リグニンペルオキシオダーゼの製造方法
【課題】 リグニンペルオキシダーゼを製造する方法およびその方法によって製造されるファネロカエテ・クリソスポリウム菌の水性抽出物を提供すること。
【解決手段】 （ａ）ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）菌を、所定の期間、グリセロールを含有する撹拌および通気された培養培地において多孔性マトリックス上で培養すること、および（ｂ）前記所定の期間の後、可溶性画分を前記ファネロカエテ・クリソスポリウム菌から抽出して、それによりリグニンペルオキシダーゼを製造することを含むリグニンペルオキシダーゼを製造する方法。
【解決手段】 （ａ）ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）菌を、所定の期間、グリセロールを含有する撹拌および通気された培養培地において多孔性マトリックス上で培養すること、および（ｂ）前記所定の期間の後、可溶性画分を前記ファネロカエテ・クリソスポリウム菌から抽出して、それによりリグニンペルオキシダーゼを製造することを含むリグニンペルオキシダーゼを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグニンペルオキシオダーゼの製造方法ならびに皮膚および毛髪の明色化におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラニン
ヒトの皮膚および毛髪の色は、植物および微生物にも存在する色素であるメラニンの量、性状および分布によって決定される。
【０００３】
メラニンの合成は前駆体チロシンから始まり、このチロシンはチロシナーゼの作用によって別の前駆体ドーパキノンに変換される。哺乳動物メラニンの生合成において、この中間体は２つの主要な経路（図１）を介して重合し得る。アミノ基の分子内での求核的付加により、インドール誘導体ロイコドーパクロムが生じ、ロイコドーパクロムは、重合後、暗褐色〜黒色の色素ユーメラニンをもたらす。チオール化合物の存在下では、ドーパのチオエステル誘導体が形成される。例えば、システインとの反応により、システイニルドーパが生じ、システイニルドーパは、さらなる酸化および重合の後、黄色〜赤褐色の色素フェオメラニンをもたらす。従って、ユーメラニンは５，６−ジヒドロキシインドール（ＤＨＩ）ユニットおよび５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸（ＤＨＩＣＡ）ユニットから主に構成され、これに対して、フェオメラニンは主にベンゾチアジンユニットを含有する（Ａｌａｌｕｆら、２００１）。これら２つの色素の利用性および相互比率は多量体色素の化学的組成に影響する。
【０００４】
メラニンの合成は、表皮基底層に存在するメラノサイト細胞に存在するメラノソームと呼ばれる顆粒において行われる（Ｃｏｏｋｓｅｙら、１９９７）；これらの細胞におけるメラニンの合成は紫外（ＵＶ）光によって誘導される。合成後、メラニンは表皮細胞に遊走し、表皮細胞に分散され、表皮細胞において、メラニンは皮膚代謝に従って脱色され、その後、皮膚更新時における垢の形態で剥がれる。メラニンは、ＵＶ光により生じる有害な影響から皮膚を守るので、臨床的重要性を有している。しかしながら、高レベルのメラニンは皮膚および毛髪の望ましくない濃色化を生じさせ得るし、一方で、その不均一な分布は、美学的に不愉快にし得る肝斑およびそばかす形成をもたらし得る。
【０００５】
明色化用製品
皮膚を明色化する（美白化する）製品がこの数年の間でますます大衆化している。美白用製品の主目的は、皮膚の色を薄くするか、皮膚を白くすることであり、あるいは、肝斑、そばかす、妊娠斑および老人性色素斑などの色素沈着障害を処置することである。数種類の美白用製品が現在、入手可能である。
【０００６】
色素細胞の変性および死に基づく製品は、典型的には、皮膚の白化および皮膚の明色化を促進させるか、または皮膚の色素沈着を徐々に消す過激な化学薬品（例えば、ヒドロキノン、４−イソプロピルカテコールおよびヒドロキノンモノベンジルエーテルなど）を含む。そのような製品は典型的には効率的でなく、また、これらの製品の連続した外用は永続的な白斑および副作用（例えば、皮膚色素異常症および発疹など）をもたらし得るので皮膚に対して有害であり得る。
【０００７】
他の明色化用製品はチロシナーゼ（前駆体チロシンを別の前駆体ドーパキノンに変換する酵素）の阻害に基づいている。この群の製品はアルブチン（銅イオンをキレート化することによってチロシナーゼを阻害し、それによりドーパクロムからＤＨＩＣＡへの互変異性化を抑制することができるグルコースヒドロキノン化合物）を含む。
【０００８】
メラノスタットは、チロシナーゼを介して作用する別の明色化用製品である。メラノスタットは、メラノサイトにおけるメラニン形成を脱活性化する際に機能する合成ペプチドである。
【０００９】
メラニンの産生を阻害することができるいくつかの抗酸化剤化合物もまた明色化用製品において利用される。メラニンの合成では酸化反応が伴うので、チロシン／ＤＯＰＡからメラニンに至る様々な段階で酸化を阻止することにより、最終的には、メラニンの合成が阻害される。
【００１０】
メラニン合成を阻止するために利用される抗酸化剤の１つはＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）であり、メラニン中間体に対する還元剤として作用し、酸化反応を阻止する。明色化用製品によって利用される他の抗酸化剤には、桑の実または甘草から典型的には抽出されるビオフラボノイドが含まれる。
【００１１】
毛髪の明色化用製品は毛皮質の内側のメラニンに対して作用する。毛髪を明色化することができる化学物質がいくつか存在し、これらには、塩酸、次亜塩素酸ナトリウムおよび過酸化水素が含まれる。
【００１２】
毛髪を明色化するために最も一般的に使用されている化学物質は過酸化水素である。所望される有効性を維持するために、過酸化水素の溶液は、アセトニトリル、薄い酸、コロイド状シリカ、ｐ−ヒドロキシベンゾアート、硫酸オキシキノリン、フェナセチンおよびスズ化合物（スズ酸ナトリウム、水酸化スズ（ＩＶ）、オクタン酸スズ（ＩＩ））などの化合物を使用して安定化されなければならない。毛髪を明色化する前には、アンモニアが、毛小皮（毛の外側層）を通過する過酸化水素の浸透を高めるために、かつ、従って、酸化反応を加速するために過酸化水素溶液に加えられる。
【００１３】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、リグニンペルオキシダーゼのイソ酵素Ｈ１がインビトロでメラニンを酸化することができ、そしてさらに、インビボで皮膚および毛髪を明色化することができることを発見した。
【００１４】
従って、本発明は、皮膚および毛髪を明色化するために非常に好適である化粧用組成物および方法を提供する。
【発明の概要】
【００１５】
本発明の１つの態様によれば、対象の皮膚領域または毛髪を明色化する方法であって、皮膚領域または毛髪の細胞に含有される色素を酸化するために好適な様式で少なくとも１つのタイプのリグニン改変酵素を皮膚領域または毛髪に適用することを含む方法が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、対象の皮膚領域または毛髪を明色化するための化粧用組成物であって、少なくとも１つのタイプのリグニン改変酵素と、化粧用として許容され得るキャリアとを含む化粧用組成物が提供される。
【００１７】
本発明のさらに別の態様によれば、対象の皮膚領域または毛髪を明色化するためのキットであって、リグニン改変酵素を含む第１の容器と、電子受容体を含む第２の容器とを含むキットが提供される。
【００１８】
本発明のなお別の態様によれば、包装材と、対象の皮膚領域または毛髪を明色化するために同定された、前記包装材に含有される化粧用組成物とを含む製品が提供され、この場合、化粧用組成物は、有効成分としてのリグニン改変酵素と、化粧用として許容され得るキャリアとを含む。
【００１９】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の方法は、少なくとも１つのタイプのリグニン改変酵素を含む調製物の局所適用によって達成される。
【００２０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の方法は、少なくとも１つのタイプのリグニン改変酵素を含む調製物の皮内投与または皮下投与によって達成される。
【００２１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニン改変酵素は、皮膚または毛髪への適用のために配合された組成物に含まれる。
【００２２】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニン改変酵素はリグニンペルオキシダーゼである。
【００２３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニンペルオキシダーゼはイソ酵素Ｈ１または改変された形態のイソ酵素Ｈ２である。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用組成物は電子受容体をさらに含む。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、電子受容体は過酸化水素である。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用組成物はベラトリルアルコールをさらに含む。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組成物は少なくとも１つのタイプの表皮浸透剤を含む。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組成物は少なくとも１つのタイプの毛髪浸透剤を含む。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の方法は、所望される明色化のレベルに従って選択された期間にわたって行われる。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用として許容され得るキャリアには、トランスキュトールおよび／またはブチレングリコールが含まれる。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用として許容され得るキャリアには、アルカノールアミンが含まれる。
【００３２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用組成物におけるリグニンペルオキシダーゼは少なくとも１Ｕ／ｇの濃度で提供される。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用組成物における過酸化水素は少なくとも０．００５％の濃度で提供される。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用組成物におけるベラトリルアルコールは少なくとも０．０５％の濃度で提供される。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、皮膚領域または毛髪を明色化するためのキットの第１の容器はベラトリルアルコールをさらに含む。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、皮膚領域または毛髪を明色化するためのキットの第１の容器および／または第２の容器は、表皮浸透のために好適な化粧用として許容され得るキャリアをさらに含む。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、皮膚領域または毛髪を明色化するためのキットの第１の容器および／または第２の容器は、毛髪浸透のために好適な化粧用として許容され得るキャリアをさらに含む。
【００３８】
本発明のさらなる態様によれば、対象の皮膚領域を明色化する方法であって、皮膚領域の細胞に含有される色素を酸化するために好適な様式でリグニン改変酵素を皮膚領域の細胞において発現させることを含む方法が提供される。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前記方法は、皮膚領域の細胞に電子受容体を提供する工程をさらに含む。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、電子受容体は過酸化水素である。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前記方法は、皮膚領域の細胞にベラトリルアルコールを提供する工程をさらに含む。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、発現は、リグニン改変酵素を発現することができる発現ベクターを細胞に導入することによって達成される。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ベクターはウイルスベクターである。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ベクターは、リグニン改変酵素のコード配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニン改変酵素はリグニンペルオキシダーゼである。
【００４６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニンペルオキシダーゼは、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【００４７】
本発明のさらなる態様によれば、リグニンペルオキシダーゼを製造する方法であって、（ａ）ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）菌を、所定の期間、グリセロールを含有する撹拌および通気された培養培地において多孔性マトリックス上で培養すること；（ｂ）前記所定の期間の後、可溶性画分を前記ファネロカエテ・クリソスポリウム菌から抽出して、それによりリグニンペルオキシダーゼを製造することを含む方法が提供される。
【００４８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、培養培地はマンガンイオンを含まない。
【００４９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、通気された培養は、培養培地を０．１〜１リットル／リットル／分の範囲における通気速度に供することによって得られる。
【００５０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、培養は３７℃の温度で達成される。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、撹拌された培養培地は、培養培地を５０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍの範囲における速度で撹拌することによって得られる。
【００５２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、撹拌された培養培地は、培養培地を１００ｒｐｍの速度で撹拌することによって得られる。
【００５３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、所定の期間は３日〜１０日の範囲から選択される。
【００５４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、所定の期間は７日である。
【００５５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、グリセロールは３グラム／リットル〜２０グラム／リットルの濃度範囲で提供される。
【００５６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、グリセロールは６グラム／リットルの濃度で提供される。
【００５７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、培養培地はベラトリルアルコールをさらに含む。
【００５８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ベラトリルアルコールは０．５ｍＭ〜４ｍＭの濃度範囲で提供される。
【００５９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ベラトリルアルコールは２ｍＭの濃度で提供される。
【００６０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニンペルオキシダーゼはイソ酵素Ｈ１または改変された形態のイソ酵素Ｈ２である。
【００６１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、多孔性マトリックスはポリウレタンフォームである。
【００６２】
本発明のさらにさらなる態様によれば、５００ユニット／リットル〜２０００ユニット／リットルの範囲でリグニンペルオキシダーゼ酵素活性を示すファネロカエテ・クリソスポリウム菌の水性抽出物が提供される。
【００６３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニンペルオキシダーゼ活性は１５００ユニット／リットルである。
【００６４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニンペルオキシダーゼ酵素活性はイソ酵素Ｈ１または改変された形態のイソ酵素Ｈ２である。
【００６５】
本発明は、対象の皮膚領域または毛髪を明色化するための効率的な方法および組成物を提供することによって、現在知られている形態の欠点を対処することに成功している。
【００６６】
別途定義されない場合、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同様または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
本発明は、例としてだけであるが、添付されている図面を参照して、本明細書中に記載される。次に図面を詳しく具体的に参照して、示されている細目は、例としてであり、また、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためだけのものであり、従って、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解された記述であると考えられるものを提供するために示されていることが強調される。これに関して、記述を図面と一緒に理解することにより、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者には明らかになるので、発明の構造的詳細を、発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に示すことは試みられていない。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】Ａｌａｌｕｆら（２００１）から採用された哺乳動物メラニンの生合成の先行技術での概略図である。
【図２】ポリウレタンフォームに固定化されたファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）によるリグニンペルオキシダーゼの製造のための撹拌型タンク反応槽（ＳＴＲ）を例示する。
【図３】培養時間を関数とするＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍの発酵装置培養物におけるＬＩＰ活性を例示する。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍは、実施例の節の実施例１に記載されるようなＳＴＲ発酵装置において成長させられ、ＬＩＰ活性が、実施例において記載されるようにベラトリルアルデヒドへのベラトリルアルコールの酸化を追跡することによって細胞外液においてアッセイされた。誤差バーは３回の反復実験の標準偏差を表す。
【図４】５０ｍＭ酒石酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）における１．５ｍＭのベラトリルアルコールの存在下での過酸化水素の増大する濃度の関数としてのＬＩＰ（０．４８μＭ）による７０．５μｇ／ｍｌの初期濃度でのメラニンの酸化を例示する。メラニンの酸化が、酵素反応の開始時および１６０秒後での４６０ｎｍにおけるその吸光度を測定することによって決定され、酸化型メラニンの割合が計算された。誤差バーは３回の反復実験の標準偏差を表す。
【図５】ＬＩＰによるメラニンの酸化に対する過酸化水素の増大する濃度の影響を例示する。メラニン酸化の程度が、過酸化水素を含まない酵素反応（０μＭ）との比較において色強度の減少によって可視化される。写真の下の数字は、μＭで表されるＨ２Ｏ２の濃度を示す。
【図６】ベラトリルアルコール（１．５ｍＭ）および過酸化水素（６００μＭ）の存在下での５０ｍＭ酒石酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）におけるＬＩＰ（０．４８μＭ）による種々の濃度のメラニンの酸化の程度を例示する。誤差バーは３回の反復実験の標準偏差を表す。
【図７】ＬＩＰ濃度の関数としてのメラニン酸化の程度を例示する。メラニン（７０μｇ／ｍｌ）の酸化が、５０ｍＭ酒石酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）におけるベラトリルアルコール（１．５ｍＭ）および過酸化水素（７００μＭ）の存在下での増大する濃度のＬＩＰによって行われた。誤差バーは３回の反復実験の標準偏差を表す。
【図８】クリーム配合物で使用されたときのＬＩＰによるメラニン酸化の可視化を例示する。メラニンの脱色が、活性化剤クリームをＬＩＰクリームに加えた後に観測される（図８ｂ）が、ＬＩＰクリームだけの存在下では観測されない（図８ａ）。
【図９】皮膚の白化に対するＬＩＰクリームの効果を例示する。クリーム配合物でのＬＩＰの（１日に２回の）適用後１週間目に撮影された女性の手の写真が示される。ＬＩＰで処置された領域（図９ａ、黒色の円）は、手におけるそれ以外の皮膚よりもはるかに薄くなっている（図９ｂ）。
【図１０】インビボでの毛髪漂白に対するＬＩＰの効果を例示する。女性の毛髪が５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ１１．５）に１時間浸された。毛髪は２５ＵのＬＩＰと１０秒間プレインキュベーションされ、その後、ベラトリルアルコール（１．５ｍＭ）および過酸化水素（８．８ｍＭ）を伴う酒石酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）に１時間漬けられた。著しい明色化効果が、ＬＩＰを含まない同じ溶液で処理された毛髪（図１０、左側試験管）と比較したとき、ＬＩＰで処理された毛髪において観察された（図１０、右側試験管）。
【図１１】皮膚色素沈着に対するＬＩＰ白化クリームの効果を例示する研究被験者番号１の右前腕のカラー写真である。図１１ａ−０日目に撮影された写真；図１１ｂ−２１日目に撮影された写真。
【図１２ａ−ｂ】研究被験者番号１における皮膚白化に対するＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームの効果を例示する。ＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームが右側および左側の前腕の上部部分に塗布され、一方、下部部分は未処置のままであった。皮膚色素沈着の程度が、Ｄｅｒｍａ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して７日間隔で両方の前腕で測定された。図１２ａ−ＬＩＰクリームの塗布；図１２ｂ−ヒドロキノンクリームの塗布；青色カラム＝ＬＩＰクリームで処置された右前腕の上部部分；明青色カラム＝右前腕の未処置の下部部分；ピンク色カラム＝ヒドロキノンで処置された左前腕の上部部分；白色カラム＝左前腕の未処置の下部部分。
【図１２ｃ】研究被験者番号１における皮膚白化に対するＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームの効果を例示する。ＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームが右側および左側の前腕の上部部分に塗布され、一方、下部部分は未処置のままであった。皮膚色素沈着の程度が、Ｄｅｒｍａ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して７日間隔で両方の前腕で測定された。図１２ｃは、ＬＩＰクリーム（図１２ｃ、青色線）またはヒドロキノンクリーム（図１２ｃ、ピンク色線）を使用する処置の２１日後における上部前腕における皮膚色素沈着の低下を比較する線グラフである。ヒドロキノンクリームを使用したときの適度な低下と比較して、ＬＩＰクリームを使用する処置の２１日後における皮膚色素沈着の急激な低下に留意すること。
【図１３】皮膚色素沈着に対するＬＩＰ白化クリームの効果を例示する研究被験者番号１０の右前腕のカラー写真である。図１３ａ−０日目に撮影された写真；図１３ｂ−２１日目に撮影された写真。
【図１４ａ−ｂ】研究被験者番号１０における皮膚白化に対するＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームの効果を例示する。ＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームが右側および左側の前腕の上部部分に塗布され、一方、下部部分は未処置のままであった。皮膚色素沈着の程度が、Ｄｅｒｍａ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して７日間隔で両方の前腕で測定された。図１４ａ−ＬＩＰクリームの塗布；図１４ｂ−ヒドロキノンクリームの塗布；青色カラム＝ＬＩＰクリームで処置された右前腕の上部部分；明青色カラム＝右前腕の未処置の下部部分；ピンク色カラム＝ヒドロキノンで処置された左前腕の上部部分；白色カラム＝左前腕の未処置の下部部分。
【図１４ｃ】研究被験者番号１０における皮膚白化に対するＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームの効果を例示する。ＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームが右側および左側の前腕の上部部分に塗布され、一方、下部部分は未処置のままであった。皮膚色素沈着の程度が、Ｄｅｒｍａ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して７日間隔で両方の前腕で測定された。図１４ｃは、ＬＩＰクリーム（図１４ｃ、青色線）またはヒドロキノンクリーム（図１４ｃ、ピンク色線）を使用する処置の２１日後における上部前腕における皮膚色素沈着の低下を比較する線グラフである。ヒドロキノンクリームを使用したときの適度な低下と比較して、ＬＩＰクリームを使用する処置の２１日後における皮膚色素沈着の急激な低下に留意すること。
【図１５】全１２名の研究被験者における皮膚白化に対するＬＩＰクリームおよびヒドロキノンクリームの平均効果を例示する線グラフである。図１５ａ−平均色素沈着スコア；図１５ｂ−初期色素沈着スコアの割合としての色素沈着における平均低下。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明は、対象の皮膚領域または毛髪を明色化するために使用することができる方法および化粧用組成物に関する。
【００６９】
具体的には、本発明の方法は、色素沈着過多に関連する医学的状態（例えば、黒皮症、肝斑、老人性色素斑、そばかす、組織黒変症およびほくろなど）から生じる不揃いな皮膚の肌色を処置するために使用することができる。
【００７０】
本発明の原理および操作は、図面および付随する記述を参照してより良く理解することができる。
【００７１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することが可能であり、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであり、限定であるとして見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００７２】
