プロシアニジンの分析方法
【課題】天然物、飲食物、医薬品及び／又は化粧品中に含まれるプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を定量する新規な方法。
【解決手段】分析試料中に含まれるプロシアニジン（カテキンのｎ重合体の混合物の総称；ｎ≧１）を定量する方法であって、ａ）プロシアニジン、フラバン−３−オールの分析に影響を与える夾雑物を分析試料から取り除くための、カラムを用いた前処理工程；及び、ｂ）前記ａ）の前処理工程で夾雑物を取り除いた処理溶液中のプロシアニジン、フラバン−３−オール類を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離し、そして定量する工程；を含む。
【解決手段】分析試料中に含まれるプロシアニジン（カテキンのｎ重合体の混合物の総称；ｎ≧１）を定量する方法であって、ａ）プロシアニジン、フラバン−３−オールの分析に影響を与える夾雑物を分析試料から取り除くための、カラムを用いた前処理工程；及び、ｂ）前記ａ）の前処理工程で夾雑物を取り除いた処理溶液中のプロシアニジン、フラバン−３−オール類を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離し、そして定量する工程；を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然物、飲食物、医薬品及び／又は化粧品中に含まれるプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を定量する方法に関するものである。
【技術背景】
【０００２】
プロアントシアニジン（ＯＰＣ）の効能については、ワインにも含まれている事からフレンチパラドックスの効能成分の一つといわれており（1995, Clin. Chim. Acta., 235, 207-219）、抗酸化作用、抹消循環改善作用、血液流動性改善効果、肝機能改善効果（2004, ジャパンフードサイエンス, 403, 1月号, 40-45）、血小板凝集抑制効果（特表2003-527418）などが知られている。
【０００３】
従来知られているプロアントシアニジンの分析方法としては、質量分析検出機を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）による逆相のＨＰＬＣ（2003, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67(5), 1140-1142)、ＬＣ−ＭＳによるグラジエント溶出の順相のＨＰＬＣ(2003, J. Agric. Food Chem., 51, 7513-7521)による方法が知られている。しかしながらいずれの分析法においても、茶やサプリメントで他の成分と混合したプロシアニジンでは夾雑ピークとの分離が困難で正確な定量方法とは言い難かった。またプロアントシアニジンは構成成分であるフラバン−３−オール類の立体異性により、非常に多くの立体異性体が存在し、標準物質として入手できる化合物には限りがあり、そのため定量分析は一部の既知化合物を除いて不可能であった。
【特許文献１】特表２００３−５２７４１８
【非特許文献１】1995, Clin. Chim. Acta., 235, 207-219
【非特許文献２】2004, ジャパンフードサイエンス, 403, 1月号, 40-45
【非特許文献３】2003, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67(5), 1140-1142
【非特許文献４】2003, J. Agric. Food Chem., 51, 7513-7521
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
プロシアニジン（カテキンのｎ重合体の混合物の総称；ｎ≧１）及びフラバン−３−オール類を含む茶製品、天然物、飲食物、医薬品及び／又は化粧品中の正確なプロシアニジン及びフラバン−３−オール類の定量を夾雑物の干渉を受けずに求めることの出来る新規な分析法の開発が強く望まれている。従って、本発明は、茶製品、天然物、飲食物、医薬品及び／又は化粧品中に含まれるプロシアニジン及びフラバン−３−オール類の新規な定量法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、上記の課題を解決するために種々研究の結果、（ａ）分析試料をデキストラン系又はビニルポリマー系の樹脂を用いて前処理することで、疎水的吸着樹脂などでは分離不可能なカフェインなどの夾雑物を除去し、そして（ｂ）分別したプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を、高速液体クロマトグラフィーで分離・定量することで、天然物、飲食物中に含まれるプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を、夾雑物の影響を受けずに定量することができることを見出した。
【０００６】
したがって、本発明の方法は、分析試料中に含まれるプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を定量する方法であって、次の工程：
ａ） プロシアニジン、フラバン−３−オール類の分析に影響を与える夾雑物を分析試料から取り除くための、カラムを用いた前処理工程；
ｂ） ａ）の前処理工程で夾雑物を取り除いた処理溶液中のプロシアニジン、フラバン−３−オール類を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離し、そして定量する工程；
を含む方法を提供する。
【０００７】
本発明の方法により定量される物質
本発明の方法により定量される物質は、プロシアニジン（カテキンのｎ重合体の混合物の総称；ｎ≧１）及びフラバン−３−オール類のいずれかの物質であってよい。本発明の方法により定量されるフラバン−３−オール類には、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキン−３−Ｏ−ガレート、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法により定量されるプロシアニジンには、プロシアニジンＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の方法により定量される物質は、プロシアニジンＢ１（ＰＢ１）及び／又はプロシアニジンＢ３（ＰＢ３）であり、さらに好ましくはＰＢ１である。
【０００８】
分析試料
