ヒトＣＤ２０に対するヒト抗体及びその使用方法
ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、そして補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を誘導することができ、そしてヒトリンパ腫のマウスモデルにおいてコントロールで処置された動物と比較して約２倍から約９倍の間に無症状生存時間を増加させることができる、ヒト抗体又は抗体の抗原結合フラグメント。本抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＣＤ２０媒介疾患又は状態、例えば非ホジキンリンパ腫、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性リンパ性白血病、及び炎症性疾患を処置するための治療方法において有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＤ２０に特異的なヒト抗体及び抗体フラグメント、医薬組成物、並びにその治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連分野の記述
ＣＤ２０（ヒトＢリンパ球限定分化抗原又はＢｐ３５；Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、ＢＭ５、及びＬＦ５としても知られる）は、約３５ｋＤの分子量を有し、プレ−Ｂリンパ球及び成熟Ｂリンパ球に発現される疎水性膜貫通タンパク質である（非特許文献１；非特許文献２）。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿６９０６０５）で示される。抗ＣＤ２０抗体は、例えば特許文献１、特許文献２、及び特許文献３に記載される。
【０００３】
ヒト治療薬として有用な抗体を製造する方法としては、キメラ抗体及びヒト化抗体の生成（例えば特許文献４を参照のこと）が挙げられる。また例えば、ヒト治療薬を製造するために有用な抗体を産生することができる遺伝子改変されたマウスを生成する方法を記載する特許文献５及び特許文献６も参照のこと。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】US 5,736,137
【特許文献２】WO 2004/056312
【特許文献３】US 2004/0167319
【特許文献４】US 6,949,245
【特許文献５】WO 94/02602
【特許文献６】US 6,596,541
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Valentine et al. (1989) J Biol Chem 264:11282
【非特許文献２】Einfield et al. (1988) EMBO J 7:711−717
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
第一の局面において、本発明は、ヒトＣＤ２０に特異的に結合するヒト抗体、好ましくは組み換えヒト抗体を提供する。これらの抗体は、ヒトＣＤ２０に特異的に結合すること、及びＣＤ２０を発現しているＢ細胞リンパ腫細胞の殺傷を媒介することを特徴とする。本抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）であり得、又は抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はｓｃＦｖフラグメント）のみを含んでいてもよく、そして機能性を達成するために、例えば残留エフェクタ機能を排除又は増強するために改変されていてもよい（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５−１９３３）。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、そして補体の存在下でＣＤ２０を発現している細胞の補体依存性細胞傷害活性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＣＤＣ）を誘導することができ、ここで濃度約１０ｎＭ又はそれ以下の抗体が、補体を含む５％正常ヒト血清の存在下でＤａｕｄｉ細胞及びＲＬ細胞の５０％溶解を誘導する。好ましい実施態様において、５０％溶解を誘導する抗体濃度は、約５ｎＭ若しくはそれ以下；約２ｎＭ若しくはそれ以下；又は約１ｎＭ若しくはそれ以下である。一実施態様において、本抗体又はそのフラグメントは、Ｄａｕｄｉ細胞において測定された場合に０．２ｎＭ若しくはそれ以下のＥＣ50を示し、又はＲＬ細胞により測定された場合に０．４ｎＭ若しくはそれ以下のＥＣ50を示す。種々の実施態様において、本抗体又は抗体フラグメントは、ヒトリンパ腫のマウスモデルにおいてコントロールで処置された動物と比較して無症状生存時間を約２倍から約９倍の間に増加することができる。
【０００８】
本抗体又はそのフラグメントは、ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、そして末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の存在下でＣＤ２０を発現している細胞の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を誘導することができ、ここで本抗体は、Ｄａｕｄｉ細胞で測定された場合に約１ｎＭ又はそれ以下のＥＣ50を示す。好ましい実施態様において、本抗体は約５０ｐＭ又はそれ以下；約２０ｐＭ又はそれ以下；約１０ｐＭ又はそれ以下のＥＣ50を示す。好ましい実施態様において、抗体は増強されたＡＤＣＣ活性を示し、減少したレベルのフコシル化（例えば約５％フコース）を含み得る。
【０００９】
一実施態様において、本発明の抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号３、１９、２３、２７、４３、４７、５１、６７、７１、７５、９１、９５、９９、１１５、１１９、１２３、１３９、１４３、１４７、１６３、１６７、１７１、１８７、１９１、１９５、２１１、２１５、２１９、２３５、２３９、２４３、２５９、２６３、２６７、２８３、２８７、２９１、３０７、３１１、３１５、３３１、３３５、３３９、３５５、３５９、３６３、３７９、３８３、３８７、３９５、及び４０３からなる群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列、又はその実質的に類似の配列を含む。好ましい実施態様において、本抗体又はフラグメントは、配列番号３３９、１９５及び２４３からなる群より選択されるＨＣＶＲ配列を含む。
【００１０】
より特定の実施態様において、本抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１、２１、２５、３５、４５、４９、５９、６９、７３、８３、９３、９７、１０７、１１７、１２１、１３１、１４１、１４５、１５５、１６５、１６９、１７９、１８９、１９３、２０３、２１３、２１７、２２７、２３７、２４１、２５１、２６１、２６５、２７５、２８５、２８９、２９９、３０９、３１３、３２３、３３３、３３７、３４７、３５７、３６１、３７１、３８１及び３８５からなる群より選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列、又はその実質的に類似の配列をさらに含む。好ましい実施態様において、本抗体又はフラグメントは、配列番号３４７、２０３及び２５１からなる群より選択されるＬＣＶＲを含む。
【００１１】
特定の実施態様において、本抗体又はそのフラグメントは、配列番号３／１１、１９／２１、２３／２５、２７／３５、４３／４５、４７／４９、５１／５９、６７／６９、７１／７３、７５／８３、９１／９３、９５／９７、９９／１０７、１１５／１１７、１１９／１２１、１２３／１３１、１３９／１４１、１４３／１４５、１４７／１５５、１６３／１６５、１６７／１６９、１７１／１７９、１８７／１８９、１９１／１９３、１９５／２０３、２１１／２１３、２１５／２１７、２１９／２２７、２３５／２３７、２３９／２４１、２４３／２５１、２５９／２６１、２６３／２６５、２６７／２７５、２８３／２８５、２８７／２８９、２９１／２９９、３０７／３０９、３１１／３１３、３１５／３２３、３３１／３３３、３３５／３３７、３３９／３４７、３５５／３５７、３５９／３６１、３６３／３７１、３７９／３８１及び３８３／３８５からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む。好ましい実施態様において、本抗体又はそのフラグメントは、配列番号３３９／３４７、１９５／２０３及び２４３／２５１からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む。
【００１２】
第二の局面において、本発明は、抗体又はそのフラグメントをコードする単離された核酸分子を提供する。特定の実施態様において、本核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号２、１８、２２、２６、４２、４６、５０、６６、７０、７４、９０、９４、９８、１１４、１１８、１２２、１３８、１４２、１４６、１６２、１６６、１７０、１８６、１９０、１９４、２１０、２１４、２１８、２３４、２３８、２４２、２５８、２６２、２６６、２８２、２８６、２９０、３０６、３１０、３１４、３３０、３３４、３３８、３５４、３５８、３６２、３７８、３８２、３８６、３９４及び４０２からなる群より選択されるＨＣＶＲ、又はその実質的に同一な配列をコードする。関連の局面において、本発明は、ヌクレオチド配列が配列番号１０、２０、２４、３４、４４、４８、５８、６８、７２、８２、９２、９６、１０６、１１６、１２０、１３０、１４０、１４４、１５４、１６４、１６８、１７８、１８８、１９２、２０２、２１２、２１６、２２６、２３６、２４０、２５０、２６０、２６４、２７４、２８４、２８８、２９８、３０８、３１２、３２２、３３２、３３６、３４６、３５６、３６０、３７０、３８０及び３８４からなる群より選択されるＬＣＶＲ、又はその実質的に同一な配列をコードする単離された核酸分子を提供する。好ましい実施態様において、本抗体又は抗体フラグメントは、それぞれ配列番号３３８、１９４及び２４２からなる群より選択される核酸分子によりコードされるＨＣＶＲ、並びに配列番号３４６、２０２及び２５０からなる群より選択される核酸分子によりコードされるＬＣＶＲを含む。
【００１３】
第三の局面において、本発明は、配列番号９、３３、５７、８１、１０４、１２９、１５３、１７７、２０１、２２５、２４９、２７３、２９７、３２１、３４５、３６９、３９３、４０１及び４０９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；並びに配列番号１７、４１、６５、８９、１１３、１３７、１６１、１８５、２０９、２３３、２５７、２８１、３０５、３２９、３５３及び３７７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを特徴とする。好ましい実施態様において、本抗体又はそのフラグメントは、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３配列対 配列番号３４５／３５３、２０１／２０９及び２４９／２５７から選択されるＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３配列を含む。
【００１４】
より特定の実施態様において、本抗体又はそのフラグメントは、配列番号５、２９、５３、７７、１０１、１２５、１４９、１７３、１９７、２２１、２４５、２６９、２９３、３１７、３４１、３６５、３８９、３９７及び４０５からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン配列；配列番号７、３１、５５、７９、１０３、１２７、１５１、１７５、１９９、２２３、２４７、２７１、２９５、３１９、３４３、３６７、３９１、３９９及び４０７からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン配列；配列番号１３、３７、６１、８５、１０９、１３３、１５７、１８１、２０５、２２９、２５３、２７７、３０１、３２５、３４９及び３７３からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン配列；並びに配列番号１５、３９、６３、８７、１１１、１３５、１５９、１８３、２０７、２３１、２５５、２７９、３０３、３２７、３５１及び３７５からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン配列をさらに含む。好ましい実施態様において、本抗体又はそのフラグメントは、それぞれ配列番号３４１、３４３、３４５、３４９、３５１及び３５３；１９７、１９９、２０１、２０５、２０７及び２０９；並びに２４５、２４７、２４９、２５３、２５５及び２５７からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ配列及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００１５】
第四の局面において、本発明は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸分子を特徴とし、ここでＨＣＤＲ３ドメイン及びＬＣＤＲ３ドメインをコードする核酸分子は、それぞれ配列番号９及び１６；３３及び４１；５７及び６５；８１及び８９；１０４及び１１３；１２９及び１３７；１５３及び１６１；１７７及び１８５；２０１及び２０９；２２５及び２３３；２４９及び２５７；２７３及び２８１；２９７及び３０５；３２１及び３２９；３４５及び３５３；並びに３６９及び３７７からなる群より選択される。
【００１６】
第五の局面において、本発明は、ＨＣＤＲ３ドメイン及びＬＣＤＲ３ドメインを含む抗体又は抗原結合フラグメントを特徴とし、ここでＨＣＤＲ３ドメインは式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｘ16−Ｘ17−Ｘ18−Ｘ19（配列番号４１２）［式中、Ｘ1＝Ａ、Ｖ又はＴ；Ｘ2＝Ｋ；Ｘ3＝Ｄ；Ｘ4＝Ｐ、Ｆ又はＧ；Ｘ5＝Ｓ又はＨ；Ｘ6＝Ｙ；Ｘ7＝Ｇ；Ｘ8＝Ｓ又はＨ；Ｘ9＝Ｇ又はＦ；Ｘ10＝Ｓ又はＹ；Ｘ11＝Ｙ、Ｎ又はＳ；Ｘ12＝Ｙ、Ｇ又はＨ；Ｘ13＝Ｇ、Ｌ又はＳ；Ｘ14＝Ｙ、Ｍ又はＤ；Ｘ15＝Ｙ、Ｄ又はＶ；Ｘ16＝Ｇ、Ｖ又は存在しない；Ｘ17＝Ｍ又は存在しない；Ｘ18＝Ｄ又は存在しない；Ｘ19＝Ｖ又は存在しない］のアミノ酸配列を含み；そしてＬＣＤＲ３ドメインは、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9（配列番号４１５）、［式中、Ｘ1＝Ｑ；Ｘ2＝Ｑ；Ｘ3＝Ｒ又はＳ；Ｘ4＝Ｎ、Ｙ又はＦ；Ｘ5＝Ｎ、Ｄ、又はＹ；Ｘ6＝Ｗ；Ｘ7＝Ｐ；Ｘ8＝Ｌ；Ｘ9＝Ｔ］のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
より特定の実施態様において、本抗体又は抗原結合フラグメントは、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２ドメインをさらに含み、ここでＨＣＤＲ１ドメインは式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8（配列番号４１０）［式中、Ｘ1＝Ｇ；Ｘ2＝Ｆ又はＩ；Ｘ3＝Ｔ；Ｘ4＝Ｆ；Ｘ5＝Ｈ、Ｒ又はＹ；Ｘ6＝Ｄ；Ｘ7＝Ｙ；Ｘ8＝Ｔ又はＡ］のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２ドメインは、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8（配列番号４１１）［式中、Ｘ1＝Ｉ；Ｘ2＝Ｓ；Ｘ3＝Ｗ；Ｘ4＝Ｎ；Ｘ5＝Ｓ；Ｘ6＝Ｇ又はＤ；Ｘ7＝Ｓ、Ｙ又はＴ；Ｘ8＝Ｉ又はＬ］のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１ドメインは、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6（配列番号４１３）［式中、Ｘ1＝Ｑ；Ｘ2＝Ｓ；Ｘ3＝Ｖ又はＩ；Ｘ4＝Ｓ；Ｘ5＝Ｓ又はＲ；Ｘ6＝Ｙ又はＮ］のアミノ酸配列を含み；そしてＬＣＤＲ２ドメインは、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3（配列番号４１４）［式中、Ｘ1＝Ｅ、Ｇ又はＶ；Ｘ2＝Ａ；Ｘ3＝Ｓ］のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
第六の局面において、本発明は、本発明の核酸分子を有する組み換え発現ベクター、及びこのようなベクターが導入された宿主細胞、さらには本発明の宿主細胞を培養することにより得られる本発明の抗体又はそのフラグメントの製造方法を提供する。宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよく、好ましくは宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞又は哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞である。好ましい実施態様において、抗体は種々の量のフコシル化を用いて製造され得る。例えば、ＣＨＯ細胞株は、最小約５％から最大約９５％までのフコシル化範囲を有する抗体又は抗体フラグメントを産生するように選択され得る。
【００１９】
第七の局面において、本発明は、抗ヒトＣＤ２０抗体又はそのフラグメント及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物を特徴とする。
【００２０】
第八の局面において、本発明は、細胞結合実験（以下に記載される）により測定した場合に、約１０ｎＭ未満のＥＣ50でヒトＣＤ２０に結合することができる、完全なヒト抗体又は抗体フラグメントを特徴とする。好ましい実施態様において、本発明の抗体は、細胞表面に提示された抗原に対する結合により測定した場合に、約１０-8〜約１０-12Ｍ若しくはそれ以上、例えば少なくとも１０-8Ｍ、少なくとも１０-9Ｍ、少なくとも１０-10Ｍ、少なくとも１０-11Ｍ、又は少なくとも１０-12ＭのＥＣ50を示す。
【００２１】
本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗ＣＤ２０抗体を包含する。いくつかの用途では、望ましくないグリコシル化部位を除去する改変が有用であり得、又は例えば抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）機能（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照のこと）を増加させるためにオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠損した抗体が有用であり得る。他の用途において、ガラクトシル化の改変が、補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）を改変するために行われ得る。
【００２２】
第九の局面において、本発明は、ヒトにおいてＣＤ２０媒介疾患又は状態を軽減又は抑制するための使用のための、上記の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。好ましい実施態様において、処置される疾患又は状態は、非ホジキンリンパ腫、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性リンパ性白血病、及び炎症性疾患である。関連の実施態様において、本発明は、ヒトにおいてＣＤ２０媒介疾患又は状態を軽減又は抑制する方法を包含し、この方法は、治療有効量の、上記の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを投与することを含む。さらに本発明は、ヒトにおいてＣＤ２０媒介疾患又は状態を低減又は抑制するための使用のための医薬の製造における、本発明の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントの使用を包含する。
【００２３】
他の目的及び利点は、次の詳細な説明を検討することにより明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】無症状生存曲線。結果をヒトＦｃコントロール、コントロール抗体Ｉ及びＩＩ、並びに抗体：８Ｇ６−５、９Ｄ４−７、１０Ｆ２−１３、及び７Ｅ１−１３について示す。
【００２５】
詳細な説明