皮膚の色素沈着の程度は一般住民の間での悩みの種である。一部の人々は老人性色素斑および妊娠斑に悩んでおり、そのような色素沈着した斑点を目立たなくしたいと思っている。一部の人々は、皮膚の色素沈着を軽減および緩和する皮膚明色化用製品で通常の場合には処置されるそばかす、肝斑、黒皮症、組織黒変症およびほくろを有する。しかしながら、現在の様々な皮膚明色化用製品は、永続的な白斑および副作用（例えば、皮膚色素異常症および発疹など）をもたらし得るヒドロキノンなどの過激な化学物質であるか、または、皮膚を明色化することにおいて十分に効率的でないかのいずれかである。それらの中には、チロシナーゼ（前駆体Ｌ−チロシンを別の前駆体ドーパキノンに変換する酵素）の阻害、従って、メラニンの生合成を阻害することに基づく製品がある。他の製品は、チロシン／ＤＯＰＡからメラニンに至る様々な段階で酸化反応を阻止し、最終的にはメラニンの生合成を阻害するために設計されている。後者の製品群には、Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）およびビオフラボノイドなどの抗酸化剤が含まれる。
【００７３】
毛髪明色化用製品では、高濃度の過酸化水素がアンモニアと一緒に利用される。これらの製品は、処置された対象にとって不快の種であり得る。
【００７４】
下記の実施例の節において明瞭に例示されるように、本発明者らは、リグニンペルオキシダーゼおよび特にそのＨ１イソ型がメラニンを効率的に酸化することができ、従って、対象の皮膚または毛髪を明色化するために利用できることを発見している。
【００７５】
米国５５７８２９６号では、担子菌菌類におけるメラニン分解能力が同定され、肝斑およびそばかす形成を処置するためにこの菌類を使用することが提案されたが、今日まで、菌類におけるメラニン分解を担う特異的な酵素は発見されていない。
【００７６】
従って、本発明の１つの態様によれば、対象の皮膚領域または毛髪を明色化する方法が提供される。
【００７７】
本発明のこの態様による方法は、少なくとも１つのタイプのリグニン改変酵素を、皮膚領域または毛髪の細胞に含有される色素（例えば、メラニン）を酸化するために好適な様式で対象の皮膚領域または毛髪に適用することによって達成される。
【００７８】
本明細書中で使用される表現「皮膚領域または毛髪を明色化する」は、皮膚または毛髪の色調または色を、それらに含有されるメラニン色素の色素形成性状または濃度を低下させることによって低下させることを示す。
【００７９】
本明細書中で使用される表現「対象」は、哺乳動物（典型的にはヒト）を示し、好ましくは、皮膚または毛髪の過度な色素沈着を有するか、あるいは、そばかすなどの皮膚障害を有する哺乳動物（典型的にはヒト）を示す。
【００８０】
本発明によって利用されるリグニン改変酵素は、好ましくは、リグニン分解において主要な役割を果たしているリグニンペルオキシダーゼである。このリグニン改変酵素の活性部位アミノ酸配列、およびこのリグニン改変酵素が基質を酸化する機構は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびダイズペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）と類似している。リグニン改変酵素は、大きな酸化還元電位を有する基質の酸化を触媒することができる。この特異な能力は、大きな酸化還元電位によって示される、電子密度が低いヘム活性部位と一致している［ＣａｉおよびＴｉｅｎ（１９９３）、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３０：７９〜９０］。
【００８１】
この分野で知られているリグニンペルオキシダーゼのイソ型はどれも本発明によって利用することができる（Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄら、１９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６３：８５７〜８６１）が、本発明では、好ましくは、Ｈ１イソ型が利用される。これは、下記の実施例の節において例示されるように、このイソ型はメラニン酸化活性をインビトロおよびインビボの両方で示したからである。
【００８２】
いくつかの方法を、本発明によって利用されるリグニン改変酵素を調製するために使用することができる。
【００８３】
例えば、リグニンペルオキシダーゼイソ酵素Ｈ１を菌類のファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）から調製することができる。リグニンペルオキシダーゼの高い酵素活性レベルを、ポリウレタンフォームに固定化されながら、または懸濁状態で、撹拌型タンク反応槽（ＳＴＲ）発酵装置において成長させたときに上記菌類から製造することができる（Ｄｏｓｏｒｅｔｚら、１９９３、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５９：１９１９〜２６）。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態によれば、発酵装置は、３７℃の培養温度を維持するための冷却システムに接続され、５０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ（より好ましくは１００ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ、最も好ましくは１６０ｒｐｍ）の速度で撹拌される。リグニンペルオキシダーゼ活性の収量を増大させるために、発酵装置は、１リットルの培養培地につき１分あたり０．１リットル〜１リットルの空気の通気速度で通気される。現時点で好ましい形態によれば、発酵装置は、１リットルの培養培地につき１分あたり０．２リットルの空気の通気速度で通気される。
【００８５】
下記の実施例の節の材料および実験方法において記載されるように、ファネロカエテ・クリソスポリウムは、マンガンイオンを含まず、グリセロールを炭素源として含有する培養条件のもとで培養される。好ましくは、本発明のグリセロールは３グラム／リットル〜２０グラム／リットルの濃度範囲で提供される。現時点で好ましい形態によれば、グリセロールは６グラム／リットルの濃度で提供される。
【００８６】
上記菌類からのリグニンペルオキシダーゼイソ酵素Ｈ１の精製プロセス時において、精製されたタンパク質の酵素活性が、バラトリルアルコールのバラトリルアルデヒドへの酸化のために生じる３１０ｎｍでの吸光度の変化によってさらに試験されている。
【００８７】
リグニンペルオキシダーゼイソ酵素Ｈ１はイソ酵素Ｈ２の翻訳後の脱リン酸化から生じ得る（ＫｕａｎおよびＴｉｅｎ、１９８９）ので、本発明によって使用されるリグニンペルオキシダーゼは、リグニンペルオキシダーゼイソ酵素Ｈ２を脱リン酸化することによって調製することができる。
【００８８】
本発明によって使用されるリグニン改変酵素はまた、米国特許第５２００３３８号に開示されるようにリグニン改変酵素を発現させるために改変された細菌細胞から抽出することができる。例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌など）を、強力な構成的プロモーター（例えば、ＳＰ６）の調節制御下に配置されたＬＩＰコード配列（配列番号１）を含む発現ベクターで形質転換することができる。発現後、細菌細胞を溶解することができ、そして、ＬＩＰを、クロマトグラフィー技術を使用して回収することができる（さらなる詳細について、Ｂｉｌｌｍａｎ−Ｊａｃｏｂｅ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７：５００〜４；ＨａｒｒｉｓおよびＥｍｔａｇｅ、１９８６、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．、３：２８〜３１を参照のこと）。
【００８９】
本発明によって使用されるリグニン改変酵素はまた、ＨｅＬａ細胞などの哺乳動物細胞株から抽出することができる。この場合、ＬＩＰコード配列が、好適な発現ベクター（例えば、ｐＣＤＮ３．１、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ、米国））において強力な哺乳動物プロモーター（例えば、ＣＭＶ）のもとに配置される。発現ベクターによるＨｅＬａ細胞のトランスフェクションの後、ＬＩＰ発現生成物を、従来の精製技術およびクロマトグラフィー技術によって、細胞から、または（例えば、分泌シグナルを含むようにＬＩＰ配列を改変することによって）培地から抽出することができる（さらなる詳細について、ＣｕｎｈａおよびＡｉｒｅｓ−Ｂａｒｒｏｓ、２００２、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：２９〜４０を参照のこと）。
【００９０】
リグニン改変酵素は、さらなる化合物の同時適用を必要とすることなく、皮膚または毛髪に適用することができるが、リグニン改変酵素ＬＩＰの明色化能力は、酸化性の活性化剤として役立つ電子受容体（すなわち、基質を酸化することができる分子）の存在下、および／または、酸化性の媒介因子として役立つフェノール性化合物、例えば、ベラトリルアルコール（Ｈａｒｖｅｙら、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ、２０：３４５〜９）およびベラトロール（Ｗａｒｄら、Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００２）、３０：４９０〜４９８）などの存在下で適用されたときに増強される。
【００９１】
従って、本発明の好ましい実施形態によれば、リグニン改変酵素は、酸化性の活性化剤（例えば、過酸化水素など）および酸化性の媒介因子（例えば、ベラトリルアルコールなど）の事前の適用、同時での適用または後での適用とともに適用される。
【００９２】
リグニン改変酵素は皮膚または毛髪に関してそのものとして適用することができる。しかしながら、明色化効率を増大するために、リグニン改変酵素は、好ましくは、特定の使用のために配合される化粧用組成物（例えば、全身の皮膚の明色化、そばかすの明色化、または毛髪の明色化などのために配合される化粧用組成物など）に含まれる。これらの化粧用組成物は表皮浸透剤（例えば、ブチレングリコールおよびトランスキュトールなど）および毛髪浸透剤（例えば、アルカノールアミンなど）を含むことができる。
【００９３】
本明細書中で使用される「化粧用組成物」は、本明細書中上記に記載される有効成分（例えば、ＬＩＰ）と、さらなる化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤、酸化性の活性化剤および／または酸化性の媒介因子など）とを含む調製物を示す。化粧用組成物の目的は、生物に対する有効成分の投与を容易にすることである。
【００９４】
以下において、使用される表現「好適なキャリア」は、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、リグニン改変酵素の生物学的な活性および性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。
【００９５】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために化粧用組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００９６】
化粧用組成物は、局所的様式で、例えば、化粧用組成物を患者の組織領域に対して直接的に投与することによって適用することができる。好適な投与経路には、例えば、局所的注射、皮下注射および皮内注射が含まれ得る。
【００９７】
本発明の化粧用組成物は、この分野で広く知られている様々な工程によって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来の工程によって製造することができる。
【００９８】
従って、本発明に従って使用される化粧用組成物は、調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合され得る。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【００９９】
注射の場合、化粧用組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的塩緩衝液など）において配合することができる。
【０１００】
あるいは、有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、無菌のパイロジェン非含有水に基づく溶液）を用いて構成される粉末形態にすることができる。
【０１０１】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１０２】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量は、最初はインビトロアッセイから推定することができる。本明細書中において実施例の節に示されるように、ＬＩＰおよび過酸化水素の濃度は、インビトロアッセイから最適化することができ、インビボ使用のためにさらに適合化することができる。また、用量は、所望される濃度または力価を達成するために、組織培養システムまたは動物モデルにおいて定めることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１０３】
皮膚色素沈着障害（例えば、肝斑、黒皮症、組織黒変症およびほくろ）の重篤度および皮膚の応答性に依存して、投薬は単回または複数の投与であり得る。この場合、処置の経過期間は数日から数週間まで、または、治癒が達成されるか、または、皮膚障害の軽減が達成されるまで続く。
【０１０４】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、病気の重篤度、投与様式、処方医師の判断などに依存する。
【０１０５】
本発明の化粧用組成物に含まれるリグニン改変酵素はまた、皮膚色素沈着障害（例えば、黒皮症、肝斑、組織黒変症およびほくろなど）を処置するための医薬組成物として、より高い濃度で提供することができ、また、医師によって処方することができる。
【０１０６】
下記は、リグニン改変酵素を含む、皮膚または毛髪の明色化のために配合された配合物の記載である。
【０１０７】
皮膚の明色化
皮膚の明色化を最適化および制御するために、リグニン改変酵素は、好ましくは、皮膚を明色化する目的のために配合される化粧用組成物に含まれる。
【０１０８】
本発明の皮膚明色化用の化粧用組成物はインビボで用いられるので、組成物は好ましくは高純度であり、かつ潜在的に有害な混入物を実質的に含まず、例えば、少なくともＮａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｏｄ（ＮＦ）規格であり、一般には少なくとも分析用規格であり、好ましくは少なくとも医薬品規格である。特定の化合物が使用前に合成されなければならないならば、そのような合成またはその後の精製は、合成手法時または精製手法時に使用されていたかもしれない何らかの潜在的に混入する毒性剤を実質的に含まない生成物をもたらされなければならない。
【０１０９】
有効成分
リグニン改変酵素（例えば、リグニンペルオキシダーゼなど）は、１Ｕ／ｇ〜１００Ｕ／ｇの範囲から選択される濃度で本発明の化粧用組成物に含まれる。現在知られている形態によれば、本発明の化粧用組成物に含まれるリグニン改変酵素は、５Ｕ／ｇ〜１００Ｕ／ｇの範囲から選択される濃度で提供される。リグニン改変酵素の好ましい濃度は、組成物の具体的な使用に従って選択されることが理解され、従って、一般的な皮膚明色化のためには、５Ｕ／ｇ〜２０Ｕ／ｇの好ましい濃度が利用され、一方で、そばかす明色化のためには、５Ｕ／ｇ〜１００Ｕ／ｇのより広い濃度が利用される。
【０１１０】
皮膚明色化用の化粧用組成物によって使用される電子受容体（酸化性の活性化剤）は、好ましくは、少なくとも０．００５％の濃度で提供される過酸化水素である。過酸化水素は安定であるが、中性またはアルカリ性の条件のもとでは分解して、水および酸素の活性な化学種を形成する。酸素の活性な化学種は非常に反応性である。
【０１１１】
化粧用組成物は、リグニンペルオキシダーゼが４未満のｐＨ（好ましくはｐＨ２．５〜３．５）のみで活性であり、また、過酸化水素がそのようなｐＨにおいて安定であるので、４以下のｐＨに好ましくは緩衝化される。
【０１１２】
４以下のｐＨを維持することができる緩衝剤はどれも用いることができる。従って、酢酸、酒石酸、リン酸またはクエン酸を用いる緩衝剤を皮膚明色化用の化粧用組成物によって使用することができる。
【０１１３】
下記の実施例の節において示されるように、本発明の過酸化水素は、リン酸を用いてｐＨ３．５において安定化される。
【０１１４】
本発明によって使用される酸化性の媒介因子は、酸化電位およびリグニン改変酵素の安定性を増大させる小さい芳香族分子、すなわち、より具体的にはメトキシル化化合物である。本発明によって使用される好ましい酸化性の媒介因子はベラトリルアルコールおよびベラトロールである。
【０１１５】
実施例の節において明らかにされるように、本発明の化粧用組成物に含まれるベラトリルアルコールは、好ましくは、少なくとも０．０５％の濃度で水に希釈される。
【０１１６】
表皮浸透剤
有効成分（例えば、ＬＩＰ）の経皮吸収を高めるために、数多くの薬剤の１つまたは複数を化粧用組成物に加えることができ、これらには、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤、アゾン、アルコール、アセトン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
下記の実施例の節において例示されるように、リグニン改変酵素（ＬＩＰ）および活性化剤（過酸化水素）は、好ましくは、ＬＩＰの皮膚浸透を高めるために最適化された様式および濃度で、ブチレングリコールおよびトランスキュトールなどの表皮浸透剤とそれぞれ混合される。本発明によって使用されるブチレングリコールは少なくとも１％の濃度で提供され、トランスキュトールは少なくとも３％の濃度で提供される。
【０１１８】
キャリア
本明細書中に開示される薬剤の薬学的に効果的な量に加えて、本発明のこの態様の化粧用組成物はまた皮膚科学的に許容され得るキャリアを含む。
【０１１９】
表現「皮膚科学的に許容され得るキャリア」は、皮膚（すなわち、ケラチン組織）への局所的適用のために好適であり、良好な美学的性質を有し、本発明の活性な薬剤および任意の他の成分との適合性を有し、また、哺乳動物における使用のために安全かつ非毒性であるキャリアを示す。キャリアの効果的な量は、組成物の重量比で約５０％〜約９９．９９％（好ましくは約８０％〜約９９．９％、より好ましくは約９０％〜約９８％、最も好ましくは約９０％〜約９５％）の範囲から選択される。
【０１２０】
エマルション
本発明の組成物において利用されるキャリアは広範囲の様々な形態であり得る。これらには、水中油型エマルション、油中水型エマルション、水中油中水型エマルションおよび油中水中シリコーン型エマルション（これらに限定されない）を含むエマルションキャリア、クリーム、軟膏、水溶液、ローションまたはエアロゾルが含まれる。当業者によって理解されるように、特定の成分は、組成物における成分の水溶解性／分散性に依存して、水相または油／シリコーン相のいずれかに主に分布する。
【０１２１】
本発明によるエマルションは一般に、薬学的に効果的な量の本明細書中に開示される薬剤と、脂質またはオイルとを含有する。脂質およびオイルは、動物、植物または石油に由来し得るし、また、天然物または合成物（すなわち、人工物）であり得る。好ましいエマルションはまた、グリセリンなどの保湿剤を含有する。エマルションは、好ましくは、キャリアの重量に基づいて、約１％〜約１０％（より好ましくは約２％〜約５％）の乳化剤をさらに含有する。乳化剤は、非イオン性、アニオン性またはカチオン性であり得る。好適な乳化剤が、例えば、米国特許第３７５５５６０号（Ｄｉｃｋｅｒｔらに対して発行、１９７３年８月２８日）、米国特許第４４２１７６９号（Ｄｉｘｏｎらに対して発行、１９８３年１２月２０日）、および、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎｓ’ｓ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｃｉｆｉｅｒｓ（北アメリカ版、３１７頁〜３２４頁、１９８６年）に記載される。
【０１２２】
エマルションはまた、ケラチン組織への適用時の泡立ちを最小限に抑えるための消泡剤を含有することができる。消泡剤には、そのような使用のためにこの分野で広く知られている高分子量シリコーンおよび他の物質が含まれる。
【０１２３】
好適なエマルションは、所望される製品形態に依存して、広範囲の様々な粘度を有し得る。好まれる例示的な低粘度エマルションは約５０センチストークス以下の粘度を有し、より好ましくは約１０センチストークス以下の粘度を有し、最も好ましくは約５センチストークス以下の粘度を有する。エマルションはまた、ケラチン組織への適用時の泡立ちを最小限に抑えるための消泡剤を含有することができる。消泡剤には、そのような使用のためにこの分野で広く知られている高分子量シリコーンおよび他の物質が含まれる。
【０１２４】
１つのタイプのエマルションは水中シリコーン型エマルションである。水中シリコーン型エマルションは、連続したシリコーン相と、分散された水相とを含有する。本発明の好ましい水中シリコーン型エマルションは、重量比で約１％〜約６０％（好ましくは約５％〜約４０％、より好ましくは約１０％〜約２０％）の連続したシリコーン相を含む。連続したシリコーン相は、本明細書中下記において記載される不連続な水相を含有または取り囲む外側相として存在する。
【０１２５】
連続したシリコーン相はポリ有機シロキサンオイルを含有することができる。好ましい水中シリコーン型エマルション系は、本明細書中に開示される薬剤の薬学的に効果的な量を送達するための酸化安定性ビヒクルを提供するために配合される。これらの好ましいエマルションの連続したシリコーン相は約５０重量％〜約９９．９重量％の間の有機ポリシロキサンオイルおよび約５０重量％未満の非シリコーンオイルを含む。特に好ましい実施形態において、連続したシリコーン相は、連続したシリコーン相の重量比で少なくとも約５０％（好ましくは約６０％〜約９９．９％、より好ましくは約７０％〜約９９．９％、さらにより好ましくは約８０％〜約９９．９％）のポリ有機シロキサンオイルと、連続したシリコーン相の重量比で約５０％までの非シリコーンオイル（好ましくは約４０％未満、より好ましくは約３０％未満、さらにより好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約２％未満）とを含む。これらの有用なエマルション系は、より低い濃度のポリ有機シロキサンオイルを含有する匹敵し得る水中油型エマルションよりも大きい酸化安定性を長い期間にわたって提供し得る。連続したシリコーン相における非シリコーンオイルの濃度は、組成物における本発明の活性な化合物の酸化安定性をおそらくはさらに高めるように最小限に抑えられるか、または完全に回避される。このタイプの水中シリコーン型エマルションが米国特許第５６９１３８０号（Ｍａｓｏｎら、１９９７年１１月２５日発行）に記載される。
【０１２６】
組成物において使用される有機ポリシロキサンオイルは揮発性または不揮発性であり得るか、あるいは揮発性シリコーンおよび不揮発性シリコーンの混合物であり得る。これに関連して使用される用語「不揮発性」は、周囲の条件のもとで液体であり、かつ、約１００℃以上の引火点（１気圧下）を有するそのようなシリコーンを示す。これに関連して使用される用語「揮発性」は、すべての他のシリコーンオイルを示す。好適な有機ポリシロキサンオイルは、広範囲の揮発性および不揮発性に及ぶ広範囲の様々なシリコーンから選択することができる。好適な有機ポリシロキサンオイルの例には、ポリアルキルシロキサン、環状ポリアルキルシロキサンおよびポリアルキルアリールシロキサンが含まれ、これらは当業者に知られており、また市販されている。
【０１２７】
連続したシリコーン相は１つまたは複数の非シリコーンオイルを含有することができる。連続したシリコーン相における非シリコーンオイルの濃度は、好ましくは、組成物における薬学的に効果的な薬剤の酸化安定性をさらに高めるように最小限に抑えられるか、または完全に回避される。好適な非シリコーンオイルは、約１気圧の圧力もとで約２５℃以下の融点を有する。連続したシリコーン相における使用のために好適な非シリコーンオイルの例が、水中油型エマルションの形態での局所用パーソナルケア製品における化学技術分野で広く知られているものであり、例えば、鉱油、植物油、合成油、半合成油などである。
【０１２８】
本発明の有用な局所用組成物は、約３０％〜約９０％（より好ましくは約５０％〜約８５％、最も好ましくは約７０％〜約８０％）の分散された水相を含む。用語「分散（された）相」は、当業者にはよく知られており、相が、連続（した）相に懸濁され、かつ連続相によって囲まれている小さい粒子または液滴として存在することを含意する。分散相はまた、内部相または不連続相として知られている。分散された水相は、本明細書中前記の連続したシリコーン相に懸濁され、そのようなシリコーン相によって囲まれている小さい水性の粒子または液滴の分散物である。水相は水であり得るか、あるいは、水および１つまたは複数の水溶性成分または水分散性成分の組合せであり得る。必要に応じて使用されるそのような成分の非限定的な例には、増粘剤、酸、塩基、塩、キラント、ガム、水溶性または水分散性のアルコールまたはポリオール、緩衝剤、保存剤、日焼け止め剤および着色剤などが含まれる。
【０１２９】
本発明の局所用組成物は、典型的には、組成物の重量比で、分散された水相において約２５％〜約９０％（好ましくは約４０％〜約８０％、より好ましくは約６０％〜約８０％）の水を含む。
【０１３０】
本発明の水中シリコーン型エマルションは好ましくは乳化剤を含む。好ましい実施形態において、組成物は、組成物の重量比で、約０．１％〜約１０％の乳化剤、より好ましくは約０．５％〜約７．５％の乳化剤、最も好ましくは約１％〜約５％の乳化剤を含有する。乳化剤は、連続したシリコーン相における水相の分散および懸濁を助ける。
【０１３１】
広範囲の様々な乳化剤を、好ましい水中シリコーン型エマルションを形成させるために本発明では用いることができる。知られている乳化剤または従来の乳化剤を、選択された乳化剤が組成物の必須成分と化学的および物理的に適合し、かつ、所望される分散特性を提供するならば、組成物において使用することができる。好適な乳化剤には、局所用パーソナルケア製品における使用について当業者によって知られているシリコーン乳化剤（例えば、有機修飾された有機ポリシロキサン）（これはまた、シリコーン界面活性剤として当業者に知られている）、シリコーン非含有乳化剤、およびそれらの混合物が含まれる。
【０１３２】
有用な乳化剤には、広範囲の様々なシリコーン乳化剤が含まれる。これらのシリコーン乳化剤は、典型的には、有機修飾された有機ポリシロキサンであり、これはまた、シリコーン界面活性剤として当業者には知られている。好適な乳化剤が、例えば、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ，Ｄｅｔｅｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ（北アメリカ版、１９８６年；Ａｌｌｕｒｅｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより刊行）；米国特許第５０１１６８１号（Ｃｉｏｔｔｉら、１９９１年４月３０日発行）、米国特許第４４２１７６９号（Ｄｉｘｏｎら、１９８３年１２月２０日発行）および米国特許第３７５５５６０号（Ｄｉｃｋｅｒｔら、１９７３年８月２８日発行）に記載される。
【０１３３】
他の好ましい局所用キャリアには、連続した水相と、連続した水相に分散された疎水性の水不溶性相（「油相」）とを有する油中水型エマルションが含まれる。油中水型エマルションを含む好適なキャリアの例が、米国特許第５０７３３７１号（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９１年１２月１７日発行）、米国特許第５０７３３７２号（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９１年１２月１７日発行）に記載される。構造剤、親水性界面活性剤および水を含有する特に好ましい油中水型エマルションが本明細書中下記において詳しく記載される。
【０１３４】
好ましい油中水型エマルションは、液晶ゲル網目構造の形成を助けるための構造剤を含む。理論によって限定されないが、構造剤は、組成物の安定性に寄与するレオロジー学的特徴を組成物に提供することを助けると考えられる。構造剤はまた、乳化剤または界面活性剤として機能し得る。本発明の好ましい組成物は、組成物の重量比で約０．５％〜約２０％（より好ましくは約１％〜約１０％、最も好ましくは約１％〜約５％）の構造剤を含む。本発明の好ましい構造剤は、ステアリン酸、パルミチン酸、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ベヘニルアルコール、ステアリン酸、パルミチン酸、平均して約１個〜約２１個のエチレンオキシドユニットを有するステアリルアルコールのポリエチレングリコールエーテル、平均して約１個〜約５個のエチレンオキシドユニットを有するセチルアルコールのポリエチレングリコールエーテル、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【０１３５】