本発明の方法が対象とする分析試料は、天然物（ブドウ種子、タマリンド、リンゴ、樹皮、松樹皮由来ポリフェノール、茶葉、ココアなど、及び／又はそれらの処理物（エキスなど）、飲食物、医薬品、及び／又は、化粧品など、プロシアニジン及び／又はフラバン−３−オール類を含むと予測される任意の試料である。本発明の方法が対象とする好ましい分析試料はプロシアニジンを含む茶飲料であり、さらに好ましくは松樹皮抽出物を含む茶飲料である。
【０００９】
前処理工程
分析試料中のプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を高速液体クロマトグラフィーで分析するにあたって、分析を妨害する夾雑物としてカフェイン、テオブロミンなどのメチルキサンチン類、カフェ酸、クマル酸、フェルラ酸などのフェニルプロパノイド類、フラボン類、フラボノール類、及びそれらの配糖体類を挙げることができる。
【００１０】
逆相（例えば、Ｃ８またはＣ１８）の担体を用いて、これらの夾雑物とプロシアニジン及びフラバン−３−オール類の分離を試みた場合には、これらの物質は共に樹脂に吸着し、そして同時に溶出するため分離が不可能であるか、あるいは分離できたとしても非常に長い分析時間を要する。本発明者等は、これらの夾雑物とプロシアニジン及びフラバン−３−オール類とを分離可能な条件について研究を重ねたところ、極性有機溶媒を含む溶出液を用いてゲルろ過カラムにかけることで、これら夾雑物を、プロシアニジン及びフラバン−３−オール類から分離することに成功した。したがって、本発明の方法においては、前処理として、カラム分離を行うことによりプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を上記の夾雑物から分別することができる。
【００１１】
前処理に用いることができるカラムの樹脂には、デキストラン系の樹脂（例えば、Sephadex LH-20（アマシャムバイオサイエンス株式会社））、親水性ビニルポリマー系のゲル濾過樹脂（例えば、TOYOPEARL HW40（東ソー株式会社）、TOYOPEARL HW-50（東ソー株式会社））が含まれ、これらの樹脂により夾雑物とプロシアニジン及びフラバン−３−オール類の分画を行うことができる。また、充填カラムであるSuperdex Peptide 10/300 GL（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を用いても同様の分画を行う事ができるが、これらに限定しているわけではない。
【００１２】
前処理工程において、分析試料をカラムにチャージして、夾雑物とプロシアニジン及びフラバン−３−オール類とを分別するための溶出溶媒は、分別可能であれば特に制限はなく、水と水に可溶の極性有機溶媒、例えば、エタノール、メタノール、アセトニトリル、アセトンなど、の混合溶媒を用いることができる。そして、水に可溶の極性溶媒としては特にエタノールが好ましく、例えば、分析試料をカラムにチャージして、夾雑物質であるカフェインは０〜２０％のエタノールにより溶出させ、フェニルプロパノイド類、フラボン類、及びフラボノール類は２０〜４０％のエタノールにより溶出させ、最後に、プロシアニジン及びフラバン−３−オール類を６０〜８０％のエタノールにより溶出させることで、目的とするプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を、夾雑物を含まないで得ることができる。
【００１３】
高速液体クロマトグラフィーによる分離・定量工程
次に、前処理工程で夾雑物を取り除いた処理溶液中のプロシアニジン、フラバン−３−オール類は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量する。分析に用いるカラムは、逆相系カラムが好ましく、逆相系カラムがシリカゲル担体にオクタデシル基が化学結合した充填剤（ＯＤＳ）、ブチル基が化学結合した充填剤（Ｃ４）、オクチル基が化学結合した充填剤（Ｃ８）、フェニル基が化学結合した充填剤（Ｐｈ）、Ｃ３０のアルキル鎖が化学結合した充填剤（Ｃ３０）、オクタデシル基が合成ポリマーに結合した（ＯＤＰ）又は逆相系合成ポリマー担体（例えば、Shodex Rspak DEシリーズ（昭和電工株式会社））、アミド結合型逆相担体（例えば、Ascentis RP-Amide（シグマアルドリッチジャパン株式会社））を用いることができるが、これらカラムに限定しているわけではない。
【００１４】
ＨＰＬＣ分析の移動相として、水と水に可溶の極性溶媒を用いる事が可能で、エタノール、メタノール、アセトニトリル、アセトンなどを、水との混合比率を０〜１００％で用いることができる。移動相は酸性にする方が分離及び分析する成分の安定性のために好ましく、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、蟻酸、酢酸、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、過塩素酸などを０．００１％〜５％混合して用いてもよい。好ましくは０．０５％〜０．１％のＴＦＡを用いる。
【００１５】
具体的には、ＯＤＳカラム（Capcellpak C-18 AQ（6mm x 150mm、資生堂株式会社）を用い、Ａ溶液に０．０５％ＴＦＡ／水、Ｂ溶液に０．０５％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル／水を用い、流速１．２ｍｌ／分で、Ｂ１０％→Ｂ１０％（１０分）次いでＢ１０％→Ｂ３５％（１０分）のグラジエント溶出を行い、カラム温度は４０℃で溶出する。検出は２２５ｎｍにおける吸光度（Ａ２２５ｎｍ）の測定により行い、それぞれの物質のピークの面積値からプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を定量することができる。プロシアニジンの標準物質としてプロシアニジンＢ１（ＰＢ１）（フナコシ株式会社）及びプロシアニジンＢ３（ＰＢ３：下記の実施例４に従い合成した）を用いることができる。ＰＢ１及びＰＢ３の構造式は図１に示す。上記の条件でＰＢ１は１０．７分、ＰＢ３は１２．６分に溶出する。フラバン−３−オール類は（−）−エピカテキン、（−）−エピカテキン ３−Ｏ−ガレート、（−）−エピガロカテキン 、（−）−エピガロカテキン ３−Ｏ−ガレート、（＋）−カテキン、（−）−カテキン ３−Ｏ−ガレート、（＋）−ガロカテキン、（−）−ガロカテキン ３−Ｏ−ガレートを和光純薬工業株式会社より購入した。（−）−エピカテキンは１７．６分、（−）−エピガロカテキンは、１１．１分、（−）−エピガロカテキン ３−Ｏ−ガレートは１８．２分、（＋）−カテキンは１４．０分、（＋）−ガロカテキンは６．４分、（−）−ガロカテキン ３−Ｏ−ガレートは１９．１分に溶出した。しかし、この分析条件に限定しているわけではなく、定量可能なすべての条件を用いることができる。
【００１６】
