ラクトフェリン徐放製剤の製造法
【課題】経口摂取で生理活性の発現を可能にするラクトフェリンの徐放性微粒子の製造法 開発。
【解決手段】ラクトフェリンを酸性ポリマー、例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液に溶かし、セスキオレイン酸ソルビタンを含有する流動パラフィンに注入して乾燥法でラクトフェリンとアルギン酸ナトリウムから構成される微粒子を調整し、次いで、塩化カルシウム溶液を加えて、ラクトフェリンとアルギン酸カルシウムからなる微粒子に転換させる。このラクトフェリンとアルギン酸カルシウムから構成される微粒子に塩基性ポリマー、例えば、キトサン水溶液を添加してポリマーブレンドを行い、ラクトフェリン、アルギン酸カルシウム、キトサンからなるポリマーアロイを形成させる。このポリマーアロイは、水に浸漬するとラクトフェリンを数時間から１日かけて徐々に放出する性質を有する。
【解決手段】ラクトフェリンを酸性ポリマー、例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液に溶かし、セスキオレイン酸ソルビタンを含有する流動パラフィンに注入して乾燥法でラクトフェリンとアルギン酸ナトリウムから構成される微粒子を調整し、次いで、塩化カルシウム溶液を加えて、ラクトフェリンとアルギン酸カルシウムからなる微粒子に転換させる。このラクトフェリンとアルギン酸カルシウムから構成される微粒子に塩基性ポリマー、例えば、キトサン水溶液を添加してポリマーブレンドを行い、ラクトフェリン、アルギン酸カルシウム、キトサンからなるポリマーアロイを形成させる。このポリマーアロイは、水に浸漬するとラクトフェリンを数時間から１日かけて徐々に放出する性質を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はラクトフェリン徐放製剤の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ラクトフェリン（ＬＦ）は、抗菌（非特許文献１）、抗癌（特許文献１）、抗ウイルス（非特許文献２）等の作用を示し、抗炎症作用（非特許文献３）や免疫調節作用（非特許文献４）等の多機能を有する鉄結合性糖蛋白質（非特許文献５）である。例えば、米国テキサス州ヒューストンのＡｇｅｎｎｉｘ社は人のＬＦ遺伝子を組替えた麹カビが産生するヒト遺伝子組替ＬＦを米食品医薬品局（ＦＤＡ）の監督下に非小細胞肺癌（非特許文献６）及び腎細胞癌（非特許文献7）の治療薬として開発している。第二相二重盲検試験で有用性が証明された前者は既に第三相試験に入り、腎細胞癌に著効を示す後者は、ＦＤＡが優先審査品目に指定した。しかしながら、ＬＦは食品に混入、あるいは錠剤として経口摂取すると、胃内で蛋白分解酵素による分解を受けやすいことや、小腸粘膜に存在する受容体近傍における滞留性や送達性に乏しいので、期待される効能・効果が発現し難いことが広汎な実用化を阻んでいた。経口投与した際、ＬＦが胃で蛋白質分解酵素により分解されることなく、吸収部位である小腸に到達し、効能・効果を発現させるための新しい方法が渇望されていたのである。
【０００３】
経口的に摂取したＬＦが効率よく小腸に到達し、効能・効果を発揮する製剤が幾つか知られている（特許文献１−３）。例えば、リポソーム化したＬＦを経口摂取すると、白血球の１型インターフェロン産生能を有意に増強することが報告されている（非特許文献８）。この臨床試験は、牛乳から抽出したウシ・ＬＦをリポソームに包埋して製剤化した腸溶錠と、リポソーム化していないウシ・ＬＦ錠剤を１０人の健常男性のボランティアがクロスオーバー二重盲検試験方式で摂取して実施された。ウシ・ＬＦの一日あたりの投与量は３１９ｍｇ、投与期間は４週間とし、投与終了３週間を無投与期間として、さらに無投与の３週が終わると、初めに摂取したのと別のＬＦ製剤を４週間摂取した。この試験で両ＬＦ製剤を摂取したボランティアは、血清生化学、血球検査、尿検査、バイタルサインおよび自覚・他覚症状に何らの異常も示さなかった。
【０００４】
特筆すべきは、典型的な腸溶製剤であるリポソーム化ＬＦを摂取した場合に限り、白血球の１型インターフェロン産生能が摂取前と比べ１週間後で２倍強、４週後で３倍弱と大きく有意に上昇したことである。それに対し、単にＬＦを錠剤化して摂取しても、１週後、４週後における白血球の１型インターフェロン産生能は、投与前の水準と比べ有意に変動しなかった。この研究は、ＬＦが胃で分解されず小腸に到達すれば、感染防御の最前線に位置する１型インターフェロンの産生を増大させ、ウイルス感染の拡大を阻止できる可能性を示唆したことで注目される。
【０００５】
１型インターフェロン（IFN）は、ウイルスに感染した宿主が、感染局所に産生する最強で非特異的な防御因子であり、産生する細胞によりインターフェロンα及びβに分かれる。プラズマ細胞由来の樹上細胞（PDC）が産生する前者は、ウイルス感染に応答した宿主が感染局所に産生する主要な防御たんぱく質である。ＰＤＣは１型インターフェロンの産生に特化した細胞で、ウイルス感染を感知し感染局所に駆けつけたＰＤＣが産生する１型インターフェロンは、感染に対する生体防御の最前線である「自然免疫」で重要な役割を果たしているのである。その産生能が増大すると、ウイルスが感染しても感染を局所に限局させ、全身的な感染症を阻止できると考えられている（非特許文献９および１０）。１型インターフェロンは、いち早く感染細胞に作用して細胞内部で起こるウイルスの増殖を抑制し、宿主が十分な免疫応答を作動できるように時間的余裕を与えているのである。
【０００６】
ＬＦの腸溶製剤と非腸溶製剤とのあいだの薬効差をしらべた例としては口臭に対する二重盲検試験がある（非特許文献１１）。この試験は歯科医院に通院中のボランティア１４名が参加し、ＬＦの投与量を一日あたり３００ｍｇとして、参加者は無作為に二群に分け、腸溶性ないし非腸溶製剤のいずれかを４週間連続して摂取した。呼気はＬＦ摂取を開始する直前と４週後の２回、早朝起床時にシリンジに採取し、呼気に含まれる硫化水素、メチルメルカプタン、ジメチルサルファイドをガスクロマトグラフィーで測定した。これら三つの揮発性硫黄化合物は、口腔内で発生する口臭の主要な原因物質である。この二重盲検試験においても、腸溶製剤は呼気に含まれる揮発性硫黄化合物濃度を低下させたが、同量の非腸溶製剤は低下させなかった。
【０００７】
さらに動物実験でもスペインのマルチネス・ゴミス等はＬＦをリポソームで被覆すると、ＬＦの免疫賦活効果が発現するが、胃で分解されるＬＦ水溶液を与えると効果が発現しないことを報告している。彼等は、ラットに齲蝕歯の原因となる病原性連鎖球菌、Streptococcus sobrinus ATCC 33478を感染させ、４２日間経過を観察した。この間、３５日にわたり飲料水にリポソーム化ＬＦ、あるいはＬＦを飲料水に溶かして与えたところ、齲蝕歯の発生頻度はリポソーム化ＬＦを与えた群が、ＬＦを溶かして与えた群より有意に少なかった(非特許文献１２)。
【０００８】
これらの例が明らかなように、ＬＦを経口摂取して効能・効果を発揮させるためには、ＬＦ溶液が胃に長時間滞留すること、酸性で作用する蛋白質分解酵素、ペプシンと接触することを避けなければならない。吸収部位である小腸下部に丸ごとの分子として到達することが必須だからである。特に、食物と混合、胃で食物を消化している際にＬＦを摂取すると、急速なＬＦの加水分解が起こる(非特許文献１３)。ペプシンにより加水分解されたＬＦのペプチド断片が効能・効果を発揮すると云う仮説が提唱されているが、それは二重の意味でありえない。一つは胃のｐＨが高いためＬＦが分解されない乳児期には、母乳由来のＬＦは腸管から吸収され，多量の尿中に排泄されること、すなわち、乳児は丸ごとのＬＦを摂取していること、胃で分解されて生じたペプチドは、仮に強い生理活性があったところで、十二指腸に流下すると腸液に含まれるペプチダーゼにより非常に急速にアミノ酸、ジペプチドのような生理活性がない小分子に分解されるからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許公開２００８−４４８７９号公報
【特許文献２】ＷＯ２００５／０２５６０９号公報
【特許文献３】ＷＯ２００６／０１６５９５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】宮崎修一等著 Chemotherapy. (1991); 39: 829-835.
