マッシュルーム菌糸体の培養方法及びマッシュルーム菌糸体培養用培地
サトウキビ抽出物を含む液体培地中でマッシュルーム菌糸体またはその胞子を培養する工程を含む、マッシュルーム菌糸体の培養方法、及びマッシュルーム菌糸体を培養するための培地を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、マッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）菌糸体の液体培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
マッシュルームは、ハラタケ目ハラタケ科に属するキノコである。従来、マッシュルーム菌糸体の培養方法としては、固体培養法と液体培養法とが知られていた。固体培養法は、裁培時間が長く、汚染が発生する確率が高く、培養が完了した後に菌糸体のみを回収する作業を自動化し難いという短所がある。
【０００３】
マッシュルーム菌糸体の液体培養法は、固体培養法に比べて汚染可能性が少なく、比較的稠密な空間で短時間に大量培養できるという長所がある。Ｈｕｎｆｅｉｄらの論文（Ｍｙｃｏｌｏｇｙ ４４：６０５−６１１，１９５２（非特許文献１））には、マッシュルーム菌糸体を振とう及び酸素供給条件下で液体培養する方法が開示されている。また、Ｆｒａｓｅｒらの論文（Ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｓｃｉ.３：１９０−２００，１９５６（非特許文献２））には、酵母抽出物及びカゼインがマッシュルーム菌糸体の生育を促進するという内容が開示されている。また、韓国特許出願公開第１９９７−００２７２９５号（特許文献１）には、炭素源として、砂糖、麦芽糖、果糖、ブドウ糖、蔗糖、麦芽抽出物、及び水飴で構成される群から選択される一つまたは二つ以上を使用して、担子菌類を液体培養する方法が開示されている。しかし、培養期間が比較的長く、単糖類及び二糖類を使用するため、コストが高くなって大量培養には適していないという短所がある。
【０００４】
技術的課題
以上のような従来の技術によっても、コストが低くて大量培養に有利であり、培養時間が短くて汚染可能性が少なく、菌体生産性の高い培地成分を利用して、マッシュルーム菌体を培養する方法が依然として要求されている。
【０００５】
【特許文献１】韓国特許出願公開第１９９７−００２７２９５号
【非特許文献１】Ｈｕｎｆｅｉｄら、Ｍｙｃｏｌｏｇｙ ４４：６０５−６１１，１９５２
【非特許文献２】Ｆｒａｓｅｒら、Ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｓｃｉ.３：１９０−２００，１９５６
【発明の開示】
【０００６】
技術的解決
本発明は、効率的にマッシュルーム菌糸体を培養する方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、マッシュルーム菌糸体培養用培地を提供する。
【０００８】
本発明の1つの局面は、サトウキビ抽出物を含む液体培地中でマッシュルーム菌糸体またはその胞子を培養する工程を含むマッシュルーム菌糸体の培養方法を提供する。
【０００９】
前記サトウキビ抽出物は、１０ｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌの濃度を有しうる。前記サトウキビ抽出物が１０ｇ／ｌ未満であれば、マッシュルーム菌糸体の成長がなされず、３０ｇ／ｌを超える場合、滲透圧が高く、かつ非経済的であるため、前記濃度範囲で使用することが望ましい。前記サトウキビ抽出物は、主に炭素源及び成長因子源として使われる。本発明において、“サトウキビ抽出物”とは、サトウキビの汁を絞って濃縮して結晶化したものを称し、直接的に製造するか、または商業的に購入して使用しうる。
【００１０】
本発明の方法において、前記培地には、前記サトウキビ抽出物以外に、窒素源、燐酸及び微量元素などの栄養素をさらに含みうる。窒素源としては、有機窒素及び無機窒素源が含まれ、望ましくは、ソイトーン及び硝酸ナトリウムであり、さらに望ましくは、硝酸ナトリウムである。前記硝酸ナトリウムは、１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度を有しうる。硝酸ナトリウムは、マッシュルーム菌糸体による吸収率が優秀であり、コストが低く、他のアンモニアに基づいた窒素源を使用する場合、培地のｐＨが変化するという短所がある一方、硝酸ナトリウムは、ｐＨを一定に維持させる役割を行う。硝酸ナトリウムが１ｇ／ｌ未満であれば、菌糸体の生育に必要な窒素源が不足し、１０ｇ／ｌを超える場合、菌糸体に成長に大差がないので、１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度で使用することが望ましい。
【００１１】
本発明の方法において、前記培地は、酵母抽出物を１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度で含みうる。
【００１２】
本発明の方法において、前記培養は、初期ｐＨ６.０〜６.５、培養温度２５℃〜２８℃で、撹拌速度１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍで撹拌しながら行われる。
【００１３】
本発明の方法に使われるマッシュルーム菌糸体は、接種される前に、ブレンダーを使用して分散させたものでありうる。接種源を培養する中に、菌糸体の成長によって大きく塊化して酸素供給が困難になることを防止するために、小さい粒子状に分散させる必要がある。
【００１４】
前記培養工程は、所望の量の菌糸体が得られる期間に行われる。例えば、培養期間は、通常３日〜１０日間行われ、望ましくは、３日〜６日間行われる。本発明による場合、３日〜６日の培養期間で最大収率でマッシュルーム菌糸体が得られるので、１４日〜１５日間培養して、所望の最大収率でマッシュルーム菌糸体が得られた従来の技術に比べて、培養期間が短縮されうる。
【００１５】
本発明はまた、ポテトデキストロースブロス１５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、酵母抽出物１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ、及びソイトーン２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌを含む液体培地中で、前記マッシュルーム菌糸体またはその胞子を前培養する工程をさらに含みうる。
【００１６】
前培養とは、マッシュルーム菌糸体を本培養する前に、原菌から本培養に使用する種培養を得るために予め培養することを称す。原菌とは、種培養の製造において、その種の起源となる菌株である。種培養は、必要とする目的種のみを純粋に培養した増殖体を称し、接種源とは、培地に移し置く菌株であって増殖用種培養を称す。
