プラスチドにおけるＴＧＦ−ベータの発現
植物においてＴＧＦ−βを発現させる方法を提供する。（１）植物細胞における転写を調節することができる第一の核酸配列、（２）ＴＧＦ−βをコードし、かつ該植物細胞における発現に適合した第二の核酸配列、および（３）該植物細胞において機能する、終止領域をコードする第三の核酸配列を含むキメラ核酸配列を植物細胞に導入し、該植物細胞を成長させて、ＴＧＦ−βを生成する。該核酸配列は、好ましくは、植物葉緑体における発現に適合することができる。全長または活性断片の形態であるかを問わず、ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３であるのが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）の発現に関する。本発明は、植物におけるＴＧＦ−βの発現に関する。特に、本発明は、植物葉緑体におけるＴＧＦ−βの発現に関する。ＴＧＦ−β３は、本発明による発現の好ましいＴＧＦ−βである。本発明は、植物におけるＴＧＦ−βの発現に用いるのに適したキメラ核酸配列、ならびにそのような方法によって産生されるＴＧＦ−β、およびそのようなＴＧＦ−βの使用も提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦ−βは多様な生物学的活性を有するサイトカインのファミリーである。ＴＧＦ−βファミリーの５つのメンバーが今日までに同定されている。すなわち、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、およびＴＧＦ−β５のイソ型である。これらのＴＧＦ−βは、共通のシステインノットモチーフ、および共通のシグナル変換経路のような構造的類似性を共有する。
【０００３】
ＴＧＦ−βは、多くの異なる治療的状況で有用性がある生物学的活性を有する。その結果、ＴＧＦ−βファミリーメンバーの医薬適用において多大な関心が寄せられている。
【０００４】
今日まで、最大の医薬的関心がＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３に示されてきた。全てヒトで見いだされているこれらのイソ型は、創傷治癒応答の調節において非常に重要な役割を担っていることが知られている。
【０００５】
ＴＧＦ−β１は、強皮症、脈管形成障害、腎臓疾患、骨粗鬆症、骨疾患、糸球体腎炎および腎臓疾患の予防および／または治療において使用される。
【０００６】
ＴＧＦ−β２は、神経膠種、非小細胞肺癌、膵臓腫瘍、固体腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、加齢性黄斑変性症、目の負傷、骨粗鬆症、網膜障害、潰瘍、癌腫、口炎症および強皮症の治療で用いることができる。
【０００７】
ＴＧＦ−β３は、線維性障害、強皮症、脈管形成障害、再狭窄、癒着、子宮内膜症、虚血性疾患、骨および軟骨誘導、体外受精、口内粘膜炎、腎臓疾患の治療、瘢痕化の予防、低下または抑制、末梢および中枢神経系におけるニューロン再結合の増強、（ＬＡＳＩＫまたはＰＲＫ外科的処置のような）目の外科的処置の合併症の予防、低下または抑制に用いることができる。
【０００８】
ＴＧＦ−βの産生、特に治療的使用のための現在の方法は、培養された動物細胞、または適切にトランスフェクトされた細菌の（それらの活性またはプロタンパク質形態のいずれかでの）培養による、これらのタンパク質の発現に依拠する。そのような方法はＴＧＦ−βの産生で効果的であるが、それらは比較的低い収率である傾向があり、そのようなタンパク質の調製に関するコストは高い。
【０００９】
上記を考慮して、これらの不利の影響を受けないＴＧＦ−β産生のための新しい方法を開発するかなりはっきりとした要望が存在することが認識されよう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明のある実施形態の目的は、先行技術の不利の少なくともいくつかを克服し、または除去することにある。本発明のある実施形態の目的は、先行技術の方法よりも低いコストにてＴＧＦ−βの製造で用いることができる方法および／または手段を提供することにある。本発明のある実施形態の目的は、先行技術の方法を用いて製造し得るよりも大量のＴＧＦ−βの製造に用いることができる方法および／または手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第一の態様によると、植物においてＴＧＦ−βを発現させる方法が提供され、該方法は、
（ａ）植物細胞に、
（１）植物細胞における転写および／または翻訳を調節することができる第一の核酸配列、
（２）ＴＧＦ−βをコードし、かつ該植物細胞における発現に適合した、第二の核酸配列、ならびに
（３）該植物細胞において機能する、終止領域をコードする第三の核酸配列、
を含むキメラ核酸配列を導入し、次いで、
（ｂ）該植物細胞を成長させて、該ＴＧＦ−βを産生する、
ことを含む。
【００１２】
本発明の第二の態様において、
（１）植物細胞における転写および／または翻訳を調節することができる第一の核酸配列、
（２）ＴＧＦ−βをコードし、かつ植物細胞における発現に適合した、第二の核酸配列、ならびに
（３）植物細胞において機能する、終止領域をコードする核酸配列、
を含むキメラ核酸配列が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法および核酸は、植物細胞の葉緑体におけるＴＧＦ−βの発現での使用に特に適している。特に、キメラ核酸は、葉緑体ゲノムの形質転換に用いられるのに適したものであり得る。適切なキメラ核酸は植物葉緑体において発現させるのに適切で有り得、好ましくは、この様式において発現させるのに適合させることができる。核酸（キメラ核酸全体、または該キメラ核酸をなす第一、第二、第三の核酸のいずれか）を植物細胞の葉緑体における発現に適合させることができる好ましい手段は、本明細書全体にわたって記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明は、ここで、以下の実験結果および付随する図１〜１２を参照してさらに説明される。
【図１】本発明に従う方法を実施するためにタバコ葉緑体形質転換に含まれる工程を概略的に示す。１において、標的ＴＧＦ−β遺伝子のｃＤＮＡが単離されかつ大腸菌特異的ベクターにクローニングされ、２において、標的ｃＤＮＡは発現カセットにクローニングされ、３において、完全な発現カセットが葉緑体標的化プラスミドに移入され、４において、プラスミドストックは精製され、かつ葉組織の粒子ボンバードメントのために使用され、５において、植物は、抗生物質選択条件下で葉組織から再生され、そして６において、葉組織からの３サイクルの再生が同種形成植物を生じる。
【図２】本発明に従う使用のために適切であるＴＧＦ−β３発現構築物を概略的に図示する。
【図３】本発明における使用のために核酸を産生するための合成遺伝子構築を図示する。この図の左側において、核酸断片は、段階的な様式で合わされて合成ＴＧＦ−β３遺伝子を産生する。図の右側は、左側のパネルに示した工程によって生じた異なる生成物のサイズを可視化するＤＮＡゲル電気泳動を示す。
【図４】合成（上の配列）および野生型（下の配列）ＴＧＦ−β３活性領域からのＤＮＡのコード配列を比較する。
【図５】図４に示した合成ＤＮＡ配列および野生型ＤＮＡ配列のアラインメントを示す。
【図６】図４および５に示した合成ＤＮＡ配列および野生型ＤＮＡ配列によってコードされるＴＧＦ−β３のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図７】本発明における使用のために適切である葉緑体標的化プラスミドを概略的に図示する。「ＬＴＲ」は左側標的化領域を示し、「ＲＴＲ」は右側標的化領域を示す。「ａａｄＡ」は使用され得る抗生物質耐性マーカーであるアミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼを示す。
【図８】タバコ葉調製物中で産生されたＴＧＦ−βの検出を図示する。この図は、タンパク質がクマシーブルーを使用して染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。収率は、野生型タバコ植物（ゲルのレーン１）、１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３活性領域−ｐｓｂＣタバコ植物（すなわち、ＴＧＦ−βをコードする核酸の配列が植物細胞における発現のために適合されていない植物であり、ゲルのレーン２に結果が示される）、および１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３合成活性領域−ｐｓｂＣタバコ植物（ＴＧＦ−βをコードする核酸の配列が植物細胞における発現のために適合されており、レーン３に結果が示される）に由来する全タンパク質調製物の間で比較される。結果の分析は、この例において、ＴＧＦ−β３が、野生型の適合されていない配列を含む植物中の全タンパク質の約１％を占め、および合成の適合した配列を含む植物中の全タンパク質の約１０％を占めることを示す。
【図９】本図もまた、タバコ葉調製物中で産生されたＴＧＦ−βの検出を図示するが、この場合においては、図は、ＴＧＦ−β３が抗ＴＧＦ−β３抗体を使用して標識されているウエスタンブロット（イムノブロット）を示す。レーン１および２は、１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３活性領域−ｐｓｂＣタバコ植物（レーン１に示す）および１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３合成活性領域−ｐｓｂＣタバコ植物（レーン２に示す）に由来する全タンパク質調製物の収率を比較する。これらは、レーン３、４、および５（それぞれ、１．０μｇ、０．０５μｇ、および０．２５μｇ）における、ＴＧＦ−β３「標準」と比較される。結果の分析は、この例において、合成適合した配列を含む植物からの２０μｇタンパク質サンプルが約２μｇ（すなわち、全タンパク質含量の約１０％）のＴＧＦ−β３を含んでいたことを示す。
【図１０】実験結果において記載される方法によって発現されたＴＧＦ−β３が不溶性タンパク質の型を有することを図示する。図の左側は、タンパク質がクマシーブルーを使用して染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、それに対して、右側は、ＴＧＦ−β３が抗ＴＧＦ−β３抗体を使用して標識されているウエスタンブロットを示す。両方の場合において、レーン１および２はＴＧＦ−β３「標準」であり（それぞれ、１．０ｍｇおよび０．１ｍｇ）、それに対して、レーン３は植物１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３合成活性領域−ｐｓｂＣタバコ植物から収集した可溶性タンパク質、レーン４は１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３合成活性領域−ｐｓｂＣタバコ植物から収集した不溶性タンパク質を示す。
【図１１】植物細胞における発現のために適合した核酸を含む植物によって発現された物質の回収を研究するために、Ｂｉｏｒａｄ ＲＣ／ＤＣアッセイを使用して得られた結果を示す。
【図１２】ブチル−セファロース捕捉後の溶出工程からのＴＧＦ−β３の収率を図示するブチルセファロースクロマトグラムを示す。
【００１５】
本開示において利用される特定のアミノ酸配列および核酸配列は、実験結果の後に続く配列情報の節においてもまた示される。上述の通り、関連配列は図面の間にもまた示される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
葉緑体におけるタンパク質の発現および、特に、葉緑体形質転換は、植物細胞の他の箇所における発現に勝る多くの利点を提供する。葉緑体において発現された外因性タンパク質の区画化は、それらが発現される細胞に対するその潜在的毒性を低下させる。葉緑体ゲノムは高いコピー数で存在し、従って、高い発現レベルを達成するのに用いることができる。相同組換えは目的の核酸の正確な挿入、およびそれらの産物の継続した安定な発現を可能とする。そのような発現は、広い範囲の植物で観察することができる。最後に、多くの作物における母性遺伝は、花粉における導入遺伝子の望ましくない伝達の危険性がかなり低下することを意味する。
【００１７】
本発明の第一および第二の態様において言及するタイプの「第一の核酸配列」は、（他の箇所で定義されるような）第二の核酸配列の植物細胞における転写および／または翻訳を調節することができるものである。第二の核酸配列の翻訳を調節することができる本発明による第一の核酸配列は、好ましくは、プロモーター部位を含む。本発明に従って第一の核酸配列に組み込むことができる適当なプロモーター部位の詳細は、本明細書の他の箇所で考慮される。第二の核酸配列の転写を調節することができる本発明による第一の核酸配列は、好ましくは、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。本発明に従って第一の核酸配列に組み込むことができる適当なＲＢＳの詳細は、本明細書中の他の箇所において考慮される。一般に、本発明による第一の核酸配列は、第二の核酸配列の転写および翻訳双方を調節することができるものである。従って、好ましい第一の核酸配列は、適当なプロモーターおよび適当なＲＢＳの双方を含み得る。そのような組み合わされた第一の核酸配列で用いることができる好ましいプロモーターおよびＲＢＳは、明細書中の他の箇所で記載される。好ましい第一の核酸配列は、植物細胞の葉緑体における転写および／または翻訳の調節に適合させることができる。
【００１８】
本発明による「第二の核酸配列」は、発現させるべきＴＧＦ−βをコードし、植物細胞における発現に適合した配列である。第二の核酸配列の翻訳および／または転写は、前記したように、適当な第一の核酸配列によって調節することができる。適当な第二の核酸配列は、植物細胞において発現させるのが望まれる任意のＴＧＦ−βをコードすることができることが認識されるであろう。好ましい第二の核酸は、例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３をコードすることができ、そのうち、ＴＧＦ−β３はより好ましくあり得る。本発明の第二の核酸配列は、種々の適合戦略の１以上を用いて植物細胞での発現のために適合させることができる。適当な適合戦略の例は、本明細書中の他の箇所に記載される。好ましい第二の核酸配列は、植物細胞の葉緑体におけるそれらの発現のために適合させることができる。
【００１９】
本発明による「第三の核酸配列」は、第二の核酸配列の転写を終了させるのに用いることができる終止領域をコードする配列である。終止領域は、植物細胞において機能的であるものである。好ましくは、適当な終止領域は、植物細胞の葉緑体において機能的なものである。（植物細胞および葉緑体に用いるのに適した配列を含む）本発明に従って用いることができる適当な第三の核酸配列の例は、本明細書中の他の箇所で考慮される。
【００２０】
第一および／または第二および／または第三の核酸配列は、好ましくは、相互に遺伝子的に融合させることができ、それにより、種々の核酸配列を含む単一のキメラ核酸分子を産生することができる。
【００２１】
本発明のキメラ核酸配列は、ＤＮＡ配列であるのが好ましい。従って、好ましい第一および／または第二のおよび／または第三の核酸配列はＤＮＡ配列であると認識されるであろう。
【００２２】
その最も広い解釈において、用語「植物細胞における発現に適合した」は、必要な活性または発現を達成するために植物細胞において発現させることができる任意の核酸も含むように用いることができる。種々の戦略を使用して、葉緑体におけるキメラ核酸の発現を促進することができる。いくつかのそのような適当な戦略は、本明細書の他の箇所においてさらに詳細に述べられ、これらの特定の戦略は、核酸が植物細胞における発現のために適合させるべき好ましい手段を表わすことができる。
【００２３】
本発明の核酸は、葉緑体標的化プラスミドのような適当なプラスミドに組み込むことができる。一般に、葉緑体において発現させるべき核酸は、葉緑体ゲノムへのキメラ核酸分子の挿入を可能とするプラスチド標的化ＤＮＡの領域によって近接されるのが好ましい。適当なプラスミドは、本発明の方法に用いるための好ましい薬剤を表す。
【００２４】
発現させるべきＴＧＦ−βは、任意の動物、ヒトまたは非ヒトに由来する任意のＴＧＦ−βであってもよいが、好ましくは、ＴＧＦ−βはヒトＴＧＦ−βである。
【００２５】
本発明の方法または核酸を用いて、任意のＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５のいずれか）を発現させることができる。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３よりなる群から選択されるのが好ましい。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β３であるのがなおより好ましい。ＴＧＦ−βはヒトＴＧＦ−βであるのが特に好ましい。
【００２６】
本発明による核酸配列によってコードされるＴＧＦ−βが、好ましくは、ＴＧＦ−βの活性断片を含むことを認識されるであろう。コードされるＴＧＦ−βは、活性断片のみを適切に（すなわち、潜伏関連ペプチドの会合なし）を含むことができる。適当な核酸は、選択されたＴＧＦ−βの活性断片の全てまたは部分をコードすることができる。参考までに、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３の活性断片のアミノ酸配列は、各々、図１１における配列番号１ないし３として記載される。
【００２７】
本発明による核酸配列によってコードされるか、または本発明による方法で発現させるＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−βプロタンパク質を含み得る。そのようなプロタンパク質は、それらを、商業的使用に先立って長期貯蔵または処理に適したものとする安定性を呈することができる。本発明者らは、プロタンパク質ホモ二量体（７５ｋＤａ）の精製は、タンパク質の安定性のため、活性な領域ホモ二量体（２４ｋＤａ）よりも容易であろうと考える。活性なタンパク質のカプセル化は、タンパク質半減期を４０倍増加させることができ、作製された切断部位はその治療的作用部位においてタンパク質を放出した。プロタンパク質は精製後にインビトロにて切断されて、例えば、治療剤として用いるための活性な領域を提供することができる。
【００２８】
本発明による核酸配列によってコードされるか、または本発明による方法で発現されたＴＧＦ−βは、全長ＴＧＦ−β、好ましくは、配列番号６、７または８のいずれか１つによってコードされるアミノ酸配列を有する全長ＴＧＦ−βを含み得る。
【００２９】
本発明の核酸配列によってコードされたＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−βの変種形態を含むことができる。
【００３０】
本発明による方法および核酸は、植物の葉緑体において発現された遺伝子に由来するプロモーターを使用することができる。適当なプロモーターは光合成遺伝子に由来するのが好ましいであろう。
【００３１】
本発明の方法または核酸に用いられる適当なプロモーターは、光合成関連遺伝子、遺伝子系遺伝子、およびプラスチドコードプラスチド（ＰＥＰ）ＲＮＡポリメラーゼまたは核コードプラスチド（ＮＥＰ）ＲＮＡポリメラーゼによって認識される任意のその他を発現するプロモーターよりなるプラスチドプロモーター、藻プロモーター、細菌プロモーター、またはファージプロモーター、例えばプラスチドｐｓｂＡプロモーター、プラスチド１６Ｓ ｒｒｎプロモーター、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）ｐｂｓＡプロモーター、細菌ｔｒｃプロモーターおよびバクテリオファージＴ７プロモーターよりなる群から選択することができる。これらの群のうち、１６ｓｒｒｎプロモーターは、好ましいプロモーターを表す。適当なプロモーターは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、好ましくはＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓに由来することができる。事実、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ １６ｓｒｒｎプロモーターは、本発明の方法または核酸に用いられる特に好ましいプロモーターを表す。
【００３２】
本発明の方法または核酸に用いられる適当なリボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、ｒｂｃＬ ＲＢＳまたはｐｓｂＡ ＲＢＳのような任意のプラスチドＲＢＳ、あるいはＴ７ｇ１０ ＲＢＳのような細菌またはバクテリオファージＲＢＳよりなる群から選択することができる。この群のうち、Ｔ７ｇ１０ ＲＢＳは、好ましいＲＢＳであり得る。本発明の方法に用いられる他の適当なＲＢＳは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｐｓｂＡ ＲＢＳのようなＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍに由来するものを含む。
【００３３】
