フィターゼ酵素低活性納豆菌及び長期安定な納豆
【課題】 フィターゼ活性を欠損させた納豆菌を開発し、該納豆菌を用いて発酵することにより、長期間安定な高品質納豆を提供すること。
【解決手段】 納豆菌のｐｈｙ遺伝子を欠損させたフィターゼ活性欠損納豆菌を開発し、あるいは、突然変異処理によってフィターゼ活性欠損納豆菌を新たにスクリーニングし、得られた納豆菌を用いて納豆を発酵生産することにより、納豆の長期保存中に見られる品質の劣化原因である白色析出物の発生抑制や豆色の褐変及び菌膜の喪失といった外観の悪化についても改善された納豆を製造する。
【解決手段】 納豆菌のｐｈｙ遺伝子を欠損させたフィターゼ活性欠損納豆菌を開発し、あるいは、突然変異処理によってフィターゼ活性欠損納豆菌を新たにスクリーニングし、得られた納豆菌を用いて納豆を発酵生産することにより、納豆の長期保存中に見られる品質の劣化原因である白色析出物の発生抑制や豆色の褐変及び菌膜の喪失といった外観の悪化についても改善された納豆を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規納豆菌及び該納豆菌を用いて製造された新規納豆に関し、さらに詳細には、フィターゼ酵素低活性納豆菌、及び長期安定な納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆は発酵終了後、長期間保存することで納豆菌の二次発酵を促し次に挙げる品質の劣化を引き起こす。即ち、チロシン及びストラバイト（リン酸マグネシウムアンモニウム）などの白色析出物が発生し食感を損ねること、豆色の褐変及び菌膜の喪失により外観を悪化させること、アンモニア発生による不快臭の増大などである。
【０００３】
これまで納豆の品質を長期間安定に保つ為、数々の試みが行われてきた。例えば、納豆の容器を酸素透過性の低い材質にし、脱気後密封することで二次発酵の原因である納豆菌の増殖を抑えること（特許文献１参照）、納豆容器中に酸素吸収剤を入れることで二次発酵の原因である納豆菌の増殖を抑えること（特許文献２参照）、納豆菌接種前の蒸煮大豆中に糊化米粉水溶液を添加すること（特許文献３参照）などである。
【０００４】
ただ、上記解決法を行うには容器の変更や添加物の使用など、納豆製造工程におけるコストの増大は避けることができず、そのため納豆菌の育種により、従来法と何ら変わらない製造法による解決法が切望されていた。
【特許文献１】特開平７−２３７２８号公報
【特許文献２】特開平１０−１６５１３０号公報
【特許文献３】特開２００４−２３６５５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、製造工程の追加や添加物の使用などを行わず、従来製造法のままで納豆菌の育種により長期間安定で高品質の納豆を開発し、提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、納豆品質の劣化原因のひとつである白色析出物の発生を解決する為、その構成成分の中でも特にリンにはじめて着目した。即ち、大豆中に含まれるリンの約８５％がフィチン態を形成している点に着目し、フィチンからのリンの遊離を抑え、白色析出物の原資の供給源を絶つことを試みた。
【０００７】
そこで、フィチンからのリンの遊離はこの納豆菌が生産するフィターゼが主原因であることを想定し、フィターゼをコードするｐｈｙ遺伝子を破壊することでフィターゼ活性を欠損させた納豆菌を構築し、該株を用いて納豆を作成し評価を行った。
【０００８】
保存試験の結果、仮説通りに親株と比較して有為に白色析出物の発生を抑えることができた。また、さらに驚くべきことには、納豆品質の劣化原因である豆色の褐変及び菌膜の喪失といった外観の悪化についても親株と比較して有意に改善されることを確認した。よって、フィターゼ遺伝子を欠損させた納豆菌を用いて納豆を製造することにより、納豆品質が親株のそれと比較して有為に改善できたことを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
即ち、請求項１の発明は、脱リン酸化酵素の活性を低下、または欠失させたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項２の発明は、フィターゼ酵素の活性を低下、または欠失させたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項３の発明は、請求項１または請求項２記載の変異領域がプロモーター領域を含むｐｈｙ遺伝子である納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項４の発明は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異が遺伝子組換え法により欠損されたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項５の発明は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異が突然変異法により欠損されたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項６の発明は、親株のｐｈｙ遺伝子を遺伝子組換え法により欠損させてなる納豆菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｈｙ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３７）についてである。請求項７の発明は、突然変異法によりフィターゼ酵素活性を欠失させた納豆菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＶＰＳ３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３６）についてである。
【００１０】
請求項８の発明は、請求項１〜７のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて製造されたことを特徴とする納豆についてである。請求項９の発明は、請求項８記載の納豆がスクロースなどの糖源を添加することで製造されたことを特徴とする納豆についてである。請求項１０の発明は、請求項１〜７のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて発酵されたことを特徴とする大豆加工物又は米糠などの穀類についてである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、添加物の使用などの工程を加えることなく、該納豆菌で納豆を製造することにより、長期保存条件において、白色析出物の発生抑制、豆色の褐変抑制及び菌膜の維持といった外観の良い高品質納豆を提供できる。また、本発明によれば、フィチン酸含有培地（選択培地）を用いてハローの形成の有無を確認することにより目的納豆菌をスクリーニングして育種する方法も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
フィターゼとは、フィチンを基質としてイノシトール環からリン酸基を遊離させる酵素である（ＥＣ ｎｕｍｂｅｒ：３．１．３．８）。今回は大豆成分からリンの遊離を抑制する為にフィターゼに着目したが、それ以外の脱リン酸化酵素も対象として使用可能であり、これらを１種又は２種以上を処理対象として併用することも可能である。
【００１３】
公知の通り、ｐｈｙ遺伝子がコードするフィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）という酵素によりフィチンからリンが遊離されるが、納豆菌ではその酵素の存在が既に報告されている（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５６（８）， １２６６−１２６９， １９９２）（または、特開平６−３８７４５号公報）ものの、納豆菌が生産する中性フィターゼの特性について言及されているものであり、納豆への応用例などは一切記載されていない。ましてや、ｐｈｙ遺伝子の破壊、欠損による納豆における白色析出物の抑制等の納豆の長期安定化については全く知られていない。
