ベンスジョーンズ蛋白質の検定法
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。（１）ステップ１ 電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ（２）ステップ２ イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ（３）ステップ３ Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断するステップ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、尿蛋白電気泳動法とイムノアッセイとを併用した尿中ベンスジョーンズ蛋白質の効率的な検定法に関するものである。
【背景技術】
イムノグロブリン重鎖と解離した状態のモノクローナルな遊離イムノグロブリン軽鎖（Ｆｒｅｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：ＦＬＣ）は、形質細胞異常などの血液疾患、特に多発性骨髄腫やマクログロブリン血症に見い出されるモノクローナル蛋白質（Ｍ蛋白質）の１つである（Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１９６９，１６，５９９−６０６）。
１８４７年、Ｈｅｎｒｙ Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓは患者尿の特異な熱凝集反応を発見し、その原因となったタンパク質をベンスジョーンズ蛋白質（Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＪＰ）と命名した（Ｌａｎｃｅｔ，１８４７，２，８８−９２）。その本態は尿中のモノクローナルなＦＬＣであることが、後に明らかとなった。
ＢＪＰは多発性骨髄腫などの有用な臨床マーカーであり、その検定は日常の臨床検査の１つの項目として実施されている。ＢＪＰは、分子量が小さく、糸球体を容易に通過し、そのほとんどが尿中に移行するため、実際の臨床検査の場においては、尿中のＢＪＰを電気泳動法で検出している（ＤＲＧ／ＰＰＳ対応 臨床検査ガイドライン 第２次案，２０００，ｐ．７８−８２）。
電気泳動法によるＢＪＰの測定を、一般に“スクリーニングアッセイ”もしくは単に“スクリーニング”と称している。通常、ヒト検体中のイムノグロブリンはポリクローナルな組成であるため、電気泳動を実施した場合、検体中のイムノグロブリンはブロードなバンドを示す。一方、Ｍ蛋白質は単一な電荷を持ち、シングルバンド（Ｍバンド）を示すため、電気泳動法により両者を識別することが可能である。
尿蛋白の電気泳動法はＢＪＰのスクリーニング方法として広く採用されているものの、その検出感度や特異性は分析システムや尿の検査前濃縮の程度等に依存し、必ずしも満足できる方法とは言えない。たとえば、電気泳動の支持体として広く用いられているセルロースアセテート膜はイムノグロブリンの分解能が悪く、また、泳動後の蛋白検出用染色色素の種類によってもその検出感度は変化し、結果として電気泳動法は低感度とならざるを得ない。さらに、尿をサンプルとして使用するため、予め尿を濃縮する必要があるが、その場合の濃縮の程度も明確に定められていない。
したがって、電気泳動法を用いたＢＪＰのスクリーニング方法は、施設間での検査精度の差が大きく、臨床検査としては様々な問題を内在している。実際、近年行われた各施設間のコントロールサーベイでは、６０ｍｇ／ｄｌのＢＪＰがおよそ３０％の施設で見逃されていることが明らかとなり、問題となっている。
加えて、上記電気泳動法ではイムノグロブリンの免疫表現型（サブクラス）を同定することができないため、免疫固定法（もしくは免疫電気泳動法）を用いて検出されたＭ蛋白質のサブクラス（ＢＪＰ、ＩｇＧ型Ｍ蛋白質、又はＩｇＭ型Ｍ蛋白質等）を確認する必要がある。また、これらの確認検査で用いる免疫固定法は、非常に煩雑で、かつ検査単価が高額であるため、臨床検査の場においては、最初に電気泳動法でＭ蛋白質をスクリーニングし、次いで免疫固定法でＢＪＰを確定する手法をとらざるを得ないのが現状である。
【発明の開示】
このような現状を克服し、電気泳動法とイムノアッセイとの２種類の方法を使用し、検査の信頼性を向上させ、また確定検査にあたる免疫固定法の実施回数を少なくすることができるか否かに関し、検討した報告がある（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９７，２６２，１２１−１３０）。すなわち、上記報告においては、電気泳動法、イムノアッセイ、免疫固定法のそれぞれの結果を対比し、インタクトなイムノグロブリンに結合している軽鎖も含めた、尿中のκ型軽鎖とλ型軽鎖との全体（ｔｏｔａｌ）量及びその量比（ｔｏｔａｌ量とκ／λ比）に異常がなく、かつ電気泳動法で異常なバンドが認められない場合には、ＢＪＰ陰性と判断可能なことを示唆している。
しかし、上記検討には以下に示すような種々の問題があり、実際の臨床検査の場に置いて使用するに当たり、必ずしも信頼性できる結論とはなっていない。
（１）感度の問題
上記検討の結果、感度は１００％であると結論付けているが、必ずしもＢＪＰ特異的とは言えない。すなわち、インタクトなイムノグロブリンに結合している軽鎖も含めた、尿中のκ型軽鎖とλ型軽鎖の全体（ｔｏｔａｌ）を定量し、その量と比を算出しているが、インタクトなイムノグロブリンＭ蛋白質（例えばＩｇＧ−κ−Ｍ蛋白質など）が尿中に存在する場合、ＦＬＣ特異的でなく、軽鎖全量を測定するイムノアッセイではその量と比が必然的に異常となる。この量及び比の異常はＢＪＰ以外のイムノグロブリンＭ蛋白質の存在に由来する異常であり、必ずしもＢＪＰ特異的とは言えない。ここで感度とはＢＪＰを伴う尿検体のうち、陽性の結果を示した検体の割合（％）をいう（実施例（４）を参照）。
また、上記検討で採用したイムノアッセイの測定感度は悪く、試験に供したサンプルの約半数は測定感度以下となって、以後の検討がなされておらず、信頼性のあるデータとはいえない。
（２）確認検査回数削減の問題
上記検討の結果、免疫固定法による確認検査の回数を５２％削減できると結論付けているが、電気泳動法とイムノアッセイとの２種類の方法を組み合わせたメリットが全く示されていない。すなわち、上記報告では電気泳動法による検査結果をイムノアッセイで単に確かめただけであって、電気泳動でＭ蛋白質を示す検体はイムノアッセイの結果に係わらず、免疫固定法の確認検査を必要としており、従来の手法と変わるところがない。なぜ確認検査を５２％削減できることの根拠が示されていない。
また、免疫固定法による確認検査において、電気泳動法でＭ蛋白質が検出されない場合であってもＢＪＰ陽性であるケースがあり、Ｍ蛋白質が確認されない場合、イムノアッセイの結果に係わらず、すべてＢＪＰ陰性（ＮＯ ＢＪＰ）と結論付けるのは強引に過ぎ、科学的な信頼性も低い。
