ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現させる形質変換体の調製方法および該形質変換体を用いた２，６−ナフタレン・ジカルボキン酸の調製
スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)ＫＣＴＣ２８８８に由来するベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを暗号化させる遺伝子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １を備え酵素を発現させる組換え体を調製するための方法、および、粗２−フォルミル−６−ナフトエ酸（ＦＮＡ）をナフタレン・ジメチルカルボン酸に変換するために形質転換体を適用することによって共存生成物であるＦＮＡとともに２，６−ナフタレン・ジカルボキン酸を酸化させて得られる粗ナフタレン・ジカルボキン酸を生物学的に純化させる方法が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)ＫＣＴＣ２８８８に由来するベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを暗号化させる遺伝子を備え、該酵素（ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼ）を発現させる形質転換体の調製方法、および、２，６−ジメチル・ナフタレン（以下「２，６−ＤＭＮ」と呼ぶ）の酸化によって共存生成物である２−フォルミル−６−ナフトエ酸（以下「ＦＮＡ」と呼ぶ）とともに得られる粗２，６−ナフタレン・ジカルボン酸（以下「ｃＮＤＡ」と呼ぶ）を、該ＦＮＡを２，６−ナフタレン・ジカルボン酸（以下「ＮＤＡ」と呼ぶ）に変換することで高純度に純化するにあたって該形質転換体を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
ナフタレン・ジカルボン酸のジエステル類は、ポリエステルやポリアミドなどの高性能ポリマー材料の調製に広く用いられて役立っている。これらのジエステル類の中でも代表的なものがジカルボン酸ジメチル−２，６−ナフタレン（以下「ＮＤＣ」と呼ぶ）である。ポリ（エチレン２−，６−ナフタレン）（以下「ＰＥＮ」と呼ぶ）は、高性能ポリエステルの一つであるが、ＮＤＣをエチレン・グリコールともに濃縮して調製される。ＰＥＮ製の繊維やフィルムは、強度や耐熱性の点でポリ（エチレン・テレフタレート）（皮下「ＰＥＴ」と呼ぶ）より優れている。ＰＥＮは、その優れた物性のために、磁気記録テープや電磁部品の調製に有用な薄膜を形成するために用いられる。さらに、ＰＥＮは、気体の拡散とくに二酸化炭素、酸素、水蒸気の拡散を防ぐ優れた機能を有するため、ＰＥＮ製のフィルム類は、食品容器とくに「高温充填」式の食品容器に適用することができる。また、ＰＥＮは、タイヤのコードの調製に有用な強度の高い繊維の製造に用いられている。
【０００３】
現在、ＮＤＣは、図１に示すように、一般に、ＤＭＮを酸化して粗ナフタレン・ジカルボン酸（ｃＮＤＡ）とし、それをエステル化することによって製造されている。最近では、ＮＤＣは、ＰＥＮの合成の主原料として用いられている。しかし、ＮＤＡと比較すると、ＮＤＣにはいくつかの問題点がある。第一に、ＮＤＣからは濃縮によってＰＥＮが生成されるが、共存生成物として爆発の危険のあるメタノールも生成される。これに対して、ＮＤＡの濃縮で生成されるのは水である。次に、ＮＤＣは、ＮＤＡからエステル化および純化によって得られるが、ＮＤＡと比較してもう一つの処理が必要となる。また、ＮＤＣには、既存のＰＥＴ生産施設を利用することができない。これらの不利な点にかかわらずＮＤＡではなくてＮＤＣが通常使用されるのは、今日に至るまで、ＮＤＡが、ＰＥＴの合成に用いるのに十分な純度で調製できないためである。
【０００４】
ＤＭＮを酸化するとｃＮＤＡが得られる。その際に、不完全な酸化のために、図２に示すように２−フォルミル−６−ナフトエ酸、２−ナフトエ酸等の副生成物が生じる。不純物とくにＦＮＡが存在すると、ＰＥＮを高分子化してポリマー材にするときに破断が生じ、ポリマーの性質に悪影響を及ぼす。ｃＮＤＡをＰＥＮの合成に適用するためには、事前にＦＮＡを除去しなければならないが、それは困難である。
【０００５】
ｃＮＤＡの反応からＦＮＡを除去するための方法には、さまざまなものが知られている。例えば、再結晶化によってＮＤＡを純化する方法、酸化を繰り返す方法、メタノールの存在下でｃＮＤＡをＮＤＣに変換し、さらに加水または水素化によって純化されたＮＤＡとする方法などが提案されている。加えて、溶剤による洗浄、溶解結晶化、高圧結晶化、超臨界抽出などの試みも行われている。しかし、これらの方法によっても十分な純度のＮＤＡは得られていない。他方、公知の方法でもＮＤＡの純度を高めることはできるが、収量を犠牲にすることとなり、実用化は困難である。
【０００６】
上に述べたように、化学的あるいは物理的なＮＤＡの生成方法には、環境汚染、高温および高圧による爆発の危険性、大規模施設による生産費の上昇、大きなエネルギー消費等を含む問題が生じる。高性能ポリマー材料への高分子化に直接使用するためには、２，６−ナフタレン・ジカルボン酸は、高純度でなければならないが、従来の方法でこれを行うことは困難である。ＮＤＡを高純度にすることは、可能ではあっても、追加の純化処理が必要であり、したがって生産性が低下し、処理が長引く結果となる。
【０００７】
このため、最近では、生物的方法とくに微生物を使用する方法が大きく注目されるようになっている。本発明の発明者らは、すでに、下記特許文献１に開示されているように新奇なＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（馬鈴薯菌、枯草菌）を用いてＦＮＡを除去することを開発し、また、下記特許文献２に開示されているようにキシレン・モノオキシゲナーゼの存在下で芳香族アルデヒドおよびカルボン酸を調製する方法を提案している。これまでの文献で、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)に由来するベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを用いてＦＮＡをＮＤＡに変換することを記載したものはない。
【特許文献１】韓国特許出願第２００２−００８７８１９号
【特許文献２】韓国特許出願第２００２−７００５３４４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明は、先行技術にまつわる上記の諸問題を考慮し、ＮＤＡの純化に使用することができ、ｘｙｌＣ遺伝子によって暗号化されたベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現させる形質変換体の調製方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明の他の目的は、形質変換体の存在下で、ｃＮＤＡに含まれるＦＮＡを酸化してＮＤＡとするｃＮＤＡ純化の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一側面にあっては、ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現させる形質変換体を調製するために、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)ＫＣＴＣ２８８８に由来するベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを暗号化させる遺伝子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １を備える組換え体発現ベクターを構成すること、および該組換え体発現ベクターで宿主細胞の形質転換を行うことからなる方法が提供される。
【００１１】
本発明の他の一側面にあっては、該方法によって調製された形質転換体が提供される。
【００１２】
本発明のさらに他の一側面にあっては、ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを生成するために、該形質転換体を２５ないし４５℃で培養すること、および該形質転換体培養菌にＩＰＴＧを０．１ないし２．０ｍＭ添加してベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼの発現を誘起させることからなる方法が提供される。
