＨ2Ｃｌ2層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン＝１：６）で精製して化合物２（４．００ｇ，７２％）を得た。
【００８６】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.26 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.86 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.27 (1H, s), 5.50 (1H, dd, J=2.5, 13.5 Hz), 5.14-5.11 (1H, m), 5.11-5.10 (1H, m), 5.02-4.99 (1H, m), 3.87 (3H, s), 3.83 (3H, s), 3.79 (6H, s), 3.50 (1H, dd, J=6.6, 15.2 Hz), 3.43 (1H, dd, J=5.8, 15.2 Hz), 3.00 (1H, dd, J=13.5, 16.7 Hz) , 2.68 (1H, dd, J=2.6, 16.7 Hz), 2.00-1.92 (2H, m), 1.75 (3H, s), 1.70 (3H, s), 1.65 (3H, s), 1.60 (3H, s), 1.52 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 189.4 (s), 164.0 (s), 163.3 (s), 159.6 (s), 153.0 (s), 147.2 (s), 135.6 (s), 134.2 (s), 131.5 (s), 131.3 (s), 129.8 (s), 124.1 (d), 122.8 (d), 122.7 (d), 122.1 (d), 118.2 (s), 110.3 (d), 108.7 (s), 95.6 (d), 75.9 (d), 61.8 (q), 60.7 (q), 55.7 (q), 55.7 (q), 45.1 (t), 39.6 (t), 26.6 (t), 25.7 (q), 25.6 (q), 24.9 (t), 22.0 (t), 17.7 (q), 17.6 (q), 16.3 (q); HREIMS C34H44O6 (M)として計算値：548.3142, 実測値：548.3140.
【００８７】
実施例２：６−（２−ヒドロキシ−２−メチルブチル）−２'−（７−ヒドロキシ−３，７−ジメチルオクト−２−エニル）−３’，４’，５，７−テトラメトキシフラバノン（６ｂ）の調製
氷浴中、化合物２（７ｇ，１２．７７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１７０ｍｌ）に、４９％Ｈ2ＳＯ4（１４０ｍＬ）を加えた。全量を加えた後、反応溶液を室温で８時間攪拌し、Ｈ2Ｏで希釈した。この反応溶液をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬｘ３）で抽出した。有機層を合わせてＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１〜１：３）で精製して純粋な油状物６ｂを得た（２．３０ｇ，３４％）。
【００８８】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.27 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.87 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.28 (1H, d, J=2.6 Hz), 5.49 (1H, dd, J=2.4, 13.6 Hz), 5.05 (1H, t, J=6.0 Hz), 3.87 (3H, s), 3.84 (3H, s), 3.79 (6H, s), 3.52 (1H, dd, J=5.5, 15.2 Hz), 3.43 (1H, dd, J=7.6, 15.2 Hz), 2.97 (1H, dd, J=8.0, 16.7 Hz), 2.70-2.59 (3H, m), 1.93 92H, t, J=6.4 Hz), 1.65 (3H, s), 1.64-1.60 (2H, m), 1.41-1.32 (4H, m), 1.25 (6H, s), 1.15 (3H, s), 1.14 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) 189.4 (s), 164.0 (s), 163.3 (s), 159.6 (s), 153.0 (s), 147.2 (s), 135.6 (s), 134.2 (s), 131.5 (s), 131.3 (s), 129.8 (s), 124.1 (d), 122.8 (d), 122.7 (d), 122.1 (d), 118.2 (s), 110.3 (d), 108.7 (s), 95.6 (d), 75.9 (d), 61.8 (q), 60.7 (q), 55.7 (q), 55.7 (q), 45.1 (t), 39.6 (t), 26.6 (t), 25.7 (q), 25.6 (q), 24.9 (t), 22.0 (t), 17.7 (q), 17.6 (q), 16.3 (q); HREIMS C34H48O8 (M)として計算値：584.3338, 実測値：584.3344.
【００８９】
実施例３：６−ゲラニル−３’，４’，５，７−テトラメトキシフラバノン（３０）の調製
化合物２９（プロポリンＣ，１２８ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（４３１ｍｇ，３．１ｍｍｏｌ）及びアセトン（１５ｍＬ）の混合物にＭｅ2ＳＯ4（０．２５ｍＬ，２．４８ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を窒素雰囲気下で２４時間、加熱還流した。有機溶媒を除去した後、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（５０ｍＬｘ３）で洗った。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン＝１：４）で精製して化合物３３（１０７ｍｇ，７２％）を得た。
【００９０】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3), 6.99-6.97 (2H, m), 6.88 (1H, d, J=8.8 Hz), 6.31 (1H, s), 5.33 (1H, dd, J=2.8, 13.3 Hz), 5.11 (1H, td, J=1, 6.9 Hz), 5.04(1H, td, J=1.3, 5.5 Hz), 3.90 (3H, s, OMe), 3.88 (3H, s, OMe), 3.81 (3H, s, OMe), 3.80 (3H, s, OMe), 3.34 (1H, dd, J=7.2, 14.1 Hz), 3.26 (1H, dd, J=7.2, 14.1Hz), 3.02 (1H, dd, J=13.3, 16.7 Hz), 2.74 (1H, dd, J=2.8, 16.7 Hz), 2.04-2.00 (2H, m), 1.96-1.92 (2H, m), 1.74 (3H, s), 1.62 (3H, s), 1.55 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) ,189.1 (s), 164.1 (s), 163.0 (s), 159.4 (s), 149.5 (s), 149.4 (s), 131.3, 131.2 (s), 124.4 (d), 122.9 (d), 118.9 (d), 109.5 (d), 108.9 (s), 95.7 (d), 79.2 (q), 61.9 (q), 56.1 (q), 56.0 (q), 55.9 (q), 45.6 (t), 39.8 (t), 26.7 (t), 25.7 (s), 22.0 (t), 17.7 (q), 16.1 (q); HREIMS C29H36O6 (M)として計算値：480.2510, 実測値：480.2511.
