ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株から得られたプロバイオティック化合物
【課題】抗腸管病原体のプロバイオティック活性を有するラクトバシラス種の新菌株、および該菌株を含有するプロバイオティック組成物の提供。
【解決手段】ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を含むプロバイオティック組成物。開示されたプロバイオティック組成物は、動物における腸管病原体による病気の阻害、および、動物の健康の維持に有用である。また、ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株プロバイオティック組成物の製造方法および使用方法も、これらプロバイオティック組成物を用いる方法。
【解決手段】ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を含むプロバイオティック組成物。開示されたプロバイオティック組成物は、動物における腸管病原体による病気の阻害、および、動物の健康の維持に有用である。また、ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株プロバイオティック組成物の製造方法および使用方法も、これらプロバイオティック組成物を用いる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年１２月１８日付けで出願された米国特許仮出願６０／２５６５２８の優先権を主張し、その全内容を参照により本明細書に含める。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、プロバイオティック性（probiotic）ラクトバシラス−カゼイ（Lactobacillus casei）調製物を開示する。詳しくは、新規に特徴付けられたＫＥ０１と指定されるラクトバシラス−カゼイ株から得られた、抗感染性で抗下痢性の調製物を開示する。また、ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を用いたプロバイオティック化合物を調製するための関連方法、および、ＫＥ０１プロバイオティック組成物を用いるための関連方法も開示する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書において記載される新規に認識されたプロバイオティック性ラクトバシラス−カゼイ株はＫＥ０１と指定されている。以前は、これと同じ生物をラクトバシラス−カゼイＫＥ９９と指定していた(例えば、米国仮出願第６０／２５６５２８号、および、A.S. Naidu, X. Xie, D.A. Leumer, S. Harrison, M.J. Burrill and E.A. Fonda. 2001. Reduction of sulfide、Ammonia Compounds and Adhesion Properties of Lactobacillus casei strain KE99 In Vitoro. Curr. Microbiol. 43: In pressを参照)。
【０００４】
乳酸菌（ＬＡＢ）は、宿主のミクロ生態学において重要な役割を果たす哺乳動物の消化管に固有のマイクロフローラであり、治療および予防特性の目覚しい一覧をもって信用されている。これら治療および予防特性としては、これらに限定されないが、腸の微生物生態学の維持、生理学的効果、免疫変調効果および抗菌効果が挙げられる。他のＬＡＢ関連性状としては、腸管腔への酵素放出が挙げられ、これはＬＡＢ付着と相乗的に作用し、腸の吸収不良の症状を緩和することができる。その上、ＬＡＢ酵素は腸のｐＨ調節を助け、それにより芳香族アミノ酸分解を増すことができる。[Fuller, R. Probioticfoods - current use and future developments. IFI NR 3:23-26 (1993); Mitsuoka, T. Taxonomy and ecology of Bifidobacteria. Bifidobacteria Microflora 3:11 (1984); Gibson, G.R. et al., Probiotics and intestinal infections, p.10-39. In R. Fuller (ed.), Probiotics 2: Applications and practical aspects. Chapman and Hall, London, U.K (1997); Naidu AS, et al., probiotic spectra of lactic acid bacteria(LAB). Crit Rev Food Sci Nutr 39:3-126 (1999); Naidu, A.S, Clemens, R.A. Probiotics. p.431-462. In A.S. Naidu (ed.), Natural Food Antimicrobial Systems. CRC Press, Boca Raton, FL (2000)]。
【０００５】
また、乳酸菌は、動物の糞廃棄物中の硫化物およびアンモニア含有化合物を顕著に減少させることにより、動物の排泄物による匂いと毒性とを減少させる能力を示した。農業ビジネスが発展し、地域社会が見た限り際限無く未使用の農業地域への進出が続くにつれ、このエキソビボ（ex vivo）でのＬＡＢの用途はますますより重要になりつつある。例え
ば、雄鶏の雛鳥や貝の廃棄物と、１５％の炭水化物およびＬＡＢを含む混合物とを混合すれば、ＬＡＢは、不快な匂いを除去し、孵化場の廃棄物に関する硫化水素生成物を減少させることが示されている。その上、ＬＡＢ組成物は、孵化場の廃棄物中の大腸菌およびサルモネラ菌含量を無視できるレベルに減少させる効能が示されている。加えて、ラクトバシラス−アシドフィルス（L. acidophilus）が媒介する乳酸発酵により、ブロイラー処理
廃棄物のような家禽廃物の匂いや粘度が顕著に減少する。その上、ＬＡＢ含有調製物は、分解困難な炭水化物の破壊を促進し、ブタの盲腸の細菌によるアンモニア生成物を減少させることが報告されている。最終的に、エキソビボでのラクトバシラス−カゼイＦＧ１およびラクトバシラス−プランタルム（L. plantarum）ＦＧ１０の貯蔵生牧草の発酵は、尿素分解生物を抑制することによって顕著にアンモニア量を減少させる。[Deshmukh, A.C.,
Patterson, P.H. Preservation of hatchery wastes by lactic acid fermentation. 1.
Laboratory scale fermentation. Poult Sci 76:1212-1219 (1997); Russell, S.M. et al., Lactic acid fermentation of broiler processing waste: physical properties and chemical analyses. Poult Sci 71:765-770 (1992); Tibbetts, G.W. et al., Poultry offal ensiled with Lactobacillus acidophilus for growing and finishing swine diets. J Anim Sci 64:182-190 (1987); Sakata, T. et al., Probiotic preperations dose-dependentty increase net production rates of organic acids and decrease that of annmonia by pig cecal bacteria in batch culture. Dig Dis Sci 44:1485-1493 (1999); Cai, Y. et al., Effect of applying lactic acid bacteria isolated from forage crops on fermentation characteristics, aerobic deterioration of silage. J Dairy Sci 82:520-526 (1999); Modler, H.W. et al., Bifidobacteria and bifidogenic factors. Can Inst Food Sci Tech 23:29-41 (1990)]。
【０００６】
しかしながら、ＬＡＢがヒトおよび家畜の生命の質を向上させる最も高い可能性は、ＬＡＢのインビボでのプロバイオティック用途にある。ＬＡＢがインビボでの有益なプロバイオティック効果を示すためには、生物は、消化管で長い時間生存しなければならない。それゆえに、腸の収縮による迅速な除去を防ぐような量を保持できるプロバイオティックＬＡＢ株を選択することが重要である。有効なプロバイオティック細菌は、胃の環境での生存が可能であり、腸上皮に付着することによって少なくとも一時的に腸で定着することが可能でなければならない。その結果として、粘膜表面に付着するための高められた能力を示し、それゆえに改善された細菌の維持、および、持続的な消化管での滞留時間を示すＬＡＢは、それらを示さないＬＡＢに対して競争力のある利点を有する。[Salminen, S. et al., Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges. Antonie Van Leeuwenhoek 70:347-358 (1996); Conway, P. Selection criteria for probiotic microorganisms. Asia Pacific J Clin Nutr 5:10-14 (1996); Havenaar, R. et al., Selection of strains for probiotic use, p.209-224. In R. Fuller (ed.), Probiotics, the scientific basis. Chapman and
Hall, London, U.K. (1992)]。
【０００７】
ラクトバシラス種は、多数の異なるメカニズムを介して哺乳動物の消化管にうまく定着することができる。例えば、いくつかの細菌種は、様々な上皮下部の（sub-epithelial）マトリックスタンパク質、および、腸の粘膜上の特定の受容体に結合する。他の種は、細菌および宿主の真核細胞表面上で、炭水化物とタンパク質因子との異なる組み合わせを必要とするメカニズムを介して、哺乳動物の腸の細胞に付着することができる。しかしながら、付着のメカニズムに関係なく、ヒト消化管にうまく定着するＬＡＢの能力により、ＬＡＢはプロバイオティック特性が与えられる。[Greene. J.D.. Klaenhammer, T.R. Factors involved in adherence of lactobacilli to human Caco-2 cell. Appl Environ Microbiol 60:4487-4494 (1994); Sarem, F. et al., Comparison of the adherence of three Lactobacillus strains to Caco-2 and Int-407 human intestinal cell lines. Lett Appl Microbiol 22:439-442 (1996); Naidu, A.S., et al., Particle agglutination assays for rapid detection of fibronectin, fibriogen, and collagen receptors on Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 26:1549-1554 (1988); Wadstrom, T. et al., Surface properties of lactobacilli isolated from the small intestines of pigs. J
Appl Bacteriol 62:513-520 (1987); Bernet, M.F. et al., Lactobacillus acidophilus LA 1 binds to cultured human intestinal cell lines and inhibits cell attachmen
t, invasion by entero-virulent bacteria. Gut 35:483-489 (1994); Jin, L.Z. et al., Effect of adherent Lactobacillus spp. on in vitro adherence of salmonellae to the intestinal epithelial cells of chichen. J Appl Bacteriol 81:201-206 (1996); Reid, G. et al., Influence of lactobacilli on the adhesion of Staphylococcus aureus and Candida albicans to fibers and epithelial cells, J Ind Microbiol 15:248-253 (1995)]。
【０００８】
一般的に言えば、競合的な結合プロセスで侵襲性または毒素産生の病原性の腸細菌（腸管病原体）を腸の粘膜から退去させることにより、プロバイオティック細菌は自身の有益な効果を働かせる。腸管病原体、例えば、これらに限定されないが、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、サルモネラ−エンテリティディス（Salmonella enteritidis）、エルシナ−シュードツベルクローシス（Yernia psudotuberculosis）、および、リステリア−モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）は、病気を引き起こすために動物の腸管にうまく定着することができなければならない。
【０００９】
有効に腸に定着するのにこれら生物が用いるメカニズムは様々である。例えば、ＣＦＡ／IまたはＣＦＡ／II付着因子を有するＥＴＥＣは、特に、培養中の、分裂したヒトの腸
上皮のＣａｃｏ−２細胞の刷子縁に付着する。サルモネラ−チフィムリウムおよびＥＰＥＣは、培養中の、分化したヒトの腸上皮のＣａｃｏ−２細胞の刷子縁に付着し、それに反して、エルシナ−シュードツベルクローシスおよびステリア−モノサイトゲネスは、未分化のＣａｃｏ−２細胞の末梢に結合する。
【００１０】
近年、熱で殺したラクトバシラス−アシドフィルス調製物が有効なプロバイオティック組成物であることが証明された。熱で殺したラクトバシラス−アシドフィルス調製物が、用量に応じて、既知の腸管病原体を試験動物の腸壁の内層から退去させることが示された。その結果として、腸管病原体は動物の消化管に定着できなくなり、病気が防がれた。例えば、ラクトバシラス−アシドフィルス（Ｌａｃｔｅｏｌ（登録商標）株）が、この大腸菌のＢ４１株（ＥＣＢ４１）の付着を用量に応じて阻害することが見出された。他の実験において、生きたラクトバシラス−アシドフィルスＬＢ株、および、熱で殺したラクトバシラス−アシドフィルスＬＢ株が、Ｃａｃｏ−２細胞の結合（association）と、腸管病
原体の侵入との両方をうまく阻害した。さらに他の研究において、熱で殺したラクトバシラス−アシドフィルスＬＢ株が、Ｃａｃｏ−２細胞へのＥＴＥＣ付着を完全に阻害することが示された。[Fourniat, J. et al., Heat- kilted Lactobacillus acidophilus inhibits adhesion of Escherichia coli B41 to HeLa cells. Ann Rech Vet 23:361-370 (1992); Chauviere, G. et al., competitive exclusion of diarrheagenic Escherichia coli (ETEC) from human enterocyte-like Caco-2 cells by heat-killed Lactobacillus. FEMS Microbiol Lett 70:213-217 (1992)]. Coconnier, M.H. et al., Inhibition of adhesion of enteroinvasive pathogens to human intestinal Caco-2 cells by Lactobacillus acidophilus strain LB decreases bacterial invasion. FEMS Microbiol Lett 110:299-305 (1993)]。
【００１１】
上述したように、プロバイオティック組成物とは、一般的に、腸の微生物バランスを改善することによって宿主に有益に作用する微生物栄養補助食品と定義される。一般的にプロバイオティックに関連する微生物の２つの主要な属としては、ラクトバシラス種と、ビフィドバクテリア種（Bifidobacteria sp）とがある。プロバイオティックによる有益な
効果としては、感染症への耐性の増加、より健全な免疫系、過敏性腸症候群の軽減、血圧の減少、血清コレステロールの減少、アレルギー緩和、および、腫瘍後退が挙げられる。しかしながら、近年の科学進歩や、プロバイオティック組成物の効能を支持する限定されたインビボおよびインビトロでの実験上の証拠が公開されているにもかかわらず、これらの利益および他の利益を報告する主な研究は解毒面での証拠に頼ってきた。
【００１２】
解毒性に依存する刊行物および限定されたインビトロのデータの例としては、米国特許（ＵＳＰＡＮ）第３，９５７，９７４号、第４，２１０，６７２号、第４，３１４，９９５号、第４，３４５，０３２号、第４，５７９，７３４号、第４，８７１，５３９号、第４，８７９，２３８号および第５，２９２，３６２号（「Hata」の特許）。Hataの特許は、ラクトバシラス種の様々な亜種を開示しており、有益なプロバイオティック様効果を報告している。しかしながら、Hataの特許は、上皮下部のマトリックスへの貪欲な結合、および、競合的な排除、および、微生物による細菌性の腸管病原体への妨害を示すラクトバシラス種を、開示または説明していない。
【００１３】
米国特許第６，０６０，０５０号（「’０５０特許」）は、貯蔵中に生物を保護するのに用いられる培地を含むスターチ含有培地中に懸濁されたプロバイオティック微生物からなる調製物を開示しており、生物を大腸に移送するのに役立ち、成長促進基質を提供する。しかしながら、’０５０特許は、腸管病原体に対するプロバイオティック活性を直接示すデータを提供していない。
【００１４】
米国特許第号５，９６５，１２８（「’１２８特許」）は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（腸管出血性大腸菌）が原因の腸の病気の治療を開示する。しかしながら、’１２８特許のプロバイオティック組成物は非病原性株の大腸菌しか含んでおらず、ラクトバシラス種は開示されていない。その結果として、’１２８特許の非病原性の腸内生物が、腸管出血性大腸菌に対する「プロバイオティック様」の保護をレシピエントに与えることができる一方で、ラクトバシラス種およびビフィドバクテリア属に関連する他の有益な特色が欠けている。
【００１５】
米国特許第４，８３９，２８１号、第５，０３２，３９９号および第５，７０９，８５７号（’８５７特許）は、腸粘膜細胞に付着する数種のラクトバシラス−アシドフィルス株を開示している。その上、’８５７特許は、ある種の腸管病原体の成長を阻害するラクトバシラス−アシドフィルス株を開示している。しかしながら、’８５７特許は、’８５７特許のラクトバシラス−アシドフィルス培養物に関して証明された有益な特色を有するラクトバシラス−カゼイ株を開示していない。
【００１６】
それゆえに、プロバイオティック活性を示すラクトバシラス種の新菌株に対する必要性が残る。特に、腸管病原体による病気を減少させ、動物の生命力と健康を増進する証明された能力を有するより多くのラクトバシラス種の株に対する必要性がある。
【発明の開示】
【発明の要旨】
【００１７】
