ピメクロリムスの合成の化学酵素的アプローチ
アスコマイシンの２４位および３３位に存在するヒドロキシル基の選択的官能基化に特に関する精製された酵素系の選択性の特性を利用して、アスコマイシンから出発するピメクロリムスを調製するための方法。かかる方法は、ピメクロリムスを調製するための化学酵素合成の初めての例を表す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピメクロリムス（pimecrolimus）を調製するための化学酵素合成方法に関する。
【０００２】
ピメクロリムス（登録番号１３７０７１−３２−０、図１）は、抗炎症性、抗増殖性および免疫抑制の特性を有するマクロリドである。この物質は、ヨーロッパおよびアメリカ合衆国で最近承認された、アトピー性皮膚炎などの皮膚の炎症状態の局所的治療のための薬品、エリデル（Ｅｌｉｄｅｌ）（登録商標）中に有効成分として存在する。
【０００３】
【化１】
【背景技術】
【０００４】
ピメクロリムスの調製は、特許出願、サンド（Ｓａｎｄｏｚ）を代表とする特許文献１に初めて記載された。かかる文献において原料として使用されているのは、アスコマイシン（登録番号１１０１１−３８−４によって同定される化合物）、すなわちストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株から発酵によって得られた天然物（例えば、ストレプトミセスハイグロスコピクス変種アスコミセチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ ａｓｃｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）、またはストレプトミセスハイグロスコピクスツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＮO９９９３など）である。ピメクロリムスは、アスコマイシンから、合成の一連の４つのステップによって得られる（スキーム１）。
【０００５】
【化２】
【０００６】
構造の観点から、ピメクロリムスは、アスコマイシンの３３−エピ−クロロ誘導体である。特許文献１に記載の通り、アスコマイシンの構造中に、２４位および３３位に２個の二級ヒドロキシル基が同時に存在するので、２４位のヒドロキシルを保護してから、塩素の原子で３３位の第２のヒドロキシルを置換する必要がある。
【０００７】
アスコマイシンの２４位のヒドロキシルのモノ保護（monoprotection）を得るために、かかる合成方法は、２４，３３−ジシリル誘導体の調製および３３位のシリルエステルの引き続いての選択的な除去を提供する。
【０００８】
シリル化剤と基質との高い割合および脱保護の引き続いてのステップの完全でない選択性により、シリカゲルのカラムでの２つのクロマトグラフィー精製を実行する必要がある（非特許文献１参照。）。
【０００９】
かかる合成方法の一般的な収率は、文献に示されておらず、本出願者による実験は、かかる収率がアスコマイシンから出発して約１６％モルに達することを明らかにした。
【００１０】
その他の合成方法が、特許文献１の合成の代替の方法として最近、提案された。
【００１１】
特に、Ｎｏｖａｒｔｉｓを代表とする国際特許出願、特許文献２は、塩素の原子でのアスコマイシンの３３位のヒドロキシルの直接的な置換を提供し、Ｔｅｖａを代表とする国際特許出願、特許文献３に記載された第２の代替方法は、アスコマイシンの３３位のスルホン酸塩誘導体を、合成の中間体として使用する。
【００１２】
特許文献２においては、提案されたハロゲン化剤（クロロホスホランおよびＮ−クロロスクシンイミド）が、同著者らによると、３３位のヒドロキシル官能基を位置選択的に置換することができない、また特許文献３においては、得られた生成物の品質の特徴が、クロマトグラフィー精製および／または結晶化の後でさえも、医薬品用に使用される生成物にとって低い（すなわち実験の部分に記載されている通り、純度９６％）という点で、提案された合成の代替方法は両方とも、完全には満足できない。
【００１３】
一般に、精製された酵素系は、多官能性の分子の有機合成のために使用されてよい（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）、特許文献４参照。）。
【００１４】
特許文献５および特許文献６は、カンジダ・アンタルチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｔｉｃａ）由来のリパーゼの存在下での、４２位のラパマイシンのアシル化を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＥＰ４２７６８０
【特許文献２】国際公開第２００６０４０１１１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００６０６０６１４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００６０２４５８２号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００７１０３３４８号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００５１０５８１１号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Baumann K., Bacher M., Damont A., Hogenauer K., Steck A． Tetrahedron, (2003), 59, 1075-1087
【非特許文献２】Wang Y-F, Wong C-H. J Org Chem (1988) 53, 3127-3129
【非特許文献３】Santaniello E., Ferraboschi P., Grisenti P., Manzocchi A. Chem. Rev. (1992), 92(5), 1071-140
【非特許文献４】Ferraboschi P., Casati S., De Grandi S., Grisenti P., Santaniello E. Biocatalysis (1994), 10(1-4), 279-88
【非特許文献５】Ferraboschi P., Grisenti P., Pengo D., Prestileo P,. Biocatalysis and Biotransformation (2006), 24(3), 209-213
【非特許文献６】Heldt-Hansen, Hans Peter; Ishii, Michiyo; Patkar, Shamkant A.; Hansen, Tomas T.; Eigtved, Peter.Novo Ind. A/S, Bagsvaerd, Den. ACS Symposium Series (1989), 389 (Biocatal. Agric. Biotechnol.), 158-72
【非特許文献７】Regent S.L., Lee D.P Journal of Organic Chemistry, (1975), 40, 1669-1670
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって、本発明の目的は、アスコマイシンの２４位および３３位に存在するヒドロキシル基の選択的官能基化の可能性に特に関する精製された酵素系の選択性の特性を利用して、アスコマイシンから出発するピメクロリムスを調製するための代替の方法である。かかる方法は、ピメクロリムスを調製するための化学酵素合成の初めての例を表す。
【発明の効果】
【００１８】
特に、本発明による方法は収率約３０％モルを有する、すなわち特許文献１に概説されている方法によって得ることができる収率より約８７．５％高い収率を有する、アスコマイシンから出発するピメクロリムスを得ることを可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の目的は、アスコマイシンの３３位または２４位のヒドロキシルの選択的な酵素的官能基化を含む、ピメクロリムスの代替の合成のための方法である。
【００２０】
例えばカンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、カンジダシリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のリパーゼ（ＣＣＬ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、ブタ膵臓（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ）由来のリパーゼ（ＰＰＬ、Ｅ．Ｃ．３．１．１３）およびシュードモナスセパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）由来のリパーゼ（ＰＦＬ、Ｅ．Ｃ．３．１．１３）などの市場で入手可能な酵素は、基質としてアスコマイシン２４，３３ジアセテート（スキーム３の化合物Ｖ）を使用する加水分解条件およびalcoho lysis条件下ならびに基質としてアスコマイシンを使用するエステル転移反応条件下の両方で実行された選別により評価された。
【００２１】
したがって、アスコマイシンの２４，３３−ジアセテート（diacetate）での加アルコール分解条件下で作用する、カンジダ・アンタルチカ（Candida antarticaＩ由来のリパーゼのみ、特にＣＡＬ Ｂが、対応するアスコマイシンの２４−モノアセテート（monoacetate）（スキーム３の化合物ＶＩ）を化学選択的にもたらすことが可能であると、驚いたことにわかったのとちょうど同じように、不可逆的なエステル転移反応条件（アシル化剤として酢酸ビニルおよび溶媒としてｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテルの使用を提供する条件）下で、カンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼ（市場で入手可能な遊離型酵素の形態で、またはポリマー樹脂上に固定された酵素として、後者の形態はまた、ＣＡＬ Ｂと呼ばれる）のみが、８０時間以内に定量的にアスコマイシンの３３位を選択的にアシル化することが可能であることが、驚いたことに発見された。
【００２２】
したがって、本発明の目的は、ピメクロリムスを調製するための方法であって、方法はアシル化および／またはカンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼによる酵素的加アルコール分解のステップを含むことを特徴とし、好ましくはカンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）からの前記リパーゼは、ＣＡＬ Ｂ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３．）である。
【００２３】
さらに、本発明の目的はピメクロリムスの合成の方法であって、アスコマイシンの３３位におけるエステル（好ましくは、Ｃ1〜Ｃ4エステル）の選択的な酵素的加アルコール分解、またはかかるエステルのシリル化された誘導体、さらに詳しくは３３−アシル−２４シリルアスコマイシンおよびカンジダ・アンタルチカ(Candida antartica)由来のリパーゼ、好ましくはリパーゼＣＡＬ Ｂ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３．）によって、２４位および３３位でジアセチル化されたアスコマイシンなどのそれらの誘導体の選択的な酵素的加アルコール分解のステップを含む。
【００２４】
かかる方法は、ピメクロリムスを調製するための化学酵素合成の初めての例を表す。文献に以前に記載された化学的な合成に対して、この方法は、アスコマイシンまたはアスコマイシンの誘導体などの多官能性の高分子において、極端ではない反応条件（例えばｐＨおよび温度）を使用して、したがって生成物それ自体の分解を最小化するという有利性を有する。
【００２５】
アスコマイシンの３３位および２４位に存在するヒドロキシル官能基の保護／脱保護を得るための、ポリマーのマトリックスに結合されたカンジダ・アンタルチカ(Candida antartica)由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ）の使用は、支持された酵素の使用が反応の後処理をかなり単純化するばかりでなく、数回の使用周期でのリパーゼの使用を可能にするという点で、この合成のさらなる有利性を表す。事実、支持されていないリパーゼとは違って、ＣＡＬ Ｂは、ほとんどの有機溶媒および水に不溶性であり、したがって単純な濾過による反応媒体からのリパーゼの容易な回収を可能にするばかりでなく、かかる種類の支持されたリパーゼは、酵素の活性の観点から、より安定的であることが知られている（非特許文献５、非特許文献６参照。）。
【００２６】
本発明の別の目的は、ピメクロリムスの合成のための方法であって、以下のステップ、ａ）アスコマイシンの３３位のヒドロキシルの選択的な酵素的アシル化のステップと、ｂ）対応する２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル中でのそのようにして得られた３３−アシル化された誘導体の転換のステップと、ｃ）ステップｂ）において調製された化合物の３３位のアシルを酵素的に除去（加アルコール分解）して、アスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを得るステップと、ｄ）塩素の原子で、アスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテルの３３のヒドロキシルを置換して、誘導体２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３３−エピ−クロロアスコマイシンを得るステップと、最後にｅ）２４位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテルの除去のステップとを含む。
【００２７】
特に、上記に示されたステップは、以下の通り実行される：
ａ）３３位のヒドロキシルでのアスコマイシンの化学選択的なエステル化反応は、ビニルエステルまたはＣ1〜Ｃ8トリフルオロエチルエステルのタイプの活性化されたエステル、好ましくはトリフルオロエチルアセテートまたは酢酸ビニルなどのアシル化剤の存在下で、例えばトルエン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ジクロロメタン、クロロホルムおよびｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル（butyldimethylether）などの０．５を超える分配係数（ｌｏｇＰ）を有する非プロトン性有機溶媒の中から選択された適切な有機溶媒中で、酵素としてカンジダ・アンタルチカ(Candida antartica)由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を特徴的に使用することによって実行される。かかるエステル化反応は、１５℃から５０℃の間に含まれる温度、好ましくは３０℃で撹拌しながら、０．１から１の間に含まれる、好ましくは０．４のアスコマイシンのｍｇとＣＡＬ Ｂのユニットとの相対比を使用して実行される。アスコマイシンと活性化されたエステルとの相対的モル比は、１から６の間に含まれ、好ましくは４．５である。かかるエステル転移の反応が実行される基質の濃度は、０．０１モルから０．１モルの間に含まれる。
