リガーゼ検出反応による核酸相違の適合性の高い検出
【課題】塩基の変更、挿入、欠失または転座により、多数標的ヌクレオチド配列と相違している、少数標的ヌクレオチド配列を、両配列を含むサンプル中で検出する方法の提供。
【解決手段】少数鋳型を正常鋳型の過剰の存在下に熱安定性リガーゼで識別するのに、リガーゼ検出反応を用いる方法。この方法は、変異リガーゼ、熱安定性リガーゼまたは修飾オリゴヌクレオチドプローブで実施でき、特に癌関連変異の検出に有用である。また少数鋳型の量および比率の測定を可能とする利点を有する。
【解決手段】少数鋳型を正常鋳型の過剰の存在下に熱安定性リガーゼで識別するのに、リガーゼ検出反応を用いる方法。この方法は、変異リガーゼ、熱安定性リガーゼまたは修飾オリゴヌクレオチドプローブで実施でき、特に癌関連変異の検出に有用である。また少数鋳型の量および比率の測定を可能とする利点を有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により１以上の多数標的ヌクレオチド配列と相違している１以上の少数標的ヌクレオチド配列を、前記少数標的ヌクレオチド配列が前記多数標的ヌクレオチドに対して１：１０より小さく、且つ１：１０００より大きい割合で、前記少数標的ヌクレオチド配列および前記多数標的ヌクレオチド配列を含むサンプル中で、検出する方法であって、
該方法が、
１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは、(a)少数標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび(b) 少数標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する少数標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有し、そして、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットは標的核酸配列の相補物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブセットを含まないものであり；
リガーゼを準備し；
サンプル、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合し、リガーゼ検出反応混合物を形成し；
リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ、この変性処理において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、このハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していれば、その夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いに連結して線形的な増幅を達成し、各セットがリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別し得るために、連結反応産物配列と一緒に結合した標的特異的部分を含有する連結反応産物配列を形成し、その中で、オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるが、１以上のミスマッチの存在によって一緒に連結せず、そして変性処理の際に個々に分離しているものであり；
サンプル中に存在する少数標的ヌクレオチド配列の結果として産生された連結反応産物配列の存在を検出する；
ことを含む方法であって、
多数標的ヌクレオチド配列の存在下で少数標的ヌクレオチド配列によって生成された連結反応産物配列量の、多数標的ヌクレオチド配列単独によって生成された連結反応産物配列量に対する割合という意味において測定される、３．４：１より大きく、１０６：１より小さいシグナル対ノイズ比率を達成する、方法。
【請求項２】
特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別され得るようにユニーク長を有し、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
該検出後に、サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
各セットの第２オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
１以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し、該検出は、アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列の存在を示し、それによってサンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を示す；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項４】
サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し；
サンプル中に存在する多数標的ヌクレオチドの結果として産生した多数連結反応産物配列を検出し；
検出した多数連結反応産物配列を定量し；
検出した少数連結反応産物配列を定量する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し；
既知量の１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
マーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む１以上の配列特異的プローブセットを準備し；
マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットをリガーゼ検出反応混合物と混合し；
多数および少数の連結反応産物配列を定量し；
未知のサンプルから生じた多数および少数の連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
第２オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
１以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し；
アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定の部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列を定量し；
未知のサンプルから生じた捕捉連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた捕捉連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項５の方法。
【請求項７】
１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列が１以上の単一ヌクレオチド位置における標的ヌクレオチド配列と相違する、請求項５の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる長さを有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項５の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なるレポーター標識を有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項５の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なるアドレス可能アレイ特異的部分を有する、請求項６の方法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、アドレス可能なアレイ特異的部分を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる検出可能なレポーター標識を有する、請求項６の方法。
【請求項１２】
単一標的ヌクレオチド配列中の２以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違、または多数標的ヌクレオチド配列中の２以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違を、重複し得る部分を有するオリゴヌクレオチドプローブセットで識別する、請求項１の方法。
【請求項１３】
サンプルにおいて、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、該検出において、連結反応産物配列の標識が検出され、それによって１以上の標的ヌクレオチド配列中の１以上のヌクレオチド位置における1以上の低存在量の対立遺伝子のサンプル中の存在が示される、請求項１の方法。
【請求項１４】
サンプル中に未知量で存在する、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を定量し、該方法がさらに、
既知量の１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
１以上のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを準備し；