本発明の目的は、プロバイオティック特性が実証されたラクトバシラス種の新菌株を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、抗腸管病原体のプロバイオティック活性を有するラクトバシラス種の新菌株を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、動物の健康および生命力を維持するラクトバシラス種の新菌株を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、実証されたプロバイオティック特性を有するラクトバシラス種から製造された栄養補助食品および医薬配合物を提供することである。
本発明は、ＫＥ０１と指定されたラクトバシラス−カゼイの新菌株を提供することによってこれらの目的および他の目的を実現し、当該新菌株は、実証されたインビボでの抗腸管病原体活性などの、科学的に証明されたプロバイオティック特性を有する。その上、本
発明は、ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株からなる栄養補助食品および医薬配合物を提供し、当該栄養補助食品および医薬配合物は、その生物に長期間の保護を提供し且つそれの証明されたプロバイオティック特性の維持を補助するトレハロースおよびフルクトオリゴ糖類からなる糖複合物に配合される。
【００２０】
腸管病原体感染を治療および予防し、ヒトおよび家畜の健康および生命力の維持を補助するのに用いることが出来る新規のプロバイオティック配合物の必要がある。近年、米国食品薬品管理局（ＦＤＡ）は、抗生物質の過剰な処方および臨床上の乱用に対する運動をを強めてきた。過剰な抗生物質使用は、第一選択抗生物質に耐性のあるヒトおよび動物病原体の数に応じて増加し、それにより従来の抗菌療法に反応しない感染症が増加してしまう。その上、動物飼料における予防的な抗生物質使用により家畜の腸の感染が驚くほど増加し、栄養素の吸収不良により群れの大きさや動物の体重が減少してしまう。その結果として、ヒトが摂取するのに適した健康な動物の数は減少し、市場に出すのに十分な程長く生存した動物は顕著に体重が減少し、結果的に肉の品質が低下する。
【００２１】
ヒトおよび家畜における薬剤耐性の腸管病原体の迅速な蔓延を防ぐ一つの手段は、抗生物質の使用を著しく減らすことである。しかしながら、飼育場および都市が過剰に込み合っているために、腸の感染などの伝染病の蔓延は不可避である。その結果として、予防的な抗生物質使用を完全に中断する前に、適切な抗菌の代案が利用可能でなければならない。近年の研究によれば、プロバイオティック微生物の特定の株を含む食料品および栄養補助食品を使用することにより、腸管病原体による病気の予防を補助し、多くの場合、実際に治癒するということが示されている。しかしながら、現在市販されている多くのプロバイオティック処方は、ラクトバシラス種およびビフィドバクテリア種（および他の属）を含む生物に依拠し、これらは、プロバイオティック効能を評価する承認された方法を用いた科学的な調査が行われていない。その結果として、現在利用可能な「プロバイオティック」処方のあまりにも多くが、インビボでの抗腸管病原体の活性が証明されていない。その上、市販の臨床上有効なプロバイオティック配合物の多くは貯蔵に適しておらず、それゆえに、有効量の生存性プロバイオティック細菌が使用者に渡されない。本発明者は、多くの市販の調製物を試験し、微生物の生存率が表示されていた濃度よりかなり低いことを見つけ、多くの場合において、本発明者は、これら市販の調製物が生存性細菌を少しも含まないことを発見している。
【００２２】
本発明者は、ＫＥ０１と指定されるラクトバシラス−カゼイの新菌株を調製およびパッケージング方法を開発した。本発明者は、もともとは、このラクトバシラス−カゼイの新菌株を伝統的な発酵したヨーグルト様のアジアの乳製品から得た。その後、本発明者は、単離物を特徴づけ、その株をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC, MD, USA
）に寄託した。ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９４５を与えられた。その上、本発明者は、生存性プロバイオティック微生物の臨床上有効な量が宿主に達するようなラクトバシラス−カゼイＫＥ０１の生存率を維持する調製物を開発した。
【００２３】
本発明は、腸管病原体の細菌付着を阻止する（微生物の妨害）ラクトバシラス−カゼイ株（ＫＥ０１）を提供し、当該腸管病原体としては、例えば、これらに限定されないが、多様な哺乳動物細胞タイプに対する、腸管病原性および腸管毒素原性大腸菌、ヘリコバクター−ピロリ（Helicobacter pylori）、カンピロバクター−ジェジュニ（Campylobacter
jejuni）、サルモネラ−チフィムリウム（S. typhimurium）、およびサルモネラ−エン
テリティディスが挙げられる。その上、本発明のラクトバシラス菌はまた、これら細菌性病原体および他の細菌性病原体を、多くの哺乳動物細胞に競合的に結合させないようにする（競合的な排除）。本発明の新規ラクトバシラス株に関する有益な特性により、全般的なヒトおよび動物の健康を支持する改善されたプロバイオティック栄養補助食品が得られ
た。その上、本発明は、例えば、これらに限定されないが、旅行者下痢症、胃腸感染症、溶血尿毒症症候群、および胃潰瘍などの状態に対して、予防薬、治療薬および苦痛緩和薬（本明細書においては、まとめて「プロバイオティック」と称する）を提供するのに用いることができる。
【００２４】
この新規ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株の追加的な新しい特徴および特色としては、これらに限定されないが、約２０００ｐｐｍの硫化物を含む増殖培地に晒した場合、４８時間以内に、硫化物濃度を３００ｐｐｍを超過する係数（factor）で減少させるラクトバシラス−カゼイＫＥ０１の能力、および、上皮下部のマトリックス、例えばバイオコート（登録商標）（コラーゲンＩ型、コラーゲンIV型、ラミニン、およびフィブロネクチン）、マトリゲル（登録商標）およびＣａｃｏ−２細胞の単分子層などへ強い結合を示すこと、が挙げられる。最も重要には、本発明のラクトバシラス−カゼイの再生した凍結乾燥調製物が、コラーゲンに付着した大腸菌を効果的に引き離すことが示された。
【００２５】
本発明のラクトバシラス−カゼイの生存率を維持し、その大腸菌置換特性を保持するのに用いられた方法としては、これらに限定されないが、糖トレハロースおよび水分の使用、ならびに、最終組成物を耐酸素ポリマー（例えばＭｙｌａｒ（登録商標））で内張りした箔膜小包（foil pouch）にパッケージングすること、が挙げられる。
【００２６】
ラクトバシラス種の新菌株の、これらの、および他の有益なプロバイオティック特性は、以下の、非限定的な本発明の詳細な説明によりさらに証明される。
発明の詳細な説明
本発明の一実施形態は、１グラム当たり約１０５〜１０１１コロニー形成単位の生存性ラクトバシラスを含む栄養補助食品である。本発明の他の実施形態において、本栄養補助食品は、１グラム当たり約１０５〜１０１１個の不生存性ラクトバシラスを含む。本発明のラクトバシラス種は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−３９４５のラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株である。ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１のコロニー形成単位（ＣＦＵ）は、１個の細菌細胞と同等である。また、コロニー形成単位またはＣＦＵという用語は、一般的に生存性細菌を述べる場合にのみ用いられるが、不生存性ラクトバシラス組成物で構成される本発明の実施形態を述べる場合には、１個の不生存性細菌細胞も定義される。
【００２７】
本発明の一実施形態において、本栄養補助食品は、乾燥ラクトバシラス種組成物で充填したゼラチンカプセルを含む。他の実施形態において、本栄養補助食品は、液体調製物の形態である。本発明のさらに他の実施形態において、本栄養補助食品は、肛門または膣用の坐剤の形態である。坐剤として用いる場合、本栄養補助食品を手ごろな巨丸剤に成形することができ、投与を容易にするための非毒性の潤滑剤、安定剤、ワックス等を含ませることができる。本発明の他の実施形態において、本ラクトバシラス種栄養補助食品は、食物、例えば、これらに限定されないが、乳製品、穀物、パン、肉、果物、野菜、米等と混合することができる。本発明のラクトバシラス種栄養補助食品が想定する形態は、重要ではなく、非限定的である。
【００２８】
本明細書を通して、本発明は、プロバイオティック組成物、ラクトバシラス種含有組成物、栄養補助食品、凍結乾燥粉末、または、ラクトバシラス種組成物と称することができる。これら全ての上述の用語は、形態または他の成分の存在もしくは非存在に関係なく、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９４５の生存性または不生存性ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株、または、本明細書で説明される方法を用いて決定された遺伝的に同等なものを含む組成物を意味する。
【００２９】
本発明の一実施形態において、そのラクトバシラス組成物は、食品科学分野の当業者に
既知の標準的な方法を用いて凍結乾燥される。本発明のラクトバシラス組成物の他の実施形態において、本ラクトバシラス組成物は風乾される。さらに他の実施形態において、そのラクトバシラス組成物はペーストである。さらに他の実施形態において、本発明のラクトバシラス組成物は液体である。
【００３０】
本発明のラクトバシラス組成物は、追加の成分と混合してもよいし、混合しなくてもよい。例えば、本発明の一実施形態において、そのラクトバシラス組成物は、トレハロース、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、および、それらの組み合わせからなる群より選択された炭水化物と混合される。当該炭水化物は、組成物全体の約５０％〜９８％で含まれ得る。他の実施形態において、タンパク質、例えばアルブミンおよび／またはホエーは、本発明のラクトバシラス組成物に添加しても、しなくてもよい。
【００３１】
本発明のラクトバシラス種杆菌組成物を、ゼラチンカプセル、圧縮錠剤、またはジェルカップの形態で、巨丸剤として経口的に摂取することができる。他の実施形態において、本発明のラクトバシラス組成物を、液体飲料の形態で経口的に摂取することができる。液体飲料は、他の成分、例えば、これらに限定されないが、フレーバー増強剤、甘味料、粘度増強剤および他の食品添加剤を含ませることができる。また、本発明を、他の食品と共に、別々に、または、それらと混合して摂取することができる。
【００３２】
本発明の一実施形態において、動物は、プロバイオティック組成物の１回の用量（１グラム当たり約１０５〜１０１１個のラクトバシラスを含む）を与えられる。総摂取量は、動物の個々の必要性、ならびに、動物の体重および大きさに依存する。いずれの所定の用途のための好ましい投与量は、滴定で簡単に決定することができる。滴定は、一連の標準重量用量（それぞれ１グラム当たり約１０５〜１０１１個のラクトバシラスを含む）を調製することによって達成される。一連の用量を投与し、０．５グラムから始めて動物のサイズおよび用量形態により決定された理論的な終了点に達するまで上げ続ける。適切な用量は、所望の結果が得られるラクトバシラス組成物の最小限の量が投与される場合に達成される。また、適切な用量は、本発明のプロバイオティック組成物の「有効量」として当業者に知られている。
【００３３】
例えば、動物における過敏性腸症候群に関する症状を軽減することが望ましい場合、上述の１つの測定用量を、症状が静まるまで用量をそれぞれ連続的に１日０．５グラムずつ増加させて段階的に上げながら毎日投与する。本発明の一実施形態において、好ましい用量は、体重（動物レシピエントの重量）１キログラム当たり、１日当たり、約１０３〜１０８個の生存性ラクトバシラスの範囲である。これは、平均的な健康な成人に関して、１日当たり約１００億個の生存性ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株と同等である。全ての体重の全ての動物に適したおよその用量を外挿法により計算することは、簡単である。これは、上述の滴定方法により、プロバイオティック組成物を処方する当業者により適切に変えることができる非限定的な例である、と認識される。
【００３４】
本発明のプロバイオティック組成物は、それを必要とする全ての動物に投与することができる、当該動物としては、これらに限定されないが、哺乳動物、鳥類、爬虫類、および、魚類が挙げられる。典型的な用途としては、本発明のプロバイオティック組成物を、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、ウズラ、インコ、オウム、ならびに、他の野生動物および家畜動物に投与することが挙げられる。
【００３５】
特に、本発明のプロバイオティック組成物は、本明細書に記載の方法を用いてそれを必要とする動物に投与する場合、腸管病原体関連病を阻害または治療するのに用いることができる。腸管病原体による病気としては、例えば下痢、過敏性腸症候群および腸の出血な
どの病原体により発症する病気が挙げられる。これら病気に関する腸管病原体の例としては、これらに限定されないが、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、サルモネラ−エンテリティディス、エルシナ−シュードツベルクローシス、および、リステリア−モノサイトゲネスが挙げられる。競合的な結合プロセスを介して腸管病原体による病気の阻害および治療が本発明のプロバイオティック組成物により達成されることが、本発明者により理論化されるが、限定として提供されることではない。すなわち、本発明のプロバイオティック性ラクトバシラスは、腸の粘膜上の結合部位で腸管病原体と競合する。本発明のプロバイオティック性ラクトバシラスがこれら結合部位に対して腸管病原体よりも高い親和性および結合活性を有するために、本発明のプロバイオティック性ラクトバシラスは、正常な代謝プロセスにより無害に腸から流出して、腸内環境に腸管病原体を置換する。腸管病原体による病気の阻害および治療におけるこの上述の競合的な結合およびその効能のインビボでの例は、下記の詳細な実施例および添付の図面で提供される。
【００３６】
以下の技術的な考察は、詳細な技術を提供する。セクションＩにおいて、当業者は、プロバイオティック性ラクトバシラス、特に、本発明のプロバイオティック性ラクトバシラス種、ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株をどのように単離し同定するかを学ぶ。セクションIIにおいて、本発明のプロバイオティック組成物をどのように調製するか、および、本発明のプロバイオティック組成物により示されるプロバイオティックの特色を科学的に確認するために行われた試験を教示する特定の実施例が提供される。これら詳細な実施例は限定を意図しないと理解される。
【００３７】
Ｉ．ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株の単離および特徴付け
Ａ．候補のプロバイオティック細菌の単離
伝統的な発酵ヨーグルト様のアジアの乳製品から本発明のプロバイオティック生物を単離した。スクリーニング方法は，安全なヒトの消費の少なくとも１０年の歴史を有する伝統的な発酵ヨーグルト様のアジアの乳製品に限定された。プロバイオティック細菌の単離は、３種の選択的な微生物用培地を用いて、微生物学の当業者既知の方法を用いて行われた。ラクトバシラス選択的培地としては０．０５％システインを添加したＳＬ培地が挙げられ、ビフィドバクテリウム属は抗生物質を含むトリプチケースフィトンイーストエクストラクト培地を用いて選択され、ストレプトコッカス属に関してはトリプチケースイーストエクストラクトシステイン培地を用いて単離された。
【００３８】
候補のプロバイオティックラクトバシラス種杆菌は、カタラーゼ陰性の、グルコースホモ発酵型の、グラム陽性の非胞子形成杆菌であり、これは、低いｐＨ、胃酸および胆汁耐性を示した。ラクトバシラス単離物が酢酸塩含有培地で成長する能力に加えて、ラクトバシラス単離物がｐＨ９．０で成長できないことは、それらをＣａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種から区別するのに役立った。トータルで８１個の単離物が、これらの基準に基づき候補のプロバイオティック性ラクトバシラスとして分類され、さらに以下の基準、すなわち：ｉ）低い膵液への耐性；ii）上皮下部のマトリックス、例えばバイオコート（登録商標）マトリゲル（Becton Dickinson, Bedford, MA）への付着能力、および、培養した腸上
皮細胞（Ｃａｃｏ−２細胞系）への付着能力；iii）コラーゲンマトリックスに付着する
腸管出血性大腸菌血清型Ｏ１５７：Ｈ７を競合的に排除するそれらの能力；および、iv）アンモニアおよび硫化物含有化合物を減少させるそれらの能力に関して特徴付けられた。
【００３９】
全ての８１個の候補のプロバイオティック性ラクトバシラスを分析した後、全ての上述した特徴を有する２つの株を同定した。これらの株は、ＫＥ９７株およびＫＥ９９株（再指定されたＫＥ０１）と指定された。最後に、成長増殖速度（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ（登録商標）バクトメーターシステムを用いたインピーダンス検出によって決定された世代時間）、連続培養における株の安定性、凍結乾燥および再生の特徴、および芳香／フレーバ
ー特性を各株で確認した。
【００４０】
本発明のプロバイオティック組成物の調製に用いるための実質的に純粋な培養物中で、単離されたラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株生物を維持する。本明細書で用いられるように、「実質的に純粋な培養物」とは、固体または半固体の微生物用培地上で培養された場合、識別可能な一つの生物のみが生じる細菌学上の培養物を意味する。他の細菌種の細胞が極めて低い量で存在してもよいが、しかしながら、これらの細胞は、生存不可能、培養不可能であるか、または、典型的なゲノムに基づかない微生物学的技術を用いた検出の限界値より低いか、のいずれかである、ということが理解される。「ゲノムに基づかない」という用語は、微生物のＤＮＡまたはＲＮＡを検出するのに用いられるＰＣＲ検出または類似方法のような方法が排除されていることを意図する。
【００４１】
その上、ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株（または、単にＫＥ０１とも称される）の粉末、ペースト、ゲル、巨丸剤、または、他のプロバイオティック組成物のいずれも本発明の教示に従って製造されることが本明細書で説明されており、そのラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株は実質的に純粋な培養物から得られたものと理解される。
【００４２】
Ｂ．ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析によるＤＮＡフィンガープリンティング
ＲＡＰＤプロトコールにおいて、細菌の同定のための独特なフィンガープリントを作製するためにＰＣＲが用いられる。ＰＣＲによる分析は、迅速かつ信頼できる方法で行うことができる。従って、ＲＡＰＤ分析が、ＫＥ０１株の分子同定およびフィンガープリンティングに用いられた。ＡＴＣＣコレクションからの全ての１２種のラクトバシラス種タイプの株をフィンガープリンティングし、ＫＥ０１と比較した。ＤＮＡフィンガープリンティングのために、全てのラクトバシラス種株をＭＲＳブロス（Difco）で一晩培養した。
ＤＮＡフィンガープリントに関して分析されたラクトバシラス種株を表１に列挙する。
【００４３】
【表１】
ＤＮＡ抽出方法
ＷｉｚａｒｄゲノムＤＮＡ精製キット（Promega, WI, USA）を用いてラクトバシラスからＤＮＡを抽出した。簡単に言えば、１ｍＬの２４時間成長させたＭＲＳブロスの各ラクトバシラス種の培養物を遠心分離により回収し、細胞を５０ｍＭのＥＤＴＡ中で再懸濁し、１０ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Sigma, MO, USA）で３７℃で６０分間処理した。ラクトバ