また、別の態様において本発明の方法は、高速液体クロマトグラフィーによる分離の後、さらに質量分析機を組み合わせて分析することを含んでいてよい。すなわち、前処理したサンプルをＬＣ−ＭＳでも定量することが可能である。ＬＣ−ＭＳによる分離・定量は、例えば下記の実施例６に示す条件を用いて行うことができるが、これらに限定されない。ＬＣ−ＭＳによる定量において、例えば、２重合体のプロシアニジンのみを定量する場合には、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ：selected ion monitoring）によりｍ／ｚ ５７９（［Ｍ＋Ｈ］＋）のイオンを選択したクロマトグラムから定量することができる。サンプルに含まれるプロシアニジンが非常に少ない場合（１ｐｐｍ以下）はＬＣ−ＭＳによる定量が有効な分析手段となる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法は、プロシアニジンを含む茶製品、天然物、飲食物及び／又は化粧品中に含まれるプロシアニジン及びフラバン−３−オール類とそれ以外の夾雑物との分離を可能とすることによって、そのような茶製品等に含まれるプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を分離・定量することができる。したがって、本発明の方法は、茶製品、天然物、飲食物、医薬品及び／又は化粧品中のプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を分解することなく分析する方法として適している。
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明は実施例に限定されない。
【実施例１】
【００１８】
前処理条件の検討
プロアントシアニジンＢ１（ＰＢ１）及びカフェインを２０ｐｐｍづつ含む水溶液５ｍｌを、乾燥重量０．２５ｇのSephadex LH-20（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を水で膨潤したカラムに負荷し、２ｍｌの水で洗浄した後、２０、４０、６０、８０％ＥｔＯＨ 各２ｍｌで溶出した。各溶出画分は減圧濃縮下で濃縮後、２ｍｌのメスフラスコでフィルアップし、各溶出画分をＨＰＬＣ（分析条件は実施例３に記載）に供し、カフェインとＰＢ１の定量を行った。
【００１９】
【表１】
この結果、カフェインはＨ２Ｏでほぼ溶出され、一方ＰＢ１は６０％ＥｔＯＨ以上で溶出されることが明らかになり、両者を分離できる事がわかった。
【実施例２】
【００２０】
茶製品のSephadex LH-20による前処理
フラバンジェノール（松樹皮由来プロシアニジン）を含む茶製品５ｍｌを乾燥重量０．２５ｇのSephadex LH-20（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を水で膨潤したカラムに負荷し、２ｍｌの水で洗浄した後、３５％ＥｔＯＨ ２ｍｌ、７０％ＥｔＯＨ ４ｍｌで溶出した。７０％ＥｔＯＨ溶出画分は減圧濃縮下で濃縮後、２ｍｌのメスフラスコでフィルアップし、各溶出画分をＨＰＬＣ（分析条件は実施例３に記載）に供し、カフェインとＰＢ１の定量を行った。濃度は元の体積（５ｍｌ）あたりに換算した。
【００２１】
【表２】
水洗浄によりカフェインがほぼ完全に溶出され、ついで３５％ＥｔＯＨによりフェニルプロパノイド類とフラボノール類が溶出し、７０％ＥｔＯＨにより、目的のプロシアニジン及びフラバン−３−オールが溶出した。
【００２２】
なお、茶製品はあらかじめ、５ｍｌを量り取り凍結乾燥したものを５ｍｌの水に溶解して用いてもよい。
【実施例３】
【００２３】
ＨＰＬＣによるプロシアニジンとフラバン−３−オール類の分離
Sephadex LH-20処理において分画した水、３５％あるいは７０％ＥｔＯＨ溶出画分及び、前処理によりカフェインなどの夾雑物を除去したサンプル溶液は下記条件のＨＰＬＣで分析を行った。
【００２４】
分析条件は，カラムとしてCapcellpak C-18 AQ （6mmｘ150mm、資生堂株式会社）を用い、Ａ溶液に０．０５％ＴＦＡ／水、Ｂ溶液に０．０５％ＴＦＡ／９０％ＣＨ３ＣＮ／水を用い、流速１．２ｍｌ／分で、Ｂ１０％→Ｂ１０％（１０分）Ｂ１０％→Ｂ３５％（１０分）のグラジエント溶出を行った。カラム温度は４０℃、検出はＡ２２５ｎｍの面積値で定量する。ＨＰＬＣは島津ＬＣ−２０１０ＨＴ（島津製作所）を用いた。
【００２５】
本条件で、プロシアニジンＢ１は１０．７分、プロシアニジンＢ３は１２．６分、カテキンは１４．０分、エピカテキンは１７．６分、ガロカテキンは６．４分、エピガロカテキンは１１．１分、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートは１８．２分、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレートは１９．１分に溶出し良好な分離を示した（図２）。
【実施例４】
【００２６】
プロシアニジンＢ３の合成
プロシアニジンＢ３の合成は論文（J. C. S. Perkin Ｉ, 1981, Jacobus J. Botha, et al., 1235-1245）に従い、以下のように行った。
（＋）−タキシフォリン ５００ｍｇをエタノール５０ｍｌに溶解し、ＮａＢＨ４を２００ｍｇ加えた後、（＋）−カテキン １ｇを加え溶解後、ＨＣｌを加え１時間撹拌した。反応物を逆相のＨＰＬＣで精製し、プロシアニジンＢ３ ２００ｍｇを得た。
【実施例５】
【００２７】
前処理に用いる樹脂の検討
プロシアニジンＢ１（ＰＢ１）及びカフェインを２０ｐｐｍづつ含む水溶液２ｍｌを、１ｍｌのTOYOPEARL HW-40（東ソー株式会社）を水で平衡化したカラムに負荷し、２ｍｌの水で洗浄した後、３５％ＥｔＯＨ ２ｍｌ、７０％ＥｔＯＨ ４ｍｌで溶出した。各溶出画分をＨＰＬＣに供し、カフェインとＰＢ１の定量を行った。
【００２８】
【表３】
この結果、Sephadex LH-20と同様にカフェインはＨ２Ｏでほぼ溶出され、一方ＰＢ１は７０％ＥｔＯＨで溶出されることが明らかになり、両者を分離できる事がわかった。したがって本前処理方法は、デキストラン系のゲル濾過樹脂や親水性ビニルポリマー系樹脂において有効な方法であることが認められた。
【実施例６】
【００２９】
質量分析機による定量
前処理したサンプルは以下の条件のＬＣ−ＭＳで定量した。
質量分析機はQuattro micro（日本ウォーターズ株式会社）を用いＥＳＩポジティブモードで以下の条件：
【００３０】
【表４】
で測定し、ＨＰＬＣはAliance 2795（日本ウォーターズ株式会社）を用いた。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
【００３１】
カラム： Capcell pak C-18 AQ（3mmφ x 15cm、資生堂株式会社）
