本発明は、ヒト胎盤テロペプチドコラーゲンを含む組成物、該組成物を調製する方法、これらの使用方法及び該組成物を含むキットを提供する。該組成物、キット及び方法は、例えば哺乳動物の組織を増大し、又は置換するために有用である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(1. 先行関連出願)
本出願は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている、2006年10月6日出願の米国仮特許出願第60/850,131号の利益を主張するものである。
【０００２】
(2. 発明の分野)
本発明は、コラーゲン、例えばヒト胎盤コラーゲンを含む組成物、該組成物を調製する方法及びこれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
(3. 発明の背景)
コラーゲンは、腱、骨、歯、並びに皮膚及び内部臓器を支持するシートを含む体の多くの構造を形成するタンパク質である。コラーゲンは、三重らせんに巻きついた三本鎖で構成される。該構造は、3アミノ酸の繰り返しから生じる。らせん体において、3アミノ酸毎にグリシンがあり、残りのアミノ酸の多くは、プロリン又はヒドロキシプロリンである。
【０００４】
コラーゲンは、商業的に、及び臨床的にしばらくの間使用されてきた。現在では、コラーゲンは、皮膚、腱、軟骨、骨及び間質などの硬又は軟結合組織を置換し、又は増大するために使用することができる。固体コラーゲンは、外科的に移植されてきたが、現在は、注射用コラーゲン製剤をより便利な投与のために利用できる。現在では、ザイダーム(Zyderm)(登録商標)、ザイプラスト(Zyplast)(登録商標)、コスモダーム(Cosmoderm)(登録商標)及びコスモプラスト(Cosmoplast)(登録商標)を含むいくつかの注射用コラーゲン組成物が市販されている。
【０００５】
それぞれのコラーゲン組成物は、特定の技術におけるその使用について、有利又は不利であり得る特定の物理的性質を有する。従って、当該技術分野において、当業者が利用できる組成物の選択を拡大するために、更なる物理的特性をもつコラーゲン組成物に対する需要が依然として残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
(4. 発明の要旨)
本発明は、一部において、例えば哺乳動物の組織を増大し、又は置換するために有用であるコラーゲン組成物の発見に基づいている。ある実施態様において、該コラーゲン組成物は、供給源組織からの実質的に高収率のコラーゲンで調製される。ある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、汚染、例えば細胞及び/又は他のタンパク質汚染物質による汚染が小さい。本発明のある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、有利なことに低毒性を示す。本発明のある実施態様において、該コラーゲン組成物は、テロペプチドコラーゲン組成物の調製のための有利な供給源を提供する。
【０００７】
一つの態様において、塩基処理、界面活性剤処理テロペプチドコラーゲンを含む組成物を本明細書に示す。当該組成物を、供給源として哺乳動物の組織から開始するのでさえも、比較的少数の工程から容易に調製することができることが見出されている。本明細書に示すある組成物は、細胞細片、細胞下細片及び/又はフィブロネクチン、ラミニン、サイトカイン及び成長因子などの汚染タンパク質が実質的にない。本明細書に示すある組成物は、高コラーゲン含有量を含む。ある実施態様において、該組成物は、該組成物におけるタンパク質の全量と比較した場合に少なくとも90%のコラーゲンを含む。ある他の実施態様において、該コラーゲン組成物は、ラミニン及び/又はフィブロネクチンを実質的に欠く(例えば、該組成物は、それぞれ乾燥重量で1%未満のラミニン及び/又はフィブロネクチンを含み、或いは検出可能なフィブロネクチン及び/又はラミニンを欠く)。
【０００８】
別の態様において、本発明は、本発明のコラーゲン組成物、例えば、複数の幹細胞を含む塩基処理、界面活性剤処理テロペプチドコラーゲンを提供する。様々な実施態様において、幹細胞は、胚幹細胞、胚生殖細胞、間葉幹細胞、骨髄由来幹細胞、造血性前駆細胞(例えば、末梢血液、胎児血液、胎盤血液、臍帯血液、胎盤潅流液等由来の造血幹細胞)、体性幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞、筋幹細胞及び脂肪幹細胞等である。
【０００９】
より具体的な実施態様において、幹細胞は、胎盤幹細胞である。より具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34^-及び/又はCD200⁺である。該胎盤幹細胞は、CDlO、CD73、CD105、CD200、HLA-G及び/又はOCT-4を発現することができ、CD34、CD38又はCD45の発現を欠く。該胎盤幹細胞は、HLA-ABC(MHC-1)及びHLA-DRを発現することもできる。別の具体的な実施態様において、本発明の組成物と組み合わせることができる幹細胞は、CD200⁺又はHLA-G⁺である。別の具体的な実施態様において、該胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺である。別の具体的な実施態様において、該胎盤幹細胞は、CD200⁺及びOCT-4⁺である。別の具体的な実施態様において、該胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である。別の具体的な実施態様において、該胎盤幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺であり、胎盤細胞の集団にある場合は、胚様体の形成を可能にする条件下で1つ以上の胚様体の形成を促進する。別の具体的な実施態様において、該胎盤幹細胞は、OCT-4⁺であり、胎盤細胞の集団にある場合は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されると、前記幹細胞を含む単離胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体の形成を促進する。
【００１０】
幹細胞を含む組成物を、幹細胞と組み合わせる前又は後に、任意の形状に成形することができる。一実施態様において、前記組成物は、シート、例えば、2つの面を有する乾燥シートとして成形され、前記幹細胞は、前記面の少なくとも1つに存在する。別の実施態様において、該組成物は、チューブとして成形され、該幹細胞は、チューブの少なくとも内面又は外面に存在する。別の具体的な実施態様において、該幹細胞を、該組成物に接着させる。上記実施態様のいずれかの具体的な実施態様において、該幹細胞は、該組成物と接触すると、IL-6、IL-8及び/又はMCP-1(単球走化性タンパク質-1)を分泌する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、塩基処理、界面活性剤処理テロペプチドコラーゲンを調製するための方法を提供する。胎盤組織の供与源は、いずれの哺乳動物であることもできるが、ある実施態様においてヒト胎盤が使用される。胎盤組織は、可溶性若しくは不溶性又は両方であるかにかかわらず、羊膜、絨毛膜及び臍帯を含む胎盤のいずれの部分由来であることも、又は胎盤全体由来であることもができる。ある実施態様において、胎盤コラーゲンは、臍帯の除去後のヒト胎盤全体から調製される。
【００１２】
ある実施態様において、本方法は、胎盤組織の浸透圧ショックを含む。いずれの特定の作動理論によって拘束されることも意図しないが、浸透圧ショックは、組織の細胞を破裂させ、これにより細胞、細胞成分及び血液成分の除去を容易にすることができると考えられる。浸透圧ショック工程により、本発明のコラーゲン組成物を有利な純度で得ることができる。浸透圧ショックは、当業者に公知のいずれの浸透圧ショック条件で行うこともできる。特定の実施態様において、浸透圧ショックは、高い塩条件におけるインキュベーション、続く水溶液中でのインキュベーションによって行われる。インキュベーションは、当業者の判断に従って繰り返すことができる。ある実施態様において、それらは、2回以上繰り返される。
【００１３】
浸透圧ショックに続いて、得られたコラーゲン組成物を界面活性剤で処理することができる。界面活性剤は、供給源組織のタンパク質及び脂質細胞構成要素を可溶化できることが当業者に知られている任意の界面活性剤であり得る。ある実施態様において、該界面活性剤は、ドデシル硫酸又はデオキシコール酸ナトリウムなどのイオン性界面活性剤である。ある実施態様において、該界面活性剤は、TWEEN(登録商標)界面活性剤又はTRITON(登録商標)-X界面活性剤などの非イオン性界面活性剤である。ある実施態様において、該界面活性剤は、両性イオン性である。ある他の実施態様において、該界面活性剤は、硫酸ドデシルナトリウム(SDS)である。ある実施態様において、該コラーゲン組成物は、供給源組織の細胞又は細胞下構成要素を可溶化するための当業者に明らかな条件下で界面活性剤と接触される。当業者の判断に応じて界面活性剤処理を繰り返すことができる。ある実施態様において、それは、2回以上繰り返される。
【００１４】
ある実施態様において、該コラーゲン組成物を塩基性条件下で処理することができる。例えば、ある実施態様において、該コラーゲン組成物をアルカリ性溶液、例えば、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム又は水酸化ナトリウム溶液と接触させることができる。ある実施態様において、該コラーゲン組成物は、本発明の組成物を得るのに十分な時間にわたって約0.5M水酸化ナトリウムでインキュベートされる。当業者の判断に応じて塩基処理を繰り返すことができる。ある実施態様において、それは、2回以上繰り返される。
【００１５】
ある実施態様において、該方法の工程は、任意の順序で実施される。ある実施態様において、少なくとも1つの浸透圧ショック工程が、界面活性剤処理又は塩基性条件下における処理に先行する。ある実施態様において、少なくとも1つの浸透圧ショック工程は、塩基処理に後続する界面活性剤処理に先行する。
【００１６】
更なる態様において、本発明は、本発明のコラーゲン組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することにより、哺乳動物の組織を増大し、又は置換する方法を提供する。ある実施態様において、哺乳動物は、ヒトである。コラーゲン組成物は、当業者に公知のいずれの技術に従って投与することもできる。ある実施態様において、コラーゲン組成物は、注射によって投与される。ある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物の流動特性は、有利となる。ある実施態様において、該コラーゲン組成物を、その内容がその全体において引用により本明細書中に組み込まれている米国特許公開第2004/0048796号に記載の方法に従って細胞外マトリックスとして使用することができる。
【００１７】
もう一つの態様において、本発明は、本発明のコラーゲン組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するためのキットを提供する。キットは、典型的には当業者に配布するための便利なパッケージ内に本発明のコラーゲン組成物を含む。キットは、本発明のコラーゲン組成物を哺乳動物に投与するための手段を更に含むことができる。手段は、注射器、注射器及び針、カニューレその他などの当業者に公知のコラーゲン組成物を投与するためのいずれの手段であることもできる。ある実施態様において、手段は、本発明のコラーゲン組成物で予め充填されている。
【００１８】
別の態様において、本発明は、創傷の治癒を促進する方法であって、創傷を本発明のコラーゲン組成物と接触させることを含み、前記接触は、該組成物と接触していない創傷と比較して該創傷の様相の検出可能に大きな改善をもたらす、前記方法を提供する。具体的な実施態様において、該方法は、前記創傷を複数の幹細胞と接触させることを含む。より具体的な実施態様において、前記幹細胞を、前記組成物を前記創傷と接触させることとは別に、前記創傷と接触させる。別の具体的な実施態様において、前記組成物は前記幹細胞を含む。別の具体的な実施態様において、前記組成物は、2つの面を有するシートとして成形され、前記幹細胞は、前記面の少なくとも1つに存在する。別の具体的な実施態様において、該幹細胞を、該組成物に接着させる。上記実施態様のいずれかの具体的な実施態様において、該幹細胞は、該組成物と接触すると、IL-6、IL-8及び/又はMCP-1(単球走化性タンパク質-1)を分泌する。より具体的な実施態様において、幹細胞は、胎盤幹細胞である。より具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、CD34^-及び/又はCD200⁺である。別の具体的な実施態様において、前記創傷は、足潰瘍である。該足潰瘍は、静脈性足潰瘍、動脈性足潰瘍、糖尿病性足潰瘍又は褥瘡性足潰瘍であり得る。別の具体的な実施態様において、前記組成物は創傷充填剤として使用される。
【００１９】
別の態様において、本発明は、本発明のコラーゲン組成物を複数の幹細胞と接触させることを含む、組成物の製造方法を提供する。一実施態様において、該方法は、前記複数の幹細胞の少なくとも一部を前記組成物に接着させることを含む。別の実施態様において、該方法は、前記幹細胞が前記組成物上で増殖させることを含む。具体的な実施態様において、該方法は、前記幹細胞が前記組成物上で密集するまで増殖させることを含む。ある実施態様において、前記幹細胞は、前記組成物と接触すると、検出可能な量のIL-6、IL-8及び/又はMCP-1を生成する。別の具体的な実施態様において、該方法は、前記幹細胞が検出可能な量の少なくとも1つの細胞外マトリックスタンパク質を堆積した後に該組成物を脱細胞化することを含む。より具体的な実施態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲン(例えば、I型、II型、III型又はIV型)、フィブロネクチン又はエラスチンである。
【００２０】
上記に、及び下記の節において詳細に記述したように、本発明の組成物、工程、方法及びキットは、コラーゲン組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するための有用性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
(5. 図面の簡単な説明)
【図１】細胞外マトリックス(ECM)を単離するための方法のフローチャート図である。
【００２２】
【図２Ａ】異なる方法で製造されたコラーゲン組成物上で成長した胎盤幹細胞からのIL-6の分泌を示す図である。横軸:組成物の種類及び該組成物上の細胞の成長の時間による具体的な成長条件。縦軸:1000個のECM結合細胞あたりピコグラム毎ミリリットル。NC=細胞なし。Purecol=精製コラーゲン。TCPS=組織培養ポリスチレン。
【００２３】
【図２Ｂ】異なる方法で製造されたコラーゲン組成物上で成長した胎盤幹細胞からのIL-8の分泌を示す図である。横軸:組成物の種類及び該組成物上の細胞の成長の時間による具体的な成長条件。縦軸:1000個のECM結合細胞あたりピコグラム毎ミリリットル。NC=細胞なし。Purecol=精製コラーゲン。TCPS=組織培養ポリスチレン。
【００２４】
【図２Ｃ】異なる方法で製造されたコラーゲン組成物上で成長した胎盤幹細胞からのMCP-1の分泌を示す図である。横軸:組成物の種類及び該組成物上の細胞の成長の時間による具体的な成長条件。縦軸:1000個のECM結合細胞あたりピコグラム毎ミリリットル。NC=細胞なし。Purecol=精製コラーゲン。TCPS=組織培養ポリスチレン。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
(6. 本発明の詳細な説明)
(6.1 定義)
本明細書に使用される以下の用語は、以下の意味を有するものとする:
【００２６】
「コラーゲン」という用語は、当業者に公知の任意のコラーゲンをいう。
【００２７】
「テロペプチドコラーゲン」という用語は、1つ以上のテロペプチド領域を含む、当業者に認識されているコラーゲンの形を指す。
【００２８】
「アテロペプチドコラーゲン」という用語は、1つ以上のテロペプチド領域を欠いている、当業者によって認識されるとおりのコラーゲンの形態をいう。ある実施態様において、以下に詳細に論議するように、テロペプチド領域は、プロテアーゼ消化によって除去することができる。
【００２９】
本明細書に使用される「生体適合性」又は「生体適合性の」とは、生体組織において中毒性、有害性若しくは免疫学的な反応又は拒絶反応を生じないことにより、生物学的に適合性である特性をいう。未知の材料に対する身体反応は、体に人工材料を使用するときの主要な懸念であり、それ故、材料の生体適合性は、このような材料の重要な設計事項である。
【００３０】
本明細書に使用される「非発熱性」とは、試験して、0.5EU/mL以下の発熱物質、例えば内毒素を含むことが見いだされた材料をいう。1EUは、1ミリリットルあたりおよそ0.1〜0.2ngのエンドトキシンであり、調査される参照により異なる。
【００３１】
「被験体」という用語は、制限されないが、霊長類(例えば、ヒト)、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、その他を含む哺乳動物などの動物をいう。ある実施態様において、被験体は、ヒトである。
【００３２】
(6.2 本発明の実施態様)
本発明は、コラーゲン組成物、コラーゲン組成物を調製する方法、コラーゲン組成物を含むキット及びこれらの使用方法に向けられる。
【００３３】
(6.2.1 本発明のコラーゲン組成物)
一つの実施態様において、本発明は、例えば哺乳動物の組織を増大し、又は置換するために有用なコラーゲン組成物を提供する。ある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、有利な耐久性、注射可能性及び流動特性を有する。ある他の実施態様において、本発明は、空間充填特性を有し、かつ例えば、該組成物が接触する組織における血管系の成長を促進及び支持するコラーゲン組成物を提供する。ある他の実施態様において、本発明の組成物は、空気乾燥又は凍結乾燥され、有用な構造に成形される。ある他の実施態様において、本発明の組成物は、水に不溶である。
【００３４】
本発明の本態様において、コラーゲンは、当業者に公知のいずれのコラーゲンであることもできる。ある実施態様において、コラーゲンは、哺乳動物コラーゲンである。特定の実施態様において、コラーゲンは、ヒト、ウシ、ヒツジ(ovine)、ヒツジ(sheep)、ラット又はカンガルーコラーゲンである。一定の非哺乳動物の実施態様において、コラーゲンは、魚コラーゲンである。コラーゲンは、これらの供与源のいずれに由来することもできるが、ヒトコラーゲンが具体例である。
【００３５】
コラーゲンは、供与源のいずれの部分に由来することもできる。有用な供与源には、ウシ皮膚、子ウシ皮膚、ラット尾、カンガルー尾及び魚皮膚を含む。特定の実施態様において、コラーゲンは、胎盤コラーゲン、例えばウシ胎盤コラーゲン、ヒツジ胎盤コラーゲン又はヒト胎盤コラーゲンである。一例は、ヒト胎盤コラーゲンである。
【００３６】
コラーゲンは、当業者に公知のコラーゲンのいずれかの型又はこのようなコラーゲンの混合物であることもできる。ある実施態様において、コラーゲンは、コラーゲンの1つ以上の型を含むコラーゲン組成物の形態である。特定のコラーゲンには、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン及びIV型コラーゲンを含む。ある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、これらのコラーゲンの特定量を含む。特定の組成物には、I型コラーゲンの相当量を含むが、IV型コラーゲンも富んでいる。ある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、1〜15%の間のIV型コラーゲン、2〜13%の間のIV型コラーゲン、3〜12%の間のIV型コラーゲン又は4〜11%の間のIV型コラーゲンを含む。同時に、コラーゲン組成物は、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%のI型コラーゲンを含むことができる。例えば、組成物は、70〜95%の間のI型コラーゲン、74〜92%の間のI型コラーゲン又は80〜90%の間のI型コラーゲンを含むことができる。本発明の同じコラーゲン組成物には、III型コラーゲン、例えば1%まで、2%まで、3%まで、4%まで、5%まで、6%まで又は7%までのIII型コラーゲンの量を含むことができる。ある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、2〜15%の間のIV型コラーゲン、70〜95%の間のI型コラーゲン及び6%までのIII型コラーゲンを含む。
【００３７】
ある実施態様において、該コラーゲン組成物は、コラーゲンに加えて、1つ以上の細胞外マトリックスタンパク質又は構成要素を含む。具体的な実施態様において、該コラーゲン組成物が、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン及び/又はグリゴサミノグリカンを含む。別の具体的な実施態様において、該コラーゲン組成物は、検出可能なフィブロネクチン又は検出可能なラミニンを含まない。別の具体的な実施態様において、該コラーゲン組成物は、検出可能な量のフィブロネクチン及びラミニンを含む。別の具体的な実施態様において、該コラーゲン組成物は、乾燥重量で約5%以上のエラスチンを含む。別の具体的な実施態様において、該コラーゲン組成物は、乾燥重量で約10%以上のエラスチンを含む。別の具体的な実施態様において、該コラーゲン組成物は、乾燥重量で約5%以下のエラスチンを含む。
【００３８】
本発明のこれらのコラーゲン組成物は、当業者に明らかないずれの工程によって得ることもできる。特定の処理を下記の節に詳述してある。
【００３９】
ある実施態様において、本発明のこの態様のコラーゲン組成物は、架橋される。ある実施態様において、該コラーゲン組成物を当業者に知られている方法に従ってグルタルアルデヒドなどの架橋剤で架橋することができる。このような方法は、例えば米国特許第4,852,640号、第5,428,022号、第5,660,692号及び第5,008,116号に、及びMcPhersonらの論文,1986, J. Biomedical Materials Res. 20:79-92に広範囲に記述されており、これらの内容は、引用によりこれらの全体において本明細書に取り込まれている。
【００４０】
更に例示的な架橋剤及び架橋コラーゲンのためのこれらの使用方法は、米国特許第5,880,242号及び第6,117,979号に、及びZeemanらの論文., 2000, J Biomed Mater Res.51(4):541-8, van Wachemらの論文, 2000, J Biomed Mater Res. 53(1):18-27, van Wachemらの論文, 1999, J Biomed Mater Res. 47(2):270-7, Zeemanらの論文, 1999, J Biomed Mater Res. 46(3):424-33, Zeemanらの論文, 1999, Biomaterials 20(10):921-31に記述されており、これらの内容は、その全体において引用により本明細書に取り込まれている。
【００４１】
さらなる実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルで架橋される。さらなる実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、ゲニピンで架橋される。ゲニピンは、無毒の天然に存在する架橋剤である。これは、クチナシ(Gardenia jasminoides)の果実から単離され得る、その親化合物のゲニポシドから得ることができる。ゲニピンは、Challenge Bioproducts Co., Ltd., 7 Alley 25, Lane 63, TzuChiang St. 404 Taichung Taiwan R.0.C., Tel 886-4-3600852から商業的に得てもよい。架橋試薬としてのゲニピンの使用は、米国特許出願公開第20030049301号に広範に記述されており、その内容は、引用によりこれらの全体において本明細書に取り込まれている。
【００４２】
さらなる実施態様において、該コラーゲン組成物を当業者に知られている他の架橋剤で架橋することができる。さらなる実施態様において、該コラーゲン組成物を当業者に知られている任意の酵素媒介架橋技術で架橋することができる。例えば、本発明のコラーゲン組成物は、当業者に公知の方法に従ってトランスグルタミナーゼによって架橋することができる。トランスグルタミナーゼは、コラーゲンのグルタミンとリジン残基との間のアミド架橋の形成を触媒する。このような方法は、例えばOrbanらの論文,2004, J Biomedical Materials Res. 68(4):756-62に記述されており、これらの内容は、引用によりこれらの全体において本明細書に取り込まれている。
【００４３】
本発明のコラーゲン組成物は、単一の架橋剤で、又は架橋剤の混合物で架橋することができる。ある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、グルタルアルデヒドで架橋された塩基処理、界面活性剤処理ヒト胎盤コラーゲンを含む。
【００４４】
(6.3 本発明のコラーゲン組成物の調製方法)
もう一つの態様において、本発明は、本発明のコラーゲン組成物を調製する方法を提供する。本方法は、例えば上記の本発明のコラーゲン組成物を調製するために有用である。
【００４５】
ある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、本明細書に記述した方法に従って、ヒト胎盤から調製される。ヒト胎盤由来のコラーゲン組成物の調製の最初の工程は、米国特許第5,428,022号、第5,660,692号及び第5,008,116号に、及び米国特許出願公開第20040048796号及び第20030187515号に詳述されており、これらの内容は、引用によりこれらの全体において本明細書に取り込まれている。
【００４６】
胎盤組織は、可溶性若しくは不溶性又は両方であるかにかかわらず、羊膜、絨毛膜及び臍帯を含む胎盤のいずれの部分由来であることも、又は胎盤全体由来であることもできる。ある実施態様において、コラーゲン組成物は、臍帯のないのヒト胎盤全体から調製される。
【００４７】
胎盤嚢は、疎性結合組織によって密接に結合された2層で構成される。これらは、羊水層及び絨毛層として公知である。羊水層は、2層のうちの最も内側にあり、胎児を囲む羊水と接触すると共に、これらは、羊膜腔を形成する。羊水層は、無血管であり、基底膜の上を覆っている単純な円柱上皮により裏打ちされており、それは30〜60ミクロンの厚さである。柔毛膜は、嚢の外層にあり、これは、多数に細分化されている。血管樹は、胎盤で始まり、絨毛層を通って胎盤膜に延びている。絨毛層は、疎性結合組織によって羊水層から分離されて、合わさっており、2層は、120〜180ミクロンである。胎盤膜は、ムコ多糖類を積んだコラーゲンマトリックスを有し、これらが主に発生中の胎児のための保護嚢として役に立つと考えられる。また、膜は、母体循環に存在する感染性及び免疫学的因子のための障壁を維持する。胎盤膜は、能動的及び受動的な輸送の両方を有する。大部分の小分子及びタンパク質は、これらを通って自由に移動することができるが、IgMなどの巨大タンパク質は、基底層を通って横切ることができない。