シラス種杆菌細胞を遠心分離でペレット化し、上清を除去した。細菌のペレットを核溶解溶液中で再懸濁し、８０℃で５分間インキュベートした。細胞懸濁液を室温に冷却し、ＲＮアーゼをその溶液に混合した。その懸濁液を３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、タンパク質沈殿溶液をその混合物に加えた。溶液をボルテックスで混合し、氷上で５分間インキュベートした。その混合物を３分間１５Ｋ×ｇで遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、ＤＮＡをイソプロピルアルコールで沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離し、イソプロピルアルコールを吸引した。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、遠心分離で回収した。エタノールを除去し、ペレットを乾燥させた。ＤＮＡをトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中で再懸濁した。
【００４４】
抽出されたＤＮＡのＰＣＲ増幅
Cocconcelli等（１９９５）に従い、１マイクロリッターの抽出されたＤＮＡを用いて
、単一の任意のヌクレオチド配列を用いてｉＣｙｃｌｅｒ（Bio-Rad, CA, USA）でＰＣＲ反応を行った。２×ＰＣＲ溶液−Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ（Takara, Shiga, Japan）を各反応に用いた。各反応は、総量５０μＬ、１．２５ユニットのＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ、１×緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭ）を含んでいた。プライマーの最終濃度を４μＭとし、増幅に用いられたプライマーは、５’−ＡｇＣＡｇＣｇＴｇｇ−３’であり(Operon Technologies. Inc., CA, USA)、テンプレートＤＮＡを含む反応混合物を、以下の温度プロフィールでサイクル反応させた：９４℃で５分間を１サイクル；９４℃で１分間、２９℃で１分間、１．５分間で７２℃まで上昇させ、７２℃で１．５分間維持を４０サイクル；７２℃で２分間を１サイクル；および、４℃で維持。[Cocconcelli, PS et al., Development of RAPD protocol for typing of strains of lactic acid bacteria and entercocci. Lett. Appl. Microbiol. 21:376-379 (1995)]。
【００４５】
ゲル電気泳動
各ＲＡＰＤで増幅された反応物のアリコート（１０μＬ）を、Sambrook等（１９８９）に従って、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中の１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のアガロースゲル電気泳動により分析した。ゲルを冷却しないで１２０Ｖで２時間泳動させた。標準としてＤＮＡ分子量マーカーのＨｙｐｅｒｌａｄｄｅｒ Ｉ（Bioline, Randolph, MA, USA）を用いた。電気泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイド（５μｇ／ｍＬ）で１０分間染色し、５分間洗浄し、可視化し、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ（BioRad, CA, USA）で分析した。[Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)]。
【００４６】
単一の１０−ｍｅｒプライマーを用いたＲＡＰＤ分析により、様々なラクトバシラス種参照株およびＫＥ０１株のＤＮＡサンプルを含む１％アガロースゲル上で、変化する強度の、多数の増幅産物のはっきりとした固定パターンが得られた。ゲル上での、異なる種の断片と参照ラクトバシラス種との比較を示した。図１および表２で示された説明文付きの固定パターンは、ＫＥ０１株を一意的に同定し、ゲノムフィンガープリンティングライブラリーを提供するのに役立つ。ゲノムフィンガープリンティングに基づいて、図２で示されたようにデンドグラム（dendogram）を推測した。系統発生分析のワードのクラスター
方法を適用した。この方法は、各工程で形成され得る２種のクラスターのいずれかの平方和を最小化し、小さいサイズのダスター（duster）を作製した。系統発生分析に基づき、ＫＥ０１株は、ラクトバチルス−ヘルヴェティクスＡＴＣＣ１５００９と１３％相同性を示し、ラクトバシラス−カゼイ属の亜種ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９と５５％相同性を示した。
【００４７】
ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株の純粋な培養物をアメリカンタイプカルチャーコレ
クション（Bethesda, MD）に寄託し、ＡＴＣＣ番号が付与された。
【００４８】
【表２】
II．本発明の実施例
以下の実施例で用いられたバルク状ラクトバシラスＫＥ０１株を、発酵微生物学の当業者に既知の標準的な発酵方法を用いて大量生産した。次に、精製したラクトバシラス種Ｋ
Ｅ０１株を、様々な送達システム、例えば、以下に示すような、微粉末、巨丸剤カプセル、ゲル、および乾燥動物飼料混合物の調製物に用いた。
【００４９】
実施例１
本発明のラクトバシラスＫＥ０１株組成物の調製
凍結乾燥ＫＥ０１の微粉末形態への調製
−２２℃で凍結保存されたラクトバシラス種ＫＥ０１の純粋な培養物（開始物）を、タンパク質、ビタミン、ミネラルおよび炭水化物源を含む発酵ブロス培地中で再生させた。ＮＢＳ１５００Ｌ発酵器に取り付けられた発酵槽で種培養を調製した。発酵プロセス中、微生物の純度を、所定の時間ポイントで（対数期と最終サイクルとを通して）モニターした。微生物の集団を殺菌した分離器で回収し、無水デキストロースおよびトレハロースの混合物を含む担体と混合した後、細胞濃縮物のスラリーを凍結乾燥した。凍結保護物質として、噴霧乾燥したグレードＡの低温加熱した無脂肪低温殺菌乳を用いた。凍結乾燥したＫＥ０１濃縮物を、殺菌した製粉器具を用いて微粉末に粉砕した。使用前に、ＫＥ０１粉末の品質の純度および生存率を確かめた。
【００５０】
ＫＥ０１粉末の混合物への混合：
全ての操作を、温度（７４〜７６°Ｆ）および湿度（３０〜４０％）に制御した環境で行った。ＫＥ０１粉末（約１０１１ＣＦＵ／ｇのラクトバシラス）、および、下記の組成に列挙された他の成分を、混合するために閉鎖系に導入した。一連のジオメトリック希釈を行い、全ての成分が均質に分配されているかを確認した。水底の分流とクロスフローとを確実にするために、カスタマイズされたジオメトリーでマスフロー容器回転システム（mass flow bin tumbling system）内で混合した。混合したら、５ｌｂの円筒型容器にパ
ッケージングするまでその粉末を閉鎖系で維持した。混合した粉末を、吸湿パックまたは内在の防湿特性を有し、気密蓋で密閉された適切な容器（円筒形容器、単位用量パックなど）に充填する。
【００５１】
「約」という用語は、バルク材料を計量したり製造したりする際に固有のエラーの妥当な要素を与えるのに用いられることは、当業者に明白である。本明細書で用いられるように「約」とは、０．１〜０．５％の誤り要因を含み、さらに、最終組成物を配合するのに用いられた材料の量は、トータルで１００％でなければならず、１００％を超えることはできない、ということは当業者に明白である。全てのパーセントは、重量パーセントを基礎とする。例えば、限定を意図しないが、本発明の一実施形態において、本発明の教示に従って製造されたプロバイオティック組成物は、１グラム当たり約１０５〜１０１１ＣＦＵのＫＥ０１を含む約１〜５％のＫＥ０１粉末、および、９５〜９９％の不活性成分または活性成分を含み、当該不活性成分または活性成分は、これらに限定されないが、炭水化物、脂質、ポリペプチド、脂肪酸、植物性化学物質（phytochemical）、および、それら
の組み合わせからなる群より選択される。
【００５２】
本発明の教示に従って用いることができる炭水化物としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および、多糖類、例えば、これらに限定されないが、トレハロース、マルトース、スクロース、デキストロース、ラクトース、イヌリン、リボース、麦芽デキストリン等が挙げられる。本発明の一実施形態において、二糖類は、トレハロース二水和物であり、オリゴ糖はフルクトオリゴ糖であり、多糖類は麦芽デキストリンである。
【００５３】
適切な脂質としては、これらに限定されないが、大豆油、オリーブ油、パーム核油、落花生油、クルミ油、キャノーラ油（cannola oil；菜種油）等が挙げられる。適切なポリ
ペプチドとしては、ホエータンパク質、卵アルブミン、ゼラチン、乳タンパク質、ならびに、他の動物タンパク質および植物タンパク質が挙げられる。最後に、本明細書で用いられる植物性化学物質としては、ポリフェノール類、サポニン類、フラボノイド類、モノテ
ルペン類、硫化アリル類、リコピン類、カロチノイド類、ポリアセチレン（polyactetylenes）、シリマリン、グリシルリジンカテキン類などのような化合物が挙げられる。
【００５４】
本発明の一実施形態において、ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株プロバイオティックは、以下の重量パーセントの成分を含む。
【００５５】
【表３】
ＫＥ０１の巨丸剤カプセルへの調製
凍結乾燥ＫＥ０１微粉末（約１０５〜１０１１ＣＦＵ／ｇのラクトバシラス）、トレハロース二水和物（食品グレード）、および、デキストロース（食品グレード）または麦芽デキストリン（Grain Processing Corp., Muscatine, IA）を、それぞれ３％：６７％：
３０％で、徹底的に混合した。混合した混合物をゼラチンカプセルに充填した。使用前に、ＫＥ０１巨丸剤カプセルの品質を純度および生存率に関して試験した。
【００５６】
【表４】
ゲル形態のＫＥ０１の調製
凍結乾燥ＫＥ０１微粉末（約１０５〜１０１１ＣＦＵ／ｇのラクトバシラス）を、２．５％濃度でフルクトオリゴ糖（医薬品グレード）と徹底的に混合した。非ＧＭＯ（遺伝子組換え生物）を押出／排除した大豆油を第一の担体としてを用いた。ゲルを徹底的に混合し、滅菌したへらを用いてバッチの上部、中心部および下部からサンプルを回収し、ＫＥ０１の純度および生存率に関して分析した。ＫＥ０１ゲルを、使用するための５０／ｃｃのチューブに充填した。
【００５７】
【表５】
実施例２
細胞付着研究
インビトロでの放射付着分析（ＲＡＡ）を行い、Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ（登録商標）（Becton Dickinson, Bedford, Mass.）の、I型コラーゲン(Cn)、IV型Cn、
ラミニン、またはフィブロネクチンを含む２４−ウェルプレート、および、Ｃａｃｏ−２細胞単層を用いて、ラクトバシラス種ＫＥ０１株の付着を測定した。
【００５８】
ラクトバシラスＫＥ０１細胞の調製
Ｂａｃｔｏ（登録商標）ラクトバシラスＭＲＳブロス（Difco）中で嫌気性条件下で一
晩培養したＫＥ０１の培養物の、５０μｌの接種材料を、１０ｍｌのＭＲＳブロス（３Ｈ
−チミジン（２０μｃｉ）を含む）中に再接種した。ＫＥ０１細胞を、嫌気性条件下で、３７℃で、対数期（約７時間）まで培養し、３Ｈ−チミジンを細菌ＤＮＡへ最適に摂取させ、取り込まさせた。３Ｈ−チミジンで標識したＫＥ０１を７，５００×ｇでの遠心分離により回収し、洗浄し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中に再懸濁した。細菌細胞密度を、６００ｎｍで光学的に１０７個のラクトバシラス／ｍｌになるように調節した。
【００５９】
放射付着分析（ＲＡＡ）
上皮下部のマトリックスの相互作用分析のために、Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ（登録商標）の、Ｉ型コラーゲン（Ｃｎ）、IV型Ｃｎ、ラミニン、またはフィブロネクチンを含む２４−ウェルプレートを用いて、ＫＥ０１の付着を試験した。マトリックス成分を、平らで光学的に透明なコーティングとして塗布し、このコーティングは総表面積の１．７５ｃｍ２をカバーした。バイオコート（登録商標）マトリゲルマトリックス、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウスの腫瘍から抽出した可溶性基底膜（室温で再生すると、ゲルを形成する）も、相互作用の研究に用いられた。２ミリリットルのＫＥ０１懸濁液（２×１０７個のラクトバシラス）を、マトリックス層を含む各ウェルに加え、室温でインキュベートした。１時間後、ＫＥ０１懸濁液をウェルから吸引し、廃棄した。１ミリリットルのトリプシン１型（１１０酵素ユニット；Sigma Chemicals, St. Louis, MO.）を、各ウェルに加え、室温で３０分間加水分解させ、マトリックスタンパク質
層を解離させた。トリプシン加水分解産物をシンチレーションバイアルに吸引し、各ウェルからの追加の１ｍｌを１０分間室温でホモジナイズした（Ｓｃｉｎｔｉｇｅｓｔ（登録商標）；Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ）。ホモジネートを対応するシンチレーションバイアルに吸引した。１０ｍｌの量のシンチレーションカクテル（Ｓｃｉｎｔｉｓａｆｅ（登録商標）Ｇｅｔ、Fisher Scientific）をバイアルに分注し、徹底的に混合した。
混合物を沈殿させ、清澄化した後、液体シンチレーション分析器（Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ２１００ＴＲ（登録商標）、Packard Inc.）を用いて放射能を測定した。
【００６０】
真核細胞の相互作用分析に関して、Ｃａｃｏ−２、結腸癌腫細胞系を、２４−ウェルの組織培養プレートで、７２時間、ＣＯ２インキュベーターで、イーグル最小必須培地（１％非必須アミノ酸および１０％ウシ胎仔血清が添加された）を用いて単層の集合になるまで培養した。完全な単層が得られた後、各プレートをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で２回洗浄した。２ｍｌ量（約２×１０７個の細菌）の３Ｈ−チミジンで標識したラクトバシラス懸濁液を、約１０５個のＣａｃｏ−２細胞を含む各ウェルに加えた。Ｃａｃｏ−２細胞とラクトバシラスとの比率を１：２００に維持した。３７℃で１時間インキュベートした後、細菌ｌ懸濁液を吸引し、ウェルをＰＢＳで洗浄した。各ウェルを１型トリプシン、組織ホモジナイザーで処理し、上述したように放射能を測定した。結合をラクトバシラスの結合として示した、生物学的表面の面積１ｃｍ２あたり（上皮下部のマトリックスタンパク質の相互作用のため）、または、細胞１個あたり（Ｃａｃｏ−２細胞の相互作用のため）。
【００６１】
また、ＫＥ０１と異なるバイオマトリックス層との相互作用を、表６に記載の３つのＡＴＣＣ参照株、ラクトバシラス−カゼイＡＴＣＣ３９３、ラクトバシラス−ロイテリＡＴＣＣ２３２７２、および、ラクトバシラス−ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９の相互作用と比較した。有意性を決定するため、分散（variance）の４×６階乗（factorial）分析を
用いて結合データを分析した（SAS Inc., Raleigh, NC）。
【００６２】
【表６】
ＫＥ０１は、インビトロで、Ｉ型コラーゲン、IV型コラーゲン、ラミニン、および、フィブロネクチン、および、マトリゲル（登録商標）層に強い結合を示した。Ｃａｃｏ−２細胞単層に結合したＫＥ０１は、約５４％（１０８個のラクトバシラス／細胞）であった。ＫＥ０１と、上皮下部のマトリックス層およびＣａｃｏ−２細胞単層とのインビトロでの相互作用の全ては、ＡＴＣＣ参照株、ラクトバシラス−カゼイＡＴＣＣ３９３（ｐ＜０．０００１）、ラクトバシラス−ロイテリＡＴＣＣ２３２７２（ｐ＜０．０００１）、およびラクトバシラス−ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９（ｐ＜０．０００１）より顕著に高かった。
【００６３】
実施例３
腸管病原体の細胞付着の妨害の研究
ＫＥ０１の効能は、腸管病原体（表７に列挙）のバイオマトリックスへの付着を阻害し、病原体−バイオマトリックスの複合体を解離することである。
【００６４】
【表７】
付着−解離の分析
ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）中で一晩培養した大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の培養物、または、適切な培地培養液中で培養された他の列挙された病原体の、１０μｌの接種材料を、３ｍｌのＴＳＢまたは対応する適切な培地（３Ｈ−チミジン（２０μｃｉ）を含む）中に再接種した。Ｉ型コラーゲン（Ｃｎ）、IV型Ｃｎ、ラミニン、フィブロ
ネクチンおよびマトリゲル表面を含むバイオコート（登録商標）プレートへの細菌性病原体の結合を、実施例１で説明されたように行った。これらのバイオコート（登録商標）−細菌病原体複合体に、２ｍｌ量の標識されていないＫＥ０１懸濁液（２．０×１０７個のラクトバシラス／ｍｌ）を各ウェルに対して加え、１時間室温でインキュベートした。ラクトバシラスＫＥ０１懸濁液をウェルから吸引した。以下の工程、すなわちウェル中の内容物の放出の工程、および、放射能測定の工程は、実施例２で説明されたプロトコールに従ってなされた。ウェル中の付着した病原体の細菌細胞数の差（ＫＥ０１処理有り、および、無し）を、「Ｌｏｇ１０解離」値として示した。
【００６５】
付着−阻害の分析
標識されていないＫＥ０１のバイオコート（登録商標）プレート（Ｉ型コラーゲン（Ｃｎ）、IV型Ｃｎ、ラミニン、フィブロネクチンおよびマトリゲル表面を含む）への結合を実施例２で説明されたように行った。これらのバイオコート（登録商標）−ＫＥ０１複合体に、２ｍｌ量の３Ｈ−チミジンで標識した大腸菌または他の細菌病原体の懸濁液（２．０×１０７個の細菌／ｍｌ）を各ウェルに対して加え、１時間室温でインキュベートし、懸濁液を吸引した。以下の工程、すなわちウェル中の内容物の放出の工程、および、放射能測定の工程は、実施例２で説明されたプロトコールに従ってなされた。ＫＥ０１で処理されていないバイオコート（登録商標）ウェルは、大腸菌または他の病原体における付着のコントロールとして提供された。ＫＥ０１で前処理された細菌性病原体のバイオマトリックスへの付着の減少を、「Ｌｏｇ１０阻害」値として示した。
【００６６】
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ４３８９５株）とバイオマトリックスおよびマトリゲル（登録商標）バイオコート表面との相互作用における、ＫＥ０１の阻害および解離効果の結果を表８に示す。
【００６７】
【表８】
ＫＥ０１は、試験された全てのバイオ表面への強い結合を示したが、Ｉ型コラーゲンおよびマトリゲル（登録商標）との相互作用は顕著に高かった。ＫＥ０１は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＩ型コラーゲンおよびマトリゲル（登録商標）へ付着の、＞３−ｌｏｇ阻害を引き起こした；その一方で、IV型コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニン相互作用については＞２−ｌｏｇ阻害を引き起こした。付着した大腸菌のＫＥ０１による解離の効能は、阻害値と同様のＬｏｇ値であった。
【００６８】
結合を阻害し付着した細菌を解離するＫＥ０１の効能の範囲を、表９で列挙された数種の腸管病原体を用いて試験した。
【００６９】
【表９】
ＫＥ０１は、２．８−ｌｏｇ（エンテロコッカス-フェカーリスについて）〜４．２−
ｌｏｇ（サルモネラ−エンテリティディスについて）の範囲で、腸管病原体の相互作用を効果的に阻害した。比較してみると、腸管病原体を解離するＫＥ０１の効能は、３．１−ｌｏｇ（腸管出血性大腸菌ＡＴＣＣ４３８８９について）〜４．４−ｌｏｇ（腸管出血性大腸菌ＡＴＣＣ４３８９０について）の範囲で、より高かった。
【００７０】
実施例４
付着した腸管病原体を解離するＫＥ０１微粉末の効能
付着した腸管病原体を解離するＫＥ０１微粉末の効能を、Ｃａｃｏ−２単層を用いた細胞系で試験した。腸管病原体に関するＣａｃｏ−２細胞の付着分析を、実施例２でＫＥ０１について説明したように行った。付着−解離分析を、実施例３でバイオマトリックス層について説明したように行った。しかしながら、上記の２つのプロトコールにおいて、ＫＥ０１粉末を、１％溶液（１００ｍｌの生理的食塩水、ｐＨ７．２中に再懸濁され、徹底的にボルテックスされた１ｇの微粉末）として用いた。生理食塩水での処理をコントロールとして用い、その値を結果を解釈する際にバックグラウンドとして差し引いた。データを表１０に示す。