【非特許文献２】Tsuda H et al. Drug Metab Pharmacokinet. 2004; 19: 245-63.
【非特許文献３】Hayashida K et al. J Vet Med Sci. 2004; 66: 149-54
【非特許文献４】Zimecki M et al. Postepy HigMed Dosw. 2007; 61: 283-7.
【非特許文献５】Baker EN & Baker HM. Biochimie. 2009; 91: 3-10.
【非特許文献６】West HJ. Clin Lung Cancer. 2009; 10 Suppl1: S41-6.
【非特許文献７】Jonasch E et al. Cancer. 2008; 113: 72-77
【非特許文献８】Ishikado A et al. Biofactors. 2004;21: 69-72.
【非特許文献９】Colina R et al. Nature. 2008; 452: 323-8
【非特許文献１０】Watarai H et al. PNAS. 2008; 105: 2993-2998.
【非特許文献１１】清水友等著 ラクトフェリン2007 (2007); 215-219.
【非特許文献１２】Martinez-Gomis J et al. Arch Oral Biol. 1999; 44: 901-6.
【非特許文献３】安藤邦雄著 JMS(医療・福祉の総合雑誌)、2008 9月号; 84-87.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、ＬＦに特有の効能・効果を発揮させるため、経口摂取したＬＦ製剤が胃において加水分解されず、丸ごとの分子として小腸に到達して効率よく体内に吸収される新しい製剤を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明が使用するＬＦは、市販のＬＦ、哺乳類（例えば人、牛、羊、山羊、馬等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）により分離したＬＦ、それらを塩酸、クエン酸等により脱鉄したアポＬＦ、それらを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせた金属飽和ＬＦ、あるいはそれらの混合物である（以下、これらをまとめてＬＦと記載する）。さらに、遺伝子組替技術によりカビおよび酵母の遺伝子組替体が産生するＬＦ、およびトランスジェニック動物が泌乳する乳汁から抽出したＬＦを含む。
【００１３】
近年、製剤枝術の進歩と発展に伴い、多くの薬物を対象に徐放化が試みられている。徐放性製剤は通常の速放性製剤に比べ、投与回数を減少ざせ、薬効を持続させ、副作用または毒性の発現を低減させることができる等、有効性、安全性上の利点が多い。一方、徐放性に製剤化した実例は、ほとんどが低分子化合物であるため、ＬＦのように分子量が８万ダルトンの高分子を徐放性微粒子として高収量で製剤化できるかどうかは不明であった。
【００１４】
本発明者等は液中乾燥法によりＬＦをアルギン酸カルシウムゲルに封じ込めた後、アルギン酸をキトサンとポリマーブレンドすることによりＬＦを含有する徐放性微粒子の製造法開発を試みた。二つのポリマーのうちで一方をクラスター状に分散させ、第二のポリマーの溶液に浸漬して均一相にする物理的なプロセスでポリマーアロイを作る技術をポリマーブレンドと呼ぶ。ポリマーブレンドは、単独のポリマーが持っていない性質を獲得する場合があるので有用である。本発明者等はアルギン酸とキトサンとで形成されるポリマーアロイがＬＦをゲル内に封じ込め、徐々にＬＦを放出することを発見した。製造条件を種々検討した結果、高い濃度でＬＦを含有する粒径が約１ミクロンの徐放性マイクロカプセルを高収率で製造する方法を確立して本発明を完成した。
【００１５】
方法の概略は次に説明するとおりである。流動パラフィンを分散媒に用いた液中乾燥によりアルギン酸,ラクトフェリン、塩化カルシウムが微粒子中にほぼ完全に回収され、ＬＦを含む球形粒子が得られた。
【００１６】
次に、ＬＦを含むアルギン酸カルシウムの球形粒子をキトサン溶液に浸漬処理するポリマーブレンド技術を用い、ＬＦを含有するポリマーアロイの微粒子粉末を得た。ポリマーブレンドの過程で、球形粒子に過剰に含まれた塩化カルシウムは速やかに酢酸水に洗い出され、その結果、粒子の球形が崩れ表面が不整形になった。
【００１７】
ＬＦがアルギン酸カルシウムのゲル・ネットワークに確り捕捉されていないと、ポリマーブレンド時に一部が粒子から流出して失われ、これがＬＦの回収率の低下につながると考えられる。このようにして、ＬＦを微粒子に封じ込めたキトサン・アルギン酸カルシウムのポリマーブアロイは、水に懸濁すると時間の経過とともに徐々にＬＦを放出する徐放性微粒子である。基本的な方法は図１に示すとおりである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＬＦを含有する微粒子は、日本薬局方に記載されている第１液あるいは第２液に浸漬すると、微粒子内に封じ込めたＬＦを２時間以上かけて徐々に放出する。したがって吸収部位である小腸下部まで多量のＬＦが到達するので、経口摂取するとＬＦ固有の効能・効果を確実に発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1はＬＦ含有微粒子の粒子形成法と構造を説明した。
【図２】図２はＡｌ／Ｃａ−ＭＰ及びＣｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰの操作型電子顕微鏡写真を示す。
【図３】図３はＡｌ／Ｃａ−ＭＰをキトサンとポリマーブレンドする前後における微粒子の性状を示す。
【図４】図４は日本薬局方第１５版記載の固形製剤の崩壊試験における第１液と第２液中でのＣｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰからのＬＦ−ＦＴＣの溶出状況を示す。
【図５】図５は日本薬局方第１５版記載の固形製剤の崩壊試験法においてＣｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰを最初に第１液に浸漬し、引き続いて第２液に浸漬した際のＬＦ−ＦＴＣの溶出状況を示す。
【図６】図６は日本薬局方第１５版記載の固形製剤の崩壊試験における第１液と第２液中にＡｌ／Ｃａ−ＭＰ、Ｃｈ０．５／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰを浸漬した液の蛍光発色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
