メチル化ＤＮＡ検出用マイクロアレイ
【課題】メチル化DNAを検出するためのDNAマイクロアレイの提供、及びメチル化DNAの検出を迅速かつ簡便に行うことができる、メチル化DNAの検出方法の提供。
【解決手段】特定なる配列に記載のキャプチャープローブが配置されたメチル化検出用DNAマイクロアレイを使用し、試料DNAをバイサルファイト処理後、ＰＣＲ処理してから、該試料を該マイクロアレイに供し、ハイブリダイゼーションを行うことにより、迅速且つ簡便にメチル化DNAの検出を行う。
【解決手段】特定なる配列に記載のキャプチャープローブが配置されたメチル化検出用DNAマイクロアレイを使用し、試料DNAをバイサルファイト処理後、ＰＣＲ処理してから、該試料を該マイクロアレイに供し、ハイブリダイゼーションを行うことにより、迅速且つ簡便にメチル化DNAの検出を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAのシトシンのメチル化を検出するためのDNAマイクロアレイ及び該マイクロアレイを用いたメチル化DNAの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAのメチル化は、DNAの複製や発現の調節において重要な役割を果たしている。真核細胞のDNAのメチル化は、Ｇ（グアニン）の５’側に位置するＣ（シトシン）（以下、「CpGジヌクレオチド」という）の５’位で生じることが多い。特に多くの遺伝子のプロモーター領域には多くのCpGジヌクレオチドが見られ、CpGアイランドと呼ばれている（非特許文献１）。一般に、常染色体のこれらCpGアイランドの大部分はメチル化されているが、プロモーター領域に密集して存在するCpGアイランドはメチル化されていない(非特許文献２)。さらにシトシンのメチル化は、遺伝子の発現制御で大きな役割を担い、そのメチル化パターンの変化が疾病等を惹起させるといえる。したがって、メチル化パターンを明らかにすることは、疾病の治療および予後を推し量る上で重要な情報となりうる。
【０００３】
メチル化されていないシトシンは、バイサルファイトで脱アミノ化することによって容易にウラシルに変換される（非特許文献３）。一方、メチル化されているシトシンは、バイサルファイトで処理してもウラシルへは変換されない。したがって、被検体由来のDNAをバイサルファイトで処理し、メチル化されたシトシンだけがウラシルに変換されたDNAを得ることができる。
【０００４】
このバイサルファイトで処理した被検体DNAを用いて、シーケンス解析、メチル化特異的PCR（MSP）により、メチル化されたシトシンを検出する。
【非特許文献１】Bird, A., Cell, 70, 5-8, 1992
【非特許文献２】Ng, H-H. et al.,Curr. Opin. Genet. Dev., 9, 158-163, 1999
【非特許文献３】Shapiro, R. et al., J. Amer. Chem.,92, 422, 1970
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、シーケンス解析によるメチル化DNA分析では、CpGアイランドが存在する調節領域は１〜２キロベースであるため、複数回のシーケンス反応を行う必要があり、容易な手段であるとはいいがたい。更に、高価な自動シーケンサー又は危険な放射性同位体を用いるため、簡便な方法とはいえない。また、シーケンス解析で多検体を処理することは難しい。
【０００６】
またMCPによるメチル化DNA分析では、各々のCpGアイランドに対して特異的なPCR用プライマーを用意する必要がある。すなわち、１箇所のCpGについて、プライマーの３’末端がＧ及びＡの２種類のプライマーと、逆方向のプライマーとの３種類のプライマーが少なくとも必要となる。そのため、CpGリッチな調節領域のメチル化シトシンのマッピングには膨大なPCR用プライマーを用意し、膨大な数のPCR反応を行い、増幅された膨大な数のPCR産物を電気泳動で解析する必要がある。更に複数の検体を調べることは、計り知れないPCR反応回数になるため、この手法では困難である。
【０００７】
本発明は、メチル化DNAを検出するためのDNAマイクロアレイの提供、及びメチル化DNAの検出を迅速かつ簡便に行うことができる、メチル化DNAの検出方法を提供することを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、DNAマイクロアレイを利用することにより、迅速且つ簡便にメチル化DNAを検出することができることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の通りである。
【０００９】
（１）配列番号１〜１０に記載のキャプチャープローブが配置されたメチル化検出用DNAマイクロアレイ。
【００１０】
（２）試料DNAをバイサルファイト処理し、該試料をマイクロアレイに供し、ハイブリダイゼーションを行うことを含む、メチル化DNAの検出方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、迅速且つ簡便にメチル化DNAを検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、配列番号１〜１０に記載のキャプチャープローブが配置されたメチル化検出用DNAマイクロアレイである。
【００１４】
配列番号１及び２は、APC（adenomatous polyposis coli）遺伝子（U02509）を検出するために設計されたプローブである。APC-Mはメチル化されたAPC遺伝子検出用プローブであり、APC-Nはメチル化されていないAPC遺伝子検出用プローブである。それらプローブは、APC遺伝子の760番目から825番目の塩基配列に相補となるよう設計されている。
【表１】
【００１５】