【００１７】
前記前培養は、初期ｐＨ６.０〜６.５、培養温度２５℃〜２８℃で、撹拌速度１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍで撹拌しながら行われる。得られた菌糸体は、ブレンダーを使用して分散しうる。培養中に菌糸体の成長によって大きい塊りを形成して酸素供給が困難になることを防止するために、小さい粒子状に分散させる必要がある。前記前培養は、所望の量の増殖用種培養を得るまで培養しうるが、通常３日〜４日間培養することが望ましい。
【００１８】
本発明はまた、マッシュルーム菌糸体培養用培地を提供する。前記培地は、前記サトウキビ抽出物を含み、望ましくは、サトウキビ抽出物を１０ｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌの濃度で含む。本発明の培地には、窒素源として硝酸ナトリウムをさらに含みうる。望ましくは、前記培地は、前記硝酸ナトリウムは、１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度で含みうる。また、本発明の培地は、１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度の酵母抽出物をさらに含みうる。本発明の培地のｐＨは、望ましくは、初期ｐＨは、６.０〜６.５である。
【００１９】
本発明の培地の一具体例は、サトウキビ抽出物を１５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ及び硝酸ナトリウムは５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌを含み、さらに望ましくは、前記培地は、酵母抽出物を５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌをさらに含む。
【００２０】
本発明はまた、ポテトデキストロースブロス１５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、酵母抽出物１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ、及びソイトーン２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌを含むマッシュルーム菌糸体またはその胞子の前培養用培地を提供する。
【００２１】
上記およびその他の特徴および本発明の利点は、添付の図面に関して例示的な態様を詳細に記載することによってより明確になるであろう。
【００２２】
最良の形態
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１：菌株の分離及び接種源の調製
本発明の菌株は、マッシュルームの組織培養を通じて獲得しポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）で２５℃で３週間培養した後、得られたマッシュルーム菌糸体を４℃で保存した。
【００２４】
図１は、本発明の方法に使われたマッシュルーム菌糸体の電子顕微鏡画像である。
【００２５】
接種源の調製は、固体培養を通じて前記原菌から接種源を調製する場合、冷蔵保管されたＰＤＡ平板培地の中央部から菌糸体の一部を分離して固体培地上に接種した後、２５℃の恒温器で培養して得た。液体培養を通じて前記原菌から接種源を調製する場合、５００mlの三角フラスコにポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ）２０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物５ｇ／ｌ、及びソイトーン５ｇ／ｌで構成されたＰＤＢＹＭＳ培地１００mlを１２１℃で１５分間高圧滅菌した後、ここに菌糸体を接種して２５℃で２００ｒｐｍで撹拌しつつ培養した。以下の実施例で特別に記述された成分以外の残りの培地成分は、蒸溜水である。
【００２６】
実施例２：種前培養
種前培養のための最適条件を調べるために、表１に示したような組成を有する培地を製造した。製造された培地を５００mlの三角フラスコにそれぞれ１００ml入れ、１２１℃で１５分間高圧滅菌した後、無菌状態で均質化された接種源を１％（ｖ／ｖ）接種し、２５℃の恒温器で２００ｒｐｍで４日間振とう培養した。菌糸体成長程度を測定するために、培養液をガーゼで濾過した後、超遠心分離機で１,５００ｒｐｍで１０分間濾過分離した後、６０℃の乾燥オーブンで２４時間乾燥させて重量を測定した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
表１に示したように、ＰＤＢ ２４ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ及びソイトーン２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌを含む培地を使用した場合、菌糸体の成長が最も良好であった。
【００２９】
したがって、種培養の前培養のための培地は、ＰＤＢ ２４ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物５ｇ／ｌ及びソイトーン５ｇ／ｌを含む培地を使用した。また、本培養の最適条件を設定するための培養の基本培地として、ＰＤＢ ２４ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物５ｇ／ｌ及びソイトーン５ｇ／ｌで構成されたＰＤＢＹＭＳ培地を使用した。
【００３０】
ブレンダーを使用して、前培養において成長したマッシュルーム菌糸体として形成された塊を本培養前に分散させた。本実施例において、前記ブレンダーは、韓国特許公開第１９９８−００７２１１２号公報に公開されたような小型ミキサー器の形態を有するものを意味する。
【００３１】
実施例３：最適本培養条件の設定
１.最適温度
マッシュルーム菌糸体の生育のための最適培養温度を調べるために、５００mlの三角フラスコに前記基本培地を１００ml入れて１２１℃で１５分間高圧滅菌した後、無菌状態で均質化された接種源１％（ｖ／ｖ）を接種して、２５℃、２８℃、３０℃の温度に設定された恒温器で２００ｒｐｍの条件で４日間振とう培養しつつ菌糸成長を調べた。
【００３２】
図２は、培養温度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。
【００３３】
図２に示したように、２８℃及び３０℃で菌糸体成長が良好であり、特に、２８℃で菌糸体の成長が最大値を表した。
