マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡ、これを含む組成物、及びその使用及び評価方法
本発明は、マイクロＲＮＡ（microRNA）の活性や機能を抑制できるペプチド核酸（ＰＮＡ）、これを含む、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するための組成物、これを利用してマイクロＲＮＡの活性や機能を抑制する方法、及びその効果を評価する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡ（microRNA antisense PNA）、これを含む組成物、及びその使用及び評価方法に関し、より詳細には、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）と知られたマイクロＲＮＡの活性や機能を抑制することができるマイクロＲＮＡに対するアンチセンスＰＮＡ、これを含む、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するための組成物、これを利用してマイクロＲＮＡの活性や機能を抑制する方法、及びその効果を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９９３年Caenorhabditis elegansで発生時期を調節する一部遺伝子が明かされたが、これらの中、ｌｅｔ−７とｌｉｎ−４は、蛋白質を生産しない小さいＲＮＡ片（non-coding RNA）であることが明かされた。これらＲＮＡは、特定発生段階で発現されて発生を調節するといって、ｓｔＲＮＡ（small temporal RNA）と呼ばれた。マイクロＲＮＡは、２１−２５ヌクレオチドの単一鎖（single-stranded）ＲＮＡ分子であって、真核生物の遺伝子発現を制御し、特定遺伝子のｍＲＮＡ ３’ ＵＴＲ（untranslated region）に結合して、遺伝子の翻訳過程を抑制すると知られている。実質的に動物で研究されたあらゆるマイクロＲＮＡは、特定遺伝子のｍＲＮＡ濃度に影響を与えることなく、蛋白質発現量を減少させる。また、マイクロＲＮＡは、ＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex）に連結されて特定ｍＲＮＡに相補的に結合するが、マイクロＲＮＡ中央部分は、ミスマッチ（mismatch）に残っており、既存のｓｉＲＮＡとは異なって、ｍＲＮＡを分解しない。動物マイクロＲＮＡとは異なって、植物マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと完全に一致（perfect match）し、ｍＲＮＡ分解を誘導することにより、ＲＮＡ干渉現象を誘導する。種々の植物マイクロＲＮＡは、動物マイクロＲＮＡのように翻訳調節に関与したりもする。また他の研究は、動植物を含んだ酵母において、マイクロＲＮＡが染色質（chromatin）のメチル化を誘導することにより、転写抑制に関与するという証拠を提示している。このようなマイクロＲＮＡの一部は、種間の保存度が非常に高く、これらが重要な生命現象に関与するという推測を可能にする。
【０００３】
マイクロＲＮＡは、二つの段階の過程で生成されるが、最初のマイクロＲＮＡ転写体（primary miRNA/pri-miRNA）が、核内でＤｒｏｓｈａというＲＮａｓｅＩＩＩタイプ酵素により７０−９０ヌクレオチド程度のステム−ループ（stem-loop）構造のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡになり、その後ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは細胞質に移動し、Ｄｉｃｅｒという酵素により切断され、２１−２５ヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡ（mature microRNA）になる。最近、多くの研究陣により、マイクロＲＮＡが癌細胞と幹細胞（stem cell）において重要な役割をするだけではなく、細胞増殖、細胞分化、細胞死滅及び脂肪代謝調節などで重要な作用をすることが明かされた。しかしながら、未だマイクロＲＮＡのより多い機能が明かされておらず、これに対する研究が活発に進行されている。
【０００４】
現在マイクロＲＮＡに対する研究は、レポーター（reporter）遺伝子の分析、マイクロアレイ（Microarray）、ノーザンブロット（Northern blot）、実時間ＰＣＲ（real-time polymerase chain reaction）などを利用して発現様相を調べるか、アンチセンスＤＮＡやＲＮＡを利用してなされてきた（文献[Boutla A, Delidakis C, and Tabler M. (2003) Developmental defects by antisense-mediated inactivation of micro-RNAs 2 and 13 in Drosophila and the identification of putative target genes. Nucleic Acids Res. 31(17):4973-4980]）。最近は、メチル基によりＲＮＡよりさらにＲＮＡに対する結合力が高く、核酸分解酵素に安定的な２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）ＲＮＡや、２’−Ｏ−Ｍｅよりさらに高い結合力を有した２’−Ｏ−メトキシオリゴヌクレオチドを合成し、マイクロＲＮＡに対するアンチセンスとして使用したりもした（文献[Weiler J, Hunziker J and Hall J. (2006) Anti-miRNA oligonucleotides (AMOs): ammunition to target miRNAs implicated in human disease? Gene Therapy 13:496-502]）。また、核酸分解酵素により分解されやすいＤＮＡの欠点を補完するために、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）をＤＮＡと混合したオリゴヌクレオチドを使用したりもするが、これらは、ＤＮＡより敏感性と選択性に優れていると知られている（文献[Cha J A, Krichevsky A M and Kosik K S. (2005) microRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res. 65:6029-6033]）。さらに、コレステロールが結合されたＲＮＡ 類似物質（antagomir）を合成し、マイクロＲＮＡの機能を調べる研究が行われた（文献[Krutzfeldt J, Rajewsky N, Braich R, Rajeev K G, Tuschl T, Manoharan M and Stoffel M. (2005) Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature 438:685-689]）。これらは、マイクロＲＮＡに対するアンチセンスとして、マイクロＲＮＡの機能を遮断し、その機能を行うが、これらは、マイクロＲＮＡの機能研究において非常に重要である。
【０００５】
上記のように、ＤＮＡとＲＮＡの欠点を克服するために、ＬＮＡや２−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドなどのように化学的に変形されたオリゴヌクレオチドが使用されたが、これらは、細胞内で依然としてエンドヌクレアーゼ（endo-nucelase）やエキソヌクレアーゼ（exo-nuclease）により分解されるか、変形により特異性が低下されるか、細胞内毒性を引き起こすなどの問題がある（文献[Crinelli R, Bianchi M, Gentilini L, and Magnani M. (2002) Design and characterization of decoy oligonucleotides containing locked nucleic acids. Nucleic Acids Res. 30(11):2435-2443]及び文献[Hutvagne G, Simard MJ, Mello C C, Zamore P D. Hutvagner G, Simard M J, Mello C C, and Zamore P D. (2004) Sequence-specific inhibition of small RNA function. PLoS Biol. 2(4):E98]）。したがって、マイクロＲＮＡの機能を遮断するより、効率的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの開発が必要である。
【０００６】
一方、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acids）は、ＤＮＡと類似した構造の高分子化学物質であって、ＤＮＡ及びＲＮＡと結合可能な蛋白質形態の核酸である（Nielsen P E, Buchardt O, Egholm M, Berg R H, US Patent 5,539,082, Peptide nucleic acids）。ＰＮＡの基本バックボーン（backbone）は、ポリペプチド構造を形成している（図１）。ＤＮＡがリン酸基により陰性電気を帯びている反面、ＰＮＡは、ペプチド結合により電気的に中性である。既存知られた核酸分解酵素は、ＰＮＡの構造を認識できないため、ＰＮＡは生体内で核酸分解酵素により分解されず、高い安定性を有する。その他にも、ＰＮＡは、様々な長所を有するが、ＤＮＡ及びＲＮＡと高い結合力を有し、必要に応じて蛍光物質を付着するか、イオンを結合させて溶解度を増加させることが容易であり、ただ一つの塩基配列差があっても、全体遺伝体から検出できるくらいの特異性を有して、ペプチドを結合することにより新しい機能を導入することができるという長所を有している。このような長所を基に、ＰＮＡは、遺伝病を起こす突然変異の追跡や病原性細菌及びウイルス感染の初期診断手段として、癌細胞抑制研究、病原微生物学、ウイルス学などで幅広く応用できる。さらに、過去何年間ＰＮＡを利用したアンチセンス開発に関する研究が活発に進行されてきた。しかしながら、マイクロＲＮＡに対するアンチセンスとしてＰＮＡを利用しようとした試みは知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、上記のような従来技術の問題点を解決するために、上記の長所を有するＰＮＡを利用して、マイクロＲＮＡと特異的に結合し、これらの活性や機能を抑制できるアンチセンスを製作するために持続的な研究を行った。その結果、既存のアンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡより優れた効果を有して、細胞内で長い期間その効果を持続させることができるアンチセンスＰＮＡを発明した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、マイクロＲＮＡと相補的に結合することにより、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するマイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、有効成分として前記マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを含む、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するための組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、前記マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを利用して、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制する方法を提供することである
【００１１】
本発明のまた他の目的は、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの効果を評価する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第一は、１０〜２５塩基からなり、マイクロＲＮＡと相補的に結合することによりマイクロＲＮＡの活性や機能を抑制する、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡに関する。
【００１３】
本発明の第二は、有効成分として前記マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを含む、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するための組成物に関する。
【００１４】
本発明の第三は、前記マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを細胞内に導入する段階を含む、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制する方法に関する。
【００１５】
本発明の第四は、アンチセンスＰＮＡの存在及び不在下で、それぞれマイクロＲＮＡの発現量を測定して比較する段階を含む、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの効果を評価する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＤＮＡ及びＰＮＡの基本構造の差異を示した図である。
【図２】標的マイクロＲＮＡに対する結合配列をクローニングするためのベクターの構造を概略的に示した図である。
【図３】Ｋペプチドが結合されたアンチセンスＰＮＡ（上部）と、変形されたＴａｔペプチド（Ｒペプチド）が結合されたアンチセンスＰＮＡ（下部）の効果を比較したグラフである。
【図４】変形されたＴａｔペプチド（Ｒペプチド）がアンチセンスＰＮＡの細胞内導入に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】標的ｍｉＲ１６に対する既存アンチセンスとアンチセンスＰＮＡの効果を比較したグラフである。
【図６】標的ｍｉＲ１６に対するアンチセンスＰＮＡの濃度別効果を比較したグラフである。
【図７】標的ｍｉＲ１６に対するアンチセンスＰＮＡの時間別効果を比較したグラフである。
【図８】標的ｍｉＲ２２１に対する既存のアンチセンスとＰＮＡアンチセンスの効果を比較したグラフである。
【図９】標的ｍｉＲ２２２に対する既存のアンチセンスとＰＮＡアンチセンスの効果を比較したグラフである。