配列番号３及び４は、E-cadherin遺伝子（L34545）を検出するために設計されたプローブである。ECAD-Mはメチル化されたE-cadherin遺伝子検出用プローブであり、ECAD-Nはメチル化されていないE-cadherin遺伝子検出用プローブである。それらプローブは、E-cadherin遺伝子の971番目から1029番目の塩基配列に相補となるよう設計されている。
【表２】
【００１６】
配列番号５及び６は、hMLH1遺伝子（U83845）を検出するために設計されたプローブである。HMLH-Mはメチル化されたhMLH1遺伝子検出用プローブであり、HMLH-Nはメチル化されていないhMLH1遺伝子検出用プローブである。それらプローブは、hMLH1遺伝子の851番目から933番目の塩基配列に相補となるよう設計されている。
【表３】
【００１７】
配列番号７及び８は、p16遺伝子（X94154）を検出するために設計されたプローブである。P16-Mはメチル化されたp16遺伝子検出用プローブであり、P16-Nはメチル化されていないp16遺伝子検出用プローブである。それらプローブは、p16遺伝子の1148番目から1202番目の塩基配列に相補となるよう設計されている。
【表４】
【００１８】
配列番号９及び１０は、RASSF1A遺伝子（AX825810）を検出するために設計されたプローブである。RAS1-Mはメチル化されたRASSF1A遺伝子検出用プローブであり、RAS1-Nはメチル化されていないRASSF1A遺伝子検出用プローブである。それらプローブは、RASSF1A遺伝子の1279番目から1339番目の塩基配列に相補となるよう設計されている。
【表５】
【００１９】
上述のプローブは、支持体に固定される。支持体の形態は、平板、棒状、ビーズ等の形態物が使用できる。例えば、支持体として、平板を使用する場合、その平板上に、所定の間隔も以って、上述のプローブを種類毎に固定していく（スポッティング法等）。また、平板上の特定の位置で、上述のプローブを逐次合成していくことも可能である（フォトリソグラフィー法等）。中でも支持体として、中空繊維を使用し、各中空繊維に種類毎にプローブを固定し、それら中空繊維を集束、固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるマイクロアレイ（以下、繊維型マイクロアレイ）が好適に使用される。
【００２０】
固定の方法としては、どのような結合様式でも良い。また、支持体に直接、固定する必要もなく、例えば、ポリリジン等のポリマーでコーティング処理を行い、そこにプローブを固定しても良い。さらに中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持し、そのゲル状物にプローブが固定されていても良い。
【００２１】
以下に繊維型マイクロアレイに関して詳細に説明する。このマイクロアレイは、例えば、下記のａ）〜ｄ）の工程を経て作成することができる。
【００２２】
ａ）複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように３次元に配列し配列体を製造する工程。
【００２３】
ｂ）前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程。
【００２４】
ｃ）核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を該ブロック体の各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、核酸プローブを含むゲル状物を中空部に保持する工程。
【００２５】
ｄ）中空繊維の長手方向と交叉する方向で、切断してブロック体を薄片化する工程。
【００２６】
中空繊維材料としては、例えば、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系中空繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系中空繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系中空繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系中空繊維、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系中空繊維、ポリビニルアルコール系中空繊維、ポリ塩化ビニリデン系中空繊維、ポリ塩化ビニル系中空繊維、ポリウレタン系中空繊維、フェノール系中空繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系中空繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系中空繊維等が挙げられる。
【００２７】
上記中空繊維は、その長手方向が同一となるように３次元に配列される。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１−１０８９２８号公報参照）が挙げられる。また、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ねあわせ、それらの孔部に、中空繊維を通過させ、２枚の多孔板の間隔を開き、２枚の多孔板間の、中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させ硬化させる方法（特開２００１−１３３４５３号公報参照）が挙げられる。
【００２８】
次に配列体はその配列が乱れないように包埋される。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法、繊維同士を熱融着により接着する方法等が挙げられる。
【００２９】