【００１４】
また、納豆菌の近縁種である枯草菌でもその存在が知られており（例えば、「（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１５１巻、ｐ．１１０２−１１０８、１９８２年」参照）（例えば、「（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、６４巻、ｐ．２０７９−２０８５、１９９８年」参照）（例えば、「（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、２６８巻、ｐ．３６５−３６９、２０００年」参照）、その基質特異性や至適条件など酵素の特性が示されている。
【００１５】
本発明で育種改良に用いる元の納豆菌には特に制限はないが、通常納豆工業で使用されている発酵能力に優れた納豆菌や、自然界から分離取得された納豆菌、及びさらに改良を重ねて得られる優れた納豆菌などを用いるのが望ましい。
【００１６】
納豆菌はその形態や遺伝子相同性から、枯草菌バシラス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されているが、粘質物（糸引物質）などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、バシラス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ）として分類されたり、枯草菌の変種としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏ或いはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ （ｎａｔｔｏ）などと枯草菌と区別して分類する場合もある。納豆菌としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ ＩＦＯ３００９株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３３３５株、同ＩＦＯ３３３６株、同ＩＦＯ３９３６株、同ＩＦＯ１３１６９株などがある他、各種の納豆菌が広く使用できる。
【００１７】
具体的には、市販納豆から分離したＯ−２株や該株の形質転換効率向上性変異株であるｒ２２株（特開２０００−２２４９８２号公報参照）が挙げられ、また市販の納豆種菌である高橋菌（Ｔ3株、東京農業大学菌株保存室）や宮城野菌（宮城野納豆製作所）など各種の納豆菌が適宜使用可能である。
【００１８】
本発明では、これら納豆菌のフィターゼ遺伝子を破壊し、該酵素活性を欠損させた納豆菌を育種することにより、フィチンを基質としてリンを遊離しない納豆菌を取得する。
【００１９】
育種方法の一つとして相同組換えを利用した遺伝子改良法が採用可能であるが、本方法の利点は標的遺伝子だけを特異的に欠損させることが可能であり、そのため納豆菌などの工業的に利用される微生物においては、他の優れた特性は壊さずに、欠点となっている性質に関与する遺伝子だけに変異を起こさせて改良することができる。
【００２０】
さらに、スタールらが枯草菌バシラス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において開発した相同組換え能を利用した遺伝子破壊法（例えば、「（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１５８巻、ｐ．４１１−４１８、１９８４年」参照）を納豆菌用に改変した方法も利用可能である。この方法は、最終的には、育種のための遺伝子破壊などの目的で納豆菌に導入した異種遺伝子を完全に除去することができる方法であるため、育種された菌は遺伝子組換え菌とはならないなどの長所を有している。
【００２１】
また、このような遺伝子組換え法を納豆菌で利用するには、納豆菌への遺伝子導入のための形質転換系が必要であるが、納豆菌を遺伝子導入活性が高くなる状態にするいわゆるコンピテンス法（例えば、「（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５６巻、ｐ．２０９−２２１、１９７１年」参照）が利用可能である。
【００２２】
また、納豆菌の遺伝子組換え系の一つとしては、ファージベクターを利用した形質導入法が既に開発されており（例えば、「（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、６３巻、ｐ．４０８３−４０８９、１９９７年」参照）、本発明ではこの方法も利用可能である。
【００２３】
本発明においては、上記の育種方法を用いて、納豆菌の脱リン酸に関与する遺伝子を欠損させることによって目的の長期安定な高品質納豆菌を作製する。なお、本発明においては、遺伝子の欠損には、欠失、改変、破壊等を包含するものである。
【００２４】
尚、上記のような遺伝子組換え技術以外によっても、即ち、既に目的遺伝子が欠損している納豆菌を自然界から選抜するいわゆるスクリーニング法や、薬剤やＵＶ変異法などによってこれらの遺伝子を変異欠損させるなどの突然変異法など、従来から実施されているような他の方法によっても育種が可能である。
【００２５】
ｐｈｙ遺伝子欠損納豆菌、フィターゼ酵素その他の脱リン酸化酵素の活性を低下又は欠失させた納豆菌をスクリーニングするためには、例えばフィチン酸を含有する選択培地（例、ＬＢＰＨ培地）を用い、ハローを形成しない株を選択すればよく、本発明は、このような納豆菌を選択するための選択培地及びこれを利用する有用納豆菌の育種方法も提供するものである。
【００２６】
このようにして開発されたフィターゼ欠損納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。
【００２７】
例えば、納豆は丸大豆を原料として製造されたいわゆる丸大豆納豆が一般的であるが、一部には予め挽割った大豆を原料とする挽割り納豆もある。丸大豆納豆の製造方法は、一般に原料である丸大豆を冷水に十数時間浸漬した後、蒸煮釜で加圧蒸気を用いて加圧蒸煮（１．５〜２ Ｋｇ／ｃｍ2・１２８〜１３３℃）して得られた蒸煮大豆に対して、高温状態（７０〜１００℃）で納豆菌を接種し混合した後、所定の容器に充填してから発酵室に搬入して比較的高温度（４０〜５５℃程度）で所定時間（１２〜４８時間程度）発酵させた後、５℃前後で冷蔵熟成（１２〜７２時間程度）して完成させるのが一般的である。また、挽割り納豆の場合は、予め挽割った大豆を水に浸漬する以外は、通常の丸大豆納豆の場合と同様の方法で製造される。
【００２８】
このような従来の納豆の製造方法において、本発明では発酵工程で用いる納豆菌を、前記方法によって育種改良したフィターゼ欠損納豆菌に代えて使用することによって製造される。
【００２９】
このようにして、フィターゼ欠損納豆菌を用いて生産した納豆と、従来から利用されている通常の納豆菌を用いた納豆とを比較すると、フィターゼ欠損納豆菌で製造した納豆は長期保存条件下において白色析出物の発生抑制、豆色の褐変抑制及び菌膜の維持といった外観の良い高品質納豆であることが確認できる。
【００３０】
このような長期保存条件下で高品質な納豆を目指した場合、このフィターゼ欠損納豆菌の能力と相乗効果を狙うために、蒸煮大豆中にスクロースなどの糖源を添加して発酵させることにより揮発アンモニア量を抑制させる製造法の併用も有効である。
【００３１】
また、今回の実施例での最終形態は蒸煮大豆を発酵させた納豆となるが、例えば豆乳や米糠といった穀類などを基質としてその発酵物を得る場合、本技術で得た株を用いることで品質の向上が期待できる。
【実施例】
【００３２】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
（実施例１）フィターゼ欠損納豆菌の作製
（１）基本条件