本発明の方法または核酸に用いることができる適切なターミネーターは、ｐｓｂＡターミネーター、ｒｂｃＬターミネーター、（リボソームタンパク質Ｓ１８からの）ｒｐｓ１８ターミネーターおよびｐｓｂＣターミネーターを含むプラスチドターミネーター、または細菌ターミネーターまたはバクテリオファージターミネーターよりなる群から選択することができる。ｐｓｂＣターミネーターは、この群からの好ましいターミネーターを表す。適当なターミネーターは、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、好ましくはＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓに由来することができる。Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｐｓｂＣターミネーターは、本発明に従って用いられる特に好ましいターミネーターである。
【００３４】
前述したように、葉緑体発現を用いて、広く種々の植物において本発明によるＴＧＦ−βの発現を達成することができる。本発明者らは、本発明の方法および核酸（特に、葉緑体発現に用いられるもの）は、単子葉植物または双子葉植物いずれでも用いることができると考える。本発明の方法および核酸に従って利用することができる双子葉植物の好ましい例はタバコである。一般に、本発明者らは、本発明の方法および核酸が、陸上植物および藻を含めた広い範囲の植物に関連して用いることができると考える。適切な植物は、限定されるものではないが、キャベツ、カリフラワー、クロレラ、クラミドモナス、大麦、ニンジン、レタス、コケ、トウモロコシ、菜種、コショウ、ジャガイモ、米、大豆、ヒマワリ、トマト、小麦を含む。本発明による方法または核酸は、それらが発現されるべき選択された植物を参照して選択された適当な標的化配列およびプロモーターを利用することができる。例えば、本発明による適切な核酸または方法は、藻またはコケで用いるのに適した標的化配列およびプロモーターを利用することができる。
【００３５】
前述したように、本発明者らは、葉緑体におけるＴＧＦ−βの発現、特に、葉緑体ゲノムの形質転換の結果として起こるそのような発現は、本発明の文脈において多くの利点を提供すると考える。本発明者らは、ＴＧＦ−βをコードする核酸を産生するのに用いることができ、かつ葉緑体における発現に適合した多数の戦略を見いだした。
【００３６】
本発明によるＴＧＦ−βの発現は、葉緑体発現に適し、好ましくは、葉緑体発現で優先されるか、または特異的でさえある第一の核酸配列を利用することができる（プロモーターおよびリボソーム結合部位を含むことができる、本明細書中の他の箇所で言及される「第一の核酸配列」における）調節核酸配列の使用によって達成することができる。
【００３７】
同様にして、本発明の方法および核酸は、葉緑体における発現に適した（明細書中の他の箇所で言及される「第三の核酸配列」における）終止領域を利用することができる。そのような第三の核酸配列は、なおより好ましくは、葉緑体における発現で優先されるか、またはそれに特異的であり得る。
【００３８】
特に、植物細胞における発現のための核酸の適合は、発現させるべきＴＧＦ−βをコードする配列（本明細書中において考えられるような「第二の核酸配列」）を参照して実行することができる。本発明者らは、植物細胞における発現、より特別には葉緑体における発現のためのそのような第二の核酸配列を適合させるのに用いることができる多数の手段を見いだした。適当な第二の核酸配列の産生におけるこれらの手段の１つ以上の使用は、本発明において記載された任意の方法または核酸配列の好ましい実施形態であり得る。
【００３９】
そのような第二の核酸配列を植物細胞、より詳細には葉緑体における発現に適合させることができる１つの好ましい方法は、発現させるべきＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡに見いだされるコドンの１つ以上の置換である。
【００４０】
特に好ましい実施形態において、野生型ＤＮＡで生じるアミノ酸システインをコードするコドンの１つ以上を置換するのが好ましいであろう。ＴＧＦ−βは多数のシステイン残基を含み、これらの残基はＴＧＦ−βタンパク質の特徴である。しかしながら、システインは、葉緑体遺伝子産物において他のアミノ酸よりも少量で、かつ光合成葉緑体遺伝子産物においてかなり低い量で見いだされるアミノ酸である。
【００４１】
本発明者らは、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡ（例えば、ＴＧＦ−β３の活性断片の場合には、配列番号４のＤＮＡ）に存在する１つ（またはそれを超える）のＵＧＣコドンが置換されれば、ＴＧＦ−βをコードするＤＮＡが、植物細胞の葉緑体における発現に適合させることができるのを見いだした。ＵＧＣコドンはアミノ酸システインをコードし、そのような場合における好ましい置換は、一般には、代替システインコードコドンＵＧＣに関連するであろう。好ましくは、野生型ＤＮＡ配列に存在するＵＧＣコドンの少なくとも２つを置換することができ、より好ましくは、ＵＧＣコドンの少なくとも３つを置換することができ、最も好ましくは、ＵＧＣコドンの４つを置換することができる。本発明者らは、野生型ＤＮＡに存在するＵＧＣコドンの５つ、または６つさえを置換することができ、依然として、所望のＴＧＤＦ−βの産生を可能とすることができるが、少なくとも１つ、より好ましくは２つのＵＧＣコドンが適切な核酸に保持されるのが好ましいと考える。
【００４２】
本発明者らは、代替、またはさらなる置換の対象となり得る多数の他のコドンを同定した。
【００４３】
例えば、ロイシンをコードするコドンＣＵＧは、有益には、植物細胞における（特に、植物細胞の葉緑体における）発現に適合した核酸の産生における置換に供することができる。少なくとも１つのＣＵＧコドンを置換して、本発明の方法または核酸配列に用いるのに適した第二の核酸配列を生じさせるのが好ましいであろう。例えば、発現させるべきＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡに存在する全てのＣＵＧコドンが置換されているのが好ましいであろう。例えば、ヒトＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡの場合において、全ての７つの存在するＣＵＧコドンを置換するのが好ましいであろう。用いるべき好ましい代替コドンは、ロイシンをコードする別のコドンＵＵＡであり得る。
【００４４】
加えて、あるいは別法として、バリンをコードするコドンＧＵＧは、有益に、植物細胞における（特に、植物細胞の葉緑体における）発現に適合した核酸を産生する場合、置換に供することができる。少なくとも１つのＧＵＧコドンを置換して、本発明の方法または核酸配列で用いるのに適した第二の核酸配列を生じさせるのが好ましいであろう。例えば、発現させるべきＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡに存在する全てのＧＵＧコドンが置換されているのが好ましいであろう。例えば、ヒトＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡの場合、そうでなければ存在するであろう全ての６つのＧＵＧコドンを置換するのが好ましいであろう。用いるべき好ましい代替コドンは、別のバリンをコードするコドンＧＵＵまたはＧＵＡであり得る。
【００４５】
別法として、あるいは加えて、プロリンをコードするコドンＣＣＣは、有益に、植物細胞における（特に、植物細胞の葉緑体における）発現に適合した核酸の産生において置換することができる。少なくとも１つのＣＣＣコドンを置換して、本発明の方法または核酸配列に用いるのに適した第二の核酸配列を生じさせるのが好ましいであろう。例えば、そうでなければ、発現されるべきＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡに存在する全てのＣＣＣコドンが置換されているのが好ましいであろう。例えば、ヒトＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡの場合には、そうでなければ存在するであろうＣＣＣコドンの全ての４つを置換するのが好ましいであろう。用いるべき好ましい代替コドンは、別のプロリンをコードするコドンＣＣＵであり得る。
【００４６】
さらに代替的に、または加えて、チロシンをコードするコドンであるＵＡＣは有利に置換され、植物細胞中での（および特に植物細胞の葉緑体中での）発現のために適合した核酸を生じ得る。少なくとも１個のＵＡＣコドンが置換され、本発明の方法または核酸配列における使用のために適切な第２の核酸配列を生じることが好ましくあり得る。例えば、発現されるＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡ中に存在する少なくとも１個、２個、３個、または４個のＵＡＣコドンが置換されることが好ましくあり得る。例えば、ヒトＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡの場合においては、そうでなければ存在する６個のＵＡＣコドンのうちの５個が置換されることが特に好ましくあり得る。使用される好ましい置換コドンは、チロシンをコードする代替のコドンであるＵＡＵであり得る。
【００４７】
上記の適合に対してなおさらに代替的にまたは加えて、植物細胞中での（および特に植物細胞の葉緑体中での）発現のために適合した核酸の産生の際に、アスパラギンをコードするコドンであるＡＡＣが置換されることが好ましくあり得る。少なくとも１つのＡＡＣコドンが置換され、本発明の方法または核酸配列における使用のために適切な第２の核酸配列を生じることが好ましくあり得る。例えば、発現されるＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡ中に存在する少なくとも１個、２個、３個、または４個のＡＡＣコドンが置換されることが好ましくあり得る。例えば、ヒトＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡの場合においては、そうでなければ存在する６個のＡＡＣコドンのうちの５個が置換されることが特に好ましくあり得る。使用される好ましい置換コドンは、アスパラギンをコードする代替のコドンであるＡＡＵであり得る。
【００４８】
植物細胞中での（および特に植物細胞の葉緑体中での）発現のために適合される核酸の産生の際に、上記の適合に対してさらに代替的にまたは加えて使用され得る別の適合は、アスパラギン酸をコードするコドンであるＧＡＣの置換である。少なくとも１個のＧＡＣコドンが置換され、本発明の方法または核酸配列における使用のために適切な第２の核酸配列を生じることが好ましくあり得る。例えば、発現されるＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡ中に存在するすべてのＧＡＣコドンが置換されることが好ましくあり得る。例えば、ヒトＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡの場合においては、そうでなければ存在する４個すべてのＧＡＣコドンが置換されることが特に好ましくあり得る。使用される好ましい置換コドンは、アスパラギン酸をコードする代替のコドンであるＧＡＵであり得る。
【００４９】
本開示の目的のために、野生型ＤＮＡは、本発明に従って発現またはコードされる、ＴＧＦ−βをコードする天然に存在するＤＮＡであると見なされるべきである。例えば、ヒトＴＧＦ−β１（その活性断片のアミノ酸配列が配列番号１に示される）の場合においては、野生型ＤＮＡは、このタンパク質をコードする天然に存在するヒトゲノムＤＮＡである（その全長ＤＮＡ配列は配列番号６に示される）。ヒトＴＧＦ−β２（その活性断片のアミノ酸配列が配列番号２に示される）の場合においては、野生型ＤＮＡは、このタンパク質をコードする天然に存在するヒトゲノムＤＮＡである（その全長ＤＮＡ配列は配列番号７に示される）。ヒトＴＧＦ−β３（その活性断片のアミノ酸配列が配列番号３に示される）の好ましい場合においては、野生型ＤＮＡは、このタンパク質をコードする天然に存在するヒトゲノムＤＮＡである（例えば、配列番号４に示されるような活性断片をコードするＤＮＡ、または配列番号８に示される全長ＤＮＡ配列）。
【００５０】
ＴＧＦ−β（この場合においては、ＴＧＦ−β３の活性断片）をコードし、かつ植物細胞における、およびより特定的には葉緑体における発現のために適合される特に好ましい核酸配列の例は、配列番号５に示される。確かに、この核酸配列は非常に好ましいので、本発明のさらなる局面において、配列番号５に示される核酸配列を含む核酸配列が提供される。配列番号５に示される核酸配列は、本発明の方法における使用のために好ましい第２の核酸配列と、本発明の核酸における使用のためにもまた好ましい第２の核酸配列の両方を表す。
【００５１】
本発明者らは、配列番号５に示される配列と少なくとも１．７５％のコドン同一性を共有する核酸配列が、このような核酸配列がなお、発現されるＴＧＦ−βをコードしていることを条件として、本発明の方法および核酸において利用され得ると考える。より好ましくは、適切な核酸は、配列番号５と少なくとも２２％のコドン同一性、さらにより好ましくは、少なくとも５０％のコドン同一性、なおより好ましくは、少なくとも７５％のコドン同一性、および最も好ましくは、少なくとも９９．１％のコドン同一性を共有し得る。
【００５２】
先の段落に記載した核酸配列、例えば、配列番号５の核酸配列（または特定の同一性の程度、例えば、少なくとも２２％のコドン同一性を配列番号５と共有する配列）は、本発明の方法または核酸のいずれかまたはすべてに従う使用のための適切な「第２の核酸配列」を含み得ることが理解されよう。
【００５３】
本発明者らは、上記の型の修飾が、植物細胞中で発現できるＴＧＦ−β（葉緑体中での発現を含む）の総量を増加させる上で非常に有効であることを見いだした。例えば、以下の実験結果の節においてさらに説明されるように、ＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡを含む核酸で形質転換された植物は、全タンパク質の約１％のＴＧＦ−β３という収率を生じ得る。対照的に、植物細胞中での発現のために適合した核酸配列、例えば、配列番号５の核酸配列の使用は、野生型配列を使用して生じるものよりも、１０倍高いＴＧＦ−β３の収率を生じることが可能である（全タンパク質の約１０％という、ＴＧＦ−β３の収率を生じる）本発明者らは、この種の選択された第２の核酸配列、例えば、配列番号５の使用することにより、同じ第１および第３のアミノ酸配列が共通して使用される場合においてさえ、野生型配列と比較して、ＴＧＦ−β収率を顕著に増加させることが可能であることを見いだした。
【００５４】
ＴＧＦ−β収率のこれらの増加は、本発明の方法および核酸を利用することなく他の方法で達成され得る場合に対して、顕著でありかつ驚くべき改善を表すことが認められる。本発明の方法および核酸を利用して産生されるＴＧＦ−βの量は、以前には不可能であった様式で、植物中におけるＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β３）の経済的に有利な産生を可能にする。
【００５５】
本発明者らは、本発明の方法において選択的に有利に使用され得る多数の新規な技術および条件をさらに見いだした。これらは、本発明に従って発現されるＴＧＦ−βの回収、および／または活性なＴＧＦ−βを産生するためのこのようなＴＧＦ−βのフォールディングもしくは再フォールティングに関して顕著な利益を提供する。開発された新規な方法には、本発明に従う方法において発現される再フォールティングされたＴＧＦ−βの捕捉における使用のために適切な手順もまた含まれる。
【００５６】
植物中で発現される組換えタンパク質は、典型的には、可溶性タンパク質として発現される。これは、一般的には、先行技術において記載された方法を使用して達成され得る比較的低いレベルのタンパク質発現に起因すると見なされている。産生した可溶性タンパク質は、生物学的に活性な型および生物学的に不活性な型の混合物を含む傾向があり、不活性型は全体の中でより大きな割合を占める。
【００５７】
本発明の方法および核酸を使用して達成される高レベルの発現は、高収率の組換えＴＧＦ−βタンパク質を産生することが見いだされたが、これらのタンパク質の不溶性凝集物を生じることが見いだされ、生物学的活性を産生するように正確にフォールディングされた型では検出可能なタンパク質は発現されなかった。いかなる仮説によっても束縛されることは望まないが、本発明者らは、これらの凝集物が、植物細胞（および特に葉緑体）内部で確立された高濃度の組換えタンパク質に起因して生じ、ＴＧＦ−βタンパク質の疎水性の結果として発現されると考えている。この様式でのＴＧＦ−βの不溶性凝集物の産生は、（そうでなければ夾雑物を構成し得る可溶性植物細胞成分から不溶性組換えタンパク質を分離することが容易であるという点で）有利であり、そしてこの不溶性型のＴＧＦ−βは、それ自体、有用な生成物を表す（これは、次には、先行技術の技法を使用して、その活性型に可溶化およびフォールティングされ得るからである）。しかし、改善された純度および収率で正確にフォールディングされたＴＧＦ−βの生物学的活性型を生じるために、本発明者らは、本発明の方法および核酸を使用して発現されるＴＧＦ−βの可溶化およびフォールディング／再フォールティングに特に適合した新規な技術を開発した。
【００５８】
本発明者らは、本発明の方法または核酸を使用して発現されるＴＧＦ−βの精製における有利な工程には、（その中では、ＴＧＦ−βが葉緑体中で発現している）葉緑体抽出物の溶解、ならびに得られた混液のＴＧＦ−βの溶解を補助するための均質化および超音波処理が含まれることを見いだした。溶解は、ｐＨ ８．０において、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２重量／重量％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１Ｍ ＤＴＴを含む緩衝液を使用して達成され得る。
【００５９】
本発明の方法または核酸を使用して発現されるＴＧＦ−βは、夾雑物、例えば、葉緑体または他の植物タンパク質を除去するために有利に「洗浄」され得る。適切な洗浄緩衝液は、ｐＨ ８．０における０．０５Ｍ Ｔｒｉｓベースおよび０．０１Ｍ ＥＤＴＡを含み得る。洗浄は、一連の遠心分離工程および再懸濁工程（好ましくは、洗浄緩衝液中での２回以上の遠心分離および再懸濁のサイクル）によって容易に実行され得る。遠心分離は、８０００×ｇ、３０分間で実行され得る。
【００６０】
次いで、このような洗浄後に得られるＴＧＦ−β産物は、好ましくは、組換えＴＧＦ−βを溶解するが、植物タンパク質または炭水化物（例えば、デンプンなど）を溶解しない溶媒を使用して可溶化され得る。本発明者らは、この機能を有する適切な緩衝液は、尿素を含み得、このような緩衝液の好ましい例は、ｐＨ ８．０における、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓベース、０．１Ｍ ＤＴＴ、６Ｍ 尿素を含むことを見いだした。このような可溶化は（好ましくは、溶解性を補助するために攪拌しながら）室温で達成することができ、可溶化溶液のｐＨを９．５周辺まで調整することによって補助され得る。組換えＴＧＦ−βを優先的に溶解可能であるが、植物細胞成分（例えば、植物タンパク質または炭水化物）を溶解しない溶媒のこの使用は、先行技術において示唆されておらず、そしてそれが付与する顕著な利点に起因して、本発明の方法において利用され得る好ましい工程を表す。
【００６１】
本発明の方法または核酸を使用して発現されたＴＧＦ−βが（例えば、上記に概略される様式で）可溶化される際、次いでこれは、膜分離精製技術を使用して濃縮され得る。適切な技術は、５ｋＤａ ＴＦＦ（接線流濾過）膜、およびｐＨ ９．５において、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓベース、０．０１Ｍ ＤＴＴ、３Ｍ 尿素を含む膜分離精製緩衝液を利用し得る。このような膜分離精製は、溶液を約１５倍に濃縮するために使用され得る。
【００６２】
本発明の方法の任意の実施形態に従って産生されるＴＧＦ−βは、活性なＴＧＦ−βが産生されるように、ＣＨＥＳ（２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）またはその機能上の類似物の存在下でフォールティングが起こる技術を使用して、フォールティングまたは再フォールティングすることができる。この様式でのＴＧＦ−βのフォールティングまたは再フォールティングは特に有利であり、このさらなる工程を組み入れた方法は、本発明の好ましい実施形態を表す。好ましくは、ＣＨＥＳは、約１００ｍＭから１．０Ｍの濃度で、より好ましくは約０．７Ｍの濃度で使用され得る。本発明の方法または核酸を使用して発現されるＴＧＦ−βのフォールティングにおけるＣＨＥＳの使用を含む任意の工程は、低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系と組み合わせたＣＨＥＳ（またはその機能的アナログ）を利用し得る。本発明の方法において有利に使用され得るＣＨＥＳを利用するフォールティングまたは再フォールティングの方法のさらなる詳細は、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０００８１４に含まれており、この文書の内容は、特に、生物学的に活性な分子を産生するためにＴＧＦ−βをフォールティングするための方法に関連する限りにおいて、参照により本明細書に援用される。