【００１３】
本発明のさらに他の一側面にあっては、粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸を純化するために、粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸を該形質転換体と反応させて該粗粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸に含まれる２−フォルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレン・ジカルボン酸に変換することからなる方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
上記および他の本発明の目的、特徴、および効果は、添付の図を参照して行う以下の詳細な説明からより明確に理解されよう。図面中、
図１は、従来の酸化法の２，６−ジメチル・ナフタレンのナフタレン・ジカルボン酸およびジカルボン酸ナフタレンへの変換を示す反応図である。
図２は、２，６−ジメチル・ナフタレンを酸化させて２，６−ナフタレン・ジカルボン酸および共存生成物である２−フォルミル−６−ナフトエ酸とすることを示す反応図である。
図３は、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)に由来するベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを暗号化させる遺伝子を備える組換え体発現ベクターｐＥＴ２０−ｘｙｌＣの遺伝子マップである。
【００１５】
以下、本発明の詳細な説明を行う。
本発明の一側面にあっては、ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現させる形質転換体を調製する本発明が提供される。そのためには、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)からベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼのための暗号化を行う遺伝子ｘｙｌＣのクローンを発生させ、それを組換え体発現ベクターの中に挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞の中に導入する。
【００１６】
ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼ（ＢＺＤＨ）は、ホモジマー（単素２量体）であり、遺伝子ｘｙｌＣによって暗号化される。ｘｙｌＣを発現させるように遺伝子工学的に発生させたＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）を用いれば、ベンズアルデヒド、３−メチル・ベンズアルデヒド、４−メチル・ベンズアルデヒド、３−ニトロ・ベンズアルデヒド、および塩素置換ベンズアルデヒドを酸化させることができる（井上等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：１１９６−１２０１、１９９５参照）。
【００１７】
スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １で表されるｘｙｌＣのクローンを発生させ、ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼのための暗号化を行うことができる。遺伝子ｘｙｌＣのクローンを発生させるためには、５‘−ＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＣＧＣＡＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ２）および５‘−ＧＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ : ３）のプライマーのセットをテンプレートとして役立つスフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)（ＫＣＴＣ ２８８８）から得られるプラスミドＤＮＡ（ｐＮＬ１）とともに用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う。
【００１８】
ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現させる形質転換体は、遺伝子ｘｙｌＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １）を備える組換え体発現ベクターとともに生成する。該組換え体発現ベクターは、クローン発生させた遺伝子ｘｙｌＣを機能的にリンクさせることによって得られる。
【００１９】
図３を参照して、図には、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)由来のベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを暗号化する遺伝子を備えた組換え体発現ベクターｐＥＴ２０−ｘｙｌＣの遺伝子マップが示されている。図３に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １で表される長さ約１．５ｋｂｐのＤＮＡ切片がｐＥＴ−２０ｂ（＋）の中に挿入されて組換え体ベクターｐＥＴ２０−ｘｙｌを形成する。
【００２０】
本明細書に開示されて特許請求されているように、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)（ＫＣＴＣ ２８８８）由来の．ｘｙｌＣのための暗号化を行うＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １に示されるシーケンス（配列）は、“控えめなシーケンスの修飾」、すなわちヌクレオチド・シーケンスによって暗号化されたまたはアミノ酸最シーケンスを含む酵素の触媒特性に有意な影響を及ぼしあるいは変更をあたえることのないヌクレオチドおよびアミノ酸シーケンスの修飾、を含むことを意図したものである。このような控えめなシーケンスの修飾は、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、添加、および削除を含むものである。修飾は、部位特異的な突然変異生成やＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を仲介とする突然変異生成など当業者には公知の標準的な手法を用いて導入することができる。控えめなアミノ酸の置換は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することを含む。
【００２１】
本発明に有用な発現ベクターには、なんら特定の制限はない。当業者には公知の発現ベクター、例えば、ｐＦｏｒｅｘＴベクター、ｐＵＣベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター。ｐＥＴベクター等々をＴ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、あるいはｓＰ６プロモーターとともに利用することができる。
【００２２】
形質転換体の調製は、当業者には公知の方法で組換え体発現を用いて行うことができる。本発明にもとづけば、ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼの発現ベクターによって形質転換された微生物の助けによって２−フォルミル−６−ナフトエ酸が２，６−ナフタレン・ジカルボン酸に変換される。したがって、形質転換された微生物は、高いレベルでベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現できることが好ましい。ｐＥＴ−２０ｂ（＋）ベクターの場合は、構造遺伝子の発現は、Ｔ７プロモーターの制御のもとで調節され、したがって、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、「ＩＰＴＧ」と呼ぶ）によって誘起することができる。
【００２３】
