ポリペプチド
免疫アジュバントを使用することなく、経粘膜投与で、抗体産生の増強を誘導することのできるポリペプチド、及び、そのポリペプチドを含有する組成物並びにその用途を提供し、ポリペプチドのアミノ末端側にマルチアグレトープ型Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列からなるペプチドを有し、リンカーペプチドをはさんで、カルボキシル末端側にＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を有し、さらに、このポリペプチドに細胞接着分子の接着モチーフのアミノ酸配列を結合させたポリペプチドを確立し、それを含有した組成物とその用途を提供することにより解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は特定の抗原エピトープを含み、免疫アジュバント非存在下においても、経粘膜投与により、この抗原エピトープに対する特異抗体の産生を効率よく誘導するポリペプチド、このポリペプチドを含有する組成物、およびその用途に関し、より詳細には、抗体産生の対象となる抗原のＢ細胞エピトープを含むポリペプチドとＴ細胞エピトープを、プロテアーゼの認識配列のアミノ酸からなるリンカーペプチドで連結し、このポリペプチドに、さらに、細胞結合モチーフのアミノ酸配列からなるペプチドを連結した、目的抗体の産生を効率よく誘導するポリペプチド、このポリペプチドを含有する組成物及びその用途に関する。
【背景技術】
生体に、特定の抗原に対して特異的な抗体産生のみを誘導する場合には、精製した抗原を単独で、或いは、抗体産生を増強する活性を有する免疫アジュバント（免疫機構を非特異的に刺激することによって、抗原に対する特異的免疫反応を強める物質）と共に生体に投与する方法が一般的に用いられてきた。この方法は、種々の感染症に対する最も有効な予防手段としても汎用されており、特に抗生物質が無効であるウイルスや、微生物が産生する毒素などのように、他に有効な予防或いは治療方法がない場合には、生体に、これらのウイルスや毒素に対する抗体産生を誘導し、防御することが唯一の対策である場合も多い。現在この方法が実用化されているものとしては、病原微生物を有機溶媒や紫外線照射等で不活化して感染性を無くした不活化ワクチン及び病原体を弱毒化して生体への病原性を弱めた弱毒化ワクチンであり、ポリオウイルスワクチンを除き、全て注射により非経口的に投与されている。しかしながら、不活化ワクチンの場合、防御に必要な抗体価を得るためには数回の注射を繰り返す必要があり、生体への負担が大きく利便性にも劣っているとの問題を抱えている。
また、生ワクチンの場合、保存安定性に欠けるだけでなく、ワクチン投与後に突然変異を起こし強毒化株となり生体に害を引き起こす可能性がある。さらには、不活化ワクチン、生ワクチンとも生体に対してアナフィラキシーショックを与えることもあり、安全性に欠ける面があった。さらにウイルス粒子そのもの、或いは、蛋白巨大分子を免疫原として用いるため、ワクチン製剤とした際の安定性に欠け、安定性を保持するためヒト血清アルブミンやゼラチン等を製剤の安定剤として用いる場合もあった。このためこれら安定剤に用いた物質に未知の感染性微生物の混入が否定できないこと、或いは、安定剤に対する生体のアナフィラキシーショックが生じることもあり、安全性、安定性に欠けるものであった。また大部分のワクチンは注射剤として製剤化されているものの、感染症の発生により多くの人命が奪われている地域の多くは発展途上国であり、ワクチンの普及を図るには安定性に優れた製剤で、かつ、注射剤以外のより簡便な投与が可能なワクチン製剤が求められている。
これらの課題を解決するために、不活化ワクチンや生ワクチンよりも高い安全性と有効性をもつ、不活化ワクチンや生ワクチンの部分アミノ酸配列からなるポリペプチドを利用した新型ワクチンの開発研究が世界中で鋭意進められており、Ｂ型肝炎ウイルスワクチンに代表される組換え型ワクチンやコンポーネントワクチンは、その新型ワクチンの代表例である。しかしながら、ワクチンとして利用するポリペプチドの鎖長は短いものほど望ましいものの、短くすればするほど、生体が個別にもつ主要組織適合性抗原（以下、「ＭＨＣ」と略記する。）のクラスＩＩハプロタイプの拘束性を幅広くカバーし、十分な免疫原性を有するようにデザインすることが難しくなる。また、経粘膜投与時の抗原の免疫原性を高める方法としては、対象とする抗原とともに、コレラ毒素（以下、「ＣＴ」と略記する。）や大腸菌由来の熱不安定型のエンテロトキシンや、これらのアミノ酸配列の一部を置換して弱毒化したものを免疫アジュバントとして投与する方法が知られてはいるものの（イー・シー・ラベル（Ｌａｖｅｌｌｅ，Ｅ．Ｃ．）著、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第９９巻、３０乃至３７頁、（２０００年））、目的とする抗原以外に、免疫アジュバントとして使用したコレラ毒素や大腸菌由来の熱不安定型のエンテロトキシンに対する抗体が産生されるなどの問題があり、実用に供されていない。
一方、歯科における微生物が原因とされる二大疾患には、う蝕症と歯周病があり、これらは、一般的な疾患で、且つ、致死的でないために、その予防や治療にはより高度な安全性が求められている。このう蝕症予防の手段として、例えば特開平６−１２２６３３号公報には、ストレプトコッカス・ミュータンス菌由来の歯面への付着性を有する蛋白質の断片ペプチドで免疫した動物の抗体を利用する（受動免疫）方法が開示されており、特表２００２−５１１４２２号公報においては、ストレプトコッカス・ミュータンス由来のＴ細胞エピトープに、同じストレプトコッカス・ミュータンス由来のＢ細胞エピトープ（グルカンバインディング蛋白質）からなるう蝕予防用のワクチンが記載されている。
また、これとは別に、本発明者は、う蝕予防効果があることが知られているストレプトコッカス・ミュータンス セロタイプＣ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕ ｍｕｔａｎｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｃ）の歯面への初期付着に関与する表層蛋白質抗原（以下、「ＰＡｃ」と略記する。）に対する抗体の産生を誘導する系を実験モデルとして使用し、経粘膜投与により、免疫アジュバント非存在下でも、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプ（遺伝子型）の個体において、ＰＡｃに対する抗体産生を効率的に誘導できる短鎖ポリペプチドを開発する目的で、研究を行ってきた。すなわち、ＰＡｃのアミノ末端から３６５乃至３７７番目までのアミノ酸配列であるところの配列表における配列番号１記載のアミノ酸配列を有するペプチドをＢ細胞エピトープとして使用し、このペプチドのアミノ末端側に、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの拘束を同時に受けるＴ細胞エピトープを結合し、その間を例えばリジン−リジン配列からなるジペプチドリンカーで、直線的に連結することにより、う蝕を抑制することのできる抗体の産生を増強する方法を提案した（西沢俊樹、今井奨、花田信弘、第４回日本ワクチン学会学術集会プログラム・抄録集、第７７頁（２０００年）、オオイシ，ワイ（Ｏｉｓｈｉ，Ｙ．）等、オーラル マイクロバイオロジー アンド イムノロジー（Ｏｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第１６巻、第４０〜４４頁（２００１年））。しかしながら、これらの文献に開示されるポリペプチドも免疫アジバント非存在下で経粘膜的に投与した場合には、免疫原性が弱く、ポリペプチドを投与しても生体に対して十分な抗体を誘導しないという欠点が解決できなかった。さらに、特表平８−５０４１１８号公報には、Ｔ細胞エピトープのカルボキシル末端側にＢ細胞エピトープを結合したトラコーマークラミジアの感染防止用の合成ペプチドワクチンが開示されているものの、経粘膜投与では十分な抗体産生を誘導することはできない。
斯かる状況に鑑み、本発明の課題は、経粘膜投与であっても十分な量の目的とする抗体を生体内で産生誘導可能であり、安全に投与できるペプチドワクチンを提供することにある。
【発明の開示】
本発明者は、上記課題を解決するために、う蝕の原因となる微生物のストレプトコッカス ミュータンスのＰＡｃ（菌体表層蛋白質抗原）由来の断片ペプチドをモデルとして使用して、う蝕の原因となる微生物の感染防御に有効な抗体の産生を増強できるポリペプチドの研究を進めてきた。その結果、ポリペプチドのアミノ末端側に、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプで同時に拘束されるＴ細胞エピトープを含むアミノ酸配列を有し、リンカーペプチドとしてプロテアーゼの認識アミノ酸配列を挟んで、カルボキシル末端側に抗体誘導用のＢ細胞エピトープを含むアミノ酸配列を有し、さらに、このポリペプチドに細胞結合モチーフと相同なアミノ酸配列を有するペプチドを結合したポリペプチドが、免疫アジュバント非存在下で経鼻などの経粘膜投与した場合において、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプにおいて、目的とする抗原に対する特異抗体の十分な産生を効率よく増強し、しかも、目的とする特異抗体以外の抗体の産生誘導能が低く、また、アナフラキシーなどの副作用を誘発しない、安全性の高いポリペプチドであることを見出した。また、このポリペプチドが、免疫アジュバントなしに経粘膜投与した場合でも、抗体産生を誘導できること、さらには、このポリペプチドが免疫アジュバント効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、アミノ末端側にＴ細胞エピトープを含むアミノ酸配列を有し、リンカーペプチドをはさんで、そのカルボキシル末端側にＢ細胞エピトープを含むアミノ酸配列を有するペプチド内に、細胞接着分子の細胞結合モチーフと相同アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供することによって前記課題を解決するものである。
発明を実施する上での最良の形態
本発明でいう抗体とは、主としてイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）抗体であり、血中や体液中に分泌されるものはもとより、鼻腔、口腔、眼、消化管などに分泌される抗体も当然これに含まれる。
本発明のポリペプチドにおいて、抗体産生を誘発する部位として使用するのは、Ｂ細胞エピトープ或いはそれを含むアミノ酸配列部分である。また、このペプチドのアミノ酸配列は、微生物、細胞、又は腫瘍細胞に由来する毒素、アレルゲン、酵素、細胞膜抗原、腫瘍特異性抗原などの抗原であって、その各々について文献的に既に明らかにされている既知の抗原エピトープのアミノ酸配列そのものでもよく、また実際に生体に対して免疫原性をもつ様々な抗原そのもの、或いは、常法により、抗原の部分ペプチドを免疫してエピトープ配列を同定し、この同定したアミノ酸配列を有するポリペプチドをＢ細胞エピトープとして用いてもよい。また、このＢ細胞エピトープは、後述のＴ細胞エピトープと同じ抗原上にあるものでもよく、Ｂ細胞エピトープとそのアミノ酸配列の一部又は全部を共有していてもよい。従って、Ｂ細胞エピトープ部分については、感染防御、癌、腫瘍、潰瘍、肝炎など炎症性疾患、アレルギー及びアトピー性皮膚炎などの免疫性疾患などの予防や治療、酵素の中和、臨床検査などに使用される各種抗原の検出など、誘導する抗体の使用目的に応じて、好ましい抗原ポリペプチドを選択することが出来る。例えば、う蝕予防用の抗体を誘導するためには、西沢俊樹、今井奨、花田信弘、第４回日本ワクチン学会学術集会プログラム・抄録集、第７７頁（２０００年）に記載の前記ＰＡｃの断片ペプチドを使用することができ、具体的には、配列表における配列番号１記載のアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。これらのＢ細胞エピトープを含むポリペプチドはそのまま使用してもよく、タンデムに連結して、その２量体、３量体あるいは多量体として使用してもよい。また、同一抗原上に存在する２種以上のＢ細胞エピトープをタンデムに連結することも、抗原全体をＢ細胞エピトープとすることもできる。また、複数種の抗原性タンパク質が関与する疾患治療の場合、それらのＢ細胞エピトープをタンデムに連結することにより、１つのポリペプチドで複数種の抗原性タンパク質に対する抗体を産生できるポリペプチドを設計することも随意である。この場合には、各Ｂ細胞エピトープの間に、後述のリンカーペプチドを挿入することにより、個々のエピトープのプロセッシングをより確実に行わせることもできる。
また、本発明のポリペプチドに使用する、Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチドのアミノ酸配列とは、投与の対象となるヒトを含む哺乳動物、鳥類、爬虫類、または、魚類のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束され、ヘルパーＴ細胞用抗原として提示を受けるアミノ酸配列或いは、それを含むアミノ酸配列のものであれば何れでもよい。このポリペプチドのアミノ酸配列は、文献的に既に明らかにされているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を利用してもよく、また、実際に生体に対して、常法により、抗原の部分ペプチドを免疫してエピトープ配列を同定し、この同定したアミノ酸配列を有するポリペプチドをＴ細胞エピトープとして用いてもよい。このＴ細胞エピトープは、前述したＢ細胞エピトープを含む抗原上にあってもよく、Ｂ細胞エピトープとそのアミノ酸配列の一部又は全部を共有していてもよい。これらのＴ細胞エピトープペプチドはそのまま使用しても、あるいは同種又は複数種のＴ細胞エピトープをタンデムに連結して使用してもよい。また、Ｔ細胞エピトープは、アグレトープ（ＭＨＣクラスＩＩ抗原との結合に必要なアミノ酸残基）となるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基は他のアミノ酸残基に置換しても機能を発揮することが可能である。よって、本発明で用いるＴ細胞エピトープポリペプチドとして、アグレトープが保存されたポリペプチドであれば用いることができる。そこで、本発明のポリペプチドを感染防御や抗アレルギー等の予防又は治療を目的として用いる場合には、多くの患者に対して適用可能とならしめるために、Ｔ細胞エピトープポリペプチド部分として、複数種のＭＨＣクラスＩＩハプロタイプに対するアグレトープをタンデムに又はオーバーラップして有するポリペプチド（いわゆるマルチアグレトープ型ポリペプチド）は極めて有用である。現在、ＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプによる拘束性ペプチドの基本構造およびアグレトープは、文献的に数多く開示されており、これらを参考に、使用目的に併せてＴ細胞エピトープを含むポリペプチドを設計することも随意である。また、異種の動物におけるＴ細胞エピトープ又はアグレトープをタンデムに又はオーバーラップして有するポリペプチドをＴ細胞エピトープポリペプチドとして用いれば、複数種の動物に対しても有効なＴ細胞エピトープポリペプチドとすることができる。
また、Ｂ細胞エピトープにおいても、複数のエピトープを重複させたり、タンデムに連結させたりして、複数種の抗体を同時に誘導させるようなポリペプチドを設計することも随意である。
Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチドとＢ細胞エピトープを含むポリペプチドを連結しないで別々に免疫しても、目的とする抗体の効率的な産生の増強は望めない。また、Ｂ細胞エピトープを含むポリペプチドとＴ細胞エピトープを含むポリペプチドとを連結したポリペプチドを用いて免疫した場合、目的とする抗体とともに、連結部分のアミノ酸配列部分を認識する抗体を同時に誘導することがある。そこで、本発明のポリペプチドにおいて、Ｔ細胞エピトープ配列とＢ細胞エピトープ配列の間に、プロテアーゼの認識配列となるアミノ酸配列からなるリンカーペプチドを挿入することにより、抗原提示におけるプロセシングのプロセスにより両ポリペプチドを酵素的な切断を受けて分離させ、連結部分のアミノ酸配列部分を認識する抗体の産生誘導が抑制されるようにデザインされている。よって、免疫原性に優れ、生体に防御効果を示すために十分な抗体の産生を増強し、免疫したペプチドに対する抗体ではなく、組み込まれたＢ細胞エピトープが由来する抗原性タンパク質に対する抗体産生を増強することが可能となる。
本発明で用いられる、Ｂ細胞エピトープを含むペプチドとＴ細胞エピトープと結合するためのリンカーペプチドは、抗原プロセッシングに関与するプロテアーゼの認識配列であれば何れでもよく、具体的には、リジン−リジン（ＫＫ）、リジン−アルギニン（ＫＲ）、アルギニン−アルギニン（ＲＲ）などジペプチドを挙げることができ、なかでも、カテプシンＢの認識配列であるリジン−リジンからなるジペプチドを使用することが望ましい。なお、Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープが重複して存在するポリペプチドを用いる場合には、そのポリペプチド同士をリンカーペプチドで連結することにより、それぞれを、Ｔ細胞エピトープ或いはＢ細胞エピトープとしての機能を発揮させることができる。
本発明で使用する細胞接着分子の細胞結合モチーフとしては、本発明のペプチドを粘膜表面に長期間保持することのできるものである限り本発明に利用することができる。例えば、インテグリンファミリーに対する結合モチーフをはじめとし、その他の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を用いることができる。例えば、インテグリン結合モチーフに属するアミノ酸配列としては、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、ヒト免疫不全ウイルス（以下、「ＨＩＶ」と略記する。）のＴａｔタンパク質等々の細胞接着分子上に存在する結合モチーフとして知られる、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ：配列表における配列番号２）、アルギニン−グルタミン酸−アスパラギン酸（ＲＥＤ：配列表における配列番号３）、ロイシン−アスパラギン酸−バリン（ＬＤＶ：配列表における配列番号４）、プロリン−ヒスチジン−セリン−アルギニン−アスパラギン（ＰＨＳＲＮ：配列表における配列番号５）、アルギニン−リジン−リジン（ＲＫＫ：配列表における配列番号６）、アスパラギン酸−グリシン−グルタミン酸−アラニン（ＤＧＥＡ：配列表における配列番号７）などのアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。また、インテグリンのファミリー以外の結合モチーフとしては、チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン（ＹＩＧＳＲ：配列表における配列番号８）、イソロイシン−リジン−バリン−アラニン−バリン（ＩＫＶＡＶ：配列表における配列番号９）、アルギニン−フェニルアラニン−チロシン−バリン−バリン−メチオニン−トリプトファン−リジン（ＲＦＹＶＶＭＷＫ：配列表における配列番号１０）、イソロイシン−アルギニン−バリン−バリン−メチオニン（ＩＲＶＶＭ：配列表における配列番号１１）などのアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。なかでも、ＲＧＤ、ＲＥＤ、ＹＩＧＳＲのアミノ酸配列からなるペプチドが、特異的な抗体産生の誘導能が強いことから望ましい。また、これら細胞結合モチーフのアミノ酸配列を有するペプチドの連結部位は、Ｔ細胞エピトープポリペプチドのアミノ末端側又はカルボキシル末端側、又は、Ｂ細胞エピトープポリペプチドのアミノ末端側又はカルボキシル末端側の合計４箇所から選択でき、そのうちすくなくとも１箇所に連結すればよい。とりわけ、Ｔ細胞エピトープポリペプチドのアミノ末端側又はカルボキシル末端側の片側又は両側に連結した本発明のポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープポリペプチドに特異的な抗体産生が特に増強されるので望ましい。