次に包埋された配列体の各中空繊維の中空部に、核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入し、中空部内で重合反応を行う。これにより中空部にゲルが保持され、ゲルには核酸プローブが固定される。
【００３０】
ゲル前駆体溶液としては、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の一種類以上と、架橋性モノマーとしてメチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等を含むものである。予め核酸プローブを不飽和官能基で修飾しておけば、ゲル前駆体と共重合することにより、ゲルの構成に核酸プローブが化学結合する（特開2004-163211号公報参照）。
【００３１】
次に、中空繊維の長手方向と交叉する方向で、切断してブロック体を薄片化する。ここで作成された薄片は、マイクロアレイとして使用できる。マイクロアレイの厚みは、0.1mm〜1mm程度である。切断は、例えばミクロトーム、レーザー等により行うことができる。
【００３２】
このように作成されたマイクロアレイは、メチル化DNAの検出に使用される。検出に供する試料は、シトシンのメチル化の存在が予想されるものであれば特に制限はない。また種々の生物由来のDNAが使用される。
【００３３】
試料は細胞から調製したDNAをそのまま使用しても良いし、標的配列を含むDNA領域をPCR等で増幅しても良い。次に、試料DNA又はその増幅産物をバイサルファイトで処理する。この処理によりメチル化されていないシトシンは脱アミノ化反応によりウラシルに変換される(Herman、J. G. et al.:Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:9821-9826,1996)。重亜硫酸処理後の試料は、Multiplex PCRにより増幅する。増幅領域は、標的配列を含んでいる。PCRに使用するプライマーは、標的配列、すなわち検出すべきDNA領域を考慮し設計される。例えば、APC遺伝子を標的としたものであれば、配列番号１１及び１２が、E-cadherin遺伝子を標的としたものであれば、配列番号１３及び１４が、hMLH1遺伝子を標的としたものであれば、配列番号１５及び１６が、p16遺伝子を標的としたものであれば、配列番号１７及び１８が、RASSF1Aを標的にしたものであれば、配列番号１９及び２０が、それぞれプライマーペアとして使用される。
【００３４】
配列番号１１：gga gag aga agt agt tgt gta att
配列番号１２：aac tac acc aat aca acc aca tat
配列番号１３：ggt agg tga att ttt agt taa taa g
配列番号１４：caa act cac aaa tac ttt aca att c
配列番号１５：gta gan gtt tta ggg t （nはc又はt）
配列番号１６：ata aaa ccc tat acc taa tct atc
配列番号１７：aga aag agg agg ggt tgg ttg gtt att aga
配列番号１８：caa cca atc aac cga aaa ctc cat act act
配列番号１９：agt ata gta aag ttg gtt ttt aga aat a
配列番号２０：caa taa aaa cct aaa tac aaa aac tat
上記のプライマーを使用し、PCRを行う。好適にはMultiplex PCRが実施される。PCRの際に予め蛍光物質等で標識することにより、後述する検出を簡便に実施することができる。
【００３５】
次に、増幅産物をマイクロアレイに供し、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションの際の、緩衝液の選択、ｐH、温度等の条件は適宜設定される。ハイブリダイゼーション操作に続き、洗浄を行った後、ハイブリットを検出する。
【００３６】
上述にように、予め試料に蛍光標識しておけば、簡便にハイブリットを蛍光検出することが可能である。また標識は蛍光物質に限定されず、例えば放射性同位元素、ビオチン、ハプテン、抗体等が使用できる。
【００３７】
検出後、例えば、以下の処理により、メチル化率（メチレーションレベル）を確認することができる。メチレーションの定量は、まず、下記式１に基づいてメチル化塩基配列プローブの蛍光強度のメチル化および非メチル化プローブの蛍光強度の和に対する蛍光強度の比を算出する。
＜式１＞
【００３８】
次いで、算出したメチレーションレベルを強度比に応じて、更に５段階に分ける（レベル１；＜２０%、レベル２；＜４０%、レベル３；＜６０%、レベル４；＜８０%、レベル５；＜１００%.）。統計的分析をFisher’s exact testで行い、A p<0.05を閾値とする。
【実施例】
【００３９】
［実施例１］
１．検体試料調製
胃の上皮の正常組織および腫瘍組織をそれぞれ20組づつ、２０名の患者（男性および女性）から採取した。採取した組織サンプルは、実験に用いるまで−８０℃で保存しておいた。ＤＮＡの抽出はSepaGene（三光純薬社製）を用いて行った。
【００４０】
またユニバーサルなメチル化ＤＮＡ（ＣｐGenomeTM Universal methylated DNA, CHEMICON International Temecula, CA）およびハイパーメチレーションが報告されていない腫瘍抑制および腫瘍関連遺伝子をもつ死産した胎児の胃粘膜から採取したＤＮＡをそれぞれポジティブコントロール（完全にメチル化されたＤＮＡ）およびネガティブコントロール（完全な非メチル化ＤＮＡ）として用いた。
【００４１】
２．重亜硫酸処理とMultiplexＰＣＲ
メチル化されているシトシン以外のすべてのシトシンをウラシルに変換するために、ＤＮＡ試料のバイサルファイト処理を行った。