各セットは、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび(b) マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する第２オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定マーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有し、該複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよび該複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは、マーカーヌクレオチド配列を含み、単一ヌクレオチド位置における多重対立遺伝子の相違を識別するためのオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し得、グループ内の１以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブとを分かち持ち、リガーゼ検出反応混合物を形成するための該混合が、マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出反応混合物に混合することを含み；
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知のサンプルから生じた連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列のレベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に、塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが変異対立遺伝子特異的プローブよりも低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し；
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に、塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、および／または１以上の内部ミスマッチまたは修飾を含有し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し；
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項１７】
正常対立遺伝子特異的プローブが正常塩基を３’末端に含有する、請求項１６の方法。
【請求項１８】
正常対立遺伝子特異的プローブが１以上の内部ミスマッチまたは修飾を３’末端から４塩基以内に含有する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
修飾が１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、４−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−２−カルボキサミド、２'−デオキシ−５−フルオロウリジン、２−デオキシイノシン、６−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド〔４，５−Ｃ〕〔１，２〕オキサジン−７−オン、２−アミノ−７−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メトキシアミノプリン、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド、３−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリミジノン、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−チオピリミジン、５−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−プロピニルピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−３−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾン−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロイミダゾールおよび１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロピラゾールよりなる群から選ばれるヌクレオチド類似体である、請求項１６の方法。
【請求項２０】
修飾オリゴヌクレオチドプローブがチオホスフェート、ジチオホスフェート、２'−メトキシまたは３'−アミノ−２'，３'−ジデオキシ修飾をその糖ホスフェート・バックボーンに、連結反応部から４塩基の１つまたは組合せの位置に含有する、請求項１６の方法。
【請求項２１】
サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチについて相対比率１：５００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２２】
サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチについて相対比率１：２０００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２３】
少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のすべてのミスマッチについて相対比率１：１００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２４】
少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇ以外のミスマッチについて相対比率１：５００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２５】
１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により１以上の多数標的ヌクレオチド配列と相違している１以上の少数標的ヌクレオチド配列を、前記少数標的ヌクレオチド配列が前記多数標的ヌクレオチドに対して１：１０より小さく、且つ１：１０００より大きい割合で、前記少数標的ヌクレオチド配列および前記多数標的ヌクレオチド配列を含むサンプル中で、検出する方法であって、
該方法が、
１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは、(a)標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび(b)標的特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有するものであり、連結反応部に３’末端を有する第１オリゴヌクレオチドプローブは１以上の修飾を有し、その修飾は、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが、少数標的ヌクレオチド配列と連結反応部に３’末端を有する第１オリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部で完全マッチを有するサンプル中の少数標的ヌクレオチドにハイブリダイズするときの連結反応速度を、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが、多数標的ヌクレオチド配列と連結反応部に３’末端を有する第１オリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部でミスマッチを有するサンプル中の多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするときの連結反応速度に比べて識別的に変えるものであり、修飾第１オリゴヌクレオチドプローブを用いた前記連結反応過程が、サンプル中の少数および多数標的ヌクレオチド配列から生成される連結反応産物合計の、少数標的ヌクレオチド配列が存在しないサンプル中の同じ量の多数標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物量に対する割合として定義されたシグナル対ノイズ比率を有し、この比率は修飾を欠く第１オリゴヌクレオチドプローブを用いた連結検出反応についてのシグナル対ノイズ比率よりも大きく、そして、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットは標的核酸配列の相補物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブセットを含まないものであり；
リガーゼを準備し；
サンプル、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合し、リガーゼ検出反応混合物を形成し；
リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ、この変性処理において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、このハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していれば、その夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、線形的な増幅を達成するためのオリゴヌクレオチドプローブの修飾なしで互いに連結して、各セットがリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別し得るために、連結反応産物配列と一緒に結合した標的特異的部分を含有する連結反応産物配列を形成し、その中で、オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるが、１以上のミスマッチの存在によって一緒に連結せず、そして変性処理の際に個々に分離しているものであり；
