ポリウレタンコーティングへの酵素の不可逆的固定化
【解決手段】ポリウレタン及び酵素含有ポリウレタンの中で、ほぼ１００％の酵素を不可逆的に固定化する方法を提供する。酵素の存在下で水性ポリウレタンコーティングを合成することにより、酵素は、ポリマーマトリックスへ不可逆的に固定される。固定化された酵素の分布と活性保持は、ポリウレタンの内部で均一である。重合において、低疎水性のポリイソシアネート・プレポリマーを使用することにより、ＥＣＣの疎水性が低下すると、ＥＣＣの固有活性は著しく増大する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００２年７月２４日に出願された米国特許出願第１０／２０２,２２４号に基づく一部継続出願であり、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９(ｃ)の規定に基づいて、２００１年７月２４日に出願された仮特許出願第６０／３０７,４５０号、発明の名称「ポリウレタンコーティング内へのジイソプロピルフルオロフォスファターゼの不可逆的固定化」の利益を主張し、該出願は参照を以てその全体が本願に組み込まれる。
【０００２】
＜発明の分野＞
本発明は、ポリウレタン、特にポリウレタンのコーティング、接着剤及びシーラント内への酵素の不可逆的固定化(irreversible immobilization)に関する。
【背景技術】
【０００３】
固定化は、産業的プロセスにおいて、酵素の触媒への適用を可能にし、またその適用を拡大するために広く利用されている。この１０年間、種々の酵素によるバイオプラスチックの合成におけるポリマー支持体としてポリウレタンフォームが用いられてきた。ポリウレタンのスポンジ状ポリマーは、親水性のトルエンジイソシアネート(ＴＤＩ)基又はメチレンビス(ｐ-フェニルイソシアネート)(ＭＤＩ)基を含むポリイソシアネートプレポリマーと水とから合成される。モノリシックポリウレタンフォームの中に酵素を含めることによってしばしばもたらされる特徴として、固定化の程度が１００％近くなること、高活性が維持されることなどがある。ポリウレタンフォームにおける固定化により熱安定性が向上することについても報告されている。
【０００４】
コーティング及び薄い膜の中に生体分子(biological molecules)が挿入されると、適用範囲が大きく拡大する。例えば、電位差測定バイオセンサは、電極の検知面に隣接する内側フィルムの上に酵素が共有結合することがあり、その結果、酵素層は外側フィルムで保護される。アンペロメトリックバイオセンサの製作における他の固定化方法として、ゲル層の中に酵素を取り込み、外部保護フィルムによってさらにコートされるものがある。しかし、そのようなシステムの寿命と使用は、酵素が外側メンブレンを通って拡散することによる制限を受け易い。この主な不都合を解消させるには、酵素は、共有結合で直接コーティングの中に固定されなければならない。コーティングの中に生体触媒(biocatalyst)を共有結合させることは、他のバイオプロセス(例えば、生体触媒分離及び濾過、マイクロチップ及び汚れ止め等)に対しても利点をもたらす。
【０００５】
高活性酵素をコーティングや膜の中で直接共有結合により固定化させることは、依然としてとらえどころのない目標であり、最も成功したやり方でも最大０.５％の活性を示すに過ぎない。水性ポリウレタンコーティングは、水分散性ポリイソシアネートを有する水性ポリオールの重合によって生じる。フィルムは室温で硬化するので、水は蒸発し、ヒドロキシル基とイソシアネート官能基との間の縮合(condensation)により架橋が生じる。２成分水性ポリウレタンは、溶剤型ポリウレタンコーティングと同様な特性を示すので、産業用としての使用量が増加している。水性ポリウレタンコーティングは、酵素の多点及び共有結合による固定化に対して、理想的なポリマーマトリックスである。
【０００６】
上記のとおり、当該分野では、重合が行われる前に、酵素を２成分系の水性相に直接添加できる方法が要請されている。固定化プロセスは、アミンが、プレポリマーに対するヒドロキシル基よりも速い速度にて、酵素表面でイソシアネート官能基と反応する能力に依存する。
【発明の開示】
【０００７】
＜発明の概要＞
本発明は、酵素をポリウレタン材料に不可逆的に固定化する方法を含んでおり、該方法は、１又は複数のポリオールディスパーション共反応物と１又は複数の酵素との混合物を反応させて水性混合物を生成するステップ、ポリウレタン材料を生成可能なディスパーションを生成するのに十分な量の１又は複数の水分散性ポリイソシアネートを水性混合物に加えるステップ、前記ディスパーションを１又は複数の基質(substrates)に加えて酵素含有材料を生成するステップ、及び、前記酵素含有材料を硬化させるステップ、を含んでいる。この方法は、酵素含有ポリウレタンのコーティング、接着剤及びシーラントの生成に特に有用である。
【０００８】
また、本発明は、ジイソプロピルフルロフォスファターゼを、ポリウレタン、特にポリウレタンのコーティング、接着剤及びシーラントに不可逆的に固定化する方法を含んでおり、該方法は、ポリオールディスパーション共反応物の混合物を、ディスパーション(好ましくは、約１０〜約９０重量％の水分、ポリエーテル変性ポリジメチルシロキサン界面活性剤、緩衝媒体(好ましくは、ビストリスプロパン緩衝剤及びＣａＣｌ2を含む)及びジイソプロピルフルロフォスファターゼ)と反応させて、水性混合物を生成するステップ、水分散性ポリイソシアネート(好ましくは、ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとするポリイソシアネート)を前記水性混合物に加えて、ディスパーション又はエマルジョンを生成するステップ、前記ディスパーション又はエマルジョンを基質に施して、酵素含有材料、好ましくはコーティング、接着剤又はシーラントを生成するステップ、及び、酵素含有材料、好ましくはコーティング、接着剤又はシーラントを硬化させるステップを含んでいる。
【０００９】
また、本発明は、ポリオールディスパーション共反応物と酵素との混合物を反応させて水性混合物を生成するステップ、ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする水分散性ポリイソシアネートを水性混合物に加えて、反応させて、ディスパーション又はエマルジョンを生成するステップ、前記ディスパーション又はエマルジョンを基質に施して、酵素含有のコーティング、接着剤又はシーラントを生成するステップ、及び、酵素含有のコーティング、接着剤又はシーラントを、周囲環境条件下で約１２時間硬化させるステップを有するプロセスによって作られた酵素含有のコーティング、接着剤又はシーラントを含んでいる。
【００１０】
本発明のこれら及びその他の利点は、以下の望ましい実施例の詳細な説明により理解されるであろう。
【００１１】
＜望ましい実施例の詳細な説明＞
本発明は、酵素を、水性ポリウレタン材料(例えば、コーティング、接着剤及びシーラント)に固定化することに関する。かかる酵素の一例として、ジイソプロピルフルロフォスファターゼ(ＤＦＰａｓｅ, Ｅ.Ｃ.３.８.２.１)である。なお、当業者であれば、広範囲に亘る種々の酵素及び抗体が用いられることは認識し得るであろう。ネイティブな(天然の)ＤＦＰａｓｅは、毒性有機リン剤の神経剤(例えば、ソマン、ジイソプロピルフルオロフォスフェート(ＤＦＰ)等)の加水分解を触媒する。従来、ＤＦＰａｓｅは、モノリシックポリウレタンフォームに共重合されることにより、活性が６７％保持され、熱安定性が向上する。酵素含有コーティング(enzyme-containing coating: ＥＣＣ)の親水性が変化すると、活性保持及び安定性に影響を及ぼすので、本発明の固定化プロセスは、様々な親水性を有するポリイソシアネートプレポリマーを用いて行われた。酵素が支持体に不可逆的に固定される程度が決められる。コーティング内の酵素の分布は、金標識(gold-labeling)を用いて観察した。酵素ポリマーの活性に及ぼす質量移動の影響は、拡散セル装置を用いて調べた。固定化によるＤＦＰａｓｅの熱安定性の向上についても調べた。
【００１２】
水性ポリウレタンのコーティング、接着剤及びシーラントは、ポリオールディスパーション又はポリオールディスパーションの混合物を、水分散性ポリイソシアネート又はポリイソシアネートの混合物と反応させることにより生成されることができる。このようなプロセスに適した公知の方法及び材料として、例えば、米国特許第４,６６３,３７７号、第５,０７５,３７０号、第５,０９８,９８３号、第５,３８９,７１８号及び第５,２００,４８９に開示されたものがあり、これらは引用を以て本願への記載加入とする。
【００１３】
＜材料及び方法＞
｛材料｝
水の中に十分分散され、コーティング、接着剤又はシーラントを生成することのできるポリイソシアネートであれば既知のあらゆるポリイソシアネートを、本発明の実施に用いることができる。特に適したポリイソシアネートは、水分散性脂肪族ポリイソシアネートであり、例えば、ＢＡＹＨＹＤＵＲポリイソシアネートであるＸＰ−７０６３、 ＸＰ−７００７、 ＸＰ−７１４８及びDesmodur N3400がある。コーティング、接着剤及び／又はシーラントの生成に有用であると知られたあらゆるポリオール又はポリオールディスパーションを、本発明の実施に用いることができる。ポリオールディスパーションは、例えば、ＢＡＹＨＹＤＲＯＬポリオールＸＰ−７０９３が特に好ましい。なお、本願明細書において、ディスパーションとエマルジョンという語は、置き換え可能に用いられる。ディスパーションが施される基質は、ポリウレタンが接着可能な任意の材料から構成される。適当な基質として、木(wood)、スチール、ガラス、コンクリート及びプラスチックが挙げられる。熱可塑性ポリオレフィン(ＴＰＯ)パネルが特に好ましい。蛋白質含有コーティングの合成及び硬化に用いられるポリイソシアネート、ポリオール及びＴＰＯパネルについて、以下により詳しく説明するが、これらはBayer Co. (Pittsburgh, PA)から提供された。ＢＡＹＨＹＤＵＲポリイソシアネートＸＰ−７０６３、 ＸＰ−７００７、 ＸＰ−７１４８及びDesmodur N3400は、ヘキサメチレンジイソシアネート(ＨＤＩ)をベースとする水分散性脂肪族ポリイソシアネートである。ＢＡＹＨＹＤＲＯＬポリオールＸＰ−７０９３は、ポリオールディスパーションである。界面活性剤ＢＹＫ−３４５は、ポリエーテル変性ポリジメチルシロキサンであり、BYK−Chemie(Wallingford, CT)から入手した。ジイソプロピルフルオロフォスフェート(ＤＦＰ)、ブラッドフォード試薬(Bradford reagent)、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、ビストリスプロパン、トリス(ヒドロキシルメチル)アミノメタンＨＣｌ(Tris-ＨＣｌ)、ＣａＣｌ2、ＮａＣｌ、Ｋ2ＣＯ3及びイソプロパノールは、Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO)から購入した。ＤＦＰａｓｅはBioCatalytics, Inc. (Pasadena, CA)から購入した。包理樹脂Polybed 812はエポキシ樹脂であり、Polysciences (Warrington, PA)から入手した。
｛方法｝
【００１４】
［ＥＣＣの合成］
ＥＣＣ'ｓは、水性混合物(１０ｍＭビストリスプロパン緩衝剤、ｐＨ７.５、５ｍＭ ＣａＣｌ2)を緩衝剤として用いて調製した。水性の２成分ポリウレタンは、ヘキサメチレンジイソシアネート(ＨＤＩ)ＢＡＹＨＹＤＵＲ及びポリオールディスパーション共反応剤ＢＡＹＨＹＤＲＯＬをベースとする水分散性脂肪族ポリイソシアネートを用いて合成した。ＥＣＣの合成が行われる間、イソシアネートとヒドロキシル官能基の比は２であった。一般的には、ＢＡＹＨＹＤＲＯＬ ＸＰ−７０９３(２.５ｇ)(水分７０重量％)、界面活性剤ＢＹＫ−３４５(０.１ｇ)及び緩衝媒体(１.２ｇ)を円筒形容器の中に注いだ後、酵素ＤＦＰａｓｅ(０.０２〜９ｍｇ)を追加した。水溶液を１分間機械的に撹拌した(３００ｒｐｍ)。ＥＣＣの合成に必要なＢＡＹＨＹＤＵＲ ＸＰ−７０６３、ＸＰ−７００７、ＸＰ−７１４８の量は、ポリイソシアネートの等モル重量から算出した。ＸＰ−７００７を用いるとき、ポリイソシアネート(１ｇ)を水溶液に加えた後、二相混合物を、２５００ｒｐｍの手持ち式ドリルに取り付けられた特注仕様のヘッドを用いて２０秒間撹拌した。混合後、水分６３％の白色エマルジョンが得られた。このエマルジョン(０.４５ｇ)を、予めイソプロパノールで清浄化された熱可塑性ポリオレフィン(ＴＰＯ)に加えて、周囲環境条件の下で乾燥した。次に、ＥＣＣを周囲環境条件下で１２時間かけて硬化させ、再び重量測定した(０.２４ｇ)。