【００９１】
実施例４：６−（２，６−ジヒドロキシ−２，６−ジメチル−オクチル）−３’，４’，５，７−テトラメトキシフラバノン（３１）の調製
氷浴中、化合物３０（８０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（６ｍｌ）に、４９％Ｈ2ＳＯ4（４ｍＬ）を加えた。全量を加えた後、反応溶液を室温で８時間攪拌し、Ｈ2Ｏで希釈した。この反応溶液をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬｘ３）で抽出した。有機層を合わせてＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（０〜３％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）で精製して純粋な油状物３１を得た（４４ｍｇ，５０％）。
【００９２】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.99-6.97 (2H, m), 6.88 (1H, d, J=8.8 Hz), 6.31 (1H, s), 5.33 (1H, dd, J=2.8, 13.3 Hz), 3.90 (3H, s, OMe), 3.88 (3H, s, OMe), 3.84 (3H, s, OMe), 3.82 (3H, s, OMe), 3.02 (1H, dd, J=13.3, 16 Hz), 2.75 (1H, dd, J=2.8, 16Hz), 2.62-2.58 (2H, m), 1.63-1.59 (7H, m), 1.49-1.48 (2H, m), 1.23 (3H, s), 1.22 (3H, s), 1.21 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) 189.1 (s), 164.1 (s), 163.0 (s), 159.4 (s), 149.5 (s), 149.4 (s), 131.2 (s), 119.0 (d), 118.9 (d), 111.3 (d), 109.5 (d), 108.9 (s), 95.8 (d), 72.9 (s), 71.1 (s), 62.1 (q), 56.0 (q), 55.9 (q), 45.5 (t), 44.5 (t), 42.3 (t), 42.1 (t), 41.5 (t), 29.4 (q), 29.3 (q), 26.9 (q), 26.8 (q), 18.8 (t), 17.5 (t); HREIMS (M-18)として計算値：498.2602, 実測値：498.2610.
【００９３】
実施例５：プロポリンＡ（３３）の調製
氷浴中、プロポリンＤ（化合物３２，１００ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（６ｍｌ）に、４９％Ｈ2ＳＯ4（４ｍＬ）を加えた。全量を加えた後、反応溶液を室温で８時間攪拌し、Ｈ2Ｏで希釈した。この反応溶液をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬｘ３）で抽出した。有機層を合わせてＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（０〜３％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）で精製して純粋な油状物３３を得た（４２ｍｇ，４０％）。
【００９４】
1H-NMR (400 MHz, MeOD) 6.87 (1H, d, J=8.4 Hz), 6.71 (1H, d, J=8.4 Hz), 5.88 (2H, dd, J=1.9, 3.3 Hz), 5.47 (1H, dd, J=2.6, 13 Hz), 5.12 (1H, dd, J=5.7, 6.7 Hz), 3.47 (2H, d, J=6.6 Hz), 3.10 (1H, dd, J=13.4, 17 Hz) , 2.60 (1H, dd, J=2.7, 17.1 Hz), 1.94 (1H, dd, J=6.6, 13.4 Hz), 1.64 (1H, d, J=0.5 Hz), 1.43-1.41 (2H, m), 1.37-1.34 (2H, m), 1.13 (3H, s), 1.12 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) ,198.2 (s), 168.5 (s), 168.4 (s), 165.5 (s), 165.4 (s), 165.2 (s), 146.5 (s), 144.5 (s), 135.8 (s), 129.7 (s), 128.2 (s), 124.7 (d), 118.7 (d), 113.6 (d), 103.2 (s), 97.1 (d), 96.2 (d),77.8 (d), 71.5 (s), 44.3 (t), 43.7 (t), 41.2 (t), 29.2 (q), 29.1 (q), 25.4 (t), 23.7 (t), 16.2 (t).
【００９５】
実施例６：３'，４'，５，７−テトラアセチルプロポリンＤ（３４）
プロポリンＤ（化合物３２，１２４ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（４ｍＬ）に無水酢酸（２ｍＬ）を加え、この反応溶液を室温で６時間攪拌した。反応溶液にＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）を加え、０．１Ｎ ＨＣｌ（１０ｍＬｘ３）で洗った。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ＣＨ2Ｃｌ2）で精製して純粋な油状物３４（１３９ｍｇ，８０％）を得た。
【００９６】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 7.49 (1H, d, J=8.6 Hz), 7.18 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.72 (1H, d, J=2.2 Hz), 6.53 (1H, d, J=2.2 Hz), 5.60 (1H, dd, J=2.5, 13.8 Hz), 5.01 (1H, td, J=5.3, 4.6 Hz), 4.94 (1H, td, J=1.0, 5.8 Hz), 3.35 (1H, dd, J=7.1, 15.7 Hz), 3.26 (1H, dd, J=5.3, 15.5 Hz) , 2.98 (1H, dd, J=13.8, 16.8 Hz), 2.36 (3H, s), 2.27 (6H, s), 2.26 (s, 3H), 2.02-1.91 (5H, m), 1.64 (3H, s), 1.62 (3H, s), 1.55 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) ,188.8 (s), 169.2 (s), 168.1 (s), 168.0 (s), 167.9 (s), 163.2 (s), 155.9 (s), 151.3 (s), 142.8 (s), 140.9 (s), 137.0 (s), 135.2 (s), 133.5 (s), 131.6 (s), 124.5 (d), 123.9 (d), 121.6 (d), 120.7 (d), 111.6 (s), 110.7 (d), 109.0 (d), 76.1 (d), 44.8 (t), 39.4 (t), 26.5 (t), 25.6 (t), 25.5 (q), 21.1 (q), 21.0 (q), 20.7 (q), 20.3 (q),17.7 (q), 16.3 (q).