【００４８】
特定の実施態様において、本発明の方法に使用するための胎盤は、新生児の分娩後、できるだけ早く採取される。更にもう一つの特定の実施態様において、胎盤は、正常な健康な乳児の帝王切開分娩に続いて、直ちに採取される。好都合には、胎盤は、滅菌条件下で収集することができる。一部の実施態様において、胎盤は、さらなる処理の前に、分娩時刻から48時間貯蔵される。その他の実施態様において、胎盤は、さらなる処理の前に、分娩時刻から5日間まで貯蔵される。
【００４９】
好都合には、胎盤、臍帯及び臍帯血は、更なる処理のために、分娩又は出産室から別の位置、例えば研究室に輸送することができる。胎盤は、任意に熱的に絶縁された滅菌バッグ又は容器などの滅菌の輸送装置に輸送することができる。一部の実施態様において、胎盤は、さらなる処理まで室温で貯蔵される。その他の実施態様において、胎盤は、さらなる処理まで冷蔵され、すなわち約2℃〜8℃の温度にて貯蔵される。更にその他の実施態様において、胎盤は、さらなる処理の前に5日間まで滅菌条件下で貯蔵される。特定の実施態様において、胎盤は、当業者に公知であるように、滅菌条件下で扱われ、処理される。研究室には、HEPA濾過システム(クラス1000を有するか、又はより優れたクリーンルーム分類によって定義されるもの)を備えることができる。特定の実施態様において、HEPA濾過システムは、本発明の方法を実施するための研究室を使用する少なくとも1時間前にオンにされる。
【００５０】
ある実施態様において、胎盤を、失血させ、すなわち出生後に残っている臍帯血を完全に排液させる。一部の実施態様において、胎盤は、70%が失血され、80%が失血され、90%が失血され、95%が失血され、99%が失血される。
【００５１】
本発明は、制限されないが、HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV及び胎盤の組織に混入することが知られるその他のウイルス病原体を含む伝染病について、当業者に公知の標準的技術を使用して、出産前の時点で妊婦をスクリーニングすることを包含する。好都合には、方法は、連邦医薬品局によって記載された規制に従う伝染病をスクリーニングするために使用することができる。妊婦は、出生の1月以内に、特に出生の2週以内に、出生の1週以内に、又は出産時にスクリーニングしてもよい(例えば、血液試料が、診断目的で採取される)。母が上述の病原体に陰性又は非陰性反応を示したドナーから収集した組織のみを使用して、本発明のコラーゲン組成物を得る。好都合には、例えば特定の家族病歴を含む、完全に父系、並びに医学的及び社会的歴史のドナーの胎盤膜を得ることができる。
【００５２】
ある実施態様において、ドナーは、当業者に公知の標準的な血清学的及び細菌学的試験を使用してスクリーニングされる。病原体を同定するいずれのアッセイ法又は診断試験も、本発明の方法の範囲内であるが、特定のアッセイ法には、高スループットのための能力と共に高い精度を合わせもつものである。具体的実施態様において、本発明は、抗原及び/又は抗体のための当業者に公知の標準的技術を使用してドナーをスクリーニングすることを包含する。抗原及び抗体の非限定的な例には:抗体スクリーン(ATY);アラニンアミノトランスフェラーゼスクリーニング(ALT);肝炎コア抗体(核酸及びELISA);B型肝炎表面抗原;C型肝炎ウイルス抗体;HIV-1及びHIV-2;HTLV-1及びHTLV-2;梅毒試験(RPR);CMV抗体試験;並びにC型肝炎及びHIV試験;を含む。使用されるアッセイ法は、当業者に公知のような、核酸に基づいたアッセイ法又はELISAに基づいたアッセイ法であってもよい。
【００５３】
本発明は、当業者に公知の標準的技術を使用して、新生児臍帯由来の血液を試験することを更に包含する(例えば、Cotorrueloらの論文,2002, Clin. Lab. 48(5 6):271 81; Maineらの論文,2001, Expert Rev. Mol. Diagn., 1(1):19 29; Nielsenらの論文,1987, J. Clin. Microbiol. 25(8):1406 10を参照され、これらの全ては、引用によりこれらの全体において本明細書に取り込まれている)。一つの実施態様において、新生児臍帯由来の血液は、当業者に公知の標準的技術を使用して、細菌病原体(グラム陽性及びグラム陰性菌を含むが、限定されない)及び真菌について試験される。具体的実施態様において、新生児臍帯の血液の血液型及びRh因子は、当業者に公知の標準的技術を使用して決定される。もう一つの実施態様において、差動的CBCは、当業者に公知の標準的方法を使用して、新生児臍帯由来の血液から得られる。更にもう一つの実施態様において、好気的細菌培養は、当業者に公知の標準的方法を使用して、新生児臍帯由来の血液から採取される。正常限界の範囲内(例えば、正常レベルから全体で異常又は逸脱なし)のCBCを有し、血清学及び細菌学的に試験陰性であり、かつ感染症及び混入について試験陰性又は非陰性のドナーから収集した組織のみを使用して、本発明のコラーゲン組成物を作成する。
【００５４】
一旦ヒト胎盤組織が得られたら、これを本発明のコラーゲン組成物を調製するために以下の工程に従って処理することができる。以下の工程は、経時的順序で示してあるが、当業者であれば、いくつかの工程の順序を本発明の範囲を越えることなく交換することができることを認識するであろう。更にまた、いくつかの工程は、本発明の所望のコラーゲン組成物の性質に応じて、任意として示してある。緩衝液交換、沈澱、遠心分離、再懸濁、希釈及びタンパク質組成の濃縮などの当業者に直ちに明らかな技術は、詳細に説明する必要はないものと思われる。例示的な調製を下記の実施例に記述してある。
【００５５】
胎盤の任意の部分又は胎盤全体を本発明の方法に使用することができる。ある実施態様において、コラーゲン組成物は、胎盤全体から調製される。しかし、ある実施態様において、コラーゲン組成物は、胎盤の絨毛又は羊膜部分から得ることができる。
【００５６】
これらの実施態様において、本発明は、臍帯が胎盤ディスクから分離されるように胎盤膜を処理すること、及び羊膜を柔毛膜から分離を包含する。特定の実施態様において、羊膜は、胎盤膜を切断する前に柔毛膜から分離される。柔毛膜からの羊膜の分離は、胎盤膜の端から開始することができる。もう一つの実施態様において、羊膜は、鈍い切開を使用して、例えば手袋をした指で柔毛膜から分離される。柔毛膜及び胎盤ディスクからの羊膜の分離に続いて、臍帯断端を、例えばはさみで切断し、胎盤ディスクから剥離させる。ある実施態様において、羊膜及び絨毛膜の分離を、組織を裂くことのなく行うことができないときに、本発明は、1つの小片として胎盤ディスクから羊膜及び絨毛膜を切断し、次いでこれらを剥がして離すことを包含する。
【００５７】
羊膜、柔毛膜又は胎盤全体は、本発明の方法に使用する前に貯蔵することができる。貯蔵技術は、当業者に明らかである。例示的な貯蔵技術は、米国特許出願公開第20040048796号及び第20030187515号に記述されており、これらの内容は、引用によりこれらの全体において本明細書に取り込まれている。
【００５８】
本発明のいくつかの方法において、胎盤組織は、細胞除去(decellularized)される。胎盤の組織は、米国特許出願公開第20040048796号及び20030187515号に詳述したものなどの当業者に公知のいずれの技術に従って細胞除去させることもでき、これらの内容は、引用によりこれらの全体において本明細書に取り込まれている。
【００５９】
ある実施態様において、胎盤の組織は、浸透圧ショックにさらされる。浸透圧ショック工程により、有利な純度で本発明のコラーゲン組成物を得ることができる。いずれの特定の作動理論によって拘束されることも意図しないが、浸透圧ショックは、組織の細胞を破裂させ、これにより細胞、細胞成分及び血液成分の除去を容易にすることができると考えられる。浸透圧ショックは、任意の清澄工程に付加することもでき、又はこれは、当業者の判断に従って単独の清澄工程であることができる。
【００６０】
浸透圧ショックは、当業者に公知のいずれの浸透圧ショック条件においても行うことができる。このような条件は、高浸透ポテンシャルの、若しくは低浸透ポテンシャルの、又は交互に高低の浸透ポテンシャルの溶液中で組織をインキュベートすることを含む。高浸透ポテンシャル溶液は、NaCl(例えば、0.2〜1.0M)、KCl(例えば、0.2〜1.0又は2.0M)、硫酸アンモニウム、単糖、二糖(例えば、20%ショ糖)、親水性重合体(例えば、ポリエチレングリコール)グリセロールなどの1つ以上を含む溶液などの当業者に公知の任意の高浸透ポテンシャル溶液であることができる。ある実施態様において、高浸透ポテンシャル溶液は、塩化ナトリウム溶液である。一部の実施態様において、塩化ナトリウム溶液は、少なくとも0.25M、0.5M、0.75M、1.0M、1.25M、1.5M、1.75M、2M又は2.5MのNaClである。一部の実施態様において、塩化ナトリウム溶液は、約0.25〜5M、約0.5〜4M、約0.75〜3M又は約1.0〜2.0M NaClである。
【００６１】
低浸透ポテンシャル溶液は、水、例えば当業者に公知の任意の方法に従って脱イオンされた水などの当業者に公知の任意の低浸透ポテンシャル溶液であることができる。いくつかの実施態様において、浸透圧ショック溶液は、50mM NaCl未満の浸透圧ショックポテンシャルをもつ水を含む。
【００６２】
ある実施態様において、浸透圧ショックは、塩化ナトリウム溶液中で、続いて水溶液中でのものである。一部の実施態様において、塩化ナトリウム溶液は、少なくとも0.5M NaClである。ある実施態様において、塩化ナトリウム溶液は、少なくとも0.75M NaClである。一部の実施態様において、塩化ナトリウム溶液は、少なくとも1.0M NaClである。一部の実施態様において、塩化ナトリウム溶液は、少なくとも1.5M NaClである。一部の実施態様において、塩化ナトリウム溶液は、少なくとも2.0M NaClである。ある実施態様において、1回の0.5M NaCl処理の後に1回の水洗浄が続く。ある実施態様において、2回の0.5M NaCl処理の後に1回の水洗浄が続く。ある実施態様において、1回の2M NaCl処理の後に1回の水洗浄が続く。これらの順序は、当業者の判断に従って繰り返することができる。
【００６３】
ある実施態様において、浸透圧ショックにより得られるコラーゲン組成物を界面活性剤とともにインキュベートすることができる。いずれの特定の作動理論によって拘束されることも意図しないが、界面活性剤は、該組成物に存在し得る細胞、細胞膜、細胞下膜及び細胞細片を破壊することができると考えられる。該界面活性剤は、細胞又は細胞下膜を破壊できることが当業者に知られている任意の界面活性剤であり得る。ある実施態様において、該界面活性剤は、イオン性である。例えば、ある実施態様において、該界面活性剤は、デオキシコール酸又はドデシル硫酸ナトリウムである。以下の作業例において、代表的な界面活性剤処理は、デオキシコール酸による。ある実施態様において、該界面活性剤は、両性イオン性である。ある実施態様において、該界面活性剤は、非イオン性である。例えば、ある実施態様において、該界面活性剤は、TWEEN(登録商標)-20などのTWEEN(登録商標)界面活性剤、又はトリトンX100などのトリトンX界面活性剤であり得る。該コラーゲン組成物は、望ましくない構成要素を該組成物から除去するのに好適であると当業者に判断される条件下で該界面活性剤と接触されるべきである。代表的な条件を以下の作業例に示す。
【００６４】
該界面活性剤処理を当業者の判断に応じて任意の温度で実施することができる。ある実施態様において、該界面活性剤処理は、約0〜30℃、約5〜25℃、約5〜20℃又は約5〜15℃で実施される。ある実施態様において、該界面活性剤処理は、約0℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃又は約30℃で実施される。特定の実施態様において、該界面活性剤処理は、約5〜15℃で実施される。
【００６５】
該界面活性剤処理を当業者の判断に応じて好適な時間にわたって実施することができる。ある実施態様において、該界面活性剤処理を約1〜24時間、約2〜20時間、約5〜15時間、約8〜12時間又は約2〜5時間にわたって実施することができる。
【００６６】
ある実施態様において、界面活性剤処理により得られるコラーゲン組成物を塩基性条件でインキュベートすることができる。いずれの特定の作動理論によって拘束されることも意図しないが、塩基処理は、該コラーゲン組成物を汚染し得るウイルス粒子を除去することができると考えられる。ある実施態様において、塩基洗浄は、エンドトキシンを除去するように作用する。該塩基性条件は、当業者に知られている任意の塩基性条件であり得る。特に、ウイルス粒子を除去することが知られる任意のpHの任意の塩基を使用することができる。該塩基処理のための特定の塩基としては、生体適合性塩基、揮発性塩基、及び該コラーゲン組成物から容易かつ安全に除去されることが当業者に知られている塩基が挙げられる。該塩基は、例えば、0.2〜1.0Mの濃度の当業者に知られている任意の有機又は無機塩基であり得る。ある実施態様において、該塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム及び水酸化ナトリウムからなる群から選択される。ある実施態様において、該塩基処理は、水酸化ナトリウム溶液中で実施される。該水酸化ナトリウム溶液は、0.1MのNaOH、0.25MのNaOH、0.5MのNaOH又は1MのNaOHであり得る。特定の実施態様において、該塩基処理は、0.1M又は0.5MのNaOH中で実施される。
【００６７】
該塩基処理を当業者の判断に応じて任意の温度で実施することができる。ある実施態様において、該塩基処理は、約0〜30℃、約5〜25℃、約5〜20℃又は約5〜15℃で実施される。ある実施態様において、該塩基処理は、約0℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃又は約30℃で実施される。特定の実施態様において、該塩基処理は、約5〜15℃で実施される。
【００６８】
該塩基処理を当業者の判断に応じて好適な時間にわたって実施することができる。ある実施態様において、該塩基処理を約1〜24時間、約2〜20時間、約5〜15時間、約8〜12時間又は約2〜5時間にわたって実施することができる。
【００６９】
様々な界面活性剤及びNaOH洗浄工程を用いて、いくつかの様々な最終ECM材料を生成することができる。例えば、ある実施態様において、コラーゲン含有組織を約0.1M、0.2M、0.3M、0.4M又は約0.5MのNaOHで約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は約24時間にわたって処理することができる。
【００７０】
ある他の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、塩基で処理せずに製造される。該方法を胎盤組織に適用する場合には、塩基処理工程を省略すると、典型的には、塩基処理を含めて製造されたコラーゲン組成物より、比較的高量のエラスチン、フィブロネクチン及び/又はラミニンを含むコラーゲン組成物が得られる。
【００７１】
ある実施態様において、該コラーゲン組成物を乾燥させることができる。乾燥は、該コラーゲン組成物の保管及び梱包を容易にする。乾燥は、また、細胞構成要素を該組成物からより除去しやすくする。更に、上記工程のいずれかの後で、次の工程の前に該コラーゲン組成物を乾燥させることができる。当業者に明らかな任意の乾燥技術に従って乾燥を実施することができる。有用な乾燥技術は、その内容がその全体において引用により本明細書中に組み込まれている米国特許公開第2004/0048796号に記載されている。代表的な乾燥技術としては、以下の作業例で実証される凍結乾燥、真空乾燥、熱(例えば、約50℃未満)凍結乾燥が挙げられる。
【００７２】
ある実施態様において、上記工程のいずれかを無菌条件下で実施することができる。特定の実施態様において、該塩基処理及びすべての後続の工程は、無菌条件下で実施される。さらなる実施態様において、本明細書に記載の方法に従って調製された任意のコラーゲン組成物を当業者に明らかな技術に従って更に滅菌することができる。
【００７３】
ある実施態様において、本発明は、上記の浸透圧ショック工程、凍結乾燥工程、界面活性剤処理工程、水洗工程、凍結乾燥工程、塩基処理工程、水洗工程及び凍結乾燥工程を含む方法を提供する。ある実施態様において、これらの工程は、順番に実施される。ある実施態様において、該界面活性剤は、1%デオキシコール酸塩である。ある実施態様において、該塩基性処理は、4時間にわたる0.5NのNaOHである。ある実施態様において、第1の水洗は、繰り返される(全部で2回の洗浄)。ある実施態様において、第2の水洗は、繰り返される(全部で3回の洗浄)。ある実施態様において、該界面活性剤は、1%のデオキシコール酸塩であり、該塩基性処理は、4時間にわたる0.5NのNaOHであり、第1の水洗は、繰り返され(全部で2回の洗浄)、第2の水洗は、2回繰り返される(全部で3回の洗浄)。ある実施態様において、当該方法は、約0.59%のグリコサミノグリカン、約3.5%のエラスチンを含み、フィブロネクチンをほとんど又は全く含まず、ラミニンをほとんど又は全く含まない組成物を提供することができる。
【００７４】
ある実施態様において、本発明は、上記の浸透圧ショック工程、塩基処理工程及び水洗工程を含む方法を提供する。ある実施態様において、これらの工程は、順番に実施される。ある実施態様において、該塩基性処理は、4時間にわたる0.5NのNaOHである。ある実施態様において、当該方法は、約0.28から約0.38%のグリコサミノグリカン、約3.2%から約4.7%のエラスチンを含み、フィブロネクチンをほとんど又は全く含まず、ラミニンをほとんど又は全く含まない組成物を提供することができる。
【００７５】
ある実施態様において、本発明は、上記の浸透圧ショック工程、界面活性剤処理工程及び水洗工程を含む方法を提供する。ある実施態様において、これらの工程は、順番に実施される。ある実施態様において、該界面活性剤は、1%のデオキシコール酸塩である。ある実施態様において、当該方法は、約0.4%のグリコサミノグリカン、約12%のエラスチン、約0.6%のフィブロネクチン及び約0.16%のラミニンを含む組成物を提供することができる。
【００７６】
(6.3.1 任意のさらなる処理)
ある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物をアテロペプチドコラーゲン組成物のための供給源として使用することができる。該アテロペプチドコラーゲン組成物をアテロペプチドコラーゲンに関する当業者に明らかな目的のために使用することができる。
【００７７】
当該実施態様において、コラーゲン組成物を、コラーゲンからテロペプチドを部分的又は完全に除去することが可能な酵素と接触させることができる。該酵素は、テロペプチドをコラーゲンから除去することが可能な当業者に知られている任意のタンパク質分解酵素であり得る。ある実施態様において、該酵素は、ペプシン又はパパインである。一般に、該酵素は、当業者に知られているテロペプチドの除去に好適な条件下で該コラーゲン組成物と接触される。
【００７８】
テロペプチドを除去するためにコラーゲン組成物を酵素で処理する方法は、米国特許番号4,511,653号、第4,582,640号、第5,436,135号及び第6,548,077号に詳述されており、これらの内容は、引用によりこれらの全体において本明細書に取り込まれている。一般に、該酵素は、当業者に公知のテロペプチドの除去のために適した条件下でコラーゲン組成物と接触される。このような条件は、例えば適切なpHで、適切な酵素濃度にて、適切な溶液の体積で、適切な温度にて、及び適切な時間、コラーゲン組成物と酵素を接触させることを含む。
【００７９】
コラーゲン組成物は、当業者の判断に従って低pH条件下で酵素と接触させることができる。ある実施態様において、コラーゲン位置は、pH約1〜3又は約2〜3にてペプシンと接触される。
【００８０】
ある実施態様において、酵素は、高温にてコラーゲン組成物と接触される。いずれの特定の作動理論によって拘束されることも意図しないが、高温では、最終コラーゲン組成物中のI型コラーゲンの収率を向上させることができると考えられる。ある実施態様において、コラーゲン組成物は、約15〜40℃、約20〜35℃、約25〜30℃、約20〜30℃又は約23〜27℃にてペプシンと接触させる。特定の実施態様において、コラーゲン組成物は、約23〜27℃にてテロペプチドを除去するために十分な時間でペプシンと接触される。
【００８１】
コラーゲン組成物は、当業者の判断に従ってテロペプチドを除去するために十分な時間で酵素と接触される。ある実施態様において、コラーゲンは、少なくとも5、10、15、20、25又は30時間ペプシンと接触される。ある実施態様において、これは、約5〜30時間、約10〜25時間又は約20〜25時間ペプシンと接触される。ある実施態様において、ある約8、16、24又は32時間のペプシンと接触される。
【００８２】
コラーゲン組成物は、当業者の判断に従ってテロペプチドを除去するために適切な量で酵素と接触される。いくつかの実施態様において、約0.1g、0.5g、1.0g、2.0g又は5.0gペプシン/kg(凍結胎盤)がコラーゲン組成物と接触される。その他の実施態様において、約0.1g、0.5g、1.0g、2.0g又は5.0gのペプシン/胎盤がコラーゲン組成物と接触される。ある実施態様において、コラーゲン組成物は、約0.1〜10.0g/L、約0.5〜5/L、約1〜2.5g/L又は約0.5〜1.5g/Lのペプシンと接触される。一部の実施態様において、コラーゲン組成物は、約0.1g/L、約0.2g/L、約0.5g/L、約1.0g/L、約2.0g/L、5g/L又は10g/Lペプシンと接触される。特定の実施態様において、コラーゲン組成物は、酢酸溶液中でpH約2〜3で、約23℃〜27℃にて、約16〜24時間、約0.5〜1.0g/Lのペプシンと接触される。
【００８３】
コラーゲン組成物は、当業者の判断に従ってテロペプチドを除去するために適した溶液体積:胎盤で酵素と接触される。胎盤に対して高い体積比だとペプシンによる効果を最大にすることができることが観察される。ある実施態様において、胎盤あたり約1、2、4、又は8体積の酢酸溶液が使用される。特定の実施態様において、胎盤あたり約2体積の酢酸溶液が使用される。
【００８４】
必要に応じて、本発明のコラーゲン組成物は、原繊維化によって更に処理することができる。原繊維化は、当業者に公知のコラーゲンを原繊維化するためのいずれの技術によって行うこともできる。コラーゲン組成物の原繊維化は、米国特許第4,511,653号、第4,582,640号及び第5,436,135号に広範に記述されており、これら内容は、引用によりこれらの全体において本明細書に取り込まれている。必要に応じて、コラーゲン組成物は、原繊維化の前に標準的技術に従って濃縮することができる。
【００８５】
所望の場合、本発明のコラーゲン組成物は、架橋することができる。ある実施態様において、コラーゲン組成物は、架橋前に原繊維化される。架橋は、当業者に公知の任意の架橋剤、例えば上記の節において論議した架橋剤であることができる。ある実施態様において、架橋剤は、グルタルアルデヒドであることができ、架橋は、当業者に公知のコラーゲンのグルタルアルデヒド架橋法に従って行うことができる。その他の実施態様において、架橋剤は、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル又はゲニピンであることができる。特定の実施態様において、架橋剤は、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルである。
【００８６】
一部の実施態様において、架橋剤とコラーゲンとの間の共有結合は、例えば安定性を改善するために、還元することができる。還元は、本発明のコラーゲン組成物を当業者に公知の任意の還元剤と接触させることによって達成することができる。ある実施態様において、還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、β-メルカプトエタノール、メルカプト酢酸、メルカプトエチルアミン、ベンジルメルカプタン、チオクレゾール、ジチオスレイトール又はトリブチルホスフィンなどのホスフィンである。水素化ホウ素ナトリウムは、有用な例である。ある実施態様において、コラーゲンは、還元剤での還元前に架橋される。コラーゲン組成物及び架橋されたコラーゲン組成物の還元は、米国特許第4,185,011号、第4,597,762号、第5,412,076号及び第5,763,579号に広範に記述されており、これらの内容は、これらの全体において引用により本明細書に取り込まれている。
【００８７】
ある実施態様において、コラーゲン組成物は、当業者に公知の方法に従って機械的剪断によって更に処理することができる。例示的剪断技術は、米国特許第4,642,117号に記述され手織り、その内容は、その全体において引用により本明細書に取り込まれている。ある実施態様において、コラーゲン組成物は、当業者に公知の組織ホモジナイザーで剪断される。
【００８８】
ある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物中のプロテアーゼ活性を限定するための工程を行うことができる。金属イオンキレート剤、例えば1,10-フェナントロリン及びエチレンジアミン四酢酸(EDTA)などの添加物は、多くのタンパク質分解酵素にとって好ましくない環境を生じる。コラゲナーゼなどのプロテアーゼに対して最適以下条件を提供することにより、コラーゲン組成物を分解から保護するのを助けてもよい。プロテアーゼに対する最適以下条件は、溶液中で利用可能なカルシウム及び亜鉛イオンの量を除去するか、又は制限するように組成物を製剤化することによって達成してもよい。多くのプロテアーゼは、カルシウム及び亜鉛イオンの存在下において活性であり、カルシウム及び亜鉛イオンのない環境では、これらの活性の多くを失う。好都合には、コラーゲン組成物は、pH条件、カルシウム及び亜鉛イオンの利用能の減少、金属イオンキレート剤の存在及びコラゲナーゼに特異的なタンパク分解阻害剤の使用を選択して調製される。例えば、コラーゲン組成物には、水の緩衝された溶液、pH5.5〜8又はpH7〜8を含んでいてもよく、カルシウム及び亜鉛イオンを含まず、EDTAなどの金属イオンキレート剤を含む。加えて、プロテアーゼの活性を制限するために、コラーゲン組成物の治療の間に温度及び時間パラメーターの制御を使用してもよい。
【００８９】
(6.4 コラーゲン組成物の特性付け)
(6.4.1 生物化学的性質)
