フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース測定方法
【課題】公知のＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの欠点を克服し、広い温度域において十分な反応性を有し、且つ、基質特異性に優れた改変型ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを提供すること。
【解決手段】ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを遺伝子レベルで改変することで、改変前のＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼよりも温度依存性が改善し且つ、キシロース作用性が低下した改変型ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
【解決手段】ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを遺伝子レベルで改変することで、改変前のＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼよりも温度依存性が改善し且つ、キシロース作用性が低下した改変型ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤＧＤＨとも表す。）を用いるグルコース（血糖）測定方法に関するもので、特に、温度依存性が改善されたグルコース測定方法に関する。
また、本発明は、温度依存性が改善された改変型ＦＡＤＧＤＨ、該改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子、該改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法及び該改変型ＦＡＤＧＤＨのグルコース測定試薬への種々の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖尿病の発生率は年々増加傾向にあり、更に糖尿病予備軍といわれる人数を合わせると、日本国内だけでも１０００万人以上の数になると推測されている。また、生活習慣病への関心が非常に高まっていることもあり、血糖値を自己管理する機会は増加している。こうした時代背景において、血糖自己測定モニターのための技術開発は、糖尿病患者が日常の血糖値を管理するための重要な技術である。血糖測定技術に関しては、多くの方法で実用化が進んでおり、検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点で電気化学的なセンシングが有利である。
【０００３】
血糖測定技術におけるセンシングの手法としては血液中のグルコースを基質とする酵素が利用される。そのような酵素の例としてはグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性や熱に対する安定性が高いという利点があった。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサはグルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に流れることで測定されるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを溶存酸素に渡しやすいため測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００４】
このような問題を回避するために、ピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＰＱＱＧＤＨとも表す。）（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサ用酵素として用いられている。ＰＱＱＧＤＨは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【０００５】
そこで、溶存酸素の影響を受けず、なおかつ基質特異性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨとも表す。）としてフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨと記載する。）が注目されている。ＦＡＤＧＤＨは非特許文献１〜６に記載されており、古くから知られている。
また、特許文献１にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ（アスペルギルス・テレウス）由来ＦＡＤＧＤＨの遺伝子配列、アミノ酸配列が記載されている。
また、特許文献２にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨが、特許文献３にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨを改変し、熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨが記載されている。特許文献４にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを改変し、熱安定性およびキシロース作用性を改善した改変型ＦＡＤＧＤＨが記載されている。
【０００６】
一方、医療と検査機器・試薬という業界紙において、『ＳＭＢＧ装置とＰＯＣＴ対応血糖測定装置のすみ分け』（２００９年３２（６）Ｐ．７０７−７１３）の中で、ＳＭＢＧ（血糖自己測定（Ｓｅｌｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ））装置の注意点として、環境温度条件が低温度域および高温度域の場合に、測定値がＩＳＯ１５１９７の許容範囲から外れる装置も多く、測定値が極端に低値や高値を示す場合は医療事故の要因になりうることを指摘している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０５８９５８
【特許文献２】特開２００７−２８９１４８
【特許文献３】特開２００８−２３７２１０
【特許文献４】ＷＯ２００８／０５９７７７
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５
【非特許文献５】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （１９６７）２４２：３６６５−３６７２
【非特許文献６】Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９６）５６：３０１−３１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、上述のような公知のグルコース（血糖）測定方法に関する問題点を解消あるいは低減し、実用面においてさらに有利なグルコース測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、特に、環境温度による測定値のばらつきや異常に焦点をあてて考察したところ、以下のような問題点が存在する可能性を見出した。
【００１１】
酵素反応温度に関して、開発の段階においては、酵素反応条件は、特定の温度（たとえば３７℃）での検討が中心になるのに対し、現実に糖尿病患者がグルコースセンサーを用いてグルコース測定が行われる温度は、室温である。したがって、酵素に、温度による反応性の差異（酵素活性の変動）があれば、測定値にばらつきが生じることはありうる。
しかし、酵素を用いた物質量の測定においては、基質である測定対象物質に対して十分量の酵素を用いることが当業者の常識であり、そうしている限り、多少の酵素活性の変動は測定値に殆ど影響を与えないはずである。
【００１２】
しかし、現実に業として供給されているグルコースセンサーなどでは、コストダウン等の理由により使用する酵素の量を最小限に抑えている可能性が考えられる。
すなわち、環境温度による測定値のばらつきが起こる原因は、酵素に、環境温度による反応性の差異があると考えられるためで、酵素の添加濃度が低いことから、通常当業者が想定する反応系では起こり得ない幅の測定値のばらつきや異常が生じていると考えられた。
【００１３】
本発明者らは、上記の考察を基に、特許文献２あるいは特許文献３に開示された公知のＦＡＤＧＤＨの温度依存性を検討してみた。すると、３７℃における活性値を１００％とした場合に、２５℃における活性値が６３％、５℃における活性値が４０％であった。このことから、本ＦＡＤＧＤＨはグルコース濃度を測定する際の温度変化によって、測定精度が低下することがわかった。
【００１４】
この環境温度による反応性の差異を縮小することができれば、測定精度や正確性を向上することが期待できる。（本願においては、この至適温度の山をなだらかにすることを温度依存性の改善と表現する。）
【００１５】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、公知のＦＡＤＧＤＨの特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することで、改変前の野生型ＦＡＤＧＤＨよりも温度依存性が改善した改変型ＦＡＤＧＤＨを見出し、それを用いてグルコース測定系を組むことで、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
以下のいずれかで示される、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（以下、ＦＡＤＧＤＨとも記載）。
（１）配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
（２）配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
［項２］
項１に記載のタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
［項３］
項１または２に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
［項４］
項３に記載の遺伝子を含むベクター。
［項５］
項４に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
［項６］
項５に記載の形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。
［項７］
項１または２に記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
［項８］
項１または２に記載のタンパク質を含むグルコースセンサー。
［項９］
項１または２に記載のタンパク質を用いるグルコース測定法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、正確性・精密性に優れたグルコース測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本願明細書において、アミノ酸配列はアスファベット１文字または３文字で表記する。また、アミノ酸の変異の位置については次のように表記する。例えば、「Ｇ５９Ａ」は５９位のＧ（Ｇｌｙ）がＡ（Ａｌａ）に置換することを意味する。なお、配列番号１、２において、アミノ酸の表記は、メチオニンを１として番号付けされている。
【００１９】
本願発明の一実施形態は、以下のいずれかで示される、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質である。