本発明のポリペプチドを製造するための方法に限定はなく、慣用のペプチド合成法によるか、或いは、慣用のペプチド合成法によりあらかじめ、部分的に合成したペプチド同士を結合して、調製することができる（例えば、社団法人日本生化学会編「新生化学実験講座」、第１巻、「タンパク質ＶＩ」、第３〜４４頁、１９９２年、東京化学同人発行参照。）。また当該ペプチドは、各メーカーから市販されているペプチドシンセサイザーを用いて装置のプロトコールに従って合成することができる。また、本発明のポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により調製することができる。例えば、設計したポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製し、これを自立増殖可能なベクターに挿入し、それを大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などの微生物、動植物やそれらの細胞又は組織等の宿主に導入して形質転換体としたり、トランスジェニック動植物を作製して、それらを培養、育成した後、本発明のポリペプチドを適宜の方法により、採取・精製することができる。また、本発明のポリペプチドを、Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープを連結するのに用いたプロセシング関連酵素切断部位となるアミノ酸配列以外から選ばれた適宜のタンパク質分解酵素の切断部位となるアミノ酸配列で連結して発現させた後、当該酵素で分解したものを使用することも自由である。さらには、本発明のポリペプチドを発現させた菌体、動物体或いは植物体をそのまま加工して、本発明のポリペプチドを含有する経口摂取用の組成物として使用することも随意である。また、本発明のポリペプチドは、前記の何れかの方法により、その全アミノ酸配列を有するポリペプチドを直接調製してもよく、或いは、予め、その一部アミノ酸配列を有するポリペプチドを合成したもの同士を、化学的に結合して調製することも随意である。
本発明のポリペプチドは、特異的な抗体産生の誘導のために、このまま単独で、或いは、同一のＢ細胞エピトープを有するポリペプチドを複数組み合わせて使用することができる。さらに、複数種の抗原に対する抗体を同時に産生させる場合には、個々の抗原に対応するＢ細胞エピトープを有するポリペプチドの２種以上を組み合わせて使用することも随意である。また、本発明の効果を妨げない限り、本発明のポリペプチドに、製剤学的に許容できる１種又は２種以上の製剤用添加剤を組み合わせた組成物を調製することも有利に実施できる。製剤用の添加剤としては、グルコース、マルトース、トレハロース、ショ糖などの還元性或いは非還元性の糖質、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコール、寒天、プルラン、グアガム、アラビアガムなどの水溶性高分子、ゼラチン、シルクなどのタンパク質やそれらの加水分解物、脂質、アミノ酸、緩衝剤、安定化剤、抗菌剤、香料、栄養機能食品、医薬部外品或いは医薬品の有効成分、ミョウバン、水酸化アルミニウムなどの免疫アジュバントなどが挙げられ、１種又は２種以上を適宜組み合わせて使用できる。また、本発明のポリペプチドを含有する製剤の形態としては、その製剤中のポリペプチドが長期間安定に保持されるものであれば特に制限はなく、溶液、凍結乾燥品、錠剤、舌下錠、トローチ、粉末、顆粒、クリーム、軟膏、シラップなどの剤形から、投与対象、投与方法、製剤の保存方法や輸送方法を考慮して適宜選択すればよい。また、本発明のポリペプチド又はそれを含有する組成物は、必要に応じて、リポソームに封入したり、皮膚、組織への浸透促進剤やイオン導入法などを併用することにより、抗原提示細胞の存在部位への浸透を促進させることも有利に実施できる。また、本発明のポリペプチドは、錠菓、飴、清涼飲料などの各種飲食品に含有せしめ、これを経口的に摂取することにより、ポリペプチドを経粘膜的に摂取させることも随意である。また、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを直接生体に投与したり、細胞にＤＮＡを導入するいわゆる遺伝子治療などにより、生体内において本発明のポリペプチドを発現させることもできる。
本発明のポリペプチドは、ヒト、イヌ、ネコ、マウスをはじめとする哺乳類、ニワトリ、アヒルをはじめとする鳥類、爬虫類、魚類とりわけ養殖魚類などの抗体産生を行う動物に対して、病原性のウイルス、微生物、細菌などの構成蛋白質やそれらが分泌する毒素に対する抗体を産生させることができる。したがって、ポツリヌス、大腸菌ＯＨ−１５７などの細菌に起因する食中毒、破傷風、ジフテリア、インフルエンザなどの感染性疾患の予防又は治療に有効である。また、アミロイドβペプチドに対する抗体を産生させることによるアルツハイマーの治療、ダニ、ハウスダスト、花粉、食物などに由来のするアレルゲンに対する特異的なＩｇＧ抗体を優位に産生させることによる各種アレルギー症やアトピー性皮膚炎などの経口減感作療法に有利に利用できる。また、本発明のポリペプチドは、口腔内、鼻腔、眼、咽喉、膣内、気管内、腹腔、胸腔、肺胞内、食道内、及び、胃や腸などの消化管内などへの経粘膜的な投与で粘膜におけるＩｇＡ抗体産生の誘導及び体液中へのＩｇＧ抗体産生の誘導が可能であり、皮下、皮内、筋肉内などの通常のワクチンの投与経路での投与、さらに、場合によっては、血管内投与も可能である。また、本発明のポリペプチドは、任意の蛋白質やポリペプチドに対する特異的な抗体の生産に利用できるだけでなく、単独では抗原性の低いオリゴペプチドやポリペプチドに対する抗体の生産に有利に用いることができる。したがって、合成オリゴペプチドを動物に免疫することによる抗血清やモノクローナル抗体産生を目的として、前記投与経路による動物での使用に加えて、試験管内での免疫担当細胞の感作に有利に使用することができる。
また、本発明のポリペプチドは、他の抗原あるいはそのポリペプチドにおけるＢ細胞エピトープが由来する抗原性タンパク質と同時に生体に投与することにより、同時に投与された抗原に対する抗体産生を誘導する免疫アジュバントとして使用することができる。その際の使用量は、同時に投与する他の抗原あるいはそのポリペプチドにおけるＢ細胞エピトープが由来する抗原に対する抗体産生を誘導できる量であれば特に制限はない。ただし、本発明のポリペプチドに対する抗体産生が誘導されることを望まない場合は、本発明のポリペプチドの投与量は、他の抗原の投与量の１０質量％以下、好ましくは１質量％以下、さらに好ましくは、０．１質量％以下のとすればよい。
本発明のポリペプチドのヒトを含む動物への投与方法には、特に制限はなく、このポリペフチドが、投与部位へ確実に到達できる方法であれば何れでよい。例えば、スポイトや注射器を使用して適量を粘膜上に滴下してもよく、経口摂取や、クリーム或いはジェル状にして粘膜に塗布したり、カテーテル等で投与部位に誘導してもよく、さらには、スプレーやネブライザーなどにより霧状にして吹き付けたり、鼻、気管或いは肺へ吸引させてもよい。皮下、皮内、筋肉内、血管内、腹腔内や胸腔内などの体腔内への投与には、注射器、カテーテル、点滴などの投与方法を使用することができる。本発明のポリペプチドの投与量は、抗体誘導能、疾患の種類、投与経路、投与方法、投与対象動物などを考慮して適宜決定すればよく、通常、０．００００１乃至１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０００１乃至２５ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．００１乃至１０ｍｇ体重である。
以下、実験例に基づいて本発明のポリペプチドについてより詳細に説明する。
実験例
生体の感染防御用のワクチンとして利用できるポリペプチドの開発を考慮して、う蝕症の病原体であるストレプトコッカス ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅＣ）の歯面付着因子の一つであるＰＡｃ（菌体表層タンパク質抗原）に対する抗体産生系をモデルに使用して、経粘膜的に投与して、効率的に誘導することのできる、ワクチンとしての機能を有するポリペプチドを調製するための実験を以下のようにして行った。また、実験には、ＰＡｃ中のアミノ酸配列であって、すでに、遺伝子クローニング、塩基配列、アミノ酸配列、生物活性部位、Ｂ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープの解析から、ＰＡｃ分子に交叉反応性を持ち、そのう蝕を阻害する活性を有する抗体のみを誘導できる最小単位のペプチド抗原であることが公知の配列表における配列番号１記載のアミノ酸アミノ酸配列のペプチド（以下、「ユニットペプチド」という。）を使用した（Ｈ．ＳＥＮＰＵＫＵら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６３：４６９５−４７０３（１９９５）参照）。なお、以下の実験で使用したポリペプチドは、全てペプチドシンセサイザー（アドバンスド・ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）社製造、Ｍｏｄｅｌ３５０ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いてＦｍｏｃ法にて合成し、ＴＳＫ−ＧＥＬカラム（カラムサイズ：直径１ｃｍ、長さ３０ｃｍ、東ソー株式会社製造）を使用した逆相ＨＰＬＣで精製した純度９５％以上の標品である。
実験例１：ユニットペプチドに対するマウスのＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの拘束性の解析
ＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプのみが異なる８種類のＢ１０コンジェニックマウス（日本ＳＬＣ株式会社販売、雌；５週令、一群；５匹）のそれぞれに前記ユニットペプチド（２００μｇ／マウス）をフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）と共に腹腔免疫し、２週間後に初回免疫と同条件で追加免疫した。その１週間後に採血し、その血清中のユニットペプチド及びＰＡｃに対する抗体価を、ユニットペプチド或いはＰＡｃをコート抗原として使用した、常法のＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果を表１に示す。なお、以下の実験における、各抗原に対する抗体価は、個々のマウスから採血した血液の血清を、それぞれ連続的に２倍希釈した標品中の抗体量を、ＥＬＩＳＡ法により、酵素標識抗体を使用して検出し、分析に使用したマイクロタイタープレートの各ウエルについて、マイクロタイタープレートリーダー（マルチスキャン バイクロマテック、ラボシステム社販売）により、４０５ｎｍの吸光度を測定して、その吸光度と、コート抗原を使用していない対照のウエルの吸光度を比較し、その差が０．１以上となる血清の最高希釈倍率を求め、平均して、抗体価として表した。また、コンジェニックマウスの種類の名称の後に、そのマウスのＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの型を括弧内に併記した。
表１から明らかなように、マウスのＭＨＣクラスＩＩ（Ｈ−２）のハプロタイプがｆ、ｄ、或いは、ｋ型のＢ１０．Ｍ、Ｂ１０．Ｄ２、Ｂ１０．ＢＲの３種のコンジェニックマウスでは、他のタイプＭＨＣクラスＩＩ（Ｈ−２）のハプロタイプのマウス比較して、ユニットペプチド及びＰＡｃに特異的な抗体の産生が強く誘導された（約１０倍以上）。このことから、このユニットペプチドには、Ｈ−２のクラスＩＩがｄ、ｆ、ｋ型の複数のハプロタイプのコンジェニックマウスにおいて、抗ＰＡｃ抗体を誘導するためのＢ細胞エピトープと、抗原提示に必要な、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプ（Ｈ−２ｄ，ｆ，ｋ型）の拘束を受ける複数のＴ細胞エピトープとが、共存していることが明らかになった。また、１３残基の短鎖ペプチドからなるユニットペプチド中に、ＭＨＣクラスＩＩ（Ｈ−２Ａ）の複数種のハプロタイプに同時に応答できる、マルチアグレトープ型のＴ細胞エピトープを有するペプチド抗原が存在することは、１種類の短いポリペプチドを使用しても、ＭＨＣクラスＩＩハプロタイプの異なる複数の個体に、効率的に抗体産生を誘導できるＴ細胞エピトープを有するポリペプチドを、人為的に設計できる可能性を示唆している。
実験例２：マウスにおけるマルチアグレトープ型Ｔ細胞エピトープの確認
実験例１でユニットペプチドに、マルチアグレトープ型のＴ細胞エピトープの存在が確認されたため、マウスにおけるマルチアグレトープ型Ｔ細胞エピトープとして機能するアミノ酸配列とその位置関係を確認するための実験を以下のようにして行った。ユニットペプチドのアミノ酸残基を順次バリンに置き換えたバリン置換ペプチドを合成し、それらを前述のユニットペプチド応答マウスに免疫することにより、抗体誘導に不可欠のアミノ酸残基をそれぞれ推定した。さらに、推定アグレトープに関与する全てのアミノ酸をバリンで同時に置換した位置限定バリン置換ペプチドをそれぞれ合成し、実験例１と同様の方法、スケジュールで、各コンジェニックマウスを免役し、実験例１と同様に、血清中の抗体価をＥＬＩＳＡを用いて測定し、その免疫による抗体誘導能の検討から、それぞれのＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに対応するユニットペプチド抗原上のアグレトープを決定した。その結果を表２にまとめて示す。なお、表２には、各々のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプで認識されるユニットペプチド上のアミノ酸のみを表記した。
表２から明らかなように、それぞれのＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプで認識されるために必要な４又は５個のアミノ酸残基（アグレトープ）が、何れでも、アミノ酸１３残基のユニットペプチド分子内に重複およびシフトして共存しており、ユニットペプチド内に、マルチアグレトープ型Ｔ細胞エピトープとして、各々のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプにより認識されるアミノ酸の位置関係が確認された。
実験例３：マルチアグレトープ型ペプチド抗原の人為的構築
前記ユニットペプチドのアミノ酸配列に手を加えることにより、人為的にＭＨＣクラスＩＩハプロタイプによる拘束に関するマウスの免疫応答を変化させることが可能か否か検討した。実験例２で決定したＢ１０．Ｄ２（ｄ）或いはＢ１０．Ｍ（ｆ）マウスにそれぞれ対応するアグレトープの一部が共存するユニットペプチド分子上の部位（配列表における配列番号１のアミノ酸配列を有するユニットペプチドのアミノ末端から１０〜１２番）のアミノ酸残基を意図的に他のアミノ酸残基と置換した、配列表における配列番号１２（以下、「ＹＱＴＥＬペプチド」という。）、配列番号１３（以下、「ＹＥＴＤＬペプチド」という。）、配列番号１４（以下、「ＹＥＴＡＬペプチド」という。）、また、配列番号１（以下、「ＹＥＡＤＬペプチド」という。）に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、ユニットペプチドのカルボキシル末端にリジン−グルタミン−チロシンをさらに結合した、配列表における配列番号１５（以下、「ＹＥＡＤＬＫＱＹペプチド」という。）に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、及び、ユニットペプチドのアミノ末端に、Ｂ１０．Ｓ（ｓ）マウスが認識するＴ細胞エピトープとして公知のＰＡｃのアミノ末端から３０５〜３１８のアミノ酸配列を有する配列表における配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、「ＰＡｃ（３０５〜３１８）」という。）を連結して、配列表における配列番号１７（以下、「ユニットペプチド−ＰＡｃ（３０５〜３１８）」という。）又は上記両ポリペプチドを逆順に連結した配列表における配列番号１８（以下、「ＰＡｃ（３０５〜３１８）−ユニットペプチド」という。）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを、それぞれ合成して、これらのポリペプチドを、実験例１と同様の、免疫方法、スケジュールで一連のＢ１０コンジェニックマウスに免疫し、追加免疫の２週間後に、各マウスから採血し、これから血清を分離後、生理食塩水で５１２倍に希釈して、実験例１と同様のＥＬＩＳＡ法で測定し、免疫に使用した各々のポリペプチドに対する各々のコンジェニックマウスにおける抗体産生の誘導程度を、４０５ｎｍの吸光度で比較した。その結果を表３に示す。また、ユニットペプチド−ＰＡｃ（３０５〜３１８）或いはＰＡｃ（３０５〜３１８）−ユニットペプチドで免疫したマウスの血清中のユニットペプチドに特異的な抗体量の測定結果を表４に示す。なお、吸光度が、０．１以上の場合には、希釈した血清中に、ユニットペプチドに対する抗体が存在すると判定した。
表３から明らかなように、ユニットペプチドのアミノ酸を意図的にデザインすることにより、ＹＱＴＥＬペプチドで免疫した場合には、Ｂ１０．ＢＲ（ｋ）１種類のみに抗体産生産生が誘導されたのに対して、ＹＥＡＤＬペプチド（ユニットペプチド）で免役した場合には、Ｂ１０．Ｓ（ｓ）及びＢ１０．ＳＭ（ｖ）を除く３種のマウスに同時に抗体の産生が誘導された。このことから、ペフチド中の１〜３個のアミノ酸の種類を変えることにより、異なるＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプを有する個体において、そのユニットペプチドに対する免疫応答性を変化させることができることが確認された。また、ＹＥＡＤＬＫＱＹペプチドのように、ユニットペプチドのカルボキシル末端にリジン−グルタミン−チロシンを附加することにより、ＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの型の異なる、Ｂ１０．Ｓ（ｓ）を除く４種類のマウスで抗体の産生が誘導された。さらに、表３及び表４から明らかなように、ＰＡｃ（３０５〜３１８）−ユニットペプチドのように、ユニットペプチドのアミノ末端に、このユニットペプチドに不応答マウスであるＢ１０．Ｓ（ｓ）が応答することが知られているＴ細胞エピトープであるＰＡｃ（３０５〜３１８）ペプチドを連結することによりｓ型を含む５種類のＭＨＣクラスＩＩ型を有する個体で、同時にユニットペプチドに対する抗体が誘導できるマルチアグレトープ型ペプチド抗原となることが確認された。これらのことから、抗原上の複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプによる拘束性に関与するアミノ酸配列の解析を行い、その結果に基づき、個々のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの拘束を受けるアミノ酸配列を重複させたアミノ酸配列を有するペプチドを人為的にデザインすることにより、抗原に対する抗体産生を効率的に誘導でき、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの拘束を同時に受けることができる重複型のマルチアグレトープ型Ｔ細胞エピトープの構築が可能であることが確認された。また、複数のＴ細胞エピトープをタンデムに結合することにより調製したクラスター型Ｔ細胞エピトープも、重複型エピトープと同様に、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの拘束を受ける個体に対する、抗体産生を効率よく誘導するＴ細胞エピトープとなることが確認された。また、表４から明らかなように、ＰＡｃ（３０５〜３１８）とユニットペプチドを連結したポリペプチドで免役したマウスにおける、ユニットペプチドに対する抗体の産生は、免疫に使用したポリペプチドのカルボキシル末端側にユニットペプチドを連結した場合の方が、アミノ末端側に連結したものよりも、抗体産生の増強が強い傾向が認められた。
実験例４：ヒト用マルチアグレトープ型ペプチド抗原の人為的構築