【００１５】
ビストリスプロパンは、ヒドロキシル基及び二次アミンを含んでおり、コーティングの合成中、イソシアネートと反応することができる。反応混合物に加えられた緩衝塩の量は、ポリイソシアネート及びポリオールディスパーションの反応性官能基と比べると無視できる程度である。それゆえ、得られた２成分水性ポリウレタンの特性に影響を及ぼしたとは考えられない。
【００１６】
［蛋白質濃度の決定］
蛋白質の濃度は、ブラッドフォード試薬を用いて調べた。色素を室温の蛋白質溶液に加ると、色素−蛋白質の錯体(complex)が１５分以内に生成し、吸収極大は５９６ｎｍであった。蛋白質濃度範囲１〜１０ｍｇ／ｍｌに対して、減衰係数０.０３４１ｍｌ／ｍｇの較正曲線が得られた。
【００１７】
［酵素／金の複合物(conjugates)の合成］
直径２５〜３０ｎｍの金コロイドを調製し、金コロイドを水性媒体中でＤＦＰａｓｅに結合させた。具体的には、金溶液(１００ｍｌの０.０１％ＨＡｕＣｌ4.２Ｈ2Ｏ)をガラス製フラスコの中で沸騰するまで加熱した。クエン酸三ナトリウム(０.０１５％で５ｍｌ)を加え、混合物をさらに沸騰させた。オレンジ色／レッド色を持続した時が、コロイドの生成完了である。複合化が行われる間、ｐＨは、Ｋ2ＣＯ3を用いて、酵素等電点(ｐＩ５.８)を僅かに越えるように調節された。ｐＨの測定はリトマス紙を用いて行なった。例えば、３０ｍｌのゲルコロイド溶液(金濃度：０.０１％)を安定化させるのに、０.１２ｇの酵素が必要であった。ＤＦＰａｓｅを加えた後、酵素−金の溶液を緩やかに撹拌し、最終濃度が０.１％(ｗ／ｖ)になるまで、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)(１０％(ｗ／ｖ))を加えた。酵素でコートされなかったコロイド表面領域は、ＢＳＡでブロックされた。得られた溶液を、１００,０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、沈殿物中の酵素−金複合物を回収し、緩衝媒体(１０ｍＭ Tris-HCl，ｐＨ７.５)の中で再溶解した。遠心分離により、ある程度の金クラスターが生成した。沈殿物の高密度領域中に存在する最も大きなクラスターは廃棄した。それより小さなクラスターは、金コロイド複合物の中に存在する。さらに、前記のＢＡＹＨＹＤＵＲ ＸＰ−７００７を用いて、コーティングを調製した。なお、酵素に結合される金コロイドは異なる２種類の濃度(０.００１ｍｇgold／ｇcoatingと、０.０１２ｍｇgold／ｇcoating)を用いた。
【００１８】
［コーティング内での金−ＤＦＰａｓｅ複合物の局在化］
透過電子顕微鏡(ＴＥＭ)用フィルムを埋め込むために、小片を１００％エタノール中で数回洗浄した後、１時間毎に包理用樹脂Polybed 812を数回変えて培養した。幾つかの包埋媒体を用いてもよいことは理解されるべきである。用いられる包理媒体の大部分は、エポキシ樹脂及び変性エポキシ樹脂又はメタクリルポリマーである。フィルムは、１ｍｍ×２ｍｍの小片にカットし、包理用鋳型の中に入れ、Polybed 812の中に埋め込んだ。ブロックは、３７℃の温度で一晩中硬化させ、次に６５℃で２日間硬化させた。フィルムの極薄切片(６０ｍｍ)は、Reichart Ultracut E ミクロトームにて得た。切片は、ＪＥＯＬ ＪＥＭ １２１０又は１００ＣＸの透過電子顕微鏡にて８０ＫＶで観察した。
【００１９】
［フッ化物イオン電極使用によるＥＣＣ's の活性］
ＥＣＣの評価は、剥離されたＤＦＰａｓｅフィルム(重量０.００９〜０.０１２ｇ)の小片を用いて行なった。代表例として、小片を、１０ｍｌの３ｍＭ ＤＦＰ緩衝溶液(５ｍＭ ＣａＣｌ2及び１０ｍＭ ｐＨ７.５)の中に入れ、磁気撹拌により撹拌した。ＤＦＰａｓｅはＤＦＰ(下記参照)を結合及び加水分解することによって作用し、活性は、フッ化物イオン電極による室温での以下のフッ化物放出によって測定した。フッ化物のバルク溶液濃度は、２０秒毎に５分間測定した。
【００２０】
コーティング中の酵素濃度は、０〜２ｍｇ／ｇcoatingの範囲で変動した。酵素が高濃度のときのＥＣＣ'ｓは、初期速度に対してあまりに活性でありすぎて測定することができなかった。
【化１】
【００２１】
［フッ化物イオン使用による運動定数(kinetic contstants)の測定］
前述したフッ化物センサーを用いて運動定数を測定した。基質の濃度は、０〜２０ｍＭの範囲であった。データは、非線形回帰(Sigma Plot Version 2)を用いてミハエリス−メンテンの式に当てはめられた。
【００２２】
［拡散セル(diffusion cell)の実験］
拡散装置は、ドナーのコンパートメントと、レセプターのコンパートメントとを具えており、各コンパートメントに水ジャケットが配備されている。拡散システムは、容積３ｍｌ及び拡散断面積(ＩＤ＝９ｍｍ)のコンパートメントを有する２つのチャンバーが水平方向に並べて構成される。ＥＣＣは２つのコンパートメントの間に装填され、実験は室温(２２℃)で行なった。
【００２３】
［基質の有効拡散係数Ｄeffの測定］
基質の有効拡散係数Ｄeff(ｍ2／分)を当該分野で知られた手順に基づいて評価した。タチナタマメ(Jack beans)のウレアーゼタイプIII(ＥＣ.３.５.１.５)(Sigma製(St. Louis, MO)は、ＤＦＰａｓｅの存在を模擬するために、コーティングに固定化された(３.６ｍｇ／ｇcoating)。まず最初に、体積３ｍｌの緩衝媒体(５ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭビストリスプロパン、ｐＨ７.５)にＤＦＰ(４ｍＭ)を補填し、これをドナーセルに入れる、一方、レセプターセルには緩衝媒体(３ｍｌ)が充填される。各セルは、磁気撹拌によって撹拌した。所定時間(５〜３００分)経過した後、内容物を取り除いて、緩衝媒体(５ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭビストリスプロパン、ｐＨ７.５)で４回希釈した。次に、各試料のＤＦＰの濃度を、可溶性ＤＦＰａｓｅによる活性評価により求めた。Ｄeffは、準定常状態で算出した(式１)。
【００２４】
【数１】
【００２５】
[ＤＦＰ]Dは、ドナーセルにおけるＤＦＰの濃度(mol/ｍ3)である。[ＤＦＰ]Rは、レセプターセルにおけるＤＦＰの濃度(mol/ｍ3)である。Ｖcell (３.１０-6 ｍ3)はセルの容積である。Ａ(６.３６.１０-5 ｍ2)は拡散断面積である。ポリウレタンフィルムの膨張(swelling)が主に肉厚方向に起こると仮定し、濡れＥＣＣの厚さδ’を次のとおり求めた。
【００２６】
【数２】
【００２７】
乾燥状態のコーティング厚さδ(１０μｍ)を、走査型電子顕微鏡を用いて求めた。ε(０.７)は、濡れコーティング中に液相が占める全容積の割合である。
【００２８】
［活性の測定］
セルには、緩衝材(５ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭビストリスプロパン、ｐＨ７.５)が充填された。ドナーセルには最初にＤＦＰ(４ｍＭ)が補填された。レセプターセルのＤＦＰの初期濃度は、０又は４ｍＭのどちらかである。実験は、一定のＤＦＰａｓｅ-ＥＣＣ濃度(３.６ｍｇ／ｇcoating)を用いて行ない、基質の完全な分解は合理的な時間範囲内で起こった。各セルは磁気撹拌により十分な混合を行なった。所定時間(５〜１２０分)経過後、内容物を取り出して、緩衝媒体(５ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭビストリスプロパン、ｐＨ７.５)で４回希釈した。次に、各試料のＤＦＰの濃度を、可溶性ＤＦＰａｓｅによる活性アッセイにより求めた。
【００２９】
図１は、レセプターセルがｔ＝０秒でＤＦＰを含んでいないとき、ＤＦＰａｓｅ含有コーティングにおける拡散及び酵素反応が同時に行われたときのＤＦＰ濃度プロファイルの概略図である。１ｓは停滞溶液層、δはコーティング厚さである。ＣDFP,D,tはドナーセルの時間ｔにおけるバルクＤＦＰ濃度であり、ＣDFP,R,tはレセプターセルの時間ｔにおけるバルクＤＦＰ濃度である。ＣDFP,0,tはコーティングの表面での液相のＤＦＰ濃度であり、ＣDFP,δ,tはコーティングのある時間における液相のＤＦＰ濃度である。境界層の拡散抵抗及びＥＣＣ膨張を無視すると、ＤＦＰａｓｅ-ＥＣＣが非定常状態でのＤＦＰの濃度プロファイルは式３によって与えられる。
【００３０】
【数３】
【００３１】
[ＤＦＰ]lc(mol/ｍ3)は、コーティングの液相のＤＦＰ濃度であり、ｋcat，int(ｓ-1) 及びＫM(mol/ｍ3)は、ＥＣＣに固有の運動定数である。
初期条件は次の通りである。
【００３２】
【数４】
【００３３】
【数５】
【００３４】
ＥＣＣとドナーセルとの界面では、次の関係がある。
【数６】
【００３５】
[ＤＦＰ]0は、液相のＥＣＣ表面(Ｘ＝０)におけるＤＦＰ濃度を表している。Ｖsurface(mol/ｍ3.ｓ)は、コーティング表面(Ｘ＝０)でのＤＦＰの加水分解速度を表し(式７)、ＶRelease (mol/(ｍ3.ｓ)は、ＥＣＣ合成中に共有結合で固定化されておらず、ドナーセルの中に放出された酵素によって触媒された反応速度を表している(式８)
【００３６】
【数７】
【００３７】
なお、[ＤＦＰａｓｅ]Surface (mol/ｍ3)は、コーティング表面におけるドナーセルの単位容積当たりの酵素のモル数である。
【００３８】
【数８】
【００３９】
なお、[ＤＦＰａｓｅ]Release (mol/ｍ3)は、ドナーセルの容積に関して算出され、ｋcat,native及びＫM,nativeは表１に示されている(実験１a*)。
【００４０】
実験によりドナーセルとレセプターセルのＤＦＰ濃度プロファイルが得られると、式２は、Athena Visual Version 7.1.1により式３〜式７を用いて解が求められる。次に、ＥＣＣ、ＫM,int及びｋcatk,intの固有運動定数が算出される。
【００４１】
［Desmodur N3400ポリイソシアネートによる酵素の変性］
ＨＤＩの二量体及び三量体からなるDesmodur N3400 (１ｇ)に、ＤＦＰａｓｅ含有溶液(１ｍｌ)(５０ｍＭ ＭＯＰＳ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)を加えた。二相混合物を室温で撹拌した。変性された酵素の活性は、前述のフッ化物センサーによって求めた。
【００４２】
ＤＦＰａｓｅの変性度は直接求めることができないので、模擬的手段として、単一リジンを含有する低分子量ペプチド(１１８２.４ Ｄａ)であるブラジキニンポテンシエーターＢを用いて、Desmodur N3400と酵素リジン残基の反応を調べた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用し、様々な反応時間(１５分〜１７時間)におけるリジンの変性度を調べた。
【００４３】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析は、Perseptive Biosystems社のVoyager elite ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて行なった。加速電圧は線形モードで２０ｋＶに設定した。ＰＥＧ化酵素溶液(１〜２ｍｇ／ｍｌ)を等量のマトリックス溶液(水０.５ｍｌ、アセトニトリル０.５ｍｌ、ＴＦＡ２μｌ及びα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸)と混合し、２μｌの最終溶液をプレートターゲットにスポットした。溶媒混合物の蒸発後、スペクトルを記録し、ＦＭＲＰ及びＡＣＴＨで外部補正をした。
【００４４】
Desmodur N3400で変性されたＤＦＰａｓｅは、前述のポリウレタンコーティングの中へさらに固定化させた。
【００４５】
［ＥＣＣの熱安定性］
ネイティブで固定化されたＤＦＰａｓｅを、６５℃で培養された緩衝剤(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)に加えて、室温の前記緩衝媒体(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2 、ｐＨ７.５)中でアッセイを行なった。
【００４６】
室温でのＥＣＣ'ｓの熱安定性を調べた。周囲環境条件下で所定時間保存した後、ＥＣＣの試料について、前記緩衝媒体(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2 、ｐＨ７.５)中で室温活性を調べた。