【００３４】
２.最適ｐＨ
マッシュルーム菌糸体の生育のための最適初期ｐＨを調べるために、５００mlの三角フラスコに前記基本培地を１００ml入れて、燐酸と５０％水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）とで初期ｐＨを４.０〜９.０と０.５単位で調節して、前記培地を１２１℃で１５分間高圧滅菌した後、無菌状態で均質化された接種源１％（ｖ／ｖ）を接種して、２５℃で２００ｒｐｍの条件で４日間振とう培養しつつ菌糸成長を調べた。
【００３５】
図３は、培地の初期ｐＨによるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。図３に示したように、ｐＨ６.０で菌糸体の成長が最も良好であったと現れた。
【００３６】
３.培養期間
マッシュルーム菌糸体の生育に及ぼす培養期間の影響を調べるために、５００mlの三角フラスコに前記基本培地を１００ml加えて初期ｐＨを６.０〜６.５に調節した後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した後、無菌状態で均質化された接種源１％（ｖ／ｖ）を接種して、２５℃で２００ｒｐｍの条件で１０日間振とう培養しつつ菌糸成長を調べた。
【００３７】
図４は、培養期間による菌糸体の生育程度を示す図面である。図４に示したように、菌糸体の成長は、培養２日目までは緩やかな増加を示し、培養３日以後から早く生育する対数期の典型的な形態を表した。最大菌糸体量は、培養９日目に２.４３ｇ／１００mlであると分かり、それ以後には、菌糸成長が減少する傾向を表した。前記結果から培養９日目と菌糸量の差が小さい６日を最適培養期間と定めた。
【００３８】
４.炭素源の選抜及び最適濃度
本培養のための最適培地の選定のために、前記基本培地を変形して菌糸体の生育を調べた。
【００３９】
すなわち、炭素源としてＰＤＢ２０ｇ／ｌを、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物５ｇ／ｌ及びソイトーン５ｇ／ｌと混合し、培地のｐＨを６.０〜６.５に調節した後、５００mlの三角フラスコに前記培地を１００ml加えて１２１℃で１５分間高圧滅菌して実験培地を調製した。ここに、無菌状態で均質化された接種源１％（ｖ／ｖ）を接種して２５℃で２００ｒｐｍの条件で４日間振とう培養して菌糸体の成長を調べた。炭素源としてブドウ糖、その後サトウキビ抽出物（ＣＪ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用すること以外は同じ条件で、この手順を繰り返した。
【００４０】
図５は、培地中の炭素源の種類によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。図５に示したように、炭素源としてサトウキビ抽出物を利用する時に最も菌糸体の成長が効率的であると分かった。
【００４１】
次いで、最適炭素源の濃度を選定するために、サトウキビ抽出物を１ｇ／ｌ、５ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ、１５ｇ／ｌ及び２０ｇ／mlとし、各実験群に酵母抽出物１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物５ｇ／ｌ及びソイトーン５ｇ／ｌを混合し、培地のｐＨを６.０〜６.５に調節した後、５００mlの三角フラスコに前記培地を１００ml加えて１２１℃で１５分間高圧滅菌して培地を調製して、炭素源選抜実験と同一に菌糸体の成長を調べた。
【００４２】
図６は、炭素源としてサトウキビ抽出物を使用する場合、その濃度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。図６に示したように、サトウキビ抽出物の濃度が１０〜２０ｇ／ｌである時に菌糸体の成長が良好であると分かった。
【００４３】
５.窒素源の選抜及び最適濃度
マッシュルーム菌糸体の生育のための最適窒素源及び濃度を調べるために、ＰＤＢＹＭＳ培地に最適炭素源であるサトウキビ抽出物を２０ｇ／ｌの濃度で添加した後、窒素源として硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム及びソイトーンを各１０ｇ／ｌずつ添加し、ｐＨを６.０〜６.５に調節した後、５００mlの三角フラスコに前記培地を１００ml加えて１２１℃で１５分間高圧滅菌して培地を調製して、炭素源選抜実験と同一に菌糸体の成長を調べた。
【００４４】
図７は、培地中の窒素源の種類によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。図７に示したように、窒素源としてソイトーンを使用する時に、最も菌糸体の成長が優秀であると分かり、硝酸ナトリウムがその次であった。経済的な面まで考慮する場合、硝酸ナトリウムが窒素源として最も望ましいと考えられる。
【００４５】
次いで、最適窒素源の濃度を選定するために、硝酸ナトリウムを１ｇ／ｌ、３ｇ／ｌ、５ｇ／ｌ、７ｇ／ｌ及び１０ｇ／ｌの濃度で使用したことを除いて、前記窒素源選抜実験と同一に菌糸体の成長を調べた。
【００４６】
図８は、窒素源として硝酸ナトリウムを使用する場合、その濃度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。図８に示したように、硝酸ナトリウムの濃度が１０ｇ／ｌである時に菌糸成長が最も良好であると分かった。追加的な実験結果、窒素源として硝酸ナトリウムを１０ｇ／ｌの濃度で含み、かつ酵母抽出物を５ｇ／ｌの濃度で含む場合、菌糸体の成長が最大であった。
【００４７】
実施例４：生物反応器でのマッシュルーム菌糸体の液体培養−最適インペラー回転数
本実施例では、マッシュルーム菌糸体を大量培養するために生物反応器内で撹拌しつつマッシュルーム菌糸体を培養した。
【００４８】
生物反応器は、ＢＩＯＦＬＯ ＩＩｃ Ｂａｔｃｈ／Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｄｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ.）を利用した。蒸溜水中にサトウキビ抽出物２０ｇ／ｌ、硝酸ナトリウム１０ｇ／ｌ及び酵母抽出物５ｇ／ｌを含む培地を培養培地とし、前記培地２ｌに無菌状態で均質化された接種源１％（ｖ／ｖ）を接種して、空気注入量０.２５ｖ／ｖ／ｍの条件で生物反応器のインペラー回転数をそれぞれ１５０ｒｐｍ、２００ｒｐｍ、２５０ｒｐｍ及び３００ｒｐｍに設定して４日間培養した後に湿重量を測定した。
【００４９】
