ポリヌクレオチド検査方法及びポリヌクレオチド検査キット
【課題】
簡便かつ迅速に、ポリヌクレオチドの長さ等に影響されずに検査できるポリヌクレオチド検査方法を提供することである。
【解決手段】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定することを特徴とするポリヌクレオチド検査方法を用いる。
簡便かつ迅速に、ポリヌクレオチドの長さ等に影響されずに検査できるポリヌクレオチド検査方法を提供することである。
【解決手段】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定することを特徴とするポリヌクレオチド検査方法を用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチド検査方法及びポリヌクレオチド検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
微粒子を用いてポリヌクレオチドを検査する方法として、２つ以上の部分を有する核酸を検出するための方法であって、オリゴヌクレオチドが付着した１種類以上のナノ粒子を提供し、該各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、前記核酸の部分の内の１配列に対して相補的な配列を有することと、前記ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸に有効にハイブリダイズする条件下において前記核酸と前記ナノ粒子とを接触させることと、前記ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが前記核酸にハイブリダイズすることにより起こる検出可能な変化を観測することを含む方法（特許文献１）や、表面に１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子とターゲットＤＮＡとを溶液中でハイブリダイズさせて、金コロイド粒子に固定された１本鎖ＤＮＡの金コロイド粒子に固定されていない側においていずれのＤＮＡ鎖も突出していない末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成し、ハイブリダイズ後の金コロイド粒子の凝集体の形成の有無により、ターゲットＤＮＡの末端一塩基の情報を得る方法であって、前記ハイブリダイズを０〜３０℃の範囲の温度で行い、かつ前記凝集体が形成された場合には、少なくとも、金コロイド粒子に固定された１本鎖ＤＮＡの金コロイド粒子に固定されていない側の末端の一塩基と、この前記一塩基と対向する前記ターゲットＤＮＡの末端の一塩基が、相補的であると判定する、前記方法（特許文献２）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０００−５１６４６０号公報
【特許文献２】特許第３９３２５１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載された方法では、検査時間が長いこと、及び複数種類のポリヌクレオチド付着微粒子等を用意する必要があり煩雑であること等の問題がある。
特許文献２に記載された方法では、末端一塩基が変異していると検出できないこと、及び３０塩基までの短いポリヌクレオチドについてしか検査できないこと等の問題がある。
本発明の目的は、簡便かつ迅速に、ポリヌクレオチドの長さ等に影響されずに検査できるポリヌクレオチド検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のポリヌクレオチド検査方法の特徴は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定する点を要旨とする。
【０００６】
本発明のポリヌクレオチド検査キットの特徴は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定するためのポリヌクレオチド検査キットであって、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、
検査対象であるポリヌクレオチドに疎水性基を導入して疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を調製するための疎水性基導入試薬（ＨＡ）とを含む点を要旨とする。
【０００７】
本発明のプライマーの特徴は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定するのに使用する疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を製造するためのプライマーであって、
３’末端又は５’末端に疎水性基を有する点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のポリヌクレオチド検査方法によると、簡便かつ迅速に、ポリヌクレオチドの長さ等に影響されずにポリヌクレオチドを検査できる。
また、本発明のポリヌクレオチド検査キットを用いると、上記のポリヌクレオチド検査方法を適用できるので、簡便かつ迅速に、簡便かつ迅速に、ポリヌクレオチドの長さ等に影響されずにポリヌクレオチドを検査できる。
また、本発明のプライマーを用いると、未知のポリヌクレオチド等から、上記のポリヌクレオチド検査方法に使用する疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を容易に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明において、ＰＣＲとは、polymerase chain reaction（核酸増幅反応）を意味する。また、塩基とは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はウラシル（Ｕ）を意味する。
【００１０】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）とは、複数のヌクレオチド（核酸）が重合したものを微粒子に付着させたものである。
ポリヌクレオチドの３’末端又は５’末端を微粒子に付着させたものであるが、ポリヌクレオチドの５’末端を微粒子に付着させたものが好ましい。
【００１１】
ヌクレオチドの数は特に限定されないが、少なくとも５個が好ましく、さらに好ましくは５〜１００個、特に好ましくは１０〜９０個、次に好ましくは２０〜８５、最も好ましくは３５〜８０個である。
【００１２】
微粒子としては、金属微粒子、シリカ微粒子及びラッテクス微粒子等が含まれる。
金属微粒子としては、金微粒子、銀微粒子及び白金微粒子等が含まれる。
【００１３】
金属微粒子の粒子径（ｎｍ）は、１０〜２００が好ましく、さらに好ましくは２０〜１００、特に好ましくは４０〜８０である。これらの範囲であると、測定感度がさらに良好となる。粒子径は、電子顕微鏡により測定される。
これらの金属微粒子は、田中貴金属工業株式会社やEYLABOR ATORIES, INC、British-Biocell社等から入手できる。金属微粒子は、公知の方法により製造でき、たとえば、塩化金酸（ＨＡｕＣｌ３）を還元剤（クエン酸等）で還元することに金コロイドを得てもよい。
【００１４】
微粒子は分散媒（水等）に分散した形態（コロイド、分散体、乳化分散体等）であることが好ましい。微粒子が分散した形態である場合、微粒子の濃度（重量％）は、０．００１〜０．１が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜０．０５、特に好ましくは０．００８〜０．０２である。
【００１５】
金属微粒子は、物理吸着によりポリヌクレオチドを付着してもよいが、測定精度及びポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）の安定性等の観点から、化学結合によりポリヌクレオチドを付着することが好ましい。また、特異的分子認識を介して付着してもよく、これらの組合せにより付着してもよい。
【００１６】
物理吸着は、公知の方法等が適用でき、金属微粒子とポリヌクレオチドを溶液中で混合する方法等により達成できる。
【００１７】
化学結合は、公知の方法等が適用でき、たとえば、メルカプト基（−ＳＨ）、チオカルボキシ基（−ＣＯＳＨ）、ジチオカルボキシ基（−ＣＳＳＨ）又はアミノ基（−ＮＨ２）を末端に導入したポリヌクレオチドと、金属粒子とを混合加熱する方法等が適用できる。
メルカプト基、チオカルボキシ基、ジチオカルボキシ基又はアミノ基を末端に導入したポリヌクレオチドは、タカラバイオ株式会社やオペロン バイオテクノロジー株式会社等から入手できる。
【００１８】
なお、メルカプト基、チオカルボキシ基、ジチオカルボキシ基又はアミノ基は、ポリヌクレオチドに直接結合していてもよいが、スペーサー｛たとえば、炭素数４〜８のアルキレン（ブチレン、へキシレン及びオクチレン等）、炭素数６〜１８のアリーレン（フェニレン、ビフェニレン等）及びポリオキシエチレン等｝を介してポリヌクレオチドに結合していてもよい。
【００１９】
特異的分子認識を介する場合、ビオチン又は糖（ラクトース及びマンノース等）が結合した金属微粒子と、アビジン（ストレプトアビジンを含む）又はレクチンが結合したポリヌクレオチドとを特異的に結合させる方法；又は
アビジン（ストレプトアビジンを含む）又はレクチンが結合した金属微粒子と、ビオチン又は糖（ラクトース及びマンノース等）が結合したポリヌクレオチドとを特異的に結合させる方法等が適用できる。
【００２０】
ビオチン又は糖（ラクトース及びマンノース等）が結合した金属微粒子及び、アビジン（ストレプトアビジンを含む）又はレクチンが結合した金属微粒子は、上記の化学結合による方法等によって得ることができ、また、フナコシ株式会社等からも入手できる。
【００２１】
アビジンやストレプトアビジン又はレクチンが結合したポリヌクレオチド及び、ビオチン又は糖（ラクトース及びマンノース等）が結合したポリヌクレオチドは、公知の方法等によって得ることができ、また、タカラバイオ株式会社やオペロン バイオテクノロジー株式会社等からも入手できる。
【００２２】
シリカ微粒子及びラッテクス微粒子としては、免疫凝集測定法に用いられる微粒子（たとえば、「検査と技術」ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１１，２０００年１０月，１３７８−１３８１頁、「検査と技術」ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．７，１９８８年増刊号，６０６−６１３頁等）等が使用できる。
これらのうち、ポリヌクレオチドと化学結合できる官能基（アミノ基、メルカプト基、カルボキシ基、ヒロドキシ基等）を有しているもの｛シリカ微粒子及び変性ラテックス微粒子（ポリスチレンラテックスにカルボキシル基を導入したカルボキシ変性ラテックス、アミノ基を導入したアミノ変性ラテックス、メルカプト基を導入したメルカプト変性ラテックス等）等｝等が好ましい。
【００２３】