連結反応産物配列の存在を検出する；
ことを含む方法。
【請求項２６】
１以上の修飾が連結反応部から９塩基以内のヌクレオチド類似体である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
修飾がオリゴヌクレオチドプローブの３’末端から９塩基以内にある、請求項２６の方法。
【請求項２８】
修飾がオリゴヌクレオチドプローブの３’末端から３塩基離れた位置のヌクレオチド類似体である、請求項２６の方法。
【請求項２９】
修飾が１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、４−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−２−カルボキサミド、２'−デオキシ−５−フルオロウリジン、２−デオキシイノシン、６−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド〔４，５−Ｃ〕〔１，２〕オキサジン−７−オン、２−アミノ−７−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メトキシアミノプリン、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド、３−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリミジノン、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−チオピリミジン、５−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−プロピニルピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−３−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾン−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロイミダゾールおよび１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロピラゾールよりなる群から選ばれるヌクレオチド類似体である、請求項２８の方法。
【請求項３０】
修飾が連結反応部から９塩基内の１つまたは組合せた位置での第１オリゴヌクレオチドプローブの糖ホスフェートバックボーンにある、請求項２５の方法。
【請求項３１】
修飾第１オリゴヌクレオチドプローブがチオホスフェート、ジチオホスフェート、２'−メトキシおよび３'−アミノ−２'，３'−ジデオキシ修飾を含有する、請求項３０の方法。
【請求項３２】
特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別され得るようにユニーク長を有し、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
該検出後に、サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項３３】
各セットの第２オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
１以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し、該捕捉はアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列を示し、それによってサンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を示す；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項３４】
サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し；
サンプル中に存在する多数標的ヌクレオチドの結果として産生した多数連結反応産物配列を検出し；
検出した多数連結反応産物配列を定量し；
検出した少数連結反応産物配列を定量する；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項３５】
サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し；
既知量の１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
マーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブを含む１以上の配列特異的プローブセットを準備し；
マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットをリガーゼ検出反応混合物と混合し；
多数および少数の連結反応産物配列を定量し；
未知のサンプルから生じた多数および少数の連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項３６】
各セットの第２オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
１以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し；
アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定の部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列を定量し；
未知のサンプルから生じた捕捉連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた捕捉連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項３５の方法。
【請求項３７】
１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列が１以上の単一ヌクレオチド位置における標的ヌクレオチド配列と相違する、請求項３５の方法。
【請求項３８】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる長さを有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項３５の方法。
【請求項３９】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なるレポーター標識を有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項３５の方法。
【請求項４０】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なるアドレス可能アレイ特異的部分を有する、請求項３６の方法。
【請求項４１】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、アドレス可能なアレイ特異的部分を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる検出可能なレポーター標識を有する、請求項３６の方法。
【請求項４２】
単一標的ヌクレオチド配列中の２以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違および多数標的ヌクレオチド配列中の２以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違を、重複し得る部分を有するオリゴヌクレオチドプローブセットで識別する、請求項２５の方法。
【請求項４３】
サンプルにおいて、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、該検出において、連結反応産物配列の標識が検出され、それによって１以上の標的ヌクレオチド配列中の１以上のヌクレオチド位置における1以上の低存在量の対立遺伝子のサンプル中の存在が示される、請求項２５の方法。
【請求項４４】
サンプル中に未知量で存在する、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を定量し、該方法がさらに、
既知量の１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
１以上のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを準備し；
各セットは、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび(b)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する第２オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有し、該複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよび該複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは、マーカーヌクレオチド配列を含み、単一ヌクレオチド位置における多重対立遺伝子の相違を識別するためのオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し得、グループ内の１以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、リガーゼ検出反応混合物を形成するための該混合が、マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出反応混合物に混合することを含み；