図９は、生物反応器でマッシュルーム菌糸体を培養する場合、インペラー回転数によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。図９に示したように、インペラー回転数が２００ｒｐｍである場合、最大菌糸体が得られた。
【００５０】
産業上の利用可能性
本発明によるマッシュルーム菌糸体の培養方法によれば、多量のマッシュルーム菌糸体を早くて効率的に培養しうる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の方法に使われたマッシュルーム菌糸体の電子顕微鏡画像である。
【図２】培養温度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【図３】培地の初期ｐＨによるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【図４】培養期間による菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【図５】培地中の炭素源の種類によるマッシュルーム菌体の生育程度を示すグラフである。
【図６】炭素源としてサトウキビ抽出物を使用する場合、その濃度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【図７】培地中の窒素源の種類によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【図８】窒素源として使用した硝酸ナトリウムの濃度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【図９】生物反応器でマッシュルーム菌糸体を培養する場合、生物反応器の撹拌速度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、マッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）菌糸体の液体培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
マッシュルームは、ハラタケ目ハラタケ科に属するキノコである。従来、マッシュルーム菌糸体の培養方法としては、固体培養法と液体培養法とが知られていた。固体培養法は、裁培時間が長く、汚染が発生する確率が高く、培養が完了した後に菌糸体のみを回収する作業を自動化し難いという短所がある。
【０００３】
マッシュルーム菌糸体の液体培養法は、固体培養法に比べて汚染可能性が少なく、比較的稠密な空間で短時間に大量培養できるという長所がある。Ｈｕｎｆｅｉｄらの論文（Ｍｙｃｏｌｏｇｙ ４４：６０５−６１１，１９５２（非特許文献１））には、マッシュルーム菌糸体を振とう及び酸素供給条件下で液体培養する方法が開示されている。また、Ｆｒａｓｅｒらの論文（Ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｓｃｉ.３：１９０−２００，１９５６（非特許文献２））には、酵母抽出物及びカゼインがマッシュルーム菌糸体の生育を促進するという内容が開示されている。また、韓国特許出願公開第１９９７−００２７２９５号（特許文献１）には、炭素源として、砂糖、麦芽糖、果糖、ブドウ糖、蔗糖、麦芽抽出物、及び水飴で構成される群から選択される一つまたは二つ以上を使用して、担子菌類を液体培養する方法が開示されている。しかし、培養期間が比較的長く、単糖類及び二糖類を使用するため、コストが高くなって大量培養には適していないという短所がある。
【０００４】
技術的課題
以上のような従来の技術によっても、コストが低くて大量培養に有利であり、培養時間が短くて汚染可能性が少なく、菌体生産性の高い培地成分を利用して、マッシュルーム菌体を培養する方法が依然として要求されている。
【０００５】
【特許文献１】韓国特許出願公開第１９９７−００２７２９５号
【非特許文献１】Ｈｕｎｆｅｉｄら、Ｍｙｃｏｌｏｇｙ ４４：６０５−６１１，１９５２
【非特許文献２】Ｆｒａｓｅｒら、Ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｓｃｉ.３：１９０−２００，１９５６
【発明の開示】
【０００６】
技術的解決
本発明は、効率的にマッシュルーム菌糸体を培養する方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、マッシュルーム菌糸体培養用培地を提供する。
【０００８】
本発明の1つの局面は、サトウキビ抽出物を含む液体培地中でマッシュルーム菌糸体またはその胞子を培養する工程を含むマッシュルーム菌糸体の培養方法を提供する。
【０００９】
前記サトウキビ抽出物は、１０ｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌの濃度を有しうる。前記サトウキビ抽出物が１０ｇ／ｌ未満であれば、マッシュルーム菌糸体の成長がなされず、３０ｇ／ｌを超える場合、滲透圧が高く、かつ非経済的であるため、前記濃度範囲で使用することが望ましい。前記サトウキビ抽出物は、主に炭素源及び成長因子源として使われる。本発明において、“サトウキビ抽出物”とは、サトウキビの汁を絞って濃縮して結晶化したものを称し、直接的に製造するか、または商業的に購入して使用しうる。
【００１０】
本発明の方法において、前記培地には、前記サトウキビ抽出物以外に、窒素源、燐酸及び微量元素などの栄養素をさらに含みうる。窒素源としては、有機窒素及び無機窒素源が含まれ、望ましくは、ソイトーン及び硝酸ナトリウムであり、さらに望ましくは、硝酸ナトリウムである。前記硝酸ナトリウムは、１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度を有しうる。硝酸ナトリウムは、マッシュルーム菌糸体による吸収率が優秀であり、コストが低く、他のアンモニアに基づいた窒素源を使用する場合、培地のｐＨが変化するという短所がある一方、硝酸ナトリウムは、ｐＨを一定に維持させる役割を行う。硝酸ナトリウムが１ｇ／ｌ未満であれば、菌糸体の生育に必要な窒素源が不足し、１０ｇ／ｌを超える場合、菌糸体に成長に大差がないので、１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度で使用することが望ましい。
【００１１】
本発明の方法において、前記培地は、酵母抽出物を１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度で含みうる。
【００１２】
本発明の方法において、前記培養は、初期ｐＨ６.０〜６.５、培養温度２５℃〜２８℃で、撹拌速度１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍで撹拌しながら行われる。
【００１３】