【００２８】
ｂ）２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（butyldimethylsilylether）−３３−アシルアスコマイシン誘導体の調製反応は、例えばイミダゾール、ピリジンまたは２，６−ルチジンなどの有機塩基、好ましくは２，６−ルチジンの存在下で、１／２から１／７の間に含まれる、好ましくは１／５の相対的モル比で使用されるｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドまたはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフレートなどのシリル化剤の存在下で得られる。シリル化剤と有機塩基との相対的モル比は、１／１から１／４の間に含まれ、好ましくは１／３である。反応は、例えばジクロロメタンまたはテトラヒドロフランなどの非プロトン性有機溶媒中で実行され、０℃から４０℃の間に含まれる温度、好ましくは２５℃で、濃度範囲０．０２モル〜０．１５モル、好ましくは０．０４モルで作用する。
【００２９】
ｃ）アスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（butyldimethylsilylether）（中間体２４−シリル−３３−ＯＨ、スキーム２の化合物ＩＩＩ）を調製するための酵素反応、すなわち３３位の加アルコール分解反応は、酵素としてカンジダ・アンタルチカ(Candida antartica)由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を特徴的に使用して実行される。使用される有機溶媒は、Ｃ1〜Ｃ8第１級脂肪族アルコール、好ましくはｎ−オクタン−１−オールの存在下で、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（butylmethylether）、ジクロロメタンまたはトルエン、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルなどの０．５を超えるｌｏｇＰを有する非プロトン性溶媒の中から選択される。かかる加アルコール分解反応は、０．１から０．５の間に含まれる、好ましくは０．２５の、２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（butyldimethylsilylether）−３３−アセチルアスコマイシン誘導体のｍｇとＣＡＬ Ｂのユニットとの相対比を使用して実行され、１５℃から６０℃の間に含まれる温度、好ましくは４０℃で撹拌しながら作用する。基質と第１級脂肪族アルコールとの相対的モル比は、０．１から０．４の間に含まれ、好ましくは０．２である。反応は、０．０１モルから０．１モルの間に含まれる、好ましくは０．０２モルの基質の濃度で実行される。
【００３０】
ｄ）２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（butyldimethylsilylether）−３３−エピ−クロロアスコマイシン（中間体２４−シリル−３３−クロロ、スキーム２の化合物ＩＶ）の調製は、試薬としてジクロロ−トリフェニルホスホラン（triphenylphosphorane）またはＮ−クロロスクシンイミド（chlorosuccinimide）を特徴的に使用して実行され、試薬は、例えばトルエン、ｎ−ヘキサン、またはジクロロメタン、好ましくはトルエンなどの非プロトン性溶媒中で、１．２から１．８の間に含まれる、好ましくは１．６の基質との相対的モル比で使用される。実行されるのは、２５℃から８０℃の間に含まれる温度範囲で、好ましくは６０℃で、０．０５モルから０．１モルの間に含まれる、好ましくは０．０７モルの基質の濃度である。
【００３１】
ｅ）ピメクロリムス（pimecrolimus）を得るための２４位のｔｅｒｔ−ブチルシリルエーテル（butilsilyl ether）の除去は、酸触媒作用を用いて実行され、酸触媒作用は、フッ化水素酸（fluorhydric acid）もしくは塩酸などの一塩基の無機酸またはｐ−トルエンスルホン酸一水和物もしくはメタンスルホン酸、好ましくはｐ−トルエンスルホン酸一水和物などの有機酸を使用して、１：０．３から１：１の間に含まれる、好ましくは１：０．４の基質と酸とのモル比を使用して、２４時間から７２時間の間に含まれる反応時間をかけて、１５℃から４０℃の間に含まれる温度範囲、好ましくは２５℃で作用して得られてよい。かかる反応は、反応溶媒として、２／８から８／２の間に含まれる相対的な容積の比で使用される非プロトン性溶媒とプロトン性溶媒との混合物を使用することによって実行され、０．０５Ｍから０．２Ｍの間に含まれる基質のモル濃度で、好ましくは０．１２Ｍの濃度で作用する。かかるステップにおいて使用可能な非プロトン性溶媒の例は、ジクロロメタンおよび炭化水素または直鎖状のＣ5〜Ｃ7炭化水素もしくは分枝状のＣ5〜Ｃ7炭化水素の混合物、好ましくはジクロロメタンである。このステップにおいて使用可能なプロトン性溶媒の例は、直鎖のＣ1〜Ｃ4アルコールまたは分枝鎖のＣ1〜Ｃ4アルコール、好ましくはメタノールである。
【００３２】
上記の方法による好ましい合成は、以下のスキーム２に図式化されている。
【００３３】
【化３】
【００３４】
初期生成物、すなわちアスコマイシンにおいて実行されるのは、アシル化剤として酢酸ビニルおよび溶媒としてｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル（ＴＢＤＭＥ）を使用する、カンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ）によって触媒される不可逆的なエステル転移反応である。これによって、８０時間内で定量的に、アスコマイシンの３３位の選択的なアセチル化を得ることが可能になる。
【００３５】
得られた反応生成物（中間体アスコマイシン３３−ＯＡｃ、スキーム２の化合物Ｉ）は、いずれの精製も受けることなく、０．５時間内で、ジクロロメタンおよび２，６−ルチジン中でｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフレートによって、対応する２４−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテル（中間体２４−シリル−３３−ＯＡｃ、スキーム２の化合物ＩＩ）に転換され、収率７５％を有した。
【００３６】
シリカゲルでのクロマトグラフィー精製の後で、中間体２４−シリル−３３−ＯＡｃの３３位のアセテートは、加アルコール分解条件下でＣＡＬ Ｂをさらに使用して、すなわちｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル中でオクタン−１−オールを使用して除去され、アスコマイシンの２４−シリルエーテル誘導体（スキーム２の化合物ＩＩＩ）を生成し、８０％から１００％の間に含まれる収率を有した。
【００３７】
この中間体は、ジクロロトリフェニルホスホラン（dichlorotriphenylphosphorane）との反応によって、塩素の原子で３３位のヒドロキシルを置換して、最終生成物に転換された。中間体２４−シリル−３３−クロロ（スキーム２の化合物ＩＶ）は、クロマトグラフィー精製の後で得られた。
【００３８】
最後に、ジクロロメタン／メタノール中でｐ−トルエンスルホン酸一水和物を使用する、２４位のシリルエーテルの除去は、アスコマイシンから出発するピメクロリムスを得ることを可能にし、全体の収率約３０％モルを有する。
【００３９】
したがって、以前に記載されたピメクロリムスの合成より高い収率、特に、特許文献１に記載の方法によって得ることができる収率より８７．５％高い収率がある。事実、特許文献１に概説された記載に関する、本願出願人によって実行された実験的な試験は、比較例４に示した通り、全体の転換収率１６％を確認した。とりわけ、方法の全体の収率を特に不利にするのは、前述の特許の実施例１ｂおよび４７（４５％〜５０％収率）に記載された条件下で実行された２４位および３３位のｔｅｒ−ブチルジメチルシリルエーテル（butyldimethylsilylether）基の脱保護のための停止、ならびに実施例１（５０％〜６０％収率）に記載されたハロゲン化であった。化合物２４−シリル−３３−ＯＡｃ（スキーム２の化合物ＩＩ）、すなわち化合物２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３３−アセチル−アスコマイシンは、文献に一度も記載されていない化合物であり、その化合物は本発明で初めて合成され、特徴付けられた。
【００４０】
したがって、本発明のさらなる態様は、ピメクロリムスの酵素的合成方法において中間体として得られた、化合物２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３３−アセチル−アスコマイシンによって表される。
【００４１】
本発明の別の主題は、ピメクロリムスの合成における中間体としての、化合物２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３３−アセチル−アスコマイシンの使用にある。
【００４２】
本発明の別の目的は、ピメクロリムスの合成のための方法であって、以下のステップ、ａ’）２４位および３３位でアセチル化されたアスコマイシンを調製するステップと、ｂ’）３３位のアシルを酵素的に除去（加アルコール分解）して、２４位でモノアセチル化されたアスコマイシンを得るステップと、ｃ’）塩素の原子でアスコマイシンの３３のヒドロキシルを置換して、化合物２４−アセテート−３３−エピ−クロロアスコマイシンを得るステップと、ｄ’）２４位のアセテートの除去のステップとを含む。
【００４３】
特に、上記に示されたステップは、以下の通り実施される：
ａ’）アスコマイシン２４，３３−ジアセテート（中間体２４，３３ジアセテート、スキーム３の化合物Ｖ）の調製は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（dimethylaminopyridine;ＤＭＡＰ）の存在下で、３から６の間に含まれる、好ましくは４．５の基質との相対的モル比で、アシル化剤として塩化アセチルまたは無水酢酸を使用して特徴的に実行され、ＤＭＡＰは、１．０から１．２の間に含まれる、好ましくは１．０のアシル化剤との相対比で使用される。反応は、溶媒としてピリジンまたはトリエチルアミン、好ましくはピリジンなどの有機塩基を使用して実行され、０．０８モル〜０．５モルの間に含まれる、好ましくは０．１モルの基質の濃度で作用する。この反応の温度は、−５℃から２５℃の間に含まれ、好ましくは０℃の温度であってよい。
【００４４】
ｂ’）アスコマイシン２４，３３−ジアセテート（中間体２４，３３−ジアセテート）から出発する２４−アセチル−アスコマイシン（中間体２４−アセテート−３３−ＯＨ、スキーム３の化合物ＶＩ）を調製するための酵素反応（加アルコール分解）は、第１級Ｃ１〜Ｃ８脂肪族アルコール、好ましくはｎ−オクタン−１−オールの存在下で、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル(butylmethylether)、ジクロロメタンまたはトルエン、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル(butylmethylether)などの０．５を超えるｌｏｇＰを有する、非プロトン性溶媒の中から選択された適切な有機溶媒中で、酵素としてカンジダ・アンタルチカ(Candida antartica)由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ、（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３．））を特徴的に使用して実行される。かかる反応は、０．１から０．５の間に含まれる、好ましくは０．２３のアスコマイシン２４，３３−ジアセテートのｍｇとＣＡＬ Ｂのユニットとの相対比(relative ratio between mg of ascomycin 24,33-diacetate and units of CAL B)を使用して実行され、１５℃から６０℃の間に含まれる温度、好ましくは３０℃で撹拌しながら作用する。第１級脂肪族アルコールと基質との相対的モル比は、０．２から０．８の間に含まれ、好ましくは０．５である。反応は、０．０１モルから０．１モルの間に含まれる、好ましくは０．０２モル濃度の基質で実行される。
【００４５】
ｃ’）２４−アセチルアスコマイシンから出発する２４−アセチル−３３−エピ−クロロアスコマイシン（中間体２４−アセテート−３３−クロロ、スキーム３の化合物ＶＩＩ）の調製は、２．０から３．０の間に含まれる、好ましくは２．３の基質に対するモル比（トリフェニルホスフィン含有量で計算される）で、（スチレンとジビニルベンゼンとのコポリマー１ｇに付きトリフェニルホスフィン約３ミリモルの力価で）市場で入手可能な、ポリマーに担持されたトリフェニルホスフィンを使用して、特徴的に実行される。反応は、四塩化炭素のみ、または例えばトルエンもしくはキシレン、好ましくは四塩化炭素などの直鎖状のもしくは分枝状のＣ5〜Ｃ8脂肪族炭化水素もしくは直鎖状のもしくは分枝状のＣ5〜Ｃ8芳香族炭化水素などの別の非極性の非プロトン性有機溶媒の存在下でのヘキサクロロエタンなどのＣ1〜Ｃ2塩素化された溶媒中で実行され、０．０５モル濃度から０．２０モル濃度の間に含まれる、好ましくは０．１モル濃度の基質で、６０℃から８５℃の間に含まれる温度、好ましくは７７℃で作用する。
【００４６】
ｄ’）ピメクロリムスを得るための２４位のアセテートの除去は、酸触媒作用を使用して実行され、０．０５から０．２モル濃度の間に含まれる濃度で、例えば直鎖状のＣ1〜Ｃ8アルコールまたは分枝状のＣ1〜Ｃ8アルコール、好ましくはメタノールなどの極性のプロトン性溶媒中で、５℃から４０℃の間に含まれる温度範囲で作用する。このステップにおいて使用できる酸触媒は、フッ化水素酸（fluorhydric acidもしくは塩酸などの無機の一塩基酸または例えばｐ−トルエンスルホン酸一水和物（p-toluenesulfonic monohydrate acid）もしくはメタンスルホン酸などの有機酸、好ましくは塩酸であってよい。このステップにおける基質と最適な酸とのモル比は、１：５から１：２０の間に含まれ、好ましくは１：１３である。
【００４７】
有利なことに、ステップｃ’）の塩素の原子での３３位のヒドロキシルの置換反応における、支持されたトリフェニルホスフィンの使用は、合成のかかるステップの後処理のかなりの単純化を可能にし、実際に単純な濾過に低減される。かかる合成的修飾のさらなる有利性は、反応の終わりに回収された、支持された酸化されたトリフェニルホスフィンが、同じ方法において、トリクロロシラン（登録番号１００２５−７７８−２、非特許文献７参照。）を使用する再生の後で、再利用されてよいという事実にある。
【００４８】
上記の方法による合成は、以下のスキーム３に図式化される。
【００４９】
【化４】
【００５０】