フィターゼ活性を欠損させる親株としては、納豆菌バシラス・サチラスｒ２２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｒ２２）株（以下、ｒ２２株と称する場合もある）（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）を用いた。ｒ２２株は、市販納豆から常法により分離した納豆菌であるＯ−２株を、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することにより取得した形質転換能を高めた変異株である。また、他には大腸菌ＤＨ５α（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α）株（タカラバイオ社製）を用いた。プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）及びｐＣ１９４（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
【００３４】
なお、特に記載しない限り、培養条件、培地及びその他の遺伝子組換え技術は、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、２版（１９９２）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ」の記載に従った。
また、基本的な培養は以下の表１（ＬＢ培地組成）に示すＬＢ培地を用いて行った。
【００３５】
【表１】
【００３６】
ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅には、Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を使用し、反応条件は、Ｅｘ Ｔａｑに添付のマニュアルに従った。
【００３７】
納豆菌の形質転換等は、以下の方法によった。
【００３８】
即ち、納豆菌の染色体ＤＮＡは、市販のキットを使用して調製し、形質転換は「（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５６巻、ｐ．２０９−２２１、１９７１年」の方法に従った。
納豆菌の胞子は、以下の表２（胞子形成培地組成）に示すＳｔｅｒｌｉｎｉ−Ｍａｄｅｌｓｔａｍ置換培地を用いて調製した。
【００３９】
【表２】
【００４０】
（２）ベクター構築
ベクター構築に用いた各ＤＮＡ断片の作製概略を図１に示した。
【００４１】
即ち、ｒ２２株のｐｈｙ遺伝子領域を含む約５Ｋｂｐの増幅にはプライマー１（配列表の配列番号１（図４）に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２（図５）に記載）を使用した。
ｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子の増幅には、プライマー３（配列表の配列番号３（図６）に記載）及びプライマー４（配列表の配列番号４（図７）に記載）を用いた。
【００４２】
それぞれのプライマーは、ｐｈｙ遺伝子領域をＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ：ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて塩基配列を決定し設計した。また、ｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子の塩基配列は文献情報（例えば、「（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、７７巻、１２号、ｐ．７０７９−７０８３、１９８０年」参照）を参考にして設計した。
【００４３】
即ち、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にし、プライマー１（配列表の配列番号１（図４）に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２（図５）に記載）を用いｐｈｙ遺伝子領域を含む約５Ｋｂｐを増幅した（ＤＮＡ断片１）（図１）。
【００４４】
さらに、ｐＣ１９４を鋳型にしプライマー３（配列表の配列番号３（図６）に記載）及びプライマー４（配列表の配列番号４（図７）に記載）を用いクロラムフェニコール耐性遺伝子を増幅するとともに制限酵素サイトＳｔｕＩを遺伝子両端に導入した（ＤＮＡ断片２）（図１）。
【００４５】
続いて、上記ＤＮＡ断片を用いてベクターを構築したが、その概略は図２に示した。即ち、ｐＢＲ３２２のマルチクローニングサイト上のＮｒｕＩサイトにＤＮＡ断片１を導入し、次いでＤＮＡ断片１内のＳｔｕＩサイトで切断した。そのＳｔｕＩサイトへＤＮＡ断片２を導入し、プラスミドｐＢＲＰＣ１を得た（図２）。
【００４６】
（３）形質転換
プラスミドｐＢＲＰＣ１のプラスミドＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列表の配列番号１に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２に記載）を用いｐｈｙ遺伝子領域及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む約６Ｋｂｐを増幅したＤＮＡを用いてｒ２２株へ形質転換した。形質転換株の選択はクロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地で３７℃、１８時間培養することによって行った。得られた形質転換株バシラス・サチラスｐｈｙ２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｈｙ２）株（以下、ｐｈｙ２株と称する場合もある）のｐｈｙ遺伝子は、塩基番号６３２のＳｔｕＩサイト内にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されていることが、ＰＣＲ法などによる解析によって確認された（図３）。
【００４７】
このようにして得た形質転換体は、バシラス・サチラス（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｈｙ２と命名し、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３７として国際寄託した。
【００４８】
（実施例２）納豆試作と品質評価
常法に従い、ｒ２２株、およびｐｈｙ２株の胞子液を調整した。即ち、ｒ２２株またはｐｈｙ２株を表１に示したＬＢ培地に１白菌耳植菌し、３７℃、１晩培養後、その培養液を表２に示した胞子形成培地に１％植菌し、３７℃、２４時間培養して胞子液を調製した。
【００４９】
以下、それぞれの胞子液を種菌として使用し、常法に従い納豆を試作した。即ち、極小大豆を水道水で４℃、１晩浸漬し、圧力蒸煮釜で蒸気圧１．８ＫＰａで１８分間蒸煮した。このようにして調製した蒸煮大豆に対して、上記のｒ２２株またはｐｈｙ２株の胞子液を滅菌水で１００倍に希釈し、蒸煮大豆１００ｇあたり０．８ｍｌ種菌し、４０℃で１８時間発酵した。発酵後、４℃で２４時間熟成して、納豆を調製した。
【００５０】
ｐｈｙ２株を用いて発酵を行った場合、ｒ２２株を用いて発酵した場合と比べて、発酵時間の遅延、発酵中の納豆品温の低下等は見られず、ｐｈｙ２欠損変異が納豆菌の生育に影響を及ぼさないことが分かった。
【００５１】
続いて試作により得られた納豆を、熟練した男女各１０名からなるパネルによる官能検査に供した。
その結果、親株（ｒ２２株）と変異株（ｐｈｙ２株）とで品質上に違いが見られず、ｐｈｙ２株を種菌に用いて作製した納豆が、納豆として必要な品質を具備していることが確認できた。
【００５２】
（実施例３）フィターゼ欠損納豆菌のフィターゼ活性
納豆菌のフィターゼ活性の測定は以下の方法に従った。即ち、５ｍｌのＬＢ液体培地で培養し、定常期での培養上澄液を粗酵素液とし、等量の基質溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０） ＋ １％ ｐｈｙｔｉｃ ａｃｉｄ （ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ） ＋ ２ｍＭ ＣａＣｌ2）と混ぜ、３７℃、６０〜１２０分インキュベートした。ブランクとして粗酵素液を５分間煮沸したものを使用した。反応終了後、即座に急冷し、反応液中のリンを定量キット（ホスファＣ−テストワコー（和光純薬工業製））で測定した。１分間あたり１ｐｍｏｌのリンを遊離させる酵素単位を１Ｕとして算出した結果を下記表３（フィターゼ活性）に示した（単位：Ｕ）。