本発明の方法に使われるマッシュルーム菌糸体は、接種される前に、ブレンダーを使用して分散させたものでありうる。接種源を培養する中に、菌糸体の成長によって大きく塊化して酸素供給が困難になることを防止するために、小さい粒子状に分散させる必要がある。
【００１４】
前記培養工程は、所望の量の菌糸体が得られる期間に行われる。例えば、培養期間は、通常３日〜１０日間行われ、望ましくは、３日〜６日間行われる。本発明による場合、３日〜６日の培養期間で最大収率でマッシュルーム菌糸体が得られるので、１４日〜１５日間培養して、所望の最大収率でマッシュルーム菌糸体が得られた従来の技術に比べて、培養期間が短縮されうる。
【００１５】
本発明はまた、ポテトデキストロースブロス１５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、酵母抽出物１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ、及びソイトーン２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌを含む液体培地中で、前記マッシュルーム菌糸体またはその胞子を前培養する工程をさらに含みうる。
【００１６】
前培養とは、マッシュルーム菌糸体を本培養する前に、原菌から本培養に使用する種培養を得るために予め培養することを称す。原菌とは、種培養の製造において、その種の起源となる菌株である。種培養は、必要とする目的種のみを純粋に培養した増殖体を称し、接種源とは、培地に移し置く菌株であって増殖用種培養を称す。
【００１７】
前記前培養は、初期ｐＨ６.０〜６.５、培養温度２５℃〜２８℃で、撹拌速度１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍで撹拌しながら行われる。得られた菌糸体は、ブレンダーを使用して分散しうる。培養中に菌糸体の成長によって大きい塊りを形成して酸素供給が困難になることを防止するために、小さい粒子状に分散させる必要がある。前記前培養は、所望の量の増殖用種培養を得るまで培養しうるが、通常３日〜４日間培養することが望ましい。
【００１８】
本発明はまた、マッシュルーム菌糸体培養用培地を提供する。前記培地は、前記サトウキビ抽出物を含み、望ましくは、サトウキビ抽出物を１０ｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌの濃度で含む。本発明の培地には、窒素源として硝酸ナトリウムをさらに含みうる。望ましくは、前記培地は、前記硝酸ナトリウムは、１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度で含みうる。また、本発明の培地は、１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度の酵母抽出物をさらに含みうる。本発明の培地のｐＨは、望ましくは、初期ｐＨは、６.０〜６.５である。
【００１９】
本発明の培地の一具体例は、サトウキビ抽出物を１５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ及び硝酸ナトリウムは５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌを含み、さらに望ましくは、前記培地は、酵母抽出物を５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌをさらに含む。
【００２０】
本発明はまた、ポテトデキストロースブロス１５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、酵母抽出物１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ、及びソイトーン２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌを含むマッシュルーム菌糸体またはその胞子の前培養用培地を提供する。
【００２１】
上記およびその他の特徴および本発明の利点は、添付の図面に関して例示的な態様を詳細に記載することによってより明確になるであろう。
【００２２】
最良の形態
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１：菌株の分離及び接種源の調製
本発明の菌株は、マッシュルームの組織培養を通じて獲得しポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）で２５℃で３週間培養した後、得られたマッシュルーム菌糸体を４℃で保存した。
【００２４】
図１は、本発明の方法に使われたマッシュルーム菌糸体の電子顕微鏡画像である。
【００２５】
接種源の調製は、固体培養を通じて前記原菌から接種源を調製する場合、冷蔵保管されたＰＤＡ平板培地の中央部から菌糸体の一部を分離して固体培地上に接種した後、２５℃の恒温器で培養して得た。液体培養を通じて前記原菌から接種源を調製する場合、５００mlの三角フラスコにポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ）２０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物５ｇ／ｌ、及びソイトーン５ｇ／ｌで構成されたＰＤＢＹＭＳ培地１００mlを１２１℃で１５分間高圧滅菌した後、ここに菌糸体を接種して２５℃で２００ｒｐｍで撹拌しつつ培養した。以下の実施例で特別に記述された成分以外の残りの培地成分は、蒸溜水である。
【００２６】
実施例２：種前培養
種前培養のための最適条件を調べるために、表１に示したような組成を有する培地を製造した。製造された培地を５００mlの三角フラスコにそれぞれ１００ml入れ、１２１℃で１５分間高圧滅菌した後、無菌状態で均質化された接種源を１％（ｖ／ｖ）接種し、２５℃の恒温器で２００ｒｐｍで４日間振とう培養した。菌糸体成長程度を測定するために、培養液をガーゼで濾過した後、超遠心分離機で１,５００ｒｐｍで１０分間濾過分離した後、６０℃の乾燥オーブンで２４時間乾燥させて重量を測定した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
表１に示したように、ＰＤＢ ２４ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ及びソイトーン２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌを含む培地を使用した場合、菌糸体の成長が最も良好であった。
【００２９】