【００６３】
本発明の方法に従って発現されるＴＧＦ−βは、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって捕捉され得る。例として、ブチル−セファロース４ファストフロー（Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）分離媒体を、このような捕捉を実施するために使用することができる。ＴＧＦ−β（好ましくは、上記の様式で活性型に再フォールディングされたもの）を含む溶液は、洗浄緩衝液および平衡化緩衝液で平衡化したブチル−セファロース４ファストフローカラムに加えられ得る。適切な平衡化緩衝液は、ｐＨ ３．３において、０．０２Ｍ 酢酸ナトリウム、１Ｍ 硫酸アンモニウム、１０％ｖ／ｖ酢酸を含み得る。カラムは、結合したＴＧＦ−βの溶出の前に、必要に応じて洗浄され得る。溶出は、適切な洗浄緩衝液、例えば、ｐＨ ３．３において、０．０２Ｍ 酢酸ナトリウム、１０％ｖ／ｖ酢酸、３０％ｖ／ｖエタノールを含むものを利用してもよい。
【００６４】
ＴＧＦ−βは、カチオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製することができる。例として、ＳＰ−セファロース媒体が、ＴＧＦ−β単量体および植物関連の不純物からＴＧＦ−β二量体をさらに精製するために使用され得る。カチオン交換クロマトグラフィー媒体へのＴＧＦ−β二量体の結合を確実にするために、捕捉精製工程からの溶離液（好ましくは、上記のブチル−セファロースの溶離液）の伝導度は低くされる必要があり得、そしてこれは、適切な緩衝液（例えば、ｐＨ ３．９〜４．１において、２．７２ｇ／Ｌ 酢酸ナトリウム三水和物、１００ｍＭ／Ｌ 氷酢酸、３００ｍＬ／Ｌエチルアルコールを含む緩衝液）中で溶離液を希釈することによって最も良好に達成される。次いで、調整済みの負荷物をＳＰ−セファロースカラムに加え、適切な緩衝液で平衡化する。この緩衝液は、ｐＨ ３．９〜４．１において、２．７２ｇ／Ｌ 酢酸ナトリウム三水和物、１００ｍＭ／Ｌ 氷酢酸、３００ｍＬ／Ｌエチルアルコール、２．９２ｇ／Ｌ 塩化ナトリウムを含み得る。カラムは、結合したＴＧＦ−βの溶出の前に、必要に応じて洗浄することができる。カラムからのＴＧＦ−βの溶出は、移動相のｐＨを変化させること、または伝導度を上昇させることによって達成することができる。一例として、適切な溶出緩衝液は、ｐＨ ３．９〜４．１において、２．７２ｇ／Ｌ 酢酸ナトリウム三水和物、１００ｍＭ／Ｌ 氷酢酸、３００ｍＬ／Ｌエチルアルコール、２９．２２ｇ／Ｌ 塩化ナトリウムからなる。ＴＧＦ−β二量体を含むＳＰセファロース溶離物の画分は、純度に従ってプールされるべきである。残渣の塩はＴＧＦ−βタンパク質の凝集を引き起こし得るので、ＳＰ−セファロースの溶離物は、適切な最終製剤に緩衝液交換されるべきであり、緩衝液の１つの例は、ｐＨ ４．０±０．１おける、１．２ｍＭ／Ｌ 酢酸、２００ｍＬ／Ｌ エチルアルコールを使用する（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）。
【００６５】
上記に示した選択的工程は、個別にまたは本発明の方法において組み合わせて利用する際、植物からの組換えヒトタンパク質の精製のため、または一般的なＴＧＦ−βの精製のために示唆されてきた先行技術の技法を超えた顕著な利点を付与する。従って、当業者には、これらの任意工程の１つ以上（好ましくはすべて）が本発明の方法に有利に組み入れられ得ることが認識されよう。特に、組換えタンパク質の精製のためのこれらの新規な方法の使用は、塩の沈殿およびクロマトグラフィーの必要性を伴うことなく、高度に精製されたＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β３を産生することを可能にする（塩の沈殿およびクロマトグラフィーは、先行技術によって示唆されている技術であるが、残渣の塩の存在に起因して、この様式で精製されたタンパク質の望ましくない凝集をもたらす可能性がある）。
【００６６】
当業者には、本発明の核酸が、任意の適切な経路を通して、（本発明の方法によって必要とされる）植物細胞に導入され得ることが容易に認識されよう。この様式での核酸の導入のために適切な広範な技術が当業者に公知であり、これには、弾道トランスフェクションが含まれるがこれに限定されない。適切な実験プロトコールは、実験結果の節にさらに記載されている
【００６７】
本発明に従う核酸は、適切な発現カセットまたはベクターにさらに組込まれ得る。このような発現カセットまたはベクターの例は、タンパク質の植物発現の当業者に周知である。本発明に従うキメラ核酸を組込む発現カセットの適切な例は、実験結果の節に示される。
【００６８】
本発明の（および本発明の方法における使用のために適切である）キメラ核酸は、キメラ核酸配列が首尾よく組込まれた植物細胞の同定において補助し得る生成物の発現のための核酸配列をさらに含むことが好ましくあり得る。この様式で使用され得る適切なさらなる核酸配列の例は当業者に明らかであり、選択のために使用され得る物質（例えば、抗生物質）に対する抵抗性を付与する生成物を生じる核酸、または選択のための基礎として使用され得る検出可能な生成物（例えば、色素生成酵素生成物）を生じるマーカーが含まれる。
【００６９】
さらなる局面において、本発明は、本発明の第２の局面（および本明細書に記載されるその任意の実施形態）に従って、核酸で形質転換された植物を提供する。
【００７０】
さらなる局面において、本発明は、本発明の第２の局面（および本明細書に記載されるその任意の実施形態）に従って、核酸を含む植物種子を提供する。
【００７１】
本明細書の他の箇所に記載される方法および核酸に加えて、本発明はまた、本発明に従う方法によって発現されるＴＧＦ−βを提供する。当業者は、このようなＴＧＦ−βの植物起源を認識し得る多数の独特な特徴が存在することを認識している。例えば、ＴＧＦ−βプロタンパク質の場合においては、動物細胞によって発現されるＴＧＦ−β、または植物細胞の核形質転換の結果として発現されるＴＧＦ−βにおいて見いだされるグリコシル化は、葉緑体中で発現されるプロタンパク質からは欠失される。これを、本発明に従って産生されるタンパク質またはプロタンパク質の同定において使用し得る。
【００７２】
当業者は、本明細書中に開示された方法および核酸が、ＴＧＦ−βアイソフォームそれら自体以外のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーの発現における使用のために、特に、第２の核酸配列の適合によって、適合され得ることを認めるであろう。従って、本発明のさらなる局面は、第２の核酸配列が一つのＴＧＦ−β以外のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーをコードする、方法および核酸を提供する。
【実施例】
【００７３】
実験結果
１．導入
以下、植物の葉緑素ゲノムの遺伝子修飾を通した、タバコ（ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）植物からの形質転換増殖因子ベータ３（ＴＧＦ−β３）タンパク質の発現を可能にする実験プロトコールを示す。
形質転換（プラスチド修飾ゲノム）植物を生産するために必要とされる段階の概略が図１に示される。
【００７４】
２．結果
２．１ 発現カセット構築物の設計
多数の発現カセットが、プラスチド特異的高発現調節領域の制御下でＤＮＡ翻訳領域を含むように設計された（図２を参照）。
【００７５】
様々な種から得られる調節領域が、しばしば遺伝子発現のために使用される。これらの要素は、非野生の種で正常な機能を可能にするのに十分に類似するが、しかしプラストームの非標的部分への相同な組換えを避けるのに十分なだけ塩基配列において異なる。
【００７６】
図２で示される発現カセットは、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ １６ＳｒｒｎプロモーターおよびＢ．ｎａｐｕｓ ｐｓｂＣ３’終結領域を含んだ。これらは両方とも、プラスチドに対して特異性を有する。Ｔ７バクテリオファージ遺伝子１０から得られるＲＢＳも、この発現カセットに組み込まれた。ＴＧＦ−β３活性領域翻訳領域が、このカセットに組み込まれた。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ葉緑体における最適な発現のために設計された合成ＴＧＦ−β３活性領域遺伝子（すなわち、本発明による第２の核酸配列）も、この発現カセットで合成され、組み込まれた。
【００７７】
１６Ｓｒｒｎプロモーターは、それが強力な遺伝子発現を生じることができるので選択された。バクテリオファージＴ７遺伝子１０リーダー配列は、高度の翻訳のために細菌中で集約的に使用され、プラスチド発現で首尾よく使用されてもきたリボソーム結合部位である。
【００７８】
全ての構築物は、プラスチドの対して特異的な調節領域の制御下でマーカー遺伝子アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）も含んだ。ａａｄＡ遺伝子は、抗生物質スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性を付与する。
【００７９】
２．２ 合成ＴＧＦ−β３活性領域遺伝子の構築
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ葉緑体遺伝子発現のために最適化された合成ＴＧＦ−β３活性領域遺伝子が設計された。段階的方法で一緒に連結した一本鎖オリゴヌクレオチドからその遺伝子を合成した（図３）。
【００８０】
第１のプライマー対は、内部のヘヤピン形成またはプライマー完全性のいずれかによりプライマー二量体を形成できず、それで、より大型のプライマーの対が、構築が迅速に継続できるために高コストで必要とされた。段階４で可視化された２つの１８５ｂｐプライマー「オクトマー」の連結時点でで、最終の３５０ｂｐ産物は、達成できなかった。これが、総ＤＮＡ鎖長に比較して非常に短い３’一本鎖重複の結果であると思われた。すでに段階２で作成された別のプライマー「二量体」を、１８０ｂｐ構築物に連結して、大きな重複を伴う２２５ｂｐＤＮＡ構築物を作成した。この方法は、その問題を首尾よく克服し、最終の３５０ｂｐの合成ＴＧＦ−β３遺伝子がＰＣＲによって増幅された。
【００８１】
合成配列は、野生型のＤＮＡ配列と７０％の塩基同一性を示し、そしてＧＣ含有量が、最適化配列で５６％から３３％までに減少された。合成ＴＧＦ−β３活性領域および野生のＴＧＦ−β３活性領域のＤＮＡ翻訳配列は、図４に示される。合成および野生型の配列のＤＮＡ配置は、図５で示される。合成および野生型の配列についての翻訳アミノ酸配列は同一であり、図６に示される。
【００８２】
２．３ プラスチド標的ベクターの構築
上に明記された４つの発現カセットを全て、照射のために作成された葉緑素標的プラスミドにクローン化した（図７Ａを参照）。葉緑素標的ベクターは、標的構築物がプラスチドでの相同な複製によって組み込まれることを可能にするタバコプラスチドゲノム（５２３７７−５９３１９、５９３２０−６３８６４）と相同なＤＮＡの領域を含有する。図７Ｂの矢印は、タバコプラスチドゲノム（プラストーム）でのＤＮＡ組込の位置を際立たせる。
【００８３】
標的遺伝子構築物は、導入遺伝子構築物の安定性を促進する選択因子発現カセットと共に、ベクター中に存在する。ａａｄＡ（アミノグリコシドアデニントランスフェラーゼ）は、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン抗体を解毒し、それは、本発明による使用のための好ましい選択因子である。
【００８４】
プラスチドゲノムに相同なＤＮＡの２つの領域は、２つの発現カセットに隣接する。これらの領域は、相同な組換えをプラスチドゲノムの特定領域に向けさせる。隣接領域は、「左標的領域」および「右標的領域」（ＬＴＲおよびＲＴＲ）として知られる。
【００８５】
使用される隣接領域は、極度に活性なｒｂｃＬ遺伝子の下流にトランスジェニック構築物を挿入し、それは、光合成に必須であるルビスコ（ｒｕｂｓｉｃｏ）の大型サブユニットを生成する。
【００８６】
２．４ 大腸菌での導入遺伝子カセットの発現
植物のプラスチド原核生物起源により、葉緑体発現カセットは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌でしばしば機能する。ＴＧＦ−β３タンパク質発現は、大腸菌で各導入遺伝子構築物について同定された（データは示されず）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大腸菌から得られる総タンパク質サンプルを分離し、そしてＴＧＦ−β３タンパク質に特異的な抗体を使用して、ウエスタンブロット分析を行った。
【００８７】
発現要素は細菌とプラスチドとの両方で作用するので、これらの研究は、発現カセットが機能することを調べる上で非常に有用である。
【００８８】
ウエスタンブロットを行い、そしてＴＧＦ−β３活性領域抗体を、発現レベルを調べるために使用した。
【００８９】
２．５ Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物の形質転換
粒子照射、続いて正の抗体選択でクローンを単離することによって、ウィスコンシン３８（ｗ３８）タバコ葉を形質転換させた。抗生物質を含むＭＳ培地上で苗条を育成し、その中で根付かせ、その後、植物を最終的に土壌に移した。
【００９０】
２．６ 植物のＤＮＡ特徴付け
推定形質転換体である植物は、特異的ＴＧＦ−β３遺伝子と（抗生物質選択のための）ａａｄＡマーカー遺伝子の組込を確認するために、ＰＣＲおよびサザンブロット分析によってそれらのＤＮＡを特徴付けられた。サザンブロット分析は、導入遺伝子カセットの正しい組込を確認し、植物におけるホモプラスミーも確認した。それは、安定な形質転換を表す。
【００９１】
２．７ タンパク質特徴付け
同質細胞質の植物から得られる葉組織を収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析により分析した。ＴＧＦ−β３活性領域タンパク質の発現は、「１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３活性領域−ｐｓｂＣ」および「１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３合成的活性領域−ｐｓｂＣ」構築物からＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定した。そして、タンパク質発現は、それぞれ総植物タンパク質の約１％および約１０％として定量された（図８を参照）。スキャンしたゲル上で、バイオラッドＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウエア分析により、デジタルで定量を行った。この結果は、ＴＧＦ−βをコードする核酸配列は植物による発現に適合する本発明の方法および核酸を用いて達成されうる大幅な収量の増加を示す。
ＴＧＦ−β３抗体のウエスタンブロット分析は、目的のタンパク質バンドがＴＧＦ−β３活性領域タンパク質であると確認し（図９を参照）、ＴＧＦ−β３の基準の定量は、上に示されたタンパク質発現レベルが正しいことを確認した。
【００９２】
「１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３合成的活性領域−ｐｓｂＣ」植物の葉から得られるタンパク質は、溶解性タンパク質調製物か、または不溶性タンパク質調製物のいずれかとして作成され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより分析された（図１０を参照）。結果は、合成ＴＧＦ−β３活性領域が不溶性タンパク質産物として発現されることを示した。
【００９３】
３．方法
３．１ 合成的ＴＧＦ−β３活性領域遺伝子の構築
Ｓｈｉｍａｄａら（１９９１年）によって、光合成タンパク質をコードすることが知られている２９個の葉緑体遺伝子全てから得られる翻訳領域が分析され、そしてコドン使用表として作表された。コドン使用表は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ部位ソフトウエア（Ｉｎｆｏｒｍａｘ社）に取り入れられ、野生型のＴＧＦ−β３活性領域アミノ酸配列が、ＤＮＡ翻訳領域配列に戻り翻訳された。多数の単一コドン型が存在する場合、第２および第３の最も頻繁に使用されるコドンが、ｔＲＮＡ代謝負荷を減じ、および／または反復配列を減じるために含められた。結果物のＤＮＡ配列は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ葉緑体での発現のために最適な合成ＴＧＦ−β３活性領域を表した。
【００９４】
３５０ｂｐの合成ＴＧＦ−β３活性領域ＤＮＡ翻訳領域を、段階的構築方法を使用して、一本鎖オリゴヌクレオチドから組み立てた（図３Ａを参照）。オリゴヌクレオチド重複、クレノー酵素指向性ＤＮＡ塩基充填、ベント−ポリメラーゼ指向性一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ産生、および二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ ＰＣＲ増幅技術が、合成構築物の組立を促進するために使用された。図３Ｂは、合成遺伝子の構築進行を表すアガロースゲルを示す。約３５、６０、１００、１８０、２２５および３５０ｂｐのｄｓＤＮＡ分子が、ゲル上で見られ、それは、遺伝子断片が段階的に組み立てられることを表す。最終の３５０ｂｐ構築物は、Ａ’尾部であり、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（インビトロゲン）にクローン化され、そして配列完全性を確認するために配列決定された。
【００９５】
３．２ タバコのプラスチド形質転換
３．２．１ 葉の調製
ウィスコンシン３８（Ｗ３８）タバコを、ショ糖を有するＭＳ培地上の種から約５週間育成した。この段階で、およそ４〜６の中程度の寸法の葉を有する植物が育成容器に存在した。これらの葉を葉組織の基で切断し、そしてＲＭＯＰプレートの中心に背軸側を上にして乗せた。プレートを覆い、密封し、ＤＮＡ照射のために必要とされるまで育成キャビネットに入れた。
【００９６】
３．２．２ ＤＮＡ被覆マイクロキャリアーの調製
金粒子（直径１．０μｍ、バイオラッド）を、ボルテックスによってエタノールで洗浄した。これらのマイクロキャリアーを遠心分離し、そして上清を除去した後、ｓ．ｄ．Ｈ２Ｏを添加し、そして短時間再度ボルテックスで撹拌した。この金溶液のアリコート量を、１．５ｍｌ遠心分離管に移した。標的プラスミドＤＮＡをマイクロキャリアー懸濁アリコートに添加し、短時間ボルテックスで撹拌した。２．５Ｍ ＣａＣｌ２を、混合しながら金調製物に即時に添加し、次いで直ぐに、０．１Ｍスペルミジンを添加した。マイクロキャリアー調製物をボルテックスで撹拌し、遠心分離した。上清を除去し、マイクロキャリアーを、ボルテックス撹拌によりＥｔＯＨで洗浄した。マイクロキャリアーを、再度遠心分離し、上清を除去した。マイクロキャリアーを、短時間ボルテックス撹拌によりＥｔＯＨで再懸濁した。無菌マイクロキャリアーディスクを、金属保持プレートに乗せ、そしてアリコート量のマイクロキャリアー調製物を、各マイクロキャリアーの中心にピペットで入れた。マイクロキャリアー溶液を蒸散させて、マイクロキャリアー表面上の小型の円形沈殿物を残した。この時点で、マイクロキャリアーは、照射実験の準備ができた。
【００９７】
３．２．３ 粒子照射
層流フード中のバイオラッド遺伝子銃装置を使用して、タバコ葉の粒子照射を行った。装置の準備、真空の作成および気体放出段階は、製造業者の使用説明に従って行われた。葉組織を、その区画の下方区分に入れ、そしてプレートの蓋を取り除いた。ＤＮＡベクターを含むマイクロキャリアーは、植物組織中に加速される。１１００ｐｓｉ破断ディスクを使用し、１０ｃｍの、停止スクリーンと植物組織との間の噴出距離を使用した。各粒子照射の後、タバコ葉を有するプレートを再度覆い、密封し、そして１２時間の明／暗サイクルで約４８時間、２３℃で育成キャビネト中でインキュベートした。光強度は、約１５０μＥｉであった。
【００９８】
３．２．４ 照射後の葉選択
照射の４８時間後、葉組織を、約２ｍｍ２片に切断し、選択培地に入れた。この選択培地は、５００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを有するＲＭＯＰか、または５００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンおよび２５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを有するＲＭＯＰのいずれかであった。組織プレートを、１２時間の明／暗サイクルで、約１５０μＥｉの光強度を用いて、２３℃でインキュベートした。形質転換した細胞は、４〜８週の間に植物苗条として再生し、そして２５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたＭＳ培地を有する育成容器に移して、育成および根付かせた。推定形質転換体を、ＰＣＲを使用して導入遺伝子についてスクリーニングし、その後、サザンブロット分析によって特徴付けた。
【００９９】
３．３ ＤＮＡ特徴付け