広範囲の様々なアニオン性界面活性剤もまた、本発明では有用である。例えば、米国特許第３９２９６７８号（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９７５年１２月３０日発行）を参照のこと。また、両性界面活性剤および双性イオン型界面活性剤もまた、本発明では有用である。
【０１３６】
好ましい油中水型エマルションは、約０．０５％〜約１０％（好ましくは約１％〜約６％、最も好ましくは約１％〜約３％）の、疎水性物質を水相に分散させることができる少なくとも１つの親水性界面活性剤を含む（局所用キャリアの重量比による百分率）。界面活性剤は、最少量において、水に分散するために十分に親水性でなければならない。好適な界面活性剤には、広範囲の様々な知られているカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、双性イオン型界面活性剤および両性界面活性剤のいずれかが含まれる。ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ，Ｄｅｔｅｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ（北アメリカ版、１９８６年；Ａｌｌｕｒｅｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより刊行）；米国特許第５０１１６８１号（Ｃｉｏｔｔｉら、１９９１年４月３０日発行）、米国特許第４４２１７６９号（Ｄｉｘｏｎら、１９８３年１２月２０日発行）および米国特許第３７５５５６０号を参照のこと。選ばれる的確な界面活性剤は、組成物のｐＨ、および存在する他の成分に依存する。カチオン性界面活性剤が好ましく、特に、ジアルキル第四級アンモニウム化合物が好ましく、その例が米国特許第５１５１２０９号（ＭｃＣａｌｌら、１９９２年９月２９日発行）、米国特許第５１５１２１０号（Ｓｔｅｕｒｉら、１９９２年９月２９日発行）、米国特許第５１２０５３２号、米国特許第４３８７０９０号、米国特許第３１５５５９１号、米国特許第３９２９６７８号、米国特許第３９５９４６１号；ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ，Ｄｅｔｅｇｅｎｔｓ ＆ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ（北アメリカ版、１９７９年；Ｍ．Ｃ．Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）；および、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ，Ｔｈｅｉｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９４９年）に記載される。
【０１３７】
あるいは、他の有用なカチオン性乳化剤には、アミノ−アミドが含まれる。これらのカチオン性乳化剤の非限定的な例には、ステアルアミドプロピルＰＧジモニウムクロリドホスファート、ベヘンアミドプロピルＰＧジモニウムクロリド、ステアルアミドプロピルエチルジモニウムエトスルファート、ステアルアミドプロピルジメチル（ミリスチルアセタート）アンモニウムクロリド、ステアルアミドプロピルジメチルセテアリルアンモニウムトシラート、ステアルアミドプロピルジメチルアンモニウムクロリド、ステアルアミドプロピルジメチルアンモニウムラクタート、およびそれらの混合物が含まれる。
【０１３８】
好ましい油中水型エマルションは、局所用キャリアの重量比で約２５％〜約９８％（好ましくは約６５％〜約９５％、より好ましくは約７０％〜約９０％）の水を含む。
【０１３９】
局所用組成物
化粧用組成物は、下記において記載されるように、溶液、ローション、スプレー、クリーム、軟膏、膏薬、ゲルなどを含む、皮膚への適用のために化粧品業界によって利用されている様々な形態のいずれかで配合することができる。
【０１４０】
好ましくは、化粧用組成物は、処置された皮膚領域に留まるために十分な粘性で配合され、容易に蒸発せず、かつ／または、水によるすすぎによって容易に除去されず、むしろ、石けん、洗剤および／またはシャンプーの助けを借りて除去可能である。
【０１４１】
そのような性質を有する組成物を調製するための様々な方法が、当業者には広く知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０、上掲）；および、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（第６版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９５）に詳しく記載されている。
【０１４２】
キャリア
ローションおよびクリーム（これらに限定されない）を含む本発明の局所用組成物は、皮膚科学的に許容され得る皮膚軟化剤を含むことができる。そのような組成物は、好ましくは、約２％〜約５０％の皮膚軟化剤を含む。本明細書中で使用される「皮膚軟化剤」は、乾燥の防止または軽減のために、そして同様に皮膚の保護のために有用である物質を示す。広範囲の様々な好適な皮膚軟化剤が知られており、これらを本発明において使用することができる。例えば、Ｓａｇａｒｉｎ、Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（第２版、第１巻、３２４３頁、１９７２年）を参照のこと；これには、皮膚軟化剤として好適な物質の数多くの例が含まれる。好ましい皮膚軟化剤はグリセリンである。グリセリンは、好ましくは、約０．００１％〜約２０％（より好ましくは０．０１％〜約１０％、最も好ましくは約０．１％〜約５％）の量で使用され、例えば、３％の量で使用される。
【０１４３】
本発明によるローションおよびクリームは、一般に、溶液キャリアシステムと、１つまたは複数の皮膚軟化剤とを含む。ローションは、典型的には、約１％〜約２０％（好ましくは約５％〜約１０％）の皮膚軟化剤と、約５０％〜約９０％（好ましくは約６０％〜約８０％）の水と、薬学的に効果的な量の本明細書中に記載される薬剤とを含む。クリームは典型的には、約５％〜約５０％（好ましくは約１０％〜約２０％）の皮膚軟化剤と、約４５％〜約８５％（好ましくは約５０％〜約７５％）の水と、薬学的に効果的な量の本明細書中に記載される薬剤とを含む。
【０１４４】
本発明の局所適用される化粧用組成物はまた、例えば、香り因子および皮膚栄養因子に関して化粧用組成物を高めるために、加えられるさらなる成分を含むことができる。
【０１４５】
そのような成分は、毒性、不適合性、不安定性およびアレルギー応答などを妥当な医学的判断の範囲内で誘導することを伴わないヒトケラチン組織における使用のために好適に選択される。また、必要に応じて使用されるそのような成分は、本発明の活性な化合物の利点を受け入れられないほど変化させないならば、有用である。
【０１４６】
ＣＴＦＡ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第２版、１９９２年）には、本発明の組成物における使用のために好適である、スキンケア産業において一般的に使用されている広範囲の様々な非限定的な化粧用成分が記載される。これらの成分クラスの例には、研磨剤、吸収剤、美学的成分（例えば、香料、顔料、着色剤、精油、皮膚感覚剤、収斂剤など）（例えば、丁子油、メントール、樟脳、ユーカリ油、オイゲノール、乳酸メチル、マンサク留出物）、ニキビ防止剤、固化防止剤、消泡剤、抗菌剤（例えば、ヨードプロピルブチルカルバマート）、抗酸化剤、結合剤、生物学的添加剤、緩衝化剤、増量剤、キレート化剤、化学的添加剤、着色剤、化粧用収斂剤、化粧用殺生物剤、変性剤、薬物収斂剤、外用鎮痛剤、フィルム形成特性および組成物の実質性を助けるためのフィルム形成剤またはフィルム物質（例えば、ポリマー）（例えば、エイコセンおよびビニルピロリドンの共重合体）、不透明化剤、ｐＨ調節剤、噴射剤、還元剤、金属イオン封鎖剤、皮膚調節剤（例えば、多種のものおよび吸蔵剤等の保湿剤）、皮膚の平滑化および／または治癒用の薬剤（例えば、パンテノールおよび誘導体（例えば、エチルパンテノール）、アロエ、パントテン酸およびその誘導体、アラントイン、ビサボロール、ならびに、グリシレチン酸二カリウム）、皮膚処置剤、増粘剤、ならびに、ビタミンおよびその誘導体が含まれる。
【０１４７】
化粧用組成物は皮膚に対して直接的に塗布することができる。あるいは、化粧用組成物は、この分野で知られている様々な経皮薬物送達システム（例えば、組成物を皮膚内に時間放出様式で放出する経皮パッチなど）による通常的な皮膚適用によって送達することができる。この分野で知られている他の薬物送達システムには、加圧エアロゾルボトル、イオン導入法または超音波導入法が含まれる。イオン導入法は、皮膚透過性を増大させ、経皮送達を促進させるために用いられる。米国特許第５６６７４８７号および同第５６５８２４７号には、皮膚を横断する治療剤の、超音波−イオン導入法により媒介される輸送のために好適なイオノソニック装置が開示される。あるいは、またはさらに、リポソームまたはミセルもまた、送達ビヒクルとして用いることができる。
【０１４８】
本発明の化粧用組成物に含まれる有効成分は、メラニンを酸化することによる皮膚の明色化のために好適である。しかしながら、その酸化反応は、還元性試薬の加えることによって所望されるときに制御および停止することができる。このような試薬は、別個の化粧用組成物において配合することができ、所望される時に皮膚に塗布することができる。
【０１４９】
毛髪の明色化
有効成分
本発明の教示に従って配合される毛髪明色化用組成物は、本明細書中上記に記載される酸化性の薬剤および媒介因子を含む。
【０１５０】
下記の実施例の節において明らかにされるように、毛髪の明色化は、ｐＨが３．５の酒石酸塩緩衝液において１．５ｍＭのベラトリルアルコールおよび８．８ｍＭの過酸化水素の存在下で達成することができる。
【０１５１】
軟化剤
軟化剤には、炭化水素オイルおよびワックス（例えば、鉱油およびワセリンなど）、植物および動物の油脂（例えば、オリーブ油、パーム油、ひまし油、トウモロコシ油およびダイズ油など、ならびに、ラノリンおよびその誘導体（ラノリン、ラノリン油、ラノリンワックスおよびラノリンアルコールなど）など）が含まれるが、これらに限定されない。他の軟化剤には、１０個〜２０個の炭素原子を有する脂肪酸（例えば、ミリスチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸およびパルミチン酸などを含む）のエステル、例えば、ミリスチン酸メチル、ミリスチン酸プロピル、ミリスチン酸ブチル、ステアリン酸プロピル、イソステアリン酸プロピルおよびパルミチン酸プロピルなどが含まれる。他の軟化剤には、ステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、イソステアリン酸およびパルミチン酸などを含む、１０個〜２０個の炭素原子を有する脂肪酸が含まれる。軟化剤にはまた、セチルアルコール、ミリスチルアルコール、ラウリルアルコール、イソステアリルアルコールおよびステアリルアルコールなどの、１０個〜２０個の炭素原子を有する脂肪アルコールが含まれる。
【０１５２】
一部は水溶性であるが、多価アルコールおよびポリエーテル誘導体が軟化剤として含まれ、これらには、グリコール類、グリセロール、ソルビトールおよびポリアルキレングリコールなど、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール２００〜５００などが含まれる。水溶性の例が好ましい。
【０１５３】
界面活性剤
乳化剤／界面活性剤もまた、本発明の毛髪明色化用組成物によって利用されることが好ましい。
【０１５４】
界面活性剤の例には、親水性のアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシド、ポリエチレンオキシドまたはポリエチレングリコールとの縮合のために利用可能なフリーの反応性水素を有する疎水性のアルキル官能基、アルケン官能基またはアルキル芳香族官能基のポリオキシアルキレンオキシド縮合生成物が含まれるが、これに限定されない。特に効果的なものは、オクチルフェノールと、約７モル〜約１３モルのエチレンオキシドとの縮合生成物であり、これらはそれらの商品名ＴＲＩＴＯＮ１００（登録商標）シリーズの製品でＲｏｈｍ＆Ｈａａｓ Ｃｏｍｐａｎｙによって販売されている。
【０１５５】
他の成分、例えば、香料、安定化剤、色素、抗微生物剤、抗菌剤、凝集防止剤、紫外線吸収剤などもまた、本発明の毛髪明色化用組成物に含まれる。
【０１５６】
コンディショナー
酸加水分解に対して安定なコンディショナー薬剤（例えば、エトキシル化モノクアド（ｑｕａｄ）とともに少なくとも１つの第四級アンモニウム成分を有するシリコーン化合物など）もまた、本発明の毛髪明色化用組成物を安定化し、場合により粘性を高めるために利用されることが好ましい。
【０１５７】
必要に応じて使用される増粘剤もまた、組成物の美観を改善し、また、毛髪への組成物の適用を容易にするために含めることができる。０重量％〜約３重量％の量での非イオン性の増粘剤が好ましい。例示的な増粘剤には、メチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース、ジ（水素化タロー）フタル酸アミド、架橋された無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体、グアールガム、キサンタンガムおよびアラビアゴムがある。
【０１５８】
コンディショニング用組成物のキャリアは主として水である。しかし、有機溶媒もまた、組成物の製造を容易にするために、または、美学的性質（例えば、粘度制御など）を提供するために含めることができる。好適な溶媒には、エチルアルコールおよびイソプロピルアルコールのような低級アルコール；２−ブトキシエタノール、エチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールおよびジエチレングリコールモノエチルエーテルまたはジエチレングリコールモノメチルエーテルのようなグリコールエーテル；およびそれらの混合物が含まれる。非水性溶媒は、組成物のキャリアの総重量の重量比で約１％〜約５０％の量で、特に約５％〜約２５％の量で本発明のコンディショニング用組成物に存在させることができる。
【０１５９】
不透明なコンディショナーにおいて使用され得る非限定的なコンディショニング用薬剤には、ステアリルトリメチルアンモニウムクロリド、ベヘントリメチルアンモニウムクロリド、セトリモニウムブロミド、ソイトリモニウムクロリド、タロートリモニウムクロリド、二水素化タロージメチルアンモニウムクロリド、ベヘントリメチルアンモニウムメトスルファート、Ｐｅｇ−２オレアンモニウムクロリド、二水素化タロージメチルアンモニウムブロミド、二水素化タロージメチルアンモニウムメトスルファート、パルミチルトリメチルアンモニウムクロリド、水素化タロートリメチルアンモニウムクロリド、水素化タロートリメチルアンモニウムブロミド、ジセチルジメチルアンモニウムクロリド、ジステアリルジメチルアンモニウムクロリド、ジパルミチルジメチルアンモニウムクロリド、水素化タロートリメチルアンモニウムメトスルファート、セトリモニウムトシラート、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリド、およびジタロージメチルアンモニウムクロリドが含まれる。
【０１６０】
本発明の組成物を不透明化するために使用され得る物質には、脂肪エステル、不透明化ポリマー（例えば、ＯＰＡＣＩＦＩＥＲ６５３（これはＭｏｒｔｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から得られる）のようなスチレンポリマーなど）、および脂肪アルコールが含まれる。下記は脂肪アルコールの非限定的な列挙である：セチルアルコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、ベヘニルアルコールおよびアラキジルアルコール。透明でない本発明のコンディショニング用組成物はまた、Ｌｅｘａｍｉｎｅ Ｓ−１３、ジセチルアンモニウムクロリド、およびセテアレス（ｃｅｔｅａｒｅｔｈ）−２０を含むことができる。
【０１６１】
本発明の組成物は、所望される場合、皮膚または毛髪の明色化における使用のための適切な説明書、および、皮膚または毛髪の明色化における使用のためのＦＤＡ承認を示す表示と一緒に、ディスペンサーデバイスまたはキットで提供され得る。
【０１６２】
皮膚領域または毛髪を明色化するためのキットは、例えば、好適な緩衝液、キャリア、浸透剤などとともに提供されるリグニン改変酵素を含む容器と、上記の酸化性の薬剤および媒介因子を含むさらなる容器とを含むことができる。
【０１６３】
リグニン改変酵素はまた、この分野で知られている分子生物学的方法を使用することによって皮膚領域の細胞の中に導入することができる。
【０１６４】
従って、本発明のさらに別の態様によれば、対象の皮膚領域を明色化する方法が提供される。本発明のこの態様による方法は、皮膚領域の細胞に含有され得る色素を酸化するために好適な様式でリグニン改変酵素を皮膚領域の細胞内において発現させることによって達成される。
【０１６５】
そのような発現は、プロモーター配列に機能的に連結されたリグニン改変酵素のコード配列を含む発現ベクターで皮膚の細胞を形質転換することによって達成することができる。
【０１６６】
そのような発現ベクターを作製するために、リグニン改変酵素をコードするポリヌクレオチドセグメント（例えば、ＬＩＰのＨ１イソ型、配列番号１）を、哺乳動物細胞を形質転換するために好適であり、かつ、形質転換された細胞におけるリグニン改変酵素の発現を行わせるために好適である市販の発現ベクターシステムに連結することができる。そのような市販のベクターシステムは、既存のプロモーター配列またはエンハンサー配列を置換し、または複製し、または変異させるために、かつ／あるいは任意のさらなるポリヌクレオチド配列（例えば、さらなる選択マーカーをコードする配列、またはレポーターポリペプチドをコードする配列など）を導入するために、一般に使用されている様々な組換え技術によって容易に改変され得ることが理解される。
【０１６７】
本発明とともに使用される好適な哺乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびにそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
本発明のこの態様とともに使用される好適な発現ベクターは、アデノウイルスに基づくベクターである。アデノウイルスベクターは、皮膚ガン治療を含む様々な医薬的適用のために広く使用されている（Ｇｈａｚｉｚａｄｅｈ Ｓ、Ｔａｉｃｈｍａｎ ＬＢ（２０００）、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１１：２２４７〜５１；Ｃａｒｔｅｒ ＰＪ、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ（２０００）、Ｉｎｔ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、６：１７〜２１）。
【０１６９】
上記の発現ベクターは、様々な送達方法を使用して細胞内に送達することができ、これらには、リポソーム、表皮パッチ、イオン導入法または受容体媒介エンドサイトーシス（これらに限定されない）が含まれる。
【０１７０】
後者の方法において、エンドサイトーシスを受けることが知られている細胞表面受容体に対する抗体またはリガンドが、共有結合的に連結されたポリカチオン性付加物（例えば、ポリリシン、各種プロタミン）を介して、リグニン改変酵素をコードするＤＮＡ配列と複合体化される。そのような複合体は細胞表面に対するその結合特異性を保持しており、複合体が通常のエンドサイトーシスプロセスによってエンドソーム区画に進入する細胞に取り込まれる。また、様々な段階を、エンドソーム−リソソーム内でのＤＮＡの分解を回避するために取らなければならない。細胞は、トランスフェクション手法の期間中、リソソーム向性剤クロロキンで処理することができる。あるいは、エンドサイトーシスによって細胞の中に進入し、かつエンドソーム「突出」能を有するウイルスの成分を使用することができる。リガンド−ＤＮＡ複合体にカップリングされた複製欠陥アデノウイルスは、インビトロで組織培養細胞に対して事実上１００％のトランスフェクション効率をもたらす。予備的研究では、ＤＮＡを選ばれた細胞タイプにインビボで特異的に標的化するこの方法の潜在的可能性が明らかにされている（Ｇｕｙ Ｊ、Ｄｒａｂｅｋ Ｄ、Ａｎｔｏｎｉｏｕ Ｍ（１９９５）、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９５、３：２３７〜４８）。
【０１７１】
標的細胞内での発現の後、記載された電子受容体および媒介因子が、好ましくは、明色化を促進させるために、処置されている領域に適用される。
【０１７２】
リグニン改変酵素を標的細胞内において発現させることは、酵素そのものの細胞内送達が必要であることを克服し、それにより明色化効率を潜在的に高めるので、特に好都合である。
【０１７３】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１７４】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１７５】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１７６】
背景
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ菌におけるリグニンペルオキシダーゼ
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ＢＫＭ−Ｆ−１７６７の培養物の細胞外液においてリグニン分解活性を示すヘムタンパク質が１２個以上存在する。これらは、リグニンペルオキシダーゼ（ＬＩＰ）およびマンガンペルオキシダーゼ（ＭＮＰ）の２つのタイプのグリコシル化ヘムペルオキシダーゼに分類することができる。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８およびＨ１０のイソ酵素がＬＩＰであることが報告され、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５およびＨ９がＭＮＰとして同定されている（Ｆａｒｒｅｌｌら、１９８９）。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍのこれらのＬＩＰイソ酵素は、一群の構造的に関連した遺伝子のファミリーによってコードされており、その物理的特性、基質特異性および安定性が異なる（Ｆａｒｒｅｌｌら、１９８９；Ｓｔｅｗａｒｔら、１９９２）。それらの分泌を生じさせるプロセスの一部として、いくつかのＬＩＰイソ酵素はタンパク質分解的に切断され、また、グリコシル化される（Ｇｈｏｓｅ、１９８７；Ｒｉｔｃｈら、１９９１；ＴｉｅｎおよびＫｉｒｋ、１９８４）。また、Ｈ２、Ｈ６、Ｈ８およびＨ１０のＬＩＰイソ酵素は、アスパラギン結合型オリゴ糖に含有されるマンノース−６−リン酸成分においてリン酸化されることが報告されている。時間をおいた細胞外液の分析から、イソ酵素Ｈ１は、おそらくは、Ｈ２の翻訳後の脱リン酸化に由来するという示唆が得られている（ＫｕａｎおよびＴｉｅｎ、１９８９）。
【０１７７】
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍによるリグニン分解酵素の発現は、窒素または炭素の制限によって開始される特発性の（ｉｄｉｏｐｈａｓｉｃ）事象であり、培養条件および培地組成に非常に依存している（ＤｏｓｏｒｅｔｚおよびＧｒｅｔｈｌｅｉｎ、１９９１；ＦａｉｓｏｎおよびＫｉｒｋ、１９８５；Ｓｔｅｗａｒｔら、１９９２；ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｕｄｅら、１９９３）。ＬＩＰの形成は、高い酸素圧に対する培養物の暴露に特に依存している（Ｄｏｓｏｒｅｔｚら、１９９０；ＦａｉｓｏｎおよびＫｉｒｋ、１９８５）。定常状態の培養物の内部への酸素移行が制限され、その結果として、培養ヘッドスペースにおける大きい酸素分圧が、十分な酸素を水面下の菌糸が利用できるようにするために必要とされることが提案されている（Ｌｅｉｓｏｌａら、１９８３；Ｍｉｃｈｅｌら、１９９２）。ＬＩＰ形成が、この菌類に対する酸素の利用性を改善する非浸漬型液体培養において菌類を多孔性担体に固定化することによって空気にさらされた培養物において観測された（Ｄｏｓｏｒｅｔｚら、１９９０；Ｐｏｐｐら、１９９０）。培地におけるＭｎ２＋の濃度はＬＩＰおよびＭＮＰの形成に悪影響を及ぼした。ＭＮＰの形成は、ＭＮＰの転写を高めるＭｎに依存しているが、ＬＩＰの形成はＭｎによって阻害される。Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄら（１９９９）は、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍの窒素制限培養および窒素過剰培養の両方において、ＬＩＰ形成のために要求される高い酸素レベルがＭｎ欠乏によって置き換えられ得ることを示した。
【０１７８】
材料および実験方法
リグニンペルオキシダーゼを産生させるためのファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）菌の成長−ファネロカエテ・クリソスポリウム菌ＢＫＭＦ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）を２％麦芽抽出物寒天の保存用斜面培養（Ｄｉｆｘｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、米国）において４℃で維持した。
【０１７９】
胞子懸濁物の調製−菌の胞子を、保存用斜面培養物からの切り取り部分を、オートクレーブ処理された３９ｇ／リットルの濃度でのポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）を含有するペトリ皿に接種することによって得た。ＰＤＡ平板は、その後、３７℃で２週間までインキュベーションされた。胞子懸濁物を調製するために、ＰＤＡ平板に０．９％ＮａＣｌが重層され、分生子懸濁物を滅菌ガラスウールでろ過し、胞子懸濁物を集めた。胞子懸濁物は、その後、−８０℃で凍結保存された。
【０１８０】
接種調製物−胞子を滅菌済み接種用培地（本明細書中下記の配合を参照のこと）に７．５×１０５胞子／ｍｌの最終濃度で接種した。混合物の９０ｍｌが各発酵バッチ物に加えられた（ＴｉｅｎおよびＫｉｒｋ、１９８８、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１６１：２３８〜４９０；Ｄｏｓｏｒｅｔｚら、１９９０、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３４：１３１〜７）。その後、各バッチ物は綿栓で栓がされた。培養物は、浅い培養物として３７℃で４８時間、静置により成長させられた。培養物の接種のために、発酵バッチ物の内容物がミキサー（Ｗａｒｉｎｇ、英国）で２分間混合された。
【０１８１】
撹拌型タンク反応槽（ＳＴＲ）発酵装置における菌類の成長−菌類を成長させる前に、ポリウレタンフォームを発酵装置の冷却管の周りに据えて、ＳＴＲ発酵装置全体を滅菌した。その後、１０リットルの発酵装置用培地（本明細書中下記の配合を参照のこと）をＳＴＲ発酵装置に注入し、９００ｍｌの混合された接種物（１０個の発酵バッチ物の内容物）を加えた。発酵装置を、３７℃の温度を維持するための冷却システムに接続し、１００ｒｐｍで回転させた。滅菌済み空気が２ｍｌ／分で発酵装置に導入された。流速は、２日間の成長の後は４ｍｌ／分に変化させられた。成長は３日間〜５日間にわたって続けられた。
【０１８２】
接種用培地が、下記の溶液を混合することによって調製され、０．４５μｍのフィルターメンブラン（ＭＳＩ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、米国）で滅菌された。１リットルの液体培地を調製するために、下記の成分が一緒にされた：
１００ｍｌのＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ成長用基礎培地（ｘ１０）（下記の配合を参照のこと）；
１０ｍｌのＣａＣｌ２ストック液（１３．２ｇ／ｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）。最終濃度、０．１３２ｇ／Ｌ；
１２ｍｌのグリセロールストック液（５０ｇ／１００ｍｌ）（Ｆｒｕｔａｒｏｍ、イスラエル）。最終濃度、６ｇ／Ｌ。
【０１８３】
二回蒸留水が１リットルになるまで加えられる。
【０１８４】