移動相： Ａ溶液：０．１％ＨＣＯＯＨ／水、Ｂ溶液：９０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＨＣＯＯＨ／水、流速０．２ｍｌ／分
グラジエント：Ｂ１０％→Ｂ３５％（７分）→Ｂ７０％（３分）
本条件でＰＢ１は７．３分に、ＰＢ３は７．８分に溶出した。定量は選択イオンモニタリング（SIM：selected ion monitoring）のｍ／ｚ ５７９（［Ｍ＋Ｈ］＋）のクロマトグラムにおける面積値で検量線を作成し定量した。サンプルに含まれるプロシアニジンが非常に少ない場合（１ｐｐｍ以下）はＬＣ−ＭＳによる定量が有効な分析手段となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３の構造式を示す図である。
【図２】図２は、前処理工程における７０％ＥｔＯＨ溶出画分のＨＰＬＣクロマトグラムである。分析条件は、ＨＰＬＣ装置：島津ＬＣ−２０１０ＨＴ（島津製作所）；カラム：capcellpak C-18 AQ （6mmｘ150mm、資生堂株式会社）；移動相：Ａ溶液：０．０５％ＴＦＡ／水、Ｂ溶液：０．０５％ＴＦＡ／９０％ＣＨ３ＣＮ／水；流速：１．２ｍｌ／分；グラジエント：Ｂ１０％→Ｂ１０％（１０分）Ｂ１０％→Ｂ３５％（１０分）；カラム温度：４０℃；検出：Ａ２２５ｎｍ。この条件で、プロシアニジンＢ１は１０．７分、プロシアニジンＢ３は１２．６分、カテキンは１４．０分、エピカテキンは１７．６分、ガロカテキンは６．４分、エピガロカテキンは１１．１分、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートは１８．２分、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレートは１９．１分にそれぞれ溶出した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然物、飲食物、医薬品及び／又は化粧品中に含まれるプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を定量する方法に関するものである。
【技術背景】
【０００２】
プロアントシアニジン（ＯＰＣ）の効能については、ワインにも含まれている事からフレンチパラドックスの効能成分の一つといわれており（1995, Clin. Chim. Acta., 235, 207-219）、抗酸化作用、抹消循環改善作用、血液流動性改善効果、肝機能改善効果（2004, ジャパンフードサイエンス, 403, 1月号, 40-45）、血小板凝集抑制効果（特表2003-527418）などが知られている。
【０００３】
従来知られているプロアントシアニジンの分析方法としては、質量分析検出機を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）による逆相のＨＰＬＣ（2003, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67(5), 1140-1142)、ＬＣ−ＭＳによるグラジエント溶出の順相のＨＰＬＣ(2003, J. Agric. Food Chem., 51, 7513-7521)による方法が知られている。しかしながらいずれの分析法においても、茶やサプリメントで他の成分と混合したプロシアニジンでは夾雑ピークとの分離が困難で正確な定量方法とは言い難かった。またプロアントシアニジンは構成成分であるフラバン−３−オール類の立体異性により、非常に多くの立体異性体が存在し、標準物質として入手できる化合物には限りがあり、そのため定量分析は一部の既知化合物を除いて不可能であった。
【特許文献１】特表２００３−５２７４１８
【非特許文献１】1995, Clin. Chim. Acta., 235, 207-219
【非特許文献２】2004, ジャパンフードサイエンス, 403, 1月号, 40-45
【非特許文献３】2003, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67(5), 1140-1142
【非特許文献４】2003, J. Agric. Food Chem., 51, 7513-7521
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
プロシアニジン（カテキンのｎ重合体の混合物の総称；ｎ≧１）及びフラバン−３−オール類を含む茶製品、天然物、飲食物、医薬品及び／又は化粧品中の正確なプロシアニジン及びフラバン−３−オール類の定量を夾雑物の干渉を受けずに求めることの出来る新規な分析法の開発が強く望まれている。従って、本発明は、茶製品、天然物、飲食物、医薬品及び／又は化粧品中に含まれるプロシアニジン及びフラバン−３−オール類の新規な定量法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、上記の課題を解決するために種々研究の結果、（ａ）分析試料をデキストラン系又はビニルポリマー系の樹脂を用いて前処理することで、疎水的吸着樹脂などでは分離不可能なカフェインなどの夾雑物を除去し、そして（ｂ）分別したプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を、高速液体クロマトグラフィーで分離・定量することで、天然物、飲食物中に含まれるプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を、夾雑物の影響を受けずに定量することができることを見出した。
【０００６】
したがって、本発明の方法は、分析試料中に含まれるプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を定量する方法であって、次の工程：
ａ） プロシアニジン、フラバン−３−オール類の分析に影響を与える夾雑物を分析試料から取り除くための、カラムを用いた前処理工程；
ｂ） ａ）の前処理工程で夾雑物を取り除いた処理溶液中のプロシアニジン、フラバン−３−オール類を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離し、そして定量する工程；
を含む方法を提供する。
【０００７】
本発明の方法により定量される物質
本発明の方法により定量される物質は、プロシアニジン（カテキンのｎ重合体の混合物の総称；ｎ≧１）及びフラバン−３−オール類のいずれかの物質であってよい。本発明の方法により定量されるフラバン−３−オール類には、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキン−３−Ｏ−ガレート、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法により定量されるプロシアニジンには、プロシアニジンＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の方法により定量される物質は、プロシアニジンＢ１（ＰＢ１）及び／又はプロシアニジンＢ３（ＰＢ３）であり、さらに好ましくはＰＢ１である。