これらの形質転換体の調製のための宿主細胞として適当なものは、腸バクテリア、例えばＭＣ１０６１（Ｅ．ｃｏｌｉ），ＪＭ１０９（Ｅ．ｃｏｌｉ），ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ）， ＤＨ５α（Ｅ．ｃｏｌｉ）などである。発現ベクターは、熱衝撃法、電気穿孔法、微量注入法、遺伝子衝撃法等によって導入できるが、本発明は、これらの方法に限定されるものではない。
【００２４】
一方、発現ベクター内へのｘｙｌＣｎｏクローン発生は、制限酵素による消化または塩基配列によって確認することができる。
【００２５】
形質転換体は、２５ないし４５℃、好ましくは３７℃の温度で十分に成長させた後、ＬＢ媒質１００ｍｌ中に１％（ｖ?ｖ）の量を植え付ける。０．４ないし０．５のＯＤ６００が観察されたら、ＩＰＴＧを０．１ないし２．０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭの量を添加して、ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼの発現を誘起し、その後３７℃で培養する。ただし、形質転換体の成長およびタンパク質の発現は、当業者には公知の任意の方法で行うことができ、上に述べたものに限定されるものではない。
【００２６】
本発明にもとづけば、粗ナフタレン・ジカルボン酸は、中でベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼが高いレベルで発現している形質転換微生物の助けをかりて、該ナフタレン・ジカルボンの中に含まれる２−フォルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレン・ジカルボン酸に変換することによって純化することができる。
【００２７】
この変換に適用するために、培養基から回収した形質転換された微生物のバイオマスを、生理食塩水の中に懸濁させる。
【００２８】
酵素の存在下では、粗ナフタレン・ジカルボン酸に含まれる２−フォルミル−６−ナフトエ酸の２，６−ナフタレン・ジカルボン酸への変換は、ｐＨ６．０ないし１０．０、好ましくはｐＨ８．０の緩衝液の中で行うことができる。
【００２９】
酵素を用いた変換に有用な緩衝液の例としては、炭酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３）、グリシン緩衝液（グリシン／ＮａＯＨ）、リン酸カリウム緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４／ＫＯＨ、Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＯＨ、ＫＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ、Ｋ２ＨＰＯ４／ＮａＯＨ）、リン酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４）、コハク酸緩衝液（コハク酸／ＮａＯＨ）、酢酸ナトリウム緩衝液（酢酸ナトリウム／酢酸）、クエン酸緩衝液（クエン酸／クエン酸ナトリウム）、ピロリン酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ４Ｐ２Ｏ７／ＨＣｌ）、ホウ酸緩衝液（ホウ酸／ＮａＯＨ），およびホウ酸ナトリウム緩衝液（ホウ酸ナトリウム／ＨＣｌ）を挙げることができる。これらの中でも、酵素活動の面からリン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００３０】
オプションとして、ｃＮＤＡを溶解するために有機溶剤を添加して酵素反応を行ってもよい。適当な溶剤の例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ），テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を挙げることができるが、酵素活動の面から、５％ＤＭＳＯを用いることが好ましい。
【００３１】
この変換は、反応速度を最適化するために、好ましくは２５ないし４５℃、最も好ましくは３０℃で行う。２−フォルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレン・ジカルボン酸へ変換するための十分な時間に関しては、０．５ないし４８時間、好ましくは０．５ないし２４時間の範囲であり、より好ましくは６時間である。
【００３２】
形質転換体ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＥＴ２０−ｘｙｌＣ）を、ｃＮＤＡ１，０００ｐｐｍおよびアンピシリン１００ｍｇ／Ｌ含んだＬＢ媒質中に植え付け、攪拌しながら３７℃で十分な時間培養する。上澄みをＨＰＬＣ分析すると、発現したベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼ（ｘｙｌＣ）がＦＮＡを除去して高純度で２，６−ＮＤＡを生成したことがしめされた。
【００３３】
本発明は、本発明を明らかにするために以下に述べる例によってよりよく理解することができよう。ただし、以下の例は、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例１】
【００３４】
例１：遺伝子ｘｙｌＣのクローンの発生
スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)（ＫＣＴＣ ２８８８）からベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼのための暗号化を行う遺伝子ｘｙｌＣのクローンを発生させるために、遺伝子ｘｙｌＣを備えるプラスミド（ｐＮＬ１）をそこから遊離した（サムブルック等、分子クローンの発生、研究所マニュアル第２版、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版部、ＮＹ州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９参照）。この遊離プラスミドＤＮＡ（ｐＮＬ１）をテンプレートとして用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のために、ｘｙｌＣの公共ＤＮＡデータベース・シーケンス（ジェンバンク・シーケンス・データベース、ＮＣ ００２０３３、から入手可能）を基礎にしてプライマー１、５‘−ＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＣＧＣＡＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ２）およびプライマー２、５‘−ＧＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ : ３）を合成した。このプライマーのセットを用いて、完全な長さの遺伝子ｘｙｌＣのクローンを発生させるためのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を９４℃で５分間の予備変性から開始し、９４℃で１分間の変性を４０サイクル行い、５６℃で１分間のアニール、７２℃で１．５分間の伸展を行い、最後に７２℃でさらに１０分間の伸展を行った。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）から、長さ約１．５ｋｂｐＤＮＡの断片を遊離し、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化させた。これを既に同じ制限酵素で切断しておいたプラスミドｐＥＴ−２０ｂ（＋）の中に挿入し、図３に示す組換え体発現ベクターｐＥＴ２０−ｘｙｌＣを構成した。
【実施例２】
【００３５】
例２：クローン発生させた遺伝子の分析
例１で組換え体ベクター（ｐＥＴ２９−ｘｙｌＣ）の中でクローン発生させた遺伝子の塩基配列をするめに、該組換え体ベクターを、二つのベクターＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９の遺伝子マップをもとに、さまざまな酵素で切断した。これによって得られたＤＮＡ断片を用いて、Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９の中でサブクローンを発生させ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ プライマー・サイクル・シーケンシング・キット（米国、パーキン・エルマー社）を用いてＡｍｐｌｉＴａｇ ＤＮＡ ポリメラーゼの存在下でベース・シーケンシング分析を行った。問題の二本のＤＮＡ鎖を両方向で読み取るために、ヌクレオチドの断片を部分合成した。ＧｅｎＢａｎｋからの塩基配列との比較によって、クローン発生させたＤＮＡは、遺伝子ｘｙｌＣであることが確定した。