（１）配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
（２）配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
【００２０】
ここで、配列番号１、２は、野生型のアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列である。
これらのアミノ酸配列は、特許文献１により公知である。
【００２１】
上記のタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。
【００２２】
本願発明のタンパク質は、改変前よりも温度依存性が改善し、および／または、キシロース作用性が低下した改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００２３】
例えば、上記の実施形態において、その４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれかにおけるアミノ酸置換が、Ｎ４６Ａ、Ｇ４９Ｎ、Ｇ４９Ｆ、Ｇ４９Ｖ、Ｇ４９Ｒ、Ｇ４９Ｉ、Ｇ４９Ｍ、Ｇ４９Ｌ、Ｇ４９Ｑ、Ｇ４９Ｄ、Ｇ４９Ｃ、Ｇ４９Ｗ、Ｇ４９Ｔ、Ｇ４９Ｅ、Ｇ４９Ｋ、Ｇ４９Ａ、Ｇ４９Ｓ、Ｙ５０Ｋ、Ｙ５０Ｉ、Ｙ５０Ｖ、Ｙ５０Ｑ、Ｙ５０Ｈ、Ｙ５０Ｃ、Ｙ５０Ｐ、Ｙ５０Ｎ、Ｙ５０Ｓ、Ｙ５０Ａ、Ｙ５０Ｄ、Ｙ５０Ｅ、Ｙ５０Ｒ、Ｙ５０Ｍ、Ｙ５０Ｔ、Ｙ５０Ｇ、Ｆ５４Ｄ、Ｆ５４Ｓ、Ｆ５４Ｅ、Ｆ５４Ｑ、Ｆ５４Ｃ、Ｆ５４Ｎ、Ｆ５４Ｔ、Ｆ５４Ａ、Ｆ５４Ｙ、Ｆ５４Ｍ、Ｇ５５Ｔ、Ｇ５５Ｋ、Ｇ５５Ｐ、Ｇ５５Ｉ、Ｇ５５Ｈ、Ｇ５５Ｌ、Ｇ５５Ｖ、Ｇ５５Ｙ、Ｇ５５Ｍ、Ｇ５５Ｗ、Ｒ７８Ｓ、Ｒ７８Ｐ、Ｒ７８Ｆ、Ｒ７８Ｑ、Ｒ７８Ｇ、Ｒ７８Ａ、Ｒ７８Ｄ、Ｒ７８Ｌ、Ａ１０４Ｎ、Ａ１０４Ｙ、Ａ１０４Ｗ、Ａ１０４Ｐ、Ａ１０４Ｍ、およびＡ１０４Ｄからなる群のうちいずれかであるＦＡＤＧＤＨは、改変前よりも温度依存性が改善した改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００２４】
例えば、上記の実施形態において、その４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれかにおけるアミノ酸置換が、Ｎ４６Ｌ、Ｇ４９Ａ、Ｇ４９Ｋ、Ｇ４９Ｄ、Ｇ４９Ｅ、Ｇ４９Ｓ、Ｇ４９Ｃ、Ｇ４９Ｔ、Ｆ５４Ｉ、Ｆ５４Ｈ、Ｆ５４Ｍ、Ｆ５４Ｎ、Ｆ５４Ｙ、Ｇ５５Ｄ、およびＲ７８Ｈからなる群のうちいずれかであるＦＡＤＧＤＨは、改変前よりもキシロース作用性が低下した改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００２５】
例えば、上記の実施形態において、その４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれかにおけるアミノ酸置換が、Ｇ４９Ａ、Ｇ４９Ｋ、Ｇ４９Ｄ、Ｇ４９Ｅ、Ｇ４９Ｓ、Ｇ４９Ｃ、Ｇ４９Ｔ、Ｆ５４Ｍ、Ｆ５４Ｎ、およびＦ５４Ｙからなる群のうちいずれかであるＦＡＤＧＤＨは、改変前よりも温度依存性が改善し、且つ、キシロース作用性が低下した改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００２６】
なお、上記の変換位置は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１、２）における同等の位置であっても良い。この同等の位置は、そのアミノ酸配列の一次構造（例えばアラインメント）、立体構造の知見を基に判断することができる。
本願明細書においては、例えばあるアミノ酸配列における配列番号１の４６位と同等の位置は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで配列の一次構造（例えばアラインメント）を比較したとき、配列番号１の４６位と対応する位置をもって同等と判断する。必要に応じてさらに立体構造の知見などを参照しても良い。
なお、ＧＥＮＥＴＹＸソフトは、ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮから販売されているＧＥＮＥＴＹＸ ＷＩＮ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１のものを使用した。
【００２７】
温度依存性
本願において、温度依存性とは、温度変化に伴って酵素活性が変化することを意味する。温度依存性の改善とは酵素活性の変化が少なく、広い範囲で一定の酵素活性を示すことを意味する。
「温度依存性が改善されているか」を判断する方法は以下のとおりである。
（１）３７℃、２４時間処理後における活性値（Ｕ／ｍｌ）を測定し、これをＡとする。
（２）２５℃、２４時間処理後における活性値（Ｕ／ｍｌ）を測定し、これをＢとする。
（３）Ａを１００％としたときのＢの相対値（％）を計算し、これをＣ（表１〜７における「温度依存性」）とする。
（４）野生型酵素（ＷＴ）のＣの値を１とし、それぞれの改変型酵素の相対値を計算しなおす。これをＤ（表１〜７における「温度依存性比」）とする。
（５）野生型酵素（ＷＴ）においてＡ＞Ｂであれば、改変型酵素がＤ＞１であって値が大きいほど温度依存性は改善されていると判断する。野生型酵素（ＷＴ）においてＡ＜Ｂであれば、改変型酵素がＤ＜１であって値が小さいほど温度依存性は改善されていると判断する。
【００２８】
後述の実施例（表１〜表７参照）において、２５℃と３７℃の反応温度で活性を測定することにより、３７℃での活性測定値を１００％とした場合の２５℃での活性測定値の割合（％）を調べた。２５℃における野生型の活性値は約５０〜５４％を示していた。
温度依存性が５５％以上を示すフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。
温度依存性は、好ましくは６０％以上であり、更に好ましくは６５％以上であり、更に好ましくは７０％以上であり、更に好ましくは７５％以上である。
これらの効果のある変異部位をさらに組合せることにより、相加・相乗効果が期待できる。
【００２９】
キシロース作用性
また、キシロース作用性とは、グルコースを基質とした場合の反応速度とキシロースを基質とした場合の反応速度の相対比％（グルコースを１００％とする。）である。
次いで、野生型酵素（ＷＴ）のキシロ−ス作用性の値を１とし、それぞれの改変型酵素の相対比％を計算しなおす。これが表１〜７における「キシロース作用性比」）である。この値が小さいほど、キシロース作用性が低下していると判断される。
【００３０】
後述の実施例（表１〜表７参照）において、野生型のグルコースに対する活性値を１００％とした場合、キシロースに対する活性値比率は、８．１〜１０．０％となっていた。
キシロースに対する反応性が８．０％以下を示すフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。
キシロースに対する反応性は、好ましくは７．０％以下であり、更に好ましくは６．０％以下であり、更に好ましくは５．５％以下であり、更に好ましくは５．０％以下である。
これらの効果のある変異部位をさらに組合せることにより、相加・相乗効果が期待できる。
【００３１】
本願発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、好ましくは、温度依存性比が改変前と比べて１．０２以上に改善している改変型ＦＡＤＧＤＨである。さらに好ましくは、改変前と比べて１．１０以上向上している改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００３２】
本願発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、好ましくは、キシロース作用性比が改変前と比べて０．９以下に低減している改変型ＦＡＤＧＤＨである。さらに好ましくは、改変前と比べて０．８以下に低減している改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００３３】
温度依存性およびキシロース作用性の測定方法は、後述のＦＡＤＧＤＨの活性測定法を用いて求める。
【００３４】
本願発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、種々の公知の手段で作製することが出来る。
以下に、配列番号１、２で示される野生型のアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨを改変したＦＡＤＧＤＨ改変体の製造法を例示する。製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。
ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社， ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製， Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００３５】
作製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物に移入され、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００などが利用できる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００３６】
なお、これらの過程で得られた、ＦＡＤＧＤＨ改変体をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体も、本発明の実施形態として含まれる。
【００３７】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨの改変の基になる遺伝子は、特に限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のＦＡＤＧＤＨを用いることが望ましい。さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来あるいはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨであることが望ましい。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨとしては、配列番号１、２で表されるタンパク質が例示できる。
【００３８】
本願発明の一実施形態は、上記のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００３９】
改変前のタンパク質をコードする遺伝子として、たとえば、上記の配列番号１、２で表されるタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号３、４で表される塩基配列が例示できる。
本願発明の遺伝子は、上記改変前のタンパク質をコードする遺伝子の配列において、４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれかのアミノ酸、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をコードする部分が、他のアミノ酸をコードするように置換されている。
【００４０】