発酵装置用培地が下記の方法で調製され、０．４５μｍのフィルターメンブラン（ＭＳＩ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、米国）で滅菌された。１０リットルの液体培地を調製するために、下記の成分が一緒にされた：
１００ｍｌのＣａＣｌ２ストック液（１３．２ｇ／ｌ）（Ｓｉｇｍａ、米国）。最終濃度、０．０１３２ｇ／ｌ；
１２０ｍｌのグリセロールストック液（５０ｇ／１００ｍｌ）（Ｆｒｕｔａｒｏｍ、イスラエル）。最終濃度、６ｇ／ｌ；
５０ｍｌのＴｗｅｅｎ−８０ストック液（１０．８ｍｌ／１００ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、米国）。最終濃度、０．５４ｍｌ／ｌ；
１０００ｍｌのＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ成長用基礎培地（ｘ１０）（下記の配合を参照のこと）；
３．３６ｇのベラトリルアルコール（Ｓｉｇｍａ、米国）。最終濃度、２ｍＭ。
【０１８５】
１０リットルの最終体積までの７．７４０リットルの二回蒸留水（ＤＤＷ）。
【０１８６】
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ成長用基礎培地（ｘ１０）−Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ成長用基礎培地（ｘ１０）は下記のように調製された：７．０７ｇのニトリロ三酢酸（三ナトリウム塩）を４リットルのＤＤＷに溶解した。その後、下記の試薬を加えた：１００ｇの無水ＫＨ２ＰＯ４、７２．７ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（または６７．３９ｇのＭｇＳＯ４・６Ｈ２Ｏ）、３．５ｇのＮａＣｌ、０．３５ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．６３ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．３５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０３５ｇのＡｌＫ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏ、０．０３５ｇのＨ３ＢＯ３、０．０３５ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、５００ｍｌの２Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）、１０ｇの酒石酸アンモニウム、および５０ｍｇのチアミン。すべてがＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）によって供給された。培地のｐＨはＮａＯＨで４．４〜４．４５に調節された。ＤＤＷが５リットルの最終体積になるまで加えられた。培地は４℃で貯蔵された。
【０１８７】
ファネロカエテ・クリソスポリウムの細胞外培地からのＬＩＰの単離および精製−細胞外培地をガラス繊維に通して真空ろ過した。その後、ろ液を０．４５μＭのフィルターメンブラン（ＭＳＩ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、米国）で滅菌して、液体を、ぜん動ポンプ（ＭＡＳＴＥＲＦＬＥＸ、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ、米国）を使用して中空繊維メンブランによって濃縮した。濃縮された細胞外液を、その後、１０ｋＤａカットオフ型ＰＭ−１０メンブラン（Ａｍｉｃｏｎ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を使用する限外ろ過によって２５倍再濃縮し、０．０１Ｍ〜１．００Ｍの酢酸ナトリウムの２回のグラジエントを使用するＨＰＬＣアニオン交換クロマトグラフィーによるＭｏｎｏＱカラム（ＨＲ５／５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により精製した。最初のグラジエントはｐＨ６．０においてであり、２回目のグラジエントは、ＬＩＰイソ酵素Ｈ１の等電点（ｐＩ）値に等しいｐＨ４．７においてであった。タンパク質ピーク部分を集め、それらの活性を、前回のバッチから得られた精製ＬＩＰイソ酵素Ｈ１を標準として使用してアッセイした。ＬＩＰ Ｈ１画分の吸光度が２８０ｎｍおよび４０９ｎｍで測定された（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、ドイツ）。純粋度（ＲＺ）は、精製されたＬＩＰイソ酵素Ｈ１の４０９ｎｍにおける吸光度（Ａ４０９）と２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）との比率から計算された場合、４．０を越えた。ＬＩＰ濃度が、１６９Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して４０９ｎｍで測定された。
【０１８８】
ＬＩＰ活性のアッセイ−ＬＩＰ活性が、ＴｉｅｎおよびＫｉｒｋ（１９８８）によって記載されるように、ベラトリルアルコールのベラトリルアルデヒドへの酸化のときにおける３１０ｎｍにおける吸光度の変化によって測定された。アッセイ試薬は、１００ｍＭの酒石酸塩緩衝液（ｐＨ２．５）における４ｍＭのベラトリルアルコールおよび０．８８ｍＭのＨ２Ｏ２から構成される。アッセイのために、０．５ｍｌのＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ細胞外培地が０．５ｍｌの試薬と混合され、３１０ｎｍにおける吸光度の増大が４０秒間にわたって記録された。１ユニットのＬＩＰ活性は、１分あたり１μｍｏｌｅのベラトリルアルコールがベラトリルアルデヒドに酸化されるとして定義される。
【０１８９】
ＬＩＰによるメラニン酸化の測定−合成メラニン（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｍ８６３１、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）が５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．００）において様々な濃度で調製された。ＬＩＰによるメラニン酸化が、ベラトリルアルコールを含有する酒石酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）において行われ、酵素反応が過酸化水素の添加によって開始された。メラニン酸化の程度が、４６０ｎｍにおける吸光度の減少を測定することによって決定された。
【０１９０】
クリームの調製−好ましい実施形態におけるＬＩＰクリームは、酵素クリームおよび活性化剤クリームの２つのタイプのクリームから構成される。それぞれのクリームは、２つの相から、すなわち、水相および油相から調製された。
【０１９１】
酵素クリーム
酵素クリーム用の水相：
０．３５％（ｗ／ｗ）ＤＭＤＭヒダントイン（Ｓｈａｒｏｎ Ｌａｂ、イスラエル）；
２％（ｗ／ｗ）グリセリン（Ｃｏｇｎｉｓ、ドイツ）；
０．１％（ｗ／ｗ）ベラトリルアルコール（３−ジメトキシベンジルアルコール、Ｓｉｇｍａ、米国）；
８１．６５％（ｗ／ｗ）ＤＤＷ（ＲＯ Ｗａｔｅｒ、イスラエル）；
０．２％（ｗ／ｗ）Ｒｈｏｄｉｃａｒｅ Ｄ（キサンタンガム、Ｒｈｏｄｉａ、フランス）；
４％（ｗ／ｗ）トランスキュトール（ＰＥＧ−４００、エトキシジグリコール、Ｇａｔｔｅｆｏｓｅｓ、フランス）；
酵素クリーム用の油相：
５％軽質鉱油；
２．５％（ｗ／ｗ）ドラゴリン１００ＳＥＰ（ＧＭＳ＆ＰＥＧ−１００ステアラート、Ｄｒａｇｏｃｏ、ドイツ）；
３％（ｗ／ｗ）セチルアルコール（Ｃｏｇｎｉｓ、ドイツ）；
０．２％（ｗ／ｗ）ソルビン酸カリウム（Ｃｈｉｓｓｏ Ｃｏｒｐ．、日本）；
１％（ｗ／ｗ）ｂｒｉｊ７２１（Ｕｎｉｑｅｍａ、イタリア）。
【０１９２】
酵素クリームの調製：酵素クリームの水相および油相を８０℃に加熱して、混合した。混合物を１０分間均質化して、５５℃に冷却した。その後、ｐＨを乳酸で３．５に調節した。
【０１９３】
混合物が４０℃に冷えたとき、リグニンペルオキシダーゼを加えた（２０〜５０ユニット／ｇ）。酵素混合物を１分間均質化した。
【０１９４】
活性化剤クリーム
活性化剤クリーム用の水相：
８２．８８８（ｗ／ｗ）ＤＤＷ（ＲＯ Ｗａｔｅｒ、イスラエル）；
０．１％（ｗ／ｗ）ＥＤＴＡ二ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）；
４％（ｗ／ｗ）トランスキュトール（ＰＥＧ−４００、エトキシジグリコール、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ、フランス）；
０．１％（ｗ／ｗ）ソルビン酸カリウム（Ｃｈｉｓｓｏ Ｃｏｒｐ．、日本）；
活性化剤クリーム用の油相：
３．５％（ｗ／ｗ）ｂｒｉｊ７２（Ｓｔｅａｒｅｔｈ−２、Ｕｎｉｑｅｍａ、イタリア）；
２．５％（ｗ／ｗ）ｂｒｉｊ７２１（Ｓｔｅａｒｅｔｈ−２０、Ｕｎｉｑｅｍａ、イタリア）；
５％（ｗ／ｗ）鉱油；
１．３％（ｗ／ｗ）セチルアルコール（Ｃｏｇｎｉｓ、ドイツ）；
０．５％（ｗ／ｗ）シリコン３５０（Ｄｉｍｅｔｈｉｃｏｎ、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）；
０．１％（ｗ／ｗ）ソルビン酸カリウム（Ｃｈｉｓｓｏ Ｃｏｒｐ．、日本）。
【０１９５】
活性化剤クリームの調製−活性化剤クリームの水相および油相を８０℃に加熱して、混合した。混合物を１０分間均質化して、４５℃に冷却し、リン酸でｐＨ３．５に調節した。
【０１９６】
混合物が４０℃に冷えたとき、過酸化水素（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ、ドイツ）を穏やかな撹拌とともに加え（０．０１２％（ｗ／ｗ））、正しいｐＨを確認した。活性化剤混合物を１分間均質化した。
【０１９７】
インビボでの皮膚明色化効果の測定−皮膚明色化に対するＬＩＰの効果を定量するために、処置された手の皮膚の色が、３波長のＭｉｎｏｌｔａ彩度計（ＣＲ−２００、日本）を使用して調べられた：Ｍｉｎｏｌｔａ Ｌは暗度および明度を測定し、Ｍｉｎｏｌｔａ Ａは赤色の色調を測定し、Ｍｉｎｏｌｔａ Ｂは黄色の色調を測定する。Ｍｉｎｏｌｔａ Ｌ値の増大は皮膚の明るさの程度を反映し、すなわち、より大きい値はより明るい皮膚に対応する。
【０１９８】
実験結果
（実施例１）
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍからのＬＩＰの精製
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍから得られた高度に精製されたＬＩＰ Ｈ１の調製−ＬＩＰイソ酵素Ｈ１をＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍから精製するために、菌を、本明細書中上記の方法の節で詳しく記載されたようにＳＴＲ発酵装置（図２）において成長させた。最初のＬＩＰ活性が４８時間の成長の後に検出され、成長が１２０時間まで維持されたとき、活性の著しい増大が検出された（図３）。ＬＩＰイソ酵素Ｈ１を精製するために、菌の細胞外液を最大ＬＩＰ活性の時（１２０時間）に集めた。その後、方法のところで記載されたように、ＬＩＰイソ酵素Ｈ１タンパク質を精製し、その濃度が測定された。従って、上記の装置および条件を使用して、ＬＩＰを確実に産生させることができ、そのＨ１イソ酵素をＨＰＬＣによって精製することができる。
【０１９９】
（実施例２）
精製されたＬＩＰを使用する水相酸化におけるメラニンの最適化
ＬＩＰによるメラニン酸化のために必要とされる条件を最適化するために、酸化反応の重要な成分のそれぞれの最適な濃度を独立的に決定した。
【０２００】
水相におけるメラニンのＬＩＰ酸化は過酸化水素の濃度の関数である−水相におけるＬＩＰによるメラニンの酸化が、過酸化水素の濃度に対する相関について最初に調べられた。一定濃度のメラニン（７０．５μｇ／ｍｌ）が、過酸化水素の濃度を増大させながら、１．５ｍＭのベラトリルアルコールの存在下での０．４８μＭの精製ＬＩＰ Ｈ１によって酸化された。酸化の程度が、過酸化水素の添加前および添加後１６０秒において４６０ｎｍにおけるメラニンの吸光度を測定することによって決定され、百分率で計算された。一般に、メラニンの酸化は、７００μＭ〜９００μＭの過酸化水素で得られるプラトー状態まで、過酸化水素の濃度の増大とともに増大した（図４）。メラニン酸化に対する過酸化物の濃度の影響が、図５における反応混合物の比較によってさらに明らかにされる。この場合、反応混合物が過酸化水素の濃度の増大とともに著しく明色化される。従って、これらの結果は、水相におけるメラニンのＬＩＰ酸化が明らかに過酸化水素の濃度に依存しており、この場合、メラニンの酸化のための過酸化水素の最適な濃度が６００μＭ〜７００μＭの範囲であることを明らかにしている。
【０２０１】
メラニンのＬＩＰ酸化は水相におけるメラニンの初期濃度の関数である−ＬＩＰによる水相におけるメラニンの酸化のために要求される最適なメラニン濃度を決定するために、酸化反応がさらに、メラニン濃度を増大させながら調べられた。メラニンの酸化が、１．５ｍＭのベラトリルアルコールおよび６００μＭの過酸化水素の存在下、０．４８μＭの精製ＬＩＰ Ｈ１によって行われた。初期メラニン濃度が１５μｇ／ｍｌ〜４５μｇ／ｍｌの間であるとき、ＬＩＰによるメラニン酸化はメラニンの初期濃度に依存していた。メラニンの最高の酸化（６０％）が４５μｇ／ｍｌ〜８５μｇ／ｍｌの間での初期メラニン濃度で達成された（図６）。従って、ＬＩＰによるメラニン酸化は、明らかに、４５μｇ／ｍｌを越える初期メラニン濃度には依存していない。
【０２０２】
ＬＩＰのメラニン酸化は水相におけるＬＩＰ濃度に部分的に依存する−メラニン酸化のための条件をさらに最適化するために、メラニン酸化に対するＬＩＰ濃度の影響が、最適な濃度のメラニン（７０μｇ／ｍｌ）、過酸化水素（７００μＭ）およびベラトリルアルコール（１．５ｍＭ）を用いて調べられた。メラニン酸化は、ＬＩＰ濃度が０．２５μＭから０．４０μＭに増大したとき、１０％から６０％に劇的に増大した。しかしながら、ＬＩＰ濃度が０．５０μＭを越えると、メラニン酸化における変化は観測されなかった（図７）。従って、インビトロでのメラニン酸化のためのＬＩＰ濃度の最適な範囲は０．４０μＭ〜０．５０μＭである。
【０２０３】
（実施例３）
クリーム配合物においてＬＩＰを使用するメラニンの酸化
メラニンを酸化するＬＩＰイソ酵素Ｈ１の能力をさらに実証するために、インビボでの皮膚明色化に向けた中間段階として、ＬＩＰ活性が、水相に可溶化されたメラニンに対するクリーム配合物において調べられた。
【０２０４】
水相におけるメラニンはクリーム配合物におけるＬＩＰによって酸化される−２つのタイプのクリームが調製された：ＬＩＰイソ酵素Ｈ１画分（２５ユニット／ｇクリーム）およびベラトリルアルコール（６ｍｍｏｌｅ／Ｋｇクリーム）を含む酵素クリーム、過酸化水素（３．５２ｍｍｏｌｅ／Ｋｇクリーム）を含む活性化剤クリーム。クリーム配合物におけるＬＩＰ活性の測定のために、酵素クリーム（０．３ｇ）が最初にメラニン（１４０μｇ／ｍｌ）と混合され、灰色がかった黒色が観測された（図８ａ）。活性化剤クリーム（０．３ｇ）が、メラニンを既に含有する酵素クリームに加えられたとき、色は直ちにベージュ色に変化した（図８ｂ）。これらの結果は、クリーム配合物におけるＬＩＰがメラニンの脱色において非常に効率的であり、ヒトの皮膚においてさらに試験できることを明らかにしている。
【０２０５】
（実施例４）
クリーム配合物における精製ＬＩＰ Ｈ１によるインビボでの皮膚および毛髪の明色化
皮膚および毛髪をインビボで明色化するＬＩＰの能力を調べるために、クリーム配合物および水性配合物における酵素が皮膚および毛髪にそれぞれ加えられた。
【０２０６】
クリーム配合物におけるＬＩＰはインビボで皮膚を明色化する−インビボで皮膚を明色化するクリーム配合物におけるＬＩＰの能力を調べるために、酵素クリームが塗布され、皮膚によって吸収され、その後、活性化剤クリームが５分間隔で４回塗布された。１週間にわたって１日２回で繰り返されたとき、処置された皮膚領域の著しい明色化が観測された（図９）。処置された手の２つの領域の皮膚の色が、Ｍｉｎｏｌｔａ彩度計を使用して定量されたとき、ＬＩＰクリームの２週間の塗布の明瞭な皮膚明色化効果が観測された（表１、％変化）。従って、これらの結果は、ＬＩＰは、塗布しやすいクリーム配合物で調製されたとき、インビボで皮膚を簡便かつ効率的に明色化することができ、また、本明細書中に詳しく記載されるように調製されたＬＩＰは、他のインビボ明色化適用のためにさらに適合化され得ることを明らかにしている。
【表１】
【０２０７】
水性配合物におけるＬＩＰはインビボで毛髪を明色化する−色素沈着の明色化は、皮膚以外の、メラニンが多い組織において要求されることが多い。そのインビボ明色化効果をさらに調べるために、ＬＩＰをヒトの毛髪に塗布した。ＬＩＰの塗布前に、毛髪は最初に５０ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ１１．５）に１時間漬けられ、その後、ＬＩＰ（２５Ｕ／２０μｌ水）を含有する別の試験管に移された。毛髪はＬＩＰと１０秒間インキュベーションされ、その後、ベラトリルアルコール（１．５ｍＭ）および過酸化水素（８．８ｍＭ）の存在下での酒石酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）の中に移された。著しい明色化効果が、ＬＩＰを含まない同じ溶液において処理された毛髪（図１０、左側試験管）と比較して、ＬＩＰの存在下で１時間以内に観測された（図１０、右側試験管）。従って、これらの結果は、非常に低い濃度の過酸化水素の存在下で、水性配合物におけるＬＩＰはインビボで毛髪を効率的に明色化することができることを明らかにしている。
【０２０８】
（実施例５）
ＬＩＰ調製プロセスのスケールアップ
商業的目的のために有用な多量のリグニンペルオキシダーゼ（ＬＩＰ）を製造するために、ＬＩＰを、スケールアップされたプロトコルを使用して、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ菌から精製した。
【０２０９】
スケールアップされた発酵プロトコルを使用して得られたＬＩＰの大きい活性−発酵が、本明細書中上記の方法の節で記載されたように９０Ｌの発酵用培地を使用して１００Ｌの発酵装置で行われた。発酵条件には、１６０ｒｐｍの撹拌および０．２ｖｖｍの空気流量が含まれた。接種が、本明細書中上記の方法の節で記載される１０Ｌ発酵装置の場合と同じ方法で行われた。７日間の成長の後、測定されたＬＩＰ活性は１６００ユニット／リットルであった。
【０２１０】
これらの結果は、多量および大きい酵素活性のＬＩＰが、大型の発酵装置および本発明のスケールアップされたプロトコルを使用してＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ菌から製造できることを明らかにしている。
【０２１１】
（実施例６）
ＬＩＰクリームについての皮膚科学的試験：正常な皮膚における低アレルギー誘発性試験、過敏性皮膚試験および過敏化攻撃試験
ＬＩＰクリームの皮膚科学的性質を特徴づけるために、また、化粧用製品としての使用のための前提条件として、ＬＩＰクリームがいくつかの皮膚科学的試験に供された：低アレルギー誘発性試験、正常な皮膚における過敏化攻撃試験、および過敏性皮膚における過敏化攻撃試験。
【０２１２】
方法
正常な皮膚における皮膚科学的試験のための研究被験者：この研究では、年齢範囲が１８歳〜６４歳である５０名の志願者（９名の男性および４１名の女性）が含まれた。被験者は良好な全身的健康状態にあり、パッチが当てられる領域において何らかの認められる皮膚の疾患または異常を有していなかった。各研究被験者は、インフォームドコンセント文書を読み、理解し、かつ署名するように要請された。除外基準は下記の通りであった：妊婦または授乳中の女性、処置される帯域において重篤または進行性の疾患および／または病理に罹患している被験者、皮膚水和の何らかの処置（例えば、レチノイド、ステロイド）および／または調節剤を使用している被験者、体重が不安定であるか、または過度な飲酒もしくは喫煙を有する被験者。
【０２１３】
研究被験者の特性のまとめが下記の表２に示される。
【表２】
【０２１４】
過敏性皮膚における皮膚科学的試験のための研究被験者−合計で５０名の被験者（６名の男性および４４名の女性）が試験を完了した：２２名の被験者が１８歳〜３５歳の範囲であり、１１名の被験者が３６歳〜４５歳の範囲であり、１７名の被験者は４６歳〜６５歳の範囲であった。
【０２１５】
研究期間中での関連した処置−水が、パッチ適用期間中、試験部位には当てられなかった；皮膚を改変する可能性のある全身的または局所的な処置は許可されなかった；洗浄用製品を含めて、皮膚医薬品または化粧用製品の使用は、評価中の帯域に対しては許可されなかった。
【０２１６】
パッチ調製物−低アレルギー誘発性試験のために、２ｍｇの本発明のＬＩＰクリームがＣｕｒａｔｅｓｔ（登録商標）Ｆ接着性細片（Ｌｏｈｍａｎｎ＆Ｒａｕｓｃｈｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｒｅｎｇｓｄｏｒｔ）に置かれた。皮膚科学的試験および感受性皮膚試験のために、各パッチはＣｕｒａｔｅｓｔ（登録商標）Ｆ接着性細片において０．０７グラム〜０．１グラムのＬＩＰクリームを含んだ。
【０２１７】
Ｄｒａｉｚｅ反復傷害パッチ試験が、本質的には、Ｊ．Ｈ．Ｄｒａｉｚｅによって「Ａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｉｎ Ｆｏｏｄｓ，Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ（食品、薬物および化粧品における化学物質の安全性の評価）」（これはｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓによって刊行された）に記載されるように行われた。
【０２１８】
誘導期−パッチが指定の接触部位に適用され、２４時間にわたって置かれたままにされた。この期間が終了したとき、パッチは除かれ、部位が何らかの皮膚応答について調べられた。研究被験者は２４時間休息し、その後で、皮膚部位が再び調べられた。その後、パッチが、以前に使用されたのと同じ部位に適用された。２回目の適用は最初と同一であり、２４時間にわたって置かれたままにされた。この手順が９回繰り返された。研究被験者は、次の適用の前に、部位を何らかの皮膚応答について調べ、その観察結果を報告した。同じ部位が研究期間中を通して使用された。それぞれの適用は、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｋｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｔｅｌ Ａｖｉｖ、イスラエル）のスタッフによって取り付けおよび除去が行われた。品質管理者により、研究プロトコルに対する順守がモニターされた。
【０２１９】
攻撃期−９回目の適用の後、２週間の休息期間が置かれ、その後、攻撃塗布物が、誘導期の期間中に使用された同じ様式で、かつ同じ部位に加えられた。攻撃塗布物は２４時間後に除かれ、部位が、刺激または過敏化の徴候について調べられ、採点された。追跡試験が、負荷塗布後４８時間（パッチ除去後２４時間）、ならびに除去後の４８時間および７２時間において行われた。
【０２２０】
採点基準−誘導試験および攻撃試験の結果は、下記の基準を使用して採点された：「０」＝反応が認められない；「？」＝疑わしい反応、すなわち、かすかで、極微の紅斑、ただし、浸潤なし；「１」＝弱い陽性反応、すなわち、紅斑、浸潤、ただし、離れた斑丘疹はない；「２」＝強い陽性反応、すなわち、紅斑、浸潤、斑丘疹、離れた小水疱；「３」＝特に大きい陽性反応、すなわち、極めて強い紅斑、浸潤、合体した小水疱／水疱性反応；「ＩＲ」＝刺激反応、すなわち、浸潤を伴わない離れた紅斑／斑点状小胞状紅斑／出血性膿疱および小胞状膿疱；「ＮＴ」＝試験されず。
【０２２１】
皮膚科学的試験の結果
低アレルギー誘発性試験−この試験では、ＬＩＰクリームを含有するパッチの適用に対する反応が、パッチ除去の２０分後、２４時間後および４８時間後に記録された。本明細書中下記の表３に示されるように、５０名の研究被験者全員において、ＬＩＰクリームに対する皮膚反応は認められなかった。
【表３】
【０２２２】
ＬＩＰクリームを用いた正常な皮膚の過敏化攻撃試験は皮膚反応を何ら生じさせなかった−ＬＩＰクリームがパッチ内に挿入され、Ｄｒａｉｚｅ反復傷害パッチ試験が５０名の健康な志願者に対して行われた。それぞれのパッチ適用の後、皮膚反応が、本明細書中上記の方法の節に記載される採点基準を使用して記録された。本明細書中下記の表４に示されるように、５０名の志願者全員において、皮膚反応は、誘導期の９回すべてのクリーム塗布の期間中、ならびに攻撃期の最後の適用の後において認められなかった。
【表４】
【０２２３】
過敏性皮膚における皮膚科学的試験−ＬＩＰクリームの過敏化性質をさらに特徴づけるために、刺激パッチ試験が、過敏性皮膚の５０名の健康な志願者に対して行われた。予備試験において、１１名の被験者は、様々な程度の刺すような痛みを有することが見出された；２名は重症の過敏性皮膚を有し、８名は中程度の過敏性皮膚を有し、１名はわずかに過敏性の皮膚を有した。ＬＩＰクリームを含む刺激用パッチが志願者の背中に４８時間にわたって置かれた。試験領域が、１時間後、２４時間後および４８時間後に調べられた。皮膚反応が５０名の志願者のいずれにも存在しないことが見出された。
【０２２４】
これらの結果では、正常な皮膚および過敏性の皮膚におけるＬＩＰクリームに対する低アレルギー誘発性反応および刺激性反応が認められない。そのうえ、反復傷害パッチ試験の結果から、安全な化粧用組成物としてのＬＩＰクリームの使用がさらに示唆される。
【０２２５】
（実施例７）
ＬＩＰクリームは皮膚色素沈着を白化することにおいて非常に効率的である
皮膚白化におけるＬＩＰクリームの効果が二重盲検研究で先行技術でのクリームと比較された。
【０２２６】
研究設計
研究被験者−この研究では、疾患を有さず、皮膚疾患またはアトピー性疾患（喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎）の病歴を有さず、また、試験中の物質のいずれか、および化粧用調製物の成分のいずれかに対する知られている過敏性を有さないアジア系の１８歳〜６５歳の１２名の健康な男性および女性が含まれた。研究では、全身的または局所的な処置のための、抗炎症性薬物、抗ヒスタミン剤またはコルチコステロイドによる処置を受けている候補者は、その処置が、研究に登録する前に、全身的処置の場合には２週間、局所的処置の場合には３日中断されない限り、除かれた。妊婦および母乳授乳中の女性だけでなく、診断または処置の任意の段階にあるガン、腎臓疾患または肝臓疾患を有する場合もまた、研究候補者から除かれた。
【０２２７】
研究プロトコル−研究では、それぞれが一方の上部前腕に二重盲検様式で塗布される２つのタイプのクリームが含まれた：有効成分としてＬＩＰを含む本発明の白化クリーム、および市販されている製品（２％ヒドロキノン、Ｅｓｏｍｅｄ Ｍｅｄｉｂｒａｎｄｓ（イスラエル））。これらのクリームは１日に２回（すなわち、午前および夕方）に塗布された。前腕の下側部分は未処置のままであった。研究被験者は、研究の開始時（０週）、ならびに、クリーム塗布の１週間後、２週間後および３週間後に、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｋｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｔｅｌ Ａｖｉｖ、イスラエル）のスタッフによって調べられた。それぞれの検査において、皮膚色素沈着および副作用が記録された。
【０２２８】
皮膚色素沈着の評価−皮膚色素沈着が、Ｄｅｒｍａ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｃｏｒｔｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（デンマーク））、同じ距離および光露光を使用して撮影されたカラー写真、Ｂｒｅｎｎｅｒ博士（皮膚科学学部長（Ｓｏｕｒａｓｋｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｅｌ Ａｖｉｖ、イスラエル）））によって行われる目視検査を使用して評価された。
【０２２９】
研究結果
ＬＩＰクリームは３週間の適用の後で皮膚色素沈着を低下させた−皮膚白化におけるＬＩＰクリームの効果を評価するために、ＬＩＰクリームが１２名の健康な志願者の右腕の上部部分に１日に２回塗布された。２名の研究被験者の代表的な写真を含む図１１ａ〜図１１ｂおよび図１３ａ〜図１３ｂに示されるように、３週間のクリーム塗布の後、右前腕の上部部分は、クリーム塗布前よりもはるかに白くなっているようであった。