【００７１】
【表１０】
Ｃａｃｏ−２細胞の腸管病原体の付着プロファイルは、１．１×１０６（腸管出血性大腸菌ＡＴＣＣ４３８８８を有するＣａｃｏ−２細胞１個あたり、１５個の細菌）〜６．７×１０６（サルモネラ−プローラムＡＴＣＣ１３０３６を有するＣａｃｏ−２細胞１個あたり、８９個の細菌）の範囲であった。ＫＥ０１は、Ｃａｃｏ−２細胞に付着した腸管病原体複合体を有効に解離し、その解離効能は、１．３−ｌｏｇ（９３．５％）〜３．１−
ｌｏｇ（９９．９％）（それぞれ大腸菌ＡＴＣＣ４３８８８およびサルモネラ-プローラ
ムについて）の範囲であった。
【００７２】
実施例５
新鮮なＫＥ０１および凍結乾燥ＫＥ０１調製物がウシの腸管の上皮粘膜に付着および定着する能力の証明
ウシの腸の付着分析：
新しく屠殺した動物から腸サンプルを得て、冷蔵状態で研究所へ移送した。腸を切り開き、内腔の上皮粘膜を穏やかに洗浄し、糞の屑を除去した。以下の２種の異なるＫＥ０１調製物、すなわちＡ）実施例２で説明された３Ｈ−チミジンで標識したＫＥ０１（約１０７個のラクトバシラスを含む接種材料の０．１ｍｌ）；および、Ｂ）実施例１で説明されたＫＥ０１粉末ブレンド混合物（生理食塩水で均一に懸濁され、懸濁された、約１０７個のラクトバシラスを含む接種材料の０．１ｍｌ）を、１インチ２の粘膜表面に接種した。２時間インキュベートした後、接種した領域を穏やかに生理食塩水で３回洗浄した。
【００７３】
サンプル調製物−ＡをＫＥ０１付着に関して試験した。接種領域を切り出し、組織ホモジナイザーで消化（digested）し、液体シンチレーションフルイドを用いて増幅し、実施例２で説明された放射付着分析に従って放射能を測定した。ＫＥ０１は、ウシの腸上皮粘膜への強い結合、すなわち、約２．５×１０６個のラクトバシラス／インチ２を示した。
【００７４】
サンプル調製物−ＢのＫＥ０１定着を、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により評価した。試験片を２％ＯｓＯ４で３０〜６０分間処理し、水でリンスした。試験片を５０％、７０％および９５％エタノールで各５分間で処理し、続いて２×１０分間１００％エタノールでリンスした。液体二酸化炭素で臨界点乾燥した後、試験片をマウントして、金、パラジウムでスパッタコーティングした。生検試験片をＪＥＯＬ６３００走査型電子顕微鏡を用いて試験した。顕微鏡観察を図３および４に示す。
【００７５】
実施例６
子豚に投与されたＫＥ０１含有動物飼料−サプリメントのインビボでのプロバイオティック効果。ＫＥ０１の腸の定着および糞放出の証明：ブタの糞臭（糞の硫化物およびアンモニア含量の減少）を減少させるＫＥ０１の能力：および、動物の体重増加へのＫＥ０１寄与率
飼料−サプリメント投与量
飼料−サプリメント投与用量を、実施例１で説明したようにゲル形態で調製した。簡単に言えば、凍結乾燥ＫＥ０１微粉末（約１０５〜１０１１ＣＦＵ／ｇのラクトバシラス）を、２．５％濃度のフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）と共に徹底的に混合した。非ＧＭＯ（遺伝子組換え生物）を押出／排除した大豆油を第一の担体としてを用いた。ゲルを徹底的に混合し、滅菌したへらを用いてバッチの上部、中心部および下部からサンプルを回収し、ＫＥ０１の純度および生存率に関して分析した。ＫＥ０１ゲルを、使用するための５０／ｃｃのチューブに充填した。また、担体のみ、ＫＥ０１細胞を混合した担体、および、ＫＥ０１細胞とＦＯＳとを混合した担体を含むコントロール飼料投与量を調製した。
【００７６】
動物飼料−サプリメント試験
研究には、４０〜６０ｌｂの範囲の重量のトータルで２０匹のブタ（６〜８週齢）を用いた。これら動物を４つのグループ（それぞれ５匹の動物を含む）に分配し、以下のように分類された。
【００７７】
グループ１（コントロール）：第一の担体のみを含むゲル１０ｃｃを与えた動物。
グループ２：第一の担体と混合した２．５％ＦＯＳのみを含むゲル１０ｃｃを毎日与えた動物。
【００７８】
グループ３：第一の担体と混合した約１０１０ｃｆｕ／ｃｃのＫＥ０１株細胞のみを含むゲル１０ｃｃを毎日与えた動物。
グループ４：第一の担体と混合した、１０１０ｃｆｕ／ｃｃのＫＥ０１株細胞と、２．５％ＦＯＳとの組み合わせを含むゲル１０ｃｃを毎日与えた動物。
【００７９】
動物をグループで分け、隔離されたおりに収容し、規則正しく高タンパク質のブタの食餌を与えた。４つの動物グループに、それらそれぞれの分類の飼料−サプリメント投与量（１０ｃｃ）を毎日を与えた。実験を６週間行った。飼料−サプリメント試験中、糞分析および体重測定を毎週規則正しく行った。
【００８０】
糞の回収
糞サンプル（動物当たり約２０ｇ）を滅菌５０ｃｃポリスチレンチューブに回収した。サンプルを正常生理的食塩水で１：１（ｗ／ｖ）の比率で希釈し、徹底的にボルテックスブレンダーでホモジナイズし、２Ｋ×ｇで５分間遠心分離した。上清を慎重にデカントし、微生物学的および化学的分析にかけた。
【００８１】
ベースラインの微生物学的計数（大腸菌型の糞およびラクトバシラス型の糞）および糞中アンモニア含量および糞中硫化物含量のベースラインのレベルを得る実際の飼料−サプリメント試験の１日前に、糞サンプルを回収した。
【００８２】
糞の微生物学的分析
糞溶液（１：１（ｗ／ｖ）のデカントされた上清）を、正常生理的食塩水で１０倍まで連続的に希釈した。Ａｕｔｏｐｌａｔｅ（登録商標）４０００装置（Spiral Biotech, Norwood, MA）を用いて、ＭＲＳ寒天（Difco）上に（全てのラクトバシラス計数のため）、および、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天（Difco）上に（全ての大腸菌型計数のため）、選択さ
れた希釈物を二連でプレーティングした。Spiral社のオートプレーターを用いて指数対数希釈設定（exponential log dilution setting）でプレーティングを行った。寒天プレートを、それぞれ３７℃（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天）および３２℃（ＭＲＳ寒天）で２４〜４８時間インキュベートした。自動化赤外線Ｑ−計数装置（Spiral Biotech, Norwood, MA）を用いて総コロニー計数を概算した。データを糞１グラム当たりの細菌として示し、
結果を、ラクトバシラス計数については図５に、大腸菌型の糞の計数については図６に示した。
【００８３】
ＫＥ０１を含む飼料−サプリメント、および、ＫＥ０１とＦＯＳとの組み合わせを含む飼料−サプリメントを投与された動物は、図５で示すように、コントロールグループに比べて、ラクトバシラス種杆菌の糞放出において約２．５−ｌｏｇの増加を示し、ブタ消化管においてＫＥ０１株の増殖および定着を示した。その一方で、大腸菌型の糞の計数は、図６で示すように、コントロール動物と比べて、ＫＥ０１を与えられた動物、および、ＫＥ０１＋ＦＯＳを与えられた動物において、約２．５−ｌｏｇの減少を示し、ブタ腸において、ＫＥ０１株による有効な競合的な排除を示した。
【００８４】
糞の硫化物およびアンモニア分析
糞における硫化物およびアンモニア量を、ＭＰ２３０ ｐＨ／イオンメーターを用いたイオン選択的電極で測定した（Mettler Toledo, Columbus, Ohio）。
【００８５】
硫化物イオン選択的電極の標準化のために、７５ｍｌの希釈硫化物標準（１０ｐｐｍ）溶液を、２５ｍｌの硫化物抗酸化剤緩衝液に穏やかに撹拌しながら加えた。ＤＸ２００参照電極と組み合わせたＤＸ２３２銀選択的電極を用いて、溶液の電極電位（Ｅ１）を測定した。７５ｍｌの硫化物（１００ｐｐｍ）溶液、および、２５ｍｌの硫化物抗酸化剤緩衝
液を別々に用いて、Ｅ２を測定した。Ｅ１とＥ２との差により、硫化物電極のスロープが構成された。サンプル測定のために、１００ｍｌの標準（１００ｐｐｍ）銀溶液と、２ｍｌの臭化物ＩＳＡ（イオン強度調節）緩衝液と混合し、Ｅ１値を測定した。１０ｍｌの糞溶液と上記溶液とを混合することによって、Ｅ２値を測定した。Ｅ１とＥ２との差をΔＥとみなした。濃度比率（Ｑ）チャートに従い、方程式：Ｃ＝Ｃｓ×Ｑ（Ｃ＝糞中の硫化物濃度；Ｃｓ＝既知の硫化物濃度、すなわち１００ｐｐｍ標準；および、Ｑ＝濃度比率）を用いて、標準スロープとΔＥとに基づき糞中の硫化物濃度を推定した。
【００８６】
アンモニアイオン選択的電極の標準化のために、１ｍｌのアンモニア標準（１０００ｐｐｍ）溶液を、２ｍｌのアンモニアｐＨ／ＩＳＡ（イオン強度調節）緩衝液を予め混合した１００ｍｌの蒸留水に穏やかに撹拌しながら加えた。アンモニアＤＸ２１７電極を用いて、溶液の電極電位（Ｅ１）を測定した。続いて、その溶液に１０ｍｌのアンモニア（１０００ｐｐｍ）標準を加え、電極電位（Ｅ２）の変化を測定した。Ｅ１とＥ２との差により、アンモニア電極のスロープが構成された。サンプル測定のために、１０ｍｌの糞溶液を、２ｍｌのアンモニアｐＨ／ＩＳＡ緩衝液を予め混合した９０ｍｌの蒸留水に、穏やかに撹拌しながら加え、Ｅ１を測定した。糞溶液にアンモニア標準を加え、Ｅ２を測定した。糞中のアンモニア濃度を上述の方程式を用いて推定した。
【００８７】
ＫＥ０１を含む飼料−サプリメント、および、ＫＥ０１とＦＯＳとを含む飼料−サプリメントを投与された動物は、図７および８に示すように、コントロールグループ動物に比べて、顕著な、約３５ｐｐｍ／ｇｍのアンモニア減少、および、約３７５ｐｐｍ／ｇｍの硫化物減少を示した。また、ＫＥ０１を与えられた動物、および、ＫＥ０１とＦＯＳとを与えられた動物からの糞は、増殖したプロバイオティック性ラクトバシラスＫＥ０１による乳酸生成のために、酸臭（rancid）がする。
【００８８】
動物体重増加測定
体重増加に関するベースライン測定を得るために実際に飼料−サプリメント試験を行う１日前に、動物の体重を測定した。全ての４つのグループからの動物の体重を、６週間の飼料試験を通して毎週１回測定した。実験の結果、図９で示したように、動物のコントロールグループに比べて、ＫＥ０１を与えられた動物は約２８ｌｂの体重増加を示し、ＫＥ０１とＦＯＳとを与えられた動物グループは２０ｌｂの体重増加を示した。
【００８９】
III．結果
最後に、本明細書で開示された本発明の実施形態は本発明の原理を説明していることが理解される。用いられ得る他の改変は、本発明の範囲に含まれる。従って、一例として、これらに限定されないが、本発明の教示に従って、本発明のその他の形状を用いてもよい。従って、本発明は、厳密に示されたもの、説明されたものに限定されない。
【００９０】
本発明を説明する文章中（特に以下の請求項の文章中）で用いられた用語「a」および
「an」および「the（該）」ならびに類似の指示語は、明細書中に特に他の規定がない限
り、または、文章により明確に否定されない限り、単数および複数の両方を含むと解釈される。本明細書における値の範囲の記述は、その範囲内に含まれるそれぞれ別々の値を個別に意味する簡略的な方法として提供されることを単に意図する。明細書中に特に他の規定がない限り、それぞれの個々の値は、本明細書で個々に列挙されたかのように、本明細書に含まれる。本明細書に記載の全ての方法は、明細書中に特に他の規定がない限り、あるいは、文章により明確に否定されない限り、適切な順番のいずれかで行うことができる。本明細書で示されるありとあらゆる実施例または典型的な言葉（例えば「such as」）
の使用は、単に、本発明をより良く説明することを意図しており、本発明の範囲あるいは特許請求された範囲に限定を与えない。本明細書における言葉は、本発明の実施に必須な、特許請求されていない要素のいずれかを示すものと解釈されるべきではない。
【００９１】
本明細書で開示された本発明の代替の要素または実施形態の分類は、限定とは解釈されない。各群の要素は、個々に、または、本明細書で見出される群または他の要素の他の要素との組み合わせのいずれかにおいて、言及され、特許請求され得る。便宜上および／または特許性の理由で、群の１またはそれ以上の要素が含まれてもよいし、または、群から削除されてもよいと予想される。このような包含または削除のいずれかがなされる場合、明細書は、ここに改変された群を含むものとみなされ、従って、添付の請求項で用いられた全てのマーカッシュ群の記載された説明を満たす。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されており、本発明者等が知る本発明を実施する最良の形態を含む。もちろん、その好ましい実施形態の改良型は、上述の説明を読めば当業者に明白である。本発明者は、当業者がこのような改良型を適切なものとして用いることを考慮しており、本発明者等は、本発明が特に本明細書に記載されたものとは異なって実施されることを意図する。従って、本発明は、準拠法により認可された本明細書に添付された請求項に記載の主題の全ての改変および同等物を含む。その上、全ての可能なそれらの改変型における上述した要素の組み合わせのいずれかは、明細書中に特に他の規定がない限り、あるいは、文章により明確に否定されない限り、本発明に含まれる。
【００９３】
その上、本明細書を通して、特許および印刷された出版物に対して多数の参照がなされている。上記で引用された参考文献および印刷された出版物はそれぞれ、参照により個々に本明細書に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析に基づいて、１２種の異なるラクトバシラス種タイプの株と比較した１％アガロースゲル上のラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株のゲノムフィンガープリントを示す。
【図２】図２は、ゲノムフィンガープリンティングから推測された系統発生学的系統樹と、ラクトバシラス種ＫＥ０１株とラクトバシラス種タイプの株の他の種との関連を示す。
【図３】図３は、ウシの腸上皮へのラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株の付着を示す。
【図４】図４は、ウシの腸上皮粘膜に生体フィルムを形成した定着を示す。
【図５】図５は、本発明の教示に従って動物の食餌にラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を添加した結果として、強化されたラクトバシラスの腸での定着および糞放出をグラフで示す。
【図６】図６は、本発明の教示に従って動物の食餌にラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を添加した結果の、大腸菌型の糞の計数の減少をグラフで示す。
【図７】本発明の教示に従ってに動物の食餌にラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を添加した結果としての、動物の糞におけるアンモニア生成物の減少をグラフで示す。
【図８】図８は、本発明の教示に従って動物の食餌をラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株に添加した結果としての、動物の糞における硫化物生成物の減少をグラフで示す。
【図９】図９は、本発明の教示に従って動物の食餌にラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を添加した結果としての、動物における体重増加の上昇をグラフで示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年１２月１８日付けで出願された米国特許仮出願６０／２５６５２８の優先権を主張し、その全内容を参照により本明細書に含める。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、プロバイオティック性（probiotic）ラクトバシラス−カゼイ（Lactobacillus casei）調製物を開示する。詳しくは、新規に特徴付けられたＫＥ０１と指定されるラクトバシラス−カゼイ株から得られた、抗感染性で抗下痢性の調製物を開示する。また、ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を用いたプロバイオティック化合物を調製するための関連方法、および、ＫＥ０１プロバイオティック組成物を用いるための関連方法も開示する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書において記載される新規に認識されたプロバイオティック性ラクトバシラス−カゼイ株はＫＥ０１と指定されている。以前は、これと同じ生物をラクトバシラス−カゼイＫＥ９９と指定していた(例えば、米国仮出願第６０／２５６５２８号、および、A.S. Naidu, X. Xie, D.A. Leumer, S. Harrison, M.J. Burrill and E.A. Fonda. 2001. Reduction of sulfide、Ammonia Compounds and Adhesion Properties of Lactobacillus casei strain KE99 In Vitoro. Curr. Microbiol. 43: In pressを参照)。
【０００４】
乳酸菌（ＬＡＢ）は、宿主のミクロ生態学において重要な役割を果たす哺乳動物の消化管に固有のマイクロフローラであり、治療および予防特性の目覚しい一覧をもって信用されている。これら治療および予防特性としては、これらに限定されないが、腸の微生物生態学の維持、生理学的効果、免疫変調効果および抗菌効果が挙げられる。他のＬＡＢ関連性状としては、腸管腔への酵素放出が挙げられ、これはＬＡＢ付着と相乗的に作用し、腸の吸収不良の症状を緩和することができる。その上、ＬＡＢ酵素は腸のｐＨ調節を助け、それにより芳香族アミノ酸分解を増すことができる。[Fuller, R. Probioticfoods - current use and future developments. IFI NR 3:23-26 (1993); Mitsuoka, T. Taxonomy and ecology of Bifidobacteria. Bifidobacteria Microflora 3:11 (1984); Gibson, G.R. et al., Probiotics and intestinal infections, p.10-39. In R. Fuller (ed.), Probiotics 2: Applications and practical aspects. Chapman and Hall, London, U.K (1997); Naidu AS, et al., probiotic spectra of lactic acid bacteria(LAB). Crit Rev Food Sci Nutr 39:3-126 (1999); Naidu, A.S, Clemens, R.A. Probiotics. p.431-462. In A.S. Naidu (ed.), Natural Food Antimicrobial Systems. CRC Press, Boca Raton, FL (2000)]。
【０００５】
また、乳酸菌は、動物の糞廃棄物中の硫化物およびアンモニア含有化合物を顕著に減少させることにより、動物の排泄物による匂いと毒性とを減少させる能力を示した。農業ビジネスが発展し、地域社会が見た限り際限無く未使用の農業地域への進出が続くにつれ、このエキソビボ（ex vivo）でのＬＡＢの用途はますますより重要になりつつある。例え
ば、雄鶏の雛鳥や貝の廃棄物と、１５％の炭水化物およびＬＡＢを含む混合物とを混合すれば、ＬＡＢは、不快な匂いを除去し、孵化場の廃棄物に関する硫化水素生成物を減少させることが示されている。その上、ＬＡＢ組成物は、孵化場の廃棄物中の大腸菌およびサルモネラ菌含量を無視できるレベルに減少させる効能が示されている。加えて、ラクトバシラス−アシドフィルス（L. acidophilus）が媒介する乳酸発酵により、ブロイラー処理
廃棄物のような家禽廃物の匂いや粘度が顕著に減少する。その上、ＬＡＢ含有調製物は、分解困難な炭水化物の破壊を促進し、ブタの盲腸の細菌によるアンモニア生成物を減少させることが報告されている。最終的に、エキソビボでのラクトバシラス−カゼイＦＧ１およびラクトバシラス−プランタルム（L. plantarum）ＦＧ１０の貯蔵生牧草の発酵は、尿素分解生物を抑制することによって顕著にアンモニア量を減少させる。[Deshmukh, A.C.,
Patterson, P.H. Preservation of hatchery wastes by lactic acid fermentation. 1.