既述のようにＬＦは、動物実験においては経口投与で多彩な生理活性を示す多機能蛋白質である。しかし、ヒトではＬＦの固形製剤、散剤あるいは顆粒製剤を経口投与しても、殆どの場合、有意な効能・効果を示さない。僅かに胃に感染したヘリコバクター・ピロリの除菌において三剤併用療法にＬＦを付加すると除菌率が向上することが報告されている。三剤併用療法には、強力に胃酸の分泌を抑制するプロトンポンプ阻害剤あるいはヒスタミン受容体２のブロッカーが含まれる。したがって、胃内のｐＨが高くＬＦは加水分解されずに吸収部位である小腸下部に到達し、体内に吸収されて免疫を賦活する。除菌率の向上はＬＦが小腸まで到達するためである。
【００２１】
本発明により製造されたＬＦの徐放性微粒子は、ヒト及び動物に投与するため、いろいろな形に製剤化することができる。使用目的に応じて各種の剤形を適宜選択可能であり、例えば、製剤として坐剤、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤等を例示することができる。
【００２２】
この発明の徐放性ＬＦ微粒子は、配合量を特に制限されず、疾患の種類、症状等により適宜選択できるが、望ましい含量は製剤１ｇ当たり０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲である。また、この発明の有効成分は、乳に由来する天然物であるから、それらの安全性について問題がないことは明らかである。
【実施例１】
【００２３】
ＬＦを定量的に検出するため、タンパク質の蛍光標識試薬フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した。ＬＦ１００ｍｇとタンパク質のＦＩＴＣ１０ｍｇをｐＨ８．４の０．１Ｍ炭酸緩衝液５ｍｌ中で４時間攪拌して反応させ、ゲルろ過を行い、さらに過剰のＦＩＴＣを透析して除去した液を凍結乾燥し、ＦＩＴＣ標識ＬＦ（ＬＦ−ＦＩＴＣ）を得た（収量 ８１ｍｇ）。以下の実施例は、ＬＦに代えてＬＦ-ＦＴＣを用いて行った。
【実施例２】
【００２４】
まず、ＬＦ−ＦＴＣを含有するアルギン酸とカルシウムの微粒子を調製するために、アルギン酸ソーダ(Ａｌ−Ｎａ)、 ＬＦ−ＦＴＣ、 塩化カルシウム(ＣａＣｌ2)の組成で、液中乾燥法による微粒子化を試みた。Ａｌ−Ｎａ１５０ｍｇを含有する水溶液１０ｍｌとＬＦ−ＦＴＣ１８ｍｇの水溶液５ｍｌを混合し、１％（Ｗ／Ｖ）のセスキオレイン酸ソルビタン含有流動パラフィン中に添加し、室温、攪拌速度１０００ｒｐｍで1時間攪拌した。その後、ＣａＣｌ2を３００ｍｇ含有する水溶液３ｍｌを添加し、１５分間攪拌行った。次に浴温３７ ℃で減圧濃縮して水分を除去して微粒子を形成させた。減圧乾燥した後、粉末に等量のn-ヘキサンを加えて混和し、遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物は、n-ヘキサンで3回洗浄し、デシケーター中で乾燥することにより、ＬＦ−ＦＴＣ含有アルギン酸カルシウム微粒子（Ａｌ／Ｃａ−ＭＰ）を得た（収量４３９ｍｇ）。
【実施例３】
【００２５】
Ａｌ／Ｃａ−ＭＰのＬＦ−ＦＴＣの含量は、一定量の粒子を最初に日本薬局方第１液中で攪拌し、次に遠心分離し、沈殿を日本薬局方第２液に懸濁した。微粒子を懸濁した第１液及び第２液上清の吸光度を測定することにより、溶存するＬＦ−ＦＴＣ量を求め、粒子中のＬＦ−ＦＴＣの含有率を算出した。また、走査型電子顕微鏡を用いて緑色微粒子の直径を測定し、粒度分布、平均粒子径を求めた。その結果、微粒子に含まれるＬＦ−ＦＴＣは２．６％(Ｗ／Ｗ)、微粒子中に回収されたＬＦ−ＦＴＣは６４％、粒子の直径は１．４５±０．３０μｍ(平均値±標準誤差)であった。なおＡｌ／Ｃａ−ＭＰは、第１液及び第２液に懸濁すると速やかにＬＦ−ＦＴＣを放出するので徐放性ではない。
【００２６】
そこでキトサンとポリマーブレンドを行い、Ａｌ、ＬＦとＣｈで形成されるポリマーアロイをつくり、その微粒子について徐放性を検討した。まず、Ａｌ／Ｃａ−ＭＰ、５０ｍｇを０．２５，０．５及び１．０％（Ｗ／Ｖ）のキトサンを溶解した１％（Ｖ／Ｖ）酢酸水溶液２０ｍｌに懸濁し、１時間攪拌した。その後、遠心分離を行い、沈殿物を水２０ｍｌで２回洗浄し、得られた沈殿物をデシケーター中で乾燥してキトサンをブレンドした微粒子（Ｃｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰ）を得た。収量はキトサン０．２５％の場合１３．３ｍｇ、同０．５％で１４．４ｍｇ、同１％で１８．５ｍｇであった。
得られた粒中の薬物含有率は、調製時の初期含有量から、洗浄によって液中に失われた薬物量を差し引くことで求めた。最初の1 %キトサン処理後に上清中のＬＦ−ＦＴＣ、水で洗浄後の洗液中のＬＦ−ＦＴＣを吸光光度法によって求め、これらの和をＡｌ／Ｃａ−ＭＰ中のＬＦ−ＦＴＣ量から差し引くことで、得れた粒子中に残存したLF-FTC量を算出し、粒子あたりのＬＦ−ＦＴＣ含有率として表示した。表２に得られた微粒子の諸性質を示した。
【００２７】
【表１】
【実施例４】
【００２８】
（Al/Ca-MPおよびCh/Al/Ca-MPの走査型電子顕微鏡写真）図２は、Ｃｈブレンド前のAlとCaの複合体粒子及びキトサン溶液を用いてポリマーブレンドした微粒子の走査型電子顕微鏡写真を示す。微粒子は、ほぼ球形であるが、キトサン溶液処理で表面が皺状になった。とくに、Ｃｈ，０．２５％処理で表面がもっとも不整状態になった。粒子径は約1 μｍで大きさのほぼそろった微粒子が得られた。
【００２９】
Ａｌ／Ｃａ−ＭＰにキトサンをブレンドする際におけるキトサン濃度、粒子径、収率、薬物含有率への影響を検討した。キトサンでポリマーブレンドするとわずかに粒子径は縮小するが、キトサンの濃度を上昇させると粒子径が徐々に増大した。キトサンのブレンドで、粒子重量は２５％−３５％減少した。これは、過剰のＣａＣｌ2を含んだＡｌ／Ｃａ−ＭＰが、キトサン溶液処理によりＣａＣｌ2が粒子から溶出し失われたためと考えられた。また、キトサン濃度上昇で重量が増加するのは、キトサンのポリマーブレンド量が増加したためと考えられる。一方、微粒子のＬＦ−ＦＴＣ回収率は、キトサンでポリマーブレンドしても高く維持される。０．２５％Ｃｈでは、約９０％が粒子中に回収され、ＬＦ−ＦＴＣはポリマーアロイ中によく保持されている。Ｃｈ濃度の上昇にともないＬＦ−ＦＴＣの回収が低下するのは、ブレンドした塩基性Ｃｈの増加により塩基性蛋白であるＬＦとＡｌの相互作用を断ち切られ、遊離したＬＦ−ＦＴＣが溶け出して失われたためである。ポリマーブレンド以前のＬＦ−ＦＴＣ含有率は、微粒子に過剰のＣａＣｌ2が残留しているため、かなり低い値であった。しかし、キトサン溶液処理で、過剰のＣａＣｌ2が洗い出されると、ＬＦ−ＦＴＣの含有率は上昇した。Ｃｈの濃度上昇により、ＬＦ−ＦＴＣ含有率の低下が見られた。図３はそれぞれのデータを示す。
