ペプチドホルモンをコードするヒト肥満感受性遺伝子及びその使用
本発明は、肥満および関連した障害の診断および予防のために使用することができるヒト肥満感受性遺伝子の同定を開示する。本発明は、更に具体的には、染色体１７上のＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰ遺伝子およびそのある種の対立遺伝子が、肥満に対する感受性に関係していることを開示する。本発明は、ＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰ遺伝子および発現産物における特定の突然変異、ならびにこれらの突然変異に基づく診断ツールおよびキットに関する。本発明は、低アルファリポタンパク血症、家族性結合性高脂血症、インスリン抵抗性症候群Ｘまたは多重代謝障害、冠動脈疾患、糖尿病及び関連合併症および異常脂血症を含むが、それらに限定されるわけではない、冠動脈性心疾患及び代謝障害の素因の診断又は、該冠動脈性心疾患及び代謝障害からの保護の診断、該冠動脈性心疾患及び代謝障害の検出、予防および／または処置において使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に遺伝学及び医学の分野に関する。
【０００２】
発明の背景
現代の工業化された国の全健康コストの約３〜８％は、現在肥満の直接コストによるものである（Ｗｏｌｆ，１９９６）。ドイツでは、肥満及共存症に関係した（直接及び間接の両方）全コストは、１９９５年には２１０億ドイツマルク（２９．４ＵＳドル）と評価された（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，１９９６）。２０３０年までに、これらのコストは肥満の普及が更に増加しないとしても、５０％上昇するであろう。
【０００３】
肥満は、健康が損なわれうる程度に脂肪組織における異常な又は過剰な脂肪蓄積の状態としてしばしば簡単に定義される。基礎をなす疾患は望ましくない正のエネルギーバランス及び重量増加のプロセスである。腹部脂肪分布は、女性的脂肪分布よりも高い健康的リスクと関連している。
【０００４】
ボデイ．マス．インデックス（ＢＭＩ；ｋｇ／ｃｍ２）は、粗いとはいえ、最も有用な集団レベルの肥満の目安を与える。それは、集団の肥満の普及及びそれに関連した危険を評価するのに使用することができる。しかしながら、ＢＭＩは、身体の組成又は身体脂肪分布を考慮していない（ＷＨＯ，１９９８）。
【０００５】
【表１】
【０００６】
肥満は、肥満及び重度の肥満の定義のためのカットオフとして８５ｔｈ及び９５ｔｈＢＭＩパーセンタイルを使用しても定義された。ＢＭＩパーセンタイルは、いくつかの母集団内で計算されている；Ｇｅｒｍａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｓｕｒｖｅｙに基づいてドイツ人口に対するパーセンタイルは１９９４年以来入手可能であった（Ｈｅｂｅｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９４，１９９６）。異なる体重クラスのＷＨＯ分類は成人のみに適用することができるので、子供及び青年期の個体の肥満の定義についてＢＭＩパーセンタイルを指すことが普通になった。
【０００７】
肥満の普及（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）の最近の上昇は、いくつかの国の健康システムにとって大きな関心のある問題である。Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）の報告に従えば、合衆国では過去２０年間に肥満が劇的に増加した。１９８５年には、少数の州のみがＣＤＣｓ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＲＦＳＳ）に参加していて、肥満データを提供していた。１９９１年に、４つの州が１５〜１９％の肥満普及率を報告しておりそして２０％又は２０％より高い率を報告する州はなかった。２００２年には、２０の州が１５〜１９％の肥満普及率を報告しており；２９の州が２０〜２４％の率を有し、そして１つの州は２５％を越える率を報告する。同様な傾向がヨーロッパ及び南アメリカの他の国々でも観察された。
【０００８】
子供及び青年期の個体は、この傾向から免がれなかった。それどころか、ＵＳＡでの増加は、実質的であった。従って、１９６０年代と１９９０年との間に体重超過及び肥満は６〜１７歳において劇的に増加した。この増分は、カットオフとして８５ｔｈＢＭＩセンタイル（１９６０年代に計算された）を使用して４０％の相対的増加になりそして９５ｔｈセンタイルの使用により１００％の相対的増加になる。１９８５年と１９９５年の間に極端な肥満のため入院患者として処置されたドイツの子供及び青年の横断研究では、この１０年間の期間にわたり殆ど２ｋｇ／ｍ２の平均ＢＭＩの有意な増加が報告された。この極端なグループ内では、増分は最高のＢＭＩ範囲において最も顕著であった。
【０００９】
肥満の普及のこの増加の基礎となる機構は知られていない。環境的因子が基礎をなす原因として普通に引き合いに出された。基本的には、増加したカロリー摂取及び減少したレベルの身体活動の両方が検討された。英国では、肥満率の増加は、後者の機構に帰された。したがって、この国では、平均カロリー摂取はここ２０年間に幾分減少すらしたが、これに対してテレビジョンを観て過ごす時間の増加及び家庭当りの車の平均数から生じる間接の証拠は、関係のある原因因子として減少したレベルの身体活動を指摘している。
【００１０】
遺伝的因子は寄与する原因として以前は考えられなかった。全く反対に、増加した率の肥満がここ２０年間に観察されたという事実は、遺伝的因子が原因となることはできないという証拠とみなされてきた。しかしながら、選択的配偶（ａｓｓｏｒｔａｔｉｖｅ ｍａｔｉｎｇ）の率の増加は、観察された現象への遺伝的寄与を非常によく形成することができるということが提唱された。この仮説は、肥満した個体の烙印を押すことはむしろ最近の社会現象を表し、従って、常に増加した率の選択的配偶をもたらしたということを示唆する証拠に基づいている。結果として、子孫は、肥満の基礎をなす加算的及び非加算的遺伝因子のより高い負荷を有している。実際に、極端に肥満した子供及び青年期の個体の両親の間の格別に高い率の（推定された）選択的配偶が観察された。
【００１１】
肥満と関連した潜在的に生命を脅かす慢性の健康問題は下記の主な分野に入る：
１）高血圧、慢性心臓疾患及び発作を含む心臓血管問題、２）インスリン抵抗性と関連した状態、即ち、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、３）あるタイプの癌、主としてホルモンが関係した癌及び大腸癌、ならびに４）胆嚢疾患。肥満と関連した他の問題は、呼吸困難、慢性筋骨格問題、皮膚問題および無生殖性を含む（ＷＨＯ，１９９８）。
【００１２】
これらの障害を処置するための最近利用可能な主なストラテジーは、食事制限、身体活動の増加、薬理学的アプローチ及び外科的アプローチを含む。成人では、伝統的介入を使用する長期間の体重損失は格別である。現在の薬理学的介入は、典型的には、５〜１５キログラムの体重損失を誘導し；もし薬剤処理が中断されるならば、再び始まる重量増加が続いて起こる。外科処置は比較的成功しておりそして極端な肥満および／または重い医学的合併症を有する患者のために取ってある。
【００１３】
最近、レプチン欠失突然変異が検出された１０歳の甚だしく肥満した少女が組換えレプチンで処置されて成功した。これは、彼女の病的な肥満の基礎をなす突然変異の検出を治療的に生かした最初の個体である。
【００１４】
いくつかの双生児の研究が行われてＢＭＩの遺伝性が評価され、そのいくらかは、１０００組以上の双生児ペアーを包含していた。結果は、非常に首尾一貫していた：一卵性双子間のペアー内相関は、年齢及び性とは無関係に、典型的には０．６〜０．８であった。１つの研究では、一卵性双生子及び二卵性双生子についての相関は、双生子が離れて育てられたか又は一緒に育てられたかとは無関係に、基本的に同じであった。ＢＭＩの遺伝性は、０．７と評価され；非共有環境因子は可変性の残りの３０％を説明した。驚くべきことに、共有された環境因子は、可変性の実質的な割合を説明しなかった。過度のカロリー及び不足カロリーの栄養は、一卵性双生子ペアーの両メンバー間で同様な程度の体重増加または損失をもたらしたが、これは、体重に対するエネルギー利用性の環境的に誘導された変動の効果を遺伝的因子が調節することを示す。過食及び過小食した際の代謝反応および体脂肪分布の変化も遺伝的制御下にある（Ｈｅｂｅｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８に概説されている）。
【００１５】
多数の養子関係の研究は、養子のＢＭＩはその生物学的両親のＢＭＩと相関しておりそして養子両親のＢＭＩと相関していないことを示した。家族の研究に依存して、同胞（ｓｉｂｓ）のＢＭＩ間の相関は０．２〜０．４であった。両親−子相関は、典型的には僅かに低かった。分離分析（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、主要な劣性遺伝効果を繰り返して示唆した。これらの分析に基づいて、サンプルサイズの計算は、一致及び不一致アプローチの両方に基づいて行われた。
【００１６】
予想とは対照的に、一致同胞ペアーアプローチは優れており；同じパワーを達成するのにより少ない数の家族が必要であった。
【００１７】
極端に肥満した若いインデックスの両親、母または父または両方に基づいた家族研究は、大多数の家族においてＢＭＩ＞９０ｔｈデシルを有する。ＢＭＩ＞９５ｔｈセンタイルを有するインデツクスの患者に基づいて、それぞれの家族の約２０％は、ＢＭＩ＞９０ｔｈセンタイルを有する同胞を有する。
【００１８】
結論として、環境因子は、個体を多少肥満の発生に感受性とする特異的遺伝子型と相互作用することは明らかである。更に、主要な遺伝子が検出されたという事実にもかかわらず、スペクトルがこのような主要な遺伝子からほんの僅かな影響を有する遺伝子に及ぶ
ことを考慮することが必要である。
【００１９】
１９９４年の終わりにおけるレプチン遺伝子の発見（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４）に続いて、食欲及び体重調節の基礎をなす調節システムを明かすための科学的努力が実質的に爆発した。それは最近最も早く成長する生物医学的分野である。この著しい増加は、明らかな臨床的興味により、ヒト、げっ歯類及び他の哺乳動物の肥満に基本的にすべて関係している大規模な分子遺伝的活動ももたらした（Ｈｅｂｅｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【００２０】
この点で、突然変異が現在知られている単一遺伝子形の肥満をもたらした多くの遺伝子がげっ歯類においてクローニングされた。これらの突然変異の全身性結果は、最近分析されている。これらのモデルは、体重調節に関与する複雑な調節システムへの洞察を与え、その最ももよく知られているのはレプチン及びその受容体を含む。
【００２１】
マウスでは、しかしブタでも、体重調節に最も関係がありそうな１５以上の量的形質遺伝子座（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ）（ＱＴＬ）が同定された（Ｃｈａｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００２２】
ヒトでは、４つの非常にまれな常染色体劣性形態の肥満が１９９７年に記載された。レプチン、レプチン受容体、プロホルモンコンベルターゼ１及びプロ−オピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）をコードする遺伝子の突然変異が、過食と関連した早期開始型のはなはだしい肥満を引き起こすことが示された。異なる追加の臨床的（例えば、赤毛、原発性無月経）および／または内分泌学的異常（例えば、顕著に変わった血清レプチンレベル、ＡＣＴＨ分泌の欠如）は、それぞれの候補遺伝子の位置を正確に示す（ｐｉｎｐｏｉｎｔ）。単一遺伝子動物モデル及びヒト単一遺伝子形態の両方とも、体重調節の基礎をなす複雑なシステムへの新規な洞察をもたらした。
【００２３】
極めて最近では、ヒトにおける第１常染色体優性形態の肥満が記載された。メラノコルチン−４−受容体遺伝子（ＭＣ４Ｒ）内の２つの異なる突然変異は、これらの変異体に対するヘテロ接合性発端者において極端な肥満をもたらすことが観察された。上記した発見とは対照的に、これらの突然変異は、極端な肥満以外の容易に明らかな表現型異常を包含しない（Ｖａｉｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８； Ｙｅｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。興味深いことに、両グループとも相対的に小さな研究グループ（ｎ＝６３およびｎ＝４３）における系統的スクリーンにより突然変異を検出した。
【００２４】
Ｈｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）は、総計４９２人の肥満した子供および青年期の個体においてＭＣ４Ｒをスクリーニングした。概して、ハプロ不全（ｈａｐｌｏ−ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）をもたらす２つの異なる突然変異を有する４つの個体が検出された。１つはＹｅｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）により以前に観察された突然変異と同じであった。３つの個体で検出された他の突然変異は、受容体の細胞外ドメインにおける停止突然変異を誘導した。約１％の極端に肥満した個体は、ＭＣ４Ｒにおけるハプロ不全突然変異を有する。２つの形態のハプロ不全に加えて、Ｈｉｎｎｅｙ等（１９９９）は、保存性及び非保存性のアミノ酸交換の両方をもたらす追加の突然変異も検出した。興味深いことに、これらの突然変異は、主として肥満研究グループにおいて観察された。これらの突然変異の機能的関与は現在未知である。
【００２５】
ＭＣ４Ｒ突然変異を有する個体の同定は、可能な薬理学的介入を考慮に入れると興味深い。従って、すべてのメラノコルチンのコア配列を表す副腎皮質刺激ホルモン４〜１０（ＡＣＴＨ４〜１０）の鼻内適用は健常な対照において減少した体重、体脂肪質量および血漿レプチン濃度をもたらした。それらの減少した受容体密度を理論的に釣り合わせることがあるこの処置に対して突然変異キャリアーがいかに反応するかに関して疑問が生じる。
【００２６】
体重調節における特定の遺伝子の関与は、トランスジェニックマウスから得られたデータにより更に立証される。例えば、ＭＣ４Ｒ欠失マウスは早期開始肥満を発生する（Ｈｕｓｚａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
【００２７】
異なるグループは、肥満又は依存性表現型（ＢＭＩ、レプチンレベル、脂肪質量等）に関係したゲノムスキャンを行っている。このアプローチは、非常に有望と思われる。何故ならば、それは系統的でありそしてモデルフリーであるからである。更に、それは格別に成功していることが既に示された。従って、比較的小さな研究グループを分析することによってすら、ポジティブな連鎖結果が得られた。更に重要なことに、いくらかの発見は、既に追試されている。下記の領域の各々は、少なくとも２つの独立したグループにより同定された：染色体１ｐ３２、染色体２ｐ２１、染色体６ｐ２１、染色体１０および染色体２０ｑ１３（Ｃｈａｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００２８】
発明の要約
本発明は、肥満および関連した障害の診断及び予防のために使用することができる３つのヒト肥満感受性遺伝子の同定を今や開示する。本発明は、更に具体的には、染色体１７上のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子およびそのある種の対立遺伝子が肥満に対する感受性に関係していることを証明する。
【００２９】
更に詳しくは、本発明は、ＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰ遺伝子を含む染色体１７上の染色体領域に位置しているいくつかハプロタイプ及びＳＮＰに関する。好ましくは、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む。特定の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８を含む。他の特定の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含む。更に、肥満と各々独立に関連した該単一ＳＮＰは、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８である。更なる態様では、肥満と各々独立に関連した該単一ＳＮＰは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１でもある。
【００３０】
本発明は、低アルファリポタンパク血症、家族性結合性高脂血症、インスリン抵抗性症候群Ｘ又は多重代謝障害、冠動脈疾患、糖尿病及び関連合併症および異常脂血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）を含むが、それらに限定されるわけではない、肥満、冠動脈性心疾患及び代謝障害の素因の診断又は該肥満、冠動脈性心疾患及び代謝障害からの保護の診断、該肥満、冠動脈性心疾患及び代謝障害の検出および／または予防において使用することができる。
【００３１】
本発明の特定の目的は、被検体からのサンプル中のＰＰＹ遺伝子座、ＰＹＹ遺伝子座、ＧＩＰ遺伝子座およびその組み合わせからなる群より選ばれる遺伝子座における変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）の存在を検出することを含み、該変化の存在が、肥満または関連した障害の存在もしくは素因を示す、被検体における肥満または関連した障害の存在もしくは素因を検出する方法にある。特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は被検体からのサンプル中のＧＩＰ遺伝子座の変化の存在を検出することを含む。
【００３２】
本発明の追加の特定の目的は、被検体からのサンプル中のＰＰＹ遺伝子座、ＰＹＹ遺伝子座、ＧＩＰ遺伝子座およびその組み合わせからなる群より選ばれる遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が肥満又は関連した障害からの保護を示す、被検体における肥満または関連した障害からの保護を検出する方法にある。特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は被検体からのサンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００３３】
本発明の他の特定の目的は、肥満または関連した障害の処置に対する被検体の応答を評価する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ遺伝子座、ＰＹＹ遺伝子座、ＧＩＰ遺伝子座およびその組み合わせからなる群より選ばれる遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が該処置に対する特定の応答を示す、方法にある。特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は被検体からのサンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００３４】
本発明は、被検体からのサンプル中のＰＰＹ遺伝子座、ＰＹＹ遺伝子座、ＧＩＰ遺伝子座およびその組み合わせからなる群より選ばれる遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が肥満または関連した障害への素因を示し、そして肥満又は関連した障害に対する予防処置を行うことを含む、被検体における肥満又は関連した障害を予防するための方法にも関する。特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は被検体からのサンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００３５】
好ましい態様では、前記変化は、肥満と関連した１つ又は複数のＳＮＰ又は肥満と関連したＳＮＰのハプロタイプである。更に好ましくは、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む。特定の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６（ハプロタイプ４−５−６）を含むか又はＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６からなる（ハプロタイプ４−５−６）。場合により、ハプロタイプ４−５−６は、ＳＮＰ７及びＳＮＰ８を更に含むことができる。別の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７（ハプロタイプ５−６−７）を含むか又はＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７（ハプロタイプ５−６−７）からなる。場合により、ハプロタイプ５−６−７は、ＳＮＰ４および／またはＳＮＰ８を更に含むことができる。追加の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、又はＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むかあるいはＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、又はＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる。場合により、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むか、又はＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる。更に好ましくは、肥満と関連した該ＳＮＰは、ＳＮＰ７またはＳＮＰ８であることができる。更なる態様では、肥満と各々独立に関連した該単一のＳＮＰは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１でもある。
【００３６】
好ましくは、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰの遺伝子座における変化は、ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、マイクロシーケンシングアッセイ、対立遺伝子特異的増幅アッセイを行うことにより決定される。
【００３７】
本発明の特定の局面は、ＰＰＹ、ＰＹＹもしくはＧＩＰ遺伝子又はその組み合わせを含むゲノム領域における肥満と関連した少なくとも１つのＳＮＰ又はハプロタイプを特異的に検出するようにデザインされる、プライマー、プローブおよび／またはオリゴヌクレオチドを含む物質の組成物にある。好ましくは、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む。好ましい態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６を含む。場合により、このハプロタイプは、ＳＮＰ７及びＳＮＰ８を更に含むことができる。別の好ましい態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７を含む。場合により、このハプロタイプは、ＳＮＰ４および／またはＳＮＰ８を更に含むことができる。好ましくは、肥満と関連した該ＳＮＰは、ＳＮＰ７またはＳＮＰ８である。他の好ましい態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、又はＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含む。場合により、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含む。好ましくは、肥満と独立に関連した該ＳＮＰは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０またはＳＮＰ１１である。
【００３８】
本発明の他の局面は、ＰＰＹおよびＰＹＹ遺伝子、ＰＰＹおよびＰＹＹ発現産物、及び／又はそれに対する抗体を利用する結合アッセイにある。本発明の更なる局面は、ＧＩＰ遺伝子、ＧＩＰ発現産物および／またはそれに対する抗体を利用する結合アッセイにある。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト肥満感受性遺伝子としてＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰの同定を開示する。肥満を有する１６４家族からの種々の核酸サンプルを、特定のＧｅｎｏｍｅＨＩＰ法に供した。この方法は、肥満した被検体における変わっている該集団における特定の同祖性（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ−ｂｙ−ｄｅｓｃｅｎｔ）断片の同定をもたらした。ＩＢＤ断片のスクリーニングにより、本発明者は、肥満および関連した表現型のための候補として、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）遺伝子、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）遺伝子および胃抑制性ポリペプチド（ＧＩＰ）遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、限界的な間隔（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｖａｌ）で実際に存在しそして肥満の遺伝的調節と合致する機能的表現型を発現する。ＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰ遺伝子を含む限界的な間隔内に位置したいくつかのＳＮＰも、ヒト被検体における肥満に相関しているものとして同定された。ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８を含むハプロタイプは、肥満と関連していることが見出された。更に、ＳＮＰ７及びＳＮＰ８は、各々肥満と独立に関連していることが見出された。ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むハプロタイプも肥満と関連していることが見出され、そしてＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１も肥満と各々独立に関連していた。別の状況では、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む他のハプロタイプも肥満と関連していることが見いだされた。
【００４０】
従って、本発明は、肥満および関連した障害の診断および予防のためにＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰ遺伝子を使用することを目的とする。
【００４１】
定義