【００４２】
まず、２μｇのゲノムＤＮＡをNaOHで解離させ、バイサルファイトを行った。処理後、試料をWizard DNA purification resin（Promega Madison WI）を使って精製し、NaOHで処理後、エタノール中に戻し、２０μｌの蒸留水中に懸濁させた。
【００４３】
MultiplexＰＣＲは、ＱＩＧＥＮ MultiplexＰＣＲ kit（キアゲン社製）を使い、説明書に従って、５０μｌの反応量で行った。
【００４４】
ＰＣＲはサーマルサイクラー（GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems社製）を用い、９５℃で15分間加熱した後、３５サイクルのＰＣＲを行った。PCR条件、使用したプライマーは下記の通りである。
【００４５】
＜PCR条件＞
解離条件；９４℃で３０秒間
アニール；５７℃で９０秒間
伸長反応；７２℃で９０分間（最後に７２℃で１０分間）
＜プライマー＞
ＡＰＣ用プライマー（配列番号１１及び１２）、E-cadherin用プライマー（配列番号１３及び１４）、hMLH1用プライマー（配列番号１５及び１６）、p16用プライマー（配列番号１７及び１８）、RASSF1A用プライマー（配列番号１９及び２０）。
【００４６】
各プライマーペアーは、プライマー配列中にあるＣｐＧ配列を除くメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡともに同時に増幅するように設計した。混合したプライマーにはＣｐＧおよびＴｐＧ配列が等モル含まれている。蛍光で分析するためプライマーの末端にはフォアードおよびリバースともにＣｙ５でラベル化を施した。
【００４７】
３．DNAマイクロアレイによるアッセイ
Multiplex PCR 産物 (50 ml)をハイブリダイゼーションバッファー溶液 (6 x SSC, 0.2% SDS) に懸濁させ、三菱レイヨン社製ＤＮＡチップ（GenoPalTM ）を使用して５５℃で１７時間ハイブリダイゼーション反応を行った。反応後チップを洗浄バッファー溶液（2 x SSC-0.2% SDS）を使って、６５℃で２０分間の洗浄を２回行い、最後に2 x SSCで１０分間洗浄した。チップの検出は三菱レイヨン社製検出器を用いて行った。
【００４８】
４．メチル化の定量
メチレーションの定量は、まず下記式１に基づいてメチル化塩基配列プローブの蛍光強度のメチル化および非メチル化プローブの蛍光強度の和に対する蛍光強度の比を算出した。
＜式２＞
【００４９】
次いで、算出したメチレーションレベルを強度比に応じて、更に５段階に分けた（レベル１；＜２０%、レベル２；＜４０%、レベル３；＜６０%、レベル４；＜８０%、レベル５；＜１００%.）。統計的分析はFisher’s exact testで行い、A p<0.05を閾値とした。
【００５０】
５．コントロールプローブのハイブリダイゼーションシグナル強度
Ｅ-Cadherinを除く全遺伝子について、全スポットの蛍光強度をそれぞれのＰＣＲ産物毎に計算した。その結果、クロスハイブリダイゼーションは全スポットの１０％以下、また各遺伝子のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのメチル化率は、ポジティブコントロールが９０％以上、ネガティブコントロールが１０％以下を示していた（図１参照）。Ｅ-Cadherin については、メチル化配列と非メチル化配列間でクロスハイブリが認められた。また、Ｅ-Cadherinのポジティブコントロールとネガティブコントロールのメチル化率はそれぞれ７４％と２８％であった。（図１参照）
６．胃上皮部の腫瘍組織および正常組織のメチル化度
胃上皮の腫瘍組織と正常組織における各遺伝子のメチル化率（平均値±標準偏差）は表６
の通りとなった。また、各遺伝子スポットのシグナル強度の検出画像を図２に示した。
【表６】
【００５１】
胃上皮の腫瘍組織及び正常組織のほとんどすべてにおいて、大きくメチル化（レベル４）されていたＡＰＣ を除き、各遺伝子のメチル化率は腫瘍組織と正常組織間で大きく変化していた。この内、高メチル化率のもの、即ちレベル３以上を観測した検体数を遺伝子別に挙げると、E-Cadhelin で、腫瘍組織で２０検体中１検体、正常組織で２０検体中０検体、hMLH1 で、腫瘍組織で２０検体中１２検体、正常組織で２０検体中１０検体、p16で、腫瘍組織で２０検体中５検体、正常組織で２０検体中３検体、RASSF1A で、腫瘍組織で２０検体中２検体、正常組織で２０検体中０検体という結果となった（表７参照）。
【表７】
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】各遺伝子のネガティブコントロール及びポジティブコントロールのスポットシグナル検出画像。
【００５３】
【図２】各遺伝子スポットのシグナル強度の検出画像。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
配列番号１ 合成DNA
配列番号２ 合成DNA
配列番号３ 合成DNA
配列番号４ 合成DNA
配列番号５ 合成DNA
配列番号６ 合成DNA
配列番号７ 合成DNA
配列番号８ 合成DNA
配列番号９ 合成DNA
配列番号１０ 合成DNA
配列番号１１ 合成DNA
配列番号１２ 合成DNA
配列番号１３ 合成DNA
配列番号１４ 合成DNA
配列番号１５ 合成DNA
配列番号１６ 合成DNA
配列番号１７ 合成DNA
配列番号１８ 合成DNA
配列番号１９ 合成DNA
配列番号２０ 合成DNA