【００３０】
（粒子形成と粒子構造に関する考察）以上に述べたＡｌ／Ｃａ−ＭＰおよびＣｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰの収量、ＬＦ−ＦＴＣの回収率、含有率、粒子形状、粒子径から、粒子形成や粒子の構造に関して、以下のように考察した。流動パラフィンを分散媒に用いた液中乾燥では、水溶液として用いたＡｌとＣａがほぼ完全に回収され、Ａｌ／Ｃａ−ＭＰが球形粒子として得られる。次に、キトサン溶液を用いてポリマーブレンドすると、過剰に添加されたＣａＣｌ2が速やかに粒子から洗い出される。 ＣａＣｌ2の洗い出しによって、粒子の球形は崩れ表面が不整形になる。微粒子のアルギン酸のネットワークに捕捉が不充分なＬＦ−ＦＴＣは、Ｃｈとのポリマーアロイ形成時に一部放出される形で失われ、これがＬＦ−ＦＴＣの回収率の低下につながる。以上をまとめたものが図４である。
【実施例５】
【００３１】
Ｃｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰからのＬＦ−ＦＴＣの放出を日局第1液、第2液を用いて調べた。日局第1液、第2液中に粒子を0.6 ｍｇ/ｍｌの濃度になるように懸濁し、３７℃、 １００ｒｐｍで水平に振とうしてインキュベーションを行った。いずれの粒子もＬＦ−ＦＴＣを徐々に放出したが、Ｃｈ濃度０．２５％＞Ｃｈ濃度０．５％＞Ｃｈ濃度１．０％の順に放出は抑制された。また、第１液と比べ第2液において放出は抑制される傾向があった。徐放性経口製剤としての観点からは、 Ｃｈ濃度を０．２５％−０．５０％でポリマーブレンドした微粒子が徐放性に優れていることが示唆された。
【００３２】
日局第1液から第2液に粒子を移した際の放出と粒子状態を観察した。この実験では、粒子（０．６ｍｇ／ｍｌ）を、最初の1時間第1液中でインキュベート（３７ ℃）、 １００ｒｐｍで遠心分離した後、沈殿粒子に第２液を添加してインキュベートを継続して放出性を調べた。放出パターンは、前の図で述べた第1液、第２液中で別々に行った時の放出パターンとほぼ同様であった。第1液中では、粒子はあまり膨潤することなく分散性よく懸濁していたが、第2液中では、膨潤し幾分柔らかい状態になって分散することが見出された。第2液中で4時間インキュベートした後、遠心分離し、沈殿を乾燥してSEM画像を観測したが、図５に示すように膨潤した粒子が絡み合った像が観測された。
【実施例６】
【００３３】
日本薬局方第1液、第２液中におけるＡｌ／Ｃａ−ＭＰとＣｈ０．５／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰの粒子状態の観察した。 Ａｌ／Ｃａ−ＭＰは、第1液中で分散性よく懸濁したが、第2液中では全体に膨潤してゾル状に広がる様子が見られた。Ｃｈ０．５／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰは、前の図でも述べたように、第1液中では、あまり膨潤することなく分散性よく懸濁したが、第2液中では、膨潤し幾分柔らかい状態になって分散することが見出された。Ｃｈ０．５／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰを第1液中で３時間インキュベートし、遠心分離後に沈殿粒子に第2液に加えて3時間インキュベートしたときの蛍光画像を示す。前の図で示したのと同様に、第1液中では、分散性のいい懸濁液で、第２液中では、粒子は膨潤、軟化した様子が見られた。蛍光顕微鏡下で撮影した写真を図６に示す。
以上より、Ｃｈ０．５／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰは、胃及び腸管内で粒子状態を維持し、ＬＦを1日から数日にわたって放出する微粒子剤形として機能することが示唆された。
【実施例７】
【００３４】
ＬＦ１８ｇを５リットルの水に溶かした水溶液と１．５％アルギン酸ナトリウム水溶液10リットルに溶かした水溶液を混合し、1 % (w/v)セスキオレイン酸ソルビタン含有流動パラフィン中５０リットルに滴下し、全量を滴下し終えたら激しく1時間攪拌した。その後、塩化カルシウムを３０ｇ含有する水溶液3リットルを添加し、15分間攪拌した。次に減圧下で水分を蒸発させて除去し、水分を除去して微粒子を形成させた。減圧乾燥した後、等量のn-ヘキサンを加えて混和し遠心分離して、流動パラフィンを除去した沈殿物を得た。沈殿物は、n-ヘキサンで3回洗浄し、真空乾燥することにより、微粒子のＬＦ含有アルギン酸カルシウム・ゲルの微粒子８１ｇを得た。この微粒子に捕捉されたＬＦは、１６．６ｇで収率は９２％であった。
【００３５】
次にキトサンとポリマーブレンドを行い、Ａｌ、ＬＦとキトサンで構成されるポリマーアロイを調製した。まず、Ａｌ／Ｃａ−ＭＰ、１００ｇを０．２５％（Ｗ／Ｖ）のキトサンを溶解した１％（Ｖ／Ｖ）酢酸水溶液４０ｌに懸濁し、１時間攪拌した。その後、遠心分離を行い、沈殿物を水２０ｍｌで２回洗浄した。得られた沈殿物をデシケーター中で乾燥してキトサンをブレンドした微粒子（Ｃｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰ）を得た。収量は２９ｇであった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のＬＦを含有する徐放性微粒子は、経口摂取しても大部分のＬＦが胃内でペプシンにより消化されるのを避け、ＬＦを小腸に到達させることができる。したがってＬＦの経口摂取用の製剤として好適である。本微粒子は食品及び医薬品に有効成分として添加し、ＬＦがもっている多彩な生理活性を発揮させることができる。徐放性微粒子化することにより、ＬＦの安全性を損なうことはまったくない。
【符号の説明】
【００３７】
１ ＬＦ;ラクトフェリン
２ ＬＦ-ＦＴＣ；蛋白質標識試薬フルオレセインイソチオシアネートを結合したＬＦ
３ Ａｌ-Ｎａ；アルギン酸ナトリウム塩
４ ＣａＣｌ２；塩化カルシウム
５ Ｃｈ；キトサン
【技術分野】
【０００１】