肥満および代謝障害：肥満は、健康が損なわれうる程度に、脂肪組織における異常なまたは過剰な脂肪蓄積の任意の状態とみなされるべきである。関連した障害、疾患または病理は、更に具体的には、低アルファリポタンパク血症、家族性結合性高脂血症、インスリン抵抗性症候群Ｘ又は多重代謝障害、冠動脈疾患、糖尿病及び関連合併症および異常脂血症を含むが、それらに限定されるわけではないいかなる代謝障害も含む。本発明は、成人、子供および出生前の段階を含む種々の被検体、特にヒトにおいて使用することができる。
【００４２】
本発明の状況内では、ＰＰＹおよびＰＹＹ遺伝子座は、ＰＰＹおよびＰＹＹコード配列、ＰＰＹおよびＰＹＹ非コード配列（例えばイントロン）、転写翻訳および／またはＲＮＡもしくはタンパク質安定性を制御するＰＰＹおよびＰＹＹ調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）、ならびにすべての対応する発現産物、例えばＰＰＹおよびＰＹＹ ＲＮＡｓ（例えばｍＲＮＡｓ）並びにＰＰＹおよびＰＹＹポリペプチド（例えば前駆タンパク質および成熟タンパク質）を含む、細胞または生物におけるすべてのＰＰＹおよびＰＹＹ配列または産物を意味する。ＰＰＹおよびＰＹＹ遺伝子座は、ＰＰＹおよびＰＹＹ遺伝子内に位置したＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含むＰＰＹおよびＰＹＹ遺伝子の周囲の（ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ）配列も含む。例えば、ＰＰＹおよびＰＹＹ遺伝子座は、ＳＮＰ４〜ＳＮＰ８を含む周囲の配列を含む。
【００４３】
本発明の状況内では、ＧＩＰ遺伝子座は、ＧＩＰコード配列、ＧＩＰ非コード配列（例えばイントロン）、転写翻訳および／またはＲＮＡもしくはタンパク質安定性を制御する ＧＩＰ調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）、ならびにすべての対応する発現産物、例えばＧＩＰ ＲＮＡｓ（例えばｍＲＮＡｓ）およびＧＩＰポリペプチド（例えば前駆タンパク質および成熟タンパク質）を含む、細胞または生物におけるすべてのＧＩＰ配列または産物を意味する。ＧＩＰ遺伝子座は、ＧＩＰ遺伝子内に位置したＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含むＧＩＰ遺伝子の周囲の配列も含む。例えば、ＧＩＰ遺伝子座は、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含む周囲の配列を含む。
【００４４】
本願で使用された、用語「ＰＰＹ遺伝子」および用語「ＰＹＹ遺伝子」は、ヒト染色体１７上のそれぞれヒト膵臓ポリペプチド遺伝子およびペプチドＹＹ遺伝子、ならびにその変異体、アナログおよびそれらの断片を意味し、これらは、肥満および代謝障害に対する感受性又は肥満および代謝障害からの保護に関係するそれらの対立遺伝子（例えば生殖系列突然変異（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ））を含む。ＰＰＹ遺伝子は、膵臓アイコサペプチド、ＰＮＰまたは膵臓ホルモン前駆体（膵臓ポリペプチド（ＰＰ）遺伝子を指すこともある。ＰＹＹ遺伝子は、ペプチドＹＹ前駆体（ＰＹＹ）（ペプチドチロシンチロシン）遺伝子を指すことができる。
【００４５】
本願で使用された、用語「ＧＩＰ遺伝子」は、ヒト染色体１７上の胃抑制ポリペプチド遺伝子、ならびにその変異体、アナログおよびそれらの断片を意味し、これらは、肥満および代謝障害に対する感受性又は肥満および代謝障害からの保護に関係するそれらの対立遺伝子（例えば生殖系列突然変異）を含む。ＧＩＰ遺伝子は、グルコース依存性インスリン刺激性ポリペプチド（ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を指すことができる。
【００４６】
用語「遺伝子」は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成または半合成ＤＮＡ、ならびに任意の形態の対応するＲＮＡを含む任意の型のコード核酸を含むとみなされるべきである。用語、遺伝子は、特に、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰをコードする組換え核酸、即ち、例えば、配列をアセンブリング、カッティング、ライゲーションまたは増幅することにより人工的に創りだされたいかなる天然に存在しない核酸分子も含む。ＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰ遺伝子は、典型的には二本鎖であるが、一本鎖などの他の形態も意図することができる。ＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰ遺伝子は、種々のソースから当該技術分野で知られた種々の技術に従って、例えば、ＤＮＡライブリーをスクリーニングすることまたは種々の天然のソースから増幅することにより得ることができる。組換え核酸は、化学合成、遺伝子工学、酵素的技術またはその組み合わせを含む慣用の技術により調製することができる。適当なＰＰＹ遺伝子配列は、遺伝子バンク、例えば、ＰＰＹのためのＵｎｉｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ（Ｈｓ．１８４６０４）、Ｕｎｉｇｅｎｅ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＭ＿００２７２２、ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡｓ：ＮＭ＿００２７２２、ＭＩＰＳアセンブリー：Ｈ３３９９８Ｓ１、ＤＯＴＳアセンブリー：ＤＴ．２０８４９２、ＤＴ．１０００１８３８７および追加の遺伝子／ｃＤＮＡ配列：ＢＣ０３２２２５、ＢＣ０４００３３、Ｍ１１７２６、Ｍ１５７８８、Ｘ００４９１に見出されうる。適当なＰＹＹ遺伝子配列は、遺伝子バンク、例えばＰＹＹのためのＵｎｉｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ（Ｈｓ．１６９２４９）、Ｕｎｉｇｅｎｅ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＭ＿００４１６０、ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡｓ：ＮＭ＿００４１６０、ＭＩＰＳアセンブリー：Ｈ３０７１０Ｓ１、Ｈ３０７１０Ｓ２、ＤＯＴＳアセンブリー：ＤＴ．４５２１１８、ＤＴ．８７０４６２７３および追加の遺伝子／ｃＤＮＡ配列：ＢＣ０４１０５７、Ｄ１３８９７、Ｄ１３８９９、Ｄ１３９０２、Ｌ２５６４８．１に見出されうる。適当なＧＩＰ遺伝子配列は、遺伝子バンク、例えばＧＩＰのためのＵｎｉｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ（Ｈｓ．１４５４）、ｍＲＮＡｓ：ＮＭ＿００４１２３に見出されうる。
【００４７】
ＰＰＹポリペプチドは、上記に開示されたＰＰＹ遺伝子によりコードされたいかなるタンパク質またはポリペプチドも意味する。ＰＹＹポリペプチドは、上記に開示されたＰＹＹ遺伝子によりコードされたいかなるタンパク質またはポリペプチドも意味する。ＧＩＰポリペプチドは、上記に開示されたＧＩＰ遺伝子によりコードされたいかなるタンパク質またはポリペプチドも意味する。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のストレッチを含むいかなる分子も指す。この用語は、種々の長さの分子、例えばペプチドおよびタンパク質を含む。ポリペプチドは、例えば、グリコシル化および／またはアセチル化および／または化学反応もしくはカップリングにより修飾することができ、そして１つ又は複数の非天然または合成アミノ酸を含有することができる。
【００４８】
ＰＹＹ、ＰＰＹまたはＧＩＰ遺伝子の断片は、上記した配列の少なくとも約８の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５、更に好ましくは少なくとも約２０のヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも３０の連続したヌクレオチドの任意の部分を意味する。断片は、８〜１００ヌクレオチド好ましくは１５〜１００、更に好ましくは２０〜１００ヌクレオチドのすべての可能なヌクレオチド長さを含む。
【００４９】
典型的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、３０℃以上、好ましくは３５℃以上、更に好ましくは４２℃以上の温度および／または約５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満の塩度を含む。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩度および／またはＳＤＳ、ＳＳＣなどの他の試薬の濃度を修飾することにより当業者によって調節されうる。
【００５０】
診断
本発明は、被検体におけるＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の監視に基づく診断方法を今や提供する。本発明の状況内では、用語「診断」は、成人、子供および生まれる前における早期段階、前兆段階および後期段階を含む種々の段階での検出、監視、投薬、比較等を含む。診断は、典型的には、予後、発生の素因もしくは危険の評価又は保護の評価、最も適切な処置を規定するための被検体の特徴付け（薬理遺伝学）等を含む。
【００５１】
本発明の特定の目的は、被検体における肥満または関連した障害の存在または素因を検出する方法であって、（ｉ）被検体からのサンプルを提供し、そして（ｉｉ）該サンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む方法にある。特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００５２】
本発明の更なる目的は、被検体における肥満または関連した障害の存在または素因を検出する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が肥満または関連した障害の存在又は素因を示す、方法にある。特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００５３】
本発明の他の特定の目的は、被検体における肥満または関連した障害からの保護を検出する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が肥満または関連した障害からの保護を示す、方法にある。特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００５４】
好ましい態様では、該変化は肥満と関連した１つ又は複数のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである。更に好ましくは、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む。特定の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６（ハプロタイプ４−５−６）を含むかまたはＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６（ハプロタイプ４−５−６）からなる。場合により、ハプロタイプ４−５−６は、ＳＮＰ７及びＳＮＰ８を更に含むことができる。別の態様では肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７（ハプロタイプ５−６−７）を含むか又はＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７（ハプロタイプ５−６−７）からなる。場合により、ハプロタイプ５−６−７は、ＳＮＰ４および／またはＳＮＰ８を更に含むことができる。追加の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、またはＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むか又はＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、またはＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる。場合により、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むかまたはＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる。更に好ましくは、肥満と関連した該ＳＮＰは、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれることができる。なお更に好ましくは、肥満と関連した該ＳＮＰは、ＳＮＰ７またはＳＮＰ８であることができる。更なる態様では、肥満と各々独立に関連した該単一のＳＮＰは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１でもある。
【００５５】
本発明の他の特定の目的は、肥満または関連した障害の処置に対する被検体の応答を評価する方法であって、（ｉ）被検体からのサンプルを提供し、そして（ｉｉ）該サンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む方法にある。特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００５６】
本発明の更なる目的は、被検体における肥満または関連した障害の処置に対する被検体の応答を評価する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が該処置に対する特定の応答を示す、方法にある。特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００５７】
好ましい態様では、該変化は肥満と関連した１つ又は複数のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである。更に好ましくは、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む。特定の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６（ハプロタイプ４−５−６）を含むかまたはＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６（ハプロタイプ４−５−６）からなる。場合により、ハプロタイプ４−５−６は、ＳＮＰ７及びＳＮＰ８を更に含むことができる。別の態様では肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７（ハプロタイプ５−６−７）を含むか又はＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７（ハプロタイプ５−６−７）からなる。場合により、ハプロタイプ５−６−７は、ＳＮＰ４および／またはＳＮＰ８を更に含むことができる。追加の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、またはＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むか又はＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、またはＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる。場合により、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むかまたはＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる。更に好ましくは、肥満と関連した該ＳＮＰは、ＳＮＰ７またはＳＮＰ８であることができる。更なる態様では、肥満と各々独立に関連した該単一のＳＮＰは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１でもある。
【００５８】
本発明は、肥満または関連した障害の処置の有効性を決定する方法であって、（ｉ）該処置期間中又は該処置の後に被検体からのサンプルを提供し、そして（ｉｉ）該サンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の状態を決定しそして（ｉｉｉ）該ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の状態を、処置の前または処置のより早期の段階の該被検体からのサンプル中の基準ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の状態と比較することを含む方法にある。特定の態様では、この方法は、（ｉｉ）該サンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座の状態を決定しそして（ｉｉｉ）該ＰＰＹおよび／または、ＰＹＹ遺伝子座の状態を、処置の前または処置のより早期の段階の該被検体からのサンプル中の基準ＰＰＹ、および／またはＰＹＹ遺伝子座の状態と比較することを含む。他の特定の態様では、この方法は、（ｉｉ）該サンプル中のＧＩＰ遺伝子座の状態を決定しそして（ｉｉｉ）該ＧＩＰ遺伝子座の状態を、処置の前または処置のより早期の段階の該被検体からのサンプル中の基準ＧＩＰ遺伝子座の状態と比較することを含む。
【００５９】
追加の態様では、本発明は、被検体における肥満または関連した障害を予防するための方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在は、肥満または関連した障害の素因を示し、そして肥満または関連した障害に対する予防処置を行うことを含む方法に関する。該予防処置は、薬物および／または食事の投与であることができる。特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００６０】
ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化は、該座のコード領域および／または非コード領域における、単独または種々の組み合わせの、突然変異、欠失、転移および／または挿入のいかなる形態であってもよい。突然変異は更に具体的には、点突然変異を含む。欠失は、遺伝子座のコード部分または非コード部分における２個以上の残基、例えば２個の残基から全体の遺伝子または遺伝子座までのいかなる領域も包含することができる。典型的な欠失は、より小さな領域、例えば約５０未満の連続した塩基対のドメイン（イントロン）、繰り返し配列または断片に影響を与えるが、より大きな欠失も起こりうる。挿入は、遺伝子座のコード領域または非コード領域における１個または複数の残基の付加を包含することができる。挿入は、典型的には遺伝子座における１〜５０塩基対の付加を含むことができる。転移は、配列の逆転又はトランスロケーションを含む。ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座変化は停止コドンの創生、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、特定のＲＮＡスプライシングもしくはプロセッシング、産物不安定性、トランケートされたポリペプチド産生等をもたらすことがある。この変化は、変化した機能、安定性、ターゲッティングまたは構造を有するＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチドの産生をもたらすことがある。変化はタンパク質発現の減少又は替わりに該産生の増加を引き起こすこともある。
【００６１】
本発明に従う方法の特定の態様では、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化は、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子または対応する発現産物における点突然変異、欠失および挿入から選ばれ、更に好ましくは点突然変異および欠失から選ばれる。変化は、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ ｇＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで決定されうる。
【００６２】
この点について、本発明は、肥満と関連しているＰＰＹ遺伝子、ＰＹＹ遺伝子およびＧＩＰ遺伝子を含むゲノム領域に位置したいくつかのＳＮＰを今や開示する。示されたヌクレオチド位置はＮＣＢＩから得られたＢｕｉｌｄ３４の最近の配列に基づいている。これらの点突然変異（または単一ヌクレオチド変化）は下記の表２に報告される。
【００６３】
【表２】
【００６４】
これらの点突然変異は、肥満を有する被検体において検出された。ハプロタイプは、
ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１について構築されて、各可能なＳＮＰ組み合わせについて天然に生じるフェイズ（ｐｈａｓｅ）を決定した。次いでこれらのハプロタイプを使用して、個々の対立遺伝子および肥満の組み合わせに由来するすべての得られるハプロタイプ間の関連について試験した。結果は、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６；またはＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７；またはＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８；またはＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８；ＳＮＰ９およびＳＮＰ１０；またはＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１；またはＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１（上記表２参照）を含むハプロタイプが肥満と関連していたことを示す（表５および６）。
【００６５】
更に、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８は、肥満との関連について各々独立に試験された。結果は、両ＳＮＰ（上記表２参照）は、肥満と各々独立に関連している（テキストで説明される）ことを示す。同様に、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１は、肥満と各々独立に関連している（表４）。
【００６６】
第１変異体においては、本発明の方法は、変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子配列の存在を検出することを含む。これは、例えば、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子、ポリペプチド又はＲＮＡのすべてまたは一部を配列決定すること、選択的ハイブリダイゼーション又は選択的増幅により行うことができる。
【００６７】
更に特定の態様は、被検体のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子配列を含むゲノム領域における表２に開示されたＳＮＰの存在を検出することを含む。
【００６８】
他の変異体では、本方法は変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ ＲＮＡ発現の存在を検出することを含む。変化したＲＮＡ発現は、変化したＲＮＡ配列の存在、変化したＲＮＡスプライシングもしくはプロセッシングの存在、変化した量のＲＮＡの存在等を含む。これらは、例えば、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ ＲＮＡのすべてもしくは一部を配列決定決定することまたは該ＲＮＡのすべてもしくは一部の選択的ハイブリダイゼーション又は選択的増幅によること含む、当該技術分野で知られた種々の技術により検出することができる。
【００６９】
更なる変法では、本方法は、変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチド発現の存在を検出することを含む。変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチド発現は、変化したポリペプチド配列の存在、変化した量のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチドの存在、変化した組織分布の存在等を含む。これらは、例えば、配列決定することおよび／または特異的リガンドに結合すること（例えば抗体）によることを含む、当技術分野で知られた種々の技術により検出することができる。
【００７０】
上記したとおり、配列決定、ハイブリダイゼーション、増幅および／または特異的リガンドへの結合（例えば抗体）を含む当該技術分野で知られた種々の技術を使用して、変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子又はＲＮＡ発現もしくは配列を検出または定量することができる。他の適当な方法は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、対立遺伝子特異的増幅、サザーンブロット（ＤＮＡについて）、ノーザンブロット（ＲＮＡについて）、一本鎖コンフォーメーション分析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ゲルマイグレーション（ｇｅｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、クランプド変性ゲル電気泳動、ヘテロ二本鎖分析、ＲＮアーゼ保護、化学ミスマッチ開裂、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を含む。
【００７１】
これらのアプローチのいくらか（例えば、ＳＳＣＡおよびＣＧＧＥ）は、変化した配列決定の存在の結果として、核酸の電気泳動移動度が変化することに基づいている。これらの技術に従えば、変化した配列は、ゲルでの移動度のシフトにより可視化される。次いで断片を配列決定して変化を確認することができる。
【００７２】
いくらかの他の方法は、被検体からの核酸と、野生型または変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡに特異的なプローブとの特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。プローブは懸濁しているかまたは基材上に固定化されることができる。プローブは、典型的には標識されてハイブリッドの検出を促進する。
【００７３】
これらのアプローチのいくらか、例えばノーザンブロット、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡは、ポリペプチド配列または発現レベルを評価するのに特に適している。これらの後者はポリペプチドに特異的なリガンド、更に好ましくは特異的抗体の使用を必要とする。
【００７４】
特定の好ましい態様では、本方法は、被検体からのサンプルにおける変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子発現プロフィルの存在を検出することを含む。示されたとおり、これは、更に好ましくは、該サンプル中に存在する核酸の配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅により達成することができる。