Laboratory scale fermentation. Poult Sci 76:1212-1219 (1997); Russell, S.M. et al., Lactic acid fermentation of broiler processing waste: physical properties and chemical analyses. Poult Sci 71:765-770 (1992); Tibbetts, G.W. et al., Poultry offal ensiled with Lactobacillus acidophilus for growing and finishing swine diets. J Anim Sci 64:182-190 (1987); Sakata, T. et al., Probiotic preperations dose-dependentty increase net production rates of organic acids and decrease that of annmonia by pig cecal bacteria in batch culture. Dig Dis Sci 44:1485-1493 (1999); Cai, Y. et al., Effect of applying lactic acid bacteria isolated from forage crops on fermentation characteristics, aerobic deterioration of silage. J Dairy Sci 82:520-526 (1999); Modler, H.W. et al., Bifidobacteria and bifidogenic factors. Can Inst Food Sci Tech 23:29-41 (1990)]。
【０００６】
しかしながら、ＬＡＢがヒトおよび家畜の生命の質を向上させる最も高い可能性は、ＬＡＢのインビボでのプロバイオティック用途にある。ＬＡＢがインビボでの有益なプロバイオティック効果を示すためには、生物は、消化管で長い時間生存しなければならない。それゆえに、腸の収縮による迅速な除去を防ぐような量を保持できるプロバイオティックＬＡＢ株を選択することが重要である。有効なプロバイオティック細菌は、胃の環境での生存が可能であり、腸上皮に付着することによって少なくとも一時的に腸で定着することが可能でなければならない。その結果として、粘膜表面に付着するための高められた能力を示し、それゆえに改善された細菌の維持、および、持続的な消化管での滞留時間を示すＬＡＢは、それらを示さないＬＡＢに対して競争力のある利点を有する。[Salminen, S. et al., Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges. Antonie Van Leeuwenhoek 70:347-358 (1996); Conway, P. Selection criteria for probiotic microorganisms. Asia Pacific J Clin Nutr 5:10-14 (1996); Havenaar, R. et al., Selection of strains for probiotic use, p.209-224. In R. Fuller (ed.), Probiotics, the scientific basis. Chapman and
Hall, London, U.K. (1992)]。
【０００７】
ラクトバシラス種は、多数の異なるメカニズムを介して哺乳動物の消化管にうまく定着することができる。例えば、いくつかの細菌種は、様々な上皮下部の（sub-epithelial）マトリックスタンパク質、および、腸の粘膜上の特定の受容体に結合する。他の種は、細菌および宿主の真核細胞表面上で、炭水化物とタンパク質因子との異なる組み合わせを必要とするメカニズムを介して、哺乳動物の腸の細胞に付着することができる。しかしながら、付着のメカニズムに関係なく、ヒト消化管にうまく定着するＬＡＢの能力により、ＬＡＢはプロバイオティック特性が与えられる。[Greene. J.D.. Klaenhammer, T.R. Factors involved in adherence of lactobacilli to human Caco-2 cell. Appl Environ Microbiol 60:4487-4494 (1994); Sarem, F. et al., Comparison of the adherence of three Lactobacillus strains to Caco-2 and Int-407 human intestinal cell lines. Lett Appl Microbiol 22:439-442 (1996); Naidu, A.S., et al., Particle agglutination assays for rapid detection of fibronectin, fibriogen, and collagen receptors on Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 26:1549-1554 (1988); Wadstrom, T. et al., Surface properties of lactobacilli isolated from the small intestines of pigs. J
Appl Bacteriol 62:513-520 (1987); Bernet, M.F. et al., Lactobacillus acidophilus LA 1 binds to cultured human intestinal cell lines and inhibits cell attachmen
t, invasion by entero-virulent bacteria. Gut 35:483-489 (1994); Jin, L.Z. et al., Effect of adherent Lactobacillus spp. on in vitro adherence of salmonellae to the intestinal epithelial cells of chichen. J Appl Bacteriol 81:201-206 (1996); Reid, G. et al., Influence of lactobacilli on the adhesion of Staphylococcus aureus and Candida albicans to fibers and epithelial cells, J Ind Microbiol 15:248-253 (1995)]。
【０００８】
一般的に言えば、競合的な結合プロセスで侵襲性または毒素産生の病原性の腸細菌（腸管病原体）を腸の粘膜から退去させることにより、プロバイオティック細菌は自身の有益な効果を働かせる。腸管病原体、例えば、これらに限定されないが、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、サルモネラ−エンテリティディス（Salmonella enteritidis）、エルシナ−シュードツベルクローシス（Yernia psudotuberculosis）、および、リステリア−モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）は、病気を引き起こすために動物の腸管にうまく定着することができなければならない。
【０００９】
有効に腸に定着するのにこれら生物が用いるメカニズムは様々である。例えば、ＣＦＡ／IまたはＣＦＡ／II付着因子を有するＥＴＥＣは、特に、培養中の、分裂したヒトの腸
上皮のＣａｃｏ−２細胞の刷子縁に付着する。サルモネラ−チフィムリウムおよびＥＰＥＣは、培養中の、分化したヒトの腸上皮のＣａｃｏ−２細胞の刷子縁に付着し、それに反して、エルシナ−シュードツベルクローシスおよびステリア−モノサイトゲネスは、未分化のＣａｃｏ−２細胞の末梢に結合する。
【００１０】
近年、熱で殺したラクトバシラス−アシドフィルス調製物が有効なプロバイオティック組成物であることが証明された。熱で殺したラクトバシラス−アシドフィルス調製物が、用量に応じて、既知の腸管病原体を試験動物の腸壁の内層から退去させることが示された。その結果として、腸管病原体は動物の消化管に定着できなくなり、病気が防がれた。例えば、ラクトバシラス−アシドフィルス（Ｌａｃｔｅｏｌ（登録商標）株）が、この大腸菌のＢ４１株（ＥＣＢ４１）の付着を用量に応じて阻害することが見出された。他の実験において、生きたラクトバシラス−アシドフィルスＬＢ株、および、熱で殺したラクトバシラス−アシドフィルスＬＢ株が、Ｃａｃｏ−２細胞の結合（association）と、腸管病
原体の侵入との両方をうまく阻害した。さらに他の研究において、熱で殺したラクトバシラス−アシドフィルスＬＢ株が、Ｃａｃｏ−２細胞へのＥＴＥＣ付着を完全に阻害することが示された。[Fourniat, J. et al., Heat- kilted Lactobacillus acidophilus inhibits adhesion of Escherichia coli B41 to HeLa cells. Ann Rech Vet 23:361-370 (1992); Chauviere, G. et al., competitive exclusion of diarrheagenic Escherichia coli (ETEC) from human enterocyte-like Caco-2 cells by heat-killed Lactobacillus. FEMS Microbiol Lett 70:213-217 (1992)]. Coconnier, M.H. et al., Inhibition of adhesion of enteroinvasive pathogens to human intestinal Caco-2 cells by Lactobacillus acidophilus strain LB decreases bacterial invasion. FEMS Microbiol Lett 110:299-305 (1993)]。
【００１１】
上述したように、プロバイオティック組成物とは、一般的に、腸の微生物バランスを改善することによって宿主に有益に作用する微生物栄養補助食品と定義される。一般的にプロバイオティックに関連する微生物の２つの主要な属としては、ラクトバシラス種と、ビフィドバクテリア種（Bifidobacteria sp）とがある。プロバイオティックによる有益な
効果としては、感染症への耐性の増加、より健全な免疫系、過敏性腸症候群の軽減、血圧の減少、血清コレステロールの減少、アレルギー緩和、および、腫瘍後退が挙げられる。しかしながら、近年の科学進歩や、プロバイオティック組成物の効能を支持する限定されたインビボおよびインビトロでの実験上の証拠が公開されているにもかかわらず、これらの利益および他の利益を報告する主な研究は解毒面での証拠に頼ってきた。
【００１２】
解毒性に依存する刊行物および限定されたインビトロのデータの例としては、米国特許（ＵＳＰＡＮ）第３，９５７，９７４号、第４，２１０，６７２号、第４，３１４，９９５号、第４，３４５，０３２号、第４，５７９，７３４号、第４，８７１，５３９号、第４，８７９，２３８号および第５，２９２，３６２号（「Hata」の特許）。Hataの特許は、ラクトバシラス種の様々な亜種を開示しており、有益なプロバイオティック様効果を報告している。しかしながら、Hataの特許は、上皮下部のマトリックスへの貪欲な結合、および、競合的な排除、および、微生物による細菌性の腸管病原体への妨害を示すラクトバシラス種を、開示または説明していない。
【００１３】
米国特許第６，０６０，０５０号（「’０５０特許」）は、貯蔵中に生物を保護するのに用いられる培地を含むスターチ含有培地中に懸濁されたプロバイオティック微生物からなる調製物を開示しており、生物を大腸に移送するのに役立ち、成長促進基質を提供する。しかしながら、’０５０特許は、腸管病原体に対するプロバイオティック活性を直接示すデータを提供していない。
【００１４】
米国特許第号５，９６５，１２８（「’１２８特許」）は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（腸管出血性大腸菌）が原因の腸の病気の治療を開示する。しかしながら、’１２８特許のプロバイオティック組成物は非病原性株の大腸菌しか含んでおらず、ラクトバシラス種は開示されていない。その結果として、’１２８特許の非病原性の腸内生物が、腸管出血性大腸菌に対する「プロバイオティック様」の保護をレシピエントに与えることができる一方で、ラクトバシラス種およびビフィドバクテリア属に関連する他の有益な特色が欠けている。
【００１５】
米国特許第４，８３９，２８１号、第５，０３２，３９９号および第５，７０９，８５７号（’８５７特許）は、腸粘膜細胞に付着する数種のラクトバシラス−アシドフィルス株を開示している。その上、’８５７特許は、ある種の腸管病原体の成長を阻害するラクトバシラス−アシドフィルス株を開示している。しかしながら、’８５７特許は、’８５７特許のラクトバシラス−アシドフィルス培養物に関して証明された有益な特色を有するラクトバシラス−カゼイ株を開示していない。
【００１６】
それゆえに、プロバイオティック活性を示すラクトバシラス種の新菌株に対する必要性が残る。特に、腸管病原体による病気を減少させ、動物の生命力と健康を増進する証明された能力を有するより多くのラクトバシラス種の株に対する必要性がある。
【発明の開示】
【発明の要旨】
【００１７】
本発明の目的は、プロバイオティック特性が実証されたラクトバシラス種の新菌株を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、抗腸管病原体のプロバイオティック活性を有するラクトバシラス種の新菌株を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、動物の健康および生命力を維持するラクトバシラス種の新菌株を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、実証されたプロバイオティック特性を有するラクトバシラス種から製造された栄養補助食品および医薬配合物を提供することである。
本発明は、ＫＥ０１と指定されたラクトバシラス−カゼイの新菌株を提供することによってこれらの目的および他の目的を実現し、当該新菌株は、実証されたインビボでの抗腸管病原体活性などの、科学的に証明されたプロバイオティック特性を有する。その上、本
発明は、ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株からなる栄養補助食品および医薬配合物を提供し、当該栄養補助食品および医薬配合物は、その生物に長期間の保護を提供し且つそれの証明されたプロバイオティック特性の維持を補助するトレハロースおよびフルクトオリゴ糖類からなる糖複合物に配合される。
【００２０】
腸管病原体感染を治療および予防し、ヒトおよび家畜の健康および生命力の維持を補助するのに用いることが出来る新規のプロバイオティック配合物の必要がある。近年、米国食品薬品管理局（ＦＤＡ）は、抗生物質の過剰な処方および臨床上の乱用に対する運動をを強めてきた。過剰な抗生物質使用は、第一選択抗生物質に耐性のあるヒトおよび動物病原体の数に応じて増加し、それにより従来の抗菌療法に反応しない感染症が増加してしまう。その上、動物飼料における予防的な抗生物質使用により家畜の腸の感染が驚くほど増加し、栄養素の吸収不良により群れの大きさや動物の体重が減少してしまう。その結果として、ヒトが摂取するのに適した健康な動物の数は減少し、市場に出すのに十分な程長く生存した動物は顕著に体重が減少し、結果的に肉の品質が低下する。
【００２１】
ヒトおよび家畜における薬剤耐性の腸管病原体の迅速な蔓延を防ぐ一つの手段は、抗生物質の使用を著しく減らすことである。しかしながら、飼育場および都市が過剰に込み合っているために、腸の感染などの伝染病の蔓延は不可避である。その結果として、予防的な抗生物質使用を完全に中断する前に、適切な抗菌の代案が利用可能でなければならない。近年の研究によれば、プロバイオティック微生物の特定の株を含む食料品および栄養補助食品を使用することにより、腸管病原体による病気の予防を補助し、多くの場合、実際に治癒するということが示されている。しかしながら、現在市販されている多くのプロバイオティック処方は、ラクトバシラス種およびビフィドバクテリア種（および他の属）を含む生物に依拠し、これらは、プロバイオティック効能を評価する承認された方法を用いた科学的な調査が行われていない。その結果として、現在利用可能な「プロバイオティック」処方のあまりにも多くが、インビボでの抗腸管病原体の活性が証明されていない。その上、市販の臨床上有効なプロバイオティック配合物の多くは貯蔵に適しておらず、それゆえに、有効量の生存性プロバイオティック細菌が使用者に渡されない。本発明者は、多くの市販の調製物を試験し、微生物の生存率が表示されていた濃度よりかなり低いことを見つけ、多くの場合において、本発明者は、これら市販の調製物が生存性細菌を少しも含まないことを発見している。
【００２２】
本発明者は、ＫＥ０１と指定されるラクトバシラス−カゼイの新菌株を調製およびパッケージング方法を開発した。本発明者は、もともとは、このラクトバシラス−カゼイの新菌株を伝統的な発酵したヨーグルト様のアジアの乳製品から得た。その後、本発明者は、単離物を特徴づけ、その株をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC, MD, USA
）に寄託した。ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９４５を与えられた。その上、本発明者は、生存性プロバイオティック微生物の臨床上有効な量が宿主に達するようなラクトバシラス−カゼイＫＥ０１の生存率を維持する調製物を開発した。
【００２３】
本発明は、腸管病原体の細菌付着を阻止する（微生物の妨害）ラクトバシラス−カゼイ株（ＫＥ０１）を提供し、当該腸管病原体としては、例えば、これらに限定されないが、多様な哺乳動物細胞タイプに対する、腸管病原性および腸管毒素原性大腸菌、ヘリコバクター−ピロリ（Helicobacter pylori）、カンピロバクター−ジェジュニ（Campylobacter
jejuni）、サルモネラ−チフィムリウム（S. typhimurium）、およびサルモネラ−エン
テリティディスが挙げられる。その上、本発明のラクトバシラス菌はまた、これら細菌性病原体および他の細菌性病原体を、多くの哺乳動物細胞に競合的に結合させないようにする（競合的な排除）。本発明の新規ラクトバシラス株に関する有益な特性により、全般的なヒトおよび動物の健康を支持する改善されたプロバイオティック栄養補助食品が得られ
た。その上、本発明は、例えば、これらに限定されないが、旅行者下痢症、胃腸感染症、溶血尿毒症症候群、および胃潰瘍などの状態に対して、予防薬、治療薬および苦痛緩和薬（本明細書においては、まとめて「プロバイオティック」と称する）を提供するのに用いることができる。
【００２４】
この新規ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株の追加的な新しい特徴および特色としては、これらに限定されないが、約２０００ｐｐｍの硫化物を含む増殖培地に晒した場合、４８時間以内に、硫化物濃度を３００ｐｐｍを超過する係数（factor）で減少させるラクトバシラス−カゼイＫＥ０１の能力、および、上皮下部のマトリックス、例えばバイオコート（登録商標）（コラーゲンＩ型、コラーゲンIV型、ラミニン、およびフィブロネクチン）、マトリゲル（登録商標）およびＣａｃｏ−２細胞の単分子層などへ強い結合を示すこと、が挙げられる。最も重要には、本発明のラクトバシラス−カゼイの再生した凍結乾燥調製物が、コラーゲンに付着した大腸菌を効果的に引き離すことが示された。
【００２５】
本発明のラクトバシラス−カゼイの生存率を維持し、その大腸菌置換特性を保持するのに用いられた方法としては、これらに限定されないが、糖トレハロースおよび水分の使用、ならびに、最終組成物を耐酸素ポリマー（例えばＭｙｌａｒ（登録商標））で内張りした箔膜小包（foil pouch）にパッケージングすること、が挙げられる。
【００２６】
ラクトバシラス種の新菌株の、これらの、および他の有益なプロバイオティック特性は、以下の、非限定的な本発明の詳細な説明によりさらに証明される。
発明の詳細な説明
本発明の一実施形態は、１グラム当たり約１０５〜１０１１コロニー形成単位の生存性ラクトバシラスを含む栄養補助食品である。本発明の他の実施形態において、本栄養補助食品は、１グラム当たり約１０５〜１０１１個の不生存性ラクトバシラスを含む。本発明のラクトバシラス種は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−３９４５のラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株である。ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１のコロニー形成単位（ＣＦＵ）は、１個の細菌細胞と同等である。また、コロニー形成単位またはＣＦＵという用語は、一般的に生存性細菌を述べる場合にのみ用いられるが、不生存性ラクトバシラス組成物で構成される本発明の実施形態を述べる場合には、１個の不生存性細菌細胞も定義される。
【００２７】
本発明の一実施形態において、本栄養補助食品は、乾燥ラクトバシラス種組成物で充填したゼラチンカプセルを含む。他の実施形態において、本栄養補助食品は、液体調製物の形態である。本発明のさらに他の実施形態において、本栄養補助食品は、肛門または膣用の坐剤の形態である。坐剤として用いる場合、本栄養補助食品を手ごろな巨丸剤に成形することができ、投与を容易にするための非毒性の潤滑剤、安定剤、ワックス等を含ませることができる。本発明の他の実施形態において、本ラクトバシラス種栄養補助食品は、食物、例えば、これらに限定されないが、乳製品、穀物、パン、肉、果物、野菜、米等と混合することができる。本発明のラクトバシラス種栄養補助食品が想定する形態は、重要ではなく、非限定的である。