本発明はラクトフェリン徐放製剤の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ラクトフェリン（ＬＦ）は、抗菌（非特許文献１）、抗癌（特許文献１）、抗ウイルス（非特許文献２）等の作用を示し、抗炎症作用（非特許文献３）や免疫調節作用（非特許文献４）等の多機能を有する鉄結合性糖蛋白質（非特許文献５）である。例えば、米国テキサス州ヒューストンのＡｇｅｎｎｉｘ社は人のＬＦ遺伝子を組替えた麹カビが産生するヒト遺伝子組替ＬＦを米食品医薬品局（ＦＤＡ）の監督下に非小細胞肺癌（非特許文献６）及び腎細胞癌（非特許文献7）の治療薬として開発している。第二相二重盲検試験で有用性が証明された前者は既に第三相試験に入り、腎細胞癌に著効を示す後者は、ＦＤＡが優先審査品目に指定した。しかしながら、ＬＦは食品に混入、あるいは錠剤として経口摂取すると、胃内で蛋白分解酵素による分解を受けやすいことや、小腸粘膜に存在する受容体近傍における滞留性や送達性に乏しいので、期待される効能・効果が発現し難いことが広汎な実用化を阻んでいた。経口投与した際、ＬＦが胃で蛋白質分解酵素により分解されることなく、吸収部位である小腸に到達し、効能・効果を発現させるための新しい方法が渇望されていたのである。
【０００３】
経口的に摂取したＬＦが効率よく小腸に到達し、効能・効果を発揮する製剤が幾つか知られている（特許文献１−３）。例えば、リポソーム化したＬＦを経口摂取すると、白血球の１型インターフェロン産生能を有意に増強することが報告されている（非特許文献８）。この臨床試験は、牛乳から抽出したウシ・ＬＦをリポソームに包埋して製剤化した腸溶錠と、リポソーム化していないウシ・ＬＦ錠剤を１０人の健常男性のボランティアがクロスオーバー二重盲検試験方式で摂取して実施された。ウシ・ＬＦの一日あたりの投与量は３１９ｍｇ、投与期間は４週間とし、投与終了３週間を無投与期間として、さらに無投与の３週が終わると、初めに摂取したのと別のＬＦ製剤を４週間摂取した。この試験で両ＬＦ製剤を摂取したボランティアは、血清生化学、血球検査、尿検査、バイタルサインおよび自覚・他覚症状に何らの異常も示さなかった。
【０００４】
特筆すべきは、典型的な腸溶製剤であるリポソーム化ＬＦを摂取した場合に限り、白血球の１型インターフェロン産生能が摂取前と比べ１週間後で２倍強、４週後で３倍弱と大きく有意に上昇したことである。それに対し、単にＬＦを錠剤化して摂取しても、１週後、４週後における白血球の１型インターフェロン産生能は、投与前の水準と比べ有意に変動しなかった。この研究は、ＬＦが胃で分解されず小腸に到達すれば、感染防御の最前線に位置する１型インターフェロンの産生を増大させ、ウイルス感染の拡大を阻止できる可能性を示唆したことで注目される。
【０００５】
１型インターフェロン（IFN）は、ウイルスに感染した宿主が、感染局所に産生する最強で非特異的な防御因子であり、産生する細胞によりインターフェロンα及びβに分かれる。プラズマ細胞由来の樹上細胞（PDC）が産生する前者は、ウイルス感染に応答した宿主が感染局所に産生する主要な防御たんぱく質である。ＰＤＣは１型インターフェロンの産生に特化した細胞で、ウイルス感染を感知し感染局所に駆けつけたＰＤＣが産生する１型インターフェロンは、感染に対する生体防御の最前線である「自然免疫」で重要な役割を果たしているのである。その産生能が増大すると、ウイルスが感染しても感染を局所に限局させ、全身的な感染症を阻止できると考えられている（非特許文献９および１０）。１型インターフェロンは、いち早く感染細胞に作用して細胞内部で起こるウイルスの増殖を抑制し、宿主が十分な免疫応答を作動できるように時間的余裕を与えているのである。
【０００６】
ＬＦの腸溶製剤と非腸溶製剤とのあいだの薬効差をしらべた例としては口臭に対する二重盲検試験がある（非特許文献１１）。この試験は歯科医院に通院中のボランティア１４名が参加し、ＬＦの投与量を一日あたり３００ｍｇとして、参加者は無作為に二群に分け、腸溶性ないし非腸溶製剤のいずれかを４週間連続して摂取した。呼気はＬＦ摂取を開始する直前と４週後の２回、早朝起床時にシリンジに採取し、呼気に含まれる硫化水素、メチルメルカプタン、ジメチルサルファイドをガスクロマトグラフィーで測定した。これら三つの揮発性硫黄化合物は、口腔内で発生する口臭の主要な原因物質である。この二重盲検試験においても、腸溶製剤は呼気に含まれる揮発性硫黄化合物濃度を低下させたが、同量の非腸溶製剤は低下させなかった。
【０００７】
さらに動物実験でもスペインのマルチネス・ゴミス等はＬＦをリポソームで被覆すると、ＬＦの免疫賦活効果が発現するが、胃で分解されるＬＦ水溶液を与えると効果が発現しないことを報告している。彼等は、ラットに齲蝕歯の原因となる病原性連鎖球菌、Streptococcus sobrinus ATCC 33478を感染させ、４２日間経過を観察した。この間、３５日にわたり飲料水にリポソーム化ＬＦ、あるいはＬＦを飲料水に溶かして与えたところ、齲蝕歯の発生頻度はリポソーム化ＬＦを与えた群が、ＬＦを溶かして与えた群より有意に少なかった(非特許文献１２)。
【０００８】
これらの例が明らかなように、ＬＦを経口摂取して効能・効果を発揮させるためには、ＬＦ溶液が胃に長時間滞留すること、酸性で作用する蛋白質分解酵素、ペプシンと接触することを避けなければならない。吸収部位である小腸下部に丸ごとの分子として到達することが必須だからである。特に、食物と混合、胃で食物を消化している際にＬＦを摂取すると、急速なＬＦの加水分解が起こる(非特許文献１３)。ペプシンにより加水分解されたＬＦのペプチド断片が効能・効果を発揮すると云う仮説が提唱されているが、それは二重の意味でありえない。一つは胃のｐＨが高いためＬＦが分解されない乳児期には、母乳由来のＬＦは腸管から吸収され，多量の尿中に排泄されること、すなわち、乳児は丸ごとのＬＦを摂取していること、胃で分解されて生じたペプチドは、仮に強い生理活性があったところで、十二指腸に流下すると腸液に含まれるペプチダーゼにより非常に急速にアミノ酸、ジペプチドのような生理活性がない小分子に分解されるからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許公開２００８−４４８７９号公報
【特許文献２】ＷＯ２００５／０２５６０９号公報
【特許文献３】ＷＯ２００６／０１６５９５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】宮崎修一等著 Chemotherapy. (1991); 39: 829-835.
【非特許文献２】Tsuda H et al. Drug Metab Pharmacokinet. 2004; 19: 245-63.
【非特許文献３】Hayashida K et al. J Vet Med Sci. 2004; 66: 149-54
【非特許文献４】Zimecki M et al. Postepy HigMed Dosw. 2007; 61: 283-7.
【非特許文献５】Baker EN & Baker HM. Biochimie. 2009; 91: 3-10.
【非特許文献６】West HJ. Clin Lung Cancer. 2009; 10 Suppl1: S41-6.