本発明者らは、より現実的で、効率的なＢＪＰの検定法に関し、鋭意検討を重ねた結果、（１）イムノアッセイにおけるＦＬＣのκ鎖とλ鎖の比（κ／λ比）を基に、ＢＪＰ陽性を判定できること、（２）電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、電気泳動におけるＭ蛋白質の有無とイムノアッセイにおけるＦＬＣのκ鎖とλ鎖の比（κ／λ比）を基に、一定の処理手順（アルゴリズム）により判断することで、効率的にＢＪＰを検定することができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の内容を包含する。
［１］電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断するステップ
［２］ステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行う、上記［１］記載の方法。
［３］ステップ２、ステップ１、ステップ３の順で行う、上記［１］記載の方法。
［４］電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロプリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断するステップ
［５］電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断するステップ
［６］電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断するステップ
［７］電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のＢＪＰを検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である場合にはＢＪＰ陰性と判断するステップ
［８］ステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行う、上記［４］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ステップ２、ステップ１、ステップ３の順で行う、上記［４］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［１０］電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質の有無とκ／λ比を指標に、ケースＡの場合にはＢＪＰ陽性と判断し、ケースＢとＣの場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断し、免疫固定法でＢＪＰの有無をさらに確認し、ケースＤの場合にはＢＪＰ陰性と判断するステップ
（ケースＡ）
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である。
（ケースＢ）
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である。
（ケースＣ）
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である。
（ケースＤ）
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である。
［１１］ステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行う、上記［１０］記載の方法。
［１２］ステップ２、ステップ１、ステップ３の順で行う、上記［１０］記載の方法。
［１３］イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求め、κ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断するベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）の検定法。
【図面の簡単な説明】
図１は、イムノアッセイにおけるＦＬＣ測定法の標準曲線の一例を示す図である。
図２は、尿中ＦＬＣの測定結果の一例を示す図である。図中、○；ＢＪＰκ陽性検体、△；ＢＪＰλ陽性検体、Ｘ；ＢＪＰ陰性検体をそれぞれ示し、図中の線２本はＲＯＣ解析で決定したκ／λ比のカットオフ値を示す。
図３は、ＦＬＣ測定法と電気泳動法の組み合わせ時のＢＪＰ検定手法（アルゴリズム）の一例を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明で使用する試料は、尿検体であれば特に限定されず、具体的には臨床にて採取される尿採取形態（保存剤添加尿、１日尿、早朝第一尿など）を試料として使用することができる。
本発明は、上述したように、イムノアッセイによりＢＪＰ陽性を検定する方法（方法１）と、電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、特定のステップにより尿試料中のＢＪＰを検定する方法（方法２）の２つの方法を包含するものである。
（方法１）
イムノアッセイによりＢＪＰ陽性を検定する方法としては、イムノアッセイにより尿試料中のＦＬＣκ鎖とＦＬＣλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求め、κ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合には、ＢＪＰ陽性と判断するＢＪＰの検定法である。
本発明で採用するイムノアッセイは、尿中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖とを測定できる方法であれば特に制限はない。具体的には、尿において微量に存在するＦＬＣに対して十分な測定感度を有し、インタクトなイムノグロブリンに対する交差反応性をほとんど示さず（例えば１％以下）、尿中のＦＬＣ以外の成分の影響を受けない方法が好適であり、好ましくは本発明者らが開発した酵素免疫測定法を例示することができる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００３，２７５，９−１７）。
測定後、測定されたＦＬＣのκ鎖とλ鎖との値を基に、その量比（κ／λ比）を算出し、κ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断する。
ＢＪＰ陽性検体はκ／λ比が大きく変動していることから、後述実施例に示すように、指標として用いるκ／λ比は、受診者動作特性（ＲＯＣ）分析（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３９，５６１−５７７）により、免疫固定法の結果と比較した場合でもＢＪＰ検定の陽性予測率が８０％以上の数値となるように、０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上、好ましくは０．１±０．０３以下又は５．５±１．６５以上という基準を用いて判定することで、高い精度で診断することが可能となる。なお、陽性予測率とはＢＪＰ陽性結果を示した検体が実際にＢＪＰを伴っている割合（％）をいう（実施例（４）を参照のこと）。