したがって、種培養の前培養のための培地は、ＰＤＢ ２４ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物５ｇ／ｌ及びソイトーン５ｇ／ｌを含む培地を使用した。また、本培養の最適条件を設定するための培養の基本培地として、ＰＤＢ ２４ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物５ｇ／ｌ及びソイトーン５ｇ／ｌで構成されたＰＤＢＹＭＳ培地を使用した。
【００３０】
ブレンダーを使用して、前培養において成長したマッシュルーム菌糸体として形成された塊を本培養前に分散させた。本実施例において、前記ブレンダーは、韓国特許公開第１９９８−００７２１１２号公報に公開されたような小型ミキサー器の形態を有するものを意味する。
【００３１】
実施例３：最適本培養条件の設定
１.最適温度
マッシュルーム菌糸体の生育のための最適培養温度を調べるために、５００mlの三角フラスコに前記基本培地を１００ml入れて１２１℃で１５分間高圧滅菌した後、無菌状態で均質化された接種源１％（ｖ／ｖ）を接種して、２５℃、２８℃、３０℃の温度に設定された恒温器で２００ｒｐｍの条件で４日間振とう培養しつつ菌糸成長を調べた。
【００３２】
図２は、培養温度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。
【００３３】
図２に示したように、２８℃及び３０℃で菌糸体成長が良好であり、特に、２８℃で菌糸体の成長が最大値を表した。
【００３４】
２.最適ｐＨ
マッシュルーム菌糸体の生育のための最適初期ｐＨを調べるために、５００mlの三角フラスコに前記基本培地を１００ml入れて、燐酸と５０％水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）とで初期ｐＨを４.０〜９.０と０.５単位で調節して、前記培地を１２１℃で１５分間高圧滅菌した後、無菌状態で均質化された接種源１％（ｖ／ｖ）を接種して、２５℃で２００ｒｐｍの条件で４日間振とう培養しつつ菌糸成長を調べた。
【００３５】
図３は、培地の初期ｐＨによるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。図３に示したように、ｐＨ６.０で菌糸体の成長が最も良好であったと現れた。
【００３６】
３.培養期間
マッシュルーム菌糸体の生育に及ぼす培養期間の影響を調べるために、５００mlの三角フラスコに前記基本培地を１００ml加えて初期ｐＨを６.０〜６.５に調節した後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した後、無菌状態で均質化された接種源１％（ｖ／ｖ）を接種して、２５℃で２００ｒｐｍの条件で１０日間振とう培養しつつ菌糸成長を調べた。
【００３７】
図４は、培養期間による菌糸体の生育程度を示す図面である。図４に示したように、菌糸体の成長は、培養２日目までは緩やかな増加を示し、培養３日以後から早く生育する対数期の典型的な形態を表した。最大菌糸体量は、培養９日目に２.４３ｇ／１００mlであると分かり、それ以後には、菌糸成長が減少する傾向を表した。前記結果から培養９日目と菌糸量の差が小さい６日を最適培養期間と定めた。
【００３８】
４.炭素源の選抜及び最適濃度
本培養のための最適培地の選定のために、前記基本培地を変形して菌糸体の生育を調べた。
【００３９】
すなわち、炭素源としてＰＤＢ２０ｇ／ｌを、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物５ｇ／ｌ及びソイトーン５ｇ／ｌと混合し、培地のｐＨを６.０〜６.５に調節した後、５００mlの三角フラスコに前記培地を１００ml加えて１２１℃で１５分間高圧滅菌して実験培地を調製した。ここに、無菌状態で均質化された接種源１％（ｖ／ｖ）を接種して２５℃で２００ｒｐｍの条件で４日間振とう培養して菌糸体の成長を調べた。炭素源としてブドウ糖、その後サトウキビ抽出物（ＣＪ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用すること以外は同じ条件で、この手順を繰り返した。
【００４０】
図５は、培地中の炭素源の種類によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。図５に示したように、炭素源としてサトウキビ抽出物を利用する時に最も菌糸体の成長が効率的であると分かった。
【００４１】
次いで、最適炭素源の濃度を選定するために、サトウキビ抽出物を１ｇ／ｌ、５ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ、１５ｇ／ｌ及び２０ｇ／mlとし、各実験群に酵母抽出物１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物５ｇ／ｌ及びソイトーン５ｇ／ｌを混合し、培地のｐＨを６.０〜６.５に調節した後、５００mlの三角フラスコに前記培地を１００ml加えて１２１℃で１５分間高圧滅菌して培地を調製して、炭素源選抜実験と同一に菌糸体の成長を調べた。
【００４２】
図６は、炭素源としてサトウキビ抽出物を使用する場合、その濃度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。図６に示したように、サトウキビ抽出物の濃度が１０〜２０ｇ／ｌである時に菌糸体の成長が良好であると分かった。
【００４３】
５.窒素源の選抜及び最適濃度
マッシュルーム菌糸体の生育のための最適窒素源及び濃度を調べるために、ＰＤＢＹＭＳ培地に最適炭素源であるサトウキビ抽出物を２０ｇ／ｌの濃度で添加した後、窒素源として硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム及びソイトーンを各１０ｇ／ｌずつ添加し、ｐＨを６.０〜６.５に調節した後、５００mlの三角フラスコに前記培地を１００ml加えて１２１℃で１５分間高圧滅菌して培地を調製して、炭素源選抜実験と同一に菌糸体の成長を調べた。
【００４４】
図７は、培地中の窒素源の種類によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。図７に示したように、窒素源としてソイトーンを使用する時に、最も菌糸体の成長が優秀であると分かり、硝酸ナトリウムがその次であった。経済的な面まで考慮する場合、硝酸ナトリウムが窒素源として最も望ましいと考えられる。
【００４５】
次いで、最適窒素源の濃度を選定するために、硝酸ナトリウムを１ｇ／ｌ、３ｇ／ｌ、５ｇ／ｌ、７ｇ／ｌ及び１０ｇ／ｌの濃度で使用したことを除いて、前記窒素源選抜実験と同一に菌糸体の成長を調べた。
【００４６】