シリカ微粒子及びラテックス微粒子の体積平均粒子径（ｎｍ）は、２０〜１０００が好ましく、さらに好ましくは３００〜５００、特に好ましくは５０〜３００である。これらの範囲であると、測定感度がさらに良好となる。この粒子径は、測定感度等の観点から、バラツキが小さい方が好ましく、粒子径の変動係数が１０％以下であることが好ましく、さらに好ましくは５％以下、特に好ましくは３％以下である。なお、変動係数は、（粒子径分布の標準偏差／体積平均粒子径）×１００により算出される。粒子径分布の標準偏差及び体積平均粒子径は、レーザー回折散乱式粒径分布測定装置（たとえば、堀場製作所製、Partica LA-950）により測定される。
【００２４】
シリカ微粒子及びラッテクス微粒子は、物理吸着によりポリヌクレオチドを付着してもよいが、測定精度及びポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）の安定性等の観点から、化学結合によりポリヌクレオチドを付着することが好ましい。また、特異的分子認識を介して付着してもよく、これらの組合せにより付着してもよい。
【００２５】
物理吸着は、公知の方法等が適用でき、シリカ微粒子又はラッテクス微粒子とポリヌクレオチドを溶液中で混合する方法等により達成できる。
化学結合は、公知の方法等が適用でき、たとえば、Immunochemistry 6, 43-52 (1969)、Immunochemistry 6, 53-66 (1969)、Immobilised Affinity Ligand Techniques, Acdemic Press (1992)、Bioconjugate Techniques, Acdemic Press (1996)、又はAnal. Lett. 18(B9), 1143-1155 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5374-5378 (1987)に記載された方法等が適用できる。
特異的分子認識を介する場合、上記の方法や直前の化学結合による方法を組み合わせる方法等が適用できる。
【００２６】
付着させるポリヌクレオチドの量（モル／１００ｇ）は、微粒子１００ｇ当たり、１０−１７〜１０−１１が好ましく、さらに好ましくは１０−１６〜１０−１０、特に好ましくは１０−１５〜１０−９である。
【００２７】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）には、測定精度等の観点から、凝集促進剤（ＣＰ）を添加しておくことが好ましい。すなわち、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とのハイブリタイズさせる際、凝集促進剤（ＣＰ）の存在下でハイブリタイズさせることが好ましい。なお、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とをハイブリタイズさせた後に、凝集促進剤（ＣＰ）を水溶液に添加してもよいし、凝集促進剤（ＣＰ）の存在下でハイブリタイズさせ、さらにハイブリタイズさせた後に、凝集促進剤（ＣＰ）を添加してもよい。
【００２８】
凝集促進剤（ＣＰ）としては、塩及び水易溶性有機溶媒が含まれる。
塩としては、ハロゲン化アルカリ金属（塩化ナトリウム、塩化カリウム及び臭化カリウム等）、ハロゲン化アルカリ土類金属（塩化カルシウム及び塩化マグネシウム等）、硫酸アルカリ金属（硫酸ナトリウム及び硫酸カリウム等）、炭酸アルカリ金属（炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム及び炭酸カリウム等）、硝酸アルカリ金属（硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム等）、過ハロゲン酸アルカリ金属（過塩素酸ナトリウム及び過臭素酸カリウム等）及びハロゲン化アンモニウム（塩化アンモニウム及び臭化アンモニウム等）等が挙げられる。
水易溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトン、ジメチルスルホキシド及びジメチルホルムアミド等が挙げられる。
【００２９】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）に凝集促進剤（ＣＰ）を添加する場合、ハイブリタイズさせる水溶液中の凝集促進剤の濃度（ｍｏｌ／Ｌ）は、０．０１〜１が好ましく、さらに好ましくは０．０５〜０．５、特に好ましくは０．０７〜０．３である。
【００３０】
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）としては、化学合成したポリヌクレオチドやＰＣＲ法により増幅したポリヌクレオチド等に結合したジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）等をモノクロル酢酸で脱離することなく、ジメトキシトリチル基を末端に残したジメトキシトリチル基含有ポリヌクレオチド等が使用できる。ジメトキシトリチル基含有ポリヌクレオチドの他に、蛍光色素を末端に持つ蛍光色素含有ポリヌクレオチド等も使用できる。
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）は、３’末端又は５’末端に疎水性基をもつが、５’側に疎水性基をもつことが好ましい。
【００３１】
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）としては、天然のポリヌクレオチド又はこれを増幅したポリヌクレオチドからでも、疎水性基導入試薬（ＨＡ）を用いて調製することができる。
疎水性基導入試薬（ＨＡ）としては、３’末端又は５’末端に疎水性基を有するプライマー（ＨＡ１）、並びに酵素と疎水性基含有オリゴヌクレオチド又は疎水性基含有塩基とを含む試薬（ＨＡ２）等が含まれる。
【００３２】
３’末端又は５’末端に疎水性基を有するプライマー（ＨＡ１）は、化学合成したポリヌクレオチドやＰＣＲ法により増幅したポリヌクレオチド等に結合したジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）等をモノクロル酢酸で脱離することなく、ジメトキシトリチル基を末端に残したジメトキシトリチル基含有ポリヌクレオチド等が使用できる。ジメトキシトリチル基含有ポリヌクレオチドの他に、蛍光色素を末端に持つ蛍光色素含有ポリヌクレオチド等も使用できる。このプライマーは、５’末端に疎水性基をもつことが好ましい。
【００３３】
３’末端又は５’末端に疎水性基を有するプライマー（ＨＡ１）を用いて、天然のポリヌクレオチドを鋳型として、ポリヌクレオチドを増幅して、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を調製する場合、ＰＣＲ法の他、他の増幅法も適用できる。そして、このように調製した疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）は、二本鎖のままで、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）の存在下、熱変成により一本鎖にした後、ハイブリタイズさせることもできる。
【００３４】
酵素としては、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼから選ばれる酵素等が含まれる。
疎水性基含有オリゴヌクレオチドとしては、ジメトキシトリチル基や蛍光色素等の疎水性基を含むオリゴヌクレオチド等が含まれる。このオリゴヌクレオチドを構成する塩基の数は５以上であれば制限がないが、測定精度及びアニーリング温度等の観点から、５〜１００が好ましく、さらに好ましくは１０〜８０、特に好ましくは１５〜７０である。また、疎水性基含有塩基としては、ジメトキシトリチル基や蛍光色素等の疎水性基を含む塩基等が含まれる。疎水性基含有オリゴヌクレオチドは、３’末端又は５'末端に疎水性基を持つが、５’末端に疎水性基を持つことが好ましい。
【００３５】
酵素と疎水性基含有オリゴヌクレオチド又は疎水性基含有塩基とを含む試薬（ＨＡ２）を用いる場合、天然のポリヌクレオチド又はこれを増幅したポリヌクレオチドの３’末端又は５’末端に（５'末端が好ましい）、酵素の作用により、疎水性基含有オリゴヌクレオチド又は疎水性基含有塩基を結合させることにより、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を調製することができる。
【００３６】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中のポリヌクレオチドを構成する塩基の数と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中のポリヌクレオチドを構成する塩基の数とは、同じである必要はない。
【００３７】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせる際の温度（℃）としては特に制限はないが、１０〜８０が好ましく、さらに好ましくは１５〜７０、特に好ましくは２０〜６０である。
【００３８】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせ、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集すれば、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中のポリヌクレオチドと、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中のポリヌクレオチドとは、相補的であると判定できる。一方、ハイブリタイズさせても、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集しなければ、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中のポリヌクレオチドと、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中のポリヌクレオチドとは、相補的でないと判定できる。
【００３９】
凝集の有無は、水溶液の色の変化や濁度を観察すること等により、判断できる。この他に、凝集の有無を、顕微鏡、散乱光の検知、電気化学的検出、表面プラズモン共鳴又は電気化学水晶振動子マイクロバランス（ＥＱＣＭ）等によっても観察できる。
【００４０】
本発明のヌクレオチド検査キットは、上記のポリヌクレオチド検査方法に適したキットである。
本発明のヌクレオチド検査キットには、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、検査対象であるポリヌクレオチドに疎水性基を導入して疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を調製するための疎水性基導入試薬（ＨＡ）とを含むものである。このキットを用いると、天然のポリヌクレオチドに、疎水性基を導入して、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）として使用することができる。