【００２８】
本明細書を通して、本発明は、プロバイオティック組成物、ラクトバシラス種含有組成物、栄養補助食品、凍結乾燥粉末、または、ラクトバシラス種組成物と称することができる。これら全ての上述の用語は、形態または他の成分の存在もしくは非存在に関係なく、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９４５の生存性または不生存性ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株、または、本明細書で説明される方法を用いて決定された遺伝的に同等なものを含む組成物を意味する。
【００２９】
本発明の一実施形態において、そのラクトバシラス組成物は、食品科学分野の当業者に
既知の標準的な方法を用いて凍結乾燥される。本発明のラクトバシラス組成物の他の実施形態において、本ラクトバシラス組成物は風乾される。さらに他の実施形態において、そのラクトバシラス組成物はペーストである。さらに他の実施形態において、本発明のラクトバシラス組成物は液体である。
【００３０】
本発明のラクトバシラス組成物は、追加の成分と混合してもよいし、混合しなくてもよい。例えば、本発明の一実施形態において、そのラクトバシラス組成物は、トレハロース、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、および、それらの組み合わせからなる群より選択された炭水化物と混合される。当該炭水化物は、組成物全体の約５０％〜９８％で含まれ得る。他の実施形態において、タンパク質、例えばアルブミンおよび／またはホエーは、本発明のラクトバシラス組成物に添加しても、しなくてもよい。
【００３１】
本発明のラクトバシラス種杆菌組成物を、ゼラチンカプセル、圧縮錠剤、またはジェルカップの形態で、巨丸剤として経口的に摂取することができる。他の実施形態において、本発明のラクトバシラス組成物を、液体飲料の形態で経口的に摂取することができる。液体飲料は、他の成分、例えば、これらに限定されないが、フレーバー増強剤、甘味料、粘度増強剤および他の食品添加剤を含ませることができる。また、本発明を、他の食品と共に、別々に、または、それらと混合して摂取することができる。
【００３２】
本発明の一実施形態において、動物は、プロバイオティック組成物の１回の用量（１グラム当たり約１０５〜１０１１個のラクトバシラスを含む）を与えられる。総摂取量は、動物の個々の必要性、ならびに、動物の体重および大きさに依存する。いずれの所定の用途のための好ましい投与量は、滴定で簡単に決定することができる。滴定は、一連の標準重量用量（それぞれ１グラム当たり約１０５〜１０１１個のラクトバシラスを含む）を調製することによって達成される。一連の用量を投与し、０．５グラムから始めて動物のサイズおよび用量形態により決定された理論的な終了点に達するまで上げ続ける。適切な用量は、所望の結果が得られるラクトバシラス組成物の最小限の量が投与される場合に達成される。また、適切な用量は、本発明のプロバイオティック組成物の「有効量」として当業者に知られている。
【００３３】
例えば、動物における過敏性腸症候群に関する症状を軽減することが望ましい場合、上述の１つの測定用量を、症状が静まるまで用量をそれぞれ連続的に１日０．５グラムずつ増加させて段階的に上げながら毎日投与する。本発明の一実施形態において、好ましい用量は、体重（動物レシピエントの重量）１キログラム当たり、１日当たり、約１０３〜１０８個の生存性ラクトバシラスの範囲である。これは、平均的な健康な成人に関して、１日当たり約１００億個の生存性ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株と同等である。全ての体重の全ての動物に適したおよその用量を外挿法により計算することは、簡単である。これは、上述の滴定方法により、プロバイオティック組成物を処方する当業者により適切に変えることができる非限定的な例である、と認識される。
【００３４】
本発明のプロバイオティック組成物は、それを必要とする全ての動物に投与することができる、当該動物としては、これらに限定されないが、哺乳動物、鳥類、爬虫類、および、魚類が挙げられる。典型的な用途としては、本発明のプロバイオティック組成物を、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、ウズラ、インコ、オウム、ならびに、他の野生動物および家畜動物に投与することが挙げられる。
【００３５】
特に、本発明のプロバイオティック組成物は、本明細書に記載の方法を用いてそれを必要とする動物に投与する場合、腸管病原体関連病を阻害または治療するのに用いることができる。腸管病原体による病気としては、例えば下痢、過敏性腸症候群および腸の出血な
どの病原体により発症する病気が挙げられる。これら病気に関する腸管病原体の例としては、これらに限定されないが、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、サルモネラ−エンテリティディス、エルシナ−シュードツベルクローシス、および、リステリア−モノサイトゲネスが挙げられる。競合的な結合プロセスを介して腸管病原体による病気の阻害および治療が本発明のプロバイオティック組成物により達成されることが、本発明者により理論化されるが、限定として提供されることではない。すなわち、本発明のプロバイオティック性ラクトバシラスは、腸の粘膜上の結合部位で腸管病原体と競合する。本発明のプロバイオティック性ラクトバシラスがこれら結合部位に対して腸管病原体よりも高い親和性および結合活性を有するために、本発明のプロバイオティック性ラクトバシラスは、正常な代謝プロセスにより無害に腸から流出して、腸内環境に腸管病原体を置換する。腸管病原体による病気の阻害および治療におけるこの上述の競合的な結合およびその効能のインビボでの例は、下記の詳細な実施例および添付の図面で提供される。
【００３６】
以下の技術的な考察は、詳細な技術を提供する。セクションＩにおいて、当業者は、プロバイオティック性ラクトバシラス、特に、本発明のプロバイオティック性ラクトバシラス種、ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株をどのように単離し同定するかを学ぶ。セクションIIにおいて、本発明のプロバイオティック組成物をどのように調製するか、および、本発明のプロバイオティック組成物により示されるプロバイオティックの特色を科学的に確認するために行われた試験を教示する特定の実施例が提供される。これら詳細な実施例は限定を意図しないと理解される。
【００３７】
Ｉ．ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株の単離および特徴付け
Ａ．候補のプロバイオティック細菌の単離
伝統的な発酵ヨーグルト様のアジアの乳製品から本発明のプロバイオティック生物を単離した。スクリーニング方法は，安全なヒトの消費の少なくとも１０年の歴史を有する伝統的な発酵ヨーグルト様のアジアの乳製品に限定された。プロバイオティック細菌の単離は、３種の選択的な微生物用培地を用いて、微生物学の当業者既知の方法を用いて行われた。ラクトバシラス選択的培地としては０．０５％システインを添加したＳＬ培地が挙げられ、ビフィドバクテリウム属は抗生物質を含むトリプチケースフィトンイーストエクストラクト培地を用いて選択され、ストレプトコッカス属に関してはトリプチケースイーストエクストラクトシステイン培地を用いて単離された。
【００３８】
候補のプロバイオティックラクトバシラス種杆菌は、カタラーゼ陰性の、グルコースホモ発酵型の、グラム陽性の非胞子形成杆菌であり、これは、低いｐＨ、胃酸および胆汁耐性を示した。ラクトバシラス単離物が酢酸塩含有培地で成長する能力に加えて、ラクトバシラス単離物がｐＨ９．０で成長できないことは、それらをＣａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種から区別するのに役立った。トータルで８１個の単離物が、これらの基準に基づき候補のプロバイオティック性ラクトバシラスとして分類され、さらに以下の基準、すなわち：ｉ）低い膵液への耐性；ii）上皮下部のマトリックス、例えばバイオコート（登録商標）マトリゲル（Becton Dickinson, Bedford, MA）への付着能力、および、培養した腸上
皮細胞（Ｃａｃｏ−２細胞系）への付着能力；iii）コラーゲンマトリックスに付着する
腸管出血性大腸菌血清型Ｏ１５７：Ｈ７を競合的に排除するそれらの能力；および、iv）アンモニアおよび硫化物含有化合物を減少させるそれらの能力に関して特徴付けられた。
【００３９】
全ての８１個の候補のプロバイオティック性ラクトバシラスを分析した後、全ての上述した特徴を有する２つの株を同定した。これらの株は、ＫＥ９７株およびＫＥ９９株（再指定されたＫＥ０１）と指定された。最後に、成長増殖速度（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ（登録商標）バクトメーターシステムを用いたインピーダンス検出によって決定された世代時間）、連続培養における株の安定性、凍結乾燥および再生の特徴、および芳香／フレーバ
ー特性を各株で確認した。
【００４０】
本発明のプロバイオティック組成物の調製に用いるための実質的に純粋な培養物中で、単離されたラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株生物を維持する。本明細書で用いられるように、「実質的に純粋な培養物」とは、固体または半固体の微生物用培地上で培養された場合、識別可能な一つの生物のみが生じる細菌学上の培養物を意味する。他の細菌種の細胞が極めて低い量で存在してもよいが、しかしながら、これらの細胞は、生存不可能、培養不可能であるか、または、典型的なゲノムに基づかない微生物学的技術を用いた検出の限界値より低いか、のいずれかである、ということが理解される。「ゲノムに基づかない」という用語は、微生物のＤＮＡまたはＲＮＡを検出するのに用いられるＰＣＲ検出または類似方法のような方法が排除されていることを意図する。
【００４１】
その上、ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株（または、単にＫＥ０１とも称される）の粉末、ペースト、ゲル、巨丸剤、または、他のプロバイオティック組成物のいずれも本発明の教示に従って製造されることが本明細書で説明されており、そのラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株は実質的に純粋な培養物から得られたものと理解される。
【００４２】
Ｂ．ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析によるＤＮＡフィンガープリンティング
ＲＡＰＤプロトコールにおいて、細菌の同定のための独特なフィンガープリントを作製するためにＰＣＲが用いられる。ＰＣＲによる分析は、迅速かつ信頼できる方法で行うことができる。従って、ＲＡＰＤ分析が、ＫＥ０１株の分子同定およびフィンガープリンティングに用いられた。ＡＴＣＣコレクションからの全ての１２種のラクトバシラス種タイプの株をフィンガープリンティングし、ＫＥ０１と比較した。ＤＮＡフィンガープリンティングのために、全てのラクトバシラス種株をＭＲＳブロス（Difco）で一晩培養した。
ＤＮＡフィンガープリントに関して分析されたラクトバシラス種株を表１に列挙する。
【００４３】
【表１】
ＤＮＡ抽出方法
ＷｉｚａｒｄゲノムＤＮＡ精製キット（Promega, WI, USA）を用いてラクトバシラスからＤＮＡを抽出した。簡単に言えば、１ｍＬの２４時間成長させたＭＲＳブロスの各ラクトバシラス種の培養物を遠心分離により回収し、細胞を５０ｍＭのＥＤＴＡ中で再懸濁し、１０ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Sigma, MO, USA）で３７℃で６０分間処理した。ラクトバ
シラス種杆菌細胞を遠心分離でペレット化し、上清を除去した。細菌のペレットを核溶解溶液中で再懸濁し、８０℃で５分間インキュベートした。細胞懸濁液を室温に冷却し、ＲＮアーゼをその溶液に混合した。その懸濁液を３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、タンパク質沈殿溶液をその混合物に加えた。溶液をボルテックスで混合し、氷上で５分間インキュベートした。その混合物を３分間１５Ｋ×ｇで遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、ＤＮＡをイソプロピルアルコールで沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離し、イソプロピルアルコールを吸引した。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、遠心分離で回収した。エタノールを除去し、ペレットを乾燥させた。ＤＮＡをトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中で再懸濁した。
【００４４】
抽出されたＤＮＡのＰＣＲ増幅
Cocconcelli等（１９９５）に従い、１マイクロリッターの抽出されたＤＮＡを用いて
、単一の任意のヌクレオチド配列を用いてｉＣｙｃｌｅｒ（Bio-Rad, CA, USA）でＰＣＲ反応を行った。２×ＰＣＲ溶液−Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ（Takara, Shiga, Japan）を各反応に用いた。各反応は、総量５０μＬ、１．２５ユニットのＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ、１×緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭ）を含んでいた。プライマーの最終濃度を４μＭとし、増幅に用いられたプライマーは、５’−ＡｇＣＡｇＣｇＴｇｇ−３’であり(Operon Technologies. Inc., CA, USA)、テンプレートＤＮＡを含む反応混合物を、以下の温度プロフィールでサイクル反応させた：９４℃で５分間を１サイクル；９４℃で１分間、２９℃で１分間、１．５分間で７２℃まで上昇させ、７２℃で１．５分間維持を４０サイクル；７２℃で２分間を１サイクル；および、４℃で維持。[Cocconcelli, PS et al., Development of RAPD protocol for typing of strains of lactic acid bacteria and entercocci. Lett. Appl. Microbiol. 21:376-379 (1995)]。
【００４５】
ゲル電気泳動
各ＲＡＰＤで増幅された反応物のアリコート（１０μＬ）を、Sambrook等（１９８９）に従って、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中の１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のアガロースゲル電気泳動により分析した。ゲルを冷却しないで１２０Ｖで２時間泳動させた。標準としてＤＮＡ分子量マーカーのＨｙｐｅｒｌａｄｄｅｒ Ｉ（Bioline, Randolph, MA, USA）を用いた。電気泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイド（５μｇ／ｍＬ）で１０分間染色し、５分間洗浄し、可視化し、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ（BioRad, CA, USA）で分析した。[Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)]。
【００４６】
単一の１０−ｍｅｒプライマーを用いたＲＡＰＤ分析により、様々なラクトバシラス種参照株およびＫＥ０１株のＤＮＡサンプルを含む１％アガロースゲル上で、変化する強度の、多数の増幅産物のはっきりとした固定パターンが得られた。ゲル上での、異なる種の断片と参照ラクトバシラス種との比較を示した。図１および表２で示された説明文付きの固定パターンは、ＫＥ０１株を一意的に同定し、ゲノムフィンガープリンティングライブラリーを提供するのに役立つ。ゲノムフィンガープリンティングに基づいて、図２で示されたようにデンドグラム（dendogram）を推測した。系統発生分析のワードのクラスター
方法を適用した。この方法は、各工程で形成され得る２種のクラスターのいずれかの平方和を最小化し、小さいサイズのダスター（duster）を作製した。系統発生分析に基づき、ＫＥ０１株は、ラクトバチルス−ヘルヴェティクスＡＴＣＣ１５００９と１３％相同性を示し、ラクトバシラス−カゼイ属の亜種ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９と５５％相同性を示した。
【００４７】
ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株の純粋な培養物をアメリカンタイプカルチャーコレ
クション（Bethesda, MD）に寄託し、ＡＴＣＣ番号が付与された。
【００４８】
【表２】
II．本発明の実施例
以下の実施例で用いられたバルク状ラクトバシラスＫＥ０１株を、発酵微生物学の当業者に既知の標準的な発酵方法を用いて大量生産した。次に、精製したラクトバシラス種Ｋ
Ｅ０１株を、様々な送達システム、例えば、以下に示すような、微粉末、巨丸剤カプセル、ゲル、および乾燥動物飼料混合物の調製物に用いた。
【００４９】
実施例１
本発明のラクトバシラスＫＥ０１株組成物の調製
凍結乾燥ＫＥ０１の微粉末形態への調製
−２２℃で凍結保存されたラクトバシラス種ＫＥ０１の純粋な培養物（開始物）を、タンパク質、ビタミン、ミネラルおよび炭水化物源を含む発酵ブロス培地中で再生させた。ＮＢＳ１５００Ｌ発酵器に取り付けられた発酵槽で種培養を調製した。発酵プロセス中、微生物の純度を、所定の時間ポイントで（対数期と最終サイクルとを通して）モニターした。微生物の集団を殺菌した分離器で回収し、無水デキストロースおよびトレハロースの混合物を含む担体と混合した後、細胞濃縮物のスラリーを凍結乾燥した。凍結保護物質として、噴霧乾燥したグレードＡの低温加熱した無脂肪低温殺菌乳を用いた。凍結乾燥したＫＥ０１濃縮物を、殺菌した製粉器具を用いて微粉末に粉砕した。使用前に、ＫＥ０１粉末の品質の純度および生存率を確かめた。
【００５０】
ＫＥ０１粉末の混合物への混合：
全ての操作を、温度（７４〜７６°Ｆ）および湿度（３０〜４０％）に制御した環境で行った。ＫＥ０１粉末（約１０１１ＣＦＵ／ｇのラクトバシラス）、および、下記の組成に列挙された他の成分を、混合するために閉鎖系に導入した。一連のジオメトリック希釈を行い、全ての成分が均質に分配されているかを確認した。水底の分流とクロスフローとを確実にするために、カスタマイズされたジオメトリーでマスフロー容器回転システム（mass flow bin tumbling system）内で混合した。混合したら、５ｌｂの円筒型容器にパ
ッケージングするまでその粉末を閉鎖系で維持した。混合した粉末を、吸湿パックまたは内在の防湿特性を有し、気密蓋で密閉された適切な容器（円筒形容器、単位用量パックなど）に充填する。
【００５１】
「約」という用語は、バルク材料を計量したり製造したりする際に固有のエラーの妥当な要素を与えるのに用いられることは、当業者に明白である。本明細書で用いられるように「約」とは、０．１〜０．５％の誤り要因を含み、さらに、最終組成物を配合するのに用いられた材料の量は、トータルで１００％でなければならず、１００％を超えることはできない、ということは当業者に明白である。全てのパーセントは、重量パーセントを基礎とする。例えば、限定を意図しないが、本発明の一実施形態において、本発明の教示に従って製造されたプロバイオティック組成物は、１グラム当たり約１０５〜１０１１ＣＦＵのＫＥ０１を含む約１〜５％のＫＥ０１粉末、および、９５〜９９％の不活性成分または活性成分を含み、当該不活性成分または活性成分は、これらに限定されないが、炭水化物、脂質、ポリペプチド、脂肪酸、植物性化学物質（phytochemical）、および、それら
の組み合わせからなる群より選択される。
【００５２】
本発明の教示に従って用いることができる炭水化物としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および、多糖類、例えば、これらに限定されないが、トレハロース、マルトース、スクロース、デキストロース、ラクトース、イヌリン、リボース、麦芽デキストリン等が挙げられる。本発明の一実施形態において、二糖類は、トレハロース二水和物であり、オリゴ糖はフルクトオリゴ糖であり、多糖類は麦芽デキストリンである。
【００５３】
適切な脂質としては、これらに限定されないが、大豆油、オリーブ油、パーム核油、落花生油、クルミ油、キャノーラ油（cannola oil；菜種油）等が挙げられる。適切なポリ
ペプチドとしては、ホエータンパク質、卵アルブミン、ゼラチン、乳タンパク質、ならびに、他の動物タンパク質および植物タンパク質が挙げられる。最後に、本明細書で用いられる植物性化学物質としては、ポリフェノール類、サポニン類、フラボノイド類、モノテ
ルペン類、硫化アリル類、リコピン類、カロチノイド類、ポリアセチレン（polyactetylenes）、シリマリン、グリシルリジンカテキン類などのような化合物が挙げられる。
【００５４】
本発明の一実施形態において、ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株プロバイオティックは、以下の重量パーセントの成分を含む。
【００５５】
【表３】
ＫＥ０１の巨丸剤カプセルへの調製
凍結乾燥ＫＥ０１微粉末（約１０５〜１０１１ＣＦＵ／ｇのラクトバシラス）、トレハロース二水和物（食品グレード）、および、デキストロース（食品グレード）または麦芽デキストリン（Grain Processing Corp., Muscatine, IA）を、それぞれ３％：６７％：
３０％で、徹底的に混合した。混合した混合物をゼラチンカプセルに充填した。使用前に、ＫＥ０１巨丸剤カプセルの品質を純度および生存率に関して試験した。
【００５６】