当該技術分野において公知で、かつ本明細書において例証された生化学に基づいたアッセイ法を本発明のコラーゲン組成物の生化学的組成物を決定するために使用してもよい。本発明は、例えば吸光度に基づいたアッセイ法及び比色に基づいたアッセイ法などの、試料中の総タンパク質含有量を決定するための生化学に基づいたアッセイ法を包含する。吸光度に基づいたアッセイ法は、280nm(例えば、Layne, E,分光光度的及び濁度のタンパク質測定方法(Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins), Methods in Enzymology 3: 447-455, (1957); Stoscheck, CM,タンパク質の定量化(Quantitation of Protein), Methods in Enzymology 182: 50-69, (1990)を参照されたい;これらは、その全体において引用により本明細書に取り込まれている)、205nmにて吸光度を測定するアッセイ法、及び試料の吸光係数に基づいたアッセイ法(例えば、Scopes, RK, Analytical Biochemistry 59: 277, (1974); Stoscheck, CM.タンパク質の定量化(Quantitation of Protein), Methods in Enzymology 182: 50-69, (1990)を参照されたい;これらは、その全体において引用により本明細書に取り込まれている)を含むが、限定されない。本発明は、限定されないが、コラーゲン(例えば、コラーゲンI型、III型、IV型)、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン及びグリコサミノグリカンを含む本発明のコラーゲン組成物中の特定タンパク質の総含量を決定するための方法を包含する。
【００９０】
比色に基づいたアッセイ法は、修飾されたLowryアッセイ法、ビウレットアッセイ法、ブラッドフォードアッセイ法、ビシンコニン酸(Smith)アッセイ法を含むが、限定されない(例えば、Stoscheck, CM,タンパク質の定量(Quantitation of Protein), Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990)を参照されたい)。
【００９１】
具体的実施態様において、ブラッドフォード色素結合アッセイ法(Bradford, M., Analytical Biochemistry, 72, 248 (1976)、これは、その全体において引用により本明細書に取り込まれている)を使用して本発明のコラーゲン組成物中の総タンパク質含有量を測定する。本発明の方法に使用するための例示的なBradfordアッセイ法は、以下を含んでいてもよい:アッセイ法は、BIO-RAD, Hercules, CA, USAを介して入手可能な、ブラッドフォード色素結合アッセイ法を使用して行うことができる。タンパク質アッセイ法は、種々の濃度のタンパク質に応答する色素クマシーブリリアントブルーR-250の色相の変化に基づく。本アッセイ法は、公知の濃度の一連のヒトコラーゲン標準吸光度(595ナノメートルにて)を測定することによって標準較正曲線を作成することを含む。試験試料、例えば羊膜の試料におけるコラーゲンの濃度は、標準曲線に参照することによって決定される。本アッセイ法は、0.2〜1.4mg/mLの範囲のコラーゲン濃度の測定が可能であり、微量アッセイ法として25μgまでのタンパク質濃度を測定する標準的形式で展開される。標準的アッセイ法のためには、100mMクエン酸(pH2.4)に溶解したコラーゲンを0.1mLの総容積にて0.1〜1mg/mLの濃度にて1.5mLマイクロ遠心に分注する。それぞれのチューブに1mLのクマシーブルー色素を添加する。試料をボルテックスし、室温で10分間静置させる。吸光度を595ナノメートル(nm)にて測定する。微量アッセイ法のためには、100mMクエン酸(pH2.4)に溶解したコラーゲンを0.1mL(2.5〜30μg/mL)の総容積にて96ウェルプレートのウェルに分注する。それぞれのウェルに10μLの色素試薬を添加する。試料をボルテックスして、10分間室温でインキュベートした後、プレートリーダーにおいて595nmの吸光度を測定する。本発明のコラーゲン組成物のためには、試験試料を3回アッセイすることができる。タンパク質濃度は、標準曲線を参照することによって決定される。タンパク質濃度は、膜の総乾燥重量の割合として算出される。約10%のエラーの発生する余地内で、膜におけるそれぞれのタンパク質含有量は、本質的に膜の総乾燥重量の95%以上である。含水量は、低く、実験誤差内(およそ、10%)であろう。
【００９２】
本発明のコラーゲン組成物の総コラーゲン量の推定は、当業者に公知で、及び本明細書において例証した方法を使用して特徴づけてもよい。特定の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物のコラーゲン量は、Biocolor Ltd, UKによって製造される定量的色素に基づいたアッセイキット(SIRCOL)を使用して測定される。本アッセイ法では、特異的コラーゲン結合色素として、Sirius Red(又は、Direct Red 80)を利用する。コラーゲンに結合した色素は、UV-Vis分光光度計において540nmの吸光度の濃度依存的な増大を示す。本アッセイ法は、公知の濃度の一連のウシコラーゲン標準吸光度を測定することによって標準較正曲線を作成することを含む。試験試料中、例えば羊膜試料中のコラーゲンの濃度は、標準曲線を参照することによって決定される。例示的アッセイ法において、コラーゲン(1mg/mL)を、1.5mLのマイクロ遠心チューブに5〜100μg/100μLの濃度にて分注する。試料体積を水で100μLに合わせる。それぞれの試料に、1mLのSIRCOL色素試薬を室温で添加する。試料チューブの蓋をして、室温で30mm間、機械的振盪しながらインキュベートさせる。次いで、試料を12,000×gにて15分間遠心分離し、ピペッターを使用して液体を排液させる。それぞれのチューブの底の赤みがかった沈殿物を1mLの0.5M(水酸化ナトリウム)に溶解する。試料についてのUV吸光度をBeckman DU-7400 UV-VIS分光光度計を使用して540nmにて測定する。標準的検量線をそれぞれの試料におけるコラーゲンの濃度対540nmにおける吸光度(OD)を使用してプロットする。実験誤差を決定するために、本アッセイ法を単一の低濃度(10μg/100μL)のコラーゲン標準にて繰り返す(n=10)。膜試料を、同じプロトコルを使用してアッセイし、試料を100μLの総容積で添加する。
【００９３】
更にその他の実施態様において、当該技術分野において公知で、及び本明細書において例証した標準的方法を使用して本発明のコラーゲン組成物のコラーゲン型を決定するために、例えばELISAアッセイ法を使用してもよい。本発明のコラーゲン組成物中の、コラーゲンの型、例えばコラーゲンI型、III型及びIV型を決定するための例示的アッセイ法は、例えばAnthrogen-CIA Collagen-I from Chondrex, Inc., Redmond, WA, USAによってキットとして提供されるサンドイッチELISAアッセイ法の使用を含む。III型及びIV型の研究のためには、一次抗体(捕獲抗体)及び二次抗体(検出抗体)、並びにコラーゲン標準をRockland Immunochemicals, gilbertsville, PAから得てもよい。検出抗体は、ストレプトアビジンペルオキシダーゼに結合するビオチン化されたヒトコラーゲンI型、III型又はIV型である。色素生産性基質及び尿素及びH₂O₂との酵素反応により、黄色を示し、これが490nmにてUV-Vis分光法を介して検出される。コラーゲン型の量を定量化するために、標準較正曲線を公知の濃度の一連のヒトコラーゲン標準試料で作成する。羊膜試験試料におけるコラーゲン濃度を、標準曲線を参照することによって決定する。アッセイプロトコルは、ELISAキットの推奨に従って展開される。標準較正曲線を作成するために、96ウェルトレーの10〜12ウェルを100×希釈したキットと共に提供される捕獲抗体の100μLを添加することによって捕獲抗体(抗ヒトI型コラーゲン抗体、抱合されていない)で被覆する。一晩インキュベーション後、ウェルを洗浄液緩衝液で3回洗浄し、結合していない抗体を除去する。次いで、ヒトコラーゲンI型を0〜5μg/mLで濃度を増大して100μL体積でウェルに添加する。室温で2時間インキュベーション後、ウェルを洗浄液緩衝液で3回洗浄して、結合していないコラーゲンを除去する。次いで、ビオチン化されたコラーゲンI抗体をウェル内の抗体-コラーゲン複合体に100μLの体積で添加し、2時間室温で結合させる。結合していない抗体を洗浄液緩衝液で3回洗浄する。次いで、検出酵素ストレプトアビジンペルオキシダーゼをキットと共に提供される酵素の200×希釈された試料を添加し、これを室温で1時間インキュベートさせることによって抗体-コラーゲン-抗体複合体に結合させる。96ウェルプレートを繰り返し洗浄し(6回)、全ての結合していない酵素を除去する。色素生産性基質+尿素/H₂O₂を各々のウェルに100μL体積で添加する。反応を室温で30分間進行させる。反応を50μLの2.5N硫酸の添加によって終結させる。吸光度を490nmにて測定する。
【００９４】
更にその他の実施態様において、本発明は、当該技術分野において公知で、及び本明細書において例証した方法を使用して、本発明のコラーゲン組成物の総エラスチン含量を決定するためのアッセイ法を包含する。本発明のコラーゲン組成物のエラスチン含量を測定するための例示的アッセイ法は、Biocolor Ltd, UKによって製造される定量的色素に基づいたアッセイキット(FASTIN)を含み得る。本アッセイ法は、特異的エラスチン結合色素として5,10,15,20-テトラフェニル-21,23-ポルフリン(TPPS)を利用する。(例えば、Winkleman, J. (1962), Cancer Research, 22,589-596を参照されたい、これは、その全体において引用により本明細書に取り込まれている)。エラスチンに結合した色素は、UV-Vis分光光度計において513nmの吸光度の濃度依存的増大を示す。本アッセイ法は、公知の濃度の一連のウシエラスチン標準吸光度を測定することによって標準較正曲線を作成することを含む。試験試料中、例えば羊膜試料中のエラスチンの濃度は、標準曲線を参照することによって決定される。エラスチン(1mg/mL)を5〜100μg/100μLの濃度にて1.5mLのマイクロ遠心チューブに分注する。試料体積を水で100μLに合わせる。それぞれの試料に、1mLのエラスチン沈澱試薬(トリクロロ酢酸+アルギニン)を4℃にて添加し、同じ温度にて一晩貯蔵する。一晩の沈澱工程に続いて、試料を12,000×gにて15分間遠心分離し、液体を、ピペッターを使用して排液する。それぞれの試料に1mLのFASTIN色素試薬(TPPS)を100μLの90%の飽和硫酸アンモニウムと共に添加する。次いで、試料チューブの蓋をして、機械振盪しながら室温で1時間インキュベートさせる。硫酸アンモニウムを作用させて、エラスチン-色素複合体を沈殿させる。混合工程の1時間後、試料を12,000×gにて15分間遠心分離し、液体を、ピペッターを使用して排液する。それぞれのチューブの底の茶色の沈殿物を、グアニジンHClのI-プロパノール溶液である1mLのFASTIN解離試薬に溶解する。試料についてのUV吸光度をBeckman DU-7400 UV-VIS分光光度計を使用して513nmにて測定する。それぞれの試料のエラスチンの濃度対513nmにおける吸光度(OD)を使用して、標準検量線をプロットする。本アッセイ法における実験誤差を決定するために、アッセイ法を単一の低濃度(10μg/100μL)の標準エラスチンにて繰り返す(n=10)。膜試料を、同じプロトコルを使用してアッセイし、試料を100μLの総容積で添加する。それぞれの試料を3回アッセイする。
【００９５】
更にその他の実施態様において、本発明は、当該技術分野において公知で、及び本明細書において例証した方法を使用して本発明のコラーゲン組成物の総グリコサミノグリカン(GAG)含量を決定するためのアッセイ法を包含する。本発明のコラーゲン組成物におけるGAGの存在は、Biocolor Ltd, UKによって製造される定量的色素に基づいたアッセイキット(BLYSCAN)を使用して測定してもよい。本アッセイ法は、特異的GAG結合色素として1,9-ジメチル-メチレンブルーを利用する。GAGに結合した色素は、UV-Vis分光光度計において656nmの吸光度の濃度依存的な増大を示す。本アッセイ法は、公知の濃度の一連のウシGAG標準吸光度を測定することによって標準較正曲線を作成することを含む。羊膜試験試料中のGAGの濃度は、標準曲線を参照することによって決定される。ウシGAG(0.1mg/mL)を0.5〜5μg/100μLの濃度にて1.5mLのマイクロ遠心チューブに分注する。試料体積を水で100μLに合わせる。それぞれの試料に1mLの1,9-ジメチル-メチレン色素試薬を室温で添加する。試料チューブの蓋をして、機械的振盪しながら室温で30分間インキュベートさせる。次いで、試料を12,000×gにて15分間遠心分離し、ピペッターを使用して液体を排液させる。それぞれのチューブの底の赤みがかった沈殿物を1mLの色素解離試薬に溶解する。試料についてのUV吸光度をBeckman DU-7400 UV-VIS分光光度計を使用して656nmにて測定する。標準的検量線をそれぞれの試料におけるGAGの濃度対540nmにおける吸光度(OD)を使用してプロットする。実験誤差を決定するために、本アッセイ法を単一の低濃度(10μg/100μL)のGAG標準にて繰り返す(n=8)。膜試料を、同じプロトコルを使用してアッセイし、試料を100μLの総容積で添加する。それぞれの試料を3回アッセイする。
【００９６】
更にその他の実施態様において、本発明は、当該技術分野において公知で、及び本明細書において例証した方法を使用して、本発明のコラーゲン組成物の総ラミニン含量を決定するためのアッセイ法を包含する。本発明のコラーゲン組成物における総ラミニン含量を決定するための例示的なアッセイ法には、以下を含んでいてもよい:Takara Bio Inc., Shiga、Japan(Cat # MKIO7)からキットとして提供されるサンドイッチELISAアッセイ法を使用してもよい。キットには、ヒトラミニンに対するマウスモノクローナル抗体である一次(捕獲抗体)でプレコートされた96ウェルプレートを含む。二次抗体(検出抗体)及びヒトラミニン標準は、キットと共に提供される。検出抗体は、ペルオキシダーゼと抱合されたヒトラミニン抗体である。色素生産性基質テトラメチルベンジジン及びH₂O₂との酵素反応により、青色を示し、これが450nmにてUV-Vis分光法を介して検出される。ラミニンの量を定量化するために、標準構成曲線を、公知の濃度の一連のヒトラミニン標準試料(キットと共に提供される)で作成する。羊膜の試験試料中のラミニンの濃度は、標準曲線を参照することによって決定される。アッセイプロトコルは、Elisaキットの推奨に従って展開される。標準較正曲線を作成するために、ヒトラミニン標準を、キットと共に提供される抗体がプレコートとされた96ウェルトレーの個々のウェルに5ng/mL〜160ng/mLの濃度を増大しつつ100μLの最終体積で添加する。室温で1時間のインキュベーション後、ウェルを3回洗浄緩衝液で洗浄して(0.05% TWEEN(登録商標)を含むPBS)、結合していないラミニンを除去する。次いで、ペルオキシダーゼ抱合ラミニン抗体をウェル内の抗体-ラミニン複合体に100μL体積で添加し、室温で1時間結合させる。96ウェルプレートを繰り返し洗浄し(4×)、あらゆる結合していない酵素/抗体複合体を除去する。色素生産性基質+ H₂O₂を各々のウェルに100μL体積で添加する。反応を室温で30分間進行させる。反応を100μLの2.5N硫酸の添加によって終結させる。吸光度を450nmにて測定する。可溶化された膜の試料を1000ng/mLの濃度にて試験する。それぞれの膜試料を3回試験する。ラミニン濃度は、以下に示すように総膜重量の濃度として示される。
【００９７】
更にその他の実施態様において、本発明は、当該技術分野において公知で、及び本明細書において例証した方法を使用して本発明のコラーゲン組成物の総フィブロネクチン含量を決定するためのアッセイ法を包含する。本発明のコラーゲン組成物の総フィブロネクチン含量を決定するための例示的アッセイ法は、以下を含んでいてもよい:Takara Bio Inc., Shiga, Japan(Cat # MK1 15)からキットとして提供されるサンドイッチELISAアッセイ法を使用してもよい。キットには、一次(捕獲抗体)ヒトフィブロネクチンに対するマウスモノクローナル抗体がプレコートされた96ウェルプレートを含む。二次抗体(検出抗体)及びヒトフィブロネクチン標準は、キットと共に提供される。検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ヒトフィブロネクチン抗体である。色素生産性基質テトラメチルベンジジン及びH₂O₂との酵素反応により、青色を示し、これが450nmにおけるUV-Vis分光法を介して検出される。フィブロネクチンの量を定量化するために、標準較正曲線を公知の濃度の一連のヒトフィブロネクチン標準試料(キットと共に提供される)で作成する。試験試料中のフィブロネクチンの濃度を、標準曲線を参照することによって決定する。アッセイプロトコルは、ELISAキットの推奨に従って展開される。標準較正曲線を作成するために、ヒトフィブロネクチン標準を、キットと共に提供される抗体がプレコートとされた96ウェルトレーの個々ウェルに12.5ng/mL〜400ng/mLの濃度を増大しつつ100μLの最終体積で添加する。室温で1時間のインキュベーション後、ウェルを3回洗浄緩衝液で洗浄して(0.05% TWEEN(登録商標)を含むPBS)、結合していないフィブロネクチンを除去する。次いで、ペルオキシダーゼ抱合フィブロネクチン抗体をウェル内の抗体-フィブロネクチン複合体に100μL体積で添加し、室温で1時間結合させる。96ウェルプレートを繰り返し洗浄し(4×)、あらゆる結合していない酵素/抗体抱合体を除去する。色素生産性基質+ H₂O₂を各々のウェルに100μL体積で添加する。反応を室温で30分間進行させる。反応を100μLの2.5N硫酸の添加によって終結させる。吸光度を450nmにて測定する。可溶化された膜の試料を1000μg/mLの濃度にて試験する。それぞれの膜試料を3回試験する。
【００９８】
(6.4.2 生体適合性研究)
本発明のコラーゲン組成物は、生物学的起源であり、有意な量のコラーゲンを含む。しかし、動物供与源(ウシ及びブタ)に由来するコラーゲンとは異なり、ヒトコラーゲンは、非免疫原性である。非免疫原性の人体組織は、他人の人体組織と本質的に生体適合性であるので、いくつかの標準的生体適合性試験(例えば、経皮刺激及び感作、急性全身毒性)を行う必要がない。本発明は、本発明のコラーゲン組成物の生体適合性を決定するためのアッセイ法を包含する。本明細書に使用される生体適合性とは、生活組織において毒性の、有害な、若しくは免疫学的な反応又は拒絶を生じないことによって、生物学的に適合性の特性をいう。体に人工物質を使用していると、未知の材料に対する身体の反応が主要な懸念となり、それ故、材料の生体適合性は、このような材料における重要な設計事項である。本発明の範囲内に包含される生体適合性アッセイ法は、細胞障害性アッセイ法、ウサギ眼刺激性試験、溶血アッセイ法及び発熱性アッセイ法を含むが、限定されない。本発明の生体適合性アッセイ法は、細胞に基づいた、又は無細胞に基づいたアッセイ法である。
【００９９】
更にもう一つの特定の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物の細胞障害性は、ISO MEM溶出試験(実施例6.4.2.2)を使用して決定される。この研究の目的は、コラーゲン組成物が、培養されたマウス線維芽細胞において細胞障害反応を誘発する能力を評価することである。例示的アッセイ法において、5%のウシ胎児血清(FBS)を補ったイーグル最小必須培地(EMEM)が抽出試験試料に使用される。また、培地には、以下の1つ以上が補充される:L-グルタミン、HEPES、ゲンタマイシン、ペニシリン、バンコマイシン及びアンフォテリシンB(ファンギゾン)。L-929細胞(マウス線維芽細胞)の培養液を培養し、空気中の5±1%の二酸化炭素の加湿された雰囲気において37±1℃にて使い捨て組織培養実験器具の単層として使用する。試験試料を、120cm²試料及び20ml-E-MEMプラス5%のFBSに等しい比率を使用して無傷のまま抽出する。試験試料を37±1℃にてE-MEMプラス5%のFBS中で5±1%の二酸化炭素にて24〜25時間抽出する。抽出期間の後、維持培地を試験培養ウェルから除去し、1mlの試験培地/抽出物と置き換えて、対照培地/抽出物及びポジティブ対照培地を塩化カドミウムでスパイクする。ポジティブ、中間及びネガティブ対照を試験試料と並行して実行する。塩化カドミウムでスパイクした試験培地/抽出物及び対照培地/抽出物及びポジティブ対照培地をプレートに3回まき、空気中の5±1%二酸化炭素の加湿された雰囲気において37±1℃にて72±4時間インキュベートする。培養を24、48及び72±4時間インキュベーション期間にて顕鏡観察によって細胞毒性について評価する。細胞障害性を評価するための基準は、肉芽形成、鋸歯状突起又は丸まりなどの細胞の形態学的変化及び溶解又は分離による単層からの生細胞の喪失を含む。試験の妥当性は、ネガティブ対照培養が試験の期間の全体にわたって健康な正常外見を維持することを必要とする。毒性の程度は、以下の通りに記録される:
【０１００】
0 なし:分散した細胞質内顆粒;細胞溶解なし。
1 軽微:細胞の20%以下が、丸く、ゆるく付着され、かつ細胞質内の顆粒がなく;随時の溶解した細胞は、存在する。
2 軽度:細胞の50%以下が丸く、細胞質内顆粒を欠いている;広範な細胞溶解及び細胞間空領域なし。
【０１０１】
3 中程度:細胞層の70%以下が丸い細胞を含み、及び/又は溶解されている。
4 重篤:ほとんど完全な細胞層の破壊。
【０１０２】
USPによれば、「0」、「1」又は「2」を記録する試験項目は、非中毒性であるとみなされる。「3」又は「4」を記録する試験項目は、有毒であるとみなされる。ポジティブ対照試料は、「3」又は「4」のスコアを有さなければならず、ネガティブ対照試料は、実証試験について「0」のスコアを有さなければならない。
【０１０３】
ウサギの接眼面は、ヒト皮膚よりも感受性が高いことが公知であり、従って、ウサギ眼刺激研究が本発明のコラーゲン組成物の生体適合性を評価するために使用される。例示的アッセイ法において、試料を一次眼刺激についてスクリーニングする。羊膜を0.05%のデオキシコール酸一水和物ナトリウム塩(D-Cell)の水溶液を使用して清浄する。試験は、連邦危険物法(FHSA)規則、16CFR 1500の指針に従って行うことができる。例示的アッセイ法において、対照眼は、補助的光源で肉眼検査によって、ウサギについて臨床的に正常であると判断される。いずれの既存の角膜傷害を検出するためにも、眼をフルオレッセイン染料で処理し、0.9%のUSP生理的食塩水(PSS)で洗浄して、暗い部屋にて紫外線で観察する。試料は、標準的技術に従ってそれぞれのウサギの片眼の下結膜嚢に滴下注入する。それぞれのウサギの反対の眼は、未処置のままにし、比較対照として役立てる。動物を処理後にそれらのケージに戻す。投薬の24、48及び72時間後にて、それぞれのウサギの試験眼を未処置の対照眼と比較して補助的光源及び適切な拡大率で調べて、眼刺激について類別する。角膜傷害を検出し、又は確認するためには、試験眼をフルオレッセイン染料で処理し、PSSで洗浄して、24時間にて紫外線灯での暗条件下で調べる。FHSA修飾ドレーズスコアリング基準に従って反応を記録する。有意な陽性反応を示す3匹の動物の1匹を境界知見とする。有意な陽性反応を示す3匹の動物のうちの2匹を有意な陽性反応とし、試験品を刺激物とみなす。
【０１０４】
本発明は、当該技術分野において公知で、及び本明細書において例証した方法(実施例6.4.2.4を参照されたい)を使用して本発明のコラーゲン組成物の溶血特性を決定することを包含する。溶血は、血液に接触するであろう試験試料の溶血特性を記述する。これは、材料及び装置と接触する際の赤血球膜脆弱性を測定するので、これは特に有意なスクリーニング試験と考えられる。例示的アッセイ法において、手順には、血球懸濁液に試験材料を曝露すること、次いで放出されるヘモグロビンの量を決定することを含む。試験は、静状態下でヒト血液と試験試料の直接接触して実行する。赤血球によって放出されるヘモグロビンの量を分光光度的に540nmにて(シアノメトヘモグロビンへの変換後)ネガティブ及びポジティブ対照と共に測定する。試料及び対照のための溶血インデックスは、以下の通りに算出する:
【０１０５】
溶血インデックス=ヘモグロビン放出(mg/ml)×100
【０１０６】
存在するヘモグロビン(mg/ml)
【０１０７】
ここで:ヘモグロビン放出(mg/ml)=(定数 + X 係数)×
【０１０８】
光学密度×16。存在するヘモグロビン(mg/mL)=希釈した血液10±1mg/mL。
【０１０９】
本発明は、当該技術分野において公知で、及び本明細書において例証した方法(実施例6.4.2.5を参照されたい)を使用して本発明のコラーゲン組成物の発熱原性を決定するための方法を包含する。一つの実施態様において、本発明のコラーゲン組成物の発熱原性は、例えばカブトガニ(Limulus Amebocyte)可溶化液(LAL)試験を使用して、本発明のコラーゲン組成物中の細菌内毒素の存在を測定することによって決定する。この試験は、細菌内毒素の検出及び定量化のためのインビトロでのアッセイ法である。例示的試験において、コラーゲン組成物の98試料(ロットあたりn=1)をそれぞれ1×2cmで測定し、抽出について個々に試験する。抽出は、それぞれの試料を30mLの抽出液体中で37〜40℃にて40〜60分間、オービタルシェーカーでの断続的に回旋しつつ洗浄することによって行う。それぞれの試料抽出物のpHは、pH紙で検証すると6〜8の間である。発熱物質レベルは、1mLあたり0.05の内毒素単位(EU)の試験感受性で、動力学的濁度比色試験(Kinetic Turbidimetric Colorimetric Test)によって測定する。試料あたりの総内毒素レベルは、検出された内毒素値(EU/mL)を30mL(装置あたりの抽出体積)に、及び再び24(6×8cmの大きさの装置をシミュレートするために)に乗じることによって算出する。
【０１１０】
(6.4.3 微生物学的研究)
本発明は、本発明のコラーゲン組成物における大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、糞便腸球菌(Enterococcus faecalis)、鵞口瘡カンジダ(Candida albicans)、尋常変形菌(Proteus vulgaris)、ビリダンス連鎖球菌(Staphylococcus viridans)及び緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)を含むが、限定されない微生物学的生物体の存在を決定するための、当該技術分野において公知であり、及び本明細書に例証した方法を包含する。このような方法は、コラーゲン組成物の調製のいずれの工程にて使用してもよい。処理の間の微生物学研究のための例示的過程には、以下を含む:未処理の羊膜の微生物学的に「スパイクした」試料及び処理の間に使用する設備の試験。試料を以下の通りの8種の微生物でスパイクした塩類溶液に5分間浸漬し、試料を故意に汚染させる:
【０１１１】
1. 大腸菌(Escherichia coli) 5.鵞口瘡カンジダ(Candida albicans)。
【０１１２】
2. 肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae) 6.尋常変形菌(Proteus vulgaris)。
【０１１３】
3.黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus) 7.ビリダンス連鎖球菌(Staphylococcus viridans)。
【０１１４】
