メチオニンの製造方法
本発明は、メチオニンの発酵による製造方法、その際に得られたメチオニンの単離方法、単離の際に生じたメチオニンを含有するバイオマス、飼料又は飼料補助剤の製造のためのその使用並びに食料又は飼料若しくは食料補助剤又は飼料補助剤の製造のための単離されたメチオニンの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチオニンを発酵により製造する方法、その際に形成されたメチオニンを単離する方法、単離の際に生じたメチオニンを含有するバイオマス、飼料及び飼料補助剤を製造するためのその使用、並びに食料又は飼料若しくは食料補助剤又は飼料補助剤を製造するための単離されたメチオニンの使用に関する。
【０００２】
背景技術
メチオニンは、食料工業、飼料工業、化粧品工業及び製薬工業を含めた種々の分野で使用されている。
【０００３】
従来、Ｄ、Ｌ−メチオニンの化学的製造方法が技術的に重要であるにすぎなかった。この合成の出発物質は、硫化水素、メチルメルカプタン、アクロレイン、青酸又はメチルメルカプトプロピオンアルデヒドである（ウールマン工業化学百科事典（１９８５年）、Ａ２巻、７１頁（Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry(1985), Vol. A2, Seite７１）を参照のこと）。
【０００４】
メチオニンはまた、天然の細胞の物質代謝プロセスを介して生産される。その工業的基準の生産は、大量の所望の物質を生産及び分泌させるために開発された細菌培養によって非常に合理的に実施された。この目的のために特に好適な生物は、非病原性コリネフォルム細菌である。
【０００５】
メチオニンを、コリネフォルム細菌株、特にコリネバクテリウム・グルタミクム（Colynebacterium glutamicum）菌の発酵によって製造できることは公知である。これは極めて重要であるので、この製造方法の改善について絶え間なく研究されている。方法の改善は、例えば、発酵技術手段、栄養培地の組成、又は微生物それ自体の固有の能力特性に関連し得る。
【０００６】
所定の分子の生産に関してこの微生物の能力特性の改善のために、突然変異、選択及び変異体選択の方法か又はアミノ酸生産株、例えばコルネ細菌の株の改善のための組換えＤＮＡ技術の方法を、個々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅するか又は消失させることによって使用でき、これによりアミノ酸生産の改善がもたらされる。
【０００７】
例えば、ＷＯ−Ａ−０２／１０２０９号及びＤＥ−Ａ−１０１３６９８６号は、遺伝子改変されたＬ−メチオニン生産コルネフォルム細菌を使用して、Ｌ−メチオニンを発酵により製造する方法を記載している。そこでは、とりわけ、細菌の発酵、培地中か又は細菌中のアミノ酸の富化及びアミノ酸の単離を含むＬ−メチオニンの製造方法が記載されている。更に、以下の段階：ａ）Ｌ−メチオニン生産微生物の発酵；ｂ）発酵ブロスの濃縮；例えば蒸発による濃縮；ｃ）バイオマスの分離（０〜１００％）、例えば遠心分離による分離；及びｄ）乾燥、例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥、噴霧造粒による乾燥を含む発酵ブロスからのＬ−メチオニンを含有する動物飼料添加剤の製造方法が記載されている。
【０００８】
スワパンら（Swapan et al）は、微生物バイオテクノロジー紀要４号（１）３５〜４１頁（１９８９年）（J.Microbial Biotechnology, 4(1), 35~41(1989)）に、発酵ブロスからの細胞を分離すること、ｐＨを５に調節すること、活性炭及びイオン交換クロマトグラフィーで処理することによる、巨大菌（Bacillus metaterium）変異体を用いるメチオニンの微生物生産を記載している。
【０００９】
ＤＥ−Ａ−３５３３１９８号からは、特定の好熱性細菌を用いるＬ−ロイシンの発酵的製造が公知である。この発酵は、＋６０℃で連続的に、バイオマスを維持しつつ、生成物を含有する消費培地の分離、結晶器内での冷却（＋２℃まで）、結晶化されたアミノ酸の回収及び反応器への母液の返送を実施する。そこには、発酵によるメチオニンの生産については記載されていない。
【００１０】
これまでに記載された微生物によるメチオニンの生産方法は、依然として工業的基準の生産の要求を満たすものではない。この理由は、一方では水性発酵培地中のメチオニンの限定された溶解性であり、これは生合成能が高い場合に、メチオニンが発酵ブロス中に沈殿することをもたらし、これにより精製が阻害される。更なる理由は、技術水準により操作する場合には、相当の廃棄物流が生じ、この除去が高コストと結びつくことである。
【００１１】
本発明の簡単な説明
従って本発明の課題は、特に、メチオニンを部分的に結晶形で含有する発酵ブロスに使用できる、発酵により製造されたメチオニンの改善された単離方法を提供することである。別の課題は、実際に廃棄物流が生じず、これにより特に経済的に実施できる、メチオニンを含有する発酵ブロスの後処理方法を提供することである。
【００１２】
驚くべきことに、前記課題は、バイオマス分離のためにメチオニンの溶解性を集中的に利用する後処理方法を提供することによって解決された。この方法は、発酵により製造されたＬ−メチオニンの精製方法として結晶化を利用する。これは、飼料添加剤として使用される異なる２種の生成物（低濃度生成物及び高濃度生成物）を供給する。特定の方法においては、実際に廃棄物流が生じず、そして特に工業的基準における経済的なメチオニン製造が可能になる。
【００１３】
本発明の詳細な説明
Ａ）一般的な定義
「メチオニン」は、本発明の意味においては、原則的に、Ｌ−メチオニン又はＤ−メチオニン、これらの異性体の混合物、例えばラセミ体を含むが、Ｌ−メチオニンが好ましい。
【００１４】
メチオニンの溶解度は、水中で２０℃では約３０ｇ／ｌであり、７０℃では９０ｇ／ｌを上回る。発酵ブロス中においては、この条件下で、これに匹敵する規模の溶解度が観察される。
【００１５】
方法の手段、例えば「濃縮」、「分離」、「洗浄」、「乾燥」は、本発明の意味においては、当業者の能力の範囲内に存在する全種の方法を含む。例えば、「濃縮」は、大気圧下か又は真空適用での液相の蒸発と解してよい。「濃縮」は、例えば、慣用技術、例えば逆浸透又はナノ濾過若しくは慣用設備、例えば流下膜式蒸発器、薄膜式蒸発器又は回転式蒸発器若しくはこれらの組み合わせ物の使用下で実施してよい。「分離」は、例えば遠心分離、濾過、デカンテーション又はこれらの方法の組み合わせを含んでよい。「洗浄」は、例えば、固体の濾別及び場合により濾過残留物の懸濁後の一回又は数回の洗浄を含んでよい。「乾燥」は、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧造粒、流動層乾燥又はこれらの方法の組み合わせを含んでよい。
【００１６】
Ｂ）本発明の好ましい実施形態
本発明の第一の対象は、発酵により製造されたメチオニンを単離する方法において、
ａ）メチオニン生産微生物の発酵の際に生じ、メチオニンを含有し、特にメチオニンを部分的に未溶解の形で含有する液体分画を、液相中のメチオニンの溶解度が増大するのに十分な温度、好ましくはメチオニンが実質的に完全に溶解するのに十分な温度に加熱し、
ｂ）この液体分画から、メチオニンが富化された液相を得て、そして、
ｃ）場合により富化された液相を濃縮した後に、メチオニンを結晶化する方法に関する。
【００１７】
「実質的に」完全に溶解とは、メチオニンが、液相中のメチオニンの全含有率に対して、例えば９５％を上回って溶解している場合、９８％を上回って溶解している場合、特に１００％まで溶解している場合である。
【００１８】
メチオニンを含有する「液体分画」は、一般的には、発酵工程から得られ、特にメチオニンを部分的に未溶解の形で含有するブロスであり、場合により、慣用的に発酵ブロス中に含まれていてよい更なる固体構成成分を有するブロスか：又はこれに由来する液体、例えば好適な前処理によって得られた液体を有していてよい。「前処理」は、例えば、蒸発による濃縮又は物質の添加であってよい。例えば、メチオニン含有分画を、前の後処理バッチからブロスに添加するか若しくは引き続いての後処理段階又は目的に応じた生成物の使用（例えば飼料添加剤として）を促進する添加剤（以下を参照のこと）を添加してよい。
【００１９】
場合により高められた発酵ブロスの未溶解メチオニンの含有率は、発酵ブロスの全質量に対して、約１質量％〜約１０質量％、好ましくは約３質量％〜約８質量％の範囲内か又は全固体含有率に対して約３０質量％〜約８０質量％、好ましくは約５０質量％〜約５７質量％の範囲内である。
【００２０】
例えば、本発明にかかる発酵は、約９６ｇ／ｌのメチオニン含有量をもたらすことができ、このうち、一般的な発酵温度では、約４６ｇ／ｌが溶解しており、かつ約５０ｇ／ｌが未溶解で存在する。
【００２１】
富化された液相のメチオニン含有率は、乾燥残留物に対して、約６０質量％〜約１００質量％、又は約９０質量％〜約１００質量％、例えば約７５質量％〜約８５質量％又は約９５質量％〜約１００質量％の範囲内であり、これらはそれぞれ乾燥質量に対するものである。
【００２２】
メチオニンを実質的に溶解させるために、段階ａ）において、溶解されるべき生成物の量に応じて、約６０℃〜約１２０℃、好ましくは約７０℃〜約１００℃の範囲内の温度に加熱する。その際、場合により圧力をわずかに高めて、例えば１〜５ａｔｍの下で操作することが必要であり得る。
【００２３】
段階ａ）においては、液体分画として、更なる前処理がなされていないバイオマスを含有する発酵ブロスを使用することが好ましい。
【００２４】
段階ｂ）のメチオニンが富化された液相は、溶解したメチオニンが富化され、加熱された発酵ブロスからバイオマスを分離することによって得ることが好ましい。メチオニンの早期の結晶化を防ぐために、バイオマスの分離の間、同様に温度を高めて、好ましくは上述した範囲の温度で操作する。
【００２５】
本発明の好ましい一実施形態においては、
ｄ）結晶化されたメチオニンを分離し、
ｅ）分離された固体の、好ましくは結晶性メチオニンを、場合により洗浄し、そして
ｆ）それを場合により乾燥させる。
【００２６】
更なる好ましい変法により、段階ｂ）において、分離されたバイオマスを、
ｇ１）場合により洗浄し、その際、洗浄に使用される液体を場合により加熱し、そして
ｇ３）それを乾燥させる。
【００２７】
この場合、この洗液の加熱は、例えば分離されたバイオマス分画中に固体メチオニンが含まれることが望ましい場合に必要であり得、かつこのバイオマス分画からメチオニンを可能な限り得ることが望ましい。
【００２８】
廃棄物流を回避するために、好ましくは、
ｇ２）段階ｇ１）において生じた洗液と、段階ｂ）のメチオニンが富化された液相とを合する。
【００２９】
上述の方法の後に得られた段階ｂ）のメチオニンを含有する液相を、例えば加熱しつつ、蒸留すること及び場合により真空を適用することによって更に濃縮する。その際に生ずる濃縮物のメチオニン含有率は、このとき濃縮物の全質量に対して約１０質量％〜約４０質量％の範囲内である。この場合、メチオニンの分離は、好ましくは冷却結晶化によって実施する。このために、この溶液を０〜２０℃の範囲内の温度に冷却する。結晶化の完了後に、この固体メチオニンを低温の洗液、例えば水で洗浄し、そして場合によりわずかに加熱して乾燥させる。
【００３０】
更なる変法によれば、段階ｄ）において生じた母液を、
ｄ１）メチオニン生産微生物を有する別の発酵バッチからのメチオニンを含有する液体分画と合するか；又は
ｄ２）メチオニン生産微生物を有する同じ又は別の発酵バッチから分離されたバイオマスに、段階ｇ３）による乾燥の前に添加する。
【００３１】
更なる変法によれば、段階ｅ）において生じた洗液を、
ｅ１）メチオニン生産微生物を有する別の発酵バッチからのメチオニンを含有する液体分画と合するか；又は
ｄ２）メチオニン生産微生物を有する同じ又は別の発酵バッチから分離されたバイオマスに、段階ｇ３）による乾燥の前に添加する。
【００３２】
母液及び洗液の返送によって、廃棄物流の発生が更に阻止される。
【００３３】
本発明によれば、更に、段階ｇ３）による乾燥は、噴霧乾燥段階を含むことが好ましい。
【００３４】
本発明の更なる対象は、メチオニンを発酵により製造する方法において、天然微生物又は組換え微生物を自体公知のように発酵し、そして形成されたメチオニンを上述の定義による方法によって単離する方法に関する。
【００３５】
好ましい実施形態においては、本発明にかかる方法は、コリネバクテリウム属の天然細菌又は組換え細菌から選択されたメチオニン生産微生物の使用下で実施する。
【００３６】
更に本発明は、飼料又は飼料補助剤（飼料添加剤）の製造のための、上述の段階ｇ３）によって得られた乾燥物の使用に関する。
【００３７】
本発明の対象はまた、食料又は飼料若しくは食料補助剤又は飼料補助剤を製造するための、本発明により単離されたメチオニンの使用である。
【００３８】
最後に、本発明は、上述の定義による方法によって得られたメチオニンを含有する乾燥バイオマス；かかるバイオマスを有する飼料添加剤；並びに慣用の飼料構成成分の他にかかる飼料添加剤を含有する飼料組成物に関する。
【００３９】
以下の段落においては、更なる本発明の展開を説明する。
【００４０】
Ｃ）本発明により使用される宿主細胞
本発明にかかる方法には、コリネフォルム細菌を使用することが好ましい。コリネバクテリウム属の細菌が好ましい。コリネバクテリウム属からは、特にＬ−アミノ酸生産能が当業者に知られているコリネバクテリウム・グルタミクム種を挙げることができる。
【００４１】
好適な株の例として：
コリネバクテリウム属から：
コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Colynebacterium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Colynebacterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Colynebacterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、コリネバクテリウム・メラッセコラ（Colynebacterium melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５；コリネバクテリウム・グルタミクム ＫＦＣＣ１００６５；又はコリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ２１６０８、
又は、ブレビバクテリウム属から：
ブレビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavum） ＡＴＣＣ１４０６７；ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum） ＡＴＣＣ１３８６９及びブレビバクテリウム・ジバリカツム（Brevibacterium divaricatum） ＡＴＣＣ１４０２０を挙げることができる；
（ＫＦＣＣ＝韓国連合細胞保存機関（Korean Federation of Culture Collection）；ＡＴＣＣ＝米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）；ＦＥＲＭ ＢＰ＝生命工学工業技術研究所保存機関、科学技術振興機構、日本（Sammlung des National institute of bioscience and Human-Technology, agency of Industrial Science and Technology, Japan））。
【００４２】
この場合、これらの細菌株は、未改変で使用するか又は好適に遺伝子改変して使用してよい。例えば、メチオニン生合成経路の遺伝子が増幅された微生物を使用して、そうして多くのメチオニンを細胞内に存在させてよい。選択的に又は付加的に、メチオニンを分解する代謝経路に関連する遺伝子を消失させるか又は減衰させてもよい。メチオニン生産を改善させる好適な戦略は、技術水準から公知であり、例えばＷＯ−Ａ−０２／１０２０９号、ＤＥ−Ａ−１０２１７０５８号、ＤＥ−Ａ−１０２３９３０８号、ＤＥ−Ａ−１０２３９０７３号、ＤＥ−Ａ−１０２３９０８２号及びＤＥ−Ａ−１０２２２８５８号に記載されており、これらは参照をもって開示されたものとする。
【００４３】
メチオニン含有量を低下させうる酵素の活性又は量を減らすために、当業者は種々の手段を単独で又は組み合わせて実施できる。本発明にかかるタンパク質をコードする遺伝子の転写頻度を低減させることによって、上述のタンパク質の濃度を低下させることができる。当業者は、コード遺伝子のプロモーター領域又は調節領域並びにリボソーム結合部位を改変又は交換することによってこれを達成できる。当業者は、コード領域の下流で、ターミネーターを改変させるか又は転写の安定性減少を導く配列を挿入することができる。ｍＲＮＡの寿命を減らすこれらの手段によって、関連するタンパク質の発現を低下させ、これによりその濃度を低下させることが可能になる。
【００４４】
発現した酵素のレベルでは、融合された配列は、分解速度を高めることができ、これにより同様にこのタンパク質の濃度の低下をもたらすことができる。更に、当業者は、コード遺伝子の標的又は非標的突然変異誘発によってその活性、基質親和性及び基質特異性を改変できる。酵素は、相応する遺伝子の突然変異によって、酵素反応の反応速度の部分的又は完全な減少が生ずるほどにその活性が影響を受けうる。かかる突然変異の例は、当業者には知られている（モトヤマ・Ｈ、ヤノ・Ｈ、テラサキ・Ｙ、アナザワ・Ｈ、応用微生物学と環境微生物学 ６７号：３０６４〜３０７０頁、２００１年（Motoyama H. Yano H. Terasaki Y. Anazawa H. Applied & Environmental Microbiology.67:3064-70, 2001）、エイクマン ＢＪ、エゲリング・Ｌ、サーム・Ｈ、アントニー・ファン・レーウェンフック６４号：１４５〜１６３頁、１９９３〜９４年（Eikmanns BJ. Eggeling L. Sahm H. Antonie Van Leeuwenhoek. 64:145-63, 1993-94））。タンパク質の変異体は、酵素複合体のホモ又はヘテロ多量体形成を減少又は阻害することもでき、これにより同様に酵素特性の悪化に導くこともできる。
【００４５】
このように改変された遺伝子は、プラスミド又は好ましくは染色体の何れかに統合されて存在していてよい。この場合、このように改変されていない元の遺伝子が依然として付加的に存在してよいが、改変された遺伝子と交換することが好ましい。
【００４６】
コリネフォルム細菌中で測定される酵素の活性を減らすために、機能的等価物、例えば人工的に生産された変異体又は他の生物からの天然のホモログをコードする遺伝子を発現させることが十分でありえる。この場合、元の遺伝子が依然として付加的に存在してよいが、改変された遺伝子又はホモログ遺伝子と交換することが好ましい。
【００４７】