【０２３０】
ＬＩＰクリームはヒドロキノンクリームよりも皮膚白化において効率的である−皮膚色素沈着を軽減することにおけるＬＩＰクリームの効果が、２％ヒドロキノンの効果と比較された。２１日間のクリーム塗布の後、研究被験者番号１のＬＩＰ処置領域の色素沈着は３．３３単位ほど低下していた（図１２ａの青色カラムおよび図１２ｃの青色曲線）。他方で、同じ前腕における非処置領域の色素沈着は１．１３単位ほど低下していた（図１２ａの明青色カラム）。他方で、ヒドロキノンクリームを使用した２１日間の処置の後では、処置された領域の色素沈着はわずかに１単位だけ低下していた（図１２ｂのピンク色カラムおよび図１２ｃのピンク色曲線）。類似する効果が、図１４ａ〜図１４ｃに示されるように、他の研究被験者において観測された。１２名すべての研究被験者から得られた結果がまとめられたとき、皮膚色素沈着における平均低下は、ＬＩＰ処置の前腕およびヒドロキノン処置の前腕において、それぞれ１．５７単位（図１５ａ、青色曲線）および１．４９単位（図１５ａ、ピンク色曲線）であることが見出された。そのうえ、皮膚色素沈着の低下が初期の皮膚色素沈着に対して正規化されたとき、皮膚色素沈着の平均低下は、ＬＩＰ処置の前腕およびヒドロキノン処置の前腕において、それぞれ４．３％（図１５ｂ、青色曲線）および３．８％（図１５ｂ、ピンク色曲線）であった。
【０２３１】
まとめると、これらの結果は、ＬＩＰクリームが、皮膚色素沈着を低下させることにおける非常に効率的であることを明らかにしている。そのうえ、これらの結果は、ＬＩＰクリームの相対的な白化効果が、２％ヒドロキノンクリームを使用して観測された相対的な白化効果よりも大きいことを示唆している。
【０２３２】
本発明のいくつかの特定の特徴が、明確化のために、別個の実施形態に関連して記載されているが、これらの特徴はまた、１つの実施形態において組合せで提供され得ることが理解される。逆に、本発明の様々な特徴が、簡略化のために、１つの実施形態に関連して記載されているが、これらの特徴はまた、別個に提供され得るか、または任意の好適な部分的組合せで提供され得る。
【０２３３】
本発明を、その具体的実施態様とともに説明してきたが、多くの変形と変更が当業技術者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内に入っているこのような変形と変更をすべて含むものである。本明細書に記載のすべての刊行物、特許、特許願、及びそれらのアセッション番号によって同定される配列は、あたかも、個々の刊行物、特許、特許願又はそれらのアセッション番号によって同定される配列各々が、本願に具体的にかつ個々に参照して示されているように、本願に援用するものである。さらに、本願における任意の文献の引用もしくは確認は、このような文献が本発明に対する従来技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグニンペルオキシオダーゼの製造方法ならびに皮膚および毛髪の明色化におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラニン
ヒトの皮膚および毛髪の色は、植物および微生物にも存在する色素であるメラニンの量、性状および分布によって決定される。
【０００３】
メラニンの合成は前駆体チロシンから始まり、このチロシンはチロシナーゼの作用によって別の前駆体ドーパキノンに変換される。哺乳動物メラニンの生合成において、この中間体は２つの主要な経路（図１）を介して重合し得る。アミノ基の分子内での求核的付加により、インドール誘導体ロイコドーパクロムが生じ、ロイコドーパクロムは、重合後、暗褐色〜黒色の色素ユーメラニンをもたらす。チオール化合物の存在下では、ドーパのチオエステル誘導体が形成される。例えば、システインとの反応により、システイニルドーパが生じ、システイニルドーパは、さらなる酸化および重合の後、黄色〜赤褐色の色素フェオメラニンをもたらす。従って、ユーメラニンは５，６−ジヒドロキシインドール（ＤＨＩ）ユニットおよび５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸（ＤＨＩＣＡ）ユニットから主に構成され、これに対して、フェオメラニンは主にベンゾチアジンユニットを含有する（Ａｌａｌｕｆら、２００１）。これら２つの色素の利用性および相互比率は多量体色素の化学的組成に影響する。
【０００４】
メラニンの合成は、表皮基底層に存在するメラノサイト細胞に存在するメラノソームと呼ばれる顆粒において行われる（Ｃｏｏｋｓｅｙら、１９９７）；これらの細胞におけるメラニンの合成は紫外（ＵＶ）光によって誘導される。合成後、メラニンは表皮細胞に遊走し、表皮細胞に分散され、表皮細胞において、メラニンは皮膚代謝に従って脱色され、その後、皮膚更新時における垢の形態で剥がれる。メラニンは、ＵＶ光により生じる有害な影響から皮膚を守るので、臨床的重要性を有している。しかしながら、高レベルのメラニンは皮膚および毛髪の望ましくない濃色化を生じさせ得るし、一方で、その不均一な分布は、美学的に不愉快にし得る肝斑およびそばかす形成をもたらし得る。
【０００５】
明色化用製品
皮膚を明色化する（美白化する）製品がこの数年の間でますます大衆化している。美白用製品の主目的は、皮膚の色を薄くするか、皮膚を白くすることであり、あるいは、肝斑、そばかす、妊娠斑および老人性色素斑などの色素沈着障害を処置することである。数種類の美白用製品が現在、入手可能である。
【０００６】
色素細胞の変性および死に基づく製品は、典型的には、皮膚の白化および皮膚の明色化を促進させるか、または皮膚の色素沈着を徐々に消す過激な化学薬品（例えば、ヒドロキノン、４−イソプロピルカテコールおよびヒドロキノンモノベンジルエーテルなど）を含む。そのような製品は典型的には効率的でなく、また、これらの製品の連続した外用は永続的な白斑および副作用（例えば、皮膚色素異常症および発疹など）をもたらし得るので皮膚に対して有害であり得る。
【０００７】
他の明色化用製品はチロシナーゼ（前駆体チロシンを別の前駆体ドーパキノンに変換する酵素）の阻害に基づいている。この群の製品はアルブチン（銅イオンをキレート化することによってチロシナーゼを阻害し、それによりドーパクロムからＤＨＩＣＡへの互変異性化を抑制することができるグルコースヒドロキノン化合物）を含む。
【０００８】
メラノスタットは、チロシナーゼを介して作用する別の明色化用製品である。メラノスタットは、メラノサイトにおけるメラニン形成を脱活性化する際に機能する合成ペプチドである。
【０００９】
メラニンの産生を阻害することができるいくつかの抗酸化剤化合物もまた明色化用製品において利用される。メラニンの合成では酸化反応が伴うので、チロシン／ＤＯＰＡからメラニンに至る様々な段階で酸化を阻止することにより、最終的には、メラニンの合成が阻害される。
【００１０】
メラニン合成を阻止するために利用される抗酸化剤の１つはＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）であり、メラニン中間体に対する還元剤として作用し、酸化反応を阻止する。明色化用製品によって利用される他の抗酸化剤には、桑の実または甘草から典型的には抽出されるビオフラボノイドが含まれる。
【００１１】
毛髪の明色化用製品は毛皮質の内側のメラニンに対して作用する。毛髪を明色化することができる化学物質がいくつか存在し、これらには、塩酸、次亜塩素酸ナトリウムおよび過酸化水素が含まれる。
【００１２】
毛髪を明色化するために最も一般的に使用されている化学物質は過酸化水素である。所望される有効性を維持するために、過酸化水素の溶液は、アセトニトリル、薄い酸、コロイド状シリカ、ｐ−ヒドロキシベンゾアート、硫酸オキシキノリン、フェナセチンおよびスズ化合物（スズ酸ナトリウム、水酸化スズ（ＩＶ）、オクタン酸スズ（ＩＩ））などの化合物を使用して安定化されなければならない。毛髪を明色化する前には、アンモニアが、毛小皮（毛の外側層）を通過する過酸化水素の浸透を高めるために、かつ、従って、酸化反応を加速するために過酸化水素溶液に加えられる。
【００１３】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、リグニンペルオキシダーゼのイソ酵素Ｈ１がインビトロでメラニンを酸化することができ、そしてさらに、インビボで皮膚および毛髪を明色化することができることを発見した。
【００１４】
従って、本発明は、皮膚および毛髪を明色化するために非常に好適である化粧用組成物および方法を提供する。
【発明の概要】
【００１５】
本発明の１つの態様によれば、対象の皮膚領域または毛髪を明色化する方法であって、皮膚領域または毛髪の細胞に含有される色素を酸化するために好適な様式で少なくとも１つのタイプのリグニン改変酵素を皮膚領域または毛髪に適用することを含む方法が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、対象の皮膚領域または毛髪を明色化するための化粧用組成物であって、少なくとも１つのタイプのリグニン改変酵素と、化粧用として許容され得るキャリアとを含む化粧用組成物が提供される。
【００１７】
本発明のさらに別の態様によれば、対象の皮膚領域または毛髪を明色化するためのキットであって、リグニン改変酵素を含む第１の容器と、電子受容体を含む第２の容器とを含むキットが提供される。
【００１８】
本発明のなお別の態様によれば、包装材と、対象の皮膚領域または毛髪を明色化するために同定された、前記包装材に含有される化粧用組成物とを含む製品が提供され、この場合、化粧用組成物は、有効成分としてのリグニン改変酵素と、化粧用として許容され得るキャリアとを含む。
【００１９】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の方法は、少なくとも１つのタイプのリグニン改変酵素を含む調製物の局所適用によって達成される。
【００２０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の方法は、少なくとも１つのタイプのリグニン改変酵素を含む調製物の皮内投与または皮下投与によって達成される。
【００２１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニン改変酵素は、皮膚または毛髪への適用のために配合された組成物に含まれる。
【００２２】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニン改変酵素はリグニンペルオキシダーゼである。
【００２３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニンペルオキシダーゼはイソ酵素Ｈ１または改変された形態のイソ酵素Ｈ２である。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用組成物は電子受容体をさらに含む。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、電子受容体は過酸化水素である。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用組成物はベラトリルアルコールをさらに含む。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組成物は少なくとも１つのタイプの表皮浸透剤を含む。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、組成物は少なくとも１つのタイプの毛髪浸透剤を含む。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の方法は、所望される明色化のレベルに従って選択された期間にわたって行われる。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用として許容され得るキャリアには、トランスキュトールおよび／またはブチレングリコールが含まれる。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用として許容され得るキャリアには、アルカノールアミンが含まれる。
【００３２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用組成物におけるリグニンペルオキシダーゼは少なくとも１Ｕ／ｇの濃度で提供される。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用組成物における過酸化水素は少なくとも０．００５％の濃度で提供される。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化粧用組成物におけるベラトリルアルコールは少なくとも０．０５％の濃度で提供される。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、皮膚領域または毛髪を明色化するためのキットの第１の容器はベラトリルアルコールをさらに含む。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、皮膚領域または毛髪を明色化するためのキットの第１の容器および／または第２の容器は、表皮浸透のために好適な化粧用として許容され得るキャリアをさらに含む。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、皮膚領域または毛髪を明色化するためのキットの第１の容器および／または第２の容器は、毛髪浸透のために好適な化粧用として許容され得るキャリアをさらに含む。
【００３８】
本発明のさらなる態様によれば、対象の皮膚領域を明色化する方法であって、皮膚領域の細胞に含有される色素を酸化するために好適な様式でリグニン改変酵素を皮膚領域の細胞において発現させることを含む方法が提供される。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前記方法は、皮膚領域の細胞に電子受容体を提供する工程をさらに含む。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、電子受容体は過酸化水素である。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前記方法は、皮膚領域の細胞にベラトリルアルコールを提供する工程をさらに含む。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、発現は、リグニン改変酵素を発現することができる発現ベクターを細胞に導入することによって達成される。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ベクターはウイルスベクターである。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ベクターは、リグニン改変酵素のコード配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニン改変酵素はリグニンペルオキシダーゼである。
【００４６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニンペルオキシダーゼは、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【００４７】
本発明のさらなる態様によれば、リグニンペルオキシダーゼを製造する方法であって、（ａ）ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）菌を、所定の期間、グリセロールを含有する撹拌および通気された培養培地において多孔性マトリックス上で培養すること；（ｂ）前記所定の期間の後、可溶性画分を前記ファネロカエテ・クリソスポリウム菌から抽出して、それによりリグニンペルオキシダーゼを製造することを含む方法が提供される。
【００４８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、培養培地はマンガンイオンを含まない。
【００４９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、通気された培養は、培養培地を０．１〜１リットル／リットル／分の範囲における通気速度に供することによって得られる。
【００５０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、培養は３７℃の温度で達成される。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、撹拌された培養培地は、培養培地を５０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍの範囲における速度で撹拌することによって得られる。
【００５２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、撹拌された培養培地は、培養培地を１００ｒｐｍの速度で撹拌することによって得られる。
【００５３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、所定の期間は３日〜１０日の範囲から選択される。
【００５４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、所定の期間は７日である。
【００５５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、グリセロールは３グラム／リットル〜２０グラム／リットルの濃度範囲で提供される。
【００５６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、グリセロールは６グラム／リットルの濃度で提供される。
【００５７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、培養培地はベラトリルアルコールをさらに含む。
【００５８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ベラトリルアルコールは０．５ｍＭ〜４ｍＭの濃度範囲で提供される。
【００５９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ベラトリルアルコールは２ｍＭの濃度で提供される。
【００６０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニンペルオキシダーゼはイソ酵素Ｈ１または改変された形態のイソ酵素Ｈ２である。
【００６１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、多孔性マトリックスはポリウレタンフォームである。
【００６２】
本発明のさらにさらなる態様によれば、５００ユニット／リットル〜２０００ユニット／リットルの範囲でリグニンペルオキシダーゼ酵素活性を示すファネロカエテ・クリソスポリウム菌の水性抽出物が提供される。
【００６３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニンペルオキシダーゼ活性は１５００ユニット／リットルである。
【００６４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、リグニンペルオキシダーゼ酵素活性はイソ酵素Ｈ１または改変された形態のイソ酵素Ｈ２である。
【００６５】
本発明は、対象の皮膚領域または毛髪を明色化するための効率的な方法および組成物を提供することによって、現在知られている形態の欠点を対処することに成功している。
【００６６】
別途定義されない場合、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同様または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
本発明は、例としてだけであるが、添付されている図面を参照して、本明細書中に記載される。次に図面を詳しく具体的に参照して、示されている細目は、例としてであり、また、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためだけのものであり、従って、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解された記述であると考えられるものを提供するために示されていることが強調される。これに関して、記述を図面と一緒に理解することにより、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者には明らかになるので、発明の構造的詳細を、発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に示すことは試みられていない。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】Ａｌａｌｕｆら（２００１）から採用された哺乳動物メラニンの生合成の先行技術での概略図である。
【図２】ポリウレタンフォームに固定化されたファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）によるリグニンペルオキシダーゼの製造のための撹拌型タンク反応槽（ＳＴＲ）を例示する。
【図３】培養時間を関数とするＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍの発酵装置培養物におけるＬＩＰ活性を例示する。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍは、実施例の節の実施例１に記載されるようなＳＴＲ発酵装置において成長させられ、ＬＩＰ活性が、実施例において記載されるようにベラトリルアルデヒドへのベラトリルアルコールの酸化を追跡することによって細胞外液においてアッセイされた。誤差バーは３回の反復実験の標準偏差を表す。
【図４】５０ｍＭ酒石酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）における１．５ｍＭのベラトリルアルコールの存在下での過酸化水素の増大する濃度の関数としてのＬＩＰ（０．４８μＭ）による７０．５μｇ／ｍｌの初期濃度でのメラニンの酸化を例示する。メラニンの酸化が、酵素反応の開始時および１６０秒後での４６０ｎｍにおけるその吸光度を測定することによって決定され、酸化型メラニンの割合が計算された。誤差バーは３回の反復実験の標準偏差を表す。
【図５】ＬＩＰによるメラニンの酸化に対する過酸化水素の増大する濃度の影響を例示する。メラニン酸化の程度が、過酸化水素を含まない酵素反応（０μＭ）との比較において色強度の減少によって可視化される。写真の下の数字は、μＭで表されるＨ２Ｏ２の濃度を示す。
【図６】ベラトリルアルコール（１．５ｍＭ）および過酸化水素（６００μＭ）の存在下での５０ｍＭ酒石酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）におけるＬＩＰ（０．４８μＭ）による種々の濃度のメラニンの酸化の程度を例示する。誤差バーは３回の反復実験の標準偏差を表す。
【図７】ＬＩＰ濃度の関数としてのメラニン酸化の程度を例示する。メラニン（７０μｇ／ｍｌ）の酸化が、５０ｍＭ酒石酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）におけるベラトリルアルコール（１．５ｍＭ）および過酸化水素（７００μＭ）の存在下での増大する濃度のＬＩＰによって行われた。誤差バーは３回の反復実験の標準偏差を表す。
【図８】クリーム配合物で使用されたときのＬＩＰによるメラニン酸化の可視化を例示する。メラニンの脱色が、活性化剤クリームをＬＩＰクリームに加えた後に観測される（図８ｂ）が、ＬＩＰクリームだけの存在下では観測されない（図８ａ）。
【図９】皮膚の白化に対するＬＩＰクリームの効果を例示する。クリーム配合物でのＬＩＰの（１日に２回の）適用後１週間目に撮影された女性の手の写真が示される。ＬＩＰで処置された領域（図９ａ、黒色の円）は、手におけるそれ以外の皮膚よりもはるかに薄くなっている（図９ｂ）。
【図１０】インビボでの毛髪漂白に対するＬＩＰの効果を例示する。女性の毛髪が５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ１１．５）に１時間浸された。毛髪は２５ＵのＬＩＰと１０秒間プレインキュベーションされ、その後、ベラトリルアルコール（１．５ｍＭ）および過酸化水素（８．８ｍＭ）を伴う酒石酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）に１時間漬けられた。著しい明色化効果が、ＬＩＰを含まない同じ溶液で処理された毛髪（図１０、左側試験管）と比較したとき、ＬＩＰで処理された毛髪において観察された（図１０、右側試験管）。
【図１１】皮膚色素沈着に対するＬＩＰ白化クリームの効果を例示する研究被験者番号１の右前腕のカラー写真である。図１１ａ−０日目に撮影された写真；図１１ｂ−２１日目に撮影された写真。
【図１２ａ−ｂ】研究被験者番号１における皮膚白化に対するＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームの効果を例示する。ＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームが右側および左側の前腕の上部部分に塗布され、一方、下部部分は未処置のままであった。皮膚色素沈着の程度が、Ｄｅｒｍａ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して７日間隔で両方の前腕で測定された。図１２ａ−ＬＩＰクリームの塗布；図１２ｂ−ヒドロキノンクリームの塗布；青色カラム＝ＬＩＰクリームで処置された右前腕の上部部分；明青色カラム＝右前腕の未処置の下部部分；ピンク色カラム＝ヒドロキノンで処置された左前腕の上部部分；白色カラム＝左前腕の未処置の下部部分。
【図１２ｃ】研究被験者番号１における皮膚白化に対するＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームの効果を例示する。ＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームが右側および左側の前腕の上部部分に塗布され、一方、下部部分は未処置のままであった。皮膚色素沈着の程度が、Ｄｅｒｍａ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して７日間隔で両方の前腕で測定された。図１２ｃは、ＬＩＰクリーム（図１２ｃ、青色線）またはヒドロキノンクリーム（図１２ｃ、ピンク色線）を使用する処置の２１日後における上部前腕における皮膚色素沈着の低下を比較する線グラフである。ヒドロキノンクリームを使用したときの適度な低下と比較して、ＬＩＰクリームを使用する処置の２１日後における皮膚色素沈着の急激な低下に留意すること。
【図１３】皮膚色素沈着に対するＬＩＰ白化クリームの効果を例示する研究被験者番号１０の右前腕のカラー写真である。図１３ａ−０日目に撮影された写真；図１３ｂ−２１日目に撮影された写真。
【図１４ａ−ｂ】研究被験者番号１０における皮膚白化に対するＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームの効果を例示する。ＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームが右側および左側の前腕の上部部分に塗布され、一方、下部部分は未処置のままであった。皮膚色素沈着の程度が、Ｄｅｒｍａ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して７日間隔で両方の前腕で測定された。図１４ａ−ＬＩＰクリームの塗布；図１４ｂ−ヒドロキノンクリームの塗布；青色カラム＝ＬＩＰクリームで処置された右前腕の上部部分；明青色カラム＝右前腕の未処置の下部部分；ピンク色カラム＝ヒドロキノンで処置された左前腕の上部部分；白色カラム＝左前腕の未処置の下部部分。
【図１４ｃ】研究被験者番号１０における皮膚白化に対するＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームの効果を例示する。ＬＩＰクリームまたはヒドロキノンクリームが右側および左側の前腕の上部部分に塗布され、一方、下部部分は未処置のままであった。皮膚色素沈着の程度が、Ｄｅｒｍａ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して７日間隔で両方の前腕で測定された。図１４ｃは、ＬＩＰクリーム（図１４ｃ、青色線）またはヒドロキノンクリーム（図１４ｃ、ピンク色線）を使用する処置の２１日後における上部前腕における皮膚色素沈着の低下を比較する線グラフである。ヒドロキノンクリームを使用したときの適度な低下と比較して、ＬＩＰクリームを使用する処置の２１日後における皮膚色素沈着の急激な低下に留意すること。