【実施例３】
【００３６】
例３：組換え体発現ＢＺＤＨの調製
塩化カルシウム法（サムブルック等、分子クローンの発生、研究所マニュアル第２版、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版部、ＮＹ州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９参照）を用いて、ｐＥＴ２０−ｘｙｌｃベクターによってＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ の形質転換を行い、アンピシリン（１００ｍｇ?Ｌ）、Ｘ−ｇａｌ，ＩＰＴＧ、およびｂａｃｔｏ−ａｇａｒ（１５ｇ／Ｌ）をサプリメントとして加えたＬＢプレート（イースト・エキス、５ｇ／Ｌ；トリプトン、１０ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ）の上で成長させ、形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＥＴ２０−ｘｙｌＣ）を選別した。
【実施例４】
【００３７】
例４：遺伝子ｘｙｌＣの発現
形質転換させた微生物中の遺伝子ｘｙｌＣの発現を調べるために、例３で得られた形質転換体ＸＬ１−Ｂｌｕｅとコントロールとして野生種のＸＬ１−Ｂｌｕｅを同じ条件で培養し、各細菌から発現させたベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼの活性を測定した。そのため、例３の形質転換体とコントロールを３７℃で十分な時間培養したそれぞれのＬＢ媒質中に植え付け、さらに１％（ｖ／ｖ）の量をＬＢ媒質１００ｍｌ中に植え付けた。６００ｎｍでの吸光度が０．４ないし０．５に達したとき、ＩＰＴＧ０．５ｍＭを添加してｘｙＬＣの発現を誘起し、さらに３７℃で培養した。
【実施例５】
【００３８】
例５：発現したＢＺＤＨを用いた２−フォルミル−６−ナフトエ酸から２，６−ナフタレン・ジカルボン酸への変換
例４でベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現した培養微生物を遠心分離機にかけて細胞の集団を回収し、０．８５％の生理食塩水で洗浄し、３０℃の槽中で表１の反応液を用いて６時間培養した後、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った。表１の反応液において、緩衝液は、ｐＨは８．０、ＤＭＳＯ濃度は５％、ＮＤＡ中のＦＮＡ含有量は９％に設定した。
【００３９】
分析の結果を下の表２に示す。表２からわかるように、ＦＮＡをＮＤＡに変換する能力において、形質転換体ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＥＴ２０−ｘｙｌＣ）は、野生種のものよりはるかに優れていた。ＨＰＬＣ分析は、下の表３に示す条件で行った。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【表２】
【００４２】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００４３】
以上説明したように、本発明にもとづいて調製した形質転換体は、粗ナフタレン・ジカルボン酸から２−フォルミル−６−ナフトエ酸を除去するのにきわめて有効である。したがって、本発明の方法は、高い純度の２，６−ナフタレン・ジカルボキン酸を経済的に有利で環境に優しい方法で生成することができ、したがって産業への適用可能性は高い。
【００４４】
本発明を説明するために、以上、本発明の好ましい実施形態を開示したが、当業者には、添付の請求の範囲で開示される本発明の範囲および精神から逸脱することなくさまざまな修正、追加、および置換を行うことができることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】従来の酸化法の２，６−ジメチル・ナフタレンのナフタレン・ジカルボン酸およびジカルボン酸ナフタレンへの変換を示す反応図である。
【図２】２，６−ジメチル・ナフタレンを酸化させて２，６−ナフタレン・ジカルボン酸および共存生成物である２−フォルミル−６−ナフトエ酸とすることを示す反応図である。
【図３】スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)に由来するベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを暗号化させる遺伝子を備える組換え体発現ベクターｐＥＴ２０−ｘｙｌＣの遺伝子マップである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)ＫＣＴＣ２８８８に由来するベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを暗号化させる遺伝子を備え、該酵素（ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼ）を発現させる形質転換体の調製方法、および、２，６−ジメチル・ナフタレン（以下「２，６−ＤＭＮ」と呼ぶ）の酸化によって共存生成物である２−フォルミル−６−ナフトエ酸（以下「ＦＮＡ」と呼ぶ）とともに得られる粗２，６−ナフタレン・ジカルボン酸（以下「ｃＮＤＡ」と呼ぶ）を、該ＦＮＡを２，６−ナフタレン・ジカルボン酸（以下「ＮＤＡ」と呼ぶ）に変換することで高純度に純化するにあたって該形質転換体を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
ナフタレン・ジカルボン酸のジエステル類は、ポリエステルやポリアミドなどの高性能ポリマー材料の調製に広く用いられて役立っている。これらのジエステル類の中でも代表的なものがジカルボン酸ジメチル−２，６−ナフタレン（以下「ＮＤＣ」と呼ぶ）である。ポリ（エチレン２−，６−ナフタレン）（以下「ＰＥＮ」と呼ぶ）は、高性能ポリエステルの一つであるが、ＮＤＣをエチレン・グリコールともに濃縮して調製される。ＰＥＮ製の繊維やフィルムは、強度や耐熱性の点でポリ（エチレン・テレフタレート）（皮下「ＰＥＴ」と呼ぶ）より優れている。ＰＥＮは、その優れた物性のために、磁気記録テープや電磁部品の調製に有用な薄膜を形成するために用いられる。さらに、ＰＥＮは、気体の拡散とくに二酸化炭素、酸素、水蒸気の拡散を防ぐ優れた機能を有するため、ＰＥＮ製のフィルム類は、食品容器とくに「高温充填」式の食品容器に適用することができる。また、ＰＥＮは、タイヤのコードの調製に有用な強度の高い繊維の製造に用いられている。
【０００３】
現在、ＮＤＣは、図１に示すように、一般に、ＤＭＮを酸化して粗ナフタレン・ジカルボン酸（ｃＮＤＡ）とし、それをエステル化することによって製造されている。最近では、ＮＤＣは、ＰＥＮの合成の主原料として用いられている。しかし、ＮＤＡと比較すると、ＮＤＣにはいくつかの問題点がある。第一に、ＮＤＣからは濃縮によってＰＥＮが生成されるが、共存生成物として爆発の危険のあるメタノールも生成される。これに対して、ＮＤＡの濃縮で生成されるのは水である。次に、ＮＤＣは、ＮＤＡからエステル化および純化によって得られるが、ＮＤＡと比較してもう一つの処理が必要となる。また、ＮＤＣには、既存のＰＥＴ生産施設を利用することができない。これらの不利な点にかかわらずＮＤＡではなくてＮＤＣが通常使用されるのは、今日に至るまで、ＮＤＡが、ＰＥＴの合成に用いるのに十分な純度で調製できないためである。
【０００４】
ＤＭＮを酸化するとｃＮＤＡが得られる。その際に、不完全な酸化のために、図２に示すように２−フォルミル−６−ナフトエ酸、２−ナフトエ酸等の副生成物が生じる。不純物とくにＦＮＡが存在すると、ＰＥＮを高分子化してポリマー材にするときに破断が生じ、ポリマーの性質に悪影響を及ぼす。ｃＮＤＡをＰＥＮの合成に適用するためには、事前にＦＮＡを除去しなければならないが、それは困難である。
【０００５】