4.糞便腸球菌(Enterococcus faecalis) 8.緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)。
【０１１５】
好都合には、本発明の細胞除去及びリンス法により、本発明のコラーゲン組成物での微生物の数を減少させることができる。
【０１１６】
本発明は、本発明のコラーゲン組成物の生物負荷を決定するための、当該技術分野において公知で、及び本明細書において例証した方法を包含する。本明細書に使用される「生物負荷」とは産業上滅菌法を受ける前の、所与の量の材料で見いだされる混入生物体の程度である。例示的方法において、10-6の滅菌保証レベルで滅菌を達成するであろう最小E-ビーム放射線量が決定される。膜は、Peptone-Tween(登録商標)溶液を使用して、液浸及び手動振盪によって抽出する。平板分離法は、ダイズ-カゼイン消化寒天を使用する膜分離である。好気条件については、プレートを30〜35℃にて4日間インキュベートし、次いで数え上げる。真菌については、プレートを20〜25℃にて4日間インキュベートし、次いで数え上げる。芽胞菌については、抽出部分を熱ショックして、濾過し、好気性菌についてと同様にプレートにまく。嫌気性菌については、プレートを30〜35℃にて4日間インキュベートし、数え上げ、プレートを嫌気的条件下で30〜35℃にて4日間インキュベートし、次いで数え上げる。利用した微生物は、クロストリジウム・スポロジェネス(Clostridium sporogenes)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、及びバシラス・アトロフェウス(Bacillus atrophaeus)である。
【０１１７】
特定の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、好気性菌及び真菌について2未満のコロニー形成単位(cfu)を、好気性菌及び真菌について1未満又は0cfuを有する。更にその他の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、嫌気性菌及び胞子について5.1未満のコロニー形成単位(cfu)を、2未満又は1未満のcfuを有する。
【０１１８】
特定の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、本明細書において例証され、及び当業者に公知の方法(実施例6.4.3.2を参照されたい)を使用して決定すると静菌剤又は静真菌剤ではない。本明細書に使用される静菌剤とは、細菌生育又は生殖を阻害するが、細菌を殺さない薬剤をいう。本明細書に使用される、静真菌剤とは、非殺真菌性の化学的又は物理的媒体の存在下で、真菌の増殖を防げる薬剤をいう。
【０１１９】
(6.4.4 コラーゲン組成物の貯蔵及び取扱い)
本発明は、室温(例えば、25℃)で、本発明のコラーゲン組成物を貯蔵することを包含する。ある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、少なくとも0℃、少なくとも4℃、少なくとも10℃、少なくとも15℃、少なくとも20℃、少なくとも25℃、少なくとも30℃、少なくとも35℃又は少なくとも40℃の温度にて貯蔵することができる。一部の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、冷蔵されない。一部の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、約2〜8℃の温度にて冷蔵してもよい。その他の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、上で確認したいずれの温度においても長期間貯蔵することができる。特定の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、滅菌及び非酸化条件下で貯蔵される。ある実施態様において、本発明の方法に従って産生されるコラーゲン組成物は、規定温度のいずれにおいても、12月以上の間に生化学的又は構造的な統合性に変化を伴わずに(例えば、分解なく)、コラーゲン組成物の生化学的又は生物物理学的特性になんらの変化を伴わずに貯蔵することができる。ある実施態様において、本発明の方法に従って産生されるコラーゲン組成物は、規定温度のいずれにおいても、数年間に生化学的又は構造的な統合性に変化を伴わずに(例えば、分解なく)、コラーゲン組成物の生化学的又は生物物理学的特性になんらの変化を伴わずに貯蔵することができる。ある実施態様において、本発明の方法に従って調製される本発明のコラーゲン組成物は、無期限に維持することが予想される。コラーゲン組成物は、長期貯蔵のために適切ないずれの容器に貯蔵してもよい。好都合には、本発明のコラーゲン組成物は、滅菌の二重ピール嚢(peal-pauch)パッケージに貯蔵することができる。
【０１２０】
(6.4.5 滅菌)
本発明のコラーゲン組成物は、このような組成物を滅菌するための当業者に公知の技術に従って滅菌することができる。
【０１２１】
ある実施態様において、コラーゲン組成物は、内毒素を通過させ、かつコラーゲン組成物を保持するフィルターを通して濾過される。内毒素の濾過のために当業者に公知の任意のサイズ、例えば30kDaのフィルターを使用することができる。ある実施態様において、コラーゲン組成物は、コラーゲン組成物を保持すると共に、内毒素がフィルターを通過することができる条件下でフィルターと接触させる。条件は、当業者に公知の濾過のための任意の条件、例えば遠心分離又はポンピングであることができる。フィルターは、内毒素がフィルターを通過することができる共に、コラーゲンを保持するサイズであるべきである。ある実施態様において、フィルターは、5kDa〜100kDaの間である。特定の実施態様において、フィルターは、約5kDa、約10kDa、約15kDa、約20kDa、約30kDa、約40kDa、約50kDa、約60kDa、約70kDa、約80kDa、約90kDa又は約100kDaである。フィルターは、セルロース、ポリエーテルスルホン及び当業者に明らかなその他のものなどのコラーゲン組成物に適合性である当業者に公知のいずれの材料のものであることもできる。濾過は、当業者の要望通りの回数繰り返すことができる。内毒素は、排除をモニターするための標準的技術に従って検出することができる。
【０１２２】
ある実施態様において、コラーゲン組成物を濾過して、ウイルス粒子がないか、又は減少したコラーゲン組成物を産生することができる。好都合には、本発明のこれらの実施態様において、フィルターは、ウイルス粒子が通過することができる共に、コラーゲン組成物を保持する。ウイルスを除くために有用な当業者に公知のいずれのフィルターを使用することもできる。例えば、1000kDaのフィルターは、パルボウイルス、A型肝炎ウイルス及びHIVの排除又は減少のために使用することができる。750kDaのフィルターは、パルボウイルス及びA型肝炎ウイルスの排除又は減少のために使用することができる。500kDaのフィルターは、パルボウイルスの排除又は減少のために使用することができる。
【０１２３】
従って、本発明は、ウイルス粒子がないか、又は減少したコラーゲン組成物を産生する方法であって、コラーゲン組成物を保持すると共に、1つ以上のウイルス粒子がフィルターを通過することができるサイズのフィルターとコラーゲン組成物を接触させる工程を含む方法を提供する。ある実施態様において、コラーゲン組成物は、コラーゲン組成物を保持すると共に、1つ以上のウイルス粒子がフィルターを通過することができる条件下でフィルターと接触される。条件は、当業者に公知の濾過のための任意の条件、例えば遠心分離又はポンピングであることができる。フィルターは、1つ以上のウイルス粒子がフィルターを通過することができる共に、コラーゲンを保持するサイズであるべきである。ある実施態様において、フィルターは、500kDa〜1000kDaの間である。特定の実施態様において、フィルターは、約500kDa、約750kDa又は約1000kDaである。フィルターは、セルロース、ポリエーテルスルホン及び当業者に明らかなその他のものなどのコラーゲン組成物に適合性である当業者に公知のいずれの材料のものであることもできる。濾過は、当業者の要望通りの回数繰り返すことができる。ウイルス粒子は、濾過をモニターするための標準的技術に従って検出することができる。
【０１２４】
また、本発明のコラーゲン組成物の滅菌は、当業者に公知の方法、例えばGorham, D. Byrom (ed.), 1991, Biomaterials, Stockton Press, New York, 55-122を使用して、電子線照射によって行うことができる。少なくとも99.9%の細菌又はその他の潜在的に混入する生物体を殺すために十分な放射のいずれの用量も、本発明の範囲内である。特定の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物の末端滅菌を達成するために少なくとも18〜25kGyの用量が使用される。
【０１２５】
(6.5 コラーゲン組成物の製剤)
ある実施態様において、本発明は、コラーゲン組成物を提供する。コラーゲンは、本発明のいずれかのコラーゲン、例えば本明細書の方法の1つによって調製されたコラーゲンであることができる。有利なことには、コラーゲンを水又はリン酸緩衝食塩水中で製剤化することができる。特定の実施態様において、コラーゲンは、リン酸緩衝食塩水中で製剤化される。
【０１２６】
コラーゲンは、当業者に有用ないずれの濃度であることもできる。ある実施態様において、本発明の製剤は、0.1〜100mg/ml、1〜100mg/ml、1〜75mg/ml、1〜50mg/ml、1〜40mg/ml、10〜40mg/ml又は20〜40mg/mlのコラーゲンを含む。ある実施態様において、本発明の製剤は、約5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml又は50mg/mlのコラーゲンを含む。特定の実施態様において、本発明は、約35mg/mlのコラーゲンを含む製剤を提供する。
【０１２７】
本発明のある実施態様において、コラーゲン組成物を乾燥させ、当業者にとって有用な形状に成形することができる。該形状は、シート、チューブ、プラグ及び球等を含む任意の有意な形状であり得る。ある実施態様において、該コラーゲン組成物は、創傷又は傷害の部位に適合するように成形される。成形したコラーゲン組成物を当業者に明らかな任意の目的で使用することができる。成形コラーゲン組成物の代表的な使用方法を以下に示す。
【０１２８】
胎盤から抽出された本発明の組成物は、典型的には白色ペーストである。このペーストを、当該材料を成形するための当該技術分野で知られているあらゆる方法に従って成形することができる。例えば、該組成物を金型に押し込み、又は金型の周囲に形成して、特定の形状を作り、加熱乾燥、真空乾燥又は凍結乾燥することができる。該組成物を薄く引き伸ばし、例えばゲル乾燥器上で、例えば真空を利用して乾燥させることもできる。
【０１２９】
ある実施態様において、本発明の組成物は、医薬として又は美容的に許容し得る担体と組み合わせて、インビトロ又はインビボにおいて組成物として投与されてもよい。投与の形態には、注射、溶液、クリーム、ゲル、インプラント、ポンプ、軟膏、エマルション、懸濁液、微粒子、粒子、微小粒子、ナノ粒子、リポソーム、ペースト、パッチ、錠剤、経皮デリバリー装置、スプレー、エアロゾル又は当該技術分野の当業者によく知られているその他の手段を含むが、限定されない。このような医薬として又は美容的に許容し得る担体は、当該技術分野の当業者に一般に公知である。本発明の医薬品製剤は、周知かつ容易に利用できる成分を使用して、当該技術分野において公知の手順によって調製することができる。例えば、化合物は、一般的賦形剤、希釈剤又は担体と共に製剤化することができ、錠剤、カプセル、懸濁液、粉末、その他の中に形成することができる。このような製剤のために適切した賦形剤、希釈剤及び担体の例には、以下を含む:充填剤及び増量剤(例えば、デンプン、糖、マンニトール及びケイ素誘導体);結合剤(例えば、カルボキシメチルセルロース及びその他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン並びにポリビニル-ピロリドン);保湿剤(例えば、グリセロール);崩壊剤(例えば、炭酸カルシウム及び炭酸水素ナトリウム);溶解を遅延させるための薬剤(例えば、パラフィン);再吸収促進剤(例えば、四級アンモニウム化合物);界面活性剤(例えば、セチルアルコール、グリセロールモノステアレート);吸着性担体(例えば、カオリン及びベントナイト);乳化剤;防腐剤;甘味料;安定剤;着色剤;芳香剤;香味料;潤滑剤(例えば、タルク、カルシウム及びステアリン酸マグネシウム);固体ポリエチルグリコール;及びこれらの混合物である。
【０１３０】
「医薬として又は美容的に許容し得る担体」又は「医薬として又は美容的に許容し得る媒体」という用語は、本明細書において、限定されることなく、有害な生理学的又は美容的反応を生じさせることなく、生きている動物又は人体組織との接触に使用するために適しており、かつ有害な様式で組成物のその他の成分と相互作用しない、水又は塩類溶液、ゲル、クリーム、膏薬、溶媒、希釈剤、液体軟膏基剤、軟膏、ペースト、インプラント、リポソーム、ミセル、巨大ミセル、その他を含むが、限定されない任意の液体、固体又は半固体を意味するために使用される。当業者に公知のその他の医薬として若しくは美容的に許容し得る担体又は媒体は、本発明の分子を送達するための組成物を作製するために使用してもよい。
【０１３１】
製剤は、これらが活性成分のみを、又は好ましくは特定の位置に、おそらくある期間にわたって放出するように構成することができる。このような組合せは、更に、放出動態を制御するための更なる機序を提供する。コーティング、エンベロープ及び保護マトリックスを、例えば高分子物質又は蝋から作製してもよい。
【０１３２】
本発明の組成物の、又はこのような組成物と本発明の種々の形態のために特に適した担体などのその他の材料とを含む製剤のインビボ投与の方法は、経口投与(例えば、頬又は舌下投与)、肛門投与、直腸投与、坐薬としての投与、局所適用、エアロゾル適用、吸入法、腹腔内注射、静脈内投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、筋内投与、子宮内投与、膣投与、体腔内投与、腫瘍又は内部損傷位置への外科的投与、器官の内腔又は実質への投与、及び非経口投与を含むが、限定されない。上記の種々の形態の投与に有用な技術には、局所適用、摂取、外科的投与、注射、スプレー、経皮デリバリー装置、浸透ポンプ、所望の部位に対する直接電着、又は当該技術分野の当業者によく知られているその他の手段を含むが、限定されない。適用の部位は、表皮上などの外部又は内部、例えば胃潰瘍、外科的領域若しくはその他であることができる。
【０１３３】
本発明のコラーゲン組成物は、クリーム、ゲル、溶液、懸濁液、リポソーム、粒子又は治療的及び美容的化合物の製剤化並びに送達の当業者に公知のその他の方法の形態で適用することができる。治療薬の吸入送達のために超微細粒径のコラーゲン材料を使用することができる。皮下投与のための適切な製剤のいくつかの例には、インプラント、デポー、針、カプセル及び浸透ポンプを含むが、限定されない。膣投与のための適切な製剤のいくつかの例には、クリーム及びリングを含むが、限定されない。経口投与のための適切な製剤のいくつかの例には、丸剤、液体、シロップ及び懸濁液を含むが、限定されない。経皮投与のための適切な製剤のいくつかの例には、ゲル、クリーム、ペースト、パッチ、スプレー及びゲルを含むが、限定されない。皮下投与のための適切な送達機序のいくつかの例には、インプラント、デポー、針、カプセル及び浸透ポンプを含むが、限定されない。非経口投与のために適切な製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張性にする溶質を含んでいてもよい水性及び非水性滅菌注射溶液、並びに懸濁剤及び糊料を含んでいてもよい水性及び非水性滅菌懸濁液を含むが、限定されない。即席注射溶液及び懸濁液は、当該技術分野の当業者によって一般に使用される滅菌の粉末、顆粒及び錠剤から調製してもよい。
【０１３４】
本発明の組成物が、例えば1つ以上の「医薬として又は美容的に許容し得る担体」又は賦形剤と組み合わせられる実施態様は、単位剤形に都合よく存在してもよく、従来の医薬的技術によって調製してもよい。このような技術には、活性成分と医薬品担体(類)又は賦形剤(類)とを含む組成物を結合させる工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体と一様かつ親密に結合させることによって調製される。特定の単位投薬量製剤は、投与される成分の、用量若しくは単位又はその適切な画分を含むものである。上で詳述した成分に加えて、本発明の組成物を含む製剤は、当該技術分野の当業者によって一般に使用されるその他の薬剤を含んでいてもよいことが理解されるはずである。投与体積は、投与経路に応じて変化するであろう。例えば、筋肉内注射は、約0.1ml〜1.0mlの体積の範囲であってもよい。
【０１３５】
本発明の組成物は、所望の生理学的又は薬理学的結果を生じるであろう任意の用量範囲にて物質を提供するようにヒト又は動物に投与してもよい。投薬量は、投与される物質又は物質群、望まれる治療指標、作用部位における、又は体液中での所望有効濃度及び投与のタイプに依存する。物質の適切な用量に関する情報は、当業者に公知であり、L. S. Goodman及びA. Gilman, eds,治療学の医薬基礎(The Pharmacological Basis of Therapeutics), Macmillan Publishing, New York, and Katzung, Basic & Clinical Pharmacology, Appleton & Lang, Norwalk, Connecticut, (6th Ed. 1995)などの文献において見いだされるであろう。所望の療法の技術分野に熟練した臨床家が、投与される環境及び物質によって必要とされる具体的投薬量及び用量の範囲、並びに投与の頻度を選んでもよい。
【０１３６】
コラーゲン組成物は、コラーゲンではない1つ以上の化合物又は物質を含んでいてもよい。例えば、コラーゲン組成物は、製造の間又は外科手術のための準備の間のいずれにおいても、生体分子と共に浸漬させてもよい。このような生体分子には、抗生物質(クリンダマイシン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシンなど)、ホルモン、成長因子、抗腫瘍薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、疼痛薬物、抗ヒスタミン剤、抗炎症薬、銀(硝酸銀及びスルファジアジン銀を含むが、限定されない銀塩など) を含むが限定されない抗感染症薬、元素の銀、抗生物質、殺菌性酵素(リゾゾーム(lysozome))など)、創傷治癒薬(PDGF、TGFを含むが、限定されないサイトカイン;チモシンなど)、創傷治癒薬としてのヒアルロン酸、創傷シーラント(トロンビンを伴う又は伴わないフィブリンなど)、細胞誘引剤及び足場試薬(フィブロネクチンなど)及びその他を含むが、限定されない。具体例において、コラーゲン組成物は、少なくとも1つの成長因子、例えば線維芽細胞成長因子、上皮成長因子などと共に浸漬させてもよい。また、コラーゲン組成物は、特定の生化学的過程の特異的阻害剤、例えば膜受容体阻害剤、キナーゼ阻害剤、成長抑制物質、抗癌薬、抗生物質、その他などの小有機分子と共に浸漬してもよい。
【０１３７】
更にその他の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、ヒドロゲルと組み合わせてもよい。当業者に公知の任意のヒドロゲル組成物が、本発明の範囲内に包含され、例えば、任意のヒドロゲル組成物が以下の総説に開示されており:Graham, 1998, Med. Device Technol. 9(1): 18-22; Peppasらの論文,2000, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50(1): 27-46; Nguyenらの論文,2002, Biomaterials, 23(22): 4307-14; Heninclらの論文,2002, Adv. Drug Deliv. Rev 54(1): 13-36; Skelhorneらの論文,2002, Med. Device. Technol. 13(9): 19-23; Schmedlenらの論文,2002, Biomaterials 23: 4325-32;これらは、これらの全体において引用により本明細書に取り込まれている。具体的実施態様において、ヒドロゲル組成物は、コラーゲン組成物に適用され、すなわちコラーゲン組成物の表面に放出される。ヒドロゲル組成物は、例えばコラーゲン組成物に吹き付けても、コラーゲン組成物の表面で飽和させても、コラーゲン組成物と共に浸漬しても、コラーゲン組成物と共に浸しても、又はコラージュコラーゲン組成物の表面に被覆してもよい。
【０１３８】
本発明の方法及び組成物に有用なヒドロゲルは、ポリビニルアルコール(PVA)、メタクリル酸ポリヒドロキシエチル、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸、デキストラン又はそれらの誘導体及び類似体を含むが、限定されない、当該技術分野において公知の任意の水相互作用的又は水溶性重合体から作製することもできる。
【０１３９】
一部の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、ヒドロゲルと組み合わせる前に、更に1つ以上の生体分子と共に浸漬される。その他の実施態様において、ヒドロゲル組成物は、本発明のコラーゲン組成物と組み合わせられる前に、更に1つ以上の生体分子と共に浸漬される。このような生体分子には、抗生物質(クリンダマイシン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシンなど)、ホルモン、成長因子、抗腫瘍薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、疼痛薬物適用、抗ヒスタミン剤、抗炎症薬、銀(硝酸銀及びスルファジアジン銀を含むが、限定されない銀塩など)を含むが限定されない抗感染症薬、元素の銀、抗生物質、殺菌性酵素(リゾゾーム(lysozome)など)、創傷治癒薬(PDGF、TGFを含むが、限定されないサイトカイン;チモシンなど)、創傷治癒薬としてのヒアルロン酸、創傷シーラント(トロンビンを伴う又は伴わないフィブリンなど)、細胞誘引剤及び足場試薬(フィブロネクチンなど)及びその他を含むが、限定されない。具体例において、コラーゲン組成物又はヒドロゲル組成物は、少なくとも1つの成長因子、例えば線維芽細胞成長因子、上皮成長因子などと共に浸漬させてもよい。好都合には、生体分子は、治療薬であることができる。
【０１４０】
一部の実施態様において、ヒドロゲル組成物は、本発明のコラーゲン組成物を含む積層物と組み合わせられる。
【０１４１】
ヒドロゲル/コラーゲン組成物は、限定されないが、創傷、火傷及び皮膚状態の治療(例えば、瘢痕を治療するため)、美容的使用(例えば、整容手術)、並びにインプラントとしての任意の使用を含む医療分野における有用性を有する。一部の実施態様において、ヒドロゲル/コラーゲン組成物は、被験体に対して局所的に、すなわち例えば創傷の治療のために皮膚の表面に適用される。その他の実施態様において、ヒドロゲル/コラーゲン組成物は、被験体の内部に、例えば体内において永久的又は準永久的な構造になるようにインプラントとして使用してもよい。いくつかの実施態様において、ヒドロゲル組成物は、生物分解性でないように製剤化される。更にその他の実施態様において、ヒドロゲル組成物は、生体分解性であるように製剤化される。具体的実施態様において、ヒドロゲル組成物は、数日以内に分解するように製剤化される。もう一つの特定の実施態様において、ヒドロゲル組成物は、数月以内に分解するように製剤化される。
【０１４２】
いくつかの実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、細胞が一様かつコンフルエントであるように、細胞と共に形成される。本発明のコラーゲン組成物を形成するために使用することができる細胞は、幹細胞、ヒト幹細胞、ヒト分化した成人細胞、全能性幹細胞、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、組織特異的幹細胞、胚様幹細胞、コミットされた前駆細胞、線維芽細胞様細胞を含むが、限定されない。その他の実施態様において、本発明は、軟骨細胞、肝細胞、造血幹細胞、膵臓実質細胞、神経芽細胞及び筋肉前駆細胞を含むが、限定されない前駆細胞の特異的クラスと共に本発明のコラーゲン組成物を形成することを包含する。
【０１４３】
(6.6 幹細胞)
ある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、複数の幹細胞を含む。該幹細胞は、所定の目的に好適な任意の幹細胞であり、全能性幹細胞若しくは多能性幹細胞であり、又は前駆細胞であり得る。好ましくは、該組成物は、米国出願公開第2003/0032179号及び同第2003/0180269号並びに米国特許第7,045,148号に記載されているもののような胎盤幹細胞を含む。しかし、該組成物は、任意の組織供給源からの幹細胞又は前駆細胞、好ましくは哺乳動物の幹細胞又は前駆細胞、例えば、胚幹細胞、胚生殖細胞、間葉幹細胞、骨髄由来幹細胞、造血性前駆細胞(例えば、末梢血液、胎児血液、胎盤血液、臍帯血液、胎盤潅流液等由来の造血幹細胞)、体性幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞、筋肉幹細胞及び脂肪幹細胞等を含むことができる。該組成物は、いくつかの種類の幹細胞の任意の組合せを含むことができる。好ましい実施態様において、該幹細胞は、ヒト幹細胞、例えば、ヒト胎盤幹細胞である。
【０１４４】
一般に、本発明の組成物は、複数の前記幹細胞又は前駆細胞が該組成物に接着するのに十分な時間にわたって複数の幹細胞又は前駆細胞と接触される。好ましい実施態様において、本発明の組成物は、幹細胞又は前駆細胞と接触する前に、有用な構造、例えば、シート、プラグ、チューブ又は他の構造に成形される。幹細胞又は前駆細胞と、本発明の組成物との接触は、当該技術分野で知られている任意の方法で実施され、例えば、幹細胞又は前駆細胞を含む培地を該組成物の表面上に分散させること;該組成物の一部又は全部を幹細胞又は前駆細胞の懸濁液に浸すこと;及び複数の幹細胞又は前駆細胞が少なくとも1つの細胞分裂にわたって増殖するのに十分な時間にわたって複数の幹細胞又は前駆細胞を該組成物の表面上で培養すること;等を含むことができる。幹細胞、好ましくは胎盤幹細胞は、本発明の組成物上に存在し得る。例えば、組成物表面の全体又は一部の該組成物の成形体は、例えば、表面上にランダム、密集した状態等で存在し得る。
【０１４５】
任意の実施態様における本発明の組成物と接触される幹細胞又は前駆細胞の数は、異なり得るが、少なくとも1×10⁶、3×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、1×10⁹、3×10⁹、1×10¹⁰、3×10¹⁰、1×10¹¹、3×10¹¹又は1×10¹²個であってもよく、或いは1×10⁶、3×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、1×10⁹、3×10⁹、1×10¹⁰、3×10¹⁰、1×10¹¹、3×10¹¹又は1×10¹²個以下の幹細胞又は前駆細胞であってもよい。