【図１０】標的ｍｉＲ３１に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１１】標的ｍｉＲ２４に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１２】標的ｍｉＲ２１に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１３】標的ｍｉＲ１８１ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１４】標的ｍｉＲ２３ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１５】標的ｍｉＲ１９ｂに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１６】標的ｍｉＲ２０ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１７】標的ｌｅｔ７ｇに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１８】標的ｍｉＲ３４ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１９】標的ｍｉＲ３０ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２０】標的ｍｉＲ１４６ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２１】標的ｍｉＲ１３０ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２２】標的ｍｉＲ１５５に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２３】標的ｍｉＲ３７３に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２４】標的ｍｉＲ１２２ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２５】標的ｍｉＲ１４５に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２６】標的ｍｉＲ１９１に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２７】標的ｍｉＲ１９３ｂに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２８】標的ｍｉＲ８０２に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、マイクロＲＮＡと相補的に結合することにより、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するマイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡに関する。本発明のアンチセンスＰＮＡは、１０〜２５ｍｅｒの塩基からなるもので、特に１５塩基からなるが、１０〜１４ｍｅｒ程度の短い長さのＰＮＡや１６〜２５ｍｅｒ程度のＰＮＡ、マイクロＲＮＡのシード（seed）部分である５’部分と３’部分の一部を含むＰＮＡも、マイクロＲＮＡに対するアンチセンスとしての機能が十分行えると予想されるため、これらは全て本発明の範囲内に含まれる。本発明において、マイクロＲＮＡは、特に制限されず、あらゆる種類のマイクロＲＮＡを含み、例えば、ｍｉＲ１６、ｍｉＲ２２１、ｍｉＲ２２２、ｍｉＲ３１、ｍｉＲ２４、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ１８１ａ、ｍｉＲ２３ａ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２０ａ、ｌｅｔ７ｇ、ｍｉＲ３４ａ、ｍｉＲ３０ａ、ｍｉＲ１４６ａ、ｍｉＲ１３０ａ、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ３７３、ｍｉＲ１２２ａ、ｍｉＲ１４５、ｍｉＲ１９１、ｍｉＲ１９３ｂ及びｍｉＲ８０２を含むが、これらに限定されるものではない。本発明によるアンチセンスＰＮＡは、マイクロＲＮＡと相補的に結合してその活性や機能を抑制する限り、その塩基配列に特に制限はなく、例えば、下記表１に示した配列番号１乃至８２、好ましくは、配列番号１乃至４、７、１１、１９、２１、２３、２６、２９乃至３２、３４乃至３６、４４、４７、４８、５１、５２、５４、５５、５９、６３、６５、６６、６８乃至８０、及び８２のいずれかの塩基配列を有することができるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
【表１−１】
【表１−２】
【００２０】
本発明によるＰＮＡは、それ自体が細胞内に導入され、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するに使用できる。しかしながら、ＰＮＡは電気的に中性であるため、細胞の脂質成分により、細胞内に導入される際に障害を受ける。これを克服するために、細胞内への伝達システムに対する研究がよく行われたが、例えば、細胞透過蛋白質（cell penetrating protein, CPP）（文献[Pooga M, Hallbrink M, Zorko M, and Langel U. (1998) Cell penetration by transportan. Faseb J. 12: 67-77]）、インシュリン様成長因子I−受容体（Insulin-like growth factor I-receptor）（文献[Basu S, and Wickstrom E. (1997) Synthesis and characterization of a peptide nucleic acid conjugated to a D-peptide analog of insulin-like growth factor 1 for increased cellular uptake. Bioconjug. Chem. 8: 481-488]）、アシアログリコプロテイン受容体（Asialoglycoprotein receptor）（文献[Zhang X, Simmons C G, and Corey D R. (2001) Liver cell specific targeting of peptide nucleic acid oligomers. Bioorg Med. Chem. Lett. 11: 1269-1271]）を付着して細胞内導入を誘導するか、電気穿孔（electroporation）（文献[Wang G, Xu X, Pace B, Dean D A, Glazer P M, Chan P, Goodman S R, and Shokolenko I. (1999) Peptide nucleic acid (PNA) binding-mediated induction of human gamma-globin gene expression. Nucleic Acids Res. 27(13):2806-2813]）またはリポソーム（文献[Faruqi A F, Egholm M, and Glazer P M. (1998) Peptide nucleic acid-targeted mutagenesis of a chromosomal gene in mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 95(4):1398-1403]）を利用して、細胞内導入を誘導する方法が知られている。一般に、ＣＰＰは大きく３種類に分類できる。第一、後天性免疫欠乏症候群を起こすＨＩＶ−１の転写関連蛋白質であるＴａｔ蛋白質の４９−５７番の間に存在するＴａｔペプチドである。第二、ホメオドメイン（homeodomain）由来のペプチドであるペネトラチン（penetratin）であって、これは、ショウジョウバエ（Drosophila）のホメオプロテイン（homeoprotein）であるアンテナペディア（antennapedia）のホメオドメインから発見された。第三、膜転移配列（membrane translocating sequence, MTS）または信号配列（signal sequences）に基礎したペプチドである。ＰＮＡを細胞内に効率的に導入するに使用できるペプチドとしては、下記表２に示したものが知られているが、本発明では、これらのペプチドのいずれか一つまたはこれら由来のものをＰＮＡに連結して使用できる。
【００２１】
【表２】
【００２２】
その他にも、ＰＮＡに有用な他のペプチドや新しいペプチドもＰＮＡに連結して使用できる。これらのペプチドは、ＰＮＡに直に連結されてもよいが、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid）リンカー（Ｏ−リンカー）、化学式１のＥ−リンカー、化学式２のＸ−リンカーなどのような適切なリンカーを介してＰＮＡに連結できる。
【００２３】
［化学式１］
［化学式２］
【００２４】
前記ペプチドの他にも、ポリアルギニン、ペネトラチン、α−アミノアクリジンなどがＰＮＡの細胞内導入を増進させると知られているが、本発明では、ＰＮＡに、これらのいずれも連結することができる。本発明の具体例において、ＰＮＡの細胞内導入を増進させるためのペプチドは、変形されたＴａｔペプチド、特に配列番号８３のアミノ酸配列（ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ）を有するもの（Ｒペプチド）と、配列番号８４のアミノ酸配列（ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ）を有するもの（Ｋペプチド）である。
【００２５】
本発明では、前記マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを細胞内に導入することにより、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制することができる。マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡは、例えば、陽イオン性脂質、特にリポフェクタミン（Lipofectamine）２０００（インビトロゲン（Invitrogen））を利用して細胞内に導入することができる。陽イオン性脂質を利用すること以外の方法（例えば：電気穿孔、リポソーム）を利用して、アンチセンスＰＮＡを細胞内に導入する場合は、ペプチドと結合されたＰＮＡの他に、ペプチドと結合されなかったＰＮＡも、マイクロＲＮＡに対するアンチセンスとしての機能を行うことができる。
【００２６】
また、本発明は、有効成分として前記マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを含む、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するための組成物を提供する。本発明によるマイクロＲＮＡ活性または機能抑制用組成物は、例えば、マイクロＲＮＡ−媒介疾患の予防または治療剤としても使用できるが、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの有効容量は、対象の年齢、性別、健康状態、疾患の種類及び重症度などによって適宜決定できるが、例えば、大人を基準に、１回当たり０．１〜２００ｍｇ容量で投与できて、一日１回または２〜３回分割投与できる。このために、通常的な遺伝子療法（Gene therapy）、例えば、体外（ex vivo）療法や体内（in vivo）療法を使用することができる。
【００２７】
本発明では、アンチセンスＰＮＡの存在及び不在下で、それぞれマイクロＲＮＡの発現量を測定して比較することにより、アンチセンスＰＮＡの効果を評価することができる。この際、発現量を測定するためには、当業界に知られた通常の方法のいずれも使用できるが、例えば、レポーター（reporter）遺伝子、ノーザンブロット、マイクロアレイ、実時間ＰＣＲ、インビボ／イン・シチュ混成化（in vivo/in situ hybridization）または標識化（labeling）を使用することができる。一例として、レポーター遺伝子を使用して遺伝子発現量を測定する場合は、
（ａ）アンチセンスＰＮＡを、レポーター遺伝子（例えば、Renilla luciferase）を含むベクター（対照ベクター）と、レポーター遺伝子（例えば、firefly luciferase）及び標的マイクロＲＮＡに対する結合配列（binding sequence）を含むベクター（実験ベクター）と混合した後、細胞内に導入し、
（ｂ）段階（ａ）の対照ベクターと実験ベクターからレポーター遺伝子の発現量をそれぞれ測定して比較することにより、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの効果を評価することができる。
【００２８】
前記実験ベクターは、レポーター遺伝子（例えば、firefly luciferase）を含むベクターに、標的マイクロＲＮＡに対する結合配列を導入して製造することができる。
【００２９】
以下、本発明を具体的な実施例によりさらに詳細に説明するが、これは、本発明の理解を助けるためのもので、これらにより本発明の範囲が限定されるわけではない。
【００３０】
実施例１：アンチセンスＰＮＡの合成
ＰＮＡのマイクロＲＮＡに対するアンチセンス効果を確認するために、特定マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ１６、ｍｉＲ２２１、ｍｉＲ２２２、ｍｉＲ３１、ｍｉＲ２４、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ１８１ａ、ｍｉＲ２３ａ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２０ａ、ｌｅｔ７ｇ、ｍｉＲ３４ａ、ｍｉＲ３０ａ、ｍｉＲ１４６ａ、ｍｉＲ１３０ａ、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ３７３、ｍｉＲ１２２ａ、ｍｉＲ１４５、ｍｉＲ１９１、ｍｉＲ１９３ｂ、ｍｉＲ８０２）に対して相補的な配列を有するアンチセンスＰＮＡを合成した。マイクロＲＮＡは、通常２１乃至２５個のヌクレオチドからなっているが、その中、塩基配列２から８までは、シード配列（seed sequence）と知られている。マイクロＲＮＡに相補的に結合できるように、標的マイクロＲＮＡの塩基配列１番から１５番まで、２番から１６番まで、３番から１７番までなど、異なる配列の１５個の塩基からなるＰＮＡを合成した。これらのＰＮＡに、Ｏリンカーを使用して、変形されたＨＩＶ−１ Ｔａｔペプチド（Ｒ−ペプチド，ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ）を結合させた。また、変形されたＴａｔペプチドの効果を比較評価するために、動物細胞ではないＥ． ｃｏｌｉでＰＮＡの細胞内導入を増加させると知られているＫ−ペプチド（ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ）を結合させたアンチセンスＰＮＡを合成した。また、アンチセンス活性を有しない対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｋ，ｃｏｎ−Ｒ及びｃｏｎ−２Ｒ）を合成した。合成したアンチセンスＰＮＡ及び対照ＰＮＡを下記表３に示した。