上記実験例３の結果に鑑み、ＭＨＣクラスＩＩハプロタイプの拘束に起因するヒトによる免疫原性の強弱の解決策として、公知のヒトのＭＨＣクラスＩＩハプロタイプ（ＨＬＡ−ＤＲ）拘束に対するＴ細胞エピトープの拘束モチーフ（アグレトープ配置）に基づき、配列表における配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの拘束に対して同時に応答可能な重複・シフト型のマルチアグレトープ型ペプチド（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ Ｍｕｌｔｉａｇｒｅｔｏｐｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ：以下の実験では、このペプチドを「ＯＭＰ」と略記する。）を構築した。なお、具体的なデータは示さないが、このポリペプチドは、マウスにおいても、Ｔ細胞のマルチアグレトープとしての機能を有することが確認された。なお、表５として、ヒトのＭＨＣクラスＩＩであるＨＬＡ−ＤＲの各々のハプロタイプにより認識されるＯＭＰ上のアミノ酸のみを示した。
実験例５：ポリペプチドの特異抗体産生の増強に及ぼすリンカーペプチドの影響
実験例３で調製した短鎖のユニットペプチドでは免疫原性が弱く、その免疫原性の増強のために、ポリペプチドをタンデムに連結することを検討したものの、このままでは、連結により生じた新たなエピトープに対する抗体産生も増強されることを考慮し、Ｂ細胞エピトープが正確に提示されることを目的として、Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチドとＢ細胞エピトープを含むポリペプチドの間に、抗原提示細胞で抗原のプロセッシングに関与するエンドソーム内プロテアーゼ（カテプシンＢ）の認識配列であるＫＫをリンカーペプチドとして挿入し、その抗体産生の増強に対する影響を確認する実験を以下のように行った。実験例４で調製したＯＭＰはマウスのＴ細胞エピトープのアミノ酸配列も含んでいることから、このＯＭＰと、Ｂ細胞エピトープを含むペプチドとなるユニットペプチドとの間に、ＫＫのアミノ酸を挿入した、配列表における配列番号２０（以下、「ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド」と略記する。）、及び、配列番号２１（以下、「ユニットペプチド−ＫＫ−ＯＭＰ」と略記する。）記載のアミノ酸配列からなる２種類のポリペプチドを合成し、実験例１と同様の方法により、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に免疫し、実験例１と同様に、ＥＬＩＳＡにより、その血清中の、ＯＭＰ、免役したポリペプチド、及び、ＰＡｃに対する抗体価を測定した。その結果を表６に示す。
表６から明らかなように、リンカーペプチドのＫＫを挟んでＴ細胞エピトープであるＯＭＰをポリペプチドのアミノ末端側に、Ｂ細胞エピトープであるユニットペプチドをカルボキシル末端側に位置させることにより、効率の良い抗体の誘導が認められた。また、この傾向は、実験例３でもマウスの系統にかかわらず同様であり、とりわけ、ユニットペプチドのアミノ酸配列にはＴ細胞エピトープが存在せず、ＰＡｃ（３０５〜３１８）のアミノ酸配列にのみにＴ細胞エピトープが存在するＢ１０．Ｓ（ｓ）においては顕著であった（表４参照）。以上から、リンカーペプチドを挟んでアミノ末側のペプチドがＴ細胞エピトープとして、またカルボキシル末側のペプチドがＢ細胞エピトープとしてより効果的に認識されることが明らかとなった。
実験例６：細胞接着分子の細胞結合モチーフ附加によるペプチド抗原の鼻腔免疫における免疫原性の増強
配列表における配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドは抗う蝕活性を有する抗体を産生誘導することができるが、この２分子をリジン−リジンからなるリンカーで連結したポリペプチド（配列表における配列番号２２：ユニットペプチド−ＫＫ−ユニットペプチド、以下、「ジユニットペプチド」という。）は、注射（皮下或いは腹腔）による免疫においては、より効果的に抗体産生誘導が可能であり、免疫アジュバントを必要しない。しかしながら、経鼻免疫においては十分な抗体誘導能を示さないので、免疫アジュバントの同時投与が必要である。そこで、経鼻免疫における抗原性を増強することを目的として、ジユニットペプチドを粘膜面に長く留めるために、インテグリンファミリー等を介しての細胞接着性が証明されているタンパク質（フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン等）のインテグリン結合モチーフや他の細胞接着モチーフのアミノ酸配列を当該ペプチドに附加することによる免疫原性に対する影響を確認するための実験を以下のように行った。すなわち、前記ジユニットペプチドの、アミノ末端側に、細胞接着アミノ酸配列としてＲＧＤ、ＲＥＤ、ＬＤＶ、ＰＨＳＲＮ、ＲＫＫ、ＤＧＥＡ及びＹＩＧＳＲ、ＩＫＶＡＶ、ＩＲＶＶＭ、及びＲＦＹＶＶＭＷＫから選ばれる何れか１種又は２種を連結したポリペプチドを合成した。また、対照として、ジユニットペプチドのみ、及び、このポリペプチドに、単独では細胞接着能が無いとされているカドヘリン関連の配列表における配列番号２３（以下、「ＤＲＥ」と略記する。）、配列番号２４（以下、「ＤＥＤ」と略記する。）配列番号２５（以下、「ＨＡＶ」と略記する。）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを連結したポリペプチドを合成した。一群５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ株式会社、雌、５週令）に、リン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」と略記する。）または蒸留水に５０μｇ／４μｌの濃度で無菌的に溶解した各種ポリペプチド溶液を、片鼻２μｌ、計４μｌ（５０μｇ／個体／回）、鼻腔から滴下により吸入させた。なお、さらに、陰性対照として、ジユニットペプチドのみを経鼻投与した群、及び、陽性対照として、ジユニットペプチドと共にＣＴ１μｇを投与した群を設定した。また、ユニットペプチド−ＫＫ−ユニットペプチド及びこれにＲＧＤを連結したポリペプチドは、腹腔内投与も行った。初回免疫の２週間後に、追加免疫として、各々初回と同種類、同量のポリペプチドを同条件下に経鼻的に投与した。さらに、その２週間後に、各々前回と同一種類、同一量のポリペプチドを同条件下で投与し、その一週後、マウスの血清中の、ＰＡｃ、ジユニットペプチド、ＣＴ、ジユニットペプチドに細胞接着アミノ酸配列を附加したポリペプチドの各々に対する抗体価を、実験例１と同様のＥＬＩＳＡ法によりそれぞれ測定した。また、ＲＧＤ或いＹＩＧＳＲを附加したポリペプチドについては、これらのペプチドが、抗体産生の増強に関与していることを確認するために、その阻害剤として知られている、ＲＧＤＳ（配列表における配列番号２６）或いはＹＩＧＳＲ（配列表における配列番号８）の過剰量を同時に添加して、同様に免疫を行った。その結果を表７に示す。なお、ＲＧＤ、ＲＥＤ、ＬＤＶ、ＰＨＳＲＮ、ＲＫＫ、ＤＧＥＡ及びＹＩＧＳＲ、ＩＫＶＡＶ、ＩＲＶＶＭ、及びＲＦＹＶＶＭＷＫから選ばれる何れか１種又は２種以上を附加したジユニットペプチドで免疫したマウスでは、何れも、ユニットペプチドに対する抗体の産生が増強され、ＤＲＥ、ＤＥＤ、或いは、ＨＡＶ附加したジユニットペプチドで免疫したマウスでは何れも、ユニットペプチドに対する抗体の産生が増強されなかったので、表７では、ジユニットペプチド、配列表における配列番号２７（以下、「ＲＧＤ−ジユニットペプチド」という。）、配列番号２８（以下、「ＲＥＤ−ジユニットペプチド」という。）、配列番号２９（以下、「ＹＩＧＳＲ−ジユニットペプチド」という。）、配列番号３０（以下、「ＤＥＤ−ジユニットペプチド」という。）、配列番号３１（以下、「ＨＡＶ−ジユニットペプチド」という。）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドで免疫した結果のみを示す。
表７から明らかなように、ジユニットペプチドを単独で経鼻投与したのでは、ほとんどユニットペプチドに対する抗体産生の誘導が認められないのに対して、インテグリン結合モチーフのＲＧＤ、ＲＥＤ、或いは、ラミニン結合タンパク質に対するラミニン分子上の結合モチーフのＹＩＧＳＲを附加したＲＧＤ−ジユニットペプチド、ＲＥＤ−ジユニットペプチド、或いは、ＹＩＧＳＲ−ジユニットペプチドを経鼻投与した場合には、抗体産生の増強効果が認められた。なお、その際に、インテグリンへの結合阻害剤であるＲＧＤＳやＹＩＧＳＲの短鎖ペプチドを過剰量共存させた場合には、ＰＡｃに特異的な抗体の産生が抑制された。この結果は、ＲＧＤやＹＩＧＳＲなどの細胞接着分子のモチーフの附加が、ポリペプチドのもつ抗体産生の誘導能をさらに増強する効果があること、その効果は、ジユニットペプチドが粘膜細胞膜に存在するインテグリンに結合することにより発揮することが示唆された。
実験例７：経粘膜投与ペプチドワクチンの抗体産生増強に対する細胞接着分子の影響
実験例６のジユニットペプチドで証明されたインテグリン結合モチーフの附加の及ぼす、他のペプチド抗原による抗体産生の増強への影響、及び、インテグリン結合モチーフの附加部位の違いによる抗体産生増強への影響を調べる実験を、以下のように行った。実験例５でＰＡｃに対する特異抗体の産生増強能の高いことが確認された、ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチドのＯＭＰ、或いは、ユニットペプチドのアミノ末端側又はカルボキシル末端側に、実験例６で、ポリペフチドの抗体産生の誘導の増強作用が示唆された細胞接着分子のインテグリン結合モチーフとして知られているＲＧＤを、挿入して、「ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド」（配列表における配列番号３２）、「ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド」（配列表における配列番号３３）、「ＯＭＰ−ＫＫ−ＲＧＤ−ユニットペプチド」（配列表における配列番号３４）、「ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド−ＲＧＤ」（配列表における配列番号３５）という配列を有する合計４種類のポリペプチドを合成した。なお、陽性対照として、経粘膜投与でアジュバント活性を有することが既に知られているＣＴを使用した。これらのポリペプチド或いはポリペプチドとＣＴの混合液を使用して、実験例６と同じ方法により、Ｂ１０マウスを免疫して、その抗体産生の増強を誘導する効果の有無を判定した。その結果を表８に示す。
表８から明らかなように、ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチドにＲＧＤを挿入するとＰＡｃに対する抗体産生が強く増強された。特に、ＲＧＤをＯＭＰのアミノ末端側或いはカルボキシル末端側に挿入した場合に、言い換えれば、リンカーを挟んでＮ末端側に挿入した場合に、目的とする抗体の産生量はアジュバントとしてＣＴを用いた場合よりも顕著に強く増強され、かつ、誘導される抗体のほとんどがＰＡｃと反応する抗体であることが確認された。一方、リンカーを挟んでＣ末端側に挿入した場合、誘導される抗体の多くは、ＲＤＧ配列を含むペプチド部分由来と反応する抗体であることが確認された。
これらのことから、アジュバント非存在下における経鼻免疫においてもリンカーを挟んでアミノ末側のペプチドがＴ細胞エピトープとして、またカルボキシル末側のペプチドがＢ細胞エピトープとしてより効果的に認識され、目的とするＢ細胞エピトープに特異的な抗体産生を効率的に増強し、しかも、リンカーを挟んでアミノ末端側にＲＧＤ配列を附加することにより、産生される抗体のほとんどをＰＡｃのみと反応する抗体とすることができることが明かとなった。
実験例８：経粘膜投与ペプチドワクチンの基本デザインの普遍性
実験例７で調製したＲＧＤ−Ｔ細胞エピトープ−ＫＫ−Ｂ細胞エピトープで構成されたポリペプチドのＴ細胞エピトープとＢ細胞エピトープの何れか一方を、ＯＭＰ或いはユニットペプチド以外のポリペプチドで置き換えた場合の、Ｂ細胞エピトープに対する抗体産生の増強への影響を調べる実験を以下のように行った。Ｔ細胞エピトープとして、種を問わず幅広いＭＨＣクラスＩＩハプロタイプの拘束性がすでに報告されている、配列表における配列番号３６記載のＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ１２０由来のマルチアグレトープ型Ｔ細胞エピトープであるＴ１ペプチド（ジェイ・ディー・アーラーズ（Ａｈｌｅｒｓ Ｊ．Ｄ．）著、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエスエイ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ）、第９４巻、第２０号、１０８５６乃至１０８６１頁（１９９７年）参照。）（以下、「Ｔ１」と略記する。）を使用し、Ｂ細胞エピトープとしてＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と略記する。）に対する抗体を誘導することが知られている、配列表における配列番号３７記載のアミノ酸配列からなるＯＶＡ由来の１４残基のペプチド（以下、「ＯＶＡｐ」と略記する）（ディー・エフ・ハント（Ｈｕｎｔ Ｄ．Ｆ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５６巻、１８１７乃至１８２０頁（１９９２年）参照。）を使用して、「ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ」（配列表における配列番号３８）、或いは、「Ｔ１−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド」（配列表における配列番号３９）からなるポリペプチドを合成した。また、対照として、「ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ」（配列表における配列番号４０）又は「Ｔ１−ＫＫ−ユニットペプチド」（配列表における配列番号４１）を用意した。これらのポリペプチドを、各々、実験例６と同様の方法で、ＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔免疫を行った。その結果を表９に示す。
表９から明らかなように、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ、或いは、Ｔ１−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチドからなるポリペプチドを経鼻免疫したマウスでは、ＯＶＡ或いはＰＡｃ特異的な抗体の産生が増強された。すなわち、ＲＧＤを附加したポリペプチドで免疫した場合には、ＲＧＤを附加していないポリペプチドで免役した場合よりも強い抗体産生の増強が認められた。
実験例９：本発明のポリペプチドによる他の抗原の抗体産生増強効果
通常、アジュバントとして用いるＣＴは抗原性が強く、経鼻的に投与すると、ＣＴに対する抗体が誘導されるだけでなく、ＣＴと同時に経粘膜投与した、ＣＴ以外の抗原に対する抗体産生を増強することが知られている。一方、実験例７及び実験例８から明らかなように、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ或いはＴ１−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチドからなる本発明のポリペプチドは、ＣＴを免疫アジュバントとして用いなくても、それらの単独の経鼻投与で、それぞれのポリペプチドに特異的な抗体の産生が誘導された。さらに、本発明のポリペプチドが、他の抗原に対して抗体産生増強作用を示すかどうかの確認のための実験を以下のように行った。
＜牛血清アルブミンの経鼻投与に及ぼす各種ポリペプチド影響＞
牛血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と略記する。）４μｇと、ジユニットペプチド１μｇ、ＲＧＤ−ユニットペプチド−ＫＫ−ユニットペプチド１μｇ、ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド１μｇ、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド１μｇ、ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ１μｇ、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ１μｇ或いはＣＴ２μｇの何れかを混合した生理食塩水溶液を調製し、各々、実験例６と同様の方法で、ＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔免疫を行い、血中の抗体価を測定した。その結果を表１０に示す。なお、測定は、ＢＳＡ、ＢＳＡと共に投与したペプチド、及び、ＣＴに対する抗体について行った。
＜卵白アルブミンの経鼻投与に及ぼす各種ポリペプチド影響
ＯＶＡ４μｇとＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド１μｇ、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ＯＶＡｐ１μｇ或いはＣＴ２μｇの何れか１種を混合した生理食塩水溶液を調製し、各々、実験例６と同様の方法で、Ｂ１０．Ｄ２マウス或いはＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔免疫を行い、血中の抗体価を測定した。その結果を表１０に示す。なお、測定は、ＯＶＡ、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ＯＶＡｐ、及び、ＣＴに対する抗体について行った。
表１０から明らかなように、ＢＳＡ或いはＯＶＡを単独で経鼻投与しても、血液中には、これらのポリペプチドに対する抗体はほとんど誘導されなかった。これに対して、ＢＳＡ又はＯＶＡと、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ又はＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐの何れか１種とを同時に投与したマウスでは、ＢＳＡ或いはＯＶＡに対する強い抗体の産生が誘導された。また、ＢＳＡとＲＧＤ−ユニットペプチド−ＫＫ−ユニットペプチド又はＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチドとを同時に投与した場合にも、ＢＳＡ又はＯＶＡに対する抗体の産生が誘導されるものの、増強の程度は、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ又はＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐと同時に投与した場合よりも低かった。ＢＳＡ又はＯＶＡと、ＣＴとを投与しした場合にも、ＢＳＡ又はＯＶＡと、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ又はＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐの何れか１種を同時に投与した場合と同程度の抗体産生が認められた。しかしながら、実験に使用した１μｇのＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ或いはＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐの何れかを同時に投与した場合には、これらのペプチドに対する抗体の産生は、わずかであったのに対して、２μｇコレラトキシンを同時に投与した場合には、ＣＴに対する抗体も強く誘導された。これらのことから、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ或いはＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐは、自己に対する抗体産生を誘導する量以下の量、あるいは、少量の自己抗体を誘導する量を、他の抗原と同時経鼻投与することにより、同時に投与した自己以外の抗原の抗体産生を誘導する免疫アジュバントとして使用できることが確認された。