最初に植物葉を収穫し、そして液体窒素中で破砕することによって、ＤＮＡ分析を行った。エッペンドルフ「植物ＤＮＡ ｐｒｅｐ」キットを使用して、ＤＮＡを作成した。制限酵素消化によってＤＮＡサンプルを切断し、そしてゲル電気泳動によりサイズ分取した。ＤＮＡをナイロン膜に移し、その後３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識されたＤＮＡプローブでハイブリッド形成して、ＴＧＦ−β３遺伝子、マーカー遺伝子および野生型葉緑体遺伝子を同定した。プローブ・ハイブリダイゼーションは、統合された遺伝子を同定し、そして制限消化パターンが、確認されるべきＤＮＡ組込地図を可能にした。
【０１００】
３．４ タンパク質特徴付け
３．４．１ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
総細胞タンパク質調製物のために、葉組織を液体窒素中で粉末に破砕し、１：５比（ｗ／ｖ）で１×サンプル緩衝液に添加した。サンプルを、５分間沸騰水浴中に入れ、その後遠心分離した。その後、上清を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために使用した。可溶性細胞タンパク質調製のために、破砕した凍結葉組織をボルテックスで撹拌し、抽出緩衝液中でインキュベートし、その後遠心分離して固形分を除去した。上清を単離し、そのタンパク質含有量を定量した。可溶性タンパク質サンプルを、２×サンプル緩衝液に添加し、５分間、沸騰水浴中に入れた。サンプルを遠心分離し、そして上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために収集した。不溶性タンパク質調製のために、可溶性タンパク質抽出物から残ったペレットを再懸濁し、抽出緩衝液で３回洗浄し、各洗浄後遠心分離した。その後、残りのペレットを、１×サンプル緩衝液で再懸濁し、５分間沸騰水浴に入れ、その後遠心分離し、上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために収集した。１０〜２０％トリス−ＨＣｌアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、タンパク質をサイズによって分取し、タンパク質バンドは、クマシーブルー染色によって可視化させた。
【０１０１】
３．４．２ ウエスタンブロット分析
タンパク質サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でサイズにより分取し、その後、ナイロン膜に移した。膜を封鎖し、ＴＧＦ−β３抗体でプローブ探査し、その後洗浄した。ＴＧＦ−β３タンパク質を、アルカリ性ホスファターゼ結合抗体のＢＣＩＰ染色により可視化した。
【０１０２】
実験結果ＩＩ
４ 発現ＴＧＦ−β３の回収
上記の技術を用いて植物クロロプラストに発現させたＴＧＦ−β３を、以下で初めて述べる技術を用いて回収した。本技術によって、先行技術にて記述された回収または精製技術より収率の高いＴＧＦ−β、およびより純度の高いＴＧＦ−βが産生される。
【０１０３】
クロロプラスト抽出液を、（ｐＨ ８．０において、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２％重量／重量 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１Ｍ ＤＴＴからなる）溶解緩衝液中で１：１希釈した。この混合液を均質化し、超音波処理して溶解を補助した。ついで得られた溶液を、８０００ｘｇにて３０分間遠心分離した。
【０１０４】
上記遠心分離によって産生されたペレットを、（ｐＨ ８．０において、０．０５Ｍ トリス塩基、０．０１Ｍ ＥＤＴＡからなる）洗浄緩衝液を用いて、元の容量まで再懸濁し、８０００ｘｇにて３０分間、さらに１回遠心分離した。
【０１０５】
この回の遠心によって産生されたペレットを洗浄し、ついで（ｐＨ ８．０において、０．０５Ｍ トリス塩基、０．１Ｍ ＤＴＴ、６Ｍ尿素からなる）可溶化緩衝液中で１０倍希釈まで再懸濁させた（すなわち、９容量の可溶化緩衝液に、１容量のペレット物質を加えた）。得られた溶液を６０分間、室温にて攪拌して、再懸濁した溶液を可溶化した。攪拌６０分後、可溶化溶液のｐＨを９．５に調節し、攪拌を室温にてさらに６０分間続けた。
【０１０６】
ついでｐＨが調節された溶液を、８０００ｘｇにて３０分間遠心分離し、その間５ｋＤａ ＴＦＦ（接線流ろ過）膜を用いたろ過の工程を用いて、希釈液をろ過緩衝液（ｐＨ９．５における、０．０５Ｍ トリス塩基、０．０１Ｍ ＤＴＴ、３Ｍ尿素）に交換し、そのようにして産生された溶液を１５倍まで濃縮した。次にこの濃縮した溶液（濃縮水）を下記の条件を用いて、再折りたたみにかけた。
【０１０７】
５ 回収ＴＧＦ−β３の解析
再折りたたみされるＴＧＦ−β３の溶液中での存在を、Ｂｉｏｒａｄ ＲＣ／ＤＣアッセイを用いて確認した。この結果を図１１に示す。図１１は、タンパク質をクマシーブルーにて標識化した、１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ還元ゲルを用いて得られた結果を示す。レーン（左から右へ１〜１０）に以下のように試料を添加した。
レーン１＝マーク１２標準
レーン２＝ＴＧＦ−β標準
レーン３＝溶解物質
レーン４＝溶解物質上清
レーン５＝洗浄上清
レーン６＝可溶化上清
レーン７＝可溶化上清
レーン８＝可溶化上清
レーン９＝ブランク
レーン１０＝可溶化上清
【０１０８】
これらの結果によって、本発明の方法を用いて発現させたＴＧＦ−β３が、溶解クロロプラスト材料から得られうること、および上記で概説した回収レジームを用いて、本材料を、再折りたたみの前に可溶性上清中に濃縮しうることが確認される。
【０１０９】
６ 発現ＴＧＦ−β３の再折りたたみ
上記物質を、（すべてｐＨ ９．５において、０．７Ｍ ＣＨＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．００２Ｍ還元グルタチオン、０．０００４Ｍ酸化グルタチオン、０．２５ｍｇ／ｍＬの本発明にて発現したＴＧＦ−β３モノマーからなる）再折りたたみ緩衝液中に希釈した。次にこの再折りたたみ混合液を１０℃にて３日間、攪拌しながら維持し、再折りたたみを発生させた。２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）の存在下で実施した、この再折りたたみ手順が、特に高収率の正しく折りたたまれたＴＧＦ−β３を産生することを本発明者らは発見した。したがって、ＣＨＥＳの存在下で、本発明にしたがって発現させたＴＧＦ−βの折りたたみ（または再折りたたみ）が、本発明のとりわけ有用で、有利な実施形態を表している。
【０１１０】
７ 本発明にしたがって発現させた再折りたたみＴＧＦ−β３の捕獲
上記のように産生した再折りたたみＴＧＦ−β３を、５ｋＤａのＭＷＣＯを含む膜で適合した調整済みＵＦ系にて５倍濃縮した。再折りたたみ濃縮液のｐＨを、氷酢酸を用いて、ｐＨ ２．５から２．８まで、段階的に調節した。酸性化した濃縮液をついで、希釈緩衝液（０．０２Ｍ酢酸ナトリウム、２Ｍ硫酸アンモニウム、１Ｍ水酸化アルギニン、８．３３％（ｗ／ｗ）酢酸）を用いて、１：１の比で希釈し、０．２２μｍフィルターを介してろ過した。この「調整添加」を、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、再折りたたみＴＦＧ−β３を捕獲するために、ブチル−セファロース４・ファースト・フロー分離培地に加えた。ブチル−セファロース４・ファースト・フローカラムを、（ｐＨ ３．３において、０．０２Ｍ 酢酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、容量酢酸に対して１０％容量からなる）洗浄緩衝液／平衡化緩衝液で平衡化した。カラムを、結合したＴＧＦ−β３の段階溶出の前に、４カラム容量（ＣＶ）の本緩衝化緩衝液で洗浄した。段階溶出を、（ｐＨ ３．３における、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム、容量酢酸に対して１０％容量、容量エタノールに対して３０％容量からなる）溶出緩衝液を用いて実施し、本様式で産生されたＴＧＦ−β３溶出液をプールした。
【０１１１】
プールした溶出液中に産生された精製ＴＧＦ−β３の分析を、図１２に示しており、本発明の方法を用いて植物内に発現したＴＧＦ−β３を、本明細書で記述された方法を用いて、再折りたたみＴＧＦ−β３を産生するために精製しうることを表している。当然のことながら、これらの方法は、ＴＧＦ−β３だけではなく、生物学的に活性なＴＧＦ−βの回収、再折りたたみおよび捕獲においても利用され得る。上記方法を用いて産生された生物学的に活性なＴＧＦ−β３の精製を、以下の手順を用いて代替で、または追加的に実施することができる。
【０１１２】
８ 本発明にしたがって発現したＴＧＦ−β３の精製
代替的精製手順において、ブチル−セファロース捕獲精製段階からの溶出液を、４．０（±０．１）にｐＨ調節し、ｐＨ ３．９〜４．１において、２．７２ｇ／Ｌ酢酸ナトリウム三水和物、１００ｍＬ／Ｌ氷酢酸および３００ｍＬ／Ｌ エチルアルコール、を含む緩衝液で、伝導率が７．０ｍＳ／ｃｍ未満という所望の規格を満たすまで希釈した。次に、調整されたブチル溶出液を、０．２２μｍフィルターを通してろ過し、次いで、ｐＨ ３．９〜４．１おいて、２．７２ｇ／Ｌ酢酸ナトリウム三水和物、１００ｍＬ／Ｌ氷酢酸、３００ｍＬ／Ｌエチルアルコールおよび２．９２ｇ／Ｌ塩化ナトリウムからなる、洗浄緩衝液および平衡化緩衝液で平衡化したＳＰ−セファロースカラム上に添加した。次いでカラムを、３カラム容量の洗浄緩衝液と平衡化緩衝液で洗浄した。直線勾配０％〜５０％の溶出緩衝液（ｐＨ ３．９〜４．１において、２．７２ｇ／Ｌ酢酸ナトリウム三水和物、１００ｍＬ／Ｌ氷酢酸、３００ｍＬ／Ｌエチルアルコールおよび２９．９２ｇ／Ｌ塩化ナトリウムからなる）を、１５カラム容量にわたってカラムに適用した。ついでカラムを、５０％〜１００％溶出緩衝液の段階勾配で、続いて２〜３カラム容量の１Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した。ＴＧＦ−β３ダイマーを含む、ＳＰセファロース溶出液の画分を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって、純度に従ってプールした。プールしたＳＰ−セファロース溶出液を、前処理済みＵＦ／ＤＦシステム（５ｋＤａのＮＷＣＯ）を用いて、（Ａ２７８ｎｍによって）１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３濃度まで濃縮した。ついで、濃縮ＴＦＧ−β３溶液を、６容量にわたって、構築緩衝液（ｐＨ４．０±０．１において、１．２ｍＬ／Ｌ酢酸、２００ｍＬ／Ｌエチルアルコール）へ緩衝液交換した。ろ過ＴＧＦ−β３溶液をついで、構築緩衝液にて、１０±２ｍｇ／ｍＬ（Ａ２７８ｎｍによって）のＴＧＦ−β３濃度に希釈した。
【０１１３】
配列情報
ＴＧＦ−β１の活性断片のアミノ酸配列（配列番号１）
ＴＧＦ−β２の活性断片のアミノ酸配列（配列番号２）
ＴＧＦ−β３の活性断片のアミノ酸配列（配列番号３）
ＴＧＦ−β３の活性断片をコードする野生型ＤＮＡ配列（配列番号４）
ＴＧＦ−β３の活性断片をコードする本発明の第二核酸配列（配列番号５）
【０１１４】
全長ＴＧＦ−ベータ１をコードするＤＮＡ（配列番号６）、シグナルペプチド（イタリック体で示す）、プロペプチド（太字で示す）、ならびに活性断片（通常の文字で示す）を示している。
【０１１５】
全長ＴＧＦ−ベータ２をコードするＤＮＡ（配列番号７）、シグナルペプチド（イタリック体で示す）、プロペプチド（太字で示す）、ならびに活性断片（通常の文字で示す）を示している。
【０１１６】
全長ＴＧＦ−ベータ３をコードするＤＮＡ（配列番号８）、シグナルペプチド（イタリック体で示す）、プロペプチド（太字で示す）、ならびに活性断片（通常の文字で示す）を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）の発現に関する。本発明は、植物におけるＴＧＦ−βの発現に関する。特に、本発明は、植物葉緑体におけるＴＧＦ−βの発現に関する。ＴＧＦ−β３は、本発明による発現の好ましいＴＧＦ−βである。本発明は、植物におけるＴＧＦ−βの発現に用いるのに適したキメラ核酸配列、ならびにそのような方法によって産生されるＴＧＦ−β、およびそのようなＴＧＦ−βの使用も提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦ−βは多様な生物学的活性を有するサイトカインのファミリーである。ＴＧＦ−βファミリーの５つのメンバーが今日までに同定されている。すなわち、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、およびＴＧＦ−β５のイソ型である。これらのＴＧＦ−βは、共通のシステインノットモチーフ、および共通のシグナル変換経路のような構造的類似性を共有する。
【０００３】
ＴＧＦ−βは、多くの異なる治療的状況で有用性がある生物学的活性を有する。その結果、ＴＧＦ−βファミリーメンバーの医薬適用において多大な関心が寄せられている。
【０００４】
今日まで、最大の医薬的関心がＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３に示されてきた。全てヒトで見いだされているこれらのイソ型は、創傷治癒応答の調節において非常に重要な役割を担っていることが知られている。
【０００５】
ＴＧＦ−β１は、強皮症、脈管形成障害、腎臓疾患、骨粗鬆症、骨疾患、糸球体腎炎および腎臓疾患の予防および／または治療において使用される。
【０００６】
ＴＧＦ−β２は、神経膠種、非小細胞肺癌、膵臓腫瘍、固体腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、加齢性黄斑変性症、目の負傷、骨粗鬆症、網膜障害、潰瘍、癌腫、口炎症および強皮症の治療で用いることができる。
【０００７】
ＴＧＦ−β３は、線維性障害、強皮症、脈管形成障害、再狭窄、癒着、子宮内膜症、虚血性疾患、骨および軟骨誘導、体外受精、口内粘膜炎、腎臓疾患の治療、瘢痕化の予防、低下または抑制、末梢および中枢神経系におけるニューロン再結合の増強、（ＬＡＳＩＫまたはＰＲＫ外科的処置のような）目の外科的処置の合併症の予防、低下または抑制に用いることができる。
【０００８】
ＴＧＦ−βの産生、特に治療的使用のための現在の方法は、培養された動物細胞、または適切にトランスフェクトされた細菌の（それらの活性またはプロタンパク質形態のいずれかでの）培養による、これらのタンパク質の発現に依拠する。そのような方法はＴＧＦ−βの産生で効果的であるが、それらは比較的低い収率である傾向があり、そのようなタンパク質の調製に関するコストは高い。
【０００９】
上記を考慮して、これらの不利の影響を受けないＴＧＦ−β産生のための新しい方法を開発するかなりはっきりとした要望が存在することが認識されよう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明のある実施形態の目的は、先行技術の不利の少なくともいくつかを克服し、または除去することにある。本発明のある実施形態の目的は、先行技術の方法よりも低いコストにてＴＧＦ−βの製造で用いることができる方法および／または手段を提供することにある。本発明のある実施形態の目的は、先行技術の方法を用いて製造し得るよりも大量のＴＧＦ−βの製造に用いることができる方法および／または手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第一の態様によると、植物においてＴＧＦ−βを発現させる方法が提供され、該方法は、
（ａ）植物細胞に、
（１）植物細胞における転写および／または翻訳を調節することができる第一の核酸配列、
（２）ＴＧＦ−βをコードし、かつ該植物細胞における発現に適合した、第二の核酸配列、ならびに
（３）該植物細胞において機能する、終止領域をコードする第三の核酸配列、
を含むキメラ核酸配列を導入し、次いで、
（ｂ）該植物細胞を成長させて、該ＴＧＦ−βを産生する、
ことを含む。
【００１２】
本発明の第二の態様において、
（１）植物細胞における転写および／または翻訳を調節することができる第一の核酸配列、
（２）ＴＧＦ−βをコードし、かつ植物細胞における発現に適合した、第二の核酸配列、ならびに
（３）植物細胞において機能する、終止領域をコードする核酸配列、
を含むキメラ核酸配列が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法および核酸は、植物細胞の葉緑体におけるＴＧＦ−βの発現での使用に特に適している。特に、キメラ核酸は、葉緑体ゲノムの形質転換に用いられるのに適したものであり得る。適切なキメラ核酸は植物葉緑体において発現させるのに適切で有り得、好ましくは、この様式において発現させるのに適合させることができる。核酸（キメラ核酸全体、または該キメラ核酸をなす第一、第二、第三の核酸のいずれか）を植物細胞の葉緑体における発現に適合させることができる好ましい手段は、本明細書全体にわたって記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明は、ここで、以下の実験結果および付随する図１〜１２を参照してさらに説明される。
【図１】本発明に従う方法を実施するためにタバコ葉緑体形質転換に含まれる工程を概略的に示す。１において、標的ＴＧＦ−β遺伝子のｃＤＮＡが単離されかつ大腸菌特異的ベクターにクローニングされ、２において、標的ｃＤＮＡは発現カセットにクローニングされ、３において、完全な発現カセットが葉緑体標的化プラスミドに移入され、４において、プラスミドストックは精製され、かつ葉組織の粒子ボンバードメントのために使用され、５において、植物は、抗生物質選択条件下で葉組織から再生され、そして６において、葉組織からの３サイクルの再生が同種形成植物を生じる。
【図２】本発明に従う使用のために適切であるＴＧＦ−β３発現構築物を概略的に図示する。
【図３】本発明における使用のために核酸を産生するための合成遺伝子構築を図示する。この図の左側において、核酸断片は、段階的な様式で合わされて合成ＴＧＦ−β３遺伝子を産生する。図の右側は、左側のパネルに示した工程によって生じた異なる生成物のサイズを可視化するＤＮＡゲル電気泳動を示す。
【図４】合成（上の配列）および野生型（下の配列）ＴＧＦ−β３活性領域からのＤＮＡのコード配列を比較する。
【図５】図４に示した合成ＤＮＡ配列および野生型ＤＮＡ配列のアラインメントを示す。
【図６】図４および５に示した合成ＤＮＡ配列および野生型ＤＮＡ配列によってコードされるＴＧＦ−β３のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図７】本発明における使用のために適切である葉緑体標的化プラスミドを概略的に図示する。「ＬＴＲ」は左側標的化領域を示し、「ＲＴＲ」は右側標的化領域を示す。「ａａｄＡ」は使用され得る抗生物質耐性マーカーであるアミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼを示す。
【図８】タバコ葉調製物中で産生されたＴＧＦ−βの検出を図示する。この図は、タンパク質がクマシーブルーを使用して染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。収率は、野生型タバコ植物（ゲルのレーン１）、１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３活性領域−ｐｓｂＣタバコ植物（すなわち、ＴＧＦ−βをコードする核酸の配列が植物細胞における発現のために適合されていない植物であり、ゲルのレーン２に結果が示される）、および１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３合成活性領域−ｐｓｂＣタバコ植物（ＴＧＦ−βをコードする核酸の配列が植物細胞における発現のために適合されており、レーン３に結果が示される）に由来する全タンパク質調製物の間で比較される。結果の分析は、この例において、ＴＧＦ−β３が、野生型の適合されていない配列を含む植物中の全タンパク質の約１％を占め、および合成の適合した配列を含む植物中の全タンパク質の約１０％を占めることを示す。
【図９】本図もまた、タバコ葉調製物中で産生されたＴＧＦ−βの検出を図示するが、この場合においては、図は、ＴＧＦ−β３が抗ＴＧＦ−β３抗体を使用して標識されているウエスタンブロット（イムノブロット）を示す。レーン１および２は、１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３活性領域−ｐｓｂＣタバコ植物（レーン１に示す）および１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３合成活性領域−ｐｓｂＣタバコ植物（レーン２に示す）に由来する全タンパク質調製物の収率を比較する。これらは、レーン３、４、および５（それぞれ、１．０μｇ、０．０５μｇ、および０．２５μｇ）における、ＴＧＦ−β３「標準」と比較される。結果の分析は、この例において、合成適合した配列を含む植物からの２０μｇタンパク質サンプルが約２μｇ（すなわち、全タンパク質含量の約１０％）のＴＧＦ−β３を含んでいたことを示す。