【００３１】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【００３２】
実施例２：アンチセンスＰＮＡの機能及び結合ペプチドの種類がアンチセンス機能に及ぼす影響の評価
アンチセンスＰＮＡの機能及びそれに結合されるペプチドの種類がアンチセンス機能に及ぼす影響を評価するために、ＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり６×１０４個で塗抹した後、２４時間培養した。陽イオン性脂質物質であるリポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して、ｍｉＲ１６に対する結合配列がクローニングされているｐＧＬ３−対照ベクター（firefly luciferase遺伝子含有、プロメガ（Promega）、図２参照）とRenilla luciferase遺伝子を含有するベクター、ｐＧＬ３−対照ベクターを、ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡと共に形質転換させた。ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡの代わりに対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｋ及びｃｏｎ−Ｒ）を同じ方法で形質転換させた。レポーター遺伝子の発現量を調べて、アンチセンスＰＮＡの効果を確認した。
【００３３】
その結果を図３に示した。図３に示したように、本発明で合成した１５塩基長のｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡの全てが、マイクロＲＮＡ １６の機能を抑制するアンチセンス効果を示した。また、変形されたＴａｔペプチド（Ｒペプチド）が結合されているアンチセンスＰＮＡが、Ｋペプチドが結合されているアンチセンスＰＮＡに比べ、より高い効率を有することが確認された。
【００３４】
実施例３：ペプチド結合がアンチセンス機能に及ぼす影響評価
変形されたＴａｔペプチドが結合されたアンチセンスＰＮＡと、ペプチドが結合されなかったアンチセンスＰＮＡの効果を比較するために、まずＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり６×１０４個で塗抹した後、２４時間培養した。リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して、ｍｉＲ１６に対する結合配列がクローニングされているｐＧＬ３−対照ベクター（前記図２参照）とRenilla luciferase遺伝子を含有するベクターを、２００ｎＭ ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡと共に形質転換させた。ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡの代わりに、対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）も同じ方法で形質転換させた。形質導入後、４８時間培養した後、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（Dual luciferase assay system）（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定した。
【００３５】
その結果を図４に示した。図４に示したように、変形されたＴａｔペプチドが結合されたｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡ（modified PNA）は、マイクロＲＮＡ １６に対するアンチセンス効果を示して、Ｔａｔペプチドが結合されなかったｍｉＲ１６用ＰＮＡ（unmodifided PNA，３００ ｎＭ）は、変形されたＴａｔペプチドが結合されたｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡよりは低いものの、アンチセンス効果を示した。
【００３６】
実施例４：標的ｍｉＲ１６に対するＰＮＡの効果の評価
マイクロＲＮＡに対するアンチセンスＰＮＡの効果を確認するために、ｍｉＲ１６マイクロＲＮＡに対する結合配列を含む実験ベクターを使用した。このために、firefly luciferase遺伝子を含むｐＧＬ３−対照ベクター（プロメガ）を利用した。形質導入水準を比較するために、Renilla luciferase遺伝子を含む対照ベクター（プロメガ）を使用した。
【００３７】
ｍｉＲ１６に対する結合配列を、ｐＧＬ３−対照ベクターのluciferase遺伝子の３’ ＵＴＲ部分のＸｂａI内に挿入して実験ベクターを製造した。ｍｉＲ１６マイクロＲＮＡの配列は、ｍｉＲ塩基配列データベース（miRBase Sequence Database）（http://microRNA.sanger.ac.uk/sequences/）を参照して定めた（表４）。
【００３８】
【表４】
【００３９】
マイクロＲＮＡ配列と同じ長さで対応する相補的なＤＮＡを、５’と３’にＸｂａ位置が入れるように合成して（表５）、ｐＧＬ３−対照ベクターにクローニングした。
【００４０】
【表５】
【００４１】
既存のマイクロＲＮＡに対するアンチセンスとＰＮＡアンチセンスの効率を比較するために、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲ１６用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブ（Knockdown probes）と、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社のマイクロＲＮＡ阻害剤であるｍｉＲ１６用ｍｉＲＩＤＮＡを購入して、２００ｎＭ濃度でその効果を比較した。ＰＮＡの場合、図３において２００ｎＭ濃度で効率が高く表れた２種のＰＮＡ（１番と７番）を、それぞれ１００ｎＭを混合して使用した。
【００４２】
ＨｅＬａ細胞を２４時間培養した後、ｍｉＲ１６に対する結合配列が導入された実験ベクターとRenilla luciferase遺伝子を含む対照ベクターを、ｍｉＲ１６用マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡ、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲ１６用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社のｍｉＲ１６用ｍｉＲＩＤＮＡの一つと共にＨｅＬａ細胞に形質導入した。形質導入は、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して行った。マイクロＲＮＡ阻害剤の効果を確認するために、核酸塩基配列がｍｉＲ１６と全く異なる対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＮＡ１８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社のｍｉＲＮＡ１８１ｂ用ｍｉＲＩＤＮＡを、同じ方法で形質転換させた。形質導入後４８時間培養して、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定し、その結果を図５に示した。ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡに対しては、その対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）に対する相対的な測定値を、ｍｉＲ１６用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対しては、ｍｉＲＮＡ１８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対する測定値を、ｍｉＲ１６用ｍｉＲＩＤＮＡに対しては、ｍｉＲＮＡ１８１ｂ用ｍｉＲＩＤＮＡに対する相対的な測定値を表示した。図５に示したように、アンチセンスＰＮＡは、ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブとｍｉＲＩＤＩＡＮに比べ、マイクロＲＮＡ １６に対して２．５倍以上のアンチセンス効果を示した。
【００４３】
実施例５：濃度によるｍｉＲ−１６アンチセンスＰＮＡの効果の評価
マイクロＲＮＡ １６に対するアンチセンスＰＮＡの効果を濃度別に確認するために、ＨｅＬａ細胞を２４時間培養した後、ｍｉＲ１６に対する結合配列が導入されたベクターとRenilla luciferase遺伝子を含む対照ベクターを、それぞれ５０，１００，２００及び３００ｎＭ濃度のアンチセンスＰＮＡ（１番と７番の混合物）と共にＨｅＬａ細胞に形質導入した。形質導入は、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して行った。 ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡの代わりに、対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）も同じ方法で形質転換させた。形質導入後４８時間培養して、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定した。その結果を図６に示した。図６に示したように、２００ｎＭ以上の濃度でｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡを処理した時、ｍｉＲ１６に対するアンチセンスの効果が最も高かった。
【００４４】
実施例６：時間によるｍｉＲ−１６アンチセンスＰＮＡの効果の評価
マイクロＲＮＡ １６に対するアンチセンスとしてのＰＮＡの効果を時間別に確認するために、ＨｅＬａ細胞を２４時間培養した後、ｍｉＲ１６に対する結合配列が導入されたベクターとRenilla luciferase遺伝子を含む対照ベクターを、２００ｎＭのｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡ（ｍｉＲ１６−１ １００ｎＭとｍｉＲ１６−７ １００ｎＭの混合物）及び２００ｎＭのｍｉＲ１６用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブと共にＨｅＬａ細胞に形質導入した。形質導入は、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して行った。マイクロＲＮＡ阻害剤の効果を確認するために、核酸塩基配列がｍｉＲ１６と全く異なる対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＮＡ １８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブを同じ方法で形質転換させた。形質導入後、それぞれ２４、３６及び４８時間培養した後、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定した。
【００４５】
その結果を図７に示した。ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡに対しては、その対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）に対する相対的な測定値を、ｍｉＲ１６用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対しては、ｍｉＲＮＡ１８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対する相対的な測定値を表示した。図７に示したように、ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブは、４８時間後にやっと効果を示したのに対し、アンチセンスＰＮＡは、２４時間後に既にｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブの４８時間後と等しいアンチセンス効果を示し、３６時間後は、アンチセンス効果がさらに増加した。したがって、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを使用すると、既存のマイクロＲＮＡアンチセンスプローブを使用した場合に比べ、１／２時間にアンチセンス効果を確認することができるため、研究開発に必要な時間を大きく減らすことができる。
【００４６】
実施例７：標的ｍｉＲ２２１に対するＰＮＡの効果の評価
ｍｉＲ２２１マイクロＲＮＡに対する結合配列を有するベクターを製造するために、変形されたｐＧＬ３−対照ベクターを使用した。即ち、５’側にＥｃｏＲI制限位置を含み、３’側にＰｓｔI制限位置を含む、合成されたオリゴマーを、変形されたｐＧＬ３−対照ベクターのＥｃｏＲI／ＰｓｔI位置にクローニングした（表６及び表７参照）。
【００４７】
【表６】
【００４８】
【表７】
【００４９】
既存のマイクロＲＮＡに対するアンチセンスとＰＮＡアンチセンスを比較するために、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブと比較した。ＨｅＬａ細胞を２４時間培養した後、ｍｉＲ２２１に対する結合配列が導入されたベクターとRenilla luciferase遺伝子を含む対照ベクターを、２００ｎＭのｍｉＲ２２１用アンチセンスＰＮＡ（ｍｉＲ１６−１ １００ｎＭとｍｉＲ１６−７ １００ｎＭの混合物）及び２００ｎＭのｍｉＲ２２１用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブと共にＨｅＬａ細胞に形質導入した。マイクロＲＮＡ阻害剤の効果を確認するために、核酸塩基配列がｍｉＲ２２１と全く異なる対照 ＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）、 Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＮＡ １８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブを同じ方法で形質転換させた。形質導入は、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して行った。 形質導入後４８時間培養して、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定した。