本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体をコードする遺伝子は、配列番号３、４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＡＤＧＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡである。ここでストリンジェントな条件とは、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドのＴｍから該Ｔｍより１５℃、好ましくは１０℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。具体的には、例えば一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。本発明において、配列番号３、４に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列と５０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、さらに好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ配列をコードする塩基配列がストリンジェントな条件に相当すると考えられる。
【００４１】
本願発明の遺伝子は、たとえばＧＤＨの発現を向上させる目的などで、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更したものを含みうる。
【００４２】
本願発明の一実施形態は、上記の遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取するグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法である。
【００４３】
例えば、上記のＧＤＨ遺伝子を発現用ベクター（プラスミド等多くのものが当該技術分野において知られている）に挿入し、適当な宿主（大腸菌等多くのものが当該技術分野において知られている）を形質転換する。得られた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００４４】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００４５】
これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）タンパク質実験プロトコール第１巻 機能解析編，第２巻 構造解析編 （秀潤社） 西村善文，大野茂男 監修
（ｂ）改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
また、以下に例示する方法によって進めることもできる。
【００４６】
作製されたタンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、ベクターと連結された状態にて宿主微生物中に移入される。
【００４７】
ベクターとしては、宿主微生物内で自立的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例示される。なかでも、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど、クローニングサイト上流にエシェリヒア・コリー内で認識されうるプロモーターを保持するものが好ましい。
また、適当な宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自立増殖可能で外来遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。エシェリヒア・コリーではエシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＨＢ１０１、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどを用いることができる。
【００４８】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いても良い。宿主として、酵母が用いられる場合にリチウム法、エレクトロポレーション法が、また、糸状菌が用いられ場合にはプロトプラスト法などが用いられる。
【００４９】
本発明において、ＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。アスペルギルス・テレウスのゲノム配列情報を用い、予測ＧＤＨ遺伝子を見出すことができる。ついで、アスペルギルス・テレウスの菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。こうして得られたｃＤＮＡをテンペレートとして、ＰＣＲ法によりＧＬＤ遺伝子を増幅させ、本遺伝子をベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーを利用してＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換え微生物を得る。
【００５０】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。組換え体の選択は、ベクターのマーカーとＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００５１】
ＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００５２】
上記のようにして、一度選択されたＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、他の微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる他の微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法、プロトプラスト法などを用いることができる。
【００５３】
なお、本発明のＧＤＨ遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、該遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよい。
【００５４】
野生型ＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００５５】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、宿主として糸状菌を使用し、固体培養で行った方が有利な場合もある。
【００５６】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００５７】
培養温度は菌が成育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜３７℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ５．０〜８．０程度の範囲である。
【００５８】
培養物中のＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００５９】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００６０】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００６１】
本発明において、ＦＡＤＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
２４ｍＭ ＰＭＳ溶液
２．０ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液２１．９ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液１．０ｍｌ、ＰＭＳ溶液２．０ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４．５ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００６２】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。また、２５℃での活性値を測定する場合は、上記の３７℃と表記した操作を２５℃に変更して測定する。キシロースに対する反応性を測定する際は、上記の１Ｍ Ｄ−グルコース溶液の代わりに１Ｍ Ｄ−キシロースを使用すればよい。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００６３】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００６４】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００６５】
グルコース測定法
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００６６】
本発明のグルコース測定に用いる試料は血液であり、ヒトの体温に近い温度（３７℃付近）であるが、血糖の測定は、通常、温度が厳密に調整されていない室温で行われるため、実際の測定温度は室温付近から体温付近の間、例えば２５℃以上３７℃以下の範囲内で行われる。
本発明のグルコース測定方法においては、例えば、上述の温度依存性が改善したＦＡＤＧＤＨを用いることが好ましく、それによって、広い温度範囲で、より正確性・精密性の高い測定値を得ることが容易になる。
【００６７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例１】
【００６８】
実施例１ アスペルギルス・テレウス由来の改変型ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の作製
アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨ（配列番号２）をコードする遺伝子（配列番号４）を含む組み換えプラスミドｐＡＴＧＤＨ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩培養した。得られた形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた菌体から常法によりプラスミドｐＡＴＧＤＨ２を調製した。
このｐＡＴＧＤＨ２プラスミドを鋳型として、４６番目のアスパラギンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨプラスミドを作製した。
【００６９】
上記と同様の方法にて、４９番目のグリシンについても部位特異的アミノ酸置換を行った。ｐＡＴＧＤＨプラスミドを鋳型として、４９番目のグリシンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。
【００７０】
上記と同様の方法にて、５０番目のチロシンについても部位特異的アミノ酸置換を行った。ｐＡＴＧＤＨプラスミドを鋳型として、５０番目のチロシンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。
【００７１】
上記と同様の方法にて、５４番目のフェニルアラニンについても部位特異的アミノ酸置換を行った。ｐＡＴＧＤＨプラスミドを鋳型として、５４番目のフェニルアラニンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。
【００７２】
上記と同様の方法にて、５５番目のグリシンについても部位特異的アミノ酸置換を行った。ｐＡＴＧＤＨプラスミドを鋳型として、５５番目のグリシンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。