また、対象となる患者群によってこの比は変動する事があり得るため、上記範囲内を目安に、その都度臨床的に適切な比を設定する必要がある。
（方法２）
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、尿試料中のＢＪＰを検定する方法は、以下のステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行うことが好ましいが、ステップ１とステップ２は順序が逆であってもかまわない。
（１）ステップ１
ステップ１は、電気泳動により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップである。
本発明で採用する電気泳動法とは、公知の方法であり、具体的には、セルロースアセテート膜やアガロースゲルなどを支持体とし、検体に含まれる蛋白質を電気的に泳動し、泳動された蛋白質を染色法並びに物理化学的に検出する方法をいう（Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｆｉｘａｔｉｏｎ，１９９４，第２章、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ）。泳動後、Ｍバンドの有無によりＭ蛋白質の有無を判断する。
（２）ステップ２
ステップ２は、上述したイムノアッセイと同様の方法により尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖とのそれぞれの含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップである。
（３）ステップ３
ステップ３は、Ｍ蛋白質の有無とκ／λ比とを指標に、それぞれのケース毎にＢＪＰ陰性、ＢＪＰ陽性、及び／またはＢＪＰ陽性の疑いありと判断するステップである。
ＢＪＰ陽性のみを判定する目的では、上記イムノアッセイの時と同じ、０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上、好ましくは０．１±０．０３以下又は５．５±１．６５以上という数値をκ／λ比として採用し、ステップ１でＭ蛋白質が確認され、ステップ２で求めたκ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合には、ＢＪＰ陽性と判断することができる。
なお、ＢＪＰ陽性のみの判定は、上述したようにイムノアッセイ単独（方法１）でも可能であるものの、ステップ１の電気泳動によるＭ蛋白質の確認を追加し、これを加味して判断することで、より確実な判定を行うことができる。
次に、ＢＪＰ陽性のみならず、陰性及び／又はＢＪＰ陽性の疑いありまで判定する目的では、受診者動作特性（ＲＯＣ）分析（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３９，５６１−５７７）により、免疫固定法の結果と比較した場合でもＢＪＰ検定の診断正確度が８０％以上、好ましくは９０％以上の数値、具体的には、後述の実施例で示されているような、ＢＪＰ陰性検体の測定値を効率よく排除できる数値である、０．２±０．１と１．６７±０．８４、好適には０．２±０．０３と１．６７±０．５範囲内の数値をκ／λ比として採用することができる。
この場合のＢＪＰの判定は、ステップ１のＭ蛋白質の有無とステップ２のκ／λ比との結果から以下の４つのケースで判断する。すなわち、ケースＡの場合にはＢＪＰ陽性と判断し、ケースＢとＣの場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断し、免疫固定法でＢＪＰの有無を更に確認し、ケースＤの場合にＢＪＰ陰性と判断する。
（ケースＡ）
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である。
（ケースＢ）
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である。
（ケースＣ）
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である。
（ケースＤ）
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である。
【実施例】
以下、実施例に基づき本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
［実施例］
（１）尿検体
ＢＪＰが疑われた患者２８７例より採取された尿２８７検体を用いた。すべての検体について日本臨床検査医学会のガイドライン（臨床病理，２００２，５０；４３８−４３９）に従い、連結不可能匿名化を行った。
（２）電気泳動法ならびに免疫固定法
電気泳動法ならびに免疫固定法はヘレナ社のキットを用いて実施した。免疫固定法に用いる抗血清はダコ社より購入した。尿検体は必要に応じて最大１００倍まで濃縮した。
（３）ＦＬＣ測定法
ＦＬＣ測定法については文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００３，２７５，９−１７）に従って行った。すなわち、モノクローナル抗体をコートした９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ）に検体あるいは標準濃度溶液を１００μｌ毎加え、室温で２時間反応させた。洗浄した後、二次抗体として抗κ軽鎖型抗体ならびに抗λ軽鎖型抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識体を各１００μｌ加え、３７℃、３０分反応させた。反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、発色液（ＯＰＤ、Ｓｉｇｍａ）を１００μｌ毎分注し発色させた。１Ｎ硫酸にて発色を停止後、４９２ｎｍでの吸光度を測定した。なお、アッセイ用の緩衝液としては１％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）を使用した。また、スタンダードとしては、尿中から単離精製したＦＬＣを使用した。標準曲線の例を図１に示す。
（４）診断精度の評価
診断精度の評価は臨床検査分野において一般的に用いられている計算方法を用いた。すなわち、ＢＪＰの有無を対照とし、リファレンスの方法としての免疫固定法と評価対象としての本発明法により表１のように区分される。
［表１］
この区分に基づき、感度、特異度、陽性予想値、正確度を以下のように定義した。
感度：式ａ／（ａ＋ｂ）×１００で算出され、ＢＪＰ陽性検体の中で、陽性の検査結果を示した検体の割合を意味する。
特異度：式ｄ／（ｃ＋ｄ）×１００で算出され、ＢＪＰ陰性検体の中で、陰性の検査結果を示した検体の割合を意味する。
陽性予測率：式ａ／（ａ＋ｃ）×１００で算出され、ＢＪＰ陽性の検査結果を示した検体の中で、実際にＢＪＰを伴う検体の割合を意味する。