【非特許文献７】Jonasch E et al. Cancer. 2008; 113: 72-77
【非特許文献８】Ishikado A et al. Biofactors. 2004;21: 69-72.
【非特許文献９】Colina R et al. Nature. 2008; 452: 323-8
【非特許文献１０】Watarai H et al. PNAS. 2008; 105: 2993-2998.
【非特許文献１１】清水友等著 ラクトフェリン2007 (2007); 215-219.
【非特許文献１２】Martinez-Gomis J et al. Arch Oral Biol. 1999; 44: 901-6.
【非特許文献３】安藤邦雄著 JMS(医療・福祉の総合雑誌)、2008 9月号; 84-87.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、ＬＦに特有の効能・効果を発揮させるため、経口摂取したＬＦ製剤が胃において加水分解されず、丸ごとの分子として小腸に到達して効率よく体内に吸収される新しい製剤を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明が使用するＬＦは、市販のＬＦ、哺乳類（例えば人、牛、羊、山羊、馬等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）により分離したＬＦ、それらを塩酸、クエン酸等により脱鉄したアポＬＦ、それらを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせた金属飽和ＬＦ、あるいはそれらの混合物である（以下、これらをまとめてＬＦと記載する）。さらに、遺伝子組替技術によりカビおよび酵母の遺伝子組替体が産生するＬＦ、およびトランスジェニック動物が泌乳する乳汁から抽出したＬＦを含む。
【００１３】
近年、製剤枝術の進歩と発展に伴い、多くの薬物を対象に徐放化が試みられている。徐放性製剤は通常の速放性製剤に比べ、投与回数を減少ざせ、薬効を持続させ、副作用または毒性の発現を低減させることができる等、有効性、安全性上の利点が多い。一方、徐放性に製剤化した実例は、ほとんどが低分子化合物であるため、ＬＦのように分子量が８万ダルトンの高分子を徐放性微粒子として高収量で製剤化できるかどうかは不明であった。
【００１４】
本発明者等は液中乾燥法によりＬＦをアルギン酸カルシウムゲルに封じ込めた後、アルギン酸をキトサンとポリマーブレンドすることによりＬＦを含有する徐放性微粒子の製造法開発を試みた。二つのポリマーのうちで一方をクラスター状に分散させ、第二のポリマーの溶液に浸漬して均一相にする物理的なプロセスでポリマーアロイを作る技術をポリマーブレンドと呼ぶ。ポリマーブレンドは、単独のポリマーが持っていない性質を獲得する場合があるので有用である。本発明者等はアルギン酸とキトサンとで形成されるポリマーアロイがＬＦをゲル内に封じ込め、徐々にＬＦを放出することを発見した。製造条件を種々検討した結果、高い濃度でＬＦを含有する粒径が約１ミクロンの徐放性マイクロカプセルを高収率で製造する方法を確立して本発明を完成した。
【００１５】
方法の概略は次に説明するとおりである。流動パラフィンを分散媒に用いた液中乾燥によりアルギン酸,ラクトフェリン、塩化カルシウムが微粒子中にほぼ完全に回収され、ＬＦを含む球形粒子が得られた。
【００１６】
次に、ＬＦを含むアルギン酸カルシウムの球形粒子をキトサン溶液に浸漬処理するポリマーブレンド技術を用い、ＬＦを含有するポリマーアロイの微粒子粉末を得た。ポリマーブレンドの過程で、球形粒子に過剰に含まれた塩化カルシウムは速やかに酢酸水に洗い出され、その結果、粒子の球形が崩れ表面が不整形になった。
【００１７】
ＬＦがアルギン酸カルシウムのゲル・ネットワークに確り捕捉されていないと、ポリマーブレンド時に一部が粒子から流出して失われ、これがＬＦの回収率の低下につながると考えられる。このようにして、ＬＦを微粒子に封じ込めたキトサン・アルギン酸カルシウムのポリマーブアロイは、水に懸濁すると時間の経過とともに徐々にＬＦを放出する徐放性微粒子である。基本的な方法は図１に示すとおりである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＬＦを含有する微粒子は、日本薬局方に記載されている第１液あるいは第２液に浸漬すると、微粒子内に封じ込めたＬＦを２時間以上かけて徐々に放出する。したがって吸収部位である小腸下部まで多量のＬＦが到達するので、経口摂取するとＬＦ固有の効能・効果を確実に発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1はＬＦ含有微粒子の粒子形成法と構造を説明した。
【図２】図２はＡｌ／Ｃａ−ＭＰ及びＣｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰの操作型電子顕微鏡写真を示す。
【図３】図３はＡｌ／Ｃａ−ＭＰをキトサンとポリマーブレンドする前後における微粒子の性状を示す。
【図４】図４は日本薬局方第１５版記載の固形製剤の崩壊試験における第１液と第２液中でのＣｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰからのＬＦ−ＦＴＣの溶出状況を示す。
【図５】図５は日本薬局方第１５版記載の固形製剤の崩壊試験法においてＣｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰを最初に第１液に浸漬し、引き続いて第２液に浸漬した際のＬＦ−ＦＴＣの溶出状況を示す。
【図６】図６は日本薬局方第１５版記載の固形製剤の崩壊試験における第１液と第２液中にＡｌ／Ｃａ−ＭＰ、Ｃｈ０．５／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰを浸漬した液の蛍光発色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
既述のようにＬＦは、動物実験においては経口投与で多彩な生理活性を示す多機能蛋白質である。しかし、ヒトではＬＦの固形製剤、散剤あるいは顆粒製剤を経口投与しても、殆どの場合、有意な効能・効果を示さない。僅かに胃に感染したヘリコバクター・ピロリの除菌において三剤併用療法にＬＦを付加すると除菌率が向上することが報告されている。三剤併用療法には、強力に胃酸の分泌を抑制するプロトンポンプ阻害剤あるいはヒスタミン受容体２のブロッカーが含まれる。したがって、胃内のｐＨが高くＬＦは加水分解されずに吸収部位である小腸下部に到達し、体内に吸収されて免疫を賦活する。除菌率の向上はＬＦが小腸まで到達するためである。
【００２１】
本発明により製造されたＬＦの徐放性微粒子は、ヒト及び動物に投与するため、いろいろな形に製剤化することができる。使用目的に応じて各種の剤形を適宜選択可能であり、例えば、製剤として坐剤、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤等を例示することができる。
【００２２】