【００４１】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）は、上記と同様のもの等が使用でき、好ましい範囲も同じである。
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）の形態としては、水分散体（コロイド）でることが好ましい。
【００４２】
疎水性基導入試薬（ＨＡ）としては、上記と同様のもの等が使用でき、好ましい範囲も同じである。
【００４３】
本発明のヌクレオチド検査キットには、凝集促進剤（ＣＰ）を含ませることができる。
凝集促進剤（ＣＰ）としては、上記と同様のもの等が使用でき、好ましい範囲も同じである。凝集促進剤（ＣＰ）は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）に含有させておいてもよい。
【実施例】
【００４４】
＜実施例１＞
Jounal of American Chemical Society,2003,125,8102-8103に記載の方法に準じて、金コロイド（EY LABORATRIES, INC製、粒子径４０ｎｍ、ＨＡｕＣｌ４濃度として０．０１重量％）９７０μＬと、ポリヌクレオチド（５’ＳＨ３０）｛配列番号１、5'-(HS-)CGCGCG GTTTT AAGGT TGCGG CCGCG AATTC-3'、５’末端にメルカプト基（−ＳＨ）を結合させたもの、オペロン バイオテクノロジー株式会社製｝３０μＬとを混合して、５０℃で１６時間インキュベートして、処理金コロイド（１）を得た。
この処理金コロイド（１）の一部（約１００μＬ）をＤＮＡ回収用フィルター付遠心チューブ（ＳＵＰＲＥＣ−ＰＣＲ、タカラバイオ株式会社、「ＳＵＰＲＥＣ」は同社の登録商標である。）に入れ、３０００ｒｐｍ（８００ｇ）、１５分間遠心濾過して、濾液のＯＤ２６０を測定したところ、−０．１５７であった。このことから、遊離ポリヌクレオチドはほぼ存在せず、ポリヌクレオチド（５’ＳＨ３０）がほぼ１００％金コロイドに付着していることが分かった。
【００４５】
簡易ゲル濾過カラム（商品名ＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰ、PRINCETON SEPARATIONS, INC.製）に、水８００μＬを加え、３０００ｒｐｍ（８００ｇ）、２分間遠心した後、処理金コロイド（１）５０μＬを加えて、３０００ｒｐｍ（８００ｇ）、２分間遠心ゲル濾過して、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）分散液を得た。
【００４６】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）分散液２０μＬに、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）｛配列番号２、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させたもの、オペロン バイオテクノロジー株式会社製｝の最終濃度が０．０７２μＭとなるように、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）を加え、全量を２２μＬとして、約２５℃で３０分間ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
【００４７】
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が７５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、直ちに、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００４８】
＜実施例２＞
塩化ナトリウムの濃度を、「７５ｍＭ」から「５５ｍＭ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分後に、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００４９】
＜実施例３＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「０．３６μＭ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が７５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、直ちに、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５０】
＜実施例４＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「０．３６μＭ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が５５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分後に、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５１】
＜実施例５＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「１．８μＭ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が７５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、直ちに、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５２】
＜実施例６＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「１．８μＭ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が５５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分後に、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５３】
＜実施例７＞
「金コロイド（EY LABORATRIES, INC、粒子径４０ｎｍ、ＨＡｕＣｌ４濃度として０．０１重量％）」を「金コロイド（EY LABORATRIES, INC、粒子径２０ｎｍ、ＨＡｕＣｌ４濃度として０．０１重量％）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、処理金コロイド（２）を得た。
この処理金コロイド（２）をＤＮＡ回収用フィルター付遠心チューブ（ＳＵＰＲＥＣ−ＰＣＲ、タカラバイオ株式会社）に入れ、３０００ｒｐｍ（８００ｇ）、１５分間遠心濾過して、濾液のＯＤ２６０を測定したところ、−０．０６８であった。このことから、遊離ポリヌクレオチドはほぼ存在せず、ポリヌクレオチド（５’ＳＨ３０）がほぼ１００％金コロイドに付着していることが分かった。
【００５４】
簡易ゲル濾過カラム（商品名ＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰ、PRINCETON SEPARATIONS, INC.製）に、水８００μＬを加え、３０００ｒｐｍ（８００ｇ）、２分間遠心した後、処理金コロイド（２）５０μＬを加えて、３０００ｒｐｍ（８００ｇ）、２分間遠心ゲル濾過して、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ２）分散液を得た。
【００５５】
「ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）分散液」を「ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ２）分散液」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
【００５６】
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が８０ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、直ちに、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５７】
＜実施例８＞
塩化ナトリウムの濃度を、「８０ｍＭ」から「６５ｍＭ」に変更したこと以外、実施例７と同様にして、インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分後に、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５８】
＜実施例９＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「０．３６μＭ」に変更したこと以外、実施例７と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が８０ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、直ちに、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５９】
＜実施例１０＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「０．３６μＭ」に変更したこと以外、実施例７と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が６５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分後に、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００６０】
＜実施例１１＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「１．８μＭ」に変更したこと以外、実施例７と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が８０ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、直ちに、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００６１】
＜実施例１２＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「１．８μＭ」に変更したこと以外、実施例７と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が６５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分後に、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００６２】
＜比較例１＞
「疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）」を「ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）｛配列番号３、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させていないこと以外、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）と同じもの｝」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が７５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分たっても、分散液の色がワインレッドのままであった。
このことから、ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）の塩基配列が、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であるどうか、判定できなかった。
【００６３】
＜比較例２＞
「疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）」を「ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）｛配列番号３、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させていないこと以外、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）と同じもの｝」に変更したこと以外、実施例３と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が７５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分たっても、分散液の色がワインレッドのままであった。
このことから、ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）の塩基配列が、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であるどうか、判定できなかった。
【００６４】
＜比較例３＞
「疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）」を「ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）｛配列番号３、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させていないこと以外、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）と同じもの｝」に変更したこと以外、実施例５と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が７５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分たっても、分散液の色がワインレッドのままであった。
このことから、ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）の塩基配列が、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であるどうか、判定できなかった。
【００６５】
＜比較例４＞
「疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）」を「ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）｛配列番号３、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させていないこと以外、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）と同じもの｝」に変更したこと以外、実施例７と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が８０ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分たっても、分散液の色がワインレッドのままであった。
このことから、ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）の塩基配列が、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であるどうか、判定できなかった。
【００６６】
＜比較例５＞
「疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）」を「ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）｛配列番号３、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させていないこと以外、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）と同じもの｝」に変更したこと以外、実施例９と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が８０ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分たっても、分散液の色がワインレッドのままであった。
このことから、ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）の塩基配列が、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であるどうか、判定できなかった。
【００６７】
＜比較例６＞
「疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）」を「ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）｛配列番号３、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させていないこと以外、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）と同じもの｝」に変更したこと以外、実施例１１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が８０ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分たっても、分散液の色がワインレッドのままであった。
このことから、ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）の塩基配列が、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であるどうか、判定できなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチド検査方法及びポリヌクレオチド検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
微粒子を用いてポリヌクレオチドを検査する方法として、２つ以上の部分を有する核酸を検出するための方法であって、オリゴヌクレオチドが付着した１種類以上のナノ粒子を提供し、該各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、前記核酸の部分の内の１配列に対して相補的な配列を有することと、前記ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸に有効にハイブリダイズする条件下において前記核酸と前記ナノ粒子とを接触させることと、前記ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが前記核酸にハイブリダイズすることにより起こる検出可能な変化を観測することを含む方法（特許文献１）や、表面に１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子とターゲットＤＮＡとを溶液中でハイブリダイズさせて、金コロイド粒子に固定された１本鎖ＤＮＡの金コロイド粒子に固定されていない側においていずれのＤＮＡ鎖も突出していない末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成し、ハイブリダイズ後の金コロイド粒子の凝集体の形成の有無により、ターゲットＤＮＡの末端一塩基の情報を得る方法であって、前記ハイブリダイズを０〜３０℃の範囲の温度で行い、かつ前記凝集体が形成された場合には、少なくとも、金コロイド粒子に固定された１本鎖ＤＮＡの金コロイド粒子に固定されていない側の末端の一塩基と、この前記一塩基と対向する前記ターゲットＤＮＡの末端の一塩基が、相補的であると判定する、前記方法（特許文献２）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０００−５１６４６０号公報
【特許文献２】特許第３９３２５１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載された方法では、検査時間が長いこと、及び複数種類のポリヌクレオチド付着微粒子等を用意する必要があり煩雑であること等の問題がある。
特許文献２に記載された方法では、末端一塩基が変異していると検出できないこと、及び３０塩基までの短いポリヌクレオチドについてしか検査できないこと等の問題がある。
本発明の目的は、簡便かつ迅速に、ポリヌクレオチドの長さ等に影響されずに検査できるポリヌクレオチド検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のポリヌクレオチド検査方法の特徴は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定する点を要旨とする。
【０００６】
本発明のポリヌクレオチド検査キットの特徴は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定するためのポリヌクレオチド検査キットであって、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、
検査対象であるポリヌクレオチドに疎水性基を導入して疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を調製するための疎水性基導入試薬（ＨＡ）とを含む点を要旨とする。
【０００７】
本発明のプライマーの特徴は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定するのに使用する疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を製造するためのプライマーであって、