【図１０】実験結果において記載される方法によって発現されたＴＧＦ−β３が不溶性タンパク質の型を有することを図示する。図の左側は、タンパク質がクマシーブルーを使用して染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、それに対して、右側は、ＴＧＦ−β３が抗ＴＧＦ−β３抗体を使用して標識されているウエスタンブロットを示す。両方の場合において、レーン１および２はＴＧＦ−β３「標準」であり（それぞれ、１．０ｍｇおよび０．１ｍｇ）、それに対して、レーン３は植物１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３合成活性領域−ｐｓｂＣタバコ植物から収集した可溶性タンパク質、レーン４は１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３合成活性領域−ｐｓｂＣタバコ植物から収集した不溶性タンパク質を示す。
【図１１】植物細胞における発現のために適合した核酸を含む植物によって発現された物質の回収を研究するために、Ｂｉｏｒａｄ ＲＣ／ＤＣアッセイを使用して得られた結果を示す。
【図１２】ブチル−セファロース捕捉後の溶出工程からのＴＧＦ−β３の収率を図示するブチルセファロースクロマトグラムを示す。
【００１５】
本開示において利用される特定のアミノ酸配列および核酸配列は、実験結果の後に続く配列情報の節においてもまた示される。上述の通り、関連配列は図面の間にもまた示される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
葉緑体におけるタンパク質の発現および、特に、葉緑体形質転換は、植物細胞の他の箇所における発現に勝る多くの利点を提供する。葉緑体において発現された外因性タンパク質の区画化は、それらが発現される細胞に対するその潜在的毒性を低下させる。葉緑体ゲノムは高いコピー数で存在し、従って、高い発現レベルを達成するのに用いることができる。相同組換えは目的の核酸の正確な挿入、およびそれらの産物の継続した安定な発現を可能とする。そのような発現は、広い範囲の植物で観察することができる。最後に、多くの作物における母性遺伝は、花粉における導入遺伝子の望ましくない伝達の危険性がかなり低下することを意味する。
【００１７】
本発明の第一および第二の態様において言及するタイプの「第一の核酸配列」は、（他の箇所で定義されるような）第二の核酸配列の植物細胞における転写および／または翻訳を調節することができるものである。第二の核酸配列の翻訳を調節することができる本発明による第一の核酸配列は、好ましくは、プロモーター部位を含む。本発明に従って第一の核酸配列に組み込むことができる適当なプロモーター部位の詳細は、本明細書の他の箇所で考慮される。第二の核酸配列の転写を調節することができる本発明による第一の核酸配列は、好ましくは、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。本発明に従って第一の核酸配列に組み込むことができる適当なＲＢＳの詳細は、本明細書中の他の箇所において考慮される。一般に、本発明による第一の核酸配列は、第二の核酸配列の転写および翻訳双方を調節することができるものである。従って、好ましい第一の核酸配列は、適当なプロモーターおよび適当なＲＢＳの双方を含み得る。そのような組み合わされた第一の核酸配列で用いることができる好ましいプロモーターおよびＲＢＳは、明細書中の他の箇所で記載される。好ましい第一の核酸配列は、植物細胞の葉緑体における転写および／または翻訳の調節に適合させることができる。
【００１８】
本発明による「第二の核酸配列」は、発現させるべきＴＧＦ−βをコードし、植物細胞における発現に適合した配列である。第二の核酸配列の翻訳および／または転写は、前記したように、適当な第一の核酸配列によって調節することができる。適当な第二の核酸配列は、植物細胞において発現させるのが望まれる任意のＴＧＦ−βをコードすることができることが認識されるであろう。好ましい第二の核酸は、例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３をコードすることができ、そのうち、ＴＧＦ−β３はより好ましくあり得る。本発明の第二の核酸配列は、種々の適合戦略の１以上を用いて植物細胞での発現のために適合させることができる。適当な適合戦略の例は、本明細書中の他の箇所に記載される。好ましい第二の核酸配列は、植物細胞の葉緑体におけるそれらの発現のために適合させることができる。
【００１９】
本発明による「第三の核酸配列」は、第二の核酸配列の転写を終了させるのに用いることができる終止領域をコードする配列である。終止領域は、植物細胞において機能的であるものである。好ましくは、適当な終止領域は、植物細胞の葉緑体において機能的なものである。（植物細胞および葉緑体に用いるのに適した配列を含む）本発明に従って用いることができる適当な第三の核酸配列の例は、本明細書中の他の箇所で考慮される。
【００２０】
第一および／または第二および／または第三の核酸配列は、好ましくは、相互に遺伝子的に融合させることができ、それにより、種々の核酸配列を含む単一のキメラ核酸分子を産生することができる。
【００２１】
本発明のキメラ核酸配列は、ＤＮＡ配列であるのが好ましい。従って、好ましい第一および／または第二のおよび／または第三の核酸配列はＤＮＡ配列であると認識されるであろう。
【００２２】
その最も広い解釈において、用語「植物細胞における発現に適合した」は、必要な活性または発現を達成するために植物細胞において発現させることができる任意の核酸も含むように用いることができる。種々の戦略を使用して、葉緑体におけるキメラ核酸の発現を促進することができる。いくつかのそのような適当な戦略は、本明細書の他の箇所においてさらに詳細に述べられ、これらの特定の戦略は、核酸が植物細胞における発現のために適合させるべき好ましい手段を表わすことができる。
【００２３】
本発明の核酸は、葉緑体標的化プラスミドのような適当なプラスミドに組み込むことができる。一般に、葉緑体において発現させるべき核酸は、葉緑体ゲノムへのキメラ核酸分子の挿入を可能とするプラスチド標的化ＤＮＡの領域によって近接されるのが好ましい。適当なプラスミドは、本発明の方法に用いるための好ましい薬剤を表す。
【００２４】
発現させるべきＴＧＦ−βは、任意の動物、ヒトまたは非ヒトに由来する任意のＴＧＦ−βであってもよいが、好ましくは、ＴＧＦ−βはヒトＴＧＦ−βである。
【００２５】
本発明の方法または核酸を用いて、任意のＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５のいずれか）を発現させることができる。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３よりなる群から選択されるのが好ましい。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β３であるのがなおより好ましい。ＴＧＦ−βはヒトＴＧＦ−βであるのが特に好ましい。
【００２６】
本発明による核酸配列によってコードされるＴＧＦ−βが、好ましくは、ＴＧＦ−βの活性断片を含むことを認識されるであろう。コードされるＴＧＦ−βは、活性断片のみを適切に（すなわち、潜伏関連ペプチドの会合なし）を含むことができる。適当な核酸は、選択されたＴＧＦ−βの活性断片の全てまたは部分をコードすることができる。参考までに、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３の活性断片のアミノ酸配列は、各々、図１１における配列番号１ないし３として記載される。
【００２７】
本発明による核酸配列によってコードされるか、または本発明による方法で発現させるＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−βプロタンパク質を含み得る。そのようなプロタンパク質は、それらを、商業的使用に先立って長期貯蔵または処理に適したものとする安定性を呈することができる。本発明者らは、プロタンパク質ホモ二量体（７５ｋＤａ）の精製は、タンパク質の安定性のため、活性な領域ホモ二量体（２４ｋＤａ）よりも容易であろうと考える。活性なタンパク質のカプセル化は、タンパク質半減期を４０倍増加させることができ、作製された切断部位はその治療的作用部位においてタンパク質を放出した。プロタンパク質は精製後にインビトロにて切断されて、例えば、治療剤として用いるための活性な領域を提供することができる。
【００２８】
本発明による核酸配列によってコードされるか、または本発明による方法で発現されたＴＧＦ−βは、全長ＴＧＦ−β、好ましくは、配列番号６、７または８のいずれか１つによってコードされるアミノ酸配列を有する全長ＴＧＦ−βを含み得る。
【００２９】
本発明の核酸配列によってコードされたＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−βの変種形態を含むことができる。
【００３０】
本発明による方法および核酸は、植物の葉緑体において発現された遺伝子に由来するプロモーターを使用することができる。適当なプロモーターは光合成遺伝子に由来するのが好ましいであろう。
【００３１】
本発明の方法または核酸に用いられる適当なプロモーターは、光合成関連遺伝子、遺伝子系遺伝子、およびプラスチドコードプラスチド（ＰＥＰ）ＲＮＡポリメラーゼまたは核コードプラスチド（ＮＥＰ）ＲＮＡポリメラーゼによって認識される任意のその他を発現するプロモーターよりなるプラスチドプロモーター、藻プロモーター、細菌プロモーター、またはファージプロモーター、例えばプラスチドｐｓｂＡプロモーター、プラスチド１６Ｓ ｒｒｎプロモーター、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）ｐｂｓＡプロモーター、細菌ｔｒｃプロモーターおよびバクテリオファージＴ７プロモーターよりなる群から選択することができる。これらの群のうち、１６ｓｒｒｎプロモーターは、好ましいプロモーターを表す。適当なプロモーターは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、好ましくはＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓに由来することができる。事実、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ １６ｓｒｒｎプロモーターは、本発明の方法または核酸に用いられる特に好ましいプロモーターを表す。
【００３２】
本発明の方法または核酸に用いられる適当なリボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、ｒｂｃＬ ＲＢＳまたはｐｓｂＡ ＲＢＳのような任意のプラスチドＲＢＳ、あるいはＴ７ｇ１０ ＲＢＳのような細菌またはバクテリオファージＲＢＳよりなる群から選択することができる。この群のうち、Ｔ７ｇ１０ ＲＢＳは、好ましいＲＢＳであり得る。本発明の方法に用いられる他の適当なＲＢＳは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｐｓｂＡ ＲＢＳのようなＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍに由来するものを含む。
【００３３】
本発明の方法または核酸に用いることができる適切なターミネーターは、ｐｓｂＡターミネーター、ｒｂｃＬターミネーター、（リボソームタンパク質Ｓ１８からの）ｒｐｓ１８ターミネーターおよびｐｓｂＣターミネーターを含むプラスチドターミネーター、または細菌ターミネーターまたはバクテリオファージターミネーターよりなる群から選択することができる。ｐｓｂＣターミネーターは、この群からの好ましいターミネーターを表す。適当なターミネーターは、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、好ましくはＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓに由来することができる。Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｐｓｂＣターミネーターは、本発明に従って用いられる特に好ましいターミネーターである。
【００３４】
前述したように、葉緑体発現を用いて、広く種々の植物において本発明によるＴＧＦ−βの発現を達成することができる。本発明者らは、本発明の方法および核酸（特に、葉緑体発現に用いられるもの）は、単子葉植物または双子葉植物いずれでも用いることができると考える。本発明の方法および核酸に従って利用することができる双子葉植物の好ましい例はタバコである。一般に、本発明者らは、本発明の方法および核酸が、陸上植物および藻を含めた広い範囲の植物に関連して用いることができると考える。適切な植物は、限定されるものではないが、キャベツ、カリフラワー、クロレラ、クラミドモナス、大麦、ニンジン、レタス、コケ、トウモロコシ、菜種、コショウ、ジャガイモ、米、大豆、ヒマワリ、トマト、小麦を含む。本発明による方法または核酸は、それらが発現されるべき選択された植物を参照して選択された適当な標的化配列およびプロモーターを利用することができる。例えば、本発明による適切な核酸または方法は、藻またはコケで用いるのに適した標的化配列およびプロモーターを利用することができる。
【００３５】
前述したように、本発明者らは、葉緑体におけるＴＧＦ−βの発現、特に、葉緑体ゲノムの形質転換の結果として起こるそのような発現は、本発明の文脈において多くの利点を提供すると考える。本発明者らは、ＴＧＦ−βをコードする核酸を産生するのに用いることができ、かつ葉緑体における発現に適合した多数の戦略を見いだした。
【００３６】
本発明によるＴＧＦ−βの発現は、葉緑体発現に適し、好ましくは、葉緑体発現で優先されるか、または特異的でさえある第一の核酸配列を利用することができる（プロモーターおよびリボソーム結合部位を含むことができる、本明細書中の他の箇所で言及される「第一の核酸配列」における）調節核酸配列の使用によって達成することができる。
【００３７】
同様にして、本発明の方法および核酸は、葉緑体における発現に適した（明細書中の他の箇所で言及される「第三の核酸配列」における）終止領域を利用することができる。そのような第三の核酸配列は、なおより好ましくは、葉緑体における発現で優先されるか、またはそれに特異的であり得る。
【００３８】
特に、植物細胞における発現のための核酸の適合は、発現させるべきＴＧＦ−βをコードする配列（本明細書中において考えられるような「第二の核酸配列」）を参照して実行することができる。本発明者らは、植物細胞における発現、より特別には葉緑体における発現のためのそのような第二の核酸配列を適合させるのに用いることができる多数の手段を見いだした。適当な第二の核酸配列の産生におけるこれらの手段の１つ以上の使用は、本発明において記載された任意の方法または核酸配列の好ましい実施形態であり得る。
【００３９】
そのような第二の核酸配列を植物細胞、より詳細には葉緑体における発現に適合させることができる１つの好ましい方法は、発現させるべきＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡに見いだされるコドンの１つ以上の置換である。
【００４０】
特に好ましい実施形態において、野生型ＤＮＡで生じるアミノ酸システインをコードするコドンの１つ以上を置換するのが好ましいであろう。ＴＧＦ−βは多数のシステイン残基を含み、これらの残基はＴＧＦ−βタンパク質の特徴である。しかしながら、システインは、葉緑体遺伝子産物において他のアミノ酸よりも少量で、かつ光合成葉緑体遺伝子産物においてかなり低い量で見いだされるアミノ酸である。
【００４１】
本発明者らは、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡ（例えば、ＴＧＦ−β３の活性断片の場合には、配列番号４のＤＮＡ）に存在する１つ（またはそれを超える）のＵＧＣコドンが置換されれば、ＴＧＦ−βをコードするＤＮＡが、植物細胞の葉緑体における発現に適合させることができるのを見いだした。ＵＧＣコドンはアミノ酸システインをコードし、そのような場合における好ましい置換は、一般には、代替システインコードコドンＵＧＣに関連するであろう。好ましくは、野生型ＤＮＡ配列に存在するＵＧＣコドンの少なくとも２つを置換することができ、より好ましくは、ＵＧＣコドンの少なくとも３つを置換することができ、最も好ましくは、ＵＧＣコドンの４つを置換することができる。本発明者らは、野生型ＤＮＡに存在するＵＧＣコドンの５つ、または６つさえを置換することができ、依然として、所望のＴＧＤＦ−βの産生を可能とすることができるが、少なくとも１つ、より好ましくは２つのＵＧＣコドンが適切な核酸に保持されるのが好ましいと考える。
【００４２】
本発明者らは、代替、またはさらなる置換の対象となり得る多数の他のコドンを同定した。
【００４３】
例えば、ロイシンをコードするコドンＣＵＧは、有益には、植物細胞における（特に、植物細胞の葉緑体における）発現に適合した核酸の産生における置換に供することができる。少なくとも１つのＣＵＧコドンを置換して、本発明の方法または核酸配列に用いるのに適した第二の核酸配列を生じさせるのが好ましいであろう。例えば、発現させるべきＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡに存在する全てのＣＵＧコドンが置換されているのが好ましいであろう。例えば、ヒトＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡの場合において、全ての７つの存在するＣＵＧコドンを置換するのが好ましいであろう。用いるべき好ましい代替コドンは、ロイシンをコードする別のコドンＵＵＡであり得る。
【００４４】
加えて、あるいは別法として、バリンをコードするコドンＧＵＧは、有益に、植物細胞における（特に、植物細胞の葉緑体における）発現に適合した核酸を産生する場合、置換に供することができる。少なくとも１つのＧＵＧコドンを置換して、本発明の方法または核酸配列で用いるのに適した第二の核酸配列を生じさせるのが好ましいであろう。例えば、発現させるべきＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡに存在する全てのＧＵＧコドンが置換されているのが好ましいであろう。例えば、ヒトＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡの場合、そうでなければ存在するであろう全ての６つのＧＵＧコドンを置換するのが好ましいであろう。用いるべき好ましい代替コドンは、別のバリンをコードするコドンＧＵＵまたはＧＵＡであり得る。
【００４５】
別法として、あるいは加えて、プロリンをコードするコドンＣＣＣは、有益に、植物細胞における（特に、植物細胞の葉緑体における）発現に適合した核酸の産生において置換することができる。少なくとも１つのＣＣＣコドンを置換して、本発明の方法または核酸配列に用いるのに適した第二の核酸配列を生じさせるのが好ましいであろう。例えば、そうでなければ、発現されるべきＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡに存在する全てのＣＣＣコドンが置換されているのが好ましいであろう。例えば、ヒトＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡの場合には、そうでなければ存在するであろうＣＣＣコドンの全ての４つを置換するのが好ましいであろう。用いるべき好ましい代替コドンは、別のプロリンをコードするコドンＣＣＵであり得る。
【００４６】
さらに代替的に、または加えて、チロシンをコードするコドンであるＵＡＣは有利に置換され、植物細胞中での（および特に植物細胞の葉緑体中での）発現のために適合した核酸を生じ得る。少なくとも１個のＵＡＣコドンが置換され、本発明の方法または核酸配列における使用のために適切な第２の核酸配列を生じることが好ましくあり得る。例えば、発現されるＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡ中に存在する少なくとも１個、２個、３個、または４個のＵＡＣコドンが置換されることが好ましくあり得る。例えば、ヒトＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡの場合においては、そうでなければ存在する６個のＵＡＣコドンのうちの５個が置換されることが特に好ましくあり得る。使用される好ましい置換コドンは、チロシンをコードする代替のコドンであるＵＡＵであり得る。
【００４７】
上記の適合に対してなおさらに代替的にまたは加えて、植物細胞中での（および特に植物細胞の葉緑体中での）発現のために適合した核酸の産生の際に、アスパラギンをコードするコドンであるＡＡＣが置換されることが好ましくあり得る。少なくとも１つのＡＡＣコドンが置換され、本発明の方法または核酸配列における使用のために適切な第２の核酸配列を生じることが好ましくあり得る。例えば、発現されるＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡ中に存在する少なくとも１個、２個、３個、または４個のＡＡＣコドンが置換されることが好ましくあり得る。例えば、ヒトＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡの場合においては、そうでなければ存在する６個のＡＡＣコドンのうちの５個が置換されることが特に好ましくあり得る。使用される好ましい置換コドンは、アスパラギンをコードする代替のコドンであるＡＡＵであり得る。