上記の方法による好ましい合成は、０℃でのピリジン中での無水酢酸およびジメチルアミノピリジン（dimethylaminopyridine；ＤＭＡＰ）とのアスコマイシンの反応を提供する。２４，３３−ジアセテート誘導体は、１時間内で調製された（スキーム３の化合物Ｖ、９５％収率）。
【００５１】
この基質上ではまた、加アルコール分解条件下で作用するカンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）が、対応するアスコマイシンの２４−モノアセテート（スキーム３の化合物ＶＩ）を化学選択的にもたらすことが可能であることが、驚いたことに発見された。
【００５２】
したがって、アスコマイシンの２４，３３−ジアセテート（化合物Ｖ）は、オクタン−１−オールによるＣＡＬ Ｂからのｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル（butyldimethylether）（ＴＢＤＭＥ）への触媒された転換の間に、２４−モノアセテート（２４−アセテート−３３−ＯＨ、化合物ＶＩ）に転換された（５時間内で、１００％）。
【００５３】
３３位の塩素は、支持されたトリフェニルホスフィンおよび四塩化炭素との反応によって導入されて収率４０％を有し、中間体２４−アセテート−３３−クロロを得た（スキーム３の化合物ＶＩＩ）。
【００５４】
アスコマイシンの保護された２４位のヒドロキシル上に塩素を導入するための、文献に以前に記載されたトリフェニルホスフィンの使用の代替としての、合成のこのステップ中の支持されたトリフェニルホスフィンの使用は、同じ転換収率を考慮すると、反応の後処理をかなり単純化することを可能にし、後処理は、支持されたトリフェニルホスフィンの場合、反応混合物を単純に濾過するステップおよび真空下で濾過物を蒸発させるステップによって実行される。
【００５５】
かかる試薬はまた、同じ方法において、トリクロロシランによる再生の後で、再利用を可能にするという有利性を有する。
【００５６】
外界温度でのメタノール中での３Ｎ ＨＣｌによる２４位のアセテートの除去（収率４０％）は、参考試料と同一の特徴を有するピメクロリムスおよび全体の収率１３％を得た（スキーム３）。方法の中間体アスコマイシン２４，３３−ジアセテート（化合物Ｖ）、アスコマイシン２４−モノアセテート（化合物ＶＩ）およびアスコマイシン２４−アセテート−３３−エピ−クロロ（化合物ＶＩＩ）は、文献に記載されておらず、それらは、本発明において初めて合成され、特徴付けられた。
【００５７】
したがって、本発明のさらなる態様は、ピメクロリムスの酵素的合成方法における中間体として得られたアスコマイシン２４，３３−ジアセテート、アスコマイシン２４−モノアセテートおよびアスコマイシン２４−アセテート−３３−クロロ化合物によって表される。
【００５８】
本発明のその他の目的は、ピメクロリムスの使用、すなわち合成における中間体としてのアスコマイシン２４，３３−ジアセテート、アスコマイシン２４−モノアセテートおよびアスコマイシン２４−アセテート−３３−クロロ化合物の使用である。
【００５９】
以下の実施例は、何であれいかなる方法においても本発明を制限することなく、本発明を例証する。
【実施例】
【００６０】
材料および方法
以下の実施例において、1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）分析を、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭ５００の装置上で、デューテロクロロホルム中に記録した、そして表示されたスペクトル値は、ｐｐｍ（δ）であり、表示されたスペクトル値は、主要な異性体に特徴的なピークを示す。
【００６１】
ＩＲ分析を、ＡＴＲを備えたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＦＴ ＩＲ（フーリエ変換赤外分光分析装置；Ｍｏｄ．Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｎｅ）の装置上で記録した。偏光分析を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｍｏｄ．３４３）の装置上で実行した。質量スペクトルを、直接注入技術を使用するＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ Ｄｅｃａ Ｔｅｒｍｏｑｕｅｓｔ分光計装置（イオントラップ、ＥＳＩポジティブ）上で記録した。
【００６２】
表示された示差走査熱量測定（ＤＳＣ）値を、５℃／分の熱量で、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｍｏｄ．ＤＳＣ７）の装置上で記録した。カンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ ２Ｕ／ｍｇ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、カンジダシリンドラセア（Candida cylindracea）由来のリパーゼ（ＣＣＬ １５〜２５Ｕ／ｍｇ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、ブタ膵臓由来のリパーゼ（ＰＰＬ ≧２００Ｕ／ｍｇ、Ｅ．Ｃ．３．１．１３）、シュードモナスセパシア（seudomonas cepacia）由来のリパーゼ（ＰＦＬ ５０Ｕ／ｍｇ、Ｅ．Ｃ．３．１．１３）および支持されたトリフェニルホスフィン（トリフェニルホスフィンの約３．２ミリモル／ｇ）を、Ｆｌｕｋａから取得した。合成の初期試薬として使用されたアスコマイシンは、Ｐｏｌｉ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ Ｃｈｉｍｉｃａ ＳｐＡ，Ｑｕｉｎｔｏ ｄｅ Ｓｔａｍｐｉ，Ｒｏｚｚａｎｏ（ＭＩ），Ｉｔａｌｙによって調製された。
【００６３】
（実施例１）
アスコマイシンの３３−アセチル誘導体（スキームＩＩの化合物Ｉ）の調製
カンジダアンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５）［０．１４０ｇ（２Ｕ／ｍｇ）ＦＬＵＫＡ］を、トルエン（８ｍｌ）および酢酸ビニル（４．５ｅｑ、０．４７３ｇ）中のアスコマイシン（１００ｍｇ、０．１２６ミリモル）の溶液に加えた。３０℃の温度で８０時間、撹拌しながら反応を維持し、次に酵素を濾過のために取り出し、濾過物を低圧で濃縮して、３３−アセチルアスコマイシン、１０５ｍｇを得る。
【００６４】
かかる中間体の試料を、分析の目的で、シリカゲルでのクロマトグラフィー（溶出剤として、ｎ−ヘキサン／アセトン＝８／２ｖ／ｖ）によって精製し、したがってアセトン／水によって結晶化した。
【００６５】
以下の分析を、かかる試料に実行した。1H-NMR (500MHz) δ: 2.10 (CH3CO), 3.92および4.70 (24CHおよび33CH); IR (cm-1): 3484.245, 2935.287, 1735.331, 1649.741, 1450.039,
1372.278; ＤＳＣ：１３４．２５℃で吸熱、［α］D＝−７４，０°（ｃ＝０．５ＣＨＣｌ3）。
ＭＳのスペクトル（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：８５６．４（Ｍ＋２３、１００．０％）
Ｃ45Ｈ71ＮＯ13のために計算された元素分析：Ｃ６４．８０％；Ｈ、８．５８％；Ｎ、１．６８％；Ｏ、２４．９４％
得られた元素分析：Ｃ６４．７８％；Ｈ、８．５４％；Ｎ、１．５９％；Ｏ、２４．８９％
【００６６】
アスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル−３３−アセチル誘導体（中間体２４−シリル−３３−Ｏａｃ、スキーム２の化合物ＩＩ）の調製
２，６−ルチジン（０．２９０ｇ、２．７ミリモル）およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフレート（０．２３８ｇ、０．９ミリモル）を、ジクロロメタン（５ｍｌ）中のアスコマイシンの３３−アセチル誘導体（１５０ｍｇ、０．１８ミリモル）の溶液に加える。外界温度で３０分間、撹拌しながら反応を放置する。この期間の後で、反応混合物を、炭酸水素ナトリウムで飽和させた溶液（５ｍｌ）によって洗浄し、得られた有機相をＨＣｌ、０．１Ｎ（５ｍｌ、３回）によって、およびＮａＣｌの３０％の溶液（５ｍｌ）によって、続けて洗浄する。有機相を硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、真空下で濃縮して残渣を生成し、生成物１２８ｍｇを得る。
【００６７】
ＭＳのスペクトル（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：９７０．５（Ｍ＋２３、１００．０％）
1H-NMR (500 MHz) δ: 0.05および0.06 ((CH3)2Si), 0.90 ((CH3)3C-Si), 2.10 (CH3CO), 4.70 (33CH)
IR (cm-1): 3462.948, 2934.450, 1739.236, 1649.937
Ｃ51Ｈ85ＮＯ13Ｓｉのために計算された元素分析：Ｃ６４．５９％；Ｈ、９．０３％；Ｎ、１．４８％；Ｏ、２１．９３％
得られた元素分析：Ｃ６４．５０％；Ｈ、９．０５％；Ｎ、１．４１％；Ｏ、２１．８８％
ＤＳＣ＝２３６．４３℃で内皮性（endoderma）。［α］D＝−８１，４°（ｃ＝０．５ＣＨＣｌ3）。
【００６８】
アスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（中間体２４−シリル−３３−ＯＨ、スキーム２の化合物ＩＩＩ）の調製
ｎ−オクタン−１−オール（０．０３５ｇ、０．２６５ミリモル）およびＣＡＬ Ｂ（Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５）［０．１００ｇ（２Ｕ／ｍｇ）ＦＬＵＫＡ］を、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（４ｍｌ）中のアスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル−３３−アセチル誘導体（５０ｍｇ、０．０５３ミリモル）の溶液に加える。４０℃の温度で１２０時間、撹拌しながら反応を維持する。この期間の後で、反応混合物を濾過し、濾過物を真空下で蒸発させて残渣を生成し、未加工の反応生成物を得て、その生成物をシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製し、生成物４４ｍｇ（０．０４８ミリモル）を石油エーテル／アセトン７／３による溶出によって回収する。
【００６９】
得られた生成物の化学的特性／物理的特性は、特許文献１によって得られた参考試料のそれらの特性に匹敵する。
【００７０】
２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル−３３−エピ−クロロアスコマイシン（中間体２４−シリル−３３−クロロ、スキーム２の化合物ＩＶ）の調製
無水トルエン（１．４リットル）およびピリジン（５０ｍｌ）中の２４−シリルＦＲ５２０、すなわち２４−シリルアスコマイシン（１６５ｇ、０．１８モル）の溶液を、不活性雰囲気において外界温度（２０℃〜２５℃）で撹拌しながら、無水トルエン（１．１リットル）中のジクロロトリフェニルホスホラン（dichlorotriphenylphosphorane）（９９．９５ｇ）の懸濁液に加える。
【００７１】
加えた後で、反応混合物を６０℃の温度で１時間、加熱する。この期間の後で、反応混合物の温度を２５℃に下げ、したがって有機相を水（１Ｌで１回）によって、および１０％のＮａＣｌの水溶液（各回１Ｌで４回）によって続けて洗浄し、次に有機相を硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、真空下で濃縮して、トルエンの湿潤固体約２５０ｇを得る。かかる残留物を、（存在するトルエンを除去するために）ｎ−ヘキサン（５００ｍｌ）によって再び取り出し、次に乾燥するまで蒸発させる。残留物を外界温度で約４５分間、撹拌しながらｎ−ヘキサン（５００ｍｌ）中で希釈し、次に溶解しなかった固体はｂｕｃｋｎｅｒ上での濾過のために取り出す（それは、ジクロロホスホランの副産物である）。
【００７２】
濾過物を低圧で濃縮して、固体１４８．６ｇを得て、この固体をシリカゲルでのクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／アセトン＝９／１での溶出）で引き続いて精製し、生成物１２３ｇ（０．１３モル）を得る。
【００７３】
得られた生成物の化学的／物理的特性は、文献（特許文献１）に記載されたそれらの特性に匹敵する。
【００７４】
２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル−３３−エピ−クロロアスコマイシンからのピメクロリムスの調製
中間体２４−シリル−３３−クロロ（１２３ｇ、０．１３モル、スキーム２の化合物ＩＶ）を、ジクロロメタン／メタノール混合物＝１／１＝ｖ／ｖ（１．１リットル）中に、外界温度で撹拌しながら溶解させ、次にｐ−トルエンスルホン酸一水和物（１０．１１ｇ）を加える。
【００７５】
２０℃〜２５℃の温度で７２時間、撹拌しながら反応を放置し、したがって水（６００ｍｌ）と炭酸水素ナトリウム（４．４６ｇ）との溶液を、反応混合物に加える。反応混合物を外界温度で１０分間、撹拌しながら維持し、次に有機相を調製し、塩化ナトリウムの１０％の水溶液（６００ｍｌ）によって洗浄する。
【００７６】
有機相を硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、真空下で濃縮して、未加工のピメクロリムス１１９ｇを得る。かかる原産物を、シリカゲルでのクロマトグラフィー（溶出剤として、ｎ−ヘキサン／アセトン）で精製し、そして酢酸エチル、シクロヘキサン／水によって結晶化して、精製ピメクロリムス６６ｇ（８１．５ミリモル）を得る。
【００７７】
得られた化学的／物理的データは、文献に示されたデータに匹敵する。
【００７８】
（実施例２）
アスコマイシン２４，３３−ジアセテート（中間体２４，３３−ジアセテート、スキーム３の化合物Ｖ）の調製
ＤＭＡＰ（４．５ｅｑ、０．１３６ｇ）および無水酢酸（４．５ｅｑ、０．１１４ｇ）を、０℃の温度で撹拌しながら、ピリジン（２．５ｍｌ）中のアスコマイシン（２００ｍｇ、０．２５ミリモル）の溶液に加える。
【００７９】
１．５時間、０℃の温度で撹拌しながら反応を維持し、次にそれを水によって希釈し、それを酢酸エチル（５ｍｌで３回）によって抽出する。有機抽出物をＨＣｌ、０．５Ｎ（１０ｍｌで５回）によって洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で無水化し、真空下で濃縮する。
【００８０】
残留物をシリカゲルでのクロマトグラフィー（溶出剤として、ｎ−ヘキサン／アセトン８／２ｖ／ｖ）で精製して、アスコマイシン２４，３２−ジアセテート（２１０ｍｇ、０．２４ミリモル）を得た。
【００８１】
本発明者らは、かかる精製された試料への以下の分析を実行した。
1H-NMR (500 MHz) δ: 2.02および2.06 (2 CH3CO), 5.20および4.70 (24CHおよび33CH);
IR (cm-1): 3462.749, 2935.824, 1734.403, 1650.739, 1449.091, 1371.079.