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAのシトシンのメチル化を検出するためのDNAマイクロアレイ及び該マイクロアレイを用いたメチル化DNAの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAのメチル化は、DNAの複製や発現の調節において重要な役割を果たしている。真核細胞のDNAのメチル化は、Ｇ（グアニン）の５’側に位置するＣ（シトシン）（以下、「CpGジヌクレオチド」という）の５’位で生じることが多い。特に多くの遺伝子のプロモーター領域には多くのCpGジヌクレオチドが見られ、CpGアイランドと呼ばれている（非特許文献１）。一般に、常染色体のこれらCpGアイランドの大部分はメチル化されているが、プロモーター領域に密集して存在するCpGアイランドはメチル化されていない(非特許文献２)。さらにシトシンのメチル化は、遺伝子の発現制御で大きな役割を担い、そのメチル化パターンの変化が疾病等を惹起させるといえる。したがって、メチル化パターンを明らかにすることは、疾病の治療および予後を推し量る上で重要な情報となりうる。
【０００３】
メチル化されていないシトシンは、バイサルファイトで脱アミノ化することによって容易にウラシルに変換される（非特許文献３）。一方、メチル化されているシトシンは、バイサルファイトで処理してもウラシルへは変換されない。したがって、被検体由来のDNAをバイサルファイトで処理し、メチル化されたシトシンだけがウラシルに変換されたDNAを得ることができる。
【０００４】
このバイサルファイトで処理した被検体DNAを用いて、シーケンス解析、メチル化特異的PCR（MSP）により、メチル化されたシトシンを検出する。
【非特許文献１】Bird, A., Cell, 70, 5-8, 1992
【非特許文献２】Ng, H-H. et al.,Curr. Opin. Genet. Dev., 9, 158-163, 1999
【非特許文献３】Shapiro, R. et al., J. Amer. Chem.,92, 422, 1970
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、シーケンス解析によるメチル化DNA分析では、CpGアイランドが存在する調節領域は１〜２キロベースであるため、複数回のシーケンス反応を行う必要があり、容易な手段であるとはいいがたい。更に、高価な自動シーケンサー又は危険な放射性同位体を用いるため、簡便な方法とはいえない。また、シーケンス解析で多検体を処理することは難しい。
【０００６】
またMCPによるメチル化DNA分析では、各々のCpGアイランドに対して特異的なPCR用プライマーを用意する必要がある。すなわち、１箇所のCpGについて、プライマーの３’末端がＧ及びＡの２種類のプライマーと、逆方向のプライマーとの３種類のプライマーが少なくとも必要となる。そのため、CpGリッチな調節領域のメチル化シトシンのマッピングには膨大なPCR用プライマーを用意し、膨大な数のPCR反応を行い、増幅された膨大な数のPCR産物を電気泳動で解析する必要がある。更に複数の検体を調べることは、計り知れないPCR反応回数になるため、この手法では困難である。
【０００７】
本発明は、メチル化DNAを検出するためのDNAマイクロアレイの提供、及びメチル化DNAの検出を迅速かつ簡便に行うことができる、メチル化DNAの検出方法を提供することを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、DNAマイクロアレイを利用することにより、迅速且つ簡便にメチル化DNAを検出することができることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の通りである。
【０００９】
（１）配列番号１〜１０に記載のキャプチャープローブが配置されたメチル化検出用DNAマイクロアレイ。
【００１０】
（２）試料DNAをバイサルファイト処理し、該試料をマイクロアレイに供し、ハイブリダイゼーションを行うことを含む、メチル化DNAの検出方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、迅速且つ簡便にメチル化DNAを検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、配列番号１〜１０に記載のキャプチャープローブが配置されたメチル化検出用DNAマイクロアレイである。
【００１４】
配列番号１及び２は、APC（adenomatous polyposis coli）遺伝子（U02509）を検出するために設計されたプローブである。APC-Mはメチル化されたAPC遺伝子検出用プローブであり、APC-Nはメチル化されていないAPC遺伝子検出用プローブである。それらプローブは、APC遺伝子の760番目から825番目の塩基配列に相補となるよう設計されている。
【表１】
【００１５】
配列番号３及び４は、E-cadherin遺伝子（L34545）を検出するために設計されたプローブである。ECAD-Mはメチル化されたE-cadherin遺伝子検出用プローブであり、ECAD-Nはメチル化されていないE-cadherin遺伝子検出用プローブである。それらプローブは、E-cadherin遺伝子の971番目から1029番目の塩基配列に相補となるよう設計されている。
【表２】
【００１６】
配列番号５及び６は、hMLH1遺伝子（U83845）を検出するために設計されたプローブである。HMLH-Mはメチル化されたhMLH1遺伝子検出用プローブであり、HMLH-Nはメチル化されていないhMLH1遺伝子検出用プローブである。それらプローブは、hMLH1遺伝子の851番目から933番目の塩基配列に相補となるよう設計されている。
【表３】
【００１７】
配列番号７及び８は、p16遺伝子（X94154）を検出するために設計されたプローブである。P16-Mはメチル化されたp16遺伝子検出用プローブであり、P16-Nはメチル化されていないp16遺伝子検出用プローブである。それらプローブは、p16遺伝子の1148番目から1202番目の塩基配列に相補となるよう設計されている。