以上の実験結果から、種々のＴ細胞エピトープと種々のＢ細胞エピトープを組み併せて、その間にＫＫなどのプロテアーゼの認識配列をリンカーペプチドとして挿入し、さらに、このペフチドに細胞接着分子のモチーフを附加したポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープ或いはそれを含む抗原に対する抗体の産生を増強することのできることが明らかとなった。また、これらのポリペプチドは、経鼻のような経粘膜投与でも免疫アジュバントを併用することなしに、投与したポリペプチドの中のＢ細胞エピトープに対する抗体を、効率よく誘導でき、しかも、それ以外の部位に対する不要な抗体の産生がほとんどないため、特異的な抗体産生の誘導剤、或いは、抗体産生の増強剤として使用できることが確認された。また、これらのポリペプチドを投与された生体では、免疫に使用したＢ細胞エピトープが由来する抗原性タンパク質を認識する抗体が効率よく産生されることから、本発明のポリペプチドは、経鼻免疫をはじめとする経粘膜免疫において、免疫アジュバントを必要とせずに、目的とする感染防御抗体や毒素、酵素類の活性の中和抗体やアレルゲンに対する抗体などの種々の抗原に対す抗体の誘導が可能であることを示しており、しかも、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束された個体に、抗体産生を効率的に誘導できることから、感染防御などの目的で使用する、経鼻粘膜免疫用ペプチドワクチンとして使用できることが示された。また、これらポリペプチドは、他の抗原と同時に粘膜免疫されたとき、免疫アジュバントとして機能することも明かとなった。
以下に、実施例で、本発明のポリペプチドについて具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１：ＰＡｃに対する抗体の産生の増強用の組成物
実験例７の方法に準じて調製した、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド及びＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド−ＲＧＤの何れか１種を１００μｇ／ｍｌとα，α−トレハロース（試薬級 株式会社林原生物化学研究所販売）を４０％となるように、蒸留水に溶解し、常法により滅菌してシラップ剤を得た。これを滅菌バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、密閉して、ポリペプチド含有シラップ剤を調製した。本品は、安定性に優れ、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されるため、多くのヒトや動物で、経鼻、或いは、経口的に投与することにより、う蝕予防活性を有する抗体産生を効率的に増強するワクチン効果を発揮することができる。また、本品は、経粘膜や経皮などの投与により、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとしても有利に利用できる。
実施例２：ＰＡｃに対する抗体の産生の増強用の組成物
安定剤として、１％（ｗ／ｖ）のショ糖を含む生理食塩水に、実験例７の方法に準じて調製したＲＧＤ−Ｔ１−ＫＫ−ユニットペプチドを、各々１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ又は、１，０００μｇ／ｍｌとなるように溶解し、ろ過滅菌した。これを滅菌バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、常法により、凍結乾燥して、密閉し、ポリペプチド含有製剤を調製した。本品は、安定性に優れた、う蝕予防効果に優れた、経粘膜摂取或いは注射用の製剤である。本品は、何れも、注射用蒸留水１ｍｌに完全に溶解して使用する。また、本品は、何れも、安定性に優れ、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されるため、多くのヒトや動物で、経鼻、或いは、経口的に投与することにより、う蝕予防活性を有する抗体産生を効率的に増強するワクチン効果を発揮することができる。また、本品は、経粘膜や経皮などの投与により、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとしても有利に利用できる。
実施例３：ポリペプチド含有組成物の毒性試験
実施例１或いは、実施例２で調製したポリペプチドを１２．５ｍｇ／ｍｌとなるように、０．５％のショ糖を含有する生理食塩水で希釈し、これを、生後５週令のＤＤＹ系の雄マウスに、常法により経口、腹腔内又は、筋肉内に投与して、ＬＤ５０を検討した。これらの標品は何れも、ＬＤ５０がポリペプチド質量に換算して１００ｍｇ／ｋｇマウス体重以上であり、このことは、本発明のポリペプチドが、ヒトや動物に投与しても、毒性のない、安全な製剤であることを示している。
実施例４：ＨＩＶに対する抗体産生の増強用の組成物
Ｔ細胞エピトープとしてＯＭＰ、Ｔ１、ＨＬＡ−ＤＲ１、２、３、４、５、６、７、８、９、５１、５２、５３に結合することが報告されている、配列表における配列番号４２記載のＨＩＶ−１由来のｇａｇ２９８−３１２ペプチドと相同のアミノ酸配列を有するペプチド、又は、配列表における配列番号４３記載のＨＩＶ−１由来のｐｏｌ５９６−６１０（シー・シー・ウイルソン（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．）著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７５，４１９５−４２０７（２００１）参照。）と相同のアミノ酸配列を有するペプチドから選ばれる何れか１つを用い、ＲＧＤをそのアミノ又はカルボキシル末端に配し、ＫＫからなるリンカーペプチドをはさんでカルボキシル末端側にＨＩＶ中和抗体を誘導するためのＢ細胞エピトープとして、配列表における配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるＨＩＶのｇｐ１２０蛋白のＶ３のｌｏｏｐペプチドと相同のペプチド（ビー・エフ・ヘイネス著（Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．）、ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第１５１巻、１６４６乃至１６５３頁、（１９９３年））を配したポリペプチドを調製した。これらのペプチドから選ばれる何れか１種又は２種を各々１５０μｇ／ｍｌとマンニトール１００ｍｇ／ｍｌ含有する生理食塩水溶液を調製した。これらを、５ｍｌ容のバイアル瓶に１ｍｌ／バイアルとなるように分注し、常法により凍結乾燥した。本品は、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されているため、ヒトに経粘膜や経皮などの投与により、多くのヒトでＨＩＶに特異的な抗体の産生を効率よく増強することができることから、ＨＩＶ感染の広がり、或いは、ＨＩＶ感染者の発症を遅延させるワクチンの目的で有利に使用できる。また、本品は、経粘膜投与などにより、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとしても有利に利用できる。
実施例５：インフルエンザウイルスに対する抗体の産生増強用の組成物
Ｔ細胞エピトープとしてＯＭＰ、Ｔ１、配列表における配列番号４２及び配列番号４３記載のアミノ酸配列を有するペプチドから選ばれる何れか１つを用い、ＲＧＤ或いはＹＩＧＳＲをそのアミノ又はカルボキシル末端に配し、ＫＫリンカーペプチドをはさんでカルボキシル末端側にインフルエンザウイルスの中和抗体を誘導するためのＢ細胞エピトープとして、配列表の配列番号４５記載のインフルエンザウイルスのヘムアグルチニン（ＨＡ）蛋白アミノ末端からの９１〜１０８番目のアミノ酸配列と相同のアミノ酸配列を有するペプチド（ティー・ベン−イエディディア著（Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ，Ｔ．）、モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第３９巻，３２３乃至３３１頁、（２００２年））を配したペプチドワクチンを、常法により合成した。これらのポリペプチドから選ばれる何れか１種又は２種を各々７５μｇ／ｍｌとヒトアルブミン０．５ｍｇ／ｍｌ含有する生理食塩水溶液を調製した。これらを、５ｍｌ容のバイアル瓶に１ｍｌ／バイアルとなるように分注し、常法により凍結乾燥した。本品は、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されるため、多くのヒトや動物で、経粘膜や経皮などで投与することにより、インフルエンザウイルスに特異的な抗体の産生を効率よく増強することができるワクチン効果を有することから、インフルエンザウイルスの感染を防御することができる。また、本品は、経粘膜投与などにより、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとしても有利に利用できる。
実施例６：パピローマウイルスワクチン
Ｔ細胞エピトープとしてＯＭＰ、Ｔ１、配列表における配列番号４２及び配列番号４３記載のアミノ酸配列を有するペプチドから選ばれる何れか１つを用い、ＲＧＤをそのアミノ末端又はカルボキシル末端に配し、ＫＫリンカーペプチドをはさんでカルボキシル末端側にヒトパピローマウイルスの中和抗体を誘導するためのＢ細胞エピトープとして、配列表における配列番号４６記載のＬ２：蛋自由来の部分アミノ酸配列と相同のアミノ酸配列を有するペプチド（ケイ・カワナ（Ｋａｗａｎａ，Ｋ．）著、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）、第１９巻、１４９６乃至１５０２頁、（２００１年））を配したポリペプチドワクチンを調製した。これらのペプチドから選ばれる何れか１種又は２種を各々２００μｇ／ｍｌとゼラチンを０．２５ｍｇ／ｍｌ含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を調製した。これらを、５ｍｌ容のバイアル瓶に０．５ｍｌ／バイアルとなるように分注し、常法により凍結乾燥した。本品は、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されるため、ヒトに経粘膜や経皮などの投与により、多くのヒトでパヒローマウイルスに特異的な抗体の産生を効率よく増強することができることから、ヒトパピローマウイルスの感染を防御できる。また、本品は、経鼻投与などの経粘膜により、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとしても有利に利用できる。
実施例７：ＯＶＡ抗体産生用組成物
実験例８の方法で調製した、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐのアミノ酸配列を有するポリペプチドを１００μｇ／ｍｌとα，α−トレハロース（試薬級、株式会社林原生物化学研究所販売）を４０％となるように、蒸留水に溶解し、常法により滅菌してシラップ状物を得た。これを滅菌バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、密閉して、ペプチドワクチン含有シラップを調製した。本品は、安定性に優れ、動物に、経鼻、或いは、経口的、経皮的などに投与することにより、ＯＶＡに対する抗体を効率的に増強することができる。また、本品は、経鼻投与などにより、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとしても有利に利用できる。
実施例８：インフルエンザワクチンの抗体産生増強用の組成物
生理食塩水１ｍｌあたり、市販のインフルエンザＨＡワクチン（藤沢薬品工業株式会社販売）４μｇあるいはＨＡやＭ蛋白質などのウイルス表層抗原性タンパク質とＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ又はＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド１μｇとを含有する標品を調製した。これを、滅菌バイアル瓶に０．５ｍｌずつ分注し、密閉した。本品は、ウイルス表層抗原性タンパク質とＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ又はＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチドのもつ免疫アジュバント作用により、そのままでは、経粘膜投与しても抗体産生を誘導することのできないインフルエンザワクチンの経鼻などの経粘膜投与による抗体産生を増強するので、本品を、２週おきに３回ないし４回鼻腔に投与することにより、インフルエンザの感染を防御する抗体の産生を増強することができるワクチンとして使用することができる。
実施例９：スギ花粉症経口減感作治療用組成物
Ｔ細胞エピトープとしてＯＭＰ、Ｔ１、配列表における配列番号４２及び配列番号４３記載のアミノ酸配列を有するペプチドから選ばれる何れか１つを用い、ＲＧＤをそのアミノ末端又はカルボキシル末端に配し、ＫＫリンカーペプチドをはさんでカルボキシル末端側にスギ花粉アレルゲン抗体を誘導するためのＢ細胞エピトープとして、Ｃｒｙｊ１のＢ細胞エピトープであるＶＨＰＱＤＧＤＡ（ワイ・タムラ（Ｔａｍｕｒａ，Ｙ．）著、インターナショナル・アーカイブズ・オブ・アレルギー・アンド・イムノロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第１２３巻、第３号、２２８乃至２３５頁、（２００１年））及びＣｒｙｊ２のＢ細胞エピトープであるＫＷＶＮＧＲＥＩ（ワイ・タムラ（Ｔａｍｕｒａ，Ｙ．）著、クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・アレルギー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ）、第３３巻、第２号、２１１乃至２１７頁、（２００３年））をＫＫで連結した配列表における配列番号４７記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを配し、これらのペプチドから選ばれる何れかを各々２００μｇ／ｍｌとゼラチンを０．２５ｍｇ／ｍｌ含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を調製し、スギ花粉症減感作治療用の組成物を得た。本品は、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されるため、ヒトに経粘膜や経皮などの投与により、多くのヒトで粘膜投与により、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ１及びＣｒｙｊ２に特異的なＩｇＧ抗体を優位に産生することから、経口投与によるスギ花粉症経口減感作治療薬として有用である。
【産業上の利用可能性】
以上説明したとおり、本発明は、特定の抗原ペプチドを含み、目的とする抗原エピトープに対する特異的な抗体の産生を、免疫アジュバント非存在下においても特異的に増強するポリペプチド及そのポリペプチドを含有する組成物に関するものである。しかも、本発明のポリペプチドは、免疫アジュバントを用いる必要もなく、また、経鼻投与や経口投与などの経粘膜投与で使用できることから、注射による経皮投与などに比して、簡易かつ安全な、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されるため、多くのヒトを含む哺乳動物や鳥類、爬虫類、魚類などの抗体産生を行う動物用のワクチン或いは特異抗体産生の増強用の抗原として使用することができる。また、本発明のポリペプチドは、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとして使用することもできる。
【配列表】
【技術分野】
本発明は特定の抗原エピトープを含み、免疫アジュバント非存在下においても、経粘膜投与により、この抗原エピトープに対する特異抗体の産生を効率よく誘導するポリペプチド、このポリペプチドを含有する組成物、およびその用途に関し、より詳細には、抗体産生の対象となる抗原のＢ細胞エピトープを含むポリペプチドとＴ細胞エピトープを、プロテアーゼの認識配列のアミノ酸からなるリンカーペプチドで連結し、このポリペプチドに、さらに、細胞結合モチーフのアミノ酸配列からなるペプチドを連結した、目的抗体の産生を効率よく誘導するポリペプチド、このポリペプチドを含有する組成物及びその用途に関する。
【背景技術】
生体に、特定の抗原に対して特異的な抗体産生のみを誘導する場合には、精製した抗原を単独で、或いは、抗体産生を増強する活性を有する免疫アジュバント（免疫機構を非特異的に刺激することによって、抗原に対する特異的免疫反応を強める物質）と共に生体に投与する方法が一般的に用いられてきた。この方法は、種々の感染症に対する最も有効な予防手段としても汎用されており、特に抗生物質が無効であるウイルスや、微生物が産生する毒素などのように、他に有効な予防或いは治療方法がない場合には、生体に、これらのウイルスや毒素に対する抗体産生を誘導し、防御することが唯一の対策である場合も多い。現在この方法が実用化されているものとしては、病原微生物を有機溶媒や紫外線照射等で不活化して感染性を無くした不活化ワクチン及び病原体を弱毒化して生体への病原性を弱めた弱毒化ワクチンであり、ポリオウイルスワクチンを除き、全て注射により非経口的に投与されている。しかしながら、不活化ワクチンの場合、防御に必要な抗体価を得るためには数回の注射を繰り返す必要があり、生体への負担が大きく利便性にも劣っているとの問題を抱えている。
また、生ワクチンの場合、保存安定性に欠けるだけでなく、ワクチン投与後に突然変異を起こし強毒化株となり生体に害を引き起こす可能性がある。さらには、不活化ワクチン、生ワクチンとも生体に対してアナフィラキシーショックを与えることもあり、安全性に欠ける面があった。さらにウイルス粒子そのもの、或いは、蛋白巨大分子を免疫原として用いるため、ワクチン製剤とした際の安定性に欠け、安定性を保持するためヒト血清アルブミンやゼラチン等を製剤の安定剤として用いる場合もあった。このためこれら安定剤に用いた物質に未知の感染性微生物の混入が否定できないこと、或いは、安定剤に対する生体のアナフィラキシーショックが生じることもあり、安全性、安定性に欠けるものであった。また大部分のワクチンは注射剤として製剤化されているものの、感染症の発生により多くの人命が奪われている地域の多くは発展途上国であり、ワクチンの普及を図るには安定性に優れた製剤で、かつ、注射剤以外のより簡便な投与が可能なワクチン製剤が求められている。
これらの課題を解決するために、不活化ワクチンや生ワクチンよりも高い安全性と有効性をもつ、不活化ワクチンや生ワクチンの部分アミノ酸配列からなるポリペプチドを利用した新型ワクチンの開発研究が世界中で鋭意進められており、Ｂ型肝炎ウイルスワクチンに代表される組換え型ワクチンやコンポーネントワクチンは、その新型ワクチンの代表例である。しかしながら、ワクチンとして利用するポリペプチドの鎖長は短いものほど望ましいものの、短くすればするほど、生体が個別にもつ主要組織適合性抗原（以下、「ＭＨＣ」と略記する。）のクラスＩＩハプロタイプの拘束性を幅広くカバーし、十分な免疫原性を有するようにデザインすることが難しくなる。また、経粘膜投与時の抗原の免疫原性を高める方法としては、対象とする抗原とともに、コレラ毒素（以下、「ＣＴ」と略記する。）や大腸菌由来の熱不安定型のエンテロトキシンや、これらのアミノ酸配列の一部を置換して弱毒化したものを免疫アジュバントとして投与する方法が知られてはいるものの（イー・シー・ラベル（Ｌａｖｅｌｌｅ，Ｅ．Ｃ．）著、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第９９巻、３０乃至３７頁、（２０００年））、目的とする抗原以外に、免疫アジュバントとして使用したコレラ毒素や大腸菌由来の熱不安定型のエンテロトキシンに対する抗体が産生されるなどの問題があり、実用に供されていない。