図８は、窒素源として硝酸ナトリウムを使用する場合、その濃度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。図８に示したように、硝酸ナトリウムの濃度が１０ｇ／ｌである時に菌糸成長が最も良好であると分かった。追加的な実験結果、窒素源として硝酸ナトリウムを１０ｇ／ｌの濃度で含み、かつ酵母抽出物を５ｇ／ｌの濃度で含む場合、菌糸体の成長が最大であった。
【００４７】
実施例４：生物反応器でのマッシュルーム菌糸体の液体培養−最適インペラー回転数
本実施例では、マッシュルーム菌糸体を大量培養するために生物反応器内で撹拌しつつマッシュルーム菌糸体を培養した。
【００４８】
生物反応器は、ＢＩＯＦＬＯ ＩＩｃ Ｂａｔｃｈ／Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｄｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ.）を利用した。蒸溜水中にサトウキビ抽出物２０ｇ／ｌ、硝酸ナトリウム１０ｇ／ｌ及び酵母抽出物５ｇ／ｌを含む培地を培養培地とし、前記培地２ｌに無菌状態で均質化された接種源１％（ｖ／ｖ）を接種して、空気注入量０.２５ｖ／ｖ／ｍの条件で生物反応器のインペラー回転数をそれぞれ１５０ｒｐｍ、２００ｒｐｍ、２５０ｒｐｍ及び３００ｒｐｍに設定して４日間培養した後に湿重量を測定した。
【００４９】
図９は、生物反応器でマッシュルーム菌糸体を培養する場合、インペラー回転数によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示す図面である。図９に示したように、インペラー回転数が２００ｒｐｍである場合、最大菌糸体が得られた。
【００５０】
産業上の利用可能性
本発明によるマッシュルーム菌糸体の培養方法によれば、多量のマッシュルーム菌糸体を早くて効率的に培養しうる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の方法に使われたマッシュルーム菌糸体の電子顕微鏡画像である。
【図２】培養温度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【図３】培地の初期ｐＨによるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【図４】培養期間による菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【図５】培地中の炭素源の種類によるマッシュルーム菌体の生育程度を示すグラフである。
【図６】炭素源としてサトウキビ抽出物を使用する場合、その濃度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【図７】培地中の窒素源の種類によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【図８】窒素源として使用した硝酸ナトリウムの濃度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【図９】生物反応器でマッシュルーム菌糸体を培養する場合、生物反応器の撹拌速度によるマッシュルーム菌糸体の生育程度を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サトウキビ抽出物を含む液体培地中でマッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）菌糸体またはその胞子を培養する工程を含む、マッシュルーム菌糸体の培養方法。
【請求項２】
サトウキビ抽出物が１０ｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌの濃度を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
培地が窒素源として硝酸ナトリウムをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
硝酸ナトリウムが１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度を有する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
培地が、酵母抽出物を１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度で含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
マッシュルーム菌糸体を培養する工程が、初期ｐＨ６.０〜６.５、培養温度２５℃〜２８℃で、撹拌速度１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍで撹拌しながら行われる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
マッシュルーム菌糸体がブレンダーを使用して分散される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
マッシュルーム菌糸体の培養が、完了前に３〜６日間行われる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ポテトデキストロースブロス１５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、酵母抽出物１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ、及びソイトーン２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌを含む液体培地中でマッシュルーム菌糸体またはその胞子を前培養することによって、マッシュルーム種培養を調製する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
マッシュルーム菌糸体またはその胞子の前培養が、初期ｐＨ６.０〜６.５、培養温度２５℃〜２８℃で、撹拌速度１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍで撹拌しながら行われる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ブレンダーを使用して前培養されたマッシュルームを分散させる工程をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
サトウキビ抽出物１０ｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ及び硝酸ナトリウム１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌを含む、マッシュルーム菌糸体培養用培地。