【表４】
【００１８】
配列番号９及び１０は、RASSF1A遺伝子（AX825810）を検出するために設計されたプローブである。RAS1-Mはメチル化されたRASSF1A遺伝子検出用プローブであり、RAS1-Nはメチル化されていないRASSF1A遺伝子検出用プローブである。それらプローブは、RASSF1A遺伝子の1279番目から1339番目の塩基配列に相補となるよう設計されている。
【表５】
【００１９】
上述のプローブは、支持体に固定される。支持体の形態は、平板、棒状、ビーズ等の形態物が使用できる。例えば、支持体として、平板を使用する場合、その平板上に、所定の間隔も以って、上述のプローブを種類毎に固定していく（スポッティング法等）。また、平板上の特定の位置で、上述のプローブを逐次合成していくことも可能である（フォトリソグラフィー法等）。中でも支持体として、中空繊維を使用し、各中空繊維に種類毎にプローブを固定し、それら中空繊維を集束、固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるマイクロアレイ（以下、繊維型マイクロアレイ）が好適に使用される。
【００２０】
固定の方法としては、どのような結合様式でも良い。また、支持体に直接、固定する必要もなく、例えば、ポリリジン等のポリマーでコーティング処理を行い、そこにプローブを固定しても良い。さらに中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持し、そのゲル状物にプローブが固定されていても良い。
【００２１】
以下に繊維型マイクロアレイに関して詳細に説明する。このマイクロアレイは、例えば、下記のａ）〜ｄ）の工程を経て作成することができる。
【００２２】
ａ）複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように３次元に配列し配列体を製造する工程。
【００２３】
ｂ）前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程。
【００２４】
ｃ）核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を該ブロック体の各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、核酸プローブを含むゲル状物を中空部に保持する工程。
【００２５】
ｄ）中空繊維の長手方向と交叉する方向で、切断してブロック体を薄片化する工程。
【００２６】
中空繊維材料としては、例えば、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系中空繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系中空繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系中空繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系中空繊維、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系中空繊維、ポリビニルアルコール系中空繊維、ポリ塩化ビニリデン系中空繊維、ポリ塩化ビニル系中空繊維、ポリウレタン系中空繊維、フェノール系中空繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系中空繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系中空繊維等が挙げられる。
【００２７】
上記中空繊維は、その長手方向が同一となるように３次元に配列される。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１−１０８９２８号公報参照）が挙げられる。また、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ねあわせ、それらの孔部に、中空繊維を通過させ、２枚の多孔板の間隔を開き、２枚の多孔板間の、中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させ硬化させる方法（特開２００１−１３３４５３号公報参照）が挙げられる。
【００２８】
次に配列体はその配列が乱れないように包埋される。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法、繊維同士を熱融着により接着する方法等が挙げられる。
【００２９】
次に包埋された配列体の各中空繊維の中空部に、核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入し、中空部内で重合反応を行う。これにより中空部にゲルが保持され、ゲルには核酸プローブが固定される。
【００３０】
ゲル前駆体溶液としては、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の一種類以上と、架橋性モノマーとしてメチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等を含むものである。予め核酸プローブを不飽和官能基で修飾しておけば、ゲル前駆体と共重合することにより、ゲルの構成に核酸プローブが化学結合する（特開2004-163211号公報参照）。
【００３１】
次に、中空繊維の長手方向と交叉する方向で、切断してブロック体を薄片化する。ここで作成された薄片は、マイクロアレイとして使用できる。マイクロアレイの厚みは、0.1mm〜1mm程度である。切断は、例えばミクロトーム、レーザー等により行うことができる。