一方、歯科における微生物が原因とされる二大疾患には、う蝕症と歯周病があり、これらは、一般的な疾患で、且つ、致死的でないために、その予防や治療にはより高度な安全性が求められている。このう蝕症予防の手段として、例えば特開平６−１２２６３３号公報には、ストレプトコッカス・ミュータンス菌由来の歯面への付着性を有する蛋白質の断片ペプチドで免疫した動物の抗体を利用する（受動免疫）方法が開示されており、特表２００２−５１１４２２号公報においては、ストレプトコッカス・ミュータンス由来のＴ細胞エピトープに、同じストレプトコッカス・ミュータンス由来のＢ細胞エピトープ（グルカンバインディング蛋白質）からなるう蝕予防用のワクチンが記載されている。
また、これとは別に、本発明者は、う蝕予防効果があることが知られているストレプトコッカス・ミュータンス セロタイプＣ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕ ｍｕｔａｎｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｃ）の歯面への初期付着に関与する表層蛋白質抗原（以下、「ＰＡｃ」と略記する。）に対する抗体の産生を誘導する系を実験モデルとして使用し、経粘膜投与により、免疫アジュバント非存在下でも、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプ（遺伝子型）の個体において、ＰＡｃに対する抗体産生を効率的に誘導できる短鎖ポリペプチドを開発する目的で、研究を行ってきた。すなわち、ＰＡｃのアミノ末端から３６５乃至３７７番目までのアミノ酸配列であるところの配列表における配列番号１記載のアミノ酸配列を有するペプチドをＢ細胞エピトープとして使用し、このペプチドのアミノ末端側に、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの拘束を同時に受けるＴ細胞エピトープを結合し、その間を例えばリジン−リジン配列からなるジペプチドリンカーで、直線的に連結することにより、う蝕を抑制することのできる抗体の産生を増強する方法を提案した（西沢俊樹、今井奨、花田信弘、第４回日本ワクチン学会学術集会プログラム・抄録集、第７７頁（２０００年）、オオイシ，ワイ（Ｏｉｓｈｉ，Ｙ．）等、オーラル マイクロバイオロジー アンド イムノロジー（Ｏｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第１６巻、第４０〜４４頁（２００１年））。しかしながら、これらの文献に開示されるポリペプチドも免疫アジバント非存在下で経粘膜的に投与した場合には、免疫原性が弱く、ポリペプチドを投与しても生体に対して十分な抗体を誘導しないという欠点が解決できなかった。さらに、特表平８−５０４１１８号公報には、Ｔ細胞エピトープのカルボキシル末端側にＢ細胞エピトープを結合したトラコーマークラミジアの感染防止用の合成ペプチドワクチンが開示されているものの、経粘膜投与では十分な抗体産生を誘導することはできない。
斯かる状況に鑑み、本発明の課題は、経粘膜投与であっても十分な量の目的とする抗体を生体内で産生誘導可能であり、安全に投与できるペプチドワクチンを提供することにある。
【発明の開示】
本発明者は、上記課題を解決するために、う蝕の原因となる微生物のストレプトコッカス ミュータンスのＰＡｃ（菌体表層蛋白質抗原）由来の断片ペプチドをモデルとして使用して、う蝕の原因となる微生物の感染防御に有効な抗体の産生を増強できるポリペプチドの研究を進めてきた。その結果、ポリペプチドのアミノ末端側に、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプで同時に拘束されるＴ細胞エピトープを含むアミノ酸配列を有し、リンカーペプチドとしてプロテアーゼの認識アミノ酸配列を挟んで、カルボキシル末端側に抗体誘導用のＢ細胞エピトープを含むアミノ酸配列を有し、さらに、このポリペプチドに細胞結合モチーフと相同なアミノ酸配列を有するペプチドを結合したポリペプチドが、免疫アジュバント非存在下で経鼻などの経粘膜投与した場合において、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプにおいて、目的とする抗原に対する特異抗体の十分な産生を効率よく増強し、しかも、目的とする特異抗体以外の抗体の産生誘導能が低く、また、アナフラキシーなどの副作用を誘発しない、安全性の高いポリペプチドであることを見出した。また、このポリペプチドが、免疫アジュバントなしに経粘膜投与した場合でも、抗体産生を誘導できること、さらには、このポリペプチドが免疫アジュバント効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、アミノ末端側にＴ細胞エピトープを含むアミノ酸配列を有し、リンカーペプチドをはさんで、そのカルボキシル末端側にＢ細胞エピトープを含むアミノ酸配列を有するペプチド内に、細胞接着分子の細胞結合モチーフと相同アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供することによって前記課題を解決するものである。
発明を実施する上での最良の形態
本発明でいう抗体とは、主としてイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）抗体であり、血中や体液中に分泌されるものはもとより、鼻腔、口腔、眼、消化管などに分泌される抗体も当然これに含まれる。
本発明のポリペプチドにおいて、抗体産生を誘発する部位として使用するのは、Ｂ細胞エピトープ或いはそれを含むアミノ酸配列部分である。また、このペプチドのアミノ酸配列は、微生物、細胞、又は腫瘍細胞に由来する毒素、アレルゲン、酵素、細胞膜抗原、腫瘍特異性抗原などの抗原であって、その各々について文献的に既に明らかにされている既知の抗原エピトープのアミノ酸配列そのものでもよく、また実際に生体に対して免疫原性をもつ様々な抗原そのもの、或いは、常法により、抗原の部分ペプチドを免疫してエピトープ配列を同定し、この同定したアミノ酸配列を有するポリペプチドをＢ細胞エピトープとして用いてもよい。また、このＢ細胞エピトープは、後述のＴ細胞エピトープと同じ抗原上にあるものでもよく、Ｂ細胞エピトープとそのアミノ酸配列の一部又は全部を共有していてもよい。従って、Ｂ細胞エピトープ部分については、感染防御、癌、腫瘍、潰瘍、肝炎など炎症性疾患、アレルギー及びアトピー性皮膚炎などの免疫性疾患などの予防や治療、酵素の中和、臨床検査などに使用される各種抗原の検出など、誘導する抗体の使用目的に応じて、好ましい抗原ポリペプチドを選択することが出来る。例えば、う蝕予防用の抗体を誘導するためには、西沢俊樹、今井奨、花田信弘、第４回日本ワクチン学会学術集会プログラム・抄録集、第７７頁（２０００年）に記載の前記ＰＡｃの断片ペプチドを使用することができ、具体的には、配列表における配列番号１記載のアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。これらのＢ細胞エピトープを含むポリペプチドはそのまま使用してもよく、タンデムに連結して、その２量体、３量体あるいは多量体として使用してもよい。また、同一抗原上に存在する２種以上のＢ細胞エピトープをタンデムに連結することも、抗原全体をＢ細胞エピトープとすることもできる。また、複数種の抗原性タンパク質が関与する疾患治療の場合、それらのＢ細胞エピトープをタンデムに連結することにより、１つのポリペプチドで複数種の抗原性タンパク質に対する抗体を産生できるポリペプチドを設計することも随意である。この場合には、各Ｂ細胞エピトープの間に、後述のリンカーペプチドを挿入することにより、個々のエピトープのプロセッシングをより確実に行わせることもできる。
また、本発明のポリペプチドに使用する、Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチドのアミノ酸配列とは、投与の対象となるヒトを含む哺乳動物、鳥類、爬虫類、または、魚類のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束され、ヘルパーＴ細胞用抗原として提示を受けるアミノ酸配列或いは、それを含むアミノ酸配列のものであれば何れでもよい。このポリペプチドのアミノ酸配列は、文献的に既に明らかにされているＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を利用してもよく、また、実際に生体に対して、常法により、抗原の部分ペプチドを免疫してエピトープ配列を同定し、この同定したアミノ酸配列を有するポリペプチドをＴ細胞エピトープとして用いてもよい。このＴ細胞エピトープは、前述したＢ細胞エピトープを含む抗原上にあってもよく、Ｂ細胞エピトープとそのアミノ酸配列の一部又は全部を共有していてもよい。これらのＴ細胞エピトープペプチドはそのまま使用しても、あるいは同種又は複数種のＴ細胞エピトープをタンデムに連結して使用してもよい。また、Ｔ細胞エピトープは、アグレトープ（ＭＨＣクラスＩＩ抗原との結合に必要なアミノ酸残基）となるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基は他のアミノ酸残基に置換しても機能を発揮することが可能である。よって、本発明で用いるＴ細胞エピトープポリペプチドとして、アグレトープが保存されたポリペプチドであれば用いることができる。そこで、本発明のポリペプチドを感染防御や抗アレルギー等の予防又は治療を目的として用いる場合には、多くの患者に対して適用可能とならしめるために、Ｔ細胞エピトープポリペプチド部分として、複数種のＭＨＣクラスＩＩハプロタイプに対するアグレトープをタンデムに又はオーバーラップして有するポリペプチド（いわゆるマルチアグレトープ型ポリペプチド）は極めて有用である。現在、ＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプによる拘束性ペプチドの基本構造およびアグレトープは、文献的に数多く開示されており、これらを参考に、使用目的に併せてＴ細胞エピトープを含むポリペプチドを設計することも随意である。また、異種の動物におけるＴ細胞エピトープ又はアグレトープをタンデムに又はオーバーラップして有するポリペプチドをＴ細胞エピトープポリペプチドとして用いれば、複数種の動物に対しても有効なＴ細胞エピトープポリペプチドとすることができる。
また、Ｂ細胞エピトープにおいても、複数のエピトープを重複させたり、タンデムに連結させたりして、複数種の抗体を同時に誘導させるようなポリペプチドを設計することも随意である。
Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチドとＢ細胞エピトープを含むポリペプチドを連結しないで別々に免疫しても、目的とする抗体の効率的な産生の増強は望めない。また、Ｂ細胞エピトープを含むポリペプチドとＴ細胞エピトープを含むポリペプチドとを連結したポリペプチドを用いて免疫した場合、目的とする抗体とともに、連結部分のアミノ酸配列部分を認識する抗体を同時に誘導することがある。そこで、本発明のポリペプチドにおいて、Ｔ細胞エピトープ配列とＢ細胞エピトープ配列の間に、プロテアーゼの認識配列となるアミノ酸配列からなるリンカーペプチドを挿入することにより、抗原提示におけるプロセシングのプロセスにより両ポリペプチドを酵素的な切断を受けて分離させ、連結部分のアミノ酸配列部分を認識する抗体の産生誘導が抑制されるようにデザインされている。よって、免疫原性に優れ、生体に防御効果を示すために十分な抗体の産生を増強し、免疫したペプチドに対する抗体ではなく、組み込まれたＢ細胞エピトープが由来する抗原性タンパク質に対する抗体産生を増強することが可能となる。
本発明で用いられる、Ｂ細胞エピトープを含むペプチドとＴ細胞エピトープと結合するためのリンカーペプチドは、抗原プロセッシングに関与するプロテアーゼの認識配列であれば何れでもよく、具体的には、リジン−リジン（ＫＫ）、リジン−アルギニン（ＫＲ）、アルギニン−アルギニン（ＲＲ）などジペプチドを挙げることができ、なかでも、カテプシンＢの認識配列であるリジン−リジンからなるジペプチドを使用することが望ましい。なお、Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープが重複して存在するポリペプチドを用いる場合には、そのポリペプチド同士をリンカーペプチドで連結することにより、それぞれを、Ｔ細胞エピトープ或いはＢ細胞エピトープとしての機能を発揮させることができる。
本発明で使用する細胞接着分子の細胞結合モチーフとしては、本発明のペプチドを粘膜表面に長期間保持することのできるものである限り本発明に利用することができる。例えば、インテグリンファミリーに対する結合モチーフをはじめとし、その他の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を用いることができる。例えば、インテグリン結合モチーフに属するアミノ酸配列としては、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、ヒト免疫不全ウイルス（以下、「ＨＩＶ」と略記する。）のＴａｔタンパク質等々の細胞接着分子上に存在する結合モチーフとして知られる、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ：配列表における配列番号２）、アルギニン−グルタミン酸−アスパラギン酸（ＲＥＤ：配列表における配列番号３）、ロイシン−アスパラギン酸−バリン（ＬＤＶ：配列表における配列番号４）、プロリン−ヒスチジン−セリン−アルギニン−アスパラギン（ＰＨＳＲＮ：配列表における配列番号５）、アルギニン−リジン−リジン（ＲＫＫ：配列表における配列番号６）、アスパラギン酸−グリシン−グルタミン酸−アラニン（ＤＧＥＡ：配列表における配列番号７）などのアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。また、インテグリンのファミリー以外の結合モチーフとしては、チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン（ＹＩＧＳＲ：配列表における配列番号８）、イソロイシン−リジン−バリン−アラニン−バリン（ＩＫＶＡＶ：配列表における配列番号９）、アルギニン−フェニルアラニン−チロシン−バリン−バリン−メチオニン−トリプトファン−リジン（ＲＦＹＶＶＭＷＫ：配列表における配列番号１０）、イソロイシン−アルギニン−バリン−バリン−メチオニン（ＩＲＶＶＭ：配列表における配列番号１１）などのアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。なかでも、ＲＧＤ、ＲＥＤ、ＹＩＧＳＲのアミノ酸配列からなるペプチドが、特異的な抗体産生の誘導能が強いことから望ましい。また、これら細胞結合モチーフのアミノ酸配列を有するペプチドの連結部位は、Ｔ細胞エピトープポリペプチドのアミノ末端側又はカルボキシル末端側、又は、Ｂ細胞エピトープポリペプチドのアミノ末端側又はカルボキシル末端側の合計４箇所から選択でき、そのうちすくなくとも１箇所に連結すればよい。とりわけ、Ｔ細胞エピトープポリペプチドのアミノ末端側又はカルボキシル末端側の片側又は両側に連結した本発明のポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープポリペプチドに特異的な抗体産生が特に増強されるので望ましい。
本発明のポリペプチドを製造するための方法に限定はなく、慣用のペプチド合成法によるか、或いは、慣用のペプチド合成法によりあらかじめ、部分的に合成したペプチド同士を結合して、調製することができる（例えば、社団法人日本生化学会編「新生化学実験講座」、第１巻、「タンパク質ＶＩ」、第３〜４４頁、１９９２年、東京化学同人発行参照。）。また当該ペプチドは、各メーカーから市販されているペプチドシンセサイザーを用いて装置のプロトコールに従って合成することができる。また、本発明のポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により調製することができる。例えば、設計したポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製し、これを自立増殖可能なベクターに挿入し、それを大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などの微生物、動植物やそれらの細胞又は組織等の宿主に導入して形質転換体としたり、トランスジェニック動植物を作製して、それらを培養、育成した後、本発明のポリペプチドを適宜の方法により、採取・精製することができる。また、本発明のポリペプチドを、Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープを連結するのに用いたプロセシング関連酵素切断部位となるアミノ酸配列以外から選ばれた適宜のタンパク質分解酵素の切断部位となるアミノ酸配列で連結して発現させた後、当該酵素で分解したものを使用することも自由である。さらには、本発明のポリペプチドを発現させた菌体、動物体或いは植物体をそのまま加工して、本発明のポリペプチドを含有する経口摂取用の組成物として使用することも随意である。また、本発明のポリペプチドは、前記の何れかの方法により、その全アミノ酸配列を有するポリペプチドを直接調製してもよく、或いは、予め、その一部アミノ酸配列を有するポリペプチドを合成したもの同士を、化学的に結合して調製することも随意である。
本発明のポリペプチドは、特異的な抗体産生の誘導のために、このまま単独で、或いは、同一のＢ細胞エピトープを有するポリペプチドを複数組み合わせて使用することができる。さらに、複数種の抗原に対する抗体を同時に産生させる場合には、個々の抗原に対応するＢ細胞エピトープを有するポリペプチドの２種以上を組み合わせて使用することも随意である。また、本発明の効果を妨げない限り、本発明のポリペプチドに、製剤学的に許容できる１種又は２種以上の製剤用添加剤を組み合わせた組成物を調製することも有利に実施できる。製剤用の添加剤としては、グルコース、マルトース、トレハロース、ショ糖などの還元性或いは非還元性の糖質、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコール、寒天、プルラン、グアガム、アラビアガムなどの水溶性高分子、ゼラチン、シルクなどのタンパク質やそれらの加水分解物、脂質、アミノ酸、緩衝剤、安定化剤、抗菌剤、香料、栄養機能食品、医薬部外品或いは医薬品の有効成分、ミョウバン、水酸化アルミニウムなどの免疫アジュバントなどが挙げられ、１種又は２種以上を適宜組み合わせて使用できる。また、本発明のポリペプチドを含有する製剤の形態としては、その製剤中のポリペプチドが長期間安定に保持されるものであれば特に制限はなく、溶液、凍結乾燥品、錠剤、舌下錠、トローチ、粉末、顆粒、クリーム、軟膏、シラップなどの剤形から、投与対象、投与方法、製剤の保存方法や輸送方法を考慮して適宜選択すればよい。また、本発明のポリペプチド又はそれを含有する組成物は、必要に応じて、リポソームに封入したり、皮膚、組織への浸透促進剤やイオン導入法などを併用することにより、抗原提示細胞の存在部位への浸透を促進させることも有利に実施できる。また、本発明のポリペプチドは、錠菓、飴、清涼飲料などの各種飲食品に含有せしめ、これを経口的に摂取することにより、ポリペプチドを経粘膜的に摂取させることも随意である。また、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを直接生体に投与したり、細胞にＤＮＡを導入するいわゆる遺伝子治療などにより、生体内において本発明のポリペプチドを発現させることもできる。
本発明のポリペプチドは、ヒト、イヌ、ネコ、マウスをはじめとする哺乳類、ニワトリ、アヒルをはじめとする鳥類、爬虫類、魚類とりわけ養殖魚類などの抗体産生を行う動物に対して、病原性のウイルス、微生物、細菌などの構成蛋白質やそれらが分泌する毒素に対する抗体を産生させることができる。したがって、ポツリヌス、大腸菌ＯＨ−１５７などの細菌に起因する食中毒、破傷風、ジフテリア、インフルエンザなどの感染性疾患の予防又は治療に有効である。また、アミロイドβペプチドに対する抗体を産生させることによるアルツハイマーの治療、ダニ、ハウスダスト、花粉、食物などに由来のするアレルゲンに対する特異的なＩｇＧ抗体を優位に産生させることによる各種アレルギー症やアトピー性皮膚炎などの経口減感作療法に有利に利用できる。また、本発明のポリペプチドは、口腔内、鼻腔、眼、咽喉、膣内、気管内、腹腔、胸腔、肺胞内、食道内、及び、胃や腸などの消化管内などへの経粘膜的な投与で粘膜におけるＩｇＡ抗体産生の誘導及び体液中へのＩｇＧ抗体産生の誘導が可能であり、皮下、皮内、筋肉内などの通常のワクチンの投与経路での投与、さらに、場合によっては、血管内投与も可能である。また、本発明のポリペプチドは、任意の蛋白質やポリペプチドに対する特異的な抗体の生産に利用できるだけでなく、単独では抗原性の低いオリゴペプチドやポリペプチドに対する抗体の生産に有利に用いることができる。したがって、合成オリゴペプチドを動物に免疫することによる抗血清やモノクローナル抗体産生を目的として、前記投与経路による動物での使用に加えて、試験管内での免疫担当細胞の感作に有利に使用することができる。