本方法を記載する前に、当然のことながら、本発明は、記載される特定の方法及び実験条件に限定されず、そのようなものとして方法及び条件は変動し得る。また当然のことながら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲にのみ限定されるので、本明細書中で使用される用語は、特定の実施態様を記載する目的のみであり、限定することを意図されない。
【００２６】
別に規定がなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は等価であるあらゆる方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料がここで記載される。
【００２７】
定義
用語「ＣＤ２０」は、ヒトＣＤ２０の変異体及びアイソフォームを含み、これらは天然で細胞により発現される。本発明の抗体のＣＤ２０抗原に対する結合は、ＣＤ２０を発現している細胞（例えば腫瘍細胞）の死滅を媒介する。ＣＤ２０を発現している細胞の死滅は、ＣＤ２０を発現している細胞の補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）、ＣＤ２０を発現している細胞のアポトーシス、ＣＤ２０を発現している細胞のエフェクター細胞ファゴサイトーシス、又はＣＤ２０を発現している細胞のエフェクター細胞抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を含む多数の様式で起こり得る。
【００２８】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、ジスルフィド結合で相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を指すことを意図される。重鎖はそれぞれ重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を構成する。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、超多様性（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）領域、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域、より保存された領域が点在している領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域にさらに細分することができる。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００２９】
用語抗体の「抗原結合部分」（又は簡単に「抗体部分」又は「抗体フラグメント」）は、本明細書で使用される場合、抗原（例えば、ｈＣＤ２０）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ又はそれ以上のフラグメントを指す。全長抗体のフラグメントが抗体の抗原結合機能を果たし得ることが示されている。用語抗体の「抗原結合部分」内に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ１及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ） Ｆ（ａｂ'）2フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦ（ａｂ）’フラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アーム（ｓｉｎｇｌｅ ａｒｍ）のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ２４１：５４４−５４６）、（これはＶＨドメインからなる）；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別の遺伝子にコードされるが、これらは組み換え法を使用して、それらをＶＬ及びＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一の連続した鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）として作成されることを可能にする合成リンカーにより連結することができる。このような単鎖抗体もまた、用語抗体の「抗原結合部分」に包含されることを意図される。単鎖抗体の他の形態、例えば二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）もまた包含される（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８を参照のこと）。
【００３０】
「ＣＤＲ」又は相補性決定領域は、より保存された、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる領域内に点在する超多様性の領域である。本発明の抗ｈＣＤ２０抗体又はフラグメントの種々の実施態様において、ＦＲはヒト生殖細胞配列と同一であってもよく、又は天然若しくは人工的に改変されていてもよい。
【００３１】
用語「表面プラズモン共鳴」は本明細書で使用される場合、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を、例えばＢＩＡＣＯＲＥTMシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ）を使用して検出することによりリアルタイムの相互作用を分析することを可能にする光学現象を指す。
【００３２】
用語「エピトープ」とは、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域において特定の抗原結合部分と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は１つより多くのエピトープを有し得る。エピトープは立体構造型（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）であっても線状であってもよい。立体構造型（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープは、１つ（又はそれ以上）の線状ポリペプチド鎖の異なる部分からの空間的に並列したアミノ酸により形成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接したアミノ酸残基により形成されるエピトープである。特定の状況では、エピトープは抗原上に他の部分、例えば糖鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基を含み得る。
【００３３】
核酸又はそのフラグメントに言及する場合の用語「実質的な同一性」又は「実質的に同一」は、別の核酸（又はその相補鎖）と、適切なヌクレオチド挿入又は欠損を伴って最適に整列した場合に、以下で考察されるように、あらゆる周知の配列同一性アルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧＡＰで測定された場合に、少なくとも約９５％、及びより好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。
【００３４】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な類似性」又は「実質的に類似」は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ加重を使用して例えばプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列された場合に、少なくとも９５％配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学特性（例えば電荷又は疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化しない。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が互いに保存的置換により異なっている場合には、類似性のパーセント又は程度は、置換の保存的性質を修正するために上方調節され得る。この調節を行う手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照のこと。類似の化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；２）脂肪族−ヒドロキシ側鎖：セリン及びトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換グループは：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３ ４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有するあらゆる変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて負でない値を有するあらゆる変化である。
【００３５】
ポリペプチドについての配列類似性は、典型的に配列解析ソフトウエアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウエアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠損及び他の変更に帰属される類似性の指標を使用して類似の配列をマッチングする。例えば、ＧＣＧソフトウエアは、密接に関連するポリペプチド（例えば異なる生物種からの同族ポリペプチド）の間、又は野生型タンパク質とその突然変異タンパク質との間の配列相同性又は配列同一性を決定するためのデフォルトパラメーターと共に使用することができるＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴのようなプログラムを含む。例えば、ＧＣＧ バージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、デフォルト又は推奨のパラメーターを用いてＦＡＳＴＡを使用して比較することができる；ＧＣＧ バージョン６．１．ＦＡＳＴＡのプログラム（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間の最大オーバーラップの領域の整列及び配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）既出）。本発明の配列を異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３ ４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９ ４０２を参照のこと。
【００３６】
用語「有効量」は、特定の記載された目的の達成をもたらす、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントの濃度又は量である。「有効量」の抗ＣＤ２０抗体又はその抗体の抗原結合フラグメントは、実験的に決定され得る。さらに、「治療有効量」は、記載された治療効果を達成するために有効である、抗ＣＤ２０抗体又はその抗原結合フラグメントの濃度又は量である。この量もまた、実験的に決定され得る。
【００３７】
ヒト抗体の製造
ヒト抗体を生成する方法としては、例えば、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅTM（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅTM技術（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１；Ａｂｇｅｎｉｘ）、「小遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチ、及びファージディスプレイ（及び例えば、ＵＳ５，５４５，８０７、ＵＳ６，７８７，６３７を参照のこと）が挙げられる。ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅTM技術（ＵＳ６，５９６，５４１）は、選択抗原に対する高特異性完全ヒト抗体を生成する方法を包含する。この技術は、マウスが抗原刺激に応じてヒト可変領域及びマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内因性マウス定常領域遺伝子座と操作可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されたヒト重鎖及び軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの生成を含む。抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、そしてヒト重鎖及び軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに操作可能に連結させる。次いでこのＤＮＡを完全ヒト抗体を発現することができる細胞で発現させる。特定の実施態様において、この細胞はＣＨＯ細胞である。
【００３８】
抗体は、補体結合による細胞の死滅（ＣＤＣ）及び参加（ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ）抗体依存性細胞媒介細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）よりもむしろ、リガンド−受容体相互作用の遮断又は受容体構成要素相互作用の阻害において治療上有用であり得る。抗体の定常領域は、補体に結合して細胞依存性細胞傷害活性を媒介する抗体の能力において重要である。従って、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害活性を媒介することが望ましいか否かに基づいて選択され得る。
【００３９】
ヒト免疫グロブリンは、ヒンジ異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）に関連する２つの形態で存在することができる。一方の形態では、免疫グロブリン分子は、ダイマーが鎖間重鎖ジスルフィド結合により一緒に保持されている約１５０−１６０ｋＤａの安定な四鎖構築物を含む。第二の形態では、ダイマーは鎖間ジスルフィド結合を介して連結しておらず、約７５−８０ｋＤａの分子が、共有結合で結合した軽鎖及び重鎖から構成されて形成される（半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ））。これらの形態は、アフィニティ精製後でさえ、分離することが非常に困難である。種々のインタクトなＩｇＧアイソタイプにおける第二の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造的な差異に起因するがこれに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一のアミノ酸置換は、第二の形態（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）の出現を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで有意に減少させることができる。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２又はＣＨ３領域において１つ又はそれ以上の変異を有する抗体を包含し、これは、例えば所望の抗体形態の収量を改善するために、製造において望ましいかもしれない。
【００４０】
本発明の抗体は、好ましくはＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅTM技術を使用して製造される。内因性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域が対応するヒト可変領域で置き換えられているトランスジェニックマウスに目的の抗原をチャレンジし、そして抗体を発現するマウスからリンパ細胞（例えばＢ細胞）を回収する。このリンパ細胞を骨髄腫細胞株に融合させて不死ハイブリドーマ細胞株を調製し得、そしてこのようなハイブリドーマ細胞株を、目的の抗原に対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するためにスクリーニングして選択する。重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、単離されて重鎖及び軽鎖の所望のアイソタイプ定常領域に連結され得る。このような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞のような細胞で産生され得る。あるいは、抗原特異的キメラ抗体又は軽鎖及び重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡは、抗原特異的リンパ球から直接単離され得る。
【００４１】
一般に、本発明の抗体は、非常に高い親和性を有しており、細胞表面に提示された抗原に対する結合により測定した場合に、典型的には約１０-8から約１０-12Ｍ若しくはそれ以上、例えば、少なくとも１０-8Ｍ、少なくとも１０-9Ｍ、少なくとも１０-10Ｍ、少なくとも１０-11Ｍ、又は少なくとも１０-12ＭのＫD又はＥＣ50を有する。
【００４２】
最初に、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体を単離する。以下に記載されるように、これら抗体を特徴付けし、そして親和性、選択性、エピトープなどの所望の特徴について選択する。マウス定常領域を、所望のヒト定常領域と置き換えて本発明の完全ヒト抗体を生成する、例えば野生型又は改変されたＩｇＧ１又はＩｇＧ４（例えば、配列番号４１６、４１７、４１８）。選択された定常領域は特定の用途に従って変化し得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性の特徴は、可変領域に存在する。
【００４３】
エピトープマッピング及び関連技術
特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 １９８８ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編、に記載されるような慣用の交差遮断（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイを行うことができる。他の方法としては、アラニン走査変異体（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｎｔｓ）、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ （２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３−６３）、又は以下の実施例に記載されるようなペプチド切断分析が挙げられる。さらに、エピトープ切り出し、エピトープ抽出及び抗原の化学修飾のような方法を使用することができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ：９：４８７−４９６）。
【００４４】
抗体の結合特性を確認するために、選択されたアミノ酸置換からなる変異体ＣＤ２０タンパク質を構築した。変異体ＣＤ２０タンパク質は、ヒトタンパク質に存在する特定のアミノ酸の、マウスタンパク質に存在する対応するアミノ酸での置換を含んでいた。このアプローチは、変異体ＣＤ２０タンパク質がそれらの三次元構造、そしておそらくあらゆる立体構造型エピトープを維持することを確実にするのに役立つ。ＦＡＣＳにより測定した場合に、試験抗体のこれらの変異体ＣＤ２０タンパク質に対する結合を、コントロール（既知）ＣＤ２０抗体と比較した。本発明の抗体のいずれも、（それぞれ及び全ての変異体に関して）コントロール抗体のいずれかと同一である結合プロフィールを示さなかった。
【００４５】
免疫複合体
本発明は、治療部分、例えば細胞毒素、化学療法薬、免疫抑制剤又は放射性同位体に結合したヒト抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。細胞毒素剤は、細胞に有害なあらゆる薬剤を含む。免疫複合体を形成するために適切な細胞毒素剤及び化学療法薬の例は、当該分野で公知であり、例えばＷＯ０５／１０３０８１を参照のこと。
【００４６】
二重特異性