【００４７】
＜結果及び検討＞
［ＥＣＣ'ｓに固定されたＤＦＰａｓｅの可逆性］
ＤＦＰａｓｅのポリマー固定化の不可逆性の程度を、ブラッドフォード試薬を用いて調べた。ＤＦＰａｓｅ含有ポリウレタンコーティングをパネルから剥がして、小片にカットし、蒸留水で十分洗浄した。洗浄物の中で検出されたＥＣＣ固定蛋白質は４％(ｗ／ｗ)未満であり、これは固定化率が１００％に近いことを示している。
【００４８】
［ＥＣＣ'ｓにおける酵素の分配］
酵素がフィルム内に取り込まれるとき、重要な問題は、酵素がフィルム内で均等に分配されているかどうかである。従来のモノリシックポリウレタンフォームに固定化された酵素を局在化するために、金標識を用いた。それゆえ、本発明では、金コロイド粒子に結合させることにより、ＤＦＰａｓｅをＥＣＣ'ｓに局在化させた。
【００４９】
図２は、ポリウレタンコーティングにおける酵素分布を示している。金／ＤＦＰａｓｅを含有するコーティングは、暗視野(Ａ；０.０００７ｍｇgold／ｇcoating)と光学顕微鏡で得られた逆像(ネガティブ像)(Ｂ；０.０１１６ｍｇgold／ｇcoating)を用いて分析した。ここでネガティブ像が用いられるのは、コーティングが厚く、金粒子が高濃度であるため、焦点像を得るのが困難であるからである。コーティングの断面は、透過電子顕微鏡を用いて得た(Ｃ及びＤ)。ヘッドが塗りつぶされた矢印は、金／酵素粒子の幾つかを示している。白抜きの矢印は、金／酵素結合クラスターの幾つかを示している。矢印ヘッドは、包理樹脂内部のコーティング試料の先端を示している。星印は、焦点の合っていない幾つかの領域を示しているが、これは、金粒子の濃度が高く、表面が不均一であることによる。コーティング中の泡は、文字ｈで示されている。Ｂに示されるサイズバーは、パネルＡとＢを表している。ＣとＤに示されるサイズバーは、これらパネルにおける寸法を示している。
【００５０】
図２Ａは、暗視野顕微鏡検査によって得られた金／ＤＦＰａｓｅ複合物含有コーティング(０.００１ｍｇgold／ｇcoating) の顕微鏡写真である。図２Ｂは、逆像光学顕微鏡検査によって得られた金／ＤＦＰａｓｅ複合物含有コーティング(０.０１２ｍｇgold／ｇcoating) の顕微鏡写真である。固定化された金コロイド／酵素複合物の濃度は１２倍増加しているので、固定化された金／酵素複合物はコーティング内で均一に分散していることは明らかである。金／酵素含有コーティング(０.０１２ｍｇgold／ｇcoating)の断面のＴＥＭは、図２Ｃに示されている(２５００倍拡大)及び図２Ｄ(１００００倍拡大)に示されている。光学顕微鏡の場合と同様、ＴＥＭもまた、金／酵素粒子及びクラスターが微小規模レベルではランダムに分配されていることを示している。これは、金／ＤＦＰａｓｅ複合物含有コーティングの合成により、ポリマーマトリックス中で金／ＤＦＰａｓｅ複合物は一様に固定化されることを意味するものである。外挿(extrapolation)により、フィルム中のＤＦＰａｓｅの局部濃度は位置依存性ではないと考えることができる。
【００５１】
［ＥＣＣ'ｓの活性］
ＥＣＣ'ｓの調製は、ポリイソシアネートプレポリマーであるＸＰ−７００７、ＸＰ−７１４８及びＸＰ−７０６３を用いて行なった。図３は、初期ＤＦＰａｓｅローディングの関数として、各ＥＣＣの活性を示している。活性は、酵素濃度に正比例しており、これは、質量移動に実質的制限がないことを意味する。図２は、フィルムが無孔(non-porous)であることを示しているので、この結果より、フィルムの薄い外部層の酵素だけが基質にアクセス可能であることを意味する(これについては後で詳しく説明する)。
【００５２】
ポリイソシアネートの親水性は、ＸＰ−７１４８＞ＸＰ−７０６３＞ＸＰ−７００７の順序で低下する。ここで、ＥＣＣ'ｓの見かけの活性保持は、ポリイソシアネートの親水性が低下するほど増大することは興味深いことである(図３参照)。脱水した有機溶媒における酵素活性を検討すると、酵素は疎水環境をより好むことがわかった。親水性の低いポリイソシアネートがすぐれたＥＣＣ材料であることは、偶然の一致でないことかもしれない。図３は合成されたコーティングを示しており、ｐＨ７.５の緩衝溶液(１０ｍＭビストリスプロパン、５ｍＭ ＣａＣｌ2)の中で、ポリオールＸＰ−７０９３及びポリイソシアネートＸＰ−７００７(塗りつぶした菱形)、ＸＰ−７０６３(塗りつぶした円)並びにＸＰ−７１４８(塗りつぶした正方形)で合成されたものである。塗りつぶした三角形は、Desmodur N3400で変性されたＤＦＰａｓｅ、ポリオールＸＰ−７０９３及びポリイソシアネートＸＰ−７００７を出発物質として合成したコーティングの見かけ活性に対応している。バイオプラスチックの活性は、３ｍＭ ＤＦＰ濃度でのものである。
【００５３】
ポリイソシアネートＸＰ−７００７を用いて作られたＥＣＣ'ｓが、最も高レベルの見かけ活性保持を有していた。それゆえ、その後の環境は、ＸＰ−７００７を含有するＥＣＣ'ｓで実施した。充填された酵素の全部が利用可能である(表１、実験１b*)と仮定して算出した見かけの運動特性により、内因性保持ではなく観察可能な活性保持(１１％)がもたらされた。
【００５４】
［ＥＣＣにおけるＤＦＰの有効拡散率Ｄeff］
ＥＣＣ'ｓの活性保持を理解するために、フィルム内の基質の拡散率を調べた。式１を使用して求めたＤeffは、(５＋／−１) ×１０-10ｍ2／分である。図４を参照すると、コーティングの合成は、ポリオールＸＰ−７０９３とポリイソシアネートＸＰ−７００７を用いて行われ、実験は、セル拡散装置により、ｐＨ７.５の緩衝媒体(１０ｍＭビストリスプロパン、５ｍＭ ＣａＣｌ2)の中で実施した。気体から液体又は有機溶質からヒドロゲルへの拡散係数と比べて、Ｄeffは約２〜３オーダー低くなっている。同様に、従来のものは、２成分水性ポリウレタンコーティングは塩化イオンの拡散に対する抵抗性が大きいことが観察された。コーティングの中に存在する酵素の基質へのアクセス可能性(accessibility)は、低コーティング透過性(low coating permeability)によって明らかに制限される。ここでもまた、ＥＣＣ'ｓの活性保持を調べるには、ＤＦＰのコーティングへの透過度が考慮されるべきであることを示している。
【００５５】
図５は、ＤＦＰａｓｅ-ＥＣＣ(３.６ｍｇgold／ｇcoating)を使用し、時間経過後におけるドナーセルとレセプターセルのＤＦＰ濃度プロファイルを示しており、初期濃度は両セルとも４ｍＭ ＤＦＰである。実験は、ドナーセルとレセプターセルの両セルの初期ＤＦＰ濃度を４ｍＭとし、ｐＨ７.５の緩衝媒体(１０ｍＭビストリスプロパン、５ｍＭ ＣａＣｌ2)の中で実施した。ドナーセルとレセプターセルについて、時間経過後のＤＦＰ濃度を調べた。ドナーセルは、塗りつぶした菱形で示し、レセプターセルは塗りつぶした円で示す。ドナーセルとレセプターセルの理論的ＤＦＰプロファイルは、その対称性により同一である。ドナーセルとレセプターセルの実験濃度曲線は、式２〜式７とAthena Visual 7.1.1を用いて、同じようにシミュレートされたプロファイル(破線)によって描かれている。ドナーセルとレセプターセルのＤＦＰ濃度減少に対するプロファイルは、同様な傾向を示している。固定化されたＤＦＰａｓｅがコーティング内で一様に分配されている(図２に示される)と仮定すると、酵素の活性保持はコーティングの両面で殆ど同じである。硬化中、ＥＣＣの上表面はＴＰＯパネルと接触し、下表面は空気に曝露されている。ＥＣＣ'ｓの外部表面の活性保持には殆ど差はないから、空気界面と、ポリマー／疎水性環境はＥＣＣの活性保持に影響を及ぼさない。
【００５６】
レセプターセルの中にＤＦＰの無いＤＦＰａｓｅ-ＥＣＣ(３.６ｍｇgold／ｇcoating)に対しても、ドナーセルとレセプターセルのＤＦＰ濃度プロファイルを測定した(図６参照)。コーティングの合成は、ポリオールＸＰ−７０９３及びポリイソシアネートＸＰ−７００７を使用し、ＤＦＰａｓｅを３.６ｍｇ／ｇcoating充填して行なった。実験は、ｐＨ７.５の緩衝媒体(１０ｍＭビストリスプロパン、５ｍＭ ＣａＣｌ2)の中で実施した。開始時、ドナーセルのＤＦＰは４ｍＭであり、レセプターセルのＤＦＰはゼロである。図６ａは、時間経過後のドナーセル(塗りつぶした菱形)とレセプターセル(塗りつぶした円)のＤＦＰ濃度を示している。ドナーセル(破線)とレセプターセル(点線)のシミュレートされたＤＦＰ濃度プロファイルは、式２〜式７とAthena Visual 7.1.1を用いて求められた。図６ｂは、ＥＣＣ'ｓの基質濃度プロファイルを示しており、０(中破線)、３０(実線)、６０(小破線)、９０(一点鎖線)、１２０(点線)、１８０(二点鎖線)、２８０(長破線)で計算されたものである。式３は、実験結果(図６ａ)と良く一致している。固定化されたＤＦＰａｓｅ、ＫM,int(表１、実験２ｂ**)の固有ミハエリス定数の推定値は、拡散装置なしで得られたもの(表１、実験１b*)と同様である。基質拡散に対するコーティングの抵抗性を考慮すると、ｋcat,int(表１、実験２ｂ**)は、拡散装置なしで測定した見かけのｋcat,app(表１、実験１b*)よりも２.４倍高かったことは興味深いことである。異なる実験時間でシミュレートされたコーティング内の基質プロファイルによって示されるように(図６ｂ)、実験の時間経過により、基質はコーティングの３分の１進入している。見かけの運動パラメータを推定すると、コーティング表面の固定化酵素の層におけるＤＦＰの分解だけを意味することは明らかである。それゆえ、ＤＦＰａｓｅ-ＥＣＣ'sの見かけ酵素効率は、固定化されたＤＦＰａｓｅのこの外層の活性保持に基づいている。ＤＦＰａｓｅ-ＥＣＣの固有運動定数が与えられると、この層内の固有活性保持は３８％である。見かけ値の固有ｋcatに対する比Ｒは、Ｒ＝ｋcat,app／ｋcat,int＝０.４であり、拡散装置なしで活性測定を行なう間、基質がＥＣＣ'ｓの中で到達可能な固定化ＤＦＰａｓｅの割合を表す。
【００５７】
［Desmodur N3400ポリイソシアネートで変性されたＥＣＣ'ｓ］
BradykininポテンシエータＢを含有する水溶液をDesmodur N3400ポリイソシアネートと激しく混合すると、ペプチドリジン残基は、ＨＤＩの二量体と化学的変性を起こし、これはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて観察される。１５分の反応時間で到達する反応収率は７０〜９０％の間で変動するが、ペプチド溶液をDesmodur N3400ポリイソシアネート相とさらに混合しても収率は向上しなかった。
【００５８】
ポリイソシアネートDesmodur N3400は、コーティングの硬化時にバルク(bulk)から重合体／空気の界面へ移動することが知られているＨＤＩのウレトジオン(uretdione)を主体としている。ＤＦＰａｓｅをコーティングへ固定する前にDesmodur N3400で変性することにより、固定化酵素は、コーティング表面の外層内に主として集中する。その結果、固定化されたＤＦＰａｓｅは、基質へのアクセス性が良好となり、見かけの活性保持力が向上する。ＨＤＩの二量体のイソシアネートと、ポテンシエータのブラジキニン(Bradykinin)Ｂのリジン残基との良好な反応が迅速に行われ、ＤＦＰａｓｅを、Desmodur N3400と１５分間反応させた。酵素活性の低下は観察されなかった。図３及び表１(実験１ｂ#*)に示されるように、ＤＦＰａｓｅをDesmodur N3400で前処理することにより、ＥＣＣの見かけの効率は６４％向上した。
【００５９】
［ＥＣＣ'ｓの熱安定性］
前述したように、活性測定中、全ての固定化酵素が基質によって認識されるわけではない。アクセス不可能な酵素は、速度測定の妨げとならないから、拡散抵抗を特に考慮することなく、フィルムの熱安定性を求めることができる。
【００６０】