【０００８】
分析試料
本発明の方法が対象とする分析試料は、天然物（ブドウ種子、タマリンド、リンゴ、樹皮、松樹皮由来ポリフェノール、茶葉、ココアなど、及び／又はそれらの処理物（エキスなど）、飲食物、医薬品、及び／又は、化粧品など、プロシアニジン及び／又はフラバン−３−オール類を含むと予測される任意の試料である。本発明の方法が対象とする好ましい分析試料はプロシアニジンを含む茶飲料であり、さらに好ましくは松樹皮抽出物を含む茶飲料である。
【０００９】
前処理工程
分析試料中のプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を高速液体クロマトグラフィーで分析するにあたって、分析を妨害する夾雑物としてカフェイン、テオブロミンなどのメチルキサンチン類、カフェ酸、クマル酸、フェルラ酸などのフェニルプロパノイド類、フラボン類、フラボノール類、及びそれらの配糖体類を挙げることができる。
【００１０】
逆相（例えば、Ｃ８またはＣ１８）の担体を用いて、これらの夾雑物とプロシアニジン及びフラバン−３−オール類の分離を試みた場合には、これらの物質は共に樹脂に吸着し、そして同時に溶出するため分離が不可能であるか、あるいは分離できたとしても非常に長い分析時間を要する。本発明者等は、これらの夾雑物とプロシアニジン及びフラバン−３−オール類とを分離可能な条件について研究を重ねたところ、極性有機溶媒を含む溶出液を用いてゲルろ過カラムにかけることで、これら夾雑物を、プロシアニジン及びフラバン−３−オール類から分離することに成功した。したがって、本発明の方法においては、前処理として、カラム分離を行うことによりプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を上記の夾雑物から分別することができる。
【００１１】
前処理に用いることができるカラムの樹脂には、デキストラン系の樹脂（例えば、Sephadex LH-20（アマシャムバイオサイエンス株式会社））、親水性ビニルポリマー系のゲル濾過樹脂（例えば、TOYOPEARL HW40（東ソー株式会社）、TOYOPEARL HW-50（東ソー株式会社））が含まれ、これらの樹脂により夾雑物とプロシアニジン及びフラバン−３−オール類の分画を行うことができる。また、充填カラムであるSuperdex Peptide 10/300 GL（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を用いても同様の分画を行う事ができるが、これらに限定しているわけではない。
【００１２】
前処理工程において、分析試料をカラムにチャージして、夾雑物とプロシアニジン及びフラバン−３−オール類とを分別するための溶出溶媒は、分別可能であれば特に制限はなく、水と水に可溶の極性有機溶媒、例えば、エタノール、メタノール、アセトニトリル、アセトンなど、の混合溶媒を用いることができる。そして、水に可溶の極性溶媒としては特にエタノールが好ましく、例えば、分析試料をカラムにチャージして、夾雑物質であるカフェインは０〜２０％のエタノールにより溶出させ、フェニルプロパノイド類、フラボン類、及びフラボノール類は２０〜４０％のエタノールにより溶出させ、最後に、プロシアニジン及びフラバン−３−オール類を６０〜８０％のエタノールにより溶出させることで、目的とするプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を、夾雑物を含まないで得ることができる。
【００１３】
高速液体クロマトグラフィーによる分離・定量工程
次に、前処理工程で夾雑物を取り除いた処理溶液中のプロシアニジン、フラバン−３−オール類は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量する。分析に用いるカラムは、逆相系カラムが好ましく、逆相系カラムがシリカゲル担体にオクタデシル基が化学結合した充填剤（ＯＤＳ）、ブチル基が化学結合した充填剤（Ｃ４）、オクチル基が化学結合した充填剤（Ｃ８）、フェニル基が化学結合した充填剤（Ｐｈ）、Ｃ３０のアルキル鎖が化学結合した充填剤（Ｃ３０）、オクタデシル基が合成ポリマーに結合した（ＯＤＰ）又は逆相系合成ポリマー担体（例えば、Shodex Rspak DEシリーズ（昭和電工株式会社））、アミド結合型逆相担体（例えば、Ascentis RP-Amide（シグマアルドリッチジャパン株式会社））を用いることができるが、これらカラムに限定しているわけではない。
【００１４】
ＨＰＬＣ分析の移動相として、水と水に可溶の極性溶媒を用いる事が可能で、エタノール、メタノール、アセトニトリル、アセトンなどを、水との混合比率を０〜１００％で用いることができる。移動相は酸性にする方が分離及び分析する成分の安定性のために好ましく、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、蟻酸、酢酸、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、過塩素酸などを０．００１％〜５％混合して用いてもよい。好ましくは０．０５％〜０．１％のＴＦＡを用いる。
【００１５】
具体的には、ＯＤＳカラム（Capcellpak C-18 AQ（6mm x 150mm、資生堂株式会社）を用い、Ａ溶液に０．０５％ＴＦＡ／水、Ｂ溶液に０．０５％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル／水を用い、流速１．２ｍｌ／分で、Ｂ１０％→Ｂ１０％（１０分）次いでＢ１０％→Ｂ３５％（１０分）のグラジエント溶出を行い、カラム温度は４０℃で溶出する。検出は２２５ｎｍにおける吸光度（Ａ２２５ｎｍ）の測定により行い、それぞれの物質のピークの面積値からプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を定量することができる。プロシアニジンの標準物質としてプロシアニジンＢ１（ＰＢ１）（フナコシ株式会社）及びプロシアニジンＢ３（ＰＢ３：下記の実施例４に従い合成した）を用いることができる。ＰＢ１及びＰＢ３の構造式は図１に示す。上記の条件でＰＢ１は１０．７分、ＰＢ３は１２．６分に溶出する。フラバン−３−オール類は（−）−エピカテキン、（−）−エピカテキン ３−Ｏ−ガレート、（−）−エピガロカテキン 、（−）−エピガロカテキン ３−Ｏ−ガレート、（＋）−カテキン、（−）−カテキン ３−Ｏ−ガレート、（＋）−ガロカテキン、（−）−ガロカテキン ３−Ｏ−ガレートを和光純薬工業株式会社より購入した。（−）−エピカテキンは１７．６分、（−）−エピガロカテキンは、１１．１分、（−）−エピガロカテキン ３−Ｏ−ガレートは１８．２分、（＋）−カテキンは１４．０分、（＋）−ガロカテキンは６．４分、（−）−ガロカテキン ３−Ｏ−ガレートは１９．１分に溶出した。しかし、この分析条件に限定しているわけではなく、定量可能なすべての条件を用いることができる。