正確度：式（ａ＋ｄ）／（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００で算出され、検査された検体のうち、ＢＪＰの陽性と陰性が正しく診断された検体の割合を意味する。
（５）統計解析
受診者動作特性（ＲＯＣ）分析には統計解析ソフトウェアパッケージ（ＳｔａｔＦｌｅｘ）を用いた。
（６）結果
イムノアッセイの測定結果より、κ／λ比０．１又は５．５をカットオフとした場合、表２に示すように、該当する検体は２８７例中５６例存在した。その中で、κ／λ比５．５以上に該当する全１８例あり、そのうち１６例がＢＪＰκ陽性で、ＢＪＰ以外の２例のうち１例は、免疫固定法でも分析不可能であった。一方、κ／λ比０．１以下で該当する全３８例あり、そのうち２９例がＢＪＰλ陽性であった。残りの９例のうち、５例はインタクトイムノグロブリンＭ蛋白陽性、３例はＢＪＰ陰性、１例は免疫固定法で解析不能の検体であった。このように、κ／λ比０．１又は５．５を基準として評価することにより、免疫固定法で解析不能だった２検体を除いて計算すると、８３．３％の陽性予測率（５４例中４５例）でＢＪＰ陽性と判定できる。
［表２］
次に、イムノアッセイ、電気泳動法ならびに免疫固定法の結果を表３に示す。表３から明らかなように、２８７臨床尿検体のうち免疫固定法により５８例にＢＪＰが同定され、１４例にインタクトイムノグロブリンＭタンパク質が検出された。また、尿蛋白の電気泳動法ではＢＪＰ陽性の５８例中５０例にＭバンドが観察された。
［表３］
また、図２に示すように、ＢＪＰ陽性検体のκ／λ比の中央値はＢＪＰκ型で５５．５、ＢＪＰλ型で０．００１２であった。一方、ＢＪＰ陰性検体では０．６３であった。
これらのデータを基に、ＲＯＣ分析によりカットオフ値を１．６７（ＢＪＰκ用）と０．２（ＢＪＰλ用）とに定め、図３に示すアルゴリズムにより電気泳動とκ／λ比を組み合わせ、２８７尿検体について解析を試みた。その結果を表４に示す。
表４から明らかなように、尿蛋白の電気泳動法でＭバンドが検出された６２例のうち、５３例をケースＡと判断し、そのうち４６検体（８６．８％）がＢＪＰ陽性であった。
また、Ｍバンドが検出されなかった２２５例のうち、１８３例にκ／λ比の異常は見られなかった。このうち９８．９％（１８３例中１８１例）がＢＪＰ陰性であった。
さらに、２８７例のうち５０例はＭバンドまたはκ／λ比の異常のどちらかを示した。このうち１０例はＢＪＰ陽性であった。
このように、上記のようなカットオフ値を用いた本発明方法により、ＢＪＰを感度８９．７％（５８検体中５２例）、特異度８１．６％（２２９例中１８７例）、正確度８４．３％（２８７例中２４２例）で検定できることが明らかとなり、ＢＪＰの可能性の高い検体を容易に抽出する事が可能となった。
［表４］
【産業上の利用可能性】
本発明の方法によれば、イムノアッセイ単独、もしくはイムノアッセイと電気泳動法を組み合わせ、一定の処理手順（アルゴリズム）により判断することで、簡便かつ信頼性の高いＢＪＰの検定法を初めて提供することが可能となる。
また、本発明の方法では、尿中の遊離イムノグロブリンκ鎖と尿中遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比を求めることによって、ＢＪＰサブクラスの同定も同時に行うことが可能で、確認検査である免役固定法の検査数を約１／６程度に削減することが可能である。
なお、本出願は、日本で出願された特願２００３−３８８６１７を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【図１】
【図２】
【図３】
【技術分野】
本発明は、尿蛋白電気泳動法とイムノアッセイとを併用した尿中ベンスジョーンズ蛋白質の効率的な検定法に関するものである。
【背景技術】
イムノグロブリン重鎖と解離した状態のモノクローナルな遊離イムノグロブリン軽鎖（Ｆｒｅｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：ＦＬＣ）は、形質細胞異常などの血液疾患、特に多発性骨髄腫やマクログロブリン血症に見い出されるモノクローナル蛋白質（Ｍ蛋白質）の１つである（Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１９６９，１６，５９９−６０６）。
１８４７年、Ｈｅｎｒｙ Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓは患者尿の特異な熱凝集反応を発見し、その原因となったタンパク質をベンスジョーンズ蛋白質（Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＪＰ）と命名した（Ｌａｎｃｅｔ，１８４７，２，８８−９２）。その本態は尿中のモノクローナルなＦＬＣであることが、後に明らかとなった。
ＢＪＰは多発性骨髄腫などの有用な臨床マーカーであり、その検定は日常の臨床検査の１つの項目として実施されている。ＢＪＰは、分子量が小さく、糸球体を容易に通過し、そのほとんどが尿中に移行するため、実際の臨床検査の場においては、尿中のＢＪＰを電気泳動法で検出している（ＤＲＧ／ＰＰＳ対応 臨床検査ガイドライン 第２次案，２０００，ｐ．７８−８２）。
電気泳動法によるＢＪＰの測定を、一般に“スクリーニングアッセイ”もしくは単に“スクリーニング”と称している。通常、ヒト検体中のイムノグロブリンはポリクローナルな組成であるため、電気泳動を実施した場合、検体中のイムノグロブリンはブロードなバンドを示す。一方、Ｍ蛋白質は単一な電荷を持ち、シングルバンド（Ｍバンド）を示すため、電気泳動法により両者を識別することが可能である。
尿蛋白の電気泳動法はＢＪＰのスクリーニング方法として広く採用されているものの、その検出感度や特異性は分析システムや尿の検査前濃縮の程度等に依存し、必ずしも満足できる方法とは言えない。たとえば、電気泳動の支持体として広く用いられているセルロースアセテート膜はイムノグロブリンの分解能が悪く、また、泳動後の蛋白検出用染色色素の種類によってもその検出感度は変化し、結果として電気泳動法は低感度とならざるを得ない。さらに、尿をサンプルとして使用するため、予め尿を濃縮する必要があるが、その場合の濃縮の程度も明確に定められていない。
したがって、電気泳動法を用いたＢＪＰのスクリーニング方法は、施設間での検査精度の差が大きく、臨床検査としては様々な問題を内在している。実際、近年行われた各施設間のコントロールサーベイでは、６０ｍｇ／ｄｌのＢＪＰがおよそ３０％の施設で見逃されていることが明らかとなり、問題となっている。
加えて、上記電気泳動法ではイムノグロブリンの免疫表現型（サブクラス）を同定することができないため、免疫固定法（もしくは免疫電気泳動法）を用いて検出されたＭ蛋白質のサブクラス（ＢＪＰ、ＩｇＧ型Ｍ蛋白質、又はＩｇＭ型Ｍ蛋白質等）を確認する必要がある。また、これらの確認検査で用いる免疫固定法は、非常に煩雑で、かつ検査単価が高額であるため、臨床検査の場においては、最初に電気泳動法でＭ蛋白質をスクリーニングし、次いで免疫固定法でＢＪＰを確定する手法をとらざるを得ないのが現状である。