付加的に、有利には、細菌によるメチオニン生産にとっては、メチオニン生合成経路、システイン代謝経路、アスパラギン酸セミアルデヒド合成、解糖、アナプレロティック、ペントースリン酸代謝、クエン酸回路又はアミノ酸輸送の１種又は複数種の酵素を増強してよい。
【００４８】
従って、メチオニンの製造のために、以下の１種又は複数種の遺伝子を増幅してよい：
− アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子ｌｙｓＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８１）、
− アスパラギン酸セミアルデヒドをコードする遺伝子ａｓｄ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８２）、
− グリセリンアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｇａｐ（エイクマン著（１９９２年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７４号：６０７６〜６０８６頁（Eikmanns （1992）,Journal of Bacteriology 174:6076~6086））、
− ３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子ｐｇｋ（エイクマン著（１９９２年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７４号：６０７６〜６０８６頁）、
− ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子ｐｙｃ（エイクマン著（１９９２年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７４号：６０７６〜６０８６頁）、
− トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子ｔｐｉ（エイクマン著（１９９２年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７４号：６０７６〜６０８６頁）、
− ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｍｅｔＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号７２５）、
− シスタチオニン−ガンマ−合成酵素をコードする遺伝子ｍｅｔＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４９１）、
− シスタチオニン−ガンマ−リアーゼをコードする遺伝子ｍｅｔＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３０６１）、
− シスタチオニン−合成酵素をコードする遺伝子ｍｅｔＨ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号１６６３）、
− セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｇｌｙＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号１１１０）、
− Ｏ−アセチルホモセリン−スルフヒドリアーゼをコードする遺伝子ｍｅｔＹ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号７２６）、
− メチレンテトラヒドロ葉酸−レダクターゼをコードする遺伝子ｍｅｔＦ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２３７９）、
− ホスホセリン−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｓｅｒＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号９２８）、
− ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子ｓｅｒＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３３４、ＤＮＡ−配列番号４６７、ＤＮＡ−配列番号２７６７）、
− セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｃｙｓＥ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８１８）、
− システイン合成酵素をコードする遺伝子ｃｙｓＫ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８１７）、
− ホモセリン−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｈｏｍ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号１３０６）。
【００４９】
付加的に、本発明にかかるメチオニンの製法にとっては、同時に以下の少なくとも１種の遺伝子を変異させ、そうして相応のタンパク質の活性が変異していないタンパク質と比べて、代謝産物によってわずかな程度で影響を受けるか又は影響を受けなくなること、若しくはその比活性を増大させることが有利であり得る：
− アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子ｌｙｓＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８１）、
− ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子ｐｙｃ（エイクマン著（１９９２年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７４号：６０７６〜６０８６頁）、
− ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｍｅｔＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号７２５）、
− シスタチオニン−ガンマ−合成酵素をコードする遺伝子ｍｅｔＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４９１）、
− シスタチオニン−ガンマ−リアーゼをコードする遺伝子ｍｅｔＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３０６１）、
− メチオニン合成酵素をコードする遺伝子ｍｅｔＨ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号１６６３）、
− セリン−ヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｇｌｙＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号１１１０）、
− Ｏ−アセチルホモセリン−スルフヒドリラーゼをコードする遺伝子ｍｅｔＹ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号７２６）、
− メチレンテトラヒドロ葉酸−レダクターゼをコードする遺伝子ｍｅｔＦ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２３７９）、
− ホスホセリン−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｓｅｒＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号９２８）、
− ホスホセリン−ホスファターゼをコードする遺伝子ｓｅｒＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３３４、ＤＮＡ−配列番号４６７、ＤＮＡ−配列番号２７６７）、
− セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｃｙｓＥ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８１８）、
− システイン合成酵素をコードする遺伝子ｃｙｓＫ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８１７）、
− ホモセリン−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｈｏｍ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号１３０６）。
【００５０】
更に、メチオニンの生産にとっては、以下の１種又は複数種の遺伝子を減衰させること、特にその発現を減少させるか又は消失させることが有利であり得る：
− Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素（Ｅ．Ｃ．２．５．１．６）をコードする遺伝子ｍｅｔＫ、
− ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子ｔｈｒＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４５３）、
− トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ｉｌｖＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２３２８）、
− トレオニン合成酵素をコードする遺伝子ｔｈｒＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４８６）、
− メソ−ジアミノピメリン酸Ｄ−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｄｄｈ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４９４）、
− ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子ｐｃｋ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３１５７）、
− グルコース−６−ホスフェート−６−イソメラーゼをコードする遺伝子ｐｇｉ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号９５０）、
− ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子ｐｏｘＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８７３）
− ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子ｄａｐＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４７６）、
− ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子ｄａｐＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４７７）、
− ジアミノジピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｌｙｓＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４５１）。
【００５１】
更に、メチオニンの生産にとって、少なくとも１種の前述の遺伝子ｍｅｔＫ、ｔｈｒＢ、ｉｌｖＡ、ｔｈｒＣ、ｄｄｈ、ｐｃｋ、ｐｇｉ、ｐｏｘＢ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｌｙｓＡを変異させ、そうして相応のタンパク質の酵素活性を部分的に又は完全に減少させることが有利であり得る。
【００５２】
更に、メチオニンの生産のために、更なる不所望な副反応を消失させることが有利であり得る（中山著「アミノ酸生産微生物の培養」、微生物による生成物の過剰生産、クラムファンツル、シキタ、ベネク（編者）、学術出版、ロンドン、イギリス、１９８２年（Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in : Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds), Academic Press, London, UK, 1982））。
【００５３】
過剰発現を達成するために、当業者は、種々の手段を単独で又は組み合わせて選ぶことができる。従って、適切な遺伝子のコピー数を高めるか、若しくは、プロモーター領域及び調節領域又は構造遺伝子の上流に見られるリボソーム結合部位を変異させてよい。同様に、構造遺伝子の上流に挿入された発現カセットが作用する。誘導可能なプロモーターによって、発酵によるＬ−メチオニン生産の過程において発現を高めることが付加的に可能である。ｍＲＮＡの寿命を延長する手段によって、同様に発現を改善する。更に、酵素タンパク質の分解の阻害によって、同様に、酵素活性を増強させる。この遺伝子又は遺伝子構造は、次の何れかで、種々のコピー数を有するプラスミド内に存在するか又は染色体内で統合及び増幅されて存在してよい。更に選択的に、関連する遺伝子の過剰発現は、培地組成及び培養条件の変更によって達成できる。
【００５４】
これに関して、当業者は、とりわけ、マルティンら（Martin et al.）（バイオテクノロジー Ｒ５、１３７〜１４６頁（１９８７年））（Biotechnology Ｒ5，137-146（1987））、ゲレロら（Guerrero et al.）（遺伝子 １３８号、３５〜４１頁（１９９４年）（Gene 138, 35-41(1994)) ツシマ、モリナガ（Tsuchiya und Morinaga）（バイオ／テクノロジー ６号、４２８〜４３０頁（１９８８年））(Bio/Technology 6, 428-430(1988)),エイクマンら（Eikmanns et al.）（遺伝子 １０２号、９３〜９８頁（１９９１年）） (Gene 102, 93-98(1991)), ＥＰ０４７２８６９号、ＵＳ４６０１８９３号、シュバルツア、プラー（Schwarzer und Puehler ）（バイオテクノロジー ９号、８４〜８７頁（１９９４年））(Biotechnology 9, 84-87(1991)）、レムシェイドら（Remscheid et al.）（応用微生物学と環境微生物学 ６０号、１２６〜１３２頁（１９９４年）） (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132(1994))、ラバールら（LaBarre et al. ）（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー １７５号、１００１〜１００７頁（１９９３年））(Journal of Bacteriology 175, 1001-1007(1993))、ＷＯ９６／１５２４６号、マランブレスら（Malumbres et al.）（遺伝子 １３４号、１５〜２４頁（１９９３年）） (Gene 134, 15-24(1993))、ＪＰ−Ａ−１０２２９８９１号、イエンセン、ハマー（Jensen und Hammer ）（バイオテクノロジーとバイオ工学 ５８号、１９１〜１９５頁（１９９８年））(Biotechnology and Bioengineering 58,.191-195(1998)), マクライド（Makrides）（微生物学紀要 ６０号：５１２〜５３８頁（１９９６年））(Microbiological Reviews 60:512-538(1996))及び公知の遺伝学及び分子生物学の教本にその手引きを見出す。
【００５５】
Ｄ）本発明にかかる発酵の実施
本発明により製造された微生物は、連続的に又は不連続的に、メチオニンの生産のために、回分法（回分培養）か又は半回分法（供給法（ｚｕｌａｕｆｖｅｒｆａｈｒｅｎ））若しくは反復半回分法（Ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ ｂａｔｃｈ Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ）（繰り返し供給法ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｚｕｌａｕｆｖｅｒｆａｈｒｅｎ））により、培養できる。公知の培養法に関する概要は、クミエル（Chmiel）の教本（バイオプロセステクニック１ 生物的方法技術入門（グスタフ・フィッシャー出版、シュツットガルト、１９９１年））（Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))又はシュトラス（Storhas）の教本（バイオリアクターとその周辺装置（フィエーク出版、ブラウンシュバイク／ビイスバデン、１９９４年））（Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,1994))に見出すことができる。
【００５６】
使用されるべき培養培地は、好適に、それぞれの株の要求を満たさなければならない。種々の微生物の培養培地の説明は、米国細菌学学会（ワシントンＤ．Ｃ、アメリカ合衆国、１９９８年）（American Society fuer Bacteriology） (Washington D.C., USA, 1981)のハンドブック「遺伝学的細菌学のための方法マニュアル」（"Manual of Methods fuer General Bacteriology"）に含まれている。
【００５７】
本発明により使用可能な培地は、大抵は、１種又は複数種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン及び／又は微量元素を含む。
【００５８】
好ましい炭素源は、糖、例えばモノ−、ジ−又はポリサッカリドである。特に好ましい炭素源は、例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、サッカロース、ラフィノース、デンプン又はセルロースである。糖は、複合化合物、例えば糖蜜、又は糖精製の他の副生物を介して、培地に添加してもよい。種々の炭素源の混合物を添加することも有利であり得る。考えられる他の炭素源は、油及び脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びヤシ油；脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸又はリノール酸；アルコール、例えばグリセリン、メタノール又はエタノール；及び有機酸、例えば酢酸又は乳酸である。