【図１５】全１２名の研究被験者における皮膚白化に対するＬＩＰクリームおよびヒドロキノンクリームの平均効果を例示する線グラフである。図１５ａ−平均色素沈着スコア；図１５ｂ−初期色素沈着スコアの割合としての色素沈着における平均低下。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明は、対象の皮膚領域または毛髪を明色化するために使用することができる方法および化粧用組成物に関する。
【００６９】
具体的には、本発明の方法は、色素沈着過多に関連する医学的状態（例えば、黒皮症、肝斑、老人性色素斑、そばかす、組織黒変症およびほくろなど）から生じる不揃いな皮膚の肌色を処置するために使用することができる。
【００７０】
本発明の原理および操作は、図面および付随する記述を参照してより良く理解することができる。
【００７１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することが可能であり、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであり、限定であるとして見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００７２】
皮膚の色素沈着の程度は一般住民の間での悩みの種である。一部の人々は老人性色素斑および妊娠斑に悩んでおり、そのような色素沈着した斑点を目立たなくしたいと思っている。一部の人々は、皮膚の色素沈着を軽減および緩和する皮膚明色化用製品で通常の場合には処置されるそばかす、肝斑、黒皮症、組織黒変症およびほくろを有する。しかしながら、現在の様々な皮膚明色化用製品は、永続的な白斑および副作用（例えば、皮膚色素異常症および発疹など）をもたらし得るヒドロキノンなどの過激な化学物質であるか、または、皮膚を明色化することにおいて十分に効率的でないかのいずれかである。それらの中には、チロシナーゼ（前駆体Ｌ−チロシンを別の前駆体ドーパキノンに変換する酵素）の阻害、従って、メラニンの生合成を阻害することに基づく製品がある。他の製品は、チロシン／ＤＯＰＡからメラニンに至る様々な段階で酸化反応を阻止し、最終的にはメラニンの生合成を阻害するために設計されている。後者の製品群には、Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）およびビオフラボノイドなどの抗酸化剤が含まれる。
【００７３】
毛髪明色化用製品では、高濃度の過酸化水素がアンモニアと一緒に利用される。これらの製品は、処置された対象にとって不快の種であり得る。
【００７４】
下記の実施例の節において明瞭に例示されるように、本発明者らは、リグニンペルオキシダーゼおよび特にそのＨ１イソ型がメラニンを効率的に酸化することができ、従って、対象の皮膚または毛髪を明色化するために利用できることを発見している。
【００７５】
米国５５７８２９６号では、担子菌菌類におけるメラニン分解能力が同定され、肝斑およびそばかす形成を処置するためにこの菌類を使用することが提案されたが、今日まで、菌類におけるメラニン分解を担う特異的な酵素は発見されていない。
【００７６】
従って、本発明の１つの態様によれば、対象の皮膚領域または毛髪を明色化する方法が提供される。
【００７７】
本発明のこの態様による方法は、少なくとも１つのタイプのリグニン改変酵素を、皮膚領域または毛髪の細胞に含有される色素（例えば、メラニン）を酸化するために好適な様式で対象の皮膚領域または毛髪に適用することによって達成される。
【００７８】
本明細書中で使用される表現「皮膚領域または毛髪を明色化する」は、皮膚または毛髪の色調または色を、それらに含有されるメラニン色素の色素形成性状または濃度を低下させることによって低下させることを示す。
【００７９】
本明細書中で使用される表現「対象」は、哺乳動物（典型的にはヒト）を示し、好ましくは、皮膚または毛髪の過度な色素沈着を有するか、あるいは、そばかすなどの皮膚障害を有する哺乳動物（典型的にはヒト）を示す。
【００８０】
本発明によって利用されるリグニン改変酵素は、好ましくは、リグニン分解において主要な役割を果たしているリグニンペルオキシダーゼである。このリグニン改変酵素の活性部位アミノ酸配列、およびこのリグニン改変酵素が基質を酸化する機構は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびダイズペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）と類似している。リグニン改変酵素は、大きな酸化還元電位を有する基質の酸化を触媒することができる。この特異な能力は、大きな酸化還元電位によって示される、電子密度が低いヘム活性部位と一致している［ＣａｉおよびＴｉｅｎ（１９９３）、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３０：７９〜９０］。
【００８１】
この分野で知られているリグニンペルオキシダーゼのイソ型はどれも本発明によって利用することができる（Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄら、１９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６３：８５７〜８６１）が、本発明では、好ましくは、Ｈ１イソ型が利用される。これは、下記の実施例の節において例示されるように、このイソ型はメラニン酸化活性をインビトロおよびインビボの両方で示したからである。
【００８２】
いくつかの方法を、本発明によって利用されるリグニン改変酵素を調製するために使用することができる。
【００８３】
例えば、リグニンペルオキシダーゼイソ酵素Ｈ１を菌類のファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）から調製することができる。リグニンペルオキシダーゼの高い酵素活性レベルを、ポリウレタンフォームに固定化されながら、または懸濁状態で、撹拌型タンク反応槽（ＳＴＲ）発酵装置において成長させたときに上記菌類から製造することができる（Ｄｏｓｏｒｅｔｚら、１９９３、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５９：１９１９〜２６）。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態によれば、発酵装置は、３７℃の培養温度を維持するための冷却システムに接続され、５０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ（より好ましくは１００ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ、最も好ましくは１６０ｒｐｍ）の速度で撹拌される。リグニンペルオキシダーゼ活性の収量を増大させるために、発酵装置は、１リットルの培養培地につき１分あたり０．１リットル〜１リットルの空気の通気速度で通気される。現時点で好ましい形態によれば、発酵装置は、１リットルの培養培地につき１分あたり０．２リットルの空気の通気速度で通気される。
【００８５】
下記の実施例の節の材料および実験方法において記載されるように、ファネロカエテ・クリソスポリウムは、マンガンイオンを含まず、グリセロールを炭素源として含有する培養条件のもとで培養される。好ましくは、本発明のグリセロールは３グラム／リットル〜２０グラム／リットルの濃度範囲で提供される。現時点で好ましい形態によれば、グリセロールは６グラム／リットルの濃度で提供される。
【００８６】
上記菌類からのリグニンペルオキシダーゼイソ酵素Ｈ１の精製プロセス時において、精製されたタンパク質の酵素活性が、バラトリルアルコールのバラトリルアルデヒドへの酸化のために生じる３１０ｎｍでの吸光度の変化によってさらに試験されている。
【００８７】
リグニンペルオキシダーゼイソ酵素Ｈ１はイソ酵素Ｈ２の翻訳後の脱リン酸化から生じ得る（ＫｕａｎおよびＴｉｅｎ、１９８９）ので、本発明によって使用されるリグニンペルオキシダーゼは、リグニンペルオキシダーゼイソ酵素Ｈ２を脱リン酸化することによって調製することができる。
【００８８】
本発明によって使用されるリグニン改変酵素はまた、米国特許第５２００３３８号に開示されるようにリグニン改変酵素を発現させるために改変された細菌細胞から抽出することができる。例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌など）を、強力な構成的プロモーター（例えば、ＳＰ６）の調節制御下に配置されたＬＩＰコード配列（配列番号１）を含む発現ベクターで形質転換することができる。発現後、細菌細胞を溶解することができ、そして、ＬＩＰを、クロマトグラフィー技術を使用して回収することができる（さらなる詳細について、Ｂｉｌｌｍａｎ−Ｊａｃｏｂｅ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７：５００〜４；ＨａｒｒｉｓおよびＥｍｔａｇｅ、１９８６、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．、３：２８〜３１を参照のこと）。
【００８９】
本発明によって使用されるリグニン改変酵素はまた、ＨｅＬａ細胞などの哺乳動物細胞株から抽出することができる。この場合、ＬＩＰコード配列が、好適な発現ベクター（例えば、ｐＣＤＮ３．１、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ、米国））において強力な哺乳動物プロモーター（例えば、ＣＭＶ）のもとに配置される。発現ベクターによるＨｅＬａ細胞のトランスフェクションの後、ＬＩＰ発現生成物を、従来の精製技術およびクロマトグラフィー技術によって、細胞から、または（例えば、分泌シグナルを含むようにＬＩＰ配列を改変することによって）培地から抽出することができる（さらなる詳細について、ＣｕｎｈａおよびＡｉｒｅｓ−Ｂａｒｒｏｓ、２００２、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：２９〜４０を参照のこと）。
【００９０】
リグニン改変酵素は、さらなる化合物の同時適用を必要とすることなく、皮膚または毛髪に適用することができるが、リグニン改変酵素ＬＩＰの明色化能力は、酸化性の活性化剤として役立つ電子受容体（すなわち、基質を酸化することができる分子）の存在下、および／または、酸化性の媒介因子として役立つフェノール性化合物、例えば、ベラトリルアルコール（Ｈａｒｖｅｙら、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ、２０：３４５〜９）およびベラトロール（Ｗａｒｄら、Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００２）、３０：４９０〜４９８）などの存在下で適用されたときに増強される。
【００９１】
従って、本発明の好ましい実施形態によれば、リグニン改変酵素は、酸化性の活性化剤（例えば、過酸化水素など）および酸化性の媒介因子（例えば、ベラトリルアルコールなど）の事前の適用、同時での適用または後での適用とともに適用される。
【００９２】
リグニン改変酵素は皮膚または毛髪に関してそのものとして適用することができる。しかしながら、明色化効率を増大するために、リグニン改変酵素は、好ましくは、特定の使用のために配合される化粧用組成物（例えば、全身の皮膚の明色化、そばかすの明色化、または毛髪の明色化などのために配合される化粧用組成物など）に含まれる。これらの化粧用組成物は表皮浸透剤（例えば、ブチレングリコールおよびトランスキュトールなど）および毛髪浸透剤（例えば、アルカノールアミンなど）を含むことができる。
【００９３】
本明細書中で使用される「化粧用組成物」は、本明細書中上記に記載される有効成分（例えば、ＬＩＰ）と、さらなる化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤、酸化性の活性化剤および／または酸化性の媒介因子など）とを含む調製物を示す。化粧用組成物の目的は、生物に対する有効成分の投与を容易にすることである。
【００９４】
以下において、使用される表現「好適なキャリア」は、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、リグニン改変酵素の生物学的な活性および性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。
【００９５】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために化粧用組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００９６】
化粧用組成物は、局所的様式で、例えば、化粧用組成物を患者の組織領域に対して直接的に投与することによって適用することができる。好適な投与経路には、例えば、局所的注射、皮下注射および皮内注射が含まれ得る。
【００９７】
本発明の化粧用組成物は、この分野で広く知られている様々な工程によって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来の工程によって製造することができる。
【００９８】
従って、本発明に従って使用される化粧用組成物は、調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合され得る。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【００９９】
注射の場合、化粧用組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的塩緩衝液など）において配合することができる。
【０１００】
あるいは、有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、無菌のパイロジェン非含有水に基づく溶液）を用いて構成される粉末形態にすることができる。
【０１０１】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１０２】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量は、最初はインビトロアッセイから推定することができる。本明細書中において実施例の節に示されるように、ＬＩＰおよび過酸化水素の濃度は、インビトロアッセイから最適化することができ、インビボ使用のためにさらに適合化することができる。また、用量は、所望される濃度または力価を達成するために、組織培養システムまたは動物モデルにおいて定めることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１０３】
皮膚色素沈着障害（例えば、肝斑、黒皮症、組織黒変症およびほくろ）の重篤度および皮膚の応答性に依存して、投薬は単回または複数の投与であり得る。この場合、処置の経過期間は数日から数週間まで、または、治癒が達成されるか、または、皮膚障害の軽減が達成されるまで続く。
【０１０４】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、病気の重篤度、投与様式、処方医師の判断などに依存する。
【０１０５】
本発明の化粧用組成物に含まれるリグニン改変酵素はまた、皮膚色素沈着障害（例えば、黒皮症、肝斑、組織黒変症およびほくろなど）を処置するための医薬組成物として、より高い濃度で提供することができ、また、医師によって処方することができる。
【０１０６】
下記は、リグニン改変酵素を含む、皮膚または毛髪の明色化のために配合された配合物の記載である。
【０１０７】
皮膚の明色化
皮膚の明色化を最適化および制御するために、リグニン改変酵素は、好ましくは、皮膚を明色化する目的のために配合される化粧用組成物に含まれる。
【０１０８】
本発明の皮膚明色化用の化粧用組成物はインビボで用いられるので、組成物は好ましくは高純度であり、かつ潜在的に有害な混入物を実質的に含まず、例えば、少なくともＮａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｏｄ（ＮＦ）規格であり、一般には少なくとも分析用規格であり、好ましくは少なくとも医薬品規格である。特定の化合物が使用前に合成されなければならないならば、そのような合成またはその後の精製は、合成手法時または精製手法時に使用されていたかもしれない何らかの潜在的に混入する毒性剤を実質的に含まない生成物をもたらされなければならない。
【０１０９】
有効成分
リグニン改変酵素（例えば、リグニンペルオキシダーゼなど）は、１Ｕ／ｇ〜１００Ｕ／ｇの範囲から選択される濃度で本発明の化粧用組成物に含まれる。現在知られている形態によれば、本発明の化粧用組成物に含まれるリグニン改変酵素は、５Ｕ／ｇ〜１００Ｕ／ｇの範囲から選択される濃度で提供される。リグニン改変酵素の好ましい濃度は、組成物の具体的な使用に従って選択されることが理解され、従って、一般的な皮膚明色化のためには、５Ｕ／ｇ〜２０Ｕ／ｇの好ましい濃度が利用され、一方で、そばかす明色化のためには、５Ｕ／ｇ〜１００Ｕ／ｇのより広い濃度が利用される。
【０１１０】
皮膚明色化用の化粧用組成物によって使用される電子受容体（酸化性の活性化剤）は、好ましくは、少なくとも０．００５％の濃度で提供される過酸化水素である。過酸化水素は安定であるが、中性またはアルカリ性の条件のもとでは分解して、水および酸素の活性な化学種を形成する。酸素の活性な化学種は非常に反応性である。
【０１１１】
化粧用組成物は、リグニンペルオキシダーゼが４未満のｐＨ（好ましくはｐＨ２．５〜３．５）のみで活性であり、また、過酸化水素がそのようなｐＨにおいて安定であるので、４以下のｐＨに好ましくは緩衝化される。
【０１１２】
４以下のｐＨを維持することができる緩衝剤はどれも用いることができる。従って、酢酸、酒石酸、リン酸またはクエン酸を用いる緩衝剤を皮膚明色化用の化粧用組成物によって使用することができる。
【０１１３】
下記の実施例の節において示されるように、本発明の過酸化水素は、リン酸を用いてｐＨ３．５において安定化される。
【０１１４】
本発明によって使用される酸化性の媒介因子は、酸化電位およびリグニン改変酵素の安定性を増大させる小さい芳香族分子、すなわち、より具体的にはメトキシル化化合物である。本発明によって使用される好ましい酸化性の媒介因子はベラトリルアルコールおよびベラトロールである。
【０１１５】
実施例の節において明らかにされるように、本発明の化粧用組成物に含まれるベラトリルアルコールは、好ましくは、少なくとも０．０５％の濃度で水に希釈される。
【０１１６】
表皮浸透剤
有効成分（例えば、ＬＩＰ）の経皮吸収を高めるために、数多くの薬剤の１つまたは複数を化粧用組成物に加えることができ、これらには、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤、アゾン、アルコール、アセトン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
下記の実施例の節において例示されるように、リグニン改変酵素（ＬＩＰ）および活性化剤（過酸化水素）は、好ましくは、ＬＩＰの皮膚浸透を高めるために最適化された様式および濃度で、ブチレングリコールおよびトランスキュトールなどの表皮浸透剤とそれぞれ混合される。本発明によって使用されるブチレングリコールは少なくとも１％の濃度で提供され、トランスキュトールは少なくとも３％の濃度で提供される。
【０１１８】
キャリア
本明細書中に開示される薬剤の薬学的に効果的な量に加えて、本発明のこの態様の化粧用組成物はまた皮膚科学的に許容され得るキャリアを含む。
【０１１９】
表現「皮膚科学的に許容され得るキャリア」は、皮膚（すなわち、ケラチン組織）への局所的適用のために好適であり、良好な美学的性質を有し、本発明の活性な薬剤および任意の他の成分との適合性を有し、また、哺乳動物における使用のために安全かつ非毒性であるキャリアを示す。キャリアの効果的な量は、組成物の重量比で約５０％〜約９９．９９％（好ましくは約８０％〜約９９．９％、より好ましくは約９０％〜約９８％、最も好ましくは約９０％〜約９５％）の範囲から選択される。
【０１２０】
エマルション
本発明の組成物において利用されるキャリアは広範囲の様々な形態であり得る。これらには、水中油型エマルション、油中水型エマルション、水中油中水型エマルションおよび油中水中シリコーン型エマルション（これらに限定されない）を含むエマルションキャリア、クリーム、軟膏、水溶液、ローションまたはエアロゾルが含まれる。当業者によって理解されるように、特定の成分は、組成物における成分の水溶解性／分散性に依存して、水相または油／シリコーン相のいずれかに主に分布する。
【０１２１】
本発明によるエマルションは一般に、薬学的に効果的な量の本明細書中に開示される薬剤と、脂質またはオイルとを含有する。脂質およびオイルは、動物、植物または石油に由来し得るし、また、天然物または合成物（すなわち、人工物）であり得る。好ましいエマルションはまた、グリセリンなどの保湿剤を含有する。エマルションは、好ましくは、キャリアの重量に基づいて、約１％〜約１０％（より好ましくは約２％〜約５％）の乳化剤をさらに含有する。乳化剤は、非イオン性、アニオン性またはカチオン性であり得る。好適な乳化剤が、例えば、米国特許第３７５５５６０号（Ｄｉｃｋｅｒｔらに対して発行、１９７３年８月２８日）、米国特許第４４２１７６９号（Ｄｉｘｏｎらに対して発行、１９８３年１２月２０日）、および、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎｓ’ｓ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｃｉｆｉｅｒｓ（北アメリカ版、３１７頁〜３２４頁、１９８６年）に記載される。
【０１２２】
エマルションはまた、ケラチン組織への適用時の泡立ちを最小限に抑えるための消泡剤を含有することができる。消泡剤には、そのような使用のためにこの分野で広く知られている高分子量シリコーンおよび他の物質が含まれる。
【０１２３】
好適なエマルションは、所望される製品形態に依存して、広範囲の様々な粘度を有し得る。好まれる例示的な低粘度エマルションは約５０センチストークス以下の粘度を有し、より好ましくは約１０センチストークス以下の粘度を有し、最も好ましくは約５センチストークス以下の粘度を有する。エマルションはまた、ケラチン組織への適用時の泡立ちを最小限に抑えるための消泡剤を含有することができる。消泡剤には、そのような使用のためにこの分野で広く知られている高分子量シリコーンおよび他の物質が含まれる。
【０１２４】
１つのタイプのエマルションは水中シリコーン型エマルションである。水中シリコーン型エマルションは、連続したシリコーン相と、分散された水相とを含有する。本発明の好ましい水中シリコーン型エマルションは、重量比で約１％〜約６０％（好ましくは約５％〜約４０％、より好ましくは約１０％〜約２０％）の連続したシリコーン相を含む。連続したシリコーン相は、本明細書中下記において記載される不連続な水相を含有または取り囲む外側相として存在する。
【０１２５】
連続したシリコーン相はポリ有機シロキサンオイルを含有することができる。好ましい水中シリコーン型エマルション系は、本明細書中に開示される薬剤の薬学的に効果的な量を送達するための酸化安定性ビヒクルを提供するために配合される。これらの好ましいエマルションの連続したシリコーン相は約５０重量％〜約９９．９重量％の間の有機ポリシロキサンオイルおよび約５０重量％未満の非シリコーンオイルを含む。特に好ましい実施形態において、連続したシリコーン相は、連続したシリコーン相の重量比で少なくとも約５０％（好ましくは約６０％〜約９９．９％、より好ましくは約７０％〜約９９．９％、さらにより好ましくは約８０％〜約９９．９％）のポリ有機シロキサンオイルと、連続したシリコーン相の重量比で約５０％までの非シリコーンオイル（好ましくは約４０％未満、より好ましくは約３０％未満、さらにより好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約２％未満）とを含む。これらの有用なエマルション系は、より低い濃度のポリ有機シロキサンオイルを含有する匹敵し得る水中油型エマルションよりも大きい酸化安定性を長い期間にわたって提供し得る。連続したシリコーン相における非シリコーンオイルの濃度は、組成物における本発明の活性な化合物の酸化安定性をおそらくはさらに高めるように最小限に抑えられるか、または完全に回避される。このタイプの水中シリコーン型エマルションが米国特許第５６９１３８０号（Ｍａｓｏｎら、１９９７年１１月２５日発行）に記載される。
【０１２６】
組成物において使用される有機ポリシロキサンオイルは揮発性または不揮発性であり得るか、あるいは揮発性シリコーンおよび不揮発性シリコーンの混合物であり得る。これに関連して使用される用語「不揮発性」は、周囲の条件のもとで液体であり、かつ、約１００℃以上の引火点（１気圧下）を有するそのようなシリコーンを示す。これに関連して使用される用語「揮発性」は、すべての他のシリコーンオイルを示す。好適な有機ポリシロキサンオイルは、広範囲の揮発性および不揮発性に及ぶ広範囲の様々なシリコーンから選択することができる。好適な有機ポリシロキサンオイルの例には、ポリアルキルシロキサン、環状ポリアルキルシロキサンおよびポリアルキルアリールシロキサンが含まれ、これらは当業者に知られており、また市販されている。
【０１２７】
連続したシリコーン相は１つまたは複数の非シリコーンオイルを含有することができる。連続したシリコーン相における非シリコーンオイルの濃度は、好ましくは、組成物における薬学的に効果的な薬剤の酸化安定性をさらに高めるように最小限に抑えられるか、または完全に回避される。好適な非シリコーンオイルは、約１気圧の圧力もとで約２５℃以下の融点を有する。連続したシリコーン相における使用のために好適な非シリコーンオイルの例が、水中油型エマルションの形態での局所用パーソナルケア製品における化学技術分野で広く知られているものであり、例えば、鉱油、植物油、合成油、半合成油などである。
【０１２８】
本発明の有用な局所用組成物は、約３０％〜約９０％（より好ましくは約５０％〜約８５％、最も好ましくは約７０％〜約８０％）の分散された水相を含む。用語「分散（された）相」は、当業者にはよく知られており、相が、連続（した）相に懸濁され、かつ連続相によって囲まれている小さい粒子または液滴として存在することを含意する。分散相はまた、内部相または不連続相として知られている。分散された水相は、本明細書中前記の連続したシリコーン相に懸濁され、そのようなシリコーン相によって囲まれている小さい水性の粒子または液滴の分散物である。水相は水であり得るか、あるいは、水および１つまたは複数の水溶性成分または水分散性成分の組合せであり得る。必要に応じて使用されるそのような成分の非限定的な例には、増粘剤、酸、塩基、塩、キラント、ガム、水溶性または水分散性のアルコールまたはポリオール、緩衝剤、保存剤、日焼け止め剤および着色剤などが含まれる。
【０１２９】
本発明の局所用組成物は、典型的には、組成物の重量比で、分散された水相において約２５％〜約９０％（好ましくは約４０％〜約８０％、より好ましくは約６０％〜約８０％）の水を含む。
【０１３０】
本発明の水中シリコーン型エマルションは好ましくは乳化剤を含む。好ましい実施形態において、組成物は、組成物の重量比で、約０．１％〜約１０％の乳化剤、より好ましくは約０．５％〜約７．５％の乳化剤、最も好ましくは約１％〜約５％の乳化剤を含有する。乳化剤は、連続したシリコーン相における水相の分散および懸濁を助ける。
【０１３１】
広範囲の様々な乳化剤を、好ましい水中シリコーン型エマルションを形成させるために本発明では用いることができる。知られている乳化剤または従来の乳化剤を、選択された乳化剤が組成物の必須成分と化学的および物理的に適合し、かつ、所望される分散特性を提供するならば、組成物において使用することができる。好適な乳化剤には、局所用パーソナルケア製品における使用について当業者によって知られているシリコーン乳化剤（例えば、有機修飾された有機ポリシロキサン）（これはまた、シリコーン界面活性剤として当業者に知られている）、シリコーン非含有乳化剤、およびそれらの混合物が含まれる。
【０１３２】
有用な乳化剤には、広範囲の様々なシリコーン乳化剤が含まれる。これらのシリコーン乳化剤は、典型的には、有機修飾された有機ポリシロキサンであり、これはまた、シリコーン界面活性剤として当業者には知られている。好適な乳化剤が、例えば、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ，Ｄｅｔｅｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ（北アメリカ版、１９８６年；Ａｌｌｕｒｅｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより刊行）；米国特許第５０１１６８１号（Ｃｉｏｔｔｉら、１９９１年４月３０日発行）、米国特許第４４２１７６９号（Ｄｉｘｏｎら、１９８３年１２月２０日発行）および米国特許第３７５５５６０号（Ｄｉｃｋｅｒｔら、１９７３年８月２８日発行）に記載される。
【０１３３】