【００５３】
【表３】
【００５４】
（実施例４）納豆からの白色析出物の抽出
試作により得られた納豆を長期間保存し、既報の抽出法（例えば、「（栄養と食糧）、２６巻、ｐ．４７３−４７８、１９７３年」参照）により白色析出物量を測定した。
【００５５】
保存法は、通常保存条件（１０℃保存）と過酷保存条件（２５℃保存）の２パターンで試験した。測定結果を、それぞれ、表４（通常保存条件（１０℃保存））及び表５（過酷保存条件（２５℃保存））に示した（単位：ｍｇ／１００ｇ）。
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
【００５８】
（実施例５）豆の色調の変遷
試作により得られた納豆を長期間保存（上記と同様）し、色差計によりＬ値（明度）の変遷を測定した。尚、色差計はＣＯＬＯＲ ＲＥＡＤＥＲ ＣＲ−１３（ＭＩＮＯＬＴＡ製）を使用した。
【００５９】
保存法は、通常保存条件（１０℃保存）と過酷保存条件（２５℃保存）、（３７℃保存）の３パターンで試験した。測定結果は、それぞれ、表６（通常保存条件（１０℃保存）、表７（過酷保存条件（２５℃保存）、表８（過酷保存条件（３７℃保存））に示した（単位：Ｌ値）。
【００６０】
【表６】
【００６１】
【表７】
【００６２】
【表８】
【００６３】
（実施例６）納豆菌膜の変遷
試作により得られた納豆を長期間保存（上記と同様）し、菌膜の状態を比較した。表記は○（不快を感じない）、△（不快を感じる）、×（不快を強く感じる）で表した。
保存法は、通常保存条件（１０℃保存）で試験した。測定結果を表９（通常保存条件（１０℃））に示した。
【００６４】
【表９】
【００６５】
（実施例７）納豆菌からのスクリーニング法
前述の遺伝子組換え納豆菌ｐｈｙ２株と同様の野生株をスクリーニングする手段を開発した。即ち、該株を用い以下の表１０に示すＬＢＰＨ培地を用いてハロー法選抜によりスクリーニングするものである。
【００６６】
実際に納豆菌ｐｈｙ２株とその親株であるｒ２２株を該培地にて３７℃、一晩培養させたところ、親株は白濁した培地上にそのコロニー周辺に透明なハローを形成したことに対し、ｐｈｙ２株ではハローを形成しなかった。この培地を使用することにより、遺伝子組換え技術を用いない野生株からフィターゼ欠損株をスクリーニングすることが可能である。該方法については、親株を薬剤処理またはＵＶ（紫外線）照射などにより突然変異を誘導させ、スクリーニングを効率化することができる。
【００６７】
薬剤処理法として、例えばニトロソグアニジンを使用する方法がある。即ち、５ｍｌのＬＢ培地に親株を植菌し、３７℃で一晩培養させ、その培養液の２％を１００ｍｌのＬＢ培地に植菌し３時間培養する。続いて集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）で２回洗浄する。その後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）４ｍｌで懸濁し、終濃度２００μｇ／ｍｌのニトロソグアニジン溶液を添加し、３０℃で１時間処理する。続いて集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）５ｍｌ及びＬＢ培地５ｍｌでそれぞれ２回ずつ洗浄し、最後にＬＢ培地５ｍｌを添加し３７℃で３時間培養させ、適量をＬＢＰＨ培地に植菌する。表１０にＬＢＰＨ培地組成を示す。
【００６８】
【表１０】
【００６９】
実際に、親株をＯＵＶ２３４８１株（特許文献 特開２０００−２８７６７６号公報）とした納豆菌から、上記薬剤処理法を用いてスクリーニングを行ったところ、ハローを形成しないコロニーを選抜することができた（ＶＰＳ３７株）。ＶＰＳ３７株のフィターゼ活性、過酷条件での保存試験を行ったところ、遺伝子組換え株である納豆菌ｐｈｙ２株と同様の効果を見出し、組換え株以外でも該スクリーニング法により長期保存条件下において白色析出物の発生抑制、豆色の褐変抑制及び菌膜の維持といった外観の良い高品質納豆を作成できる納豆菌を取得することができた。
【００７０】
このようにして分離して得た突然変異株は、バシラス・サチラス（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＰＳ３７と命名し、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３６として国際寄託した。
【００７１】
ＶＰＳ３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３６）のフィターゼ活性を測定し、測定結果を下記表１１に示した（単位：Ｕ）。
【００７２】
【表１１】
【００７３】
ＶＰＳ３７株（突然変異株）の通常保存条件（１０℃）、及び過酷保存条件（２５℃）での白色析出物の発生量（ｍｇ／１００ｇ）の経日変化を、それぞれ、表１２及び表１３に示した。なお、ＯＵＶ２３４８１は親株である。
【００７４】
【表１２】
【００７５】
【表１３】
【００７６】
また、ＶＰＳ３７株の通常保存条件（１０℃）、及び、過酷保存条件（２５℃）において保存した場合の豆の色調の変遷（Ｌ値）（経日変化）を、それぞれ、表１４及び表１５に示した。
【００７７】
【表１４】
【００７８】
【表１５】
【００７９】
更に、ＶＰＳ３７株の通常保存条件（１０℃）での納豆菌膜の変遷を表１６に示した。表中、○は不快を感じない、△は不快を感じる、×は不快を強く感じるを示し、ｄａｙｓは日数を示す。
【００８０】
【表１６】
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ＤＮＡ断片作製の概略を示した図である。
【図２】ベクター構築の概略を示す図である。
【図３】ｐｈｙ遺伝子欠損工程の概略を示す図である。
【図４】プライマー１を示す。
【図５】プライマー２を示す。
【図６】プライマー３を示す。
【図７】プライマー４を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規納豆菌及び該納豆菌を用いて製造された新規納豆に関し、さらに詳細には、フィターゼ酵素低活性納豆菌、及び長期安定な納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆は発酵終了後、長期間保存することで納豆菌の二次発酵を促し次に挙げる品質の劣化を引き起こす。即ち、チロシン及びストラバイト（リン酸マグネシウムアンモニウム）などの白色析出物が発生し食感を損ねること、豆色の褐変及び菌膜の喪失により外観を悪化させること、アンモニア発生による不快臭の増大などである。
【０００３】
これまで納豆の品質を長期間安定に保つ為、数々の試みが行われてきた。例えば、納豆の容器を酸素透過性の低い材質にし、脱気後密封することで二次発酵の原因である納豆菌の増殖を抑えること（特許文献１参照）、納豆容器中に酸素吸収剤を入れることで二次発酵の原因である納豆菌の増殖を抑えること（特許文献２参照）、納豆菌接種前の蒸煮大豆中に糊化米粉水溶液を添加すること（特許文献３参照）などである。
【０００４】
ただ、上記解決法を行うには容器の変更や添加物の使用など、納豆製造工程におけるコストの増大は避けることができず、そのため納豆菌の育種により、従来法と何ら変わらない製造法による解決法が切望されていた。
【特許文献１】特開平７−２３７２８号公報
【特許文献２】特開平１０−１６５１３０号公報
【特許文献３】特開２００４−２３６５５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、製造工程の追加や添加物の使用などを行わず、従来製造法のままで納豆菌の育種により長期間安定で高品質の納豆を開発し、提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、納豆品質の劣化原因のひとつである白色析出物の発生を解決する為、その構成成分の中でも特にリンにはじめて着目した。即ち、大豆中に含まれるリンの約８５％がフィチン態を形成している点に着目し、フィチンからのリンの遊離を抑え、白色析出物の原資の供給源を絶つことを試みた。