【００５９】
窒素源は、大抵、有機又は無機窒素化合物又はこれらの化合物を含有する物質である。窒素源の例は、アンモニアガス、又はアンモニウム塩、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム又は硝酸アンモニウム、硝酸塩、尿素、アミノ酸又は複合窒素源、例えばコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキス等を含む。これらの窒素源は、単独で又は混合物として使用してよい。
【００６０】
培地中に含まれていてよい無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅及び鉄の塩化物、リン塩又は硫酸塩を含む。
【００６１】
メチオニンを製造するための硫黄源としては、硫黄含有無機化合物、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、亜二チオン酸塩、四チオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物を使用してよいが、有機硫黄化合物、例えばメルカプタン及びチオールを使用してもよい。
【００６２】
リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム、若しくは適切なナトリウム含有塩を使用してよい。
【００６３】
金属イオンを溶液中で保持させるために、キレート剤を培地に添加してよい。特に好適なキレート剤は、ジヒドロキシフェノール、例えばカテコール、又はプロトカテキュエート（Ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔ）、若しくは有機酸、例えばクエン酸を含む。
【００６４】
本発明により使用される発酵培地は、慣用的に他の成長因子、例えばビタミン、又は成長促進物質をも含有しており、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、及びピリドキシンが挙げられる。成長因子及び塩は、しばしば、複合培地成分、例えば酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカー等に由来する。その上、培養培地に好適な前駆物質を添加してよい。培地化合物の厳密な組成は、それぞれの実験に強く依存し、かつかかる特定の事例ごとに決定する。培地の最適化についての情報は、教本「応用微生物学・生理学・実践アプローチ」編者Ｐ．Ｍ．ローデス、Ｐ．Ｆ．スタンベリー、ＩＲＬ出版（１９９７年）５３〜７３頁（"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach"（Hrsg. P.M. Phodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S.53-73, ISBN 0199635773）から得られる。成長培地は、例えばＳｔａｎｄａｒｄ １（Ｍｅｒｃｋ社製）又はＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン、ＤＩＦＣＯ社製）等を供給業者から購入することもできる。
【００６５】
全ての培地成分は、熱（２０分、１．５バール及び１２１℃）又は除菌の何れかによって滅菌する。これらの成分は、一緒に滅菌すること又は必要ならば別々に滅菌することの何れかを行ってよい。全ての培地成分は、培養の最初に添加するか又は、場合により連続的に又は回分的に添加してよい。
【００６６】
培養温度は、通常、１５〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃であり、かつ実験の間、一定に維持させるか又は変更してよい。培地のｐＨ値は、５〜８．５の範囲、好ましくは７．０付近であることが望ましい。培養物のｐＨ値は、培養の間、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア若しくはアンモニア水、又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸の添加によって調節することができる。泡の作用を調節するために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用してよい。プラスミドの安定性を維持するために、培地に好適な選択的作用物質、例えば抗生物質を添加してよい。好気的条件を維持するために、酸素又は酸素含有混合物、例えば周囲空気を培養物中に入れる。この培養は、最大の所望の生成物が形成されるまで継続する。この目的は、通常、１０〜１６０時間内で達成される。
【００６７】
こうして得られた、メチオニンを含有する発酵ブロスは、慣用的に、乾燥質量が７．５〜２５質量％である。
【００６８】
更に、発酵は、少なくとも終盤で糖を制限して行うことも有利であるが、特に少なくとも３０％の発酵時間をわたって、糖を制限して行うことが有利である。このことは、この時間の間、発酵培地中の使用可能な糖の濃度を≧０〜３ｇ／ｌに維持するか若しくは低下させることを意味する。
【００６９】
Ｅ）メチオニンの精製
本発明により結晶化の後に得られたメチオニンが、依然として所望の純度を有していないのであれば、これらを更に精製してよい。このために、この生成物を溶解した形で、好適な樹脂を有するクロマトグラフィーにかけ、その際、この所望の生成物又は不純物が完全に又は部分的にクロマトグラフィー樹脂上に留まる。このクロマトグラフィー段階は、必要であれば、繰り返してよく、その際、同じ又は別のクロマトグラフィー樹脂を使用する。当業者は、好適なクロマトグラフィー樹脂及びその有効な使用の選択に精通している。精製された生成物は、濾過又は限外濾過によって濃縮し、そして、生成物の安定性が最大である温度で貯蔵してよい。
【００７０】
単離された化合物の独自性及び純度は、公知の技術によって測定できる。これらは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、分光的方法、染色的方法、薄層クロマトグラフィー、ＮＩＲＳ、酵素試験、又は微生物学的試験を含む。これらの分析方法は：パテックら著（１９９４年）応用環境微生物学６０号：１３３〜１４０頁（Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140）；マラクホバら著（１９９６年）バイオテクノロジー１１号２７〜３２頁（Malakhova et al. (1996) Biotechnologiya 11 27-32）；及びシュミットら著（１９９８年）バイオプロセス工学１９号：６７〜７０頁（Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70）、ウールマン工業化学百科事典（１９９６年）Ａ２７巻、ＶＣＨ：ヴァインハイム、８９〜９０頁、５２１〜５４０頁、５４０〜５４７頁、５５９〜５６６頁、５７５〜５８１頁及び５８１〜５８７頁（Ulmann's Encuclopedia of Industrial Chemistry(1996) Bd. A27, VCH:Weinheim, S. 89-90,S. 521-540, S.540-547, S. 559-566, 575-581 und S. 581-587）；ミハル・Ｇ著（１９９９年）生化学経路：生物化学及び分子生物学アトラス、ジョンウィリアンドサンズ（Michal, G(1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons）；生化学及び分子生物学のラボラトリーテクニック１７巻（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17）のファロン・Ａら著（１９８７年）生化学におけるＨＰＬＣの応用（Fallon, A. et al.(1987) Applications of HPLC in Biochemistry）にまとめられている。
【００７１】
Ｆ）バイオマスの乾燥
発酵の完了後に、メチオニンを含有する発酵ブロスを、最終的な乾燥飼料添加剤に直接加工してよい。しかしながら、本発明の好ましい実施形態によれば、最初に、この発酵ブロスからバイオマス分を完全に又は部分的に、好ましくは完全に、例えば遠心分離によって取り出して、そして本発明にかかる飼料添加剤に加工する。生じたバイオマスは、依然として所定のメチオニン分を含有し、該メチオニン分は所望により、中間に提供された洗浄段階によって減少していてよい。
【００７２】
本発明にかかるバイオマスを好適な乾燥製品とする後処理は、技術水準から自体公知の種々の方法によって実施してよい。特に、製造には、乾燥方法、例えば噴霧乾燥、噴霧造粒、接触乾燥、流動層乾燥、又は凍結乾燥が好適である。好適な方法は、例えば：
Ｏ・クリシェール、Ｗ・カスト著 乾燥技術 第１巻「乾燥技術の科学的基礎」、シュプリンガー出版（１９７８年）（O. Krischer, W. Kast, Trocknungstechnik Erster Band, "Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik", Springer-Verlag 1978）；クリシュール／クレール著 乾燥技術 第２巻「乾燥剤と乾燥方法」シュプリンガー出版（１９５９年）（Krischer/Kroell., Trocknungstechnik Zweiter Band, "Trockner und Trocknungsverfahren", Springer-Verlag 1959）；Ｋ・クレール、Ｗ・カスト著 乾燥技術 第３巻「製造における乾燥と乾燥剤」シュプリンガー出版（１９８９年）（K.Kroell, W. Kast, Trocknungstechnik Dritter Band,"Trocknen und Trochner in der Produktion", Springer-Verlag 1989）；Ｋ・マスターズ著「噴霧乾燥ハンドブック」ロングマンサイエンティフィック＆テクニカル１９９１年、７２５頁（K. Masters, "Spray Drying Handbook", Longman Scientific & Technical 1991, 725 Seiten）；Ｈ・ウールマン、Ｌ・メール著「流動層−噴霧造粒」シュプリンガー出版（２０００年）（H.Uhlemann, L. Moerl, "Wirbelschicht-Spruehgranulation", Springer-Verlag 2000）；凍結乾燥：ゲオルグ−ヴィルハイム エトイエン著、「凍結乾燥」、ＶＣＨ１９９７年（Gefriertrocknung: Georg-Wilheim Oetjen, "Gefrietrocknen", VCH1997）並びにＥＰ−Ａ０８０９９４０号に記載されている。上述の文献は参照をもって開示されたものとする。
【００７３】
本発明にかかる乾燥段階は、噴霧乾燥、例えば組み込まれた流動床を用いる噴霧乾燥又は噴霧造粒によって実施することが特に好ましい。
【００７４】
所望であれば、乾燥を、好適な飼料に適した担体材料の存在下で実施してよく、これにより特に流動性が改善され、これにより製品の質を改善することができる。
【００７５】
飼料に適した担体材料としては、慣用の不活性担体を使用してよい。「不活性」担体は、添加剤中に含まれる食料添加剤との負の相互作用を示してはならず、かつ飼料添加剤中の助剤としての使用に懸念を示してはならない。好適な担体材料の例として：天然又は合成由来の無機又は有機化合物を挙げることができる。好適な低分子無機担体は、塩、例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、硫酸ナトリウム及び硫酸マグネシウム、又はケイ酸である。好適な有機担体の例は、特に糖、例えばグルコース、フルクトース、サッカロース並びにデキストリン及びデンプン製品である。高分子有機担体の例としては：デンプン調製物及びセルロース調製物、例えば特にトウモロコシデンプン、穀粉、例えば小麦粉、ライ麦粉、大麦粉及びカラスムギ粉又はこれらの混合物若しくは小麦セモリナふすま（Ｗｅｉｚｅｎｇｒｉｅｓｓｋｌｅｉｅ）を挙げることができる。この担体材料は、調製物中に、乾燥量基準に対して、約５質量％〜約８５質量％、例えば約１０質量％〜約３０質量％、２０質量％〜４０質量％又は５０質量％〜８５質量％の含有率で含まれていてよい。
【００７６】
以下に、幾つかの好ましい乾燥技術を一般的な形で簡単に説明する。
【００７７】
噴霧乾燥は、最初に、依然として湿潤なバイオマスを噴霧塔中のアトマイザーにポンプ導入して実施してよい。このアトマイジングは、例えば、圧力ノズル（一成分ノズル）、二成分ノズル又は遠心噴霧器を用いて実施する。液滴の乾燥は、噴霧乾燥器中に導かれた熱気流によって実施する。遠心噴霧器を使用する場合には、この乾燥は、並流において実施するのが好ましい。ノズルを使用する場合には、この乾燥は逆流又は混合流中で実施することも好ましい。乾燥した粉末は、塔において排出するか、空気流と一緒に飛沫同伴させ、そしてサイクロン及び／又はフィルター中で分離してよい。生成物及び動作様式に応じて、噴霧乾燥器にフランジ取付形の内部の流動床又は外部の流動床中で実施できる後乾燥が必要でありうる。
【００７８】
本発明にかかる乾燥方法の変法においては、乾燥段階、特に噴霧乾燥に、連続的又は不連続的な流動床凝集を後接続する。このために、流動床乾燥器内で、この工程の最初に、粉末形状の材料、例えば噴霧乾燥によって得られた粉末形状の添加剤を装入する。この流動化は、例えば予熱された空気を供給することによって実施する。流動層に液相、例えば更なるバイオマス、又は結合剤を含有する溶液を噴霧し、これにより装入された粉末をこの溶液で湿潤させ、この付着特性によって更に凝集させる。同時に、連続的に又は準連続的、すなわち周期的な間隔で、部分量の凝集物を流動層から排出する。この排出物は、例えばふるいを用いて分級化する。その際に生ずる粗材料は、このときに粉砕し、そして流動床に再び連続的に返送してよい。微細成分、例えば排気フィルター装置からの微細成分は、同様に連続的に返送してよい。
【００７９】
更なる好ましい変法は、噴霧乾燥された粉末の引き続いての凝集と結びつくバイオマスの粉末への噴霧乾燥を含む。これは、不連続的又は連続的に実施してよい。連続的な動作様式が好ましい。かかる方法は市販の噴霧乾燥装置を使用して実施できる。しかし、有利には、ＦＳＤ（流動層噴霧乾燥器（Ｆｌｕｉｄｉｚｅｄ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ））、ＳＢＤ（スプレーベッド乾燥器（Ｓｐｒａｙ Ｂｅｄ Ｄｒｙｅｒ））、又はＭＳＤ（多段階乾燥器（Ｍｕｌｔｉｓｔａｇｅ Ｄｒｙｅｒ））として公知の装置内で実施する。
【００８０】
本発明にかかる乾燥製品の連続的製造のための流動層噴霧乾燥器（ＦＳＤ）−乾燥装置は、特に、以下の型によって作動させてよい：湿潤なバイオマスを、ＦＳＤ乾燥器の頂部に供給路を介して導入し、そして噴霧器を用いて噴霧する。この乾燥は、空気を並流で導入することによって実施する。この場合、空気は熱を介して予熱する。噴霧乾燥された粉末は、ＦＳＤ乾燥器の底部の組み込まれた流動床中に集まり、そこで噴霧装置を用いて圧縮空気の使用下で、例えばこの粉末に結合剤溶液を噴霧し、それを導入された空気で流動させる。このために、空気を予熱し、そして供給路を介して組み込まれた流動床のガス整流板の下方に供給する。その際に生じた前凝集物は、後接続された外部の流動床に達する。この外部の流動床においては、予熱された空気が更なる供給路を介して下方から導入される。この流動床に装入された前凝集物に、更なる噴霧装置を用いて、圧縮空気の使用下で、（例えば、結合剤溶液を）再び噴霧し、そして凝集させて最終生成物を得る。微細な凝集物は、流動床から排出させ、そして上述のとおり、更なる後処理を行ってよい。
【００８１】
噴霧される液体の組成及び量は、噴霧される溶液の付着特性、達成されるべき凝集物の大きさ及びプロセス条件に依存する。
【００８２】
噴霧されるバイオマスの付着特性が十分でない場合には、噴霧の後に粒子の安定した付着を確保するために、結合剤を付加的に使用することが有利である。これにより、凝集物が乾燥の際に再び分かれることを回避する。かかる場合においては、水性媒質中に可溶であるか又は分散可能な結合剤を流動床中に噴霧することが好ましい。好ましい結合剤の例としては、糖質、例えばグルコース、サッカロース、デキストリン、とりわけ糖アルコール、例えばマンニットの溶液、又はポリマー溶液、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、エトキシ化セルロース（ＥＣ）、エチルセルロース又はプロピルセルロースの溶液を挙げることができる。噴霧される結合剤の量及び付着特性の目標とする選択によって、種々の大きさ及び強度の凝集物が生ずる。
【００８３】
結合剤を別個の溶液として噴霧するのであれば、この溶液の結合剤含有率は、溶液の全質量に対して約１質量％〜約３０質量％の範囲内である。これに関して、この結合剤は、同様に、水性媒質、好ましくは無菌の脱塩水中に溶解して存在している。慣用の添加剤、例えば緩衝液、又は可溶化剤が同様に含まれていてよい。
【００８４】
本発明によれば、最終製品中の結合剤の含有率は、０質量％〜約２０質量％、例えば約１質量％〜約６質量％である。また、最適な量は選択された結合剤の種類にも依存する。この場合、製品についての悪影響を回避することを留意しなければならない。
【００８５】
Ｇ）配合物
ｉ）飼料添加剤及び飼料組成物：
本発明にかかるメチオニンを含有する飼料添加剤は、流動性の微細な粉末として若しくは造粒された形で存在していることが好ましい。この場合、粒子は、例えば５〜２００μｍ、例えば１０〜１５０μｍ、２０〜１００μｍ又は３０〜８０μｍの大きさの範囲内であってよいが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
本発明にかかる添加剤のかさ密度は、約１００ｇ／ｌ〜約６００ｇ／ｌ、例えば１５０〜４００ｇ／ｌ又は２００〜３５０ｇ／ｌの範囲内であってよいが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
本発明にかかる添加剤のメチオニン含有率は、製法に応じて変動する。
【００８８】
本発明により得られるメチオニン結晶は更に、メチオニン含有率が、６０質量％よりも大きく、例えば約７０質量％〜約９８質量％、好ましくは約８０質量％〜約９５質量％、特に好ましくは約８７質量％〜約９５質量％である。塩（発酵ブロスからの残留物）の含有率は更に、約０質量％〜約２０質量％、特に約５質量％〜約１５質量％の範囲内であってよい。その他の発酵副成分は、約０質量％〜約２０質量％、特に約５質量％〜約１５質量％の含有率で含まれていてよい。
【００８９】
本発明にかかるバイオマスメチオニンは更に、メチオニン含有率が、３質量％よりも大きく、例えば約５質量％〜約４０質量％、又は約１０質量％〜約３５質量％である。更に、塩の含有率は、約０質量％〜約３０質量％、例えば約５質量％〜約２５質量％の範囲内であってよい。その他の発酵副成分は、約０質量％〜約２０質量％、例えば約５質量％〜約１５質量％の含有率で含まれていてよい。