ＤＳＣ：２３４．１０℃で吸熱のピーク、［α］D＝−１００．０°（Ｃ＝０．５ＣＨＣｌ3）。
ＭＳのスペクトル（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：８９８．４（１００．０％、Ｍ＋２３）。
Ｃ47Ｈ73ＮＯ14のために計算された元素分析：Ｃ６４．４４％；Ｈ８．４０％；Ｎ１．６０％；Ｏ２５．５７％
得られた元素分析：Ｃ６４．５５％；Ｈ８．４４％；Ｎ１．６１％；Ｏ２５．４０％
【００８２】
２４−アセチルアスコマイシン（中間体２４−アセテート−３３−ＯＨ、スキーム３の化合物ＶＩ）の調製
カンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５）［１．１ｇ（２Ｕ／ｍｇ）ＦＬＵＫＡ］を、ＴＢＤＭＥ（２５ｍｌ）およびｎ−オクタン−１−オール（４．５ｅｑ、０．３７１ｇ）中のアスコマイシン３３，２４−ジアセテート（５００ｍｇ、０．５７ミリモル）の溶液に加える。３０℃で１００時間、撹拌しながら反応を維持し、次に酵素を濾過のために取り出し、得られた濾過物を低圧下で濃縮して、生成物４２５ｍｇ（０．５１ミリモル）を得る。
【００８３】
試料を、分析の目的で、シリカゲルでのクロマトグラフィー（溶出剤として、ｎ−ヘキサン／アセトン＝７：３ｖ／ｖ）によって精製し、したがってアセトン／水によって結晶化した。
【００８４】
本発明者らは、かかる精製された試料への以下の分析を実行した。1H-NMR (500MHz) δ: 2.05 (CH3CO); IR (cm-1): 3491.528, 2935.860, 1744.728, 1710.227, 1652.310, 1448.662, 1371.335. ＤＳＣ：１３４．６８℃で吸熱のピーク、Ｃ；［α］D＝−１０２．７°（ｃ＝０．５ＣＨＣｌ3）
ＭＳのスペクトル（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：８５６．４（Ｍ＋２３、１００．０％）
Ｃ45Ｈ71ＮＯ13のために計算された元素分析：Ｃ６４．８０％；Ｈ、８．５８％；Ｎ、１．６８％；Ｏ、２４．９４％
得られた元素分析：Ｃ６４．７１％；Ｈ、８．４９％；Ｎ、１．６０％；Ｏ、２４．９７％
【００８５】
２４−アセチル−３３エピ−クロロアスコマイシン（中間体２４−アセテート−３３−クロロ、スキーム３の化合物ＶＩＩ）の調製
支持されたトリフェニルホスフィン（０．３３５ｇ、１．１ミリモル）を、四塩化炭素（５ｍｌ）中の２４−アセチルアスコマイシン（４００ｍｇ、０．４８ミリモル）の溶液に加える。反応混合物を３時間、還流下で維持し、次に反応混合物を外界温度で冷却する。得られた懸濁液を濾過し、濾過物を真空下で濃縮して残渣を生成し、反応原産物０．４５ｇを得て、この生成物をシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製し、生成物１６３ｍｇ（０．１９ミリモル）を、石油エーテル／アセトン＝９０／１０による溶出によって得る。
1H-NMR δ: 2.08 (CH3CO); 4.60 (33CH); IR (cm-1)= 3464.941, 2934.360, 1738.993, 1650.366, 1450.424, 1371.557; ＤＳＣ：２３１．６７℃で吸熱のピーク、［α］D＝−７５．２°（ｃ＝０．５ＣＨＣｌ3）
ＭＳのスペクトル（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：８７４．３（Ｍ＋２３、１００．０％）
Ｃ45Ｈ70ＣｌＮＯ12のために計算された元素分析：Ｃ６３．４０％；Ｈ、８．２８％；Ｃｌ、４．１６％；Ｎ、１．６４％；Ｏ、２２．５２％
得られた元素分析：Ｃ６３．３１％；Ｈ、８．３０％；Ｃｌ、４．０５％；Ｎ、１．５８％；Ｏ、２２．４２％。
【００８６】
２４−アセチル−３３−エピ−クロロアスコマイシンからのピメクロリムスの調製
メタノール（２ｍｌ）およびＨＣｌ ３Ｎ（１ｍｌ）中の２４−アセチル−３３−エピ−クロロアスコマイシン（２００ｍｇ、０．２３ミリモル、化合物ＶＩＩ）の溶液を、外界温度で４０時間、撹拌する。この期間の後で、反応を重炭酸塩水溶液によって中和して、メタノールを真空下で蒸発させる。混合物をジクロロメタン（５ｍｌで３回）によって抽出し、硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、濃縮して残渣を生成し、残留物を得て、その残留物を、シリカゲルでのクロマトグラフィー（溶出剤としてｎ−ヘキサン／アセトン）によって精製し、そして酢酸エチル、シクロヘキサン／水によって結晶化して、精製されたピメクロリムス７８ｍｇ（０．０９６ミリモル）を得る。
【００８７】
得られた生成物の化学的／物理的特徴は、ピメクロリムスのための文献に示されたデータに匹敵する。
【００８８】
（実施例３）
リパーゼの選別：アスコマイシンでのエステル転移反応およびアスコマイシン３３，２４−ジアセテート（スキーム３の化合物Ｖ）での加アルコール分解
酵素反応の位置選択性を、1Ｈ−ＮＭＲ分析の使用によって判定した。アスコマイシンの２４，３３−ジアセテート（化合物Ｖ）ならびに２４−モノアセテートおよび３３−モノアセテート（それぞれ、スキーム３の化合物ＶＩおよびスキーム２の化合物Ｉ）は、文献において特徴付けられていない。記載されたアスコマイシンのエステルのみが、２４，３３−ジホルミエート（ｄｉｆｏｒｍｉａｔｅ）であり、この化合物のために、２４位および３３位のプロトンは、２つの特徴的な信号、それぞれ５．２２ｐｐｍおよび４．７１ｐｐｍを示す。
【００８９】
３３−モノアセテート（化合物Ｉ）のスペクトルに存在するのは、提案された構造に適合する３．９２ｐｐｍおよび４．７０ｐｐｍでの２つのピークである。
【００９０】
アスコマイシンの２４，３３−ジアセテート（化合物Ｖ）のスペクトルにおいて、かかるプロトンは、５．２０ｐｐｍおよび４．７０ｐｐｍになる。
【００９１】
２４−アセテート（化合物ＶＩ）のスペクトルにおいて、５．０ｐｐｍから５．４ｐｐｍの間の領域が改変され、ピークが４．７ｐｐｍで不在になることが観察される。
【００９２】
表１および表２は、エステル化（エステル転移反応）、加水分解および加アルコール分解において、アスコマイシンおよびアスコマイシン３３，２４−ジアセテート（化合物Ｖ）上で実行された酵素反応に関する実験データを要約している。
【００９３】
【表１】
【００９４】
【表２】
【００９５】
（実施例４）
（比較）
特許文献１に記載されたピメクロリムスの合成の方法の検証
イミダゾール（５０８ｍｇ）およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１．１２５ｇ）を、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍｌ）中のアスコマイシン２ｇ（２．５３ミリモル）の溶液に、分けて加える。反応混合物を外界温度で４．５日間、撹拌しながら維持する。酢酸エチル（２００ｍｌ）によって混合物を希釈し、水（５ｘ１００ｍｌ）を使用して反応物を処理し、反応をそのようにして処理する。有機相を分離し、硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、真空下で蒸発させて残渣を生成し、泡沫状の原産物を得て、生成物をシリカゲルでのクロマトグラフィー（１：３０ｐ／ｐ）によって、引き続いて精製する。アスコマイシン２４，３３ジシリル中間体２．１ｇ（２．０５ミリモル、収率８１％モル）を、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル３／１による溶出によって得る。かかる中間体の化学的／物理的データは、特許文献１に示されたデータに匹敵する。
【００９６】
アスコマイシン２４，３３ジシリル中間体２．１ｇ（２．０５ミリモル）を、０℃の温度で撹拌しながら、アセトニトリル（４２ｍｌ）および水性ＨＦ４０％（２３．１ｍｌ）からなる溶液中に溶解させる。反応混合物を０℃の温度で２時間、撹拌しながら維持し、次にその反応混合物をジクロロメタン（３０ｍｌ）によって希釈する。次に、反応物を、炭酸水素ナトリウム（３０ｍｌ）および水（３０ｍｌ）を使用する飽和水溶液によって、引き続いて洗浄する。分離された有機相を硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、真空下で蒸発させて残渣を生成し、泡沫状の残渣を得て、その残渣を引き続いてシリカゲルでのクロマトグラフィー（１：３０ｐ／ｐ）によって精製し、アスコマイシン２４モノシリル中間体８３９ｍｇ（０．９２ミリモル、収率４５％モル）を、ジクロロメタン／メタノール９／１による溶出によって得る。かかる中間体の化学的／物理的データは、スキーム２の化合物ＩＩＩで得られたデータに匹敵し、特許文献１に示された文献のデータに匹敵する。
【００９７】
四塩化炭素（３６．４ｍｌ）中のアスコマイシン２４モノシリル中間体８３９ｍｇ（０．９２ミリモル、収率４５％モル）、トリフェニルホスフィン（３３７ｍｇ）の混合物を、還流下で１５時間、撹拌しながら加熱する。この期間の後で、反応混合物を真空下で蒸発させて残渣を生成し、シリカゲルでのクロマトグラフィー（１：３０ｐ／ｐ）によって精製された固体生成物を得て、アスコマイシン２４モノシリル中間体、３３−クロロ誘導体５３５ｍｇ（０．５７ミリモル、収率６３％モル）を、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル２／１による溶出によって得る。かかる中間体の化学的／物理的データは、本発明者らがスキーム２の化合物ＩＶで得たデータに匹敵し、特許文献１に示された文献のデータに匹敵する。
【００９８】
アスコマイシン２４モノシリル中間体、３３−クロロ誘導体５３５ｍｇ（０．５７ミリモル）を、アセトニトリル（１６．４ｍｌ）および水性ＨＦ４０％（０．４４ｍｌ）中に、外界温度で撹拌しながら溶解させる。反応混合物を外界温度で４５分間（４５’）、撹拌しながら維持し、次にその反応混合物を、酢酸エチル（１００ｍｌ）によって希釈する。したがって、有機相を炭酸水素ナトリウムの水溶液（７０ｍｌ）によって、水によって（２ｘ７０ｍｌ）引き続いて洗浄し、したがって、有機相を硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、真空下で蒸発させて、固体を得て、その固体をシリカゲルでのクロマトグラフィー（１：３０ｐ／ｐ）によって引き続いて精製し、ピメクロリムス３２３ｍｇ（０．３９９ミリモル、収率７０％モル）を、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル２／３による溶出によって得る。得られた生成物の化学的／物理的特徴は、ピメクロリムスに関する文献に示されたデータに匹敵し、方法の全体の収率は、１６％である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピメクロリムス（pimecrolimus）を調製するための化学酵素合成方法に関する。
【０００２】
ピメクロリムス（登録番号１３７０７１−３２−０、図１）は、抗炎症性、抗増殖性および免疫抑制の特性を有するマクロリドである。この物質は、ヨーロッパおよびアメリカ合衆国で最近承認された、アトピー性皮膚炎などの皮膚の炎症状態の局所的治療のための薬品、エリデル（Ｅｌｉｄｅｌ）（登録商標）中に有効成分として存在する。
【０００３】
【化１】
【背景技術】
【０００４】
ピメクロリムスの調製は、特許出願、サンド（Ｓａｎｄｏｚ）を代表とする特許文献１に初めて記載された。かかる文献において原料として使用されているのは、アスコマイシン（登録番号１１０１１−３８−４によって同定される化合物）、すなわちストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株から発酵によって得られた天然物（例えば、ストレプトミセスハイグロスコピクス変種アスコミセチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ ａｓｃｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）、またはストレプトミセスハイグロスコピクスツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＮO９９９３など）である。ピメクロリムスは、アスコマイシンから、合成の一連の４つのステップによって得られる（スキーム１）。
【０００５】
【化２】
【０００６】
構造の観点から、ピメクロリムスは、アスコマイシンの３３−エピ−クロロ誘導体である。特許文献１に記載の通り、アスコマイシンの構造中に、２４位および３３位に２個の二級ヒドロキシル基が同時に存在するので、２４位のヒドロキシルを保護してから、塩素の原子で３３位の第２のヒドロキシルを置換する必要がある。
【０００７】
アスコマイシンの２４位のヒドロキシルのモノ保護（monoprotection）を得るために、かかる合成方法は、２４，３３−ジシリル誘導体の調製および３３位のシリルエステルの引き続いての選択的な除去を提供する。
【０００８】
シリル化剤と基質との高い割合および脱保護の引き続いてのステップの完全でない選択性により、シリカゲルのカラムでの２つのクロマトグラフィー精製を実行する必要がある（非特許文献１参照。）。
【０００９】
かかる合成方法の一般的な収率は、文献に示されておらず、本出願者による実験は、かかる収率がアスコマイシンから出発して約１６％モルに達することを明らかにした。
【００１０】
その他の合成方法が、特許文献１の合成の代替の方法として最近、提案された。
【００１１】
特に、Ｎｏｖａｒｔｉｓを代表とする国際特許出願、特許文献２は、塩素の原子でのアスコマイシンの３３位のヒドロキシルの直接的な置換を提供し、Ｔｅｖａを代表とする国際特許出願、特許文献３に記載された第２の代替方法は、アスコマイシンの３３位のスルホン酸塩誘導体を、合成の中間体として使用する。
【００１２】
特許文献２においては、提案されたハロゲン化剤（クロロホスホランおよびＮ−クロロスクシンイミド）が、同著者らによると、３３位のヒドロキシル官能基を位置選択的に置換することができない、また特許文献３においては、得られた生成物の品質の特徴が、クロマトグラフィー精製および／または結晶化の後でさえも、医薬品用に使用される生成物にとって低い（すなわち実験の部分に記載されている通り、純度９６％）という点で、提案された合成の代替方法は両方とも、完全には満足できない。
【００１３】
一般に、精製された酵素系は、多官能性の分子の有機合成のために使用されてよい（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）、特許文献４参照。）。
【００１４】
特許文献５および特許文献６は、カンジダ・アンタルチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｔｉｃａ）由来のリパーゼの存在下での、４２位のラパマイシンのアシル化を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＥＰ４２７６８０
【特許文献２】国際公開第２００６０４０１１１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００６０６０６１４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００６０２４５８２号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００７１０３３４８号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００５１０５８１１号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Baumann K., Bacher M., Damont A., Hogenauer K., Steck A． Tetrahedron, (2003), 59, 1075-1087
【非特許文献２】Wang Y-F, Wong C-H. J Org Chem (1988) 53, 3127-3129
【非特許文献３】Santaniello E., Ferraboschi P., Grisenti P., Manzocchi A. Chem. Rev. (1992), 92(5), 1071-140
【非特許文献４】Ferraboschi P., Casati S., De Grandi S., Grisenti P., Santaniello E. Biocatalysis (1994), 10(1-4), 279-88
【非特許文献５】Ferraboschi P., Grisenti P., Pengo D., Prestileo P,. Biocatalysis and Biotransformation (2006), 24(3), 209-213
【非特許文献６】Heldt-Hansen, Hans Peter; Ishii, Michiyo; Patkar, Shamkant A.; Hansen, Tomas T.; Eigtved, Peter.Novo Ind. A/S, Bagsvaerd, Den. ACS Symposium Series (1989), 389 (Biocatal. Agric. Biotechnol.), 158-72
【非特許文献７】Regent S.L., Lee D.P Journal of Organic Chemistry, (1975), 40, 1669-1670