【００７３】
上記と同様の方法にて、７８番目のアルギニンについても部位特異的アミノ酸置換を行った。ｐＡＴＧＤＨプラスミドを鋳型として、７８番目のアルギニンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。
【００７４】
上記と同様の方法にて、１０４番目のアラニンについても部位特異的アミノ酸置換を行った。ｐＡＴＧＤＨプラスミドを鋳型として、１０４番目のアラニンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。
【００７５】
これらの改変型ＦＡＤＧＤＨプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地で３０℃、１６時間培養した。その後、改変型ＦＡＤＧＤＨを有したシングルコロニーを、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカした後、アンピシリンを含むＬＢ液体培地に摂取して、３０℃で一晩振とう培養した。その後、１ｍｌの培養液を摂取し、常法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの当該部位をＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて特定した。
【実施例２】
【００７６】
実施例２ アスペルギルス・テレウス由来の改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性の比較検討
実施例１で確認した野生型とは異なるアミノ酸種に部位特異的変異している形質転換株を１５ｍｌのアンピシリンを含むTＢ液体培地に植菌して、２５℃、６４時間培養した。培養液全量を集菌した後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、ガラスビーズを用いて該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
得られた粗酵素液は、試験例に示した活性測定法を基本として、２５℃と３７℃の反応温度で活性を測定することにより、３７℃での活性測定値を１００％とした場合の２５℃での活性測定値の割合（％）を調べた。２５℃における野生型の活性値は約５０〜５４％を示していた。野生型の活性値比率と比べて上昇しているものは温度依存性が改善されていると考えられた。
Ｎ４６Ａ、またはＧ４９Ｎ、またはＧ４９Ｆ、またはＧ４９Ｖ、またはＧ４９Ｒ、またはＧ４９Ｉ、またはＧ４９Ｍ、またはＧ４９Ｌ、またはＧ４９Ｑ、またはＧ４９Ｄ、またはＧ４９Ｃ、またはＧ４９Ｗ、またはＧ４９Ｔ、またはＧ４９Ｅ、またはＧ４９Ｋ、またはＧ４９Ａ、またはＧ４９Ｓ、またはＹ５０Ｋ、またはＹ５０Ｉ、またはＹ５０Ｖ、またはＹ５０Ｑ、またはＹ５０Ｈ、またはＹ５０Ｃ、またはＹ５０Ｐ、またはＹ５０Ｎ、またはＹ５０Ｓ、またはＹ５０Ａ、またはＹ５０Ｄ、またはＹ５０Ｅ、またはＹ５０Ｒ、またはＹ５０Ｍ、またはＹ５０Ｔ、またはＹ５０Ｇ、またはＦ５４Ｄ、またはＦ５４Ｓ、またはＦ５４Ｅ、またはＦ５４Ｑ、またはＦ５４Ｃ、またはＦ５４Ｎ、またはＦ５４Ｔ、またはＦ５４Ａ、またはＦ５４Ｙ、またはＦ５４Ｍ、またはＧ５５Ｔ、またはＧ５５Ｋ、またはＧ５５Ｐ、またはＧ５５Ｉ、またはＧ５５Ｈ、またはＧ５５Ｌ、またはＧ５５Ｖ、またはＧ５５Ｙ、またはＧ５５Ｍ、またはＧ５５Ｗ、またはＲ７８Ｓ、またはＲ７８Ｐ、またはＲ７８Ｆ、またはＲ７８Ｑ、またはＲ７８Ｇ、またはＲ７８Ａ、またはＲ７８Ｄ、またはＲ７８Ｌ、またはＡ１０４Ｎ、またはＡ１０４Ｙ、またはＡ１０４Ｗ、またはＡ１０４Ｐ、またはＡ１０４Ｍ、またはＡ１０４Ｄのアミノ酸置換した改変型ＦＡＤＧＤＨにおいて温度依存性の顕著な改善効果が見られた。
【００７７】
表１の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの４６位のNを１７種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００７８】
【表１】
【００７９】
表２の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの４９位のＧを１６種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００８０】
【表２】
【００８１】
表３の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの５０位のＹを１８種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００８２】
【表３】
【００８３】
表４の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの５４位のＦを１４種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００８４】
【表４】
【００８５】
表５の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの５５位のＧを１６種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００８６】
【表５】
【００８７】
表６の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの７８位のＲを１４種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００８８】
【表６】
【００８９】
表７の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの１０４位のＡを１４種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００９０】
【表７】
【実施例３】
【００９１】
実施例３ アスペルギルス・テレウス由来の改変型ＦＡＤＧＤＨのキシロース作用性の比較検討
実施例１で確認した野生型とは異なるアミノ酸種に部位特異的変異している形質転換株を１５ｍｌのアンピシリンを含むTＢ液体培地に植菌して、２５℃、６４時間培養した。培養液全量を集菌した後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、ガラスビーズを用いて該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
得られた粗酵素液は、試験例に示した活性測定法を基本として、グルコースの代わりにキシロースを基質として、活性値を測定した。そして、グルコースを基質とした場合の活性値を１００％として、キシロースを基質とした場合の活性値の割合（％）を調べた。野生型のキシロースに対する活性値比率（８．１〜１０．０％）と比べて減少しているものが、キシロースに対する反応性が低下して、グルコースに対する特異性が向上していると考えた。
Ｎ４６Ｌ、またはＧ４９Ａ、またはＧ４９Ｋ、またはＧ４９Ｄ、またはＧ４９Ｅ、またはＧ４９Ｓ、またはＧ４９Ｃ、またはＧ４９Ｔ、またはＦ５４Ｉ、またはＦ５４Ｈ、またはＦ５４Ｍ、またはＦ５４Ｎ、またはＦ５４Ｙ、またはＧ５５Ｄ、またはＲ７８Ｈのアミノ酸置換した改変型ＦＡＤＧＤＨにおいてキシロースの対する反応性が低下する顕著な改善効果が見られた。
Ｇ４９Ａ、またはＧ４９Ｋ、またはＧ４９Ｄ、またはＧ４９Ｅ、またはＧ４９Ｓ、またはＧ４９Ｃ、またはＧ４９Ｔ、またはＦ５４Ｍ、またはＦ５４Ｎ、またはＦ５４Ｙのアミノ酸置換した改変型ＦＡＤＧＤＨにおいては、温度依存性と共に、キシロースの対する反応性が低下する2重の改善効果が見られた。
【００９２】
表１の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの４６位のNを１７種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
表２の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの４９位のＧを１６種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
表３の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの５０位のＹを１８種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
表４の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの５４位のＦを１４種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
表５の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの５５位のＧを１６種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
表６の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの７８位のＲを１４種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
表７の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの１０４位のＡを１４種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
【００９３】
また、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨ（配列番号１）をコードする遺伝子（配列番号３）を含む組み換えプラスミドｐＡＴＧＤＨ１で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩培養した。得られた形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた菌体から常法によりプラスミドｐＡＴＧＤＨ１を調製した。
このｐＡＴＧＤＨ１プラスミドを鋳型として、先と同様の方法にて、配列番号１のアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれかの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨプラスミドを作製した。
【００９４】
これらの改変型ＦＡＤＧＤＨプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した改変型ＦＡＤＧＤＨについても、同様の検討を行い、同じ変異体で温度依存性およびキシロース作用性の低下において、同程度の改善効果が見られることを確認している。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明による温度依存性が改善し、且つ、基質特異性が向上したＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを利用することにより、グルコース測定の精度向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ大である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤＧＤＨとも表す。）を用いるグルコース（血糖）測定方法に関するもので、特に、温度依存性が改善されたグルコース測定方法に関する。