【００７５】
配列決定
配列決定は、自動シーケンサーを使用して当技術分野で周知された技術を使用して行うことができる。配列決定は、完全なＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子で行うことができ、又は更に好ましくは、その特定のドメイン、典型的には有害な突然変異または他の変化を有することが知られているかあるいは有害な突然変異または他の変化を有する疑いのあるその特定のドメインに関して行うことができる。
【００７６】
増幅
増幅は、核酸再生を開始するのに役立つ相補性核酸配列間の特定のハイブリッドの形成に基づいている。
【００７７】
増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列をベースとする増幅（ＮＡＳＢＡ）などの当該技術分野で知られた種々の技術に従って行うことができる。これらの技術は、商業的に入手可能な試薬およびプロトコールを使用して行うことができる。好ましい技術は、対立遺伝子特異的ＰＣＲまたはＰＣＲ−ＳＳＣＰを使用する。増幅は、反応を開始するために、通常特異的核酸プライマー使用を必要とする。
【００７８】
これに関して、本発明の特定の目的は、周囲の領域を含むＰＰＹ遺伝子または遺伝子座からの配列を増幅するために有用な核酸プライマーにある。このようなプライマーは、好ましくは、ＰＰＹ遺伝子座における核酸配列に対して好ましくは相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする。特定のプライマーは、該遺伝子座の標的領域にフランキングするＰＰＹ遺伝子座の一部と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、該標的領域は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している。このような標的領域の例は上記表２において与えられる。
【００７９】
本発明の他の特定の目的は、周囲の領域を含むＰＹＹ遺伝子又は遺伝子座から配列を増幅するために有用な核酸プライマーにある。このようなプライマーは、ＰＹＹ遺伝子座における核酸配列に対して好ましくは相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする。特定のプライマーは、該遺伝子座の標的領域にフランキングするＰＹＹ遺伝子座の一部と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、該標的領域は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している。このような標的領域の例は上記表２において与えられる。
【００８０】
本発明の追加の特定の目的は、周囲の領域を含むＧＩＰ遺伝子または遺伝子座からの配列を増幅するために有用な核酸プライマーにある。このようなプライマーは、好ましくは、ＧＩＰ遺伝子座における核酸配列に対して好ましくは相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする。特定のプライマーは、該遺伝子座の標的領域にフランキングするＧＩＰ遺伝子座の一部と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、該標的領域は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している。このような標的領域の例は上記表２に示される。
【００８１】
更に特定の態様では、本発明は、ＰＰＹコード配列（例えば遺伝子またはＲＮＡ）の一部に対して相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする核酸プライマーであって、該一部は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している、核酸プライマーに関する。これに関して、本発明の特定のプライマーは、ＰＰＹ遺伝子またはＲＮＡにおける変化した配列に対して特異的である。このようなプライマーを使用することにより、増幅産物の検出は、ＰＰＹ遺伝子座における変化の存在を示す。対照的に、増幅産物の不存在は、特異的変化がサンプルにおいて存在しないことを示す。
【００８２】
更に特定の態様では、本発明は、ＰＹＹコード配列（例えば遺伝子またはＲＮＡ）の一部に対して相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする核酸プライマーであって、該一部は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している、核酸プライマーにも関する。これに関して、本発明の特定のプライマーは、ＰＹＹ遺伝子またはＲＮＡにおける変化した配列に対して特異的である。このようなプライマーを使用することにより、増幅産物の検出は、ＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を示す。対照的に、増幅産物の不存在は、特異的変化がサンプルにおいて存在しないことを示す。
【００８３】
更に特定の態様では、本発明は、ＧＩＰコード配列（例えば遺伝子またはＲＮＡ）の一部に対して相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする核酸プライマーであって、該一部は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している、核酸プライマーにも関する。これに関して、本発明の特定のプライマーは、ＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡにおける変化した配列に対して特異的である。このようなプライマーを使用することにより、増幅産物の検出は、ＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を示す。対照的に、増幅産物の不存在は、特異的変化がサンプルにおいて存在しないことを示す。
【００８４】
本発明の更なる局面は、センスプライマーおよびリバースプライマーを含む核酸プライマーの対であって、該センスプライマーおよびリバースプライマーは、ＰＰＹ遺伝子もしくはＲＮＡまたはその標的領域を特異的に増幅し、該標的領域は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している、核酸プライマーの対に関する。
【００８５】
本発明の更なる局面は、センスプライマーおよびリバースプライマーを含む核酸プライマーの対であって、該センスプライマーおよびリバースプライマーは、ＰＹＹ遺伝子もしくはＲＮＡまたはその標的領域を特異的に増幅し、該標的領域は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している、核酸プライマーの対に関する。
【００８６】
本発明の更なる局面は、センスプライマーおよびリバースプライマーを含む核酸プライマーの対であって、該センスプライマーおよびリバースプライマーは、ＧＩＰ遺伝子もしくはＲＮＡまたはその標的領域を特異的に増幅し、該標的領域は肥満または関連した障害を有すある種の被検体において変化している、核酸プライマーの対に関する。
【００８７】
本発明の典型的なプライマーは、長さが約５〜６０ヌクレオチド、更に好ましくは長さが約８〜約２５ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。この配列は、それぞれ、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の配列に直接由来することができる。完全な相補性は、高い特異性を確実にするのに好ましい。しかしながら、ある種のミスマッチは許容されうる。
【００８８】
選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション検出法は、核酸配列変化を検出するのに役立つ相補性核酸配列間の特異的ハブリッドの形成に基づいている。
【００８９】
特定の検出技術は、野生型または変化したＰＰＹ遺伝子またはＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用、および／または野生型または変化したＰＰＹ遺伝子またはＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用、および／または野生型または変化したＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用、次いでハイブリッドの存在の検出を含む。プローブは、懸濁していてもよく又は基材もしくは支持体に固定化されていてもよい（核酸アレー又はチップ技術におけるように）。プローブは典型的には標識されてハイブリッドの検出を促進する。
【００９０】
この点で、本発明の特定の態様は、被検体からのサンプルを、変化したＰＰＹ遺伝子座に特異的な核酸プローブと接触させること、および／または被検体からのサンプルを変化したＰＹＹ遺伝子座に特異的な核酸プローブと接触させること、および／または被検体からのサンプルを変化したＧＩＰ遺伝子座に特異的な核酸プローブと接触させること、およびハイブリッドの形成を評価することを含む。特定の好ましい態様では、本方法は、前記サンプルを、それぞれ、野生型ＰＰＹ遺伝子座およびその種々の変化した形態に対して特異的なプローブのセットと同時に接触させることを含む。特定の好ましい態様では、本方法は、前記サンプルを、それぞれ、野生型ＰＹＹおよびその種々の変化した形態に対して特異的なプローブのセットと同時に接触させることも含む。特定の好ましい態様では、本方法は、前記サンプルを、それぞれ、野生型ＧＩＰおよびその種々の変化した形態に対して特異的なプローブのセットと同時に接触させることも含む。この態様では、サンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における種々の形態の変化の存在を直接検出することが可能である。また、種々の被検体からの種々のサンプルを平行して処理することができる。
【００９１】
本発明の更なる特定の目的は、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡに対して特異的な核酸プローブにある。本発明の状況内では、プローブは、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡ（の標的部分）に対して相補性でありそしてＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡ（の標的部分）と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、そして肥満または代謝障害の傾向を与えるか、肥満又は代謝障害に対して保護するかまたは肥満または代謝障害と関連しているＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ対立遺伝子と関連したポリヌクレオチド多型を検出するのに適当なポリヌクレオチド配列を指す。プローブは、好ましくは、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子、ＲＮＡまたはその標的部分に対して完全に相補性である。プローブは、典型的には、長さが８〜１０００ヌクレオチド、例えば１０〜８００、更に好ましくは１５〜７００、典型的には、２０〜５００ヌクレオチドの一本鎖核酸含む。より長いプローブも使用することができることは理解されるべきである。本発明の好ましいプローブは、変化を有するＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡの領域に特異的にハイブリダイゼーションすることができる、長さが８〜５００ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。
【００９２】
本発明の特定の態様は、変化した（例えば突然変異した）ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡに対して特異的な核酸プローブ、即ち、該変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡに対して特異的にハイブリダイゼーションしそして該変化を欠いているＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡに対して本質的に特異的にハイブリダイゼーションしない核酸プローブである。特異性は、標的配列へのハイブリダイゼーションが、非特異的ハイブリダイゼーションによって発生するシグナルとは区別されうる特異的シグナルを発生することを示す。完全に相補性の配列は、本発明に従うプローブをデザインするのに好ましい。しかしながら、特異的シグナルが非特異的ハイブリダイゼーションから識別されうる限りは、ある種のミスマッチは許容されうることは理解されるべきである。
【００９３】
このようなプローブの特定の例は、上記表２にリストされた点突然変異を有するＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡを含むゲノム領域の標的部分に対して相補性の核酸配列である。更に具体的には、プローブは、配列番号１〜８からなる群より選ばれる配列又はＳＮＰを含むその断片又はその相補性配列を含むことができる。
【００９４】
プローブの配列は、本願で提供されたＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡの配列に由来することができる。ヌクレオチド置換を行うことができ、そしてプローブの化学修飾も行うことができる。このような化学修飾は、ハイブリッドの安定性を増加させるため（例えばインターカレーション基）又はプローブを標識するために達成することができる。標識の典型的な例は、放射能、螢光、ルミネッセンス、酵素標識等を含むがそれらに限定されるわけではない。
【００９５】
特異的リガンド結合
上記したとおり、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰ遺伝子座における変化は、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチド配列または発現レベルの変化についてスクリーニングすることにより検出することもできる。この点で、本発明の特定の態様は、前記サンプルをＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチドに対して特異的なリガンドと接触させそして複合体の形成を決定することを含む。
【００９６】
特異的抗体などの異なるタイプのリガンドを使用することができる。特定の態様では、サンプルを、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドに対して特異的な抗体と接触させ、そして免疫複合体の形成を決定する。免疫複合体を検出するための種々の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡＳ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を使用することができる。
【００９７】
本発明の状況内では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および実質的に同じ抗原特異性を有するその断片又は誘導体を意味する。断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ領域等を含む。誘導体は、一本鎖抗体、ヒトに適合させた抗体、多官能性抗体等を含む。
【００９８】
ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドに対して特異的な抗体は、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドに対して選択的に結合する抗体、即ち、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドあるいはそのエピトープ含有断片に対して生じた抗体を意味する。他の抗原に対する非特異的な結合が起こりうるけれども、標的ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドへの結合がより高いアフイニティーで起こり、そして非特異的結合から信頼可能に識別することができる。好ましい抗体は、野生型ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチド、またはその特定の変化した形態に対して特異的である。本発明の好ましい態様は、変化した形態のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチド、例えば突然変異した、トランケーションされた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）又は伸張したポリペプチドに対して特異的な抗体を使用する。特に、変化したＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドは、コード領域のフレームシフト突然変異から生じる特異的ドメインを含むことができる。該ドメインに対して特異的に抗体は、サンプルにおけるこのような変化したポリペプチドの存在の検出を可能とする。リガンドは、可溶性形態で使用することができ、又は表面または支持体上にコーティングされていてもよい。
【００９９】
特定の態様では、本方法は、被検体からのサンプルを、変化した形態のＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドに対して特異的な抗体（でコーティングされた支持体）と接触させ、そして免疫複合体の存在を決定することを含む。特定の態様では、サンプルを、異なる形態のＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチド、例えば野生型およびその種々の変化し形態に対して特異的な種々の抗体（でコーティングされた支持体）と同時に、平行して又は順次に接触させることができる。
【０１００】
診断方法は、インビトロ、エクスビボ又はインビボ、好ましくはインビボまたはエクスビボで行うことができる。診断方法では被検体からのサンプルを使用して、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の状態を評価することができる。サンプルは、核酸又はポリペプチドを含有する、被検体に由来するいかなる生物学的サンプルであってもよい。このようなサンプルの例は、体液、組織、細胞サンプル、器官、生検等を含む。最も好ましいサンプルは、血液、血漿、唾液、尿、精液等である。例えば、胎児細胞または胎盤細胞を試験することにより、出生前診断を行うこともできる。サンプルは、慣用の方法により集めることができ、そして診断のために直接使用するか又は保存することができる。サンプルは、試験のための核酸またはポリペプチドの効用（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を与えるか又は改善するために、本方法を行う前に処理することができる。処理は、例えば、ライシス（ｌｙｓｉｓ）（例えば、機械的、物理的、化学的等）、遠心等を含む。核酸および／またはポリペプチドは、慣用の技術により予備精製するか又は濃縮することができおよび／または複雑性を減少させることができる。核酸およびポリペプチドは酵素又は他の化学的処理または物理的処理により処理してその断片を生成させることもできる。請求された方法の高い感度を考えると、非常に少ない量のサンプルがアッセイを行うのに十分である。
【０１０１】
示されたとおり、好ましくは、変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の存在を評価するために、サンプルを、プローブ、プライマーまたはリガンドなどの試薬と接触させる。接触は、プレート、管、ウエル、ガラス等などの任意の適当な装置において行うことができる。特定の態様では、接触は、核酸アレー又は特異的リガンドアレーなどの試薬でコーティングされた基材上で行われる。基材は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマー等を含む任意の支持体などの固体または半固体基材であることができる。基材は、種々の形態およびサイズ、例えば、スライド、膜、ビーズ、カラム、ゲル等であることができる。接触は、試薬とサンプルの核酸またはポリペプチド間で複合体が形成されるのに適当な条件下に行うことができる。
【０１０２】
サンプルにおける変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチド、ＲＮＡまたはＤＮＡの発見は、被検体における変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の存在を示し、これは肥満または代謝障害の存在、素因又は進行の段階と相関することができる。例えば、生殖細胞系列ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ突然変異を有する個体は、肥満または代謝障害の発生の増加した危険を有する。被検体における変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の存在の決定は、より効果的でそして特注される適切な治療介入のデザインも可能とする。また前兆レベルでのこの決定は、予防法を適用することを可能とする。
【０１０３】
連鎖不平衡
一旦第１ＳＮＰが関心のあるゲノム領域、特にＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座において同定されると、当業者は、この第１ＳＮＰと連鎖不平衡にある追加のＳＮＰを容易に同定することができる。実際、肥満または関連した障害と関連した第１ＳＮＰと連鎖不平衡にあるいかなるＳＮＰもこの特質と関連するであろう。従って、所与のＳＮＰと肥満または関連した障害との間で関連が一旦証明されると、この特質と関連した追加のＳＮＰの発見は、この特定の領域におけるＳＮＰの密度を増加させるために大いに興味を引くことができる。
【０１０４】
所与のＳＮＰと連鎖不平衡にある追加のＳＮＰの同定は、（ａ）複数の個体からの第１ＳＮＰを含むまたは取り囲むゲノム領域からの断片を増幅し；（ｂ）該第１ＳＮＰを有する又は取り囲むゲノム領域における第２ＳＮＰを同定し；（ｃ）該第１ＳＮＰと第２ＳＮＰとの連鎖不平衡分析を行い；そして（ｄ）該第１マーカーと連鎖不平衡にある該第２ＳＮＰを選ぶことを含む。段階（ｂ）および（ｃ）を含む副組み合わせも意図する。
【０１０５】
ＳＮＰを同定しそして連鎖不平衡分析を行うための方法は、周知の方法を使用することにより過度の実験をすることなく当業者により行われうる。
【０１０６】
連鎖不平衡にあるこれらのＳＮＰも、本発明に従う方法、更に詳しくは本発明に従う診断方法において使用することができる。
【０１０７】
例えば、クローン病の連鎖座（ｌｉｎｋａｇｅ ｌｏｃｕｓ）は、染色体５ｑ３１上の１８ｃＭにわたる大きな領域に対してマッピングされた（Ｒｉｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０００及び２００１）。全体の領域にわたるマイクロサテライトマーカーおよびＳＮＰの密なマップを使用して、連鎖不平衡（ＬＤ）の強い証拠が見出された。ＬＤの証拠を見出したので、著者は、超高密度ＳＮＰマップを開発し、そしてこのマップから選ばれるマーカーのより密なコレクションを調べた。多重座分析は、ＴＤＴを使用して各々独立に関連している多重ＳＮＰにより特徴付けられた単一コモンリスクハプロタイプ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｍｍｏｎ ｒｉｓｋ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）を規定した。これらのＳＮＰは、リスクハプロタイプに独特でありそして、互いに殆ど完全な連鎖不平衡にあることによりそれらの情報内容において本質的に同一であった。これらのＳＮＰの同等な性質は、遺伝的証拠のみに基づいてこの領域内の原因突然変異を同定することを不可能とする。
【０１０８】
原因突然変異
肥満又は関連した障害を示す患者および対照個体からのＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子の配列を比較することにより、肥満又は関連した障害の原因となりうるＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子における突然変異を同定することができる。ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰと肥満又は関連した障害との同定された関連に基づいて、同定された座位を突然変異についてスキャンすることができる。好ましい態様では、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子のエキソンおよびスプライス部位、プロモーターおよび他の調節領域などの機能的領域を突然変異についてスキャンする。好ましくは、肥満または関連した障害を示す患者は、肥満又は関連した障害と関連していることが示された突然変異を有し、そして対照個体は肥満又は関連した障害と関連した突然変異又は対立遺伝子を有していない。肥満または関連した障害を示す患者は、対照個体よりも高い頻度で肥満または関連した障害と関連していることが示された突然変異を有することも可能でありうる。
【０１０９】
このような突然変異を検出するのに使用される方法は、一般に下記の段階を一般に含む：肥満又は関連した障害を示す患者および対照個体からのＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子のＤＮＡサンプルから、肥満または関連した障害と関連したＳＮＰ又はＳＮＰの群を含むＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子の領域を増幅する段階；増幅された領域の配列決定をする段階；肥満又は関連した障害を示す患者および対照個体からのＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子のＤＮＡ配列を比較する段階；肥満または関連した障害を示す患者に特異的な突然変異を決定する段階。
【０１１０】
従って、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子における原因突然変異の同定は、周知の方法を使用することにより過度の実験をすることなく当業者により行われうる。
【０１１１】
例えば、原因突然変異は、ルーチンな方法を使用することにより下記の実施例で同定された。
【０１１２】
Ｈｕｇｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）は、クローン病に対する感受性に連鎖していることが以前に見出された染色体１６の領域におけるクローン病に対する感受性を有する遺伝子変異体を同定するためにポジショナルクローニングストラテジーを適用した。潜在的感受性座の位置を精密化するために、２６のマイクロサテライトマーカーをジェノタイピングしそして伝達不平衡テストを使用してクローン病に対する関連について試験した。ボーダーラインの有意な関連がマイクロサテライトマーカーＤ１６Ｓ１３６の１つの対立遺伝子の間で見出された。１１の追加のＳＮＰが周囲の領域から選ばれ、そしていくつかのＳＮＰは、有意な関連を示した。この領域からのＳＮＰ５〜８は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の単一のエキソンに存在することが見出されそして非同義変異体（ｎｏｎ−ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔｓ）であることが示された。これは、著者に５０人のＣＤ患者におけるこの遺伝子の完全なコード配列の配列決定をすることを促した。２つの追加の非同義的突然変異（ＳＮＰ１２およびＳＮＰ１３）が見出された。ＳＮＰ１３は、家系伝達不平衡テスト（ｐｅｄｉｇｒｅｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｔｅｓｔ）を使用して最も有意に関連していた（ｐ＝６×１０−６）。他の独立した研究では、同じ変異体が４人の対照と比較して１２人の罹患個体（ａｆｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）からのこの遺伝子のコード領域を配列決定することによっても見出された（Ｏｇｕｒａ ｅｔ ａｌ，ｍ ２００１）。ＳＮＰ１３の低頻度対立遺伝子（ｒａｒｅ ａｌｌｅｌｅ）はＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質をトランケートすることが予測された１ｂｐ挿入に対応していた。この対立遺伝子は、対照に比べて有意により低い頻度ではあるが、健常な個体にも存在していた。
【０１１３】
同様に、Ｌｅｓａｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）は、１６６人の散発性症例（ｓｐｏｒａｄｉｃ ｃａｓｅｓ）および２８７の家族性症例（ｆａｍｉｌｉａｌ ｃａｓｅｓ）を含むＣＤを有する４５３人の患者、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を有する１５９人の患者および１０３人の健康な対照被検体におけるＣＡＲＤ１５の突然変異分析を、コード領域の系統的配列決定により行った。同定された６７の配列変異のうち、９つはＣＤを有する患者において＞５％の対立遺伝子頻度を有していた。それらのうち６つは多型であると考えられ、そして３つ（ＳＮＰ１２−Ｒ７０２Ｗ、ＳＮＰ８−Ｇ９０８ＲおよびＳＮＰ１３−１００７ｆｓ）はＣＤに対する感受性と独立に関連していることが確認された。２７の低頻度の追加の突然変異も潜在的疾患原因突然変異（ＤＣＭｓ）であると考えられた。上記３つの主な変異体（Ｒ７０２Ｗ、Ｇ９０８Ｒおよび１００７ｆｓ）は、それぞれ、全ＣＤ突然変異の３２％、１８％および３１％を示し、これに対して、２７の低頻度突然変異の総計はＤＣＭｓの１９％を示した。要するに、突然変異の９３％は遺伝子の遠位３分の１（ｄｉｓｔａｌ ｔｈｉｒｄ）に位置していた。突然変異はＵＣと関連していることは見出されなかった。対照的に、二重突然変異を有する１７％を含めて、ＣＤを有する患者の５０％は、少なくとも１つのＤＣＭを有していた。
【０１１４】
本発明の更なる局面および利点を下記の実施例に開示する。これらは本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。
【０１１５】
実施例
１．ヒト染色体１７上の肥満感受性座の同定
Ａ．染色体１７感受性遺伝子を同定するためのＧｅｎｏｍｅＨＩＰプラットフォーム
２つの肥満感受性遺伝子の迅速な同定を可能とするためにＧｅｎｏｍｅＨＩＰプラットフォームを適用した。
【０１１６】
簡単に言えば、この技術は、関連した個体のＤＮＡからペアーを形成することからなる。各ＤＮＡを、その同定を可能とする特異的標識で標識する。次いで２つのＤＮＡ間でハイブリッドを形成する。次いで多段階手順で２つのＤＮＡからすべての同祖（ＩＢＤ）断片を選ぶ特定の方法（ＷＯ００／５３８０２）を適用する。次いで残りのＩＢＤに富んだＤＮＡを染色体上のＩＢＤフラクションのポジショニングを可能とするＢＡＣクローン由来のＤＮＡマイクロアレーに対してスコア化する。
【０１１７】
多くの異なる家族に対してこの方法を適用すると、各家族からの各ペアーについてＩＢＤフラクションのマトリックスが得られる。次いで統計的解析により、試験されるすべての家族間で共有される最小ＩＢＤ領域を計算する。有意な結果（ｐ値）は、関心のある特質（ここでは肥満）を有するボジティブ領域の連鎖の証拠である。連鎖した間隔（ｌｉｎｋｅｄ ｉｎｔｅｒｖａｌ）は、有意なｐ値を示す２つの最も遠く離れたクローンにより限界を定められうる。
【０１１８】
この研究では、甚だしい肥満（＞９０ｔｈパーセンタイルのボディマスインデックスにより定義された）に合致したドイツ起源の（１７８の独立した同胞ペアー）の１６４家族を、ＧｅｎｏｍｅＨＩＰプロセスに供した。次いで、得られるＩＢＤに富んだＤＮＡフラクションを、Ｃｙ５蛍光染料で標識し、そして１．２メガ塩基対の平均間隔で全ヒトゲノムを包含する２２６３ＢＡＣクローンからなるＤＮＡアレーに対してハイブリダイズさせた。Ｃｙ３で標識された選ばれなかったＤＮＡを使用してシグナル値を正規化しそして各クローンについて割合を計算した。次いで割合の結果のクラスタリングを行って、各クローンおよびペアーについてＩＢＤ状態を決定した。
【０１１９】
この手順を適用することにより、染色体１７上で約５．３５メガ塩基領域（塩基４２２０００００〜４７５５００００）に及んでいる、肥満に対する連鎖の有意な（ｐ値＜２．２Ｅ−０５）または示唆的（ｐ値＜７．４Ｅ−０４）証拠を示す、いくつかのＢＡＣクローンを同定した（表３）。
【０１２０】
表３：ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰの領域における染色体１７についての連鎖結果：
連鎖の証拠を有する３つのＢＡＣクローンに相当する領域が示される。クローンの開始および停止位置は各々染色体の開始に対するＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ３４配列に基づくそれらのゲノム位置に対応する（ｐ−ｔｅｒ）。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】
Ｂ．染色体１７上の肥満感受性遺伝子の同定
上記した５．３５メガ塩基染色体領域をスクリーニングすることにより、我々は、肥満および関連した表現型のための候補として、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）および胃阻害ペプチド（ＧＩＰ）遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、上記表３に概説されたクローンにより限界を定められた連鎖の証拠を伴って、実際にクリティカルな間隔（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｖａｌ）で存在する。
【０１２３】
Ｈｏｒｔ等（１９９５）は、予測された９５アミノ酸配列ポリペプチドをコードするＰＰＹ遺伝子（ｍＲＮＡ ４２５ｂｐ）および予測された９７アミノ酸配列ポリペプチドをコードするＰＹＹ遺伝子（ｍＲＮＡ ５８２ｂｐ）は１７ｑ２１．１上で約１０ｋｂ離れて位置していることを示した。２つの遺伝子によりコードされたペプチド、それぞれ、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）およびペプチドＹＹ（ＰＹＹ）は、高い配列相同性を示すペプチドの神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）ファミリーに属する。３つの遺伝子間の配列比較に基づいて、ＮＰＹおよびＰＹＹは遺伝子重複事象の結果でありそしてその後のタンデム重複はＰＰＹ遺伝子を産生したことが結論された（Ｈｏｒｔ ｅｔ ａｌ． １９９５）。
【０１２４】
これらの３つの内在性ペプチドに対する異なるアフイニティーを有する多重受容体サブタイプが同定された。ＮＰＹおよびＰＹＹはＹ１、Ｙ２およびＹ５受容体に対して最も高いアフイニティーを有し、ＰＰはＹ４部位に対する内在性リガンドである（Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＰＹＹの別の内在性形態、ＰＹＹ（３−３６）は、主としてＮＰＹ発現ニューロン上に見いだされるシナプス前受容体であると考えられるＹ２部位に対する増加したアフイニティーを示す（Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【０１２５】
食物摂取におけるＰＰおよびＰＹＹの多重作用は、今やげっ歯類およびヒトにおいて記載されている。
【０１２６】
げっ歯類へのＰＰの末梢投与は、食物摂取を減少させることが示された（Ａｓａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＰＰの静脈内注入は、健康なボランティアにおいて食欲と食物摂取の両方の持続した減少を引き起こした（Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【０１２７】
Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（２００２）は、ラットにおけるＰＹＹ（３−３６）の末梢注射は食物摂取を抑制しそして体重増加を減少させることを示した。ＰＹＹ（３−３６）は、マウスにおいても食物摂取を抑制するが、Ｙ２ｒヌルマウスではそうではなく、これは食欲減退効果はＹ２受容体を必要とすること示唆する。ヒトでは、正常な食後の濃度のＰＹＹ（３−３６）の注入は食欲を有意に減少させそして２４時間にわたり食物摂取を３３％減少させた（Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００２）。従って、ＰＹＹ（３−３６）の食後の上昇は、弓状核Ｙ２Ｒを介して作用して、腸−視床下部経路における栄養補給（ｆｅｅｄｉｎｇ）を抑制することができる。
【０１２８】
更にＰＹＹは、視床下部における食欲回路をモジュレーションすることにより食物摂取を減少させる。Ｂａｔｔｅｒｈａｍ等（２００３）は、肥満した被検体はＰＹＹの食欲減退効果に対して抵抗性ではないことを見出した。内在性ＰＹＹレベルは、肥満した被検体において低かったが、これは、ＰＹＹ不足は肥満の発病学に寄与することができることを示唆する。
【０１２９】
グルコース依存性インスリン刺激性ポリペプチド（ＧＩＰ）としても知られている胃抑制ポリペプチドは、グルコースの存在下にインスリン分泌を刺激する４２アミノ酸ホルモンである。その配列は、それがセクレチン、グルカゴン、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドおよび成長ホルモン放出因子を含む構造的に関連したホルモンのファミリーのメンバーであることを示す。Ｔａｋｅｄａ等（１９８７）は、ヒトＧＩＰ前駆体をコードするｃＤＮＡクローンを単離しそして配列決定した。前駆体の予想されたアミノ酸配列はＧＩＰが１５３残基前駆体、プレプロＧＩＰのタンパク分解プロセッシングにより誘導されることを示す。ＧＩＰ部分は、それぞれ、そのアミノ末端およびカルボキシル末端で５１および６０アミノ酸のポリペプチドセグメントによりフランキングされている。ＧＩＰは、単一のアルギニン残基においてプロセッシングすることにより前駆体から放出される。
【０１３０】
Ｍｉｙａｗａｋｉ等（２００２）は、ＧＩＰを介する肥満促進の新規な経路を記載している。高脂肪食を与えられた野生型マウスは、ＧＩＰの分泌過剰およびインスリン抵抗を伴う過度の内臓および皮下脂肪堆積の両方を示した。対照的に、高脂肪食を与えられたＧＩＰ受容体を欠いているマウス（Ｇｉｐｒ（−／−）は、肥満およびインスリン抵抗性の両方から明らかに保護された。更に、Ｇｉｐｒ（−／−）マウスと肥満ｏｂ／ｏｂ（Ｌｅｐ（ｏｂ）／Ｌｅｐ（ｏｂ）マウスを交雑させることにより発生した二重ホモ接合マウス（ｄｏｕｂｌｅ−ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｍｉｃｅ）（Ｇｉｐｒ（−／−），Ｌｅｐ（ｏｂ）／Ｌｅｐ（ｏｂ））は、体重増加がより少なくそしてＬｅｐ（ｏｂ）／Ｌｅｐ（ｏｂ）マウスよりも低い脂肪症を有していた。Ｇｉｐｒ（−／−）マウスは、より低い呼吸商を有しておりそしてより好むエネルギー基質として脂肪を使用し、従って肥満に抵抗性であった。従って、ＧＩＰは、栄養過多を肥満に直接関連させそしてそれは抗肥満薬のための潜在力のある標的である。
【０１３１】
Ｓｉｒｉｎｅｋ等（１９８６）は、病的肥満のインスリン過剰症および胃バイパス後のその改善は、手術前のＧＩＰの顕著に高められたレベルおよびバイパス後のその減少した放出により引き起こされうることを示した。
【０１３２】
ＧＩＰは脂質生理学において役割を演じると思われそして増加した栄養ロードに応答する高められたレベルのＧＩＰは肥満と関連していたので、ＧＩＰ作用に対する拮抗が、肥満のための治療ストラテジーとして提唱された（Ｍｅｉｅｒ ａｎｄ Ｎｕｃｕｃｋ．，２００４）。
【０１３３】
ＧＩＰの異常な機能は、２型糖尿病とも関連していた。ＧＩＰは健康なヒトにおけるインスリン放出を強く刺激するが、このペプチドは、２型糖尿病を有する患者においてはそのインスン刺激性効果を殆ど完全に失った。
【０１３４】
Ｌｙｎｎ等（２００３）は、ＧＩＰ受容体（ＧＩＰＲ）は、膵島への脂肪酸負荷により正常血糖に制御されるが、しかしながら、高血糖状態にさらされると、ＧＩＰＲはダウンレギュレーションされ、これは２型糖尿病で観察されるＧＩＰに対する減少した応答に寄与しうる、という証拠を提示した。
【０１３５】
ＧＩＰのインスリン刺激性活性により、２型糖尿病の潜在力のある治療としてホルモンを利用する際に関心の相当な増加もあった。（Ｇａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【０１３６】
染色体１７での肥満に連鎖した遺伝子変化の限界的間隔におけるヒトＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子を同定する、本願で提供された連鎖結果を、食物摂取およびエネルギー消費の制御に関与するＮＰＹ／ＰＰシグナリング経路におけるＰＰＹおよびＰＹＹの関与および栄養過多におけるＧＩＰの関与と一緒に合わせて、本発明者は、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子又はその調節配列における変化（例えば突然変異および／または多形）は、ヒト肥満の発生に寄与することができそして診断のための新規な標的を表すことができると結論する。
【０１３７】
２．関連の研究
連鎖の研究のために使用された同じ家族を、伝達不平衡テスト（ＴＤＴ）を使用する問題の特定の表現型（ここでは肥満）と特異的マーカー対立遺伝子を含有する遺伝子マーカー対立遺伝子またはハプロタイプとの関連について試験するためにも使用した。ＴＤＴは強力な関連テストである。何故ならば、それは試験されたサンプルにおける集団層別化問題に感受性ではないからである。簡単に言えば、ヘテロ接合性両親からそれらの罹患した子孫への対立遺伝子の分離を試験する。非伝達対立遺伝子に比べて罹患子孫に伝達された対立遺伝子の部分を、無作為分布下に期待された割合と比較する。期待値を超える有意に過剰の対立遺伝子伝達は、それぞれの対立遺伝子またはハプロタイプの研究された肥満表現型との関連のための証拠である。
【０１３８】
この分析の結果は、ＧＩＰ遺伝子のある対立遺伝子は、肥満とポジティブに関連しており、従って疾患に対する感受性を増加させることを示す。試験された集団では、例えばＳＮＰ１０の対立遺伝子Ｃは、ＤＤＴにより決定されたとおり、肥満と相関している（ｐ値＝０．００７）。対照的に、ＳＮＰ１０の対立遺伝子Ｔは、自閉的個体（ａｕｔｉｓｔｉｃ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）に有意に低く伝達され（ｕｎｄｅｒｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ）、これは、この対立遺伝子が疾患から保護するのを助けることを示す。
【０１３９】
肥満と関連した他のＳＮＰは、表３において肥満患者への対立遺伝子の伝達の実施例に示されたＳＮＰ９を含む。
【０１４０】
肥満患者への対立遺伝子の伝達および非伝達の例を表４に示す。
【０１４１】
【表４】
【０１４２】
更に、ＳＮＰ４〜１１に対するハプロタイプを構築してすべてのＳＮＰについてフェイズを同定した。
【０１４３】
試験した集団におけるこの分析の結果は、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子のあるハプロタイプは肥満とポジティブに関連しており、従って疾患に対する感受性を増加させることを示した。他方、あるハプロタイプは、肥満患者に優先的に伝達されず、これは疾患から保護するのを助ける。肥満患者に優先的に伝達されるハプロタイプの例は、ＳＮＰ１０−ＳＮＰ１１に対するハプロタイプＣ−Ａ、ｐ＝０．００４、である。肥満患者に優先的に伝達されないハプロタイプの例は、ＳＮＰ１０−ＳＮＰ１１に対するハプロタイプＴ−Ｔ、ｐ＝０．００５、である。
【０１４４】
肥満患者への優先的に伝達されるハプロタイプおよび優先的に伝達されないハプロタイプの例を表５に示す。
【０１４５】
【表５】
【０１４６】
更に、極端な早期開始肥満（症例）を有する５６４個体および３２８の健康な個体（対照）を含む、独立した症例／対照関連研究を行って、マーカー対立遺伝子、ハプロタイプおよび／またはジェノタイプと肥満の関連を試験した。
【０１４７】
ＰＹＹおよびＰＰＹ遺伝子＋周囲の５’および３’領域を含む染色体領域を包含するＳＮＰ４〜８がこの研究においてジェノタイピングのために選ばれた。
【０１４８】
ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６に対するハプロタイプを構築して、ＰＨＡＳＥプログラム（バージョン：２．０；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）を使用してすべてのＳＮＰについてフェイズを同定した。患者におけるハプロタイプの分布を決定し、そして対照群におけるハプロタイプの分布と比較した。
【０１４９】
肥満患者と対照間のＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６のハプロタイプの分布の統計的分析は、肥満に対する相関（ｐ＝０．０２）を示した。表６に示されたとおり、ハプロタイプＧ−Ｇ−Ａ（２５．９％対２３．７４％）は、対照と比較して肥満固体（症例）においてより高い頻度で観察されたが、ハプロタイプＴ−Ａ−Ａ（５２．４８％対５４．０１）は、対照に比べて肥満患者において低く表現された（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）。
【０１５０】
【表６】
【０１５１】
ＳＮＰ７およびＳＮＰ８の対立遺伝子の分布を患者と対照間で各々独立に比較した。患者と対照における各ＳＮＰの対立遺伝子の分布に基づいて、オッズ比および対応する信頼区間を計算して関連の程度を測定した。１より大きいオッズ比は、試験した遺伝子マーカーが疾患と関連しており、従って疾患に対する感受性を増加させるであろうということを意味する。オッズ比が１より小さければネガティブな関連があり、そして試験した遺伝子マーカーは疾患から保護することを助ける。
【０１５２】
この分析の結果は、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８のある対立遺伝子は肥満と各々独立に関連していることを示す。対照と比較して患者においてＳＮＰ７の対立遺伝子Ｔのより高い頻度が観察されて（０．４２対０．３７）、対立遺伝子Ｃを有する個体に対する対立遺伝子Ｔを有する個体の１．２４のオッズ比をもたらす（９５％ＣＩ：１．０１−１．５１、ｐ＝０．０３９５）。ＳＮＰ８の対立遺伝子Ｔも、対照に比べて患者においてより頻繁に存在して（０．３９対０．３４）、対立遺伝子Ｃを有する個体に対する対立遺伝子Ｔを有する個体の１．２４のオッズ比をもたらす（９５％ＣＩ：１．０２−１．５２、ｐ＝０．０３５１）。更に、対照に比べて患者の両ＳＮＰでホモ接合ＴＴジェノタイプのより高い頻度が観察された（ＳＮＰ７では０．１７対０．１３およびＳＮＰ８では０．１４対０．１０）。これはジェノタイプＣＣのキャリヤーに対するＳＮＰ７のジェノタイプＴＴのキャリヤーの１．５６のオッズ比をもたらした（９５％ＣＩ：１．０１−２．４０、ｐ＝０．０４２５）。１．６０のオッズ比（９５％ＣＩ：１．０１−２．５２、ｐ＝０．０４２２）が、ジェノタイプＣＣのキャリヤーに対してＳＮＰ８のジェノタイプＴＴのキャリヤーについて決定された。
【０１５３】
結果は、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８の対立遺伝子Ｃが肥満とネガティブに関連していることも示す。対照に比べてＳＮＰ７の対立遺伝子Ｃのより低い頻度が患者において観察されて（０．５８対０．６３）、対立遺伝子Ｔを有する個体に対する対立遺伝子Ｃを有する個体の０．８１のオッズ比をもたらした（９５％ＣＩ：０．６６−０．９９、ｐ＝０．０３９５）。更に、ＳＮＰ８の対立遺伝子Ｃも、対照に比べて患者においてより頻繁に低く表現されて（０．６１対０．６６）、対立遺伝子Ｔのキャリヤーに対するこの対立遺伝子のキャリヤーの０．８１のオッズ比をもたらした（９５％ＣＩ：０．６６−０．９９、ｐ＝０．０３５１）。更に、対照に比べて患者における両ＳＮＰでホモ接合ＣＣジェノタイプのより低い頻度が観察された（ＳＮＰ７では０．３３対０．３９およびＳＮＰ８では０．３７対０．４３）。これは、ジェノタイプＴＴのキャリヤーに対するＳＮＰ７のジェノタイプＣＣのキャリヤーの０．６４のオッズ比をもたらした（９５％ＣＩ：０．４２−０．９９、ｐ＝０．０４２５）。、ジェノタイプＴＴのキャリャーに対するＳＮＰ８のジェノタイプＣＣのキャリヤーの０．６３のオッズ比（９５％ＣＩ：０．４０−０．９９、ｐ＝０．０４２３）が決定された。
【０１５４】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ゲノム．ハイブリッド．アイデンティティー．プロファイリング）（ＧｅｎｏｍｅＨＩＰ）を使用する高密度マッピング 全ヒトゲノムを表すクローン間の１．２メガ塩基対の平均間隔を有する総計２２６３のＢＡＣクローンを、ＧｅｎｏｍｅＨＩＰを使用して連鎖について試験した。ｘ軸における各点はクローンに対応する。いくつかのクローンはより良好な配向のためのそれらのライブラリー名により示される（例えば、ＢＡＣＡ９ＺＦ１０）。連鎖のための有意な証拠が、クローンＢＡＣＡ９ＺＦ１０について計算された（ｐ値１．７×１０−５）。連鎖のための示唆的証拠が、クローンＢＡＣＡ１２ＺＡ０６およびＢＡＣＡ１６ＺＦ０２について計算された（それぞれ、ｐ値２．１×１０−５および７．３×１０−５）。全連鎖領域は、ヒト染色体１７上の４２２１４７５９塩基対から出発して４７５４５８７６塩基対までの領域を包含する。有意な連鎖のための有意水準に対応するｐ値２×１０−５および示唆的連鎖のための有意水準に対応するｐ値３×１０−４が、ＬａｎｄｅｒおよびＫｒｕｇｌｙａｋ（１９９５）により提唱された全ゲノムスクリーンのための有意水準として使用された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に遺伝学及び医学の分野に関する。
【０００２】
発明の背景
現代の工業化された国の全健康コストの約３〜８％は、現在肥満の直接コストによるものである（Ｗｏｌｆ，１９９６）。ドイツでは、肥満及共存症に関係した（直接及び間接の両方）全コストは、１９９５年には２１０億ドイツマルク（２９．４ＵＳドル）と評価された（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，１９９６）。２０３０年までに、これらのコストは肥満の普及が更に増加しないとしても、５０％上昇するであろう。
【０００３】
肥満は、健康が損なわれうる程度に脂肪組織における異常な又は過剰な脂肪蓄積の状態としてしばしば簡単に定義される。基礎をなす疾患は望ましくない正のエネルギーバランス及び重量増加のプロセスである。腹部脂肪分布は、女性的脂肪分布よりも高い健康的リスクと関連している。
【０００４】
ボデイ．マス．インデックス（ＢＭＩ；ｋｇ／ｃｍ２）は、粗いとはいえ、最も有用な集団レベルの肥満の目安を与える。それは、集団の肥満の普及及びそれに関連した危険を評価するのに使用することができる。しかしながら、ＢＭＩは、身体の組成又は身体脂肪分布を考慮していない（ＷＨＯ，１９９８）。
【０００５】
【表１】
【０００６】
肥満は、肥満及び重度の肥満の定義のためのカットオフとして８５ｔｈ及び９５ｔｈＢＭＩパーセンタイルを使用しても定義された。ＢＭＩパーセンタイルは、いくつかの母集団内で計算されている；Ｇｅｒｍａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｓｕｒｖｅｙに基づいてドイツ人口に対するパーセンタイルは１９９４年以来入手可能であった（Ｈｅｂｅｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９４，１９９６）。異なる体重クラスのＷＨＯ分類は成人のみに適用することができるので、子供及び青年期の個体の肥満の定義についてＢＭＩパーセンタイルを指すことが普通になった。
【０００７】
肥満の普及（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）の最近の上昇は、いくつかの国の健康システムにとって大きな関心のある問題である。Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）の報告に従えば、合衆国では過去２０年間に肥満が劇的に増加した。１９８５年には、少数の州のみがＣＤＣｓ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＲＦＳＳ）に参加していて、肥満データを提供していた。１９９１年に、４つの州が１５〜１９％の肥満普及率を報告しておりそして２０％又は２０％より高い率を報告する州はなかった。２００２年には、２０の州が１５〜１９％の肥満普及率を報告しており；２９の州が２０〜２４％の率を有し、そして１つの州は２５％を越える率を報告する。同様な傾向がヨーロッパ及び南アメリカの他の国々でも観察された。
【０００８】
子供及び青年期の個体は、この傾向から免がれなかった。それどころか、ＵＳＡでの増加は、実質的であった。従って、１９６０年代と１９９０年との間に体重超過及び肥満は６〜１７歳において劇的に増加した。この増分は、カットオフとして８５ｔｈＢＭＩセンタイル（１９６０年代に計算された）を使用して４０％の相対的増加になりそして９５ｔｈセンタイルの使用により１００％の相対的増加になる。１９８５年と１９９５年の間に極端な肥満のため入院患者として処置されたドイツの子供及び青年の横断研究では、この１０年間の期間にわたり殆ど２ｋｇ／ｍ２の平均ＢＭＩの有意な増加が報告された。この極端なグループ内では、増分は最高のＢＭＩ範囲において最も顕著であった。
【０００９】
肥満の普及のこの増加の基礎となる機構は知られていない。環境的因子が基礎をなす原因として普通に引き合いに出された。基本的には、増加したカロリー摂取及び減少したレベルの身体活動の両方が検討された。英国では、肥満率の増加は、後者の機構に帰された。したがって、この国では、平均カロリー摂取はここ２０年間に幾分減少すらしたが、これに対してテレビジョンを観て過ごす時間の増加及び家庭当りの車の平均数から生じる間接の証拠は、関係のある原因因子として減少したレベルの身体活動を指摘している。
【００１０】