【請求項１３】
１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度で酵母抽出物をさらに含む、請求項１２記載の培地。
【請求項１４】
ポテトデキストロースブロス１５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、酵母抽出物１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ、及びソイトーン２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌを含む、マッシュルーム菌糸体またはその胞子の前培養用培地。
【請求項１】
サトウキビ抽出物を含む液体培地中でマッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）菌糸体またはその胞子を培養する工程を含む、マッシュルーム菌糸体の培養方法。
【請求項２】
サトウキビ抽出物が１０ｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌの濃度を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
培地が窒素源として硝酸ナトリウムをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
硝酸ナトリウムが１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度を有する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
培地が、酵母抽出物を１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度で含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
マッシュルーム菌糸体を培養する工程が、初期ｐＨ６.０〜６.５、培養温度２５℃〜２８℃で、撹拌速度１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍで撹拌しながら行われる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
マッシュルーム菌糸体がブレンダーを使用して分散される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
マッシュルーム菌糸体の培養が、完了前に３〜６日間行われる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ポテトデキストロースブロス１５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、酵母抽出物１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ、及びソイトーン２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌを含む液体培地中でマッシュルーム菌糸体またはその胞子を前培養することによって、マッシュルーム種培養を調製する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
マッシュルーム菌糸体またはその胞子の前培養が、初期ｐＨ６.０〜６.５、培養温度２５℃〜２８℃で、撹拌速度１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍで撹拌しながら行われる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ブレンダーを使用して前培養されたマッシュルームを分散させる工程をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
サトウキビ抽出物１０ｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌ及び硝酸ナトリウム１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌを含む、マッシュルーム菌糸体培養用培地。
【請求項１３】
１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度で酵母抽出物をさらに含む、請求項１２記載の培地。
【請求項１４】
ポテトデキストロースブロス１５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、酵母抽出物１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、麦芽抽出物２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ、及びソイトーン２ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌを含む、マッシュルーム菌糸体またはその胞子の前培養用培地。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５３８１２９（Ｐ２００９−５３８１２９Ａ）
【公表日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１１９５３（Ｐ２００９−５１１９５３）
【出願日】平成１９年５月２５日（２００７．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００２５５５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３９３２２
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０５１９６２００）シージェー コーポレーション (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２５日（２００７．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００２５５５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３９３２２
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０５１９６２００）シージェー コーポレーション (8)
【Ｆターム（参考）】
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