ネイティブなＤＦＰａｓｅとは異なり、固定化されたＤＦＰａｓｅは、６５℃で二相性の熱不活性プロファイルを有する(図７参照)。固定ＤＦＰａｓｅ(塗りつぶされた四角)及び天然ＤＦＰａｓｅ(塗りつぶされた菱形)の非活性化は、緩衝溶液(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)の中で行なった。残存酵素活性は、基質にＤＦＰ(３ｍＭ)を用いた緩衝媒体(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)の中で、室温での時間経過による変化を測定した。二相間挙動を４パラメータモデルで表し、運動定数α1(０.３４±０.０３)、α2(０.１０±０.０１)、ｋ1(１.３±０.１)及びｋ2(０.０４２±０.００３)を、Marquardt-Levenberg(マルカート・レーベンベルグ)のアルゴリズム(SigmaPlot Version 2.0)を用いて求めた。酵素を不活性化する際、適当な時間範囲内で実験を行なうために６５℃の高温を利用した。この範囲の培養時間では、２成分のポリウレタンコーティングは、水相中にさほど溶解しない。最初は、ＥＣＣは、天然酵素と同様な不活性傾向を示した。しかしながら、初期段階で急速な不活性化が起こると、固定化酵素が安定で且つ活性な状態となり、残存活性は６〜７％である。３５０分以上経過しても、ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣの非常に安定した状態の活性に顕著な変化は観察されなかった。ＥＣＣの二相性非活性化動力学は、次のスキームを仮定し、４パラメータ・モデルによってモデル化した。
【００６１】
【数９】
ここで、Ｅは酵素の初期状態、Ｅ1は酵素の中間状態、Ｅ2は酵素の最終状態である。α1はＥ1の残存活性、α2はＥ2の残存活性である。また、ｋ1及びｋ2は、一次非活性化率を表す。酵素活性αの解析解は、式１０によって与えられる。
【００６２】
【数１０】
ここで、ｔは、非活性化時間を表す。式１０にデータをフィットさせたものを図７に示している。
【００６３】
異なる非活性化経路を有するＥＣＣ'ｓの中に異なる２種類の形態のＤＦＰａｓｅが存在すると仮定し、４つの物理的パラメータだけを必要とする別の動力学モデルでは、実験データを適切に記載することができなかった。また、少なくとも５以上のパラメータを含むようなさらに複雑な機構については考慮しなかった。
【００６４】
また、ポリウレタンフォームの中のＤＦＰａｓｅの固定化とペグ化は、一次不活性化動力学から二相性不活性化動力学への移行を引き起こした。構造的変化によって生じるＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣの熱不活性化は、ＤＦＰａｓｅ含有ポリウレタンフォームのモノリシスの熱不活性化について前述したものと同様に変化すると考えられる。
【００６５】
ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣは、６５℃以上の室温でさらに高い安定性を示す。実際、ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣ'ｓは、室温で１００日間保存後の活性損失は４０％にすぎない(図８参照)。残りの酵素活性については、ＦＰを基質として使用し、緩衝媒体(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)の中で時間経過による活性を測定した。安定性の高いＥＣＣ'ｓが周囲条件下で乾燥状態が維持されると、得られる触媒は、有効な汚染防止剤として様々な用途に適用することができる。
【００６６】
それゆえ、本発明は、単一ステップの蛋白質−重合体の合成において、ポリオールとポリイソシアネートを使用して水性ポリウレタンコーティングの中にＤＦＰａｓｅを共有結合させるものである。固定化プロセスにおいて、ポリイソシアネートXP-7007と、Desmodur N3400で修飾された酵素を使用することにより、最大の固有触媒効率(活性保持率１８〜３８％)がもたらされる。高温では、ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣ'ｓの活性の９３％は急速に損なわれるが、その後は超安定(hyper-stable)になる。
【００６７】
本発明を、望ましい実施例を参照して説明したが、当該分野の専門家であれば、実施例について多くの変更及び変形をなし得るであろう。前記の説明及び請求の範囲は、それらの変更及び変形を包含するものと解されるべきである。
【００６８】
表１は、ＤＦＰａｓｅ含有コーティングと可溶性ＤＦＰａｓｅの運動パラメータを示している。
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＤＦＰａｓｅ含有ポリウレタンコーティングの中で拡散と酵素反応が同時に起こる場合のＤＦＰ濃度プロフィールの模式図である。
【図２】ポリウレタンコーティング内での酵素分布を示す図である。
【図３】ＤＦＰａｓｅ含有コーティングに対するＤＦＰａｓｅ濃度の影響を示すグラフである。
【図４】コーティングにおけるＤＦＰの有効拡散を示すグラフである。
【図５】ポリオールXP-7096とポリイソシアネートXP-7007を用いて合成し、３.６ｍｇ／ｇcoatingのＤＦＰａｓｅをローディングしたコーティングについて、拡散細胞内のＤＦＰ消費プロファイルを示すグラフである。
【図６ａ】拡散セルにおけるＤＦＰの消費プロフィールを示すグラフである。
【図６ｂ】拡散セルにおけるＤＦＰの消費プロフィールを示すグラフである。
【図７】ＤＦＰａｓｅ含有コーティングの６５℃での熱活性化を示すグラフである。
【図８】ＤＦＰａｓｅ含有コーティングの室温での熱不活性化を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００２年７月２４日に出願された米国特許出願第１０／２０２,２２４号に基づく一部継続出願であり、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９(ｃ)の規定に基づいて、２００１年７月２４日に出願された仮特許出願第６０／３０７,４５０号、発明の名称「ポリウレタンコーティング内へのジイソプロピルフルオロフォスファターゼの不可逆的固定化」の利益を主張し、該出願は参照を以てその全体が本願に組み込まれる。
【０００２】
＜発明の分野＞
本発明は、ポリウレタン、特にポリウレタンのコーティング、接着剤及びシーラント内への酵素の不可逆的固定化(irreversible immobilization)に関する。
【背景技術】
【０００３】
固定化は、産業的プロセスにおいて、酵素の触媒への適用を可能にし、またその適用を拡大するために広く利用されている。この１０年間、種々の酵素によるバイオプラスチックの合成におけるポリマー支持体としてポリウレタンフォームが用いられてきた。ポリウレタンのスポンジ状ポリマーは、親水性のトルエンジイソシアネート(ＴＤＩ)基又はメチレンビス(ｐ-フェニルイソシアネート)(ＭＤＩ)基を含むポリイソシアネートプレポリマーと水とから合成される。モノリシックポリウレタンフォームの中に酵素を含めることによってしばしばもたらされる特徴として、固定化の程度が１００％近くなること、高活性が維持されることなどがある。ポリウレタンフォームにおける固定化により熱安定性が向上することについても報告されている。
【０００４】
コーティング及び薄い膜の中に生体分子(biological molecules)が挿入されると、適用範囲が大きく拡大する。例えば、電位差測定バイオセンサは、電極の検知面に隣接する内側フィルムの上に酵素が共有結合することがあり、その結果、酵素層は外側フィルムで保護される。アンペロメトリックバイオセンサの製作における他の固定化方法として、ゲル層の中に酵素を取り込み、外部保護フィルムによってさらにコートされるものがある。しかし、そのようなシステムの寿命と使用は、酵素が外側メンブレンを通って拡散することによる制限を受け易い。この主な不都合を解消させるには、酵素は、共有結合で直接コーティングの中に固定されなければならない。コーティングの中に生体触媒(biocatalyst)を共有結合させることは、他のバイオプロセス(例えば、生体触媒分離及び濾過、マイクロチップ及び汚れ止め等)に対しても利点をもたらす。
【０００５】
高活性酵素をコーティングや膜の中で直接共有結合により固定化させることは、依然としてとらえどころのない目標であり、最も成功したやり方でも最大０.５％の活性を示すに過ぎない。水性ポリウレタンコーティングは、水分散性ポリイソシアネートを有する水性ポリオールの重合によって生じる。フィルムは室温で硬化するので、水は蒸発し、ヒドロキシル基とイソシアネート官能基との間の縮合(condensation)により架橋が生じる。２成分水性ポリウレタンは、溶剤型ポリウレタンコーティングと同様な特性を示すので、産業用としての使用量が増加している。水性ポリウレタンコーティングは、酵素の多点及び共有結合による固定化に対して、理想的なポリマーマトリックスである。
【０００６】
上記のとおり、当該分野では、重合が行われる前に、酵素を２成分系の水性相に直接添加できる方法が要請されている。固定化プロセスは、アミンが、プレポリマーに対するヒドロキシル基よりも速い速度にて、酵素表面でイソシアネート官能基と反応する能力に依存する。
【発明の開示】
【０００７】
＜発明の概要＞
本発明は、酵素をポリウレタン材料に不可逆的に固定化する方法を含んでおり、該方法は、１又は複数のポリオールディスパーション共反応物と１又は複数の酵素との混合物を反応させて水性混合物を生成するステップ、ポリウレタン材料を生成可能なディスパーションを生成するのに十分な量の１又は複数の水分散性ポリイソシアネートを水性混合物に加えるステップ、前記ディスパーションを１又は複数の基質(substrates)に加えて酵素含有材料を生成するステップ、及び、前記酵素含有材料を硬化させるステップ、を含んでいる。この方法は、酵素含有ポリウレタンのコーティング、接着剤及びシーラントの生成に特に有用である。
【０００８】
また、本発明は、ジイソプロピルフルロフォスファターゼを、ポリウレタン、特にポリウレタンのコーティング、接着剤及びシーラントに不可逆的に固定化する方法を含んでおり、該方法は、ポリオールディスパーション共反応物の混合物を、ディスパーション(好ましくは、約１０〜約９０重量％の水分、ポリエーテル変性ポリジメチルシロキサン界面活性剤、緩衝媒体(好ましくは、ビストリスプロパン緩衝剤及びＣａＣｌ2を含む)及びジイソプロピルフルロフォスファターゼ)と反応させて、水性混合物を生成するステップ、水分散性ポリイソシアネート(好ましくは、ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとするポリイソシアネート)を前記水性混合物に加えて、ディスパーション又はエマルジョンを生成するステップ、前記ディスパーション又はエマルジョンを基質に施して、酵素含有材料、好ましくはコーティング、接着剤又はシーラントを生成するステップ、及び、酵素含有材料、好ましくはコーティング、接着剤又はシーラントを硬化させるステップを含んでいる。
【０００９】
また、本発明は、ポリオールディスパーション共反応物と酵素との混合物を反応させて水性混合物を生成するステップ、ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする水分散性ポリイソシアネートを水性混合物に加えて、反応させて、ディスパーション又はエマルジョンを生成するステップ、前記ディスパーション又はエマルジョンを基質に施して、酵素含有のコーティング、接着剤又はシーラントを生成するステップ、及び、酵素含有のコーティング、接着剤又はシーラントを、周囲環境条件下で約１２時間硬化させるステップを有するプロセスによって作られた酵素含有のコーティング、接着剤又はシーラントを含んでいる。
【００１０】
本発明のこれら及びその他の利点は、以下の望ましい実施例の詳細な説明により理解されるであろう。
【００１１】
＜望ましい実施例の詳細な説明＞
本発明は、酵素を、水性ポリウレタン材料(例えば、コーティング、接着剤及びシーラント)に固定化することに関する。かかる酵素の一例として、ジイソプロピルフルロフォスファターゼ(ＤＦＰａｓｅ, Ｅ.Ｃ.３.８.２.１)である。なお、当業者であれば、広範囲に亘る種々の酵素及び抗体が用いられることは認識し得るであろう。ネイティブな(天然の)ＤＦＰａｓｅは、毒性有機リン剤の神経剤(例えば、ソマン、ジイソプロピルフルオロフォスフェート(ＤＦＰ)等)の加水分解を触媒する。従来、ＤＦＰａｓｅは、モノリシックポリウレタンフォームに共重合されることにより、活性が６７％保持され、熱安定性が向上する。酵素含有コーティング(enzyme-containing coating: ＥＣＣ)の親水性が変化すると、活性保持及び安定性に影響を及ぼすので、本発明の固定化プロセスは、様々な親水性を有するポリイソシアネートプレポリマーを用いて行われた。酵素が支持体に不可逆的に固定される程度が決められる。コーティング内の酵素の分布は、金標識(gold-labeling)を用いて観察した。酵素ポリマーの活性に及ぼす質量移動の影響は、拡散セル装置を用いて調べた。固定化によるＤＦＰａｓｅの熱安定性の向上についても調べた。
【００１２】