本発明の抗体は、単一特異性でも、二重特異性でも、多重特異性でもよい。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープについて特異的であっても、１つより多くの標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含んでいてもよい。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９を参照のこと。ヒト抗ＣＤ２０抗体は、別の機能的分子、例えば別のペプチド若しくはタンパク質に連結又は別のペプチド若しくはタンパク質と同時発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）してもよい。例えば、抗体又はそのフラグメントは、１つ又はそれ以上の他の分子実体、例えば別の抗体又は抗体フラグメントに、（例えば化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合又はその他により）機能的に連結されて、第二の結合特異性を有する二重特異性又は多重特異性抗体を生じ得る。本発明の多重特異性抗体は、ＣＤ２０を発現している細胞、並びにポリペプチド、例えばヒトＦｃ受容体、及び／又はＴ細胞受容体複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を発現しているヒトエフェクター細胞の両方に特異的に結合し得る。一実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、ＣＤ２０結合部分及びサイトカインを含む。
【００４７】
治療用途
本発明のヒト抗体、抗体の抗原結合フラグメント、免疫複合体、及び二重特異性分子は、ＣＤ２０を発現している細胞の成長を阻害すること及び／又はＣＤ２０を発現している細胞を死滅させることにより抑制又は改善されるヒト疾患を処置するための治療方法において有用である。本発明の治療方法が達成される作用機序には、例えば、ＣＤＣ、アポトーシス、ＡＤＣＣ、ファゴサイトーシス、又は２つ若しくはそれ以上のこれらの機序の組み合わせによる、エフェクター細胞の存在下でのＣＤ２０を発現している細胞の死滅が含まれる。本発明の分子の治療効果を達成するための機序は、ＣＤ２０を発現している細胞の死滅又は阻害を直接的に生じても、間接的に、ＣＤ２０を発現していない、例えば構造的に関連した細胞表面抗原（すなわち、関連するが機能的に異なる細胞表面抗原に対する交差反応性はない）を発現する細胞を阻害することにより生じてもよい。本発明のヒト抗体を使用して阻害又は死滅することができる、ＣＤ２０を発現している細胞としては、例えば腫瘍形成性Ｂ細胞が挙げられる。
【００４８】
抗ＣＤ２０抗体及びそのフラグメントを用いて処置又は改善することができる疾患及び状態の例としては、限定されないが、腫瘍形成性疾患、例えばＢ細胞リンパ腫（ＮＨＬ、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性（ｐｒｏｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ）白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、プラスマ細胞腫、プラスマ細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及び未分化大細胞リンパ腫）；免疫疾患、例えば自己免疫疾患（乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎、全身性強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、糸球体腎炎、湿疹、ぜんそく、アテローム性動脈硬化症、白血球接着不全、多発性硬化症、レイノー症候群、シェーグレン症候群、若年発症糖尿病、ライター病、ベーチェット病、免疫複合体性腎炎、ＩｇＡネフロパシー、ＩｇＭ多発ニューロパシー）；免疫性の血小板減少、急性特発性血小板減少性紫斑病及び慢性特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、重症筋無力症、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性伝染性単核球症、ＨＩＶ、及びヘルペスウイルス関連疾患；重症急性呼吸促迫症候群及び脈絡網膜炎（ｃｈｏｒｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）；エプスタイン−バーウイルスのようなウイルスへのＢ細胞の感染により引き起こされる疾患及び障害が挙げられる。
【００４９】
特定の実施態様において、抗体を投与される被験体は、Ｆｃ受容体の発現又は活性を調節する（増強又は阻害する）化学療法剤、放射線又は薬剤、例えばサイトカインでさらに処置される。処置の間の投与に典型的なサイトカインとしては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−(）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。典型的な治療剤としては、とりわけ、抗腫瘍剤、例えばドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、及びシクロホスファミドが挙げられる。
【００５０】
治療用投与及び製剤
本発明は、本発明のヒト抗ＣＤ２０抗体又はその抗原結合フラグメントを含む治療用組成物を提供する。本発明に従う治療用組成物は、適切な担体、賦形剤、及び製剤中に組み込まれて改善された移動、送達、耐性などをもたらす他の薬剤とともに投与される。一般に、担体、賦形剤、又は他の薬剤としては、例えば、油脂（例えば、菜種油、綿実油、落花生油、ベニバナ油、ゴマ油、大豆油）、脂肪酸並びにその塩及びエステル（例えば、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸）、アルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコール）、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧ ３３５０）、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、ゼラチン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、塩（例えば、塩化ナトリウム）、コハク酸及びその塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、アミノ酸及びその塩（例えば、アラニン、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リジン）、酢酸又はその塩若しくはエステル（例えば、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム）、クエン酸及びその塩（例えば、クエン酸ナトリウム）、安息香酸及びその塩、リン酸及びその塩（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム）、乳酸及びその塩、ポリ乳酸、グルタミン酸及びその塩（例えば、グルタミン酸ナトリウム）、カルシウム及びその塩（例えば、塩化カルシウム、酢酸カルシウム）、フェノール、糖質（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース）、エリトリトール、アラビトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、イオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、クロロブタノール、ＤＭＳＯ、水酸化ナトリウム、グリセリン、ｍ−クレゾール、イミダゾール、プロタミン、亜鉛及びその塩（例えば、硫酸亜鉛）、チメロサール、メチルパラベン、プロピルパラベン、カルボキシメチルセルロース、クロロブタノール、及びヘパリンを挙げることができる。他の非治療用薬剤は、ＵＳ７，００１，８９２にて特に表Ａに記載される。多数の適切な製剤は、全ての薬化学者に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ）に見いだされ得る。これらの製剤としては、例えば、散剤、ペースト、軟膏、ゼリー、ロウ、油状物、脂質、脂質を含有する小胞（カチオン性又はアニオン性）（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油及び油中水乳剤、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル、及びカーボワックスを含有する半固形混合物を挙げることができる。前述の混合物のいずれも本発明による処置及び治療において適切であり得るが、ただし製剤中の活性成分は、製剤化により不活性化されず、そして製剤は生理学的に適合性であり、そして投与経路に許容しうるものである。薬化学者に周知の賦形剤及び担体に関連するさらなる情報については、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１及びその中の引用も参照のこと。
【００５１】
治療用組成物の用量は、投与される被験体の年齢及び大きさ、標的の疾患、状態、投与経路などに依存して変動し得る。本発明の抗体が、成人患者においてＣＤ２０活性に関連する種々の状態及び疾患（非ホジキンリンパ腫、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性リンパ性白血病、炎症性疾患などを含む）を処置するために使用される場合、本発明の抗体を、通常約０．０１〜約２０ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／体重１ｋｇ、そしてより好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／体重１ｋｇの単回用量で静脈内に投与することが有利である。状態または疾患の重篤度に依存して、処置の頻度及び持続時間を調節することができる。他の非経口投与及び経口投与において、本抗体を上記に示される用量に相当する用量で投与することができる。
【００５２】
種々の送達系が知られており、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる、例えば、リポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することができる組み換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）。導入方法としては、限定されないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口の経路が挙げられる。本組成物は、あらゆる都合の良い経路により、例えば注入又はボーラス注射により、上皮又は粘膜皮膚内層を通る吸収により（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤とともに投与され得る。投与は好ましくは全身でも局所的でもよい。
【００５３】
本医薬組成物はまた、小胞で、特にリポソーム（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３を参照のこと）で送達され得る。特定の状況において、本医薬組成物は、制御放出システムで送達することができる。一実施態様において、ポンプを使用してもよい（Ｌａｎｇｅｒ、既出；Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１）。別の実施態様において、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ及びＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ （１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｓｍｏｌｅｎ及びＢａｌｌ （編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８４）を参照のこと。さらに別の実施態様において、制御放出システムは、組成物の標的の近位に配置することができ、従って全身用量の一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、既出、ｖｏｌ．２、ｐｐ．１１５−１３８、１９８４を参照のこと）。
【００５４】
注射可能製剤は、静脈内、皮下、皮内及び筋内の注射、点滴などのための投薬形態を含み得る。これらの注射可能製剤は、公知の方法により製造され得る。例えば、注射可能製剤は、例えば上記の抗体又はその塩を、注射用に従来使用される滅菌水性媒体又は油性媒体中に溶解、懸濁又は乳化させることにより製造され得る。注射用の水性媒体としては、例えば生理食塩水、グルコース及び他の補助剤などを含有する等張液があり、これらは適切な可溶化剤、例えばアルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ひまし油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加体）］などと組み合わせて使用され得る。油性媒体としては、例えばごま油、大豆油などが使用され得、これらは、可溶化剤、例えば安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと組み合わせて使用され得る。このようにして製造された注射は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
【００５５】
有利には、上記の経口又は非経口用途の医薬組成物は、活性成分の用量に適合させるために適した単回用量で投薬形態に調製される。このような単回用量の投薬形態としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される上述の抗体の量は、一般的に単回用量の投薬形態あたり約５〜５００ｍｇであり；特に注射の形態では、上述の抗体が約５〜１００ｍｇ、そして他の投薬形態については約１０〜２５０ｍｇ含有されることが好ましい。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を製造し、使用する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために示されるものであり、本発明者らが彼らの発明と考えるものの範囲を限定することは意図されない。使用される数値（例えば量、温度など）に関して正確さを確実にしようとする努力がなされるが、いくらかの実験誤差及び偏差が存在するはずである。別に指示がなければ、部は質量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、そして圧力は大気圧又はその付近である。
【００５７】
実施例１． ヒトＣＤ２０に対するヒト抗体の生成
齧歯動物を、当該分野で公知のいずれかの方法により免疫状態にすることができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ編（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｍａｌｉｋ ａｎｄ Ｌｉｌｌｅｈｏｊ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９４、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照のこと）。一実施態様において、ＣＤ２０を発現している細胞を、ヒトＩｇ重鎖可変領域及びκ軽鎖可変領域の両方をコードするＤＮＡ座を有するマウスに（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅTM、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．；ＵＳ６，５９６，５４１）、免疫応答を刺激するアジュバントとともに直接投与した。このようなアジュバントとしては、完全及び不完全フロイントアジュバント、ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント系（Ｓｉｇｍａ）、又はＲＩＢＩ（ムラミールジペプチド）を挙げることができる（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、２０００、Ｔｏｔａｗａ、ＮＪによるＯ’Ｈａｇａｎ、Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔを参照のこと）。細胞表面でのヒトＣＤ２０の高い発現レベルを達成するために、マウス細胞株、ＭＧ８７及び／又はＮＳ／０細胞を、ヒトＣＤ２０をコードするプラスミドでトランスフェクトし、そして高レベルのＣＤ２０を発現している細胞を、ＦＡＣＳ技術を使用して濃縮した。一実施態様では、ＣＤ２０を、ＣＤ２０遺伝子を含有するＤＮＡプラスミドとして間接的に投与し、そしてＣＤ２０を宿主のタンパク質発現系を使用して発現させて、インビボで抗原タンパク質を産生する。両方のアプローチにおいて、最適な抗体免疫応答を得るために３〜４週間ごとにマウスにブースター注射を行った。１〜３倍段階希釈の血清サンプルを免疫アッセイにかける、以下に記載される細胞ベースの免疫アッセイにより、免疫応答をモニタリングした。血清力価を、バックグラウンドの２倍のアッセイシグナルを生じた血清サンプルの希釈として規定した。動物がそれらの最大免疫応答に達した場合に、抗体を発現しているＢ細胞を採取し、そしてマウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成した。
【００５８】
実施例２． 抗原特異的ハイブリドーマのスクリーニング
一次スクリーニングにおいて、ＮＳ／０細胞（ＡＴＣＣ）を、ヒトＣＤ２０遺伝子でトランスフェクとし、高発現細胞（ＮＳ／０−ｈＣＤ２０細胞）をプールし、そして 一般に融合の約１１〜１４日後にハイブリドーマ−馴化培地中でのスクリーニングにおける使用のために培養液中に維持した。１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０中のＮＳ／０−ｈＣＤ２０細胞を、９６ウェルポリ−Ｄ−リジンプレートにおいて１ウェルあたり５０，０００個の細胞の密度でプレーティングした。ハイブリドーマ−馴化培地を５倍希釈し、そして３０分間細胞に結合させた。次いでこれらの細胞を、等体積の８％ホルムアルデヒドを加えて２０分間プレートに固定し、続いて４回連続してＰＢＳＴ洗浄した。プレートを５％ＢＳＡと共に２時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。洗浄した後、プレートに結合した抗体をＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃγ特異的ポリクローナル抗体とともに３０分間インキュベートし、そしてプレートを、最終洗浄の後、３．３’，５．５’−テトラメチル−ベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を使用して現像した。ＨＲＰ反応を、等体積の１Ｍリン酸を用いて停止した。抗体結合シグナルを、４５０ｎｍにて光学濃度により測定した。ＮＳ／０親細胞（検出可能なＣＤ２０発現がない）をバックグラウンドコントロールとして使用して、非特異的細胞表面結合を有するハイブリドーマ上清を除いた。ＮＳ／０親細胞及びＣＤ２０を発現している細胞の両方に陽性のウェルを除いた。
【００５９】
実施例３． ＣＤ２０に対するヒト抗体の配列決定