【００３２】
このように作成されたマイクロアレイは、メチル化DNAの検出に使用される。検出に供する試料は、シトシンのメチル化の存在が予想されるものであれば特に制限はない。また種々の生物由来のDNAが使用される。
【００３３】
試料は細胞から調製したDNAをそのまま使用しても良いし、標的配列を含むDNA領域をPCR等で増幅しても良い。次に、試料DNA又はその増幅産物をバイサルファイトで処理する。この処理によりメチル化されていないシトシンは脱アミノ化反応によりウラシルに変換される(Herman、J. G. et al.:Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:9821-9826,1996)。重亜硫酸処理後の試料は、Multiplex PCRにより増幅する。増幅領域は、標的配列を含んでいる。PCRに使用するプライマーは、標的配列、すなわち検出すべきDNA領域を考慮し設計される。例えば、APC遺伝子を標的としたものであれば、配列番号１１及び１２が、E-cadherin遺伝子を標的としたものであれば、配列番号１３及び１４が、hMLH1遺伝子を標的としたものであれば、配列番号１５及び１６が、p16遺伝子を標的としたものであれば、配列番号１７及び１８が、RASSF1Aを標的にしたものであれば、配列番号１９及び２０が、それぞれプライマーペアとして使用される。
【００３４】
配列番号１１：gga gag aga agt agt tgt gta att
配列番号１２：aac tac acc aat aca acc aca tat
配列番号１３：ggt agg tga att ttt agt taa taa g
配列番号１４：caa act cac aaa tac ttt aca att c
配列番号１５：gta gan gtt tta ggg t （nはc又はt）
配列番号１６：ata aaa ccc tat acc taa tct atc
配列番号１７：aga aag agg agg ggt tgg ttg gtt att aga
配列番号１８：caa cca atc aac cga aaa ctc cat act act
配列番号１９：agt ata gta aag ttg gtt ttt aga aat a
配列番号２０：caa taa aaa cct aaa tac aaa aac tat
上記のプライマーを使用し、PCRを行う。好適にはMultiplex PCRが実施される。PCRの際に予め蛍光物質等で標識することにより、後述する検出を簡便に実施することができる。
【００３５】
次に、増幅産物をマイクロアレイに供し、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションの際の、緩衝液の選択、ｐH、温度等の条件は適宜設定される。ハイブリダイゼーション操作に続き、洗浄を行った後、ハイブリットを検出する。
【００３６】
上述にように、予め試料に蛍光標識しておけば、簡便にハイブリットを蛍光検出することが可能である。また標識は蛍光物質に限定されず、例えば放射性同位元素、ビオチン、ハプテン、抗体等が使用できる。
【００３７】
検出後、例えば、以下の処理により、メチル化率（メチレーションレベル）を確認することができる。メチレーションの定量は、まず、下記式１に基づいてメチル化塩基配列プローブの蛍光強度のメチル化および非メチル化プローブの蛍光強度の和に対する蛍光強度の比を算出する。
＜式１＞
【００３８】
次いで、算出したメチレーションレベルを強度比に応じて、更に５段階に分ける（レベル１；＜２０%、レベル２；＜４０%、レベル３；＜６０%、レベル４；＜８０%、レベル５；＜１００%.）。統計的分析をFisher’s exact testで行い、A p<0.05を閾値とする。
【実施例】
【００３９】
［実施例１］
１．検体試料調製
胃の上皮の正常組織および腫瘍組織をそれぞれ20組づつ、２０名の患者（男性および女性）から採取した。採取した組織サンプルは、実験に用いるまで−８０℃で保存しておいた。ＤＮＡの抽出はSepaGene（三光純薬社製）を用いて行った。
【００４０】
またユニバーサルなメチル化ＤＮＡ（ＣｐGenomeTM Universal methylated DNA, CHEMICON International Temecula, CA）およびハイパーメチレーションが報告されていない腫瘍抑制および腫瘍関連遺伝子をもつ死産した胎児の胃粘膜から採取したＤＮＡをそれぞれポジティブコントロール（完全にメチル化されたＤＮＡ）およびネガティブコントロール（完全な非メチル化ＤＮＡ）として用いた。
【００４１】
２．重亜硫酸処理とMultiplexＰＣＲ
メチル化されているシトシン以外のすべてのシトシンをウラシルに変換するために、ＤＮＡ試料のバイサルファイト処理を行った。
【００４２】
まず、２μｇのゲノムＤＮＡをNaOHで解離させ、バイサルファイトを行った。処理後、試料をWizard DNA purification resin（Promega Madison WI）を使って精製し、NaOHで処理後、エタノール中に戻し、２０μｌの蒸留水中に懸濁させた。
【００４３】
MultiplexＰＣＲは、ＱＩＧＥＮ MultiplexＰＣＲ kit（キアゲン社製）を使い、説明書に従って、５０μｌの反応量で行った。
【００４４】
ＰＣＲはサーマルサイクラー（GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems社製）を用い、９５℃で15分間加熱した後、３５サイクルのＰＣＲを行った。PCR条件、使用したプライマーは下記の通りである。
【００４５】
＜PCR条件＞
解離条件；９４℃で３０秒間
アニール；５７℃で９０秒間
伸長反応；７２℃で９０分間（最後に７２℃で１０分間）
＜プライマー＞