ｃＮＤＡの反応からＦＮＡを除去するための方法には、さまざまなものが知られている。例えば、再結晶化によってＮＤＡを純化する方法、酸化を繰り返す方法、メタノールの存在下でｃＮＤＡをＮＤＣに変換し、さらに加水または水素化によって純化されたＮＤＡとする方法などが提案されている。加えて、溶剤による洗浄、溶解結晶化、高圧結晶化、超臨界抽出などの試みも行われている。しかし、これらの方法によっても十分な純度のＮＤＡは得られていない。他方、公知の方法でもＮＤＡの純度を高めることはできるが、収量を犠牲にすることとなり、実用化は困難である。
【０００６】
上に述べたように、化学的あるいは物理的なＮＤＡの生成方法には、環境汚染、高温および高圧による爆発の危険性、大規模施設による生産費の上昇、大きなエネルギー消費等を含む問題が生じる。高性能ポリマー材料への高分子化に直接使用するためには、２，６−ナフタレン・ジカルボン酸は、高純度でなければならないが、従来の方法でこれを行うことは困難である。ＮＤＡを高純度にすることは、可能ではあっても、追加の純化処理が必要であり、したがって生産性が低下し、処理が長引く結果となる。
【０００７】
このため、最近では、生物的方法とくに微生物を使用する方法が大きく注目されるようになっている。本発明の発明者らは、すでに、下記特許文献１に開示されているように新奇なＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（馬鈴薯菌、枯草菌）を用いてＦＮＡを除去することを開発し、また、下記特許文献２に開示されているようにキシレン・モノオキシゲナーゼの存在下で芳香族アルデヒドおよびカルボン酸を調製する方法を提案している。これまでの文献で、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)に由来するベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを用いてＦＮＡをＮＤＡに変換することを記載したものはない。
【特許文献１】韓国特許出願第２００２−００８７８１９号
【特許文献２】韓国特許出願第２００２−７００５３４４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明は、先行技術にまつわる上記の諸問題を考慮し、ＮＤＡの純化に使用することができ、ｘｙｌＣ遺伝子によって暗号化されたベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現させる形質変換体の調製方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明の他の目的は、形質変換体の存在下で、ｃＮＤＡに含まれるＦＮＡを酸化してＮＤＡとするｃＮＤＡ純化の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一側面にあっては、ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現させる形質変換体を調製するために、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)ＫＣＴＣ２８８８に由来するベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを暗号化させる遺伝子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １を備える組換え体発現ベクターを構成すること、および該組換え体発現ベクターで宿主細胞の形質転換を行うことからなる方法が提供される。
【００１１】
本発明の他の一側面にあっては、該方法によって調製された形質転換体が提供される。
【００１２】
本発明のさらに他の一側面にあっては、ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを生成するために、該形質転換体を２５ないし４５℃で培養すること、および該形質転換体培養菌にＩＰＴＧを０．１ないし２．０ｍＭ添加してベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼの発現を誘起させることからなる方法が提供される。
【００１３】
本発明のさらに他の一側面にあっては、粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸を純化するために、粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸を該形質転換体と反応させて該粗粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸に含まれる２−フォルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレン・ジカルボン酸に変換することからなる方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
上記および他の本発明の目的、特徴、および効果は、添付の図を参照して行う以下の詳細な説明からより明確に理解されよう。図面中、
図１は、従来の酸化法の２，６−ジメチル・ナフタレンのナフタレン・ジカルボン酸およびジカルボン酸ナフタレンへの変換を示す反応図である。
図２は、２，６−ジメチル・ナフタレンを酸化させて２，６−ナフタレン・ジカルボン酸および共存生成物である２−フォルミル−６−ナフトエ酸とすることを示す反応図である。
図３は、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)に由来するベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを暗号化させる遺伝子を備える組換え体発現ベクターｐＥＴ２０−ｘｙｌＣの遺伝子マップである。
【００１５】
以下、本発明の詳細な説明を行う。
本発明の一側面にあっては、ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現させる形質転換体を調製する本発明が提供される。そのためには、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)からベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼのための暗号化を行う遺伝子ｘｙｌＣのクローンを発生させ、それを組換え体発現ベクターの中に挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞の中に導入する。
【００１６】
ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼ（ＢＺＤＨ）は、ホモジマー（単素２量体）であり、遺伝子ｘｙｌＣによって暗号化される。ｘｙｌＣを発現させるように遺伝子工学的に発生させたＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）を用いれば、ベンズアルデヒド、３−メチル・ベンズアルデヒド、４−メチル・ベンズアルデヒド、３−ニトロ・ベンズアルデヒド、および塩素置換ベンズアルデヒドを酸化させることができる（井上等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：１１９６−１２０１、１９９５参照）。
【００１７】
スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １で表されるｘｙｌＣのクローンを発生させ、ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼのための暗号化を行うことができる。遺伝子ｘｙｌＣのクローンを発生させるためには、５‘−ＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＣＧＣＡＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ２）および５‘−ＧＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ : ３）のプライマーのセットをテンプレートとして役立つスフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)（ＫＣＴＣ ２８８８）から得られるプラスミドＤＮＡ（ｐＮＬ１）とともに用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う。
【００１８】
ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現させる形質転換体は、遺伝子ｘｙｌＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １）を備える組換え体発現ベクターとともに生成する。該組換え体発現ベクターは、クローン発生させた遺伝子ｘｙｌＣを機能的にリンクさせることによって得られる。
【００１９】
図３を参照して、図には、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)由来のベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを暗号化する遺伝子を備えた組換え体発現ベクターｐＥＴ２０−ｘｙｌＣの遺伝子マップが示されている。図３に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １で表される長さ約１．５ｋｂｐのＤＮＡ切片がｐＥＴ−２０ｂ（＋）の中に挿入されて組換え体ベクターｐＥＴ２０−ｘｙｌを形成する。
【００２０】
本明細書に開示されて特許請求されているように、スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)（ＫＣＴＣ ２８８８）由来の．ｘｙｌＣのための暗号化を行うＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １に示されるシーケンス（配列）は、“控えめなシーケンスの修飾」、すなわちヌクレオチド・シーケンスによって暗号化されたまたはアミノ酸最シーケンスを含む酵素の触媒特性に有意な影響を及ぼしあるいは変更をあたえることのないヌクレオチドおよびアミノ酸シーケンスの修飾、を含むことを意図したものである。このような控えめなシーケンスの修飾は、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、添加、および削除を含むものである。修飾は、部位特異的な突然変異生成やＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を仲介とする突然変異生成など当業者には公知の標準的な手法を用いて導入することができる。控えめなアミノ酸の置換は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することを含む。
【００２１】
本発明に有用な発現ベクターには、なんら特定の制限はない。当業者には公知の発現ベクター、例えば、ｐＦｏｒｅｘＴベクター、ｐＵＣベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター。ｐＥＴベクター等々をＴ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、あるいはｓＰ６プロモーターとともに利用することができる。
【００２２】
形質転換体の調製は、当業者には公知の方法で組換え体発現を用いて行うことができる。本発明にもとづけば、ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼの発現ベクターによって形質転換された微生物の助けによって２−フォルミル−６−ナフトエ酸が２，６−ナフタレン・ジカルボン酸に変換される。したがって、形質転換された微生物は、高いレベルでベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現できることが好ましい。ｐＥＴ−２０ｂ（＋）ベクターの場合は、構造遺伝子の発現は、Ｔ７プロモーターの制御のもとで調節され、したがって、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、「ＩＰＴＧ」と呼ぶ）によって誘起することができる。
【００２３】
これらの形質転換体の調製のための宿主細胞として適当なものは、腸バクテリア、例えばＭＣ１０６１（Ｅ．ｃｏｌｉ），ＪＭ１０９（Ｅ．ｃｏｌｉ），ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ）， ＤＨ５α（Ｅ．ｃｏｌｉ）などである。発現ベクターは、熱衝撃法、電気穿孔法、微量注入法、遺伝子衝撃法等によって導入できるが、本発明は、これらの方法に限定されるものではない。
【００２４】
一方、発現ベクター内へのｘｙｌＣｎｏクローン発生は、制限酵素による消化または塩基配列によって確認することができる。
【００２５】
形質転換体は、２５ないし４５℃、好ましくは３７℃の温度で十分に成長させた後、ＬＢ媒質１００ｍｌ中に１％（ｖ?ｖ）の量を植え付ける。０．４ないし０．５のＯＤ６００が観察されたら、ＩＰＴＧを０．１ないし２．０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭの量を添加して、ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼの発現を誘起し、その後３７℃で培養する。ただし、形質転換体の成長およびタンパク質の発現は、当業者には公知の任意の方法で行うことができ、上に述べたものに限定されるものではない。
【００２６】
本発明にもとづけば、粗ナフタレン・ジカルボン酸は、中でベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼが高いレベルで発現している形質転換微生物の助けをかりて、該ナフタレン・ジカルボンの中に含まれる２−フォルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレン・ジカルボン酸に変換することによって純化することができる。
【００２７】
この変換に適用するために、培養基から回収した形質転換された微生物のバイオマスを、生理食塩水の中に懸濁させる。
【００２８】
酵素の存在下では、粗ナフタレン・ジカルボン酸に含まれる２−フォルミル−６−ナフトエ酸の２，６−ナフタレン・ジカルボン酸への変換は、ｐＨ６．０ないし１０．０、好ましくはｐＨ８．０の緩衝液の中で行うことができる。
【００２９】
酵素を用いた変換に有用な緩衝液の例としては、炭酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３）、グリシン緩衝液（グリシン／ＮａＯＨ）、リン酸カリウム緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４／ＫＯＨ、Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＯＨ、ＫＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ、Ｋ２ＨＰＯ４／ＮａＯＨ）、リン酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４）、コハク酸緩衝液（コハク酸／ＮａＯＨ）、酢酸ナトリウム緩衝液（酢酸ナトリウム／酢酸）、クエン酸緩衝液（クエン酸／クエン酸ナトリウム）、ピロリン酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ４Ｐ２Ｏ７／ＨＣｌ）、ホウ酸緩衝液（ホウ酸／ＮａＯＨ），およびホウ酸ナトリウム緩衝液（ホウ酸ナトリウム／ＨＣｌ）を挙げることができる。これらの中でも、酵素活動の面からリン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００３０】
オプションとして、ｃＮＤＡを溶解するために有機溶剤を添加して酵素反応を行ってもよい。適当な溶剤の例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ），テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を挙げることができるが、酵素活動の面から、５％ＤＭＳＯを用いることが好ましい。
【００３１】
この変換は、反応速度を最適化するために、好ましくは２５ないし４５℃、最も好ましくは３０℃で行う。２−フォルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレン・ジカルボン酸へ変換するための十分な時間に関しては、０．５ないし４８時間、好ましくは０．５ないし２４時間の範囲であり、より好ましくは６時間である。
【００３２】