配列決定の前に、抗原特異的ハイブリドーマ細胞を、ＭＯＦＬＯTMフローサイトメーターを使用して単一細胞サブクローニングした。可変軽鎖及び重鎖領域の配列決定を、標準的方法（例えば、ＵＳ ２００４／０１６７３１９Ａ１を参照のこと）により行った。完全ＲＮＡを各ハイブリドーマ細胞株からＲＮＥＡＳＹTMキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した。ｃＤＮＡをＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥTM ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用して調製した。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのＤＮＡ配列を配列決定し、そして選択された抗体について得られたＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのアミノ酸配列を推定した（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列番号）：３Ｂ９−１０Ｎ（３／１１）；３Ｂ９−１０ＧＳＰ（１９／２１）；３Ｂ９−１０ＦＧＬ（２３／２５）；９Ｃ１１−１４Ｎ（２７／３５）；９Ｃ１１−１４ＧＳＰ（４３／４５）；９Ｃ１１−１４ＦＧＬ（４７／４９）；２Ｂ７−７Ｎ（５１／５９）；２Ｂ７−７ＧＳＰ（６７／６９）；２Ｂ７−７ＦＧＬ（７１／７３）；２Ｃ１１−４Ｎ（７５／８３）；２Ｃ１１−４ＧＳＰ（９１／９３）；２Ｃ１１−４ＦＧＬ（９５／９７）；３Ｈ７−６Ｎ（９９／１０７）；３Ｈ７−６ＧＳＰ（１１５／１１７）；３Ｈ７−６ＦＧＬ（１１９／１２１）；５Ｈ２−１７Ｎ（１２３／１３１）；５Ｈ２−１７ＧＳＰ（１３９／１４１）；５Ｈ２−１７ＦＧＬ（１４３／１４５）；６Ｂ９−４Ｎ（１４７／１５５）；６Ｂ９−４ＧＳＰ（１６３／１６５）；６Ｂ９−４ＦＧＬ（１６７／１６９）；６Ｆ６−１Ｎ（１７１／１７９）；６Ｆ６−１ＧＳＰ（１８７／１８９）；６Ｆ６−１ＦＧＬ（１９１／１９３）；８Ｇ６−５Ｎ（「８Ｇ６−５」）（１９５／２０３）；８Ｇ６−５ＧＳＰ（２１１／２１３）；８Ｇ６−５ＦＧＬ（２１５／２１７）；９Ｃ３−８Ｎ（２１９／２２７）；９Ｃ３−８ＧＳＰ（２３５／２３７）；９Ｃ３−８ＦＧＬ（２３９／２４１）；９Ｄ４−７Ｎ（「９Ｄ４−７」）（２４３／２５１）；９Ｄ４−７ＧＳＰ（２５９／２６１）；９Ｄ４−７ＦＧＬ（２６３／２６５）；９Ｅ４−２０Ｎ（２６７／２７５）；９Ｅ４−２０ＧＳＰ（２８３／２８５）；９Ｅ４−２０ＦＧＬ（２８７／２８９）；９Ｈ４−１２Ｎ（２９１／２９９）；９Ｈ４−１２ＧＳＰ（３０７／３０９）；９Ｈ４−１２ＦＧＬ（３１１／３１３）；１０Ｅ３−１７Ｎ（３１５／３２３）；１０Ｅ３−１７ＧＳＰ（３３１／３３３）；１０Ｅ３−１７ＦＧＬ（３３５／３３７）；１０Ｆ２−１３Ｎ（“１０Ｆ２−１３”）（３３９／３４７）；１０Ｆ２−１３ＧＳＰ（３５５／３５７）；１０Ｆ２−１３ＦＧＬ（３５９／３６１）；７Ｅ１−１３Ｎ（３６３／３７１）；７Ｅ１−１３ＧＳＰ（３７９／３８１）；７Ｅ１−１３ＦＧＬ（３８３／３８５）。
【００６０】
実施例４． 抗ＣＤ２０抗体の抗原結合特異性
キメラ抗体を完全ヒトＩｇＧに変換した後、特異的抗原結合特性を、ＨＲＰ結合ヤギ抗ｈＩｇＧ Ｆｃ(特異的ポリクローナルを検出抗体として使用し、そしてＤａｕｄｉ細胞株（内因性ＣＤ２０を発現する）を抗原源として使用したこと以外は、上記のプロトコールと同様のＥＬＩＳＡプロトコールを用いて決定した。試験した抗体の全ては、約０．４ｎＭ〜約２０ｎＭの範囲のＥＣ50値でＤａｕｄｉ細胞に特異的に結合した。
【００６１】
完全ヒト抗ＣＤ２０抗体の抗原結合特異性を、以下に記載されるようにフローサイトメトリーを使用してヒトＣＤ２０でトランスフェクトしたＭＧ８７細胞を用いて検証した。手短には、親ＭＧ８７細胞及びヒトＣＤ２０でトランスフェクトしたＭＧ８７細胞を３０分間４℃にて１５のヒト抗体のそれぞれ及び２つのコントロール抗体とともにインキュベートし、続いてＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ 抗体とともにインキュベートした。結合をフローサイトメトリーにより評価した。蛍光強度を親細胞株及びコントロールアイソタイプ適合サンプルに対する結合と比較した。結果を表１に要約する。全ての抗体がヒトＣＤ２０トランスフェクトＭＧ８７細胞に結合したが、親ＭＧ８７細胞に対する結合は見られず、抗体がＣＤ２０特異的であることを示した。コントロールＩ：キメラ（マウス／ヒト）抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、リツキシマブ、（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）；コントロールＩＩ：ヒト抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、２Ｆ２、ＷＯ ２００５／１０３０８１に記載される）。
【００６２】
【表１】
【００６３】
実施例５． 変異体ヒトＣＤ２０に対するヒト抗ＣＤ２０抗体の結合
変異体ヒトＣＤ２０を、ヒトＣＤ２０アミノ酸配列を対応するマウスアミノ酸でＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを使用して置換することにより生成した（表２）。次いで変異体ヒトＣＤ２０、ＣＭＶプロモーター、及びハイグロマイシン耐性遺伝子ＩＲＥＳ−ＧＦＰマーカーを含むプラスミドベクターを、ＭＧ８７細胞にトランスフェクトした。各変異体ヒトＣＤ２０について、高ＧＦＰ発現を示したハイグロマイシン耐性細胞のプールを収集し、そして安定な細胞株を抗体結合アッセイのために生成した。
【００６４】
【表２】
【００６５】
手短には、変異体ヒトＣＤ２０を発現しているそれぞれの安定にトランスフェクトされた細胞株から約１×１０6個の細胞を収集し、そして各抗ヒト抗体とともに１０μｇ／ｍｌで氷上にて１時間インキュベートし、続いてＡＰＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ）とともに１０μｇ／ｍｌで氷上にて４５分間インキュベートした。各抗体について、各変異体ヒトＣＤ２０に対する結合を、フローサイトメトリーにより評価した。平均蛍光強度レベルを、各細胞株内で変動する変異体ＣＤ２０発現レベルに起因する効果を最小にするために、平均レベルのＧＦＰ発現を示した細胞の小さな（約２０％）集団にゲーティングしながら評価した。各変異体ＣＤ２０について、最も高い平均蛍光強度を示した抗体を１００％結合として指定した。表３は、各変異体ヒトＣＤ２０に対する各抗ＣＤ２０抗体の結合パーセントを示す。
【００６６】
【表３】
【００６７】
実施例６． 補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）における有効性
抗ヒトＣＤ２０ヒト抗体を、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を促進するそれらの能力について、ヒトリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ及びＲＬを標的細胞株として使用して試験した。抗体を媒体中に連続希釈し（最終濃度範囲５０ｎＭ〜０．８５ｐＭ及び緩衝液コントロール）、そして９６ウェルプレート型に播種された標的細胞に加えた。補体成分（Ｑｕｉｄｅｌ）を含むヒト血清を各ウェルに加えて、最終血清濃度を５％とした。細胞を試験抗体、及び補体成分を含むヒト血清とともに３７(Ｃで２時間インキュベートし、次いでＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥTMにより検出した場合の細胞生存について測定した。蛍光を、５６０ｎｍの励起波長及び５９０ｎｍの発光波長を使用して測定した（表４）。
【００６８】
【表４】
【００６９】
実施例７． ヒト抗ＣＤ２０抗体の機能的解離速度（Ｏｆｆ−Ｒａｔｅ）
抗ＣＤ２０ｍＡｂの解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅｓ）をＣＤＣアッセイで分析した。３つの別々の組で実験を行った。各組内において、細胞溶解のパーセンテージを、コントロールＩ及びＩＩと比較して０時間、１時間、及び６時間目に５つの抗体について測定した。各抗体２μｇを１０6Ｄａｕｄｉ細胞と４５分間（ＲＴ）インキュベートすることにより抗体を細胞に結合させた。０時間の時点で細胞を洗浄し、そしてすぐに２０％正常ヒト血清補体を含有する培地１００μｌに再懸濁し、次いで４５分間３７℃、５％ＣＯ2にてインキュベートした。１時間及び６時間の時点について、抗体結合後の１０6個の細胞を洗浄し、１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブ中で新鮮な培地１２ｍｌに再懸濁し、そしてメカニカルインバーターでそれぞれ１時間及び６時間インキュベートした。選択された時点が完了すると細胞を洗浄し、そして２０％正常ヒト血清補体を含有する培地中でインキュベートし、そして４５分間インキュベートした。血清インキュベーションの後、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）を各サンプルに加え、そして１５分間室温でインキュベートして細胞生存を評価した。細胞傷害性パーセントを各時点において、前方散乱対７ＡＡＤ陽性及び陰性の細胞を表す７ＡＡＤ２次元散乱プロットとしての領域を設定し、両方の領域からごみ（ｄｅｂｒｉｓ）を除去することにより決定した。細胞傷害性パーセントを、各時点について１００−７ＡＡＤネガティブ細胞のパーセンテージとしてプロットした（表５〜７）。
【００７０】
【表５】
【００７１】
【表６】
【００７２】
【表７】
【００７３】
実施例８． ヒト抗ＣＤ２０抗体の生化学的解離速度
選択された試験抗ＣＤ２０抗体についての生化学的解離速度を決定し、そしてコントロール抗体Ｉ及びＩＩと比較した。２つの選択されたヒト抗体、コントロールＩ又はＩＩ（各２μｇ／ｍｌ）を、ＣＤ２０を発現しているＲａｊｉ細胞とともに、１０6／ｍｌにて２時間室温でインキュベートした。次いで細胞を洗浄し、過剰の抗体を除去し、１％血清含有培地に再懸濁し、そして３７℃でインキュベートした。０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、及び１８０分の時点で、細胞の１ｍｌのアリコートを取り出し、洗浄し、ＰＥ標識抗ｈＦｃ抗体で染色し、そしてＦＡＣＳ分析を行った。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を細胞表面に結合した抗体の量の指標として使用した。生化学的解離速度を、時間０の時点の結合パーセントを１００％として計算した。実験をさらに５回繰り返し、そして１２の試験抗体についての生化学的解離速度を決定し、そしてコントロールＩ及びＩＩと比較した（表８〜１３）。
【００７４】
【表８】
【００７５】
【表９】
【００７６】
【表１０】
【００７７】
【表１１】
【００７８】
【表１２】
【００７９】
【表１３】
【００８０】
実施例９． 抗体依存性細胞媒介細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）アッセイ
選択されたヒト抗ＣＤ２０抗体により誘導されたＡＤＣＣを、Ｄａｕｄｉ細胞（内因的にＣＤ２０を発現するヒトリンパ腫細胞株由来の細胞）を使用して評価した。手短には、Ｄａｕｄｉ細胞（５０μｌ中１０，０００細胞／ウェル）を最初に等体積の連続希釈したヒト抗ＣＤ２０抗体と混合し、最終抗体濃度を０．１６９ｐＭ〜１０ｎＭの範囲とし、そして１０分間室温にて９６ウェルプレートでインキュベートした（コントロール＝抗体（ａｂ）を含まないウェル）。別に、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、エフェクター細胞）を、従来のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅグラジエント遠心分離濃縮手順にしたがって調製した。濃縮したＰＢＭＣを集めて洗浄し、そして１０％熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン及び５０ｎＭベータ−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ １６４０中にプレーティングした。次いで細胞を５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−２で３日間刺激し、培地で１回洗浄し、次いでＡＤＣＣアッセイでそのまま使用した。約３００，０００のＰＢＭＣを抗体及び標的細胞の各混合物に加えてエフェクター対標的細胞の最終比率を約３０：１とした。次いで９６ウェルプレートを４時間インキュベートし、そして２５０ｘｇで遠心分離した。上清を採取し、そして乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性についてＣＹＴＯＴＯＸ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した（表１４）。
【００８１】
【表１４】
【００８２】
実施例１０． ヒトリンパ腫異種移植マウスモデルを用いた抗ＣＤ２０抗体の治療活性
選択された抗ＣＤ２０抗体についてのインビボ有効性研究を、ヒト非ホジキンＢ細胞リンパ腫異種移植マウスモデルを使用して行った。雌性重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを６週齢で購入した。１週間馴化させた後、２５００万個の採取直後のＲａｊｉ細胞（ヒト非ホジキンＢ細胞リンパ腫細胞株由来の細胞）を各マウスに静脈内注射した。次いでＲａｊｉ細胞を移植された各マウスをヒトＦＣ（ｈＦＣ）、コントロールＩ、コントロールＩＩ、８Ｇ６−５、９Ｄ４−７、１０Ｆ２−１３、又は７Ｅ１−１３で、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇで、静脈注射で側尾（ｌａｔｅｒａｌ ｔａｉｌ）により移植後３、６、及び９日目に処置した。マウスを１８０日までの期間モニタリングした。後肢麻痺、悪液質、及び偶発的な（ｏｃｃａｓｉｏｎａｌ）大きい局所的な腫瘍塊を含む疾患の兆候を示すマウスをＣＯ2窒息により安楽死させた。無症状生存曲線をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して作図した（図１）。結果を無症状生存時間の関数として生存パーセントとして表す。これらの結果は、ａｂ １０Ｆ２−１３が動物モデルにおいて生存時間を約２０日（ｈＦｃコントロール処置動物）から約１８０日（生存率において９倍より多い増加）（処置された動物の５０％は約２０日（ｈＦｃコントロール）、約４０日（コントロールＩ）、約８５日（コントロールＩＩ）まで、及び１８０日より多く（１０Ｆ２−１３）有意に増加させた。これらの増加した生存時間は、少なくとも２倍より大きい（コントロールＩＩと比較して）か、約４．５倍大きい（コントロールＩと比較して）か、又はｈＦｃ処置動物と比較して少なくとも約９倍又はそれ以上である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＤ２０に特異的なヒト抗体及び抗体フラグメント、医薬組成物、並びにその治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連分野の記述
ＣＤ２０（ヒトＢリンパ球限定分化抗原又はＢｐ３５；Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、ＢＭ５、及びＬＦ５としても知られる）は、約３５ｋＤの分子量を有し、プレ−Ｂリンパ球及び成熟Ｂリンパ球に発現される疎水性膜貫通タンパク質である（非特許文献１；非特許文献２）。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿６９０６０５）で示される。抗ＣＤ２０抗体は、例えば特許文献１、特許文献２、及び特許文献３に記載される。
【０００３】
ヒト治療薬として有用な抗体を製造する方法としては、キメラ抗体及びヒト化抗体の生成（例えば特許文献４を参照のこと）が挙げられる。また例えば、ヒト治療薬を製造するために有用な抗体を産生することができる遺伝子改変されたマウスを生成する方法を記載する特許文献５及び特許文献６も参照のこと。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】US 5,736,137
【特許文献２】WO 2004/056312
【特許文献３】US 2004/0167319
【特許文献４】US 6,949,245
【特許文献５】WO 94/02602
【特許文献６】US 6,596,541
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Valentine et al. (1989) J Biol Chem 264:11282
【非特許文献２】Einfield et al. (1988) EMBO J 7:711−717
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
第一の局面において、本発明は、ヒトＣＤ２０に特異的に結合するヒト抗体、好ましくは組み換えヒト抗体を提供する。これらの抗体は、ヒトＣＤ２０に特異的に結合すること、及びＣＤ２０を発現しているＢ細胞リンパ腫細胞の殺傷を媒介することを特徴とする。本抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）であり得、又は抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はｓｃＦｖフラグメント）のみを含んでいてもよく、そして機能性を達成するために、例えば残留エフェクタ機能を排除又は増強するために改変されていてもよい（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５−１９３３）。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、そして補体の存在下でＣＤ２０を発現している細胞の補体依存性細胞傷害活性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＣＤＣ）を誘導することができ、ここで濃度約１０ｎＭ又はそれ以下の抗体が、補体を含む５％正常ヒト血清の存在下でＤａｕｄｉ細胞及びＲＬ細胞の５０％溶解を誘導する。好ましい実施態様において、５０％溶解を誘導する抗体濃度は、約５ｎＭ若しくはそれ以下；約２ｎＭ若しくはそれ以下；又は約１ｎＭ若しくはそれ以下である。一実施態様において、本抗体又はそのフラグメントは、Ｄａｕｄｉ細胞において測定された場合に０．２ｎＭ若しくはそれ以下のＥＣ50を示し、又はＲＬ細胞により測定された場合に０．４ｎＭ若しくはそれ以下のＥＣ50を示す。種々の実施態様において、本抗体又は抗体フラグメントは、ヒトリンパ腫のマウスモデルにおいてコントロールで処置された動物と比較して無症状生存時間を約２倍から約９倍の間に増加することができる。
【０００８】
本抗体又はそのフラグメントは、ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、そして末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の存在下でＣＤ２０を発現している細胞の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を誘導することができ、ここで本抗体は、Ｄａｕｄｉ細胞で測定された場合に約１ｎＭ又はそれ以下のＥＣ50を示す。好ましい実施態様において、本抗体は約５０ｐＭ又はそれ以下；約２０ｐＭ又はそれ以下；約１０ｐＭ又はそれ以下のＥＣ50を示す。好ましい実施態様において、抗体は増強されたＡＤＣＣ活性を示し、減少したレベルのフコシル化（例えば約５％フコース）を含み得る。
【０００９】
一実施態様において、本発明の抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号３、１９、２３、２７、４３、４７、５１、６７、７１、７５、９１、９５、９９、１１５、１１９、１２３、１３９、１４３、１４７、１６３、１６７、１７１、１８７、１９１、１９５、２１１、２１５、２１９、２３５、２３９、２４３、２５９、２６３、２６７、２８３、２８７、２９１、３０７、３１１、３１５、３３１、３３５、３３９、３５５、３５９、３６３、３７９、３８３、３８７、３９５、及び４０３からなる群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列、又はその実質的に類似の配列を含む。好ましい実施態様において、本抗体又はフラグメントは、配列番号３３９、１９５及び２４３からなる群より選択されるＨＣＶＲ配列を含む。
【００１０】
より特定の実施態様において、本抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１、２１、２５、３５、４５、４９、５９、６９、７３、８３、９３、９７、１０７、１１７、１２１、１３１、１４１、１４５、１５５、１６５、１６９、１７９、１８９、１９３、２０３、２１３、２１７、２２７、２３７、２４１、２５１、２６１、２６５、２７５、２８５、２８９、２９９、３０９、３１３、３２３、３３３、３３７、３４７、３５７、３６１、３７１、３８１及び３８５からなる群より選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列、又はその実質的に類似の配列をさらに含む。好ましい実施態様において、本抗体又はフラグメントは、配列番号３４７、２０３及び２５１からなる群より選択されるＬＣＶＲを含む。
【００１１】