遺伝的因子は寄与する原因として以前は考えられなかった。全く反対に、増加した率の肥満がここ２０年間に観察されたという事実は、遺伝的因子が原因となることはできないという証拠とみなされてきた。しかしながら、選択的配偶（ａｓｓｏｒｔａｔｉｖｅ ｍａｔｉｎｇ）の率の増加は、観察された現象への遺伝的寄与を非常によく形成することができるということが提唱された。この仮説は、肥満した個体の烙印を押すことはむしろ最近の社会現象を表し、従って、常に増加した率の選択的配偶をもたらしたということを示唆する証拠に基づいている。結果として、子孫は、肥満の基礎をなす加算的及び非加算的遺伝因子のより高い負荷を有している。実際に、極端に肥満した子供及び青年期の個体の両親の間の格別に高い率の（推定された）選択的配偶が観察された。
【００１１】
肥満と関連した潜在的に生命を脅かす慢性の健康問題は下記の主な分野に入る：
１）高血圧、慢性心臓疾患及び発作を含む心臓血管問題、２）インスリン抵抗性と関連した状態、即ち、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、３）あるタイプの癌、主としてホルモンが関係した癌及び大腸癌、ならびに４）胆嚢疾患。肥満と関連した他の問題は、呼吸困難、慢性筋骨格問題、皮膚問題および無生殖性を含む（ＷＨＯ，１９９８）。
【００１２】
これらの障害を処置するための最近利用可能な主なストラテジーは、食事制限、身体活動の増加、薬理学的アプローチ及び外科的アプローチを含む。成人では、伝統的介入を使用する長期間の体重損失は格別である。現在の薬理学的介入は、典型的には、５〜１５キログラムの体重損失を誘導し；もし薬剤処理が中断されるならば、再び始まる重量増加が続いて起こる。外科処置は比較的成功しておりそして極端な肥満および／または重い医学的合併症を有する患者のために取ってある。
【００１３】
最近、レプチン欠失突然変異が検出された１０歳の甚だしく肥満した少女が組換えレプチンで処置されて成功した。これは、彼女の病的な肥満の基礎をなす突然変異の検出を治療的に生かした最初の個体である。
【００１４】
いくつかの双生児の研究が行われてＢＭＩの遺伝性が評価され、そのいくらかは、１０００組以上の双生児ペアーを包含していた。結果は、非常に首尾一貫していた：一卵性双子間のペアー内相関は、年齢及び性とは無関係に、典型的には０．６〜０．８であった。１つの研究では、一卵性双生子及び二卵性双生子についての相関は、双生子が離れて育てられたか又は一緒に育てられたかとは無関係に、基本的に同じであった。ＢＭＩの遺伝性は、０．７と評価され；非共有環境因子は可変性の残りの３０％を説明した。驚くべきことに、共有された環境因子は、可変性の実質的な割合を説明しなかった。過度のカロリー及び不足カロリーの栄養は、一卵性双生子ペアーの両メンバー間で同様な程度の体重増加または損失をもたらしたが、これは、体重に対するエネルギー利用性の環境的に誘導された変動の効果を遺伝的因子が調節することを示す。過食及び過小食した際の代謝反応および体脂肪分布の変化も遺伝的制御下にある（Ｈｅｂｅｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８に概説されている）。
【００１５】
多数の養子関係の研究は、養子のＢＭＩはその生物学的両親のＢＭＩと相関しておりそして養子両親のＢＭＩと相関していないことを示した。家族の研究に依存して、同胞（ｓｉｂｓ）のＢＭＩ間の相関は０．２〜０．４であった。両親−子相関は、典型的には僅かに低かった。分離分析（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、主要な劣性遺伝効果を繰り返して示唆した。これらの分析に基づいて、サンプルサイズの計算は、一致及び不一致アプローチの両方に基づいて行われた。
【００１６】
予想とは対照的に、一致同胞ペアーアプローチは優れており；同じパワーを達成するのにより少ない数の家族が必要であった。
【００１７】
極端に肥満した若いインデックスの両親、母または父または両方に基づいた家族研究は、大多数の家族においてＢＭＩ＞９０ｔｈデシルを有する。ＢＭＩ＞９５ｔｈセンタイルを有するインデツクスの患者に基づいて、それぞれの家族の約２０％は、ＢＭＩ＞９０ｔｈセンタイルを有する同胞を有する。
【００１８】
結論として、環境因子は、個体を多少肥満の発生に感受性とする特異的遺伝子型と相互作用することは明らかである。更に、主要な遺伝子が検出されたという事実にもかかわらず、スペクトルがこのような主要な遺伝子からほんの僅かな影響を有する遺伝子に及ぶ
ことを考慮することが必要である。
【００１９】
１９９４年の終わりにおけるレプチン遺伝子の発見（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４）に続いて、食欲及び体重調節の基礎をなす調節システムを明かすための科学的努力が実質的に爆発した。それは最近最も早く成長する生物医学的分野である。この著しい増加は、明らかな臨床的興味により、ヒト、げっ歯類及び他の哺乳動物の肥満に基本的にすべて関係している大規模な分子遺伝的活動ももたらした（Ｈｅｂｅｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【００２０】
この点で、突然変異が現在知られている単一遺伝子形の肥満をもたらした多くの遺伝子がげっ歯類においてクローニングされた。これらの突然変異の全身性結果は、最近分析されている。これらのモデルは、体重調節に関与する複雑な調節システムへの洞察を与え、その最ももよく知られているのはレプチン及びその受容体を含む。
【００２１】
マウスでは、しかしブタでも、体重調節に最も関係がありそうな１５以上の量的形質遺伝子座（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ）（ＱＴＬ）が同定された（Ｃｈａｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００２２】
ヒトでは、４つの非常にまれな常染色体劣性形態の肥満が１９９７年に記載された。レプチン、レプチン受容体、プロホルモンコンベルターゼ１及びプロ−オピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）をコードする遺伝子の突然変異が、過食と関連した早期開始型のはなはだしい肥満を引き起こすことが示された。異なる追加の臨床的（例えば、赤毛、原発性無月経）および／または内分泌学的異常（例えば、顕著に変わった血清レプチンレベル、ＡＣＴＨ分泌の欠如）は、それぞれの候補遺伝子の位置を正確に示す（ｐｉｎｐｏｉｎｔ）。単一遺伝子動物モデル及びヒト単一遺伝子形態の両方とも、体重調節の基礎をなす複雑なシステムへの新規な洞察をもたらした。
【００２３】
極めて最近では、ヒトにおける第１常染色体優性形態の肥満が記載された。メラノコルチン−４−受容体遺伝子（ＭＣ４Ｒ）内の２つの異なる突然変異は、これらの変異体に対するヘテロ接合性発端者において極端な肥満をもたらすことが観察された。上記した発見とは対照的に、これらの突然変異は、極端な肥満以外の容易に明らかな表現型異常を包含しない（Ｖａｉｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８； Ｙｅｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。興味深いことに、両グループとも相対的に小さな研究グループ（ｎ＝６３およびｎ＝４３）における系統的スクリーンにより突然変異を検出した。
【００２４】
Ｈｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）は、総計４９２人の肥満した子供および青年期の個体においてＭＣ４Ｒをスクリーニングした。概して、ハプロ不全（ｈａｐｌｏ−ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）をもたらす２つの異なる突然変異を有する４つの個体が検出された。１つはＹｅｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）により以前に観察された突然変異と同じであった。３つの個体で検出された他の突然変異は、受容体の細胞外ドメインにおける停止突然変異を誘導した。約１％の極端に肥満した個体は、ＭＣ４Ｒにおけるハプロ不全突然変異を有する。２つの形態のハプロ不全に加えて、Ｈｉｎｎｅｙ等（１９９９）は、保存性及び非保存性のアミノ酸交換の両方をもたらす追加の突然変異も検出した。興味深いことに、これらの突然変異は、主として肥満研究グループにおいて観察された。これらの突然変異の機能的関与は現在未知である。
【００２５】
ＭＣ４Ｒ突然変異を有する個体の同定は、可能な薬理学的介入を考慮に入れると興味深い。従って、すべてのメラノコルチンのコア配列を表す副腎皮質刺激ホルモン４〜１０（ＡＣＴＨ４〜１０）の鼻内適用は健常な対照において減少した体重、体脂肪質量および血漿レプチン濃度をもたらした。それらの減少した受容体密度を理論的に釣り合わせることがあるこの処置に対して突然変異キャリアーがいかに反応するかに関して疑問が生じる。
【００２６】
体重調節における特定の遺伝子の関与は、トランスジェニックマウスから得られたデータにより更に立証される。例えば、ＭＣ４Ｒ欠失マウスは早期開始肥満を発生する（Ｈｕｓｚａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
【００２７】
異なるグループは、肥満又は依存性表現型（ＢＭＩ、レプチンレベル、脂肪質量等）に関係したゲノムスキャンを行っている。このアプローチは、非常に有望と思われる。何故ならば、それは系統的でありそしてモデルフリーであるからである。更に、それは格別に成功していることが既に示された。従って、比較的小さな研究グループを分析することによってすら、ポジティブな連鎖結果が得られた。更に重要なことに、いくらかの発見は、既に追試されている。下記の領域の各々は、少なくとも２つの独立したグループにより同定された：染色体１ｐ３２、染色体２ｐ２１、染色体６ｐ２１、染色体１０および染色体２０ｑ１３（Ｃｈａｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００２８】
発明の要約
本発明は、肥満および関連した障害の診断及び予防のために使用することができる３つのヒト肥満感受性遺伝子の同定を今や開示する。本発明は、更に具体的には、染色体１７上のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子およびそのある種の対立遺伝子が肥満に対する感受性に関係していることを証明する。
【００２９】
更に詳しくは、本発明は、ＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰ遺伝子を含む染色体１７上の染色体領域に位置しているいくつかハプロタイプ及びＳＮＰに関する。好ましくは、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む。特定の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８を含む。他の特定の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含む。更に、肥満と各々独立に関連した該単一ＳＮＰは、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８である。更なる態様では、肥満と各々独立に関連した該単一ＳＮＰは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１でもある。
【００３０】
本発明は、低アルファリポタンパク血症、家族性結合性高脂血症、インスリン抵抗性症候群Ｘ又は多重代謝障害、冠動脈疾患、糖尿病及び関連合併症および異常脂血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）を含むが、それらに限定されるわけではない、肥満、冠動脈性心疾患及び代謝障害の素因の診断又は該肥満、冠動脈性心疾患及び代謝障害からの保護の診断、該肥満、冠動脈性心疾患及び代謝障害の検出および／または予防において使用することができる。
【００３１】
本発明の特定の目的は、被検体からのサンプル中のＰＰＹ遺伝子座、ＰＹＹ遺伝子座、ＧＩＰ遺伝子座およびその組み合わせからなる群より選ばれる遺伝子座における変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）の存在を検出することを含み、該変化の存在が、肥満または関連した障害の存在もしくは素因を示す、被検体における肥満または関連した障害の存在もしくは素因を検出する方法にある。特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は被検体からのサンプル中のＧＩＰ遺伝子座の変化の存在を検出することを含む。
【００３２】
本発明の追加の特定の目的は、被検体からのサンプル中のＰＰＹ遺伝子座、ＰＹＹ遺伝子座、ＧＩＰ遺伝子座およびその組み合わせからなる群より選ばれる遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が肥満又は関連した障害からの保護を示す、被検体における肥満または関連した障害からの保護を検出する方法にある。特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は被検体からのサンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００３３】
本発明の他の特定の目的は、肥満または関連した障害の処置に対する被検体の応答を評価する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ遺伝子座、ＰＹＹ遺伝子座、ＧＩＰ遺伝子座およびその組み合わせからなる群より選ばれる遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が該処置に対する特定の応答を示す、方法にある。特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は被検体からのサンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００３４】
本発明は、被検体からのサンプル中のＰＰＹ遺伝子座、ＰＹＹ遺伝子座、ＧＩＰ遺伝子座およびその組み合わせからなる群より選ばれる遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が肥満または関連した障害への素因を示し、そして肥満又は関連した障害に対する予防処置を行うことを含む、被検体における肥満又は関連した障害を予防するための方法にも関する。特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は被検体からのサンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００３５】
好ましい態様では、前記変化は、肥満と関連した１つ又は複数のＳＮＰ又は肥満と関連したＳＮＰのハプロタイプである。更に好ましくは、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む。特定の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６（ハプロタイプ４−５−６）を含むか又はＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６からなる（ハプロタイプ４−５−６）。場合により、ハプロタイプ４−５−６は、ＳＮＰ７及びＳＮＰ８を更に含むことができる。別の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７（ハプロタイプ５−６−７）を含むか又はＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７（ハプロタイプ５−６−７）からなる。場合により、ハプロタイプ５−６−７は、ＳＮＰ４および／またはＳＮＰ８を更に含むことができる。追加の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、又はＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むかあるいはＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、又はＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる。場合により、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むか、又はＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる。更に好ましくは、肥満と関連した該ＳＮＰは、ＳＮＰ７またはＳＮＰ８であることができる。更なる態様では、肥満と各々独立に関連した該単一のＳＮＰは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１でもある。
【００３６】
好ましくは、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰの遺伝子座における変化は、ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、マイクロシーケンシングアッセイ、対立遺伝子特異的増幅アッセイを行うことにより決定される。
【００３７】
本発明の特定の局面は、ＰＰＹ、ＰＹＹもしくはＧＩＰ遺伝子又はその組み合わせを含むゲノム領域における肥満と関連した少なくとも１つのＳＮＰ又はハプロタイプを特異的に検出するようにデザインされる、プライマー、プローブおよび／またはオリゴヌクレオチドを含む物質の組成物にある。好ましくは、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む。好ましい態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６を含む。場合により、このハプロタイプは、ＳＮＰ７及びＳＮＰ８を更に含むことができる。別の好ましい態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７を含む。場合により、このハプロタイプは、ＳＮＰ４および／またはＳＮＰ８を更に含むことができる。好ましくは、肥満と関連した該ＳＮＰは、ＳＮＰ７またはＳＮＰ８である。他の好ましい態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、又はＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含む。場合により、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含む。好ましくは、肥満と独立に関連した該ＳＮＰは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０またはＳＮＰ１１である。
【００３８】
本発明の他の局面は、ＰＰＹおよびＰＹＹ遺伝子、ＰＰＹおよびＰＹＹ発現産物、及び／又はそれに対する抗体を利用する結合アッセイにある。本発明の更なる局面は、ＧＩＰ遺伝子、ＧＩＰ発現産物および／またはそれに対する抗体を利用する結合アッセイにある。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト肥満感受性遺伝子としてＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰの同定を開示する。肥満を有する１６４家族からの種々の核酸サンプルを、特定のＧｅｎｏｍｅＨＩＰ法に供した。この方法は、肥満した被検体における変わっている該集団における特定の同祖性（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ−ｂｙ−ｄｅｓｃｅｎｔ）断片の同定をもたらした。ＩＢＤ断片のスクリーニングにより、本発明者は、肥満および関連した表現型のための候補として、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）遺伝子、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）遺伝子および胃抑制性ポリペプチド（ＧＩＰ）遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、限界的な間隔（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｖａｌ）で実際に存在しそして肥満の遺伝的調節と合致する機能的表現型を発現する。ＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰ遺伝子を含む限界的な間隔内に位置したいくつかのＳＮＰも、ヒト被検体における肥満に相関しているものとして同定された。ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８を含むハプロタイプは、肥満と関連していることが見出された。更に、ＳＮＰ７及びＳＮＰ８は、各々肥満と独立に関連していることが見出された。ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むハプロタイプも肥満と関連していることが見出され、そしてＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１も肥満と各々独立に関連していた。別の状況では、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む他のハプロタイプも肥満と関連していることが見いだされた。
【００４０】
従って、本発明は、肥満および関連した障害の診断および予防のためにＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰ遺伝子を使用することを目的とする。
【００４１】
定義
肥満および代謝障害：肥満は、健康が損なわれうる程度に、脂肪組織における異常なまたは過剰な脂肪蓄積の任意の状態とみなされるべきである。関連した障害、疾患または病理は、更に具体的には、低アルファリポタンパク血症、家族性結合性高脂血症、インスリン抵抗性症候群Ｘ又は多重代謝障害、冠動脈疾患、糖尿病及び関連合併症および異常脂血症を含むが、それらに限定されるわけではないいかなる代謝障害も含む。本発明は、成人、子供および出生前の段階を含む種々の被検体、特にヒトにおいて使用することができる。
【００４２】
本発明の状況内では、ＰＰＹおよびＰＹＹ遺伝子座は、ＰＰＹおよびＰＹＹコード配列、ＰＰＹおよびＰＹＹ非コード配列（例えばイントロン）、転写翻訳および／またはＲＮＡもしくはタンパク質安定性を制御するＰＰＹおよびＰＹＹ調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）、ならびにすべての対応する発現産物、例えばＰＰＹおよびＰＹＹ ＲＮＡｓ（例えばｍＲＮＡｓ）並びにＰＰＹおよびＰＹＹポリペプチド（例えば前駆タンパク質および成熟タンパク質）を含む、細胞または生物におけるすべてのＰＰＹおよびＰＹＹ配列または産物を意味する。ＰＰＹおよびＰＹＹ遺伝子座は、ＰＰＹおよびＰＹＹ遺伝子内に位置したＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含むＰＰＹおよびＰＹＹ遺伝子の周囲の（ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ）配列も含む。例えば、ＰＰＹおよびＰＹＹ遺伝子座は、ＳＮＰ４〜ＳＮＰ８を含む周囲の配列を含む。
【００４３】
本発明の状況内では、ＧＩＰ遺伝子座は、ＧＩＰコード配列、ＧＩＰ非コード配列（例えばイントロン）、転写翻訳および／またはＲＮＡもしくはタンパク質安定性を制御する ＧＩＰ調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）、ならびにすべての対応する発現産物、例えばＧＩＰ ＲＮＡｓ（例えばｍＲＮＡｓ）およびＧＩＰポリペプチド（例えば前駆タンパク質および成熟タンパク質）を含む、細胞または生物におけるすべてのＧＩＰ配列または産物を意味する。ＧＩＰ遺伝子座は、ＧＩＰ遺伝子内に位置したＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含むＧＩＰ遺伝子の周囲の配列も含む。例えば、ＧＩＰ遺伝子座は、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含む周囲の配列を含む。
【００４４】
本願で使用された、用語「ＰＰＹ遺伝子」および用語「ＰＹＹ遺伝子」は、ヒト染色体１７上のそれぞれヒト膵臓ポリペプチド遺伝子およびペプチドＹＹ遺伝子、ならびにその変異体、アナログおよびそれらの断片を意味し、これらは、肥満および代謝障害に対する感受性又は肥満および代謝障害からの保護に関係するそれらの対立遺伝子（例えば生殖系列突然変異（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ））を含む。ＰＰＹ遺伝子は、膵臓アイコサペプチド、ＰＮＰまたは膵臓ホルモン前駆体（膵臓ポリペプチド（ＰＰ）遺伝子を指すこともある。ＰＹＹ遺伝子は、ペプチドＹＹ前駆体（ＰＹＹ）（ペプチドチロシンチロシン）遺伝子を指すことができる。
【００４５】
本願で使用された、用語「ＧＩＰ遺伝子」は、ヒト染色体１７上の胃抑制ポリペプチド遺伝子、ならびにその変異体、アナログおよびそれらの断片を意味し、これらは、肥満および代謝障害に対する感受性又は肥満および代謝障害からの保護に関係するそれらの対立遺伝子（例えば生殖系列突然変異）を含む。ＧＩＰ遺伝子は、グルコース依存性インスリン刺激性ポリペプチド（ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を指すことができる。
【００４６】
用語「遺伝子」は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成または半合成ＤＮＡ、ならびに任意の形態の対応するＲＮＡを含む任意の型のコード核酸を含むとみなされるべきである。用語、遺伝子は、特に、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰをコードする組換え核酸、即ち、例えば、配列をアセンブリング、カッティング、ライゲーションまたは増幅することにより人工的に創りだされたいかなる天然に存在しない核酸分子も含む。ＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰ遺伝子は、典型的には二本鎖であるが、一本鎖などの他の形態も意図することができる。ＰＰＹ、ＰＹＹおよびＧＩＰ遺伝子は、種々のソースから当該技術分野で知られた種々の技術に従って、例えば、ＤＮＡライブリーをスクリーニングすることまたは種々の天然のソースから増幅することにより得ることができる。組換え核酸は、化学合成、遺伝子工学、酵素的技術またはその組み合わせを含む慣用の技術により調製することができる。適当なＰＰＹ遺伝子配列は、遺伝子バンク、例えば、ＰＰＹのためのＵｎｉｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ（Ｈｓ．１８４６０４）、Ｕｎｉｇｅｎｅ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＭ＿００２７２２、ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡｓ：ＮＭ＿００２７２２、ＭＩＰＳアセンブリー：Ｈ３３９９８Ｓ１、ＤＯＴＳアセンブリー：ＤＴ．２０８４９２、ＤＴ．１０００１８３８７および追加の遺伝子／ｃＤＮＡ配列：ＢＣ０３２２２５、ＢＣ０４００３３、Ｍ１１７２６、Ｍ１５７８８、Ｘ００４９１に見出されうる。適当なＰＹＹ遺伝子配列は、遺伝子バンク、例えばＰＹＹのためのＵｎｉｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ（Ｈｓ．１６９２４９）、Ｕｎｉｇｅｎｅ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＭ＿００４１６０、ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡｓ：ＮＭ＿００４１６０、ＭＩＰＳアセンブリー：Ｈ３０７１０Ｓ１、Ｈ３０７１０Ｓ２、ＤＯＴＳアセンブリー：ＤＴ．４５２１１８、ＤＴ．８７０４６２７３および追加の遺伝子／ｃＤＮＡ配列：ＢＣ０４１０５７、Ｄ１３８９７、Ｄ１３８９９、Ｄ１３９０２、Ｌ２５６４８．１に見出されうる。適当なＧＩＰ遺伝子配列は、遺伝子バンク、例えばＧＩＰのためのＵｎｉｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ（Ｈｓ．１４５４）、ｍＲＮＡｓ：ＮＭ＿００４１２３に見出されうる。