【００１６】
また、別の態様において本発明の方法は、高速液体クロマトグラフィーによる分離の後、さらに質量分析機を組み合わせて分析することを含んでいてよい。すなわち、前処理したサンプルをＬＣ−ＭＳでも定量することが可能である。ＬＣ−ＭＳによる分離・定量は、例えば下記の実施例６に示す条件を用いて行うことができるが、これらに限定されない。ＬＣ−ＭＳによる定量において、例えば、２重合体のプロシアニジンのみを定量する場合には、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ：selected ion monitoring）によりｍ／ｚ ５７９（［Ｍ＋Ｈ］＋）のイオンを選択したクロマトグラムから定量することができる。サンプルに含まれるプロシアニジンが非常に少ない場合（１ｐｐｍ以下）はＬＣ−ＭＳによる定量が有効な分析手段となる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法は、プロシアニジンを含む茶製品、天然物、飲食物及び／又は化粧品中に含まれるプロシアニジン及びフラバン−３−オール類とそれ以外の夾雑物との分離を可能とすることによって、そのような茶製品等に含まれるプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を分離・定量することができる。したがって、本発明の方法は、茶製品、天然物、飲食物、医薬品及び／又は化粧品中のプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を分解することなく分析する方法として適している。
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明は実施例に限定されない。
【実施例１】
【００１８】
前処理条件の検討
プロアントシアニジンＢ１（ＰＢ１）及びカフェインを２０ｐｐｍづつ含む水溶液５ｍｌを、乾燥重量０．２５ｇのSephadex LH-20（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を水で膨潤したカラムに負荷し、２ｍｌの水で洗浄した後、２０、４０、６０、８０％ＥｔＯＨ 各２ｍｌで溶出した。各溶出画分は減圧濃縮下で濃縮後、２ｍｌのメスフラスコでフィルアップし、各溶出画分をＨＰＬＣ（分析条件は実施例３に記載）に供し、カフェインとＰＢ１の定量を行った。
【００１９】
【表１】
この結果、カフェインはＨ２Ｏでほぼ溶出され、一方ＰＢ１は６０％ＥｔＯＨ以上で溶出されることが明らかになり、両者を分離できる事がわかった。
【実施例２】
【００２０】
茶製品のSephadex LH-20による前処理
フラバンジェノール（松樹皮由来プロシアニジン）を含む茶製品５ｍｌを乾燥重量０．２５ｇのSephadex LH-20（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を水で膨潤したカラムに負荷し、２ｍｌの水で洗浄した後、３５％ＥｔＯＨ ２ｍｌ、７０％ＥｔＯＨ ４ｍｌで溶出した。７０％ＥｔＯＨ溶出画分は減圧濃縮下で濃縮後、２ｍｌのメスフラスコでフィルアップし、各溶出画分をＨＰＬＣ（分析条件は実施例３に記載）に供し、カフェインとＰＢ１の定量を行った。濃度は元の体積（５ｍｌ）あたりに換算した。
【００２１】
【表２】
水洗浄によりカフェインがほぼ完全に溶出され、ついで３５％ＥｔＯＨによりフェニルプロパノイド類とフラボノール類が溶出し、７０％ＥｔＯＨにより、目的のプロシアニジン及びフラバン−３−オールが溶出した。
【００２２】
なお、茶製品はあらかじめ、５ｍｌを量り取り凍結乾燥したものを５ｍｌの水に溶解して用いてもよい。
【実施例３】
【００２３】
ＨＰＬＣによるプロシアニジンとフラバン−３−オール類の分離
Sephadex LH-20処理において分画した水、３５％あるいは７０％ＥｔＯＨ溶出画分及び、前処理によりカフェインなどの夾雑物を除去したサンプル溶液は下記条件のＨＰＬＣで分析を行った。
【００２４】
分析条件は，カラムとしてCapcellpak C-18 AQ （6mmｘ150mm、資生堂株式会社）を用い、Ａ溶液に０．０５％ＴＦＡ／水、Ｂ溶液に０．０５％ＴＦＡ／９０％ＣＨ３ＣＮ／水を用い、流速１．２ｍｌ／分で、Ｂ１０％→Ｂ１０％（１０分）Ｂ１０％→Ｂ３５％（１０分）のグラジエント溶出を行った。カラム温度は４０℃、検出はＡ２２５ｎｍの面積値で定量する。ＨＰＬＣは島津ＬＣ−２０１０ＨＴ（島津製作所）を用いた。
【００２５】
本条件で、プロシアニジンＢ１は１０．７分、プロシアニジンＢ３は１２．６分、カテキンは１４．０分、エピカテキンは１７．６分、ガロカテキンは６．４分、エピガロカテキンは１１．１分、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートは１８．２分、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレートは１９．１分に溶出し良好な分離を示した（図２）。
【実施例４】
【００２６】
プロシアニジンＢ３の合成
プロシアニジンＢ３の合成は論文（J. C. S. Perkin Ｉ, 1981, Jacobus J. Botha, et al., 1235-1245）に従い、以下のように行った。
（＋）−タキシフォリン ５００ｍｇをエタノール５０ｍｌに溶解し、ＮａＢＨ４を２００ｍｇ加えた後、（＋）−カテキン １ｇを加え溶解後、ＨＣｌを加え１時間撹拌した。反応物を逆相のＨＰＬＣで精製し、プロシアニジンＢ３ ２００ｍｇを得た。
【実施例５】
【００２７】
前処理に用いる樹脂の検討
プロシアニジンＢ１（ＰＢ１）及びカフェインを２０ｐｐｍづつ含む水溶液２ｍｌを、１ｍｌのTOYOPEARL HW-40（東ソー株式会社）を水で平衡化したカラムに負荷し、２ｍｌの水で洗浄した後、３５％ＥｔＯＨ ２ｍｌ、７０％ＥｔＯＨ ４ｍｌで溶出した。各溶出画分をＨＰＬＣに供し、カフェインとＰＢ１の定量を行った。
【００２８】
【表３】
この結果、Sephadex LH-20と同様にカフェインはＨ２Ｏでほぼ溶出され、一方ＰＢ１は７０％ＥｔＯＨで溶出されることが明らかになり、両者を分離できる事がわかった。したがって本前処理方法は、デキストラン系のゲル濾過樹脂や親水性ビニルポリマー系樹脂において有効な方法であることが認められた。
【実施例６】
【００２９】
質量分析機による定量
前処理したサンプルは以下の条件のＬＣ−ＭＳで定量した。
質量分析機はQuattro micro（日本ウォーターズ株式会社）を用いＥＳＩポジティブモードで以下の条件：