特定の実施態様において、本抗体又はそのフラグメントは、配列番号３／１１、１９／２１、２３／２５、２７／３５、４３／４５、４７／４９、５１／５９、６７／６９、７１／７３、７５／８３、９１／９３、９５／９７、９９／１０７、１１５／１１７、１１９／１２１、１２３／１３１、１３９／１４１、１４３／１４５、１４７／１５５、１６３／１６５、１６７／１６９、１７１／１７９、１８７／１８９、１９１／１９３、１９５／２０３、２１１／２１３、２１５／２１７、２１９／２２７、２３５／２３７、２３９／２４１、２４３／２５１、２５９／２６１、２６３／２６５、２６７／２７５、２８３／２８５、２８７／２８９、２９１／２９９、３０７／３０９、３１１／３１３、３１５／３２３、３３１／３３３、３３５／３３７、３３９／３４７、３５５／３５７、３５９／３６１、３６３／３７１、３７９／３８１及び３８３／３８５からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む。好ましい実施態様において、本抗体又はそのフラグメントは、配列番号３３９／３４７、１９５／２０３及び２４３／２５１からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む。
【００１２】
第二の局面において、本発明は、抗体又はそのフラグメントをコードする単離された核酸分子を提供する。特定の実施態様において、本核酸分子は、ヌクレオチド配列が配列番号２、１８、２２、２６、４２、４６、５０、６６、７０、７４、９０、９４、９８、１１４、１１８、１２２、１３８、１４２、１４６、１６２、１６６、１７０、１８６、１９０、１９４、２１０、２１４、２１８、２３４、２３８、２４２、２５８、２６２、２６６、２８２、２８６、２９０、３０６、３１０、３１４、３３０、３３４、３３８、３５４、３５８、３６２、３７８、３８２、３８６、３９４及び４０２からなる群より選択されるＨＣＶＲ、又はその実質的に同一な配列をコードする。関連の局面において、本発明は、ヌクレオチド配列が配列番号１０、２０、２４、３４、４４、４８、５８、６８、７２、８２、９２、９６、１０６、１１６、１２０、１３０、１４０、１４４、１５４、１６４、１６８、１７８、１８８、１９２、２０２、２１２、２１６、２２６、２３６、２４０、２５０、２６０、２６４、２７４、２８４、２８８、２９８、３０８、３１２、３２２、３３２、３３６、３４６、３５６、３６０、３７０、３８０及び３８４からなる群より選択されるＬＣＶＲ、又はその実質的に同一な配列をコードする単離された核酸分子を提供する。好ましい実施態様において、本抗体又は抗体フラグメントは、それぞれ配列番号３３８、１９４及び２４２からなる群より選択される核酸分子によりコードされるＨＣＶＲ、並びに配列番号３４６、２０２及び２５０からなる群より選択される核酸分子によりコードされるＬＣＶＲを含む。
【００１３】
第三の局面において、本発明は、配列番号９、３３、５７、８１、１０４、１２９、１５３、１７７、２０１、２２５、２４９、２７３、２９７、３２１、３４５、３６９、３９３、４０１及び４０９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；並びに配列番号１７、４１、６５、８９、１１３、１３７、１６１、１８５、２０９、２３３、２５７、２８１、３０５、３２９、３５３及び３７７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを特徴とする。好ましい実施態様において、本抗体又はそのフラグメントは、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３配列対 配列番号３４５／３５３、２０１／２０９及び２４９／２５７から選択されるＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３配列を含む。
【００１４】
より特定の実施態様において、本抗体又はそのフラグメントは、配列番号５、２９、５３、７７、１０１、１２５、１４９、１７３、１９７、２２１、２４５、２６９、２９３、３１７、３４１、３６５、３８９、３９７及び４０５からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン配列；配列番号７、３１、５５、７９、１０３、１２７、１５１、１７５、１９９、２２３、２４７、２７１、２９５、３１９、３４３、３６７、３９１、３９９及び４０７からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン配列；配列番号１３、３７、６１、８５、１０９、１３３、１５７、１８１、２０５、２２９、２５３、２７７、３０１、３２５、３４９及び３７３からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン配列；並びに配列番号１５、３９、６３、８７、１１１、１３５、１５９、１８３、２０７、２３１、２５５、２７９、３０３、３２７、３５１及び３７５からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン配列をさらに含む。好ましい実施態様において、本抗体又はそのフラグメントは、それぞれ配列番号３４１、３４３、３４５、３４９、３５１及び３５３；１９７、１９９、２０１、２０５、２０７及び２０９；並びに２４５、２４７、２４９、２５３、２５５及び２５７からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ配列及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００１５】
第四の局面において、本発明は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸分子を特徴とし、ここでＨＣＤＲ３ドメイン及びＬＣＤＲ３ドメインをコードする核酸分子は、それぞれ配列番号９及び１６；３３及び４１；５７及び６５；８１及び８９；１０４及び１１３；１２９及び１３７；１５３及び１６１；１７７及び１８５；２０１及び２０９；２２５及び２３３；２４９及び２５７；２７３及び２８１；２９７及び３０５；３２１及び３２９；３４５及び３５３；並びに３６９及び３７７からなる群より選択される。
【００１６】
第五の局面において、本発明は、ＨＣＤＲ３ドメイン及びＬＣＤＲ３ドメインを含む抗体又は抗原結合フラグメントを特徴とし、ここでＨＣＤＲ３ドメインは式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｘ16−Ｘ17−Ｘ18−Ｘ19（配列番号４１２）［式中、Ｘ1＝Ａ、Ｖ又はＴ；Ｘ2＝Ｋ；Ｘ3＝Ｄ；Ｘ4＝Ｐ、Ｆ又はＧ；Ｘ5＝Ｓ又はＨ；Ｘ6＝Ｙ；Ｘ7＝Ｇ；Ｘ8＝Ｓ又はＨ；Ｘ9＝Ｇ又はＦ；Ｘ10＝Ｓ又はＹ；Ｘ11＝Ｙ、Ｎ又はＳ；Ｘ12＝Ｙ、Ｇ又はＨ；Ｘ13＝Ｇ、Ｌ又はＳ；Ｘ14＝Ｙ、Ｍ又はＤ；Ｘ15＝Ｙ、Ｄ又はＶ；Ｘ16＝Ｇ、Ｖ又は存在しない；Ｘ17＝Ｍ又は存在しない；Ｘ18＝Ｄ又は存在しない；Ｘ19＝Ｖ又は存在しない］のアミノ酸配列を含み；そしてＬＣＤＲ３ドメインは、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9（配列番号４１５）、［式中、Ｘ1＝Ｑ；Ｘ2＝Ｑ；Ｘ3＝Ｒ又はＳ；Ｘ4＝Ｎ、Ｙ又はＦ；Ｘ5＝Ｎ、Ｄ、又はＹ；Ｘ6＝Ｗ；Ｘ7＝Ｐ；Ｘ8＝Ｌ；Ｘ9＝Ｔ］のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
より特定の実施態様において、本抗体又は抗原結合フラグメントは、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２ドメインをさらに含み、ここでＨＣＤＲ１ドメインは式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8（配列番号４１０）［式中、Ｘ1＝Ｇ；Ｘ2＝Ｆ又はＩ；Ｘ3＝Ｔ；Ｘ4＝Ｆ；Ｘ5＝Ｈ、Ｒ又はＹ；Ｘ6＝Ｄ；Ｘ7＝Ｙ；Ｘ8＝Ｔ又はＡ］のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２ドメインは、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8（配列番号４１１）［式中、Ｘ1＝Ｉ；Ｘ2＝Ｓ；Ｘ3＝Ｗ；Ｘ4＝Ｎ；Ｘ5＝Ｓ；Ｘ6＝Ｇ又はＤ；Ｘ7＝Ｓ、Ｙ又はＴ；Ｘ8＝Ｉ又はＬ］のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１ドメインは、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6（配列番号４１３）［式中、Ｘ1＝Ｑ；Ｘ2＝Ｓ；Ｘ3＝Ｖ又はＩ；Ｘ4＝Ｓ；Ｘ5＝Ｓ又はＲ；Ｘ6＝Ｙ又はＮ］のアミノ酸配列を含み；そしてＬＣＤＲ２ドメインは、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3（配列番号４１４）［式中、Ｘ1＝Ｅ、Ｇ又はＶ；Ｘ2＝Ａ；Ｘ3＝Ｓ］のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
第六の局面において、本発明は、本発明の核酸分子を有する組み換え発現ベクター、及びこのようなベクターが導入された宿主細胞、さらには本発明の宿主細胞を培養することにより得られる本発明の抗体又はそのフラグメントの製造方法を提供する。宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよく、好ましくは宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞又は哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞である。好ましい実施態様において、抗体は種々の量のフコシル化を用いて製造され得る。例えば、ＣＨＯ細胞株は、最小約５％から最大約９５％までのフコシル化範囲を有する抗体又は抗体フラグメントを産生するように選択され得る。
【００１９】
第七の局面において、本発明は、抗ヒトＣＤ２０抗体又はそのフラグメント及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物を特徴とする。
【００２０】
第八の局面において、本発明は、細胞結合実験（以下に記載される）により測定した場合に、約１０ｎＭ未満のＥＣ50でヒトＣＤ２０に結合することができる、完全なヒト抗体又は抗体フラグメントを特徴とする。好ましい実施態様において、本発明の抗体は、細胞表面に提示された抗原に対する結合により測定した場合に、約１０-8〜約１０-12Ｍ若しくはそれ以上、例えば少なくとも１０-8Ｍ、少なくとも１０-9Ｍ、少なくとも１０-10Ｍ、少なくとも１０-11Ｍ、又は少なくとも１０-12ＭのＥＣ50を示す。
【００２１】
本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗ＣＤ２０抗体を包含する。いくつかの用途では、望ましくないグリコシル化部位を除去する改変が有用であり得、又は例えば抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）機能（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照のこと）を増加させるためにオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠損した抗体が有用であり得る。他の用途において、ガラクトシル化の改変が、補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）を改変するために行われ得る。
【００２２】
第九の局面において、本発明は、ヒトにおいてＣＤ２０媒介疾患又は状態を軽減又は抑制するための使用のための、上記の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。好ましい実施態様において、処置される疾患又は状態は、非ホジキンリンパ腫、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性リンパ性白血病、及び炎症性疾患である。関連の実施態様において、本発明は、ヒトにおいてＣＤ２０媒介疾患又は状態を軽減又は抑制する方法を包含し、この方法は、治療有効量の、上記の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを投与することを含む。さらに本発明は、ヒトにおいてＣＤ２０媒介疾患又は状態を低減又は抑制するための使用のための医薬の製造における、本発明の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントの使用を包含する。
【００２３】
他の目的及び利点は、次の詳細な説明を検討することにより明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】無症状生存曲線。結果をヒトＦｃコントロール、コントロール抗体Ｉ及びＩＩ、並びに抗体：８Ｇ６−５、９Ｄ４−７、１０Ｆ２−１３、及び７Ｅ１−１３について示す。
【００２５】
詳細な説明
本方法を記載する前に、当然のことながら、本発明は、記載される特定の方法及び実験条件に限定されず、そのようなものとして方法及び条件は変動し得る。また当然のことながら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲にのみ限定されるので、本明細書中で使用される用語は、特定の実施態様を記載する目的のみであり、限定することを意図されない。
【００２６】
別に規定がなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は等価であるあらゆる方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料がここで記載される。
【００２７】
定義
用語「ＣＤ２０」は、ヒトＣＤ２０の変異体及びアイソフォームを含み、これらは天然で細胞により発現される。本発明の抗体のＣＤ２０抗原に対する結合は、ＣＤ２０を発現している細胞（例えば腫瘍細胞）の死滅を媒介する。ＣＤ２０を発現している細胞の死滅は、ＣＤ２０を発現している細胞の補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）、ＣＤ２０を発現している細胞のアポトーシス、ＣＤ２０を発現している細胞のエフェクター細胞ファゴサイトーシス、又はＣＤ２０を発現している細胞のエフェクター細胞抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を含む多数の様式で起こり得る。
【００２８】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、ジスルフィド結合で相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を指すことを意図される。重鎖はそれぞれ重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を構成する。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、超多様性（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）領域、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域、より保存された領域が点在している領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域にさらに細分することができる。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００２９】
用語抗体の「抗原結合部分」（又は簡単に「抗体部分」又は「抗体フラグメント」）は、本明細書で使用される場合、抗原（例えば、ｈＣＤ２０）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ又はそれ以上のフラグメントを指す。全長抗体のフラグメントが抗体の抗原結合機能を果たし得ることが示されている。用語抗体の「抗原結合部分」内に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ１及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ） Ｆ（ａｂ'）2フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦ（ａｂ）’フラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アーム（ｓｉｎｇｌｅ ａｒｍ）のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ２４１：５４４−５４６）、（これはＶＨドメインからなる）；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別の遺伝子にコードされるが、これらは組み換え法を使用して、それらをＶＬ及びＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一の連続した鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）として作成されることを可能にする合成リンカーにより連結することができる。このような単鎖抗体もまた、用語抗体の「抗原結合部分」に包含されることを意図される。単鎖抗体の他の形態、例えば二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）もまた包含される（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８を参照のこと）。
【００３０】
「ＣＤＲ」又は相補性決定領域は、より保存された、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる領域内に点在する超多様性の領域である。本発明の抗ｈＣＤ２０抗体又はフラグメントの種々の実施態様において、ＦＲはヒト生殖細胞配列と同一であってもよく、又は天然若しくは人工的に改変されていてもよい。
【００３１】
用語「表面プラズモン共鳴」は本明細書で使用される場合、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を、例えばＢＩＡＣＯＲＥTMシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ）を使用して検出することによりリアルタイムの相互作用を分析することを可能にする光学現象を指す。
【００３２】
用語「エピトープ」とは、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域において特定の抗原結合部分と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は１つより多くのエピトープを有し得る。エピトープは立体構造型（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）であっても線状であってもよい。立体構造型（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープは、１つ（又はそれ以上）の線状ポリペプチド鎖の異なる部分からの空間的に並列したアミノ酸により形成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接したアミノ酸残基により形成されるエピトープである。特定の状況では、エピトープは抗原上に他の部分、例えば糖鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基を含み得る。
【００３３】
核酸又はそのフラグメントに言及する場合の用語「実質的な同一性」又は「実質的に同一」は、別の核酸（又はその相補鎖）と、適切なヌクレオチド挿入又は欠損を伴って最適に整列した場合に、以下で考察されるように、あらゆる周知の配列同一性アルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧＡＰで測定された場合に、少なくとも約９５％、及びより好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。