【００４８】
植物細胞中での（および特に植物細胞の葉緑体中での）発現のために適合される核酸の産生の際に、上記の適合に対してさらに代替的にまたは加えて使用され得る別の適合は、アスパラギン酸をコードするコドンであるＧＡＣの置換である。少なくとも１個のＧＡＣコドンが置換され、本発明の方法または核酸配列における使用のために適切な第２の核酸配列を生じることが好ましくあり得る。例えば、発現されるＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡ中に存在するすべてのＧＡＣコドンが置換されることが好ましくあり得る。例えば、ヒトＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡの場合においては、そうでなければ存在する４個すべてのＧＡＣコドンが置換されることが特に好ましくあり得る。使用される好ましい置換コドンは、アスパラギン酸をコードする代替のコドンであるＧＡＵであり得る。
【００４９】
本開示の目的のために、野生型ＤＮＡは、本発明に従って発現またはコードされる、ＴＧＦ−βをコードする天然に存在するＤＮＡであると見なされるべきである。例えば、ヒトＴＧＦ−β１（その活性断片のアミノ酸配列が配列番号１に示される）の場合においては、野生型ＤＮＡは、このタンパク質をコードする天然に存在するヒトゲノムＤＮＡである（その全長ＤＮＡ配列は配列番号６に示される）。ヒトＴＧＦ−β２（その活性断片のアミノ酸配列が配列番号２に示される）の場合においては、野生型ＤＮＡは、このタンパク質をコードする天然に存在するヒトゲノムＤＮＡである（その全長ＤＮＡ配列は配列番号７に示される）。ヒトＴＧＦ−β３（その活性断片のアミノ酸配列が配列番号３に示される）の好ましい場合においては、野生型ＤＮＡは、このタンパク質をコードする天然に存在するヒトゲノムＤＮＡである（例えば、配列番号４に示されるような活性断片をコードするＤＮＡ、または配列番号８に示される全長ＤＮＡ配列）。
【００５０】
ＴＧＦ−β（この場合においては、ＴＧＦ−β３の活性断片）をコードし、かつ植物細胞における、およびより特定的には葉緑体における発現のために適合される特に好ましい核酸配列の例は、配列番号５に示される。確かに、この核酸配列は非常に好ましいので、本発明のさらなる局面において、配列番号５に示される核酸配列を含む核酸配列が提供される。配列番号５に示される核酸配列は、本発明の方法における使用のために好ましい第２の核酸配列と、本発明の核酸における使用のためにもまた好ましい第２の核酸配列の両方を表す。
【００５１】
本発明者らは、配列番号５に示される配列と少なくとも１．７５％のコドン同一性を共有する核酸配列が、このような核酸配列がなお、発現されるＴＧＦ−βをコードしていることを条件として、本発明の方法および核酸において利用され得ると考える。より好ましくは、適切な核酸は、配列番号５と少なくとも２２％のコドン同一性、さらにより好ましくは、少なくとも５０％のコドン同一性、なおより好ましくは、少なくとも７５％のコドン同一性、および最も好ましくは、少なくとも９９．１％のコドン同一性を共有し得る。
【００５２】
先の段落に記載した核酸配列、例えば、配列番号５の核酸配列（または特定の同一性の程度、例えば、少なくとも２２％のコドン同一性を配列番号５と共有する配列）は、本発明の方法または核酸のいずれかまたはすべてに従う使用のための適切な「第２の核酸配列」を含み得ることが理解されよう。
【００５３】
本発明者らは、上記の型の修飾が、植物細胞中で発現できるＴＧＦ−β（葉緑体中での発現を含む）の総量を増加させる上で非常に有効であることを見いだした。例えば、以下の実験結果の節においてさらに説明されるように、ＴＧＦ−β３をコードする野生型ＤＮＡを含む核酸で形質転換された植物は、全タンパク質の約１％のＴＧＦ−β３という収率を生じ得る。対照的に、植物細胞中での発現のために適合した核酸配列、例えば、配列番号５の核酸配列の使用は、野生型配列を使用して生じるものよりも、１０倍高いＴＧＦ−β３の収率を生じることが可能である（全タンパク質の約１０％という、ＴＧＦ−β３の収率を生じる）本発明者らは、この種の選択された第２の核酸配列、例えば、配列番号５の使用することにより、同じ第１および第３のアミノ酸配列が共通して使用される場合においてさえ、野生型配列と比較して、ＴＧＦ−β収率を顕著に増加させることが可能であることを見いだした。
【００５４】
ＴＧＦ−β収率のこれらの増加は、本発明の方法および核酸を利用することなく他の方法で達成され得る場合に対して、顕著でありかつ驚くべき改善を表すことが認められる。本発明の方法および核酸を利用して産生されるＴＧＦ−βの量は、以前には不可能であった様式で、植物中におけるＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β３）の経済的に有利な産生を可能にする。
【００５５】
本発明者らは、本発明の方法において選択的に有利に使用され得る多数の新規な技術および条件をさらに見いだした。これらは、本発明に従って発現されるＴＧＦ−βの回収、および／または活性なＴＧＦ−βを産生するためのこのようなＴＧＦ−βのフォールディングもしくは再フォールティングに関して顕著な利益を提供する。開発された新規な方法には、本発明に従う方法において発現される再フォールティングされたＴＧＦ−βの捕捉における使用のために適切な手順もまた含まれる。
【００５６】
植物中で発現される組換えタンパク質は、典型的には、可溶性タンパク質として発現される。これは、一般的には、先行技術において記載された方法を使用して達成され得る比較的低いレベルのタンパク質発現に起因すると見なされている。産生した可溶性タンパク質は、生物学的に活性な型および生物学的に不活性な型の混合物を含む傾向があり、不活性型は全体の中でより大きな割合を占める。
【００５７】
本発明の方法および核酸を使用して達成される高レベルの発現は、高収率の組換えＴＧＦ−βタンパク質を産生することが見いだされたが、これらのタンパク質の不溶性凝集物を生じることが見いだされ、生物学的活性を産生するように正確にフォールディングされた型では検出可能なタンパク質は発現されなかった。いかなる仮説によっても束縛されることは望まないが、本発明者らは、これらの凝集物が、植物細胞（および特に葉緑体）内部で確立された高濃度の組換えタンパク質に起因して生じ、ＴＧＦ−βタンパク質の疎水性の結果として発現されると考えている。この様式でのＴＧＦ−βの不溶性凝集物の産生は、（そうでなければ夾雑物を構成し得る可溶性植物細胞成分から不溶性組換えタンパク質を分離することが容易であるという点で）有利であり、そしてこの不溶性型のＴＧＦ−βは、それ自体、有用な生成物を表す（これは、次には、先行技術の技法を使用して、その活性型に可溶化およびフォールティングされ得るからである）。しかし、改善された純度および収率で正確にフォールディングされたＴＧＦ−βの生物学的活性型を生じるために、本発明者らは、本発明の方法および核酸を使用して発現されるＴＧＦ−βの可溶化およびフォールディング／再フォールティングに特に適合した新規な技術を開発した。
【００５８】
本発明者らは、本発明の方法または核酸を使用して発現されるＴＧＦ−βの精製における有利な工程には、（その中では、ＴＧＦ−βが葉緑体中で発現している）葉緑体抽出物の溶解、ならびに得られた混液のＴＧＦ−βの溶解を補助するための均質化および超音波処理が含まれることを見いだした。溶解は、ｐＨ ８．０において、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２重量／重量％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１Ｍ ＤＴＴを含む緩衝液を使用して達成され得る。
【００５９】
本発明の方法または核酸を使用して発現されるＴＧＦ−βは、夾雑物、例えば、葉緑体または他の植物タンパク質を除去するために有利に「洗浄」され得る。適切な洗浄緩衝液は、ｐＨ ８．０における０．０５Ｍ Ｔｒｉｓベースおよび０．０１Ｍ ＥＤＴＡを含み得る。洗浄は、一連の遠心分離工程および再懸濁工程（好ましくは、洗浄緩衝液中での２回以上の遠心分離および再懸濁のサイクル）によって容易に実行され得る。遠心分離は、８０００×ｇ、３０分間で実行され得る。
【００６０】
次いで、このような洗浄後に得られるＴＧＦ−β産物は、好ましくは、組換えＴＧＦ−βを溶解するが、植物タンパク質または炭水化物（例えば、デンプンなど）を溶解しない溶媒を使用して可溶化され得る。本発明者らは、この機能を有する適切な緩衝液は、尿素を含み得、このような緩衝液の好ましい例は、ｐＨ ８．０における、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓベース、０．１Ｍ ＤＴＴ、６Ｍ 尿素を含むことを見いだした。このような可溶化は（好ましくは、溶解性を補助するために攪拌しながら）室温で達成することができ、可溶化溶液のｐＨを９．５周辺まで調整することによって補助され得る。組換えＴＧＦ−βを優先的に溶解可能であるが、植物細胞成分（例えば、植物タンパク質または炭水化物）を溶解しない溶媒のこの使用は、先行技術において示唆されておらず、そしてそれが付与する顕著な利点に起因して、本発明の方法において利用され得る好ましい工程を表す。
【００６１】
本発明の方法または核酸を使用して発現されたＴＧＦ−βが（例えば、上記に概略される様式で）可溶化される際、次いでこれは、膜分離精製技術を使用して濃縮され得る。適切な技術は、５ｋＤａ ＴＦＦ（接線流濾過）膜、およびｐＨ ９．５において、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓベース、０．０１Ｍ ＤＴＴ、３Ｍ 尿素を含む膜分離精製緩衝液を利用し得る。このような膜分離精製は、溶液を約１５倍に濃縮するために使用され得る。
【００６２】
本発明の方法の任意の実施形態に従って産生されるＴＧＦ−βは、活性なＴＧＦ−βが産生されるように、ＣＨＥＳ（２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）またはその機能上の類似物の存在下でフォールティングが起こる技術を使用して、フォールティングまたは再フォールティングすることができる。この様式でのＴＧＦ−βのフォールティングまたは再フォールティングは特に有利であり、このさらなる工程を組み入れた方法は、本発明の好ましい実施形態を表す。好ましくは、ＣＨＥＳは、約１００ｍＭから１．０Ｍの濃度で、より好ましくは約０．７Ｍの濃度で使用され得る。本発明の方法または核酸を使用して発現されるＴＧＦ−βのフォールティングにおけるＣＨＥＳの使用を含む任意の工程は、低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系と組み合わせたＣＨＥＳ（またはその機能的アナログ）を利用し得る。本発明の方法において有利に使用され得るＣＨＥＳを利用するフォールティングまたは再フォールティングの方法のさらなる詳細は、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０００８１４に含まれており、この文書の内容は、特に、生物学的に活性な分子を産生するためにＴＧＦ−βをフォールティングするための方法に関連する限りにおいて、参照により本明細書に援用される。
【００６３】
本発明の方法に従って発現されるＴＧＦ−βは、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって捕捉され得る。例として、ブチル−セファロース４ファストフロー（Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）分離媒体を、このような捕捉を実施するために使用することができる。ＴＧＦ−β（好ましくは、上記の様式で活性型に再フォールディングされたもの）を含む溶液は、洗浄緩衝液および平衡化緩衝液で平衡化したブチル−セファロース４ファストフローカラムに加えられ得る。適切な平衡化緩衝液は、ｐＨ ３．３において、０．０２Ｍ 酢酸ナトリウム、１Ｍ 硫酸アンモニウム、１０％ｖ／ｖ酢酸を含み得る。カラムは、結合したＴＧＦ−βの溶出の前に、必要に応じて洗浄され得る。溶出は、適切な洗浄緩衝液、例えば、ｐＨ ３．３において、０．０２Ｍ 酢酸ナトリウム、１０％ｖ／ｖ酢酸、３０％ｖ／ｖエタノールを含むものを利用してもよい。
【００６４】
ＴＧＦ−βは、カチオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製することができる。例として、ＳＰ−セファロース媒体が、ＴＧＦ−β単量体および植物関連の不純物からＴＧＦ−β二量体をさらに精製するために使用され得る。カチオン交換クロマトグラフィー媒体へのＴＧＦ−β二量体の結合を確実にするために、捕捉精製工程からの溶離液（好ましくは、上記のブチル−セファロースの溶離液）の伝導度は低くされる必要があり得、そしてこれは、適切な緩衝液（例えば、ｐＨ ３．９〜４．１において、２．７２ｇ／Ｌ 酢酸ナトリウム三水和物、１００ｍＭ／Ｌ 氷酢酸、３００ｍＬ／Ｌエチルアルコールを含む緩衝液）中で溶離液を希釈することによって最も良好に達成される。次いで、調整済みの負荷物をＳＰ−セファロースカラムに加え、適切な緩衝液で平衡化する。この緩衝液は、ｐＨ ３．９〜４．１において、２．７２ｇ／Ｌ 酢酸ナトリウム三水和物、１００ｍＭ／Ｌ 氷酢酸、３００ｍＬ／Ｌエチルアルコール、２．９２ｇ／Ｌ 塩化ナトリウムを含み得る。カラムは、結合したＴＧＦ−βの溶出の前に、必要に応じて洗浄することができる。カラムからのＴＧＦ−βの溶出は、移動相のｐＨを変化させること、または伝導度を上昇させることによって達成することができる。一例として、適切な溶出緩衝液は、ｐＨ ３．９〜４．１において、２．７２ｇ／Ｌ 酢酸ナトリウム三水和物、１００ｍＭ／Ｌ 氷酢酸、３００ｍＬ／Ｌエチルアルコール、２９．２２ｇ／Ｌ 塩化ナトリウムからなる。ＴＧＦ−β二量体を含むＳＰセファロース溶離物の画分は、純度に従ってプールされるべきである。残渣の塩はＴＧＦ−βタンパク質の凝集を引き起こし得るので、ＳＰ−セファロースの溶離物は、適切な最終製剤に緩衝液交換されるべきであり、緩衝液の１つの例は、ｐＨ ４．０±０．１おける、１．２ｍＭ／Ｌ 酢酸、２００ｍＬ／Ｌ エチルアルコールを使用する（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）。
【００６５】
上記に示した選択的工程は、個別にまたは本発明の方法において組み合わせて利用する際、植物からの組換えヒトタンパク質の精製のため、または一般的なＴＧＦ−βの精製のために示唆されてきた先行技術の技法を超えた顕著な利点を付与する。従って、当業者には、これらの任意工程の１つ以上（好ましくはすべて）が本発明の方法に有利に組み入れられ得ることが認識されよう。特に、組換えタンパク質の精製のためのこれらの新規な方法の使用は、塩の沈殿およびクロマトグラフィーの必要性を伴うことなく、高度に精製されたＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β３を産生することを可能にする（塩の沈殿およびクロマトグラフィーは、先行技術によって示唆されている技術であるが、残渣の塩の存在に起因して、この様式で精製されたタンパク質の望ましくない凝集をもたらす可能性がある）。
【００６６】
当業者には、本発明の核酸が、任意の適切な経路を通して、（本発明の方法によって必要とされる）植物細胞に導入され得ることが容易に認識されよう。この様式での核酸の導入のために適切な広範な技術が当業者に公知であり、これには、弾道トランスフェクションが含まれるがこれに限定されない。適切な実験プロトコールは、実験結果の節にさらに記載されている
【００６７】
本発明に従う核酸は、適切な発現カセットまたはベクターにさらに組込まれ得る。このような発現カセットまたはベクターの例は、タンパク質の植物発現の当業者に周知である。本発明に従うキメラ核酸を組込む発現カセットの適切な例は、実験結果の節に示される。
【００６８】
本発明の（および本発明の方法における使用のために適切である）キメラ核酸は、キメラ核酸配列が首尾よく組込まれた植物細胞の同定において補助し得る生成物の発現のための核酸配列をさらに含むことが好ましくあり得る。この様式で使用され得る適切なさらなる核酸配列の例は当業者に明らかであり、選択のために使用され得る物質（例えば、抗生物質）に対する抵抗性を付与する生成物を生じる核酸、または選択のための基礎として使用され得る検出可能な生成物（例えば、色素生成酵素生成物）を生じるマーカーが含まれる。
【００６９】
さらなる局面において、本発明は、本発明の第２の局面（および本明細書に記載されるその任意の実施形態）に従って、核酸で形質転換された植物を提供する。
【００７０】
さらなる局面において、本発明は、本発明の第２の局面（および本明細書に記載されるその任意の実施形態）に従って、核酸を含む植物種子を提供する。
【００７１】
本明細書の他の箇所に記載される方法および核酸に加えて、本発明はまた、本発明に従う方法によって発現されるＴＧＦ−βを提供する。当業者は、このようなＴＧＦ−βの植物起源を認識し得る多数の独特な特徴が存在することを認識している。例えば、ＴＧＦ−βプロタンパク質の場合においては、動物細胞によって発現されるＴＧＦ−β、または植物細胞の核形質転換の結果として発現されるＴＧＦ−βにおいて見いだされるグリコシル化は、葉緑体中で発現されるプロタンパク質からは欠失される。これを、本発明に従って産生されるタンパク質またはプロタンパク質の同定において使用し得る。
【００７２】
当業者は、本明細書中に開示された方法および核酸が、ＴＧＦ−βアイソフォームそれら自体以外のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーの発現における使用のために、特に、第２の核酸配列の適合によって、適合され得ることを認めるであろう。従って、本発明のさらなる局面は、第２の核酸配列が一つのＴＧＦ−β以外のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーをコードする、方法および核酸を提供する。
【実施例】
【００７３】
実験結果
１．導入
以下、植物の葉緑素ゲノムの遺伝子修飾を通した、タバコ（ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）植物からの形質転換増殖因子ベータ３（ＴＧＦ−β３）タンパク質の発現を可能にする実験プロトコールを示す。
形質転換（プラスチド修飾ゲノム）植物を生産するために必要とされる段階の概略が図１に示される。
【００７４】
２．結果
２．１ 発現カセット構築物の設計
多数の発現カセットが、プラスチド特異的高発現調節領域の制御下でＤＮＡ翻訳領域を含むように設計された（図２を参照）。
【００７５】
様々な種から得られる調節領域が、しばしば遺伝子発現のために使用される。これらの要素は、非野生の種で正常な機能を可能にするのに十分に類似するが、しかしプラストームの非標的部分への相同な組換えを避けるのに十分なだけ塩基配列において異なる。
【００７６】
図２で示される発現カセットは、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ １６ＳｒｒｎプロモーターおよびＢ．ｎａｐｕｓ ｐｓｂＣ３’終結領域を含んだ。これらは両方とも、プラスチドに対して特異性を有する。Ｔ７バクテリオファージ遺伝子１０から得られるＲＢＳも、この発現カセットに組み込まれた。ＴＧＦ−β３活性領域翻訳領域が、このカセットに組み込まれた。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ葉緑体における最適な発現のために設計された合成ＴＧＦ−β３活性領域遺伝子（すなわち、本発明による第２の核酸配列）も、この発現カセットで合成され、組み込まれた。
【００７７】
１６Ｓｒｒｎプロモーターは、それが強力な遺伝子発現を生じることができるので選択された。バクテリオファージＴ７遺伝子１０リーダー配列は、高度の翻訳のために細菌中で集約的に使用され、プラスチド発現で首尾よく使用されてもきたリボソーム結合部位である。
【００７８】
全ての構築物は、プラスチドの対して特異的な調節領域の制御下でマーカー遺伝子アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）も含んだ。ａａｄＡ遺伝子は、抗生物質スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性を付与する。
【００７９】
２．２ 合成ＴＧＦ−β３活性領域遺伝子の構築
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ葉緑体遺伝子発現のために最適化された合成ＴＧＦ−β３活性領域遺伝子が設計された。段階的方法で一緒に連結した一本鎖オリゴヌクレオチドからその遺伝子を合成した（図３）。
【００８０】
第１のプライマー対は、内部のヘヤピン形成またはプライマー完全性のいずれかによりプライマー二量体を形成できず、それで、より大型のプライマーの対が、構築が迅速に継続できるために高コストで必要とされた。段階４で可視化された２つの１８５ｂｐプライマー「オクトマー」の連結時点でで、最終の３５０ｂｐ産物は、達成できなかった。これが、総ＤＮＡ鎖長に比較して非常に短い３’一本鎖重複の結果であると思われた。すでに段階２で作成された別のプライマー「二量体」を、１８０ｂｐ構築物に連結して、大きな重複を伴う２２５ｂｐＤＮＡ構築物を作成した。この方法は、その問題を首尾よく克服し、最終の３５０ｂｐの合成ＴＧＦ−β３遺伝子がＰＣＲによって増幅された。