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知のサンプルから生じた連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列のレベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項４５】
過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の１以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが変異対立遺伝子特異的プローブよりも低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し；
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項４６】
過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の１以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、および／または１以上の内部ミスマッチまたは修飾を含有し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し；
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項４７】
正常対立遺伝子特異的プローブが正常塩基を３’末端に含有する、請求項４６の方法。
【請求項４８】
正常対立遺伝子特異的プローブが１以上の内部ミスマッチまたは修飾を３’末端から４塩基以内に含有する、請求項４７の方法。
【請求項４９】
修飾が１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、４−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−２−カルボキサミド、２'−デオキシ−５−フルオロウリジン、２−デオキシイノシン、６−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド〔４，５−Ｃ〕〔１，２〕オキサジン−７−オン、２−アミノ−７−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メトキシアミノプリン、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド、３−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリミジノン、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−チオピリミジン、５−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−プロピニルピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−３−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾン−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロイミダゾールおよび１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロピラゾールよりなる群から選ばれるヌクレオチド類似体である、請求項４６の方法。
【請求項５０】
修飾オリゴヌクレオチドプローブがチオホスフェート、ジチオホスフェート、２'−メトキシまたは３'−アミノ−２'，３'−ジデオキシ修飾をその糖ホスフェート・バックボーンに含有する、請求項４６の方法。
【請求項５１】
サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチについて相対比率１：５００で、識別される、請求項２５の方法。
【請求項５２】
サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチについて相対比率１：２０００で、識別される、請求項２５の方法。
【請求項５３】
少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のすべてのミスマッチについて相対比率１：１００で、識別される、請求項２５の方法。
【請求項５４】
少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇ以外のミスマッチについて相対比率１：５００で、識別される、請求項２５の方法。
【請求項５５】
リガーゼ検出混合物が、ミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
リガーゼ検出混合物が、多数標的ヌクレオチド配列に対するミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを、少数標的ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの量より少量で、且つサンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効である量で、含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
リガーゼ検出混合物が、サンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効な形態で、多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする修飾オリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
リガーゼ検出混合物が、ミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを含まない、請求項２５に記載の方法。
【請求項５９】
リガーゼ検出混合物が、多数標的ヌクレオチド配列に対するミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを、少数標的ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの量より少量で、且つサンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効である量で、含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項６０】
リガーゼ検出混合物が、サンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効な形態で、多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする修飾オリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項６１】
第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが連結反応部において完全マッチで標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズされるとき、第２オリゴヌクレオチドプローブに、連結反応部で、その３’末端で連結するために好適な第１オリゴヌクレオチドプローブであって、該第１オリゴヌクレオチドプローブはヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログは、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが多数標的ヌクレオチド配列と第１オリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部でミスマッチを伴ってサンプルの多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするときのライゲーション速度に比較して、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブが少数標的ヌクレオチド配列と第１オリゴヌクレオチドプローブとの間において完全マッチでハイブリダイズするときのライゲーション速度を、異なるように変化させ、そして、第１オリゴヌクレオチドプローブを用いる連結が、同量の多数標的ヌクレオチド配列のみから生成される連結反応産物配列の量に対する、小数および多数標的ヌクレオチド配列から生成される連結反応産物配列の量である、シグナル対ノイズ比率を有し、それが、修飾のない第１オリゴヌクレオチドプローブを用いる連結のシグナル対ノイズ比率より大きく、該第１オリゴヌクレオチドプローブが２０−２８ヌクレオチド長である、第１オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１】
１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により１以上の多数標的ヌクレオチド配列と相違している１以上の少数標的ヌクレオチド配列を、前記少数標的ヌクレオチド配列が前記多数標的ヌクレオチドに対して１：１０より小さく、且つ１：１０００より大きい割合で、前記少数標的ヌクレオチド配列および前記多数標的ヌクレオチド配列を含むサンプル中で、検出する方法であって、
該方法が、