【発明の開示】
このような現状を克服し、電気泳動法とイムノアッセイとの２種類の方法を使用し、検査の信頼性を向上させ、また確定検査にあたる免疫固定法の実施回数を少なくすることができるか否かに関し、検討した報告がある（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９７，２６２，１２１−１３０）。すなわち、上記報告においては、電気泳動法、イムノアッセイ、免疫固定法のそれぞれの結果を対比し、インタクトなイムノグロブリンに結合している軽鎖も含めた、尿中のκ型軽鎖とλ型軽鎖との全体（ｔｏｔａｌ）量及びその量比（ｔｏｔａｌ量とκ／λ比）に異常がなく、かつ電気泳動法で異常なバンドが認められない場合には、ＢＪＰ陰性と判断可能なことを示唆している。
しかし、上記検討には以下に示すような種々の問題があり、実際の臨床検査の場に置いて使用するに当たり、必ずしも信頼性できる結論とはなっていない。
（１）感度の問題
上記検討の結果、感度は１００％であると結論付けているが、必ずしもＢＪＰ特異的とは言えない。すなわち、インタクトなイムノグロブリンに結合している軽鎖も含めた、尿中のκ型軽鎖とλ型軽鎖の全体（ｔｏｔａｌ）を定量し、その量と比を算出しているが、インタクトなイムノグロブリンＭ蛋白質（例えばＩｇＧ−κ−Ｍ蛋白質など）が尿中に存在する場合、ＦＬＣ特異的でなく、軽鎖全量を測定するイムノアッセイではその量と比が必然的に異常となる。この量及び比の異常はＢＪＰ以外のイムノグロブリンＭ蛋白質の存在に由来する異常であり、必ずしもＢＪＰ特異的とは言えない。ここで感度とはＢＪＰを伴う尿検体のうち、陽性の結果を示した検体の割合（％）をいう（実施例（４）を参照）。
また、上記検討で採用したイムノアッセイの測定感度は悪く、試験に供したサンプルの約半数は測定感度以下となって、以後の検討がなされておらず、信頼性のあるデータとはいえない。
（２）確認検査回数削減の問題
上記検討の結果、免疫固定法による確認検査の回数を５２％削減できると結論付けているが、電気泳動法とイムノアッセイとの２種類の方法を組み合わせたメリットが全く示されていない。すなわち、上記報告では電気泳動法による検査結果をイムノアッセイで単に確かめただけであって、電気泳動でＭ蛋白質を示す検体はイムノアッセイの結果に係わらず、免疫固定法の確認検査を必要としており、従来の手法と変わるところがない。なぜ確認検査を５２％削減できることの根拠が示されていない。
また、免疫固定法による確認検査において、電気泳動法でＭ蛋白質が検出されない場合であってもＢＪＰ陽性であるケースがあり、Ｍ蛋白質が確認されない場合、イムノアッセイの結果に係わらず、すべてＢＪＰ陰性（ＮＯ ＢＪＰ）と結論付けるのは強引に過ぎ、科学的な信頼性も低い。
本発明者らは、より現実的で、効率的なＢＪＰの検定法に関し、鋭意検討を重ねた結果、（１）イムノアッセイにおけるＦＬＣのκ鎖とλ鎖の比（κ／λ比）を基に、ＢＪＰ陽性を判定できること、（２）電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、電気泳動におけるＭ蛋白質の有無とイムノアッセイにおけるＦＬＣのκ鎖とλ鎖の比（κ／λ比）を基に、一定の処理手順（アルゴリズム）により判断することで、効率的にＢＪＰを検定することができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の内容を包含する。
［１］電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断するステップ
［２］ステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行う、上記［１］記載の方法。
［３］ステップ２、ステップ１、ステップ３の順で行う、上記［１］記載の方法。
［４］電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロプリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断するステップ
［５］電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断するステップ
［６］電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断するステップ
［７］電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のＢＪＰを検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である場合にはＢＪＰ陰性と判断するステップ
［８］ステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行う、上記［４］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ステップ２、ステップ１、ステップ３の順で行う、上記［４］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［１０］電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質の有無とκ／λ比を指標に、ケースＡの場合にはＢＪＰ陽性と判断し、ケースＢとＣの場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断し、免疫固定法でＢＪＰの有無をさらに確認し、ケースＤの場合にはＢＪＰ陰性と判断するステップ
（ケースＡ）
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である。
（ケースＢ）
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である。
（ケースＣ）
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である。
（ケースＤ）
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である。
［１１］ステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行う、上記［１０］記載の方法。
［１２］ステップ２、ステップ１、ステップ３の順で行う、上記［１０］記載の方法。
［１３］イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求め、κ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断するベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）の検定法。
【図面の簡単な説明】
図１は、イムノアッセイにおけるＦＬＣ測定法の標準曲線の一例を示す図である。