【００３０】
【表４】
で測定し、ＨＰＬＣはAliance 2795（日本ウォーターズ株式会社）を用いた。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
【００３１】
カラム： Capcell pak C-18 AQ（3mmφ x 15cm、資生堂株式会社）
移動相： Ａ溶液：０．１％ＨＣＯＯＨ／水、Ｂ溶液：９０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＨＣＯＯＨ／水、流速０．２ｍｌ／分
グラジエント：Ｂ１０％→Ｂ３５％（７分）→Ｂ７０％（３分）
本条件でＰＢ１は７．３分に、ＰＢ３は７．８分に溶出した。定量は選択イオンモニタリング（SIM：selected ion monitoring）のｍ／ｚ ５７９（［Ｍ＋Ｈ］＋）のクロマトグラムにおける面積値で検量線を作成し定量した。サンプルに含まれるプロシアニジンが非常に少ない場合（１ｐｐｍ以下）はＬＣ−ＭＳによる定量が有効な分析手段となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３の構造式を示す図である。
【図２】図２は、前処理工程における７０％ＥｔＯＨ溶出画分のＨＰＬＣクロマトグラムである。分析条件は、ＨＰＬＣ装置：島津ＬＣ−２０１０ＨＴ（島津製作所）；カラム：capcellpak C-18 AQ （6mmｘ150mm、資生堂株式会社）；移動相：Ａ溶液：０．０５％ＴＦＡ／水、Ｂ溶液：０．０５％ＴＦＡ／９０％ＣＨ３ＣＮ／水；流速：１．２ｍｌ／分；グラジエント：Ｂ１０％→Ｂ１０％（１０分）Ｂ１０％→Ｂ３５％（１０分）；カラム温度：４０℃；検出：Ａ２２５ｎｍ。この条件で、プロシアニジンＢ１は１０．７分、プロシアニジンＢ３は１２．６分、カテキンは１４．０分、エピカテキンは１７．６分、ガロカテキンは６．４分、エピガロカテキンは１１．１分、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートは１８．２分、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレートは１９．１分にそれぞれ溶出した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析試料中に含まれるプロシアニジン（カテキンのｎ重合体の混合物の総称：ｎ≧１）及びフラバン−３−オール類を定量する方法であって、次の工程：
ａ） プロシアニジン、フラバン−３−オール類の分析に影響を与える夾雑物を分析試料から取り除くための、カラムを用いた前処理工程；
ｂ） ａ）の前処理工程で夾雑物を取り除いた処理溶液中のプロシアニジン、フラバン−３−オール類を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離し、そして定量する工程；
を含む、前記方法。
【請求項２】
夾雑物が、カフェイン、ならびに、フェニルプロパノイド類及びフラボノール類ならびにそれらの配糖体類、からなる群より選択される１以上の物質であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分析試料が、プロシアニジンを含む茶飲料であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分析試料が、松樹皮抽出物を含む茶飲料であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前処理工程において、デキストラン系又はビニルポリマー系の樹脂のカラムを用いることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前処理工程における条件として水／エタノールの混合液を用い、それによりプロシアニジン及びフラバン−３−オール類と夾雑物を分離することを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前処理工程において、デキストラン系の樹脂のカラムを用い、これを水で平衡化した後、サンプルを負荷し、水及び／又は０〜４０％エタノールで夾雑物を溶出し、そして、６０％以上のエタノールによりプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を回収することを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前処理工程における条件として、水／メタノールの混合液、水／エタノールの混合液、水／アセトニトリルの混合液、及び水／アセトンの混合液からなる群より選択される混合液を用い、それによりプロシアニジン及びフラバン−３−オール類と夾雑物を分離することを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｂ）において使用する高速液体クロマトグラフィーのカラムが、逆相系カラムであることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
逆相系カラムが、シリカゲル担体にオクタデシル基が化学結合した充填剤（ＯＤＳ）、ブチル基が化学結合した充填剤（Ｃ４）、オクチル基が化学結合した充填剤（Ｃ８）、フェニル基が化学結合した充填剤（Ｐｈ）、Ｃ３０のアルキル鎖が化学結合した充填剤（Ｃ３０）、オクタデシル基が合成ポリマーに結合した充填剤（ＯＤＰ）、逆相系合成ポリマー担体、及び、アミド結合型逆相担体からなる群より選択される充填剤を有するカラムであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｂ）の高速液体クロマトグラフィーによる分離に使用する移動相が、アセトニトリル及び／又は水であることを特徴とし、ここでアセトニトリル及び／又は水は、それぞれＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む又は含まない、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
移動相が、アセトニトリル及び水のグラジエントであることを特徴とし、ここでアセトニトリル及び水は、それぞれＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む又は含まない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）の高速液体クロマトグラフィーによる分離に使用する移動相として、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン及びこれらを混合した溶媒からなる群より選択される溶媒を含む移動相を用いることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｂ）の高速液体クロマトグラフィーによる分離に使用する移動相中に、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、蟻酸、酢酸、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）、過塩素酸を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