【００９７】
実施例７：３'，４'，５，７−テトラメチルプロポリンＤ（３５）
化合物３２（１２８ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（４３１ｍｇ，３．１ｍｍｏｌ）及びアセトン（１５ｍＬ）の混合物にＭｅ2ＳＯ4（０．２５ｍＬ，２．４８ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を窒素雰囲気下で２４時間、加熱還流した。有機溶媒を除去した後、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（５０ｍＬｘ３）で洗った。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン＝１：４）で精製して化合物３５（１０７ｍｇ，７２％）を得た。
【００９８】
H-NMR (400 MHz, CDCl3) 7.26 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.85 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.10 (1H, d, J=2.3 Hz), 6.07 (1H, d, J=2.3 Hz), 5.34 (1H, dd, J=2.6, 13.5 Hz), 5.04 (1H, td, J=5.3, 4.6 Hz), 4.99 (1H, td, J=1.0, 5.8 Hz), 3.88 (3H, s), 3.86 (3H, s) , 3.80 (3H, s), 3.74 (3H, s), 3.46 (1H, dd, J=6.6, 15.2 Hz), 3.44 (1H, dd, J=5.8, 15.2 Hz), 3.02 (1H, dd, J=13.5, 16.5 Hz), 2.69 (1H, dd, J=2.6, 16.5 Hz), 2.00-1.97 (2H, m), 1.94-1.92 (2H, m), 1.65 (3H, s), 1.60 (3H, s), 1.52 (3H, s).
【００９９】
実施例８：３'，４'，７−Ｏ−トリメチルプロポリンＧ（４）
【０１００】
【化４８】
【０１０１】
プロポリンＧ（２．３０ｇ，２．７５ｍｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（１．９４ｇ，１３．９９ｍｍｏｌ）及びアセトン（８０ｍＬ）の混合物にＭｅ2ＳＯ4（２．１７ｍＬ，１７．３５ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を０．５時間攪拌した後、窒素雰囲気下で６時間加熱還流した。有機溶媒を除去した後、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍＬ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（４０ｍＬｘ３）で洗った。ＣＨ2Ｃｌ2層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン＝１：８）で精製して化合物４（９５４ｍｇ，６５％）を得た。
【０１０２】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.06 (1H, s), 7.26 (1H, d, J=8.4 Hz), 6.86 (1H, d, J=8.4 Hz), 6.03 (1H, s), 5.50 (1H, dd, J=2.4, 13.4 Hz), 5.17-5.14 (1H, m), 5.04-5.00 (2H, m), 3.87 (3H, s), 3.79 (3H, s), 3.79 (6H, s), 3.46-3.45 (2H, m), 3.25-3.23 (2H, m), 3.05 (1H, dd, J=13.5, 16.7 Hz) , 2.70 (1H, dd, J=2.6, 16.7 Hz), 2.02-1.94 (7H, m), 1.75 (3H, s), 1.67 (3H, s), 1.66 (3H, s), 1.61 (3H, s), 1.58 (3H, s)
【０１０３】
実施例９：６−（２−ヒドロキシ−２−メチルブチル）−２'−（７−ヒドロキシ−３，７−ジメチルオクト−２−エニル）−５−ヒドロキシ−３'，４'，７−トリメトキシフラバノン（６ｄ）
【０１０４】
【化４９】
【０１０５】
氷浴中、化合物４（５３０ｍｇ，０，９９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１５ｍｌ）に、４９％Ｈ2ＳＯ4（１０ｍＬ）を加えた。全量を加えた後、反応溶液を室温で８時間攪拌し、Ｈ2Ｏで希釈した。この反応溶液をＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬｘ３）で抽出した。有機層を合わせてＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１）で精製して純粋な油状物６ｄを得た（１９１ｍｇ，３４％）。
【０１０６】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.06 (1H, brs), 7.27 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.86 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.05 (1H, s), 5.50 (1H, dd, J=2.6, 13.6 Hz), 5.03 (1H, t, J=6.2 Hz), 3.87 (3H, s), 3.80 (6H, s), 3.48 (1H, dd, J=5.5, 15.2 Hz), 3.42 (1H, dd, J=6.1, 15.2 Hz), 3.06 (1H, dd, J=13.6, 17.1 Hz), 2.70(1H, dd, J=2.7, 17.1 Hz), 2.65-2.61 (2H, m), 1.95-1.92(2H, m), 1.65 (3H, s), 1.41-1.35 (5H, m), 1.26 (6H, s), 1.15 (3H, s), 1.14 (3H, s).