【００３４】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な類似性」又は「実質的に類似」は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ加重を使用して例えばプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列された場合に、少なくとも９５％配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学特性（例えば電荷又は疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化しない。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が互いに保存的置換により異なっている場合には、類似性のパーセント又は程度は、置換の保存的性質を修正するために上方調節され得る。この調節を行う手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照のこと。類似の化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；２）脂肪族−ヒドロキシ側鎖：セリン及びトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換グループは：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３ ４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有するあらゆる変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて負でない値を有するあらゆる変化である。
【００３５】
ポリペプチドについての配列類似性は、典型的に配列解析ソフトウエアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウエアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠損及び他の変更に帰属される類似性の指標を使用して類似の配列をマッチングする。例えば、ＧＣＧソフトウエアは、密接に関連するポリペプチド（例えば異なる生物種からの同族ポリペプチド）の間、又は野生型タンパク質とその突然変異タンパク質との間の配列相同性又は配列同一性を決定するためのデフォルトパラメーターと共に使用することができるＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴのようなプログラムを含む。例えば、ＧＣＧ バージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、デフォルト又は推奨のパラメーターを用いてＦＡＳＴＡを使用して比較することができる；ＧＣＧ バージョン６．１．ＦＡＳＴＡのプログラム（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間の最大オーバーラップの領域の整列及び配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）既出）。本発明の配列を異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３ ４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９ ４０２を参照のこと。
【００３６】
用語「有効量」は、特定の記載された目的の達成をもたらす、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントの濃度又は量である。「有効量」の抗ＣＤ２０抗体又はその抗体の抗原結合フラグメントは、実験的に決定され得る。さらに、「治療有効量」は、記載された治療効果を達成するために有効である、抗ＣＤ２０抗体又はその抗原結合フラグメントの濃度又は量である。この量もまた、実験的に決定され得る。
【００３７】
ヒト抗体の製造
ヒト抗体を生成する方法としては、例えば、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅTM（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅTM技術（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１；Ａｂｇｅｎｉｘ）、「小遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチ、及びファージディスプレイ（及び例えば、ＵＳ５，５４５，８０７、ＵＳ６，７８７，６３７を参照のこと）が挙げられる。ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅTM技術（ＵＳ６，５９６，５４１）は、選択抗原に対する高特異性完全ヒト抗体を生成する方法を包含する。この技術は、マウスが抗原刺激に応じてヒト可変領域及びマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内因性マウス定常領域遺伝子座と操作可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されたヒト重鎖及び軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの生成を含む。抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、そしてヒト重鎖及び軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに操作可能に連結させる。次いでこのＤＮＡを完全ヒト抗体を発現することができる細胞で発現させる。特定の実施態様において、この細胞はＣＨＯ細胞である。
【００３８】
抗体は、補体結合による細胞の死滅（ＣＤＣ）及び参加（ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ）抗体依存性細胞媒介細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）よりもむしろ、リガンド−受容体相互作用の遮断又は受容体構成要素相互作用の阻害において治療上有用であり得る。抗体の定常領域は、補体に結合して細胞依存性細胞傷害活性を媒介する抗体の能力において重要である。従って、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害活性を媒介することが望ましいか否かに基づいて選択され得る。
【００３９】
ヒト免疫グロブリンは、ヒンジ異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）に関連する２つの形態で存在することができる。一方の形態では、免疫グロブリン分子は、ダイマーが鎖間重鎖ジスルフィド結合により一緒に保持されている約１５０−１６０ｋＤａの安定な四鎖構築物を含む。第二の形態では、ダイマーは鎖間ジスルフィド結合を介して連結しておらず、約７５−８０ｋＤａの分子が、共有結合で結合した軽鎖及び重鎖から構成されて形成される（半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ））。これらの形態は、アフィニティ精製後でさえ、分離することが非常に困難である。種々のインタクトなＩｇＧアイソタイプにおける第二の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造的な差異に起因するがこれに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一のアミノ酸置換は、第二の形態（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）の出現を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで有意に減少させることができる。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２又はＣＨ３領域において１つ又はそれ以上の変異を有する抗体を包含し、これは、例えば所望の抗体形態の収量を改善するために、製造において望ましいかもしれない。
【００４０】
本発明の抗体は、好ましくはＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅTM技術を使用して製造される。内因性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域が対応するヒト可変領域で置き換えられているトランスジェニックマウスに目的の抗原をチャレンジし、そして抗体を発現するマウスからリンパ細胞（例えばＢ細胞）を回収する。このリンパ細胞を骨髄腫細胞株に融合させて不死ハイブリドーマ細胞株を調製し得、そしてこのようなハイブリドーマ細胞株を、目的の抗原に対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するためにスクリーニングして選択する。重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、単離されて重鎖及び軽鎖の所望のアイソタイプ定常領域に連結され得る。このような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞のような細胞で産生され得る。あるいは、抗原特異的キメラ抗体又は軽鎖及び重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡは、抗原特異的リンパ球から直接単離され得る。
【００４１】
一般に、本発明の抗体は、非常に高い親和性を有しており、細胞表面に提示された抗原に対する結合により測定した場合に、典型的には約１０-8から約１０-12Ｍ若しくはそれ以上、例えば、少なくとも１０-8Ｍ、少なくとも１０-9Ｍ、少なくとも１０-10Ｍ、少なくとも１０-11Ｍ、又は少なくとも１０-12ＭのＫD又はＥＣ50を有する。
【００４２】
最初に、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体を単離する。以下に記載されるように、これら抗体を特徴付けし、そして親和性、選択性、エピトープなどの所望の特徴について選択する。マウス定常領域を、所望のヒト定常領域と置き換えて本発明の完全ヒト抗体を生成する、例えば野生型又は改変されたＩｇＧ１又はＩｇＧ４（例えば、配列番号４１６、４１７、４１８）。選択された定常領域は特定の用途に従って変化し得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性の特徴は、可変領域に存在する。
【００４３】
エピトープマッピング及び関連技術
特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 １９８８ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編、に記載されるような慣用の交差遮断（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイを行うことができる。他の方法としては、アラニン走査変異体（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｎｔｓ）、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ （２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３−６３）、又は以下の実施例に記載されるようなペプチド切断分析が挙げられる。さらに、エピトープ切り出し、エピトープ抽出及び抗原の化学修飾のような方法を使用することができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ：９：４８７−４９６）。
【００４４】
抗体の結合特性を確認するために、選択されたアミノ酸置換からなる変異体ＣＤ２０タンパク質を構築した。変異体ＣＤ２０タンパク質は、ヒトタンパク質に存在する特定のアミノ酸の、マウスタンパク質に存在する対応するアミノ酸での置換を含んでいた。このアプローチは、変異体ＣＤ２０タンパク質がそれらの三次元構造、そしておそらくあらゆる立体構造型エピトープを維持することを確実にするのに役立つ。ＦＡＣＳにより測定した場合に、試験抗体のこれらの変異体ＣＤ２０タンパク質に対する結合を、コントロール（既知）ＣＤ２０抗体と比較した。本発明の抗体のいずれも、（それぞれ及び全ての変異体に関して）コントロール抗体のいずれかと同一である結合プロフィールを示さなかった。
【００４５】
免疫複合体
本発明は、治療部分、例えば細胞毒素、化学療法薬、免疫抑制剤又は放射性同位体に結合したヒト抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。細胞毒素剤は、細胞に有害なあらゆる薬剤を含む。免疫複合体を形成するために適切な細胞毒素剤及び化学療法薬の例は、当該分野で公知であり、例えばＷＯ０５／１０３０８１を参照のこと。
【００４６】
二重特異性
本発明の抗体は、単一特異性でも、二重特異性でも、多重特異性でもよい。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープについて特異的であっても、１つより多くの標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含んでいてもよい。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９を参照のこと。ヒト抗ＣＤ２０抗体は、別の機能的分子、例えば別のペプチド若しくはタンパク質に連結又は別のペプチド若しくはタンパク質と同時発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）してもよい。例えば、抗体又はそのフラグメントは、１つ又はそれ以上の他の分子実体、例えば別の抗体又は抗体フラグメントに、（例えば化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合又はその他により）機能的に連結されて、第二の結合特異性を有する二重特異性又は多重特異性抗体を生じ得る。本発明の多重特異性抗体は、ＣＤ２０を発現している細胞、並びにポリペプチド、例えばヒトＦｃ受容体、及び／又はＴ細胞受容体複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を発現しているヒトエフェクター細胞の両方に特異的に結合し得る。一実施態様において、本発明の多重特異性抗体は、ＣＤ２０結合部分及びサイトカインを含む。
【００４７】
治療用途
本発明のヒト抗体、抗体の抗原結合フラグメント、免疫複合体、及び二重特異性分子は、ＣＤ２０を発現している細胞の成長を阻害すること及び／又はＣＤ２０を発現している細胞を死滅させることにより抑制又は改善されるヒト疾患を処置するための治療方法において有用である。本発明の治療方法が達成される作用機序には、例えば、ＣＤＣ、アポトーシス、ＡＤＣＣ、ファゴサイトーシス、又は２つ若しくはそれ以上のこれらの機序の組み合わせによる、エフェクター細胞の存在下でのＣＤ２０を発現している細胞の死滅が含まれる。本発明の分子の治療効果を達成するための機序は、ＣＤ２０を発現している細胞の死滅又は阻害を直接的に生じても、間接的に、ＣＤ２０を発現していない、例えば構造的に関連した細胞表面抗原（すなわち、関連するが機能的に異なる細胞表面抗原に対する交差反応性はない）を発現する細胞を阻害することにより生じてもよい。本発明のヒト抗体を使用して阻害又は死滅することができる、ＣＤ２０を発現している細胞としては、例えば腫瘍形成性Ｂ細胞が挙げられる。
【００４８】
抗ＣＤ２０抗体及びそのフラグメントを用いて処置又は改善することができる疾患及び状態の例としては、限定されないが、腫瘍形成性疾患、例えばＢ細胞リンパ腫（ＮＨＬ、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性（ｐｒｏｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ）白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、プラスマ細胞腫、プラスマ細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及び未分化大細胞リンパ腫）；免疫疾患、例えば自己免疫疾患（乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎、全身性強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、糸球体腎炎、湿疹、ぜんそく、アテローム性動脈硬化症、白血球接着不全、多発性硬化症、レイノー症候群、シェーグレン症候群、若年発症糖尿病、ライター病、ベーチェット病、免疫複合体性腎炎、ＩｇＡネフロパシー、ＩｇＭ多発ニューロパシー）；免疫性の血小板減少、急性特発性血小板減少性紫斑病及び慢性特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、重症筋無力症、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性伝染性単核球症、ＨＩＶ、及びヘルペスウイルス関連疾患；重症急性呼吸促迫症候群及び脈絡網膜炎（ｃｈｏｒｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）；エプスタイン−バーウイルスのようなウイルスへのＢ細胞の感染により引き起こされる疾患及び障害が挙げられる。
【００４９】
特定の実施態様において、抗体を投与される被験体は、Ｆｃ受容体の発現又は活性を調節する（増強又は阻害する）化学療法剤、放射線又は薬剤、例えばサイトカインでさらに処置される。処置の間の投与に典型的なサイトカインとしては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−(）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。典型的な治療剤としては、とりわけ、抗腫瘍剤、例えばドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、及びシクロホスファミドが挙げられる。
【００５０】
治療用投与及び製剤
本発明は、本発明のヒト抗ＣＤ２０抗体又はその抗原結合フラグメントを含む治療用組成物を提供する。本発明に従う治療用組成物は、適切な担体、賦形剤、及び製剤中に組み込まれて改善された移動、送達、耐性などをもたらす他の薬剤とともに投与される。一般に、担体、賦形剤、又は他の薬剤としては、例えば、油脂（例えば、菜種油、綿実油、落花生油、ベニバナ油、ゴマ油、大豆油）、脂肪酸並びにその塩及びエステル（例えば、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸）、アルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコール）、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧ ３３５０）、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、ゼラチン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、塩（例えば、塩化ナトリウム）、コハク酸及びその塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、アミノ酸及びその塩（例えば、アラニン、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リジン）、酢酸又はその塩若しくはエステル（例えば、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム）、クエン酸及びその塩（例えば、クエン酸ナトリウム）、安息香酸及びその塩、リン酸及びその塩（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム）、乳酸及びその塩、ポリ乳酸、グルタミン酸及びその塩（例えば、グルタミン酸ナトリウム）、カルシウム及びその塩（例えば、塩化カルシウム、酢酸カルシウム）、フェノール、糖質（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース）、エリトリトール、アラビトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、イオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、クロロブタノール、ＤＭＳＯ、水酸化ナトリウム、グリセリン、ｍ−クレゾール、イミダゾール、プロタミン、亜鉛及びその塩（例えば、硫酸亜鉛）、チメロサール、メチルパラベン、プロピルパラベン、カルボキシメチルセルロース、クロロブタノール、及びヘパリンを挙げることができる。他の非治療用薬剤は、ＵＳ７，００１，８９２にて特に表Ａに記載される。多数の適切な製剤は、全ての薬化学者に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ）に見いだされ得る。これらの製剤としては、例えば、散剤、ペースト、軟膏、ゼリー、ロウ、油状物、脂質、脂質を含有する小胞（カチオン性又はアニオン性）（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油及び油中水乳剤、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル、及びカーボワックスを含有する半固形混合物を挙げることができる。前述の混合物のいずれも本発明による処置及び治療において適切であり得るが、ただし製剤中の活性成分は、製剤化により不活性化されず、そして製剤は生理学的に適合性であり、そして投与経路に許容しうるものである。薬化学者に周知の賦形剤及び担体に関連するさらなる情報については、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１及びその中の引用も参照のこと。