形質転換体ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＥＴ２０−ｘｙｌＣ）を、ｃＮＤＡ１，０００ｐｐｍおよびアンピシリン１００ｍｇ／Ｌ含んだＬＢ媒質中に植え付け、攪拌しながら３７℃で十分な時間培養する。上澄みをＨＰＬＣ分析すると、発現したベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼ（ｘｙｌＣ）がＦＮＡを除去して高純度で２，６−ＮＤＡを生成したことがしめされた。
【００３３】
本発明は、本発明を明らかにするために以下に述べる例によってよりよく理解することができよう。ただし、以下の例は、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例１】
【００３４】
例１：遺伝子ｘｙｌＣのクローンの発生
スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)（ＫＣＴＣ ２８８８）からベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼのための暗号化を行う遺伝子ｘｙｌＣのクローンを発生させるために、遺伝子ｘｙｌＣを備えるプラスミド（ｐＮＬ１）をそこから遊離した（サムブルック等、分子クローンの発生、研究所マニュアル第２版、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版部、ＮＹ州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９参照）。この遊離プラスミドＤＮＡ（ｐＮＬ１）をテンプレートとして用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のために、ｘｙｌＣの公共ＤＮＡデータベース・シーケンス（ジェンバンク・シーケンス・データベース、ＮＣ ００２０３３、から入手可能）を基礎にしてプライマー１、５‘−ＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＣＧＣＡＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ２）およびプライマー２、５‘−ＧＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ : ３）を合成した。このプライマーのセットを用いて、完全な長さの遺伝子ｘｙｌＣのクローンを発生させるためのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を９４℃で５分間の予備変性から開始し、９４℃で１分間の変性を４０サイクル行い、５６℃で１分間のアニール、７２℃で１．５分間の伸展を行い、最後に７２℃でさらに１０分間の伸展を行った。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）から、長さ約１．５ｋｂｐＤＮＡの断片を遊離し、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化させた。これを既に同じ制限酵素で切断しておいたプラスミドｐＥＴ−２０ｂ（＋）の中に挿入し、図３に示す組換え体発現ベクターｐＥＴ２０−ｘｙｌＣを構成した。
【実施例２】
【００３５】
例２：クローン発生させた遺伝子の分析
例１で組換え体ベクター（ｐＥＴ２９−ｘｙｌＣ）の中でクローン発生させた遺伝子の塩基配列をするめに、該組換え体ベクターを、二つのベクターＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９の遺伝子マップをもとに、さまざまな酵素で切断した。これによって得られたＤＮＡ断片を用いて、Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９の中でサブクローンを発生させ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ プライマー・サイクル・シーケンシング・キット（米国、パーキン・エルマー社）を用いてＡｍｐｌｉＴａｇ ＤＮＡ ポリメラーゼの存在下でベース・シーケンシング分析を行った。問題の二本のＤＮＡ鎖を両方向で読み取るために、ヌクレオチドの断片を部分合成した。ＧｅｎＢａｎｋからの塩基配列との比較によって、クローン発生させたＤＮＡは、遺伝子ｘｙｌＣであることが確定した。
【実施例３】
【００３６】
例３：組換え体発現ＢＺＤＨの調製
塩化カルシウム法（サムブルック等、分子クローンの発生、研究所マニュアル第２版、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版部、ＮＹ州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９参照）を用いて、ｐＥＴ２０−ｘｙｌｃベクターによってＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ の形質転換を行い、アンピシリン（１００ｍｇ?Ｌ）、Ｘ−ｇａｌ，ＩＰＴＧ、およびｂａｃｔｏ−ａｇａｒ（１５ｇ／Ｌ）をサプリメントとして加えたＬＢプレート（イースト・エキス、５ｇ／Ｌ；トリプトン、１０ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ）の上で成長させ、形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＥＴ２０−ｘｙｌＣ）を選別した。
【実施例４】
【００３７】
例４：遺伝子ｘｙｌＣの発現
形質転換させた微生物中の遺伝子ｘｙｌＣの発現を調べるために、例３で得られた形質転換体ＸＬ１−Ｂｌｕｅとコントロールとして野生種のＸＬ１−Ｂｌｕｅを同じ条件で培養し、各細菌から発現させたベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼの活性を測定した。そのため、例３の形質転換体とコントロールを３７℃で十分な時間培養したそれぞれのＬＢ媒質中に植え付け、さらに１％（ｖ／ｖ）の量をＬＢ媒質１００ｍｌ中に植え付けた。６００ｎｍでの吸光度が０．４ないし０．５に達したとき、ＩＰＴＧ０．５ｍＭを添加してｘｙＬＣの発現を誘起し、さらに３７℃で培養した。
【実施例５】
【００３８】
例５：発現したＢＺＤＨを用いた２−フォルミル−６−ナフトエ酸から２，６−ナフタレン・ジカルボン酸への変換
例４でベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現した培養微生物を遠心分離機にかけて細胞の集団を回収し、０．８５％の生理食塩水で洗浄し、３０℃の槽中で表１の反応液を用いて６時間培養した後、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った。表１の反応液において、緩衝液は、ｐＨは８．０、ＤＭＳＯ濃度は５％、ＮＤＡ中のＦＮＡ含有量は９％に設定した。
【００３９】
分析の結果を下の表２に示す。表２からわかるように、ＦＮＡをＮＤＡに変換する能力において、形質転換体ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＥＴ２０−ｘｙｌＣ）は、野生種のものよりはるかに優れていた。ＨＰＬＣ分析は、下の表３に示す条件で行った。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【表２】
【００４２】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００４３】
以上説明したように、本発明にもとづいて調製した形質転換体は、粗ナフタレン・ジカルボン酸から２−フォルミル−６−ナフトエ酸を除去するのにきわめて有効である。したがって、本発明の方法は、高い純度の２，６−ナフタレン・ジカルボキン酸を経済的に有利で環境に優しい方法で生成することができ、したがって産業への適用可能性は高い。
【００４４】
本発明を説明するために、以上、本発明の好ましい実施形態を開示したが、当業者には、添付の請求の範囲で開示される本発明の範囲および精神から逸脱することなくさまざまな修正、追加、および置換を行うことができることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】従来の酸化法の２，６−ジメチル・ナフタレンのナフタレン・ジカルボン酸およびジカルボン酸ナフタレンへの変換を示す反応図である。