【０１０７】
実施例１０：他の化合物
以下の２化合物を上述の方法にしたがって調製した。
【０１０８】
【化５０】
【０１０９】
【化５１】
（ＮＢＭ−ＨＤ−２）
【０１１０】
実施例１１：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−１）による癌細胞増殖の阻害
【化６７】
【０１１１】
癌細胞系列であるラットＣ６グリオーマ細胞を、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）中で３７℃、５％ＣＯ2、相対湿度９５％の条件で培養した。各実験で細胞は６穴プレートに３×１０5細胞／ウェルの細胞密度で播種した。２４時間後に、細胞を異なる濃度のＮＢＭ−ＨＤ−１（明細書中の式（ＩＩＩ）の化合物）で処理した。４８時間後に細胞を観察、計数した。図１の結果に示されるように、ＮＢＭ−ＨＤ−１はラットＣ６グリオーマ細胞の増殖を停止させた。Ｃ６グリオーマ細胞を２．５μｇ／ｍＬ（図１（Ａ）−ｂ）、５μｇ／ｍＬ（図１（Ａ）−ｃ）、及び１０μｇ／ｍＬ（図１（Ａ）−ｄ）のＮＢＭ−ＨＤ−１の存在下で４８時間培養することにより、細胞密度はコントロール（図１（Ａ）−ａ）と比較して顕著に低下した。細胞計数の結果によっても同様の傾向が示された（図１（Ｂ））。上記の結果はＮＢＭ−ＨＤ−１が用量依存的にＣ６グリオーマ細胞の増殖を阻害する作用を有することを示すものである。
【０１１２】
１×１０6個のラットＣ６グリオーマ細胞を異なる濃度のＮＢＭ−ＨＤ−１（０μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬ）で７２時間処理した。処理細胞をトリプシン処理して集めた。この細胞を２００μＬ ＰＢＳに再懸濁し、冷たい１００％エタノール８００μＬを加えることで固定した。得られた細胞を−２０℃で一晩固定した。遠心により細胞ペレットを集め、１ｍＬの低張緩衝液（０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳ溶液、１μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ）に再懸濁し、３７℃で３０分培養した。次いで細胞ペレットに１ｍＬのＰＩ溶液（５０μｇ／ｍＬ）を加えた。この混合物を４℃で３０分静置した。細胞のＤＮＡ量をＦＡＣＳｃａｎサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により調べた（図２）。図２の結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−１が細胞周期をＧ０／Ｇ１期で停止するように用量依存的に調節することによりＣ６グリオーマの細胞増殖を顕著に阻害することを示している。
【０１１３】
実施例１２：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−１）による癌細胞の細胞増殖の阻害及び分化誘導
ラットＣ６グリオーマ細胞についてｍＲＮＡの発現に関連する細胞周期をＲＴ−ＰＣＲにより調べた。製造者の指示にしたがってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、処理Ｃ６細胞から全ＲＮＡを単離した。ＲｅｖｅｒＴｒａ−ＰｌｕｓＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて５００ｎｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを作成した。ＧＡＰＤＨを内部コントロールとして用い、細胞周期の複数の遺伝子を調べるためのプライマーを用いたＰＣＲによってＲＴ産物（１μｌ）を増幅した。この結果を図３に示した。図３の結果に示されるとおり、ＮＢＭ−ＨＤ−１は幾つかの細胞周期調節因子の発現を調節する作用を示した。この結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−１が用量依存的にサイクリンＤ１及びサイクリンＢ１の発現を低減させることを示すものである。これに対し、ｐ２１の発現量は増加した。
【０１１４】
Ｃ６グリオーマ細胞を１０μｇ／ｍＬのＮＢＭ−ＨＤ−１と２４時間培養した後、固定し、公知の免疫蛍光染色法によって調べた。グリア細胞の染色はグリア特異的なＧＦＡＰ抗体（ＳＩＧＭＡ）を一次抗体として用い、蛍光標識したウサギ免疫グロブリン（ＳＩＧＭＡ）を一次抗体に結合する二次抗体として用いて行った。ＧＦＡＰ抗体陽性の細胞は特定の光源によって励起されることで蛍光を発する。更に細胞核をＤＡＰＩで染色した。染色の結果を図４（Ａ）に示した。図４（Ａ）に示されるように、ＮＢＭ−ＨＤ−１はＣ６グリオーマ癌細胞でＧＦＡＰの発現を誘導する。１０μｇ／ｍＬのＮＢＭ−ＨＤ−１で処理した細胞の写真ではコントロール群と比較してより多くのＧＦＡＰタンパク質が検出された。図４（Ａ）の中央の列はＤＡＰＩ染色した細胞の写真である。
【０１１５】
ＧＦＡＰのｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲによって調べた。図４（Ｂ）の結果は、ＧＦＡＰの発現量が用量依存的に増加したことを示している。これらの結果によれば、ＧＦＡＰの発現量が増加したことからＮＢＭ−ＨＤ−１がＣ６グリオーマ癌細胞の細胞分化を誘導することが示される。
【０１１６】
実施例１３：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−１）で処理した癌細胞における過剰アセチル化ヒストンの蓄積量の増加
細胞ライセート中の過剰アセチル化ヒストンＨ４の蓄積量を、ウエスタンブロット及びアセチル化ヒストンＨ４に対する抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いて調べた。Ｃ６グリオーマ細胞は１０ｃｍの培養皿毎に１×１０6個の細胞密度で播種した。２４時間後に細胞を１０μｇ／ｍＬのＮＢＭ−ＨＤ−１または４ｍＭの酪酸ナトリウムで数時間処理した。全細胞ライセートを変性用ＳＤＳサンプルバッファーを用い、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離することによって調製した。図５に示したように、酪酸ナトリウム及びＮＢＭ−ＨＤ−１のいずれにおいても過剰アセチル化ヒストンＨ４の蓄積量の増加が見られた。アセチル化ヒストンは非処理のＣ６グリオーマ細胞ではほとんど検出されなかった。４ｍＭの酪酸ナトリウムで２時間処理した細胞ではアセチル化ヒストンＨ４の量は増加した。この後、培地から酪酸ナトリウムを除去した。６時間後、アセチル化ヒストンＨ４の量は減少した。ＮＢＭ−ＨＤ−１で２時間処理した細胞ではアセチル化ヒストンＨ４の蓄積量は増加した。ＮＢＭ−ＨＤ−１の除去後、アセチル化ヒストンＨ４の量は時間とともに増加した。化合物の除去から６時間後にヒストンのアセチル化レベルは最も高くなった。これらの結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−１が、酪酸ナトリウムと同様、ＨＤＡＣ阻害剤であることを示すものである。ＮＢＭ−ＨＤ−１は酪酸ナトリウムよりも疎水性が高いことから、ＮＢＭ−ＨＤ−１は酪酸ナトリウムよりも長時間にわたって細胞内に留まり、ヒストンＨ４のアセチル化を継続的に誘導すると考えられる。
【０１１７】
実施例１４：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−１）によるＨＤＡＣ活性の阻害
Ｃ６グリオーマ細胞を異なる用量のＮＢＭ−ＨＤ−１及び酪酸ナトリウム（ＳＢ）で処理した。２４時間後に細胞を収集し、製造者の指示にしたがってＮｕｃＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて核タンパク質を抽出した。ＨＤＡＣ活性アッセイキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いてこれらの抽出物のＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチル化酵素）阻害活性について調べた。先ず、アセチル化されたリジン側鎖を有するＨＤＡＣの蛍光定量的基質を、抽出した核タンパク質とインキュベートした。この基質は脱アセチル化によって感受性が高くなることから、第２の工程でリジン検出剤で処理することによってフルオロフォアを生成する。このフルオロフォアは蛍光プレートリーダーによって容易に分析することができる。図６に示すように、ＮＢＭ−ＨＤ−１はＣ６グリオーマ細胞のＨＤＡＣ活性を阻害した。ＨＤＡＣの阻害は癌細胞の分化の誘導との関連が示唆されている。この実験ではＨＤＡＣ阻害活性を示すことで知られる化合物である酪酸ナトリウムをポジティブコントロールとして用いた。蛍光単位の低い値は、実験群でのＨＤＡＣ阻害活性が高いことを示している。実験結果からＮＢＭ−ＨＤ−１はＨＤＡＣ活性を顕著に阻害することが示された。