【０００７】
そこで、フィチンからのリンの遊離はこの納豆菌が生産するフィターゼが主原因であることを想定し、フィターゼをコードするｐｈｙ遺伝子を破壊することでフィターゼ活性を欠損させた納豆菌を構築し、該株を用いて納豆を作成し評価を行った。
【０００８】
保存試験の結果、仮説通りに親株と比較して有為に白色析出物の発生を抑えることができた。また、さらに驚くべきことには、納豆品質の劣化原因である豆色の褐変及び菌膜の喪失といった外観の悪化についても親株と比較して有意に改善されることを確認した。よって、フィターゼ遺伝子を欠損させた納豆菌を用いて納豆を製造することにより、納豆品質が親株のそれと比較して有為に改善できたことを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
即ち、請求項１の発明は、脱リン酸化酵素の活性を低下、または欠失させたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項２の発明は、フィターゼ酵素の活性を低下、または欠失させたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項３の発明は、請求項１または請求項２記載の変異領域がプロモーター領域を含むｐｈｙ遺伝子である納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項４の発明は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異が遺伝子組換え法により欠損されたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項５の発明は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異が突然変異法により欠損されたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項６の発明は、親株のｐｈｙ遺伝子を遺伝子組換え法により欠損させてなる納豆菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｈｙ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３７）についてである。請求項７の発明は、突然変異法によりフィターゼ酵素活性を欠失させた納豆菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＶＰＳ３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３６）についてである。
【００１０】
請求項８の発明は、請求項１〜７のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて製造されたことを特徴とする納豆についてである。請求項９の発明は、請求項８記載の納豆がスクロースなどの糖源を添加することで製造されたことを特徴とする納豆についてである。請求項１０の発明は、請求項１〜７のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて発酵されたことを特徴とする大豆加工物又は米糠などの穀類についてである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、添加物の使用などの工程を加えることなく、該納豆菌で納豆を製造することにより、長期保存条件において、白色析出物の発生抑制、豆色の褐変抑制及び菌膜の維持といった外観の良い高品質納豆を提供できる。また、本発明によれば、フィチン酸含有培地（選択培地）を用いてハローの形成の有無を確認することにより目的納豆菌をスクリーニングして育種する方法も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
フィターゼとは、フィチンを基質としてイノシトール環からリン酸基を遊離させる酵素である（ＥＣ ｎｕｍｂｅｒ：３．１．３．８）。今回は大豆成分からリンの遊離を抑制する為にフィターゼに着目したが、それ以外の脱リン酸化酵素も対象として使用可能であり、これらを１種又は２種以上を処理対象として併用することも可能である。
【００１３】
公知の通り、ｐｈｙ遺伝子がコードするフィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）という酵素によりフィチンからリンが遊離されるが、納豆菌ではその酵素の存在が既に報告されている（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５６（８）， １２６６−１２６９， １９９２）（または、特開平６−３８７４５号公報）ものの、納豆菌が生産する中性フィターゼの特性について言及されているものであり、納豆への応用例などは一切記載されていない。ましてや、ｐｈｙ遺伝子の破壊、欠損による納豆における白色析出物の抑制等の納豆の長期安定化については全く知られていない。
【００１４】
また、納豆菌の近縁種である枯草菌でもその存在が知られており（例えば、「（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１５１巻、ｐ．１１０２−１１０８、１９８２年」参照）（例えば、「（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、６４巻、ｐ．２０７９−２０８５、１９９８年」参照）（例えば、「（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、２６８巻、ｐ．３６５−３６９、２０００年」参照）、その基質特異性や至適条件など酵素の特性が示されている。
【００１５】
本発明で育種改良に用いる元の納豆菌には特に制限はないが、通常納豆工業で使用されている発酵能力に優れた納豆菌や、自然界から分離取得された納豆菌、及びさらに改良を重ねて得られる優れた納豆菌などを用いるのが望ましい。
【００１６】
納豆菌はその形態や遺伝子相同性から、枯草菌バシラス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されているが、粘質物（糸引物質）などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、バシラス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ）として分類されたり、枯草菌の変種としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏ或いはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ （ｎａｔｔｏ）などと枯草菌と区別して分類する場合もある。納豆菌としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ ＩＦＯ３００９株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３３３５株、同ＩＦＯ３３３６株、同ＩＦＯ３９３６株、同ＩＦＯ１３１６９株などがある他、各種の納豆菌が広く使用できる。
【００１７】
具体的には、市販納豆から分離したＯ−２株や該株の形質転換効率向上性変異株であるｒ２２株（特開２０００−２２４９８２号公報参照）が挙げられ、また市販の納豆種菌である高橋菌（Ｔ3株、東京農業大学菌株保存室）や宮城野菌（宮城野納豆製作所）など各種の納豆菌が適宜使用可能である。
【００１８】
本発明では、これら納豆菌のフィターゼ遺伝子を破壊し、該酵素活性を欠損させた納豆菌を育種することにより、フィチンを基質としてリンを遊離しない納豆菌を取得する。
【００１９】
育種方法の一つとして相同組換えを利用した遺伝子改良法が採用可能であるが、本方法の利点は標的遺伝子だけを特異的に欠損させることが可能であり、そのため納豆菌などの工業的に利用される微生物においては、他の優れた特性は壊さずに、欠点となっている性質に関与する遺伝子だけに変異を起こさせて改良することができる。