【００８１】
合成配列は、野生型のＤＮＡ配列と７０％の塩基同一性を示し、そしてＧＣ含有量が、最適化配列で５６％から３３％までに減少された。合成ＴＧＦ−β３活性領域および野生のＴＧＦ−β３活性領域のＤＮＡ翻訳配列は、図４に示される。合成および野生型の配列のＤＮＡ配置は、図５で示される。合成および野生型の配列についての翻訳アミノ酸配列は同一であり、図６に示される。
【００８２】
２．３ プラスチド標的ベクターの構築
上に明記された４つの発現カセットを全て、照射のために作成された葉緑素標的プラスミドにクローン化した（図７Ａを参照）。葉緑素標的ベクターは、標的構築物がプラスチドでの相同な複製によって組み込まれることを可能にするタバコプラスチドゲノム（５２３７７−５９３１９、５９３２０−６３８６４）と相同なＤＮＡの領域を含有する。図７Ｂの矢印は、タバコプラスチドゲノム（プラストーム）でのＤＮＡ組込の位置を際立たせる。
【００８３】
標的遺伝子構築物は、導入遺伝子構築物の安定性を促進する選択因子発現カセットと共に、ベクター中に存在する。ａａｄＡ（アミノグリコシドアデニントランスフェラーゼ）は、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン抗体を解毒し、それは、本発明による使用のための好ましい選択因子である。
【００８４】
プラスチドゲノムに相同なＤＮＡの２つの領域は、２つの発現カセットに隣接する。これらの領域は、相同な組換えをプラスチドゲノムの特定領域に向けさせる。隣接領域は、「左標的領域」および「右標的領域」（ＬＴＲおよびＲＴＲ）として知られる。
【００８５】
使用される隣接領域は、極度に活性なｒｂｃＬ遺伝子の下流にトランスジェニック構築物を挿入し、それは、光合成に必須であるルビスコ（ｒｕｂｓｉｃｏ）の大型サブユニットを生成する。
【００８６】
２．４ 大腸菌での導入遺伝子カセットの発現
植物のプラスチド原核生物起源により、葉緑体発現カセットは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌でしばしば機能する。ＴＧＦ−β３タンパク質発現は、大腸菌で各導入遺伝子構築物について同定された（データは示されず）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大腸菌から得られる総タンパク質サンプルを分離し、そしてＴＧＦ−β３タンパク質に特異的な抗体を使用して、ウエスタンブロット分析を行った。
【００８７】
発現要素は細菌とプラスチドとの両方で作用するので、これらの研究は、発現カセットが機能することを調べる上で非常に有用である。
【００８８】
ウエスタンブロットを行い、そしてＴＧＦ−β３活性領域抗体を、発現レベルを調べるために使用した。
【００８９】
２．５ Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物の形質転換
粒子照射、続いて正の抗体選択でクローンを単離することによって、ウィスコンシン３８（ｗ３８）タバコ葉を形質転換させた。抗生物質を含むＭＳ培地上で苗条を育成し、その中で根付かせ、その後、植物を最終的に土壌に移した。
【００９０】
２．６ 植物のＤＮＡ特徴付け
推定形質転換体である植物は、特異的ＴＧＦ−β３遺伝子と（抗生物質選択のための）ａａｄＡマーカー遺伝子の組込を確認するために、ＰＣＲおよびサザンブロット分析によってそれらのＤＮＡを特徴付けられた。サザンブロット分析は、導入遺伝子カセットの正しい組込を確認し、植物におけるホモプラスミーも確認した。それは、安定な形質転換を表す。
【００９１】
２．７ タンパク質特徴付け
同質細胞質の植物から得られる葉組織を収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析により分析した。ＴＧＦ−β３活性領域タンパク質の発現は、「１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３活性領域−ｐｓｂＣ」および「１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３合成的活性領域−ｐｓｂＣ」構築物からＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定した。そして、タンパク質発現は、それぞれ総植物タンパク質の約１％および約１０％として定量された（図８を参照）。スキャンしたゲル上で、バイオラッドＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウエア分析により、デジタルで定量を行った。この結果は、ＴＧＦ−βをコードする核酸配列は植物による発現に適合する本発明の方法および核酸を用いて達成されうる大幅な収量の増加を示す。
ＴＧＦ−β３抗体のウエスタンブロット分析は、目的のタンパク質バンドがＴＧＦ−β３活性領域タンパク質であると確認し（図９を参照）、ＴＧＦ−β３の基準の定量は、上に示されたタンパク質発現レベルが正しいことを確認した。
【００９２】
「１６Ｓｒｒｎ−Ｔ７−ＴＧＦ−β３合成的活性領域−ｐｓｂＣ」植物の葉から得られるタンパク質は、溶解性タンパク質調製物か、または不溶性タンパク質調製物のいずれかとして作成され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより分析された（図１０を参照）。結果は、合成ＴＧＦ−β３活性領域が不溶性タンパク質産物として発現されることを示した。
【００９３】
３．方法
３．１ 合成的ＴＧＦ−β３活性領域遺伝子の構築
Ｓｈｉｍａｄａら（１９９１年）によって、光合成タンパク質をコードすることが知られている２９個の葉緑体遺伝子全てから得られる翻訳領域が分析され、そしてコドン使用表として作表された。コドン使用表は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ部位ソフトウエア（Ｉｎｆｏｒｍａｘ社）に取り入れられ、野生型のＴＧＦ−β３活性領域アミノ酸配列が、ＤＮＡ翻訳領域配列に戻り翻訳された。多数の単一コドン型が存在する場合、第２および第３の最も頻繁に使用されるコドンが、ｔＲＮＡ代謝負荷を減じ、および／または反復配列を減じるために含められた。結果物のＤＮＡ配列は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ葉緑体での発現のために最適な合成ＴＧＦ−β３活性領域を表した。
【００９４】
３５０ｂｐの合成ＴＧＦ−β３活性領域ＤＮＡ翻訳領域を、段階的構築方法を使用して、一本鎖オリゴヌクレオチドから組み立てた（図３Ａを参照）。オリゴヌクレオチド重複、クレノー酵素指向性ＤＮＡ塩基充填、ベント−ポリメラーゼ指向性一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ産生、および二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ ＰＣＲ増幅技術が、合成構築物の組立を促進するために使用された。図３Ｂは、合成遺伝子の構築進行を表すアガロースゲルを示す。約３５、６０、１００、１８０、２２５および３５０ｂｐのｄｓＤＮＡ分子が、ゲル上で見られ、それは、遺伝子断片が段階的に組み立てられることを表す。最終の３５０ｂｐ構築物は、Ａ’尾部であり、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（インビトロゲン）にクローン化され、そして配列完全性を確認するために配列決定された。
【００９５】
３．２ タバコのプラスチド形質転換
３．２．１ 葉の調製
ウィスコンシン３８（Ｗ３８）タバコを、ショ糖を有するＭＳ培地上の種から約５週間育成した。この段階で、およそ４〜６の中程度の寸法の葉を有する植物が育成容器に存在した。これらの葉を葉組織の基で切断し、そしてＲＭＯＰプレートの中心に背軸側を上にして乗せた。プレートを覆い、密封し、ＤＮＡ照射のために必要とされるまで育成キャビネットに入れた。
【００９６】
３．２．２ ＤＮＡ被覆マイクロキャリアーの調製
金粒子（直径１．０μｍ、バイオラッド）を、ボルテックスによってエタノールで洗浄した。これらのマイクロキャリアーを遠心分離し、そして上清を除去した後、ｓ．ｄ．Ｈ２Ｏを添加し、そして短時間再度ボルテックスで撹拌した。この金溶液のアリコート量を、１．５ｍｌ遠心分離管に移した。標的プラスミドＤＮＡをマイクロキャリアー懸濁アリコートに添加し、短時間ボルテックスで撹拌した。２．５Ｍ ＣａＣｌ２を、混合しながら金調製物に即時に添加し、次いで直ぐに、０．１Ｍスペルミジンを添加した。マイクロキャリアー調製物をボルテックスで撹拌し、遠心分離した。上清を除去し、マイクロキャリアーを、ボルテックス撹拌によりＥｔＯＨで洗浄した。マイクロキャリアーを、再度遠心分離し、上清を除去した。マイクロキャリアーを、短時間ボルテックス撹拌によりＥｔＯＨで再懸濁した。無菌マイクロキャリアーディスクを、金属保持プレートに乗せ、そしてアリコート量のマイクロキャリアー調製物を、各マイクロキャリアーの中心にピペットで入れた。マイクロキャリアー溶液を蒸散させて、マイクロキャリアー表面上の小型の円形沈殿物を残した。この時点で、マイクロキャリアーは、照射実験の準備ができた。
【００９７】
３．２．３ 粒子照射
層流フード中のバイオラッド遺伝子銃装置を使用して、タバコ葉の粒子照射を行った。装置の準備、真空の作成および気体放出段階は、製造業者の使用説明に従って行われた。葉組織を、その区画の下方区分に入れ、そしてプレートの蓋を取り除いた。ＤＮＡベクターを含むマイクロキャリアーは、植物組織中に加速される。１１００ｐｓｉ破断ディスクを使用し、１０ｃｍの、停止スクリーンと植物組織との間の噴出距離を使用した。各粒子照射の後、タバコ葉を有するプレートを再度覆い、密封し、そして１２時間の明／暗サイクルで約４８時間、２３℃で育成キャビネト中でインキュベートした。光強度は、約１５０μＥｉであった。
【００９８】
３．２．４ 照射後の葉選択
照射の４８時間後、葉組織を、約２ｍｍ２片に切断し、選択培地に入れた。この選択培地は、５００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを有するＲＭＯＰか、または５００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンおよび２５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを有するＲＭＯＰのいずれかであった。組織プレートを、１２時間の明／暗サイクルで、約１５０μＥｉの光強度を用いて、２３℃でインキュベートした。形質転換した細胞は、４〜８週の間に植物苗条として再生し、そして２５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたＭＳ培地を有する育成容器に移して、育成および根付かせた。推定形質転換体を、ＰＣＲを使用して導入遺伝子についてスクリーニングし、その後、サザンブロット分析によって特徴付けた。
【００９９】
３．３ ＤＮＡ特徴付け
最初に植物葉を収穫し、そして液体窒素中で破砕することによって、ＤＮＡ分析を行った。エッペンドルフ「植物ＤＮＡ ｐｒｅｐ」キットを使用して、ＤＮＡを作成した。制限酵素消化によってＤＮＡサンプルを切断し、そしてゲル電気泳動によりサイズ分取した。ＤＮＡをナイロン膜に移し、その後３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識されたＤＮＡプローブでハイブリッド形成して、ＴＧＦ−β３遺伝子、マーカー遺伝子および野生型葉緑体遺伝子を同定した。プローブ・ハイブリダイゼーションは、統合された遺伝子を同定し、そして制限消化パターンが、確認されるべきＤＮＡ組込地図を可能にした。
【０１００】
３．４ タンパク質特徴付け
３．４．１ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
総細胞タンパク質調製物のために、葉組織を液体窒素中で粉末に破砕し、１：５比（ｗ／ｖ）で１×サンプル緩衝液に添加した。サンプルを、５分間沸騰水浴中に入れ、その後遠心分離した。その後、上清を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために使用した。可溶性細胞タンパク質調製のために、破砕した凍結葉組織をボルテックスで撹拌し、抽出緩衝液中でインキュベートし、その後遠心分離して固形分を除去した。上清を単離し、そのタンパク質含有量を定量した。可溶性タンパク質サンプルを、２×サンプル緩衝液に添加し、５分間、沸騰水浴中に入れた。サンプルを遠心分離し、そして上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために収集した。不溶性タンパク質調製のために、可溶性タンパク質抽出物から残ったペレットを再懸濁し、抽出緩衝液で３回洗浄し、各洗浄後遠心分離した。その後、残りのペレットを、１×サンプル緩衝液で再懸濁し、５分間沸騰水浴に入れ、その後遠心分離し、上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために収集した。１０〜２０％トリス−ＨＣｌアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、タンパク質をサイズによって分取し、タンパク質バンドは、クマシーブルー染色によって可視化させた。
【０１０１】
３．４．２ ウエスタンブロット分析
タンパク質サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でサイズにより分取し、その後、ナイロン膜に移した。膜を封鎖し、ＴＧＦ−β３抗体でプローブ探査し、その後洗浄した。ＴＧＦ−β３タンパク質を、アルカリ性ホスファターゼ結合抗体のＢＣＩＰ染色により可視化した。
【０１０２】
実験結果ＩＩ
４ 発現ＴＧＦ−β３の回収
上記の技術を用いて植物クロロプラストに発現させたＴＧＦ−β３を、以下で初めて述べる技術を用いて回収した。本技術によって、先行技術にて記述された回収または精製技術より収率の高いＴＧＦ−β、およびより純度の高いＴＧＦ−βが産生される。
【０１０３】
クロロプラスト抽出液を、（ｐＨ ８．０において、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２％重量／重量 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１Ｍ ＤＴＴからなる）溶解緩衝液中で１：１希釈した。この混合液を均質化し、超音波処理して溶解を補助した。ついで得られた溶液を、８０００ｘｇにて３０分間遠心分離した。
【０１０４】
上記遠心分離によって産生されたペレットを、（ｐＨ ８．０において、０．０５Ｍ トリス塩基、０．０１Ｍ ＥＤＴＡからなる）洗浄緩衝液を用いて、元の容量まで再懸濁し、８０００ｘｇにて３０分間、さらに１回遠心分離した。
【０１０５】
この回の遠心によって産生されたペレットを洗浄し、ついで（ｐＨ ８．０において、０．０５Ｍ トリス塩基、０．１Ｍ ＤＴＴ、６Ｍ尿素からなる）可溶化緩衝液中で１０倍希釈まで再懸濁させた（すなわち、９容量の可溶化緩衝液に、１容量のペレット物質を加えた）。得られた溶液を６０分間、室温にて攪拌して、再懸濁した溶液を可溶化した。攪拌６０分後、可溶化溶液のｐＨを９．５に調節し、攪拌を室温にてさらに６０分間続けた。
【０１０６】
ついでｐＨが調節された溶液を、８０００ｘｇにて３０分間遠心分離し、その間５ｋＤａ ＴＦＦ（接線流ろ過）膜を用いたろ過の工程を用いて、希釈液をろ過緩衝液（ｐＨ９．５における、０．０５Ｍ トリス塩基、０．０１Ｍ ＤＴＴ、３Ｍ尿素）に交換し、そのようにして産生された溶液を１５倍まで濃縮した。次にこの濃縮した溶液（濃縮水）を下記の条件を用いて、再折りたたみにかけた。
【０１０７】
５ 回収ＴＧＦ−β３の解析
再折りたたみされるＴＧＦ−β３の溶液中での存在を、Ｂｉｏｒａｄ ＲＣ／ＤＣアッセイを用いて確認した。この結果を図１１に示す。図１１は、タンパク質をクマシーブルーにて標識化した、１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ還元ゲルを用いて得られた結果を示す。レーン（左から右へ１〜１０）に以下のように試料を添加した。
レーン１＝マーク１２標準
レーン２＝ＴＧＦ−β標準
レーン３＝溶解物質
レーン４＝溶解物質上清
レーン５＝洗浄上清
レーン６＝可溶化上清
レーン７＝可溶化上清
レーン８＝可溶化上清
レーン９＝ブランク
レーン１０＝可溶化上清
【０１０８】
これらの結果によって、本発明の方法を用いて発現させたＴＧＦ−β３が、溶解クロロプラスト材料から得られうること、および上記で概説した回収レジームを用いて、本材料を、再折りたたみの前に可溶性上清中に濃縮しうることが確認される。
【０１０９】
６ 発現ＴＧＦ−β３の再折りたたみ
上記物質を、（すべてｐＨ ９．５において、０．７Ｍ ＣＨＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．００２Ｍ還元グルタチオン、０．０００４Ｍ酸化グルタチオン、０．２５ｍｇ／ｍＬの本発明にて発現したＴＧＦ−β３モノマーからなる）再折りたたみ緩衝液中に希釈した。次にこの再折りたたみ混合液を１０℃にて３日間、攪拌しながら維持し、再折りたたみを発生させた。２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）の存在下で実施した、この再折りたたみ手順が、特に高収率の正しく折りたたまれたＴＧＦ−β３を産生することを本発明者らは発見した。したがって、ＣＨＥＳの存在下で、本発明にしたがって発現させたＴＧＦ−βの折りたたみ（または再折りたたみ）が、本発明のとりわけ有用で、有利な実施形態を表している。
【０１１０】
７ 本発明にしたがって発現させた再折りたたみＴＧＦ−β３の捕獲
上記のように産生した再折りたたみＴＧＦ−β３を、５ｋＤａのＭＷＣＯを含む膜で適合した調整済みＵＦ系にて５倍濃縮した。再折りたたみ濃縮液のｐＨを、氷酢酸を用いて、ｐＨ ２．５から２．８まで、段階的に調節した。酸性化した濃縮液をついで、希釈緩衝液（０．０２Ｍ酢酸ナトリウム、２Ｍ硫酸アンモニウム、１Ｍ水酸化アルギニン、８．３３％（ｗ／ｗ）酢酸）を用いて、１：１の比で希釈し、０．２２μｍフィルターを介してろ過した。この「調整添加」を、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、再折りたたみＴＦＧ−β３を捕獲するために、ブチル−セファロース４・ファースト・フロー分離培地に加えた。ブチル−セファロース４・ファースト・フローカラムを、（ｐＨ ３．３において、０．０２Ｍ 酢酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、容量酢酸に対して１０％容量からなる）洗浄緩衝液／平衡化緩衝液で平衡化した。カラムを、結合したＴＧＦ−β３の段階溶出の前に、４カラム容量（ＣＶ）の本緩衝化緩衝液で洗浄した。段階溶出を、（ｐＨ ３．３における、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム、容量酢酸に対して１０％容量、容量エタノールに対して３０％容量からなる）溶出緩衝液を用いて実施し、本様式で産生されたＴＧＦ−β３溶出液をプールした。
【０１１１】
プールした溶出液中に産生された精製ＴＧＦ−β３の分析を、図１２に示しており、本発明の方法を用いて植物内に発現したＴＧＦ−β３を、本明細書で記述された方法を用いて、再折りたたみＴＧＦ−β３を産生するために精製しうることを表している。当然のことながら、これらの方法は、ＴＧＦ−β３だけではなく、生物学的に活性なＴＧＦ−βの回収、再折りたたみおよび捕獲においても利用され得る。上記方法を用いて産生された生物学的に活性なＴＧＦ−β３の精製を、以下の手順を用いて代替で、または追加的に実施することができる。
【０１１２】
８ 本発明にしたがって発現したＴＧＦ−β３の精製
代替的精製手順において、ブチル−セファロース捕獲精製段階からの溶出液を、４．０（±０．１）にｐＨ調節し、ｐＨ ３．９〜４．１において、２．７２ｇ／Ｌ酢酸ナトリウム三水和物、１００ｍＬ／Ｌ氷酢酸および３００ｍＬ／Ｌ エチルアルコール、を含む緩衝液で、伝導率が７．０ｍＳ／ｃｍ未満という所望の規格を満たすまで希釈した。次に、調整されたブチル溶出液を、０．２２μｍフィルターを通してろ過し、次いで、ｐＨ ３．９〜４．１おいて、２．７２ｇ／Ｌ酢酸ナトリウム三水和物、１００ｍＬ／Ｌ氷酢酸、３００ｍＬ／Ｌエチルアルコールおよび２．９２ｇ／Ｌ塩化ナトリウムからなる、洗浄緩衝液および平衡化緩衝液で平衡化したＳＰ−セファロースカラム上に添加した。次いでカラムを、３カラム容量の洗浄緩衝液と平衡化緩衝液で洗浄した。直線勾配０％〜５０％の溶出緩衝液（ｐＨ ３．９〜４．１において、２．７２ｇ／Ｌ酢酸ナトリウム三水和物、１００ｍＬ／Ｌ氷酢酸、３００ｍＬ／Ｌエチルアルコールおよび２９．９２ｇ／Ｌ塩化ナトリウムからなる）を、１５カラム容量にわたってカラムに適用した。ついでカラムを、５０％〜１００％溶出緩衝液の段階勾配で、続いて２〜３カラム容量の１Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した。ＴＧＦ−β３ダイマーを含む、ＳＰセファロース溶出液の画分を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって、純度に従ってプールした。プールしたＳＰ−セファロース溶出液を、前処理済みＵＦ／ＤＦシステム（５ｋＤａのＮＷＣＯ）を用いて、（Ａ２７８ｎｍによって）１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３濃度まで濃縮した。ついで、濃縮ＴＦＧ−β３溶液を、６容量にわたって、構築緩衝液（ｐＨ４．０±０．１において、１．２ｍＬ／Ｌ酢酸、２００ｍＬ／Ｌエチルアルコール）へ緩衝液交換した。ろ過ＴＧＦ−β３溶液をついで、構築緩衝液にて、１０±２ｍｇ／ｍＬ（Ａ２７８ｎｍによって）のＴＧＦ−β３濃度に希釈した。