【図２】２，６−ジメチル・ナフタレンを酸化させて２，６−ナフタレン・ジカルボン酸および共存生成物である２−フォルミル−６−ナフトエ酸とすることを示す反応図である。
【図３】スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)に由来するベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを暗号化させる遺伝子を備える組換え体発現ベクターｐＥＴ２０−ｘｙｌＣの遺伝子マップである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現させる形質変換体を調製するための方法において、
スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)ＫＣＴＣ２８８８に由来するベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを暗号化させる遺伝子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １を備える組換え体発現ベクターを構成すること、および
該組換え体発現ベクターで宿主細胞の形質転換を行うことからなる方法。
【請求項２】
該宿主細胞が腸バクテリアである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法によって調製された形質転換。
【請求項４】
ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを生成する方法において、
該形質転換体を２５ないし４５℃で培養すること、および
該形質転換体培養菌にＩＰＴＧを０．１ないし２．０ｍＭ添加してベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼの発現を誘起させることからなる方法。
【請求項５】
粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸を純化する方法において、
粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸を請求項３に記載の該形質転換体と反応させて該粗粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸に含まれる２−フォルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレン・ジカルボン酸に変換することからなる方法。
【請求項６】
該粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸と該形質転換対との反応は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、およびテトラヒドロフランからなる群から選ばれた有機溶媒を０ないし２０％含む緩衝液中で行われる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該反応は、２５ないし４５℃で０．５ないし４８時間行われる請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸を、有機溶媒を含むｐＨ６．０ないし１０．０の範囲のリン酸カリウム溶液（ＫＨ２ＰＯ４／ＫＯＨ、Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＯＨ、ＫＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ、Ｋ２ＨＰＯ４／ＮａＯＨ）である緩衝液中で該形質転換対と反応させる請求項５に記載の方法。
【請求項１】
ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを発現させる形質変換体を調製するための方法において、
スフィンゴモナス・アロマティシヴォランス(Sphingomonas aromaticivorans)ＫＣＴＣ２８８８に由来するベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを暗号化させる遺伝子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １を備える組換え体発現ベクターを構成すること、および
該組換え体発現ベクターで宿主細胞の形質転換を行うことからなる方法。
【請求項２】
該宿主細胞が腸バクテリアである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法によって調製された形質転換。
【請求項４】
ベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼを生成する方法において、
該形質転換体を２５ないし４５℃で培養すること、および
該形質転換体培養菌にＩＰＴＧを０．１ないし２．０ｍＭ添加してベンズアルデヒド・デハイドロゲナーゼの発現を誘起させることからなる方法。
【請求項５】
粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸を純化する方法において、
粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸を請求項３に記載の該形質転換体と反応させて該粗粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸に含まれる２−フォルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレン・ジカルボン酸に変換することからなる方法。
【請求項６】
該粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸と該形質転換対との反応は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、およびテトラヒドロフランからなる群から選ばれた有機溶媒を０ないし２０％含む緩衝液中で行われる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該反応は、２５ないし４５℃で０．５ないし４８時間行われる請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該粗ナフタレン・ジメチルカルボン酸を、有機溶媒を含むｐＨ６．０ないし１０．０の範囲のリン酸カリウム溶液（ＫＨ２ＰＯ４／ＫＯＨ、Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＯＨ、ＫＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ、Ｋ２ＨＰＯ４／ＮａＯＨ）である緩衝液中で該形質転換対と反応させる請求項５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００８−５２６１９５（Ｐ２００８−５２６１９５Ａ）
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４９２４６（Ｐ２００７−５４９２４６）
【出願日】平成１７年１２月２３日（２００５．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００４４８６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７１０２８
【国際公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【出願人】（５０７２２２２６２）ヒョサン コーポレーション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２３日（２００５．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００４４８６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７１０２８
【国際公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【出願人】（５０７２２２２６２）ヒョサン コーポレーション (1)
【Ｆターム（参考）】
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