【０１１８】
実施例１５：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−１）による癌細胞のＨＤＡＣ活性の阻害及び形態の変化
ヒト神経膠芽腫細胞ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧを、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）、１００ｍｈ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で３７℃、５％ＣＯ2、相対湿度９５％の条件で培養した。各実験で細胞は６穴プレートに３×１０5細胞／ウェルの細胞密度で播種した。２４時間後に、細胞を異なる濃度のＮＢＭ−ＨＤ−１及び４ｍＭの酪酸ナトリウムで処理した。７２時間後に細胞を観察、計数した。図７に示されるようにＮＢＭ−ＨＤ−１は０５ＭＧ細胞の増殖を著しく阻害し、細胞の形態を変化させた。０５ＭＧ細胞（図７（Ａ））を２．５μｇ／ｍＬ（図７（Ａ）−ｂ）、５μｇ／ｍＬ（図７（Ａ）−ｃ）、及び１０μｇ／ｍＬ（図７（Ａ）−ｄ）のＮＢＭ−ＨＤ−１の存在下で７２時間培養することにより、細胞密度はコントロール（図７（Ａ）−ａ）と比較して大幅に低下した。実験群の０５ＭＧ細胞はコントロール群の細胞よりも長い形態に変化した。細胞計数の結果（図７（Ｂ））は、ＮＢＭ−ＨＤ−１は酪酸ナトリウムと同様、０５ＭＧ細胞の増殖を阻害したことを示している。これらの結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−１が用量依存的に０５ＭＧ細胞の増殖を阻害し、０５ＭＧ癌細胞の形態の変化を引き起こすことを示すものである。
【０１１９】
乳癌細胞ＭＣＦ−７を、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）中で３７℃、５％ＣＯ2、相対湿度９５％の条件で培養した。細胞は６穴プレートに３×１０5細胞／ウェルの細胞密度で播種した。２４時間後に、細胞を異なる濃度の化合物ＮＢＭ−ＨＤ−１及びポジティブコントロールとして４ｍＭの酪酸ナトリウムで処理した。４８時間後に細胞を観察し、９６時間後に計数した。図８に示されるようにＮＢＭ−ＨＤ−１はＭＣＦ−７癌細胞の増殖を著しく阻害し、細胞の形態を変化させた。図８（Ａ）に示されるように、細胞を２．５μｇ／ｍＬ（図８（Ａ）−ｂ）、５μｇ／ｍＬ（図８（Ａ）−ｃ）、及び１０μｇ／ｍＬ（図８（Ａ）−ｄ）のＮＢＭ−ＨＤ−１の存在下で４８時間培養することにより、ＭＣＦ−７細胞の細胞密度はコントロール（図８（Ａ）−ａ）と比較して大幅に低下した。実験群のＭＣＦ−７細胞の形態はコントロール群の細胞と比較して変化した。図８（Ｂ）は、４ｍＭの酪酸ナトリウムによってＭＣＦ−７細胞の増殖が阻害されたことを示す。細胞計数の結果（図８（Ｂ））は、ＮＢＭ−ＨＤ−１は酪酸ナトリウムと同様、細胞の増殖を阻害したことを示している。これらの結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−１が用量依存的にＭＣＦ−７細胞の増殖を阻害し、その形態変化を引き起こすことを示すものである。
【０１２０】
１００ｍｍの培養皿中でＭＣＦ−７癌細胞を異なる濃度（０，２．５，５及び１０μｇ／ｍＬ）のＮＢＭ−ＨＤ−１または４ｍＭの酪酸ナトリウムで７２時間処理した。実施例８で述べた工程にしたがってサンプルを調製した。次いで細胞のＤＮＡをＦＡＣＳｃａｎサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により調べた。図９に示されるように、ＮＢＭ−ＨＤ−１は細胞周期がＧ０／Ｇ１期で停止するように用量依存的に調節することによりＭＣＦ−７細胞の細胞増殖を顕著に阻害することを示している。Ｇ０／Ｇ１期の細胞の比率は７４．４６から９２．５５へと用量依存的に高くなっている。更に、ＮＢＭ−ＨＤ−１によって細胞周期のＳ期及びＧ２／Ｍ期が用量依存的にいずれも大幅に短縮することが示された。
【０１２１】
ｐ２１のｍＲＮＡ発現に関連する細胞周期をＲＴ−ＰＣＲにより調べた。処理ＭＣＦ−７細胞から全ＲＮＡを単離してＲＴ反応に用いた。ｃＤＮＡ（１μｌ）をテンプレートとしてＰＣＲによりｐ２１遺伝子を増幅した。ＧＡＰＤＨを内部コントロールとして用いた。図１０に示されるように、ＮＢＭ−ＨＤ−１はＭＣＦ−７癌細胞におけるｐ２１のｍＲＮＡの発現量を増加させた。この実験では、ＭＣＦ−７細胞を異なる用量のＮＢＭ−ＨＤ−１で２４時間処理した。実験結果はＮＢＭ−ＨＤ−１が用量依存的にｐ２１の発現を誘導することを示すものである。
【０１２２】
細胞ライセート中の過剰アセチル化されたヒストンＨ４の蓄積量を、ウエスタンブロット及びアセチル化ヒストンＨ４に結合する抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いて調べた。ＭＣＦ−７細胞は１０ｃｍの培養皿毎に１×１０6個の細胞密度で播種した。２４時間後に細胞を１０μｇ／ｍＬのＮＢＭ−ＨＤ−１または４ｍＭの酪酸ナトリウムで数時間処理した。過剰アセチル化されたヒストンＨ４に対する特異的抗体を用いてヒストンのアセチル化度を調べることによってＮＢＭ−ＨＤ−１によるＨＤＡＣの阻害を調べた。酪酸ナトリウムをポジティブコントロールとして用いた。図１１に示されるように、ＭＣＦ−７細胞における結果はＣ６グリオーマ細胞と同様であった。
【０１２３】
実施例１６：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−１）による神経突起伸長の促進
Ｂ−２７を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）にペニシリンＧ、ストレプトマイシン、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミンを加えることによってＮＣＳ（神経幹細胞）及び皮質ニューロン用の培地を調製した。麻酔下の妊娠１７日目のＷｉｓｔａｒ系ラットの腹腔内の胎嚢から胎児を摘出した。胎児から脳組織を取り出し、０．１％トリプシン溶液で２５℃で３分間処理した。ＰＢＳ溶液で３回洗浄した後、細胞をピペッティングして解離させた。得られた溶液を７０μｍナイロン製セルストレイナー（Ｆａｌｃｏｎ）に通過させて脳細胞を含んだ濾液を得た。この濾液を１０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を吸引除去した。得られたペレットを上記で調製した培地に再懸濁した。得られた懸濁液はＮＣＳを含んでいた。
【０１２４】
懸濁液から得た細胞を３０μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした６穴プレートに７５細胞／ｍｍ2の密度で播種した。この細胞を３７℃、５％ＣＯ2、相対湿度９５％の条件で培養した。培地には０．６３μｇ／ｍＬのＮＢＭ−ＨＤ−１を加え、１μｌのＤＭＳＯを含む培地をコントロールとして用いた。培養後の分化した細胞は皮質ニューロンと呼ばれる。
【０１２５】
６日間の培養後、細胞を生きたまま顕微鏡で観察した。６つの視野におけるニューロンの神経突起の長さを測定して平均をとった。図１２に示されるようにＮＢＭ−ＨＤ−１は神経突起伸長を促進した。図１２では、実験群（図１２（Ａ）−ｂ）の神経突起の長さはコントロール群（図１２（Ａ）−ａ）と比較して長くなっている。神経突起の長さを測定した結果、実験群の神経突起の平均の長さは比較群よりも長いことが示された（図１２（Ｂ））。
【０１２６】
実施例１７：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−２）による癌細胞増殖の阻害