また、本発明のポリペプチドは、他の抗原あるいはそのポリペプチドにおけるＢ細胞エピトープが由来する抗原性タンパク質と同時に生体に投与することにより、同時に投与された抗原に対する抗体産生を誘導する免疫アジュバントとして使用することができる。その際の使用量は、同時に投与する他の抗原あるいはそのポリペプチドにおけるＢ細胞エピトープが由来する抗原に対する抗体産生を誘導できる量であれば特に制限はない。ただし、本発明のポリペプチドに対する抗体産生が誘導されることを望まない場合は、本発明のポリペプチドの投与量は、他の抗原の投与量の１０質量％以下、好ましくは１質量％以下、さらに好ましくは、０．１質量％以下のとすればよい。
本発明のポリペプチドのヒトを含む動物への投与方法には、特に制限はなく、このポリペフチドが、投与部位へ確実に到達できる方法であれば何れでよい。例えば、スポイトや注射器を使用して適量を粘膜上に滴下してもよく、経口摂取や、クリーム或いはジェル状にして粘膜に塗布したり、カテーテル等で投与部位に誘導してもよく、さらには、スプレーやネブライザーなどにより霧状にして吹き付けたり、鼻、気管或いは肺へ吸引させてもよい。皮下、皮内、筋肉内、血管内、腹腔内や胸腔内などの体腔内への投与には、注射器、カテーテル、点滴などの投与方法を使用することができる。本発明のポリペプチドの投与量は、抗体誘導能、疾患の種類、投与経路、投与方法、投与対象動物などを考慮して適宜決定すればよく、通常、０．００００１乃至１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０００１乃至２５ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．００１乃至１０ｍｇ体重である。
以下、実験例に基づいて本発明のポリペプチドについてより詳細に説明する。
実験例
生体の感染防御用のワクチンとして利用できるポリペプチドの開発を考慮して、う蝕症の病原体であるストレプトコッカス ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅＣ）の歯面付着因子の一つであるＰＡｃ（菌体表層タンパク質抗原）に対する抗体産生系をモデルに使用して、経粘膜的に投与して、効率的に誘導することのできる、ワクチンとしての機能を有するポリペプチドを調製するための実験を以下のようにして行った。また、実験には、ＰＡｃ中のアミノ酸配列であって、すでに、遺伝子クローニング、塩基配列、アミノ酸配列、生物活性部位、Ｂ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープの解析から、ＰＡｃ分子に交叉反応性を持ち、そのう蝕を阻害する活性を有する抗体のみを誘導できる最小単位のペプチド抗原であることが公知の配列表における配列番号１記載のアミノ酸アミノ酸配列のペプチド（以下、「ユニットペプチド」という。）を使用した（Ｈ．ＳＥＮＰＵＫＵら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６３：４６９５−４７０３（１９９５）参照）。なお、以下の実験で使用したポリペプチドは、全てペプチドシンセサイザー（アドバンスド・ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）社製造、Ｍｏｄｅｌ３５０ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いてＦｍｏｃ法にて合成し、ＴＳＫ−ＧＥＬカラム（カラムサイズ：直径１ｃｍ、長さ３０ｃｍ、東ソー株式会社製造）を使用した逆相ＨＰＬＣで精製した純度９５％以上の標品である。
実験例１：ユニットペプチドに対するマウスのＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの拘束性の解析
ＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプのみが異なる８種類のＢ１０コンジェニックマウス（日本ＳＬＣ株式会社販売、雌；５週令、一群；５匹）のそれぞれに前記ユニットペプチド（２００μｇ／マウス）をフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）と共に腹腔免疫し、２週間後に初回免疫と同条件で追加免疫した。その１週間後に採血し、その血清中のユニットペプチド及びＰＡｃに対する抗体価を、ユニットペプチド或いはＰＡｃをコート抗原として使用した、常法のＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果を表１に示す。なお、以下の実験における、各抗原に対する抗体価は、個々のマウスから採血した血液の血清を、それぞれ連続的に２倍希釈した標品中の抗体量を、ＥＬＩＳＡ法により、酵素標識抗体を使用して検出し、分析に使用したマイクロタイタープレートの各ウエルについて、マイクロタイタープレートリーダー（マルチスキャン バイクロマテック、ラボシステム社販売）により、４０５ｎｍの吸光度を測定して、その吸光度と、コート抗原を使用していない対照のウエルの吸光度を比較し、その差が０．１以上となる血清の最高希釈倍率を求め、平均して、抗体価として表した。また、コンジェニックマウスの種類の名称の後に、そのマウスのＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの型を括弧内に併記した。
表１から明らかなように、マウスのＭＨＣクラスＩＩ（Ｈ−２）のハプロタイプがｆ、ｄ、或いは、ｋ型のＢ１０．Ｍ、Ｂ１０．Ｄ２、Ｂ１０．ＢＲの３種のコンジェニックマウスでは、他のタイプＭＨＣクラスＩＩ（Ｈ−２）のハプロタイプのマウス比較して、ユニットペプチド及びＰＡｃに特異的な抗体の産生が強く誘導された（約１０倍以上）。このことから、このユニットペプチドには、Ｈ−２のクラスＩＩがｄ、ｆ、ｋ型の複数のハプロタイプのコンジェニックマウスにおいて、抗ＰＡｃ抗体を誘導するためのＢ細胞エピトープと、抗原提示に必要な、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプ（Ｈ−２ｄ，ｆ，ｋ型）の拘束を受ける複数のＴ細胞エピトープとが、共存していることが明らかになった。また、１３残基の短鎖ペプチドからなるユニットペプチド中に、ＭＨＣクラスＩＩ（Ｈ−２Ａ）の複数種のハプロタイプに同時に応答できる、マルチアグレトープ型のＴ細胞エピトープを有するペプチド抗原が存在することは、１種類の短いポリペプチドを使用しても、ＭＨＣクラスＩＩハプロタイプの異なる複数の個体に、効率的に抗体産生を誘導できるＴ細胞エピトープを有するポリペプチドを、人為的に設計できる可能性を示唆している。
実験例２：マウスにおけるマルチアグレトープ型Ｔ細胞エピトープの確認
実験例１でユニットペプチドに、マルチアグレトープ型のＴ細胞エピトープの存在が確認されたため、マウスにおけるマルチアグレトープ型Ｔ細胞エピトープとして機能するアミノ酸配列とその位置関係を確認するための実験を以下のようにして行った。ユニットペプチドのアミノ酸残基を順次バリンに置き換えたバリン置換ペプチドを合成し、それらを前述のユニットペプチド応答マウスに免疫することにより、抗体誘導に不可欠のアミノ酸残基をそれぞれ推定した。さらに、推定アグレトープに関与する全てのアミノ酸をバリンで同時に置換した位置限定バリン置換ペプチドをそれぞれ合成し、実験例１と同様の方法、スケジュールで、各コンジェニックマウスを免役し、実験例１と同様に、血清中の抗体価をＥＬＩＳＡを用いて測定し、その免疫による抗体誘導能の検討から、それぞれのＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに対応するユニットペプチド抗原上のアグレトープを決定した。その結果を表２にまとめて示す。なお、表２には、各々のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプで認識されるユニットペプチド上のアミノ酸のみを表記した。
表２から明らかなように、それぞれのＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプで認識されるために必要な４又は５個のアミノ酸残基（アグレトープ）が、何れでも、アミノ酸１３残基のユニットペプチド分子内に重複およびシフトして共存しており、ユニットペプチド内に、マルチアグレトープ型Ｔ細胞エピトープとして、各々のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプにより認識されるアミノ酸の位置関係が確認された。
実験例３：マルチアグレトープ型ペプチド抗原の人為的構築
前記ユニットペプチドのアミノ酸配列に手を加えることにより、人為的にＭＨＣクラスＩＩハプロタイプによる拘束に関するマウスの免疫応答を変化させることが可能か否か検討した。実験例２で決定したＢ１０．Ｄ２（ｄ）或いはＢ１０．Ｍ（ｆ）マウスにそれぞれ対応するアグレトープの一部が共存するユニットペプチド分子上の部位（配列表における配列番号１のアミノ酸配列を有するユニットペプチドのアミノ末端から１０〜１２番）のアミノ酸残基を意図的に他のアミノ酸残基と置換した、配列表における配列番号１２（以下、「ＹＱＴＥＬペプチド」という。）、配列番号１３（以下、「ＹＥＴＤＬペプチド」という。）、配列番号１４（以下、「ＹＥＴＡＬペプチド」という。）、また、配列番号１（以下、「ＹＥＡＤＬペプチド」という。）に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、ユニットペプチドのカルボキシル末端にリジン−グルタミン−チロシンをさらに結合した、配列表における配列番号１５（以下、「ＹＥＡＤＬＫＱＹペプチド」という。）に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、及び、ユニットペプチドのアミノ末端に、Ｂ１０．Ｓ（ｓ）マウスが認識するＴ細胞エピトープとして公知のＰＡｃのアミノ末端から３０５〜３１８のアミノ酸配列を有する配列表における配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、「ＰＡｃ（３０５〜３１８）」という。）を連結して、配列表における配列番号１７（以下、「ユニットペプチド−ＰＡｃ（３０５〜３１８）」という。）又は上記両ポリペプチドを逆順に連結した配列表における配列番号１８（以下、「ＰＡｃ（３０５〜３１８）−ユニットペプチド」という。）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを、それぞれ合成して、これらのポリペプチドを、実験例１と同様の、免疫方法、スケジュールで一連のＢ１０コンジェニックマウスに免疫し、追加免疫の２週間後に、各マウスから採血し、これから血清を分離後、生理食塩水で５１２倍に希釈して、実験例１と同様のＥＬＩＳＡ法で測定し、免疫に使用した各々のポリペプチドに対する各々のコンジェニックマウスにおける抗体産生の誘導程度を、４０５ｎｍの吸光度で比較した。その結果を表３に示す。また、ユニットペプチド−ＰＡｃ（３０５〜３１８）或いはＰＡｃ（３０５〜３１８）−ユニットペプチドで免疫したマウスの血清中のユニットペプチドに特異的な抗体量の測定結果を表４に示す。なお、吸光度が、０．１以上の場合には、希釈した血清中に、ユニットペプチドに対する抗体が存在すると判定した。
表３から明らかなように、ユニットペプチドのアミノ酸を意図的にデザインすることにより、ＹＱＴＥＬペプチドで免疫した場合には、Ｂ１０．ＢＲ（ｋ）１種類のみに抗体産生産生が誘導されたのに対して、ＹＥＡＤＬペプチド（ユニットペプチド）で免役した場合には、Ｂ１０．Ｓ（ｓ）及びＢ１０．ＳＭ（ｖ）を除く３種のマウスに同時に抗体の産生が誘導された。このことから、ペフチド中の１〜３個のアミノ酸の種類を変えることにより、異なるＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプを有する個体において、そのユニットペプチドに対する免疫応答性を変化させることができることが確認された。また、ＹＥＡＤＬＫＱＹペプチドのように、ユニットペプチドのカルボキシル末端にリジン−グルタミン−チロシンを附加することにより、ＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの型の異なる、Ｂ１０．Ｓ（ｓ）を除く４種類のマウスで抗体の産生が誘導された。さらに、表３及び表４から明らかなように、ＰＡｃ（３０５〜３１８）−ユニットペプチドのように、ユニットペプチドのアミノ末端に、このユニットペプチドに不応答マウスであるＢ１０．Ｓ（ｓ）が応答することが知られているＴ細胞エピトープであるＰＡｃ（３０５〜３１８）ペプチドを連結することによりｓ型を含む５種類のＭＨＣクラスＩＩ型を有する個体で、同時にユニットペプチドに対する抗体が誘導できるマルチアグレトープ型ペプチド抗原となることが確認された。これらのことから、抗原上の複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプによる拘束性に関与するアミノ酸配列の解析を行い、その結果に基づき、個々のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの拘束を受けるアミノ酸配列を重複させたアミノ酸配列を有するペプチドを人為的にデザインすることにより、抗原に対する抗体産生を効率的に誘導でき、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの拘束を同時に受けることができる重複型のマルチアグレトープ型Ｔ細胞エピトープの構築が可能であることが確認された。また、複数のＴ細胞エピトープをタンデムに結合することにより調製したクラスター型Ｔ細胞エピトープも、重複型エピトープと同様に、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの拘束を受ける個体に対する、抗体産生を効率よく誘導するＴ細胞エピトープとなることが確認された。また、表４から明らかなように、ＰＡｃ（３０５〜３１８）とユニットペプチドを連結したポリペプチドで免役したマウスにおける、ユニットペプチドに対する抗体の産生は、免疫に使用したポリペプチドのカルボキシル末端側にユニットペプチドを連結した場合の方が、アミノ末端側に連結したものよりも、抗体産生の増強が強い傾向が認められた。
実験例４：ヒト用マルチアグレトープ型ペプチド抗原の人為的構築
上記実験例３の結果に鑑み、ＭＨＣクラスＩＩハプロタイプの拘束に起因するヒトによる免疫原性の強弱の解決策として、公知のヒトのＭＨＣクラスＩＩハプロタイプ（ＨＬＡ−ＤＲ）拘束に対するＴ細胞エピトープの拘束モチーフ（アグレトープ配置）に基づき、配列表における配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する、複数のＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプの拘束に対して同時に応答可能な重複・シフト型のマルチアグレトープ型ペプチド（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ Ｍｕｌｔｉａｇｒｅｔｏｐｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ：以下の実験では、このペプチドを「ＯＭＰ」と略記する。）を構築した。なお、具体的なデータは示さないが、このポリペプチドは、マウスにおいても、Ｔ細胞のマルチアグレトープとしての機能を有することが確認された。なお、表５として、ヒトのＭＨＣクラスＩＩであるＨＬＡ−ＤＲの各々のハプロタイプにより認識されるＯＭＰ上のアミノ酸のみを示した。
実験例５：ポリペプチドの特異抗体産生の増強に及ぼすリンカーペプチドの影響
実験例３で調製した短鎖のユニットペプチドでは免疫原性が弱く、その免疫原性の増強のために、ポリペプチドをタンデムに連結することを検討したものの、このままでは、連結により生じた新たなエピトープに対する抗体産生も増強されることを考慮し、Ｂ細胞エピトープが正確に提示されることを目的として、Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチドとＢ細胞エピトープを含むポリペプチドの間に、抗原提示細胞で抗原のプロセッシングに関与するエンドソーム内プロテアーゼ（カテプシンＢ）の認識配列であるＫＫをリンカーペプチドとして挿入し、その抗体産生の増強に対する影響を確認する実験を以下のように行った。実験例４で調製したＯＭＰはマウスのＴ細胞エピトープのアミノ酸配列も含んでいることから、このＯＭＰと、Ｂ細胞エピトープを含むペプチドとなるユニットペプチドとの間に、ＫＫのアミノ酸を挿入した、配列表における配列番号２０（以下、「ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド」と略記する。）、及び、配列番号２１（以下、「ユニットペプチド−ＫＫ−ＯＭＰ」と略記する。）記載のアミノ酸配列からなる２種類のポリペプチドを合成し、実験例１と同様の方法により、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に免疫し、実験例１と同様に、ＥＬＩＳＡにより、その血清中の、ＯＭＰ、免役したポリペプチド、及び、ＰＡｃに対する抗体価を測定した。その結果を表６に示す。
表６から明らかなように、リンカーペプチドのＫＫを挟んでＴ細胞エピトープであるＯＭＰをポリペプチドのアミノ末端側に、Ｂ細胞エピトープであるユニットペプチドをカルボキシル末端側に位置させることにより、効率の良い抗体の誘導が認められた。また、この傾向は、実験例３でもマウスの系統にかかわらず同様であり、とりわけ、ユニットペプチドのアミノ酸配列にはＴ細胞エピトープが存在せず、ＰＡｃ（３０５〜３１８）のアミノ酸配列にのみにＴ細胞エピトープが存在するＢ１０．Ｓ（ｓ）においては顕著であった（表４参照）。以上から、リンカーペプチドを挟んでアミノ末側のペプチドがＴ細胞エピトープとして、またカルボキシル末側のペプチドがＢ細胞エピトープとしてより効果的に認識されることが明らかとなった。
実験例６：細胞接着分子の細胞結合モチーフ附加によるペプチド抗原の鼻腔免疫における免疫原性の増強