また、本発明は、温度依存性が改善された改変型ＦＡＤＧＤＨ、該改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子、該改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法及び該改変型ＦＡＤＧＤＨのグルコース測定試薬への種々の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖尿病の発生率は年々増加傾向にあり、更に糖尿病予備軍といわれる人数を合わせると、日本国内だけでも１０００万人以上の数になると推測されている。また、生活習慣病への関心が非常に高まっていることもあり、血糖値を自己管理する機会は増加している。こうした時代背景において、血糖自己測定モニターのための技術開発は、糖尿病患者が日常の血糖値を管理するための重要な技術である。血糖測定技術に関しては、多くの方法で実用化が進んでおり、検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点で電気化学的なセンシングが有利である。
【０００３】
血糖測定技術におけるセンシングの手法としては血液中のグルコースを基質とする酵素が利用される。そのような酵素の例としてはグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性や熱に対する安定性が高いという利点があった。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサはグルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に流れることで測定されるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを溶存酸素に渡しやすいため測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００４】
このような問題を回避するために、ピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＰＱＱＧＤＨとも表す。）（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサ用酵素として用いられている。ＰＱＱＧＤＨは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【０００５】
そこで、溶存酸素の影響を受けず、なおかつ基質特異性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨとも表す。）としてフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨと記載する。）が注目されている。ＦＡＤＧＤＨは非特許文献１〜６に記載されており、古くから知られている。
また、特許文献１にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ（アスペルギルス・テレウス）由来ＦＡＤＧＤＨの遺伝子配列、アミノ酸配列が記載されている。
また、特許文献２にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨが、特許文献３にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨを改変し、熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨが記載されている。特許文献４にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを改変し、熱安定性およびキシロース作用性を改善した改変型ＦＡＤＧＤＨが記載されている。
【０００６】
一方、医療と検査機器・試薬という業界紙において、『ＳＭＢＧ装置とＰＯＣＴ対応血糖測定装置のすみ分け』（２００９年３２（６）Ｐ．７０７−７１３）の中で、ＳＭＢＧ（血糖自己測定（Ｓｅｌｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ））装置の注意点として、環境温度条件が低温度域および高温度域の場合に、測定値がＩＳＯ１５１９７の許容範囲から外れる装置も多く、測定値が極端に低値や高値を示す場合は医療事故の要因になりうることを指摘している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０５８９５８
【特許文献２】特開２００７−２８９１４８
【特許文献３】特開２００８−２３７２１０
【特許文献４】ＷＯ２００８／０５９７７７
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５
【非特許文献５】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （１９６７）２４２：３６６５−３６７２
【非特許文献６】Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９６）５６：３０１−３１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、上述のような公知のグルコース（血糖）測定方法に関する問題点を解消あるいは低減し、実用面においてさらに有利なグルコース測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、特に、環境温度による測定値のばらつきや異常に焦点をあてて考察したところ、以下のような問題点が存在する可能性を見出した。
【００１１】
酵素反応温度に関して、開発の段階においては、酵素反応条件は、特定の温度（たとえば３７℃）での検討が中心になるのに対し、現実に糖尿病患者がグルコースセンサーを用いてグルコース測定が行われる温度は、室温である。したがって、酵素に、温度による反応性の差異（酵素活性の変動）があれば、測定値にばらつきが生じることはありうる。
しかし、酵素を用いた物質量の測定においては、基質である測定対象物質に対して十分量の酵素を用いることが当業者の常識であり、そうしている限り、多少の酵素活性の変動は測定値に殆ど影響を与えないはずである。
【００１２】
しかし、現実に業として供給されているグルコースセンサーなどでは、コストダウン等の理由により使用する酵素の量を最小限に抑えている可能性が考えられる。
すなわち、環境温度による測定値のばらつきが起こる原因は、酵素に、環境温度による反応性の差異があると考えられるためで、酵素の添加濃度が低いことから、通常当業者が想定する反応系では起こり得ない幅の測定値のばらつきや異常が生じていると考えられた。
【００１３】
本発明者らは、上記の考察を基に、特許文献２あるいは特許文献３に開示された公知のＦＡＤＧＤＨの温度依存性を検討してみた。すると、３７℃における活性値を１００％とした場合に、２５℃における活性値が６３％、５℃における活性値が４０％であった。このことから、本ＦＡＤＧＤＨはグルコース濃度を測定する際の温度変化によって、測定精度が低下することがわかった。
【００１４】
この環境温度による反応性の差異を縮小することができれば、測定精度や正確性を向上することが期待できる。（本願においては、この至適温度の山をなだらかにすることを温度依存性の改善と表現する。）
【００１５】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、公知のＦＡＤＧＤＨの特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することで、改変前の野生型ＦＡＤＧＤＨよりも温度依存性が改善した改変型ＦＡＤＧＤＨを見出し、それを用いてグルコース測定系を組むことで、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
以下のいずれかで示される、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（以下、ＦＡＤＧＤＨとも記載）。
（１）配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
（２）配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
［項２］
項１に記載のタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
［項３］
項１または２に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
［項４］
項３に記載の遺伝子を含むベクター。
［項５］
項４に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
［項６］
項５に記載の形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。
［項７］
項１または２に記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
［項８］
項１または２に記載のタンパク質を含むグルコースセンサー。
［項９］
項１または２に記載のタンパク質を用いるグルコース測定法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、正確性・精密性に優れたグルコース測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本願明細書において、アミノ酸配列はアスファベット１文字または３文字で表記する。また、アミノ酸の変異の位置については次のように表記する。例えば、「Ｇ５９Ａ」は５９位のＧ（Ｇｌｙ）がＡ（Ａｌａ）に置換することを意味する。なお、配列番号１、２において、アミノ酸の表記は、メチオニンを１として番号付けされている。
【００１９】
本願発明の一実施形態は、以下のいずれかで示される、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質である。
（１）配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
（２）配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
【００２０】
ここで、配列番号１、２は、野生型のアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列である。
これらのアミノ酸配列は、特許文献１により公知である。
【００２１】
上記のタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。
【００２２】
本願発明のタンパク質は、改変前よりも温度依存性が改善し、および／または、キシロース作用性が低下した改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００２３】
例えば、上記の実施形態において、その４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれかにおけるアミノ酸置換が、Ｎ４６Ａ、Ｇ４９Ｎ、Ｇ４９Ｆ、Ｇ４９Ｖ、Ｇ４９Ｒ、Ｇ４９Ｉ、Ｇ４９Ｍ、Ｇ４９Ｌ、Ｇ４９Ｑ、Ｇ４９Ｄ、Ｇ４９Ｃ、Ｇ４９Ｗ、Ｇ４９Ｔ、Ｇ４９Ｅ、Ｇ４９Ｋ、Ｇ４９Ａ、Ｇ４９Ｓ、Ｙ５０Ｋ、Ｙ５０Ｉ、Ｙ５０Ｖ、Ｙ５０Ｑ、Ｙ５０Ｈ、Ｙ５０Ｃ、Ｙ５０Ｐ、Ｙ５０Ｎ、Ｙ５０Ｓ、Ｙ５０Ａ、Ｙ５０Ｄ、Ｙ５０Ｅ、Ｙ５０Ｒ、Ｙ５０Ｍ、Ｙ５０Ｔ、Ｙ５０Ｇ、Ｆ５４Ｄ、Ｆ５４Ｓ、Ｆ５４Ｅ、Ｆ５４Ｑ、Ｆ５４Ｃ、Ｆ５４Ｎ、Ｆ５４Ｔ、Ｆ５４Ａ、Ｆ５４Ｙ、Ｆ５４Ｍ、Ｇ５５Ｔ、Ｇ５５Ｋ、Ｇ５５Ｐ、Ｇ５５Ｉ、Ｇ５５Ｈ、Ｇ５５Ｌ、Ｇ５５Ｖ、Ｇ５５Ｙ、Ｇ５５Ｍ、Ｇ５５Ｗ、Ｒ７８Ｓ、Ｒ７８Ｐ、Ｒ７８Ｆ、Ｒ７８Ｑ、Ｒ７８Ｇ、Ｒ７８Ａ、Ｒ７８Ｄ、Ｒ７８Ｌ、Ａ１０４Ｎ、Ａ１０４Ｙ、Ａ１０４Ｗ、Ａ１０４Ｐ、Ａ１０４Ｍ、およびＡ１０４Ｄからなる群のうちいずれかであるＦＡＤＧＤＨは、改変前よりも温度依存性が改善した改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００２４】