【００４７】
ＰＰＹポリペプチドは、上記に開示されたＰＰＹ遺伝子によりコードされたいかなるタンパク質またはポリペプチドも意味する。ＰＹＹポリペプチドは、上記に開示されたＰＹＹ遺伝子によりコードされたいかなるタンパク質またはポリペプチドも意味する。ＧＩＰポリペプチドは、上記に開示されたＧＩＰ遺伝子によりコードされたいかなるタンパク質またはポリペプチドも意味する。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のストレッチを含むいかなる分子も指す。この用語は、種々の長さの分子、例えばペプチドおよびタンパク質を含む。ポリペプチドは、例えば、グリコシル化および／またはアセチル化および／または化学反応もしくはカップリングにより修飾することができ、そして１つ又は複数の非天然または合成アミノ酸を含有することができる。
【００４８】
ＰＹＹ、ＰＰＹまたはＧＩＰ遺伝子の断片は、上記した配列の少なくとも約８の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５、更に好ましくは少なくとも約２０のヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも３０の連続したヌクレオチドの任意の部分を意味する。断片は、８〜１００ヌクレオチド好ましくは１５〜１００、更に好ましくは２０〜１００ヌクレオチドのすべての可能なヌクレオチド長さを含む。
【００４９】
典型的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、３０℃以上、好ましくは３５℃以上、更に好ましくは４２℃以上の温度および／または約５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満の塩度を含む。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩度および／またはＳＤＳ、ＳＳＣなどの他の試薬の濃度を修飾することにより当業者によって調節されうる。
【００５０】
診断
本発明は、被検体におけるＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の監視に基づく診断方法を今や提供する。本発明の状況内では、用語「診断」は、成人、子供および生まれる前における早期段階、前兆段階および後期段階を含む種々の段階での検出、監視、投薬、比較等を含む。診断は、典型的には、予後、発生の素因もしくは危険の評価又は保護の評価、最も適切な処置を規定するための被検体の特徴付け（薬理遺伝学）等を含む。
【００５１】
本発明の特定の目的は、被検体における肥満または関連した障害の存在または素因を検出する方法であって、（ｉ）被検体からのサンプルを提供し、そして（ｉｉ）該サンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む方法にある。特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００５２】
本発明の更なる目的は、被検体における肥満または関連した障害の存在または素因を検出する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が肥満または関連した障害の存在又は素因を示す、方法にある。特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００５３】
本発明の他の特定の目的は、被検体における肥満または関連した障害からの保護を検出する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が肥満または関連した障害からの保護を示す、方法にある。特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００５４】
好ましい態様では、該変化は肥満と関連した１つ又は複数のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである。更に好ましくは、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む。特定の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６（ハプロタイプ４−５−６）を含むかまたはＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６（ハプロタイプ４−５−６）からなる。場合により、ハプロタイプ４−５−６は、ＳＮＰ７及びＳＮＰ８を更に含むことができる。別の態様では肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７（ハプロタイプ５−６−７）を含むか又はＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７（ハプロタイプ５−６−７）からなる。場合により、ハプロタイプ５−６−７は、ＳＮＰ４および／またはＳＮＰ８を更に含むことができる。追加の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、またはＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むか又はＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、またはＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる。場合により、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むかまたはＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる。更に好ましくは、肥満と関連した該ＳＮＰは、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれることができる。なお更に好ましくは、肥満と関連した該ＳＮＰは、ＳＮＰ７またはＳＮＰ８であることができる。更なる態様では、肥満と各々独立に関連した該単一のＳＮＰは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１でもある。
【００５５】
本発明の他の特定の目的は、肥満または関連した障害の処置に対する被検体の応答を評価する方法であって、（ｉ）被検体からのサンプルを提供し、そして（ｉｉ）該サンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む方法にある。特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００５６】
本発明の更なる目的は、被検体における肥満または関連した障害の処置に対する被検体の応答を評価する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が該処置に対する特定の応答を示す、方法にある。特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、該サンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００５７】
好ましい態様では、該変化は肥満と関連した１つ又は複数のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである。更に好ましくは、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む。特定の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６（ハプロタイプ４−５−６）を含むかまたはＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６（ハプロタイプ４−５−６）からなる。場合により、ハプロタイプ４−５−６は、ＳＮＰ７及びＳＮＰ８を更に含むことができる。別の態様では肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７（ハプロタイプ５−６−７）を含むか又はＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７（ハプロタイプ５−６−７）からなる。場合により、ハプロタイプ５−６−７は、ＳＮＰ４および／またはＳＮＰ８を更に含むことができる。追加の態様では、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、またはＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むか又はＳＮＰ９およびＳＮＰ１０、またはＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる。場合により、肥満と関連した該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含むかまたはＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる。更に好ましくは、肥満と関連した該ＳＮＰは、ＳＮＰ７またはＳＮＰ８であることができる。更なる態様では、肥満と各々独立に関連した該単一のＳＮＰは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１でもある。
【００５８】
本発明は、肥満または関連した障害の処置の有効性を決定する方法であって、（ｉ）該処置期間中又は該処置の後に被検体からのサンプルを提供し、そして（ｉｉ）該サンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の状態を決定しそして（ｉｉｉ）該ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の状態を、処置の前または処置のより早期の段階の該被検体からのサンプル中の基準ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の状態と比較することを含む方法にある。特定の態様では、この方法は、（ｉｉ）該サンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座の状態を決定しそして（ｉｉｉ）該ＰＰＹおよび／または、ＰＹＹ遺伝子座の状態を、処置の前または処置のより早期の段階の該被検体からのサンプル中の基準ＰＰＹ、および／またはＰＹＹ遺伝子座の状態と比較することを含む。他の特定の態様では、この方法は、（ｉｉ）該サンプル中のＧＩＰ遺伝子座の状態を決定しそして（ｉｉｉ）該ＧＩＰ遺伝子座の状態を、処置の前または処置のより早期の段階の該被検体からのサンプル中の基準ＧＩＰ遺伝子座の状態と比較することを含む。
【００５９】
追加の態様では、本発明は、被検体における肥満または関連した障害を予防するための方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在は、肥満または関連した障害の素因を示し、そして肥満または関連した障害に対する予防処置を行うことを含む方法に関する。該予防処置は、薬物および／または食事の投与であることができる。特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＰＰＹおよび／またはＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。他の特定の態様では、この方法は、被検体からのサンプル中のＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含む。
【００６０】
ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化は、該座のコード領域および／または非コード領域における、単独または種々の組み合わせの、突然変異、欠失、転移および／または挿入のいかなる形態であってもよい。突然変異は更に具体的には、点突然変異を含む。欠失は、遺伝子座のコード部分または非コード部分における２個以上の残基、例えば２個の残基から全体の遺伝子または遺伝子座までのいかなる領域も包含することができる。典型的な欠失は、より小さな領域、例えば約５０未満の連続した塩基対のドメイン（イントロン）、繰り返し配列または断片に影響を与えるが、より大きな欠失も起こりうる。挿入は、遺伝子座のコード領域または非コード領域における１個または複数の残基の付加を包含することができる。挿入は、典型的には遺伝子座における１〜５０塩基対の付加を含むことができる。転移は、配列の逆転又はトランスロケーションを含む。ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座変化は停止コドンの創生、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、特定のＲＮＡスプライシングもしくはプロセッシング、産物不安定性、トランケートされたポリペプチド産生等をもたらすことがある。この変化は、変化した機能、安定性、ターゲッティングまたは構造を有するＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチドの産生をもたらすことがある。変化はタンパク質発現の減少又は替わりに該産生の増加を引き起こすこともある。
【００６１】
本発明に従う方法の特定の態様では、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化は、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子または対応する発現産物における点突然変異、欠失および挿入から選ばれ、更に好ましくは点突然変異および欠失から選ばれる。変化は、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ ｇＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで決定されうる。
【００６２】
この点について、本発明は、肥満と関連しているＰＰＹ遺伝子、ＰＹＹ遺伝子およびＧＩＰ遺伝子を含むゲノム領域に位置したいくつかのＳＮＰを今や開示する。示されたヌクレオチド位置はＮＣＢＩから得られたＢｕｉｌｄ３４の最近の配列に基づいている。これらの点突然変異（または単一ヌクレオチド変化）は下記の表２に報告される。
【００６３】
【表２】
【００６４】
これらの点突然変異は、肥満を有する被検体において検出された。ハプロタイプは、
ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１について構築されて、各可能なＳＮＰ組み合わせについて天然に生じるフェイズ（ｐｈａｓｅ）を決定した。次いでこれらのハプロタイプを使用して、個々の対立遺伝子および肥満の組み合わせに由来するすべての得られるハプロタイプ間の関連について試験した。結果は、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６；またはＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７；またはＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８；またはＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８；ＳＮＰ９およびＳＮＰ１０；またはＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１；またはＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１（上記表２参照）を含むハプロタイプが肥満と関連していたことを示す（表５および６）。
【００６５】
更に、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８は、肥満との関連について各々独立に試験された。結果は、両ＳＮＰ（上記表２参照）は、肥満と各々独立に関連している（テキストで説明される）ことを示す。同様に、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１は、肥満と各々独立に関連している（表４）。
【００６６】
第１変異体においては、本発明の方法は、変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子配列の存在を検出することを含む。これは、例えば、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子、ポリペプチド又はＲＮＡのすべてまたは一部を配列決定すること、選択的ハイブリダイゼーション又は選択的増幅により行うことができる。
【００６７】
更に特定の態様は、被検体のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子配列を含むゲノム領域における表２に開示されたＳＮＰの存在を検出することを含む。
【００６８】
他の変異体では、本方法は変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ ＲＮＡ発現の存在を検出することを含む。変化したＲＮＡ発現は、変化したＲＮＡ配列の存在、変化したＲＮＡスプライシングもしくはプロセッシングの存在、変化した量のＲＮＡの存在等を含む。これらは、例えば、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ ＲＮＡのすべてもしくは一部を配列決定決定することまたは該ＲＮＡのすべてもしくは一部の選択的ハイブリダイゼーション又は選択的増幅によること含む、当該技術分野で知られた種々の技術により検出することができる。
【００６９】
更なる変法では、本方法は、変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチド発現の存在を検出することを含む。変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチド発現は、変化したポリペプチド配列の存在、変化した量のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチドの存在、変化した組織分布の存在等を含む。これらは、例えば、配列決定することおよび／または特異的リガンドに結合すること（例えば抗体）によることを含む、当技術分野で知られた種々の技術により検出することができる。
【００７０】
上記したとおり、配列決定、ハイブリダイゼーション、増幅および／または特異的リガンドへの結合（例えば抗体）を含む当該技術分野で知られた種々の技術を使用して、変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子又はＲＮＡ発現もしくは配列を検出または定量することができる。他の適当な方法は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、対立遺伝子特異的増幅、サザーンブロット（ＤＮＡについて）、ノーザンブロット（ＲＮＡについて）、一本鎖コンフォーメーション分析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ゲルマイグレーション（ｇｅｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、クランプド変性ゲル電気泳動、ヘテロ二本鎖分析、ＲＮアーゼ保護、化学ミスマッチ開裂、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を含む。
【００７１】
これらのアプローチのいくらか（例えば、ＳＳＣＡおよびＣＧＧＥ）は、変化した配列決定の存在の結果として、核酸の電気泳動移動度が変化することに基づいている。これらの技術に従えば、変化した配列は、ゲルでの移動度のシフトにより可視化される。次いで断片を配列決定して変化を確認することができる。
【００７２】
いくらかの他の方法は、被検体からの核酸と、野生型または変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡに特異的なプローブとの特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。プローブは懸濁しているかまたは基材上に固定化されることができる。プローブは、典型的には標識されてハイブリッドの検出を促進する。
【００７３】
これらのアプローチのいくらか、例えばノーザンブロット、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡは、ポリペプチド配列または発現レベルを評価するのに特に適している。これらの後者はポリペプチドに特異的なリガンド、更に好ましくは特異的抗体の使用を必要とする。
【００７４】
特定の好ましい態様では、本方法は、被検体からのサンプルにおける変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子発現プロフィルの存在を検出することを含む。示されたとおり、これは、更に好ましくは、該サンプル中に存在する核酸の配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅により達成することができる。
【００７５】
配列決定
配列決定は、自動シーケンサーを使用して当技術分野で周知された技術を使用して行うことができる。配列決定は、完全なＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子で行うことができ、又は更に好ましくは、その特定のドメイン、典型的には有害な突然変異または他の変化を有することが知られているかあるいは有害な突然変異または他の変化を有する疑いのあるその特定のドメインに関して行うことができる。
【００７６】
増幅
増幅は、核酸再生を開始するのに役立つ相補性核酸配列間の特定のハイブリッドの形成に基づいている。
【００７７】
増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列をベースとする増幅（ＮＡＳＢＡ）などの当該技術分野で知られた種々の技術に従って行うことができる。これらの技術は、商業的に入手可能な試薬およびプロトコールを使用して行うことができる。好ましい技術は、対立遺伝子特異的ＰＣＲまたはＰＣＲ−ＳＳＣＰを使用する。増幅は、反応を開始するために、通常特異的核酸プライマー使用を必要とする。
【００７８】
これに関して、本発明の特定の目的は、周囲の領域を含むＰＰＹ遺伝子または遺伝子座からの配列を増幅するために有用な核酸プライマーにある。このようなプライマーは、好ましくは、ＰＰＹ遺伝子座における核酸配列に対して好ましくは相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする。特定のプライマーは、該遺伝子座の標的領域にフランキングするＰＰＹ遺伝子座の一部と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、該標的領域は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している。このような標的領域の例は上記表２において与えられる。
【００７９】
本発明の他の特定の目的は、周囲の領域を含むＰＹＹ遺伝子又は遺伝子座から配列を増幅するために有用な核酸プライマーにある。このようなプライマーは、ＰＹＹ遺伝子座における核酸配列に対して好ましくは相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする。特定のプライマーは、該遺伝子座の標的領域にフランキングするＰＹＹ遺伝子座の一部と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、該標的領域は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している。このような標的領域の例は上記表２において与えられる。
【００８０】
本発明の追加の特定の目的は、周囲の領域を含むＧＩＰ遺伝子または遺伝子座からの配列を増幅するために有用な核酸プライマーにある。このようなプライマーは、好ましくは、ＧＩＰ遺伝子座における核酸配列に対して好ましくは相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする。特定のプライマーは、該遺伝子座の標的領域にフランキングするＧＩＰ遺伝子座の一部と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、該標的領域は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している。このような標的領域の例は上記表２に示される。
【００８１】
更に特定の態様では、本発明は、ＰＰＹコード配列（例えば遺伝子またはＲＮＡ）の一部に対して相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする核酸プライマーであって、該一部は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している、核酸プライマーに関する。これに関して、本発明の特定のプライマーは、ＰＰＹ遺伝子またはＲＮＡにおける変化した配列に対して特異的である。このようなプライマーを使用することにより、増幅産物の検出は、ＰＰＹ遺伝子座における変化の存在を示す。対照的に、増幅産物の不存在は、特異的変化がサンプルにおいて存在しないことを示す。
【００８２】
更に特定の態様では、本発明は、ＰＹＹコード配列（例えば遺伝子またはＲＮＡ）の一部に対して相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする核酸プライマーであって、該一部は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している、核酸プライマーにも関する。これに関して、本発明の特定のプライマーは、ＰＹＹ遺伝子またはＲＮＡにおける変化した配列に対して特異的である。このようなプライマーを使用することにより、増幅産物の検出は、ＰＹＹ遺伝子座における変化の存在を示す。対照的に、増幅産物の不存在は、特異的変化がサンプルにおいて存在しないことを示す。
【００８３】