１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは、(a)少数標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび(b) 少数標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する少数標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有し、そして、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットは標的核酸配列の相補物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブセットを含まないものであり；
リガーゼを準備し；
サンプル、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合し、リガーゼ検出反応混合物を形成し；
リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ、この変性処理において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、このハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していれば、その夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いに連結して線形的な増幅を達成し、各セットがリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別し得るために、連結反応産物配列と一緒に結合した標的特異的部分を含有する連結反応産物配列を形成し、その中で、オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるが、１以上のミスマッチの存在によって一緒に連結せず、そして変性処理の際に個々に分離しているものであり；
サンプル中に存在する少数標的ヌクレオチド配列の結果として産生された連結反応産物配列の存在を検出する；
ことを含む方法であって、
多数標的ヌクレオチド配列の存在下で少数標的ヌクレオチド配列によって生成された連結反応産物配列量の、多数標的ヌクレオチド配列単独によって生成された連結反応産物配列量に対する割合という意味において測定される、３．４：１より大きく、１０６：１より小さいシグナル対ノイズ比率を達成する、方法。
【請求項２】
特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別され得るようにユニーク長を有し、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
該検出後に、サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
各セットの第２オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
１以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し、該検出は、アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列の存在を示し、それによってサンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を示す；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項４】
サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し；
サンプル中に存在する多数標的ヌクレオチドの結果として産生した多数連結反応産物配列を検出し；
検出した多数連結反応産物配列を定量し；
検出した少数連結反応産物配列を定量する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し；
既知量の１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
マーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む１以上の配列特異的プローブセットを準備し；
マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットをリガーゼ検出反応混合物と混合し；
多数および少数の連結反応産物配列を定量し；
未知のサンプルから生じた多数および少数の連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
第２オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
１以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し；
アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定の部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列を定量し；
未知のサンプルから生じた捕捉連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた捕捉連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項５の方法。
【請求項７】
１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列が１以上の単一ヌクレオチド位置における標的ヌクレオチド配列と相違する、請求項５の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる長さを有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項５の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なるレポーター標識を有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項５の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なるアドレス可能アレイ特異的部分を有する、請求項６の方法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、アドレス可能なアレイ特異的部分を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる検出可能なレポーター標識を有する、請求項６の方法。
【請求項１２】
単一標的ヌクレオチド配列中の２以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違、または多数標的ヌクレオチド配列中の２以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違を、重複し得る部分を有するオリゴヌクレオチドプローブセットで識別する、請求項１の方法。
【請求項１３】
サンプルにおいて、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、該検出において、連結反応産物配列の標識が検出され、それによって１以上の標的ヌクレオチド配列中の１以上のヌクレオチド位置における1以上の低存在量の対立遺伝子のサンプル中の存在が示される、請求項１の方法。
【請求項１４】
サンプル中に未知量で存在する、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を定量し、該方法がさらに、
既知量の１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
１以上のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを準備し；
各セットは、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび(b) マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する第２オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定マーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有し、該複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよび該複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは、マーカーヌクレオチド配列を含み、単一ヌクレオチド位置における多重対立遺伝子の相違を識別するためのオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し得、グループ内の１以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブとを分かち持ち、リガーゼ検出反応混合物を形成するための該混合が、マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出反応混合物に混合することを含み；