配列表における配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドは抗う蝕活性を有する抗体を産生誘導することができるが、この２分子をリジン−リジンからなるリンカーで連結したポリペプチド（配列表における配列番号２２：ユニットペプチド−ＫＫ−ユニットペプチド、以下、「ジユニットペプチド」という。）は、注射（皮下或いは腹腔）による免疫においては、より効果的に抗体産生誘導が可能であり、免疫アジュバントを必要しない。しかしながら、経鼻免疫においては十分な抗体誘導能を示さないので、免疫アジュバントの同時投与が必要である。そこで、経鼻免疫における抗原性を増強することを目的として、ジユニットペプチドを粘膜面に長く留めるために、インテグリンファミリー等を介しての細胞接着性が証明されているタンパク質（フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン等）のインテグリン結合モチーフや他の細胞接着モチーフのアミノ酸配列を当該ペプチドに附加することによる免疫原性に対する影響を確認するための実験を以下のように行った。すなわち、前記ジユニットペプチドの、アミノ末端側に、細胞接着アミノ酸配列としてＲＧＤ、ＲＥＤ、ＬＤＶ、ＰＨＳＲＮ、ＲＫＫ、ＤＧＥＡ及びＹＩＧＳＲ、ＩＫＶＡＶ、ＩＲＶＶＭ、及びＲＦＹＶＶＭＷＫから選ばれる何れか１種又は２種を連結したポリペプチドを合成した。また、対照として、ジユニットペプチドのみ、及び、このポリペプチドに、単独では細胞接着能が無いとされているカドヘリン関連の配列表における配列番号２３（以下、「ＤＲＥ」と略記する。）、配列番号２４（以下、「ＤＥＤ」と略記する。）配列番号２５（以下、「ＨＡＶ」と略記する。）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを連結したポリペプチドを合成した。一群５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ株式会社、雌、５週令）に、リン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」と略記する。）または蒸留水に５０μｇ／４μｌの濃度で無菌的に溶解した各種ポリペプチド溶液を、片鼻２μｌ、計４μｌ（５０μｇ／個体／回）、鼻腔から滴下により吸入させた。なお、さらに、陰性対照として、ジユニットペプチドのみを経鼻投与した群、及び、陽性対照として、ジユニットペプチドと共にＣＴ１μｇを投与した群を設定した。また、ユニットペプチド−ＫＫ−ユニットペプチド及びこれにＲＧＤを連結したポリペプチドは、腹腔内投与も行った。初回免疫の２週間後に、追加免疫として、各々初回と同種類、同量のポリペプチドを同条件下に経鼻的に投与した。さらに、その２週間後に、各々前回と同一種類、同一量のポリペプチドを同条件下で投与し、その一週後、マウスの血清中の、ＰＡｃ、ジユニットペプチド、ＣＴ、ジユニットペプチドに細胞接着アミノ酸配列を附加したポリペプチドの各々に対する抗体価を、実験例１と同様のＥＬＩＳＡ法によりそれぞれ測定した。また、ＲＧＤ或いＹＩＧＳＲを附加したポリペプチドについては、これらのペプチドが、抗体産生の増強に関与していることを確認するために、その阻害剤として知られている、ＲＧＤＳ（配列表における配列番号２６）或いはＹＩＧＳＲ（配列表における配列番号８）の過剰量を同時に添加して、同様に免疫を行った。その結果を表７に示す。なお、ＲＧＤ、ＲＥＤ、ＬＤＶ、ＰＨＳＲＮ、ＲＫＫ、ＤＧＥＡ及びＹＩＧＳＲ、ＩＫＶＡＶ、ＩＲＶＶＭ、及びＲＦＹＶＶＭＷＫから選ばれる何れか１種又は２種以上を附加したジユニットペプチドで免疫したマウスでは、何れも、ユニットペプチドに対する抗体の産生が増強され、ＤＲＥ、ＤＥＤ、或いは、ＨＡＶ附加したジユニットペプチドで免疫したマウスでは何れも、ユニットペプチドに対する抗体の産生が増強されなかったので、表７では、ジユニットペプチド、配列表における配列番号２７（以下、「ＲＧＤ−ジユニットペプチド」という。）、配列番号２８（以下、「ＲＥＤ−ジユニットペプチド」という。）、配列番号２９（以下、「ＹＩＧＳＲ−ジユニットペプチド」という。）、配列番号３０（以下、「ＤＥＤ−ジユニットペプチド」という。）、配列番号３１（以下、「ＨＡＶ−ジユニットペプチド」という。）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドで免疫した結果のみを示す。
表７から明らかなように、ジユニットペプチドを単独で経鼻投与したのでは、ほとんどユニットペプチドに対する抗体産生の誘導が認められないのに対して、インテグリン結合モチーフのＲＧＤ、ＲＥＤ、或いは、ラミニン結合タンパク質に対するラミニン分子上の結合モチーフのＹＩＧＳＲを附加したＲＧＤ−ジユニットペプチド、ＲＥＤ−ジユニットペプチド、或いは、ＹＩＧＳＲ−ジユニットペプチドを経鼻投与した場合には、抗体産生の増強効果が認められた。なお、その際に、インテグリンへの結合阻害剤であるＲＧＤＳやＹＩＧＳＲの短鎖ペプチドを過剰量共存させた場合には、ＰＡｃに特異的な抗体の産生が抑制された。この結果は、ＲＧＤやＹＩＧＳＲなどの細胞接着分子のモチーフの附加が、ポリペプチドのもつ抗体産生の誘導能をさらに増強する効果があること、その効果は、ジユニットペプチドが粘膜細胞膜に存在するインテグリンに結合することにより発揮することが示唆された。
実験例７：経粘膜投与ペプチドワクチンの抗体産生増強に対する細胞接着分子の影響
実験例６のジユニットペプチドで証明されたインテグリン結合モチーフの附加の及ぼす、他のペプチド抗原による抗体産生の増強への影響、及び、インテグリン結合モチーフの附加部位の違いによる抗体産生増強への影響を調べる実験を、以下のように行った。実験例５でＰＡｃに対する特異抗体の産生増強能の高いことが確認された、ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチドのＯＭＰ、或いは、ユニットペプチドのアミノ末端側又はカルボキシル末端側に、実験例６で、ポリペフチドの抗体産生の誘導の増強作用が示唆された細胞接着分子のインテグリン結合モチーフとして知られているＲＧＤを、挿入して、「ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド」（配列表における配列番号３２）、「ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド」（配列表における配列番号３３）、「ＯＭＰ−ＫＫ−ＲＧＤ−ユニットペプチド」（配列表における配列番号３４）、「ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド−ＲＧＤ」（配列表における配列番号３５）という配列を有する合計４種類のポリペプチドを合成した。なお、陽性対照として、経粘膜投与でアジュバント活性を有することが既に知られているＣＴを使用した。これらのポリペプチド或いはポリペプチドとＣＴの混合液を使用して、実験例６と同じ方法により、Ｂ１０マウスを免疫して、その抗体産生の増強を誘導する効果の有無を判定した。その結果を表８に示す。
表８から明らかなように、ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチドにＲＧＤを挿入するとＰＡｃに対する抗体産生が強く増強された。特に、ＲＧＤをＯＭＰのアミノ末端側或いはカルボキシル末端側に挿入した場合に、言い換えれば、リンカーを挟んでＮ末端側に挿入した場合に、目的とする抗体の産生量はアジュバントとしてＣＴを用いた場合よりも顕著に強く増強され、かつ、誘導される抗体のほとんどがＰＡｃと反応する抗体であることが確認された。一方、リンカーを挟んでＣ末端側に挿入した場合、誘導される抗体の多くは、ＲＤＧ配列を含むペプチド部分由来と反応する抗体であることが確認された。
これらのことから、アジュバント非存在下における経鼻免疫においてもリンカーを挟んでアミノ末側のペプチドがＴ細胞エピトープとして、またカルボキシル末側のペプチドがＢ細胞エピトープとしてより効果的に認識され、目的とするＢ細胞エピトープに特異的な抗体産生を効率的に増強し、しかも、リンカーを挟んでアミノ末端側にＲＧＤ配列を附加することにより、産生される抗体のほとんどをＰＡｃのみと反応する抗体とすることができることが明かとなった。
実験例８：経粘膜投与ペプチドワクチンの基本デザインの普遍性
実験例７で調製したＲＧＤ−Ｔ細胞エピトープ−ＫＫ−Ｂ細胞エピトープで構成されたポリペプチドのＴ細胞エピトープとＢ細胞エピトープの何れか一方を、ＯＭＰ或いはユニットペプチド以外のポリペプチドで置き換えた場合の、Ｂ細胞エピトープに対する抗体産生の増強への影響を調べる実験を以下のように行った。Ｔ細胞エピトープとして、種を問わず幅広いＭＨＣクラスＩＩハプロタイプの拘束性がすでに報告されている、配列表における配列番号３６記載のＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ１２０由来のマルチアグレトープ型Ｔ細胞エピトープであるＴ１ペプチド（ジェイ・ディー・アーラーズ（Ａｈｌｅｒｓ Ｊ．Ｄ．）著、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエスエイ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ）、第９４巻、第２０号、１０８５６乃至１０８６１頁（１９９７年）参照。）（以下、「Ｔ１」と略記する。）を使用し、Ｂ細胞エピトープとしてＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と略記する。）に対する抗体を誘導することが知られている、配列表における配列番号３７記載のアミノ酸配列からなるＯＶＡ由来の１４残基のペプチド（以下、「ＯＶＡｐ」と略記する）（ディー・エフ・ハント（Ｈｕｎｔ Ｄ．Ｆ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５６巻、１８１７乃至１８２０頁（１９９２年）参照。）を使用して、「ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ」（配列表における配列番号３８）、或いは、「Ｔ１−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド」（配列表における配列番号３９）からなるポリペプチドを合成した。また、対照として、「ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ」（配列表における配列番号４０）又は「Ｔ１−ＫＫ−ユニットペプチド」（配列表における配列番号４１）を用意した。これらのポリペプチドを、各々、実験例６と同様の方法で、ＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔免疫を行った。その結果を表９に示す。
表９から明らかなように、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ、或いは、Ｔ１−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチドからなるポリペプチドを経鼻免疫したマウスでは、ＯＶＡ或いはＰＡｃ特異的な抗体の産生が増強された。すなわち、ＲＧＤを附加したポリペプチドで免疫した場合には、ＲＧＤを附加していないポリペプチドで免役した場合よりも強い抗体産生の増強が認められた。
実験例９：本発明のポリペプチドによる他の抗原の抗体産生増強効果
通常、アジュバントとして用いるＣＴは抗原性が強く、経鼻的に投与すると、ＣＴに対する抗体が誘導されるだけでなく、ＣＴと同時に経粘膜投与した、ＣＴ以外の抗原に対する抗体産生を増強することが知られている。一方、実験例７及び実験例８から明らかなように、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ或いはＴ１−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチドからなる本発明のポリペプチドは、ＣＴを免疫アジュバントとして用いなくても、それらの単独の経鼻投与で、それぞれのポリペプチドに特異的な抗体の産生が誘導された。さらに、本発明のポリペプチドが、他の抗原に対して抗体産生増強作用を示すかどうかの確認のための実験を以下のように行った。
＜牛血清アルブミンの経鼻投与に及ぼす各種ポリペプチド影響＞
牛血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と略記する。）４μｇと、ジユニットペプチド１μｇ、ＲＧＤ−ユニットペプチド−ＫＫ−ユニットペプチド１μｇ、ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド１μｇ、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド１μｇ、ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ１μｇ、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ１μｇ或いはＣＴ２μｇの何れかを混合した生理食塩水溶液を調製し、各々、実験例６と同様の方法で、ＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔免疫を行い、血中の抗体価を測定した。その結果を表１０に示す。なお、測定は、ＢＳＡ、ＢＳＡと共に投与したペプチド、及び、ＣＴに対する抗体について行った。
＜卵白アルブミンの経鼻投与に及ぼす各種ポリペプチド影響
ＯＶＡ４μｇとＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド１μｇ、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ＯＶＡｐ１μｇ或いはＣＴ２μｇの何れか１種を混合した生理食塩水溶液を調製し、各々、実験例６と同様の方法で、Ｂ１０．Ｄ２マウス或いはＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔免疫を行い、血中の抗体価を測定した。その結果を表１０に示す。なお、測定は、ＯＶＡ、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ＯＶＡｐ、及び、ＣＴに対する抗体について行った。
表１０から明らかなように、ＢＳＡ或いはＯＶＡを単独で経鼻投与しても、血液中には、これらのポリペプチドに対する抗体はほとんど誘導されなかった。これに対して、ＢＳＡ又はＯＶＡと、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ又はＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐの何れか１種とを同時に投与したマウスでは、ＢＳＡ或いはＯＶＡに対する強い抗体の産生が誘導された。また、ＢＳＡとＲＧＤ−ユニットペプチド−ＫＫ−ユニットペプチド又はＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチドとを同時に投与した場合にも、ＢＳＡ又はＯＶＡに対する抗体の産生が誘導されるものの、増強の程度は、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ又はＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐと同時に投与した場合よりも低かった。ＢＳＡ又はＯＶＡと、ＣＴとを投与しした場合にも、ＢＳＡ又はＯＶＡと、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ又はＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐの何れか１種を同時に投与した場合と同程度の抗体産生が認められた。しかしながら、実験に使用した１μｇのＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ或いはＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐの何れかを同時に投与した場合には、これらのペプチドに対する抗体の産生は、わずかであったのに対して、２μｇコレラトキシンを同時に投与した場合には、ＣＴに対する抗体も強く誘導された。これらのことから、ＯＭＰ−ＲＧＤ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ或いはＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐは、自己に対する抗体産生を誘導する量以下の量、あるいは、少量の自己抗体を誘導する量を、他の抗原と同時経鼻投与することにより、同時に投与した自己以外の抗原の抗体産生を誘導する免疫アジュバントとして使用できることが確認された。
以上の実験結果から、種々のＴ細胞エピトープと種々のＢ細胞エピトープを組み併せて、その間にＫＫなどのプロテアーゼの認識配列をリンカーペプチドとして挿入し、さらに、このペフチドに細胞接着分子のモチーフを附加したポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープ或いはそれを含む抗原に対する抗体の産生を増強することのできることが明らかとなった。また、これらのポリペプチドは、経鼻のような経粘膜投与でも免疫アジュバントを併用することなしに、投与したポリペプチドの中のＢ細胞エピトープに対する抗体を、効率よく誘導でき、しかも、それ以外の部位に対する不要な抗体の産生がほとんどないため、特異的な抗体産生の誘導剤、或いは、抗体産生の増強剤として使用できることが確認された。また、これらのポリペプチドを投与された生体では、免疫に使用したＢ細胞エピトープが由来する抗原性タンパク質を認識する抗体が効率よく産生されることから、本発明のポリペプチドは、経鼻免疫をはじめとする経粘膜免疫において、免疫アジュバントを必要とせずに、目的とする感染防御抗体や毒素、酵素類の活性の中和抗体やアレルゲンに対する抗体などの種々の抗原に対す抗体の誘導が可能であることを示しており、しかも、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束された個体に、抗体産生を効率的に誘導できることから、感染防御などの目的で使用する、経鼻粘膜免疫用ペプチドワクチンとして使用できることが示された。また、これらポリペプチドは、他の抗原と同時に粘膜免疫されたとき、免疫アジュバントとして機能することも明かとなった。
以下に、実施例で、本発明のポリペプチドについて具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１：ＰＡｃに対する抗体の産生の増強用の組成物
実験例７の方法に準じて調製した、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド及びＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド−ＲＧＤの何れか１種を１００μｇ／ｍｌとα，α−トレハロース（試薬級 株式会社林原生物化学研究所販売）を４０％となるように、蒸留水に溶解し、常法により滅菌してシラップ剤を得た。これを滅菌バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、密閉して、ポリペプチド含有シラップ剤を調製した。本品は、安定性に優れ、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されるため、多くのヒトや動物で、経鼻、或いは、経口的に投与することにより、う蝕予防活性を有する抗体産生を効率的に増強するワクチン効果を発揮することができる。また、本品は、経粘膜や経皮などの投与により、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとしても有利に利用できる。
実施例２：ＰＡｃに対する抗体の産生の増強用の組成物
安定剤として、１％（ｗ／ｖ）のショ糖を含む生理食塩水に、実験例７の方法に準じて調製したＲＧＤ−Ｔ１−ＫＫ−ユニットペプチドを、各々１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ又は、１，０００μｇ／ｍｌとなるように溶解し、ろ過滅菌した。これを滅菌バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、常法により、凍結乾燥して、密閉し、ポリペプチド含有製剤を調製した。本品は、安定性に優れた、う蝕予防効果に優れた、経粘膜摂取或いは注射用の製剤である。本品は、何れも、注射用蒸留水１ｍｌに完全に溶解して使用する。また、本品は、何れも、安定性に優れ、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されるため、多くのヒトや動物で、経鼻、或いは、経口的に投与することにより、う蝕予防活性を有する抗体産生を効率的に増強するワクチン効果を発揮することができる。また、本品は、経粘膜や経皮などの投与により、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとしても有利に利用できる。
実施例３：ポリペプチド含有組成物の毒性試験
実施例１或いは、実施例２で調製したポリペプチドを１２．５ｍｇ／ｍｌとなるように、０．５％のショ糖を含有する生理食塩水で希釈し、これを、生後５週令のＤＤＹ系の雄マウスに、常法により経口、腹腔内又は、筋肉内に投与して、ＬＤ５０を検討した。これらの標品は何れも、ＬＤ５０がポリペプチド質量に換算して１００ｍｇ／ｋｇマウス体重以上であり、このことは、本発明のポリペプチドが、ヒトや動物に投与しても、毒性のない、安全な製剤であることを示している。
実施例４：ＨＩＶに対する抗体産生の増強用の組成物