３’末端又は５’末端に疎水性基を有する点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のポリヌクレオチド検査方法によると、簡便かつ迅速に、ポリヌクレオチドの長さ等に影響されずにポリヌクレオチドを検査できる。
また、本発明のポリヌクレオチド検査キットを用いると、上記のポリヌクレオチド検査方法を適用できるので、簡便かつ迅速に、簡便かつ迅速に、ポリヌクレオチドの長さ等に影響されずにポリヌクレオチドを検査できる。
また、本発明のプライマーを用いると、未知のポリヌクレオチド等から、上記のポリヌクレオチド検査方法に使用する疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を容易に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明において、ＰＣＲとは、polymerase chain reaction（核酸増幅反応）を意味する。また、塩基とは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はウラシル（Ｕ）を意味する。
【００１０】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）とは、複数のヌクレオチド（核酸）が重合したものを微粒子に付着させたものである。
ポリヌクレオチドの３’末端又は５’末端を微粒子に付着させたものであるが、ポリヌクレオチドの５’末端を微粒子に付着させたものが好ましい。
【００１１】
ヌクレオチドの数は特に限定されないが、少なくとも５個が好ましく、さらに好ましくは５〜１００個、特に好ましくは１０〜９０個、次に好ましくは２０〜８５、最も好ましくは３５〜８０個である。
【００１２】
微粒子としては、金属微粒子、シリカ微粒子及びラッテクス微粒子等が含まれる。
金属微粒子としては、金微粒子、銀微粒子及び白金微粒子等が含まれる。
【００１３】
金属微粒子の粒子径（ｎｍ）は、１０〜２００が好ましく、さらに好ましくは２０〜１００、特に好ましくは４０〜８０である。これらの範囲であると、測定感度がさらに良好となる。粒子径は、電子顕微鏡により測定される。
これらの金属微粒子は、田中貴金属工業株式会社やEYLABOR ATORIES, INC、British-Biocell社等から入手できる。金属微粒子は、公知の方法により製造でき、たとえば、塩化金酸（ＨＡｕＣｌ３）を還元剤（クエン酸等）で還元することに金コロイドを得てもよい。
【００１４】
微粒子は分散媒（水等）に分散した形態（コロイド、分散体、乳化分散体等）であることが好ましい。微粒子が分散した形態である場合、微粒子の濃度（重量％）は、０．００１〜０．１が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜０．０５、特に好ましくは０．００８〜０．０２である。
【００１５】
金属微粒子は、物理吸着によりポリヌクレオチドを付着してもよいが、測定精度及びポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）の安定性等の観点から、化学結合によりポリヌクレオチドを付着することが好ましい。また、特異的分子認識を介して付着してもよく、これらの組合せにより付着してもよい。
【００１６】
物理吸着は、公知の方法等が適用でき、金属微粒子とポリヌクレオチドを溶液中で混合する方法等により達成できる。
【００１７】
化学結合は、公知の方法等が適用でき、たとえば、メルカプト基（−ＳＨ）、チオカルボキシ基（−ＣＯＳＨ）、ジチオカルボキシ基（−ＣＳＳＨ）又はアミノ基（−ＮＨ２）を末端に導入したポリヌクレオチドと、金属粒子とを混合加熱する方法等が適用できる。
メルカプト基、チオカルボキシ基、ジチオカルボキシ基又はアミノ基を末端に導入したポリヌクレオチドは、タカラバイオ株式会社やオペロン バイオテクノロジー株式会社等から入手できる。
【００１８】
なお、メルカプト基、チオカルボキシ基、ジチオカルボキシ基又はアミノ基は、ポリヌクレオチドに直接結合していてもよいが、スペーサー｛たとえば、炭素数４〜８のアルキレン（ブチレン、へキシレン及びオクチレン等）、炭素数６〜１８のアリーレン（フェニレン、ビフェニレン等）及びポリオキシエチレン等｝を介してポリヌクレオチドに結合していてもよい。
【００１９】
特異的分子認識を介する場合、ビオチン又は糖（ラクトース及びマンノース等）が結合した金属微粒子と、アビジン（ストレプトアビジンを含む）又はレクチンが結合したポリヌクレオチドとを特異的に結合させる方法；又は
アビジン（ストレプトアビジンを含む）又はレクチンが結合した金属微粒子と、ビオチン又は糖（ラクトース及びマンノース等）が結合したポリヌクレオチドとを特異的に結合させる方法等が適用できる。
【００２０】
ビオチン又は糖（ラクトース及びマンノース等）が結合した金属微粒子及び、アビジン（ストレプトアビジンを含む）又はレクチンが結合した金属微粒子は、上記の化学結合による方法等によって得ることができ、また、フナコシ株式会社等からも入手できる。
【００２１】
アビジンやストレプトアビジン又はレクチンが結合したポリヌクレオチド及び、ビオチン又は糖（ラクトース及びマンノース等）が結合したポリヌクレオチドは、公知の方法等によって得ることができ、また、タカラバイオ株式会社やオペロン バイオテクノロジー株式会社等からも入手できる。
【００２２】
シリカ微粒子及びラッテクス微粒子としては、免疫凝集測定法に用いられる微粒子（たとえば、「検査と技術」ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１１，２０００年１０月，１３７８−１３８１頁、「検査と技術」ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．７，１９８８年増刊号，６０６−６１３頁等）等が使用できる。
これらのうち、ポリヌクレオチドと化学結合できる官能基（アミノ基、メルカプト基、カルボキシ基、ヒロドキシ基等）を有しているもの｛シリカ微粒子及び変性ラテックス微粒子（ポリスチレンラテックスにカルボキシル基を導入したカルボキシ変性ラテックス、アミノ基を導入したアミノ変性ラテックス、メルカプト基を導入したメルカプト変性ラテックス等）等｝等が好ましい。
【００２３】
シリカ微粒子及びラテックス微粒子の体積平均粒子径（ｎｍ）は、２０〜１０００が好ましく、さらに好ましくは３００〜５００、特に好ましくは５０〜３００である。これらの範囲であると、測定感度がさらに良好となる。この粒子径は、測定感度等の観点から、バラツキが小さい方が好ましく、粒子径の変動係数が１０％以下であることが好ましく、さらに好ましくは５％以下、特に好ましくは３％以下である。なお、変動係数は、（粒子径分布の標準偏差／体積平均粒子径）×１００により算出される。粒子径分布の標準偏差及び体積平均粒子径は、レーザー回折散乱式粒径分布測定装置（たとえば、堀場製作所製、Partica LA-950）により測定される。
【００２４】
シリカ微粒子及びラッテクス微粒子は、物理吸着によりポリヌクレオチドを付着してもよいが、測定精度及びポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）の安定性等の観点から、化学結合によりポリヌクレオチドを付着することが好ましい。また、特異的分子認識を介して付着してもよく、これらの組合せにより付着してもよい。
【００２５】
物理吸着は、公知の方法等が適用でき、シリカ微粒子又はラッテクス微粒子とポリヌクレオチドを溶液中で混合する方法等により達成できる。
化学結合は、公知の方法等が適用でき、たとえば、Immunochemistry 6, 43-52 (1969)、Immunochemistry 6, 53-66 (1969)、Immobilised Affinity Ligand Techniques, Acdemic Press (1992)、Bioconjugate Techniques, Acdemic Press (1996)、又はAnal. Lett. 18(B9), 1143-1155 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5374-5378 (1987)に記載された方法等が適用できる。
特異的分子認識を介する場合、上記の方法や直前の化学結合による方法を組み合わせる方法等が適用できる。
【００２６】
付着させるポリヌクレオチドの量（モル／１００ｇ）は、微粒子１００ｇ当たり、１０−１７〜１０−１１が好ましく、さらに好ましくは１０−１６〜１０−１０、特に好ましくは１０−１５〜１０−９である。
【００２７】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）には、測定精度等の観点から、凝集促進剤（ＣＰ）を添加しておくことが好ましい。すなわち、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とのハイブリタイズさせる際、凝集促進剤（ＣＰ）の存在下でハイブリタイズさせることが好ましい。なお、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とをハイブリタイズさせた後に、凝集促進剤（ＣＰ）を水溶液に添加してもよいし、凝集促進剤（ＣＰ）の存在下でハイブリタイズさせ、さらにハイブリタイズさせた後に、凝集促進剤（ＣＰ）を添加してもよい。
【００２８】
凝集促進剤（ＣＰ）としては、塩及び水易溶性有機溶媒が含まれる。
塩としては、ハロゲン化アルカリ金属（塩化ナトリウム、塩化カリウム及び臭化カリウム等）、ハロゲン化アルカリ土類金属（塩化カルシウム及び塩化マグネシウム等）、硫酸アルカリ金属（硫酸ナトリウム及び硫酸カリウム等）、炭酸アルカリ金属（炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム及び炭酸カリウム等）、硝酸アルカリ金属（硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム等）、過ハロゲン酸アルカリ金属（過塩素酸ナトリウム及び過臭素酸カリウム等）及びハロゲン化アンモニウム（塩化アンモニウム及び臭化アンモニウム等）等が挙げられる。
水易溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトン、ジメチルスルホキシド及びジメチルホルムアミド等が挙げられる。
【００２９】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）に凝集促進剤（ＣＰ）を添加する場合、ハイブリタイズさせる水溶液中の凝集促進剤の濃度（ｍｏｌ／Ｌ）は、０．０１〜１が好ましく、さらに好ましくは０．０５〜０．５、特に好ましくは０．０７〜０．３である。
【００３０】