定量するプロシアニジンが、プロシアニジンＢ１（Procyanidin B1: PB1）であることを特徴とする請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
２重合体のプロシアニジンのみを定量するために、さらに質量分析機を組み合わせることを特徴とする請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
分析試料中に含まれるプロシアニジン（カテキンのｎ重合体の混合物の総称：ｎ≧１）及びフラバン−３−オール類を定量する方法であって、次の工程：
ａ） プロシアニジン、フラバン−３−オール類の分析に影響を与える夾雑物を分析試料から取り除くための、カラムを用いた前処理工程；
ｂ） ａ）の前処理工程で夾雑物を取り除いた処理溶液中のプロシアニジン、フラバン−３−オール類を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離し、そして定量する工程；
を含む、前記方法。
【請求項２】
夾雑物が、カフェイン、ならびに、フェニルプロパノイド類及びフラボノール類ならびにそれらの配糖体類、からなる群より選択される１以上の物質であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分析試料が、プロシアニジンを含む茶飲料であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分析試料が、松樹皮抽出物を含む茶飲料であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前処理工程において、デキストラン系又はビニルポリマー系の樹脂のカラムを用いることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前処理工程における条件として水／エタノールの混合液を用い、それによりプロシアニジン及びフラバン−３−オール類と夾雑物を分離することを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前処理工程において、デキストラン系の樹脂のカラムを用い、これを水で平衡化した後、サンプルを負荷し、水及び／又は０〜４０％エタノールで夾雑物を溶出し、そして、６０％以上のエタノールによりプロシアニジン及びフラバン−３−オール類を回収することを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前処理工程における条件として、水／メタノールの混合液、水／エタノールの混合液、水／アセトニトリルの混合液、及び水／アセトンの混合液からなる群より選択される混合液を用い、それによりプロシアニジン及びフラバン−３−オール類と夾雑物を分離することを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｂ）において使用する高速液体クロマトグラフィーのカラムが、逆相系カラムであることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
逆相系カラムが、シリカゲル担体にオクタデシル基が化学結合した充填剤（ＯＤＳ）、ブチル基が化学結合した充填剤（Ｃ４）、オクチル基が化学結合した充填剤（Ｃ８）、フェニル基が化学結合した充填剤（Ｐｈ）、Ｃ３０のアルキル鎖が化学結合した充填剤（Ｃ３０）、オクタデシル基が合成ポリマーに結合した充填剤（ＯＤＰ）、逆相系合成ポリマー担体、及び、アミド結合型逆相担体からなる群より選択される充填剤を有するカラムであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｂ）の高速液体クロマトグラフィーによる分離に使用する移動相が、アセトニトリル及び／又は水であることを特徴とし、ここでアセトニトリル及び／又は水は、それぞれＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む又は含まない、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
移動相が、アセトニトリル及び水のグラジエントであることを特徴とし、ここでアセトニトリル及び水は、それぞれＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む又は含まない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）の高速液体クロマトグラフィーによる分離に使用する移動相として、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン及びこれらを混合した溶媒からなる群より選択される溶媒を含む移動相を用いることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｂ）の高速液体クロマトグラフィーによる分離に使用する移動相中に、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、蟻酸、酢酸、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）、過塩素酸を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
定量するプロシアニジンが、プロシアニジンＢ１（Procyanidin B1: PB1）であることを特徴とする請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
２重合体のプロシアニジンのみを定量するために、さらに質量分析機を組み合わせることを特徴とする請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−１０４８７（Ｐ２００７−１０４８７Ａ）
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１９１６６５（Ｐ２００５−１９１６６５）
【出願日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
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