【０１４６】
ある他の実施態様において、本発明の組成物は、幹細胞によって堆積される1つ以上の種類の細胞外マトリックスタンパク質を含む。一実施態様において、例えば、本発明のコラーゲン組成物を複数の幹細胞と接触させること;幹細胞が検出可能な量の少なくとも1種類の細胞外マトリックスタンパク質を堆積するのに十分な時間にわたって幹細胞を該組成物上で培養すること;及び、該組成物を脱細胞化して、少なくとも1種類の細胞外マトリックスタンパク質を含むコラーゲン組成物を製造すること;によって、本発明のコラーゲン組成物に細胞外マトリックスタンパク質を含ませるように製造する。したがって、一実施態様において、本発明の組成物は、脱細胞化細胞外マトリックスを含み、該脱細胞化細胞外マトリックスは、幹細胞によって堆積又は生成される。様々な実施態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲン(I型、II型、III型及び/又はIV型)、エラスチン又はフィブロネクチンである。別の実施態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、増殖するが分化しない複数の幹細胞によって生成される。別の実施態様において、細胞外マトリックスは、分化する複数の幹細胞、又は複数の幹細胞から分化した複数の細胞によって生成される。上記実施態様の具体的な実施態様において、幹細胞は、胎盤幹細胞、例えば、CD34^-胎盤幹細胞又はCD200⁺胎盤幹細胞である。
【０１４７】
(6.6.1 胎盤幹細胞)
好ましい実施態様において、該組成物は、複数のCD34^-胎盤幹細胞を含む。CD34^-胎盤幹細胞は、胎盤組織から入手可能であり、組織培養基質に接着し、非胎盤細胞型に分化する能力を有する幹細胞である。胎盤幹細胞は、本来胎児細胞又は母体細胞であり得る(すなわち、母胎又は胎児の遺伝型を有し得る)。胎盤幹細胞の集団、又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、本来胎児細胞又は母体細胞のみの胎盤幹細胞を含むことができ、或いは胎児起源と母体起源の双方の胎盤幹細胞の混合集団を含むことができる。胎盤幹細胞、及び胎盤幹細胞を含む細胞の集団を、以下に記載の形態学的特性、マーカー特性及び培養特性によって識別並びに選択することができる。
【０１４８】
胎盤幹細胞は、一次培養又は細胞培養で培養されると、組織培養基質、例えば、組織培養容器表面(例えば、組織培養プラスチック)に接着する。培養における胎盤幹細胞は、一般には、線維芽、星状の外観を呈し、いくつかの細胞質プロセスが中央細胞体から伸びている。しかし、胎盤幹細胞は、線維芽細胞より多くの数の当該プロセスを示すため、同一条件下で培養された線維芽細胞と形態学的に区別可能である。形態学的には、胎盤幹細胞は、一般に培養中でより丸い又は玉石状の形態を呈する造血幹細胞とも区別可能である。
【０１４９】
胎盤幹細胞は、一般には、マーカーCD10、CD73、CD105、CD200、HLA-G及び/又はOCT-4を発現し、CD34、CD38又はCD45を発現しない。胎盤幹細胞は、HLA-ABC(MHC-1)及びHLA-DRを発現することもできる。したがって、一実施態様において、本発明の組成物と組み合わせることができる幹細胞は、CD200⁺又はHLA-G⁺である。別の実施態様において、該胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺である。別の実施態様において、該胎盤幹細胞は、CD200⁺及びOCT-4⁺である。別の実施態様において、該胎盤幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である。別の実施態様において、該胎盤幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺であり、胎盤細胞の集団においては、胚様体の形成を可能にする条件下で1つ以上の胚様体の形成を促進する。別の実施態様において、該胎盤幹細胞は、OCT-4⁺であり、胎盤細胞の集団においては、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されると、前記幹細胞を含む単離胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体の形成を促進する。
【０１５０】
胎盤幹細胞を潅流によって得ることができる。例えば、本発明は、臍帯血を抜き、残留血液を除去するために潅流された哺乳動物の胎盤を潅流すること;前記胎盤を潅流溶液で潅流すること;及び、前記潅流溶液を回収することであって、潅流後の前記潅流溶液が、胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を含むこと;並びに、複数の前記胎盤幹細胞を前記細胞の集団から単離すること;を含む方法に従って生成される胎盤幹細胞の単離集団を提供する。具体的な実施態様において、該潅流溶液は、臍静脈及び臍動脈の両方に通され、胎盤から滲出した後に回収される。この方法によって生成される胎盤幹細胞の集団は、典型的には、胎児細胞と母体細胞の混合物を含む。別の具体的な実施態様において、該潅流溶液は、臍静脈に通され、臍動脈から回収される、又は臍動脈に通され、臍静脈から回収される。この方法によって生成される胎盤幹細胞の集団は、本来実質的に専ら胎児細胞である。すなわち、該集団における胎盤幹細胞の例えば90%、95%、99%又は99.5%より多くが本来胎児細胞である。
【０１５１】
様々な実施態様において、胎盤の潅流により得られる細胞集団内に含まれる胎盤幹細胞は、前記胎盤細胞集団の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%又は少なくとも99.5%である。別の具体的な実施態様において、潅流によって回収される胎盤幹細胞は、胎児細胞及び母体細胞を含む。別の具体的な実施態様において、潅流によって回収される胎盤幹細胞は、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%又は少なくとも99.5%胎児細胞である。
【０１５２】
胎盤幹細胞を器官又はその一部の物理的破壊、例えば酵素消化によって哺乳動物の胎盤から回収することもできる。例えば、胎盤又はその一部を破砕する、切断する、切り刻む、さいの目に切る、細断する、浸軟する等しながら、本発明の幹細胞回収組成物と接触させ、続いて組織を1つ以上の酵素で消化させることができる。胎盤又はその一部を1つ以上の酵素で物理的に破壊・消化させ、次いで得られた材料を本発明の幹細胞回収組成物に浸漬又は混入させることもできる。物理的破壊方法が、例えば、トリパンブルー排除で測定された場合に前記器官における複数の、より好ましくは多くの、より好ましくは少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%又は99%の細胞を生存させることを条件として、任意の物理的破壊方法を用いることができる。
【０１５３】
胎盤を物理的破壊及び/又は酵素消化並びに幹細胞回収の前に構成要素に分けることができる。例えば、胎盤幹細胞を羊膜、柔網膜、臍帯、胎盤葉又はそれらの任意の組合せから得ることができる。好ましくは、胎盤幹細胞は、羊膜及び柔網膜を含む胎盤組織から得られる。典型的には、胎盤幹細胞を胎盤組織の小ブロック、例えば、容量が約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900又は約1000立方ミリメートルである胎盤組織のブロックの破壊によって得ることができる。
【０１５４】
好ましい幹細胞回収組成物は、1つ以上の組織破壊性酵素を含む。酵素消化には、好ましくは、酵素の組合せ、例えば、マトリックス金属プロテアーゼと中性プロテアーゼの組合せ、例えば、コラゲナーゼとジスパーゼの組合せが使用される。一実施態様において、胎盤組織の酵素消化には、コラゲナーゼと、ジスパーゼと、ヒアルロニダーゼとの組合せ、又はLIBERASE(Boehringer Mannheim Corp.(インディアナ州Indianapolis))とヒアルロニダーゼの組合せなどのマトリックス金属プロテアーゼと、中性プロテアーゼと、ヒアルロン酸の消化のための粘液溶解酵素との組合せが使用される。胎盤組織を破壊するのに使用できる他の酵素としては、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、トリプシンなどのセリンプロテアーゼ、キモトリプシン又はエラスターゼが挙げられる。セリンプロテアーゼは、血清中のアルファ2ミクログロブリンによって阻害され得るため、消化に使用される培地は、通常血清を含まない。EDTA及びDNアーゼは、細胞回収の効率を高めるために酵素消化手順に広く使用される。消化薬は、好ましくは、幹細胞を粘性消化物内に閉じ込めるのを回避するように希釈される。
【０１５５】
組織消化酵素の任意の組合せを使用することができる。組織消化酵素の典型的な濃度としては、例えば、コラゲナーゼI及びコラゲナーゼIVの50〜200U/mL、ジスパーゼの1〜10U/mL及びエラスターゼの10〜100U/mLが挙げられる。プロテアーゼを組み合わせて使用する、すなわち2つ以上のプロテアーゼを同一の消化反応に使用することができ、又は胎盤幹細胞を解放するために順次使用することができる。例えば、一実施態様において、胎盤又はその一部を最初に30分間にわたって2mg/mlにて適切な量のコラゲナーゼIで消化し、続いて37℃にて10分間にわたって0.25%のトリプシンで消化する。セリンプロテアーゼは、好ましくは、他の酵素の使用後に続けて使用される。
【０１５６】
別の実施態様において、キレート剤、例えば、エチレングリコールビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N'N'-テトラ酢酸(EGTA)又はエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を、幹細胞を含む幹細胞回収組成物、又は組織が幹細胞の単離前に幹細胞回収組成物で破壊及び/又は消化された溶液に添加することによって組織を更に破壊することができる。
【０１５７】
胎盤全体又は胎盤の一部が胎児細胞及び母体細胞を含む場合(例えば、胎盤の一部が柔網膜又は子葉を含む場合)には、回収された胎盤幹細胞は、胎児供給源及び母体供給源の双方に由来する胎盤幹細胞の混合物を含むことになる。胎盤の一部が、母体細胞(例えば羊膜)を含まないか、無視できる数の母体細胞を含む場合には、回収された幹細胞は、ほぼ全面的に胎児胎盤幹細胞を含むことになる。
【０１５８】
(6.6.1.1 胎盤幹細胞の単離及び特性決定)
哺乳動物の胎盤の幹細胞は、潅流によって得られても酵素消化によって得られても、例えばフィコール比重差遠心によって他の細胞から最初に純化(例えば単離)され得る。当該遠心は、遠心速度等について任意の標準的なプロトコルに準拠することができる。一実施態様において、例えば、胎盤から回収された細胞は、細胞を例えば汚染細片及び血小板から分離する室温での15分間にわたる5000×gの遠心によって潅流液から回収される。別の実施態様において、胎盤潅流液は、約200mlまで濃縮され、フィコール上に静かに積層され、22℃にて20分間にわたって約1100×gで遠心され、細胞の低密度界面層がさらなる処理のために回収される。
【０１５９】
細胞ペレットを新鮮な幹細胞回収組成物、又は幹細胞維持に好適な培地、例えば、2U/mlのヘパリン及び2mMのEDTA(GibcoBRL、NY)を含有するIMDM無血清培地に再懸濁することができる。全単核細胞部分を、例えば、製造元が推奨する手順に従って、Lymphoprep(Nycomed Pharma(ノルウェー、Oslo))を使用して単離することができる。
【０１６０】
本明細書に用いられているように、胎盤幹細胞を「単離する」とは、無傷の哺乳動物の胎盤において幹細胞が通常付随する細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%又は99%を除去することを意味する。器官の幹細胞は、幹細胞が無傷の器官において通常付随する幹細胞の50%未満を含む細胞集団に存在するときに「単離」される。
【０１６１】
例えば、0.2%EDTAを含む0.05%トリプシンの溶液(Sigma(ミズーリ州St. Louis))を使用する差別的トリプシン化によって、潅流又は消化によって得られた胎盤細胞を、例えば、更に又は最初に単離することができる。胎盤幹細胞は、典型的には、約5分間以内でプラスチック表面から剥がれるのに対して、他の接着性集団は、典型的には、20〜30分を超えるインキュベーションを必要とするため、差別的トリプシン化が可能である。例えば、トリプシン中和溶液(TNS、Cambrex)を使用して、トリプシン化及びトリプシン中和の後に、剥がれた胎盤幹細胞を収穫することができる。接着細胞の単離の一実施態様において、例えば、約5〜10×10⁶個の細胞のアリコットをいくつかのT-75フラスコ、好ましくはフィブロネクチンがコーティングされたT75フラスコの各々に入れる。当該実施態様において、細胞を市販の間葉幹細胞成長培地(MSCGM)(Cambrex)で培養し、組織培養インキュベータ(37℃、5%CO₂)に入れることができる。10から15日後、PBSで洗浄することによって無接着細胞をフラスコから除去する。次いで、PBSをMSCGMで置換する。好ましくは、様々な接着細胞型の存在、特に線維芽細胞群の特定及び拡大についてフラスコを毎日調べる。
【０１６２】
哺乳動物の胎盤から回収された細胞の数及び型を、例えば、流動細胞計測法、細胞分類、免疫細胞化学(例えば、組織に特異的な抗体又は細胞マーカーに特異的な抗体による染色)、蛍光活性化細胞分類(FACS)、磁気活性細胞分類(MACS)などの標準的な細胞検出技術を用いて形態の変化及び細胞表面マーカーを測定すること、光学顕微鏡法又は共焦点顕微鏡法を用いて細胞の形態を調べること、及び/又はPCR及び遺伝子発現プロファイリングなどの当該技術分野でよく知られている技術を用いて遺伝子発現の変化を測定することによって監視することができる。これらの技術を用いて、1つ以上の特定のマーカーに対して陽性の細胞を識別することもできる。例えば、CD34に対する抗体を使用し、上記技術を用いて、細胞が検出可能な量のCD34を含むかどうかを判断することができ、含む場合は、該細胞はCD34⁺である。同様に、細胞が、RT-PCRによって検出可能なほど十分なOCT-4RNA、又は成体細胞より有意に多くのOCT-4RNAを生成する場合は、該細胞はOCT-4⁺である。細胞表面マーカー(例えば、CD34などのCDマーカー)に対する抗体及びOCT-4などの幹細胞に特異的な遺伝子の配列は、当該技術分野でよく知られている。
【０１６３】
胎盤幹細胞、特に、フィコール分離、差別的接着又は両方の組合せによって単離された細胞を、蛍光活性化細胞ソーター(FACS)を使用して分類することができる。蛍光活性化細胞分類(FACS)は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含む粒子を分離するためのよく知られた方法である(Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165)。個々の粒子における蛍光成分のレーザー励起は、混合物からの正粒子及び負粒子の電磁分離を可能にする小さい電荷を与える。一実施態様において、細胞表面マーカーに特異的な抗体又はリガンドを異なる蛍光標識で標識する。細胞を細胞ソーターで処理して、使用する抗体に対して結合するそれらの能力に基づいて細胞の分離を可能にする。FACS分類粒子を96ウェル又は384ウェルプレートの個々のウェル内にそのまま堆積して、分離及びクローニングを容易にすることができる。
【０１６４】
1つの分類スキームにおいて、胎盤からの幹細胞をマーカーCD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4及び/又はHLA-Gの発現に基づいて分類する。これを、培養におけるそれらの接着特性に基づいて幹細胞を選択する手順に関連して遂行することができる。例えば、接着性選択スキームをマーカー発現に基づく分類の前又は後に遂行することができる。一実施態様において、例えば、細胞を最初にCD34の発現に基づいて分類し、CD34^-を保持し、かつCD200⁺HLA-G⁺である細胞を他のすべてのCD34^-細胞から分離する。別の実施態様において、胎盤からの細胞は、それらのマーカーCD200及び/又はHLA-Gの発現に基づき;例えば、これらのマーカーのいずれかを示す細胞をさらなる使用のために単離する。例えば、具体的な実施態様において、CD200及び/又はHLA-Gを発現する細胞を、CD73及び/又はCD105の発現、又は抗体SH2、SH3若しくはSH4によって認識されるエピトープ、或いはCD34、CD38又はCD45の発現の欠如に基づいて更に分類することができる。例えば、一実施態様において、胎盤細胞は、CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38及びCD45の発現又はその欠如によって分類され、CD200⁺、HLA-G⁺、CD73⁺、CD105⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である胎盤細胞は、さらなる使用のために他の胎盤細胞から単離される。
【０１６５】
別の実施態様において、磁気ビーズを使用して、細胞を分離することができる。磁気ビーズ(直径0.5〜100μm)を結合するそれらの能力に基づいて粒子を分離するための方法である磁気活性化細胞分類(MACS)技術を用いて細胞を分類することができる。特定の細胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合性付加を含む様々な有用な改良を磁気微球体に加えることができる。次いで、ビーズを細胞と混合して結合を可能にする。次いで、細胞を磁場に通して、特定の細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一実施態様において、次いで、これらの細胞を単離し、さらなる細胞表面マーカーに対する抗体に結合された磁気ビーズと再混合する。細胞を再び磁場に通し、両抗体を結合した細胞を単離する。次いで、当該細胞を希釈して、クローン単離のためのマイクロタイタ皿などの個別の皿に入れる。
【０１６６】
細胞形態及び成長特性に基づいて胎盤幹細胞の特性決定及び/又は分類を行うこともできる。例えば、胎盤幹細胞を、例えば、培養における線維芽様外観を有するものとして特徴付けること及び/又は該外観に基づいて選択することができる。胎盤幹細胞を、胚様体を形成する能力を有するものとして特徴付けること及び/又は該能力に基づいて選択することもできる。一実施態様において、例えば、形状が線維芽様であり、CD73及びCD105を発現し、かつ培養において1つ以上の胚様体を生成する胎盤細胞を他の胎盤細胞から単離する。別の実施態様において、培養において1つ以上の胚様体を生成するOCT-4⁺胎盤細胞を他の胎盤細胞から単離する。
【０１６７】
別の実施態様において、胎盤幹細胞を識別し、コロニー形成単位アッセイによってその特性決定を行うことができる。MESENCULT(商標)培地(Stem Cell Technologies, Inc.,(コロンビア州Vancouver British)などのコロニー形成単位アッセイは、当該技術分野で広く知られている。
【０１６８】
トリパンブルー排除アッセイ、二酢酸フルオレセイン取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ(生死を評価する);及びチミジン取込みアッセイ、MTT細胞増殖アッセイ(増殖を評価する)などの当該技術分野で知られている標準的な技術を用いて、胎盤幹細胞を生死、増殖潜在性及び寿命について評価することができる。長時間の培養において倍増する集団の最大数を求めることなどの当該技術分野でよく知られている方法によって寿命を測定することができる。
【０１６９】
当該技術分野で知られている他の技術、例えば、所望の細胞の選択的成長(正の選択)、望ましくない細胞の選択的破壊(負の選択);例えば大豆アグルチニンなどとの混合集団における差別的細胞アグルチニン化に基づく分離;凍結溶解手順;濾過;従来の遠心及びゾーン遠心;遠心溶離(逆流遠心);単位重力分離;向流分配;及び電気泳動等を用いて、胎盤幹細胞を他の胎盤細胞から分離することができる。
【０１７０】
(6.6.1.2 胎盤幹細胞の培養)
胎盤幹細胞を上記のように単離し、本発明の組成物と直に接触させることができる。胎盤幹細胞を本発明の組成物との接触前にいくつかの世代にわたって、例えば、細胞培養で培養することもできる。例えば、単離した胎盤幹細胞又は胎盤幹細胞集団、或いはそこから胎盤幹細胞が成長する細胞又は胎盤組織を使用して、細胞培養を開始又は接種することができる。細胞は、一般には、コーティングされていない、又はラミニン、コラーゲン(例えば、原生又は変性)、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン及び細胞外膜タンパク質(例えば、MATRIGEL(登録商標)(BD Discovery Labware(マサチューセッツ州Bedford))などの細胞外マトリックス若しくはリガンドでコーティングされた無菌組織培養容器に移される。
【０１７１】
好ましい実施態様において、胎盤幹細胞を本発明のコラーゲン組成物上で培養する。ある実施態様において、該コラーゲン組成物は、検出可能な量のフィブロネクチン及びラミニンを含む。他の実施態様において、該コラーゲン組成物は、検出可能な量のフィブロネクチン又はラミニンを含まない。他の実施態様において、該コラーゲン組成物は、乾燥重量で少なくとも約5%、又は少なくとも約10%のエラスチンを含む。別の実施態様において、該コラーゲン組成物は、乾燥重量で約5%以下のエラスチンを含む。
【０１７２】
ある実施態様において、胎盤幹細胞を培地から回収可能な特定のサイトカインの製造のために培養する。具体的な実施態様において、該サイトカインは、IL-6、IL-8及び/又は単球走化性タンパク質-1(MCP-1)である。ある他の実施態様において、胎盤幹細胞をフィブロネクチンの製造のために培養する。具体的な実施態様において、胎盤幹細胞を、約5%未満のフィブロネクチンを含む本発明の組成物上で培養する。
【０１７３】
上記のように、本発明の胎盤コラーゲン組成物を有用な、例えば医学的に有用な任意の形状に成形することができる。これらの組成物は、成形及び乾燥されると、水溶液中、例えば組織培地又は緩衝液中で安定する。したがって、胎盤幹細胞などの幹細胞を成形組成物上でそのまま培養することができる。当該培養を細胞培養皿、又は細胞培養に好適な他の液体容器、例えばフラスコ内で行うことができる。
【０１７４】
胎盤幹細胞は、任意の培地で培養され、及びあらゆる条件下で、幹細胞の培養に許容し得るものとして当該技術分野で認識され得る。好ましくは、培地は、血清を含む。胎盤幹細胞を、例えば、ITS(インシュリン-トランスフェリン-セレニウム)、LA+BSA(リノレン酸-ウシ血清アルブミン)、デキストロース、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF、IGF-1及びペニシリン/ストレプトマイシンを含有するDMEM-LG(ダルベッコの修飾必須培地、低グルコース)/MCDB201(ニワトリ線維芽基本培地);10%ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM-HG(高グルコース);15%FBSを含むDMEM-HG;10%FBS、10%ウマ血清及びヒドロコルチソンを含むIMDM(Iscoveの修飾ダルベッコ培地);10%FBS、EGF及びヘパリンを含むM199;10%FBS、GLUTAMAX(商標)及びゲンタマイシンを含むy-MEM(最小必須培地);10%FBS、GLUTAMAX(商標)及びゲンタマイシンを含むDMEM;等に培養することができる。好ましい培地は、2%FBS、ITS、LA+BSA、デキストロース、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM-LG/MCDB-201である。
【０１７５】
胎盤幹細胞を培養するのに使用できる他の培地としては、DMEM(高又は低グルコース)、イーグル基本培地、ハムF10培地(F10)、ハムF-12培地(F12)、Iscoveの修飾ダルベッコ培地、間葉幹細胞成長培地(MSCGM)、リーボビッツL-15培地、MCDB、DMEM/F12、RPMI 1640、高度DMEM(Gibco)、DMEM/MCDB201(Sigma)及びセル-グロフリーが挙げられる。
【０１７６】
例えば、血清(例えば、ウシ胎児血清(FBS)、好ましくは約2〜15%(v/v);ウマ(equine)(ウマ(horse)血清(ES);ヒト血清(HS));ベータ-メルカプトエタノール(BME)、好ましくは約0.001%(v/v);1つ以上の成長因子、例えば、血小板由来成長因子(PDGF)、表皮成長因子(EGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、インシュリン様成長因子-1(IGF-1)、白血病阻害因子(LIF)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)及びエリスロポイエチン(EPO);L-バリンを含むアミノ酸;及び例えば、ペニシリンG、硫酸ストレプトマイシン、アムホテリシンB、ゲンタマイシン及びナイスタチンなどの微生物汚染を抑制するための1つ以上の抗生物質及び/又は抗真菌剤を含む1つ以上の構成要素を単独で、又は組み合わせて培地に補充することができる。
【０１７７】
胎盤幹細胞を標準的な組織培養条件で、例えば、組織培養皿又はマルチウェルプレートで培養することができる。懸滴法を用いて胎盤幹細胞を培養することもできる。この方法では、胎盤幹細胞を約5mLの培地に1mLあたり約1×10⁴個で胎盤幹細胞を懸濁させ、1滴以上の培地を組織培養容器、例えば100mLペトリ皿の蓋の内側に落とす。該液滴は、例えば、単一の液滴、又は例えばマルチチャネルピペッタからの複数の液滴であり得る。蓋を注意深く逆転させ、皿の雰囲気中に水分を維持するのに十分な容量の液体、例えば無菌PBSを含む皿の底面の上部に配置し、幹細胞を培養する。
【０１７８】
胎盤幹細胞を単離する、又は幹細胞集団を単離すると(例えば、幹細胞又は幹細胞集団がインビボで通常付随する胎盤細胞の少なくとも50%から幹細胞又は幹細胞集団を分離すると)、幹細胞又は幹細胞集団を増殖させ、インビトロで拡大することができる。例えば、胎盤幹細胞集団を組織培養容器、例えば、皿、フラスコ又はマルチウェルプレート等の中で、幹細胞が70〜90%コンフルエンスまで増殖するのに十分な時間にわたって、すなわち幹細胞及びそれらの後代が組織培養容器の培養表面積の70〜90%を占めるまで培養することができる。
【０１７９】
胎盤幹細胞を、細胞成長を可能にする密度で培養容器に接種することができる。例えば、細胞を低密度(例えば、約1,000から約5,000個/cm²)から高密度(例えば、約50,000個/cm²以上)で接種できる。好ましい実施態様において、細胞を空気中約0から約5パーセント容量のCO₂で培養する。いくつかの好ましい実施態様において、細胞を空気中約2から約25パーセントのO₂、好ましくは空気中約5から約20パーセントのO₂で培養する。細胞を好ましくは約25℃から約40℃、好ましくは37℃で培養する。細胞を好ましくはインキュベータ中で培養する。培地を静的なものとすることができ、又は例えばバイオリアクターを使用して撹拌することができる。胎盤幹細胞を、好ましくは、(例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラ-ゼ、トコフェロール又はN-アセチルシステイン等を添加することによる)低酸化応力下で成長させる。