例えば、上記の実施形態において、その４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれかにおけるアミノ酸置換が、Ｎ４６Ｌ、Ｇ４９Ａ、Ｇ４９Ｋ、Ｇ４９Ｄ、Ｇ４９Ｅ、Ｇ４９Ｓ、Ｇ４９Ｃ、Ｇ４９Ｔ、Ｆ５４Ｉ、Ｆ５４Ｈ、Ｆ５４Ｍ、Ｆ５４Ｎ、Ｆ５４Ｙ、Ｇ５５Ｄ、およびＲ７８Ｈからなる群のうちいずれかであるＦＡＤＧＤＨは、改変前よりもキシロース作用性が低下した改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００２５】
例えば、上記の実施形態において、その４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれかにおけるアミノ酸置換が、Ｇ４９Ａ、Ｇ４９Ｋ、Ｇ４９Ｄ、Ｇ４９Ｅ、Ｇ４９Ｓ、Ｇ４９Ｃ、Ｇ４９Ｔ、Ｆ５４Ｍ、Ｆ５４Ｎ、およびＦ５４Ｙからなる群のうちいずれかであるＦＡＤＧＤＨは、改変前よりも温度依存性が改善し、且つ、キシロース作用性が低下した改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００２６】
なお、上記の変換位置は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１、２）における同等の位置であっても良い。この同等の位置は、そのアミノ酸配列の一次構造（例えばアラインメント）、立体構造の知見を基に判断することができる。
本願明細書においては、例えばあるアミノ酸配列における配列番号１の４６位と同等の位置は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで配列の一次構造（例えばアラインメント）を比較したとき、配列番号１の４６位と対応する位置をもって同等と判断する。必要に応じてさらに立体構造の知見などを参照しても良い。
なお、ＧＥＮＥＴＹＸソフトは、ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮから販売されているＧＥＮＥＴＹＸ ＷＩＮ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１のものを使用した。
【００２７】
温度依存性
本願において、温度依存性とは、温度変化に伴って酵素活性が変化することを意味する。温度依存性の改善とは酵素活性の変化が少なく、広い範囲で一定の酵素活性を示すことを意味する。
「温度依存性が改善されているか」を判断する方法は以下のとおりである。
（１）３７℃、２４時間処理後における活性値（Ｕ／ｍｌ）を測定し、これをＡとする。
（２）２５℃、２４時間処理後における活性値（Ｕ／ｍｌ）を測定し、これをＢとする。
（３）Ａを１００％としたときのＢの相対値（％）を計算し、これをＣ（表１〜７における「温度依存性」）とする。
（４）野生型酵素（ＷＴ）のＣの値を１とし、それぞれの改変型酵素の相対値を計算しなおす。これをＤ（表１〜７における「温度依存性比」）とする。
（５）野生型酵素（ＷＴ）においてＡ＞Ｂであれば、改変型酵素がＤ＞１であって値が大きいほど温度依存性は改善されていると判断する。野生型酵素（ＷＴ）においてＡ＜Ｂであれば、改変型酵素がＤ＜１であって値が小さいほど温度依存性は改善されていると判断する。
【００２８】
後述の実施例（表１〜表７参照）において、２５℃と３７℃の反応温度で活性を測定することにより、３７℃での活性測定値を１００％とした場合の２５℃での活性測定値の割合（％）を調べた。２５℃における野生型の活性値は約５０〜５４％を示していた。
温度依存性が５５％以上を示すフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。
温度依存性は、好ましくは６０％以上であり、更に好ましくは６５％以上であり、更に好ましくは７０％以上であり、更に好ましくは７５％以上である。
これらの効果のある変異部位をさらに組合せることにより、相加・相乗効果が期待できる。
【００２９】
キシロース作用性
また、キシロース作用性とは、グルコースを基質とした場合の反応速度とキシロースを基質とした場合の反応速度の相対比％（グルコースを１００％とする。）である。
次いで、野生型酵素（ＷＴ）のキシロ−ス作用性の値を１とし、それぞれの改変型酵素の相対比％を計算しなおす。これが表１〜７における「キシロース作用性比」）である。この値が小さいほど、キシロース作用性が低下していると判断される。
【００３０】
後述の実施例（表１〜表７参照）において、野生型のグルコースに対する活性値を１００％とした場合、キシロースに対する活性値比率は、８．１〜１０．０％となっていた。
キシロースに対する反応性が８．０％以下を示すフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。
キシロースに対する反応性は、好ましくは７．０％以下であり、更に好ましくは６．０％以下であり、更に好ましくは５．５％以下であり、更に好ましくは５．０％以下である。
これらの効果のある変異部位をさらに組合せることにより、相加・相乗効果が期待できる。
【００３１】
本願発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、好ましくは、温度依存性比が改変前と比べて１．０２以上に改善している改変型ＦＡＤＧＤＨである。さらに好ましくは、改変前と比べて１．１０以上向上している改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００３２】
本願発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、好ましくは、キシロース作用性比が改変前と比べて０．９以下に低減している改変型ＦＡＤＧＤＨである。さらに好ましくは、改変前と比べて０．８以下に低減している改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００３３】
温度依存性およびキシロース作用性の測定方法は、後述のＦＡＤＧＤＨの活性測定法を用いて求める。
【００３４】
本願発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、種々の公知の手段で作製することが出来る。
以下に、配列番号１、２で示される野生型のアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨを改変したＦＡＤＧＤＨ改変体の製造法を例示する。製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。
ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社， ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製， Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００３５】
作製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物に移入され、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００などが利用できる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００３６】
なお、これらの過程で得られた、ＦＡＤＧＤＨ改変体をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体も、本発明の実施形態として含まれる。
【００３７】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨの改変の基になる遺伝子は、特に限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のＦＡＤＧＤＨを用いることが望ましい。さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来あるいはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨであることが望ましい。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨとしては、配列番号１、２で表されるタンパク質が例示できる。
【００３８】
本願発明の一実施形態は、上記のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００３９】
改変前のタンパク質をコードする遺伝子として、たとえば、上記の配列番号１、２で表されるタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号３、４で表される塩基配列が例示できる。
本願発明の遺伝子は、上記改変前のタンパク質をコードする遺伝子の配列において、４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれかのアミノ酸、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をコードする部分が、他のアミノ酸をコードするように置換されている。
【００４０】
本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体をコードする遺伝子は、配列番号３、４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＡＤＧＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡである。ここでストリンジェントな条件とは、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドのＴｍから該Ｔｍより１５℃、好ましくは１０℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。具体的には、例えば一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。本発明において、配列番号３、４に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列と５０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、さらに好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ配列をコードする塩基配列がストリンジェントな条件に相当すると考えられる。
【００４１】
本願発明の遺伝子は、たとえばＧＤＨの発現を向上させる目的などで、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更したものを含みうる。
【００４２】
本願発明の一実施形態は、上記の遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取するグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法である。
【００４３】