【００５０】
その結果を図８に示した。ｍｉＲ２２１用アンチセンスＰＮＡに対しては、その対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）に対する相対的な測定値を、ｍｉＲ２２１用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対しては、ｍｉＲＮＡ １８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対する相対的な測定値を表示した。図８に示したように、ｍｉＲ２２１アンチセンスＰＮＡが、ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに比べ、マイクロＲＮＡ ２２１の機能を抑制するアンチセンス効果にさらに優れていた。
【００５１】
実施例８：標的ｍｉＲ２２２に対するＰＮＡの効果の評価
ｍｉＲ２２２マイクロＲＮＡに対する結合配列を有するベクターを製造するために、変形されたｐＧＬ３−対照ベクターを使用した。即ち、５’側にＥｃｏＲI制限位置を含み、３’側にＰｓｔI制限位置を含む、合成されたオリゴマーを、変形されたｐＧＬ３−対照ベクターのＥｃｏＲI／ＰｓｔI位置にクローニングした（表８及び９参照）。
【００５２】
【表８】
【００５３】
【表９】
【００５４】
既存のマイクロＲＮＡに対するアンチセンスとＰＮＡアンチセンスを比較するために、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブと比較した。ＨｅＬａ細胞を２４時間培養した後、ｍｉＲ２２２に対する結合配列が導入されたベクターとRenilla luciferase遺伝子を含む対照ベクターを、２００ｎＭのｍｉＲ２２２用アンチセンスＰＮＡ（ｍｉＲ１６−１ １００ｎＭとｍｉＲ１６−７ １００ｎＭの混合物）及び２００ｎＭのｍｉＲ２２２用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブと共にＨｅＬａ細胞に形質導入した。形質導入は、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して行った。マイクロＲＮＡ阻害剤の効果を確認するために、核酸塩基配列がｍｉＲ２２２と全く異なる対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）、 Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＮＡ １８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブを同じ方法で形質転換させた。形質導入後４８時間培養して、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定した。
【００５５】
その結果を図９に示した。ｍｉＲ２２２用アンチセンスＰＮＡに対しては、その対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）に対する相対的な測定値を、ｍｉＲ２２２用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対しては、ｍｉＲＮＡ １８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対する相対的な測定値を表示した。図９に示したように、ｍｉＲ２２２アンチセンスＰＮＡが、ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに比べ、マイクロＲＮＡ ２２２の機能を抑制するアンチセンス効果にさらに優れていた。
【００５６】
実施例９：標的ｍｉＲ３１，ｍｉＲ２４，ｍｉＲ２１，ｍｉＲ１８１ａ，ｍｉＲ２３ａ，ｍｉＲ１９ｂ，ｍｉＲ２０ａ，ｌｅｔ７ｇ，ｍｉＲ３４ａ，ｍｉＲ３０ａ，ｍｉＲ１４６ａ，ｍｉＲ１３０ａ，ｍｉＲ１５５，ｍｉＲ３７３，ｍｉＲ１２２ａ，ｍｉＲ１４５，ｍｉＲ１９１，ｍｉＲ１９３ｂ，ｍｉＲ８０２に対するＰＮＡの効果の評価
ｍｉＲ塩基配列データベースで見つけたｍｉＲ３１，ｍｉＲ２４，ｍｉＲ２１，ｍｉＲ１８１ａ，ｍｉＲ２３ａ，ｍｉＲ１９ｂ，ｍｉＲ２０ａ，ｌｅｔ７ｇ，ｍｉＲ３４ａ，ｍｉＲ３０ａ，ｍｉＲ１４６ａ，ｍｉＲ１３０ａ，ｍｉＲ１５５，ｍｉＲ３７３，ｍｉＲ１２２ａ，ｍｉＲ１４５，ｍｉＲ１９１，ｍｉＲ１９３ｂ，ｍｉＲ８０２マイクロＲＮＡ配列と同じ長さで対応する相補的なＤＮＡを、実施例３と同様な方法によりｐＧＬ３−対照ベクターにクローニングした。
【００５７】
ＨｅＬａ細胞を２４時間培養した後、それぞれのマイクロＲＮＡに対する結合配列が導入された実験ベクターとRenilla luciferase遺伝子を含む対照ベクターを、２００ｎＭのマイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡと共にＨｅＬａ細胞に形質導入した。形質導入は、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して行った。マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの効果を確認するために、核酸塩基配列が全く異なる対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−２Ｒ）も同じ方法で形質転換させた。形質導入後４８時間培養して、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定した。
【００５８】
その結果を図１０乃至図２８に示した。対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−２Ｒ）に対する相対的な測定値を表示した。前記図に示したように、ｍｉＲ３１−１Ｒ，ｍｉＲ３１−２Ｒ，ｍｉＲ３１−３Ｒ，ｍｉＲ３１−５Ｒ，ｍｉＲ３１−６Ｒ，ｍｉＲ３１−７Ｒ，ｍｉＲ２４−８Ｒ，ｍｉＲ２１−８Ｒ，ｍｉＲ１８１−１Ｒ，ｍｉＲ２３ａ−２Ｒ，ｍｉＲ１９ｂ−１Ｒ，ｍｉＲ２０ａ−１Ｒ，ｍｉＲ２０ａ−２Ｒ，ｌｅｔ７ｇ−４Ｒ，ｍｉＲ３４ａ−１Ｒ，ｍｉＲ３０ａ−１Ｒ，ｍｉＲ１４６ａ−１Ｒ，ｍｉＲ１３０ａ−１Ｒ，ｍｉＲ１３０ａ−２Ｒ，ｍｉＲ１５５−１Ｒ，ｍｉＲ１５５−２Ｒ，ｍｉＲ３７３−１Ｒ，ｍｉＲ３７３−２Ｒ，ｍｉＲ１２２−１Ｒ，ｍｉＲ１２２−２Ｒ，ｍｉＲ１４５−１Ｒ，ｍｉＲ１４５−２Ｒ，ｍｉＲ１９１−１Ｒ，ｍｉＲ１９１−２Ｒ，ｍｉＲ１９３ｂ−１Ｒ，ｍｉＲ８０２−２ＲアンチセンスＰＮＡを使用した場合、対照ＰＮＡに比べ、２倍以上の優れたｍｉＲＮＡ機能抑制効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、人工的に合成されたＤＮＡ類似体として、ＤＮＡ及びＲＮＡより高い強度と特異性及び敏感度でＤＮＡ及びＲＮＡと相補的に結合し、核酸分解酵素、蛋白質分解酵素などの生物学的分解酵素に対して安定性が高いだけではなく、ｐＨ及び熱のような化学的条件に対する安定性に優れたマイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを使用するため、 ＤＮＡやＲＮＡを使用する既存のアンチセンス製剤より、細胞内で長期間その効果を持続させることができて、保存期間が長く、効率的に使用できるという長所がある。本発明のアンチセンスＰＮＡは、マイクロＲＮＡの機能研究に使用されて、真核生物の遺伝子発現の調節を理解する研究に使用できるだけではなく、マイクロＲＮＡの代謝または機能の欠陥により発生する疾病の研究と治療のための新薬としても使用できる。
（配列番号プリテキスト）
配列番号１乃至８２は、ｍｉＲＮＡアンチセンスＰＮＡの塩基配列を示して；
配列番号８３は、Ｒペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号８４は、Ｋ ペプチドのアミノ酸配列を示して；
配列番号８５及び８６は、対照ＰＮＡの塩基配列を示し；
配列番号８７乃至８９は、ｍｉＲＮＡの塩基配列を示して；
配列番号９０乃至９５は、ｍｉＲＮＡ標的配列クローニングオリゴマーの塩基配列を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡ（microRNA antisense PNA）、これを含む組成物、及びその使用及び評価方法に関し、より詳細には、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）と知られたマイクロＲＮＡの活性や機能を抑制することができるマイクロＲＮＡに対するアンチセンスＰＮＡ、これを含む、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するための組成物、これを利用してマイクロＲＮＡの活性や機能を抑制する方法、及びその効果を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９９３年Caenorhabditis elegansで発生時期を調節する一部遺伝子が明かされたが、これらの中、ｌｅｔ−７とｌｉｎ−４は、蛋白質を生産しない小さいＲＮＡ片（non-coding RNA）であることが明かされた。これらＲＮＡは、特定発生段階で発現されて発生を調節するといって、ｓｔＲＮＡ（small temporal RNA）と呼ばれた。マイクロＲＮＡは、２１−２５ヌクレオチドの単一鎖（single-stranded）ＲＮＡ分子であって、真核生物の遺伝子発現を制御し、特定遺伝子のｍＲＮＡ ３’ ＵＴＲ（untranslated region）に結合して、遺伝子の翻訳過程を抑制すると知られている。実質的に動物で研究されたあらゆるマイクロＲＮＡは、特定遺伝子のｍＲＮＡ濃度に影響を与えることなく、蛋白質発現量を減少させる。また、マイクロＲＮＡは、ＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex）に連結されて特定ｍＲＮＡに相補的に結合するが、マイクロＲＮＡ中央部分は、ミスマッチ（mismatch）に残っており、既存のｓｉＲＮＡとは異なって、ｍＲＮＡを分解しない。動物マイクロＲＮＡとは異なって、植物マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと完全に一致（perfect match）し、ｍＲＮＡ分解を誘導することにより、ＲＮＡ干渉現象を誘導する。種々の植物マイクロＲＮＡは、動物マイクロＲＮＡのように翻訳調節に関与したりもする。また他の研究は、動植物を含んだ酵母において、マイクロＲＮＡが染色質（chromatin）のメチル化を誘導することにより、転写抑制に関与するという証拠を提示している。このようなマイクロＲＮＡの一部は、種間の保存度が非常に高く、これらが重要な生命現象に関与するという推測を可能にする。
【０００３】
マイクロＲＮＡは、二つの段階の過程で生成されるが、最初のマイクロＲＮＡ転写体（primary miRNA/pri-miRNA）が、核内でＤｒｏｓｈａというＲＮａｓｅＩＩＩタイプ酵素により７０−９０ヌクレオチド程度のステム−ループ（stem-loop）構造のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡになり、その後ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは細胞質に移動し、Ｄｉｃｅｒという酵素により切断され、２１−２５ヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡ（mature microRNA）になる。最近、多くの研究陣により、マイクロＲＮＡが癌細胞と幹細胞（stem cell）において重要な役割をするだけではなく、細胞増殖、細胞分化、細胞死滅及び脂肪代謝調節などで重要な作用をすることが明かされた。しかしながら、未だマイクロＲＮＡのより多い機能が明かされておらず、これに対する研究が活発に進行されている。
【０００４】
現在マイクロＲＮＡに対する研究は、レポーター（reporter）遺伝子の分析、マイクロアレイ（Microarray）、ノーザンブロット（Northern blot）、実時間ＰＣＲ（real-time polymerase chain reaction）などを利用して発現様相を調べるか、アンチセンスＤＮＡやＲＮＡを利用してなされてきた（文献[Boutla A, Delidakis C, and Tabler M. (2003) Developmental defects by antisense-mediated inactivation of micro-RNAs 2 and 13 in Drosophila and the identification of putative target genes. Nucleic Acids Res. 31(17):4973-4980]）。最近は、メチル基によりＲＮＡよりさらにＲＮＡに対する結合力が高く、核酸分解酵素に安定的な２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）ＲＮＡや、２’−Ｏ−Ｍｅよりさらに高い結合力を有した２’−Ｏ−メトキシオリゴヌクレオチドを合成し、マイクロＲＮＡに対するアンチセンスとして使用したりもした（文献[Weiler J, Hunziker J and Hall J. (2006) Anti-miRNA oligonucleotides (AMOs): ammunition to target miRNAs implicated in human disease? Gene Therapy 13:496-502]）。また、核酸分解酵素により分解されやすいＤＮＡの欠点を補完するために、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）をＤＮＡと混合したオリゴヌクレオチドを使用したりもするが、これらは、ＤＮＡより敏感性と選択性に優れていると知られている（文献[Cha J A, Krichevsky A M and Kosik K S. (2005) microRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res. 65:6029-6033]）。さらに、コレステロールが結合されたＲＮＡ 類似物質（antagomir）を合成し、マイクロＲＮＡの機能を調べる研究が行われた（文献[Krutzfeldt J, Rajewsky N, Braich R, Rajeev K G, Tuschl T, Manoharan M and Stoffel M. (2005) Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature 438:685-689]）。これらは、マイクロＲＮＡに対するアンチセンスとして、マイクロＲＮＡの機能を遮断し、その機能を行うが、これらは、マイクロＲＮＡの機能研究において非常に重要である。