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知のサンプルから生じた連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列のレベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に、塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが変異対立遺伝子特異的プローブよりも低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し；
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に、塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、および／または１以上の内部ミスマッチまたは修飾を含有し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し；
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項１７】
正常対立遺伝子特異的プローブが正常塩基を３’末端に含有する、請求項１６の方法。
【請求項１８】
正常対立遺伝子特異的プローブが１以上の内部ミスマッチまたは修飾を３’末端から４塩基以内に含有する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
修飾が１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、４−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−２−カルボキサミド、２'−デオキシ−５−フルオロウリジン、２−デオキシイノシン、６−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド〔４，５−Ｃ〕〔１，２〕オキサジン−７−オン、２−アミノ−７−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メトキシアミノプリン、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド、３−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリミジノン、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−チオピリミジン、５−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−プロピニルピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−３−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾン−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロイミダゾールおよび１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロピラゾールよりなる群から選ばれるヌクレオチド類似体である、請求項１６の方法。
【請求項２０】
修飾オリゴヌクレオチドプローブがチオホスフェート、ジチオホスフェート、２'−メトキシまたは３'−アミノ−２'，３'−ジデオキシ修飾をその糖ホスフェート・バックボーンに、連結反応部から４塩基の１つまたは組合せの位置に含有する、請求項１６の方法。
【請求項２１】
サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチについて相対比率１：５００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２２】
サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチについて相対比率１：２０００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２３】
少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のすべてのミスマッチについて相対比率１：１００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２４】
少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇ以外のミスマッチについて相対比率１：５００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２５】
１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により１以上の多数標的ヌクレオチド配列と相違している１以上の少数標的ヌクレオチド配列を、前記少数標的ヌクレオチド配列が前記多数標的ヌクレオチドに対して１：１０より小さく、且つ１：１０００より大きい割合で、前記少数標的ヌクレオチド配列および前記多数標的ヌクレオチド配列を含むサンプル中で、検出する方法であって、
該方法が、
１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは、(a)標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび(b)標的特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有するものであり、連結反応部に３’末端を有する第１オリゴヌクレオチドプローブは１以上の修飾を有し、その修飾は、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが、少数標的ヌクレオチド配列と連結反応部に３’末端を有する第１オリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部で完全マッチを有するサンプル中の少数標的ヌクレオチドにハイブリダイズするときの連結反応速度を、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが、多数標的ヌクレオチド配列と連結反応部に３’末端を有する第１オリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部でミスマッチを有するサンプル中の多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするときの連結反応速度に比べて識別的に変えるものであり、修飾第１オリゴヌクレオチドプローブを用いた前記連結反応過程が、サンプル中の少数および多数標的ヌクレオチド配列から生成される連結反応産物合計の、少数標的ヌクレオチド配列が存在しないサンプル中の同じ量の多数標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物量に対する割合として定義されたシグナル対ノイズ比率を有し、この比率は修飾を欠く第１オリゴヌクレオチドプローブを用いた連結検出反応についてのシグナル対ノイズ比率よりも大きく、そして、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットは標的核酸配列の相補物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブセットを含まないものであり；
リガーゼを準備し；
サンプル、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合し、リガーゼ検出反応混合物を形成し；
リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ、この変性処理において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、このハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していれば、その夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、線形的な増幅を達成するためのオリゴヌクレオチドプローブの修飾なしで互いに連結して、各セットがリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別し得るために、連結反応産物配列と一緒に結合した標的特異的部分を含有する連結反応産物配列を形成し、その中で、オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるが、１以上のミスマッチの存在によって一緒に連結せず、そして変性処理の際に個々に分離しているものであり；
連結反応産物配列の存在を検出する；
ことを含む方法。
【請求項２６】
１以上の修飾が連結反応部から９塩基以内のヌクレオチド類似体である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
修飾がオリゴヌクレオチドプローブの３’末端から９塩基以内にある、請求項２６の方法。
【請求項２８】
修飾がオリゴヌクレオチドプローブの３’末端から３塩基離れた位置のヌクレオチド類似体である、請求項２６の方法。
【請求項２９】