図２は、尿中ＦＬＣの測定結果の一例を示す図である。図中、○；ＢＪＰκ陽性検体、△；ＢＪＰλ陽性検体、Ｘ；ＢＪＰ陰性検体をそれぞれ示し、図中の線２本はＲＯＣ解析で決定したκ／λ比のカットオフ値を示す。
図３は、ＦＬＣ測定法と電気泳動法の組み合わせ時のＢＪＰ検定手法（アルゴリズム）の一例を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明で使用する試料は、尿検体であれば特に限定されず、具体的には臨床にて採取される尿採取形態（保存剤添加尿、１日尿、早朝第一尿など）を試料として使用することができる。
本発明は、上述したように、イムノアッセイによりＢＪＰ陽性を検定する方法（方法１）と、電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、特定のステップにより尿試料中のＢＪＰを検定する方法（方法２）の２つの方法を包含するものである。
（方法１）
イムノアッセイによりＢＪＰ陽性を検定する方法としては、イムノアッセイにより尿試料中のＦＬＣκ鎖とＦＬＣλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求め、κ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合には、ＢＪＰ陽性と判断するＢＪＰの検定法である。
本発明で採用するイムノアッセイは、尿中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖とを測定できる方法であれば特に制限はない。具体的には、尿において微量に存在するＦＬＣに対して十分な測定感度を有し、インタクトなイムノグロブリンに対する交差反応性をほとんど示さず（例えば１％以下）、尿中のＦＬＣ以外の成分の影響を受けない方法が好適であり、好ましくは本発明者らが開発した酵素免疫測定法を例示することができる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００３，２７５，９−１７）。
測定後、測定されたＦＬＣのκ鎖とλ鎖との値を基に、その量比（κ／λ比）を算出し、κ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断する。
ＢＪＰ陽性検体はκ／λ比が大きく変動していることから、後述実施例に示すように、指標として用いるκ／λ比は、受診者動作特性（ＲＯＣ）分析（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３９，５６１−５７７）により、免疫固定法の結果と比較した場合でもＢＪＰ検定の陽性予測率が８０％以上の数値となるように、０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上、好ましくは０．１±０．０３以下又は５．５±１．６５以上という基準を用いて判定することで、高い精度で診断することが可能となる。なお、陽性予測率とはＢＪＰ陽性結果を示した検体が実際にＢＪＰを伴っている割合（％）をいう（実施例（４）を参照のこと）。
また、対象となる患者群によってこの比は変動する事があり得るため、上記範囲内を目安に、その都度臨床的に適切な比を設定する必要がある。
（方法２）
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、尿試料中のＢＪＰを検定する方法は、以下のステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行うことが好ましいが、ステップ１とステップ２は順序が逆であってもかまわない。
（１）ステップ１
ステップ１は、電気泳動により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップである。
本発明で採用する電気泳動法とは、公知の方法であり、具体的には、セルロースアセテート膜やアガロースゲルなどを支持体とし、検体に含まれる蛋白質を電気的に泳動し、泳動された蛋白質を染色法並びに物理化学的に検出する方法をいう（Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｆｉｘａｔｉｏｎ，１９９４，第２章、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ）。泳動後、Ｍバンドの有無によりＭ蛋白質の有無を判断する。
（２）ステップ２
ステップ２は、上述したイムノアッセイと同様の方法により尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖とのそれぞれの含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップである。
（３）ステップ３
ステップ３は、Ｍ蛋白質の有無とκ／λ比とを指標に、それぞれのケース毎にＢＪＰ陰性、ＢＪＰ陽性、及び／またはＢＪＰ陽性の疑いありと判断するステップである。
ＢＪＰ陽性のみを判定する目的では、上記イムノアッセイの時と同じ、０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上、好ましくは０．１±０．０３以下又は５．５±１．６５以上という数値をκ／λ比として採用し、ステップ１でＭ蛋白質が確認され、ステップ２で求めたκ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合には、ＢＪＰ陽性と判断することができる。
なお、ＢＪＰ陽性のみの判定は、上述したようにイムノアッセイ単独（方法１）でも可能であるものの、ステップ１の電気泳動によるＭ蛋白質の確認を追加し、これを加味して判断することで、より確実な判定を行うことができる。
次に、ＢＪＰ陽性のみならず、陰性及び／又はＢＪＰ陽性の疑いありまで判定する目的では、受診者動作特性（ＲＯＣ）分析（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３９，５６１−５７７）により、免疫固定法の結果と比較した場合でもＢＪＰ検定の診断正確度が８０％以上、好ましくは９０％以上の数値、具体的には、後述の実施例で示されているような、ＢＪＰ陰性検体の測定値を効率よく排除できる数値である、０．２±０．１と１．６７±０．８４、好適には０．２±０．０３と１．６７±０．５範囲内の数値をκ／λ比として採用することができる。
この場合のＢＪＰの判定は、ステップ１のＭ蛋白質の有無とステップ２のκ／λ比との結果から以下の４つのケースで判断する。すなわち、ケースＡの場合にはＢＪＰ陽性と判断し、ケースＢとＣの場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断し、免疫固定法でＢＪＰの有無を更に確認し、ケースＤの場合にＢＪＰ陰性と判断する。
（ケースＡ）
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である。
（ケースＢ）