【００９０】
最終的な添加剤の残留湿分の含有率は、添加剤の全質量に対して、好ましくは約３質量％未満〜約５質量％未満の範囲内である。前述の質量％は、乾燥生成物（好ましくは残留湿分を有さない）の全質量に対するものである。
【００９１】
上述の本発明にかかる配合物は、上述の構成成分の他に、更なる添加剤を含有してよく、それをバイオマスの後処理前、後処理の間又は後処理後に添加してよい。例として、保存剤、抗生物質、抗菌添加剤、酸化防止剤、キレート剤、生理学的に懸念のない塩、調味料、着色剤等を挙げることができる。栄養に関連する添加剤、例えばビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ３及び／又はＥ、Ｋ３、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸）；タウリン、カルボン酸、例えばトリカルボン酸及びその塩、例えばクエン酸塩、イソクエン酸塩、トランス−／シス−アコニット酸塩及び／又はホモクエン酸塩、酵素、カロチノイド、ミネラル、例えばＰ、Ｃａ、Ｍｇ及び／又はＦｅ及び微量元素、例えばＳｅ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、タンパク質、糖質、脂肪、アミノ酸が含まれていてもよい。更に、ピルビン酸、Ｌ−カルニチン、リポ酸、コエンザイムＱ１０、アミノカルボン酸、例えばクレアチン、オロト酸、ミオイノシトール、フラボノイド、ベタイン、ｐ−アミノ安息香酸が含まれていてよい。
【００９２】
本発明にかかるメチオニンを含有する飼料添加剤は、市販の動物飼料配合物中に添加でき、次いでそれを例えばウシ、ブタ、ヒツジ、家禽類等に与えることができる。本発明にかかる添加剤は、慣用の動物飼料構成成分と混合し、そして場合により仕上げ、例えばペレット化を行う。慣用の動物飼料構成成分は、例えばトウモロコシ、大麦、カッサバ、カラスムギ、大豆、魚粉、小麦セモリナふすま、大豆油、石灰、ミネラル、微量元素、アミノ酸及びビタミンである。
【００９３】
ｉｉ）食料補助剤及び飼料補助剤
本発明により製造されたメチオニンは、食品又は飼料中の添加剤又は栄養補助剤及び飼料補助剤、例えば総合ビタミン剤中の添加剤として使用される。このために、本発明により製造された生成物は、所望の量で、かつ自体公知のように、市販の食料及び飼料若しくは食料補助剤又は飼料補助剤中に添加してよい。この場合、使用に応じて種々の適切な含有率で含まれていてよい。
【００９４】
ｉｉｉ）被覆配合物
上述の本発明にかかる配合物は、場合により付加的に被覆を有していてよい。この場合、以下から選択された少なくとも１種の化合物を有する被覆剤を施す：
− ポリアルキレングリコール、特にポリエチレングリコール、例えば数平均分子量は約４００〜約１５０００、例えば４００〜１００００である；
− ポリアルキレンオキシドポリマー又はポリアルキレンオキシドコポリマー、例えば数量的な分子量は約４０００〜約２００００であり、特にポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマー；
− 置換ポリスチレン、マレイン酸誘導体及びスチレン−マレイン酸コポリマー；
− ビニルポリマー、特にポリビニルピロリドン、例えば数平均分子量は約７０００〜約１００００００である；単独又は他の化合物、例えばセルロースエーテル又はデンプンとの組み合わせの何れか；
− ビニルピロリドン／ビニルアセテート−コポリマー、例えば数平均分子量は約３００００〜約１０００００である；
− ポリビニルアルコール、例えば数平均分子量が約１００００〜約２０００００でありポリビニルアルコール、及びポリフタル酸ビニルエステル；
− ヒドロキシプロピルメチルセルロース、例えば数平均分子量は約６０００〜約８００００である；
− アルキル（メタ）アクリレートポリマー及びアルキル（メタ）アクリレートコポリマー、例えば数平均分子量は約１０００００〜約１００００００であり、特にエチルアクリレート／メチルメタクリレート−コポリマー及びメタクリレート／エチルアクリレート−コポリマー；
− ポリビニルアセテート、例えば数平均分子量は約２５００００〜約７０００００であり、場合により、ポリビニルピロリドンで安定化されている；
− ポリアルキレン、特にポリエチレン；
− 芳香族ポリマー、例えばリグニン；
− ポリアクリル酸；
− ポリアクリルアミド；
− ポリシアノアクリレート；
− フェノキシ酢酸−ホルムアルデヒド−樹脂；
− セルロース誘導体、例えばエチルセルロース、エチルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート；
− 動物性脂肪、植物性脂肪又は合成脂肪及び改質脂肪、例えばポリグリコール、脂肪アルコール、エトキシ化脂肪アルコール、高級脂肪酸；高級脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリド、例えばグリセリンモノステアラート、アルキルアリールエトキシレート及びヤシ油モノエタノールアミド；
動物性及び植物性ろう又は化学的に改質された動物性及び植物性ろう、例えば蜜ろう、カンデリラろう、カルナウバろう、モンタンエステルろう及び米胚芽ろう、鯨ろう、ラノリン、ホホバろう、サソールろう（ｓａｓｏｌｗａｃｈｓ）；
− 動物性及び植物性タンパク質、例えばゼラチン、ゼラチン誘導体、ゼラチン置換物、カゼイン、ホエイ、ケラチン、大豆タンパク質；ゼイン及び小麦タンパク質；
− モノ−及びジサッカリド、オリゴサッカリド、ポリサッカリド、例えばヒアルロン酸、プルラン、エルシナン、デンプン、化工デンプン、並びにペクチン、アルギン酸塩、キトサン、ガラギナン；
− 植物性油、例えばヒマワリ油、アザミ油、綿実油、大豆油、コーン胚芽油、オリーブ油、ナタネ油、アマニ油、オイルツリー（ｏｅｌｂａｕｍ）油、ヤシ油、アブラヤシ油；合成又は半合成油、例えば中鎖トリグリセリド又は鉱物油；動物性油、例えばニシン油、イワシ油、及び鯨油；
− 硬化（水素化又は部分水素化された）油／脂肪、例えば上述のうちの、特に水素化パーム油、水素化綿実油、水素化大豆油；
− 塗料被覆、例えばテルペン、特にセラック、トルーバルサム、ペルーバルサム、サンダラック及びシリコーン樹脂；
− 脂肪酸、飽和Ｃ６〜Ｃ２４カルボン酸及びモノ不飽和又はポリ不飽和のＣ６〜Ｃ２４カルボン酸の両方；
− ケイ酸；
及びこれらの混合物。
【００９５】
被覆の前に可塑剤又は乳化剤を脂肪又はろうに添加することは、場合により、皮膜の柔軟性を改善させるのに有利であり得る。
【００９６】
被覆の適用は、自体公知のように、場合により添加剤と一緒に、一般的には、混合装置中に存在する有用な生成物上に滴下又は噴霧する装置を介して実施する。この例は、ランス、スプリンクラーヘッド、一成分又は二成分ノズル、回転式滴下装置又はアトマイズ装置である。非常に簡単な事例においては、集中的な噴射としての局所的な添加も考えられる。選択的に、最初に、混合装置内で、被覆材料を装入し、次いで有用な生成物を添加してよい。更なる可能性は、最初に、壁の加熱の結果として又は機械的なエネルギー入力に基づいて溶解し、そして有用な生成物を覆う固体の被覆材料を添加することである。
【００９７】
ここで本発明を、添付の図面に関連してより詳細に説明する。その際、図１〜図４は、本発明にかかる結晶性の乾燥メチオニン及びメチオニンを含有する乾燥バイオマス（「バイオマスメチオニン」）の製造方法の異なる展開を示している。
【００９８】
実施例１：
ａ）発酵によるメチオニンの製造
メチオニン精製のための代表的な発酵ブロスの製造のために、実験室発酵を実施した。コリネバクテリウム・グルタミクム株ＡＴＣＣ１３０３２（米国培養細胞系統保存機関 マナッサス、アメリカ合衆国）を、２００ｍｌのＢＨＩ培地（Ｄｉｆｃｏ／Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、フランクリンレイク（Ｆｒａｎｋｉｎ Ｌａｋｅｓ）、アメリカ合衆国）の予備培養物中で培養した。次いで、Ｔｅｃｈｆｏｒｓ型発酵槽中において、この予備培養物を培養培地（約１４ｌ）中に移種した。
【００９９】
本培養の発酵培地は、以下の組成
２ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４
２ｇ／ｌ Ｋ２ＨＰＯ４
１０ｇ／ｌ 硫酸アンモニウム
１００ｇ／ｌ グルコース
５ｇ／ｌ 酵母エキス
２０ｍｇ／ｌ カナマイシン
１ｇ／ｌ ＫＳ９１１ ＡＳＭ 消泡剤
ｐＨ７．０
であり、脱塩水を所望の最終容量になるまで補充した。
【０１００】
微量塩溶液１ｍｌ／ｌ培地
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
１ｍｌ／ｌのプロトカテキュエート溶液（原液３００ｍｇ／１０ｍｌ）
ビオチン １ｍｇ／ｌ
チアミン １ｍｇ／ｌ
ＣａＣｌ２ ５ｍｇ／ｌ。
【０１０３】
予備培養による発酵槽のインキュベーション後に、この発酵槽を塩基（２５％ＮＨ４ＯＨ）の添加によりｐＨ７に維持し、そして糖が消費されるまで発酵させた。このことは、ｐＯ２値の増大か若しくはＯＴＲ及びＣＴＲの低下によって示された。
【０１０４】
ｂ）発酵ブロスの後処理
後処理の手順を、図１において図式を用いて概要を示す。
【０１０５】
出発物質としては、区域ａ）により製造された発酵ブロスを利用する。３０〜４０℃の発酵温度では、含まれるメチオニンの約５０％が結晶形で存在する。出発生成物は、含水率が約８６％であり、高められたメチオニン含有率が約９％、かつバイオマス含有率が約３％である。その他の発酵副生物及び鉱質は、発酵ブロス中に微量（約２．５質量％）で含まれている。
【０１０６】
この発酵ブロス２０ｋｇを、１５分にわたって７０℃に加熱する。これによりメチオニンが完全に溶解する。次いで、一定の温度で、バイオマスを遠心分離する。次いで、上清（約１５ｋｇ）を１００℃かつ大気圧で、メチオニン含有率が２０％になるまで濃縮する。次いで、この濃縮物を５Ｋ／ｈで５℃に冷却し、これにより大部分のメチオニンが結晶化する。次いでこの結晶を、ヌッチェフィルター上で結晶原料から分離し、事前に平衡化された４リットルの水（５℃）で洗浄し、次いで窒素を用いて４０℃で吹付乾燥する。この手順によって、純度約９０％の乾燥メチオニン１．３ｋｇを単離することができた。
【０１０７】
遠心分離残留物（約５ｋｇ）は、乾燥バイオマスの他に、約６％のメチオニンをも含有する。噴霧乾燥によって、この残留物を、約０．７ｋｇの淡黄色かつ流動性の残留湿分３％の乾燥粉末に変換でき、これは乾燥バイオマス及びその他の発酵副生物及び鉱物塩の他に、メチオニン（約３０％）をも含有する。
【０１０８】
噴霧乾燥は、実験室噴霧乾燥器中で、以下の装置設定で実施した：
入口温度：２００℃
出口温度：８０〜８２℃。
【０１０９】
加熱ガスとしては、６０ｍ３／ｈの窒素を使用した。ノズルガスを、２バールの圧力で、１．２ｍｍのノズルによって噴霧した。
【０１１０】
実施例２：
同じ出発材料を出発点として、この方法を改変し、バイオマスを遠心分離によって分離し、次いで分離されたバイオマスを５ｌの水で洗浄する（図２）。遠心分離後に、生じた上清を最初のバイオマス分離物に添加する。全ての上清を、１００℃かつ大気圧で、メチオニン含有率が１６％になるまで濃縮する。この濃縮物を５Ｋ／ｈで５℃に冷却することによって、メチオニンを結晶化する。この結晶を、ヌッチェフィルター上で分離し、事前に平衡化された４．５リットルの水（５℃）で洗浄し、次いで窒素を用いて４０℃で乾燥させる。この手順によって、乾燥メチオニンの量が約１．５ｋｇまで高まる。更に、単離された結晶体の純度は、約９０％である。
【０１１１】
分離及び洗浄されたバイオマスの残留物を、噴霧乾燥によって約０．５ｋｇの乾燥生成物に変換する。
【０１１２】
このように製造された生成物は、バイオマス及びその他の発酵副生物並びに鉱物塩の他に、メチオニン（約１０％）をも含有しており、流動性を示す。
【０１１３】
実施例３：
同じ出発材料を出発点として、実施例２からの方法を更に改変し、結晶性メチオニンの分離の際に生ずる母液及び洗浄水を、次のバッチ中において、メチオニンを含有する発酵ブロスに再び添加する（図３）。
【０１１４】
他の点では実施例２と同様の手順で行うと、発酵の際に、結晶化から乾燥メチオニン約１．５ｋｇが純度約９０％で得られ、メチオニン含有率が約１０％である噴霧乾燥されたバイオマスからは０．５ｋｇの生成物が得られる。
【０１１５】
実施例４：
同じ出発物質を出発点として、実施例２からの方法を更に改変し、結晶性メチオニンの分離の際に生ずる母液及び洗浄水をバイオマス流に、噴霧乾燥の前に添加する（図４）。
【０１１６】
他の点では実施例２と同様の手順で行うと、約１．１ｋｇのメチオニン含有バイオマスが生じ、これは乾燥バイオマス及びその他の発酵副生物並びに鉱物塩の他に、メチオニン（約３０％）をも含有する。乾燥メチオニンの量は、１．５ｋｇであり、その純度は約９０％である。
【０１１７】
実施例５：
メチオニン結晶化の後の母液及び洗浄水の一部を、バイオマス分離の前に発酵ブロスに添加し、そして他方の部分流を噴霧乾燥の前にバイオマス流に添加する変法（実施例３及び４の組み合わせ）も考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】本発明にかかる結晶性の乾燥メチオニン及びメチオニンを含有する乾燥バイオマスの製造方法を示す
【図２】本発明にかかる結晶性の乾燥メチオニン及びメチオニンを含有する乾燥バイオマスの製造方法を示す
【図３】本発明にかかる結晶性の乾燥メチオニン及びメチオニンを含有する乾燥バイオマスの製造方法を示す
【図４】本発明にかかる結晶性の乾燥メチオニン及びメチオニンを含有する乾燥バイオマスの製造方法を示す
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチオニンを発酵により製造する方法、その際に形成されたメチオニンを単離する方法、単離の際に生じたメチオニンを含有するバイオマス、飼料及び飼料補助剤を製造するためのその使用、並びに食料又は飼料若しくは食料補助剤又は飼料補助剤を製造するための単離されたメチオニンの使用に関する。
【０００２】
背景技術
メチオニンは、食料工業、飼料工業、化粧品工業及び製薬工業を含めた種々の分野で使用されている。
【０００３】
従来、Ｄ、Ｌ−メチオニンの化学的製造方法が技術的に重要であるにすぎなかった。この合成の出発物質は、硫化水素、メチルメルカプタン、アクロレイン、青酸又はメチルメルカプトプロピオンアルデヒドである（ウールマン工業化学百科事典（１９８５年）、Ａ２巻、７１頁（Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry(1985), Vol. A2, Seite７１）を参照のこと）。
【０００４】
メチオニンはまた、天然の細胞の物質代謝プロセスを介して生産される。その工業的基準の生産は、大量の所望の物質を生産及び分泌させるために開発された細菌培養によって非常に合理的に実施された。この目的のために特に好適な生物は、非病原性コリネフォルム細菌である。
【０００５】
メチオニンを、コリネフォルム細菌株、特にコリネバクテリウム・グルタミクム（Colynebacterium glutamicum）菌の発酵によって製造できることは公知である。これは極めて重要であるので、この製造方法の改善について絶え間なく研究されている。方法の改善は、例えば、発酵技術手段、栄養培地の組成、又は微生物それ自体の固有の能力特性に関連し得る。
【０００６】
所定の分子の生産に関してこの微生物の能力特性の改善のために、突然変異、選択及び変異体選択の方法か又はアミノ酸生産株、例えばコルネ細菌の株の改善のための組換えＤＮＡ技術の方法を、個々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅するか又は消失させることによって使用でき、これによりアミノ酸生産の改善がもたらされる。
【０００７】
例えば、ＷＯ−Ａ−０２／１０２０９号及びＤＥ−Ａ−１０１３６９８６号は、遺伝子改変されたＬ−メチオニン生産コルネフォルム細菌を使用して、Ｌ−メチオニンを発酵により製造する方法を記載している。そこでは、とりわけ、細菌の発酵、培地中か又は細菌中のアミノ酸の富化及びアミノ酸の単離を含むＬ−メチオニンの製造方法が記載されている。更に、以下の段階：ａ）Ｌ−メチオニン生産微生物の発酵；ｂ）発酵ブロスの濃縮；例えば蒸発による濃縮；ｃ）バイオマスの分離（０〜１００％）、例えば遠心分離による分離；及びｄ）乾燥、例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥、噴霧造粒による乾燥を含む発酵ブロスからのＬ−メチオニンを含有する動物飼料添加剤の製造方法が記載されている。
【０００８】
スワパンら（Swapan et al）は、微生物バイオテクノロジー紀要４号（１）３５〜４１頁（１９８９年）（J.Microbial Biotechnology, 4(1), 35~41(1989)）に、発酵ブロスからの細胞を分離すること、ｐＨを５に調節すること、活性炭及びイオン交換クロマトグラフィーで処理することによる、巨大菌（Bacillus metaterium）変異体を用いるメチオニンの微生物生産を記載している。
【０００９】
ＤＥ−Ａ−３５３３１９８号からは、特定の好熱性細菌を用いるＬ−ロイシンの発酵的製造が公知である。この発酵は、＋６０℃で連続的に、バイオマスを維持しつつ、生成物を含有する消費培地の分離、結晶器内での冷却（＋２℃まで）、結晶化されたアミノ酸の回収及び反応器への母液の返送を実施する。そこには、発酵によるメチオニンの生産については記載されていない。
【００１０】
これまでに記載された微生物によるメチオニンの生産方法は、依然として工業的基準の生産の要求を満たすものではない。この理由は、一方では水性発酵培地中のメチオニンの限定された溶解性であり、これは生合成能が高い場合に、メチオニンが発酵ブロス中に沈殿することをもたらし、これにより精製が阻害される。更なる理由は、技術水準により操作する場合には、相当の廃棄物流が生じ、この除去が高コストと結びつくことである。
【００１１】
本発明の簡単な説明
従って本発明の課題は、特に、メチオニンを部分的に結晶形で含有する発酵ブロスに使用できる、発酵により製造されたメチオニンの改善された単離方法を提供することである。別の課題は、実際に廃棄物流が生じず、これにより特に経済的に実施できる、メチオニンを含有する発酵ブロスの後処理方法を提供することである。
【００１２】
驚くべきことに、前記課題は、バイオマス分離のためにメチオニンの溶解性を集中的に利用する後処理方法を提供することによって解決された。この方法は、発酵により製造されたＬ−メチオニンの精製方法として結晶化を利用する。これは、飼料添加剤として使用される異なる２種の生成物（低濃度生成物及び高濃度生成物）を供給する。特定の方法においては、実際に廃棄物流が生じず、そして特に工業的基準における経済的なメチオニン製造が可能になる。
【００１３】
本発明の詳細な説明
Ａ）一般的な定義