【００２０】
さらに、スタールらが枯草菌バシラス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において開発した相同組換え能を利用した遺伝子破壊法（例えば、「（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１５８巻、ｐ．４１１−４１８、１９８４年」参照）を納豆菌用に改変した方法も利用可能である。この方法は、最終的には、育種のための遺伝子破壊などの目的で納豆菌に導入した異種遺伝子を完全に除去することができる方法であるため、育種された菌は遺伝子組換え菌とはならないなどの長所を有している。
【００２１】
また、このような遺伝子組換え法を納豆菌で利用するには、納豆菌への遺伝子導入のための形質転換系が必要であるが、納豆菌を遺伝子導入活性が高くなる状態にするいわゆるコンピテンス法（例えば、「（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５６巻、ｐ．２０９−２２１、１９７１年」参照）が利用可能である。
【００２２】
また、納豆菌の遺伝子組換え系の一つとしては、ファージベクターを利用した形質導入法が既に開発されており（例えば、「（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、６３巻、ｐ．４０８３−４０８９、１９９７年」参照）、本発明ではこの方法も利用可能である。
【００２３】
本発明においては、上記の育種方法を用いて、納豆菌の脱リン酸に関与する遺伝子を欠損させることによって目的の長期安定な高品質納豆菌を作製する。なお、本発明においては、遺伝子の欠損には、欠失、改変、破壊等を包含するものである。
【００２４】
尚、上記のような遺伝子組換え技術以外によっても、即ち、既に目的遺伝子が欠損している納豆菌を自然界から選抜するいわゆるスクリーニング法や、薬剤やＵＶ変異法などによってこれらの遺伝子を変異欠損させるなどの突然変異法など、従来から実施されているような他の方法によっても育種が可能である。
【００２５】
ｐｈｙ遺伝子欠損納豆菌、フィターゼ酵素その他の脱リン酸化酵素の活性を低下又は欠失させた納豆菌をスクリーニングするためには、例えばフィチン酸を含有する選択培地（例、ＬＢＰＨ培地）を用い、ハローを形成しない株を選択すればよく、本発明は、このような納豆菌を選択するための選択培地及びこれを利用する有用納豆菌の育種方法も提供するものである。
【００２６】
このようにして開発されたフィターゼ欠損納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。
【００２７】
例えば、納豆は丸大豆を原料として製造されたいわゆる丸大豆納豆が一般的であるが、一部には予め挽割った大豆を原料とする挽割り納豆もある。丸大豆納豆の製造方法は、一般に原料である丸大豆を冷水に十数時間浸漬した後、蒸煮釜で加圧蒸気を用いて加圧蒸煮（１．５〜２ Ｋｇ／ｃｍ2・１２８〜１３３℃）して得られた蒸煮大豆に対して、高温状態（７０〜１００℃）で納豆菌を接種し混合した後、所定の容器に充填してから発酵室に搬入して比較的高温度（４０〜５５℃程度）で所定時間（１２〜４８時間程度）発酵させた後、５℃前後で冷蔵熟成（１２〜７２時間程度）して完成させるのが一般的である。また、挽割り納豆の場合は、予め挽割った大豆を水に浸漬する以外は、通常の丸大豆納豆の場合と同様の方法で製造される。
【００２８】
このような従来の納豆の製造方法において、本発明では発酵工程で用いる納豆菌を、前記方法によって育種改良したフィターゼ欠損納豆菌に代えて使用することによって製造される。
【００２９】
このようにして、フィターゼ欠損納豆菌を用いて生産した納豆と、従来から利用されている通常の納豆菌を用いた納豆とを比較すると、フィターゼ欠損納豆菌で製造した納豆は長期保存条件下において白色析出物の発生抑制、豆色の褐変抑制及び菌膜の維持といった外観の良い高品質納豆であることが確認できる。
【００３０】
このような長期保存条件下で高品質な納豆を目指した場合、このフィターゼ欠損納豆菌の能力と相乗効果を狙うために、蒸煮大豆中にスクロースなどの糖源を添加して発酵させることにより揮発アンモニア量を抑制させる製造法の併用も有効である。
【００３１】
また、今回の実施例での最終形態は蒸煮大豆を発酵させた納豆となるが、例えば豆乳や米糠といった穀類などを基質としてその発酵物を得る場合、本技術で得た株を用いることで品質の向上が期待できる。
【実施例】
【００３２】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
（実施例１）フィターゼ欠損納豆菌の作製
（１）基本条件
フィターゼ活性を欠損させる親株としては、納豆菌バシラス・サチラスｒ２２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｒ２２）株（以下、ｒ２２株と称する場合もある）（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）を用いた。ｒ２２株は、市販納豆から常法により分離した納豆菌であるＯ−２株を、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することにより取得した形質転換能を高めた変異株である。また、他には大腸菌ＤＨ５α（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α）株（タカラバイオ社製）を用いた。プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）及びｐＣ１９４（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
【００３４】
なお、特に記載しない限り、培養条件、培地及びその他の遺伝子組換え技術は、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、２版（１９９２）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ」の記載に従った。
また、基本的な培養は以下の表１（ＬＢ培地組成）に示すＬＢ培地を用いて行った。
【００３５】
【表１】
【００３６】
ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅には、Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を使用し、反応条件は、Ｅｘ Ｔａｑに添付のマニュアルに従った。
【００３７】
納豆菌の形質転換等は、以下の方法によった。
【００３８】
即ち、納豆菌の染色体ＤＮＡは、市販のキットを使用して調製し、形質転換は「（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５６巻、ｐ．２０９−２２１、１９７１年」の方法に従った。
納豆菌の胞子は、以下の表２（胞子形成培地組成）に示すＳｔｅｒｌｉｎｉ−Ｍａｄｅｌｓｔａｍ置換培地を用いて調製した。
【００３９】
【表２】
【００４０】
（２）ベクター構築
ベクター構築に用いた各ＤＮＡ断片の作製概略を図１に示した。
【００４１】
即ち、ｒ２２株のｐｈｙ遺伝子領域を含む約５Ｋｂｐの増幅にはプライマー１（配列表の配列番号１（図４）に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２（図５）に記載）を使用した。
ｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子の増幅には、プライマー３（配列表の配列番号３（図６）に記載）及びプライマー４（配列表の配列番号４（図７）に記載）を用いた。
【００４２】