【０１８０】
70%〜90%のコンフルエンスが得られると、細胞を継代することができる。例えば、当該技術分野でよく知られている技術を用いて、細胞を酵素処理、例えば、トリプシン化して、それらを組織培養表面から分離することができる。ピペット採取によって細胞を除去し、細胞を計数した後に、約20,000〜100,000個の幹細胞、好ましくは約50,000個の幹細胞を、新鮮な培地を含む新しい培養容器に継代する。典型的には、新しい培地は、幹細胞が除去されたのと同じ種類の培地である。少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18若しくは20回又はそれより多く継代された胎盤幹細胞を本発明のコラーゲン組成物と併用することができる。
【０１８１】
(6.6.2 非幹細胞)
幹細胞を含む本発明の組成物は、ある実施態様において、1つ以上の型の非幹細胞をも含む。本明細書に用いられているように、「非幹細胞」は、最終分化細胞を指す。例えば、一実施態様において、本発明の組成物は、複数の幹細胞及び複数の線維芽細胞を含む。本発明の組成物に含めることができる非幹細胞としては、限定することなく、線維芽細胞又は線維芽様細胞;内皮細胞、上皮細胞、筋細胞、心細胞、膵細胞等が挙げられる。ある他の実施態様において、該組成物は、少なくとも2つの型の幹細胞及び少なくとも2つの型の非幹細胞を含む。
【０１８２】
(6.7 コラーゲン組成物を使用する方法)
更なる態様において、本発明は、治療的に、予防的に、又は美容的に本発明のコラーゲン組成物を使用する方法を提供する。
【０１８３】
本発明のコラーゲン組成物は、数多くの広範な使用可能性を有する。使用には、組織若しくはマトリックス物質のパッチ又はプラグなどの操作された組織及び器官の製造、縫合、補綴及びその他のインプラント、組織足場、創傷の修復剤又は包帯剤、止血装置、構造、外科用及び整形用スクリュー並びに外科用及び整形用プレートなどの組織修復剤及び支持体に使用するための装置、合成インプラントのための天然のコーティング又は成分、美容用インプラント及び支持体、器官若しくは組織のための修復又は構造用支持材、物質送達、生物工学プラットフォーム、細胞に対する物質の効果を試験するためのプラットフォーム、細胞培養、並びに多くのその他の使用を含むが、限定されない。この使用可能性の考察は、網羅的であることは意図されず、多くのその他の実施態様が存在する。更に、その他の材料及び/又は具体的物質とコラーゲンの組合せに関して多くの具体例を下記に提供してあるが、多くのその他の材料及び物質の組合せを使用してもよい。
【０１８４】
該コラーゲン組成物が創傷の治療又は充填に使用される用途において、該組成物が、周囲の組織における幹細胞によるフィブロネクチンの生成を刺激することに有利であり得る。当該実施態様において、創傷を、検出可能な量のフィブロネクチンを含まない本発明の組成物と接触させることができる。
【０１８５】
細胞をコラーゲン材料に組み合わせる能力は、本発明の組成物を組織、器官又は器官様組織を構築するために使用する能力を提供する。このような組織、又は器官に含まれる細胞は、物質を送達する機能を果たす細胞、組織交替の開始をもたらすであろう播種された細胞又は両方を含むことができる。組織又は器官を作製するために多くのタイプの細胞を使用することができる。幹細胞、前駆細胞及び/又は分化細胞は、種々の実施態様で使用される。これらの実施態様に使用される幹細胞の例には、肝臓又は腎臓などの器官又は器官様組織を作製するために使用される胚幹細胞、骨髄幹細胞及び臍帯幹細胞を含むが、限定されない。いくつかの実施態様において、組成物の形状は、細胞に対して所望の方法の特定タイプに成長して、複製するためのシグナルを送るのを補助する。その他の物質、例えば分化誘導因子を特定タイプの細胞増殖を促進するためにマトリックスに添加することができる。更に、一部の実施態様において、細胞タイプの異なる混合物が組成物に組み込まれる。コラーゲン材料及びマトリックスを生物工学によって作られた組織又は器官に使用する能力により、多種多様な生物工学によって作られた組織置換適用が生み出される。生物工学によって作られた成分の例には、骨、歯構造、関節、軟骨、骨格筋、平滑筋、心筋、腱、メニスカス、靱帯、血管、ステント、心臓弁、角膜、鼓膜、神経ガイド、組織若しくは器官パッチ又はシーラント、失われた組織のための充填剤、美容用修復剤のためのシート、皮膚(皮膚相当物を作製するために細胞が付加されたシート)、気管、喉頭蓋及び声帯などの咽喉の軟部組織構造、鼻軟骨、瞼板、気管の環、甲状軟骨及び披裂軟骨などのその他の軟骨構造、結合組織、血管移植及びこれらの成分、並びに局所適用のためのシート、並びに肝臓、腎臓及び膵臓などの器官に対する修復剤又は置換を含むが、限定されない。一部の実施態様において、このようなマトリックスは、インプラントの機能を改善するであろう方法で、本発明の薬物及び物質送達マトリックスと組み合わせられる。例えば、抗生物質、抗炎症薬、局所麻酔薬又はその組み合わせを生体工学によって作られた器官のマトリックスに添加して、治癒過程の速度を上げ、及び不快感を減少させることができる。
【０１８６】
(6.7.1 美容用適用)
ヒト皮膚は、表皮及び真皮の複合材料である。皮膚の表皮層の最外層は、角質層である。角質層の下が表皮である。表皮の下は、乳頭真皮と呼ばれる真皮の最外層、続いて網状真皮及び皮下層である。
【０１８７】
皮膚は、保護、吸収、色素発生、感覚認知、分泌、排出、温度調節及び免疫過程の制御を含む多くの機能を果たす。これらの皮膚機能は、例えば老化、過剰の日光暴露、喫煙、外傷及び/又は環境要因によってネガティブな影響を受け、これが皮膚の構造変化を引き起こして、皮膚の障壁機能の機能障害及び表皮細胞の代謝回転の減少を生じ得る。ダメージを受けたコラーゲン及びエラスチンは、適切に縮む能力を失い、これにより、皮膚のしわ及び表面の荒れを生じる。しわは、典型的には皮膚の老化と関連した皮膚の改変であり、太陽に曝露された皮膚で優先して発生する。老化が進行すると、顔並びに体のその他の領域は、例えば微笑む、噛む、及び目を細めるなどの顔面筋動作において、重力、日光暴露及び年の効果を示し始める。皮膚が年をとり、又は病的になると、しわ、下落及び伸展線をもたらし、荒れて、及びビタミンDを合成する能力が減少する。また、老化した皮膚は、薄くなり、コラーゲン、エラスチン及びグリコサミノグリカンの変化のため、平らな真皮表皮境界面を有する。典型的には、老化皮膚は、厚み、弾性及び基礎をなす組織に対する付着の減少によって特徴づけることができる。
【０１８８】
老化、環境要因、太陽に対する曝露及び体重減少、出産、疾患(例えば、座瘡及び癌)及び外科手術などのその他の要素による皮膚に対するダメージは、皮膚輪郭欠損及びその他の皮膚異常を生じることが多い。皮膚の輪郭欠損及びその他の異常を修正するために、人々は、フェイスリフト及び皮膚タックなどの美容手術に頼ることが多い。しかし、美容手術は、一般に高価で、侵襲性であり、手術領域に瘢痕を残す可能性を有し、正常な生物学的及び生理機能に影響を及ぼし得る。従って、代替療法の必要性が残る。
【０１８９】
本発明は、患者における皮膚増強のための方法を提供する。一つの実施態様において、患者における皮膚増強のための方法には、本発明のコラーゲン組成物を、増強する必要がある患者の顔又は体の領域に注射し、又はさもなければ投与することを含み、患者の顔又は体の領域は、コラーゲンの投与の前の領域と比較して増強される。本発明の状況における「皮膚増強」は、外部からの作用又は効果による患者の(例えば、ヒトの)皮膚及び関連した領域の天然の状態の何らかの変化をいう。皮膚増強によって変化するであろう非限定的な皮膚の領域には、表皮、真皮、皮下層、脂肪、立毛筋、毛幹、汗口、皮脂腺又はそれらの組合せを含む。
【０１９０】
一部の実施態様において、本発明の方法には、目尻のしわ、鼻唇溝(「笑線」)、マリオネット線(marionette lines)、眉間の折り重なり(「まゆをひそめた線(frown lines)」)又はそれらの組合せの治療のために、本発明のコラーゲン組成物を患者に注射するか、又はさもなければ与えることを含む。本発明のコラーゲン組成物は、線、折り目及びその他のしわを埋めるのを補助すること、及びより平滑な、より若い様子の外見を回復するのを補助することができる。本発明のコラーゲン組成物は、単独で、又は1つ以上の更なる注射用組成物、レーザー治療などの再表面手法若しくはフェイスリフトなどの痩身美容と組み合わせて使用することができる。
【０１９１】
一つの実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、また、顔の折り目がついたか、くぼんだ領域を増大するために、及び/又は患者の顔及び体の領域に肉付きを付加するか、若しくは増やすために使用してもよい。増大が必要とされる顔及び/又は体の領域は、例えば老化、外傷、疾患、病気、環境要因、体重減少、出産又はその組合せの結果である。本発明のコラーゲン組成物を注射してもよい、又はさもなければ投与してもよい患者の顔又は体の領域の非限定的な例は、眼の下、こめかみ、上頬、下頬、頤、口唇、下あごの輪郭、額、眉間、眉外側、頬、上唇と鼻の間の領域、鼻(鼻橋など)、頚部、殿部、臀部、胸甲又は顔若しくは体のその他のいずれかの部分又はそれらの組合せを含む。
【０１９２】
本発明のコラーゲン組成物は、しわ、くぼみ又はその他の折り目(例えば、まゆをひそめた線、心配線(worry line)、目尻のしわ、マリオネット線)、伸展線、内外の瘢痕(傷害、創傷、事故、咬合又は外科手術により生じる瘢痕など)又はそれらの組合せを含むが、限定されない皮膚欠損を治療するために使用してもよい。一部の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、例えば「くぼんだ」眼、暗い円を生じる目に見える血管、並びに目に見える視涙のくぼみの矯正のために使用してもよい。また、本発明のコラーゲン組成物は、例えば下部眼瞼形成術から眼の下の脂肪褥の積極的除去の後の眼の下の矯正又は積極的な頬脂肪の抽出又は自然の喪失の後の下部頬の矯正のために使用してもよい。一つの実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、造鼻術の結果、皮膚移植又は脂肪吸引により生じるへこみなどのその他の外科的に誘導されたでこぼこを矯正するために使用してもよい。その他の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、顔又は体の瘢痕(例えば、創傷、水痘又は座瘡瘢痕)の矯正のために使用してもよい。一部の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、顔の再造形のために患者に注射されるか、又はさもなければ投与される。本発明の方法を使用する顔の再造形は、頚のゆるみをもつか、又はやつれた顔、長い顔、下部が重い顔、非対称の顔、丸々した顔を有するか、又は局在化した脂肪萎縮、顔中央の下顎後退、くぼんだ眼及び/又はそれらのいずれかの組合せをもつ顔を有する患者において完了してもよい。
【０１９３】
一つの実施態様において、本発明の方法は、癌若しくは座瘡などの疾患又は疾病によって生じる皮膚欠損などの皮膚欠損を治療するために、患者に本発明のコラーゲン組成物を注射する、又はさもなければ投与することを含む。欠損は、疾患又は疾病の直接的又は間接的な結果であることができる。例えば、皮膚欠損は、疾患若しくは疾病によって引き起こされ得る、又は疾患若しくは疾病の治療によって引き起こされ得る。
【０１９４】
(6.7.2 非美容適用)
(6.7.2.1 空隙充填物)
本発明は、患者の体内の空隙を封着し、充填し、及び/又はさもなければ治療するための方法を提供する。一部の実施態様において、本発明の方法は、患者の体内の空隙を充填するために患者に本発明のコラーゲン組成物を注射するか、又はさもなければ投与することを含む。例えば、コラーゲン組成物は、患者に対して空隙が位置する領域に投与することができる。「空隙」という用語は、老化、疾患、外科手術、先天性異常又はその組合せによって生じた任意の望ましくない中空空間を包含することが意図される。例えば、空隙は、患者の体からの腫瘍又はその他の塊の外科的除去後に生じ得る。本発明のコラーゲン組成物を充填してもよい空隙の非限定的例には、患者の体の任意の器官若しくは組織における亀裂、瘻孔、憩室、動脈瘤、嚢胞、病変又はその他の任意の望ましくない中空空間を含む。
【０１９５】
一部の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、組織、器官、又は体のその他の構造(例えば、血管)内、或いは、血液、尿又はその他の体液などの体液の漏出を防止するための隣接組織、器官又は構造間の接合部内の間隙、亀裂、又は瘻孔を、全体的に若しくは部分的に充填し、封着し、及び/又はさもなければ治療するために使用してもよい。例えば、本発明のコラーゲン組成物は、内臓間の瘻孔に、又は患者の体の内臓から外側への開口又は開口部に注射し、移植し、又はさもなければ投与することができる。本発明のコラーゲン組成物は、これらの病理学的状態によって形成される空隙又はその他の欠損を充填し、かつ組織の線維芽細胞浸潤、治癒及び内殖を刺激するために使用することができる。
【０１９６】
一つの実施態様において、本発明の方法は、治療を必要とする患者における瘻孔を充填し、封着し、及び/又はさもなければ治療するために使用され、前記方法は、本発明のコラーゲン組成物を患者に注射するか、又はさもなければ投与することを含む。本発明のコラーゲン組成物は、瘻孔開口部の1つに針を介した注射によって患者に投与して、開口部の枝分れのほとんど又は全てを充填することができる。或いは、コラーゲンの紐又はロッドを、開口部を介して瘻孔病変に通すことができ、又はコラーゲンは、カテーテルで患者に導入することができる。本発明のコラーゲン組成物又は方法により、肛門、動静脈、膀胱、頸動脈空洞の、外部の、胃の、腸管の、頭頂部の、唾液の、膣の、及び肛門直腸の瘻孔又はそれらの組合せなどの様々なタイプの瘻孔を充填すること、封着すること、及び/又はさもなければ治療することができる。
【０１９７】
一つの実施態様において、本発明の方法は、治療を必要とする患者における憩室を充填し、封着し、及び/又はさもなければ治療するために使用され、前記方法は、本発明のコラーゲン組成物を患者に注射するか、又はさもなければ投与することを含む。憩室は、小腸、膀胱、その他などの管状又は球状の器官からの窩又は嚢の開口部である異常な生理学的構造であり、本発明のコラーゲン組成物を使用して充填し、又は増大することができる。
【０１９８】
もう一つの実施態様において、本発明の方法は、治療を必要とする患者の嚢胞を充填し、封着し、及び/又はさもなければ治療するために使用され、前記方法は、本発明のコラーゲン組成物を患者に注射するか、又はさもなければ投与することを含む。嚢胞は、線に沿ってガス、液体又は半固体材料を含む膜裏打ちを有する異常な嚢である。一部の実施態様において、嚢胞は、偽嚢胞であり、これは、例えば液体の蓄積を有するが、上皮又はその他の膜状の裏打ちを含まない。本発明によって充填し、封着し、及び/又はさもなければ治療することができる嚢胞の更なる非限定的例には、皮脂、類皮、骨若しくは漿液性嚢胞又はそれらの組合せを含む。
【０１９９】
もう一つの実施態様において、本発明の方法は、不必要な、若しくは望ましくない増殖、液体、細胞又は組織の患者からの外科的、化学的又は生物学的除去の結果として生じた任意の空隙を全体に、又は部分的に充填するために本発明のコラーゲン組成物を注射するか、又はさもなければ投与することを含む。コラーゲン組成物は、残りの組織及び周囲組織を増大するために、治癒過程を助けるために、及び感染のリスクを最小にするために、空隙の部位に局所的に注射するか、又はさもなければ投与することができる。この増強は、乳癌外科手術、腫瘍状結合組織、外科手術、骨組織又は軟骨組織、その他の除去のための後などの腫瘍切除術後に生じる空隙部位のために特に有用である。
【０２００】
本発明は、本発明のコラーゲン組成物を体に直接ではないが、体外で器官、器官の成分又は組織に、前記組織、器官又は器官の成分を体内に含める前に注射するか、又はさもなければ投与することによって増強を生じさせる方法を更に提供する。
【０２０１】
(6.7.2.2 組織増量)
一つの実施態様において、本発明の方法は、組織増量のために、患者に本発明のコラーゲン組成物を投与することを含む。本発明の状況における「組織増量」とは、外部の作用又は効果による、患者の(例えば、ヒトの)非経皮軟組織の天然の状態の何らかの変化をいう。本発明に包含される組織には、筋組織、結合組織、脂肪及び神経組織を含むが、限定されない。本発明に包含される組織は、限定されないが、括約筋、膀胱括約筋及び尿道を含む多くの器官の一部又は体の一部であってもよい。
【０２０２】
(6.7.2.3 尿失禁)
尿失禁(ストレス性尿失禁を含む)は、咳嗽、くしゃみ、笑い又は運動などの腹腔内圧の増大を生じる活動に伴って生じる尿の突発性の漏出である。これらの活動の間に、腹腔内圧が一過性に尿道の耐性以上に上昇し、従って突発性に通常小量の尿の漏出を生じる。ストレス性失禁は、一般に、尿道括約筋の強度が減弱し、かつ腹部からの圧力が増加するときに、括約筋が尿の流れを防ぐことができない膀胱貯蔵の問題である。尿失禁は、膀胱及び尿道を支持する骨盤筋が弱くなった結果として、又は尿道括約筋の機能不全のために生じ得る。例えば、尿道領域に対する以前の外傷、神経性傷害及びいくつかの薬物適用は、尿道を弱め得る。尿失禁は、最も一般的には、閉経、骨盤外科手術若しくは出産後、例えば多胎妊娠及び膣出産後の女性、又は骨盤の逸脱(膣空間への膀胱、尿道又は直腸の壁の突出)を有し、膀胱瘤、膀胱尿道脱又は直腸瘤を伴う者において見られ、通常前膣補助の喪失に関連がある。男性では、尿失禁は、前立腺外科手術、最も一般的には、根治的前立腺切除後に観察され得るし、外部尿道括約筋に対する傷害があるかもしれない。
【０２０３】
本発明は、尿失禁又はそれによって生じる症候若しくは状態を管理又は治療するための方法であって、これらの必要な患者に本発明のコラーゲン組成物を注射するか、又はさもなければ投与することを含み、該患者の括約筋組織は、増大され、かつ患者における排泄抑制能力が改善されるか、又は回復される、前記方法を包含する。コラーゲン組成物は、尿失禁の処置及び/又は治療のために尿道周辺の組織容積を増大するために尿道周囲に注射するか、又はさもなければ投与することができる。ストレス性失調症の改善は、組織容積を増大させることにより、尿の流出に対する耐性を増大させることによって達成することができる。
【０２０４】
一部の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、例えば尿が漏れる尿道の穴を閉じるために、又は尿道の壁の厚みを、尿が保持されている時にそれがしっかりと密閉するように確立するために、患者に対して尿道周辺領域に注射されるか、又はさもなければ投与される。
【０２０５】
もう一つの実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、患者に対して、膀胱出口の尿道の筋肉のすぐ外側の尿道周辺に注射されるか、又はさもなければ投与される。増量材料の注射は、皮膚を介して、尿道を介して、又は女性では膣を介して行うことができる。
【０２０６】
本発明のコラーゲン組成物の注射のために針が使用されるときは、針の配置は、尿道に挿入した膀胱鏡を用いて誘導することができる。尿道の増量手順は、局所麻酔下で行うことができるが、一部の患者には、一般的な局所麻酔又は脊髄麻酔が必要であるかもしれない。患者が注射後に立ち上がることができるように、局所麻酔薬を使用することができ、これにより、排泄抑制能力が達成されたかどうかを決定することができる。排泄抑制能力が回復されなかった場合、1回以上のその後の注射を患者に投与することができる。手順は、膀胱対照を達成するために数月後に繰り返す必要があるかしれない。コラーゲン注射は、尿道周辺の領域を増量し、従って括約筋を圧縮することにより、尿漏出の制御を補助する。
【０２０７】
(6.7.2.4 膀胱尿管逆流)
膀胱尿管逆流(VUR)(又は尿逆流)は、膀胱から腎臓への尿の逆流によって特徴づけられる。未治療のVURは、腎機能及び全体的な患者の健康に対して破壊的な長期間の影響を生じることがある。VUR患者は、尿路感染症、腎臓瘢痕、腎盂腎炎、高血圧症及び進行性腎不全を発病するリスクが増加する。
【０２０８】
本発明は、VUR又はそれにより生じる症候若しくは状態の管理又は治療のための方法であって、これらの必要な患者に本発明のコラーゲン組成物を注射するか、又はさもなければ投与することを含み、該患者の尿管壁が増強されて、VURの症候が減少されるか、又は解消される、前記方法を提供する。コラーゲン組成物は、当業者に公知のいずれかの方法を使用して尿管口の下の排尿筋裏打ち内に、内視鏡誘導下などで、注射し(例えば、半三角注射)又はさもなければ投与することができる。
【０２０９】
(6.7.2.5 胃食道逆流疾患)
胃食道逆流疾患(GERD)は、通常、食道を適切に胃に連結する筋肉弁である下部食道括約筋(LES)が適切に閉じないか、弛緩するか、又は弱り、胃内容物が食道へ漏れて戻るか、又は逆流するために生じる障害である。胃酸又は時に胆汁酸塩が食道と接触すると、これが大部分の私たちのほとんどが時折感じる胸焼けの灼熱感を生じさせる。逆流した胃酸が食道の裏打ちに触れると、これが胸部又は咽喉における灼熱感(胸焼け)を生じさせ、口の奥で液体の味がするかもしれない(酸不消化)。時間とともに、胃酸の逆流は、食道を裏打ちする組織に損傷を与え、炎症及び疼痛を引き起こす。成人において、持続性の未治療のGERDは、食道永久的な損傷及び時に更に癌に至ることがある。乳児、子供及び妊婦を含む誰もが、GERDを有し得る。
【０２１０】
本発明は、GERD又はそれにより生じる症候若しくは状態の管理又は治療のための方法であって、これらの必要な患者に本発明のコラーゲン組成物を注射するか、又はさもなければ投与することを含み、該患者のLESは、増大され、GERDの症候が減少されるか、又は解消される、前記方法を提供する。一部の実施態様において、コラーゲン組成物は、内視鏡誘導下で食道胃接合部のレベルで食道壁に投与される。逆流を妨げることを意図して、増量効果は、残分及び結果的な組織反応の組合せによって生じる。本発明のコラーゲン組成物は、標準的な、又は大きな孔(例えば、大きなゲージ)の注射針を介して注射することができる。
【０２１１】
(6.7.2.6 声帯及び喉頭)
本発明は、疾患、障害(神経疾患など)、又は一方若しくは両方の声帯(皺襞)及び/又は喉頭(Larynx)(喉頭(voice box))に影響を及ぼすその他の異常の管理又は治療のための方法を提供する。このような喉頭及び声帯の疾患、障害又はその他の異常の非限定的例は、声門不全、一側声帯麻痺、両側声帯麻痺、麻痺患者発声障害、非麻痺患者発声障害、痙攣性発声障害又はそれらの組合せである。その他の実施態様において、本発明の方法は、また、声帯の不全麻痺(「運動麻痺」)、一般に例えば老年での弱った声帯(「老人性喉頭炎」)及び/又は声帯の瘢痕(例えば、以前の外科手術又は放射線療法による)などの、不適当に閉じた声帯を生じる疾患、障害又はその他の異常を処置又は治療するために使用してもよい。
【０２１２】
本発明は、声帯がかつて有していたかさ(声帯皺襞内反又は萎縮症においてなど)若しくは運動性(麻痺においてなど)のない患者の声帯皺襞に対して補助又はかさを提供する方法を包含する。一部の実施態様において、声帯及び/又はその他の喉頭の軟部組織は、本発明のコラーゲン組成物で、単独で、又はその他の治療又は薬物適用と組み合わせて増強することができる。一つの実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、一方(又は両方)の声帯皺襞を増強し、かさを付加して、その結果、それをその他の声帯皺襞と接触させることができる。
【０２１３】
当業者に周知の多数の手順いずれか1つを使用して、患者の声帯又は喉頭に本発明のコラーゲン組成物を投与してよい。一部の実施態様において、湾曲した針を使用して、患者の口を介して本発明のコラーゲン組成物を注射する。その他の実施態様において、針(より高ゲージ、短い針など)を使用して、患者の皮膚及び喉仏を介して本発明のコラーゲン組成物を直接注射してもよい。本発明のコラーゲン組成物は、ビデオモニターにて喉頭鏡での患者の声帯皺襞をモニターしつつ、患者に投与することができる。
【０２１４】
(6.7.2.7 声門不全)
一つの実施態様において、本発明は、声門不全の管理又は治療のための方法を提供する。経皮的喉頭コラーゲン増強は、当該技術分野において公知の方法を使用して、本発明のコラーゲンを、針を使用して患者の生体内に注射することによって生じさせることができる。場合によっては、患者は、喉頭の声機能に影響を及ぼす発生不全及び/又は声門不全、筋硬直の増加、及び甲状披裂筋の動作のための能力の減少を有する。もう一つの実施態様において、発生不全は、パーキンソン病の結果である。一つの実施態様において、声門不全の管理又は治療の必要がある患者における、そのための本発明の方法は、患者の声帯に本発明のコラーゲン組成物を注射するか、又はさもなければ投与することを含み、注射により、声帯が増大し、及び声門の閉鎖を改善し、その結果、患者の声門不全が減少されるか、又は解消される。患者は、本発明のコラーゲン組成物の投与の前に、可動の声帯を有していても、又は有していなくてもよい。
【０２１５】
(6.7.2.8 発声障害)
発声障害は、何らかの声の機能障害また話すことが困難なことである。発声障害は、喉頭部又は声帯麻痺と関連していても、又は関連していなくてもよい。本発明は、麻痺患者発声障害、非麻痺患者発声障害又は痙攣性発声障害などの発声障害の管理又は治療のための方法を提供する。一つの実施態様において、患者における筋緊張異常を管理又は治療するための方法は、これらの必要がある患者に本発明のコラーゲン組成物を注射するか、又は投与することを含み、患者における筋緊張異常は、コラーゲン組成物の投与の前にと比較して改善される。場合によっては、喉頭コラーゲン注射により、わずかな増加によって、一方又は両方の声帯皺襞の内方転位(medialization)が更に可能になり、内方転位甲状軟骨形成術と組み合わせて、又はその後で発声が改善する。
【０２１６】
(6.7.2.9 声帯麻痺)
声帯は、本質的に、粘膜で覆われた筋肉である。筋肉は、もはや筋肉が神経に接続していないときには、萎縮する。従って、典型的な麻痺した声帯は、大きさが小さく、曲がっている。加えて、麻痺のタイプに応じて、声帯は、他方の声帯がそれに触れるようになるほど十分に中央近くに移動していても、又は移動していなくてもよい。声帯が交わることができないときは、患者が音(又は、少なくとも大きい音)を生じることは困難である。従って、本発明は、声帯麻痺患者における萎縮した声帯を増強し、又はかさを増大するための方法であって、声帯が一緒になる能力が改善される、前記方法を提供する。
【０２１７】
一側声帯皺襞麻痺では、典型的には神経機能障害のために、一方の声帯皺襞が不動であり、たいてい喉頭を完全に閉じることができない。反回神経は、それぞれの声帯皺襞の大部分の動作を担う主要な神経であり、例えば種々の疾患、特定の外科手術又はウイルス感染による損傷を受け得る。一部の実施態様において、患者の声帯麻痺は、甲状腺癌、肺癌、結核又はサルコイド(又は胸部においてリンパ節を拡大させる任意のもの)、脳卒中、神経疾患(例えば、シャルコー・マリー・トゥース、シャイ・ドレーガー及び多系統萎縮症)の症候又は結果である。
【０２１８】