【０００５】
上記のように、ＤＮＡとＲＮＡの欠点を克服するために、ＬＮＡや２−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドなどのように化学的に変形されたオリゴヌクレオチドが使用されたが、これらは、細胞内で依然としてエンドヌクレアーゼ（endo-nucelase）やエキソヌクレアーゼ（exo-nuclease）により分解されるか、変形により特異性が低下されるか、細胞内毒性を引き起こすなどの問題がある（文献[Crinelli R, Bianchi M, Gentilini L, and Magnani M. (2002) Design and characterization of decoy oligonucleotides containing locked nucleic acids. Nucleic Acids Res. 30(11):2435-2443]及び文献[Hutvagne G, Simard MJ, Mello C C, Zamore P D. Hutvagner G, Simard M J, Mello C C, and Zamore P D. (2004) Sequence-specific inhibition of small RNA function. PLoS Biol. 2(4):E98]）。したがって、マイクロＲＮＡの機能を遮断するより、効率的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの開発が必要である。
【０００６】
一方、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acids）は、ＤＮＡと類似した構造の高分子化学物質であって、ＤＮＡ及びＲＮＡと結合可能な蛋白質形態の核酸である（Nielsen P E, Buchardt O, Egholm M, Berg R H, US Patent 5,539,082, Peptide nucleic acids）。ＰＮＡの基本バックボーン（backbone）は、ポリペプチド構造を形成している（図１）。ＤＮＡがリン酸基により陰性電気を帯びている反面、ＰＮＡは、ペプチド結合により電気的に中性である。既存知られた核酸分解酵素は、ＰＮＡの構造を認識できないため、ＰＮＡは生体内で核酸分解酵素により分解されず、高い安定性を有する。その他にも、ＰＮＡは、様々な長所を有するが、ＤＮＡ及びＲＮＡと高い結合力を有し、必要に応じて蛍光物質を付着するか、イオンを結合させて溶解度を増加させることが容易であり、ただ一つの塩基配列差があっても、全体遺伝体から検出できるくらいの特異性を有して、ペプチドを結合することにより新しい機能を導入することができるという長所を有している。このような長所を基に、ＰＮＡは、遺伝病を起こす突然変異の追跡や病原性細菌及びウイルス感染の初期診断手段として、癌細胞抑制研究、病原微生物学、ウイルス学などで幅広く応用できる。さらに、過去何年間ＰＮＡを利用したアンチセンス開発に関する研究が活発に進行されてきた。しかしながら、マイクロＲＮＡに対するアンチセンスとしてＰＮＡを利用しようとした試みは知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、上記のような従来技術の問題点を解決するために、上記の長所を有するＰＮＡを利用して、マイクロＲＮＡと特異的に結合し、これらの活性や機能を抑制できるアンチセンスを製作するために持続的な研究を行った。その結果、既存のアンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡより優れた効果を有して、細胞内で長い期間その効果を持続させることができるアンチセンスＰＮＡを発明した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、マイクロＲＮＡと相補的に結合することにより、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するマイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、有効成分として前記マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを含む、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するための組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、前記マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを利用して、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制する方法を提供することである
【００１１】
本発明のまた他の目的は、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの効果を評価する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第一は、１０〜２５塩基からなり、マイクロＲＮＡと相補的に結合することによりマイクロＲＮＡの活性や機能を抑制する、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡに関する。
【００１３】
本発明の第二は、有効成分として前記マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを含む、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するための組成物に関する。
【００１４】
本発明の第三は、前記マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを細胞内に導入する段階を含む、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制する方法に関する。
【００１５】
本発明の第四は、アンチセンスＰＮＡの存在及び不在下で、それぞれマイクロＲＮＡの発現量を測定して比較する段階を含む、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの効果を評価する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＤＮＡ及びＰＮＡの基本構造の差異を示した図である。
【図２】標的マイクロＲＮＡに対する結合配列をクローニングするためのベクターの構造を概略的に示した図である。
【図３】Ｋペプチドが結合されたアンチセンスＰＮＡ（上部）と、変形されたＴａｔペプチド（Ｒペプチド）が結合されたアンチセンスＰＮＡ（下部）の効果を比較したグラフである。
【図４】変形されたＴａｔペプチド（Ｒペプチド）がアンチセンスＰＮＡの細胞内導入に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】標的ｍｉＲ１６に対する既存アンチセンスとアンチセンスＰＮＡの効果を比較したグラフである。
【図６】標的ｍｉＲ１６に対するアンチセンスＰＮＡの濃度別効果を比較したグラフである。
【図７】標的ｍｉＲ１６に対するアンチセンスＰＮＡの時間別効果を比較したグラフである。
【図８】標的ｍｉＲ２２１に対する既存のアンチセンスとＰＮＡアンチセンスの効果を比較したグラフである。
【図９】標的ｍｉＲ２２２に対する既存のアンチセンスとＰＮＡアンチセンスの効果を比較したグラフである。
【図１０】標的ｍｉＲ３１に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１１】標的ｍｉＲ２４に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１２】標的ｍｉＲ２１に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１３】標的ｍｉＲ１８１ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１４】標的ｍｉＲ２３ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１５】標的ｍｉＲ１９ｂに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１６】標的ｍｉＲ２０ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１７】標的ｌｅｔ７ｇに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１８】標的ｍｉＲ３４ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図１９】標的ｍｉＲ３０ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２０】標的ｍｉＲ１４６ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２１】標的ｍｉＲ１３０ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２２】標的ｍｉＲ１５５に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２３】標的ｍｉＲ３７３に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２４】標的ｍｉＲ１２２ａに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２５】標的ｍｉＲ１４５に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２６】標的ｍｉＲ１９１に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２７】標的ｍｉＲ１９３ｂに対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【図２８】標的ｍｉＲ８０２に対するＰＮＡアンチセンスの効果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、マイクロＲＮＡと相補的に結合することにより、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するマイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡに関する。本発明のアンチセンスＰＮＡは、１０〜２５ｍｅｒの塩基からなるもので、特に１５塩基からなるが、１０〜１４ｍｅｒ程度の短い長さのＰＮＡや１６〜２５ｍｅｒ程度のＰＮＡ、マイクロＲＮＡのシード（seed）部分である５’部分と３’部分の一部を含むＰＮＡも、マイクロＲＮＡに対するアンチセンスとしての機能が十分行えると予想されるため、これらは全て本発明の範囲内に含まれる。本発明において、マイクロＲＮＡは、特に制限されず、あらゆる種類のマイクロＲＮＡを含み、例えば、ｍｉＲ１６、ｍｉＲ２２１、ｍｉＲ２２２、ｍｉＲ３１、ｍｉＲ２４、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ１８１ａ、ｍｉＲ２３ａ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２０ａ、ｌｅｔ７ｇ、ｍｉＲ３４ａ、ｍｉＲ３０ａ、ｍｉＲ１４６ａ、ｍｉＲ１３０ａ、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ３７３、ｍｉＲ１２２ａ、ｍｉＲ１４５、ｍｉＲ１９１、ｍｉＲ１９３ｂ及びｍｉＲ８０２を含むが、これらに限定されるものではない。本発明によるアンチセンスＰＮＡは、マイクロＲＮＡと相補的に結合してその活性や機能を抑制する限り、その塩基配列に特に制限はなく、例えば、下記表１に示した配列番号１乃至８２、好ましくは、配列番号１乃至４、７、１１、１９、２１、２３、２６、２９乃至３２、３４乃至３６、４４、４７、４８、５１、５２、５４、５５、５９、６３、６５、６６、６８乃至８０、及び８２のいずれかの塩基配列を有することができるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
【表１−１】
【表１−２】
【００２０】