他の好ましい局所用キャリアには、連続した水相と、連続した水相に分散された疎水性の水不溶性相（「油相」）とを有する油中水型エマルションが含まれる。油中水型エマルションを含む好適なキャリアの例が、米国特許第５０７３３７１号（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９１年１２月１７日発行）、米国特許第５０７３３７２号（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９１年１２月１７日発行）に記載される。構造剤、親水性界面活性剤および水を含有する特に好ましい油中水型エマルションが本明細書中下記において詳しく記載される。
【０１３４】
好ましい油中水型エマルションは、液晶ゲル網目構造の形成を助けるための構造剤を含む。理論によって限定されないが、構造剤は、組成物の安定性に寄与するレオロジー学的特徴を組成物に提供することを助けると考えられる。構造剤はまた、乳化剤または界面活性剤として機能し得る。本発明の好ましい組成物は、組成物の重量比で約０．５％〜約２０％（より好ましくは約１％〜約１０％、最も好ましくは約１％〜約５％）の構造剤を含む。本発明の好ましい構造剤は、ステアリン酸、パルミチン酸、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ベヘニルアルコール、ステアリン酸、パルミチン酸、平均して約１個〜約２１個のエチレンオキシドユニットを有するステアリルアルコールのポリエチレングリコールエーテル、平均して約１個〜約５個のエチレンオキシドユニットを有するセチルアルコールのポリエチレングリコールエーテル、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【０１３５】
広範囲の様々なアニオン性界面活性剤もまた、本発明では有用である。例えば、米国特許第３９２９６７８号（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９７５年１２月３０日発行）を参照のこと。また、両性界面活性剤および双性イオン型界面活性剤もまた、本発明では有用である。
【０１３６】
好ましい油中水型エマルションは、約０．０５％〜約１０％（好ましくは約１％〜約６％、最も好ましくは約１％〜約３％）の、疎水性物質を水相に分散させることができる少なくとも１つの親水性界面活性剤を含む（局所用キャリアの重量比による百分率）。界面活性剤は、最少量において、水に分散するために十分に親水性でなければならない。好適な界面活性剤には、広範囲の様々な知られているカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、双性イオン型界面活性剤および両性界面活性剤のいずれかが含まれる。ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ，Ｄｅｔｅｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ（北アメリカ版、１９８６年；Ａｌｌｕｒｅｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより刊行）；米国特許第５０１１６８１号（Ｃｉｏｔｔｉら、１９９１年４月３０日発行）、米国特許第４４２１７６９号（Ｄｉｘｏｎら、１９８３年１２月２０日発行）および米国特許第３７５５５６０号を参照のこと。選ばれる的確な界面活性剤は、組成物のｐＨ、および存在する他の成分に依存する。カチオン性界面活性剤が好ましく、特に、ジアルキル第四級アンモニウム化合物が好ましく、その例が米国特許第５１５１２０９号（ＭｃＣａｌｌら、１９９２年９月２９日発行）、米国特許第５１５１２１０号（Ｓｔｅｕｒｉら、１９９２年９月２９日発行）、米国特許第５１２０５３２号、米国特許第４３８７０９０号、米国特許第３１５５５９１号、米国特許第３９２９６７８号、米国特許第３９５９４６１号；ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ，Ｄｅｔｅｇｅｎｔｓ ＆ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ（北アメリカ版、１９７９年；Ｍ．Ｃ．Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）；および、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ，Ｔｈｅｉｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９４９年）に記載される。
【０１３７】
あるいは、他の有用なカチオン性乳化剤には、アミノ−アミドが含まれる。これらのカチオン性乳化剤の非限定的な例には、ステアルアミドプロピルＰＧジモニウムクロリドホスファート、ベヘンアミドプロピルＰＧジモニウムクロリド、ステアルアミドプロピルエチルジモニウムエトスルファート、ステアルアミドプロピルジメチル（ミリスチルアセタート）アンモニウムクロリド、ステアルアミドプロピルジメチルセテアリルアンモニウムトシラート、ステアルアミドプロピルジメチルアンモニウムクロリド、ステアルアミドプロピルジメチルアンモニウムラクタート、およびそれらの混合物が含まれる。
【０１３８】
好ましい油中水型エマルションは、局所用キャリアの重量比で約２５％〜約９８％（好ましくは約６５％〜約９５％、より好ましくは約７０％〜約９０％）の水を含む。
【０１３９】
局所用組成物
化粧用組成物は、下記において記載されるように、溶液、ローション、スプレー、クリーム、軟膏、膏薬、ゲルなどを含む、皮膚への適用のために化粧品業界によって利用されている様々な形態のいずれかで配合することができる。
【０１４０】
好ましくは、化粧用組成物は、処置された皮膚領域に留まるために十分な粘性で配合され、容易に蒸発せず、かつ／または、水によるすすぎによって容易に除去されず、むしろ、石けん、洗剤および／またはシャンプーの助けを借りて除去可能である。
【０１４１】
そのような性質を有する組成物を調製するための様々な方法が、当業者には広く知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０、上掲）；および、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（第６版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９５）に詳しく記載されている。
【０１４２】
キャリア
ローションおよびクリーム（これらに限定されない）を含む本発明の局所用組成物は、皮膚科学的に許容され得る皮膚軟化剤を含むことができる。そのような組成物は、好ましくは、約２％〜約５０％の皮膚軟化剤を含む。本明細書中で使用される「皮膚軟化剤」は、乾燥の防止または軽減のために、そして同様に皮膚の保護のために有用である物質を示す。広範囲の様々な好適な皮膚軟化剤が知られており、これらを本発明において使用することができる。例えば、Ｓａｇａｒｉｎ、Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（第２版、第１巻、３２４３頁、１９７２年）を参照のこと；これには、皮膚軟化剤として好適な物質の数多くの例が含まれる。好ましい皮膚軟化剤はグリセリンである。グリセリンは、好ましくは、約０．００１％〜約２０％（より好ましくは０．０１％〜約１０％、最も好ましくは約０．１％〜約５％）の量で使用され、例えば、３％の量で使用される。
【０１４３】
本発明によるローションおよびクリームは、一般に、溶液キャリアシステムと、１つまたは複数の皮膚軟化剤とを含む。ローションは、典型的には、約１％〜約２０％（好ましくは約５％〜約１０％）の皮膚軟化剤と、約５０％〜約９０％（好ましくは約６０％〜約８０％）の水と、薬学的に効果的な量の本明細書中に記載される薬剤とを含む。クリームは典型的には、約５％〜約５０％（好ましくは約１０％〜約２０％）の皮膚軟化剤と、約４５％〜約８５％（好ましくは約５０％〜約７５％）の水と、薬学的に効果的な量の本明細書中に記載される薬剤とを含む。
【０１４４】
本発明の局所適用される化粧用組成物はまた、例えば、香り因子および皮膚栄養因子に関して化粧用組成物を高めるために、加えられるさらなる成分を含むことができる。
【０１４５】
そのような成分は、毒性、不適合性、不安定性およびアレルギー応答などを妥当な医学的判断の範囲内で誘導することを伴わないヒトケラチン組織における使用のために好適に選択される。また、必要に応じて使用されるそのような成分は、本発明の活性な化合物の利点を受け入れられないほど変化させないならば、有用である。
【０１４６】
ＣＴＦＡ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第２版、１９９２年）には、本発明の組成物における使用のために好適である、スキンケア産業において一般的に使用されている広範囲の様々な非限定的な化粧用成分が記載される。これらの成分クラスの例には、研磨剤、吸収剤、美学的成分（例えば、香料、顔料、着色剤、精油、皮膚感覚剤、収斂剤など）（例えば、丁子油、メントール、樟脳、ユーカリ油、オイゲノール、乳酸メチル、マンサク留出物）、ニキビ防止剤、固化防止剤、消泡剤、抗菌剤（例えば、ヨードプロピルブチルカルバマート）、抗酸化剤、結合剤、生物学的添加剤、緩衝化剤、増量剤、キレート化剤、化学的添加剤、着色剤、化粧用収斂剤、化粧用殺生物剤、変性剤、薬物収斂剤、外用鎮痛剤、フィルム形成特性および組成物の実質性を助けるためのフィルム形成剤またはフィルム物質（例えば、ポリマー）（例えば、エイコセンおよびビニルピロリドンの共重合体）、不透明化剤、ｐＨ調節剤、噴射剤、還元剤、金属イオン封鎖剤、皮膚調節剤（例えば、多種のものおよび吸蔵剤等の保湿剤）、皮膚の平滑化および／または治癒用の薬剤（例えば、パンテノールおよび誘導体（例えば、エチルパンテノール）、アロエ、パントテン酸およびその誘導体、アラントイン、ビサボロール、ならびに、グリシレチン酸二カリウム）、皮膚処置剤、増粘剤、ならびに、ビタミンおよびその誘導体が含まれる。
【０１４７】
化粧用組成物は皮膚に対して直接的に塗布することができる。あるいは、化粧用組成物は、この分野で知られている様々な経皮薬物送達システム（例えば、組成物を皮膚内に時間放出様式で放出する経皮パッチなど）による通常的な皮膚適用によって送達することができる。この分野で知られている他の薬物送達システムには、加圧エアロゾルボトル、イオン導入法または超音波導入法が含まれる。イオン導入法は、皮膚透過性を増大させ、経皮送達を促進させるために用いられる。米国特許第５６６７４８７号および同第５６５８２４７号には、皮膚を横断する治療剤の、超音波−イオン導入法により媒介される輸送のために好適なイオノソニック装置が開示される。あるいは、またはさらに、リポソームまたはミセルもまた、送達ビヒクルとして用いることができる。
【０１４８】
本発明の化粧用組成物に含まれる有効成分は、メラニンを酸化することによる皮膚の明色化のために好適である。しかしながら、その酸化反応は、還元性試薬の加えることによって所望されるときに制御および停止することができる。このような試薬は、別個の化粧用組成物において配合することができ、所望される時に皮膚に塗布することができる。
【０１４９】
毛髪の明色化
有効成分
本発明の教示に従って配合される毛髪明色化用組成物は、本明細書中上記に記載される酸化性の薬剤および媒介因子を含む。
【０１５０】
下記の実施例の節において明らかにされるように、毛髪の明色化は、ｐＨが３．５の酒石酸塩緩衝液において１．５ｍＭのベラトリルアルコールおよび８．８ｍＭの過酸化水素の存在下で達成することができる。
【０１５１】
軟化剤
軟化剤には、炭化水素オイルおよびワックス（例えば、鉱油およびワセリンなど）、植物および動物の油脂（例えば、オリーブ油、パーム油、ひまし油、トウモロコシ油およびダイズ油など、ならびに、ラノリンおよびその誘導体（ラノリン、ラノリン油、ラノリンワックスおよびラノリンアルコールなど）など）が含まれるが、これらに限定されない。他の軟化剤には、１０個〜２０個の炭素原子を有する脂肪酸（例えば、ミリスチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸およびパルミチン酸などを含む）のエステル、例えば、ミリスチン酸メチル、ミリスチン酸プロピル、ミリスチン酸ブチル、ステアリン酸プロピル、イソステアリン酸プロピルおよびパルミチン酸プロピルなどが含まれる。他の軟化剤には、ステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、イソステアリン酸およびパルミチン酸などを含む、１０個〜２０個の炭素原子を有する脂肪酸が含まれる。軟化剤にはまた、セチルアルコール、ミリスチルアルコール、ラウリルアルコール、イソステアリルアルコールおよびステアリルアルコールなどの、１０個〜２０個の炭素原子を有する脂肪アルコールが含まれる。
【０１５２】
一部は水溶性であるが、多価アルコールおよびポリエーテル誘導体が軟化剤として含まれ、これらには、グリコール類、グリセロール、ソルビトールおよびポリアルキレングリコールなど、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール２００〜５００などが含まれる。水溶性の例が好ましい。
【０１５３】
界面活性剤
乳化剤／界面活性剤もまた、本発明の毛髪明色化用組成物によって利用されることが好ましい。
【０１５４】
界面活性剤の例には、親水性のアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシド、ポリエチレンオキシドまたはポリエチレングリコールとの縮合のために利用可能なフリーの反応性水素を有する疎水性のアルキル官能基、アルケン官能基またはアルキル芳香族官能基のポリオキシアルキレンオキシド縮合生成物が含まれるが、これに限定されない。特に効果的なものは、オクチルフェノールと、約７モル〜約１３モルのエチレンオキシドとの縮合生成物であり、これらはそれらの商品名ＴＲＩＴＯＮ１００（登録商標）シリーズの製品でＲｏｈｍ＆Ｈａａｓ Ｃｏｍｐａｎｙによって販売されている。
【０１５５】
他の成分、例えば、香料、安定化剤、色素、抗微生物剤、抗菌剤、凝集防止剤、紫外線吸収剤などもまた、本発明の毛髪明色化用組成物に含まれる。
【０１５６】
コンディショナー
酸加水分解に対して安定なコンディショナー薬剤（例えば、エトキシル化モノクアド（ｑｕａｄ）とともに少なくとも１つの第四級アンモニウム成分を有するシリコーン化合物など）もまた、本発明の毛髪明色化用組成物を安定化し、場合により粘性を高めるために利用されることが好ましい。
【０１５７】
必要に応じて使用される増粘剤もまた、組成物の美観を改善し、また、毛髪への組成物の適用を容易にするために含めることができる。０重量％〜約３重量％の量での非イオン性の増粘剤が好ましい。例示的な増粘剤には、メチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース、ジ（水素化タロー）フタル酸アミド、架橋された無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体、グアールガム、キサンタンガムおよびアラビアゴムがある。
【０１５８】
コンディショニング用組成物のキャリアは主として水である。しかし、有機溶媒もまた、組成物の製造を容易にするために、または、美学的性質（例えば、粘度制御など）を提供するために含めることができる。好適な溶媒には、エチルアルコールおよびイソプロピルアルコールのような低級アルコール；２−ブトキシエタノール、エチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールおよびジエチレングリコールモノエチルエーテルまたはジエチレングリコールモノメチルエーテルのようなグリコールエーテル；およびそれらの混合物が含まれる。非水性溶媒は、組成物のキャリアの総重量の重量比で約１％〜約５０％の量で、特に約５％〜約２５％の量で本発明のコンディショニング用組成物に存在させることができる。
【０１５９】
不透明なコンディショナーにおいて使用され得る非限定的なコンディショニング用薬剤には、ステアリルトリメチルアンモニウムクロリド、ベヘントリメチルアンモニウムクロリド、セトリモニウムブロミド、ソイトリモニウムクロリド、タロートリモニウムクロリド、二水素化タロージメチルアンモニウムクロリド、ベヘントリメチルアンモニウムメトスルファート、Ｐｅｇ−２オレアンモニウムクロリド、二水素化タロージメチルアンモニウムブロミド、二水素化タロージメチルアンモニウムメトスルファート、パルミチルトリメチルアンモニウムクロリド、水素化タロートリメチルアンモニウムクロリド、水素化タロートリメチルアンモニウムブロミド、ジセチルジメチルアンモニウムクロリド、ジステアリルジメチルアンモニウムクロリド、ジパルミチルジメチルアンモニウムクロリド、水素化タロートリメチルアンモニウムメトスルファート、セトリモニウムトシラート、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリド、およびジタロージメチルアンモニウムクロリドが含まれる。
【０１６０】
本発明の組成物を不透明化するために使用され得る物質には、脂肪エステル、不透明化ポリマー（例えば、ＯＰＡＣＩＦＩＥＲ６５３（これはＭｏｒｔｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から得られる）のようなスチレンポリマーなど）、および脂肪アルコールが含まれる。下記は脂肪アルコールの非限定的な列挙である：セチルアルコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、ベヘニルアルコールおよびアラキジルアルコール。透明でない本発明のコンディショニング用組成物はまた、Ｌｅｘａｍｉｎｅ Ｓ−１３、ジセチルアンモニウムクロリド、およびセテアレス（ｃｅｔｅａｒｅｔｈ）−２０を含むことができる。
【０１６１】
本発明の組成物は、所望される場合、皮膚または毛髪の明色化における使用のための適切な説明書、および、皮膚または毛髪の明色化における使用のためのＦＤＡ承認を示す表示と一緒に、ディスペンサーデバイスまたはキットで提供され得る。
【０１６２】
皮膚領域または毛髪を明色化するためのキットは、例えば、好適な緩衝液、キャリア、浸透剤などとともに提供されるリグニン改変酵素を含む容器と、上記の酸化性の薬剤および媒介因子を含むさらなる容器とを含むことができる。
【０１６３】
リグニン改変酵素はまた、この分野で知られている分子生物学的方法を使用することによって皮膚領域の細胞の中に導入することができる。
【０１６４】
従って、本発明のさらに別の態様によれば、対象の皮膚領域を明色化する方法が提供される。本発明のこの態様による方法は、皮膚領域の細胞に含有され得る色素を酸化するために好適な様式でリグニン改変酵素を皮膚領域の細胞内において発現させることによって達成される。
【０１６５】
そのような発現は、プロモーター配列に機能的に連結されたリグニン改変酵素のコード配列を含む発現ベクターで皮膚の細胞を形質転換することによって達成することができる。
【０１６６】
そのような発現ベクターを作製するために、リグニン改変酵素をコードするポリヌクレオチドセグメント（例えば、ＬＩＰのＨ１イソ型、配列番号１）を、哺乳動物細胞を形質転換するために好適であり、かつ、形質転換された細胞におけるリグニン改変酵素の発現を行わせるために好適である市販の発現ベクターシステムに連結することができる。そのような市販のベクターシステムは、既存のプロモーター配列またはエンハンサー配列を置換し、または複製し、または変異させるために、かつ／あるいは任意のさらなるポリヌクレオチド配列（例えば、さらなる選択マーカーをコードする配列、またはレポーターポリペプチドをコードする配列など）を導入するために、一般に使用されている様々な組換え技術によって容易に改変され得ることが理解される。
【０１６７】
本発明とともに使用される好適な哺乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびにそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
本発明のこの態様とともに使用される好適な発現ベクターは、アデノウイルスに基づくベクターである。アデノウイルスベクターは、皮膚ガン治療を含む様々な医薬的適用のために広く使用されている（Ｇｈａｚｉｚａｄｅｈ Ｓ、Ｔａｉｃｈｍａｎ ＬＢ（２０００）、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１１：２２４７〜５１；Ｃａｒｔｅｒ ＰＪ、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ（２０００）、Ｉｎｔ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、６：１７〜２１）。
【０１６９】
上記の発現ベクターは、様々な送達方法を使用して細胞内に送達することができ、これらには、リポソーム、表皮パッチ、イオン導入法または受容体媒介エンドサイトーシス（これらに限定されない）が含まれる。
【０１７０】
後者の方法において、エンドサイトーシスを受けることが知られている細胞表面受容体に対する抗体またはリガンドが、共有結合的に連結されたポリカチオン性付加物（例えば、ポリリシン、各種プロタミン）を介して、リグニン改変酵素をコードするＤＮＡ配列と複合体化される。そのような複合体は細胞表面に対するその結合特異性を保持しており、複合体が通常のエンドサイトーシスプロセスによってエンドソーム区画に進入する細胞に取り込まれる。また、様々な段階を、エンドソーム−リソソーム内でのＤＮＡの分解を回避するために取らなければならない。細胞は、トランスフェクション手法の期間中、リソソーム向性剤クロロキンで処理することができる。あるいは、エンドサイトーシスによって細胞の中に進入し、かつエンドソーム「突出」能を有するウイルスの成分を使用することができる。リガンド−ＤＮＡ複合体にカップリングされた複製欠陥アデノウイルスは、インビトロで組織培養細胞に対して事実上１００％のトランスフェクション効率をもたらす。予備的研究では、ＤＮＡを選ばれた細胞タイプにインビボで特異的に標的化するこの方法の潜在的可能性が明らかにされている（Ｇｕｙ Ｊ、Ｄｒａｂｅｋ Ｄ、Ａｎｔｏｎｉｏｕ Ｍ（１９９５）、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９５、３：２３７〜４８）。
【０１７１】
標的細胞内での発現の後、記載された電子受容体および媒介因子が、好ましくは、明色化を促進させるために、処置されている領域に適用される。
【０１７２】
リグニン改変酵素を標的細胞内において発現させることは、酵素そのものの細胞内送達が必要であることを克服し、それにより明色化効率を潜在的に高めるので、特に好都合である。
【０１７３】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１７４】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１７５】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１７６】
背景
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ菌におけるリグニンペルオキシダーゼ
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ＢＫＭ−Ｆ−１７６７の培養物の細胞外液においてリグニン分解活性を示すヘムタンパク質が１２個以上存在する。これらは、リグニンペルオキシダーゼ（ＬＩＰ）およびマンガンペルオキシダーゼ（ＭＮＰ）の２つのタイプのグリコシル化ヘムペルオキシダーゼに分類することができる。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８およびＨ１０のイソ酵素がＬＩＰであることが報告され、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５およびＨ９がＭＮＰとして同定されている（Ｆａｒｒｅｌｌら、１９８９）。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍのこれらのＬＩＰイソ酵素は、一群の構造的に関連した遺伝子のファミリーによってコードされており、その物理的特性、基質特異性および安定性が異なる（Ｆａｒｒｅｌｌら、１９８９；Ｓｔｅｗａｒｔら、１９９２）。それらの分泌を生じさせるプロセスの一部として、いくつかのＬＩＰイソ酵素はタンパク質分解的に切断され、また、グリコシル化される（Ｇｈｏｓｅ、１９８７；Ｒｉｔｃｈら、１９９１；ＴｉｅｎおよびＫｉｒｋ、１９８４）。また、Ｈ２、Ｈ６、Ｈ８およびＨ１０のＬＩＰイソ酵素は、アスパラギン結合型オリゴ糖に含有されるマンノース−６−リン酸成分においてリン酸化されることが報告されている。時間をおいた細胞外液の分析から、イソ酵素Ｈ１は、おそらくは、Ｈ２の翻訳後の脱リン酸化に由来するという示唆が得られている（ＫｕａｎおよびＴｉｅｎ、１９８９）。
【０１７７】
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍによるリグニン分解酵素の発現は、窒素または炭素の制限によって開始される特発性の（ｉｄｉｏｐｈａｓｉｃ）事象であり、培養条件および培地組成に非常に依存している（ＤｏｓｏｒｅｔｚおよびＧｒｅｔｈｌｅｉｎ、１９９１；ＦａｉｓｏｎおよびＫｉｒｋ、１９８５；Ｓｔｅｗａｒｔら、１９９２；ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｕｄｅら、１９９３）。ＬＩＰの形成は、高い酸素圧に対する培養物の暴露に特に依存している（Ｄｏｓｏｒｅｔｚら、１９９０；ＦａｉｓｏｎおよびＫｉｒｋ、１９８５）。定常状態の培養物の内部への酸素移行が制限され、その結果として、培養ヘッドスペースにおける大きい酸素分圧が、十分な酸素を水面下の菌糸が利用できるようにするために必要とされることが提案されている（Ｌｅｉｓｏｌａら、１９８３；Ｍｉｃｈｅｌら、１９９２）。ＬＩＰ形成が、この菌類に対する酸素の利用性を改善する非浸漬型液体培養において菌類を多孔性担体に固定化することによって空気にさらされた培養物において観測された（Ｄｏｓｏｒｅｔｚら、１９９０；Ｐｏｐｐら、１９９０）。培地におけるＭｎ２＋の濃度はＬＩＰおよびＭＮＰの形成に悪影響を及ぼした。ＭＮＰの形成は、ＭＮＰの転写を高めるＭｎに依存しているが、ＬＩＰの形成はＭｎによって阻害される。Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄら（１９９９）は、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍの窒素制限培養および窒素過剰培養の両方において、ＬＩＰ形成のために要求される高い酸素レベルがＭｎ欠乏によって置き換えられ得ることを示した。
【０１７８】
材料および実験方法
リグニンペルオキシダーゼを産生させるためのファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）菌の成長−ファネロカエテ・クリソスポリウム菌ＢＫＭＦ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）を２％麦芽抽出物寒天の保存用斜面培養（Ｄｉｆｘｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、米国）において４℃で維持した。
【０１７９】
胞子懸濁物の調製−菌の胞子を、保存用斜面培養物からの切り取り部分を、オートクレーブ処理された３９ｇ／リットルの濃度でのポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）を含有するペトリ皿に接種することによって得た。ＰＤＡ平板は、その後、３７℃で２週間までインキュベーションされた。胞子懸濁物を調製するために、ＰＤＡ平板に０．９％ＮａＣｌが重層され、分生子懸濁物を滅菌ガラスウールでろ過し、胞子懸濁物を集めた。胞子懸濁物は、その後、−８０℃で凍結保存された。
【０１８０】
接種調製物−胞子を滅菌済み接種用培地（本明細書中下記の配合を参照のこと）に７．５×１０５胞子／ｍｌの最終濃度で接種した。混合物の９０ｍｌが各発酵バッチ物に加えられた（ＴｉｅｎおよびＫｉｒｋ、１９８８、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１６１：２３８〜４９０；Ｄｏｓｏｒｅｔｚら、１９９０、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３４：１３１〜７）。その後、各バッチ物は綿栓で栓がされた。培養物は、浅い培養物として３７℃で４８時間、静置により成長させられた。培養物の接種のために、発酵バッチ物の内容物がミキサー（Ｗａｒｉｎｇ、英国）で２分間混合された。
【０１８１】