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって、本発明の目的は、アスコマイシンの２４位および３３位に存在するヒドロキシル基の選択的官能基化の可能性に特に関する精製された酵素系の選択性の特性を利用して、アスコマイシンから出発するピメクロリムスを調製するための代替の方法である。かかる方法は、ピメクロリムスを調製するための化学酵素合成の初めての例を表す。
【発明の効果】
【００１８】
特に、本発明による方法は収率約３０％モルを有する、すなわち特許文献１に概説されている方法によって得ることができる収率より約８７．５％高い収率を有する、アスコマイシンから出発するピメクロリムスを得ることを可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の目的は、アスコマイシンの３３位または２４位のヒドロキシルの選択的な酵素的官能基化を含む、ピメクロリムスの代替の合成のための方法である。
【００２０】
例えばカンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、カンジダシリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のリパーゼ（ＣＣＬ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、ブタ膵臓（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ）由来のリパーゼ（ＰＰＬ、Ｅ．Ｃ．３．１．１３）およびシュードモナスセパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）由来のリパーゼ（ＰＦＬ、Ｅ．Ｃ．３．１．１３）などの市場で入手可能な酵素は、基質としてアスコマイシン２４，３３ジアセテート（スキーム３の化合物Ｖ）を使用する加水分解条件およびalcoho lysis条件下ならびに基質としてアスコマイシンを使用するエステル転移反応条件下の両方で実行された選別により評価された。
【００２１】
したがって、アスコマイシンの２４，３３−ジアセテート（diacetate）での加アルコール分解条件下で作用する、カンジダ・アンタルチカ（Candida antarticaＩ由来のリパーゼのみ、特にＣＡＬ Ｂが、対応するアスコマイシンの２４−モノアセテート（monoacetate）（スキーム３の化合物ＶＩ）を化学選択的にもたらすことが可能であると、驚いたことにわかったのとちょうど同じように、不可逆的なエステル転移反応条件（アシル化剤として酢酸ビニルおよび溶媒としてｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテルの使用を提供する条件）下で、カンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼ（市場で入手可能な遊離型酵素の形態で、またはポリマー樹脂上に固定された酵素として、後者の形態はまた、ＣＡＬ Ｂと呼ばれる）のみが、８０時間以内に定量的にアスコマイシンの３３位を選択的にアシル化することが可能であることが、驚いたことに発見された。
【００２２】
したがって、本発明の目的は、ピメクロリムスを調製するための方法であって、方法はアシル化および／またはカンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼによる酵素的加アルコール分解のステップを含むことを特徴とし、好ましくはカンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）からの前記リパーゼは、ＣＡＬ Ｂ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３．）である。
【００２３】
さらに、本発明の目的はピメクロリムスの合成の方法であって、アスコマイシンの３３位におけるエステル（好ましくは、Ｃ1〜Ｃ4エステル）の選択的な酵素的加アルコール分解、またはかかるエステルのシリル化された誘導体、さらに詳しくは３３−アシル−２４シリルアスコマイシンおよびカンジダ・アンタルチカ(Candida antartica)由来のリパーゼ、好ましくはリパーゼＣＡＬ Ｂ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３．）によって、２４位および３３位でジアセチル化されたアスコマイシンなどのそれらの誘導体の選択的な酵素的加アルコール分解のステップを含む。
【００２４】
かかる方法は、ピメクロリムスを調製するための化学酵素合成の初めての例を表す。文献に以前に記載された化学的な合成に対して、この方法は、アスコマイシンまたはアスコマイシンの誘導体などの多官能性の高分子において、極端ではない反応条件（例えばｐＨおよび温度）を使用して、したがって生成物それ自体の分解を最小化するという有利性を有する。
【００２５】
アスコマイシンの３３位および２４位に存在するヒドロキシル官能基の保護／脱保護を得るための、ポリマーのマトリックスに結合されたカンジダ・アンタルチカ(Candida antartica)由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ）の使用は、支持された酵素の使用が反応の後処理をかなり単純化するばかりでなく、数回の使用周期でのリパーゼの使用を可能にするという点で、この合成のさらなる有利性を表す。事実、支持されていないリパーゼとは違って、ＣＡＬ Ｂは、ほとんどの有機溶媒および水に不溶性であり、したがって単純な濾過による反応媒体からのリパーゼの容易な回収を可能にするばかりでなく、かかる種類の支持されたリパーゼは、酵素の活性の観点から、より安定的であることが知られている（非特許文献５、非特許文献６参照。）。
【００２６】
本発明の別の目的は、ピメクロリムスの合成のための方法であって、以下のステップ、ａ）アスコマイシンの３３位のヒドロキシルの選択的な酵素的アシル化のステップと、ｂ）対応する２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル中でのそのようにして得られた３３−アシル化された誘導体の転換のステップと、ｃ）ステップｂ）において調製された化合物の３３位のアシルを酵素的に除去（加アルコール分解）して、アスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを得るステップと、ｄ）塩素の原子で、アスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテルの３３のヒドロキシルを置換して、誘導体２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３３−エピ−クロロアスコマイシンを得るステップと、最後にｅ）２４位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテルの除去のステップとを含む。
【００２７】
特に、上記に示されたステップは、以下の通り実行される：
ａ）３３位のヒドロキシルでのアスコマイシンの化学選択的なエステル化反応は、ビニルエステルまたはＣ1〜Ｃ8トリフルオロエチルエステルのタイプの活性化されたエステル、好ましくはトリフルオロエチルアセテートまたは酢酸ビニルなどのアシル化剤の存在下で、例えばトルエン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ジクロロメタン、クロロホルムおよびｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル（butyldimethylether）などの０．５を超える分配係数（ｌｏｇＰ）を有する非プロトン性有機溶媒の中から選択された適切な有機溶媒中で、酵素としてカンジダ・アンタルチカ(Candida antartica)由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を特徴的に使用することによって実行される。かかるエステル化反応は、１５℃から５０℃の間に含まれる温度、好ましくは３０℃で撹拌しながら、０．１から１の間に含まれる、好ましくは０．４のアスコマイシンのｍｇとＣＡＬ Ｂのユニットとの相対比を使用して実行される。アスコマイシンと活性化されたエステルとの相対的モル比は、１から６の間に含まれ、好ましくは４．５である。かかるエステル転移の反応が実行される基質の濃度は、０．０１モルから０．１モルの間に含まれる。
【００２８】
ｂ）２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（butyldimethylsilylether）−３３−アシルアスコマイシン誘導体の調製反応は、例えばイミダゾール、ピリジンまたは２，６−ルチジンなどの有機塩基、好ましくは２，６−ルチジンの存在下で、１／２から１／７の間に含まれる、好ましくは１／５の相対的モル比で使用されるｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドまたはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフレートなどのシリル化剤の存在下で得られる。シリル化剤と有機塩基との相対的モル比は、１／１から１／４の間に含まれ、好ましくは１／３である。反応は、例えばジクロロメタンまたはテトラヒドロフランなどの非プロトン性有機溶媒中で実行され、０℃から４０℃の間に含まれる温度、好ましくは２５℃で、濃度範囲０．０２モル〜０．１５モル、好ましくは０．０４モルで作用する。
【００２９】
ｃ）アスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（butyldimethylsilylether）（中間体２４−シリル−３３−ＯＨ、スキーム２の化合物ＩＩＩ）を調製するための酵素反応、すなわち３３位の加アルコール分解反応は、酵素としてカンジダ・アンタルチカ(Candida antartica)由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を特徴的に使用して実行される。使用される有機溶媒は、Ｃ1〜Ｃ8第１級脂肪族アルコール、好ましくはｎ−オクタン−１−オールの存在下で、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（butylmethylether）、ジクロロメタンまたはトルエン、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルなどの０．５を超えるｌｏｇＰを有する非プロトン性溶媒の中から選択される。かかる加アルコール分解反応は、０．１から０．５の間に含まれる、好ましくは０．２５の、２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（butyldimethylsilylether）−３３−アセチルアスコマイシン誘導体のｍｇとＣＡＬ Ｂのユニットとの相対比を使用して実行され、１５℃から６０℃の間に含まれる温度、好ましくは４０℃で撹拌しながら作用する。基質と第１級脂肪族アルコールとの相対的モル比は、０．１から０．４の間に含まれ、好ましくは０．２である。反応は、０．０１モルから０．１モルの間に含まれる、好ましくは０．０２モルの基質の濃度で実行される。
【００３０】
ｄ）２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（butyldimethylsilylether）−３３−エピ−クロロアスコマイシン（中間体２４−シリル−３３−クロロ、スキーム２の化合物ＩＶ）の調製は、試薬としてジクロロ−トリフェニルホスホラン（triphenylphosphorane）またはＮ−クロロスクシンイミド（chlorosuccinimide）を特徴的に使用して実行され、試薬は、例えばトルエン、ｎ−ヘキサン、またはジクロロメタン、好ましくはトルエンなどの非プロトン性溶媒中で、１．２から１．８の間に含まれる、好ましくは１．６の基質との相対的モル比で使用される。実行されるのは、２５℃から８０℃の間に含まれる温度範囲で、好ましくは６０℃で、０．０５モルから０．１モルの間に含まれる、好ましくは０．０７モルの基質の濃度である。
【００３１】
ｅ）ピメクロリムス（pimecrolimus）を得るための２４位のｔｅｒｔ−ブチルシリルエーテル（butilsilyl ether）の除去は、酸触媒作用を用いて実行され、酸触媒作用は、フッ化水素酸（fluorhydric acid）もしくは塩酸などの一塩基の無機酸またはｐ−トルエンスルホン酸一水和物もしくはメタンスルホン酸、好ましくはｐ−トルエンスルホン酸一水和物などの有機酸を使用して、１：０．３から１：１の間に含まれる、好ましくは１：０．４の基質と酸とのモル比を使用して、２４時間から７２時間の間に含まれる反応時間をかけて、１５℃から４０℃の間に含まれる温度範囲、好ましくは２５℃で作用して得られてよい。かかる反応は、反応溶媒として、２／８から８／２の間に含まれる相対的な容積の比で使用される非プロトン性溶媒とプロトン性溶媒との混合物を使用することによって実行され、０．０５Ｍから０．２Ｍの間に含まれる基質のモル濃度で、好ましくは０．１２Ｍの濃度で作用する。かかるステップにおいて使用可能な非プロトン性溶媒の例は、ジクロロメタンおよび炭化水素または直鎖状のＣ5〜Ｃ7炭化水素もしくは分枝状のＣ5〜Ｃ7炭化水素の混合物、好ましくはジクロロメタンである。このステップにおいて使用可能なプロトン性溶媒の例は、直鎖のＣ1〜Ｃ4アルコールまたは分枝鎖のＣ1〜Ｃ4アルコール、好ましくはメタノールである。
【００３２】
上記の方法による好ましい合成は、以下のスキーム２に図式化されている。
【００３３】
【化３】
【００３４】
初期生成物、すなわちアスコマイシンにおいて実行されるのは、アシル化剤として酢酸ビニルおよび溶媒としてｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル（ＴＢＤＭＥ）を使用する、カンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ）によって触媒される不可逆的なエステル転移反応である。これによって、８０時間内で定量的に、アスコマイシンの３３位の選択的なアセチル化を得ることが可能になる。
【００３５】
得られた反応生成物（中間体アスコマイシン３３−ＯＡｃ、スキーム２の化合物Ｉ）は、いずれの精製も受けることなく、０．５時間内で、ジクロロメタンおよび２，６−ルチジン中でｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフレートによって、対応する２４−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテル（中間体２４−シリル−３３−ＯＡｃ、スキーム２の化合物ＩＩ）に転換され、収率７５％を有した。
【００３６】
シリカゲルでのクロマトグラフィー精製の後で、中間体２４−シリル−３３−ＯＡｃの３３位のアセテートは、加アルコール分解条件下でＣＡＬ Ｂをさらに使用して、すなわちｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル中でオクタン−１−オールを使用して除去され、アスコマイシンの２４−シリルエーテル誘導体（スキーム２の化合物ＩＩＩ）を生成し、８０％から１００％の間に含まれる収率を有した。
【００３７】
この中間体は、ジクロロトリフェニルホスホラン（dichlorotriphenylphosphorane）との反応によって、塩素の原子で３３位のヒドロキシルを置換して、最終生成物に転換された。中間体２４−シリル−３３−クロロ（スキーム２の化合物ＩＶ）は、クロマトグラフィー精製の後で得られた。
【００３８】
最後に、ジクロロメタン／メタノール中でｐ−トルエンスルホン酸一水和物を使用する、２４位のシリルエーテルの除去は、アスコマイシンから出発するピメクロリムスを得ることを可能にし、全体の収率約３０％モルを有する。
【００３９】
したがって、以前に記載されたピメクロリムスの合成より高い収率、特に、特許文献１に記載の方法によって得ることができる収率より８７．５％高い収率がある。事実、特許文献１に概説された記載に関する、本願出願人によって実行された実験的な試験は、比較例４に示した通り、全体の転換収率１６％を確認した。とりわけ、方法の全体の収率を特に不利にするのは、前述の特許の実施例１ｂおよび４７（４５％〜５０％収率）に記載された条件下で実行された２４位および３３位のｔｅｒ−ブチルジメチルシリルエーテル（butyldimethylsilylether）基の脱保護のための停止、ならびに実施例１（５０％〜６０％収率）に記載されたハロゲン化であった。化合物２４−シリル−３３−ＯＡｃ（スキーム２の化合物ＩＩ）、すなわち化合物２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３３−アセチル−アスコマイシンは、文献に一度も記載されていない化合物であり、その化合物は本発明で初めて合成され、特徴付けられた。
【００４０】
したがって、本発明のさらなる態様は、ピメクロリムスの酵素的合成方法において中間体として得られた、化合物２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３３−アセチル−アスコマイシンによって表される。
【００４１】
本発明の別の主題は、ピメクロリムスの合成における中間体としての、化合物２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３３−アセチル−アスコマイシンの使用にある。
【００４２】