水性ポリウレタンのコーティング、接着剤及びシーラントは、ポリオールディスパーション又はポリオールディスパーションの混合物を、水分散性ポリイソシアネート又はポリイソシアネートの混合物と反応させることにより生成されることができる。このようなプロセスに適した公知の方法及び材料として、例えば、米国特許第４,６６３,３７７号、第５,０７５,３７０号、第５,０９８,９８３号、第５,３８９,７１８号及び第５,２００,４８９に開示されたものがあり、これらは引用を以て本願への記載加入とする。
【００１３】
＜材料及び方法＞
｛材料｝
水の中に十分分散され、コーティング、接着剤又はシーラントを生成することのできるポリイソシアネートであれば既知のあらゆるポリイソシアネートを、本発明の実施に用いることができる。特に適したポリイソシアネートは、水分散性脂肪族ポリイソシアネートであり、例えば、ＢＡＹＨＹＤＵＲポリイソシアネートであるＸＰ−７０６３、 ＸＰ−７００７、 ＸＰ−７１４８及びDesmodur N3400がある。コーティング、接着剤及び／又はシーラントの生成に有用であると知られたあらゆるポリオール又はポリオールディスパーションを、本発明の実施に用いることができる。ポリオールディスパーションは、例えば、ＢＡＹＨＹＤＲＯＬポリオールＸＰ−７０９３が特に好ましい。なお、本願明細書において、ディスパーションとエマルジョンという語は、置き換え可能に用いられる。ディスパーションが施される基質は、ポリウレタンが接着可能な任意の材料から構成される。適当な基質として、木(wood)、スチール、ガラス、コンクリート及びプラスチックが挙げられる。熱可塑性ポリオレフィン(ＴＰＯ)パネルが特に好ましい。蛋白質含有コーティングの合成及び硬化に用いられるポリイソシアネート、ポリオール及びＴＰＯパネルについて、以下により詳しく説明するが、これらはBayer Co. (Pittsburgh, PA)から提供された。ＢＡＹＨＹＤＵＲポリイソシアネートＸＰ−７０６３、 ＸＰ−７００７、 ＸＰ−７１４８及びDesmodur N3400は、ヘキサメチレンジイソシアネート(ＨＤＩ)をベースとする水分散性脂肪族ポリイソシアネートである。ＢＡＹＨＹＤＲＯＬポリオールＸＰ−７０９３は、ポリオールディスパーションである。界面活性剤ＢＹＫ−３４５は、ポリエーテル変性ポリジメチルシロキサンであり、BYK−Chemie(Wallingford, CT)から入手した。ジイソプロピルフルオロフォスフェート(ＤＦＰ)、ブラッドフォード試薬(Bradford reagent)、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、ビストリスプロパン、トリス(ヒドロキシルメチル)アミノメタンＨＣｌ(Tris-ＨＣｌ)、ＣａＣｌ2、ＮａＣｌ、Ｋ2ＣＯ3及びイソプロパノールは、Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO)から購入した。ＤＦＰａｓｅはBioCatalytics, Inc. (Pasadena, CA)から購入した。包理樹脂Polybed 812はエポキシ樹脂であり、Polysciences (Warrington, PA)から入手した。
｛方法｝
【００１４】
［ＥＣＣの合成］
ＥＣＣ'ｓは、水性混合物(１０ｍＭビストリスプロパン緩衝剤、ｐＨ７.５、５ｍＭ ＣａＣｌ2)を緩衝剤として用いて調製した。水性の２成分ポリウレタンは、ヘキサメチレンジイソシアネート(ＨＤＩ)ＢＡＹＨＹＤＵＲ及びポリオールディスパーション共反応剤ＢＡＹＨＹＤＲＯＬをベースとする水分散性脂肪族ポリイソシアネートを用いて合成した。ＥＣＣの合成が行われる間、イソシアネートとヒドロキシル官能基の比は２であった。一般的には、ＢＡＹＨＹＤＲＯＬ ＸＰ−７０９３(２.５ｇ)(水分７０重量％)、界面活性剤ＢＹＫ−３４５(０.１ｇ)及び緩衝媒体(１.２ｇ)を円筒形容器の中に注いだ後、酵素ＤＦＰａｓｅ(０.０２〜９ｍｇ)を追加した。水溶液を１分間機械的に撹拌した(３００ｒｐｍ)。ＥＣＣの合成に必要なＢＡＹＨＹＤＵＲ ＸＰ−７０６３、ＸＰ−７００７、ＸＰ−７１４８の量は、ポリイソシアネートの等モル重量から算出した。ＸＰ−７００７を用いるとき、ポリイソシアネート(１ｇ)を水溶液に加えた後、二相混合物を、２５００ｒｐｍの手持ち式ドリルに取り付けられた特注仕様のヘッドを用いて２０秒間撹拌した。混合後、水分６３％の白色エマルジョンが得られた。このエマルジョン(０.４５ｇ)を、予めイソプロパノールで清浄化された熱可塑性ポリオレフィン(ＴＰＯ)に加えて、周囲環境条件の下で乾燥した。次に、ＥＣＣを周囲環境条件下で１２時間かけて硬化させ、再び重量測定した(０.２４ｇ)。
【００１５】
ビストリスプロパンは、ヒドロキシル基及び二次アミンを含んでおり、コーティングの合成中、イソシアネートと反応することができる。反応混合物に加えられた緩衝塩の量は、ポリイソシアネート及びポリオールディスパーションの反応性官能基と比べると無視できる程度である。それゆえ、得られた２成分水性ポリウレタンの特性に影響を及ぼしたとは考えられない。
【００１６】
［蛋白質濃度の決定］
蛋白質の濃度は、ブラッドフォード試薬を用いて調べた。色素を室温の蛋白質溶液に加ると、色素−蛋白質の錯体(complex)が１５分以内に生成し、吸収極大は５９６ｎｍであった。蛋白質濃度範囲１〜１０ｍｇ／ｍｌに対して、減衰係数０.０３４１ｍｌ／ｍｇの較正曲線が得られた。
【００１７】
［酵素／金の複合物(conjugates)の合成］
直径２５〜３０ｎｍの金コロイドを調製し、金コロイドを水性媒体中でＤＦＰａｓｅに結合させた。具体的には、金溶液(１００ｍｌの０.０１％ＨＡｕＣｌ4.２Ｈ2Ｏ)をガラス製フラスコの中で沸騰するまで加熱した。クエン酸三ナトリウム(０.０１５％で５ｍｌ)を加え、混合物をさらに沸騰させた。オレンジ色／レッド色を持続した時が、コロイドの生成完了である。複合化が行われる間、ｐＨは、Ｋ2ＣＯ3を用いて、酵素等電点(ｐＩ５.８)を僅かに越えるように調節された。ｐＨの測定はリトマス紙を用いて行なった。例えば、３０ｍｌのゲルコロイド溶液(金濃度：０.０１％)を安定化させるのに、０.１２ｇの酵素が必要であった。ＤＦＰａｓｅを加えた後、酵素−金の溶液を緩やかに撹拌し、最終濃度が０.１％(ｗ／ｖ)になるまで、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)(１０％(ｗ／ｖ))を加えた。酵素でコートされなかったコロイド表面領域は、ＢＳＡでブロックされた。得られた溶液を、１００,０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、沈殿物中の酵素−金複合物を回収し、緩衝媒体(１０ｍＭ Tris-HCl，ｐＨ７.５)の中で再溶解した。遠心分離により、ある程度の金クラスターが生成した。沈殿物の高密度領域中に存在する最も大きなクラスターは廃棄した。それより小さなクラスターは、金コロイド複合物の中に存在する。さらに、前記のＢＡＹＨＹＤＵＲ ＸＰ−７００７を用いて、コーティングを調製した。なお、酵素に結合される金コロイドは異なる２種類の濃度(０.００１ｍｇgold／ｇcoatingと、０.０１２ｍｇgold／ｇcoating)を用いた。
【００１８】
［コーティング内での金−ＤＦＰａｓｅ複合物の局在化］
透過電子顕微鏡(ＴＥＭ)用フィルムを埋め込むために、小片を１００％エタノール中で数回洗浄した後、１時間毎に包理用樹脂Polybed 812を数回変えて培養した。幾つかの包埋媒体を用いてもよいことは理解されるべきである。用いられる包理媒体の大部分は、エポキシ樹脂及び変性エポキシ樹脂又はメタクリルポリマーである。フィルムは、１ｍｍ×２ｍｍの小片にカットし、包理用鋳型の中に入れ、Polybed 812の中に埋め込んだ。ブロックは、３７℃の温度で一晩中硬化させ、次に６５℃で２日間硬化させた。フィルムの極薄切片(６０ｍｍ)は、Reichart Ultracut E ミクロトームにて得た。切片は、ＪＥＯＬ ＪＥＭ １２１０又は１００ＣＸの透過電子顕微鏡にて８０ＫＶで観察した。
【００１９】
［フッ化物イオン電極使用によるＥＣＣ's の活性］
ＥＣＣの評価は、剥離されたＤＦＰａｓｅフィルム(重量０.００９〜０.０１２ｇ)の小片を用いて行なった。代表例として、小片を、１０ｍｌの３ｍＭ ＤＦＰ緩衝溶液(５ｍＭ ＣａＣｌ2及び１０ｍＭ ｐＨ７.５)の中に入れ、磁気撹拌により撹拌した。ＤＦＰａｓｅはＤＦＰ(下記参照)を結合及び加水分解することによって作用し、活性は、フッ化物イオン電極による室温での以下のフッ化物放出によって測定した。フッ化物のバルク溶液濃度は、２０秒毎に５分間測定した。
【００２０】
コーティング中の酵素濃度は、０〜２ｍｇ／ｇcoatingの範囲で変動した。酵素が高濃度のときのＥＣＣ'ｓは、初期速度に対してあまりに活性でありすぎて測定することができなかった。
【化１】
【００２１】
［フッ化物イオン使用による運動定数(kinetic contstants)の測定］
前述したフッ化物センサーを用いて運動定数を測定した。基質の濃度は、０〜２０ｍＭの範囲であった。データは、非線形回帰(Sigma Plot Version 2)を用いてミハエリス−メンテンの式に当てはめられた。
【００２２】
［拡散セル(diffusion cell)の実験］
拡散装置は、ドナーのコンパートメントと、レセプターのコンパートメントとを具えており、各コンパートメントに水ジャケットが配備されている。拡散システムは、容積３ｍｌ及び拡散断面積(ＩＤ＝９ｍｍ)のコンパートメントを有する２つのチャンバーが水平方向に並べて構成される。ＥＣＣは２つのコンパートメントの間に装填され、実験は室温(２２℃)で行なった。
【００２３】
［基質の有効拡散係数Ｄeffの測定］
基質の有効拡散係数Ｄeff(ｍ2／分)を当該分野で知られた手順に基づいて評価した。タチナタマメ(Jack beans)のウレアーゼタイプIII(ＥＣ.３.５.１.５)(Sigma製(St. Louis, MO)は、ＤＦＰａｓｅの存在を模擬するために、コーティングに固定化された(３.６ｍｇ／ｇcoating)。まず最初に、体積３ｍｌの緩衝媒体(５ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭビストリスプロパン、ｐＨ７.５)にＤＦＰ(４ｍＭ)を補填し、これをドナーセルに入れる、一方、レセプターセルには緩衝媒体(３ｍｌ)が充填される。各セルは、磁気撹拌によって撹拌した。所定時間(５〜３００分)経過した後、内容物を取り除いて、緩衝媒体(５ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭビストリスプロパン、ｐＨ７.５)で４回希釈した。次に、各試料のＤＦＰの濃度を、可溶性ＤＦＰａｓｅによる活性評価により求めた。Ｄeffは、準定常状態で算出した(式１)。
【００２４】
【数１】
【００２５】
[ＤＦＰ]Dは、ドナーセルにおけるＤＦＰの濃度(mol/ｍ3)である。[ＤＦＰ]Rは、レセプターセルにおけるＤＦＰの濃度(mol/ｍ3)である。Ｖcell (３.１０-6 ｍ3)はセルの容積である。Ａ(６.３６.１０-5 ｍ2)は拡散断面積である。ポリウレタンフィルムの膨張(swelling)が主に肉厚方向に起こると仮定し、濡れＥＣＣの厚さδ’を次のとおり求めた。
【００２６】
【数２】
【００２７】
乾燥状態のコーティング厚さδ(１０μｍ)を、走査型電子顕微鏡を用いて求めた。ε(０.７)は、濡れコーティング中に液相が占める全容積の割合である。
【００２８】
［活性の測定］
セルには、緩衝材(５ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭビストリスプロパン、ｐＨ７.５)が充填された。ドナーセルには最初にＤＦＰ(４ｍＭ)が補填された。レセプターセルのＤＦＰの初期濃度は、０又は４ｍＭのどちらかである。実験は、一定のＤＦＰａｓｅ-ＥＣＣ濃度(３.６ｍｇ／ｇcoating)を用いて行ない、基質の完全な分解は合理的な時間範囲内で起こった。各セルは磁気撹拌により十分な混合を行なった。所定時間(５〜１２０分)経過後、内容物を取り出して、緩衝媒体(５ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭビストリスプロパン、ｐＨ７.５)で４回希釈した。次に、各試料のＤＦＰの濃度を、可溶性ＤＦＰａｓｅによる活性アッセイにより求めた。
【００２９】
図１は、レセプターセルがｔ＝０秒でＤＦＰを含んでいないとき、ＤＦＰａｓｅ含有コーティングにおける拡散及び酵素反応が同時に行われたときのＤＦＰ濃度プロファイルの概略図である。１ｓは停滞溶液層、δはコーティング厚さである。ＣDFP,D,tはドナーセルの時間ｔにおけるバルクＤＦＰ濃度であり、ＣDFP,R,tはレセプターセルの時間ｔにおけるバルクＤＦＰ濃度である。ＣDFP,0,tはコーティングの表面での液相のＤＦＰ濃度であり、ＣDFP,δ,tはコーティングのある時間における液相のＤＦＰ濃度である。境界層の拡散抵抗及びＥＣＣ膨張を無視すると、ＤＦＰａｓｅ-ＥＣＣが非定常状態でのＤＦＰの濃度プロファイルは式３によって与えられる。