例えば、上記のＧＤＨ遺伝子を発現用ベクター（プラスミド等多くのものが当該技術分野において知られている）に挿入し、適当な宿主（大腸菌等多くのものが当該技術分野において知られている）を形質転換する。得られた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００４４】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００４５】
これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）タンパク質実験プロトコール第１巻 機能解析編，第２巻 構造解析編 （秀潤社） 西村善文，大野茂男 監修
（ｂ）改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
また、以下に例示する方法によって進めることもできる。
【００４６】
作製されたタンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、ベクターと連結された状態にて宿主微生物中に移入される。
【００４７】
ベクターとしては、宿主微生物内で自立的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例示される。なかでも、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど、クローニングサイト上流にエシェリヒア・コリー内で認識されうるプロモーターを保持するものが好ましい。
また、適当な宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自立増殖可能で外来遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。エシェリヒア・コリーではエシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＨＢ１０１、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどを用いることができる。
【００４８】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いても良い。宿主として、酵母が用いられる場合にリチウム法、エレクトロポレーション法が、また、糸状菌が用いられ場合にはプロトプラスト法などが用いられる。
【００４９】
本発明において、ＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。アスペルギルス・テレウスのゲノム配列情報を用い、予測ＧＤＨ遺伝子を見出すことができる。ついで、アスペルギルス・テレウスの菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。こうして得られたｃＤＮＡをテンペレートとして、ＰＣＲ法によりＧＬＤ遺伝子を増幅させ、本遺伝子をベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーを利用してＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換え微生物を得る。
【００５０】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。組換え体の選択は、ベクターのマーカーとＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００５１】
ＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００５２】
上記のようにして、一度選択されたＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、他の微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる他の微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法、プロトプラスト法などを用いることができる。
【００５３】
なお、本発明のＧＤＨ遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、該遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよい。
【００５４】
野生型ＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００５５】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、宿主として糸状菌を使用し、固体培養で行った方が有利な場合もある。
【００５６】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００５７】
培養温度は菌が成育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜３７℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ５．０〜８．０程度の範囲である。
【００５８】
培養物中のＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００５９】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００６０】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００６１】
本発明において、ＦＡＤＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
２４ｍＭ ＰＭＳ溶液
２．０ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液２１．９ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液１．０ｍｌ、ＰＭＳ溶液２．０ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４．５ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００６２】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。また、２５℃での活性値を測定する場合は、上記の３７℃と表記した操作を２５℃に変更して測定する。キシロースに対する反応性を測定する際は、上記の１Ｍ Ｄ−グルコース溶液の代わりに１Ｍ Ｄ−キシロースを使用すればよい。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００６３】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００６４】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００６５】
グルコース測定法
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００６６】
本発明のグルコース測定に用いる試料は血液であり、ヒトの体温に近い温度（３７℃付近）であるが、血糖の測定は、通常、温度が厳密に調整されていない室温で行われるため、実際の測定温度は室温付近から体温付近の間、例えば２５℃以上３７℃以下の範囲内で行われる。
本発明のグルコース測定方法においては、例えば、上述の温度依存性が改善したＦＡＤＧＤＨを用いることが好ましく、それによって、広い温度範囲で、より正確性・精密性の高い測定値を得ることが容易になる。
【００６７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例１】
【００６８】
実施例１ アスペルギルス・テレウス由来の改変型ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の作製
アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨ（配列番号２）をコードする遺伝子（配列番号４）を含む組み換えプラスミドｐＡＴＧＤＨ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩培養した。得られた形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた菌体から常法によりプラスミドｐＡＴＧＤＨ２を調製した。
このｐＡＴＧＤＨ２プラスミドを鋳型として、４６番目のアスパラギンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨプラスミドを作製した。
【００６９】
上記と同様の方法にて、４９番目のグリシンについても部位特異的アミノ酸置換を行った。ｐＡＴＧＤＨプラスミドを鋳型として、４９番目のグリシンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。
【００７０】
上記と同様の方法にて、５０番目のチロシンについても部位特異的アミノ酸置換を行った。ｐＡＴＧＤＨプラスミドを鋳型として、５０番目のチロシンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。
【００７１】
上記と同様の方法にて、５４番目のフェニルアラニンについても部位特異的アミノ酸置換を行った。ｐＡＴＧＤＨプラスミドを鋳型として、５４番目のフェニルアラニンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。
【００７２】
上記と同様の方法にて、５５番目のグリシンについても部位特異的アミノ酸置換を行った。ｐＡＴＧＤＨプラスミドを鋳型として、５５番目のグリシンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。
【００７３】
上記と同様の方法にて、７８番目のアルギニンについても部位特異的アミノ酸置換を行った。ｐＡＴＧＤＨプラスミドを鋳型として、７８番目のアルギニンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。
【００７４】
上記と同様の方法にて、１０４番目のアラニンについても部位特異的アミノ酸置換を行った。ｐＡＴＧＤＨプラスミドを鋳型として、１０４番目のアラニンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。
【００７５】
これらの改変型ＦＡＤＧＤＨプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地で３０℃、１６時間培養した。その後、改変型ＦＡＤＧＤＨを有したシングルコロニーを、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地にレプリカした後、アンピシリンを含むＬＢ液体培地に摂取して、３０℃で一晩振とう培養した。その後、１ｍｌの培養液を摂取し、常法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの当該部位をＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて特定した。
【実施例２】
【００７６】
実施例２ アスペルギルス・テレウス由来の改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性の比較検討