更に特定の態様では、本発明は、ＧＩＰコード配列（例えば遺伝子またはＲＮＡ）の一部に対して相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする核酸プライマーであって、該一部は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している、核酸プライマーにも関する。これに関して、本発明の特定のプライマーは、ＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡにおける変化した配列に対して特異的である。このようなプライマーを使用することにより、増幅産物の検出は、ＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を示す。対照的に、増幅産物の不存在は、特異的変化がサンプルにおいて存在しないことを示す。
【００８４】
本発明の更なる局面は、センスプライマーおよびリバースプライマーを含む核酸プライマーの対であって、該センスプライマーおよびリバースプライマーは、ＰＰＹ遺伝子もしくはＲＮＡまたはその標的領域を特異的に増幅し、該標的領域は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している、核酸プライマーの対に関する。
【００８５】
本発明の更なる局面は、センスプライマーおよびリバースプライマーを含む核酸プライマーの対であって、該センスプライマーおよびリバースプライマーは、ＰＹＹ遺伝子もしくはＲＮＡまたはその標的領域を特異的に増幅し、該標的領域は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している、核酸プライマーの対に関する。
【００８６】
本発明の更なる局面は、センスプライマーおよびリバースプライマーを含む核酸プライマーの対であって、該センスプライマーおよびリバースプライマーは、ＧＩＰ遺伝子もしくはＲＮＡまたはその標的領域を特異的に増幅し、該標的領域は肥満または関連した障害を有すある種の被検体において変化している、核酸プライマーの対に関する。
【００８７】
本発明の典型的なプライマーは、長さが約５〜６０ヌクレオチド、更に好ましくは長さが約８〜約２５ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。この配列は、それぞれ、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の配列に直接由来することができる。完全な相補性は、高い特異性を確実にするのに好ましい。しかしながら、ある種のミスマッチは許容されうる。
【００８８】
選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション検出法は、核酸配列変化を検出するのに役立つ相補性核酸配列間の特異的ハブリッドの形成に基づいている。
【００８９】
特定の検出技術は、野生型または変化したＰＰＹ遺伝子またはＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用、および／または野生型または変化したＰＰＹ遺伝子またはＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用、および／または野生型または変化したＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用、次いでハイブリッドの存在の検出を含む。プローブは、懸濁していてもよく又は基材もしくは支持体に固定化されていてもよい（核酸アレー又はチップ技術におけるように）。プローブは典型的には標識されてハイブリッドの検出を促進する。
【００９０】
この点で、本発明の特定の態様は、被検体からのサンプルを、変化したＰＰＹ遺伝子座に特異的な核酸プローブと接触させること、および／または被検体からのサンプルを変化したＰＹＹ遺伝子座に特異的な核酸プローブと接触させること、および／または被検体からのサンプルを変化したＧＩＰ遺伝子座に特異的な核酸プローブと接触させること、およびハイブリッドの形成を評価することを含む。特定の好ましい態様では、本方法は、前記サンプルを、それぞれ、野生型ＰＰＹ遺伝子座およびその種々の変化した形態に対して特異的なプローブのセットと同時に接触させることを含む。特定の好ましい態様では、本方法は、前記サンプルを、それぞれ、野生型ＰＹＹおよびその種々の変化した形態に対して特異的なプローブのセットと同時に接触させることも含む。特定の好ましい態様では、本方法は、前記サンプルを、それぞれ、野生型ＧＩＰおよびその種々の変化した形態に対して特異的なプローブのセットと同時に接触させることも含む。この態様では、サンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における種々の形態の変化の存在を直接検出することが可能である。また、種々の被検体からの種々のサンプルを平行して処理することができる。
【００９１】
本発明の更なる特定の目的は、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡに対して特異的な核酸プローブにある。本発明の状況内では、プローブは、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡ（の標的部分）に対して相補性でありそしてＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡ（の標的部分）と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、そして肥満または代謝障害の傾向を与えるか、肥満又は代謝障害に対して保護するかまたは肥満または代謝障害と関連しているＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ対立遺伝子と関連したポリヌクレオチド多型を検出するのに適当なポリヌクレオチド配列を指す。プローブは、好ましくは、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子、ＲＮＡまたはその標的部分に対して完全に相補性である。プローブは、典型的には、長さが８〜１０００ヌクレオチド、例えば１０〜８００、更に好ましくは１５〜７００、典型的には、２０〜５００ヌクレオチドの一本鎖核酸含む。より長いプローブも使用することができることは理解されるべきである。本発明の好ましいプローブは、変化を有するＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡの領域に特異的にハイブリダイゼーションすることができる、長さが８〜５００ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。
【００９２】
本発明の特定の態様は、変化した（例えば突然変異した）ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡに対して特異的な核酸プローブ、即ち、該変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡに対して特異的にハイブリダイゼーションしそして該変化を欠いているＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡに対して本質的に特異的にハイブリダイゼーションしない核酸プローブである。特異性は、標的配列へのハイブリダイゼーションが、非特異的ハイブリダイゼーションによって発生するシグナルとは区別されうる特異的シグナルを発生することを示す。完全に相補性の配列は、本発明に従うプローブをデザインするのに好ましい。しかしながら、特異的シグナルが非特異的ハイブリダイゼーションから識別されうる限りは、ある種のミスマッチは許容されうることは理解されるべきである。
【００９３】
このようなプローブの特定の例は、上記表２にリストされた点突然変異を有するＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡを含むゲノム領域の標的部分に対して相補性の核酸配列である。更に具体的には、プローブは、配列番号１〜８からなる群より選ばれる配列又はＳＮＰを含むその断片又はその相補性配列を含むことができる。
【００９４】
プローブの配列は、本願で提供されたＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子またはＲＮＡの配列に由来することができる。ヌクレオチド置換を行うことができ、そしてプローブの化学修飾も行うことができる。このような化学修飾は、ハイブリッドの安定性を増加させるため（例えばインターカレーション基）又はプローブを標識するために達成することができる。標識の典型的な例は、放射能、螢光、ルミネッセンス、酵素標識等を含むがそれらに限定されるわけではない。
【００９５】
特異的リガンド結合
上記したとおり、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰ遺伝子座における変化は、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチド配列または発現レベルの変化についてスクリーニングすることにより検出することもできる。この点で、本発明の特定の態様は、前記サンプルをＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチドに対して特異的なリガンドと接触させそして複合体の形成を決定することを含む。
【００９６】
特異的抗体などの異なるタイプのリガンドを使用することができる。特定の態様では、サンプルを、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドに対して特異的な抗体と接触させ、そして免疫複合体の形成を決定する。免疫複合体を検出するための種々の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡＳ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を使用することができる。
【００９７】
本発明の状況内では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および実質的に同じ抗原特異性を有するその断片又は誘導体を意味する。断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ領域等を含む。誘導体は、一本鎖抗体、ヒトに適合させた抗体、多官能性抗体等を含む。
【００９８】
ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドに対して特異的な抗体は、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドに対して選択的に結合する抗体、即ち、ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドあるいはそのエピトープ含有断片に対して生じた抗体を意味する。他の抗原に対する非特異的な結合が起こりうるけれども、標的ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドへの結合がより高いアフイニティーで起こり、そして非特異的結合から信頼可能に識別することができる。好ましい抗体は、野生型ＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチド、またはその特定の変化した形態に対して特異的である。本発明の好ましい態様は、変化した形態のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチド、例えば突然変異した、トランケーションされた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）又は伸張したポリペプチドに対して特異的な抗体を使用する。特に、変化したＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドは、コード領域のフレームシフト突然変異から生じる特異的ドメインを含むことができる。該ドメインに対して特異的に抗体は、サンプルにおけるこのような変化したポリペプチドの存在の検出を可能とする。リガンドは、可溶性形態で使用することができ、又は表面または支持体上にコーティングされていてもよい。
【００９９】
特定の態様では、本方法は、被検体からのサンプルを、変化した形態のＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチドに対して特異的な抗体（でコーティングされた支持体）と接触させ、そして免疫複合体の存在を決定することを含む。特定の態様では、サンプルを、異なる形態のＰＰＹ、ＰＹＹまたはＧＩＰポリペプチド、例えば野生型およびその種々の変化し形態に対して特異的な種々の抗体（でコーティングされた支持体）と同時に、平行して又は順次に接触させることができる。
【０１００】
診断方法は、インビトロ、エクスビボ又はインビボ、好ましくはインビボまたはエクスビボで行うことができる。診断方法では被検体からのサンプルを使用して、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の状態を評価することができる。サンプルは、核酸又はポリペプチドを含有する、被検体に由来するいかなる生物学的サンプルであってもよい。このようなサンプルの例は、体液、組織、細胞サンプル、器官、生検等を含む。最も好ましいサンプルは、血液、血漿、唾液、尿、精液等である。例えば、胎児細胞または胎盤細胞を試験することにより、出生前診断を行うこともできる。サンプルは、慣用の方法により集めることができ、そして診断のために直接使用するか又は保存することができる。サンプルは、試験のための核酸またはポリペプチドの効用（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を与えるか又は改善するために、本方法を行う前に処理することができる。処理は、例えば、ライシス（ｌｙｓｉｓ）（例えば、機械的、物理的、化学的等）、遠心等を含む。核酸および／またはポリペプチドは、慣用の技術により予備精製するか又は濃縮することができおよび／または複雑性を減少させることができる。核酸およびポリペプチドは酵素又は他の化学的処理または物理的処理により処理してその断片を生成させることもできる。請求された方法の高い感度を考えると、非常に少ない量のサンプルがアッセイを行うのに十分である。
【０１０１】
示されたとおり、好ましくは、変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の存在を評価するために、サンプルを、プローブ、プライマーまたはリガンドなどの試薬と接触させる。接触は、プレート、管、ウエル、ガラス等などの任意の適当な装置において行うことができる。特定の態様では、接触は、核酸アレー又は特異的リガンドアレーなどの試薬でコーティングされた基材上で行われる。基材は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマー等を含む任意の支持体などの固体または半固体基材であることができる。基材は、種々の形態およびサイズ、例えば、スライド、膜、ビーズ、カラム、ゲル等であることができる。接触は、試薬とサンプルの核酸またはポリペプチド間で複合体が形成されるのに適当な条件下に行うことができる。
【０１０２】
サンプルにおける変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰポリペプチド、ＲＮＡまたはＤＮＡの発見は、被検体における変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の存在を示し、これは肥満または代謝障害の存在、素因又は進行の段階と相関することができる。例えば、生殖細胞系列ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ突然変異を有する個体は、肥満または代謝障害の発生の増加した危険を有する。被検体における変化したＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座の存在の決定は、より効果的でそして特注される適切な治療介入のデザインも可能とする。また前兆レベルでのこの決定は、予防法を適用することを可能とする。
【０１０３】
連鎖不平衡
一旦第１ＳＮＰが関心のあるゲノム領域、特にＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座において同定されると、当業者は、この第１ＳＮＰと連鎖不平衡にある追加のＳＮＰを容易に同定することができる。実際、肥満または関連した障害と関連した第１ＳＮＰと連鎖不平衡にあるいかなるＳＮＰもこの特質と関連するであろう。従って、所与のＳＮＰと肥満または関連した障害との間で関連が一旦証明されると、この特質と関連した追加のＳＮＰの発見は、この特定の領域におけるＳＮＰの密度を増加させるために大いに興味を引くことができる。
【０１０４】
所与のＳＮＰと連鎖不平衡にある追加のＳＮＰの同定は、（ａ）複数の個体からの第１ＳＮＰを含むまたは取り囲むゲノム領域からの断片を増幅し；（ｂ）該第１ＳＮＰを有する又は取り囲むゲノム領域における第２ＳＮＰを同定し；（ｃ）該第１ＳＮＰと第２ＳＮＰとの連鎖不平衡分析を行い；そして（ｄ）該第１マーカーと連鎖不平衡にある該第２ＳＮＰを選ぶことを含む。段階（ｂ）および（ｃ）を含む副組み合わせも意図する。
【０１０５】
ＳＮＰを同定しそして連鎖不平衡分析を行うための方法は、周知の方法を使用することにより過度の実験をすることなく当業者により行われうる。
【０１０６】
連鎖不平衡にあるこれらのＳＮＰも、本発明に従う方法、更に詳しくは本発明に従う診断方法において使用することができる。
【０１０７】
例えば、クローン病の連鎖座（ｌｉｎｋａｇｅ ｌｏｃｕｓ）は、染色体５ｑ３１上の１８ｃＭにわたる大きな領域に対してマッピングされた（Ｒｉｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０００及び２００１）。全体の領域にわたるマイクロサテライトマーカーおよびＳＮＰの密なマップを使用して、連鎖不平衡（ＬＤ）の強い証拠が見出された。ＬＤの証拠を見出したので、著者は、超高密度ＳＮＰマップを開発し、そしてこのマップから選ばれるマーカーのより密なコレクションを調べた。多重座分析は、ＴＤＴを使用して各々独立に関連している多重ＳＮＰにより特徴付けられた単一コモンリスクハプロタイプ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｍｍｏｎ ｒｉｓｋ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）を規定した。これらのＳＮＰは、リスクハプロタイプに独特でありそして、互いに殆ど完全な連鎖不平衡にあることによりそれらの情報内容において本質的に同一であった。これらのＳＮＰの同等な性質は、遺伝的証拠のみに基づいてこの領域内の原因突然変異を同定することを不可能とする。
【０１０８】
原因突然変異
肥満又は関連した障害を示す患者および対照個体からのＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子の配列を比較することにより、肥満又は関連した障害の原因となりうるＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子における突然変異を同定することができる。ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰと肥満又は関連した障害との同定された関連に基づいて、同定された座位を突然変異についてスキャンすることができる。好ましい態様では、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子のエキソンおよびスプライス部位、プロモーターおよび他の調節領域などの機能的領域を突然変異についてスキャンする。好ましくは、肥満または関連した障害を示す患者は、肥満又は関連した障害と関連していることが示された突然変異を有し、そして対照個体は肥満又は関連した障害と関連した突然変異又は対立遺伝子を有していない。肥満または関連した障害を示す患者は、対照個体よりも高い頻度で肥満または関連した障害と関連していることが示された突然変異を有することも可能でありうる。
【０１０９】
このような突然変異を検出するのに使用される方法は、一般に下記の段階を一般に含む：肥満又は関連した障害を示す患者および対照個体からのＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子のＤＮＡサンプルから、肥満または関連した障害と関連したＳＮＰ又はＳＮＰの群を含むＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子の領域を増幅する段階；増幅された領域の配列決定をする段階；肥満又は関連した障害を示す患者および対照個体からのＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子のＤＮＡ配列を比較する段階；肥満または関連した障害を示す患者に特異的な突然変異を決定する段階。
【０１１０】
従って、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子における原因突然変異の同定は、周知の方法を使用することにより過度の実験をすることなく当業者により行われうる。
【０１１１】
例えば、原因突然変異は、ルーチンな方法を使用することにより下記の実施例で同定された。
【０１１２】
Ｈｕｇｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）は、クローン病に対する感受性に連鎖していることが以前に見出された染色体１６の領域におけるクローン病に対する感受性を有する遺伝子変異体を同定するためにポジショナルクローニングストラテジーを適用した。潜在的感受性座の位置を精密化するために、２６のマイクロサテライトマーカーをジェノタイピングしそして伝達不平衡テストを使用してクローン病に対する関連について試験した。ボーダーラインの有意な関連がマイクロサテライトマーカーＤ１６Ｓ１３６の１つの対立遺伝子の間で見出された。１１の追加のＳＮＰが周囲の領域から選ばれ、そしていくつかのＳＮＰは、有意な関連を示した。この領域からのＳＮＰ５〜８は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の単一のエキソンに存在することが見出されそして非同義変異体（ｎｏｎ−ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔｓ）であることが示された。これは、著者に５０人のＣＤ患者におけるこの遺伝子の完全なコード配列の配列決定をすることを促した。２つの追加の非同義的突然変異（ＳＮＰ１２およびＳＮＰ１３）が見出された。ＳＮＰ１３は、家系伝達不平衡テスト（ｐｅｄｉｇｒｅｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｔｅｓｔ）を使用して最も有意に関連していた（ｐ＝６×１０−６）。他の独立した研究では、同じ変異体が４人の対照と比較して１２人の罹患個体（ａｆｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）からのこの遺伝子のコード領域を配列決定することによっても見出された（Ｏｇｕｒａ ｅｔ ａｌ，ｍ ２００１）。ＳＮＰ１３の低頻度対立遺伝子（ｒａｒｅ ａｌｌｅｌｅ）はＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質をトランケートすることが予測された１ｂｐ挿入に対応していた。この対立遺伝子は、対照に比べて有意により低い頻度ではあるが、健常な個体にも存在していた。
【０１１３】
同様に、Ｌｅｓａｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）は、１６６人の散発性症例（ｓｐｏｒａｄｉｃ ｃａｓｅｓ）および２８７の家族性症例（ｆａｍｉｌｉａｌ ｃａｓｅｓ）を含むＣＤを有する４５３人の患者、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を有する１５９人の患者および１０３人の健康な対照被検体におけるＣＡＲＤ１５の突然変異分析を、コード領域の系統的配列決定により行った。同定された６７の配列変異のうち、９つはＣＤを有する患者において＞５％の対立遺伝子頻度を有していた。それらのうち６つは多型であると考えられ、そして３つ（ＳＮＰ１２−Ｒ７０２Ｗ、ＳＮＰ８−Ｇ９０８ＲおよびＳＮＰ１３−１００７ｆｓ）はＣＤに対する感受性と独立に関連していることが確認された。２７の低頻度の追加の突然変異も潜在的疾患原因突然変異（ＤＣＭｓ）であると考えられた。上記３つの主な変異体（Ｒ７０２Ｗ、Ｇ９０８Ｒおよび１００７ｆｓ）は、それぞれ、全ＣＤ突然変異の３２％、１８％および３１％を示し、これに対して、２７の低頻度突然変異の総計はＤＣＭｓの１９％を示した。要するに、突然変異の９３％は遺伝子の遠位３分の１（ｄｉｓｔａｌ ｔｈｉｒｄ）に位置していた。突然変異はＵＣと関連していることは見出されなかった。対照的に、二重突然変異を有する１７％を含めて、ＣＤを有する患者の５０％は、少なくとも１つのＤＣＭを有していた。
【０１１４】
本発明の更なる局面および利点を下記の実施例に開示する。これらは本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。
【０１１５】
実施例
１．ヒト染色体１７上の肥満感受性座の同定
Ａ．染色体１７感受性遺伝子を同定するためのＧｅｎｏｍｅＨＩＰプラットフォーム
２つの肥満感受性遺伝子の迅速な同定を可能とするためにＧｅｎｏｍｅＨＩＰプラットフォームを適用した。
【０１１６】
簡単に言えば、この技術は、関連した個体のＤＮＡからペアーを形成することからなる。各ＤＮＡを、その同定を可能とする特異的標識で標識する。次いで２つのＤＮＡ間でハイブリッドを形成する。次いで多段階手順で２つのＤＮＡからすべての同祖（ＩＢＤ）断片を選ぶ特定の方法（ＷＯ００／５３８０２）を適用する。次いで残りのＩＢＤに富んだＤＮＡを染色体上のＩＢＤフラクションのポジショニングを可能とするＢＡＣクローン由来のＤＮＡマイクロアレーに対してスコア化する。
【０１１７】
多くの異なる家族に対してこの方法を適用すると、各家族からの各ペアーについてＩＢＤフラクションのマトリックスが得られる。次いで統計的解析により、試験されるすべての家族間で共有される最小ＩＢＤ領域を計算する。有意な結果（ｐ値）は、関心のある特質（ここでは肥満）を有するボジティブ領域の連鎖の証拠である。連鎖した間隔（ｌｉｎｋｅｄ ｉｎｔｅｒｖａｌ）は、有意なｐ値を示す２つの最も遠く離れたクローンにより限界を定められうる。
【０１１８】
この研究では、甚だしい肥満（＞９０ｔｈパーセンタイルのボディマスインデックスにより定義された）に合致したドイツ起源の（１７８の独立した同胞ペアー）の１６４家族を、ＧｅｎｏｍｅＨＩＰプロセスに供した。次いで、得られるＩＢＤに富んだＤＮＡフラクションを、Ｃｙ５蛍光染料で標識し、そして１．２メガ塩基対の平均間隔で全ヒトゲノムを包含する２２６３ＢＡＣクローンからなるＤＮＡアレーに対してハイブリダイズさせた。Ｃｙ３で標識された選ばれなかったＤＮＡを使用してシグナル値を正規化しそして各クローンについて割合を計算した。次いで割合の結果のクラスタリングを行って、各クローンおよびペアーについてＩＢＤ状態を決定した。
【０１１９】
この手順を適用することにより、染色体１７上で約５．３５メガ塩基領域（塩基４２２０００００〜４７５５００００）に及んでいる、肥満に対する連鎖の有意な（ｐ値＜２．２Ｅ−０５）または示唆的（ｐ値＜７．４Ｅ−０４）証拠を示す、いくつかのＢＡＣクローンを同定した（表３）。
【０１２０】
表３：ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰの領域における染色体１７についての連鎖結果：