本発明の別の目的は、ピメクロリムスの合成のための方法であって、以下のステップ、ａ’）２４位および３３位でアセチル化されたアスコマイシンを調製するステップと、ｂ’）３３位のアシルを酵素的に除去（加アルコール分解）して、２４位でモノアセチル化されたアスコマイシンを得るステップと、ｃ’）塩素の原子でアスコマイシンの３３のヒドロキシルを置換して、化合物２４−アセテート−３３−エピ−クロロアスコマイシンを得るステップと、ｄ’）２４位のアセテートの除去のステップとを含む。
【００４３】
特に、上記に示されたステップは、以下の通り実施される：
ａ’）アスコマイシン２４，３３−ジアセテート（中間体２４，３３ジアセテート、スキーム３の化合物Ｖ）の調製は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（dimethylaminopyridine;ＤＭＡＰ）の存在下で、３から６の間に含まれる、好ましくは４．５の基質との相対的モル比で、アシル化剤として塩化アセチルまたは無水酢酸を使用して特徴的に実行され、ＤＭＡＰは、１．０から１．２の間に含まれる、好ましくは１．０のアシル化剤との相対比で使用される。反応は、溶媒としてピリジンまたはトリエチルアミン、好ましくはピリジンなどの有機塩基を使用して実行され、０．０８モル〜０．５モルの間に含まれる、好ましくは０．１モルの基質の濃度で作用する。この反応の温度は、−５℃から２５℃の間に含まれ、好ましくは０℃の温度であってよい。
【００４４】
ｂ’）アスコマイシン２４，３３−ジアセテート（中間体２４，３３−ジアセテート）から出発する２４−アセチル−アスコマイシン（中間体２４−アセテート−３３−ＯＨ、スキーム３の化合物ＶＩ）を調製するための酵素反応（加アルコール分解）は、第１級Ｃ１〜Ｃ８脂肪族アルコール、好ましくはｎ−オクタン−１−オールの存在下で、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル(butylmethylether)、ジクロロメタンまたはトルエン、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル(butylmethylether)などの０．５を超えるｌｏｇＰを有する、非プロトン性溶媒の中から選択された適切な有機溶媒中で、酵素としてカンジダ・アンタルチカ(Candida antartica)由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ、（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３．））を特徴的に使用して実行される。かかる反応は、０．１から０．５の間に含まれる、好ましくは０．２３のアスコマイシン２４，３３−ジアセテートのｍｇとＣＡＬ Ｂのユニットとの相対比(relative ratio between mg of ascomycin 24,33-diacetate and units of CAL B)を使用して実行され、１５℃から６０℃の間に含まれる温度、好ましくは３０℃で撹拌しながら作用する。第１級脂肪族アルコールと基質との相対的モル比は、０．２から０．８の間に含まれ、好ましくは０．５である。反応は、０．０１モルから０．１モルの間に含まれる、好ましくは０．０２モル濃度の基質で実行される。
【００４５】
ｃ’）２４−アセチルアスコマイシンから出発する２４−アセチル−３３−エピ−クロロアスコマイシン（中間体２４−アセテート−３３−クロロ、スキーム３の化合物ＶＩＩ）の調製は、２．０から３．０の間に含まれる、好ましくは２．３の基質に対するモル比（トリフェニルホスフィン含有量で計算される）で、（スチレンとジビニルベンゼンとのコポリマー１ｇに付きトリフェニルホスフィン約３ミリモルの力価で）市場で入手可能な、ポリマーに担持されたトリフェニルホスフィンを使用して、特徴的に実行される。反応は、四塩化炭素のみ、または例えばトルエンもしくはキシレン、好ましくは四塩化炭素などの直鎖状のもしくは分枝状のＣ5〜Ｃ8脂肪族炭化水素もしくは直鎖状のもしくは分枝状のＣ5〜Ｃ8芳香族炭化水素などの別の非極性の非プロトン性有機溶媒の存在下でのヘキサクロロエタンなどのＣ1〜Ｃ2塩素化された溶媒中で実行され、０．０５モル濃度から０．２０モル濃度の間に含まれる、好ましくは０．１モル濃度の基質で、６０℃から８５℃の間に含まれる温度、好ましくは７７℃で作用する。
【００４６】
ｄ’）ピメクロリムスを得るための２４位のアセテートの除去は、酸触媒作用を使用して実行され、０．０５から０．２モル濃度の間に含まれる濃度で、例えば直鎖状のＣ1〜Ｃ8アルコールまたは分枝状のＣ1〜Ｃ8アルコール、好ましくはメタノールなどの極性のプロトン性溶媒中で、５℃から４０℃の間に含まれる温度範囲で作用する。このステップにおいて使用できる酸触媒は、フッ化水素酸（fluorhydric acidもしくは塩酸などの無機の一塩基酸または例えばｐ−トルエンスルホン酸一水和物（p-toluenesulfonic monohydrate acid）もしくはメタンスルホン酸などの有機酸、好ましくは塩酸であってよい。このステップにおける基質と最適な酸とのモル比は、１：５から１：２０の間に含まれ、好ましくは１：１３である。
【００４７】
有利なことに、ステップｃ’）の塩素の原子での３３位のヒドロキシルの置換反応における、支持されたトリフェニルホスフィンの使用は、合成のかかるステップの後処理のかなりの単純化を可能にし、実際に単純な濾過に低減される。かかる合成的修飾のさらなる有利性は、反応の終わりに回収された、支持された酸化されたトリフェニルホスフィンが、同じ方法において、トリクロロシラン（登録番号１００２５−７７８−２、非特許文献７参照。）を使用する再生の後で、再利用されてよいという事実にある。
【００４８】
上記の方法による合成は、以下のスキーム３に図式化される。
【００４９】
【化４】
【００５０】
上記の方法による好ましい合成は、０℃でのピリジン中での無水酢酸およびジメチルアミノピリジン（dimethylaminopyridine；ＤＭＡＰ）とのアスコマイシンの反応を提供する。２４，３３−ジアセテート誘導体は、１時間内で調製された（スキーム３の化合物Ｖ、９５％収率）。
【００５１】
この基質上ではまた、加アルコール分解条件下で作用するカンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）が、対応するアスコマイシンの２４−モノアセテート（スキーム３の化合物ＶＩ）を化学選択的にもたらすことが可能であることが、驚いたことに発見された。
【００５２】
したがって、アスコマイシンの２４，３３−ジアセテート（化合物Ｖ）は、オクタン−１−オールによるＣＡＬ Ｂからのｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル（butyldimethylether）（ＴＢＤＭＥ）への触媒された転換の間に、２４−モノアセテート（２４−アセテート−３３−ＯＨ、化合物ＶＩ）に転換された（５時間内で、１００％）。
【００５３】
３３位の塩素は、支持されたトリフェニルホスフィンおよび四塩化炭素との反応によって導入されて収率４０％を有し、中間体２４−アセテート−３３−クロロを得た（スキーム３の化合物ＶＩＩ）。
【００５４】
アスコマイシンの保護された２４位のヒドロキシル上に塩素を導入するための、文献に以前に記載されたトリフェニルホスフィンの使用の代替としての、合成のこのステップ中の支持されたトリフェニルホスフィンの使用は、同じ転換収率を考慮すると、反応の後処理をかなり単純化することを可能にし、後処理は、支持されたトリフェニルホスフィンの場合、反応混合物を単純に濾過するステップおよび真空下で濾過物を蒸発させるステップによって実行される。
【００５５】
かかる試薬はまた、同じ方法において、トリクロロシランによる再生の後で、再利用を可能にするという有利性を有する。
【００５６】
外界温度でのメタノール中での３Ｎ ＨＣｌによる２４位のアセテートの除去（収率４０％）は、参考試料と同一の特徴を有するピメクロリムスおよび全体の収率１３％を得た（スキーム３）。方法の中間体アスコマイシン２４，３３−ジアセテート（化合物Ｖ）、アスコマイシン２４−モノアセテート（化合物ＶＩ）およびアスコマイシン２４−アセテート−３３−エピ−クロロ（化合物ＶＩＩ）は、文献に記載されておらず、それらは、本発明において初めて合成され、特徴付けられた。
【００５７】
したがって、本発明のさらなる態様は、ピメクロリムスの酵素的合成方法における中間体として得られたアスコマイシン２４，３３−ジアセテート、アスコマイシン２４−モノアセテートおよびアスコマイシン２４−アセテート−３３−クロロ化合物によって表される。
【００５８】
本発明のその他の目的は、ピメクロリムスの使用、すなわち合成における中間体としてのアスコマイシン２４，３３−ジアセテート、アスコマイシン２４−モノアセテートおよびアスコマイシン２４−アセテート−３３−クロロ化合物の使用である。
【００５９】
以下の実施例は、何であれいかなる方法においても本発明を制限することなく、本発明を例証する。
【実施例】
【００６０】
材料および方法
以下の実施例において、1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）分析を、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭ５００の装置上で、デューテロクロロホルム中に記録した、そして表示されたスペクトル値は、ｐｐｍ（δ）であり、表示されたスペクトル値は、主要な異性体に特徴的なピークを示す。
【００６１】
ＩＲ分析を、ＡＴＲを備えたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＦＴ ＩＲ（フーリエ変換赤外分光分析装置；Ｍｏｄ．Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｎｅ）の装置上で記録した。偏光分析を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｍｏｄ．３４３）の装置上で実行した。質量スペクトルを、直接注入技術を使用するＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ Ｄｅｃａ Ｔｅｒｍｏｑｕｅｓｔ分光計装置（イオントラップ、ＥＳＩポジティブ）上で記録した。
【００６２】
表示された示差走査熱量測定（ＤＳＣ）値を、５℃／分の熱量で、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｍｏｄ．ＤＳＣ７）の装置上で記録した。カンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ ２Ｕ／ｍｇ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、カンジダシリンドラセア（Candida cylindracea）由来のリパーゼ（ＣＣＬ １５〜２５Ｕ／ｍｇ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、ブタ膵臓由来のリパーゼ（ＰＰＬ ≧２００Ｕ／ｍｇ、Ｅ．Ｃ．３．１．１３）、シュードモナスセパシア（seudomonas cepacia）由来のリパーゼ（ＰＦＬ ５０Ｕ／ｍｇ、Ｅ．Ｃ．３．１．１３）および支持されたトリフェニルホスフィン（トリフェニルホスフィンの約３．２ミリモル／ｇ）を、Ｆｌｕｋａから取得した。合成の初期試薬として使用されたアスコマイシンは、Ｐｏｌｉ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ Ｃｈｉｍｉｃａ ＳｐＡ，Ｑｕｉｎｔｏ ｄｅ Ｓｔａｍｐｉ，Ｒｏｚｚａｎｏ（ＭＩ），Ｉｔａｌｙによって調製された。
【００６３】
（実施例１）
アスコマイシンの３３−アセチル誘導体（スキームＩＩの化合物Ｉ）の調製
カンジダアンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５）［０．１４０ｇ（２Ｕ／ｍｇ）ＦＬＵＫＡ］を、トルエン（８ｍｌ）および酢酸ビニル（４．５ｅｑ、０．４７３ｇ）中のアスコマイシン（１００ｍｇ、０．１２６ミリモル）の溶液に加えた。３０℃の温度で８０時間、撹拌しながら反応を維持し、次に酵素を濾過のために取り出し、濾過物を低圧で濃縮して、３３−アセチルアスコマイシン、１０５ｍｇを得る。
【００６４】
かかる中間体の試料を、分析の目的で、シリカゲルでのクロマトグラフィー（溶出剤として、ｎ−ヘキサン／アセトン＝８／２ｖ／ｖ）によって精製し、したがってアセトン／水によって結晶化した。
【００６５】
以下の分析を、かかる試料に実行した。1H-NMR (500MHz) δ: 2.10 (CH3CO), 3.92および4.70 (24CHおよび33CH); IR (cm-1): 3484.245, 2935.287, 1735.331, 1649.741, 1450.039,
1372.278; ＤＳＣ：１３４．２５℃で吸熱、［α］D＝−７４，０°（ｃ＝０．５ＣＨＣｌ3）。
ＭＳのスペクトル（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：８５６．４（Ｍ＋２３、１００．０％）
Ｃ45Ｈ71ＮＯ13のために計算された元素分析：Ｃ６４．８０％；Ｈ、８．５８％；Ｎ、１．６８％；Ｏ、２４．９４％
得られた元素分析：Ｃ６４．７８％；Ｈ、８．５４％；Ｎ、１．５９％；Ｏ、２４．８９％
【００６６】
アスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル−３３−アセチル誘導体（中間体２４−シリル−３３−Ｏａｃ、スキーム２の化合物ＩＩ）の調製
２，６−ルチジン（０．２９０ｇ、２．７ミリモル）およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフレート（０．２３８ｇ、０．９ミリモル）を、ジクロロメタン（５ｍｌ）中のアスコマイシンの３３−アセチル誘導体（１５０ｍｇ、０．１８ミリモル）の溶液に加える。外界温度で３０分間、撹拌しながら反応を放置する。この期間の後で、反応混合物を、炭酸水素ナトリウムで飽和させた溶液（５ｍｌ）によって洗浄し、得られた有機相をＨＣｌ、０．１Ｎ（５ｍｌ、３回）によって、およびＮａＣｌの３０％の溶液（５ｍｌ）によって、続けて洗浄する。有機相を硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、真空下で濃縮して残渣を生成し、生成物１２８ｍｇを得る。
【００６７】
ＭＳのスペクトル（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：９７０．５（Ｍ＋２３、１００．０％）
1H-NMR (500 MHz) δ: 0.05および0.06 ((CH3)2Si), 0.90 ((CH3)3C-Si), 2.10 (CH3CO), 4.70 (33CH)
IR (cm-1): 3462.948, 2934.450, 1739.236, 1649.937
Ｃ51Ｈ85ＮＯ13Ｓｉのために計算された元素分析：Ｃ６４．５９％；Ｈ、９．０３％；Ｎ、１．４８％；Ｏ、２１．９３％
得られた元素分析：Ｃ６４．５０％；Ｈ、９．０５％；Ｎ、１．４１％；Ｏ、２１．８８％
ＤＳＣ＝２３６．４３℃で内皮性（endoderma）。［α］D＝−８１，４°（ｃ＝０．５ＣＨＣｌ3）。
【００６８】
アスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（中間体２４−シリル−３３−ＯＨ、スキーム２の化合物ＩＩＩ）の調製
ｎ−オクタン−１−オール（０．０３５ｇ、０．２６５ミリモル）およびＣＡＬ Ｂ（Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５）［０．１００ｇ（２Ｕ／ｍｇ）ＦＬＵＫＡ］を、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（４ｍｌ）中のアスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル−３３−アセチル誘導体（５０ｍｇ、０．０５３ミリモル）の溶液に加える。４０℃の温度で１２０時間、撹拌しながら反応を維持する。この期間の後で、反応混合物を濾過し、濾過物を真空下で蒸発させて残渣を生成し、未加工の反応生成物を得て、その生成物をシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製し、生成物４４ｍｇ（０．０４８ミリモル）を石油エーテル／アセトン７／３による溶出によって回収する。
【００６９】
得られた生成物の化学的特性／物理的特性は、特許文献１によって得られた参考試料のそれらの特性に匹敵する。
【００７０】
２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル−３３−エピ−クロロアスコマイシン（中間体２４−シリル−３３−クロロ、スキーム２の化合物ＩＶ）の調製
無水トルエン（１．４リットル）およびピリジン（５０ｍｌ）中の２４−シリルＦＲ５２０、すなわち２４−シリルアスコマイシン（１６５ｇ、０．１８モル）の溶液を、不活性雰囲気において外界温度（２０℃〜２５℃）で撹拌しながら、無水トルエン（１．１リットル）中のジクロロトリフェニルホスホラン（dichlorotriphenylphosphorane）（９９．９５ｇ）の懸濁液に加える。
【００７１】
加えた後で、反応混合物を６０℃の温度で１時間、加熱する。この期間の後で、反応混合物の温度を２５℃に下げ、したがって有機相を水（１Ｌで１回）によって、および１０％のＮａＣｌの水溶液（各回１Ｌで４回）によって続けて洗浄し、次に有機相を硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、真空下で濃縮して、トルエンの湿潤固体約２５０ｇを得る。かかる残留物を、（存在するトルエンを除去するために）ｎ−ヘキサン（５００ｍｌ）によって再び取り出し、次に乾燥するまで蒸発させる。残留物を外界温度で約４５分間、撹拌しながらｎ−ヘキサン（５００ｍｌ）中で希釈し、次に溶解しなかった固体はｂｕｃｋｎｅｒ上での濾過のために取り出す（それは、ジクロロホスホランの副産物である）。