【００３０】
【数３】
【００３１】
[ＤＦＰ]lc(mol/ｍ3)は、コーティングの液相のＤＦＰ濃度であり、ｋcat，int(ｓ-1) 及びＫM(mol/ｍ3)は、ＥＣＣに固有の運動定数である。
初期条件は次の通りである。
【００３２】
【数４】
【００３３】
【数５】
【００３４】
ＥＣＣとドナーセルとの界面では、次の関係がある。
【数６】
【００３５】
[ＤＦＰ]0は、液相のＥＣＣ表面(Ｘ＝０)におけるＤＦＰ濃度を表している。Ｖsurface(mol/ｍ3.ｓ)は、コーティング表面(Ｘ＝０)でのＤＦＰの加水分解速度を表し(式７)、ＶRelease (mol/(ｍ3.ｓ)は、ＥＣＣ合成中に共有結合で固定化されておらず、ドナーセルの中に放出された酵素によって触媒された反応速度を表している(式８)
【００３６】
【数７】
【００３７】
なお、[ＤＦＰａｓｅ]Surface (mol/ｍ3)は、コーティング表面におけるドナーセルの単位容積当たりの酵素のモル数である。
【００３８】
【数８】
【００３９】
なお、[ＤＦＰａｓｅ]Release (mol/ｍ3)は、ドナーセルの容積に関して算出され、ｋcat,native及びＫM,nativeは表１に示されている(実験１a*)。
【００４０】
実験によりドナーセルとレセプターセルのＤＦＰ濃度プロファイルが得られると、式２は、Athena Visual Version 7.1.1により式３〜式７を用いて解が求められる。次に、ＥＣＣ、ＫM,int及びｋcatk,intの固有運動定数が算出される。
【００４１】
［Desmodur N3400ポリイソシアネートによる酵素の変性］
ＨＤＩの二量体及び三量体からなるDesmodur N3400 (１ｇ)に、ＤＦＰａｓｅ含有溶液(１ｍｌ)(５０ｍＭ ＭＯＰＳ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)を加えた。二相混合物を室温で撹拌した。変性された酵素の活性は、前述のフッ化物センサーによって求めた。
【００４２】
ＤＦＰａｓｅの変性度は直接求めることができないので、模擬的手段として、単一リジンを含有する低分子量ペプチド(１１８２.４ Ｄａ)であるブラジキニンポテンシエーターＢを用いて、Desmodur N3400と酵素リジン残基の反応を調べた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用し、様々な反応時間(１５分〜１７時間)におけるリジンの変性度を調べた。
【００４３】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析は、Perseptive Biosystems社のVoyager elite ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて行なった。加速電圧は線形モードで２０ｋＶに設定した。ＰＥＧ化酵素溶液(１〜２ｍｇ／ｍｌ)を等量のマトリックス溶液(水０.５ｍｌ、アセトニトリル０.５ｍｌ、ＴＦＡ２μｌ及びα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸)と混合し、２μｌの最終溶液をプレートターゲットにスポットした。溶媒混合物の蒸発後、スペクトルを記録し、ＦＭＲＰ及びＡＣＴＨで外部補正をした。
【００４４】
Desmodur N3400で変性されたＤＦＰａｓｅは、前述のポリウレタンコーティングの中へさらに固定化させた。
【００４５】
［ＥＣＣの熱安定性］
ネイティブで固定化されたＤＦＰａｓｅを、６５℃で培養された緩衝剤(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)に加えて、室温の前記緩衝媒体(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2 、ｐＨ７.５)中でアッセイを行なった。
【００４６】
室温でのＥＣＣ'ｓの熱安定性を調べた。周囲環境条件下で所定時間保存した後、ＥＣＣの試料について、前記緩衝媒体(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2 、ｐＨ７.５)中で室温活性を調べた。
【００４７】
＜結果及び検討＞
［ＥＣＣ'ｓに固定されたＤＦＰａｓｅの可逆性］
ＤＦＰａｓｅのポリマー固定化の不可逆性の程度を、ブラッドフォード試薬を用いて調べた。ＤＦＰａｓｅ含有ポリウレタンコーティングをパネルから剥がして、小片にカットし、蒸留水で十分洗浄した。洗浄物の中で検出されたＥＣＣ固定蛋白質は４％(ｗ／ｗ)未満であり、これは固定化率が１００％に近いことを示している。
【００４８】
［ＥＣＣ'ｓにおける酵素の分配］
酵素がフィルム内に取り込まれるとき、重要な問題は、酵素がフィルム内で均等に分配されているかどうかである。従来のモノリシックポリウレタンフォームに固定化された酵素を局在化するために、金標識を用いた。それゆえ、本発明では、金コロイド粒子に結合させることにより、ＤＦＰａｓｅをＥＣＣ'ｓに局在化させた。
【００４９】
図２は、ポリウレタンコーティングにおける酵素分布を示している。金／ＤＦＰａｓｅを含有するコーティングは、暗視野(Ａ；０.０００７ｍｇgold／ｇcoating)と光学顕微鏡で得られた逆像(ネガティブ像)(Ｂ；０.０１１６ｍｇgold／ｇcoating)を用いて分析した。ここでネガティブ像が用いられるのは、コーティングが厚く、金粒子が高濃度であるため、焦点像を得るのが困難であるからである。コーティングの断面は、透過電子顕微鏡を用いて得た(Ｃ及びＤ)。ヘッドが塗りつぶされた矢印は、金／酵素粒子の幾つかを示している。白抜きの矢印は、金／酵素結合クラスターの幾つかを示している。矢印ヘッドは、包理樹脂内部のコーティング試料の先端を示している。星印は、焦点の合っていない幾つかの領域を示しているが、これは、金粒子の濃度が高く、表面が不均一であることによる。コーティング中の泡は、文字ｈで示されている。Ｂに示されるサイズバーは、パネルＡとＢを表している。ＣとＤに示されるサイズバーは、これらパネルにおける寸法を示している。
【００５０】
図２Ａは、暗視野顕微鏡検査によって得られた金／ＤＦＰａｓｅ複合物含有コーティング(０.００１ｍｇgold／ｇcoating) の顕微鏡写真である。図２Ｂは、逆像光学顕微鏡検査によって得られた金／ＤＦＰａｓｅ複合物含有コーティング(０.０１２ｍｇgold／ｇcoating) の顕微鏡写真である。固定化された金コロイド／酵素複合物の濃度は１２倍増加しているので、固定化された金／酵素複合物はコーティング内で均一に分散していることは明らかである。金／酵素含有コーティング(０.０１２ｍｇgold／ｇcoating)の断面のＴＥＭは、図２Ｃに示されている(２５００倍拡大)及び図２Ｄ(１００００倍拡大)に示されている。光学顕微鏡の場合と同様、ＴＥＭもまた、金／酵素粒子及びクラスターが微小規模レベルではランダムに分配されていることを示している。これは、金／ＤＦＰａｓｅ複合物含有コーティングの合成により、ポリマーマトリックス中で金／ＤＦＰａｓｅ複合物は一様に固定化されることを意味するものである。外挿(extrapolation)により、フィルム中のＤＦＰａｓｅの局部濃度は位置依存性ではないと考えることができる。
【００５１】
［ＥＣＣ'ｓの活性］
ＥＣＣ'ｓの調製は、ポリイソシアネートプレポリマーであるＸＰ−７００７、ＸＰ−７１４８及びＸＰ−７０６３を用いて行なった。図３は、初期ＤＦＰａｓｅローディングの関数として、各ＥＣＣの活性を示している。活性は、酵素濃度に正比例しており、これは、質量移動に実質的制限がないことを意味する。図２は、フィルムが無孔(non-porous)であることを示しているので、この結果より、フィルムの薄い外部層の酵素だけが基質にアクセス可能であることを意味する(これについては後で詳しく説明する)。
【００５２】
ポリイソシアネートの親水性は、ＸＰ−７１４８＞ＸＰ−７０６３＞ＸＰ−７００７の順序で低下する。ここで、ＥＣＣ'ｓの見かけの活性保持は、ポリイソシアネートの親水性が低下するほど増大することは興味深いことである(図３参照)。脱水した有機溶媒における酵素活性を検討すると、酵素は疎水環境をより好むことがわかった。親水性の低いポリイソシアネートがすぐれたＥＣＣ材料であることは、偶然の一致でないことかもしれない。図３は合成されたコーティングを示しており、ｐＨ７.５の緩衝溶液(１０ｍＭビストリスプロパン、５ｍＭ ＣａＣｌ2)の中で、ポリオールＸＰ−７０９３及びポリイソシアネートＸＰ−７００７(塗りつぶした菱形)、ＸＰ−７０６３(塗りつぶした円)並びにＸＰ−７１４８(塗りつぶした正方形)で合成されたものである。塗りつぶした三角形は、Desmodur N3400で変性されたＤＦＰａｓｅ、ポリオールＸＰ−７０９３及びポリイソシアネートＸＰ−７００７を出発物質として合成したコーティングの見かけ活性に対応している。バイオプラスチックの活性は、３ｍＭ ＤＦＰ濃度でのものである。
【００５３】
ポリイソシアネートＸＰ−７００７を用いて作られたＥＣＣ'ｓが、最も高レベルの見かけ活性保持を有していた。それゆえ、その後の環境は、ＸＰ−７００７を含有するＥＣＣ'ｓで実施した。充填された酵素の全部が利用可能である(表１、実験１b*)と仮定して算出した見かけの運動特性により、内因性保持ではなく観察可能な活性保持(１１％)がもたらされた。
【００５４】
［ＥＣＣにおけるＤＦＰの有効拡散率Ｄeff］
ＥＣＣ'ｓの活性保持を理解するために、フィルム内の基質の拡散率を調べた。式１を使用して求めたＤeffは、(５＋／−１) ×１０-10ｍ2／分である。図４を参照すると、コーティングの合成は、ポリオールＸＰ−７０９３とポリイソシアネートＸＰ−７００７を用いて行われ、実験は、セル拡散装置により、ｐＨ７.５の緩衝媒体(１０ｍＭビストリスプロパン、５ｍＭ ＣａＣｌ2)の中で実施した。気体から液体又は有機溶質からヒドロゲルへの拡散係数と比べて、Ｄeffは約２〜３オーダー低くなっている。同様に、従来のものは、２成分水性ポリウレタンコーティングは塩化イオンの拡散に対する抵抗性が大きいことが観察された。コーティングの中に存在する酵素の基質へのアクセス可能性(accessibility)は、低コーティング透過性(low coating permeability)によって明らかに制限される。ここでもまた、ＥＣＣ'ｓの活性保持を調べるには、ＤＦＰのコーティングへの透過度が考慮されるべきであることを示している。
【００５５】
図５は、ＤＦＰａｓｅ-ＥＣＣ(３.６ｍｇgold／ｇcoating)を使用し、時間経過後におけるドナーセルとレセプターセルのＤＦＰ濃度プロファイルを示しており、初期濃度は両セルとも４ｍＭ ＤＦＰである。実験は、ドナーセルとレセプターセルの両セルの初期ＤＦＰ濃度を４ｍＭとし、ｐＨ７.５の緩衝媒体(１０ｍＭビストリスプロパン、５ｍＭ ＣａＣｌ2)の中で実施した。ドナーセルとレセプターセルについて、時間経過後のＤＦＰ濃度を調べた。ドナーセルは、塗りつぶした菱形で示し、レセプターセルは塗りつぶした円で示す。ドナーセルとレセプターセルの理論的ＤＦＰプロファイルは、その対称性により同一である。ドナーセルとレセプターセルの実験濃度曲線は、式２〜式７とAthena Visual 7.1.1を用いて、同じようにシミュレートされたプロファイル(破線)によって描かれている。ドナーセルとレセプターセルのＤＦＰ濃度減少に対するプロファイルは、同様な傾向を示している。固定化されたＤＦＰａｓｅがコーティング内で一様に分配されている(図２に示される)と仮定すると、酵素の活性保持はコーティングの両面で殆ど同じである。硬化中、ＥＣＣの上表面はＴＰＯパネルと接触し、下表面は空気に曝露されている。ＥＣＣ'ｓの外部表面の活性保持には殆ど差はないから、空気界面と、ポリマー／疎水性環境はＥＣＣの活性保持に影響を及ぼさない。
【００５６】