【００５１】
治療用組成物の用量は、投与される被験体の年齢及び大きさ、標的の疾患、状態、投与経路などに依存して変動し得る。本発明の抗体が、成人患者においてＣＤ２０活性に関連する種々の状態及び疾患（非ホジキンリンパ腫、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性リンパ性白血病、炎症性疾患などを含む）を処置するために使用される場合、本発明の抗体を、通常約０．０１〜約２０ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／体重１ｋｇ、そしてより好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／体重１ｋｇの単回用量で静脈内に投与することが有利である。状態または疾患の重篤度に依存して、処置の頻度及び持続時間を調節することができる。他の非経口投与及び経口投与において、本抗体を上記に示される用量に相当する用量で投与することができる。
【００５２】
種々の送達系が知られており、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる、例えば、リポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することができる組み換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）。導入方法としては、限定されないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口の経路が挙げられる。本組成物は、あらゆる都合の良い経路により、例えば注入又はボーラス注射により、上皮又は粘膜皮膚内層を通る吸収により（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤とともに投与され得る。投与は好ましくは全身でも局所的でもよい。
【００５３】
本医薬組成物はまた、小胞で、特にリポソーム（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３を参照のこと）で送達され得る。特定の状況において、本医薬組成物は、制御放出システムで送達することができる。一実施態様において、ポンプを使用してもよい（Ｌａｎｇｅｒ、既出；Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１）。別の実施態様において、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ及びＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ （１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｓｍｏｌｅｎ及びＢａｌｌ （編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８４）を参照のこと。さらに別の実施態様において、制御放出システムは、組成物の標的の近位に配置することができ、従って全身用量の一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、既出、ｖｏｌ．２、ｐｐ．１１５−１３８、１９８４を参照のこと）。
【００５４】
注射可能製剤は、静脈内、皮下、皮内及び筋内の注射、点滴などのための投薬形態を含み得る。これらの注射可能製剤は、公知の方法により製造され得る。例えば、注射可能製剤は、例えば上記の抗体又はその塩を、注射用に従来使用される滅菌水性媒体又は油性媒体中に溶解、懸濁又は乳化させることにより製造され得る。注射用の水性媒体としては、例えば生理食塩水、グルコース及び他の補助剤などを含有する等張液があり、これらは適切な可溶化剤、例えばアルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ひまし油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加体）］などと組み合わせて使用され得る。油性媒体としては、例えばごま油、大豆油などが使用され得、これらは、可溶化剤、例えば安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと組み合わせて使用され得る。このようにして製造された注射は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
【００５５】
有利には、上記の経口又は非経口用途の医薬組成物は、活性成分の用量に適合させるために適した単回用量で投薬形態に調製される。このような単回用量の投薬形態としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される上述の抗体の量は、一般的に単回用量の投薬形態あたり約５〜５００ｍｇであり；特に注射の形態では、上述の抗体が約５〜１００ｍｇ、そして他の投薬形態については約１０〜２５０ｍｇ含有されることが好ましい。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を製造し、使用する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために示されるものであり、本発明者らが彼らの発明と考えるものの範囲を限定することは意図されない。使用される数値（例えば量、温度など）に関して正確さを確実にしようとする努力がなされるが、いくらかの実験誤差及び偏差が存在するはずである。別に指示がなければ、部は質量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、そして圧力は大気圧又はその付近である。
【００５７】
実施例１． ヒトＣＤ２０に対するヒト抗体の生成
齧歯動物を、当該分野で公知のいずれかの方法により免疫状態にすることができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ編（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｍａｌｉｋ ａｎｄ Ｌｉｌｌｅｈｏｊ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９４、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照のこと）。一実施態様において、ＣＤ２０を発現している細胞を、ヒトＩｇ重鎖可変領域及びκ軽鎖可変領域の両方をコードするＤＮＡ座を有するマウスに（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅTM、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．；ＵＳ６，５９６，５４１）、免疫応答を刺激するアジュバントとともに直接投与した。このようなアジュバントとしては、完全及び不完全フロイントアジュバント、ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント系（Ｓｉｇｍａ）、又はＲＩＢＩ（ムラミールジペプチド）を挙げることができる（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、２０００、Ｔｏｔａｗａ、ＮＪによるＯ’Ｈａｇａｎ、Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔを参照のこと）。細胞表面でのヒトＣＤ２０の高い発現レベルを達成するために、マウス細胞株、ＭＧ８７及び／又はＮＳ／０細胞を、ヒトＣＤ２０をコードするプラスミドでトランスフェクトし、そして高レベルのＣＤ２０を発現している細胞を、ＦＡＣＳ技術を使用して濃縮した。一実施態様では、ＣＤ２０を、ＣＤ２０遺伝子を含有するＤＮＡプラスミドとして間接的に投与し、そしてＣＤ２０を宿主のタンパク質発現系を使用して発現させて、インビボで抗原タンパク質を産生する。両方のアプローチにおいて、最適な抗体免疫応答を得るために３〜４週間ごとにマウスにブースター注射を行った。１〜３倍段階希釈の血清サンプルを免疫アッセイにかける、以下に記載される細胞ベースの免疫アッセイにより、免疫応答をモニタリングした。血清力価を、バックグラウンドの２倍のアッセイシグナルを生じた血清サンプルの希釈として規定した。動物がそれらの最大免疫応答に達した場合に、抗体を発現しているＢ細胞を採取し、そしてマウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成した。
【００５８】
実施例２． 抗原特異的ハイブリドーマのスクリーニング
一次スクリーニングにおいて、ＮＳ／０細胞（ＡＴＣＣ）を、ヒトＣＤ２０遺伝子でトランスフェクとし、高発現細胞（ＮＳ／０−ｈＣＤ２０細胞）をプールし、そして 一般に融合の約１１〜１４日後にハイブリドーマ−馴化培地中でのスクリーニングにおける使用のために培養液中に維持した。１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０中のＮＳ／０−ｈＣＤ２０細胞を、９６ウェルポリ−Ｄ−リジンプレートにおいて１ウェルあたり５０，０００個の細胞の密度でプレーティングした。ハイブリドーマ−馴化培地を５倍希釈し、そして３０分間細胞に結合させた。次いでこれらの細胞を、等体積の８％ホルムアルデヒドを加えて２０分間プレートに固定し、続いて４回連続してＰＢＳＴ洗浄した。プレートを５％ＢＳＡと共に２時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。洗浄した後、プレートに結合した抗体をＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃγ特異的ポリクローナル抗体とともに３０分間インキュベートし、そしてプレートを、最終洗浄の後、３．３’，５．５’−テトラメチル−ベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を使用して現像した。ＨＲＰ反応を、等体積の１Ｍリン酸を用いて停止した。抗体結合シグナルを、４５０ｎｍにて光学濃度により測定した。ＮＳ／０親細胞（検出可能なＣＤ２０発現がない）をバックグラウンドコントロールとして使用して、非特異的細胞表面結合を有するハイブリドーマ上清を除いた。ＮＳ／０親細胞及びＣＤ２０を発現している細胞の両方に陽性のウェルを除いた。
【００５９】
実施例３． ＣＤ２０に対するヒト抗体の配列決定
配列決定の前に、抗原特異的ハイブリドーマ細胞を、ＭＯＦＬＯTMフローサイトメーターを使用して単一細胞サブクローニングした。可変軽鎖及び重鎖領域の配列決定を、標準的方法（例えば、ＵＳ ２００４／０１６７３１９Ａ１を参照のこと）により行った。完全ＲＮＡを各ハイブリドーマ細胞株からＲＮＥＡＳＹTMキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した。ｃＤＮＡをＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥTM ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用して調製した。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのＤＮＡ配列を配列決定し、そして選択された抗体について得られたＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのアミノ酸配列を推定した（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列番号）：３Ｂ９−１０Ｎ（３／１１）；３Ｂ９−１０ＧＳＰ（１９／２１）；３Ｂ９−１０ＦＧＬ（２３／２５）；９Ｃ１１−１４Ｎ（２７／３５）；９Ｃ１１−１４ＧＳＰ（４３／４５）；９Ｃ１１−１４ＦＧＬ（４７／４９）；２Ｂ７−７Ｎ（５１／５９）；２Ｂ７−７ＧＳＰ（６７／６９）；２Ｂ７−７ＦＧＬ（７１／７３）；２Ｃ１１−４Ｎ（７５／８３）；２Ｃ１１−４ＧＳＰ（９１／９３）；２Ｃ１１−４ＦＧＬ（９５／９７）；３Ｈ７−６Ｎ（９９／１０７）；３Ｈ７−６ＧＳＰ（１１５／１１７）；３Ｈ７−６ＦＧＬ（１１９／１２１）；５Ｈ２−１７Ｎ（１２３／１３１）；５Ｈ２−１７ＧＳＰ（１３９／１４１）；５Ｈ２−１７ＦＧＬ（１４３／１４５）；６Ｂ９−４Ｎ（１４７／１５５）；６Ｂ９−４ＧＳＰ（１６３／１６５）；６Ｂ９−４ＦＧＬ（１６７／１６９）；６Ｆ６−１Ｎ（１７１／１７９）；６Ｆ６−１ＧＳＰ（１８７／１８９）；６Ｆ６−１ＦＧＬ（１９１／１９３）；８Ｇ６−５Ｎ（「８Ｇ６−５」）（１９５／２０３）；８Ｇ６−５ＧＳＰ（２１１／２１３）；８Ｇ６−５ＦＧＬ（２１５／２１７）；９Ｃ３−８Ｎ（２１９／２２７）；９Ｃ３−８ＧＳＰ（２３５／２３７）；９Ｃ３−８ＦＧＬ（２３９／２４１）；９Ｄ４−７Ｎ（「９Ｄ４−７」）（２４３／２５１）；９Ｄ４−７ＧＳＰ（２５９／２６１）；９Ｄ４−７ＦＧＬ（２６３／２６５）；９Ｅ４−２０Ｎ（２６７／２７５）；９Ｅ４−２０ＧＳＰ（２８３／２８５）；９Ｅ４−２０ＦＧＬ（２８７／２８９）；９Ｈ４−１２Ｎ（２９１／２９９）；９Ｈ４−１２ＧＳＰ（３０７／３０９）；９Ｈ４−１２ＦＧＬ（３１１／３１３）；１０Ｅ３−１７Ｎ（３１５／３２３）；１０Ｅ３−１７ＧＳＰ（３３１／３３３）；１０Ｅ３−１７ＦＧＬ（３３５／３３７）；１０Ｆ２−１３Ｎ（“１０Ｆ２−１３”）（３３９／３４７）；１０Ｆ２−１３ＧＳＰ（３５５／３５７）；１０Ｆ２−１３ＦＧＬ（３５９／３６１）；７Ｅ１−１３Ｎ（３６３／３７１）；７Ｅ１−１３ＧＳＰ（３７９／３８１）；７Ｅ１−１３ＦＧＬ（３８３／３８５）。
【００６０】
実施例４． 抗ＣＤ２０抗体の抗原結合特異性
キメラ抗体を完全ヒトＩｇＧに変換した後、特異的抗原結合特性を、ＨＲＰ結合ヤギ抗ｈＩｇＧ Ｆｃ(特異的ポリクローナルを検出抗体として使用し、そしてＤａｕｄｉ細胞株（内因性ＣＤ２０を発現する）を抗原源として使用したこと以外は、上記のプロトコールと同様のＥＬＩＳＡプロトコールを用いて決定した。試験した抗体の全ては、約０．４ｎＭ〜約２０ｎＭの範囲のＥＣ50値でＤａｕｄｉ細胞に特異的に結合した。
【００６１】
完全ヒト抗ＣＤ２０抗体の抗原結合特異性を、以下に記載されるようにフローサイトメトリーを使用してヒトＣＤ２０でトランスフェクトしたＭＧ８７細胞を用いて検証した。手短には、親ＭＧ８７細胞及びヒトＣＤ２０でトランスフェクトしたＭＧ８７細胞を３０分間４℃にて１５のヒト抗体のそれぞれ及び２つのコントロール抗体とともにインキュベートし、続いてＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ 抗体とともにインキュベートした。結合をフローサイトメトリーにより評価した。蛍光強度を親細胞株及びコントロールアイソタイプ適合サンプルに対する結合と比較した。結果を表１に要約する。全ての抗体がヒトＣＤ２０トランスフェクトＭＧ８７細胞に結合したが、親ＭＧ８７細胞に対する結合は見られず、抗体がＣＤ２０特異的であることを示した。コントロールＩ：キメラ（マウス／ヒト）抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、リツキシマブ、（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）；コントロールＩＩ：ヒト抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、２Ｆ２、ＷＯ ２００５／１０３０８１に記載される）。
【００６２】
【表１】
【００６３】
実施例５． 変異体ヒトＣＤ２０に対するヒト抗ＣＤ２０抗体の結合
変異体ヒトＣＤ２０を、ヒトＣＤ２０アミノ酸配列を対応するマウスアミノ酸でＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを使用して置換することにより生成した（表２）。次いで変異体ヒトＣＤ２０、ＣＭＶプロモーター、及びハイグロマイシン耐性遺伝子ＩＲＥＳ−ＧＦＰマーカーを含むプラスミドベクターを、ＭＧ８７細胞にトランスフェクトした。各変異体ヒトＣＤ２０について、高ＧＦＰ発現を示したハイグロマイシン耐性細胞のプールを収集し、そして安定な細胞株を抗体結合アッセイのために生成した。
【００６４】
【表２】
【００６５】
手短には、変異体ヒトＣＤ２０を発現しているそれぞれの安定にトランスフェクトされた細胞株から約１×１０6個の細胞を収集し、そして各抗ヒト抗体とともに１０μｇ／ｍｌで氷上にて１時間インキュベートし、続いてＡＰＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ）とともに１０μｇ／ｍｌで氷上にて４５分間インキュベートした。各抗体について、各変異体ヒトＣＤ２０に対する結合を、フローサイトメトリーにより評価した。平均蛍光強度レベルを、各細胞株内で変動する変異体ＣＤ２０発現レベルに起因する効果を最小にするために、平均レベルのＧＦＰ発現を示した細胞の小さな（約２０％）集団にゲーティングしながら評価した。各変異体ＣＤ２０について、最も高い平均蛍光強度を示した抗体を１００％結合として指定した。表３は、各変異体ヒトＣＤ２０に対する各抗ＣＤ２０抗体の結合パーセントを示す。
【００６６】
【表３】
【００６７】
実施例６． 補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）における有効性
抗ヒトＣＤ２０ヒト抗体を、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を促進するそれらの能力について、ヒトリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ及びＲＬを標的細胞株として使用して試験した。抗体を媒体中に連続希釈し（最終濃度範囲５０ｎＭ〜０．８５ｐＭ及び緩衝液コントロール）、そして９６ウェルプレート型に播種された標的細胞に加えた。補体成分（Ｑｕｉｄｅｌ）を含むヒト血清を各ウェルに加えて、最終血清濃度を５％とした。細胞を試験抗体、及び補体成分を含むヒト血清とともに３７(Ｃで２時間インキュベートし、次いでＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥTMにより検出した場合の細胞生存について測定した。蛍光を、５６０ｎｍの励起波長及び５９０ｎｍの発光波長を使用して測定した（表４）。
【００６８】
【表４】
【００６９】
実施例７． ヒト抗ＣＤ２０抗体の機能的解離速度（Ｏｆｆ−Ｒａｔｅ）
抗ＣＤ２０ｍＡｂの解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅｓ）をＣＤＣアッセイで分析した。３つの別々の組で実験を行った。各組内において、細胞溶解のパーセンテージを、コントロールＩ及びＩＩと比較して０時間、１時間、及び６時間目に５つの抗体について測定した。各抗体２μｇを１０6Ｄａｕｄｉ細胞と４５分間（ＲＴ）インキュベートすることにより抗体を細胞に結合させた。０時間の時点で細胞を洗浄し、そしてすぐに２０％正常ヒト血清補体を含有する培地１００μｌに再懸濁し、次いで４５分間３７℃、５％ＣＯ2にてインキュベートした。１時間及び６時間の時点について、抗体結合後の１０6個の細胞を洗浄し、１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブ中で新鮮な培地１２ｍｌに再懸濁し、そしてメカニカルインバーターでそれぞれ１時間及び６時間インキュベートした。選択された時点が完了すると細胞を洗浄し、そして２０％正常ヒト血清補体を含有する培地中でインキュベートし、そして４５分間インキュベートした。血清インキュベーションの後、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）を各サンプルに加え、そして１５分間室温でインキュベートして細胞生存を評価した。細胞傷害性パーセントを各時点において、前方散乱対７ＡＡＤ陽性及び陰性の細胞を表す７ＡＡＤ２次元散乱プロットとしての領域を設定し、両方の領域からごみ（ｄｅｂｒｉｓ）を除去することにより決定した。細胞傷害性パーセントを、各時点について１００−７ＡＡＤネガティブ細胞のパーセンテージとしてプロットした（表５〜７）。