「メチオニン」は、本発明の意味においては、原則的に、Ｌ−メチオニン又はＤ−メチオニン、これらの異性体の混合物、例えばラセミ体を含むが、Ｌ−メチオニンが好ましい。
【００１４】
メチオニンの溶解度は、水中で２０℃では約３０ｇ／ｌであり、７０℃では９０ｇ／ｌを上回る。発酵ブロス中においては、この条件下で、これに匹敵する規模の溶解度が観察される。
【００１５】
方法の手段、例えば「濃縮」、「分離」、「洗浄」、「乾燥」は、本発明の意味においては、当業者の能力の範囲内に存在する全種の方法を含む。例えば、「濃縮」は、大気圧下か又は真空適用での液相の蒸発と解してよい。「濃縮」は、例えば、慣用技術、例えば逆浸透又はナノ濾過若しくは慣用設備、例えば流下膜式蒸発器、薄膜式蒸発器又は回転式蒸発器若しくはこれらの組み合わせ物の使用下で実施してよい。「分離」は、例えば遠心分離、濾過、デカンテーション又はこれらの方法の組み合わせを含んでよい。「洗浄」は、例えば、固体の濾別及び場合により濾過残留物の懸濁後の一回又は数回の洗浄を含んでよい。「乾燥」は、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧造粒、流動層乾燥又はこれらの方法の組み合わせを含んでよい。
【００１６】
Ｂ）本発明の好ましい実施形態
本発明の第一の対象は、発酵により製造されたメチオニンを単離する方法において、
ａ）メチオニン生産微生物の発酵の際に生じ、メチオニンを含有し、特にメチオニンを部分的に未溶解の形で含有する液体分画を、液相中のメチオニンの溶解度が増大するのに十分な温度、好ましくはメチオニンが実質的に完全に溶解するのに十分な温度に加熱し、
ｂ）この液体分画から、メチオニンが富化された液相を得て、そして、
ｃ）場合により富化された液相を濃縮した後に、メチオニンを結晶化する方法に関する。
【００１７】
「実質的に」完全に溶解とは、メチオニンが、液相中のメチオニンの全含有率に対して、例えば９５％を上回って溶解している場合、９８％を上回って溶解している場合、特に１００％まで溶解している場合である。
【００１８】
メチオニンを含有する「液体分画」は、一般的には、発酵工程から得られ、特にメチオニンを部分的に未溶解の形で含有するブロスであり、場合により、慣用的に発酵ブロス中に含まれていてよい更なる固体構成成分を有するブロスか：又はこれに由来する液体、例えば好適な前処理によって得られた液体を有していてよい。「前処理」は、例えば、蒸発による濃縮又は物質の添加であってよい。例えば、メチオニン含有分画を、前の後処理バッチからブロスに添加するか若しくは引き続いての後処理段階又は目的に応じた生成物の使用（例えば飼料添加剤として）を促進する添加剤（以下を参照のこと）を添加してよい。
【００１９】
場合により高められた発酵ブロスの未溶解メチオニンの含有率は、発酵ブロスの全質量に対して、約１質量％〜約１０質量％、好ましくは約３質量％〜約８質量％の範囲内か又は全固体含有率に対して約３０質量％〜約８０質量％、好ましくは約５０質量％〜約５７質量％の範囲内である。
【００２０】
例えば、本発明にかかる発酵は、約９６ｇ／ｌのメチオニン含有量をもたらすことができ、このうち、一般的な発酵温度では、約４６ｇ／ｌが溶解しており、かつ約５０ｇ／ｌが未溶解で存在する。
【００２１】
富化された液相のメチオニン含有率は、乾燥残留物に対して、約６０質量％〜約１００質量％、又は約９０質量％〜約１００質量％、例えば約７５質量％〜約８５質量％又は約９５質量％〜約１００質量％の範囲内であり、これらはそれぞれ乾燥質量に対するものである。
【００２２】
メチオニンを実質的に溶解させるために、段階ａ）において、溶解されるべき生成物の量に応じて、約６０℃〜約１２０℃、好ましくは約７０℃〜約１００℃の範囲内の温度に加熱する。その際、場合により圧力をわずかに高めて、例えば１〜５ａｔｍの下で操作することが必要であり得る。
【００２３】
段階ａ）においては、液体分画として、更なる前処理がなされていないバイオマスを含有する発酵ブロスを使用することが好ましい。
【００２４】
段階ｂ）のメチオニンが富化された液相は、溶解したメチオニンが富化され、加熱された発酵ブロスからバイオマスを分離することによって得ることが好ましい。メチオニンの早期の結晶化を防ぐために、バイオマスの分離の間、同様に温度を高めて、好ましくは上述した範囲の温度で操作する。
【００２５】
本発明の好ましい一実施形態においては、
ｄ）結晶化されたメチオニンを分離し、
ｅ）分離された固体の、好ましくは結晶性メチオニンを、場合により洗浄し、そして
ｆ）それを場合により乾燥させる。
【００２６】
更なる好ましい変法により、段階ｂ）において、分離されたバイオマスを、
ｇ１）場合により洗浄し、その際、洗浄に使用される液体を場合により加熱し、そして
ｇ３）それを乾燥させる。
【００２７】
この場合、この洗液の加熱は、例えば分離されたバイオマス分画中に固体メチオニンが含まれることが望ましい場合に必要であり得、かつこのバイオマス分画からメチオニンを可能な限り得ることが望ましい。
【００２８】
廃棄物流を回避するために、好ましくは、
ｇ２）段階ｇ１）において生じた洗液と、段階ｂ）のメチオニンが富化された液相とを合する。
【００２９】
上述の方法の後に得られた段階ｂ）のメチオニンを含有する液相を、例えば加熱しつつ、蒸留すること及び場合により真空を適用することによって更に濃縮する。その際に生ずる濃縮物のメチオニン含有率は、このとき濃縮物の全質量に対して約１０質量％〜約４０質量％の範囲内である。この場合、メチオニンの分離は、好ましくは冷却結晶化によって実施する。このために、この溶液を０〜２０℃の範囲内の温度に冷却する。結晶化の完了後に、この固体メチオニンを低温の洗液、例えば水で洗浄し、そして場合によりわずかに加熱して乾燥させる。
【００３０】
更なる変法によれば、段階ｄ）において生じた母液を、
ｄ１）メチオニン生産微生物を有する別の発酵バッチからのメチオニンを含有する液体分画と合するか；又は
ｄ２）メチオニン生産微生物を有する同じ又は別の発酵バッチから分離されたバイオマスに、段階ｇ３）による乾燥の前に添加する。
【００３１】
更なる変法によれば、段階ｅ）において生じた洗液を、
ｅ１）メチオニン生産微生物を有する別の発酵バッチからのメチオニンを含有する液体分画と合するか；又は
ｄ２）メチオニン生産微生物を有する同じ又は別の発酵バッチから分離されたバイオマスに、段階ｇ３）による乾燥の前に添加する。
【００３２】
母液及び洗液の返送によって、廃棄物流の発生が更に阻止される。
【００３３】
本発明によれば、更に、段階ｇ３）による乾燥は、噴霧乾燥段階を含むことが好ましい。
【００３４】
本発明の更なる対象は、メチオニンを発酵により製造する方法において、天然微生物又は組換え微生物を自体公知のように発酵し、そして形成されたメチオニンを上述の定義による方法によって単離する方法に関する。
【００３５】
好ましい実施形態においては、本発明にかかる方法は、コリネバクテリウム属の天然細菌又は組換え細菌から選択されたメチオニン生産微生物の使用下で実施する。
【００３６】
更に本発明は、飼料又は飼料補助剤（飼料添加剤）の製造のための、上述の段階ｇ３）によって得られた乾燥物の使用に関する。
【００３７】
本発明の対象はまた、食料又は飼料若しくは食料補助剤又は飼料補助剤を製造するための、本発明により単離されたメチオニンの使用である。
【００３８】
最後に、本発明は、上述の定義による方法によって得られたメチオニンを含有する乾燥バイオマス；かかるバイオマスを有する飼料添加剤；並びに慣用の飼料構成成分の他にかかる飼料添加剤を含有する飼料組成物に関する。
【００３９】
以下の段落においては、更なる本発明の展開を説明する。
【００４０】
Ｃ）本発明により使用される宿主細胞
本発明にかかる方法には、コリネフォルム細菌を使用することが好ましい。コリネバクテリウム属の細菌が好ましい。コリネバクテリウム属からは、特にＬ−アミノ酸生産能が当業者に知られているコリネバクテリウム・グルタミクム種を挙げることができる。
【００４１】
好適な株の例として：
コリネバクテリウム属から：
コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Colynebacterium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Colynebacterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Colynebacterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、コリネバクテリウム・メラッセコラ（Colynebacterium melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５；コリネバクテリウム・グルタミクム ＫＦＣＣ１００６５；又はコリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ２１６０８、
又は、ブレビバクテリウム属から：
ブレビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavum） ＡＴＣＣ１４０６７；ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum） ＡＴＣＣ１３８６９及びブレビバクテリウム・ジバリカツム（Brevibacterium divaricatum） ＡＴＣＣ１４０２０を挙げることができる；
（ＫＦＣＣ＝韓国連合細胞保存機関（Korean Federation of Culture Collection）；ＡＴＣＣ＝米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）；ＦＥＲＭ ＢＰ＝生命工学工業技術研究所保存機関、科学技術振興機構、日本（Sammlung des National institute of bioscience and Human-Technology, agency of Industrial Science and Technology, Japan））。
【００４２】
この場合、これらの細菌株は、未改変で使用するか又は好適に遺伝子改変して使用してよい。例えば、メチオニン生合成経路の遺伝子が増幅された微生物を使用して、そうして多くのメチオニンを細胞内に存在させてよい。選択的に又は付加的に、メチオニンを分解する代謝経路に関連する遺伝子を消失させるか又は減衰させてもよい。メチオニン生産を改善させる好適な戦略は、技術水準から公知であり、例えばＷＯ−Ａ−０２／１０２０９号、ＤＥ−Ａ−１０２１７０５８号、ＤＥ−Ａ−１０２３９３０８号、ＤＥ−Ａ−１０２３９０７３号、ＤＥ−Ａ−１０２３９０８２号及びＤＥ−Ａ−１０２２２８５８号に記載されており、これらは参照をもって開示されたものとする。
【００４３】
メチオニン含有量を低下させうる酵素の活性又は量を減らすために、当業者は種々の手段を単独で又は組み合わせて実施できる。本発明にかかるタンパク質をコードする遺伝子の転写頻度を低減させることによって、上述のタンパク質の濃度を低下させることができる。当業者は、コード遺伝子のプロモーター領域又は調節領域並びにリボソーム結合部位を改変又は交換することによってこれを達成できる。当業者は、コード領域の下流で、ターミネーターを改変させるか又は転写の安定性減少を導く配列を挿入することができる。ｍＲＮＡの寿命を減らすこれらの手段によって、関連するタンパク質の発現を低下させ、これによりその濃度を低下させることが可能になる。
【００４４】
発現した酵素のレベルでは、融合された配列は、分解速度を高めることができ、これにより同様にこのタンパク質の濃度の低下をもたらすことができる。更に、当業者は、コード遺伝子の標的又は非標的突然変異誘発によってその活性、基質親和性及び基質特異性を改変できる。酵素は、相応する遺伝子の突然変異によって、酵素反応の反応速度の部分的又は完全な減少が生ずるほどにその活性が影響を受けうる。かかる突然変異の例は、当業者には知られている（モトヤマ・Ｈ、ヤノ・Ｈ、テラサキ・Ｙ、アナザワ・Ｈ、応用微生物学と環境微生物学 ６７号：３０６４〜３０７０頁、２００１年（Motoyama H. Yano H. Terasaki Y. Anazawa H. Applied & Environmental Microbiology.67:3064-70, 2001）、エイクマン ＢＪ、エゲリング・Ｌ、サーム・Ｈ、アントニー・ファン・レーウェンフック６４号：１４５〜１６３頁、１９９３〜９４年（Eikmanns BJ. Eggeling L. Sahm H. Antonie Van Leeuwenhoek. 64:145-63, 1993-94））。タンパク質の変異体は、酵素複合体のホモ又はヘテロ多量体形成を減少又は阻害することもでき、これにより同様に酵素特性の悪化に導くこともできる。
【００４５】
このように改変された遺伝子は、プラスミド又は好ましくは染色体の何れかに統合されて存在していてよい。この場合、このように改変されていない元の遺伝子が依然として付加的に存在してよいが、改変された遺伝子と交換することが好ましい。
【００４６】
コリネフォルム細菌中で測定される酵素の活性を減らすために、機能的等価物、例えば人工的に生産された変異体又は他の生物からの天然のホモログをコードする遺伝子を発現させることが十分でありえる。この場合、元の遺伝子が依然として付加的に存在してよいが、改変された遺伝子又はホモログ遺伝子と交換することが好ましい。
【００４７】
付加的に、有利には、細菌によるメチオニン生産にとっては、メチオニン生合成経路、システイン代謝経路、アスパラギン酸セミアルデヒド合成、解糖、アナプレロティック、ペントースリン酸代謝、クエン酸回路又はアミノ酸輸送の１種又は複数種の酵素を増強してよい。
【００４８】
従って、メチオニンの製造のために、以下の１種又は複数種の遺伝子を増幅してよい：
− アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子ｌｙｓＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８１）、
− アスパラギン酸セミアルデヒドをコードする遺伝子ａｓｄ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８２）、
− グリセリンアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｇａｐ（エイクマン著（１９９２年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７４号：６０７６〜６０８６頁（Eikmanns （1992）,Journal of Bacteriology 174:6076~6086））、
− ３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子ｐｇｋ（エイクマン著（１９９２年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７４号：６０７６〜６０８６頁）、
− ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子ｐｙｃ（エイクマン著（１９９２年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７４号：６０７６〜６０８６頁）、
− トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子ｔｐｉ（エイクマン著（１９９２年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７４号：６０７６〜６０８６頁）、
− ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｍｅｔＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号７２５）、
− シスタチオニン−ガンマ−合成酵素をコードする遺伝子ｍｅｔＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４９１）、
− シスタチオニン−ガンマ−リアーゼをコードする遺伝子ｍｅｔＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３０６１）、
− シスタチオニン−合成酵素をコードする遺伝子ｍｅｔＨ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号１６６３）、
− セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｇｌｙＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号１１１０）、
− Ｏ−アセチルホモセリン−スルフヒドリアーゼをコードする遺伝子ｍｅｔＹ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号７２６）、
− メチレンテトラヒドロ葉酸−レダクターゼをコードする遺伝子ｍｅｔＦ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２３７９）、
− ホスホセリン−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｓｅｒＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号９２８）、
− ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子ｓｅｒＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３３４、ＤＮＡ−配列番号４６７、ＤＮＡ−配列番号２７６７）、
− セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｃｙｓＥ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８１８）、
− システイン合成酵素をコードする遺伝子ｃｙｓＫ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８１７）、
− ホモセリン−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｈｏｍ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号１３０６）。
【００４９】
付加的に、本発明にかかるメチオニンの製法にとっては、同時に以下の少なくとも１種の遺伝子を変異させ、そうして相応のタンパク質の活性が変異していないタンパク質と比べて、代謝産物によってわずかな程度で影響を受けるか又は影響を受けなくなること、若しくはその比活性を増大させることが有利であり得る：
− アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子ｌｙｓＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８１）、
− ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子ｐｙｃ（エイクマン著（１９９２年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７４号：６０７６〜６０８６頁）、
− ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｍｅｔＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号７２５）、
− シスタチオニン−ガンマ−合成酵素をコードする遺伝子ｍｅｔＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４９１）、
− シスタチオニン−ガンマ−リアーゼをコードする遺伝子ｍｅｔＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３０６１）、
− メチオニン合成酵素をコードする遺伝子ｍｅｔＨ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号１６６３）、
− セリン−ヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｇｌｙＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号１１１０）、
− Ｏ−アセチルホモセリン−スルフヒドリラーゼをコードする遺伝子ｍｅｔＹ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号７２６）、
− メチレンテトラヒドロ葉酸−レダクターゼをコードする遺伝子ｍｅｔＦ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２３７９）、
− ホスホセリン−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｓｅｒＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号９２８）、
− ホスホセリン−ホスファターゼをコードする遺伝子ｓｅｒＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３３４、ＤＮＡ−配列番号４６７、ＤＮＡ−配列番号２７６７）、
− セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｃｙｓＥ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８１８）、
− システイン合成酵素をコードする遺伝子ｃｙｓＫ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８１７）、
− ホモセリン−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｈｏｍ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号１３０６）。
【００５０】
更に、メチオニンの生産にとっては、以下の１種又は複数種の遺伝子を減衰させること、特にその発現を減少させるか又は消失させることが有利であり得る：
− Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素（Ｅ．Ｃ．２．５．１．６）をコードする遺伝子ｍｅｔＫ、
− ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子ｔｈｒＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４５３）、
− トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ｉｌｖＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２３２８）、
− トレオニン合成酵素をコードする遺伝子ｔｈｒＣ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４８６）、
− メソ−ジアミノピメリン酸Ｄ−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｄｄｈ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４９４）、
− ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子ｐｃｋ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３１５７）、
− グルコース−６−ホスフェート−６−イソメラーゼをコードする遺伝子ｐｇｉ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号９５０）、
− ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子ｐｏｘＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号２８７３）
− ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子ｄａｐＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４７６）、
− ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子ｄａｐＢ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４７７）、
− ジアミノジピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｌｙｓＡ（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ−配列番号３４５１）。
【００５１】
更に、メチオニンの生産にとって、少なくとも１種の前述の遺伝子ｍｅｔＫ、ｔｈｒＢ、ｉｌｖＡ、ｔｈｒＣ、ｄｄｈ、ｐｃｋ、ｐｇｉ、ｐｏｘＢ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｌｙｓＡを変異させ、そうして相応のタンパク質の酵素活性を部分的に又は完全に減少させることが有利であり得る。
【００５２】
更に、メチオニンの生産のために、更なる不所望な副反応を消失させることが有利であり得る（中山著「アミノ酸生産微生物の培養」、微生物による生成物の過剰生産、クラムファンツル、シキタ、ベネク（編者）、学術出版、ロンドン、イギリス、１９８２年（Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in : Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds), Academic Press, London, UK, 1982））。
【００５３】
過剰発現を達成するために、当業者は、種々の手段を単独で又は組み合わせて選ぶことができる。従って、適切な遺伝子のコピー数を高めるか、若しくは、プロモーター領域及び調節領域又は構造遺伝子の上流に見られるリボソーム結合部位を変異させてよい。同様に、構造遺伝子の上流に挿入された発現カセットが作用する。誘導可能なプロモーターによって、発酵によるＬ−メチオニン生産の過程において発現を高めることが付加的に可能である。ｍＲＮＡの寿命を延長する手段によって、同様に発現を改善する。更に、酵素タンパク質の分解の阻害によって、同様に、酵素活性を増強させる。この遺伝子又は遺伝子構造は、次の何れかで、種々のコピー数を有するプラスミド内に存在するか又は染色体内で統合及び増幅されて存在してよい。更に選択的に、関連する遺伝子の過剰発現は、培地組成及び培養条件の変更によって達成できる。
【００５４】
これに関して、当業者は、とりわけ、マルティンら（Martin et al.）（バイオテクノロジー Ｒ５、１３７〜１４６頁（１９８７年））（Biotechnology Ｒ5，137-146（1987））、ゲレロら（Guerrero et al.）（遺伝子 １３８号、３５〜４１頁（１９９４年）（Gene 138, 35-41(1994)) ツシマ、モリナガ（Tsuchiya und Morinaga）（バイオ／テクノロジー ６号、４２８〜４３０頁（１９８８年））(Bio/Technology 6, 428-430(1988)),エイクマンら（Eikmanns et al.）（遺伝子 １０２号、９３〜９８頁（１９９１年）） (Gene 102, 93-98(1991)), ＥＰ０４７２８６９号、ＵＳ４６０１８９３号、シュバルツア、プラー（Schwarzer und Puehler ）（バイオテクノロジー ９号、８４〜８７頁（１９９４年））(Biotechnology 9, 84-87(1991)）、レムシェイドら（Remscheid et al.）（応用微生物学と環境微生物学 ６０号、１２６〜１３２頁（１９９４年）） (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132(1994))、ラバールら（LaBarre et al. ）（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー １７５号、１００１〜１００７頁（１９９３年））(Journal of Bacteriology 175, 1001-1007(1993))、ＷＯ９６／１５２４６号、マランブレスら（Malumbres et al.）（遺伝子 １３４号、１５〜２４頁（１９９３年）） (Gene 134, 15-24(1993))、ＪＰ−Ａ−１０２２９８９１号、イエンセン、ハマー（Jensen und Hammer ）（バイオテクノロジーとバイオ工学 ５８号、１９１〜１９５頁（１９９８年））(Biotechnology and Bioengineering 58,.191-195(1998)), マクライド（Makrides）（微生物学紀要 ６０号：５１２〜５３８頁（１９９６年））(Microbiological Reviews 60:512-538(1996))及び公知の遺伝学及び分子生物学の教本にその手引きを見出す。
【００５５】
Ｄ）本発明にかかる発酵の実施
本発明により製造された微生物は、連続的に又は不連続的に、メチオニンの生産のために、回分法（回分培養）か又は半回分法（供給法（ｚｕｌａｕｆｖｅｒｆａｈｒｅｎ））若しくは反復半回分法（Ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ ｂａｔｃｈ Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ）（繰り返し供給法ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｚｕｌａｕｆｖｅｒｆａｈｒｅｎ））により、培養できる。公知の培養法に関する概要は、クミエル（Chmiel）の教本（バイオプロセステクニック１ 生物的方法技術入門（グスタフ・フィッシャー出版、シュツットガルト、１９９１年））（Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))又はシュトラス（Storhas）の教本（バイオリアクターとその周辺装置（フィエーク出版、ブラウンシュバイク／ビイスバデン、１９９４年））（Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,1994))に見出すことができる。
【００５６】
使用されるべき培養培地は、好適に、それぞれの株の要求を満たさなければならない。種々の微生物の培養培地の説明は、米国細菌学学会（ワシントンＤ．Ｃ、アメリカ合衆国、１９９８年）（American Society fuer Bacteriology） (Washington D.C., USA, 1981)のハンドブック「遺伝学的細菌学のための方法マニュアル」（"Manual of Methods fuer General Bacteriology"）に含まれている。
【００５７】
本発明により使用可能な培地は、大抵は、１種又は複数種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン及び／又は微量元素を含む。
【００５８】
好ましい炭素源は、糖、例えばモノ−、ジ−又はポリサッカリドである。特に好ましい炭素源は、例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、サッカロース、ラフィノース、デンプン又はセルロースである。糖は、複合化合物、例えば糖蜜、又は糖精製の他の副生物を介して、培地に添加してもよい。種々の炭素源の混合物を添加することも有利であり得る。考えられる他の炭素源は、油及び脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びヤシ油；脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸又はリノール酸；アルコール、例えばグリセリン、メタノール又はエタノール；及び有機酸、例えば酢酸又は乳酸である。
【００５９】
窒素源は、大抵、有機又は無機窒素化合物又はこれらの化合物を含有する物質である。窒素源の例は、アンモニアガス、又はアンモニウム塩、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム又は硝酸アンモニウム、硝酸塩、尿素、アミノ酸又は複合窒素源、例えばコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキス等を含む。これらの窒素源は、単独で又は混合物として使用してよい。
【００６０】
培地中に含まれていてよい無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅及び鉄の塩化物、リン塩又は硫酸塩を含む。
【００６１】
メチオニンを製造するための硫黄源としては、硫黄含有無機化合物、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、亜二チオン酸塩、四チオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物を使用してよいが、有機硫黄化合物、例えばメルカプタン及びチオールを使用してもよい。
【００６２】
リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム、若しくは適切なナトリウム含有塩を使用してよい。
【００６３】
金属イオンを溶液中で保持させるために、キレート剤を培地に添加してよい。特に好適なキレート剤は、ジヒドロキシフェノール、例えばカテコール、又はプロトカテキュエート（Ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔ）、若しくは有機酸、例えばクエン酸を含む。
【００６４】
本発明により使用される発酵培地は、慣用的に他の成長因子、例えばビタミン、又は成長促進物質をも含有しており、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、及びピリドキシンが挙げられる。成長因子及び塩は、しばしば、複合培地成分、例えば酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカー等に由来する。その上、培養培地に好適な前駆物質を添加してよい。培地化合物の厳密な組成は、それぞれの実験に強く依存し、かつかかる特定の事例ごとに決定する。培地の最適化についての情報は、教本「応用微生物学・生理学・実践アプローチ」編者Ｐ．Ｍ．ローデス、Ｐ．Ｆ．スタンベリー、ＩＲＬ出版（１９９７年）５３〜７３頁（"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach"（Hrsg. P.M. Phodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S.53-73, ISBN 0199635773）から得られる。成長培地は、例えばＳｔａｎｄａｒｄ １（Ｍｅｒｃｋ社製）又はＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン、ＤＩＦＣＯ社製）等を供給業者から購入することもできる。
【００６５】
全ての培地成分は、熱（２０分、１．５バール及び１２１℃）又は除菌の何れかによって滅菌する。これらの成分は、一緒に滅菌すること又は必要ならば別々に滅菌することの何れかを行ってよい。全ての培地成分は、培養の最初に添加するか又は、場合により連続的に又は回分的に添加してよい。
【００６６】
培養温度は、通常、１５〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃であり、かつ実験の間、一定に維持させるか又は変更してよい。培地のｐＨ値は、５〜８．５の範囲、好ましくは７．０付近であることが望ましい。培養物のｐＨ値は、培養の間、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア若しくはアンモニア水、又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸の添加によって調節することができる。泡の作用を調節するために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用してよい。プラスミドの安定性を維持するために、培地に好適な選択的作用物質、例えば抗生物質を添加してよい。好気的条件を維持するために、酸素又は酸素含有混合物、例えば周囲空気を培養物中に入れる。この培養は、最大の所望の生成物が形成されるまで継続する。この目的は、通常、１０〜１６０時間内で達成される。
【００６７】
こうして得られた、メチオニンを含有する発酵ブロスは、慣用的に、乾燥質量が７．５〜２５質量％である。
【００６８】
更に、発酵は、少なくとも終盤で糖を制限して行うことも有利であるが、特に少なくとも３０％の発酵時間をわたって、糖を制限して行うことが有利である。このことは、この時間の間、発酵培地中の使用可能な糖の濃度を≧０〜３ｇ／ｌに維持するか若しくは低下させることを意味する。
【００６９】
Ｅ）メチオニンの精製
本発明により結晶化の後に得られたメチオニンが、依然として所望の純度を有していないのであれば、これらを更に精製してよい。このために、この生成物を溶解した形で、好適な樹脂を有するクロマトグラフィーにかけ、その際、この所望の生成物又は不純物が完全に又は部分的にクロマトグラフィー樹脂上に留まる。このクロマトグラフィー段階は、必要であれば、繰り返してよく、その際、同じ又は別のクロマトグラフィー樹脂を使用する。当業者は、好適なクロマトグラフィー樹脂及びその有効な使用の選択に精通している。精製された生成物は、濾過又は限外濾過によって濃縮し、そして、生成物の安定性が最大である温度で貯蔵してよい。