レセプターセルの中にＤＦＰの無いＤＦＰａｓｅ-ＥＣＣ(３.６ｍｇgold／ｇcoating)に対しても、ドナーセルとレセプターセルのＤＦＰ濃度プロファイルを測定した(図６参照)。コーティングの合成は、ポリオールＸＰ−７０９３及びポリイソシアネートＸＰ−７００７を使用し、ＤＦＰａｓｅを３.６ｍｇ／ｇcoating充填して行なった。実験は、ｐＨ７.５の緩衝媒体(１０ｍＭビストリスプロパン、５ｍＭ ＣａＣｌ2)の中で実施した。開始時、ドナーセルのＤＦＰは４ｍＭであり、レセプターセルのＤＦＰはゼロである。図６ａは、時間経過後のドナーセル(塗りつぶした菱形)とレセプターセル(塗りつぶした円)のＤＦＰ濃度を示している。ドナーセル(破線)とレセプターセル(点線)のシミュレートされたＤＦＰ濃度プロファイルは、式２〜式７とAthena Visual 7.1.1を用いて求められた。図６ｂは、ＥＣＣ'ｓの基質濃度プロファイルを示しており、０(中破線)、３０(実線)、６０(小破線)、９０(一点鎖線)、１２０(点線)、１８０(二点鎖線)、２８０(長破線)で計算されたものである。式３は、実験結果(図６ａ)と良く一致している。固定化されたＤＦＰａｓｅ、ＫM,int(表１、実験２ｂ**)の固有ミハエリス定数の推定値は、拡散装置なしで得られたもの(表１、実験１b*)と同様である。基質拡散に対するコーティングの抵抗性を考慮すると、ｋcat,int(表１、実験２ｂ**)は、拡散装置なしで測定した見かけのｋcat,app(表１、実験１b*)よりも２.４倍高かったことは興味深いことである。異なる実験時間でシミュレートされたコーティング内の基質プロファイルによって示されるように(図６ｂ)、実験の時間経過により、基質はコーティングの３分の１進入している。見かけの運動パラメータを推定すると、コーティング表面の固定化酵素の層におけるＤＦＰの分解だけを意味することは明らかである。それゆえ、ＤＦＰａｓｅ-ＥＣＣ'sの見かけ酵素効率は、固定化されたＤＦＰａｓｅのこの外層の活性保持に基づいている。ＤＦＰａｓｅ-ＥＣＣの固有運動定数が与えられると、この層内の固有活性保持は３８％である。見かけ値の固有ｋcatに対する比Ｒは、Ｒ＝ｋcat,app／ｋcat,int＝０.４であり、拡散装置なしで活性測定を行なう間、基質がＥＣＣ'ｓの中で到達可能な固定化ＤＦＰａｓｅの割合を表す。
【００５７】
［Desmodur N3400ポリイソシアネートで変性されたＥＣＣ'ｓ］
BradykininポテンシエータＢを含有する水溶液をDesmodur N3400ポリイソシアネートと激しく混合すると、ペプチドリジン残基は、ＨＤＩの二量体と化学的変性を起こし、これはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて観察される。１５分の反応時間で到達する反応収率は７０〜９０％の間で変動するが、ペプチド溶液をDesmodur N3400ポリイソシアネート相とさらに混合しても収率は向上しなかった。
【００５８】
ポリイソシアネートDesmodur N3400は、コーティングの硬化時にバルク(bulk)から重合体／空気の界面へ移動することが知られているＨＤＩのウレトジオン(uretdione)を主体としている。ＤＦＰａｓｅをコーティングへ固定する前にDesmodur N3400で変性することにより、固定化酵素は、コーティング表面の外層内に主として集中する。その結果、固定化されたＤＦＰａｓｅは、基質へのアクセス性が良好となり、見かけの活性保持力が向上する。ＨＤＩの二量体のイソシアネートと、ポテンシエータのブラジキニン(Bradykinin)Ｂのリジン残基との良好な反応が迅速に行われ、ＤＦＰａｓｅを、Desmodur N3400と１５分間反応させた。酵素活性の低下は観察されなかった。図３及び表１(実験１ｂ#*)に示されるように、ＤＦＰａｓｅをDesmodur N3400で前処理することにより、ＥＣＣの見かけの効率は６４％向上した。
【００５９】
［ＥＣＣ'ｓの熱安定性］
前述したように、活性測定中、全ての固定化酵素が基質によって認識されるわけではない。アクセス不可能な酵素は、速度測定の妨げとならないから、拡散抵抗を特に考慮することなく、フィルムの熱安定性を求めることができる。
【００６０】
ネイティブなＤＦＰａｓｅとは異なり、固定化されたＤＦＰａｓｅは、６５℃で二相性の熱不活性プロファイルを有する(図７参照)。固定ＤＦＰａｓｅ(塗りつぶされた四角)及び天然ＤＦＰａｓｅ(塗りつぶされた菱形)の非活性化は、緩衝溶液(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)の中で行なった。残存酵素活性は、基質にＤＦＰ(３ｍＭ)を用いた緩衝媒体(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)の中で、室温での時間経過による変化を測定した。二相間挙動を４パラメータモデルで表し、運動定数α1(０.３４±０.０３)、α2(０.１０±０.０１)、ｋ1(１.３±０.１)及びｋ2(０.０４２±０.００３)を、Marquardt-Levenberg(マルカート・レーベンベルグ)のアルゴリズム(SigmaPlot Version 2.0)を用いて求めた。酵素を不活性化する際、適当な時間範囲内で実験を行なうために６５℃の高温を利用した。この範囲の培養時間では、２成分のポリウレタンコーティングは、水相中にさほど溶解しない。最初は、ＥＣＣは、天然酵素と同様な不活性傾向を示した。しかしながら、初期段階で急速な不活性化が起こると、固定化酵素が安定で且つ活性な状態となり、残存活性は６〜７％である。３５０分以上経過しても、ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣの非常に安定した状態の活性に顕著な変化は観察されなかった。ＥＣＣの二相性非活性化動力学は、次のスキームを仮定し、４パラメータ・モデルによってモデル化した。
【００６１】
【数９】
ここで、Ｅは酵素の初期状態、Ｅ1は酵素の中間状態、Ｅ2は酵素の最終状態である。α1はＥ1の残存活性、α2はＥ2の残存活性である。また、ｋ1及びｋ2は、一次非活性化率を表す。酵素活性αの解析解は、式１０によって与えられる。
【００６２】
【数１０】
ここで、ｔは、非活性化時間を表す。式１０にデータをフィットさせたものを図７に示している。
【００６３】
異なる非活性化経路を有するＥＣＣ'ｓの中に異なる２種類の形態のＤＦＰａｓｅが存在すると仮定し、４つの物理的パラメータだけを必要とする別の動力学モデルでは、実験データを適切に記載することができなかった。また、少なくとも５以上のパラメータを含むようなさらに複雑な機構については考慮しなかった。
【００６４】
また、ポリウレタンフォームの中のＤＦＰａｓｅの固定化とペグ化は、一次不活性化動力学から二相性不活性化動力学への移行を引き起こした。構造的変化によって生じるＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣの熱不活性化は、ＤＦＰａｓｅ含有ポリウレタンフォームのモノリシスの熱不活性化について前述したものと同様に変化すると考えられる。
【００６５】
ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣは、６５℃以上の室温でさらに高い安定性を示す。実際、ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣ'ｓは、室温で１００日間保存後の活性損失は４０％にすぎない(図８参照)。残りの酵素活性については、ＦＰを基質として使用し、緩衝媒体(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)の中で時間経過による活性を測定した。安定性の高いＥＣＣ'ｓが周囲条件下で乾燥状態が維持されると、得られる触媒は、有効な汚染防止剤として様々な用途に適用することができる。
【００６６】
それゆえ、本発明は、単一ステップの蛋白質−重合体の合成において、ポリオールとポリイソシアネートを使用して水性ポリウレタンコーティングの中にＤＦＰａｓｅを共有結合させるものである。固定化プロセスにおいて、ポリイソシアネートXP-7007と、Desmodur N3400で修飾された酵素を使用することにより、最大の固有触媒効率(活性保持率１８〜３８％)がもたらされる。高温では、ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣ'ｓの活性の９３％は急速に損なわれるが、その後は超安定(hyper-stable)になる。
【００６７】
本発明を、望ましい実施例を参照して説明したが、当該分野の専門家であれば、実施例について多くの変更及び変形をなし得るであろう。前記の説明及び請求の範囲は、それらの変更及び変形を包含するものと解されるべきである。
【００６８】
表１は、ＤＦＰａｓｅ含有コーティングと可溶性ＤＦＰａｓｅの運動パラメータを示している。
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＤＦＰａｓｅ含有ポリウレタンコーティングの中で拡散と酵素反応が同時に起こる場合のＤＦＰ濃度プロフィールの模式図である。
【図２】ポリウレタンコーティング内での酵素分布を示す図である。
【図３】ＤＦＰａｓｅ含有コーティングに対するＤＦＰａｓｅ濃度の影響を示すグラフである。
【図４】コーティングにおけるＤＦＰの有効拡散を示すグラフである。
【図５】ポリオールXP-7096とポリイソシアネートXP-7007を用いて合成し、３.６ｍｇ／ｇcoatingのＤＦＰａｓｅをローディングしたコーティングについて、拡散細胞内のＤＦＰ消費プロファイルを示すグラフである。
【図６ａ】拡散セルにおけるＤＦＰの消費プロフィールを示すグラフである。
【図６ｂ】拡散セルにおけるＤＦＰの消費プロフィールを示すグラフである。
【図７】ＤＦＰａｓｅ含有コーティングの６５℃での熱活性化を示すグラフである。
【図８】ＤＦＰａｓｅ含有コーティングの室温での熱不活性化を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリウレタン材料の中に酵素を不可逆的に固定化する方法であって、
(a) (i)ポリオールディスパーション共反応剤と(ii)酵素との混合物を反応させて水性混合物を作るステップ、
(b) ポリウレタンを生成可能なディスパーションを作るのに十分な量の(iii)水分散性ポリイソシアネートを、前記水性混合物に加えるステップ、
(c) ポリイソシアネートを水性混合物の中に分散させて、ポリウレタン材料を生成可能なディスパーションを作るステップ、
(d) ポリウレタンを生成可能なディスパーションを基質に施すステップ、及び
(e) 酵素含有ディスパーションを硬化させるステップ、
を含んでいる方法。
【請求項２】
酵素含有ディスパーションが硬化して、コーティング、接着剤又はシーラントを生成する請求項１の方法。
【請求項３】
酵素含有ディスパーションが硬化して、コーティングを生成する請求項１の方法。
【請求項４】
水分散性ポリイソシアネートは脂肪族ポリイソシアネートである請求項１の方法。
【請求項５】
水分散性ポリイソシアネートはヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする請求項１の方法。
【請求項６】
基質は、木、スチール、ガラス、コンクリート又はプラスチックである請求項１の方法。
【請求項７】
基質はポリマーである請求項１の方法。
【請求項８】
ポリオールディスパーション(i)は、２以上のポリオールを含んでいる請求項１の方法。
【請求項９】
水分散性ポリイソシアネートとして、２以上のポリイソシアネートが用いられる請求項１の方法。
【請求項１０】
ポリウレタンを生成可能なディスパーションは、ステップ(d)の後、第２の基質と接触させられる請求項１の方法。
【請求項１１】
ポリオールディスパーションは、ステップ(b)で加えられるポリイソシアネートの量の約２倍を越える量で存在する請求項１の方法。
【請求項１２】
ステップ(a)で用いられるポリオールディスパーションは、含水量約７０重量％である請求項１の方法。
【請求項１３】
ステップ(a)では、ポリエチレン変性ポリジメチルシロキサン界面活性剤が存在する請求項１の方法。
【請求項１４】
ステップ(a)で反応が行われる混合物は、ビストリスプロパン緩衝剤とＣａＣｌ2を含んでいる請求項１の方法。
【請求項１５】
ステップ(c)で反応が行われる混合物は、ポリオールディスパーション共反応剤を、脂肪族ポリイソシアネートよりも約２.５倍多く含んでいる請求項１の方法。
【請求項１６】
ステップ(a)で反応が行われる混合物には、約０.０２〜９ｍｇのジイソプロピルフルロホスファターゼが含まれている請求項１の方法。
【請求項１７】
ステップ(a)の前に、酵素は、ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする低粘度脂肪族ポリイソシアネート樹脂と反応が行われる請求項１の方法。
【請求項１８】
ポリウレタンの中にジイソプロピルフルロホスファターゼを不可逆的に固定化する方法であって、
(a) (i)含水量約７０重量％のポリオールディスパーション共反応剤、(ii)ポリエーテル変性ポリジメチルシロキサン界面活性剤、(iii)ビストリスプロパン緩衝剤液及びＣａＣｌ2を含む緩衝媒体、及び(iv)ジイソプロピルフルロホスファターゼ、との混合物を反応させて水性混合物を作るステップ、