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）としては、化学合成したポリヌクレオチドやＰＣＲ法により増幅したポリヌクレオチド等に結合したジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）等をモノクロル酢酸で脱離することなく、ジメトキシトリチル基を末端に残したジメトキシトリチル基含有ポリヌクレオチド等が使用できる。ジメトキシトリチル基含有ポリヌクレオチドの他に、蛍光色素を末端に持つ蛍光色素含有ポリヌクレオチド等も使用できる。
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）は、３’末端又は５’末端に疎水性基をもつが、５’側に疎水性基をもつことが好ましい。
【００３１】
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）としては、天然のポリヌクレオチド又はこれを増幅したポリヌクレオチドからでも、疎水性基導入試薬（ＨＡ）を用いて調製することができる。
疎水性基導入試薬（ＨＡ）としては、３’末端又は５’末端に疎水性基を有するプライマー（ＨＡ１）、並びに酵素と疎水性基含有オリゴヌクレオチド又は疎水性基含有塩基とを含む試薬（ＨＡ２）等が含まれる。
【００３２】
３’末端又は５’末端に疎水性基を有するプライマー（ＨＡ１）は、化学合成したポリヌクレオチドやＰＣＲ法により増幅したポリヌクレオチド等に結合したジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）等をモノクロル酢酸で脱離することなく、ジメトキシトリチル基を末端に残したジメトキシトリチル基含有ポリヌクレオチド等が使用できる。ジメトキシトリチル基含有ポリヌクレオチドの他に、蛍光色素を末端に持つ蛍光色素含有ポリヌクレオチド等も使用できる。このプライマーは、５’末端に疎水性基をもつことが好ましい。
【００３３】
３’末端又は５’末端に疎水性基を有するプライマー（ＨＡ１）を用いて、天然のポリヌクレオチドを鋳型として、ポリヌクレオチドを増幅して、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を調製する場合、ＰＣＲ法の他、他の増幅法も適用できる。そして、このように調製した疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）は、二本鎖のままで、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）の存在下、熱変成により一本鎖にした後、ハイブリタイズさせることもできる。
【００３４】
酵素としては、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼから選ばれる酵素等が含まれる。
疎水性基含有オリゴヌクレオチドとしては、ジメトキシトリチル基や蛍光色素等の疎水性基を含むオリゴヌクレオチド等が含まれる。このオリゴヌクレオチドを構成する塩基の数は５以上であれば制限がないが、測定精度及びアニーリング温度等の観点から、５〜１００が好ましく、さらに好ましくは１０〜８０、特に好ましくは１５〜７０である。また、疎水性基含有塩基としては、ジメトキシトリチル基や蛍光色素等の疎水性基を含む塩基等が含まれる。疎水性基含有オリゴヌクレオチドは、３’末端又は５'末端に疎水性基を持つが、５’末端に疎水性基を持つことが好ましい。
【００３５】
酵素と疎水性基含有オリゴヌクレオチド又は疎水性基含有塩基とを含む試薬（ＨＡ２）を用いる場合、天然のポリヌクレオチド又はこれを増幅したポリヌクレオチドの３’末端又は５’末端に（５'末端が好ましい）、酵素の作用により、疎水性基含有オリゴヌクレオチド又は疎水性基含有塩基を結合させることにより、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を調製することができる。
【００３６】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中のポリヌクレオチドを構成する塩基の数と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中のポリヌクレオチドを構成する塩基の数とは、同じである必要はない。
【００３７】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせる際の温度（℃）としては特に制限はないが、１０〜８０が好ましく、さらに好ましくは１５〜７０、特に好ましくは２０〜６０である。
【００３８】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせ、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集すれば、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中のポリヌクレオチドと、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中のポリヌクレオチドとは、相補的であると判定できる。一方、ハイブリタイズさせても、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集しなければ、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中のポリヌクレオチドと、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中のポリヌクレオチドとは、相補的でないと判定できる。
【００３９】
凝集の有無は、水溶液の色の変化や濁度を観察すること等により、判断できる。この他に、凝集の有無を、顕微鏡、散乱光の検知、電気化学的検出、表面プラズモン共鳴又は電気化学水晶振動子マイクロバランス（ＥＱＣＭ）等によっても観察できる。
【００４０】
本発明のヌクレオチド検査キットは、上記のポリヌクレオチド検査方法に適したキットである。
本発明のヌクレオチド検査キットには、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、検査対象であるポリヌクレオチドに疎水性基を導入して疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を調製するための疎水性基導入試薬（ＨＡ）とを含むものである。このキットを用いると、天然のポリヌクレオチドに、疎水性基を導入して、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）として使用することができる。
【００４１】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）は、上記と同様のもの等が使用でき、好ましい範囲も同じである。
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）の形態としては、水分散体（コロイド）でることが好ましい。
【００４２】
疎水性基導入試薬（ＨＡ）としては、上記と同様のもの等が使用でき、好ましい範囲も同じである。
【００４３】
本発明のヌクレオチド検査キットには、凝集促進剤（ＣＰ）を含ませることができる。
凝集促進剤（ＣＰ）としては、上記と同様のもの等が使用でき、好ましい範囲も同じである。凝集促進剤（ＣＰ）は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）に含有させておいてもよい。
【実施例】
【００４４】
＜実施例１＞
Jounal of American Chemical Society,2003,125,8102-8103に記載の方法に準じて、金コロイド（EY LABORATRIES, INC製、粒子径４０ｎｍ、ＨＡｕＣｌ４濃度として０．０１重量％）９７０μＬと、ポリヌクレオチド（５’ＳＨ３０）｛配列番号１、5'-(HS-)CGCGCG GTTTT AAGGT TGCGG CCGCG AATTC-3'、５’末端にメルカプト基（−ＳＨ）を結合させたもの、オペロン バイオテクノロジー株式会社製｝３０μＬとを混合して、５０℃で１６時間インキュベートして、処理金コロイド（１）を得た。
この処理金コロイド（１）の一部（約１００μＬ）をＤＮＡ回収用フィルター付遠心チューブ（ＳＵＰＲＥＣ−ＰＣＲ、タカラバイオ株式会社、「ＳＵＰＲＥＣ」は同社の登録商標である。）に入れ、３０００ｒｐｍ（８００ｇ）、１５分間遠心濾過して、濾液のＯＤ２６０を測定したところ、−０．１５７であった。このことから、遊離ポリヌクレオチドはほぼ存在せず、ポリヌクレオチド（５’ＳＨ３０）がほぼ１００％金コロイドに付着していることが分かった。
【００４５】
簡易ゲル濾過カラム（商品名ＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰ、PRINCETON SEPARATIONS, INC.製）に、水８００μＬを加え、３０００ｒｐｍ（８００ｇ）、２分間遠心した後、処理金コロイド（１）５０μＬを加えて、３０００ｒｐｍ（８００ｇ）、２分間遠心ゲル濾過して、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）分散液を得た。
【００４６】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）分散液２０μＬに、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）｛配列番号２、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させたもの、オペロン バイオテクノロジー株式会社製｝の最終濃度が０．０７２μＭとなるように、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）を加え、全量を２２μＬとして、約２５℃で３０分間ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
【００４７】
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が７５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、直ちに、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００４８】
＜実施例２＞
塩化ナトリウムの濃度を、「７５ｍＭ」から「５５ｍＭ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分後に、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００４９】
＜実施例３＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「０．３６μＭ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が７５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、直ちに、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５０】