ＭＣＦ−７癌細胞を６穴プレートに３×１０5細胞／ウェルの細胞密度で播種した。２４時間後に、細胞を異なる濃度の化合物ＮＢＭ−ＨＤ−２及びポジティブコントロールとして４ｍＭの酪酸ナトリウムで処理した。細胞を７２時間後に観察、計数した。図１３に示されるように、ＮＢＭ−ＨＤ−２はＭＣＦ−７癌細胞の増殖を著しく阻害し、細胞の形態を変化させた。図１３（Ａ）に示されるように、細胞を２．５μｇ／ｍＬ（図１３（Ａ）−ｃ）、５μｇ／ｍＬ（図１３（Ａ）−ｄ）、７．５μｇ／ｍＬ（図１３（Ａ）−ｅ）、及び１０μｇ／ｍＬ（図１３（Ａ）−ｆ）のＮＢＭ−ＨＤ−２の存在下で７２時間培養することにより、ＭＣＦ−７細胞の細胞密度はコントロール（図１３（Ａ）−ａ）と比較して大幅に低下した。実験群のＭＣＦ−７細胞の形態はコントロール群の細胞と比較して変化した。図１３（Ａ）は、４ｍＭの酪酸ナトリウムによってＭＣＦ−７細胞の増殖が阻害されたことを示す。細胞計数の結果（図１３（Ｂ））は、ＮＢＭ−ＨＤ−２は酪酸ナトリウムと同様、細胞の増殖を阻害したことを示している。これらの結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−２が用量依存的にＭＣＦ−７癌細胞の増殖を阻害し、その形態変化を引き起こすことを示すものである。
【０１２７】
実施例１８：本発明の化合物（ＮＢＭ−ＨＤ−３）による癌細胞増殖の阻害
ＭＣＦ−７癌細胞を６穴プレートに３×１０5細胞／ウェルの細胞密度で播種した。２４時間後に、細胞を異なる濃度の化合物ＮＢＭ−ＨＤ−３及びポジティブコントロールとして４ｍＭの酪酸ナトリウムで処理した。細胞を７２時間後に観察、計数した。図１４に示されるように、ＮＢＭ−ＨＤ−３はＭＣＦ−７癌細胞の増殖を著しく阻害し、細胞の形態を変化させた。図１４（Ａ）に示されるように、細胞を２．５μｇ／ｍＬ（図１４（Ａ）−ｃ）、５μｇ／ｍＬ（図１４（Ａ）−ｄ）、７．５μｇ／ｍＬ（図１４（Ａ）−ｅ）、及び１０μｇ／ｍＬ（図１４（Ａ）−ｆ）のＮＢＭ−ＨＤ−３の存在下で７２時間培養することにより、ＭＣＦ−７細胞の細胞密度はコントロール（図１４（Ａ）−ａ）と比較して大幅に低下した。実験群のＭＣＦ−７細胞の形態はコントロール群の細胞と比較して変化した。図１４（Ａ）は、４ｍＭの酪酸ナトリウムによってＭＣＦ−７細胞の増殖が阻害されたことを示す。細胞計数の結果（図１４（Ｂ））は、ＮＢＭ−ＨＤ−３は酪酸ナトリウムと同様、細胞の増殖を阻害したことを示している。これらの結果は、ＮＢＭ−ＨＤ−３が用量依存的にＭＣＦ−７癌細胞の増殖を阻害し、その形態変化を引き起こすことを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】異なる濃度のＮＢＭ−ＨＤ−１で処理したラットグリオーマＣ６細胞の顕微鏡写真を示す。
【図２】ＦＡＣＳｃａｎサイトメトリーによって分析したラットグリオーマＣ６細胞のＤＮＡ含量を示す。
【図３】異なる用量のＮＢＭ−ＨＤ−１で処理したラットグリオーマＣ６細胞の細胞周期における各遺伝子の電気泳動像を示す。
【図４】ＮＢＭ−ＨＤ−１で処理したラットグリオーマＣ６細胞の免疫蛍光染色写真及びＲＴ−ＰＣＲデータを示す。
【図５】ＮＢＭ−ＨＤ−１及び酪酸ナトリウムで処理したラットグリオーマＣ６細胞のウェスタンブロット像を示す。
【図６】ＮＢＭ−ＨＤ−１及び酪酸ナトリウムで処理したラットグリオーマＣ６細胞におけるＨＤＡＣの相対的な活性阻害を示す。
【図７】異なる用量のＮＢＭ−ＨＤ−１で処理したヒト神経膠芽腫細胞ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧの顕微鏡写真を示す。
【図８】異なる用量のＮＢＭ−ＨＤ−１で処理したヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７の顕微鏡写真を示す。
【図９】ＮＢＭ−ＨＤ−１による用量依存的な調節によって細胞周期がＧ０／Ｇ１期で停止することによってＭＣＦ−７細胞の増殖が著しく阻害された結果を示す。
【図１０】ＮＢＭ−ＨＤ−１が用量依存的にｐ２１WAF1/CIP1遺伝子の発現を増大させた結果を示す。
【図１１】ＮＢＭ−ＨＤ−１で処理したＭＣＦ−７細胞のウェスタンブロット像を示す。
【図１２】ＮＢＭ−ＨＤ−１で処理した皮質ニューロンの神経突起伸長の顕微鏡写真を示す。
【図１３】異なる濃度のＮＢＭ−ＨＤ−２で処理したヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞の顕微鏡写真を示す。
【図１４】異なる濃度のＮＢＭ−ＨＤ−３で処理したヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞の顕微鏡写真を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）によって表される化合物：
【化１】
［式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、Ｏ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｓ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｎ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｏ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｓ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｎ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、アルキル、アルキレニル、アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、または、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個の環へテロ原子を含む飽和または不飽和の５〜１０員複素環基であるか；またはＲ1及びＲ2は共にジオキソランを形成し；
Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、Ｏ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｓ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｎ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｏ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｓ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｎ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、アルキル、アルキレニル、アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、または、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個の環へテロ原子を含む飽和または不飽和の５〜１０員複素環基であり；
Ｒ5は、Ｃ4-16アルキルまたはＣ4-16アルケニルであり（ただし該アルキルまたはアルケニルは非置換もしくは、１以上のＣ1-6アルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ、Ｎ3、ＮＨ2、ＣＨＯ、ＯＲ9、ＳＲ9、ＮＲ9またはＣＯＯＲ9によって置換される）；
Ｒ6は、Ｃ2-12アルキルまたはＣ2-12アルケニルであるか（ただし該アルキルまたはアルケニルは非置換もしくは、１以上のＣ1-6アルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ、Ｎ3、ＮＨ2、ＣＨＯ、ＯＲ9、ＳＲ9またはＮＲ9によって置換される）；またはＲ5及びＲ6の一方は水素、ハロゲンまたはＯＨであり、他方は非置換もしくは１以上のＣ1-6アルキル、ＯＨ、ＮＨ2、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯまたはＮ3によって置換されるＣ4-16アルキルまたはＣ4-16アルキレンであり；
Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ2、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、ＣＮ、ＮＯ、非置換またはＯＨ、ＮＨ2、ＣＯＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯまたはＣＨＯによって置換されたＣ1-6アルキル、＝Ｏ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルまたはＮ−アルキニルであるか、またはＲ7及びＲ8は共に二重結合、Ｃ3-6シクロアルキルまたはＮ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個のへテロ原子を含む５〜１０員の複素環基を形成し；
Ｒ9はフェニル、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ10またはベンジルであり；
Ｒ10はＯＨ、ＮＨＯＨ、ＮＨ2、Ｃ1-6アルキル、フェニルまたはベンジルである；（ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＯＨである場合、Ｒ5は、
【化２】
ではなく、かつＲ6は、
【化３】
またはＨのいずれでもない；またはＲ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＯＨであり、かつＲ5がＨである場合、Ｒ6は、
【化４】
または
【化５】
のいずれでもない）］
ならびに薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ1及びＲ2がそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ1-6アルキル、ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ1-6アルキル、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルであるか、Ｒ1及びＲ2が共にジオキソランを形成する請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ1及びＲ2がそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ3、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルである請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ1及びＲ2が共にジオキソランを形成する請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ3及びＲ4がそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ1-6アルキル、ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ1-6アルキル、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルである請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ3及びＲ4がそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ3、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルである請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ5が、
【化６】
【化７】
または、
【化１７】
である請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ6が、
【化１８】
【化２２】
【化２６】
または、
【化３１】
である請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【化３９】
【化４０】
【化４１】
【化４２】
【化４３】
【化４４】
【化４５】
【化４６】
【化４７】
【化４８】
【化４９】
【化５０】
及び
【化５１】
からなる群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
【化５２】
【化５３】
【化５４】
【化５５】
及び
【化５６】
からなる群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
下式（ＩＩ）によって表される請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の立体異性体：
【化５７】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は式（Ｉ）と同様］。
【請求項１２】
有効成分としての請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
患者のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を阻害するための薬剤の製造における、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物の使用。
【請求項１４】
患者の腫瘍または細胞増殖性疾患を治療するための薬剤の製造における、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物の使用。
【請求項１５】
患者の神経突起伸長を促進するための薬剤の製造における、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物の使用。
【請求項１６】
患者の神経変性疾患及びヒト脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療するための薬剤の製造における、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物の使用。
【請求項１】
下記式（Ｉ）によって表される化合物：
【化１】
［式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、Ｏ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｓ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｎ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｏ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｓ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｎ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、アルキル、アルキレニル、アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、または、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個の環へテロ原子を含む飽和または不飽和の５〜１０員複素環基であるか；またはＲ1及びＲ2は共にジオキソランを形成し；
Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、Ｏ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｓ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｎ−Ｃ3-8シクロアルキル、Ｏ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｓ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、Ｎ−不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、アルキル、アルキレニル、アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、不飽和の５〜１０員単環式または２環式基、または、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個の環へテロ原子を含む飽和または不飽和の５〜１０員複素環基であり；