実施例１で確認した野生型とは異なるアミノ酸種に部位特異的変異している形質転換株を１５ｍｌのアンピシリンを含むTＢ液体培地に植菌して、２５℃、６４時間培養した。培養液全量を集菌した後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、ガラスビーズを用いて該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
得られた粗酵素液は、試験例に示した活性測定法を基本として、２５℃と３７℃の反応温度で活性を測定することにより、３７℃での活性測定値を１００％とした場合の２５℃での活性測定値の割合（％）を調べた。２５℃における野生型の活性値は約５０〜５４％を示していた。野生型の活性値比率と比べて上昇しているものは温度依存性が改善されていると考えられた。
Ｎ４６Ａ、またはＧ４９Ｎ、またはＧ４９Ｆ、またはＧ４９Ｖ、またはＧ４９Ｒ、またはＧ４９Ｉ、またはＧ４９Ｍ、またはＧ４９Ｌ、またはＧ４９Ｑ、またはＧ４９Ｄ、またはＧ４９Ｃ、またはＧ４９Ｗ、またはＧ４９Ｔ、またはＧ４９Ｅ、またはＧ４９Ｋ、またはＧ４９Ａ、またはＧ４９Ｓ、またはＹ５０Ｋ、またはＹ５０Ｉ、またはＹ５０Ｖ、またはＹ５０Ｑ、またはＹ５０Ｈ、またはＹ５０Ｃ、またはＹ５０Ｐ、またはＹ５０Ｎ、またはＹ５０Ｓ、またはＹ５０Ａ、またはＹ５０Ｄ、またはＹ５０Ｅ、またはＹ５０Ｒ、またはＹ５０Ｍ、またはＹ５０Ｔ、またはＹ５０Ｇ、またはＦ５４Ｄ、またはＦ５４Ｓ、またはＦ５４Ｅ、またはＦ５４Ｑ、またはＦ５４Ｃ、またはＦ５４Ｎ、またはＦ５４Ｔ、またはＦ５４Ａ、またはＦ５４Ｙ、またはＦ５４Ｍ、またはＧ５５Ｔ、またはＧ５５Ｋ、またはＧ５５Ｐ、またはＧ５５Ｉ、またはＧ５５Ｈ、またはＧ５５Ｌ、またはＧ５５Ｖ、またはＧ５５Ｙ、またはＧ５５Ｍ、またはＧ５５Ｗ、またはＲ７８Ｓ、またはＲ７８Ｐ、またはＲ７８Ｆ、またはＲ７８Ｑ、またはＲ７８Ｇ、またはＲ７８Ａ、またはＲ７８Ｄ、またはＲ７８Ｌ、またはＡ１０４Ｎ、またはＡ１０４Ｙ、またはＡ１０４Ｗ、またはＡ１０４Ｐ、またはＡ１０４Ｍ、またはＡ１０４Ｄのアミノ酸置換した改変型ＦＡＤＧＤＨにおいて温度依存性の顕著な改善効果が見られた。
【００７７】
表１の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの４６位のNを１７種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００７８】
【表１】
【００７９】
表２の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの４９位のＧを１６種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００８０】
【表２】
【００８１】
表３の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの５０位のＹを１８種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００８２】
【表３】
【００８３】
表４の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの５４位のＦを１４種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００８４】
【表４】
【００８５】
表５の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの５５位のＧを１６種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００８６】
【表５】
【００８７】
表６の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの７８位のＲを１４種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００８８】
【表６】
【００８９】
表７の左側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの１０４位のＡを１４種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤの温度依存性の比較である。
【００９０】
【表７】
【実施例３】
【００９１】
実施例３ アスペルギルス・テレウス由来の改変型ＦＡＤＧＤＨのキシロース作用性の比較検討
実施例１で確認した野生型とは異なるアミノ酸種に部位特異的変異している形質転換株を１５ｍｌのアンピシリンを含むTＢ液体培地に植菌して、２５℃、６４時間培養した。培養液全量を集菌した後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、ガラスビーズを用いて該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
得られた粗酵素液は、試験例に示した活性測定法を基本として、グルコースの代わりにキシロースを基質として、活性値を測定した。そして、グルコースを基質とした場合の活性値を１００％として、キシロースを基質とした場合の活性値の割合（％）を調べた。野生型のキシロースに対する活性値比率（８．１〜１０．０％）と比べて減少しているものが、キシロースに対する反応性が低下して、グルコースに対する特異性が向上していると考えた。
Ｎ４６Ｌ、またはＧ４９Ａ、またはＧ４９Ｋ、またはＧ４９Ｄ、またはＧ４９Ｅ、またはＧ４９Ｓ、またはＧ４９Ｃ、またはＧ４９Ｔ、またはＦ５４Ｉ、またはＦ５４Ｈ、またはＦ５４Ｍ、またはＦ５４Ｎ、またはＦ５４Ｙ、またはＧ５５Ｄ、またはＲ７８Ｈのアミノ酸置換した改変型ＦＡＤＧＤＨにおいてキシロースの対する反応性が低下する顕著な改善効果が見られた。
Ｇ４９Ａ、またはＧ４９Ｋ、またはＧ４９Ｄ、またはＧ４９Ｅ、またはＧ４９Ｓ、またはＧ４９Ｃ、またはＧ４９Ｔ、またはＦ５４Ｍ、またはＦ５４Ｎ、またはＦ５４Ｙのアミノ酸置換した改変型ＦＡＤＧＤＨにおいては、温度依存性と共に、キシロースの対する反応性が低下する2重の改善効果が見られた。
【００９２】
表１の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの４６位のNを１７種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
表２の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの４９位のＧを１６種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
表３の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの５０位のＹを１８種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
表４の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの５４位のＦを１４種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
表５の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの５５位のＧを１６種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
表６の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの７８位のＲを１４種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
表７の右側４列は、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの１０４位のＡを１４種の他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＬＤのキシロース作用性の比較である。
【００９３】
また、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨ（配列番号１）をコードする遺伝子（配列番号３）を含む組み換えプラスミドｐＡＴＧＤＨ１で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩培養した。得られた形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた菌体から常法によりプラスミドｐＡＴＧＤＨ１を調製した。
このｐＡＴＧＤＨ１プラスミドを鋳型として、先と同様の方法にて、配列番号１のアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれかの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨプラスミドを作製した。
【００９４】
これらの改変型ＦＡＤＧＤＨプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した改変型ＦＡＤＧＤＨについても、同様の検討を行い、同じ変異体で温度依存性およびキシロース作用性の低下において、同程度の改善効果が見られることを確認している。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明による温度依存性が改善し、且つ、基質特異性が向上したＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを利用することにより、グルコース測定の精度向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ大である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかで示される、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（以下、ＦＡＤＧＤＨとも記載）。
（１）配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
（２）配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
【請求項８】
請求項１または２に記載のタンパク質を含むグルコースセンサー。
【請求項９】
請求項１または２に記載のタンパク質を用いるグルコース測定法。
【請求項１】
以下のいずれかで示される、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（以下、ＦＡＤＧＤＨとも記載）。
（１）配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
（２）配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の４６位、４９位、５０位、５４位、５５位、７８位、１０４位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
【請求項８】
請求項１または２に記載のタンパク質を含むグルコースセンサー。
【請求項９】
請求項１または２に記載のタンパク質を用いるグルコース測定法。
【公開番号】特開２０１２−１９７５６（Ｐ２０１２−１９７５６Ａ）
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６１６４０（Ｐ２０１０−１６１６４０）
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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