【００７２】
濾過物を低圧で濃縮して、固体１４８．６ｇを得て、この固体をシリカゲルでのクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／アセトン＝９／１での溶出）で引き続いて精製し、生成物１２３ｇ（０．１３モル）を得る。
【００７３】
得られた生成物の化学的／物理的特性は、文献（特許文献１）に記載されたそれらの特性に匹敵する。
【００７４】
２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル−３３−エピ−クロロアスコマイシンからのピメクロリムスの調製
中間体２４−シリル−３３−クロロ（１２３ｇ、０．１３モル、スキーム２の化合物ＩＶ）を、ジクロロメタン／メタノール混合物＝１／１＝ｖ／ｖ（１．１リットル）中に、外界温度で撹拌しながら溶解させ、次にｐ−トルエンスルホン酸一水和物（１０．１１ｇ）を加える。
【００７５】
２０℃〜２５℃の温度で７２時間、撹拌しながら反応を放置し、したがって水（６００ｍｌ）と炭酸水素ナトリウム（４．４６ｇ）との溶液を、反応混合物に加える。反応混合物を外界温度で１０分間、撹拌しながら維持し、次に有機相を調製し、塩化ナトリウムの１０％の水溶液（６００ｍｌ）によって洗浄する。
【００７６】
有機相を硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、真空下で濃縮して、未加工のピメクロリムス１１９ｇを得る。かかる原産物を、シリカゲルでのクロマトグラフィー（溶出剤として、ｎ−ヘキサン／アセトン）で精製し、そして酢酸エチル、シクロヘキサン／水によって結晶化して、精製ピメクロリムス６６ｇ（８１．５ミリモル）を得る。
【００７７】
得られた化学的／物理的データは、文献に示されたデータに匹敵する。
【００７８】
（実施例２）
アスコマイシン２４，３３−ジアセテート（中間体２４，３３−ジアセテート、スキーム３の化合物Ｖ）の調製
ＤＭＡＰ（４．５ｅｑ、０．１３６ｇ）および無水酢酸（４．５ｅｑ、０．１１４ｇ）を、０℃の温度で撹拌しながら、ピリジン（２．５ｍｌ）中のアスコマイシン（２００ｍｇ、０．２５ミリモル）の溶液に加える。
【００７９】
１．５時間、０℃の温度で撹拌しながら反応を維持し、次にそれを水によって希釈し、それを酢酸エチル（５ｍｌで３回）によって抽出する。有機抽出物をＨＣｌ、０．５Ｎ（１０ｍｌで５回）によって洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で無水化し、真空下で濃縮する。
【００８０】
残留物をシリカゲルでのクロマトグラフィー（溶出剤として、ｎ−ヘキサン／アセトン８／２ｖ／ｖ）で精製して、アスコマイシン２４，３２−ジアセテート（２１０ｍｇ、０．２４ミリモル）を得た。
【００８１】
本発明者らは、かかる精製された試料への以下の分析を実行した。
1H-NMR (500 MHz) δ: 2.02および2.06 (2 CH3CO), 5.20および4.70 (24CHおよび33CH);
IR (cm-1): 3462.749, 2935.824, 1734.403, 1650.739, 1449.091, 1371.079.
ＤＳＣ：２３４．１０℃で吸熱のピーク、［α］D＝−１００．０°（Ｃ＝０．５ＣＨＣｌ3）。
ＭＳのスペクトル（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：８９８．４（１００．０％、Ｍ＋２３）。
Ｃ47Ｈ73ＮＯ14のために計算された元素分析：Ｃ６４．４４％；Ｈ８．４０％；Ｎ１．６０％；Ｏ２５．５７％
得られた元素分析：Ｃ６４．５５％；Ｈ８．４４％；Ｎ１．６１％；Ｏ２５．４０％
【００８２】
２４−アセチルアスコマイシン（中間体２４−アセテート−３３−ＯＨ、スキーム３の化合物ＶＩ）の調製
カンジダ・アンタルチカ（Candida antartica）由来のリパーゼ（ＣＡＬ Ｂ Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５）［１．１ｇ（２Ｕ／ｍｇ）ＦＬＵＫＡ］を、ＴＢＤＭＥ（２５ｍｌ）およびｎ−オクタン−１−オール（４．５ｅｑ、０．３７１ｇ）中のアスコマイシン３３，２４−ジアセテート（５００ｍｇ、０．５７ミリモル）の溶液に加える。３０℃で１００時間、撹拌しながら反応を維持し、次に酵素を濾過のために取り出し、得られた濾過物を低圧下で濃縮して、生成物４２５ｍｇ（０．５１ミリモル）を得る。
【００８３】
試料を、分析の目的で、シリカゲルでのクロマトグラフィー（溶出剤として、ｎ−ヘキサン／アセトン＝７：３ｖ／ｖ）によって精製し、したがってアセトン／水によって結晶化した。
【００８４】
本発明者らは、かかる精製された試料への以下の分析を実行した。1H-NMR (500MHz) δ: 2.05 (CH3CO); IR (cm-1): 3491.528, 2935.860, 1744.728, 1710.227, 1652.310, 1448.662, 1371.335. ＤＳＣ：１３４．６８℃で吸熱のピーク、Ｃ；［α］D＝−１０２．７°（ｃ＝０．５ＣＨＣｌ3）
ＭＳのスペクトル（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：８５６．４（Ｍ＋２３、１００．０％）
Ｃ45Ｈ71ＮＯ13のために計算された元素分析：Ｃ６４．８０％；Ｈ、８．５８％；Ｎ、１．６８％；Ｏ、２４．９４％
得られた元素分析：Ｃ６４．７１％；Ｈ、８．４９％；Ｎ、１．６０％；Ｏ、２４．９７％
【００８５】
２４−アセチル−３３エピ−クロロアスコマイシン（中間体２４−アセテート−３３−クロロ、スキーム３の化合物ＶＩＩ）の調製
支持されたトリフェニルホスフィン（０．３３５ｇ、１．１ミリモル）を、四塩化炭素（５ｍｌ）中の２４−アセチルアスコマイシン（４００ｍｇ、０．４８ミリモル）の溶液に加える。反応混合物を３時間、還流下で維持し、次に反応混合物を外界温度で冷却する。得られた懸濁液を濾過し、濾過物を真空下で濃縮して残渣を生成し、反応原産物０．４５ｇを得て、この生成物をシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製し、生成物１６３ｍｇ（０．１９ミリモル）を、石油エーテル／アセトン＝９０／１０による溶出によって得る。
1H-NMR δ: 2.08 (CH3CO); 4.60 (33CH); IR (cm-1)= 3464.941, 2934.360, 1738.993, 1650.366, 1450.424, 1371.557; ＤＳＣ：２３１．６７℃で吸熱のピーク、［α］D＝−７５．２°（ｃ＝０．５ＣＨＣｌ3）
ＭＳのスペクトル（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：８７４．３（Ｍ＋２３、１００．０％）
Ｃ45Ｈ70ＣｌＮＯ12のために計算された元素分析：Ｃ６３．４０％；Ｈ、８．２８％；Ｃｌ、４．１６％；Ｎ、１．６４％；Ｏ、２２．５２％
得られた元素分析：Ｃ６３．３１％；Ｈ、８．３０％；Ｃｌ、４．０５％；Ｎ、１．５８％；Ｏ、２２．４２％。
【００８６】
２４−アセチル−３３−エピ−クロロアスコマイシンからのピメクロリムスの調製
メタノール（２ｍｌ）およびＨＣｌ ３Ｎ（１ｍｌ）中の２４−アセチル−３３−エピ−クロロアスコマイシン（２００ｍｇ、０．２３ミリモル、化合物ＶＩＩ）の溶液を、外界温度で４０時間、撹拌する。この期間の後で、反応を重炭酸塩水溶液によって中和して、メタノールを真空下で蒸発させる。混合物をジクロロメタン（５ｍｌで３回）によって抽出し、硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、濃縮して残渣を生成し、残留物を得て、その残留物を、シリカゲルでのクロマトグラフィー（溶出剤としてｎ−ヘキサン／アセトン）によって精製し、そして酢酸エチル、シクロヘキサン／水によって結晶化して、精製されたピメクロリムス７８ｍｇ（０．０９６ミリモル）を得る。
【００８７】
得られた生成物の化学的／物理的特徴は、ピメクロリムスのための文献に示されたデータに匹敵する。
【００８８】
（実施例３）
リパーゼの選別：アスコマイシンでのエステル転移反応およびアスコマイシン３３，２４−ジアセテート（スキーム３の化合物Ｖ）での加アルコール分解
酵素反応の位置選択性を、1Ｈ−ＮＭＲ分析の使用によって判定した。アスコマイシンの２４，３３−ジアセテート（化合物Ｖ）ならびに２４−モノアセテートおよび３３−モノアセテート（それぞれ、スキーム３の化合物ＶＩおよびスキーム２の化合物Ｉ）は、文献において特徴付けられていない。記載されたアスコマイシンのエステルのみが、２４，３３−ジホルミエート（ｄｉｆｏｒｍｉａｔｅ）であり、この化合物のために、２４位および３３位のプロトンは、２つの特徴的な信号、それぞれ５．２２ｐｐｍおよび４．７１ｐｐｍを示す。
【００８９】
３３−モノアセテート（化合物Ｉ）のスペクトルに存在するのは、提案された構造に適合する３．９２ｐｐｍおよび４．７０ｐｐｍでの２つのピークである。
【００９０】
アスコマイシンの２４，３３−ジアセテート（化合物Ｖ）のスペクトルにおいて、かかるプロトンは、５．２０ｐｐｍおよび４．７０ｐｐｍになる。
【００９１】
２４−アセテート（化合物ＶＩ）のスペクトルにおいて、５．０ｐｐｍから５．４ｐｐｍの間の領域が改変され、ピークが４．７ｐｐｍで不在になることが観察される。
【００９２】
表１および表２は、エステル化（エステル転移反応）、加水分解および加アルコール分解において、アスコマイシンおよびアスコマイシン３３，２４−ジアセテート（化合物Ｖ）上で実行された酵素反応に関する実験データを要約している。
【００９３】
【表１】
【００９４】
【表２】
【００９５】
（実施例４）
（比較）
特許文献１に記載されたピメクロリムスの合成の方法の検証
イミダゾール（５０８ｍｇ）およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１．１２５ｇ）を、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍｌ）中のアスコマイシン２ｇ（２．５３ミリモル）の溶液に、分けて加える。反応混合物を外界温度で４．５日間、撹拌しながら維持する。酢酸エチル（２００ｍｌ）によって混合物を希釈し、水（５ｘ１００ｍｌ）を使用して反応物を処理し、反応をそのようにして処理する。有機相を分離し、硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、真空下で蒸発させて残渣を生成し、泡沫状の原産物を得て、生成物をシリカゲルでのクロマトグラフィー（１：３０ｐ／ｐ）によって、引き続いて精製する。アスコマイシン２４，３３ジシリル中間体２．１ｇ（２．０５ミリモル、収率８１％モル）を、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル３／１による溶出によって得る。かかる中間体の化学的／物理的データは、特許文献１に示されたデータに匹敵する。
【００９６】
アスコマイシン２４，３３ジシリル中間体２．１ｇ（２．０５ミリモル）を、０℃の温度で撹拌しながら、アセトニトリル（４２ｍｌ）および水性ＨＦ４０％（２３．１ｍｌ）からなる溶液中に溶解させる。反応混合物を０℃の温度で２時間、撹拌しながら維持し、次にその反応混合物をジクロロメタン（３０ｍｌ）によって希釈する。次に、反応物を、炭酸水素ナトリウム（３０ｍｌ）および水（３０ｍｌ）を使用する飽和水溶液によって、引き続いて洗浄する。分離された有機相を硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、真空下で蒸発させて残渣を生成し、泡沫状の残渣を得て、その残渣を引き続いてシリカゲルでのクロマトグラフィー（１：３０ｐ／ｐ）によって精製し、アスコマイシン２４モノシリル中間体８３９ｍｇ（０．９２ミリモル、収率４５％モル）を、ジクロロメタン／メタノール９／１による溶出によって得る。かかる中間体の化学的／物理的データは、スキーム２の化合物ＩＩＩで得られたデータに匹敵し、特許文献１に示された文献のデータに匹敵する。
【００９７】
四塩化炭素（３６．４ｍｌ）中のアスコマイシン２４モノシリル中間体８３９ｍｇ（０．９２ミリモル、収率４５％モル）、トリフェニルホスフィン（３３７ｍｇ）の混合物を、還流下で１５時間、撹拌しながら加熱する。この期間の後で、反応混合物を真空下で蒸発させて残渣を生成し、シリカゲルでのクロマトグラフィー（１：３０ｐ／ｐ）によって精製された固体生成物を得て、アスコマイシン２４モノシリル中間体、３３−クロロ誘導体５３５ｍｇ（０．５７ミリモル、収率６３％モル）を、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル２／１による溶出によって得る。かかる中間体の化学的／物理的データは、本発明者らがスキーム２の化合物ＩＶで得たデータに匹敵し、特許文献１に示された文献のデータに匹敵する。
【００９８】
アスコマイシン２４モノシリル中間体、３３−クロロ誘導体５３５ｍｇ（０．５７ミリモル）を、アセトニトリル（１６．４ｍｌ）および水性ＨＦ４０％（０．４４ｍｌ）中に、外界温度で撹拌しながら溶解させる。反応混合物を外界温度で４５分間（４５’）、撹拌しながら維持し、次にその反応混合物を、酢酸エチル（１００ｍｌ）によって希釈する。したがって、有機相を炭酸水素ナトリウムの水溶液（７０ｍｌ）によって、水によって（２ｘ７０ｍｌ）引き続いて洗浄し、したがって、有機相を硫酸ナトリウム上で無水化し、濾過し、真空下で蒸発させて、固体を得て、その固体をシリカゲルでのクロマトグラフィー（１：３０ｐ／ｐ）によって引き続いて精製し、ピメクロリムス３２３ｍｇ（０．３９９ミリモル、収率７０％モル）を、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル２／３による溶出によって得る。得られた生成物の化学的／物理的特徴は、ピメクロリムスに関する文献に示されたデータに匹敵し、方法の全体の収率は、１６％である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピメクロリムスを調製するための方法であって、酵素的アシル化のステップおよびカンジダ・アンタルチカ由来のリパーゼによる酵素的加アルコール分解のステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記カンジダ・アンタルチカ由来のリパーゼは、ＣＡＬ Ｂ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３．）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記加アルコール分解が、アスコマイシンの３３位のエステルまたはそれらのシリル化された誘導体、好ましくはＣ1〜Ｃ4エステルまたはそれらのシリル化された誘導体の選択的な加アルコール分解であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アスコマイシンの３３位のエステルまたはそれらのシリル化された誘導体が、３３−アシル−２４−シリルアスコマイシンならびに２４位および３３位がジアセチル化されたアスコマイシンであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、以下の、
ａ）アシル化剤および有機溶媒の存在下における、カンジダ・アンタルチカ由来のリパーゼによるアスコマイシンの３３位のヒドロキシルの選択的な酵素的アシル化のステップと、
ｂ）有機塩基の存在下におけるシリル化剤による、対応する２４−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテル中でのそのようにして得られた３３位−アシル化誘導体の転換のステップと、及び
ｃ）有機溶媒およびＣ1〜Ｃ8第１級脂肪族アルコールの存在下における、ステップｂ）において調製された化合物の３３位のアシルをカンジダ・アンタルチカ由来のリパーゼにより酵素的に除去して、アスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテルを得るステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記ステップａ）のアシル化剤は、ビニルエステルまたはＣ1〜Ｃ8トリフルオロエチルエステル、好ましくは酢酸ビニルまたはトリフルオロエチルアセテートから選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップａ）およびステップｃ）の有機溶媒は、０．５を超える分配係数を有する非プロトン性有機溶媒であって、ステップａ）においては好ましくはトルエン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ジクロロメタン、クロロホルムまたはｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル、およびステップｃ）においては好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル、ジクロロメタンまたはトルエン、さらにより好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテルであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）の前記シリル化剤は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドまたはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフレートであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）の前記有機塩基は、イミダゾール、ピリジンまたは２，６−ルチジン、好ましくは２，６−ルチジンであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｃ）の前記第１級脂肪族アルコールは、ｎ−オクタン−１−オールであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