(b) ポリウレタンを生成可能なディスパーションを作るのに十分な量のポリイソシアネートを、前記水性混合物に加えるステップ、
(c) 前記ディスパーションを基質に施すステップ、
(d) 酵素含有ディスパーションを硬化させるステップ、
を含んでいる方法。
【請求項１９】
ポリオールディスパーションは、ステップ(c)の脂肪族ポリイソシアネートの量の約２倍を越える量で存在する請求項１８の方法。
【請求項２０】
ジイソプロピルフルロホスファターゼは、ステップ(a)の前に、ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする低粘度脂肪族ポリイソシアネート樹脂と反応が行われる請求項１８の方法。
【請求項２１】
酵素含有ポリウレタンであって、
(a) (i)ポリオールディスパーション共反応剤と(ii)酵素との混合物を反応させて水性混合物を作るステップ、
(b) ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする水分散性ポリイソシアネートを、前記水性混合物に加えるステップ、
(c) ポリイソシアネートと水性混合物からディスパーションを生成するステップ、
(d) 前記ディスパーションを基質に施して、酵素含有ポリウレタンを生成するステップ、及び
(e) 酵素含有ポリウレタンを硬化させるステップ、
を含むプロセスによって作られた酵素含有ポリウレタン。
【請求項２２】
ポリオールディスパーションの量は、ステップ(b)で加えられるポリイソシアネートの量よりも約２倍多い請求項２１の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２３】
ステップ(a)で用いられるポリオールディスパーションは、含水量約７０重量％である請求項２２の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２４】
ステップ(a)で、ポリエチレン変性ポリジメチルシロキサン界面活性剤が存在する請求項２３の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２５】
ステップ(a)で、ビストリスプロパン緩衝剤とＣａＣｌ2が存在する請求項２４の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２６】
ステップ(c)で存在するポリオールディスパーション共反応剤の量は、ステップ(c)で存在するポリイソシアネートの量の約２.５倍である請求項２５の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２７】
約０.０２〜９ｍｇのジイソプロピルフルロホスファターゼが、ステップ(a)で用いられる請求項２６の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２８】
活性保持は１０％〜１００％である請求項２１の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２９】
ジイソプロピルフルロホスファターゼの固定化の程度は約１００％である請求項２１の酵素含有ポリウレタン。
【請求項１】
ポリウレタン材料の中に酵素を不可逆的に固定化する方法であって、
(a) (i)ポリオールディスパーション共反応剤と(ii)酵素との混合物を反応させて水性混合物を作るステップ、
(b) ポリウレタンを生成可能なディスパーションを作るのに十分な量の(iii)水分散性ポリイソシアネートを、前記水性混合物に加えるステップ、
(c) ポリイソシアネートを水性混合物の中に分散させて、ポリウレタン材料を生成可能なディスパーションを作るステップ、
(d) ポリウレタンを生成可能なディスパーションを基質に施すステップ、及び
(e) 酵素含有ディスパーションを硬化させるステップ、
を含んでいる方法。
【請求項２】
酵素含有ディスパーションが硬化して、コーティング、接着剤又はシーラントを生成する請求項１の方法。
【請求項３】
酵素含有ディスパーションが硬化して、コーティングを生成する請求項１の方法。
【請求項４】
水分散性ポリイソシアネートは脂肪族ポリイソシアネートである請求項１の方法。
【請求項５】
水分散性ポリイソシアネートはヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする請求項１の方法。
【請求項６】
基質は、木、スチール、ガラス、コンクリート又はプラスチックである請求項１の方法。
【請求項７】
基質はポリマーである請求項１の方法。
【請求項８】
ポリオールディスパーション(i)は、２以上のポリオールを含んでいる請求項１の方法。
【請求項９】
水分散性ポリイソシアネートとして、２以上のポリイソシアネートが用いられる請求項１の方法。
【請求項１０】
ポリウレタンを生成可能なディスパーションは、ステップ(d)の後、第２の基質と接触させられる請求項１の方法。
【請求項１１】
ポリオールディスパーションは、ステップ(b)で加えられるポリイソシアネートの量の約２倍を越える量で存在する請求項１の方法。
【請求項１２】
ステップ(a)で用いられるポリオールディスパーションは、含水量約７０重量％である請求項１の方法。
【請求項１３】
ステップ(a)では、ポリエチレン変性ポリジメチルシロキサン界面活性剤が存在する請求項１の方法。
【請求項１４】
ステップ(a)で反応が行われる混合物は、ビストリスプロパン緩衝剤とＣａＣｌ2を含んでいる請求項１の方法。
【請求項１５】
ステップ(c)で反応が行われる混合物は、ポリオールディスパーション共反応剤を、脂肪族ポリイソシアネートよりも約２.５倍多く含んでいる請求項１の方法。
【請求項１６】
ステップ(a)で反応が行われる混合物には、約０.０２〜９ｍｇのジイソプロピルフルロホスファターゼが含まれている請求項１の方法。
【請求項１７】
ステップ(a)の前に、酵素は、ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする低粘度脂肪族ポリイソシアネート樹脂と反応が行われる請求項１の方法。
【請求項１８】
ポリウレタンの中にジイソプロピルフルロホスファターゼを不可逆的に固定化する方法であって、
(a) (i)含水量約７０重量％のポリオールディスパーション共反応剤、(ii)ポリエーテル変性ポリジメチルシロキサン界面活性剤、(iii)ビストリスプロパン緩衝剤液及びＣａＣｌ2を含む緩衝媒体、及び(iv)ジイソプロピルフルロホスファターゼ、との混合物を反応させて水性混合物を作るステップ、
(b) ポリウレタンを生成可能なディスパーションを作るのに十分な量のポリイソシアネートを、前記水性混合物に加えるステップ、
(c) 前記ディスパーションを基質に施すステップ、
(d) 酵素含有ディスパーションを硬化させるステップ、
を含んでいる方法。
【請求項１９】
ポリオールディスパーションは、ステップ(c)の脂肪族ポリイソシアネートの量の約２倍を越える量で存在する請求項１８の方法。
【請求項２０】
ジイソプロピルフルロホスファターゼは、ステップ(a)の前に、ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする低粘度脂肪族ポリイソシアネート樹脂と反応が行われる請求項１８の方法。
【請求項２１】
酵素含有ポリウレタンであって、
(a) (i)ポリオールディスパーション共反応剤と(ii)酵素との混合物を反応させて水性混合物を作るステップ、
(b) ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする水分散性ポリイソシアネートを、前記水性混合物に加えるステップ、
(c) ポリイソシアネートと水性混合物からディスパーションを生成するステップ、
(d) 前記ディスパーションを基質に施して、酵素含有ポリウレタンを生成するステップ、及び
(e) 酵素含有ポリウレタンを硬化させるステップ、
を含むプロセスによって作られた酵素含有ポリウレタン。
【請求項２２】
ポリオールディスパーションの量は、ステップ(b)で加えられるポリイソシアネートの量よりも約２倍多い請求項２１の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２３】
ステップ(a)で用いられるポリオールディスパーションは、含水量約７０重量％である請求項２２の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２４】
ステップ(a)で、ポリエチレン変性ポリジメチルシロキサン界面活性剤が存在する請求項２３の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２５】
ステップ(a)で、ビストリスプロパン緩衝剤とＣａＣｌ2が存在する請求項２４の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２６】
ステップ(c)で存在するポリオールディスパーション共反応剤の量は、ステップ(c)で存在するポリイソシアネートの量の約２.５倍である請求項２５の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２７】
約０.０２〜９ｍｇのジイソプロピルフルロホスファターゼが、ステップ(a)で用いられる請求項２６の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２８】
活性保持は１０％〜１００％である請求項２１の酵素含有ポリウレタン。
【請求項２９】
ジイソプロピルフルロホスファターゼの固定化の程度は約１００％である請求項２１の酵素含有ポリウレタン。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５０００５９（Ｐ２００８−５０００５９Ａ）
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２７１９８（Ｐ２００７−５２７１９８）
【出願日】平成１７年２月２２日（２００５．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００５５７３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１８８０１
【国際公開日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（５０４０２９３５２）ユニバーシティ オブ ピッツバーグ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＰＩＴＴＳＢＵＲＧＨ
【出願人】（５０３３２８２８５）バイエル マテリアルサイエンス エルエルシー (5)
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｅｒ ＭａｔｅｒｉａｌＳｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】１００ Ｂａｙｅｒ Ｒｏａｄ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ １５２０５， ＵＳＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２２日（２００５．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００５５７３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１８８０１
【国際公開日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（５０４０２９３５２）ユニバーシティ オブ ピッツバーグ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＰＩＴＴＳＢＵＲＧＨ
【出願人】（５０３３２８２８５）バイエル マテリアルサイエンス エルエルシー (5)
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｅｒ ＭａｔｅｒｉａｌＳｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】１００ Ｂａｙｅｒ Ｒｏａｄ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ １５２０５， ＵＳＡ
【Ｆターム（参考）】
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