【００７０】
単離された化合物の独自性及び純度は、公知の技術によって測定できる。これらは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、分光的方法、染色的方法、薄層クロマトグラフィー、ＮＩＲＳ、酵素試験、又は微生物学的試験を含む。これらの分析方法は：パテックら著（１９９４年）応用環境微生物学６０号：１３３〜１４０頁（Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140）；マラクホバら著（１９９６年）バイオテクノロジー１１号２７〜３２頁（Malakhova et al. (1996) Biotechnologiya 11 27-32）；及びシュミットら著（１９９８年）バイオプロセス工学１９号：６７〜７０頁（Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70）、ウールマン工業化学百科事典（１９９６年）Ａ２７巻、ＶＣＨ：ヴァインハイム、８９〜９０頁、５２１〜５４０頁、５４０〜５４７頁、５５９〜５６６頁、５７５〜５８１頁及び５８１〜５８７頁（Ulmann's Encuclopedia of Industrial Chemistry(1996) Bd. A27, VCH:Weinheim, S. 89-90,S. 521-540, S.540-547, S. 559-566, 575-581 und S. 581-587）；ミハル・Ｇ著（１９９９年）生化学経路：生物化学及び分子生物学アトラス、ジョンウィリアンドサンズ（Michal, G(1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons）；生化学及び分子生物学のラボラトリーテクニック１７巻（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17）のファロン・Ａら著（１９８７年）生化学におけるＨＰＬＣの応用（Fallon, A. et al.(1987) Applications of HPLC in Biochemistry）にまとめられている。
【００７１】
Ｆ）バイオマスの乾燥
発酵の完了後に、メチオニンを含有する発酵ブロスを、最終的な乾燥飼料添加剤に直接加工してよい。しかしながら、本発明の好ましい実施形態によれば、最初に、この発酵ブロスからバイオマス分を完全に又は部分的に、好ましくは完全に、例えば遠心分離によって取り出して、そして本発明にかかる飼料添加剤に加工する。生じたバイオマスは、依然として所定のメチオニン分を含有し、該メチオニン分は所望により、中間に提供された洗浄段階によって減少していてよい。
【００７２】
本発明にかかるバイオマスを好適な乾燥製品とする後処理は、技術水準から自体公知の種々の方法によって実施してよい。特に、製造には、乾燥方法、例えば噴霧乾燥、噴霧造粒、接触乾燥、流動層乾燥、又は凍結乾燥が好適である。好適な方法は、例えば：
Ｏ・クリシェール、Ｗ・カスト著 乾燥技術 第１巻「乾燥技術の科学的基礎」、シュプリンガー出版（１９７８年）（O. Krischer, W. Kast, Trocknungstechnik Erster Band, "Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik", Springer-Verlag 1978）；クリシュール／クレール著 乾燥技術 第２巻「乾燥剤と乾燥方法」シュプリンガー出版（１９５９年）（Krischer/Kroell., Trocknungstechnik Zweiter Band, "Trockner und Trocknungsverfahren", Springer-Verlag 1959）；Ｋ・クレール、Ｗ・カスト著 乾燥技術 第３巻「製造における乾燥と乾燥剤」シュプリンガー出版（１９８９年）（K.Kroell, W. Kast, Trocknungstechnik Dritter Band,"Trocknen und Trochner in der Produktion", Springer-Verlag 1989）；Ｋ・マスターズ著「噴霧乾燥ハンドブック」ロングマンサイエンティフィック＆テクニカル１９９１年、７２５頁（K. Masters, "Spray Drying Handbook", Longman Scientific & Technical 1991, 725 Seiten）；Ｈ・ウールマン、Ｌ・メール著「流動層−噴霧造粒」シュプリンガー出版（２０００年）（H.Uhlemann, L. Moerl, "Wirbelschicht-Spruehgranulation", Springer-Verlag 2000）；凍結乾燥：ゲオルグ−ヴィルハイム エトイエン著、「凍結乾燥」、ＶＣＨ１９９７年（Gefriertrocknung: Georg-Wilheim Oetjen, "Gefrietrocknen", VCH1997）並びにＥＰ−Ａ０８０９９４０号に記載されている。上述の文献は参照をもって開示されたものとする。
【００７３】
本発明にかかる乾燥段階は、噴霧乾燥、例えば組み込まれた流動床を用いる噴霧乾燥又は噴霧造粒によって実施することが特に好ましい。
【００７４】
所望であれば、乾燥を、好適な飼料に適した担体材料の存在下で実施してよく、これにより特に流動性が改善され、これにより製品の質を改善することができる。
【００７５】
飼料に適した担体材料としては、慣用の不活性担体を使用してよい。「不活性」担体は、添加剤中に含まれる食料添加剤との負の相互作用を示してはならず、かつ飼料添加剤中の助剤としての使用に懸念を示してはならない。好適な担体材料の例として：天然又は合成由来の無機又は有機化合物を挙げることができる。好適な低分子無機担体は、塩、例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、硫酸ナトリウム及び硫酸マグネシウム、又はケイ酸である。好適な有機担体の例は、特に糖、例えばグルコース、フルクトース、サッカロース並びにデキストリン及びデンプン製品である。高分子有機担体の例としては：デンプン調製物及びセルロース調製物、例えば特にトウモロコシデンプン、穀粉、例えば小麦粉、ライ麦粉、大麦粉及びカラスムギ粉又はこれらの混合物若しくは小麦セモリナふすま（Ｗｅｉｚｅｎｇｒｉｅｓｓｋｌｅｉｅ）を挙げることができる。この担体材料は、調製物中に、乾燥量基準に対して、約５質量％〜約８５質量％、例えば約１０質量％〜約３０質量％、２０質量％〜４０質量％又は５０質量％〜８５質量％の含有率で含まれていてよい。
【００７６】
以下に、幾つかの好ましい乾燥技術を一般的な形で簡単に説明する。
【００７７】
噴霧乾燥は、最初に、依然として湿潤なバイオマスを噴霧塔中のアトマイザーにポンプ導入して実施してよい。このアトマイジングは、例えば、圧力ノズル（一成分ノズル）、二成分ノズル又は遠心噴霧器を用いて実施する。液滴の乾燥は、噴霧乾燥器中に導かれた熱気流によって実施する。遠心噴霧器を使用する場合には、この乾燥は、並流において実施するのが好ましい。ノズルを使用する場合には、この乾燥は逆流又は混合流中で実施することも好ましい。乾燥した粉末は、塔において排出するか、空気流と一緒に飛沫同伴させ、そしてサイクロン及び／又はフィルター中で分離してよい。生成物及び動作様式に応じて、噴霧乾燥器にフランジ取付形の内部の流動床又は外部の流動床中で実施できる後乾燥が必要でありうる。
【００７８】
本発明にかかる乾燥方法の変法においては、乾燥段階、特に噴霧乾燥に、連続的又は不連続的な流動床凝集を後接続する。このために、流動床乾燥器内で、この工程の最初に、粉末形状の材料、例えば噴霧乾燥によって得られた粉末形状の添加剤を装入する。この流動化は、例えば予熱された空気を供給することによって実施する。流動層に液相、例えば更なるバイオマス、又は結合剤を含有する溶液を噴霧し、これにより装入された粉末をこの溶液で湿潤させ、この付着特性によって更に凝集させる。同時に、連続的に又は準連続的、すなわち周期的な間隔で、部分量の凝集物を流動層から排出する。この排出物は、例えばふるいを用いて分級化する。その際に生ずる粗材料は、このときに粉砕し、そして流動床に再び連続的に返送してよい。微細成分、例えば排気フィルター装置からの微細成分は、同様に連続的に返送してよい。
【００７９】
更なる好ましい変法は、噴霧乾燥された粉末の引き続いての凝集と結びつくバイオマスの粉末への噴霧乾燥を含む。これは、不連続的又は連続的に実施してよい。連続的な動作様式が好ましい。かかる方法は市販の噴霧乾燥装置を使用して実施できる。しかし、有利には、ＦＳＤ（流動層噴霧乾燥器（Ｆｌｕｉｄｉｚｅｄ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ））、ＳＢＤ（スプレーベッド乾燥器（Ｓｐｒａｙ Ｂｅｄ Ｄｒｙｅｒ））、又はＭＳＤ（多段階乾燥器（Ｍｕｌｔｉｓｔａｇｅ Ｄｒｙｅｒ））として公知の装置内で実施する。
【００８０】
本発明にかかる乾燥製品の連続的製造のための流動層噴霧乾燥器（ＦＳＤ）−乾燥装置は、特に、以下の型によって作動させてよい：湿潤なバイオマスを、ＦＳＤ乾燥器の頂部に供給路を介して導入し、そして噴霧器を用いて噴霧する。この乾燥は、空気を並流で導入することによって実施する。この場合、空気は熱を介して予熱する。噴霧乾燥された粉末は、ＦＳＤ乾燥器の底部の組み込まれた流動床中に集まり、そこで噴霧装置を用いて圧縮空気の使用下で、例えばこの粉末に結合剤溶液を噴霧し、それを導入された空気で流動させる。このために、空気を予熱し、そして供給路を介して組み込まれた流動床のガス整流板の下方に供給する。その際に生じた前凝集物は、後接続された外部の流動床に達する。この外部の流動床においては、予熱された空気が更なる供給路を介して下方から導入される。この流動床に装入された前凝集物に、更なる噴霧装置を用いて、圧縮空気の使用下で、（例えば、結合剤溶液を）再び噴霧し、そして凝集させて最終生成物を得る。微細な凝集物は、流動床から排出させ、そして上述のとおり、更なる後処理を行ってよい。
【００８１】
噴霧される液体の組成及び量は、噴霧される溶液の付着特性、達成されるべき凝集物の大きさ及びプロセス条件に依存する。
【００８２】
噴霧されるバイオマスの付着特性が十分でない場合には、噴霧の後に粒子の安定した付着を確保するために、結合剤を付加的に使用することが有利である。これにより、凝集物が乾燥の際に再び分かれることを回避する。かかる場合においては、水性媒質中に可溶であるか又は分散可能な結合剤を流動床中に噴霧することが好ましい。好ましい結合剤の例としては、糖質、例えばグルコース、サッカロース、デキストリン、とりわけ糖アルコール、例えばマンニットの溶液、又はポリマー溶液、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、エトキシ化セルロース（ＥＣ）、エチルセルロース又はプロピルセルロースの溶液を挙げることができる。噴霧される結合剤の量及び付着特性の目標とする選択によって、種々の大きさ及び強度の凝集物が生ずる。
【００８３】
結合剤を別個の溶液として噴霧するのであれば、この溶液の結合剤含有率は、溶液の全質量に対して約１質量％〜約３０質量％の範囲内である。これに関して、この結合剤は、同様に、水性媒質、好ましくは無菌の脱塩水中に溶解して存在している。慣用の添加剤、例えば緩衝液、又は可溶化剤が同様に含まれていてよい。
【００８４】
本発明によれば、最終製品中の結合剤の含有率は、０質量％〜約２０質量％、例えば約１質量％〜約６質量％である。また、最適な量は選択された結合剤の種類にも依存する。この場合、製品についての悪影響を回避することを留意しなければならない。
【００８５】
Ｇ）配合物
ｉ）飼料添加剤及び飼料組成物：
本発明にかかるメチオニンを含有する飼料添加剤は、流動性の微細な粉末として若しくは造粒された形で存在していることが好ましい。この場合、粒子は、例えば５〜２００μｍ、例えば１０〜１５０μｍ、２０〜１００μｍ又は３０〜８０μｍの大きさの範囲内であってよいが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
本発明にかかる添加剤のかさ密度は、約１００ｇ／ｌ〜約６００ｇ／ｌ、例えば１５０〜４００ｇ／ｌ又は２００〜３５０ｇ／ｌの範囲内であってよいが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
本発明にかかる添加剤のメチオニン含有率は、製法に応じて変動する。
【００８８】
本発明により得られるメチオニン結晶は更に、メチオニン含有率が、６０質量％よりも大きく、例えば約７０質量％〜約９８質量％、好ましくは約８０質量％〜約９５質量％、特に好ましくは約８７質量％〜約９５質量％である。塩（発酵ブロスからの残留物）の含有率は更に、約０質量％〜約２０質量％、特に約５質量％〜約１５質量％の範囲内であってよい。その他の発酵副成分は、約０質量％〜約２０質量％、特に約５質量％〜約１５質量％の含有率で含まれていてよい。
【００８９】
本発明にかかるバイオマスメチオニンは更に、メチオニン含有率が、３質量％よりも大きく、例えば約５質量％〜約４０質量％、又は約１０質量％〜約３５質量％である。更に、塩の含有率は、約０質量％〜約３０質量％、例えば約５質量％〜約２５質量％の範囲内であってよい。その他の発酵副成分は、約０質量％〜約２０質量％、例えば約５質量％〜約１５質量％の含有率で含まれていてよい。
【００９０】
最終的な添加剤の残留湿分の含有率は、添加剤の全質量に対して、好ましくは約３質量％未満〜約５質量％未満の範囲内である。前述の質量％は、乾燥生成物（好ましくは残留湿分を有さない）の全質量に対するものである。
【００９１】
上述の本発明にかかる配合物は、上述の構成成分の他に、更なる添加剤を含有してよく、それをバイオマスの後処理前、後処理の間又は後処理後に添加してよい。例として、保存剤、抗生物質、抗菌添加剤、酸化防止剤、キレート剤、生理学的に懸念のない塩、調味料、着色剤等を挙げることができる。栄養に関連する添加剤、例えばビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ３及び／又はＥ、Ｋ３、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸）；タウリン、カルボン酸、例えばトリカルボン酸及びその塩、例えばクエン酸塩、イソクエン酸塩、トランス−／シス−アコニット酸塩及び／又はホモクエン酸塩、酵素、カロチノイド、ミネラル、例えばＰ、Ｃａ、Ｍｇ及び／又はＦｅ及び微量元素、例えばＳｅ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、タンパク質、糖質、脂肪、アミノ酸が含まれていてもよい。更に、ピルビン酸、Ｌ−カルニチン、リポ酸、コエンザイムＱ１０、アミノカルボン酸、例えばクレアチン、オロト酸、ミオイノシトール、フラボノイド、ベタイン、ｐ−アミノ安息香酸が含まれていてよい。
【００９２】
本発明にかかるメチオニンを含有する飼料添加剤は、市販の動物飼料配合物中に添加でき、次いでそれを例えばウシ、ブタ、ヒツジ、家禽類等に与えることができる。本発明にかかる添加剤は、慣用の動物飼料構成成分と混合し、そして場合により仕上げ、例えばペレット化を行う。慣用の動物飼料構成成分は、例えばトウモロコシ、大麦、カッサバ、カラスムギ、大豆、魚粉、小麦セモリナふすま、大豆油、石灰、ミネラル、微量元素、アミノ酸及びビタミンである。
【００９３】
ｉｉ）食料補助剤及び飼料補助剤
本発明により製造されたメチオニンは、食品又は飼料中の添加剤又は栄養補助剤及び飼料補助剤、例えば総合ビタミン剤中の添加剤として使用される。このために、本発明により製造された生成物は、所望の量で、かつ自体公知のように、市販の食料及び飼料若しくは食料補助剤又は飼料補助剤中に添加してよい。この場合、使用に応じて種々の適切な含有率で含まれていてよい。
【００９４】
ｉｉｉ）被覆配合物
上述の本発明にかかる配合物は、場合により付加的に被覆を有していてよい。この場合、以下から選択された少なくとも１種の化合物を有する被覆剤を施す：
− ポリアルキレングリコール、特にポリエチレングリコール、例えば数平均分子量は約４００〜約１５０００、例えば４００〜１００００である；
− ポリアルキレンオキシドポリマー又はポリアルキレンオキシドコポリマー、例えば数量的な分子量は約４０００〜約２００００であり、特にポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマー；
− 置換ポリスチレン、マレイン酸誘導体及びスチレン−マレイン酸コポリマー；
− ビニルポリマー、特にポリビニルピロリドン、例えば数平均分子量は約７０００〜約１００００００である；単独又は他の化合物、例えばセルロースエーテル又はデンプンとの組み合わせの何れか；
− ビニルピロリドン／ビニルアセテート−コポリマー、例えば数平均分子量は約３００００〜約１０００００である；
− ポリビニルアルコール、例えば数平均分子量が約１００００〜約２０００００でありポリビニルアルコール、及びポリフタル酸ビニルエステル；
− ヒドロキシプロピルメチルセルロース、例えば数平均分子量は約６０００〜約８００００である；
− アルキル（メタ）アクリレートポリマー及びアルキル（メタ）アクリレートコポリマー、例えば数平均分子量は約１０００００〜約１００００００であり、特にエチルアクリレート／メチルメタクリレート−コポリマー及びメタクリレート／エチルアクリレート−コポリマー；
− ポリビニルアセテート、例えば数平均分子量は約２５００００〜約７０００００であり、場合により、ポリビニルピロリドンで安定化されている；
− ポリアルキレン、特にポリエチレン；
− 芳香族ポリマー、例えばリグニン；
− ポリアクリル酸；
− ポリアクリルアミド；
− ポリシアノアクリレート；
− フェノキシ酢酸−ホルムアルデヒド−樹脂；
− セルロース誘導体、例えばエチルセルロース、エチルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート；
− 動物性脂肪、植物性脂肪又は合成脂肪及び改質脂肪、例えばポリグリコール、脂肪アルコール、エトキシ化脂肪アルコール、高級脂肪酸；高級脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリド、例えばグリセリンモノステアラート、アルキルアリールエトキシレート及びヤシ油モノエタノールアミド；
動物性及び植物性ろう又は化学的に改質された動物性及び植物性ろう、例えば蜜ろう、カンデリラろう、カルナウバろう、モンタンエステルろう及び米胚芽ろう、鯨ろう、ラノリン、ホホバろう、サソールろう（ｓａｓｏｌｗａｃｈｓ）；
− 動物性及び植物性タンパク質、例えばゼラチン、ゼラチン誘導体、ゼラチン置換物、カゼイン、ホエイ、ケラチン、大豆タンパク質；ゼイン及び小麦タンパク質；