連鎖の証拠を有する３つのＢＡＣクローンに相当する領域が示される。クローンの開始および停止位置は各々染色体の開始に対するＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ３４配列に基づくそれらのゲノム位置に対応する（ｐ−ｔｅｒ）。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】
Ｂ．染色体１７上の肥満感受性遺伝子の同定
上記した５．３５メガ塩基染色体領域をスクリーニングすることにより、我々は、肥満および関連した表現型のための候補として、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）および胃阻害ペプチド（ＧＩＰ）遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、上記表３に概説されたクローンにより限界を定められた連鎖の証拠を伴って、実際にクリティカルな間隔（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｖａｌ）で存在する。
【０１２３】
Ｈｏｒｔ等（１９９５）は、予測された９５アミノ酸配列ポリペプチドをコードするＰＰＹ遺伝子（ｍＲＮＡ ４２５ｂｐ）および予測された９７アミノ酸配列ポリペプチドをコードするＰＹＹ遺伝子（ｍＲＮＡ ５８２ｂｐ）は１７ｑ２１．１上で約１０ｋｂ離れて位置していることを示した。２つの遺伝子によりコードされたペプチド、それぞれ、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）およびペプチドＹＹ（ＰＹＹ）は、高い配列相同性を示すペプチドの神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）ファミリーに属する。３つの遺伝子間の配列比較に基づいて、ＮＰＹおよびＰＹＹは遺伝子重複事象の結果でありそしてその後のタンデム重複はＰＰＹ遺伝子を産生したことが結論された（Ｈｏｒｔ ｅｔ ａｌ． １９９５）。
【０１２４】
これらの３つの内在性ペプチドに対する異なるアフイニティーを有する多重受容体サブタイプが同定された。ＮＰＹおよびＰＹＹはＹ１、Ｙ２およびＹ５受容体に対して最も高いアフイニティーを有し、ＰＰはＹ４部位に対する内在性リガンドである（Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＰＹＹの別の内在性形態、ＰＹＹ（３−３６）は、主としてＮＰＹ発現ニューロン上に見いだされるシナプス前受容体であると考えられるＹ２部位に対する増加したアフイニティーを示す（Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【０１２５】
食物摂取におけるＰＰおよびＰＹＹの多重作用は、今やげっ歯類およびヒトにおいて記載されている。
【０１２６】
げっ歯類へのＰＰの末梢投与は、食物摂取を減少させることが示された（Ａｓａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＰＰの静脈内注入は、健康なボランティアにおいて食欲と食物摂取の両方の持続した減少を引き起こした（Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【０１２７】
Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（２００２）は、ラットにおけるＰＹＹ（３−３６）の末梢注射は食物摂取を抑制しそして体重増加を減少させることを示した。ＰＹＹ（３−３６）は、マウスにおいても食物摂取を抑制するが、Ｙ２ｒヌルマウスではそうではなく、これは食欲減退効果はＹ２受容体を必要とすること示唆する。ヒトでは、正常な食後の濃度のＰＹＹ（３−３６）の注入は食欲を有意に減少させそして２４時間にわたり食物摂取を３３％減少させた（Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００２）。従って、ＰＹＹ（３−３６）の食後の上昇は、弓状核Ｙ２Ｒを介して作用して、腸−視床下部経路における栄養補給（ｆｅｅｄｉｎｇ）を抑制することができる。
【０１２８】
更にＰＹＹは、視床下部における食欲回路をモジュレーションすることにより食物摂取を減少させる。Ｂａｔｔｅｒｈａｍ等（２００３）は、肥満した被検体はＰＹＹの食欲減退効果に対して抵抗性ではないことを見出した。内在性ＰＹＹレベルは、肥満した被検体において低かったが、これは、ＰＹＹ不足は肥満の発病学に寄与することができることを示唆する。
【０１２９】
グルコース依存性インスリン刺激性ポリペプチド（ＧＩＰ）としても知られている胃抑制ポリペプチドは、グルコースの存在下にインスリン分泌を刺激する４２アミノ酸ホルモンである。その配列は、それがセクレチン、グルカゴン、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドおよび成長ホルモン放出因子を含む構造的に関連したホルモンのファミリーのメンバーであることを示す。Ｔａｋｅｄａ等（１９８７）は、ヒトＧＩＰ前駆体をコードするｃＤＮＡクローンを単離しそして配列決定した。前駆体の予想されたアミノ酸配列はＧＩＰが１５３残基前駆体、プレプロＧＩＰのタンパク分解プロセッシングにより誘導されることを示す。ＧＩＰ部分は、それぞれ、そのアミノ末端およびカルボキシル末端で５１および６０アミノ酸のポリペプチドセグメントによりフランキングされている。ＧＩＰは、単一のアルギニン残基においてプロセッシングすることにより前駆体から放出される。
【０１３０】
Ｍｉｙａｗａｋｉ等（２００２）は、ＧＩＰを介する肥満促進の新規な経路を記載している。高脂肪食を与えられた野生型マウスは、ＧＩＰの分泌過剰およびインスリン抵抗を伴う過度の内臓および皮下脂肪堆積の両方を示した。対照的に、高脂肪食を与えられたＧＩＰ受容体を欠いているマウス（Ｇｉｐｒ（−／−）は、肥満およびインスリン抵抗性の両方から明らかに保護された。更に、Ｇｉｐｒ（−／−）マウスと肥満ｏｂ／ｏｂ（Ｌｅｐ（ｏｂ）／Ｌｅｐ（ｏｂ）マウスを交雑させることにより発生した二重ホモ接合マウス（ｄｏｕｂｌｅ−ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｍｉｃｅ）（Ｇｉｐｒ（−／−），Ｌｅｐ（ｏｂ）／Ｌｅｐ（ｏｂ））は、体重増加がより少なくそしてＬｅｐ（ｏｂ）／Ｌｅｐ（ｏｂ）マウスよりも低い脂肪症を有していた。Ｇｉｐｒ（−／−）マウスは、より低い呼吸商を有しておりそしてより好むエネルギー基質として脂肪を使用し、従って肥満に抵抗性であった。従って、ＧＩＰは、栄養過多を肥満に直接関連させそしてそれは抗肥満薬のための潜在力のある標的である。
【０１３１】
Ｓｉｒｉｎｅｋ等（１９８６）は、病的肥満のインスリン過剰症および胃バイパス後のその改善は、手術前のＧＩＰの顕著に高められたレベルおよびバイパス後のその減少した放出により引き起こされうることを示した。
【０１３２】
ＧＩＰは脂質生理学において役割を演じると思われそして増加した栄養ロードに応答する高められたレベルのＧＩＰは肥満と関連していたので、ＧＩＰ作用に対する拮抗が、肥満のための治療ストラテジーとして提唱された（Ｍｅｉｅｒ ａｎｄ Ｎｕｃｕｃｋ．，２００４）。
【０１３３】
ＧＩＰの異常な機能は、２型糖尿病とも関連していた。ＧＩＰは健康なヒトにおけるインスリン放出を強く刺激するが、このペプチドは、２型糖尿病を有する患者においてはそのインスン刺激性効果を殆ど完全に失った。
【０１３４】
Ｌｙｎｎ等（２００３）は、ＧＩＰ受容体（ＧＩＰＲ）は、膵島への脂肪酸負荷により正常血糖に制御されるが、しかしながら、高血糖状態にさらされると、ＧＩＰＲはダウンレギュレーションされ、これは２型糖尿病で観察されるＧＩＰに対する減少した応答に寄与しうる、という証拠を提示した。
【０１３５】
ＧＩＰのインスリン刺激性活性により、２型糖尿病の潜在力のある治療としてホルモンを利用する際に関心の相当な増加もあった。（Ｇａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【０１３６】
染色体１７での肥満に連鎖した遺伝子変化の限界的間隔におけるヒトＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子を同定する、本願で提供された連鎖結果を、食物摂取およびエネルギー消費の制御に関与するＮＰＹ／ＰＰシグナリング経路におけるＰＰＹおよびＰＹＹの関与および栄養過多におけるＧＩＰの関与と一緒に合わせて、本発明者は、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子又はその調節配列における変化（例えば突然変異および／または多形）は、ヒト肥満の発生に寄与することができそして診断のための新規な標的を表すことができると結論する。
【０１３７】
２．関連の研究
連鎖の研究のために使用された同じ家族を、伝達不平衡テスト（ＴＤＴ）を使用する問題の特定の表現型（ここでは肥満）と特異的マーカー対立遺伝子を含有する遺伝子マーカー対立遺伝子またはハプロタイプとの関連について試験するためにも使用した。ＴＤＴは強力な関連テストである。何故ならば、それは試験されたサンプルにおける集団層別化問題に感受性ではないからである。簡単に言えば、ヘテロ接合性両親からそれらの罹患した子孫への対立遺伝子の分離を試験する。非伝達対立遺伝子に比べて罹患子孫に伝達された対立遺伝子の部分を、無作為分布下に期待された割合と比較する。期待値を超える有意に過剰の対立遺伝子伝達は、それぞれの対立遺伝子またはハプロタイプの研究された肥満表現型との関連のための証拠である。
【０１３８】
この分析の結果は、ＧＩＰ遺伝子のある対立遺伝子は、肥満とポジティブに関連しており、従って疾患に対する感受性を増加させることを示す。試験された集団では、例えばＳＮＰ１０の対立遺伝子Ｃは、ＤＤＴにより決定されたとおり、肥満と相関している（ｐ値＝０．００７）。対照的に、ＳＮＰ１０の対立遺伝子Ｔは、自閉的個体（ａｕｔｉｓｔｉｃ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）に有意に低く伝達され（ｕｎｄｅｒｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ）、これは、この対立遺伝子が疾患から保護するのを助けることを示す。
【０１３９】
肥満と関連した他のＳＮＰは、表３において肥満患者への対立遺伝子の伝達の実施例に示されたＳＮＰ９を含む。
【０１４０】
肥満患者への対立遺伝子の伝達および非伝達の例を表４に示す。
【０１４１】
【表４】
【０１４２】
更に、ＳＮＰ４〜１１に対するハプロタイプを構築してすべてのＳＮＰについてフェイズを同定した。
【０１４３】
試験した集団におけるこの分析の結果は、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子のあるハプロタイプは肥満とポジティブに関連しており、従って疾患に対する感受性を増加させることを示した。他方、あるハプロタイプは、肥満患者に優先的に伝達されず、これは疾患から保護するのを助ける。肥満患者に優先的に伝達されるハプロタイプの例は、ＳＮＰ１０−ＳＮＰ１１に対するハプロタイプＣ−Ａ、ｐ＝０．００４、である。肥満患者に優先的に伝達されないハプロタイプの例は、ＳＮＰ１０−ＳＮＰ１１に対するハプロタイプＴ−Ｔ、ｐ＝０．００５、である。
【０１４４】
肥満患者への優先的に伝達されるハプロタイプおよび優先的に伝達されないハプロタイプの例を表５に示す。
【０１４５】
【表５】
【０１４６】
更に、極端な早期開始肥満（症例）を有する５６４個体および３２８の健康な個体（対照）を含む、独立した症例／対照関連研究を行って、マーカー対立遺伝子、ハプロタイプおよび／またはジェノタイプと肥満の関連を試験した。
【０１４７】
ＰＹＹおよびＰＰＹ遺伝子＋周囲の５’および３’領域を含む染色体領域を包含するＳＮＰ４〜８がこの研究においてジェノタイピングのために選ばれた。
【０１４８】
ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６に対するハプロタイプを構築して、ＰＨＡＳＥプログラム（バージョン：２．０；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）を使用してすべてのＳＮＰについてフェイズを同定した。患者におけるハプロタイプの分布を決定し、そして対照群におけるハプロタイプの分布と比較した。
【０１４９】
肥満患者と対照間のＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６のハプロタイプの分布の統計的分析は、肥満に対する相関（ｐ＝０．０２）を示した。表６に示されたとおり、ハプロタイプＧ−Ｇ−Ａ（２５．９％対２３．７４％）は、対照と比較して肥満固体（症例）においてより高い頻度で観察されたが、ハプロタイプＴ−Ａ−Ａ（５２．４８％対５４．０１）は、対照に比べて肥満患者において低く表現された（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）。
【０１５０】
【表６】
【０１５１】
ＳＮＰ７およびＳＮＰ８の対立遺伝子の分布を患者と対照間で各々独立に比較した。患者と対照における各ＳＮＰの対立遺伝子の分布に基づいて、オッズ比および対応する信頼区間を計算して関連の程度を測定した。１より大きいオッズ比は、試験した遺伝子マーカーが疾患と関連しており、従って疾患に対する感受性を増加させるであろうということを意味する。オッズ比が１より小さければネガティブな関連があり、そして試験した遺伝子マーカーは疾患から保護することを助ける。
【０１５２】
この分析の結果は、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８のある対立遺伝子は肥満と各々独立に関連していることを示す。対照と比較して患者においてＳＮＰ７の対立遺伝子Ｔのより高い頻度が観察されて（０．４２対０．３７）、対立遺伝子Ｃを有する個体に対する対立遺伝子Ｔを有する個体の１．２４のオッズ比をもたらす（９５％ＣＩ：１．０１−１．５１、ｐ＝０．０３９５）。ＳＮＰ８の対立遺伝子Ｔも、対照に比べて患者においてより頻繁に存在して（０．３９対０．３４）、対立遺伝子Ｃを有する個体に対する対立遺伝子Ｔを有する個体の１．２４のオッズ比をもたらす（９５％ＣＩ：１．０２−１．５２、ｐ＝０．０３５１）。更に、対照に比べて患者の両ＳＮＰでホモ接合ＴＴジェノタイプのより高い頻度が観察された（ＳＮＰ７では０．１７対０．１３およびＳＮＰ８では０．１４対０．１０）。これはジェノタイプＣＣのキャリヤーに対するＳＮＰ７のジェノタイプＴＴのキャリヤーの１．５６のオッズ比をもたらした（９５％ＣＩ：１．０１−２．４０、ｐ＝０．０４２５）。１．６０のオッズ比（９５％ＣＩ：１．０１−２．５２、ｐ＝０．０４２２）が、ジェノタイプＣＣのキャリヤーに対してＳＮＰ８のジェノタイプＴＴのキャリヤーについて決定された。
【０１５３】
結果は、ＳＮＰ７およびＳＮＰ８の対立遺伝子Ｃが肥満とネガティブに関連していることも示す。対照に比べてＳＮＰ７の対立遺伝子Ｃのより低い頻度が患者において観察されて（０．５８対０．６３）、対立遺伝子Ｔを有する個体に対する対立遺伝子Ｃを有する個体の０．８１のオッズ比をもたらした（９５％ＣＩ：０．６６−０．９９、ｐ＝０．０３９５）。更に、ＳＮＰ８の対立遺伝子Ｃも、対照に比べて患者においてより頻繁に低く表現されて（０．６１対０．６６）、対立遺伝子Ｔのキャリヤーに対するこの対立遺伝子のキャリヤーの０．８１のオッズ比をもたらした（９５％ＣＩ：０．６６−０．９９、ｐ＝０．０３５１）。更に、対照に比べて患者における両ＳＮＰでホモ接合ＣＣジェノタイプのより低い頻度が観察された（ＳＮＰ７では０．３３対０．３９およびＳＮＰ８では０．３７対０．４３）。これは、ジェノタイプＴＴのキャリヤーに対するＳＮＰ７のジェノタイプＣＣのキャリヤーの０．６４のオッズ比をもたらした（９５％ＣＩ：０．４２−０．９９、ｐ＝０．０４２５）。、ジェノタイプＴＴのキャリャーに対するＳＮＰ８のジェノタイプＣＣのキャリヤーの０．６３のオッズ比（９５％ＣＩ：０．４０−０．９９、ｐ＝０．０４２３）が決定された。
【０１５４】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ゲノム．ハイブリッド．アイデンティティー．プロファイリング）（ＧｅｎｏｍｅＨＩＰ）を使用する高密度マッピング 全ヒトゲノムを表すクローン間の１．２メガ塩基対の平均間隔を有する総計２２６３のＢＡＣクローンを、ＧｅｎｏｍｅＨＩＰを使用して連鎖について試験した。ｘ軸における各点はクローンに対応する。いくつかのクローンはより良好な配向のためのそれらのライブラリー名により示される（例えば、ＢＡＣＡ９ＺＦ１０）。連鎖のための有意な証拠が、クローンＢＡＣＡ９ＺＦ１０について計算された（ｐ値１．７×１０−５）。連鎖のための示唆的証拠が、クローンＢＡＣＡ１２ＺＡ０６およびＢＡＣＡ１６ＺＦ０２について計算された（それぞれ、ｐ値２．１×１０−５および７．３×１０−５）。全連鎖領域は、ヒト染色体１７上の４２２１４７５９塩基対から出発して４７５４５８７６塩基対までの領域を包含する。有意な連鎖のための有意水準に対応するｐ値２×１０−５および示唆的連鎖のための有意水準に対応するｐ値３×１０−４が、ＬａｎｄｅｒおよびＫｒｕｇｌｙａｋ（１９９５）により提唱された全ゲノムスクリーンのための有意水準として使用された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体における肥満又は関連した代謝障害の存在もしくは素因、または肥満又は関連した代謝障害からの保護を検出する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が、肥満または関連した障害の存在もしくは素因、または肥満又は関連した障害からの保護を示す、方法。
【請求項２】
肥満又は関連した代謝障害の処置に対する被検体の応答を評価する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が、該処置に対する特定の応答を示す、方法。
【請求項３】
被検体における肥満または関連した疾患を予防する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出し、該変化の存在が肥満または関連した障害の素因を示し；そして肥満又は関連した障害に対する予防処置を行うことを含む、方法。
【請求項４】
ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における前記変化が、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における突然変異、欠失および挿入から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在が、配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅により検出される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記変化が、肥満と関連した１つ又は複数のＳＮＰ又は肥満と関連したＳＮＰのハプロタイプである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
肥満と関連した前記ハプロタイプが、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
肥満と関連した前記ハプロタイプが、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
肥満と関連した前記ハプロタイプが、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハプロタイプが、ＳＮＰ４またはＳＮＰ８またはその両方を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
肥満と関連した前記ハプロタイプが、ＳＮＰ９およびＳＮＰ１０を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
肥満と関連した前記ハプロタイプが、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
肥満と関連した前記ハプロタイプが、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
肥満と関連した前記ＳＮＰが、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群において選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
肥満と関連した前記ＳＮＰが、ＳＮＰ７又はＳＮＰ８である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
肥満と関連した前記ＳＮＰが、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０またはＳＮＰ１１である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記変化がＰＹＹ遺伝子座にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記変化がＰＰＹ遺伝子座にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記変化がＧＩＰ遺伝子座にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
被検体における肥満又は関連した代謝障害の存在もしくは素因、または肥満又は関連した代謝障害からの保護を検出する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が、肥満または関連した障害の存在もしくは素因、または肥満又は関連した障害からの保護を示す、方法。
【請求項２】
肥満又は関連した代謝障害の処置に対する被検体の応答を評価する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が、該処置に対する特定の応答を示す、方法。
【請求項３】
被検体における肥満または関連した疾患を予防する方法であって、被検体からのサンプル中のＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在を検出し、該変化の存在が肥満または関連した障害の素因を示し；そして肥満又は関連した障害に対する予防処置を行うことを含む、方法。
【請求項４】
ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における前記変化が、ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における突然変異、欠失および挿入から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＰＰＹ、ＰＹＹおよび／またはＧＩＰ遺伝子座における変化の存在が、配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅により検出される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記変化が、肥満と関連した１つ又は複数のＳＮＰ又は肥満と関連したＳＮＰのハプロタイプである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
肥満と関連した前記ハプロタイプが、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群より選ばれるＳＮＰを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
肥満と関連した前記ハプロタイプが、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５およびＳＮＰ６を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
肥満と関連した前記ハプロタイプが、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６およびＳＮＰ７を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハプロタイプが、ＳＮＰ４またはＳＮＰ８またはその両方を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
肥満と関連した前記ハプロタイプが、ＳＮＰ９およびＳＮＰ１０を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
肥満と関連した前記ハプロタイプが、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
肥満と関連した前記ハプロタイプが、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
肥満と関連した前記ＳＮＰが、ＳＮＰ７、ＳＮＰ８、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０およびＳＮＰ１１からなる群において選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
肥満と関連した前記ＳＮＰが、ＳＮＰ７又はＳＮＰ８である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
肥満と関連した前記ＳＮＰが、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０またはＳＮＰ１１である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記変化がＰＹＹ遺伝子座にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記変化がＰＰＹ遺伝子座にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記変化がＧＩＰ遺伝子座にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２００７−５３００２８（Ｐ２００７−５３００２８Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０４５１２（Ｐ２００７−５０４５１２）
【出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００１０３０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９０６００
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５０１３５８０６８）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＥＧＲＡＧＥＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００１０３０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９０６００
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５０１３５８０６８）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＥＧＲＡＧＥＮ
【Ｆターム（参考）】
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