ＡＰＣ用プライマー（配列番号１１及び１２）、E-cadherin用プライマー（配列番号１３及び１４）、hMLH1用プライマー（配列番号１５及び１６）、p16用プライマー（配列番号１７及び１８）、RASSF1A用プライマー（配列番号１９及び２０）。
【００４６】
各プライマーペアーは、プライマー配列中にあるＣｐＧ配列を除くメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡともに同時に増幅するように設計した。混合したプライマーにはＣｐＧおよびＴｐＧ配列が等モル含まれている。蛍光で分析するためプライマーの末端にはフォアードおよびリバースともにＣｙ５でラベル化を施した。
【００４７】
３．DNAマイクロアレイによるアッセイ
Multiplex PCR 産物 (50 ml)をハイブリダイゼーションバッファー溶液 (6 x SSC, 0.2% SDS) に懸濁させ、三菱レイヨン社製ＤＮＡチップ（GenoPalTM ）を使用して５５℃で１７時間ハイブリダイゼーション反応を行った。反応後チップを洗浄バッファー溶液（2 x SSC-0.2% SDS）を使って、６５℃で２０分間の洗浄を２回行い、最後に2 x SSCで１０分間洗浄した。チップの検出は三菱レイヨン社製検出器を用いて行った。
【００４８】
４．メチル化の定量
メチレーションの定量は、まず下記式１に基づいてメチル化塩基配列プローブの蛍光強度のメチル化および非メチル化プローブの蛍光強度の和に対する蛍光強度の比を算出した。
＜式２＞
【００４９】
次いで、算出したメチレーションレベルを強度比に応じて、更に５段階に分けた（レベル１；＜２０%、レベル２；＜４０%、レベル３；＜６０%、レベル４；＜８０%、レベル５；＜１００%.）。統計的分析はFisher’s exact testで行い、A p<0.05を閾値とした。
【００５０】
５．コントロールプローブのハイブリダイゼーションシグナル強度
Ｅ-Cadherinを除く全遺伝子について、全スポットの蛍光強度をそれぞれのＰＣＲ産物毎に計算した。その結果、クロスハイブリダイゼーションは全スポットの１０％以下、また各遺伝子のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのメチル化率は、ポジティブコントロールが９０％以上、ネガティブコントロールが１０％以下を示していた（図１参照）。Ｅ-Cadherin については、メチル化配列と非メチル化配列間でクロスハイブリが認められた。また、Ｅ-Cadherinのポジティブコントロールとネガティブコントロールのメチル化率はそれぞれ７４％と２８％であった。（図１参照）
６．胃上皮部の腫瘍組織および正常組織のメチル化度
胃上皮の腫瘍組織と正常組織における各遺伝子のメチル化率（平均値±標準偏差）は表６
の通りとなった。また、各遺伝子スポットのシグナル強度の検出画像を図２に示した。
【表６】
【００５１】
胃上皮の腫瘍組織及び正常組織のほとんどすべてにおいて、大きくメチル化（レベル４）されていたＡＰＣ を除き、各遺伝子のメチル化率は腫瘍組織と正常組織間で大きく変化していた。この内、高メチル化率のもの、即ちレベル３以上を観測した検体数を遺伝子別に挙げると、E-Cadhelin で、腫瘍組織で２０検体中１検体、正常組織で２０検体中０検体、hMLH1 で、腫瘍組織で２０検体中１２検体、正常組織で２０検体中１０検体、p16で、腫瘍組織で２０検体中５検体、正常組織で２０検体中３検体、RASSF1A で、腫瘍組織で２０検体中２検体、正常組織で２０検体中０検体という結果となった（表７参照）。
【表７】
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】各遺伝子のネガティブコントロール及びポジティブコントロールのスポットシグナル検出画像。
【００５３】
【図２】各遺伝子スポットのシグナル強度の検出画像。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
配列番号１ 合成DNA
配列番号２ 合成DNA
配列番号３ 合成DNA
配列番号４ 合成DNA
配列番号５ 合成DNA
配列番号６ 合成DNA
配列番号７ 合成DNA
配列番号８ 合成DNA
配列番号９ 合成DNA
配列番号１０ 合成DNA
配列番号１１ 合成DNA
配列番号１２ 合成DNA
配列番号１３ 合成DNA
配列番号１４ 合成DNA
配列番号１５ 合成DNA
配列番号１６ 合成DNA
配列番号１７ 合成DNA
配列番号１８ 合成DNA
配列番号１９ 合成DNA
配列番号２０ 合成DNA
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１０に記載のキャプチャープローブが固定されたメチル化検出用DNAマイクロアレイ。
【請求項２】
試料DNAをバイサルファイト処理し、該試料を請求項１記載のマイクロアレイに供し、ハイブリダイゼーションを行うことを含む、メチル化DNAの検出方法。
【請求項１】
配列番号１〜１０に記載のキャプチャープローブが固定されたメチル化検出用DNAマイクロアレイ。
【請求項２】
試料DNAをバイサルファイト処理し、該試料を請求項１記載のマイクロアレイに供し、ハイブリダイゼーションを行うことを含む、メチル化DNAの検出方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−２３８７０１（Ｐ２００６−２３８７０１Ａ）
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５４１３８（Ｐ２００５−５４１３８）
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
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