この発明の徐放性ＬＦ微粒子は、配合量を特に制限されず、疾患の種類、症状等により適宜選択できるが、望ましい含量は製剤１ｇ当たり０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲である。また、この発明の有効成分は、乳に由来する天然物であるから、それらの安全性について問題がないことは明らかである。
【実施例１】
【００２３】
ＬＦを定量的に検出するため、タンパク質の蛍光標識試薬フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した。ＬＦ１００ｍｇとタンパク質のＦＩＴＣ１０ｍｇをｐＨ８．４の０．１Ｍ炭酸緩衝液５ｍｌ中で４時間攪拌して反応させ、ゲルろ過を行い、さらに過剰のＦＩＴＣを透析して除去した液を凍結乾燥し、ＦＩＴＣ標識ＬＦ（ＬＦ−ＦＩＴＣ）を得た（収量 ８１ｍｇ）。以下の実施例は、ＬＦに代えてＬＦ-ＦＴＣを用いて行った。
【実施例２】
【００２４】
まず、ＬＦ−ＦＴＣを含有するアルギン酸とカルシウムの微粒子を調製するために、アルギン酸ソーダ(Ａｌ−Ｎａ)、 ＬＦ−ＦＴＣ、 塩化カルシウム(ＣａＣｌ2)の組成で、液中乾燥法による微粒子化を試みた。Ａｌ−Ｎａ１５０ｍｇを含有する水溶液１０ｍｌとＬＦ−ＦＴＣ１８ｍｇの水溶液５ｍｌを混合し、１％（Ｗ／Ｖ）のセスキオレイン酸ソルビタン含有流動パラフィン中に添加し、室温、攪拌速度１０００ｒｐｍで1時間攪拌した。その後、ＣａＣｌ2を３００ｍｇ含有する水溶液３ｍｌを添加し、１５分間攪拌行った。次に浴温３７ ℃で減圧濃縮して水分を除去して微粒子を形成させた。減圧乾燥した後、粉末に等量のn-ヘキサンを加えて混和し、遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物は、n-ヘキサンで3回洗浄し、デシケーター中で乾燥することにより、ＬＦ−ＦＴＣ含有アルギン酸カルシウム微粒子（Ａｌ／Ｃａ−ＭＰ）を得た（収量４３９ｍｇ）。
【実施例３】
【００２５】
Ａｌ／Ｃａ−ＭＰのＬＦ−ＦＴＣの含量は、一定量の粒子を最初に日本薬局方第１液中で攪拌し、次に遠心分離し、沈殿を日本薬局方第２液に懸濁した。微粒子を懸濁した第１液及び第２液上清の吸光度を測定することにより、溶存するＬＦ−ＦＴＣ量を求め、粒子中のＬＦ−ＦＴＣの含有率を算出した。また、走査型電子顕微鏡を用いて緑色微粒子の直径を測定し、粒度分布、平均粒子径を求めた。その結果、微粒子に含まれるＬＦ−ＦＴＣは２．６％(Ｗ／Ｗ)、微粒子中に回収されたＬＦ−ＦＴＣは６４％、粒子の直径は１．４５±０．３０μｍ(平均値±標準誤差)であった。なおＡｌ／Ｃａ−ＭＰは、第１液及び第２液に懸濁すると速やかにＬＦ−ＦＴＣを放出するので徐放性ではない。
【００２６】
そこでキトサンとポリマーブレンドを行い、Ａｌ、ＬＦとＣｈで形成されるポリマーアロイをつくり、その微粒子について徐放性を検討した。まず、Ａｌ／Ｃａ−ＭＰ、５０ｍｇを０．２５，０．５及び１．０％（Ｗ／Ｖ）のキトサンを溶解した１％（Ｖ／Ｖ）酢酸水溶液２０ｍｌに懸濁し、１時間攪拌した。その後、遠心分離を行い、沈殿物を水２０ｍｌで２回洗浄し、得られた沈殿物をデシケーター中で乾燥してキトサンをブレンドした微粒子（Ｃｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰ）を得た。収量はキトサン０．２５％の場合１３．３ｍｇ、同０．５％で１４．４ｍｇ、同１％で１８．５ｍｇであった。
得られた粒中の薬物含有率は、調製時の初期含有量から、洗浄によって液中に失われた薬物量を差し引くことで求めた。最初の1 %キトサン処理後に上清中のＬＦ−ＦＴＣ、水で洗浄後の洗液中のＬＦ−ＦＴＣを吸光光度法によって求め、これらの和をＡｌ／Ｃａ−ＭＰ中のＬＦ−ＦＴＣ量から差し引くことで、得れた粒子中に残存したLF-FTC量を算出し、粒子あたりのＬＦ−ＦＴＣ含有率として表示した。表２に得られた微粒子の諸性質を示した。
【００２７】
【表１】
【実施例４】
【００２８】
（Al/Ca-MPおよびCh/Al/Ca-MPの走査型電子顕微鏡写真）図２は、Ｃｈブレンド前のAlとCaの複合体粒子及びキトサン溶液を用いてポリマーブレンドした微粒子の走査型電子顕微鏡写真を示す。微粒子は、ほぼ球形であるが、キトサン溶液処理で表面が皺状になった。とくに、Ｃｈ，０．２５％処理で表面がもっとも不整状態になった。粒子径は約1 μｍで大きさのほぼそろった微粒子が得られた。
【００２９】
Ａｌ／Ｃａ−ＭＰにキトサンをブレンドする際におけるキトサン濃度、粒子径、収率、薬物含有率への影響を検討した。キトサンでポリマーブレンドするとわずかに粒子径は縮小するが、キトサンの濃度を上昇させると粒子径が徐々に増大した。キトサンのブレンドで、粒子重量は２５％−３５％減少した。これは、過剰のＣａＣｌ2を含んだＡｌ／Ｃａ−ＭＰが、キトサン溶液処理によりＣａＣｌ2が粒子から溶出し失われたためと考えられた。また、キトサン濃度上昇で重量が増加するのは、キトサンのポリマーブレンド量が増加したためと考えられる。一方、微粒子のＬＦ−ＦＴＣ回収率は、キトサンでポリマーブレンドしても高く維持される。０．２５％Ｃｈでは、約９０％が粒子中に回収され、ＬＦ−ＦＴＣはポリマーアロイ中によく保持されている。Ｃｈ濃度の上昇にともないＬＦ−ＦＴＣの回収が低下するのは、ブレンドした塩基性Ｃｈの増加により塩基性蛋白であるＬＦとＡｌの相互作用を断ち切られ、遊離したＬＦ−ＦＴＣが溶け出して失われたためである。ポリマーブレンド以前のＬＦ−ＦＴＣ含有率は、微粒子に過剰のＣａＣｌ2が残留しているため、かなり低い値であった。しかし、キトサン溶液処理で、過剰のＣａＣｌ2が洗い出されると、ＬＦ−ＦＴＣの含有率は上昇した。Ｃｈの濃度上昇により、ＬＦ−ＦＴＣ含有率の低下が見られた。図３はそれぞれのデータを示す。
【００３０】
（粒子形成と粒子構造に関する考察）以上に述べたＡｌ／Ｃａ−ＭＰおよびＣｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰの収量、ＬＦ−ＦＴＣの回収率、含有率、粒子形状、粒子径から、粒子形成や粒子の構造に関して、以下のように考察した。流動パラフィンを分散媒に用いた液中乾燥では、水溶液として用いたＡｌとＣａがほぼ完全に回収され、Ａｌ／Ｃａ−ＭＰが球形粒子として得られる。次に、キトサン溶液を用いてポリマーブレンドすると、過剰に添加されたＣａＣｌ2が速やかに粒子から洗い出される。 ＣａＣｌ2の洗い出しによって、粒子の球形は崩れ表面が不整形になる。微粒子のアルギン酸のネットワークに捕捉が不充分なＬＦ−ＦＴＣは、Ｃｈとのポリマーアロイ形成時に一部放出される形で失われ、これがＬＦ−ＦＴＣの回収率の低下につながる。以上をまとめたものが図４である。
【実施例５】
【００３１】
Ｃｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰからのＬＦ−ＦＴＣの放出を日局第1液、第2液を用いて調べた。日局第1液、第2液中に粒子を0.6 ｍｇ/ｍｌの濃度になるように懸濁し、３７℃、 １００ｒｐｍで水平に振とうしてインキュベーションを行った。いずれの粒子もＬＦ−ＦＴＣを徐々に放出したが、Ｃｈ濃度０．２５％＞Ｃｈ濃度０．５％＞Ｃｈ濃度１．０％の順に放出は抑制された。また、第１液と比べ第2液において放出は抑制される傾向があった。徐放性経口製剤としての観点からは、 Ｃｈ濃度を０．２５％−０．５０％でポリマーブレンドした微粒子が徐放性に優れていることが示唆された。