それぞれのプライマーは、ｐｈｙ遺伝子領域をＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ：ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて塩基配列を決定し設計した。また、ｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子の塩基配列は文献情報（例えば、「（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、７７巻、１２号、ｐ．７０７９−７０８３、１９８０年」参照）を参考にして設計した。
【００４３】
即ち、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にし、プライマー１（配列表の配列番号１（図４）に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２（図５）に記載）を用いｐｈｙ遺伝子領域を含む約５Ｋｂｐを増幅した（ＤＮＡ断片１）（図１）。
【００４４】
さらに、ｐＣ１９４を鋳型にしプライマー３（配列表の配列番号３（図６）に記載）及びプライマー４（配列表の配列番号４（図７）に記載）を用いクロラムフェニコール耐性遺伝子を増幅するとともに制限酵素サイトＳｔｕＩを遺伝子両端に導入した（ＤＮＡ断片２）（図１）。
【００４５】
続いて、上記ＤＮＡ断片を用いてベクターを構築したが、その概略は図２に示した。即ち、ｐＢＲ３２２のマルチクローニングサイト上のＮｒｕＩサイトにＤＮＡ断片１を導入し、次いでＤＮＡ断片１内のＳｔｕＩサイトで切断した。そのＳｔｕＩサイトへＤＮＡ断片２を導入し、プラスミドｐＢＲＰＣ１を得た（図２）。
【００４６】
（３）形質転換
プラスミドｐＢＲＰＣ１のプラスミドＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列表の配列番号１に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２に記載）を用いｐｈｙ遺伝子領域及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む約６Ｋｂｐを増幅したＤＮＡを用いてｒ２２株へ形質転換した。形質転換株の選択はクロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地で３７℃、１８時間培養することによって行った。得られた形質転換株バシラス・サチラスｐｈｙ２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｈｙ２）株（以下、ｐｈｙ２株と称する場合もある）のｐｈｙ遺伝子は、塩基番号６３２のＳｔｕＩサイト内にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されていることが、ＰＣＲ法などによる解析によって確認された（図３）。
【００４７】
このようにして得た形質転換体は、バシラス・サチラス（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｈｙ２と命名し、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３７として国際寄託した。
【００４８】
（実施例２）納豆試作と品質評価
常法に従い、ｒ２２株、およびｐｈｙ２株の胞子液を調整した。即ち、ｒ２２株またはｐｈｙ２株を表１に示したＬＢ培地に１白菌耳植菌し、３７℃、１晩培養後、その培養液を表２に示した胞子形成培地に１％植菌し、３７℃、２４時間培養して胞子液を調製した。
【００４９】
以下、それぞれの胞子液を種菌として使用し、常法に従い納豆を試作した。即ち、極小大豆を水道水で４℃、１晩浸漬し、圧力蒸煮釜で蒸気圧１．８ＫＰａで１８分間蒸煮した。このようにして調製した蒸煮大豆に対して、上記のｒ２２株またはｐｈｙ２株の胞子液を滅菌水で１００倍に希釈し、蒸煮大豆１００ｇあたり０．８ｍｌ種菌し、４０℃で１８時間発酵した。発酵後、４℃で２４時間熟成して、納豆を調製した。
【００５０】
ｐｈｙ２株を用いて発酵を行った場合、ｒ２２株を用いて発酵した場合と比べて、発酵時間の遅延、発酵中の納豆品温の低下等は見られず、ｐｈｙ２欠損変異が納豆菌の生育に影響を及ぼさないことが分かった。
【００５１】
続いて試作により得られた納豆を、熟練した男女各１０名からなるパネルによる官能検査に供した。
その結果、親株（ｒ２２株）と変異株（ｐｈｙ２株）とで品質上に違いが見られず、ｐｈｙ２株を種菌に用いて作製した納豆が、納豆として必要な品質を具備していることが確認できた。
【００５２】
（実施例３）フィターゼ欠損納豆菌のフィターゼ活性
納豆菌のフィターゼ活性の測定は以下の方法に従った。即ち、５ｍｌのＬＢ液体培地で培養し、定常期での培養上澄液を粗酵素液とし、等量の基質溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０） ＋ １％ ｐｈｙｔｉｃ ａｃｉｄ （ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ） ＋ ２ｍＭ ＣａＣｌ2）と混ぜ、３７℃、６０〜１２０分インキュベートした。ブランクとして粗酵素液を５分間煮沸したものを使用した。反応終了後、即座に急冷し、反応液中のリンを定量キット（ホスファＣ−テストワコー（和光純薬工業製））で測定した。１分間あたり１ｐｍｏｌのリンを遊離させる酵素単位を１Ｕとして算出した結果を下記表３（フィターゼ活性）に示した（単位：Ｕ）。
【００５３】
【表３】
【００５４】
（実施例４）納豆からの白色析出物の抽出
試作により得られた納豆を長期間保存し、既報の抽出法（例えば、「（栄養と食糧）、２６巻、ｐ．４７３−４７８、１９７３年」参照）により白色析出物量を測定した。
【００５５】
保存法は、通常保存条件（１０℃保存）と過酷保存条件（２５℃保存）の２パターンで試験した。測定結果を、それぞれ、表４（通常保存条件（１０℃保存））及び表５（過酷保存条件（２５℃保存））に示した（単位：ｍｇ／１００ｇ）。
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
【００５８】
（実施例５）豆の色調の変遷
試作により得られた納豆を長期間保存（上記と同様）し、色差計によりＬ値（明度）の変遷を測定した。尚、色差計はＣＯＬＯＲ ＲＥＡＤＥＲ ＣＲ−１３（ＭＩＮＯＬＴＡ製）を使用した。
【００５９】
保存法は、通常保存条件（１０℃保存）と過酷保存条件（２５℃保存）、（３７℃保存）の３パターンで試験した。測定結果は、それぞれ、表６（通常保存条件（１０℃保存）、表７（過酷保存条件（２５℃保存）、表８（過酷保存条件（３７℃保存））に示した（単位：Ｌ値）。
【００６０】
【表６】
【００６１】
【表７】
【００６２】
【表８】
【００６３】
（実施例６）納豆菌膜の変遷
試作により得られた納豆を長期間保存（上記と同様）し、菌膜の状態を比較した。表記は○（不快を感じない）、△（不快を感じる）、×（不快を強く感じる）で表した。
保存法は、通常保存条件（１０℃保存）で試験した。測定結果を表９（通常保存条件（１０℃））に示した。
【００６４】
【表９】
【００６５】
（実施例７）納豆菌からのスクリーニング法
前述の遺伝子組換え納豆菌ｐｈｙ２株と同様の野生株をスクリーニングする手段を開発した。即ち、該株を用い以下の表１０に示すＬＢＰＨ培地を用いてハロー法選抜によりスクリーニングするものである。
【００６６】
実際に納豆菌ｐｈｙ２株とその親株であるｒ２２株を該培地にて３７℃、一晩培養させたところ、親株は白濁した培地上にそのコロニー周辺に透明なハローを形成したことに対し、ｐｈｙ２株ではハローを形成しなかった。この培地を使用することにより、遺伝子組換え技術を用いない野生株からフィターゼ欠損株をスクリーニングすることが可能である。該方法については、親株を薬剤処理またはＵＶ（紫外線）照射などにより突然変異を誘導させ、スクリーニングを効率化することができる。
【００６７】