＜実施例４＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「０．３６μＭ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が５５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分後に、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５１】
＜実施例５＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「１．８μＭ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が７５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、直ちに、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５２】
＜実施例６＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「１．８μＭ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が５５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分後に、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５３】
＜実施例７＞
「金コロイド（EY LABORATRIES, INC、粒子径４０ｎｍ、ＨＡｕＣｌ４濃度として０．０１重量％）」を「金コロイド（EY LABORATRIES, INC、粒子径２０ｎｍ、ＨＡｕＣｌ４濃度として０．０１重量％）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、処理金コロイド（２）を得た。
この処理金コロイド（２）をＤＮＡ回収用フィルター付遠心チューブ（ＳＵＰＲＥＣ−ＰＣＲ、タカラバイオ株式会社）に入れ、３０００ｒｐｍ（８００ｇ）、１５分間遠心濾過して、濾液のＯＤ２６０を測定したところ、−０．０６８であった。このことから、遊離ポリヌクレオチドはほぼ存在せず、ポリヌクレオチド（５’ＳＨ３０）がほぼ１００％金コロイドに付着していることが分かった。
【００５４】
簡易ゲル濾過カラム（商品名ＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰ、PRINCETON SEPARATIONS, INC.製）に、水８００μＬを加え、３０００ｒｐｍ（８００ｇ）、２分間遠心した後、処理金コロイド（２）５０μＬを加えて、３０００ｒｐｍ（８００ｇ）、２分間遠心ゲル濾過して、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ２）分散液を得た。
【００５５】
「ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）分散液」を「ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ２）分散液」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
【００５６】
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が８０ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、直ちに、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５７】
＜実施例８＞
塩化ナトリウムの濃度を、「８０ｍＭ」から「６５ｍＭ」に変更したこと以外、実施例７と同様にして、インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分後に、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５８】
＜実施例９＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「０．３６μＭ」に変更したこと以外、実施例７と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が８０ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、直ちに、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００５９】
＜実施例１０＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「０．３６μＭ」に変更したこと以外、実施例７と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が６５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分後に、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００６０】
＜実施例１１＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「１．８μＭ」に変更したこと以外、実施例７と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が８０ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、直ちに、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００６１】
＜実施例１２＞
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）の最終濃度を、「０．０７２μＭ」から「１．８μＭ」に変更したこと以外、実施例７と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が６５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分後に、分散液の色がワインレッドから、青紫色に変化し、沈殿が析出した。
このことから、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）中の塩基配列は、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であると判定できた。
【００６２】
＜比較例１＞
「疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）」を「ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）｛配列番号３、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させていないこと以外、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）と同じもの｝」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が７５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分たっても、分散液の色がワインレッドのままであった。
このことから、ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）の塩基配列が、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であるどうか、判定できなかった。
【００６３】
＜比較例２＞
「疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）」を「ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）｛配列番号３、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させていないこと以外、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）と同じもの｝」に変更したこと以外、実施例３と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が７５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分たっても、分散液の色がワインレッドのままであった。
このことから、ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）の塩基配列が、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であるどうか、判定できなかった。
【００６４】
＜比較例３＞
「疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）」を「ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）｛配列番号３、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させていないこと以外、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）と同じもの｝」に変更したこと以外、実施例５と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が７５ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分たっても、分散液の色がワインレッドのままであった。
このことから、ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）の塩基配列が、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であるどうか、判定できなかった。
【００６５】
＜比較例４＞
「疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）」を「ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）｛配列番号３、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させていないこと以外、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）と同じもの｝」に変更したこと以外、実施例７と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が８０ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分たっても、分散液の色がワインレッドのままであった。