修飾が１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、４−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−２−カルボキサミド、２'−デオキシ−５−フルオロウリジン、２−デオキシイノシン、６−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド〔４，５−Ｃ〕〔１，２〕オキサジン−７−オン、２−アミノ−７−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メトキシアミノプリン、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド、３−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリミジノン、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−チオピリミジン、５−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−プロピニルピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−３−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾン−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロイミダゾールおよび１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロピラゾールよりなる群から選ばれるヌクレオチド類似体である、請求項２８の方法。
【請求項３０】
修飾が連結反応部から９塩基内の１つまたは組合せた位置での第１オリゴヌクレオチドプローブの糖ホスフェートバックボーンにある、請求項２５の方法。
【請求項３１】
修飾第１オリゴヌクレオチドプローブがチオホスフェート、ジチオホスフェート、２'−メトキシおよび３'−アミノ−２'，３'−ジデオキシ修飾を含有する、請求項３０の方法。
【請求項３２】
特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別され得るようにユニーク長を有し、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
該検出後に、サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項３３】
各セットの第２オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
１以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し、該捕捉はアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列を示し、それによってサンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を示す；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項３４】
サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し；
サンプル中に存在する多数標的ヌクレオチドの結果として産生した多数連結反応産物配列を検出し；
検出した多数連結反応産物配列を定量し；
検出した少数連結反応産物配列を定量する；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項３５】
サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し；
既知量の１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
マーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブを含む１以上の配列特異的プローブセットを準備し；
マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットをリガーゼ検出反応混合物と混合し；
多数および少数の連結反応産物配列を定量し；
未知のサンプルから生じた多数および少数の連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項３６】
各セットの第２オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
１以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し；
アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定の部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列を定量し；
未知のサンプルから生じた捕捉連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた捕捉連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項３５の方法。
【請求項３７】
１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列が１以上の単一ヌクレオチド位置における標的ヌクレオチド配列と相違する、請求項３５の方法。
【請求項３８】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる長さを有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項３５の方法。
【請求項３９】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なるレポーター標識を有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項３５の方法。
【請求項４０】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なるアドレス可能アレイ特異的部分を有する、請求項３６の方法。
【請求項４１】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、アドレス可能なアレイ特異的部分を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる検出可能なレポーター標識を有する、請求項３６の方法。
【請求項４２】
単一標的ヌクレオチド配列中の２以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違および多数標的ヌクレオチド配列中の２以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違を、重複し得る部分を有するオリゴヌクレオチドプローブセットで識別する、請求項２５の方法。
【請求項４３】
サンプルにおいて、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、該検出において、連結反応産物配列の標識が検出され、それによって１以上の標的ヌクレオチド配列中の１以上のヌクレオチド位置における1以上の低存在量の対立遺伝子のサンプル中の存在が示される、請求項２５の方法。
【請求項４４】
サンプル中に未知量で存在する、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を定量し、該方法がさらに、
既知量の１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
１以上のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを準備し；
各セットは、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび(b)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する第２オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有し、該複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよび該複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは、マーカーヌクレオチド配列を含み、単一ヌクレオチド位置における多重対立遺伝子の相違を識別するためのオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し得、グループ内の１以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、リガーゼ検出反応混合物を形成するための該混合が、マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出反応混合物に混合することを含み；
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知のサンプルから生じた連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列のレベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項４５】
過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の１以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが変異対立遺伝子特異的プローブよりも低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し；
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項４６】