両側声帯麻痺は、両方の声帯皺襞麻痺(通常正中線に近い)である。一部の実施態様において、患者における両側声帯皺襞麻痺は、例えば脳卒中又はその他の神経性状態(アルノルト-キアーリ奇形など)、甲状腺癌、外科手術(主要な脳外科手術など)又は甲状腺摘除の症候又は結果である。
【０２１９】
本発明は、声帯麻痺の管理又は治療に使用するための方法を提供する。一つの実施態様において、方法は、患者において一側若しくは両側声帯麻痺又はそれに関連した症候を管理するか、又は治療するための方法であって、患者に本発明のコラーゲン組成物を注射するか、又はさもなければ投与することを含み、該患者において声帯皺襞閉鎖が改善される、前記方法が提供される。一つの実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、一方(又は両方)の麻痺した声帯皺襞を、それが他方の声帯皺襞と接触することができるように増強するか、又はかさを付加する。本発明のコラーゲン組成物の、これらの必要がある患者に対する注射は、患者の口を介し、又は直接皮膚及び喉仏を介することができる。
【０２２０】
(6.7.2.10 薬物送達)
本発明のコラーゲン組成物は、薬物、例えば治療薬の制御された送達のための薬物送達媒体として使用することができる。いくつかの実施態様において、コラーゲン組成物は、被験体、例えばヒトに対して1つ以上の治療薬を送達する。本発明の範囲内に包含される治療薬は、タンパク質、ペプチド、多糖体、多糖体抱合物、遺伝子に基づいたワクチン、生きた弱毒ワクチン、細胞全体である。本発明の方法に使用するための薬物の非限定的な例は、抗生物質、抗癌剤、抗バクテリア薬剤、抗ウイルス薬;ワクチン;麻酔薬;鎮痛剤;抗ぜん息薬;抗炎症薬;抗うつ薬;抗関節炎薬剤;抗糖尿病性薬剤;抗精神病薬;中枢神経興奮薬;ホルモン;免疫抑制薬;筋弛緩剤;プロスタグランジン;である。
【０２２１】
コラーゲン組成物は、被験体、例えばヒトに対する1つ以上の小分子の制御された送達のための送達媒体として使用してもよい。いくつかの実施態様において、コラーゲン組成物は、被験体、例えばヒトに対して1つ以上の小分子を送達する。本明細書に使用される「小分子」という用語及び類似の用語は、ペプチド、ペプチド擬態、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、1モルあたり約10,000グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物(すなわち、ヘテロ有機化合物及び有機金属化合物を含む)、1モルあたり約5,000グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、1モルあたり約1,000グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、1モルあたり約500グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、1モルあたり約100グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、並びにこのような化合物の塩、エステル及びその他の医薬として許容し得る形態を含むが、限定されない。このような化合物の塩、エステル及びその他の医薬として許容し得る形態も包含される。
【０２２２】
ある実施態様において、薬物送達のための媒体としての本発明のコラーゲン組成物により、薬物の吸収の増強;当該技術分野において公知のその他の薬物送達システムに相対的な薬物動態学的なプロフィール及び薬物の全身分布の改善が生じる。薬物動態が改善されることにより、最大の血漿濃度を達成するための時間(Tmax);最大の血漿濃度の程度(Cmax);検出可能な血液又は血漿濃度を誘発する時間(Tlag)などの標準的な薬物動態学的パラメーターによって測定される薬物動態学的プロフィールの増強が達成されることを意味する。吸収が増強されることにより、このようなパラメーターによって測定される薬物の吸収が改善されたことを意味する。薬物動態学的パラメーターの測定は、当該技術分野のルーチンで行われる。
【０２２３】
一部の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、1つ以上の成長因子、例えば限定されないが、抗生物質、ホルモン、成長因子、抗腫瘍薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、疼痛薬物、抗ヒスタミン剤、抗炎症薬、抗感染症薬、損傷治癒薬、創傷シーラント、細胞誘引剤及び足場試薬、酵素、受容体アンタゴニスト又はアゴニスト、ホルモン、成長因子、自己骨髄又はその他の細胞タイプ、抗生物質、抗菌薬及び抗体、その他、又はこれらの組合せを含む1つ以上の生体分子、例えば治療薬を更に含む。具体例において、本発明のコラーゲン組成物は、線維芽細胞成長因子、上皮性の成長因子などと共に含浸させてもよい。また、本発明のコラーゲン組成物は、限定されないが、特定の生化学的過程の特異的阻害剤などの小有機分子、例えば膜受容器阻害剤、ホルモン、キナーゼ阻害剤、成長抑制物質、抗癌剤、抗生物質、その他を含む1つ以上の小分子と共に含浸させてもよい。
【０２２４】
一部の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、その意図された使用に応じて生産の間に、又は注射の前に生体分子と共に含浸される。一部の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、1つ以上のインターフェロン(α-IFN、β-IFN、γ-IFN)、コロニー刺激因子(CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)、神経成長因子(NGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、リンホトキシン、上皮細胞成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、血管内皮細胞成長因子、エリスロポエチン、トランスフォーミング成長因子(TGF)、オンコスタチンM、インターロイキン(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、その他)、それらのファミリーのメンバー又はそれらの組合せを含む。一部の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、このような成長因子若しくはその他の生体分子の生物学的に活性な類似体、断片又は誘導体を含む。
【０２２５】
本発明の方法に使用するための特定の活性薬剤には、トランスフォーミング成長因子(TGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、上皮細胞成長因子(EGF)、結合組織活性化ペプチド(CTAP)、骨原性因子、並びにこのような成長因子の生物学的に活性な類似体、断片、及び誘導体などの成長因子を含む。多機能性調節タンパク質であるトランスフォーミング成長因子(TGF)スーパーファミリーのメンバーは、有用である。TGFスーパー遺伝子ファミリーのメンバーには、βトランスフォーミング成長因子(例えば、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3);骨形成タンパク質(例えば、BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9);ヘパリン結合成長因子(例えば、線維芽細胞成長因子(FGF)、上皮細胞成長因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、インスリン様増殖因子(IGF));インヒビン(例えば、インヒビンA、インヒビンB);増殖分化因子(例えば、GDF-1);及びアクチビン(例えば、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB)を含む。
【０２２６】
(6.7.2.11 創傷及び火傷)
本発明のコラーゲン組成物は、一部にはその物理的特性のために、硬及び/又は軟組織修復を増強し、又は置き換えるための創傷被覆材として、当該技術分野において公知のその他の生体材料、例えば米国特許第3,157,524号、第4,320,201号;第3,800,792号;第4,837,285号;第5,116,620号に記述されたものと比較して増強された臨床的有用性を有することが予想される。本発明のコラーゲン組成物は、これがコラーゲンの天然の四次構造を保持するので、コラーゲンマトリックスの間隔への細胞遊走を介した組織内増殖の改善をもたらす。本発明のコラーゲン組成物は、細胞をコラーゲンマトリックス内に付着させて、増殖させること、及びそれら自体の巨大分子を合成することができる。これにより、細胞は、新たな組織を増殖させることができる新たなマトリックスを産生する。このような細胞発生は、線維、羊毛及び可溶性コラーゲンなどのコラーゲンのその他の公知の形態では観察されない。
【０２２７】
一部の実施態様において、本発明は、本発明のコラーゲン組成物を、創傷が、例えば絆創膏を使用して覆われるように、創傷部位に対して、被験体の皮膚の上に、すなわち緻密層に直接配置することによって創傷を治療することを包含する。その他の実施態様において、本発明は、インプラントとして、例えば皮下埋込として本発明のコラーゲン組成物を使用して創傷を治療することを包含する。
【０２２８】
本発明は、組織内増殖を促進することができる巨大分子を本発明のコラーゲン組成物に添加することにより、創傷治癒の速度を増大させることを包含する。このような巨大分子には、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含むが、限定されない(例えば、Doillonらの論文(1987) Biomaterials 8:195 200; Doillon及びSilverの論文(1986) Biomaterials 7:3 8を参照されたい)。
【０２２９】
一部の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、限定されないが、一部の層及び全層の創傷、圧力性潰瘍、圧力性潰瘍、静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、慢性血管潰瘍、トンネル型/侵食型創傷、外科的創傷(例えば、ドナー部位/移植片、モース手術後、レーザー手術後、足治療、創傷裂開)、傷部外傷(例えば、剥離、裂傷、二度熱傷及び皮膚涙)及び疲労創傷を含む創傷の管理のために使用される。ある実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、一回使用が意図される。
【０２３０】
本発明は、本明細書において皮膚への送達のための5.4.2.7節に記述した本発明のコラーゲン組成物及び上に記述したいずれかの生体分子中に、限定されないが、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子、上皮細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子β、血管形成誘導因子、抗生物質、抗真菌薬、殺精子薬剤、ホルモン、酵素、酵素阻害剤を含む薬理活性薬を組み込むことを更に包含する。ある実施態様において、薬理活性薬剤は、生理的に有効な量で提供される。
【０２３１】
一部の実施態様において、コラーゲン組成物は、限定されないが、創傷の部位に適用される前に、同種間の幹細胞、幹細胞及び自己の成人の細胞を含む生細胞によって更に占められる。
【０２３２】
本発明のコラーゲン組成物は、創傷感染、例えば創傷感染に続く外科的又は傷部外傷の破壊の治療のために特に有用である。特定の実施態様において、コラーゲン組成物は、限定されないが、抗生物質、抗菌薬及び抗バクテリア薬剤を含む創傷感染の治療に有用な薬剤の治療上有効量と共に含浸される。本発明のコラーゲン組成物は、当該技術分野において公知の任意の微生物、例えば病原体のための公知の貯蔵所である人体内から生じるか、又は環境起源に由来する創傷に感染する微生物による創傷感染の治療において臨床的及び治療的な有用性を有する。創傷におけるその増殖が本発明の方法及び組成物によって減少され、又は予防されるであろう微生物の非限定的な例は、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、St.エピダーミス(St. epidermis)、β溶血性連鎖球菌、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ属(Klebsiella)種及びシュードモナス属(Pseudomonas)種、並びに嫌気性菌のもの、主に深部の傷部外傷ガス壊疸を生じさせるウェルチ菌(Clostridium welchii)又はタルチウム(tartium)である。
【０２３３】
その他の実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、上皮創傷、皮膚創傷、慢性創傷、急性創傷、外部創傷、内部創傷(例えば、コラーゲン組成物は、縫合線から血液の漏出を防ぐために、及び体が縫合材料に対して接着するのを形成するのを防ぐために、外科手術の間に吻合部位をくるんでもよい)、先天性創傷(例えば、ジストロフィー性表皮水泡症)を含むが限定されない創傷治療のために使用される。特に、コラーゲン組成物は、圧力性潰瘍(例えば、褥瘡性潰瘍)の治療における有用性を増強した。圧力潰瘍は、長期床上安静を受けた患者被験体、例えば局所的圧力の効果による皮膚喪失に苦しむ四肢麻痺患者及び対麻痺患者で頻繁に生じる。生じる床ずれにより、真皮糜爛、並びに表皮及び皮膚付属器の喪失を示す。更にその他のより具体的実施態様において、本発明のコラーゲン組成物は、一部の層及び全層の創傷、圧力性潰瘍、静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、慢性血管潰瘍、トンネル型/侵食型創傷、外科的創傷(例えば、ドナー部位/移植片、モース手術後、レーザー手術後、足治療、創傷裂開)、傷部外傷(例えば、剥離、裂傷、二度熱傷及び皮膚涙)及び疲労創傷を含むが、限定されない創傷の処置のために使用される。
【０２３４】
また、本発明のコラーゲン組成物は、限定されないが、第一度火傷、第二度火傷(一部の層火傷)、第三度火傷(全層熱傷)、火傷創傷の感染、切除された火傷創傷及び切除されていない火傷創傷の感染、移植された創傷の感染、ドナー部位の感染、以前に移植されたか、若しくは治癒された火傷創傷又は皮膚移植ドナー部位からの上皮の喪失及び火傷創傷膿痂疹を含む火傷の治療に使用してもよい。
【０２３５】
(6.7.2.12 歯科用)
本発明のコラーゲン組成物は、歯学、例えば歯周部外科手術、歯周組織の再生のための組織再生の誘導、骨再生の誘導及び根被覆において特定の有用性を有する。本発明は、限定されないが、対応する両側歯周欠損、歯間骨内欠損、深部3壁性骨内欠損、2壁性骨内欠損、並びに骨内欠損2及び3を含む歯周部の骨内欠損の再生を促進するための本発明のコラーゲン組成物の使用を包含する。本発明のコラーゲン組成物は、当該技術分野において公知のその他の技術、例えばQuteishらの論文,1992, J. Clin. Periodontol. 19(7): 476-84; Chungらの論文, 1990, J. Periodontol. 61(12): 732-6; Mattsonらの論文,1995, J. Periodontol. 66(7): 635-45; Benqueらの論文,1997, J. Clin. Periodontol. 24(8): 544-9; Mattsonらの論文,1999, J. Periodontol. 70(5): 510-7に開示されたものなどの架橋されたコラーゲン膜の使用と比べて、増強された治療的有用性及び増強された歯周部の骨内欠損の治療のための臨床パラメーターを有することが予想される。本発明のコラーゲン組成物を使用して改善される臨床パラメーターの例には、当業者に公知であるプラーク及び歯肉のインデックス・スコアリング、プロービングポケット深度、プロービング付着深度、並びに分岐部関与の分類及び骨欠損を含むが、限定されない。
【０２３６】
また、本発明は、限定されないが、両側欠損、対の頬側クラスII下顎軟骨大臼歯分岐部欠損、及び両側の下顎分岐部欠損を含むクラスII分岐部欠損を治療する際の本発明のコラーゲン組成物の使用を包含する。クラスII分岐部欠損の処理における本発明のコラーゲン組成物の有用性は、部分的には、それが分岐部欠損の失われた歯根膜を再生する能力によって説明することができる。本発明のコラーゲン組成物は、Paulらの論文,1992, Int. J. Periodontics Restorative Dent. 12: 123-31; Wangらの論文,1994, J. Periodontol. 65: 1029-36; Blumenthal, 1993, J. Periodontol. 64: 925-33; Blackらの論文,1994, J. Periodontol. 54: 598-604; Yuknaらの論文,1995, J. Periodontol. 67: 650-7に開示したものなどのクラスII分岐部欠損の治療のために当該技術分野において使用されるコラーゲン膜と比べて、増強された治療的及び臨床的有用性を有することが予想される。
【０２３７】
本発明は、根被覆法における本発明のコラーゲン組成物の使用を更に包含する。根被覆における本発明のコラーゲン組成物の有用性は、一部には、組織再生が誘導される原理に基づいて、失われたか、ダメージを受けたか、又は病気の歯肉組織を置き換えるその能力によるものと説明することができる。本発明のコラーゲン組成物は、上で挙げた理由のために、Shiehらの論文,1997 J. Periodontol., 68: 770-8; Zahediらの論文,1998 J. Periodontol. 69: 975-81; Ozcanらの論文,1997 J. Marmara Univ. Dent. Fa. 2: 588-98; Wangらの論文,1997 J. Dent. Res. 78 (Spec Issue): 119 (Abstr. 106)に開示されたものなどの、根被覆のために当該技術分野において伝統的に使用されるコラーゲン膜と比較して、根被覆における増強された臨床的有用性を有することが予想される。
【０２３８】
本発明は、限定されないが、歯根膜炎及び歯肉炎を含む歯周病をもつ被験体におけるコラーゲン組成物の使用を更に包含する。また、本発明のコラーゲン組成物は、スケーリング及び根被覆のための補助としての臨床的有用性を有する。本発明は、本発明のコラーゲン組成物を使用して歯周病である被験体を治療することを包含する。本発明のコラーゲン組成物を使用することにより被験体における歯周病を治療するための例示的方法は、クロルヘキシジングルコネートなどの抗菌剤と共に含浸させることができるコラーゲン組成物を、被験体の1つ以上の、例えば5mm以上の歯周ポケットに挿入することを含む。好都合には、コラーゲン組成物は、生体分解性であり得る。
【０２３９】
歯科に使用するための本発明のコラーゲン組成物は、治療される歯の障害のタイプに応じて、1つ以上の生体分子と共に含浸させてもよい。歯の障害の治療のための当該技術分野において公知のいずれの生体分子も、本発明の方法及び組成物に包含される。具体的実施態様において、感染と関連する歯の障害の治療に用されるコラーゲン組成物は、限定されないが、ドキソサイクリン、テトラサイクリン、クロルヘキシジングルコネート及びミノサイクリンを含む1つ以上の抗生物質と共に含浸させてもよい。
【０２４０】
(6.7.2.13 その他の使用)
また、本発明のコラーゲン組成物は、卵巣又は子宮角における術後癒着障壁として使用してもよい。また、コラーゲン組成物は、(例えば、髄膜-大脳接着の予防において)脳における接着障壁として使用してもよい。ここで、コラーゲン組成物は、硬膜及び軟髄膜を分離する硬膜下腔を修復するために使用してもよい。一般に、コラーゲン組成物は、術後の漏出を制御するための、傷ついた内部臓器、例えば脾臓に対する包装として、又は肺に付着させるシートとして使用してもよい。また、コラーゲン組成物は、(鼓室の穿孔の際の)鼓膜移植片の外科的療法を補助するために、又は乳様突起の空洞の裏打ちとして使用してもよい。また、コラーゲン組成物は、膣新生術における裏打ち組織として使用してもよい。心臓血管手術において、コラーゲン組成物を心臓周囲の閉鎖材料として使用してもよい。また、コラーゲン組成物は、精管吻合術における吻合完了の際に使用してもよい。
【０２４１】
(6.7.3 幹細胞を含む組成物の使用)
上記の使用のいずれかの場面において、美容であっても美容以外であっても、該組成物は、上記セクション5.6に記載したように、1つ以上の型の幹細胞、好ましくは胎盤幹細胞を含むことができる。胎盤幹細胞は、本発明の組成物と接触すると、創傷の治癒を促進するサイトカイン、例えば、IL-6、IL-8及びMCP-1(単球走化性タンパク質-1)を分泌する。本発明の組成物がフィブロネクチンを含まないか、又は無視し得る量のフィブロネクチンを含む実施態様において、胎盤幹細胞は、該組成物に結合することが可能になると、フィブロネクチンを含む細胞外マトリックスタンパク質を分泌する。したがって、該組成物は、該組成物に結合した胎盤幹細胞と一緒になって、例えば、該組合せを受け入れる個体の一部への、又はそれに沿う細胞移動を刺激し、及び可能にする表面又は導管を生成するように作用することができる。
【０２４２】
該組成物及び幹細胞を一緒に個体に投与することができる。例えば、一実施態様において、該組成物は、該組成物を個体に投与する直前(例えば、10〜20分以内)に該組成物と接触された幹細胞を含むことができる。別の実施態様において、幹細胞を該組成物に結合させるのに十分な投与前の時間に、典型的には、投与の少なくとも1時間前に幹細胞を該組成物と接触させることができる。より具体的な実施態様において、投与前の時間は、幹細胞が結合及び増殖するのに十分な時間、典型的には、投与前の少なくとも24時間から48時間、又はそれより長い時間である。別のより具体的な実施態様において、該時間は、幹細胞が、本発明の組成物に結合し、その上で増殖し、検出可能な量の細胞外マトリックスタンパク質、例えば、フィブロネクチンを堆積するのに十分な時間である。
【０２４３】
該組成物及び幹細胞を個体に個別に投与することもできる。例えば、一実施態様において、該組成物を、傷又は修復を必要とする組織の部位において、個体に投与し、続いて幹細胞を投与することができる。別の実施態様において、幹細胞を、傷又は修復を必要とする組織の部位と接触させ、続いて該創傷又は修復を必要とする組織を本発明の組成物と接触させる。
【０２４４】
したがって、一実施態様において、本発明は、創傷の治癒を促進する方法であって、該創傷を、幹細胞、例えば、胎盤幹細胞を含む本発明の組成物と接触させることを含み、該幹細胞は、IL-6、IL-8若しくはMCP-1又はそれらの任意の組合せを、或いはフィブロネクチンを該創傷の少なくとも一部に分泌する、前記方法を提供する。幹細胞がフィブロネクチンを分泌する場合には、本発明のコラーゲン組成物は、検出不能な量のフィブロネクチンを含むことが好ましい。具体的な実施態様において、該組成物をほぼ創傷の形に成形又は形成する。ある実施態様において、該創傷は、治癒しない創傷である。具体的な実施態様において、該創傷は、足潰瘍、例えば、静脈足潰瘍、動脈足潰瘍、糖尿病性足潰瘍又は褥瘡性(圧力)潰瘍である。該創傷が足潰瘍である場合には、該組成物を、好ましくは、潰瘍の少なくとも一部を被覆するのに十分に大きいシートに形成し、該シートは、少なくとも潰瘍と接触するシート面上に胎盤幹細胞を含む。様々な実施態様において、該創傷は、事故創傷であり、又は外科手術によって引き起こされた、又は外科手術に付随する創傷である。外科手術は、上述のように、本発明のコラーゲン組成物が有用である任意の外科手術であり、美容外科手術又は非美容外科手術であり得る。
【０２４５】
別の実施態様において、本発明は、個体の身体の一部の欠陥の改善又は治癒を促進させる。当該欠陥は瘻孔、不完全心臓弁及び腹壁の穴などの自然に発生した、例えば遺伝子上の欠陥であり得る。
【０２４６】
(6.8 コラーゲン組成物を含むキット)
もう一つの態様において、本発明は、本発明のコラーゲン組成物を含むキットを提供する。例えば、本発明は、哺乳動物の組織を増強するか、又は置き換えるためのキットを提供する。キットは、当該技術分野に熟練した開業医に配布するためのパッケージ内に本発明の1つ以上のコラーゲン組成物を含む。キットには、本発明の方法に従って哺乳動物の組織を増大するか、又は置き換えるためのコラーゲン組成物の使用法に関する説明を伴うラベル又はラベリングを含むことができる。ある実施態様において、キットは、1つ以上の注射器、カニューレ、カテーテル、その他などのコラーゲン組成物を投与するための手段などの、本方法を実施するために有用な構成要素を含むことができる。ある実施態様において、キットは、コラーゲン組成物を投与するための手段を安全に処理するために有用な構成要素(例えば、使用した注射器のための「シャープス(sharps)」容器)を含むことができる。ある実施態様において、キットは、事前に満たされた注射器、単位投与量又は使用単位パッケージ内に組成物を含むことができる。
【０２４７】
ある他の実施態様において、本発明のキットは、本発明のコラーゲン組成物、及び幹細胞集団の培養のための1つ以上の他の構成要素を含むことができる。例えば、該キットは、幹細胞、例えば胎盤幹細胞の培養に好適な1つ以上の構造の本発明のコラーゲン組成物、例えば、シート、チューブ及びメッシュ等の形態のコラーゲン組成物を含むことができる。該キットは、幹細胞の培養に使用される1つ以上の品目、例えば、細胞培養時に本発明のコラーゲン組成物を収容することが可能な培養皿、プラスチック器具、シリンジ、ピペットチップ、細胞培地、1つ以上のサイトカイン又は成長因子及び消耗品等を含むことができる。
【０２４８】
他の実施態様において、該キットは、胎盤組織からの幹細胞の回収を促進する1つ以上の構成要素を含むことができる。様々な具体的な実施態様において、該キットは、幹細胞を回収するための胎盤の潅流を促す構成要素、例えば、潅流溶液;胎盤を収容するのに十分に大きい1つ以上のトレー、潅流溶液を回収するためのガラス器具又はプラスチック器具;潅流溶液を回収するための1つ以上の袋、臍血管を疎通するためのニードル及び/又はカニューレ等を含む。他の具体的な実施態様において、該キットは、胎盤幹細胞を単離するための胎盤組織の酵素消化を促す1つ以上の構成要素、例えば、1つ以上の組織消化酵素(例えば、トリプシン又はキモトリプシン等);細胞培養に好適なプラスチック器具(例えば、培養皿及びマルチウェル培養プレート等);を含む。
【０２４９】
ある実施態様において、該キットは、少なくとも1つの医学的場面、例えば創傷の治癒における本発明のコラーゲン組成物の使用説明書を含む。他の実施態様において、該キットは、1つ以上の幹細胞群を本発明のコラーゲン組成物上で培養するための説明書を含む。
【実施例】
【０２５０】
(7. 実施例)
以下のセクションにおいて、「約23℃で」という語句は、室温を指し得ることを当業者なら認識するであろう。
【０２５１】
(7.1 実施例1:胎盤からコラーゲンの単離)
本実施例は、胎盤からのコラーゲンの単離を例示する。
【０２５２】
凍結した胎盤を本明細書に記載の方法に従って得る。該胎盤を、水を含むNalgeneトレーで1〜4時間ラップすることによって解凍させる。次いで、それらをプラスチックラップから取り出し、更に解凍させるために水中に入れる。
【０２５３】
解凍した胎盤を挽肉機のステンレス鋼トレー上に載せる。臍帯片を各胎盤から切断し、各胎盤を約23℃で約4つの細片にスライスする。それらの細片を約23℃にて挽肉機で粉砕する。