このことから、ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）の塩基配列が、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であるどうか、判定できなかった。
【００６６】
＜比較例５＞
「疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）」を「ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）｛配列番号３、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させていないこと以外、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）と同じもの｝」に変更したこと以外、実施例９と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が８０ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分たっても、分散液の色がワインレッドのままであった。
このことから、ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）の塩基配列が、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であるどうか、判定できなかった。
【００６７】
＜比較例６＞
「疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）」を「ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）｛配列番号３、5'-GAATT CGCGG CCGCA AGCTT AAAAC GCGCG-3'、５’末端にジメトキシトリチル基を結合させていないこと以外、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ｈｐ１）と同じもの｝」に変更したこと以外、実施例１１と同様にして、ハイブリタイズさせ、さらに５０℃で５分間インキュベーションした。
インキュベーション後の分散液に、塩化ナトリウムの濃度が８０ｍＭとなるように、塩化ナトリウム水溶液を加えたところ、約１０分たっても、分散液の色がワインレッドのままであった。
このことから、ポリヌクレオチド（ｈｐ１’）の塩基配列が、ポリヌクレオチド付着微粒子（ｐｇ１）中の塩基配列と相補的であるどうか、判定できなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定することを特徴とするポリヌクレオチド検査方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が、ポリヌクレオチド付着金属微粒子である請求項１に記載のポリヌケレオチド検査方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が、ポリヌクレオチド付着金コロイドである請求項１に記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が、１０〜２００ｎｍの金コロイドにメルカプト基含有ポリヌクレオチドを付着させた金コロイドである請求項１に記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が、１０〜２００ｎｍのビオチン結合金コロイドにアビジン結合ポリヌクレオチドを結合させた金コロイド又は
１０〜２００ｎｍのアビジン結合金コロイドにビオチン結合ポリヌクレオチドを結合させた金コロイドである請求項１に記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項６】
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）の疎水性基が、ジメトキシトリチル基である請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項７】
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）が、ＰＣＲにより増幅して得られたポリヌクレオチドである請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列が、５〜１００塩基から構成されている請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とのハイブリタイズさせる際、凝集促進剤（ＣＰ）の存在下でハイブリタイズさせる、及び／又はハイブリタイズさせた後に、凝集促進剤（ＣＰ）を水溶液に添加する請求項１〜８のいずれかに記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定するためのポリヌクレオチド検査キットであって、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、
検査対象であるポリヌクレオチドに疎水性基を導入して疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を調製するための疎水性基導入試薬（ＨＡ）とを含むことを特徴とするポリヌクレオチド検査キット。
【請求項１１】
疎水性基導入試薬（ＨＡ）が、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼから選ばれる酵素と、疎水性基含有オリゴヌクレオチド又は疎水性基含有塩基とを含む試薬である請求項１０に記載のポリヌクレオチド検査キット。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定するのに使用する疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を製造するためのプライマーであって、
３’末端又は５’末端に疎水性基を有することを特徴とするプライマー。
【請求項１】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定することを特徴とするポリヌクレオチド検査方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が、ポリヌクレオチド付着金属微粒子である請求項１に記載のポリヌケレオチド検査方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が、ポリヌクレオチド付着金コロイドである請求項１に記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が、１０〜２００ｎｍの金コロイドにメルカプト基含有ポリヌクレオチドを付着させた金コロイドである請求項１に記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が、１０〜２００ｎｍのビオチン結合金コロイドにアビジン結合ポリヌクレオチドを結合させた金コロイド又は
１０〜２００ｎｍのアビジン結合金コロイドにビオチン結合ポリヌクレオチドを結合させた金コロイドである請求項１に記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項６】
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）の疎水性基が、ジメトキシトリチル基である請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項７】
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）が、ＰＣＲにより増幅して得られたポリヌクレオチドである請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列が、５〜１００塩基から構成されている請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とのハイブリタイズさせる際、凝集促進剤（ＣＰ）の存在下でハイブリタイズさせる、及び／又はハイブリタイズさせた後に、凝集促進剤（ＣＰ）を水溶液に添加する請求項１〜８のいずれかに記載のポリヌクレオチド検査方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定するためのポリヌクレオチド検査キットであって、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、
検査対象であるポリヌクレオチドに疎水性基を導入して疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を調製するための疎水性基導入試薬（ＨＡ）とを含むことを特徴とするポリヌクレオチド検査キット。
【請求項１１】
疎水性基導入試薬（ＨＡ）が、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼから選ばれる酵素と、疎水性基含有オリゴヌクレオチド又は疎水性基含有塩基とを含む試薬である請求項１０に記載のポリヌクレオチド検査キット。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）と、疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）とを水溶液中でハイブリタイズさせて、
ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）が凝集するか否かを観察することにより、
疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）中の塩基配列と、ポリヌクレオチド付着微粒子（ＰＧ）中の塩基配列とが相補的であるか否かを判定するのに使用する疎水性基含有ポリヌクレオチド（ＨＰ）を製造するためのプライマーであって、
３’末端又は５’末端に疎水性基を有することを特徴とするプライマー。
【公開番号】特開２０１０−４６０５６（Ｐ２０１０−４６０５６Ａ）
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７０８２５（Ｐ２００９−１７０８２５）
【出願日】平成２１年７月２２日（２００９．７．２２）
【出願人】（５０７０８５６６７）長浜バイオラボラトリー株式会社 (4)
【出願人】（５０３３０３４６６）学校法人関西文理総合学園 (26)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２２日（２００９．７．２２）
【出願人】（５０７０８５６６７）長浜バイオラボラトリー株式会社 (4)
【出願人】（５０３３０３４６６）学校法人関西文理総合学園 (26)
【Ｆターム（参考）】
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