塩素の原子でアスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテルの３３位のヒドロキシルを置換して、２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３３−エピ−クロロアスコマイシン誘導体を得るステップ、および２４位のｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテルを引き続いて除去するステップを含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記塩素の原子でのアスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテルの３３のヒドロキシルによる置換が、ジクロロトリフェニルホスホランまたはＮ−クロロスクシンイミドを使用して実行されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記２４位のｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテルの除去は、一塩基の無機酸、好ましくはフッ化水素酸もしくは塩酸、または有機酸、好ましくはｐ−トルエンスルホン酸一水和物もしくはメタンスルホン酸、さらにより好ましくはｐ−トルエンスルホン酸一水和物による酸触媒作用を用いて実行されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
式
【化１】
の２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３３−アセチル−アスコマイシン。
【請求項１５】
ピメクロリムスの合成における反応中間体としての請求項１４に記載の前記化合物の使用。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、以下の、
ａ’）Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンの存在下において、有機溶媒中のアスコマイシンおよびアシル化剤から出発して、２４位および３３位がアセチル化されたアスコマイシンを調製するステップと、及び
ｂ’）有機溶媒およびＣ1〜Ｃ8第１級脂肪族アルコールの存在下において、ステップａ’）で調製された化合物の３３位のアシルをカンジダ・アンタルチカ由来のリパーゼにより酵素的に除去して、２４位がモノアセチル化されたアスコマイシンを得るステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
ステップａ’）の前記アシル化剤が、塩化アセチルまたは無水酢酸であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップａ’）の前記有機溶媒が、有機塩基、好ましくはピリジンまたはトリエチルアミンであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｂ’）の前記有機溶媒が、０．５を超える分配係数を有する非プロトン性有機溶媒、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル、ジクロロメタンまたはトルエン、さらにより好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテルであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ステップｂ’）の前記第１級脂肪族アルコールが、ｎ−オクタン−１−オールであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
塩素の原子で、２４位がモノアセチル化されたアスコマイシンの３３位のヒドロキシルを置換して、２４−アセテート−３３−エピ−クロロアスコマイシン誘導体を得るステップ、および引き続いて２４位のアセテートを除去するステップを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、塩素の原子での２４位がモノアセチル化された前記アスコマイシンの３３位の前記ヒドロキシルの置換が、ポリマーに担持されたトリフェニルホスフィンを使用して、Ｃ1〜Ｃ2塩素化された溶媒、好ましくは四塩化炭素中、または、別の非極性の非プロトン性有機溶媒、好ましくは直鎖状もしくは分枝状のＣ5〜Ｃ8脂肪族炭化水素または芳香族炭化水素、好ましくはトルエンもしくはキシレンの存在下において、ヘキサクロロエタンを使用して実行されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
２４位の前記アセテートの除去が、一塩基の無機酸、好ましくはフッ化水素酸もしくは塩酸、または有機酸、好ましくはｐ−トルエンスルホン酸一水和物もしくはメタンスルホン酸、さらに好ましくは塩酸による酸触媒作用を用いて実行されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
式
【化２】
の２４，３３−ジアセテートアスコマイシン。
【請求項２５】
ピメクロリムスの合成における反応中間体としての請求項２４に記載の前記化合物の使用。
【請求項２６】
式
【化３】
の２４−モノアセテートアスコマイシン。
【請求項２７】
ピメクロリムスの合成における反応中間体としての請求項２６に記載の前記化合物の使用。
【請求項２８】
式
【化４】
の２４−アセテート−３３−エピ−クロロアスコマイシン。
【請求項２９】
ピメクロリムスの合成における反応中間体としての請求項２８に記載の前記化合物の使用。
【請求項１】
ピメクロリムスを調製するための方法であって、酵素的アシル化のステップおよびカンジダ・アンタルチカ由来のリパーゼによる酵素的加アルコール分解のステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記カンジダ・アンタルチカ由来のリパーゼは、ＣＡＬ Ｂ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３．）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記加アルコール分解が、アスコマイシンの３３位のエステルまたはそれらのシリル化された誘導体、好ましくはＣ1〜Ｃ4エステルまたはそれらのシリル化された誘導体の選択的な加アルコール分解であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アスコマイシンの３３位のエステルまたはそれらのシリル化された誘導体が、３３−アシル−２４−シリルアスコマイシンならびに２４位および３３位がジアセチル化されたアスコマイシンであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、以下の、
ａ）アシル化剤および有機溶媒の存在下における、カンジダ・アンタルチカ由来のリパーゼによるアスコマイシンの３３位のヒドロキシルの選択的な酵素的アシル化のステップと、
ｂ）有機塩基の存在下におけるシリル化剤による、対応する２４−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテル中でのそのようにして得られた３３位−アシル化誘導体の転換のステップと、及び
ｃ）有機溶媒およびＣ1〜Ｃ8第１級脂肪族アルコールの存在下における、ステップｂ）において調製された化合物の３３位のアシルをカンジダ・アンタルチカ由来のリパーゼにより酵素的に除去して、アスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテルを得るステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記ステップａ）のアシル化剤は、ビニルエステルまたはＣ1〜Ｃ8トリフルオロエチルエステル、好ましくは酢酸ビニルまたはトリフルオロエチルアセテートから選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップａ）およびステップｃ）の有機溶媒は、０．５を超える分配係数を有する非プロトン性有機溶媒であって、ステップａ）においては好ましくはトルエン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ジクロロメタン、クロロホルムまたはｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル、およびステップｃ）においては好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル、ジクロロメタンまたはトルエン、さらにより好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテルであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）の前記シリル化剤は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドまたはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフレートであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）の前記有機塩基は、イミダゾール、ピリジンまたは２，６−ルチジン、好ましくは２，６−ルチジンであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｃ）の前記第１級脂肪族アルコールは、ｎ−オクタン−１−オールであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
塩素の原子でアスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテルの３３位のヒドロキシルを置換して、２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３３−エピ−クロロアスコマイシン誘導体を得るステップ、および２４位のｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテルを引き続いて除去するステップを含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記塩素の原子でのアスコマイシンの２４−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテルの３３のヒドロキシルによる置換が、ジクロロトリフェニルホスホランまたはＮ−クロロスクシンイミドを使用して実行されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記２４位のｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルエーテルの除去は、一塩基の無機酸、好ましくはフッ化水素酸もしくは塩酸、または有機酸、好ましくはｐ−トルエンスルホン酸一水和物もしくはメタンスルホン酸、さらにより好ましくはｐ−トルエンスルホン酸一水和物による酸触媒作用を用いて実行されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
式
【化１】
の２４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３３−アセチル−アスコマイシン。
【請求項１５】
ピメクロリムスの合成における反応中間体としての請求項１４に記載の前記化合物の使用。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、以下の、
ａ’）Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンの存在下において、有機溶媒中のアスコマイシンおよびアシル化剤から出発して、２４位および３３位がアセチル化されたアスコマイシンを調製するステップと、及び
ｂ’）有機溶媒およびＣ1〜Ｃ8第１級脂肪族アルコールの存在下において、ステップａ’）で調製された化合物の３３位のアシルをカンジダ・アンタルチカ由来のリパーゼにより酵素的に除去して、２４位がモノアセチル化されたアスコマイシンを得るステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
ステップａ’）の前記アシル化剤が、塩化アセチルまたは無水酢酸であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップａ’）の前記有機溶媒が、有機塩基、好ましくはピリジンまたはトリエチルアミンであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｂ’）の前記有機溶媒が、０．５を超える分配係数を有する非プロトン性有機溶媒、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテル、ジクロロメタンまたはトルエン、さらにより好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルエーテルであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ステップｂ’）の前記第１級脂肪族アルコールが、ｎ−オクタン−１−オールであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
塩素の原子で、２４位がモノアセチル化されたアスコマイシンの３３位のヒドロキシルを置換して、２４−アセテート−３３−エピ−クロロアスコマイシン誘導体を得るステップ、および引き続いて２４位のアセテートを除去するステップを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、塩素の原子での２４位がモノアセチル化された前記アスコマイシンの３３位の前記ヒドロキシルの置換が、ポリマーに担持されたトリフェニルホスフィンを使用して、Ｃ1〜Ｃ2塩素化された溶媒、好ましくは四塩化炭素中、または、別の非極性の非プロトン性有機溶媒、好ましくは直鎖状もしくは分枝状のＣ5〜Ｃ8脂肪族炭化水素または芳香族炭化水素、好ましくはトルエンもしくはキシレンの存在下において、ヘキサクロロエタンを使用して実行されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
２４位の前記アセテートの除去が、一塩基の無機酸、好ましくはフッ化水素酸もしくは塩酸、または有機酸、好ましくはｐ−トルエンスルホン酸一水和物もしくはメタンスルホン酸、さらに好ましくは塩酸による酸触媒作用を用いて実行されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
式
【化２】
の２４，３３−ジアセテートアスコマイシン。
【請求項２５】
ピメクロリムスの合成における反応中間体としての請求項２４に記載の前記化合物の使用。
【請求項２６】
式
【化３】
の２４−モノアセテートアスコマイシン。
【請求項２７】
ピメクロリムスの合成における反応中間体としての請求項２６に記載の前記化合物の使用。
【請求項２８】
式
【化４】
の２４−アセテート−３３−エピ−クロロアスコマイシン。
【請求項２９】
ピメクロリムスの合成における反応中間体としての請求項２８に記載の前記化合物の使用。
【公表番号】特表２０１２−５２７２２９（Ｐ２０１２−５２７２２９Ａ）
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１３９４（Ｐ２０１２−５１１３９４）
【出願日】平成２２年５月１９日（２０１０．５．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５２２１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３４０２７
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１１５９９３４）ユーティカルズ ソシエタ ペル アチオニ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１９日（２０１０．５．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５２２１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３４０２７
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１１５９９３４）ユーティカルズ ソシエタ ペル アチオニ (4)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]