Ｔ細胞エピトープとしてＯＭＰ、Ｔ１、ＨＬＡ−ＤＲ１、２、３、４、５、６、７、８、９、５１、５２、５３に結合することが報告されている、配列表における配列番号４２記載のＨＩＶ−１由来のｇａｇ２９８−３１２ペプチドと相同のアミノ酸配列を有するペプチド、又は、配列表における配列番号４３記載のＨＩＶ−１由来のｐｏｌ５９６−６１０（シー・シー・ウイルソン（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．）著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７５，４１９５−４２０７（２００１）参照。）と相同のアミノ酸配列を有するペプチドから選ばれる何れか１つを用い、ＲＧＤをそのアミノ又はカルボキシル末端に配し、ＫＫからなるリンカーペプチドをはさんでカルボキシル末端側にＨＩＶ中和抗体を誘導するためのＢ細胞エピトープとして、配列表における配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるＨＩＶのｇｐ１２０蛋白のＶ３のｌｏｏｐペプチドと相同のペプチド（ビー・エフ・ヘイネス著（Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．）、ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第１５１巻、１６４６乃至１６５３頁、（１９９３年））を配したポリペプチドを調製した。これらのペプチドから選ばれる何れか１種又は２種を各々１５０μｇ／ｍｌとマンニトール１００ｍｇ／ｍｌ含有する生理食塩水溶液を調製した。これらを、５ｍｌ容のバイアル瓶に１ｍｌ／バイアルとなるように分注し、常法により凍結乾燥した。本品は、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されているため、ヒトに経粘膜や経皮などの投与により、多くのヒトでＨＩＶに特異的な抗体の産生を効率よく増強することができることから、ＨＩＶ感染の広がり、或いは、ＨＩＶ感染者の発症を遅延させるワクチンの目的で有利に使用できる。また、本品は、経粘膜投与などにより、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとしても有利に利用できる。
実施例５：インフルエンザウイルスに対する抗体の産生増強用の組成物
Ｔ細胞エピトープとしてＯＭＰ、Ｔ１、配列表における配列番号４２及び配列番号４３記載のアミノ酸配列を有するペプチドから選ばれる何れか１つを用い、ＲＧＤ或いはＹＩＧＳＲをそのアミノ又はカルボキシル末端に配し、ＫＫリンカーペプチドをはさんでカルボキシル末端側にインフルエンザウイルスの中和抗体を誘導するためのＢ細胞エピトープとして、配列表の配列番号４５記載のインフルエンザウイルスのヘムアグルチニン（ＨＡ）蛋白アミノ末端からの９１〜１０８番目のアミノ酸配列と相同のアミノ酸配列を有するペプチド（ティー・ベン−イエディディア著（Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ，Ｔ．）、モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第３９巻，３２３乃至３３１頁、（２００２年））を配したペプチドワクチンを、常法により合成した。これらのポリペプチドから選ばれる何れか１種又は２種を各々７５μｇ／ｍｌとヒトアルブミン０．５ｍｇ／ｍｌ含有する生理食塩水溶液を調製した。これらを、５ｍｌ容のバイアル瓶に１ｍｌ／バイアルとなるように分注し、常法により凍結乾燥した。本品は、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されるため、多くのヒトや動物で、経粘膜や経皮などで投与することにより、インフルエンザウイルスに特異的な抗体の産生を効率よく増強することができるワクチン効果を有することから、インフルエンザウイルスの感染を防御することができる。また、本品は、経粘膜投与などにより、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとしても有利に利用できる。
実施例６：パピローマウイルスワクチン
Ｔ細胞エピトープとしてＯＭＰ、Ｔ１、配列表における配列番号４２及び配列番号４３記載のアミノ酸配列を有するペプチドから選ばれる何れか１つを用い、ＲＧＤをそのアミノ末端又はカルボキシル末端に配し、ＫＫリンカーペプチドをはさんでカルボキシル末端側にヒトパピローマウイルスの中和抗体を誘導するためのＢ細胞エピトープとして、配列表における配列番号４６記載のＬ２：蛋自由来の部分アミノ酸配列と相同のアミノ酸配列を有するペプチド（ケイ・カワナ（Ｋａｗａｎａ，Ｋ．）著、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）、第１９巻、１４９６乃至１５０２頁、（２００１年））を配したポリペプチドワクチンを調製した。これらのペプチドから選ばれる何れか１種又は２種を各々２００μｇ／ｍｌとゼラチンを０．２５ｍｇ／ｍｌ含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を調製した。これらを、５ｍｌ容のバイアル瓶に０．５ｍｌ／バイアルとなるように分注し、常法により凍結乾燥した。本品は、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されるため、ヒトに経粘膜や経皮などの投与により、多くのヒトでパヒローマウイルスに特異的な抗体の産生を効率よく増強することができることから、ヒトパピローマウイルスの感染を防御できる。また、本品は、経鼻投与などの経粘膜により、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとしても有利に利用できる。
実施例７：ＯＶＡ抗体産生用組成物
実験例８の方法で調製した、ＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐのアミノ酸配列を有するポリペプチドを１００μｇ／ｍｌとα，α−トレハロース（試薬級、株式会社林原生物化学研究所販売）を４０％となるように、蒸留水に溶解し、常法により滅菌してシラップ状物を得た。これを滅菌バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、密閉して、ペプチドワクチン含有シラップを調製した。本品は、安定性に優れ、動物に、経鼻、或いは、経口的、経皮的などに投与することにより、ＯＶＡに対する抗体を効率的に増強することができる。また、本品は、経鼻投与などにより、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとしても有利に利用できる。
実施例８：インフルエンザワクチンの抗体産生増強用の組成物
生理食塩水１ｍｌあたり、市販のインフルエンザＨＡワクチン（藤沢薬品工業株式会社販売）４μｇあるいはＨＡやＭ蛋白質などのウイルス表層抗原性タンパク質とＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ又はＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチド１μｇとを含有する標品を調製した。これを、滅菌バイアル瓶に０．５ｍｌずつ分注し、密閉した。本品は、ウイルス表層抗原性タンパク質とＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ＯＶＡｐ又はＲＧＤ−ＯＭＰ−ＫＫ−ユニットペプチドのもつ免疫アジュバント作用により、そのままでは、経粘膜投与しても抗体産生を誘導することのできないインフルエンザワクチンの経鼻などの経粘膜投与による抗体産生を増強するので、本品を、２週おきに３回ないし４回鼻腔に投与することにより、インフルエンザの感染を防御する抗体の産生を増強することができるワクチンとして使用することができる。
実施例９：スギ花粉症経口減感作治療用組成物
Ｔ細胞エピトープとしてＯＭＰ、Ｔ１、配列表における配列番号４２及び配列番号４３記載のアミノ酸配列を有するペプチドから選ばれる何れか１つを用い、ＲＧＤをそのアミノ末端又はカルボキシル末端に配し、ＫＫリンカーペプチドをはさんでカルボキシル末端側にスギ花粉アレルゲン抗体を誘導するためのＢ細胞エピトープとして、Ｃｒｙｊ１のＢ細胞エピトープであるＶＨＰＱＤＧＤＡ（ワイ・タムラ（Ｔａｍｕｒａ，Ｙ．）著、インターナショナル・アーカイブズ・オブ・アレルギー・アンド・イムノロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第１２３巻、第３号、２２８乃至２３５頁、（２００１年））及びＣｒｙｊ２のＢ細胞エピトープであるＫＷＶＮＧＲＥＩ（ワイ・タムラ（Ｔａｍｕｒａ，Ｙ．）著、クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・アレルギー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ）、第３３巻、第２号、２１１乃至２１７頁、（２００３年））をＫＫで連結した配列表における配列番号４７記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを配し、これらのペプチドから選ばれる何れかを各々２００μｇ／ｍｌとゼラチンを０．２５ｍｇ／ｍｌ含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を調製し、スギ花粉症減感作治療用の組成物を得た。本品は、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されるため、ヒトに経粘膜や経皮などの投与により、多くのヒトで粘膜投与により、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ１及びＣｒｙｊ２に特異的なＩｇＧ抗体を優位に産生することから、経口投与によるスギ花粉症経口減感作治療薬として有用である。
【産業上の利用可能性】
以上説明したとおり、本発明は、特定の抗原ペプチドを含み、目的とする抗原エピトープに対する特異的な抗体の産生を、免疫アジュバント非存在下においても特異的に増強するポリペプチド及そのポリペプチドを含有する組成物に関するものである。しかも、本発明のポリペプチドは、免疫アジュバントを用いる必要もなく、また、経鼻投与や経口投与などの経粘膜投与で使用できることから、注射による経皮投与などに比して、簡易かつ安全な、広範なＭＨＣクラスＩＩのハプロタイプに拘束されるため、多くのヒトを含む哺乳動物や鳥類、爬虫類、魚類などの抗体産生を行う動物用のワクチン或いは特異抗体産生の増強用の抗原として使用することができる。また、本発明のポリペプチドは、これとともに投与した、他の抗原の抗体産生を増強する免疫アジュバントとして使用することもできる。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端側にＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、リンカーペプチドをはさんで、そのカルボキシ末端側にＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチド内に、１種又は２種以上の細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を１種又は２種以上有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
リンカーペプチドが、リジン−リジン、リジン−アルギニン及びアルギニン−アルギニンからなるジペプチドから選ばれる１種又は２種以上で構成されていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
【請求項３】
細胞接着分子の細胞結合モチーフが、配列表における配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１記載のアミノ酸配列を有するペプチドから選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載のポリペプチド。
【請求項４】
細胞接着分子の細胞結合モチーフが、インテグリンファミリー結合モチーフから選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｔ細胞エピトープが、マルチアグレトープ型であることを特徴とする請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４項記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｂ細胞エピトープが、疾患の原因となる抗原性タンパク質由来であることを特徴とする請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項又は第５項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
疾患の原因となる抗原性タンパク質がストレプトコカス・ミュータンス セロタイプＣ菌の表層蛋白質抗原、ＨＩＶタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、パピローマウイルスタンパク質、オブアルブミン及びスギ花粉抗原から選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求の範囲第６項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項又は第７項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ。
【請求項９】
請求の範囲第８項に記載のＤＮＡを導入した微生物又は動植物。
【請求項１０】
請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項又は第７項に記載のポリペプチド及び製剤学的に許容しうる製剤用添加剤を１種又は２種以上含有することを特徴とする組成物。
【請求項１１】
さらに抗原性タンパク質を含有することを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項又は第７項に記載のポリペプチド、請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ又はＲＮＡ、請求の範囲第９項に記載の動植物又は微生物、又は請求の範囲第１０項又は第１１項に記載の組成物を生体に投与又は摂取することによる抗体産生方法。
【請求項１３】
経粘膜投与又は摂取による請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１４】
疾患の予防又は治療のために行なわれる請求の範囲第１２項又は第１３項記載の方法。
【請求項１５】
請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項又は第７項に記載のポリペプチドを免疫アジュバントとして用いることを特徴とする抗原性タンパク質に対する抗体産生を増強する方法。
【請求項１】
アミノ末端側にＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、リンカーペプチドをはさんで、そのカルボキシ末端側にＢ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチド内に、１種又は２種以上の細胞接着分子の細胞結合モチーフのアミノ酸配列を１種又は２種以上有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
リンカーペプチドが、リジン−リジン、リジン−アルギニン及びアルギニン−アルギニンからなるジペプチドから選ばれる１種又は２種以上で構成されていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
【請求項３】
細胞接着分子の細胞結合モチーフが、配列表における配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１記載のアミノ酸配列を有するペプチドから選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載のポリペプチド。
【請求項４】
細胞接着分子の細胞結合モチーフが、インテグリンファミリー結合モチーフから選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｔ細胞エピトープが、マルチアグレトープ型であることを特徴とする請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４項記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｂ細胞エピトープが、疾患の原因となる抗原性タンパク質由来であることを特徴とする請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項又は第５項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
疾患の原因となる抗原性タンパク質がストレプトコカス・ミュータンス セロタイプＣ菌の表層蛋白質抗原、ＨＩＶタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、パピローマウイルスタンパク質、オブアルブミン及びスギ花粉抗原から選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求の範囲第６項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項又は第７項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ。
【請求項９】
請求の範囲第８項に記載のＤＮＡを導入した微生物又は動植物。
【請求項１０】
請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項又は第７項に記載のポリペプチド及び製剤学的に許容しうる製剤用添加剤を１種又は２種以上含有することを特徴とする組成物。
【請求項１１】
さらに抗原性タンパク質を含有することを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項又は第７項に記載のポリペプチド、請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ又はＲＮＡ、請求の範囲第９項に記載の動植物又は微生物、又は請求の範囲第１０項又は第１１項に記載の組成物を生体に投与又は摂取することによる抗体産生方法。
【請求項１３】
経粘膜投与又は摂取による請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１４】
疾患の予防又は治療のために行なわれる請求の範囲第１２項又は第１３項記載の方法。
【請求項１５】
請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項又は第７項に記載のポリペプチドを免疫アジュバントとして用いることを特徴とする抗原性タンパク質に対する抗体産生を増強する方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７７６７
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【発行日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４２３０（Ｐ２００５−５０４２３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４４６０
【国際出願日】平成１６年３月２９日（２００４．３．２９）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【発行日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４４６０
【国際出願日】平成１６年３月２９日（２００４．３．２９）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
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