【０２５４】
浸透圧ショック:得られた粉砕胎盤を、0.5MのNaCl(5リットル/胎盤)を含むNalgeneタンクに添加し、75〜100rpmの電動ミキサーを使用して(4〜6℃で24時間)混合する。
【０２５５】
24時間後、ミキサーを停止し、約23℃で組織をミキサーの底部に沈降させる。#36TYGON(登録商標)チューブを備えた蠕動ポンプを使用して組織及び体液を吸い出し、約23℃で#40篩にて濾過し、単離された組織を混合タンクに戻す。
【０２５６】
新鮮な0.5MのNaCl(5L/胎盤)を混合物に添加し、4〜6℃で24時間混合する(電動ミキサー、75〜100rpm)。24時間後、上記の方法を用いて組織を単離する。
【０２５７】
組織を水(5L/胎盤)で洗浄し、4〜6℃で24時間混合する(電動ミキサー、75〜100rpm)。24時間後、上記の方法を用いて組織を単離する。
【０２５８】
上記の4つのパラグラフに従って、組織を再び0.5MのNaCl、再び0.5MのNaCl、及び次いで水で更に洗浄する。
【０２５９】
凍結乾燥:得られた試料を凍結乾燥器容器にて200〜400gの量に減量させ、-70℃で1〜2時間凍結させる。凍結した試料を凍結乾燥器で24〜48時間凍結乾燥し、次いで取り出す。凍結乾燥した試料をブレンダーにて滑らかな粉末に混合し、次いで清浄な混合タンクに移す。
【０２６０】
界面活性剤処理:1%デオキシコール酸溶液(1L/胎盤)を、混合した凍結乾燥試料を含む混合タンクに添加する。該試料と1%デオキシコール酸溶液を4〜6℃で24時間混合する(電動ミキサー、75〜100rpm)。24時間後、ミキサーを停止し、上記のように組織を#40篩で単離する。
【０２６１】
界面活性剤処理を4〜6℃で24時間繰り返す(電動ミキサー、75〜100rpm)。24時間後、ミキサーを停止し、上記のように組織を#40篩で単離する。
【０２６２】
水洗:組織を水(5L/胎盤)で洗浄し、4〜6℃で24時間混合する(電動ミキサー、75〜100rpm)。24時間後、上記の方法を用いて組織を単離する。
【０２６３】
組織を再び水(5L/胎盤)で洗浄し、4〜6℃で24時間混合する(電動ミキサー、100〜150rpm)。24時間後、上記の方法を用いて組織を単離する。
【０２６４】
組織を再び水(5L/胎盤)で洗浄し、4〜6℃で24時間混合する(電動ミキサー、150rpm)。24時間後、上記の方法を用いて組織を単離する。
【０２６５】
任意に、組織を水(5L/胎盤)で4回洗浄し、4〜6℃で24時間混合する(電動ミキサー、150rpm)。24時間後、上記の方法を用いて組織を単離する。
【０２６６】
凍結乾燥:得られた試料を200gの量でブレンダーに添加する。200mLの脱イオン水を試料に添加し、試料をブレンダーで滑らかなペーストに混合する。混合した試料を蓄積させ、水(1L/胎盤)で濯ぐ。
【０２６７】
200〜400gの量の試料を凍結乾燥器容器に添加する。試料を減量させ、-70℃で凍結する。減量した試料を24〜48時間凍結乾燥する。
【０２６８】
無菌塩基処理:凍結乾燥した試料を蓄積させる。水酸化ナトリウム溶液(0.5M、1L)を加熱滅菌された無菌フラスコに添加する。低エンドトキシン水(1L)を、蓄積された凍結乾燥試料に添加する。該試料及び水酸化ナトリウム溶液を約23℃で4時間にわたって250rpmでシェーカー上にて混合する。
【０２６９】
無菌水洗:試料を無菌#70フィルターによる濾過によって回収し、1Lの無エンドトキシン水で濯ぐ。無エンドトキシン水(1L)を添加し、試料を約23℃で18〜24時間にわたって250rpmでシェーカー上にて混合する。
【０２７０】
試料を無菌#70フィルターによる濾過によって回収する。無エンドトキシン水(1L)を添加し、試料を約23℃で18〜24時間にわたって250rpmでシェーカー上にて混合する。
【０２７１】
試料を無菌#70フィルターによる濾過によって回収し、1Lの無エンドトキシン水で濯ぐ。無エンドトキシン水(1L)を添加し、試料を約23℃で18〜24時間にわたって250rpmでシェーカー上にて混合する。
【０２７２】
pHが9を超える場合は、試料を無エンドトキシン水で再び洗浄し、約18〜24時間にわたって約250RPMでシェーカー上にて混合する。
【０２７３】
pHが9以下の場合は、試料をそのまま製剤化できる。
【０２７４】
収量は、10g/胎盤以上であり得る。
【０２７５】
得られた試料を保管のために凍結乾燥することができる。使用に際して、試料を、例えば、シリンジ内でペーストとして使用するために、ブレンダー内で300〜1000mg/mLのリン酸緩衝食塩水に懸濁させることができる。試料を500〜1000mg/mLのリン酸緩衝食塩水中で成形し、例えば、シート、チューブ又はプラグ等として使用するために成形することができる。
【０２７６】
(7.2 実施例2:テロペプチドコラーゲン試料の調製)
実施例1の浸透圧ショック工程、凍結乾燥工程、界面活性剤処理工程、水洗工程、凍結乾燥工程、塩基処理工程、水洗工程及び凍結乾燥工程に従って7.5gのテロペプチドコラーゲンを調製した。
【０２７７】
実施例1の浸透圧ショック工程、凍結乾燥工程、界面活性剤処理工程、水洗工程、塩基処理工程、水洗工程及び凍結乾燥工程に従って11.8gのテロペプチドコラーゲンを調製した。
【０２７８】
実施例1の浸透圧ショック工程、凍結乾燥工程、界面活性剤処理工程、水洗工程、塩基処理工程、水洗工程及び凍結乾燥工程に従って12.0gのテロペプチドコラーゲンを調製した。
【０２７９】
実施例1の浸透圧ショック工程、界面活性剤処理工程、水洗工程、塩基処理工程、水洗工程及び凍結乾燥工程に従って11.8gのテロペプチドコラーゲンを調製した。
【０２８０】
(7.3 実施例3:生化学分析)
実施例1及び2に従ってコラーゲン試料を調製した。標準的な技術による生化学分析は、乾燥重量で80.40%のコラーゲン、11.0%の水並びに0.01%未満のフィブロネクチン、ラミニン及びグリゴソアミノグリカンを示した。エラスチン含有量は、測定しなかった。
【０２８１】
実施例1及び2に従って調製された試料のアミノ酸分析は、34〜35%のグリシン、約11%のヒドロキシプロリン及び10〜11%のプロリンを示した。
【０２８２】
実施例1及び2に従って調製された試料の免疫分析は、74〜92%のI型コラーゲン、4〜6%のIII型コラーゲン及び2〜15%のIV型コラーゲンを示した。
【０２８３】
(7.4 実施例4:代替的なECMの製造方法、及びECM上での幹細胞の培養)
本実施例は、本発明のコラーゲン組成物を製造する代替的な方法を実証し、それらの方法によって製造された材料の組成の分析を示す。
【０２８４】
(材料及び方法)
細胞外マトリックス(ECM)の単離:ECMを以下のようにして単離した。手短に述べると、凍結したヒト胎盤を0.5Mの塩化ナトリウム中で解凍し、挽肉機で粉砕し、23℃でインキュベータシェーカー中にて0.5Mの塩化ナトリウム及び水で繰り返し洗浄した後、1%のSDS又は0.5%のデオキシコール酸などの界面活性剤で洗浄した。血液のない胎盤組織を3時間から24時間の間の時間にわたって0.1〜0.5Nの水酸化ナトリウムで処理して、胎盤葉組織を可溶化させた後、リン酸緩衝食塩水(PBS)で濯いで、pHを中性にした。そのようにして製造された材料は、安定したペーストであり、4℃で保管された。
【０２８５】
生化学分析:単離したECMの生化学組成を測定するために、1グラムの試料を凍結乾燥し、乾燥重量を測定した。ECMを、70℃で100mMのHClに溶解させること、又は23℃で18時間にわたって10mMのHClでECMのペプシン処理(1mg/gm)をすることによって可溶化させた。100mMのHClに溶解した組織を使用して、フィブロネクチン、ラミニン、GAG及びエラスチンの含有量を測定した。ペプシン可溶化組織を使用して、コラーゲン含有量を測定した。
【０２８６】
サンドイッチELISAを用いて、フィブロネクチン及びラミニン濃度を測定した。色素ベースのアッセイを用いて、エラスチン及びグリコサミノグリカン(GAG)の含有量を測定した。サンドイッチELISA(コンドレックス)を用いて、コラーゲンIの含有量の測定を実施した。II型コラーゲン及びIV型コラーゲンに対する一次抗体並びにHRP結合二次抗体を使用するインハウスELISAを用いて、コラーゲンIII及びIVの含有量を測定した。
【０２８７】
ECM構造体の調製:ECM材料のシートを調製するために、水和ECMペーストの層を2つの医薬グレードのTYVEK(登録商標)シートの間に挟んだ。この構造体をゲルドライヤーに充填し、ECM膜が乾燥するまで23℃で終夜真空にした。シートを細胞培養試験のために適切なサイズに切断した。ECMの三次元構造体を調製するために、ECMペーストを様々な金型に充填し、凍結乾燥した。培地又は水におけるECMシート及び3D金型の安定性を調べる。該構造体を水、食塩水又は細胞培地中で37℃にて1週間までインキュベートした。
【０２８８】
細胞培養:胎盤幹細胞を60%の低グルコースDMEM(Invitrogen(カリフォルニア州Carlsbad))、40%のMCDB-201(Sigma(ミズーリ州St. Louis))、2%のウシ胎児血清(Hyclone(ユタ州Logan))、1×インシュリン-トランスフェリン-セレニウム補充物(Invitrogen)、0.02%のリノレン酸/ウシ血清アルブミン(Sigma)、10ng/mLの表皮成長因子(Sigma)、10ng/mLの血小板由来成長因子(R&D Systems(ミネソタ州Minneapolis))、0.05Mのデキサメタソン(Sigma)、0.1mMのアスコルビン酸2-リン酸塩(Sigma)及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシン(Invitrogen)で二次培養した。胎盤幹細胞(1ウェルあたり30,000個)を、24個のマルチウェルクラスタプレート内に配置されたECM膜上に接種した。胎盤幹細胞を、また、コラーゲン(Inamed(カリフォルニア州Fremont))で予めコーティングされたLabtekチャンバスライド(Nalgene Nunc International(ニューヨーク州Rochester))上に同等の密度で接種した。細胞を37℃で3及び48時間インキュベートし、免疫蛍光顕微鏡検査のために処理した。
【０２８９】
免疫蛍光顕微鏡検査:ECM膜とともに3又は48時間インキュベートした後、胎盤幹細胞-ECM構造体を3.7%のホルムアルデヒドで10分間固定し、0.5%トリトン-X100で20分間透過化処理した。胎盤幹細胞をAlexaFluor488結合ファロイジンとともにインキュベートして、F-アクチンを可視化した。フィブロネクチン染色では、試料を遮断緩衝液(3%ウシ血清アルブミン/1Xリン酸緩衝食塩水)中ウサギ抗ヒトフィブロネクチン抗体(Sigma)とともに1時間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、遮断緩衝液中AlxaFluor594結合抗ウサギ抗体とともに30分間更にインキュベートした。試料をリン酸緩衝食塩水で再び洗浄し、スライド上に配置し、蛍光顕微鏡で観察した。
【０２９０】
サイトカイン分泌分析:胎盤幹細胞を含有する細胞培養ECMシート、並びに胎盤幹細胞を含有する組織培養処理プレートから培地試料(100μl)を培養の0、3、24及び48時間目に取り出した。試料を1mLのPBSで希釈し、サイトカインの存在について分析した。各サイトカインの濃度をサイトカインの既知の濃度の基準プロットから計算した。
【０２９１】
(結果)
ECMの単離:典型的な胎盤の乾燥重量は、約300g毎胎盤の湿重量に対応する約30gである。図1に示されるように、浸透圧ショック工程及び界面活性剤洗浄工程を用いて、多量の非細胞外マトリックス組織を除去して、最終残留重量を約10gとすることができる。NaOHを使用する可溶化と界面活性剤を併用すると、残留重量が約6gまで更に減少する。NaOHへの曝露時間及びNaOHの濃度は、胎盤から単離されるECMの全質量に影響することが判明した。様々な我々の界面活性剤洗浄工程及びNaOH洗浄工程を用いて、5種類の最終ECM材料を生成した。典型的には、単一の胎盤から、約6gから約10gのECM材料が得られた。
【０２９２】
ECMの生化学組成:5種類のECMの生化学分析は、それらが基本的にコラーゲンで構成されていることを示した。I型は、主要コラーゲン(全コラーゲンの約74%から約90%)であり、III型(全コラーゲンの約4%から約6%)及びIV型(全コラーゲンの約2%から約15%)は、副次的構成要素であった。胎盤ECMに見いだされる他の主要細胞外マトリックスタンパク質は、エラスチンであった。表1に示されるように、エラスチンは、ECM-1からECM-4の全乾燥重量の約3〜5%を占めていた。しかし、NaOHを使用せずに生成されたECM-5は、約12%のエラスチンを含有していた。5つのすべての方法によって製造されたECM材料中にグリコサミノグリカンが特定されたが、乾燥重量%は、該単離方法におけるNaOHの使用に影響されていないようであった。逆に、重要な接着タンパク質であるフィブロネクチン及びラミニンの存在は、NaOHの使用に酷く影響された。フィブロネクチン及びラミニンは、NaOH処理に耐えず、ECM1から4に見いだすことができなかった。しかし、NaOHを使用せずに単離されたECM-5は、接着タンパク質がより豊富な組成を有する(表1)。
【表１】

【０２９３】
細胞結合試験:播種の3時間後に、胎盤幹細胞の同様の結合レベルがすべてのECM(#1〜5)について観察された。ECMに対する幹細胞の結合のレベルは、精製されたコラーゲンについて観察されたものよりわずかに低かった。この時点におけるフィブロネクチンの免疫染色により、細胞内染色が豊富で、検出可能な細胞外フィブロネクチンが存在しないことが明らかになった。培養から48時間までに、胎盤幹細胞は、数が増加し、精製されたコラーゲン、ECM2及びECM4上に類似した十分に拡散した形態を採用していることが観察された。対照的に、ECM1上で培養された胎盤幹細胞は、成長しなかった。観察された細胞がより少なかっただけでなく、それらの形態が丸みを帯び、十分に拡散していなかった。ECM5上の胎盤幹細胞は、他のECM又はコラーゲン上の胎盤幹細胞より長く、かつ偏っているように思われた。
【０２９４】
ECM3上の細胞結合の測定は、乾燥による材料の表面の異質性により幾分支障があった。1つの焦点面に沿って撮像するのが困難であったため、最初は、非常に少数の細胞しか結合しないように思われた。しかし、異なる焦点面における観察により、ECM3上でのいくつかの細胞結合が明らかになった。
【０２９５】
48時間の時点におけるフィブロネクチンに対する免疫染色により、ECM1〜ECM4上の細胞外フィブロネクチンマトリックス原線維の大規模なネットワークが明らかになった。胎盤幹細胞がECM上で培養されなかった対照は、フィブロネクチン原線維の形跡を示さなかったため、これらのフィブロネクチンマトリックス原線維は、胎盤幹細胞によって結集されていた。ECM1〜ECM4と対照的に、ECM5及びコラーゲンは、胎盤幹細胞によるフィブロネクチンマトリックス結集を支持していなかった。これらの表面上に細胞外原線維フィブロネクチンが検出されなかった。
【０２９６】
サイトカインアレイ試験:我々は、ECM上での結合及び増殖の結果としての胎盤幹細胞からの重要サイトカイン/ケモカインの分泌を調べた。ECM上のサイトカイン分泌を、組織培養処理細胞培養プレート上でインキュベートされた胎盤幹細胞からのそれと比較した。いくつかのインターロイキン及びサイトカイン(Biosource)を含む標準25多重サイトカインアレイを使用した。それらのサイトカインは、IL-1β、IL-1Ra、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12p40/p70、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、MIG、エオタキシン、ランテス(Rantes)及びMCP-1を含んでいた。胎盤幹細胞をECMシート上で培養した場合に、試験した25種のサイトカインのうち、IL-6、IL-8及びMCP-1の3つのサイトカインの分泌が、組織培養処理プレート上で培養された胎盤幹細胞による分泌を上回って増加していることが観察された。図2A〜2Cは、5つのECM構造体上の胎盤幹細胞によるサイトカイン分泌(IL-6、IL-8&MCP-1)の時間依存的増加を示す。すべてのデータを1cm²あたり1000個の結合細胞に対して正規化した。ECM-5は、MCP-1分泌が明らかに増加していないという点で異例であり、この細胞外マトリックス上で培養された場合における胎盤幹細胞の細胞生理の変化を示唆していた。既に示したように、ECM-5は、ECM-1から4と全く異なり、フィブロネクチンの発現を支持しなかった。ECM-5は、NaOHを使用せずに生成される唯一のマトリックスであり、2つの重要細胞接着タンパク質であるフィブロネクチン及びラミニンを維持する生化学組成を有していたことに注目すると興味深い。
【０２９７】
本明細書において引用される全ての刊行物及び特許出願は、あたかもそれぞれの刊行物又は特許出願が引用により取り込まれていることが具体的かつ個々に示されたかのように、引用により本明細書に取り込まれている。前述の発明は、理解の明快さのを目的として例証及び実施例によっていくらか詳細に記述してあるが、本発明の教示を考慮して、添付の請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、それに対して一定の変更及び修飾を行ってもよいことは当業者に直ちに明らかであろう。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基処理、界面活性剤処理テロペプチドコラーゲン。
【請求項２】
哺乳動物コラーゲンである、請求項1記載のコラーゲン。
【請求項３】
ウシ、ヒツジ又はラットコラーゲンである、請求項1記載のコラーゲン。
【請求項４】
ヒトコラーゲンである、請求項1記載のコラーゲン。
【請求項５】
胎盤コラーゲンである、請求項1記載のコラーゲン。
【請求項６】
ヒト胎盤コラーゲンである、請求項1記載のコラーゲン。
【請求項７】
架橋されている、請求項1記載のコラーゲン。
【請求項８】
グルタルアルデヒドで架橋されている、請求項1記載のコラーゲン。
【請求項９】
検出可能な量のフィブロネクチンを含む、界面活性剤処理テロペプチドコラーゲン。
【請求項１０】
複数の幹細胞を含む、請求項1又は請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
前記幹細胞が、胚幹細胞、胚生殖細胞、間葉幹細胞、骨髄由来幹細胞、末梢血液からの造血幹細胞、胎児血液からの造血幹細胞、胎盤血液からの造血幹細胞、臍帯血液からの造血幹細胞、胎盤潅流液からの造血幹細胞、体性幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞、筋幹細胞、脂肪幹細胞、又はCD34^-胎盤幹細胞である、請求項10記載の組成物。
【請求項１２】
前記CD34^-胎盤幹細胞がCD200⁺である、請求項11記載の組成物。
【請求項１３】
前記CD34^-胎盤幹細胞が、
a. CD200⁺又はHLA-G⁺であり;
b. CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺であり;
c. CD200⁺及びOCT-4⁺であり;
d. CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺であり、CD73⁺及びCD105⁺であり、胎盤細胞の集団にある場合は、胚様体の形成を可能にする条件下で1つ以上の胚様体の形成を促進し;
e. OCT-4⁺であり、胎盤細胞の集団にある場合は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されると、前記幹細胞を含む単離胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体の形成を促進する、請求項11記載の組成物。
【請求項１４】
2つ以上の型の幹細胞を含む、請求項10記載の組成物。
【請求項１５】
複数の非幹細胞を含む、請求項10記載の組成物。
【請求項１６】
シートとして成形された、請求項10記載の組成物。
【請求項１７】
チューブとして成形された、請求項10記載の組成物。
【請求項１８】
メッシュとして成形された、請求項10記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、創傷又は傷害の部位に適合するように成形される、請求項10記載の組成物。
【請求項２０】
請求項1記載のコラーゲンを哺乳動物の組織に投与することを含む、哺乳動物の組織を増大し、増量し、又は置換する方法。
【請求項２１】
請求項1記載のコラーゲンと、架橋されたテロペプチドコラーゲンを投与するための説明書を伴うラベルとを含む、哺乳動物の組織を増大し、増量し、又は置換するためのキット。
【請求項２２】
コラーゲンを含む哺乳動物の組織からテロペプチドコラーゲンを調製するための方法であって:
a.該組織を浸透圧ショック溶液と接触させて、コラーゲン組成物を得る工程と;
b.該コラーゲン組成物を界面活性剤と接触させる工程と;
c.該界面活性剤処理コラーゲン溶液を塩基性溶液と接触させる工程と;を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記浸透圧ショック溶液が、50mM NaCl未満の浸透ポテンシャルをもつ水を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
工程(a)が、前記組織を、少なくとも0.5M NaClの溶液の浸透ポテンシャルを有する溶液と接触させることに先行又は後続する、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
前記塩基性溶液が、少なくとも0.5M NaOHを含む、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
前記塩基処理、界面活性剤処理コラーゲン溶液を濾過する工程を更に含む、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
前記コラーゲンを架橋して、架橋されたコラーゲンを得る工程を更に含む、請求項22記載の方法。
【請求項２８】
前記コラーゲンをグルタルアルデヒドで架橋する、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
前記架橋されたコラーゲンを剪断する工程を更に含む、請求項22記載の方法。
【請求項３０】
前記コラーゲン組成物を、1つ以上のウイルス粒子がフィルターを通過することができるが該コラーゲン組成物を保持するサイズのフィルターと接触させる工程を更に含む、請求項22記載の方法。
【請求項３１】
前記フィルターが約500kDa、約750kDa又は約1000kDaである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
創傷の治癒を促進する方法であって、該創傷を本発明のコラーゲン組成物と接触させることを含み、前記接触は、該組成物と接触していない創傷と比較して該創傷の様相の検出可能に大きな改善をもたらす、前記方法。
【請求項３３】
前記創傷を複数の幹細胞と接触させることを更に含む、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
前記幹細胞を、前記組成物を前記創傷と接触させることとは別に、前記創傷と接触させる、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が前記幹細胞を含む、請求項32記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、2つの面を有するシートとして成形され、かつ前記幹細胞が前記面の少なくとも1つに存在する、請求項32記載の方法。
【請求項３７】
前記幹細胞を前記組成物に接着させる、請求項32記載の方法。
【請求項３８】
前記幹細胞がIL-6、IL-8及び/又はMCP-1を分泌する、請求項32記載の方法。
【請求項３９】
前記幹細胞が胎盤幹細胞である、請求項32記載の方法。
【請求項４０】
前記胎盤幹細胞がCD34^-及びCD200⁺である、請求項34記載の方法。
【請求項４１】
前記創傷が足潰瘍である、請求項32記載の方法。
【請求項４２】
前記足潰瘍が、静脈足潰瘍、動脈足潰瘍、糖尿病性足潰瘍又は褥瘡性足潰瘍である、請求項43記載の方法。
【請求項４３】
前記組成物が創傷充填剤として使用される、請求項32記載の方法。
【請求項４４】
請求項1記載の組成物を複数の幹細胞と接触させることを含む、組成物を製造する方法。
【請求項４５】
前記複数の幹細胞の少なくとも一部を前記組成物に接着させることを含む、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
前記幹細胞を前記組成物上で増殖させることを含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
前記幹細胞が前記組成物上で密集するまで増殖する、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
前記幹細胞が、前記組成物と接触すると、検出可能な量のIL-6、IL-8及び/又はMCP-1を生成する、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
治療における塩基処理、界面活性剤処理テロペプチドコラーゲンの使用。
【請求項５０】
哺乳動物の組織を増大し、増量し、又は置換するための塩基処理、界面活性剤処理テロペプチドコラーゲンの使用であって、前記増大、増量又は置換は、前記コラーゲンを該哺乳動物の組織に投与することを含む、前記使用。
【請求項５１】
哺乳動物の組織を増大し、増量し、又は置換するための組成物の製造における塩基処理、界面活性剤処理テロペプチドコラーゲンの使用であって、前記増大、増量又は置換は、前記コラーゲンを該哺乳動物の組織に投与することを含む、前記使用。
【請求項５２】
対象における創傷の治癒を促進するための塩基処理、界面活性剤処理テロペプチドコラーゲンの使用であって、前記促進は、前記組成物を該創傷と接触させることを含み、前記接触は、該組成物と接触していない創傷と比較して該創傷の様相の検出可能に大きな改善をもたらす、前記使用。
【請求項５３】
対象における創傷の治癒を促進するための組成物の製造における塩基処理、界面活性剤処理テロペプチドコラーゲンの使用であって、前記促進は、該組成物を該創傷と接触させることを含み、前記接触は、該組成物と接触していない創傷と比較して該創傷の様相の検出可能に大きな改善をもたらす、前記使用。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【公表番号】特表２０１０−５０５８５７（Ｐ２０１０−５０５８５７Ａ）
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３１４９１（Ｐ２００９−５３１４９１）
【出願日】平成１９年１０月９日（２００７．１０．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２１６７７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５７１６２
【国際公開日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５０８００００７６）アントフロゲネシス　コーポレーション (12)
【Ｆターム（参考）】