薬剤処理法として、例えばニトロソグアニジンを使用する方法がある。即ち、５ｍｌのＬＢ培地に親株を植菌し、３７℃で一晩培養させ、その培養液の２％を１００ｍｌのＬＢ培地に植菌し３時間培養する。続いて集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）で２回洗浄する。その後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）４ｍｌで懸濁し、終濃度２００μｇ／ｍｌのニトロソグアニジン溶液を添加し、３０℃で１時間処理する。続いて集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）５ｍｌ及びＬＢ培地５ｍｌでそれぞれ２回ずつ洗浄し、最後にＬＢ培地５ｍｌを添加し３７℃で３時間培養させ、適量をＬＢＰＨ培地に植菌する。表１０にＬＢＰＨ培地組成を示す。
【００６８】
【表１０】
【００６９】
実際に、親株をＯＵＶ２３４８１株（特許文献 特開２０００−２８７６７６号公報）とした納豆菌から、上記薬剤処理法を用いてスクリーニングを行ったところ、ハローを形成しないコロニーを選抜することができた（ＶＰＳ３７株）。ＶＰＳ３７株のフィターゼ活性、過酷条件での保存試験を行ったところ、遺伝子組換え株である納豆菌ｐｈｙ２株と同様の効果を見出し、組換え株以外でも該スクリーニング法により長期保存条件下において白色析出物の発生抑制、豆色の褐変抑制及び菌膜の維持といった外観の良い高品質納豆を作成できる納豆菌を取得することができた。
【００７０】
このようにして分離して得た突然変異株は、バシラス・サチラス（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＰＳ３７と命名し、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３６として国際寄託した。
【００７１】
ＶＰＳ３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３６）のフィターゼ活性を測定し、測定結果を下記表１１に示した（単位：Ｕ）。
【００７２】
【表１１】
【００７３】
ＶＰＳ３７株（突然変異株）の通常保存条件（１０℃）、及び過酷保存条件（２５℃）での白色析出物の発生量（ｍｇ／１００ｇ）の経日変化を、それぞれ、表１２及び表１３に示した。なお、ＯＵＶ２３４８１は親株である。
【００７４】
【表１２】
【００７５】
【表１３】
【００７６】
また、ＶＰＳ３７株の通常保存条件（１０℃）、及び、過酷保存条件（２５℃）において保存した場合の豆の色調の変遷（Ｌ値）（経日変化）を、それぞれ、表１４及び表１５に示した。
【００７７】
【表１４】
【００７８】
【表１５】
【００７９】
更に、ＶＰＳ３７株の通常保存条件（１０℃）での納豆菌膜の変遷を表１６に示した。表中、○は不快を感じない、△は不快を感じる、×は不快を強く感じるを示し、ｄａｙｓは日数を示す。
【００８０】
【表１６】
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ＤＮＡ断片作製の概略を示した図である。
【図２】ベクター構築の概略を示す図である。
【図３】ｐｈｙ遺伝子欠損工程の概略を示す図である。
【図４】プライマー１を示す。
【図５】プライマー２を示す。
【図６】プライマー３を示す。
【図７】プライマー４を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱リン酸化酵素の活性を低下、または欠失させたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌。
【請求項２】
フィターゼ酵素の活性を低下、または欠失させたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌。
【請求項３】
請求項１または請求項２記載の変異領域がプロモーター領域を含むｐｈｙ遺伝子である納豆菌を含むバシラス属の菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異が遺伝子組換え法により欠損されたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異が突然変異法により欠損されたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌。
【請求項６】
親株のｐｈｙ遺伝子を遺伝子組換え法により欠損させてなる納豆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｈｙ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３７）。
【請求項７】
突然変異法によりフィターゼ酵素活性を欠損させた納豆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＶＰＳ３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３６）。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて製造されたことを特徴とする納豆。
【請求項９】
請求項８記載の納豆がスクロースなどの糖源を添加することで製造されたことを特徴とする納豆。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて発酵されたことを特徴とする大豆加工物又は米糠などの穀類。
【請求項１】
脱リン酸化酵素の活性を低下、または欠失させたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌。
【請求項２】
フィターゼ酵素の活性を低下、または欠失させたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌。
【請求項３】
請求項１または請求項２記載の変異領域がプロモーター領域を含むｐｈｙ遺伝子である納豆菌を含むバシラス属の菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異が遺伝子組換え法により欠損されたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異が突然変異法により欠損されたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌。
【請求項６】
親株のｐｈｙ遺伝子を遺伝子組換え法により欠損させてなる納豆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｈｙ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３７）。
【請求項７】
突然変異法によりフィターゼ酵素活性を欠損させた納豆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＶＰＳ３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３６）。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて製造されたことを特徴とする納豆。
【請求項９】
請求項８記載の納豆がスクロースなどの糖源を添加することで製造されたことを特徴とする納豆。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて発酵されたことを特徴とする大豆加工物又は米糠などの穀類。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００７−１４２９８（Ｐ２００７−１４２９８Ａ）
【公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２０１３３９（Ｐ２００５−２０１３３９）
【出願日】平成１７年７月１１日（２００５．７．１１）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１１日（２００５．７．１１）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
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