本発明によるＰＮＡは、それ自体が細胞内に導入され、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するに使用できる。しかしながら、ＰＮＡは電気的に中性であるため、細胞の脂質成分により、細胞内に導入される際に障害を受ける。これを克服するために、細胞内への伝達システムに対する研究がよく行われたが、例えば、細胞透過蛋白質（cell penetrating protein, CPP）（文献[Pooga M, Hallbrink M, Zorko M, and Langel U. (1998) Cell penetration by transportan. Faseb J. 12: 67-77]）、インシュリン様成長因子I−受容体（Insulin-like growth factor I-receptor）（文献[Basu S, and Wickstrom E. (1997) Synthesis and characterization of a peptide nucleic acid conjugated to a D-peptide analog of insulin-like growth factor 1 for increased cellular uptake. Bioconjug. Chem. 8: 481-488]）、アシアログリコプロテイン受容体（Asialoglycoprotein receptor）（文献[Zhang X, Simmons C G, and Corey D R. (2001) Liver cell specific targeting of peptide nucleic acid oligomers. Bioorg Med. Chem. Lett. 11: 1269-1271]）を付着して細胞内導入を誘導するか、電気穿孔（electroporation）（文献[Wang G, Xu X, Pace B, Dean D A, Glazer P M, Chan P, Goodman S R, and Shokolenko I. (1999) Peptide nucleic acid (PNA) binding-mediated induction of human gamma-globin gene expression. Nucleic Acids Res. 27(13):2806-2813]）またはリポソーム（文献[Faruqi A F, Egholm M, and Glazer P M. (1998) Peptide nucleic acid-targeted mutagenesis of a chromosomal gene in mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 95(4):1398-1403]）を利用して、細胞内導入を誘導する方法が知られている。一般に、ＣＰＰは大きく３種類に分類できる。第一、後天性免疫欠乏症候群を起こすＨＩＶ−１の転写関連蛋白質であるＴａｔ蛋白質の４９−５７番の間に存在するＴａｔペプチドである。第二、ホメオドメイン（homeodomain）由来のペプチドであるペネトラチン（penetratin）であって、これは、ショウジョウバエ（Drosophila）のホメオプロテイン（homeoprotein）であるアンテナペディア（antennapedia）のホメオドメインから発見された。第三、膜転移配列（membrane translocating sequence, MTS）または信号配列（signal sequences）に基礎したペプチドである。ＰＮＡを細胞内に効率的に導入するに使用できるペプチドとしては、下記表２に示したものが知られているが、本発明では、これらのペプチドのいずれか一つまたはこれら由来のものをＰＮＡに連結して使用できる。
【００２１】
【表２】
【００２２】
その他にも、ＰＮＡに有用な他のペプチドや新しいペプチドもＰＮＡに連結して使用できる。これらのペプチドは、ＰＮＡに直に連結されてもよいが、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid）リンカー（Ｏ−リンカー）、化学式１のＥ−リンカー、化学式２のＸ−リンカーなどのような適切なリンカーを介してＰＮＡに連結できる。
【００２３】
［化学式１］
［化学式２］
【００２４】
前記ペプチドの他にも、ポリアルギニン、ペネトラチン、α−アミノアクリジンなどがＰＮＡの細胞内導入を増進させると知られているが、本発明では、ＰＮＡに、これらのいずれも連結することができる。本発明の具体例において、ＰＮＡの細胞内導入を増進させるためのペプチドは、変形されたＴａｔペプチド、特に配列番号８３のアミノ酸配列（ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ）を有するもの（Ｒペプチド）と、配列番号８４のアミノ酸配列（ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ）を有するもの（Ｋペプチド）である。
【００２５】
本発明では、前記マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを細胞内に導入することにより、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制することができる。マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡは、例えば、陽イオン性脂質、特にリポフェクタミン（Lipofectamine）２０００（インビトロゲン（Invitrogen））を利用して細胞内に導入することができる。陽イオン性脂質を利用すること以外の方法（例えば：電気穿孔、リポソーム）を利用して、アンチセンスＰＮＡを細胞内に導入する場合は、ペプチドと結合されたＰＮＡの他に、ペプチドと結合されなかったＰＮＡも、マイクロＲＮＡに対するアンチセンスとしての機能を行うことができる。
【００２６】
また、本発明は、有効成分として前記マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを含む、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するための組成物を提供する。本発明によるマイクロＲＮＡ活性または機能抑制用組成物は、例えば、マイクロＲＮＡ−媒介疾患の予防または治療剤としても使用できるが、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの有効容量は、対象の年齢、性別、健康状態、疾患の種類及び重症度などによって適宜決定できるが、例えば、大人を基準に、１回当たり０．１〜２００ｍｇ容量で投与できて、一日１回または２〜３回分割投与できる。このために、通常的な遺伝子療法（Gene therapy）、例えば、体外（ex vivo）療法や体内（in vivo）療法を使用することができる。
【００２７】
本発明では、アンチセンスＰＮＡの存在及び不在下で、それぞれマイクロＲＮＡの発現量を測定して比較することにより、アンチセンスＰＮＡの効果を評価することができる。この際、発現量を測定するためには、当業界に知られた通常の方法のいずれも使用できるが、例えば、レポーター（reporter）遺伝子、ノーザンブロット、マイクロアレイ、実時間ＰＣＲ、インビボ／イン・シチュ混成化（in vivo/in situ hybridization）または標識化（labeling）を使用することができる。一例として、レポーター遺伝子を使用して遺伝子発現量を測定する場合は、
（ａ）アンチセンスＰＮＡを、レポーター遺伝子（例えば、Renilla luciferase）を含むベクター（対照ベクター）と、レポーター遺伝子（例えば、firefly luciferase）及び標的マイクロＲＮＡに対する結合配列（binding sequence）を含むベクター（実験ベクター）と混合した後、細胞内に導入し、
（ｂ）段階（ａ）の対照ベクターと実験ベクターからレポーター遺伝子の発現量をそれぞれ測定して比較することにより、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの効果を評価することができる。
【００２８】
前記実験ベクターは、レポーター遺伝子（例えば、firefly luciferase）を含むベクターに、標的マイクロＲＮＡに対する結合配列を導入して製造することができる。
【００２９】
以下、本発明を具体的な実施例によりさらに詳細に説明するが、これは、本発明の理解を助けるためのもので、これらにより本発明の範囲が限定されるわけではない。
【００３０】
実施例１：アンチセンスＰＮＡの合成
ＰＮＡのマイクロＲＮＡに対するアンチセンス効果を確認するために、特定マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ１６、ｍｉＲ２２１、ｍｉＲ２２２、ｍｉＲ３１、ｍｉＲ２４、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ１８１ａ、ｍｉＲ２３ａ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２０ａ、ｌｅｔ７ｇ、ｍｉＲ３４ａ、ｍｉＲ３０ａ、ｍｉＲ１４６ａ、ｍｉＲ１３０ａ、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ３７３、ｍｉＲ１２２ａ、ｍｉＲ１４５、ｍｉＲ１９１、ｍｉＲ１９３ｂ、ｍｉＲ８０２）に対して相補的な配列を有するアンチセンスＰＮＡを合成した。マイクロＲＮＡは、通常２１乃至２５個のヌクレオチドからなっているが、その中、塩基配列２から８までは、シード配列（seed sequence）と知られている。マイクロＲＮＡに相補的に結合できるように、標的マイクロＲＮＡの塩基配列１番から１５番まで、２番から１６番まで、３番から１７番までなど、異なる配列の１５個の塩基からなるＰＮＡを合成した。これらのＰＮＡに、Ｏリンカーを使用して、変形されたＨＩＶ−１ Ｔａｔペプチド（Ｒ−ペプチド，ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ）を結合させた。また、変形されたＴａｔペプチドの効果を比較評価するために、動物細胞ではないＥ． ｃｏｌｉでＰＮＡの細胞内導入を増加させると知られているＫ−ペプチド（ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ）を結合させたアンチセンスＰＮＡを合成した。また、アンチセンス活性を有しない対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｋ，ｃｏｎ−Ｒ及びｃｏｎ−２Ｒ）を合成した。合成したアンチセンスＰＮＡ及び対照ＰＮＡを下記表３に示した。
【００３１】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【００３２】
実施例２：アンチセンスＰＮＡの機能及び結合ペプチドの種類がアンチセンス機能に及ぼす影響の評価
アンチセンスＰＮＡの機能及びそれに結合されるペプチドの種類がアンチセンス機能に及ぼす影響を評価するために、ＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり６×１０４個で塗抹した後、２４時間培養した。陽イオン性脂質物質であるリポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して、ｍｉＲ１６に対する結合配列がクローニングされているｐＧＬ３−対照ベクター（firefly luciferase遺伝子含有、プロメガ（Promega）、図２参照）とRenilla luciferase遺伝子を含有するベクター、ｐＧＬ３−対照ベクターを、ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡと共に形質転換させた。ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡの代わりに対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｋ及びｃｏｎ−Ｒ）を同じ方法で形質転換させた。レポーター遺伝子の発現量を調べて、アンチセンスＰＮＡの効果を確認した。
【００３３】
その結果を図３に示した。図３に示したように、本発明で合成した１５塩基長のｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡの全てが、マイクロＲＮＡ １６の機能を抑制するアンチセンス効果を示した。また、変形されたＴａｔペプチド（Ｒペプチド）が結合されているアンチセンスＰＮＡが、Ｋペプチドが結合されているアンチセンスＰＮＡに比べ、より高い効率を有することが確認された。
【００３４】
実施例３：ペプチド結合がアンチセンス機能に及ぼす影響評価
変形されたＴａｔペプチドが結合されたアンチセンスＰＮＡと、ペプチドが結合されなかったアンチセンスＰＮＡの効果を比較するために、まずＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり６×１０４個で塗抹した後、２４時間培養した。リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して、ｍｉＲ１６に対する結合配列がクローニングされているｐＧＬ３−対照ベクター（前記図２参照）とRenilla luciferase遺伝子を含有するベクターを、２００ｎＭ ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡと共に形質転換させた。ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡの代わりに、対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）も同じ方法で形質転換させた。形質導入後、４８時間培養した後、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（Dual luciferase assay system）（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定した。
【００３５】
その結果を図４に示した。図４に示したように、変形されたＴａｔペプチドが結合されたｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡ（modified PNA）は、マイクロＲＮＡ １６に対するアンチセンス効果を示して、Ｔａｔペプチドが結合されなかったｍｉＲ１６用ＰＮＡ（unmodifided PNA，３００ ｎＭ）は、変形されたＴａｔペプチドが結合されたｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡよりは低いものの、アンチセンス効果を示した。
【００３６】
実施例４：標的ｍｉＲ１６に対するＰＮＡの効果の評価
マイクロＲＮＡに対するアンチセンスＰＮＡの効果を確認するために、ｍｉＲ１６マイクロＲＮＡに対する結合配列を含む実験ベクターを使用した。このために、firefly luciferase遺伝子を含むｐＧＬ３−対照ベクター（プロメガ）を利用した。形質導入水準を比較するために、Renilla luciferase遺伝子を含む対照ベクター（プロメガ）を使用した。
【００３７】
ｍｉＲ１６に対する結合配列を、ｐＧＬ３−対照ベクターのluciferase遺伝子の３’ ＵＴＲ部分のＸｂａI内に挿入して実験ベクターを製造した。ｍｉＲ１６マイクロＲＮＡの配列は、ｍｉＲ塩基配列データベース（miRBase Sequence Database）（http://microRNA.sanger.ac.uk/sequences/）を参照して定めた（表４）。
【００３８】
【表４】
【００３９】
マイクロＲＮＡ配列と同じ長さで対応する相補的なＤＮＡを、５’と３’にＸｂａ位置が入れるように合成して（表５）、ｐＧＬ３−対照ベクターにクローニングした。
【００４０】
【表５】
【００４１】