− モノ−及びジサッカリド、オリゴサッカリド、ポリサッカリド、例えばヒアルロン酸、プルラン、エルシナン、デンプン、化工デンプン、並びにペクチン、アルギン酸塩、キトサン、ガラギナン；
− 植物性油、例えばヒマワリ油、アザミ油、綿実油、大豆油、コーン胚芽油、オリーブ油、ナタネ油、アマニ油、オイルツリー（ｏｅｌｂａｕｍ）油、ヤシ油、アブラヤシ油；合成又は半合成油、例えば中鎖トリグリセリド又は鉱物油；動物性油、例えばニシン油、イワシ油、及び鯨油；
− 硬化（水素化又は部分水素化された）油／脂肪、例えば上述のうちの、特に水素化パーム油、水素化綿実油、水素化大豆油；
− 塗料被覆、例えばテルペン、特にセラック、トルーバルサム、ペルーバルサム、サンダラック及びシリコーン樹脂；
− 脂肪酸、飽和Ｃ６〜Ｃ２４カルボン酸及びモノ不飽和又はポリ不飽和のＣ６〜Ｃ２４カルボン酸の両方；
− ケイ酸；
及びこれらの混合物。
【００９５】
被覆の前に可塑剤又は乳化剤を脂肪又はろうに添加することは、場合により、皮膜の柔軟性を改善させるのに有利であり得る。
【００９６】
被覆の適用は、自体公知のように、場合により添加剤と一緒に、一般的には、混合装置中に存在する有用な生成物上に滴下又は噴霧する装置を介して実施する。この例は、ランス、スプリンクラーヘッド、一成分又は二成分ノズル、回転式滴下装置又はアトマイズ装置である。非常に簡単な事例においては、集中的な噴射としての局所的な添加も考えられる。選択的に、最初に、混合装置内で、被覆材料を装入し、次いで有用な生成物を添加してよい。更なる可能性は、最初に、壁の加熱の結果として又は機械的なエネルギー入力に基づいて溶解し、そして有用な生成物を覆う固体の被覆材料を添加することである。
【００９７】
ここで本発明を、添付の図面に関連してより詳細に説明する。その際、図１〜図４は、本発明にかかる結晶性の乾燥メチオニン及びメチオニンを含有する乾燥バイオマス（「バイオマスメチオニン」）の製造方法の異なる展開を示している。
【００９８】
実施例１：
ａ）発酵によるメチオニンの製造
メチオニン精製のための代表的な発酵ブロスの製造のために、実験室発酵を実施した。コリネバクテリウム・グルタミクム株ＡＴＣＣ１３０３２（米国培養細胞系統保存機関 マナッサス、アメリカ合衆国）を、２００ｍｌのＢＨＩ培地（Ｄｉｆｃｏ／Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、フランクリンレイク（Ｆｒａｎｋｉｎ Ｌａｋｅｓ）、アメリカ合衆国）の予備培養物中で培養した。次いで、Ｔｅｃｈｆｏｒｓ型発酵槽中において、この予備培養物を培養培地（約１４ｌ）中に移種した。
【００９９】
本培養の発酵培地は、以下の組成
２ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４
２ｇ／ｌ Ｋ２ＨＰＯ４
１０ｇ／ｌ 硫酸アンモニウム
１００ｇ／ｌ グルコース
５ｇ／ｌ 酵母エキス
２０ｍｇ／ｌ カナマイシン
１ｇ／ｌ ＫＳ９１１ ＡＳＭ 消泡剤
ｐＨ７．０
であり、脱塩水を所望の最終容量になるまで補充した。
【０１００】
微量塩溶液１ｍｌ／ｌ培地
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
１ｍｌ／ｌのプロトカテキュエート溶液（原液３００ｍｇ／１０ｍｌ）
ビオチン １ｍｇ／ｌ
チアミン １ｍｇ／ｌ
ＣａＣｌ２ ５ｍｇ／ｌ。
【０１０３】
予備培養による発酵槽のインキュベーション後に、この発酵槽を塩基（２５％ＮＨ４ＯＨ）の添加によりｐＨ７に維持し、そして糖が消費されるまで発酵させた。このことは、ｐＯ２値の増大か若しくはＯＴＲ及びＣＴＲの低下によって示された。
【０１０４】
ｂ）発酵ブロスの後処理
後処理の手順を、図１において図式を用いて概要を示す。
【０１０５】
出発物質としては、区域ａ）により製造された発酵ブロスを利用する。３０〜４０℃の発酵温度では、含まれるメチオニンの約５０％が結晶形で存在する。出発生成物は、含水率が約８６％であり、高められたメチオニン含有率が約９％、かつバイオマス含有率が約３％である。その他の発酵副生物及び鉱質は、発酵ブロス中に微量（約２．５質量％）で含まれている。
【０１０６】
この発酵ブロス２０ｋｇを、１５分にわたって７０℃に加熱する。これによりメチオニンが完全に溶解する。次いで、一定の温度で、バイオマスを遠心分離する。次いで、上清（約１５ｋｇ）を１００℃かつ大気圧で、メチオニン含有率が２０％になるまで濃縮する。次いで、この濃縮物を５Ｋ／ｈで５℃に冷却し、これにより大部分のメチオニンが結晶化する。次いでこの結晶を、ヌッチェフィルター上で結晶原料から分離し、事前に平衡化された４リットルの水（５℃）で洗浄し、次いで窒素を用いて４０℃で吹付乾燥する。この手順によって、純度約９０％の乾燥メチオニン１．３ｋｇを単離することができた。
【０１０７】
遠心分離残留物（約５ｋｇ）は、乾燥バイオマスの他に、約６％のメチオニンをも含有する。噴霧乾燥によって、この残留物を、約０．７ｋｇの淡黄色かつ流動性の残留湿分３％の乾燥粉末に変換でき、これは乾燥バイオマス及びその他の発酵副生物及び鉱物塩の他に、メチオニン（約３０％）をも含有する。
【０１０８】
噴霧乾燥は、実験室噴霧乾燥器中で、以下の装置設定で実施した：
入口温度：２００℃
出口温度：８０〜８２℃。
【０１０９】
加熱ガスとしては、６０ｍ３／ｈの窒素を使用した。ノズルガスを、２バールの圧力で、１．２ｍｍのノズルによって噴霧した。
【０１１０】
実施例２：
同じ出発材料を出発点として、この方法を改変し、バイオマスを遠心分離によって分離し、次いで分離されたバイオマスを５ｌの水で洗浄する（図２）。遠心分離後に、生じた上清を最初のバイオマス分離物に添加する。全ての上清を、１００℃かつ大気圧で、メチオニン含有率が１６％になるまで濃縮する。この濃縮物を５Ｋ／ｈで５℃に冷却することによって、メチオニンを結晶化する。この結晶を、ヌッチェフィルター上で分離し、事前に平衡化された４．５リットルの水（５℃）で洗浄し、次いで窒素を用いて４０℃で乾燥させる。この手順によって、乾燥メチオニンの量が約１．５ｋｇまで高まる。更に、単離された結晶体の純度は、約９０％である。
【０１１１】
分離及び洗浄されたバイオマスの残留物を、噴霧乾燥によって約０．５ｋｇの乾燥生成物に変換する。
【０１１２】
このように製造された生成物は、バイオマス及びその他の発酵副生物並びに鉱物塩の他に、メチオニン（約１０％）をも含有しており、流動性を示す。
【０１１３】
実施例３：
同じ出発材料を出発点として、実施例２からの方法を更に改変し、結晶性メチオニンの分離の際に生ずる母液及び洗浄水を、次のバッチ中において、メチオニンを含有する発酵ブロスに再び添加する（図３）。
【０１１４】
他の点では実施例２と同様の手順で行うと、発酵の際に、結晶化から乾燥メチオニン約１．５ｋｇが純度約９０％で得られ、メチオニン含有率が約１０％である噴霧乾燥されたバイオマスからは０．５ｋｇの生成物が得られる。
【０１１５】
実施例４：
同じ出発物質を出発点として、実施例２からの方法を更に改変し、結晶性メチオニンの分離の際に生ずる母液及び洗浄水をバイオマス流に、噴霧乾燥の前に添加する（図４）。
【０１１６】
他の点では実施例２と同様の手順で行うと、約１．１ｋｇのメチオニン含有バイオマスが生じ、これは乾燥バイオマス及びその他の発酵副生物並びに鉱物塩の他に、メチオニン（約３０％）をも含有する。乾燥メチオニンの量は、１．５ｋｇであり、その純度は約９０％である。
【０１１７】
実施例５：
メチオニン結晶化の後の母液及び洗浄水の一部を、バイオマス分離の前に発酵ブロスに添加し、そして他方の部分流を噴霧乾燥の前にバイオマス流に添加する変法（実施例３及び４の組み合わせ）も考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】本発明にかかる結晶性の乾燥メチオニン及びメチオニンを含有する乾燥バイオマスの製造方法を示す
【図２】本発明にかかる結晶性の乾燥メチオニン及びメチオニンを含有する乾燥バイオマスの製造方法を示す
【図３】本発明にかかる結晶性の乾燥メチオニン及びメチオニンを含有する乾燥バイオマスの製造方法を示す
【図４】本発明にかかる結晶性の乾燥メチオニン及びメチオニンを含有する乾燥バイオマスの製造方法を示す
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵により製造されたメチオニンを単離する方法において、
ａ）メチオニン生産微生物の発酵の際に生ずるメチオニンを含有する液体分画を、液相中のメチオニンの溶解度が増大するのに十分な温度に加熱し、
ｂ）この液体分画から、メチオニンが富化された液相を得て、そして
ｃ）場合により富化された液相を濃縮した後に、メチオニンを結晶化する方法。
【請求項２】
段階ａ）において、メチオニンを実質的に完全に溶解させるのに十分な条件を選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
約６０℃〜約１２０℃、好ましくは約７０℃〜約１００℃の範囲内の温度に加熱する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
段階ａ）において使用される液体分画が、バイオマスを含有する発酵ブロスである、請求項１から３までの何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
段階ｂ）のメチオニンが富化された液相を、それが富化された発酵ブロスからバイオマスを分離することによって得る、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ｄ）結晶化されたメチオニンを分離し、
ｅ）分離された固体メチオニンを場合により洗浄し、そして
ｆ）それを場合により乾燥させる、請求項１から５までの何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
段階ｂ）において分離されたバイオマスを、
ｇ１）場合により洗浄し、その際、洗浄に使用される液体を場合により加熱し、そして
ｇ３）それを乾燥させる、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
ｇ２）段階ｇ１）において生じた洗液と、段階ｂ）のメチオニンが富化された液相とを合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
段階ｄ）において生じた母液を、
ｄ１）メチオニン生産微生物を有する別の発酵バッチからのメチオニンを含有する液体分画と合するか；又は
ｄ２）メチオニン生産微生物を有する同じ又は別の発酵バッチから分離されたバイオマスに、段階ｇ３）による乾燥の前に添加する、請求項６から８までの何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
段階ｅ）において生じた洗液を、
ｅ１）メチオニン生産微生物を有する別の発酵バッチからのメチオニンを含有する液体分画と合するか；又は
ｅ２）メチオニン生産微生物を有する同じ又は別の発酵バッチから分離されたバイオマスに、段階ｇ３）による乾燥の前に添加する、請求項６から９までの何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
段階ｇ３）による乾燥が噴霧乾燥段階を含む、請求項７から１０までの何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
メチオニンを発酵により製造する方法において、天然微生物又は組換え微生物を自体公知のように発酵させ、そして形成されたメチオニンを、請求項１から１１までの何れか１項に記載の方法によって単離する方法。
【請求項１３】
メチオニン生産微生物が、コリネバクテリウム属の天然細菌又は組換え細菌から選択される、請求項１から１２までの何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｌ−メチオニンを単離する、請求項１から１３までの何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
飼料又は飼料補助剤の製造のための、請求項７から１１までの何れか１項に記載の方法によって得られた段階ｇ３）の乾燥物の使用。
【請求項１６】
食料又は飼料若しくは食料補助剤又は飼料補助剤の製造のための、請求項１から１４までの何れか１項に記載の方法によって単離されたメチオニンの使用。
【請求項１７】
請求項５から１１までの何れか１項に記載の方法によって得られた、メチオニンを含有するバイオマス。
【請求項１８】
請求項１７に記載のバイオマス及び／又は請求項１から４までの何れか１項に記載の方法によって得られたメチオニンを含有する飼料添加剤。
【請求項１９】
請求項１８に記載の飼料添加剤を含有する飼料組成物。
【請求項１】
発酵により製造されたメチオニンを単離する方法において、
ａ）メチオニン生産微生物の発酵の際に生ずるメチオニンを含有する液体分画を、液相中のメチオニンの溶解度が増大するのに十分な温度に加熱し、
ｂ）この液体分画から、メチオニンが富化された液相を得て、そして
ｃ）場合により富化された液相を濃縮した後に、メチオニンを結晶化する方法。
【請求項２】
段階ａ）において、メチオニンを実質的に完全に溶解させるのに十分な条件を選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
約６０℃〜約１２０℃、好ましくは約７０℃〜約１００℃の範囲内の温度に加熱する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
段階ａ）において使用される液体分画が、バイオマスを含有する発酵ブロスである、請求項１から３までの何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
段階ｂ）のメチオニンが富化された液相を、それが富化された発酵ブロスからバイオマスを分離することによって得る、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ｄ）結晶化されたメチオニンを分離し、
ｅ）分離された固体メチオニンを場合により洗浄し、そして
ｆ）それを場合により乾燥させる、請求項１から５までの何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
段階ｂ）において分離されたバイオマスを、
ｇ１）場合により洗浄し、その際、洗浄に使用される液体を場合により加熱し、そして
ｇ３）それを乾燥させる、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
ｇ２）段階ｇ１）において生じた洗液と、段階ｂ）のメチオニンが富化された液相とを合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
段階ｄ）において生じた母液を、
ｄ１）メチオニン生産微生物を有する別の発酵バッチからのメチオニンを含有する液体分画と合するか；又は
ｄ２）メチオニン生産微生物を有する同じ又は別の発酵バッチから分離されたバイオマスに、段階ｇ３）による乾燥の前に添加する、請求項６から８までの何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
段階ｅ）において生じた洗液を、
ｅ１）メチオニン生産微生物を有する別の発酵バッチからのメチオニンを含有する液体分画と合するか；又は
ｅ２）メチオニン生産微生物を有する同じ又は別の発酵バッチから分離されたバイオマスに、段階ｇ３）による乾燥の前に添加する、請求項６から９までの何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
段階ｇ３）による乾燥が噴霧乾燥段階を含む、請求項７から１０までの何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
メチオニンを発酵により製造する方法において、天然微生物又は組換え微生物を自体公知のように発酵させ、そして形成されたメチオニンを、請求項１から１１までの何れか１項に記載の方法によって単離する方法。
【請求項１３】
メチオニン生産微生物が、コリネバクテリウム属の天然細菌又は組換え細菌から選択される、請求項１から１２までの何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｌ−メチオニンを単離する、請求項１から１３までの何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
飼料又は飼料補助剤の製造のための、請求項７から１１までの何れか１項に記載の方法によって得られた段階ｇ３）の乾燥物の使用。
【請求項１６】
食料又は飼料若しくは食料補助剤又は飼料補助剤の製造のための、請求項１から１４までの何れか１項に記載の方法によって単離されたメチオニンの使用。
【請求項１７】
請求項５から１１までの何れか１項に記載の方法によって得られた、メチオニンを含有するバイオマス。
【請求項１８】
請求項１７に記載のバイオマス及び／又は請求項１から４までの何れか１項に記載の方法によって得られたメチオニンを含有する飼料添加剤。
【請求項１９】
請求項１８に記載の飼料添加剤を含有する飼料組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００７−５１４４３０（Ｐ２００７−５１４４３０Ａ）
【公表日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４４３６２（Ｐ２００６−５４４３６２）
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１４４２３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５９１５５
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（５９５１２３０６９）ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト (847)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ
【住所又は居所原語表記】Ｄ−６７０５６ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１４４２３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５９１５５
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（５９５１２３０６９）ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト (847)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ
【住所又は居所原語表記】Ｄ−６７０５６ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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