【００３２】
日局第1液から第2液に粒子を移した際の放出と粒子状態を観察した。この実験では、粒子（０．６ｍｇ／ｍｌ）を、最初の1時間第1液中でインキュベート（３７ ℃）、 １００ｒｐｍで遠心分離した後、沈殿粒子に第２液を添加してインキュベートを継続して放出性を調べた。放出パターンは、前の図で述べた第1液、第２液中で別々に行った時の放出パターンとほぼ同様であった。第1液中では、粒子はあまり膨潤することなく分散性よく懸濁していたが、第2液中では、膨潤し幾分柔らかい状態になって分散することが見出された。第2液中で4時間インキュベートした後、遠心分離し、沈殿を乾燥してSEM画像を観測したが、図５に示すように膨潤した粒子が絡み合った像が観測された。
【実施例６】
【００３３】
日本薬局方第1液、第２液中におけるＡｌ／Ｃａ−ＭＰとＣｈ０．５／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰの粒子状態の観察した。 Ａｌ／Ｃａ−ＭＰは、第1液中で分散性よく懸濁したが、第2液中では全体に膨潤してゾル状に広がる様子が見られた。Ｃｈ０．５／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰは、前の図でも述べたように、第1液中では、あまり膨潤することなく分散性よく懸濁したが、第2液中では、膨潤し幾分柔らかい状態になって分散することが見出された。Ｃｈ０．５／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰを第1液中で３時間インキュベートし、遠心分離後に沈殿粒子に第2液に加えて3時間インキュベートしたときの蛍光画像を示す。前の図で示したのと同様に、第1液中では、分散性のいい懸濁液で、第２液中では、粒子は膨潤、軟化した様子が見られた。蛍光顕微鏡下で撮影した写真を図６に示す。
以上より、Ｃｈ０．５／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰは、胃及び腸管内で粒子状態を維持し、ＬＦを1日から数日にわたって放出する微粒子剤形として機能することが示唆された。
【実施例７】
【００３４】
ＬＦ１８ｇを５リットルの水に溶かした水溶液と１．５％アルギン酸ナトリウム水溶液10リットルに溶かした水溶液を混合し、1 % (w/v)セスキオレイン酸ソルビタン含有流動パラフィン中５０リットルに滴下し、全量を滴下し終えたら激しく1時間攪拌した。その後、塩化カルシウムを３０ｇ含有する水溶液3リットルを添加し、15分間攪拌した。次に減圧下で水分を蒸発させて除去し、水分を除去して微粒子を形成させた。減圧乾燥した後、等量のn-ヘキサンを加えて混和し遠心分離して、流動パラフィンを除去した沈殿物を得た。沈殿物は、n-ヘキサンで3回洗浄し、真空乾燥することにより、微粒子のＬＦ含有アルギン酸カルシウム・ゲルの微粒子８１ｇを得た。この微粒子に捕捉されたＬＦは、１６．６ｇで収率は９２％であった。
【００３５】
次にキトサンとポリマーブレンドを行い、Ａｌ、ＬＦとキトサンで構成されるポリマーアロイを調製した。まず、Ａｌ／Ｃａ−ＭＰ、１００ｇを０．２５％（Ｗ／Ｖ）のキトサンを溶解した１％（Ｖ／Ｖ）酢酸水溶液４０ｌに懸濁し、１時間攪拌した。その後、遠心分離を行い、沈殿物を水２０ｍｌで２回洗浄した。得られた沈殿物をデシケーター中で乾燥してキトサンをブレンドした微粒子（Ｃｈ／Ａｌ／Ｃａ−ＭＰ）を得た。収量は２９ｇであった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のＬＦを含有する徐放性微粒子は、経口摂取しても大部分のＬＦが胃内でペプシンにより消化されるのを避け、ＬＦを小腸に到達させることができる。したがってＬＦの経口摂取用の製剤として好適である。本微粒子は食品及び医薬品に有効成分として添加し、ＬＦがもっている多彩な生理活性を発揮させることができる。徐放性微粒子化することにより、ＬＦの安全性を損なうことはまったくない。
【符号の説明】
【００３７】
１ ＬＦ;ラクトフェリン
２ ＬＦ-ＦＴＣ；蛋白質標識試薬フルオレセインイソチオシアネートを結合したＬＦ
３ Ａｌ-Ｎａ；アルギン酸ナトリウム塩
４ ＣａＣｌ２；塩化カルシウム
５ Ｃｈ；キトサン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンを含有するアルギン酸カルシウム等の酸性ポリマーのゲルを塩基性ポリマーの水溶液と処理することを特徴とする徐放性ラクトフェリン微粒子の製造法。
【請求項２】
酸性ポリマーが、アルギン酸、ヒアルロン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、酸化澱粉、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、カルボキシメチルセルロース等であることを特徴とする請求項１の徐放性ラクトフェリン微粒子の製造法。
【請求項３】
塩基性ポリマーが、キトサン、ポリリジン、ラクトパーオキシダーゼ、ポリアミン、ＤＥＡＥセルローズ、ＤＥＡＥデキストラン等であることを特徴とする請求項１の徐放性ラクトフェリン微粒子の製造法。
【請求項１】
ラクトフェリンを含有するアルギン酸カルシウム等の酸性ポリマーのゲルを塩基性ポリマーの水溶液と処理することを特徴とする徐放性ラクトフェリン微粒子の製造法。
【請求項２】
酸性ポリマーが、アルギン酸、ヒアルロン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、酸化澱粉、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、カルボキシメチルセルロース等であることを特徴とする請求項１の徐放性ラクトフェリン微粒子の製造法。
【請求項３】
塩基性ポリマーが、キトサン、ポリリジン、ラクトパーオキシダーゼ、ポリアミン、ＤＥＡＥセルローズ、ＤＥＡＥデキストラン等であることを特徴とする請求項１の徐放性ラクトフェリン微粒子の製造法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−５１９０３（Ｐ２０１１−５１９０３Ａ）
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９９６６８（Ｐ２００９−１９９６６８）
【出願日】平成２１年８月３１日（２００９．８．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年３月２７日 社団法人日本薬学会主催の「日本薬学会第１２９年会」において文書をもって発表
【出願人】（５９９０１２１６７）株式会社ＮＲＬファーマ (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月３１日（２００９．８．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年３月２７日 社団法人日本薬学会主催の「日本薬学会第１２９年会」において文書をもって発表
【出願人】（５９９０１２１６７）株式会社ＮＲＬファーマ (18)
【Ｆターム（参考）】
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