【表４】
ゲル形態のＫＥ０１の調製
凍結乾燥ＫＥ０１微粉末（約１０５〜１０１１ＣＦＵ／ｇのラクトバシラス）を、２．５％濃度でフルクトオリゴ糖（医薬品グレード）と徹底的に混合した。非ＧＭＯ（遺伝子組換え生物）を押出／排除した大豆油を第一の担体としてを用いた。ゲルを徹底的に混合し、滅菌したへらを用いてバッチの上部、中心部および下部からサンプルを回収し、ＫＥ０１の純度および生存率に関して分析した。ＫＥ０１ゲルを、使用するための５０／ｃｃのチューブに充填した。
【００５７】
【表５】
実施例２
細胞付着研究
インビトロでの放射付着分析（ＲＡＡ）を行い、Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ（登録商標）（Becton Dickinson, Bedford, Mass.）の、I型コラーゲン(Cn)、IV型Cn、
ラミニン、またはフィブロネクチンを含む２４−ウェルプレート、および、Ｃａｃｏ−２細胞単層を用いて、ラクトバシラス種ＫＥ０１株の付着を測定した。
【００５８】
ラクトバシラスＫＥ０１細胞の調製
Ｂａｃｔｏ（登録商標）ラクトバシラスＭＲＳブロス（Difco）中で嫌気性条件下で一
晩培養したＫＥ０１の培養物の、５０μｌの接種材料を、１０ｍｌのＭＲＳブロス（３Ｈ
−チミジン（２０μｃｉ）を含む）中に再接種した。ＫＥ０１細胞を、嫌気性条件下で、３７℃で、対数期（約７時間）まで培養し、３Ｈ−チミジンを細菌ＤＮＡへ最適に摂取させ、取り込まさせた。３Ｈ−チミジンで標識したＫＥ０１を７，５００×ｇでの遠心分離により回収し、洗浄し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中に再懸濁した。細菌細胞密度を、６００ｎｍで光学的に１０７個のラクトバシラス／ｍｌになるように調節した。
【００５９】
放射付着分析（ＲＡＡ）
上皮下部のマトリックスの相互作用分析のために、Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ（登録商標）の、Ｉ型コラーゲン（Ｃｎ）、IV型Ｃｎ、ラミニン、またはフィブロネクチンを含む２４−ウェルプレートを用いて、ＫＥ０１の付着を試験した。マトリックス成分を、平らで光学的に透明なコーティングとして塗布し、このコーティングは総表面積の１．７５ｃｍ２をカバーした。バイオコート（登録商標）マトリゲルマトリックス、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウスの腫瘍から抽出した可溶性基底膜（室温で再生すると、ゲルを形成する）も、相互作用の研究に用いられた。２ミリリットルのＫＥ０１懸濁液（２×１０７個のラクトバシラス）を、マトリックス層を含む各ウェルに加え、室温でインキュベートした。１時間後、ＫＥ０１懸濁液をウェルから吸引し、廃棄した。１ミリリットルのトリプシン１型（１１０酵素ユニット；Sigma Chemicals, St. Louis, MO.）を、各ウェルに加え、室温で３０分間加水分解させ、マトリックスタンパク質
層を解離させた。トリプシン加水分解産物をシンチレーションバイアルに吸引し、各ウェルからの追加の１ｍｌを１０分間室温でホモジナイズした（Ｓｃｉｎｔｉｇｅｓｔ（登録商標）；Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ）。ホモジネートを対応するシンチレーションバイアルに吸引した。１０ｍｌの量のシンチレーションカクテル（Ｓｃｉｎｔｉｓａｆｅ（登録商標）Ｇｅｔ、Fisher Scientific）をバイアルに分注し、徹底的に混合した。
混合物を沈殿させ、清澄化した後、液体シンチレーション分析器（Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ２１００ＴＲ（登録商標）、Packard Inc.）を用いて放射能を測定した。
【００６０】
真核細胞の相互作用分析に関して、Ｃａｃｏ−２、結腸癌腫細胞系を、２４−ウェルの組織培養プレートで、７２時間、ＣＯ２インキュベーターで、イーグル最小必須培地（１％非必須アミノ酸および１０％ウシ胎仔血清が添加された）を用いて単層の集合になるまで培養した。完全な単層が得られた後、各プレートをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で２回洗浄した。２ｍｌ量（約２×１０７個の細菌）の３Ｈ−チミジンで標識したラクトバシラス懸濁液を、約１０５個のＣａｃｏ−２細胞を含む各ウェルに加えた。Ｃａｃｏ−２細胞とラクトバシラスとの比率を１：２００に維持した。３７℃で１時間インキュベートした後、細菌ｌ懸濁液を吸引し、ウェルをＰＢＳで洗浄した。各ウェルを１型トリプシン、組織ホモジナイザーで処理し、上述したように放射能を測定した。結合をラクトバシラスの結合として示した、生物学的表面の面積１ｃｍ２あたり（上皮下部のマトリックスタンパク質の相互作用のため）、または、細胞１個あたり（Ｃａｃｏ−２細胞の相互作用のため）。
【００６１】
また、ＫＥ０１と異なるバイオマトリックス層との相互作用を、表６に記載の３つのＡＴＣＣ参照株、ラクトバシラス−カゼイＡＴＣＣ３９３、ラクトバシラス−ロイテリＡＴＣＣ２３２７２、および、ラクトバシラス−ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９の相互作用と比較した。有意性を決定するため、分散（variance）の４×６階乗（factorial）分析を
用いて結合データを分析した（SAS Inc., Raleigh, NC）。
【００６２】
【表６】
ＫＥ０１は、インビトロで、Ｉ型コラーゲン、IV型コラーゲン、ラミニン、および、フィブロネクチン、および、マトリゲル（登録商標）層に強い結合を示した。Ｃａｃｏ−２細胞単層に結合したＫＥ０１は、約５４％（１０８個のラクトバシラス／細胞）であった。ＫＥ０１と、上皮下部のマトリックス層およびＣａｃｏ−２細胞単層とのインビトロでの相互作用の全ては、ＡＴＣＣ参照株、ラクトバシラス−カゼイＡＴＣＣ３９３（ｐ＜０．０００１）、ラクトバシラス−ロイテリＡＴＣＣ２３２７２（ｐ＜０．０００１）、およびラクトバシラス−ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９（ｐ＜０．０００１）より顕著に高かった。
【００６３】
実施例３
腸管病原体の細胞付着の妨害の研究
ＫＥ０１の効能は、腸管病原体（表７に列挙）のバイオマトリックスへの付着を阻害し、病原体−バイオマトリックスの複合体を解離することである。
【００６４】
【表７】
付着−解離の分析
ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）中で一晩培養した大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の培養物、または、適切な培地培養液中で培養された他の列挙された病原体の、１０μｌの接種材料を、３ｍｌのＴＳＢまたは対応する適切な培地（３Ｈ−チミジン（２０μｃｉ）を含む）中に再接種した。Ｉ型コラーゲン（Ｃｎ）、IV型Ｃｎ、ラミニン、フィブロ
ネクチンおよびマトリゲル表面を含むバイオコート（登録商標）プレートへの細菌性病原体の結合を、実施例１で説明されたように行った。これらのバイオコート（登録商標）−細菌病原体複合体に、２ｍｌ量の標識されていないＫＥ０１懸濁液（２．０×１０７個のラクトバシラス／ｍｌ）を各ウェルに対して加え、１時間室温でインキュベートした。ラクトバシラスＫＥ０１懸濁液をウェルから吸引した。以下の工程、すなわちウェル中の内容物の放出の工程、および、放射能測定の工程は、実施例２で説明されたプロトコールに従ってなされた。ウェル中の付着した病原体の細菌細胞数の差（ＫＥ０１処理有り、および、無し）を、「Ｌｏｇ１０解離」値として示した。
【００６５】
付着−阻害の分析
標識されていないＫＥ０１のバイオコート（登録商標）プレート（Ｉ型コラーゲン（Ｃｎ）、IV型Ｃｎ、ラミニン、フィブロネクチンおよびマトリゲル表面を含む）への結合を実施例２で説明されたように行った。これらのバイオコート（登録商標）−ＫＥ０１複合体に、２ｍｌ量の３Ｈ−チミジンで標識した大腸菌または他の細菌病原体の懸濁液（２．０×１０７個の細菌／ｍｌ）を各ウェルに対して加え、１時間室温でインキュベートし、懸濁液を吸引した。以下の工程、すなわちウェル中の内容物の放出の工程、および、放射能測定の工程は、実施例２で説明されたプロトコールに従ってなされた。ＫＥ０１で処理されていないバイオコート（登録商標）ウェルは、大腸菌または他の病原体における付着のコントロールとして提供された。ＫＥ０１で前処理された細菌性病原体のバイオマトリックスへの付着の減少を、「Ｌｏｇ１０阻害」値として示した。
【００６６】
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ４３８９５株）とバイオマトリックスおよびマトリゲル（登録商標）バイオコート表面との相互作用における、ＫＥ０１の阻害および解離効果の結果を表８に示す。
【００６７】
【表８】
ＫＥ０１は、試験された全てのバイオ表面への強い結合を示したが、Ｉ型コラーゲンおよびマトリゲル（登録商標）との相互作用は顕著に高かった。ＫＥ０１は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＩ型コラーゲンおよびマトリゲル（登録商標）へ付着の、＞３−ｌｏｇ阻害を引き起こした；その一方で、IV型コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニン相互作用については＞２−ｌｏｇ阻害を引き起こした。付着した大腸菌のＫＥ０１による解離の効能は、阻害値と同様のＬｏｇ値であった。
【００６８】
結合を阻害し付着した細菌を解離するＫＥ０１の効能の範囲を、表９で列挙された数種の腸管病原体を用いて試験した。
【００６９】
【表９】
ＫＥ０１は、２．８−ｌｏｇ（エンテロコッカス-フェカーリスについて）〜４．２−
ｌｏｇ（サルモネラ−エンテリティディスについて）の範囲で、腸管病原体の相互作用を効果的に阻害した。比較してみると、腸管病原体を解離するＫＥ０１の効能は、３．１−ｌｏｇ（腸管出血性大腸菌ＡＴＣＣ４３８８９について）〜４．４−ｌｏｇ（腸管出血性大腸菌ＡＴＣＣ４３８９０について）の範囲で、より高かった。
【００７０】
実施例４
付着した腸管病原体を解離するＫＥ０１微粉末の効能
付着した腸管病原体を解離するＫＥ０１微粉末の効能を、Ｃａｃｏ−２単層を用いた細胞系で試験した。腸管病原体に関するＣａｃｏ−２細胞の付着分析を、実施例２でＫＥ０１について説明したように行った。付着−解離分析を、実施例３でバイオマトリックス層について説明したように行った。しかしながら、上記の２つのプロトコールにおいて、ＫＥ０１粉末を、１％溶液（１００ｍｌの生理的食塩水、ｐＨ７．２中に再懸濁され、徹底的にボルテックスされた１ｇの微粉末）として用いた。生理食塩水での処理をコントロールとして用い、その値を結果を解釈する際にバックグラウンドとして差し引いた。データを表１０に示す。
【００７１】
【表１０】
Ｃａｃｏ−２細胞の腸管病原体の付着プロファイルは、１．１×１０６（腸管出血性大腸菌ＡＴＣＣ４３８８８を有するＣａｃｏ−２細胞１個あたり、１５個の細菌）〜６．７×１０６（サルモネラ−プローラムＡＴＣＣ１３０３６を有するＣａｃｏ−２細胞１個あたり、８９個の細菌）の範囲であった。ＫＥ０１は、Ｃａｃｏ−２細胞に付着した腸管病原体複合体を有効に解離し、その解離効能は、１．３−ｌｏｇ（９３．５％）〜３．１−
ｌｏｇ（９９．９％）（それぞれ大腸菌ＡＴＣＣ４３８８８およびサルモネラ-プローラ
ムについて）の範囲であった。
【００７２】
実施例５
新鮮なＫＥ０１および凍結乾燥ＫＥ０１調製物がウシの腸管の上皮粘膜に付着および定着する能力の証明
ウシの腸の付着分析：
新しく屠殺した動物から腸サンプルを得て、冷蔵状態で研究所へ移送した。腸を切り開き、内腔の上皮粘膜を穏やかに洗浄し、糞の屑を除去した。以下の２種の異なるＫＥ０１調製物、すなわちＡ）実施例２で説明された３Ｈ−チミジンで標識したＫＥ０１（約１０７個のラクトバシラスを含む接種材料の０．１ｍｌ）；および、Ｂ）実施例１で説明されたＫＥ０１粉末ブレンド混合物（生理食塩水で均一に懸濁され、懸濁された、約１０７個のラクトバシラスを含む接種材料の０．１ｍｌ）を、１インチ２の粘膜表面に接種した。２時間インキュベートした後、接種した領域を穏やかに生理食塩水で３回洗浄した。
【００７３】
サンプル調製物−ＡをＫＥ０１付着に関して試験した。接種領域を切り出し、組織ホモジナイザーで消化（digested）し、液体シンチレーションフルイドを用いて増幅し、実施例２で説明された放射付着分析に従って放射能を測定した。ＫＥ０１は、ウシの腸上皮粘膜への強い結合、すなわち、約２．５×１０６個のラクトバシラス／インチ２を示した。
【００７４】
サンプル調製物−ＢのＫＥ０１定着を、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により評価した。試験片を２％ＯｓＯ４で３０〜６０分間処理し、水でリンスした。試験片を５０％、７０％および９５％エタノールで各５分間で処理し、続いて２×１０分間１００％エタノールでリンスした。液体二酸化炭素で臨界点乾燥した後、試験片をマウントして、金、パラジウムでスパッタコーティングした。生検試験片をＪＥＯＬ６３００走査型電子顕微鏡を用いて試験した。顕微鏡観察を図３および４に示す。
【００７５】
実施例６
子豚に投与されたＫＥ０１含有動物飼料−サプリメントのインビボでのプロバイオティック効果。ＫＥ０１の腸の定着および糞放出の証明：ブタの糞臭（糞の硫化物およびアンモニア含量の減少）を減少させるＫＥ０１の能力：および、動物の体重増加へのＫＥ０１寄与率
飼料−サプリメント投与量
飼料−サプリメント投与用量を、実施例１で説明したようにゲル形態で調製した。簡単に言えば、凍結乾燥ＫＥ０１微粉末（約１０５〜１０１１ＣＦＵ／ｇのラクトバシラス）を、２．５％濃度のフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）と共に徹底的に混合した。非ＧＭＯ（遺伝子組換え生物）を押出／排除した大豆油を第一の担体としてを用いた。ゲルを徹底的に混合し、滅菌したへらを用いてバッチの上部、中心部および下部からサンプルを回収し、ＫＥ０１の純度および生存率に関して分析した。ＫＥ０１ゲルを、使用するための５０／ｃｃのチューブに充填した。また、担体のみ、ＫＥ０１細胞を混合した担体、および、ＫＥ０１細胞とＦＯＳとを混合した担体を含むコントロール飼料投与量を調製した。
【００７６】
動物飼料−サプリメント試験
研究には、４０〜６０ｌｂの範囲の重量のトータルで２０匹のブタ（６〜８週齢）を用いた。これら動物を４つのグループ（それぞれ５匹の動物を含む）に分配し、以下のように分類された。
【００７７】
グループ１（コントロール）：第一の担体のみを含むゲル１０ｃｃを与えた動物。
グループ２：第一の担体と混合した２．５％ＦＯＳのみを含むゲル１０ｃｃを毎日与えた動物。
【００７８】
グループ３：第一の担体と混合した約１０１０ｃｆｕ／ｃｃのＫＥ０１株細胞のみを含むゲル１０ｃｃを毎日与えた動物。
グループ４：第一の担体と混合した、１０１０ｃｆｕ／ｃｃのＫＥ０１株細胞と、２．５％ＦＯＳとの組み合わせを含むゲル１０ｃｃを毎日与えた動物。
【００７９】
動物をグループで分け、隔離されたおりに収容し、規則正しく高タンパク質のブタの食餌を与えた。４つの動物グループに、それらそれぞれの分類の飼料−サプリメント投与量（１０ｃｃ）を毎日を与えた。実験を６週間行った。飼料−サプリメント試験中、糞分析および体重測定を毎週規則正しく行った。
【００８０】
糞の回収
糞サンプル（動物当たり約２０ｇ）を滅菌５０ｃｃポリスチレンチューブに回収した。サンプルを正常生理的食塩水で１：１（ｗ／ｖ）の比率で希釈し、徹底的にボルテックスブレンダーでホモジナイズし、２Ｋ×ｇで５分間遠心分離した。上清を慎重にデカントし、微生物学的および化学的分析にかけた。
【００８１】
ベースラインの微生物学的計数（大腸菌型の糞およびラクトバシラス型の糞）および糞中アンモニア含量および糞中硫化物含量のベースラインのレベルを得る実際の飼料−サプリメント試験の１日前に、糞サンプルを回収した。
【００８２】
糞の微生物学的分析
糞溶液（１：１（ｗ／ｖ）のデカントされた上清）を、正常生理的食塩水で１０倍まで連続的に希釈した。Ａｕｔｏｐｌａｔｅ（登録商標）４０００装置（Spiral Biotech, Norwood, MA）を用いて、ＭＲＳ寒天（Difco）上に（全てのラクトバシラス計数のため）、および、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天（Difco）上に（全ての大腸菌型計数のため）、選択さ
れた希釈物を二連でプレーティングした。Spiral社のオートプレーターを用いて指数対数希釈設定（exponential log dilution setting）でプレーティングを行った。寒天プレートを、それぞれ３７℃（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天）および３２℃（ＭＲＳ寒天）で２４〜４８時間インキュベートした。自動化赤外線Ｑ−計数装置（Spiral Biotech, Norwood, MA）を用いて総コロニー計数を概算した。データを糞１グラム当たりの細菌として示し、
結果を、ラクトバシラス計数については図５に、大腸菌型の糞の計数については図６に示した。
【００８３】
ＫＥ０１を含む飼料−サプリメント、および、ＫＥ０１とＦＯＳとの組み合わせを含む飼料−サプリメントを投与された動物は、図５で示すように、コントロールグループに比べて、ラクトバシラス種杆菌の糞放出において約２．５−ｌｏｇの増加を示し、ブタ消化管においてＫＥ０１株の増殖および定着を示した。その一方で、大腸菌型の糞の計数は、図６で示すように、コントロール動物と比べて、ＫＥ０１を与えられた動物、および、ＫＥ０１＋ＦＯＳを与えられた動物において、約２．５−ｌｏｇの減少を示し、ブタ腸において、ＫＥ０１株による有効な競合的な排除を示した。
【００８４】
糞の硫化物およびアンモニア分析
糞における硫化物およびアンモニア量を、ＭＰ２３０ ｐＨ／イオンメーターを用いたイオン選択的電極で測定した（Mettler Toledo, Columbus, Ohio）。
【００８５】
硫化物イオン選択的電極の標準化のために、７５ｍｌの希釈硫化物標準（１０ｐｐｍ）溶液を、２５ｍｌの硫化物抗酸化剤緩衝液に穏やかに撹拌しながら加えた。ＤＸ２００参照電極と組み合わせたＤＸ２３２銀選択的電極を用いて、溶液の電極電位（Ｅ１）を測定した。７５ｍｌの硫化物（１００ｐｐｍ）溶液、および、２５ｍｌの硫化物抗酸化剤緩衝
液を別々に用いて、Ｅ２を測定した。Ｅ１とＥ２との差により、硫化物電極のスロープが構成された。サンプル測定のために、１００ｍｌの標準（１００ｐｐｍ）銀溶液と、２ｍｌの臭化物ＩＳＡ（イオン強度調節）緩衝液と混合し、Ｅ１値を測定した。１０ｍｌの糞溶液と上記溶液とを混合することによって、Ｅ２値を測定した。Ｅ１とＥ２との差をΔＥとみなした。濃度比率（Ｑ）チャートに従い、方程式：Ｃ＝Ｃｓ×Ｑ（Ｃ＝糞中の硫化物濃度；Ｃｓ＝既知の硫化物濃度、すなわち１００ｐｐｍ標準；および、Ｑ＝濃度比率）を用いて、標準スロープとΔＥとに基づき糞中の硫化物濃度を推定した。
【００８６】
アンモニアイオン選択的電極の標準化のために、１ｍｌのアンモニア標準（１０００ｐｐｍ）溶液を、２ｍｌのアンモニアｐＨ／ＩＳＡ（イオン強度調節）緩衝液を予め混合した１００ｍｌの蒸留水に穏やかに撹拌しながら加えた。アンモニアＤＸ２１７電極を用いて、溶液の電極電位（Ｅ１）を測定した。続いて、その溶液に１０ｍｌのアンモニア（１０００ｐｐｍ）標準を加え、電極電位（Ｅ２）の変化を測定した。Ｅ１とＥ２との差により、アンモニア電極のスロープが構成された。サンプル測定のために、１０ｍｌの糞溶液を、２ｍｌのアンモニアｐＨ／ＩＳＡ緩衝液を予め混合した９０ｍｌの蒸留水に、穏やかに撹拌しながら加え、Ｅ１を測定した。糞溶液にアンモニア標準を加え、Ｅ２を測定した。糞中のアンモニア濃度を上述の方程式を用いて推定した。
【００８７】
ＫＥ０１を含む飼料−サプリメント、および、ＫＥ０１とＦＯＳとを含む飼料−サプリメントを投与された動物は、図７および８に示すように、コントロールグループ動物に比べて、顕著な、約３５ｐｐｍ／ｇｍのアンモニア減少、および、約３７５ｐｐｍ／ｇｍの硫化物減少を示した。また、ＫＥ０１を与えられた動物、および、ＫＥ０１とＦＯＳとを与えられた動物からの糞は、増殖したプロバイオティック性ラクトバシラスＫＥ０１による乳酸生成のために、酸臭（rancid）がする。
【００８８】
動物体重増加測定
体重増加に関するベースライン測定を得るために実際に飼料−サプリメント試験を行う１日前に、動物の体重を測定した。全ての４つのグループからの動物の体重を、６週間の飼料試験を通して毎週１回測定した。実験の結果、図９で示したように、動物のコントロールグループに比べて、ＫＥ０１を与えられた動物は約２８ｌｂの体重増加を示し、ＫＥ０１とＦＯＳとを与えられた動物グループは２０ｌｂの体重増加を示した。
【００８９】
III．結果
最後に、本明細書で開示された本発明の実施形態は本発明の原理を説明していることが理解される。用いられ得る他の改変は、本発明の範囲に含まれる。従って、一例として、これらに限定されないが、本発明の教示に従って、本発明のその他の形状を用いてもよい。従って、本発明は、厳密に示されたもの、説明されたものに限定されない。
【００９０】
本発明を説明する文章中（特に以下の請求項の文章中）で用いられた用語「a」および
「an」および「the（該）」ならびに類似の指示語は、明細書中に特に他の規定がない限
り、または、文章により明確に否定されない限り、単数および複数の両方を含むと解釈される。本明細書における値の範囲の記述は、その範囲内に含まれるそれぞれ別々の値を個別に意味する簡略的な方法として提供されることを単に意図する。明細書中に特に他の規定がない限り、それぞれの個々の値は、本明細書で個々に列挙されたかのように、本明細書に含まれる。本明細書に記載の全ての方法は、明細書中に特に他の規定がない限り、あるいは、文章により明確に否定されない限り、適切な順番のいずれかで行うことができる。本明細書で示されるありとあらゆる実施例または典型的な言葉（例えば「such as」）