【００７０】
【表５】
【００７１】
【表６】
【００７２】
【表７】
【００７３】
実施例８． ヒト抗ＣＤ２０抗体の生化学的解離速度
選択された試験抗ＣＤ２０抗体についての生化学的解離速度を決定し、そしてコントロール抗体Ｉ及びＩＩと比較した。２つの選択されたヒト抗体、コントロールＩ又はＩＩ（各２μｇ／ｍｌ）を、ＣＤ２０を発現しているＲａｊｉ細胞とともに、１０6／ｍｌにて２時間室温でインキュベートした。次いで細胞を洗浄し、過剰の抗体を除去し、１％血清含有培地に再懸濁し、そして３７℃でインキュベートした。０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、及び１８０分の時点で、細胞の１ｍｌのアリコートを取り出し、洗浄し、ＰＥ標識抗ｈＦｃ抗体で染色し、そしてＦＡＣＳ分析を行った。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を細胞表面に結合した抗体の量の指標として使用した。生化学的解離速度を、時間０の時点の結合パーセントを１００％として計算した。実験をさらに５回繰り返し、そして１２の試験抗体についての生化学的解離速度を決定し、そしてコントロールＩ及びＩＩと比較した（表８〜１３）。
【００７４】
【表８】
【００７５】
【表９】
【００７６】
【表１０】
【００７７】
【表１１】
【００７８】
【表１２】
【００７９】
【表１３】
【００８０】
実施例９． 抗体依存性細胞媒介細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）アッセイ
選択されたヒト抗ＣＤ２０抗体により誘導されたＡＤＣＣを、Ｄａｕｄｉ細胞（内因的にＣＤ２０を発現するヒトリンパ腫細胞株由来の細胞）を使用して評価した。手短には、Ｄａｕｄｉ細胞（５０μｌ中１０，０００細胞／ウェル）を最初に等体積の連続希釈したヒト抗ＣＤ２０抗体と混合し、最終抗体濃度を０．１６９ｐＭ〜１０ｎＭの範囲とし、そして１０分間室温にて９６ウェルプレートでインキュベートした（コントロール＝抗体（ａｂ）を含まないウェル）。別に、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、エフェクター細胞）を、従来のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅグラジエント遠心分離濃縮手順にしたがって調製した。濃縮したＰＢＭＣを集めて洗浄し、そして１０％熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン及び５０ｎＭベータ−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ １６４０中にプレーティングした。次いで細胞を５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−２で３日間刺激し、培地で１回洗浄し、次いでＡＤＣＣアッセイでそのまま使用した。約３００，０００のＰＢＭＣを抗体及び標的細胞の各混合物に加えてエフェクター対標的細胞の最終比率を約３０：１とした。次いで９６ウェルプレートを４時間インキュベートし、そして２５０ｘｇで遠心分離した。上清を採取し、そして乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性についてＣＹＴＯＴＯＸ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した（表１４）。
【００８１】
【表１４】
【００８２】
実施例１０． ヒトリンパ腫異種移植マウスモデルを用いた抗ＣＤ２０抗体の治療活性
選択された抗ＣＤ２０抗体についてのインビボ有効性研究を、ヒト非ホジキンＢ細胞リンパ腫異種移植マウスモデルを使用して行った。雌性重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを６週齢で購入した。１週間馴化させた後、２５００万個の採取直後のＲａｊｉ細胞（ヒト非ホジキンＢ細胞リンパ腫細胞株由来の細胞）を各マウスに静脈内注射した。次いでＲａｊｉ細胞を移植された各マウスをヒトＦＣ（ｈＦＣ）、コントロールＩ、コントロールＩＩ、８Ｇ６−５、９Ｄ４−７、１０Ｆ２−１３、又は７Ｅ１−１３で、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇで、静脈注射で側尾（ｌａｔｅｒａｌ ｔａｉｌ）により移植後３、６、及び９日目に処置した。マウスを１８０日までの期間モニタリングした。後肢麻痺、悪液質、及び偶発的な（ｏｃｃａｓｉｏｎａｌ）大きい局所的な腫瘍塊を含む疾患の兆候を示すマウスをＣＯ2窒息により安楽死させた。無症状生存曲線をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して作図した（図１）。結果を無症状生存時間の関数として生存パーセントとして表す。これらの結果は、ａｂ １０Ｆ２−１３が動物モデルにおいて生存時間を約２０日（ｈＦｃコントロール処置動物）から約１８０日（生存率において９倍より多い増加）（処置された動物の５０％は約２０日（ｈＦｃコントロール）、約４０日（コントロールＩ）、約８５日（コントロールＩＩ）まで、及び１８０日より多く（１０Ｆ２−１３）有意に増加させた。これらの増加した生存時間は、少なくとも２倍より大きい（コントロールＩＩと比較して）か、約４．５倍大きい（コントロールＩと比較して）か、又はｈＦｃ処置動物と比較して少なくとも約９倍又はそれ以上である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、そして約５ｎＭ又はそれ以下の抗体濃度で補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を誘導することができ、そしてヒトリンパ腫のマウスモデルにおいてコントロールで処置された動物と比較して無症状生存時間を約２倍から約９倍の間に増加することができる、ヒト抗体又は抗体の抗原結合フラグメントであって、該抗体又は抗体フラグメントは、重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）及び軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、ここでＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３は配列番号３４５及び３５３；２０１及び２０９；並びに２４９及び２５７からなる群より選択される、ヒト抗体又は抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、そして約５ｎＭ又はそれ以下の抗体濃度で補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を誘導することができる、ヒト抗体又は抗体の抗原結合フラグメントであって、該抗体又はそのフラグメントは、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列を含み、ここでＨＣＶＲ配列及びＬＣＶＲ配列は、配列番号３３９及び３４７；１９５及び２０３；並びに２４３及び２５１からなる群より選択される、ヒト抗体又は抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ＣＤＣを誘導するために必要な抗体濃度が１ｎＭ又はそれ以下である、請求項１又は２に記載のヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４】
Ｄａｕｄｉ細胞で測定した場合に０．２ｎＭ若しくはそれ以下のＥＣ50、又はＲＬ細胞で測定した場合に０．４ｎＭ若しくはそれ以下のＥＣ50を示すことをさらに特徴とする、請求項３に記載のヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ヒトＣＤ２０に結合し、そしてＲＬ細胞又はＤａｕｄｉ細胞で測定した場合に約５ｎＭ又はそれ以下の抗体濃度で補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を誘導することができ、重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）ドメイン及び軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む、ヒト抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
ＨＣＤＲ３ドメインが式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｘ16−Ｘ17−Ｘ18−Ｘ19（配列番号４１２）［式中、Ｘ1＝Ａ、Ｖ又はＴ；Ｘ2＝Ｋ；Ｘ3＝Ｄ；Ｘ4＝Ｐ、Ｆ又はＧ；Ｘ5＝Ｓ又はＨ；Ｘ6＝Ｙ；Ｘ7＝Ｇ；Ｘ8＝Ｓ又はＨ；Ｘ9＝Ｇ又はＦ；Ｘ10＝Ｓ又はＹ；Ｘ11＝Ｙ、Ｎ又はＳ；Ｘ12＝Ｙ、Ｇ又はＨ；Ｘ13＝Ｇ、Ｌ又はＳ；Ｘ14＝Ｙ、Ｍ又はＤ；Ｘ15＝Ｙ、Ｄ又はＶ；Ｘ16＝Ｇ、Ｖ又は存在しない；Ｘ17＝Ｍ又は存在しない；Ｘ18＝Ｄ又は存在しない；Ｘ19＝Ｖ又は存在しない］のアミノ酸配列を含み；そして
ＬＣＤＲ３ドメインが、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9（配列番号４１５）、［式中、Ｘ1＝Ｑ；Ｘ2＝Ｑ；Ｘ3＝Ｒ又はＳ；Ｘ4＝Ｎ、Ｙ又はＦ；Ｘ5＝Ｎ、Ｄ、又はＹ；Ｘ6＝Ｗ；Ｘ7＝Ｐ；Ｘ8＝Ｌ；Ｘ9＝Ｔ］のアミノ酸配列を含む、ヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
細胞表面に提示された抗原に対する結合により測定された場合に、少なくとも１０-11ＭのＫD又はＥＣ50を示すことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７】
請求項６に記載のヒト抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項９】
抗ヒトＣＤ２０抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを製造する方法であって、請求項８に記載の発現ベクターを、単離された宿主細胞に導入する工程、抗体又は抗体フラグメントの産生を可能にする条件下で細胞を培養する工程、及びこのようにして産生された抗体又は抗体フラグメントを回収する工程を含む、方法。
【請求項１０】
宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞、ＣＨＯ細胞、又はＣＯＳ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
【請求項１２】
ヒトにおいてＣＤ２０媒介疾患又は状態を軽減又は抑制するための使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
処置される疾患又は状態が、非ホジキンリンパ腫、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性リンパ性白血病、及び炎症性疾患からなる群より選択される、請求項１２に記載の抗体又は抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ヒトにおいてＣＤ２０媒介疾患又は状態を軽減又は抑制する方法であって、治療有効量の請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを投与することを含む、方法。
【請求項１５】
ヒトにおいてＣＤ２０媒介疾患又は状態を軽減又は抑制するための使用のための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントの使用。
【請求項１６】
処置される疾患又は状態が、非ホジキンリンパ腫、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性リンパ性白血病、及び炎症性疾患である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１】
ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、そして約５ｎＭ又はそれ以下の抗体濃度で補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を誘導することができ、そしてヒトリンパ腫のマウスモデルにおいてコントロールで処置された動物と比較して無症状生存時間を約２倍から約９倍の間に増加することができる、ヒト抗体又は抗体の抗原結合フラグメントであって、該抗体又は抗体フラグメントは、重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）及び軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、ここでＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３は配列番号３４５及び３５３；２０１及び２０９；並びに２４９及び２５７からなる群より選択される、ヒト抗体又は抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、そして約５ｎＭ又はそれ以下の抗体濃度で補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を誘導することができる、ヒト抗体又は抗体の抗原結合フラグメントであって、該抗体又はそのフラグメントは、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列を含み、ここでＨＣＶＲ配列及びＬＣＶＲ配列は、配列番号３３９及び３４７；１９５及び２０３；並びに２４３及び２５１からなる群より選択される、ヒト抗体又は抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ＣＤＣを誘導するために必要な抗体濃度が１ｎＭ又はそれ以下である、請求項１又は２に記載のヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４】
Ｄａｕｄｉ細胞で測定した場合に０．２ｎＭ若しくはそれ以下のＥＣ50、又はＲＬ細胞で測定した場合に０．４ｎＭ若しくはそれ以下のＥＣ50を示すことをさらに特徴とする、請求項３に記載のヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ヒトＣＤ２０に結合し、そしてＲＬ細胞又はＤａｕｄｉ細胞で測定した場合に約５ｎＭ又はそれ以下の抗体濃度で補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を誘導することができ、重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）ドメイン及び軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む、ヒト抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
ＨＣＤＲ３ドメインが式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｘ16−Ｘ17−Ｘ18−Ｘ19（配列番号４１２）［式中、Ｘ1＝Ａ、Ｖ又はＴ；Ｘ2＝Ｋ；Ｘ3＝Ｄ；Ｘ4＝Ｐ、Ｆ又はＧ；Ｘ5＝Ｓ又はＨ；Ｘ6＝Ｙ；Ｘ7＝Ｇ；Ｘ8＝Ｓ又はＨ；Ｘ9＝Ｇ又はＦ；Ｘ10＝Ｓ又はＹ；Ｘ11＝Ｙ、Ｎ又はＳ；Ｘ12＝Ｙ、Ｇ又はＨ；Ｘ13＝Ｇ、Ｌ又はＳ；Ｘ14＝Ｙ、Ｍ又はＤ；Ｘ15＝Ｙ、Ｄ又はＶ；Ｘ16＝Ｇ、Ｖ又は存在しない；Ｘ17＝Ｍ又は存在しない；Ｘ18＝Ｄ又は存在しない；Ｘ19＝Ｖ又は存在しない］のアミノ酸配列を含み；そして
ＬＣＤＲ３ドメインが、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9（配列番号４１５）、［式中、Ｘ1＝Ｑ；Ｘ2＝Ｑ；Ｘ3＝Ｒ又はＳ；Ｘ4＝Ｎ、Ｙ又はＦ；Ｘ5＝Ｎ、Ｄ、又はＹ；Ｘ6＝Ｗ；Ｘ7＝Ｐ；Ｘ8＝Ｌ；Ｘ9＝Ｔ］のアミノ酸配列を含む、ヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
細胞表面に提示された抗原に対する結合により測定された場合に、少なくとも１０-11ＭのＫD又はＥＣ50を示すことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７】
請求項６に記載のヒト抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項９】
抗ヒトＣＤ２０抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを製造する方法であって、請求項８に記載の発現ベクターを、単離された宿主細胞に導入する工程、抗体又は抗体フラグメントの産生を可能にする条件下で細胞を培養する工程、及びこのようにして産生された抗体又は抗体フラグメントを回収する工程を含む、方法。
【請求項１０】
宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞、ＣＨＯ細胞、又はＣＯＳ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
【請求項１２】
ヒトにおいてＣＤ２０媒介疾患又は状態を軽減又は抑制するための使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
処置される疾患又は状態が、非ホジキンリンパ腫、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性リンパ性白血病、及び炎症性疾患からなる群より選択される、請求項１２に記載の抗体又は抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ヒトにおいてＣＤ２０媒介疾患又は状態を軽減又は抑制する方法であって、治療有効量の請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを投与することを含む、方法。
【請求項１５】
ヒトにおいてＣＤ２０媒介疾患又は状態を軽減又は抑制するための使用のための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントの使用。
【請求項１６】
処置される疾患又は状態が、非ホジキンリンパ腫、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性リンパ性白血病、及び炎症性疾患である、請求項１５に記載の使用。
【図１】
【公表番号】特表２０１０−５３５０３３（Ｐ２０１０−５３５０３３Ａ）
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２０１８０（Ｐ２０１０−５２０１８０）
【出願日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７１７０９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１８４１１
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（５９７１６０５１０）リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (50)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７１７０９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１８４１１
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（５９７１６０５１０）リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (50)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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