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である。
（ケースＣ）
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である。
（ケースＤ）
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である。
【実施例】
以下、実施例に基づき本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
［実施例］
（１）尿検体
ＢＪＰが疑われた患者２８７例より採取された尿２８７検体を用いた。すべての検体について日本臨床検査医学会のガイドライン（臨床病理，２００２，５０；４３８−４３９）に従い、連結不可能匿名化を行った。
（２）電気泳動法ならびに免疫固定法
電気泳動法ならびに免疫固定法はヘレナ社のキットを用いて実施した。免疫固定法に用いる抗血清はダコ社より購入した。尿検体は必要に応じて最大１００倍まで濃縮した。
（３）ＦＬＣ測定法
ＦＬＣ測定法については文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００３，２７５，９−１７）に従って行った。すなわち、モノクローナル抗体をコートした９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ）に検体あるいは標準濃度溶液を１００μｌ毎加え、室温で２時間反応させた。洗浄した後、二次抗体として抗κ軽鎖型抗体ならびに抗λ軽鎖型抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識体を各１００μｌ加え、３７℃、３０分反応させた。反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、発色液（ＯＰＤ、Ｓｉｇｍａ）を１００μｌ毎分注し発色させた。１Ｎ硫酸にて発色を停止後、４９２ｎｍでの吸光度を測定した。なお、アッセイ用の緩衝液としては１％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）を使用した。また、スタンダードとしては、尿中から単離精製したＦＬＣを使用した。標準曲線の例を図１に示す。
（４）診断精度の評価
診断精度の評価は臨床検査分野において一般的に用いられている計算方法を用いた。すなわち、ＢＪＰの有無を対照とし、リファレンスの方法としての免疫固定法と評価対象としての本発明法により表１のように区分される。
［表１］
この区分に基づき、感度、特異度、陽性予想値、正確度を以下のように定義した。
感度：式ａ／（ａ＋ｂ）×１００で算出され、ＢＪＰ陽性検体の中で、陽性の検査結果を示した検体の割合を意味する。
特異度：式ｄ／（ｃ＋ｄ）×１００で算出され、ＢＪＰ陰性検体の中で、陰性の検査結果を示した検体の割合を意味する。
陽性予測率：式ａ／（ａ＋ｃ）×１００で算出され、ＢＪＰ陽性の検査結果を示した検体の中で、実際にＢＪＰを伴う検体の割合を意味する。
正確度：式（ａ＋ｄ）／（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００で算出され、検査された検体のうち、ＢＪＰの陽性と陰性が正しく診断された検体の割合を意味する。
（５）統計解析
受診者動作特性（ＲＯＣ）分析には統計解析ソフトウェアパッケージ（ＳｔａｔＦｌｅｘ）を用いた。
（６）結果
イムノアッセイの測定結果より、κ／λ比０．１又は５．５をカットオフとした場合、表２に示すように、該当する検体は２８７例中５６例存在した。その中で、κ／λ比５．５以上に該当する全１８例あり、そのうち１６例がＢＪＰκ陽性で、ＢＪＰ以外の２例のうち１例は、免疫固定法でも分析不可能であった。一方、κ／λ比０．１以下で該当する全３８例あり、そのうち２９例がＢＪＰλ陽性であった。残りの９例のうち、５例はインタクトイムノグロブリンＭ蛋白陽性、３例はＢＪＰ陰性、１例は免疫固定法で解析不能の検体であった。このように、κ／λ比０．１又は５．５を基準として評価することにより、免疫固定法で解析不能だった２検体を除いて計算すると、８３．３％の陽性予測率（５４例中４５例）でＢＪＰ陽性と判定できる。
［表２］
次に、イムノアッセイ、電気泳動法ならびに免疫固定法の結果を表３に示す。表３から明らかなように、２８７臨床尿検体のうち免疫固定法により５８例にＢＪＰが同定され、１４例にインタクトイムノグロブリンＭタンパク質が検出された。また、尿蛋白の電気泳動法ではＢＪＰ陽性の５８例中５０例にＭバンドが観察された。
［表３］
また、図２に示すように、ＢＪＰ陽性検体のκ／λ比の中央値はＢＪＰκ型で５５．５、ＢＪＰλ型で０．００１２であった。一方、ＢＪＰ陰性検体では０．６３であった。
これらのデータを基に、ＲＯＣ分析によりカットオフ値を１．６７（ＢＪＰκ用）と０．２（ＢＪＰλ用）とに定め、図３に示すアルゴリズムにより電気泳動とκ／λ比を組み合わせ、２８７尿検体について解析を試みた。その結果を表４に示す。
表４から明らかなように、尿蛋白の電気泳動法でＭバンドが検出された６２例のうち、５３例をケースＡと判断し、そのうち４６検体（８６．８％）がＢＪＰ陽性であった。
また、Ｍバンドが検出されなかった２２５例のうち、１８３例にκ／λ比の異常は見られなかった。このうち９８．９％（１８３例中１８１例）がＢＪＰ陰性であった。
さらに、２８７例のうち５０例はＭバンドまたはκ／λ比の異常のどちらかを示した。このうち１０例はＢＪＰ陽性であった。
このように、上記のようなカットオフ値を用いた本発明方法により、ＢＪＰを感度８９．７％（５８検体中５２例）、特異度８１．６％（２２９例中１８７例）、正確度８４．３％（２８７例中２４２例）で検定できることが明らかとなり、ＢＪＰの可能性の高い検体を容易に抽出する事が可能となった。
［表４］
【産業上の利用可能性】
本発明の方法によれば、イムノアッセイ単独、もしくはイムノアッセイと電気泳動法を組み合わせ、一定の処理手順（アルゴリズム）により判断することで、簡便かつ信頼性の高いＢＪＰの検定法を初めて提供することが可能となる。
また、本発明の方法では、尿中の遊離イムノグロブリンκ鎖と尿中遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比を求めることによって、ＢＪＰサブクラスの同定も同時に行うことが可能で、確認検査である免役固定法の検査数を約１／６程度に削減することが可能である。
なお、本出願は、日本で出願された特願２００３−３８８６１７を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【図１】
【図２】
【図３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断するステップ
【請求項２】
ステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ２、ステップ１、ステップ３の順で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断するステップ