【０１１３】
配列情報
ＴＧＦ−β１の活性断片のアミノ酸配列（配列番号１）
ＴＧＦ−β２の活性断片のアミノ酸配列（配列番号２）
ＴＧＦ−β３の活性断片のアミノ酸配列（配列番号３）
ＴＧＦ−β３の活性断片をコードする野生型ＤＮＡ配列（配列番号４）
ＴＧＦ−β３の活性断片をコードする本発明の第二核酸配列（配列番号５）
【０１１４】
全長ＴＧＦ−ベータ１をコードするＤＮＡ（配列番号６）、シグナルペプチド（イタリック体で示す）、プロペプチド（太字で示す）、ならびに活性断片（通常の文字で示す）を示している。
【０１１５】
全長ＴＧＦ−ベータ２をコードするＤＮＡ（配列番号７）、シグナルペプチド（イタリック体で示す）、プロペプチド（太字で示す）、ならびに活性断片（通常の文字で示す）を示している。
【０１１６】
全長ＴＧＦ−ベータ３をコードするＤＮＡ（配列番号８）、シグナルペプチド（イタリック体で示す）、プロペプチド（太字で示す）、ならびに活性断片（通常の文字で示す）を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物においてＴＧＦ−βを発現させる方法であって、前記方法は、
（ａ）植物細胞に、
（１）植物細胞における転写を調節することができる第一の核酸配列、
（２）ＴＧＦ−βをコードし、かつ該植物細胞における発現に適合した、第二の核酸配列、ならびに
（３）前記植物細胞において機能する、終止領域をコードする第三の核酸配列、
を含むキメラ核酸配列を導入し、次いで、
（ｂ）前記植物細胞を成長させて、該ＴＧＦ−βを生成する、
ことを含む、方法。
【請求項２】
核酸配列が植物細胞の葉緑体において発現させるのに適している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸配列が植物細胞の葉緑体において発現されるのに適合した、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＴＧＦ−βがヒトＴＧＦ−βである、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３である、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＴＧＦ−βが配列番号１、配列番号２、および配列番号３よりなる群から選択されるＴＧＦ−β活性断片を含む、請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＴＧＦ−βが全長ＴＧＦ−βタンパク質を含む、請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＴＧＦ−βがＴＧＦ−βプロタンパク質を含む、請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項９】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＵＧＣコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜８いずれかに記載の方法。
【請求項１０】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＣＵＧコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜９いずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＵＡＣコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１０いずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＧＵＧコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１１いずれかに記載の方法。
【請求項１３】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＣＣＣコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１２いずれかに記載の方法。
【請求項１４】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＡＡＣコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１３いずれかに記載の方法。
【請求項１５】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＧＡＣコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１４いずれかに記載の方法。
【請求項１６】
第一の核酸配列が、光合成関連遺伝子を発現するプロモーター、遺伝子系遺伝子を発現するプロモーター、プラスチドによりコードされるプラスチド（ＰＥＰ）ＲＮＡポリメラーゼ、または核によりコードされるプラスチド（ＮＥＰ）ＲＮＡポリメラーゼによって認識される遺伝子を発現するプロモーター、プラスチドｐｓｂＡプロモーター、およびプラスチド１６Ｓ ｒｒｎプロモーターよりなる群から選択されるプラスチドプロモーターを含む、請求項１〜１５いずれかに記載の方法。
【請求項１７】
第一の核酸配列が、クラミドモナスｐｓｂＡプロモーターのような藻プロモーターを含む、請求項１〜１６いずれかに記載の方法。
【請求項１８】
第一の核酸配列が細菌ｔｒｃプロモーターのような細菌プロモーターを含む、請求項１〜１７いずれかに記載の方法。
【請求項１９】
第一の核酸配列がバクテリオファージＴ７プロモーターのようなファージプロモーターを含む、請求項１〜１８いずれかに記載の方法。
【請求項２０】
第一の核酸配列が１６ｓｒｒｎプロモーターを含む、請求項１〜１９いずれかに記載の方法。
【請求項２１】
第一の核酸配列が、
（ｉ）ｒｂｃＬ ＲＢＳまたはｐｓｂＡ ＲＢＳのようなプラスチドＲＢＳ、
（ｉｉ）細菌ＲＢＳ、および
（ｉｉｉ）Ｔ７ｇ１０ ＲＢＡのようなバクテリオファージＲＢＳ、
よりなる群から選択されるリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む、請求項１〜２０いずれかに記載の方法。
【請求項２２】
第一の核酸配列がＴ７ｇ１０リボソーム結合部位を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
第三の核酸配列が、
ｉ）ｐｓｂＡターミネーター、ｒｂｃＬターミネーター、ｒｐｓ１８ターミネーター、またはｐｓｂＣターミネーターのようなプラスチドターミネーター、
ｉｉ）細菌ターミネーター、および
ｉｉｉ）バクテリオファージターミネーター、
よりなる群から選択されるターミネーターを含む、請求項１〜２２いずれかに記載の方法。
【請求項２４】
第三の核酸配列がｐｓｂＣターミネーターを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
キメラ核酸配列が、さらに、形質転換された細胞を選択するための手段を含む、請求項１〜２４いずれかに記載の方法。
【請求項２６】
第二の核酸配列が配列番号５、または配列番号５に対して少なくとも２２％コドン同一性を有する配列を含む、請求項１〜２５いずれかに記載の方法。
【請求項２７】
第二の核酸配列が配列番号５を含む請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
さらに、組換えＴＧＦ−βを優先的に可溶化することができるが、植物細胞成分を可溶化することはできない溶媒にＴＧＦ−βを溶解させることを含む、請求項１〜２７いずれかに記載の方法。
【請求項２９】
溶媒が尿素を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
さらに、膜分離精製を行って、ＴＧＦ−βの溶液を濃縮することを含む、請求項１〜２９いずれかに記載の方法。
【請求項３１】
さらに、活性なＴＧＦ−βが生成されるように、ＣＨＥＳ（２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、またはその機能上の類似物の存在下で、ＴＧＦ−βを折畳むことを含む、請求項１〜３０いずれかに記載の方法。
【請求項３２】
ＣＨＥＳが約１００ｍＭ〜１．０Ｍの濃度で用いられる、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
さらに、そのように発現されたＴＧＦ−βを医薬の製造において、用いることを含む、請求項１〜３２いずれかに記載の方法。
【請求項３４】
医薬が瘢痕化または線維症の予防用である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４いずれかに記載の方法によって生成されるＴＧＦ−β。
【請求項３６】
ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３である、請求項３５記載のＴＧＦ−β。
【請求項３７】
ＴＧＦ−βが、配列番号１、配列番号２、および配列番号３よりなる群から選択されるＴＧＦ−β活性断片を含む、請求項３５または請求項３６記載のＴＧＦ−β。
【請求項３８】
ＴＧＦ−βがＴＧＦ−βプロタンパク質を含む、請求項３５または請求項３６記載のＴＧＦ−β。
【請求項３９】
（１）植物細胞における転写を調節することができる第一の核酸配列、
（２）ＴＧＦ−βをコードし、かつ植物細胞における発現に適合した、第二の核酸配列、および
（３）植物細胞において機能する、終止領域をコードする第三の核酸配列、
を含む、キメラ核酸配列。
【請求項４０】
植物細胞の葉緑体において発現させるのに適した核酸配列を含む、請求項３９記載の核酸。
【請求項４１】
植物細胞の葉緑体において発現させるのに適合した核酸配列を含む、請求項４０記載の核酸配列。
【請求項４２】
請求項３〜請求項２７いずれかに記載の核酸を含む、請求項３９〜４１いずれかに記載の核酸配列。
【請求項４３】
請求項３９〜請求項４２いずれかに記載の核酸で形質転換された植物。
【請求項４４】
請求項３９〜請求項４２いずれかに記載の核酸を含む植物種子。
【請求項４５】
請求項１〜３４いずれかに１項に従って生成されたＴＧＦ−ベータを含む医薬。
【請求項１】
植物においてＴＧＦ−βを発現させる方法であって、前記方法は、
（ａ）植物細胞に、
（１）植物細胞における転写を調節することができる第一の核酸配列、
（２）ＴＧＦ−βをコードし、かつ該植物細胞における発現に適合した、第二の核酸配列、ならびに
（３）前記植物細胞において機能する、終止領域をコードする第三の核酸配列、
を含むキメラ核酸配列を導入し、次いで、
（ｂ）前記植物細胞を成長させて、該ＴＧＦ−βを生成する、
ことを含む、方法。
【請求項２】
核酸配列が植物細胞の葉緑体において発現させるのに適している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸配列が植物細胞の葉緑体において発現されるのに適合した、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＴＧＦ−βがヒトＴＧＦ−βである、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３である、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＴＧＦ−βが配列番号１、配列番号２、および配列番号３よりなる群から選択されるＴＧＦ−β活性断片を含む、請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＴＧＦ−βが全長ＴＧＦ−βタンパク質を含む、請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＴＧＦ−βがＴＧＦ−βプロタンパク質を含む、請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項９】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＵＧＣコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜８いずれかに記載の方法。
【請求項１０】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＣＵＧコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜９いずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＵＡＣコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１０いずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＧＵＧコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１１いずれかに記載の方法。
【請求項１３】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＣＣＣコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１２いずれかに記載の方法。
【請求項１４】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＡＡＣコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１３いずれかに記載の方法。
【請求項１５】
第二の核酸が、ＴＧＦ−βをコードする野生型ＤＮＡと比較して、ＧＡＣコドンの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１４いずれかに記載の方法。
【請求項１６】
第一の核酸配列が、光合成関連遺伝子を発現するプロモーター、遺伝子系遺伝子を発現するプロモーター、プラスチドによりコードされるプラスチド（ＰＥＰ）ＲＮＡポリメラーゼ、または核によりコードされるプラスチド（ＮＥＰ）ＲＮＡポリメラーゼによって認識される遺伝子を発現するプロモーター、プラスチドｐｓｂＡプロモーター、およびプラスチド１６Ｓ ｒｒｎプロモーターよりなる群から選択されるプラスチドプロモーターを含む、請求項１〜１５いずれかに記載の方法。
【請求項１７】
第一の核酸配列が、クラミドモナスｐｓｂＡプロモーターのような藻プロモーターを含む、請求項１〜１６いずれかに記載の方法。
【請求項１８】
第一の核酸配列が細菌ｔｒｃプロモーターのような細菌プロモーターを含む、請求項１〜１７いずれかに記載の方法。
【請求項１９】
第一の核酸配列がバクテリオファージＴ７プロモーターのようなファージプロモーターを含む、請求項１〜１８いずれかに記載の方法。
【請求項２０】
第一の核酸配列が１６ｓｒｒｎプロモーターを含む、請求項１〜１９いずれかに記載の方法。
【請求項２１】
第一の核酸配列が、
（ｉ）ｒｂｃＬ ＲＢＳまたはｐｓｂＡ ＲＢＳのようなプラスチドＲＢＳ、
（ｉｉ）細菌ＲＢＳ、および
（ｉｉｉ）Ｔ７ｇ１０ ＲＢＡのようなバクテリオファージＲＢＳ、
よりなる群から選択されるリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む、請求項１〜２０いずれかに記載の方法。
【請求項２２】
第一の核酸配列がＴ７ｇ１０リボソーム結合部位を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
第三の核酸配列が、
ｉ）ｐｓｂＡターミネーター、ｒｂｃＬターミネーター、ｒｐｓ１８ターミネーター、またはｐｓｂＣターミネーターのようなプラスチドターミネーター、
ｉｉ）細菌ターミネーター、および
ｉｉｉ）バクテリオファージターミネーター、
よりなる群から選択されるターミネーターを含む、請求項１〜２２いずれかに記載の方法。
【請求項２４】
第三の核酸配列がｐｓｂＣターミネーターを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
キメラ核酸配列が、さらに、形質転換された細胞を選択するための手段を含む、請求項１〜２４いずれかに記載の方法。
【請求項２６】
第二の核酸配列が配列番号５、または配列番号５に対して少なくとも２２％コドン同一性を有する配列を含む、請求項１〜２５いずれかに記載の方法。
【請求項２７】
第二の核酸配列が配列番号５を含む請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
さらに、組換えＴＧＦ−βを優先的に可溶化することができるが、植物細胞成分を可溶化することはできない溶媒にＴＧＦ−βを溶解させることを含む、請求項１〜２７いずれかに記載の方法。
【請求項２９】
溶媒が尿素を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
さらに、膜分離精製を行って、ＴＧＦ−βの溶液を濃縮することを含む、請求項１〜２９いずれかに記載の方法。
【請求項３１】
さらに、活性なＴＧＦ−βが生成されるように、ＣＨＥＳ（２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、またはその機能上の類似物の存在下で、ＴＧＦ−βを折畳むことを含む、請求項１〜３０いずれかに記載の方法。
【請求項３２】
ＣＨＥＳが約１００ｍＭ〜１．０Ｍの濃度で用いられる、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
さらに、そのように発現されたＴＧＦ−βを医薬の製造において、用いることを含む、請求項１〜３２いずれかに記載の方法。
【請求項３４】
医薬が瘢痕化または線維症の予防用である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４いずれかに記載の方法によって生成されるＴＧＦ−β。
【請求項３６】
ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３である、請求項３５記載のＴＧＦ−β。
【請求項３７】
ＴＧＦ−βが、配列番号１、配列番号２、および配列番号３よりなる群から選択されるＴＧＦ−β活性断片を含む、請求項３５または請求項３６記載のＴＧＦ−β。
【請求項３８】
ＴＧＦ−βがＴＧＦ−βプロタンパク質を含む、請求項３５または請求項３６記載のＴＧＦ−β。
【請求項３９】
（１）植物細胞における転写を調節することができる第一の核酸配列、
（２）ＴＧＦ−βをコードし、かつ植物細胞における発現に適合した、第二の核酸配列、および
（３）植物細胞において機能する、終止領域をコードする第三の核酸配列、
を含む、キメラ核酸配列。
【請求項４０】
植物細胞の葉緑体において発現させるのに適した核酸配列を含む、請求項３９記載の核酸。
【請求項４１】
植物細胞の葉緑体において発現させるのに適合した核酸配列を含む、請求項４０記載の核酸配列。
【請求項４２】
請求項３〜請求項２７いずれかに記載の核酸を含む、請求項３９〜４１いずれかに記載の核酸配列。
【請求項４３】
請求項３９〜請求項４２いずれかに記載の核酸で形質転換された植物。
【請求項４４】
請求項３９〜請求項４２いずれかに記載の核酸を含む植物種子。
【請求項４５】
請求項１〜３４いずれかに１項に従って生成されたＴＧＦ−ベータを含む医薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１０−５０２２３７（Ｐ２０１０−５０２２３７Ａ）
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２７８８０（Ｐ２００９−５２７８８０）
【出願日】平成１９年９月１１日（２００７．９．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００３４１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３２０３５
【国際公開日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【出願人】（５０８２７５０２１）レノヴォ リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１１日（２００７．９．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００３４１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３２０３５
【国際公開日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【出願人】（５０８２７５０２１）レノヴォ リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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