既存のマイクロＲＮＡに対するアンチセンスとＰＮＡアンチセンスの効率を比較するために、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲ１６用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブ（Knockdown probes）と、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社のマイクロＲＮＡ阻害剤であるｍｉＲ１６用ｍｉＲＩＤＮＡを購入して、２００ｎＭ濃度でその効果を比較した。ＰＮＡの場合、図３において２００ｎＭ濃度で効率が高く表れた２種のＰＮＡ（１番と７番）を、それぞれ１００ｎＭを混合して使用した。
【００４２】
ＨｅＬａ細胞を２４時間培養した後、ｍｉＲ１６に対する結合配列が導入された実験ベクターとRenilla luciferase遺伝子を含む対照ベクターを、ｍｉＲ１６用マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡ、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲ１６用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社のｍｉＲ１６用ｍｉＲＩＤＮＡの一つと共にＨｅＬａ細胞に形質導入した。形質導入は、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して行った。マイクロＲＮＡ阻害剤の効果を確認するために、核酸塩基配列がｍｉＲ１６と全く異なる対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＮＡ１８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社のｍｉＲＮＡ１８１ｂ用ｍｉＲＩＤＮＡを、同じ方法で形質転換させた。形質導入後４８時間培養して、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定し、その結果を図５に示した。ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡに対しては、その対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）に対する相対的な測定値を、ｍｉＲ１６用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対しては、ｍｉＲＮＡ１８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対する測定値を、ｍｉＲ１６用ｍｉＲＩＤＮＡに対しては、ｍｉＲＮＡ１８１ｂ用ｍｉＲＩＤＮＡに対する相対的な測定値を表示した。図５に示したように、アンチセンスＰＮＡは、ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブとｍｉＲＩＤＩＡＮに比べ、マイクロＲＮＡ １６に対して２．５倍以上のアンチセンス効果を示した。
【００４３】
実施例５：濃度によるｍｉＲ−１６アンチセンスＰＮＡの効果の評価
マイクロＲＮＡ １６に対するアンチセンスＰＮＡの効果を濃度別に確認するために、ＨｅＬａ細胞を２４時間培養した後、ｍｉＲ１６に対する結合配列が導入されたベクターとRenilla luciferase遺伝子を含む対照ベクターを、それぞれ５０，１００，２００及び３００ｎＭ濃度のアンチセンスＰＮＡ（１番と７番の混合物）と共にＨｅＬａ細胞に形質導入した。形質導入は、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して行った。 ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡの代わりに、対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）も同じ方法で形質転換させた。形質導入後４８時間培養して、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定した。その結果を図６に示した。図６に示したように、２００ｎＭ以上の濃度でｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡを処理した時、ｍｉＲ１６に対するアンチセンスの効果が最も高かった。
【００４４】
実施例６：時間によるｍｉＲ−１６アンチセンスＰＮＡの効果の評価
マイクロＲＮＡ １６に対するアンチセンスとしてのＰＮＡの効果を時間別に確認するために、ＨｅＬａ細胞を２４時間培養した後、ｍｉＲ１６に対する結合配列が導入されたベクターとRenilla luciferase遺伝子を含む対照ベクターを、２００ｎＭのｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡ（ｍｉＲ１６−１ １００ｎＭとｍｉＲ１６−７ １００ｎＭの混合物）及び２００ｎＭのｍｉＲ１６用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブと共にＨｅＬａ細胞に形質導入した。形質導入は、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して行った。マイクロＲＮＡ阻害剤の効果を確認するために、核酸塩基配列がｍｉＲ１６と全く異なる対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＮＡ １８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブを同じ方法で形質転換させた。形質導入後、それぞれ２４、３６及び４８時間培養した後、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定した。
【００４５】
その結果を図７に示した。ｍｉＲ１６用アンチセンスＰＮＡに対しては、その対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）に対する相対的な測定値を、ｍｉＲ１６用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対しては、ｍｉＲＮＡ１８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対する相対的な測定値を表示した。図７に示したように、ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブは、４８時間後にやっと効果を示したのに対し、アンチセンスＰＮＡは、２４時間後に既にｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブの４８時間後と等しいアンチセンス効果を示し、３６時間後は、アンチセンス効果がさらに増加した。したがって、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを使用すると、既存のマイクロＲＮＡアンチセンスプローブを使用した場合に比べ、１／２時間にアンチセンス効果を確認することができるため、研究開発に必要な時間を大きく減らすことができる。
【００４６】
実施例７：標的ｍｉＲ２２１に対するＰＮＡの効果の評価
ｍｉＲ２２１マイクロＲＮＡに対する結合配列を有するベクターを製造するために、変形されたｐＧＬ３−対照ベクターを使用した。即ち、５’側にＥｃｏＲI制限位置を含み、３’側にＰｓｔI制限位置を含む、合成されたオリゴマーを、変形されたｐＧＬ３−対照ベクターのＥｃｏＲI／ＰｓｔI位置にクローニングした（表６及び表７参照）。
【００４７】
【表６】
【００４８】
【表７】
【００４９】
既存のマイクロＲＮＡに対するアンチセンスとＰＮＡアンチセンスを比較するために、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブと比較した。ＨｅＬａ細胞を２４時間培養した後、ｍｉＲ２２１に対する結合配列が導入されたベクターとRenilla luciferase遺伝子を含む対照ベクターを、２００ｎＭのｍｉＲ２２１用アンチセンスＰＮＡ（ｍｉＲ１６−１ １００ｎＭとｍｉＲ１６−７ １００ｎＭの混合物）及び２００ｎＭのｍｉＲ２２１用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブと共にＨｅＬａ細胞に形質導入した。マイクロＲＮＡ阻害剤の効果を確認するために、核酸塩基配列がｍｉＲ２２１と全く異なる対照 ＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）、 Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＮＡ １８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブを同じ方法で形質転換させた。形質導入は、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して行った。 形質導入後４８時間培養して、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定した。
【００５０】
その結果を図８に示した。ｍｉＲ２２１用アンチセンスＰＮＡに対しては、その対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）に対する相対的な測定値を、ｍｉＲ２２１用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対しては、ｍｉＲＮＡ １８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対する相対的な測定値を表示した。図８に示したように、ｍｉＲ２２１アンチセンスＰＮＡが、ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに比べ、マイクロＲＮＡ ２２１の機能を抑制するアンチセンス効果にさらに優れていた。
【００５１】
実施例８：標的ｍｉＲ２２２に対するＰＮＡの効果の評価
ｍｉＲ２２２マイクロＲＮＡに対する結合配列を有するベクターを製造するために、変形されたｐＧＬ３−対照ベクターを使用した。即ち、５’側にＥｃｏＲI制限位置を含み、３’側にＰｓｔI制限位置を含む、合成されたオリゴマーを、変形されたｐＧＬ３−対照ベクターのＥｃｏＲI／ＰｓｔI位置にクローニングした（表８及び９参照）。
【００５２】
【表８】
【００５３】
【表９】
【００５４】
既存のマイクロＲＮＡに対するアンチセンスとＰＮＡアンチセンスを比較するために、Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブと比較した。ＨｅＬａ細胞を２４時間培養した後、ｍｉＲ２２２に対する結合配列が導入されたベクターとRenilla luciferase遺伝子を含む対照ベクターを、２００ｎＭのｍｉＲ２２２用アンチセンスＰＮＡ（ｍｉＲ１６−１ １００ｎＭとｍｉＲ１６−７ １００ｎＭの混合物）及び２００ｎＭのｍｉＲ２２２用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブと共にＨｅＬａ細胞に形質導入した。形質導入は、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して行った。マイクロＲＮＡ阻害剤の効果を確認するために、核酸塩基配列がｍｉＲ２２２と全く異なる対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）、 Ｅｘｉｑｏｎ社のｍｉＲＮＡ １８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブを同じ方法で形質転換させた。形質導入後４８時間培養して、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定した。
【００５５】
その結果を図９に示した。ｍｉＲ２２２用アンチセンスＰＮＡに対しては、その対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−Ｒ）に対する相対的な測定値を、ｍｉＲ２２２用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対しては、ｍｉＲＮＡ １８１ｂ用ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに対する相対的な測定値を表示した。図９に示したように、ｍｉＲ２２２アンチセンスＰＮＡが、ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＬＮＡノックダウンプローブに比べ、マイクロＲＮＡ ２２２の機能を抑制するアンチセンス効果にさらに優れていた。
【００５６】
実施例９：標的ｍｉＲ３１，ｍｉＲ２４，ｍｉＲ２１，ｍｉＲ１８１ａ，ｍｉＲ２３ａ，ｍｉＲ１９ｂ，ｍｉＲ２０ａ，ｌｅｔ７ｇ，ｍｉＲ３４ａ，ｍｉＲ３０ａ，ｍｉＲ１４６ａ，ｍｉＲ１３０ａ，ｍｉＲ１５５，ｍｉＲ３７３，ｍｉＲ１２２ａ，ｍｉＲ１４５，ｍｉＲ１９１，ｍｉＲ１９３ｂ，ｍｉＲ８０２に対するＰＮＡの効果の評価
ｍｉＲ塩基配列データベースで見つけたｍｉＲ３１，ｍｉＲ２４，ｍｉＲ２１，ｍｉＲ１８１ａ，ｍｉＲ２３ａ，ｍｉＲ１９ｂ，ｍｉＲ２０ａ，ｌｅｔ７ｇ，ｍｉＲ３４ａ，ｍｉＲ３０ａ，ｍｉＲ１４６ａ，ｍｉＲ１３０ａ，ｍｉＲ１５５，ｍｉＲ３７３，ｍｉＲ１２２ａ，ｍｉＲ１４５，ｍｉＲ１９１，ｍｉＲ１９３ｂ，ｍｉＲ８０２マイクロＲＮＡ配列と同じ長さで対応する相補的なＤＮＡを、実施例３と同様な方法によりｐＧＬ３−対照ベクターにクローニングした。
【００５７】
ＨｅＬａ細胞を２４時間培養した後、それぞれのマイクロＲＮＡに対する結合配列が導入された実験ベクターとRenilla luciferase遺伝子を含む対照ベクターを、２００ｎＭのマイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡと共にＨｅＬａ細胞に形質導入した。形質導入は、リポフェクタミン２０００（インビトロゲン）を利用して行った。マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの効果を確認するために、核酸塩基配列が全く異なる対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−２Ｒ）も同じ方法で形質転換させた。形質導入後４８時間培養して、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用して、firefly luciferaseとRenilla luciferaseの発現量を測定した。
【００５８】