【請求項５】
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断するステップ
【請求項６】
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断するステップ
【請求項７】
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である場合にはＢＪＰ陽性と判断するステップ
【請求項８】
ステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行う、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ２、ステップ１、ステップ３の順で行う、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質の有無とκ／λ比を指標に、ケースＡの場合にはＢＪＰ陽性と判断し、ケースＢとＣの場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断し、免疫固定法でＢＪＰの有無をさらに確認し、ケースＤの場合にはＢＪＰ陰性と判断するステップ
（ケースＡ）
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である。
（ケースＢ）
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である。
（ケースＣ）
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である。
（ケースＤ）
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である。
【請求項１１】
ステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行う、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ステップ２、ステップ１、ステップ３の順で行う、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求め、κ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断するベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）の検定法。
【請求項１】
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断するステップ
【請求項２】
ステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ２、ステップ１、ステップ３の順で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断するステップ
【請求項５】
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断するステップ
【請求項６】
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断するステップ
【請求項７】
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である場合にはＢＪＰ陽性と判断するステップ
【請求項８】
ステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行う、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ２、ステップ１、ステップ３の順で行う、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
電気泳動法とイムノアッセイとを併用し、次のステップを実施することにより尿試料中のベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）を検定する方法。
（１）ステップ１
電気泳動法により尿試料中のＭ蛋白質の存在を確認するステップ
（２）ステップ２
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求めるステップ
（３）ステップ３
Ｍ蛋白質の有無とκ／λ比を指標に、ケースＡの場合にはＢＪＰ陽性と判断し、ケースＢとＣの場合にはＢＪＰ陽性の疑いありと判断し、免疫固定法でＢＪＰの有無をさらに確認し、ケースＤの場合にはＢＪＰ陰性と判断するステップ
（ケースＡ）
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である。
（ケースＢ）
Ｍ蛋白質が確認され、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である。
（ケースＣ）
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１以下又は１．６７±０．８４以上である。
（ケースＤ）
Ｍ蛋白質が確認されず、κ／λ比が０．２±０．１超かつ１．６７±０．８４未満である。
【請求項１１】
ステップ１、ステップ２、ステップ３の順で行う、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ステップ２、ステップ１、ステップ３の順で行う、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
イムノアッセイにより尿試料中の遊離イムノグロブリンκ鎖と遊離イムノグロブリンλ鎖との含有量を測定し、その量比（κ／λ比）を求め、κ／λ比が０．１±０．０５以下又は５．５±２．７５以上である場合にはＢＪＰ陽性と判断するベンスジョーンズ蛋白質（ＢＪＰ）の検定法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６２０４４
【国際公開日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【発行日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１６４３５（Ｐ２００５−５１６４３５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７６４５
【国際出願日】平成１６年１１月１９日（２００４．１１．１９）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【発行日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７６４５
【国際出願日】平成１６年１１月１９日（２００４．１１．１９）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]