の使用は、単に、本発明をより良く説明することを意図しており、本発明の範囲あるいは特許請求された範囲に限定を与えない。本明細書における言葉は、本発明の実施に必須な、特許請求されていない要素のいずれかを示すものと解釈されるべきではない。
【００９１】
本明細書で開示された本発明の代替の要素または実施形態の分類は、限定とは解釈されない。各群の要素は、個々に、または、本明細書で見出される群または他の要素の他の要素との組み合わせのいずれかにおいて、言及され、特許請求され得る。便宜上および／または特許性の理由で、群の１またはそれ以上の要素が含まれてもよいし、または、群から削除されてもよいと予想される。このような包含または削除のいずれかがなされる場合、明細書は、ここに改変された群を含むものとみなされ、従って、添付の請求項で用いられた全てのマーカッシュ群の記載された説明を満たす。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されており、本発明者等が知る本発明を実施する最良の形態を含む。もちろん、その好ましい実施形態の改良型は、上述の説明を読めば当業者に明白である。本発明者は、当業者がこのような改良型を適切なものとして用いることを考慮しており、本発明者等は、本発明が特に本明細書に記載されたものとは異なって実施されることを意図する。従って、本発明は、準拠法により認可された本明細書に添付された請求項に記載の主題の全ての改変および同等物を含む。その上、全ての可能なそれらの改変型における上述した要素の組み合わせのいずれかは、明細書中に特に他の規定がない限り、あるいは、文章により明確に否定されない限り、本発明に含まれる。
【００９３】
その上、本明細書を通して、特許および印刷された出版物に対して多数の参照がなされている。上記で引用された参考文献および印刷された出版物はそれぞれ、参照により個々に本明細書に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析に基づいて、１２種の異なるラクトバシラス種タイプの株と比較した１％アガロースゲル上のラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株のゲノムフィンガープリントを示す。
【図２】図２は、ゲノムフィンガープリンティングから推測された系統発生学的系統樹と、ラクトバシラス種ＫＥ０１株とラクトバシラス種タイプの株の他の種との関連を示す。
【図３】図３は、ウシの腸上皮へのラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株の付着を示す。
【図４】図４は、ウシの腸上皮粘膜に生体フィルムを形成した定着を示す。
【図５】図５は、本発明の教示に従って動物の食餌にラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を添加した結果として、強化されたラクトバシラスの腸での定着および糞放出をグラフで示す。
【図６】図６は、本発明の教示に従って動物の食餌にラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を添加した結果の、大腸菌型の糞の計数の減少をグラフで示す。
【図７】本発明の教示に従ってに動物の食餌にラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を添加した結果としての、動物の糞におけるアンモニア生成物の減少をグラフで示す。
【図８】図８は、本発明の教示に従って動物の食餌をラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株に添加した結果としての、動物の糞における硫化物生成物の減少をグラフで示す。
【図９】図９は、本発明の教示に従って動物の食餌にラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を添加した結果としての、動物における体重増加の上昇をグラフで示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９４５を有するラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を含んでなるプロバイオティック組成物であって、前記ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株が実質的に純粋な培養物から由来するものであるプロバイオティック組成物。
【請求項２】
炭水化物、ポリペプチド、脂質、植物性化学物質、および、それらの組み合わせからなる群より選択された不活性成分または活性成分をさらに含む、請求項１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項３】
前記炭水化物が、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項４】
前記炭水化物が、トレハロース、マルトース、スクロース、デキストロース、ラクトース、イヌリン、リボース、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項５】
前記二糖類がトレハロース二水和物である、請求項３に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項６】
前記オリゴ糖は、フルクトオリゴ糖である、請求項３に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項７】
前記多糖類が麦芽デキストリンである、請求項３に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、ホエータンパク質、卵アルブミン、ゼラチン、乳タンパク質、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項９】
前記脂質は、大豆油、オリーブ油、パーム核油、落花生油、クルミ油、菜種油、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１０】
前記植物性化学物質は、ポリフェノール類、サポニン類、フラボノイド類、モノテルペン類、硫化アリル類、リコペン類、カロチノイド類、ポリアセチレン、シリマリン、グリシルリジンカテキン類、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１１】
さらにトレハロースを含む、請求項１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１２】
さらに麦芽デキストリンを含む、請求項１１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１３】
さらにフルクトオリゴ糖を含む、請求項１１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１４】
前記ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株が、１グラム当たり約１０５〜１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）の量で存在する、請求項１３に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１５】
前記プロバイオティック組成物が、動物に投与される巨丸剤、ゲルまたは液体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１６】
前記動物が、哺乳動物、魚類、鳥類および爬虫類からなる群より選択される、請求項１５に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１７】
前記哺乳動物が、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ブタおよびウシからなる群より選択される、請求項１６に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１８】
前記鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、ウズラ、インコおよびオウムからなる群より選択される、請求項１６に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１９】
前記巨丸剤が、ゼラチンカプセル、圧縮錠剤およびジェルカプセルからなる群より選択される、請求項１５に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項２０】
前記巨丸剤が、ポリマーで内張りした箔膜小包にパッケージングされる、請求項１９に記載のプロバイオティック。
【請求項２１】
約１〜５重量パーセントの量のＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９４５を有する粉末状ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株；
約２５〜９５重量パーセントの量の二糖類；
約０〜１０重量パーセントのオリゴ糖；および、
約０〜５０重量パーセントの多糖類、
を含む、プロバイオティック組成物。
【請求項２２】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９４５を有する前記粉末状ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株が、１グラム当たり約１０５〜１０１１ＣＦＵを持ち、且つ約３重量パーセントの量で存在する、請求項２１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項２３】
前記二糖類が、約６２重量パーセントの量で存在する、請求項２１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項２４】
前記オリゴ糖が、約５重量パーセントの量で存在する、請求項２１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項２５】
前記多糖類が、約３０重量パーセントの量で存在する、請求項２１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項２６】
前記二糖類がトレハロースであり、前記オリゴ糖がフルクトオリゴ糖であり、前記多糖類が麦芽デキストリンである、請求項２１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項２７】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９４５を有し且つ１グラム当たり約１０５〜１０１１ＣＦＵを有する、約３重量パーセントの粉末状ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株；
約６２重量パーセントのトレハロース；
約５重量パーセントのフルクトオリゴ糖；および、
約３０重量パーセントの麦芽デキストリン；
を含む、プロバイオティック組成物。
【請求項２８】
請求項１、１１、１２、１３、２０または２６のいずれか一項による有効量のプロバイオティック組成物を、それを必要とする動物に投与することを含む、動物における腸管病原体による疾患を抑制する方法。
【請求項２９】
前記腸管病原体が、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、サ
ルモネラ−エンテリティディス、エルシナ−シュードツベルクローシスおよびリステリア−モノサイトゲネスからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記動物が、哺乳動物、魚類、鳥類および爬虫類からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物が、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ブタおよびウシからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、ウズラ、インコおよびオウムからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記投与する工程が、さらに、ゼラチンカプセル、圧縮錠剤、ジェルカプセル、動物飼料および液体飲料からなる群より選択されたプロバイオティック組成物を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項１】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９４５を有するラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を含んでなるプロバイオティック組成物であって、前記ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株が実質的に純粋な培養物から由来するものであるプロバイオティック組成物。
【請求項２】
炭水化物、ポリペプチド、脂質、植物性化学物質、および、それらの組み合わせからなる群より選択された不活性成分または活性成分をさらに含む、請求項１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項３】
前記炭水化物が、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項４】
前記炭水化物が、トレハロース、マルトース、スクロース、デキストロース、ラクトース、イヌリン、リボース、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項５】
前記二糖類がトレハロース二水和物である、請求項３に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項６】
前記オリゴ糖は、フルクトオリゴ糖である、請求項３に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項７】
前記多糖類が麦芽デキストリンである、請求項３に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、ホエータンパク質、卵アルブミン、ゼラチン、乳タンパク質、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項９】
前記脂質は、大豆油、オリーブ油、パーム核油、落花生油、クルミ油、菜種油、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１０】
前記植物性化学物質は、ポリフェノール類、サポニン類、フラボノイド類、モノテルペン類、硫化アリル類、リコペン類、カロチノイド類、ポリアセチレン、シリマリン、グリシルリジンカテキン類、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１１】
さらにトレハロースを含む、請求項１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１２】
さらに麦芽デキストリンを含む、請求項１１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１３】
さらにフルクトオリゴ糖を含む、請求項１１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１４】
前記ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株が、１グラム当たり約１０５〜１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）の量で存在する、請求項１３に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１５】
前記プロバイオティック組成物が、動物に投与される巨丸剤、ゲルまたは液体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１６】
前記動物が、哺乳動物、魚類、鳥類および爬虫類からなる群より選択される、請求項１５に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１７】
前記哺乳動物が、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ブタおよびウシからなる群より選択される、請求項１６に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１８】
前記鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、ウズラ、インコおよびオウムからなる群より選択される、請求項１６に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１９】
前記巨丸剤が、ゼラチンカプセル、圧縮錠剤およびジェルカプセルからなる群より選択される、請求項１５に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項２０】
前記巨丸剤が、ポリマーで内張りした箔膜小包にパッケージングされる、請求項１９に記載のプロバイオティック。
【請求項２１】
約１〜５重量パーセントの量のＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９４５を有する粉末状ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株；
約２５〜９５重量パーセントの量の二糖類；
約０〜１０重量パーセントのオリゴ糖；および、
約０〜５０重量パーセントの多糖類、
を含む、プロバイオティック組成物。
【請求項２２】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９４５を有する前記粉末状ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株が、１グラム当たり約１０５〜１０１１ＣＦＵを持ち、且つ約３重量パーセントの量で存在する、請求項２１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項２３】
前記二糖類が、約６２重量パーセントの量で存在する、請求項２１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項２４】
前記オリゴ糖が、約５重量パーセントの量で存在する、請求項２１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項２５】
前記多糖類が、約３０重量パーセントの量で存在する、請求項２１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項２６】
前記二糖類がトレハロースであり、前記オリゴ糖がフルクトオリゴ糖であり、前記多糖類が麦芽デキストリンである、請求項２１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項２７】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９４５を有し且つ１グラム当たり約１０５〜１０１１ＣＦＵを有する、約３重量パーセントの粉末状ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株；
約６２重量パーセントのトレハロース；
約５重量パーセントのフルクトオリゴ糖；および、
約３０重量パーセントの麦芽デキストリン；
を含む、プロバイオティック組成物。
【請求項２８】
請求項１、１１、１２、１３、２０または２６のいずれか一項による有効量のプロバイオティック組成物を、それを必要とする動物に投与することを含む、動物における腸管病原体による疾患を抑制する方法。
【請求項２９】
前記腸管病原体が、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、サ
ルモネラ−エンテリティディス、エルシナ−シュードツベルクローシスおよびリステリア−モノサイトゲネスからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記動物が、哺乳動物、魚類、鳥類および爬虫類からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物が、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ブタおよびウシからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、ウズラ、インコおよびオウムからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記投与する工程が、さらに、ゼラチンカプセル、圧縮錠剤、ジェルカプセル、動物飼料および液体飲料からなる群より選択されたプロバイオティック組成物を含む、請求項２８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１９５７７８（Ｐ２０１０−１９５７７８Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２９９７４（Ｐ２０１０−２９９７４）
【出願日】平成２２年２月１５日（２０１０．２．１５）
【分割の表示】特願２００２−５５９０４６（Ｐ２００２−５５９０４６）の分割
【原出願日】平成１３年１２月１７日（２００１．１２．１７）
【出願人】（５０５１１３０１２）プロバイオヘルス・エルエルシー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１５日（２０１０．２．１５）
【分割の表示】特願２００２−５５９０４６（Ｐ２００２−５５９０４６）の分割
【原出願日】平成１３年１２月１７日（２００１．１２．１７）
【出願人】（５０５１１３０１２）プロバイオヘルス・エルエルシー (2)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]