その結果を図１０乃至図２８に示した。対照ＰＮＡ（ｃｏｎ−２Ｒ）に対する相対的な測定値を表示した。前記図に示したように、ｍｉＲ３１−１Ｒ，ｍｉＲ３１−２Ｒ，ｍｉＲ３１−３Ｒ，ｍｉＲ３１−５Ｒ，ｍｉＲ３１−６Ｒ，ｍｉＲ３１−７Ｒ，ｍｉＲ２４−８Ｒ，ｍｉＲ２１−８Ｒ，ｍｉＲ１８１−１Ｒ，ｍｉＲ２３ａ−２Ｒ，ｍｉＲ１９ｂ−１Ｒ，ｍｉＲ２０ａ−１Ｒ，ｍｉＲ２０ａ−２Ｒ，ｌｅｔ７ｇ−４Ｒ，ｍｉＲ３４ａ−１Ｒ，ｍｉＲ３０ａ−１Ｒ，ｍｉＲ１４６ａ−１Ｒ，ｍｉＲ１３０ａ−１Ｒ，ｍｉＲ１３０ａ−２Ｒ，ｍｉＲ１５５−１Ｒ，ｍｉＲ１５５−２Ｒ，ｍｉＲ３７３−１Ｒ，ｍｉＲ３７３−２Ｒ，ｍｉＲ１２２−１Ｒ，ｍｉＲ１２２−２Ｒ，ｍｉＲ１４５−１Ｒ，ｍｉＲ１４５−２Ｒ，ｍｉＲ１９１−１Ｒ，ｍｉＲ１９１−２Ｒ，ｍｉＲ１９３ｂ−１Ｒ，ｍｉＲ８０２−２ＲアンチセンスＰＮＡを使用した場合、対照ＰＮＡに比べ、２倍以上の優れたｍｉＲＮＡ機能抑制効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、人工的に合成されたＤＮＡ類似体として、ＤＮＡ及びＲＮＡより高い強度と特異性及び敏感度でＤＮＡ及びＲＮＡと相補的に結合し、核酸分解酵素、蛋白質分解酵素などの生物学的分解酵素に対して安定性が高いだけではなく、ｐＨ及び熱のような化学的条件に対する安定性に優れたマイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを使用するため、 ＤＮＡやＲＮＡを使用する既存のアンチセンス製剤より、細胞内で長期間その効果を持続させることができて、保存期間が長く、効率的に使用できるという長所がある。本発明のアンチセンスＰＮＡは、マイクロＲＮＡの機能研究に使用されて、真核生物の遺伝子発現の調節を理解する研究に使用できるだけではなく、マイクロＲＮＡの代謝または機能の欠陥により発生する疾病の研究と治療のための新薬としても使用できる。
（配列番号プリテキスト）
配列番号１乃至８２は、ｍｉＲＮＡアンチセンスＰＮＡの塩基配列を示して；
配列番号８３は、Ｒペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号８４は、Ｋ ペプチドのアミノ酸配列を示して；
配列番号８５及び８６は、対照ＰＮＡの塩基配列を示し；
配列番号８７乃至８９は、ｍｉＲＮＡの塩基配列を示して；
配列番号９０乃至９５は、ｍｉＲＮＡ標的配列クローニングオリゴマーの塩基配列を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜２５塩基からなり、マイクロＲＮＡと相補的に結合することによりマイクロＲＮＡの活性や機能を抑制する、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）。
【請求項２】
マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ１６、ｍｉＲ２２１、ｍｉＲ２２２、ｍｉＲ３１、ｍｉＲ２４、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ１８１ａ、ｍｉＲ２３ａ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２０ａ、ｌｅｔ７ｇ、ｍｉＲ３４ａ、ｍｉＲ３０ａ、ｍｉＲ１４６ａ、ｍｉＲ１３０ａ、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ３７３、ｍｉＲ１２２ａ、ｍｉＲ１４５、ｍｉＲ１９１、ｍｉＲ１９３ｂ及びｍｉＲ８０２のいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載のアンチセンスＰＮＡ。
【請求項３】
配列番号１乃至４、７、１１、１９、２１、２３、２６、２９乃至３２、３４乃至３６、４４、４７、４８、５１、５２、５４、５５、５９、６３、６５、６６、６８乃至８０、及び８２のいずれかの塩基配列を有することを特徴とする、請求項２に記載のアンチセンスＰＮＡ。
【請求項４】
ペプチドがさらに結合されていることを特徴とする、請求項１に記載のアンチセンスＰＮＡ。
【請求項５】
ペプチドが、ＰＮＡの細胞内導入を増進させるためのものであることを特徴とする、請求項４に記載のアンチセンスＰＮＡ。
【請求項６】
ペプチドが、オクトレオチド（Octreotide）、Ｔａｔペプチド、ＮＬＳ（Nuclear Localization Signal）、陽イオン性ペプチド、Ｈ部位、Ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ配列、ＰＴＤ（Protein Transduction Domain）−４、トランスポータン（Transportan）、細菌細胞膜活性ペプチド、ＮＬ１．１結合チロシンキナーゼ受容体、ＮＬ４ｃ結合チロシンキナーゼ受容体、最小転写活性剤、ｐＡｎｔｐ／ペネトラチン、Ｇａｌ ８０ ＢＰ、信号−配列基礎ペプチド（I）、信号−配列基礎ペプチド（II）、９９ｍＴｃキレーティングペプチド、ＩＧＦ１、ミトコンドリア獲得ペプチド、ＹＤＥＧＥ、Ｍ９１８及びＲ６−Ｐｅｎからなる群から選択されるか、これら由来のものであることを特徴とする、請求項５に記載のアンチセンスＰＮＡ。
【請求項７】
ペプチドが、配列番号８３または８４のアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする、請求項６に記載のアンチセンスＰＮＡ。
【請求項８】
有効成分として、請求項１乃至７のいずれかに記載のマイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを含むことを特徴とする、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するための組成物。
【請求項９】
請求項１乃至７のいずれかに記載のマイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを細胞内に導入する段階を含むことを特徴とする、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制する方法。
【請求項１０】
マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを、陽イオン性脂質を利用して細胞内に導入することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの存在及び不在下で、それぞれマイクロＲＮＡの発現量を測定して比較する段階を含むことを特徴とする、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの効果を評価する方法。
【請求項１２】
レポーター遺伝子、ノーザンブロット、マイクロアレイ、実時間ＰＣＲ、インビボ／イン・シチュ混成化または標識化を利用してマイクロＲＮＡの発現量を測定することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）アンチセンスＰＮＡを、レポーター遺伝子を含む対照ベクターと、レポーター遺伝子及び標的マイクロＲＮＡに対する結合配列を含む実験ベクターと混合した後、細胞内に導入し、
（ｂ）段階（ａ）の対照ベクターと実験ベクターからレポーター遺伝子の発現量をそれぞれ測定して比較する段階を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
２４〜３６時間細胞を培養した後、マイクロＲＮＡの発現量を測定することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１】
１０〜２５塩基からなり、マイクロＲＮＡと相補的に結合することによりマイクロＲＮＡの活性や機能を抑制する、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）。
【請求項２】
マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ１６、ｍｉＲ２２１、ｍｉＲ２２２、ｍｉＲ３１、ｍｉＲ２４、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ１８１ａ、ｍｉＲ２３ａ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２０ａ、ｌｅｔ７ｇ、ｍｉＲ３４ａ、ｍｉＲ３０ａ、ｍｉＲ１４６ａ、ｍｉＲ１３０ａ、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ３７３、ｍｉＲ１２２ａ、ｍｉＲ１４５、ｍｉＲ１９１、ｍｉＲ１９３ｂ及びｍｉＲ８０２のいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載のアンチセンスＰＮＡ。
【請求項３】
配列番号１乃至４、７、１１、１９、２１、２３、２６、２９乃至３２、３４乃至３６、４４、４７、４８、５１、５２、５４、５５、５９、６３、６５、６６、６８乃至８０、及び８２のいずれかの塩基配列を有することを特徴とする、請求項２に記載のアンチセンスＰＮＡ。
【請求項４】
ペプチドがさらに結合されていることを特徴とする、請求項１に記載のアンチセンスＰＮＡ。
【請求項５】
ペプチドが、ＰＮＡの細胞内導入を増進させるためのものであることを特徴とする、請求項４に記載のアンチセンスＰＮＡ。
【請求項６】
ペプチドが、オクトレオチド（Octreotide）、Ｔａｔペプチド、ＮＬＳ（Nuclear Localization Signal）、陽イオン性ペプチド、Ｈ部位、Ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ配列、ＰＴＤ（Protein Transduction Domain）−４、トランスポータン（Transportan）、細菌細胞膜活性ペプチド、ＮＬ１．１結合チロシンキナーゼ受容体、ＮＬ４ｃ結合チロシンキナーゼ受容体、最小転写活性剤、ｐＡｎｔｐ／ペネトラチン、Ｇａｌ ８０ ＢＰ、信号−配列基礎ペプチド（I）、信号−配列基礎ペプチド（II）、９９ｍＴｃキレーティングペプチド、ＩＧＦ１、ミトコンドリア獲得ペプチド、ＹＤＥＧＥ、Ｍ９１８及びＲ６−Ｐｅｎからなる群から選択されるか、これら由来のものであることを特徴とする、請求項５に記載のアンチセンスＰＮＡ。
【請求項７】
ペプチドが、配列番号８３または８４のアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする、請求項６に記載のアンチセンスＰＮＡ。
【請求項８】
有効成分として、請求項１乃至７のいずれかに記載のマイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを含むことを特徴とする、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制するための組成物。
【請求項９】
請求項１乃至７のいずれかに記載のマイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを細胞内に導入する段階を含むことを特徴とする、マイクロＲＮＡの活性や機能を抑制する方法。
【請求項１０】
マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡを、陽イオン性脂質を利用して細胞内に導入することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの存在及び不在下で、それぞれマイクロＲＮＡの発現量を測定して比較する段階を含むことを特徴とする、マイクロＲＮＡアンチセンスＰＮＡの効果を評価する方法。
【請求項１２】
レポーター遺伝子、ノーザンブロット、マイクロアレイ、実時間ＰＣＲ、インビボ／イン・シチュ混成化または標識化を利用してマイクロＲＮＡの発現量を測定することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）アンチセンスＰＮＡを、レポーター遺伝子を含む対照ベクターと、レポーター遺伝子及び標的マイクロＲＮＡに対する結合配列を含む実験ベクターと混合した後、細胞内に導入し、
（ｂ）段階（ａ）の対照ベクターと実験ベクターからレポーター遺伝子の発現量をそれぞれ測定して比較する段階を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
２４〜３６時間細胞を培養した後、マイクロＲＮＡの発現量を測定することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【公表番号】特表２０１１−５０４１１０（Ｐ２０１１−５０４１１０Ａ）
【公表日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３４８９６（Ｐ２０１０−５３４８９６）
【出願日】平成２０年１１月２４日（２００８．１１．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００６９２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６６９６７
【国際公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【出願人】（３１０００７１２８）パナジェン インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＮＡＧＥＮＥ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｓｓａｎｇｙｏｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， １００， Ｓｉｎｓｅｏｎｇ−ｄｏｎｇ， Ｙｕｓｅｏｎｇ−ｇｕ， Ｄａｅｊｅｏｎ ３０５−８０４ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２４日（２００８．１１．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００６９２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６６９６７
【国際公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【出願人】（３１０００７１２８）パナジェン インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＮＡＧＥＮＥ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｓｓａｎｇｙｏｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， １００， Ｓｉｎｓｅｏｎｇ−ｄｏｎｇ， Ｙｕｓｅｏｎｇ−ｇｕ， Ｄａｅｊｅｏｎ ３０５−８０４ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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