過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の１以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、および／または１以上の内部ミスマッチまたは修飾を含有し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し；
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項２５の方法。
【請求項４７】
正常対立遺伝子特異的プローブが正常塩基を３’末端に含有する、請求項４６の方法。
【請求項４８】
正常対立遺伝子特異的プローブが１以上の内部ミスマッチまたは修飾を３’末端から４塩基以内に含有する、請求項４７の方法。
【請求項４９】
修飾が１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、４−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−２−カルボキサミド、２'−デオキシ−５−フルオロウリジン、２−デオキシイノシン、６−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド〔４，５−Ｃ〕〔１，２〕オキサジン−７−オン、２−アミノ−７−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メトキシアミノプリン、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド、３−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリミジノン、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−チオピリミジン、５−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−プロピニルピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−３−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾン−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロイミダゾールおよび１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロピラゾールよりなる群から選ばれるヌクレオチド類似体である、請求項４６の方法。
【請求項５０】
修飾オリゴヌクレオチドプローブがチオホスフェート、ジチオホスフェート、２'−メトキシまたは３'−アミノ−２'，３'−ジデオキシ修飾をその糖ホスフェート・バックボーンに含有する、請求項４６の方法。
【請求項５１】
サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチについて相対比率１：５００で、識別される、請求項２５の方法。
【請求項５２】
サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチについて相対比率１：２０００で、識別される、請求項２５の方法。
【請求項５３】
少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のすべてのミスマッチについて相対比率１：１００で、識別される、請求項２５の方法。
【請求項５４】
少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇ以外のミスマッチについて相対比率１：５００で、識別される、請求項２５の方法。
【請求項５５】
リガーゼ検出混合物が、ミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
リガーゼ検出混合物が、多数標的ヌクレオチド配列に対するミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを、少数標的ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの量より少量で、且つサンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効である量で、含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
リガーゼ検出混合物が、サンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効な形態で、多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする修飾オリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
リガーゼ検出混合物が、ミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを含まない、請求項２５に記載の方法。
【請求項５９】
リガーゼ検出混合物が、多数標的ヌクレオチド配列に対するミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを、少数標的ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの量より少量で、且つサンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効である量で、含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項６０】
リガーゼ検出混合物が、サンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効な形態で、多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする修飾オリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項６１】
第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが連結反応部において完全マッチで標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズされるとき、第２オリゴヌクレオチドプローブに、連結反応部で、その３’末端で連結するために好適な第１オリゴヌクレオチドプローブであって、該第１オリゴヌクレオチドプローブはヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログは、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが多数標的ヌクレオチド配列と第１オリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部でミスマッチを伴ってサンプルの多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするときのライゲーション速度に比較して、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブが少数標的ヌクレオチド配列と第１オリゴヌクレオチドプローブとの間において完全マッチでハイブリダイズするときのライゲーション速度を、異なるように変化させ、そして、第１オリゴヌクレオチドプローブを用いる連結が、同量の多数標的ヌクレオチド配列のみから生成される連結反応産物配列の量に対する、小数および多数標的ヌクレオチド配列から生成される連結反応産物配列の量である、シグナル対ノイズ比率を有し、それが、修飾のない第１オリゴヌクレオチドプローブを用いる連結のシグナル対ノイズ比率より大きく、該第１オリゴヌクレオチドプローブが２０−２８ヌクレオチド長である、第１オリゴヌクレオチドプローブ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【公開番号】特開２００９−１２３（Ｐ２００９−１２３Ａ）
【公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０３３４３（Ｐ２００８−２０３３４３）
【出願日】平成２０年８月６日（２００８．８．６）
【分割の表示】特願平１０−５０７０１６の分割
【原出願日】平成９年７月１５日（１９９７．７．１５）
【出願人】（５９２０３５４５３）コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド (39)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＲＮＥＬＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【出願人】（３９９０２６５０２）パーデュー・リサーチ・ファウンデイション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月６日（２００８．８．６）
【分割の表示】特願平１０−５０７０１６の分割
【原出願日】平成９年７月１５日（１９９７．７．１５）
【出願人】（５９２０３５４５３）コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド (39)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＲＮＥＬＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【出願人】（３９９０２６５０２）パーデュー・リサーチ・ファウンデイション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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