Ｒ5は、Ｃ4-16アルキルまたはＣ4-16アルケニルであり（ただし該アルキルまたはアルケニルは非置換もしくは、１以上のＣ1-6アルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ、Ｎ3、ＮＨ2、ＣＨＯ、ＯＲ9、ＳＲ9、ＮＲ9またはＣＯＯＲ9によって置換される）；
Ｒ6は、Ｃ2-12アルキルまたはＣ2-12アルケニルであるか（ただし該アルキルまたはアルケニルは非置換もしくは、１以上のＣ1-6アルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ、Ｎ3、ＮＨ2、ＣＨＯ、ＯＲ9、ＳＲ9またはＮＲ9によって置換される）；またはＲ5及びＲ6の一方は水素、ハロゲンまたはＯＨであり、他方は非置換もしくは１以上のＣ1-6アルキル、ＯＨ、ＮＨ2、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯまたはＮ3によって置換されるＣ4-16アルキルまたはＣ4-16アルキレンであり；
Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ2、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、ＣＮ、ＮＯ、非置換またはＯＨ、ＮＨ2、ＣＯＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯまたはＣＨＯによって置換されたＣ1-6アルキル、＝Ｏ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルまたはＮ−アルキニルであるか、またはＲ7及びＲ8は共に二重結合、Ｃ3-6シクロアルキルまたはＮ、Ｏ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個のへテロ原子を含む５〜１０員の複素環基を形成し；
Ｒ9はフェニル、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ10またはベンジルであり；
Ｒ10はＯＨ、ＮＨＯＨ、ＮＨ2、Ｃ1-6アルキル、フェニルまたはベンジルである；（ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＯＨである場合、Ｒ5は、
【化２】
ではなく、かつＲ6は、
【化３】
またはＨのいずれでもない；またはＲ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＯＨであり、かつＲ5がＨである場合、Ｒ6は、
【化４】
または
【化５】
のいずれでもない）］
ならびに薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ1及びＲ2がそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ1-6アルキル、ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ1-6アルキル、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルであるか、Ｒ1及びＲ2が共にジオキソランを形成する請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ1及びＲ2がそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ3、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルである請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ1及びＲ2が共にジオキソランを形成する請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ3及びＲ4がそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣ1-6アルキル、ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ1-6アルキル、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルである請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ3及びＲ4がそれぞれ独立してＯＨ、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ3、Ｏ−フェニルまたはＯ−ベンジルである請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ5が、
【化６】
【化７】
または、
【化１７】
である請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ6が、
【化１８】
【化２２】
【化２６】
または、
【化３１】
である請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【化３９】
【化４０】
【化４１】
【化４２】
【化４３】
【化４４】
【化４５】
【化４６】
【化４７】
【化４８】
【化４９】
【化５０】
及び
【化５１】
からなる群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
【化５２】
【化５３】
【化５４】
【化５５】
及び
【化５６】
からなる群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
下式（ＩＩ）によって表される請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の立体異性体：
【化５７】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は式（Ｉ）と同様］。
【請求項１２】
有効成分としての請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
患者のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を阻害するための薬剤の製造における、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物の使用。
【請求項１４】
患者の腫瘍または細胞増殖性疾患を治療するための薬剤の製造における、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物の使用。
【請求項１５】
患者の神経突起伸長を促進するための薬剤の製造における、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物の使用。
【請求項１６】
患者の神経変性疾患及びヒト脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療するための薬剤の製造における、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグ及び溶媒和物の使用。
【図２】
【図９】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図９】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００９−６７７５０（Ｐ２００９−６７７５０Ａ）
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００７−２３９９３４（Ｐ２００７−２３９９３４）
【出願日】平成１９年９月１４日（２００７．９．１４）
【出願人】（５０７３１０４９９）ナチュレワイズ バイオテック＆メディカル コーポレーション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３９９３４（Ｐ２００７−２３９９３４）
【出願日】平成１９年９月１４日（２００７．９．１４）
【出願人】（５０７３１０４９９）ナチュレワイズ バイオテック＆メディカル コーポレーション (1)
【Ｆターム（参考）】
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