撹拌型タンク反応槽（ＳＴＲ）発酵装置における菌類の成長−菌類を成長させる前に、ポリウレタンフォームを発酵装置の冷却管の周りに据えて、ＳＴＲ発酵装置全体を滅菌した。その後、１０リットルの発酵装置用培地（本明細書中下記の配合を参照のこと）をＳＴＲ発酵装置に注入し、９００ｍｌの混合された接種物（１０個の発酵バッチ物の内容物）を加えた。発酵装置を、３７℃の温度を維持するための冷却システムに接続し、１００ｒｐｍで回転させた。滅菌済み空気が２ｍｌ／分で発酵装置に導入された。流速は、２日間の成長の後は４ｍｌ／分に変化させられた。成長は３日間〜５日間にわたって続けられた。
【０１８２】
接種用培地が、下記の溶液を混合することによって調製され、０．４５μｍのフィルターメンブラン（ＭＳＩ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、米国）で滅菌された。１リットルの液体培地を調製するために、下記の成分が一緒にされた：
１００ｍｌのＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ成長用基礎培地（ｘ１０）（下記の配合を参照のこと）；
１０ｍｌのＣａＣｌ２ストック液（１３．２ｇ／ｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）。最終濃度、０．１３２ｇ／Ｌ；
１２ｍｌのグリセロールストック液（５０ｇ／１００ｍｌ）（Ｆｒｕｔａｒｏｍ、イスラエル）。最終濃度、６ｇ／Ｌ。
【０１８３】
二回蒸留水が１リットルになるまで加えられる。
【０１８４】
発酵装置用培地が下記の方法で調製され、０．４５μｍのフィルターメンブラン（ＭＳＩ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、米国）で滅菌された。１０リットルの液体培地を調製するために、下記の成分が一緒にされた：
１００ｍｌのＣａＣｌ２ストック液（１３．２ｇ／ｌ）（Ｓｉｇｍａ、米国）。最終濃度、０．０１３２ｇ／ｌ；
１２０ｍｌのグリセロールストック液（５０ｇ／１００ｍｌ）（Ｆｒｕｔａｒｏｍ、イスラエル）。最終濃度、６ｇ／ｌ；
５０ｍｌのＴｗｅｅｎ−８０ストック液（１０．８ｍｌ／１００ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、米国）。最終濃度、０．５４ｍｌ／ｌ；
１０００ｍｌのＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ成長用基礎培地（ｘ１０）（下記の配合を参照のこと）；
３．３６ｇのベラトリルアルコール（Ｓｉｇｍａ、米国）。最終濃度、２ｍＭ。
【０１８５】
１０リットルの最終体積までの７．７４０リットルの二回蒸留水（ＤＤＷ）。
【０１８６】
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ成長用基礎培地（ｘ１０）−Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ成長用基礎培地（ｘ１０）は下記のように調製された：７．０７ｇのニトリロ三酢酸（三ナトリウム塩）を４リットルのＤＤＷに溶解した。その後、下記の試薬を加えた：１００ｇの無水ＫＨ２ＰＯ４、７２．７ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（または６７．３９ｇのＭｇＳＯ４・６Ｈ２Ｏ）、３．５ｇのＮａＣｌ、０．３５ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．６３ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．３５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０３５ｇのＡｌＫ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏ、０．０３５ｇのＨ３ＢＯ３、０．０３５ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、５００ｍｌの２Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）、１０ｇの酒石酸アンモニウム、および５０ｍｇのチアミン。すべてがＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）によって供給された。培地のｐＨはＮａＯＨで４．４〜４．４５に調節された。ＤＤＷが５リットルの最終体積になるまで加えられた。培地は４℃で貯蔵された。
【０１８７】
ファネロカエテ・クリソスポリウムの細胞外培地からのＬＩＰの単離および精製−細胞外培地をガラス繊維に通して真空ろ過した。その後、ろ液を０．４５μＭのフィルターメンブラン（ＭＳＩ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、米国）で滅菌して、液体を、ぜん動ポンプ（ＭＡＳＴＥＲＦＬＥＸ、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ、米国）を使用して中空繊維メンブランによって濃縮した。濃縮された細胞外液を、その後、１０ｋＤａカットオフ型ＰＭ−１０メンブラン（Ａｍｉｃｏｎ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を使用する限外ろ過によって２５倍再濃縮し、０．０１Ｍ〜１．００Ｍの酢酸ナトリウムの２回のグラジエントを使用するＨＰＬＣアニオン交換クロマトグラフィーによるＭｏｎｏＱカラム（ＨＲ５／５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により精製した。最初のグラジエントはｐＨ６．０においてであり、２回目のグラジエントは、ＬＩＰイソ酵素Ｈ１の等電点（ｐＩ）値に等しいｐＨ４．７においてであった。タンパク質ピーク部分を集め、それらの活性を、前回のバッチから得られた精製ＬＩＰイソ酵素Ｈ１を標準として使用してアッセイした。ＬＩＰ Ｈ１画分の吸光度が２８０ｎｍおよび４０９ｎｍで測定された（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、ドイツ）。純粋度（ＲＺ）は、精製されたＬＩＰイソ酵素Ｈ１の４０９ｎｍにおける吸光度（Ａ４０９）と２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）との比率から計算された場合、４．０を越えた。ＬＩＰ濃度が、１６９Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して４０９ｎｍで測定された。
【０１８８】
ＬＩＰ活性のアッセイ−ＬＩＰ活性が、ＴｉｅｎおよびＫｉｒｋ（１９８８）によって記載されるように、ベラトリルアルコールのベラトリルアルデヒドへの酸化のときにおける３１０ｎｍにおける吸光度の変化によって測定された。アッセイ試薬は、１００ｍＭの酒石酸塩緩衝液（ｐＨ２．５）における４ｍＭのベラトリルアルコールおよび０．８８ｍＭのＨ２Ｏ２から構成される。アッセイのために、０．５ｍｌのＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ細胞外培地が０．５ｍｌの試薬と混合され、３１０ｎｍにおける吸光度の増大が４０秒間にわたって記録された。１ユニットのＬＩＰ活性は、１分あたり１μｍｏｌｅのベラトリルアルコールがベラトリルアルデヒドに酸化されるとして定義される。
【０１８９】
ＬＩＰによるメラニン酸化の測定−合成メラニン（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｍ８６３１、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）が５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．００）において様々な濃度で調製された。ＬＩＰによるメラニン酸化が、ベラトリルアルコールを含有する酒石酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）において行われ、酵素反応が過酸化水素の添加によって開始された。メラニン酸化の程度が、４６０ｎｍにおける吸光度の減少を測定することによって決定された。
【０１９０】
クリームの調製−好ましい実施形態におけるＬＩＰクリームは、酵素クリームおよび活性化剤クリームの２つのタイプのクリームから構成される。それぞれのクリームは、２つの相から、すなわち、水相および油相から調製された。
【０１９１】
酵素クリーム
酵素クリーム用の水相：
０．３５％（ｗ／ｗ）ＤＭＤＭヒダントイン（Ｓｈａｒｏｎ Ｌａｂ、イスラエル）；
２％（ｗ／ｗ）グリセリン（Ｃｏｇｎｉｓ、ドイツ）；
０．１％（ｗ／ｗ）ベラトリルアルコール（３−ジメトキシベンジルアルコール、Ｓｉｇｍａ、米国）；
８１．６５％（ｗ／ｗ）ＤＤＷ（ＲＯ Ｗａｔｅｒ、イスラエル）；
０．２％（ｗ／ｗ）Ｒｈｏｄｉｃａｒｅ Ｄ（キサンタンガム、Ｒｈｏｄｉａ、フランス）；
４％（ｗ／ｗ）トランスキュトール（ＰＥＧ−４００、エトキシジグリコール、Ｇａｔｔｅｆｏｓｅｓ、フランス）；
酵素クリーム用の油相：
５％軽質鉱油；
２．５％（ｗ／ｗ）ドラゴリン１００ＳＥＰ（ＧＭＳ＆ＰＥＧ−１００ステアラート、Ｄｒａｇｏｃｏ、ドイツ）；
３％（ｗ／ｗ）セチルアルコール（Ｃｏｇｎｉｓ、ドイツ）；
０．２％（ｗ／ｗ）ソルビン酸カリウム（Ｃｈｉｓｓｏ Ｃｏｒｐ．、日本）；
１％（ｗ／ｗ）ｂｒｉｊ７２１（Ｕｎｉｑｅｍａ、イタリア）。
【０１９２】
酵素クリームの調製：酵素クリームの水相および油相を８０℃に加熱して、混合した。混合物を１０分間均質化して、５５℃に冷却した。その後、ｐＨを乳酸で３．５に調節した。
【０１９３】
混合物が４０℃に冷えたとき、リグニンペルオキシダーゼを加えた（２０〜５０ユニット／ｇ）。酵素混合物を１分間均質化した。
【０１９４】
活性化剤クリーム
活性化剤クリーム用の水相：
８２．８８８（ｗ／ｗ）ＤＤＷ（ＲＯ Ｗａｔｅｒ、イスラエル）；
０．１％（ｗ／ｗ）ＥＤＴＡ二ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）；
４％（ｗ／ｗ）トランスキュトール（ＰＥＧ−４００、エトキシジグリコール、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ、フランス）；
０．１％（ｗ／ｗ）ソルビン酸カリウム（Ｃｈｉｓｓｏ Ｃｏｒｐ．、日本）；
活性化剤クリーム用の油相：
３．５％（ｗ／ｗ）ｂｒｉｊ７２（Ｓｔｅａｒｅｔｈ−２、Ｕｎｉｑｅｍａ、イタリア）；
２．５％（ｗ／ｗ）ｂｒｉｊ７２１（Ｓｔｅａｒｅｔｈ−２０、Ｕｎｉｑｅｍａ、イタリア）；
５％（ｗ／ｗ）鉱油；
１．３％（ｗ／ｗ）セチルアルコール（Ｃｏｇｎｉｓ、ドイツ）；
０．５％（ｗ／ｗ）シリコン３５０（Ｄｉｍｅｔｈｉｃｏｎ、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）；
０．１％（ｗ／ｗ）ソルビン酸カリウム（Ｃｈｉｓｓｏ Ｃｏｒｐ．、日本）。
【０１９５】
活性化剤クリームの調製−活性化剤クリームの水相および油相を８０℃に加熱して、混合した。混合物を１０分間均質化して、４５℃に冷却し、リン酸でｐＨ３．５に調節した。
【０１９６】
混合物が４０℃に冷えたとき、過酸化水素（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ、ドイツ）を穏やかな撹拌とともに加え（０．０１２％（ｗ／ｗ））、正しいｐＨを確認した。活性化剤混合物を１分間均質化した。
【０１９７】
インビボでの皮膚明色化効果の測定−皮膚明色化に対するＬＩＰの効果を定量するために、処置された手の皮膚の色が、３波長のＭｉｎｏｌｔａ彩度計（ＣＲ−２００、日本）を使用して調べられた：Ｍｉｎｏｌｔａ Ｌは暗度および明度を測定し、Ｍｉｎｏｌｔａ Ａは赤色の色調を測定し、Ｍｉｎｏｌｔａ Ｂは黄色の色調を測定する。Ｍｉｎｏｌｔａ Ｌ値の増大は皮膚の明るさの程度を反映し、すなわち、より大きい値はより明るい皮膚に対応する。
【０１９８】
実験結果
（実施例１）
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍからのＬＩＰの精製
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍから得られた高度に精製されたＬＩＰ Ｈ１の調製−ＬＩＰイソ酵素Ｈ１をＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍから精製するために、菌を、本明細書中上記の方法の節で詳しく記載されたようにＳＴＲ発酵装置（図２）において成長させた。最初のＬＩＰ活性が４８時間の成長の後に検出され、成長が１２０時間まで維持されたとき、活性の著しい増大が検出された（図３）。ＬＩＰイソ酵素Ｈ１を精製するために、菌の細胞外液を最大ＬＩＰ活性の時（１２０時間）に集めた。その後、方法のところで記載されたように、ＬＩＰイソ酵素Ｈ１タンパク質を精製し、その濃度が測定された。従って、上記の装置および条件を使用して、ＬＩＰを確実に産生させることができ、そのＨ１イソ酵素をＨＰＬＣによって精製することができる。
【０１９９】
（実施例２）
精製されたＬＩＰを使用する水相酸化におけるメラニンの最適化
ＬＩＰによるメラニン酸化のために必要とされる条件を最適化するために、酸化反応の重要な成分のそれぞれの最適な濃度を独立的に決定した。
【０２００】
水相におけるメラニンのＬＩＰ酸化は過酸化水素の濃度の関数である−水相におけるＬＩＰによるメラニンの酸化が、過酸化水素の濃度に対する相関について最初に調べられた。一定濃度のメラニン（７０．５μｇ／ｍｌ）が、過酸化水素の濃度を増大させながら、１．５ｍＭのベラトリルアルコールの存在下での０．４８μＭの精製ＬＩＰ Ｈ１によって酸化された。酸化の程度が、過酸化水素の添加前および添加後１６０秒において４６０ｎｍにおけるメラニンの吸光度を測定することによって決定され、百分率で計算された。一般に、メラニンの酸化は、７００μＭ〜９００μＭの過酸化水素で得られるプラトー状態まで、過酸化水素の濃度の増大とともに増大した（図４）。メラニン酸化に対する過酸化物の濃度の影響が、図５における反応混合物の比較によってさらに明らかにされる。この場合、反応混合物が過酸化水素の濃度の増大とともに著しく明色化される。従って、これらの結果は、水相におけるメラニンのＬＩＰ酸化が明らかに過酸化水素の濃度に依存しており、この場合、メラニンの酸化のための過酸化水素の最適な濃度が６００μＭ〜７００μＭの範囲であることを明らかにしている。
【０２０１】
メラニンのＬＩＰ酸化は水相におけるメラニンの初期濃度の関数である−ＬＩＰによる水相におけるメラニンの酸化のために要求される最適なメラニン濃度を決定するために、酸化反応がさらに、メラニン濃度を増大させながら調べられた。メラニンの酸化が、１．５ｍＭのベラトリルアルコールおよび６００μＭの過酸化水素の存在下、０．４８μＭの精製ＬＩＰ Ｈ１によって行われた。初期メラニン濃度が１５μｇ／ｍｌ〜４５μｇ／ｍｌの間であるとき、ＬＩＰによるメラニン酸化はメラニンの初期濃度に依存していた。メラニンの最高の酸化（６０％）が４５μｇ／ｍｌ〜８５μｇ／ｍｌの間での初期メラニン濃度で達成された（図６）。従って、ＬＩＰによるメラニン酸化は、明らかに、４５μｇ／ｍｌを越える初期メラニン濃度には依存していない。
【０２０２】
ＬＩＰのメラニン酸化は水相におけるＬＩＰ濃度に部分的に依存する−メラニン酸化のための条件をさらに最適化するために、メラニン酸化に対するＬＩＰ濃度の影響が、最適な濃度のメラニン（７０μｇ／ｍｌ）、過酸化水素（７００μＭ）およびベラトリルアルコール（１．５ｍＭ）を用いて調べられた。メラニン酸化は、ＬＩＰ濃度が０．２５μＭから０．４０μＭに増大したとき、１０％から６０％に劇的に増大した。しかしながら、ＬＩＰ濃度が０．５０μＭを越えると、メラニン酸化における変化は観測されなかった（図７）。従って、インビトロでのメラニン酸化のためのＬＩＰ濃度の最適な範囲は０．４０μＭ〜０．５０μＭである。
【０２０３】
（実施例３）
クリーム配合物においてＬＩＰを使用するメラニンの酸化
メラニンを酸化するＬＩＰイソ酵素Ｈ１の能力をさらに実証するために、インビボでの皮膚明色化に向けた中間段階として、ＬＩＰ活性が、水相に可溶化されたメラニンに対するクリーム配合物において調べられた。
【０２０４】
水相におけるメラニンはクリーム配合物におけるＬＩＰによって酸化される−２つのタイプのクリームが調製された：ＬＩＰイソ酵素Ｈ１画分（２５ユニット／ｇクリーム）およびベラトリルアルコール（６ｍｍｏｌｅ／Ｋｇクリーム）を含む酵素クリーム、過酸化水素（３．５２ｍｍｏｌｅ／Ｋｇクリーム）を含む活性化剤クリーム。クリーム配合物におけるＬＩＰ活性の測定のために、酵素クリーム（０．３ｇ）が最初にメラニン（１４０μｇ／ｍｌ）と混合され、灰色がかった黒色が観測された（図８ａ）。活性化剤クリーム（０．３ｇ）が、メラニンを既に含有する酵素クリームに加えられたとき、色は直ちにベージュ色に変化した（図８ｂ）。これらの結果は、クリーム配合物におけるＬＩＰがメラニンの脱色において非常に効率的であり、ヒトの皮膚においてさらに試験できることを明らかにしている。
【０２０５】
（実施例４）
クリーム配合物における精製ＬＩＰ Ｈ１によるインビボでの皮膚および毛髪の明色化
皮膚および毛髪をインビボで明色化するＬＩＰの能力を調べるために、クリーム配合物および水性配合物における酵素が皮膚および毛髪にそれぞれ加えられた。
【０２０６】
クリーム配合物におけるＬＩＰはインビボで皮膚を明色化する−インビボで皮膚を明色化するクリーム配合物におけるＬＩＰの能力を調べるために、酵素クリームが塗布され、皮膚によって吸収され、その後、活性化剤クリームが５分間隔で４回塗布された。１週間にわたって１日２回で繰り返されたとき、処置された皮膚領域の著しい明色化が観測された（図９）。処置された手の２つの領域の皮膚の色が、Ｍｉｎｏｌｔａ彩度計を使用して定量されたとき、ＬＩＰクリームの２週間の塗布の明瞭な皮膚明色化効果が観測された（表１、％変化）。従って、これらの結果は、ＬＩＰは、塗布しやすいクリーム配合物で調製されたとき、インビボで皮膚を簡便かつ効率的に明色化することができ、また、本明細書中に詳しく記載されるように調製されたＬＩＰは、他のインビボ明色化適用のためにさらに適合化され得ることを明らかにしている。
【表１】
【０２０７】
水性配合物におけるＬＩＰはインビボで毛髪を明色化する−色素沈着の明色化は、皮膚以外の、メラニンが多い組織において要求されることが多い。そのインビボ明色化効果をさらに調べるために、ＬＩＰをヒトの毛髪に塗布した。ＬＩＰの塗布前に、毛髪は最初に５０ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ１１．５）に１時間漬けられ、その後、ＬＩＰ（２５Ｕ／２０μｌ水）を含有する別の試験管に移された。毛髪はＬＩＰと１０秒間インキュベーションされ、その後、ベラトリルアルコール（１．５ｍＭ）および過酸化水素（８．８ｍＭ）の存在下での酒石酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）の中に移された。著しい明色化効果が、ＬＩＰを含まない同じ溶液において処理された毛髪（図１０、左側試験管）と比較して、ＬＩＰの存在下で１時間以内に観測された（図１０、右側試験管）。従って、これらの結果は、非常に低い濃度の過酸化水素の存在下で、水性配合物におけるＬＩＰはインビボで毛髪を効率的に明色化することができることを明らかにしている。
【０２０８】
（実施例５）
ＬＩＰ調製プロセスのスケールアップ
商業的目的のために有用な多量のリグニンペルオキシダーゼ（ＬＩＰ）を製造するために、ＬＩＰを、スケールアップされたプロトコルを使用して、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ菌から精製した。
【０２０９】
スケールアップされた発酵プロトコルを使用して得られたＬＩＰの大きい活性−発酵が、本明細書中上記の方法の節で記載されたように９０Ｌの発酵用培地を使用して１００Ｌの発酵装置で行われた。発酵条件には、１６０ｒｐｍの撹拌および０．２ｖｖｍの空気流量が含まれた。接種が、本明細書中上記の方法の節で記載される１０Ｌ発酵装置の場合と同じ方法で行われた。７日間の成長の後、測定されたＬＩＰ活性は１６００ユニット／リットルであった。
【０２１０】
これらの結果は、多量および大きい酵素活性のＬＩＰが、大型の発酵装置および本発明のスケールアップされたプロトコルを使用してＰ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ菌から製造できることを明らかにしている。
【０２１１】
（実施例６）
ＬＩＰクリームについての皮膚科学的試験：正常な皮膚における低アレルギー誘発性試験、過敏性皮膚試験および過敏化攻撃試験
ＬＩＰクリームの皮膚科学的性質を特徴づけるために、また、化粧用製品としての使用のための前提条件として、ＬＩＰクリームがいくつかの皮膚科学的試験に供された：低アレルギー誘発性試験、正常な皮膚における過敏化攻撃試験、および過敏性皮膚における過敏化攻撃試験。
【０２１２】
方法
正常な皮膚における皮膚科学的試験のための研究被験者：この研究では、年齢範囲が１８歳〜６４歳である５０名の志願者（９名の男性および４１名の女性）が含まれた。被験者は良好な全身的健康状態にあり、パッチが当てられる領域において何らかの認められる皮膚の疾患または異常を有していなかった。各研究被験者は、インフォームドコンセント文書を読み、理解し、かつ署名するように要請された。除外基準は下記の通りであった：妊婦または授乳中の女性、処置される帯域において重篤または進行性の疾患および／または病理に罹患している被験者、皮膚水和の何らかの処置（例えば、レチノイド、ステロイド）および／または調節剤を使用している被験者、体重が不安定であるか、または過度な飲酒もしくは喫煙を有する被験者。
【０２１３】
研究被験者の特性のまとめが下記の表２に示される。
【表２】
【０２１４】
過敏性皮膚における皮膚科学的試験のための研究被験者−合計で５０名の被験者（６名の男性および４４名の女性）が試験を完了した：２２名の被験者が１８歳〜３５歳の範囲であり、１１名の被験者が３６歳〜４５歳の範囲であり、１７名の被験者は４６歳〜６５歳の範囲であった。
【０２１５】
研究期間中での関連した処置−水が、パッチ適用期間中、試験部位には当てられなかった；皮膚を改変する可能性のある全身的または局所的な処置は許可されなかった；洗浄用製品を含めて、皮膚医薬品または化粧用製品の使用は、評価中の帯域に対しては許可されなかった。
【０２１６】
パッチ調製物−低アレルギー誘発性試験のために、２ｍｇの本発明のＬＩＰクリームがＣｕｒａｔｅｓｔ（登録商標）Ｆ接着性細片（Ｌｏｈｍａｎｎ＆Ｒａｕｓｃｈｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｒｅｎｇｓｄｏｒｔ）に置かれた。皮膚科学的試験および感受性皮膚試験のために、各パッチはＣｕｒａｔｅｓｔ（登録商標）Ｆ接着性細片において０．０７グラム〜０．１グラムのＬＩＰクリームを含んだ。
【０２１７】
Ｄｒａｉｚｅ反復傷害パッチ試験が、本質的には、Ｊ．Ｈ．Ｄｒａｉｚｅによって「Ａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｉｎ Ｆｏｏｄｓ，Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ（食品、薬物および化粧品における化学物質の安全性の評価）」（これはｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓによって刊行された）に記載されるように行われた。
【０２１８】
誘導期−パッチが指定の接触部位に適用され、２４時間にわたって置かれたままにされた。この期間が終了したとき、パッチは除かれ、部位が何らかの皮膚応答について調べられた。研究被験者は２４時間休息し、その後で、皮膚部位が再び調べられた。その後、パッチが、以前に使用されたのと同じ部位に適用された。２回目の適用は最初と同一であり、２４時間にわたって置かれたままにされた。この手順が９回繰り返された。研究被験者は、次の適用の前に、部位を何らかの皮膚応答について調べ、その観察結果を報告した。同じ部位が研究期間中を通して使用された。それぞれの適用は、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｋｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｔｅｌ Ａｖｉｖ、イスラエル）のスタッフによって取り付けおよび除去が行われた。品質管理者により、研究プロトコルに対する順守がモニターされた。
【０２１９】
攻撃期−９回目の適用の後、２週間の休息期間が置かれ、その後、攻撃塗布物が、誘導期の期間中に使用された同じ様式で、かつ同じ部位に加えられた。攻撃塗布物は２４時間後に除かれ、部位が、刺激または過敏化の徴候について調べられ、採点された。追跡試験が、負荷塗布後４８時間（パッチ除去後２４時間）、ならびに除去後の４８時間および７２時間において行われた。
【０２２０】
採点基準−誘導試験および攻撃試験の結果は、下記の基準を使用して採点された：「０」＝反応が認められない；「？」＝疑わしい反応、すなわち、かすかで、極微の紅斑、ただし、浸潤なし；「１」＝弱い陽性反応、すなわち、紅斑、浸潤、ただし、離れた斑丘疹はない；「２」＝強い陽性反応、すなわち、紅斑、浸潤、斑丘疹、離れた小水疱；「３」＝特に大きい陽性反応、すなわち、極めて強い紅斑、浸潤、合体した小水疱／水疱性反応；「ＩＲ」＝刺激反応、すなわち、浸潤を伴わない離れた紅斑／斑点状小胞状紅斑／出血性膿疱および小胞状膿疱；「ＮＴ」＝試験されず。
【０２２１】
皮膚科学的試験の結果
低アレルギー誘発性試験−この試験では、ＬＩＰクリームを含有するパッチの適用に対する反応が、パッチ除去の２０分後、２４時間後および４８時間後に記録された。本明細書中下記の表３に示されるように、５０名の研究被験者全員において、ＬＩＰクリームに対する皮膚反応は認められなかった。
【表３】
【０２２２】
ＬＩＰクリームを用いた正常な皮膚の過敏化攻撃試験は皮膚反応を何ら生じさせなかった−ＬＩＰクリームがパッチ内に挿入され、Ｄｒａｉｚｅ反復傷害パッチ試験が５０名の健康な志願者に対して行われた。それぞれのパッチ適用の後、皮膚反応が、本明細書中上記の方法の節に記載される採点基準を使用して記録された。本明細書中下記の表４に示されるように、５０名の志願者全員において、皮膚反応は、誘導期の９回すべてのクリーム塗布の期間中、ならびに攻撃期の最後の適用の後において認められなかった。
【表４】
【０２２３】
過敏性皮膚における皮膚科学的試験−ＬＩＰクリームの過敏化性質をさらに特徴づけるために、刺激パッチ試験が、過敏性皮膚の５０名の健康な志願者に対して行われた。予備試験において、１１名の被験者は、様々な程度の刺すような痛みを有することが見出された；２名は重症の過敏性皮膚を有し、８名は中程度の過敏性皮膚を有し、１名はわずかに過敏性の皮膚を有した。ＬＩＰクリームを含む刺激用パッチが志願者の背中に４８時間にわたって置かれた。試験領域が、１時間後、２４時間後および４８時間後に調べられた。皮膚反応が５０名の志願者のいずれにも存在しないことが見出された。
【０２２４】
これらの結果では、正常な皮膚および過敏性の皮膚におけるＬＩＰクリームに対する低アレルギー誘発性反応および刺激性反応が認められない。そのうえ、反復傷害パッチ試験の結果から、安全な化粧用組成物としてのＬＩＰクリームの使用がさらに示唆される。
【０２２５】
（実施例７）
ＬＩＰクリームは皮膚色素沈着を白化することにおいて非常に効率的である
皮膚白化におけるＬＩＰクリームの効果が二重盲検研究で先行技術でのクリームと比較された。
【０２２６】
研究設計
研究被験者−この研究では、疾患を有さず、皮膚疾患またはアトピー性疾患（喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎）の病歴を有さず、また、試験中の物質のいずれか、および化粧用調製物の成分のいずれかに対する知られている過敏性を有さないアジア系の１８歳〜６５歳の１２名の健康な男性および女性が含まれた。研究では、全身的または局所的な処置のための、抗炎症性薬物、抗ヒスタミン剤またはコルチコステロイドによる処置を受けている候補者は、その処置が、研究に登録する前に、全身的処置の場合には２週間、局所的処置の場合には３日中断されない限り、除かれた。妊婦および母乳授乳中の女性だけでなく、診断または処置の任意の段階にあるガン、腎臓疾患または肝臓疾患を有する場合もまた、研究候補者から除かれた。
【０２２７】
研究プロトコル−研究では、それぞれが一方の上部前腕に二重盲検様式で塗布される２つのタイプのクリームが含まれた：有効成分としてＬＩＰを含む本発明の白化クリーム、および市販されている製品（２％ヒドロキノン、Ｅｓｏｍｅｄ Ｍｅｄｉｂｒａｎｄｓ（イスラエル））。これらのクリームは１日に２回（すなわち、午前および夕方）に塗布された。前腕の下側部分は未処置のままであった。研究被験者は、研究の開始時（０週）、ならびに、クリーム塗布の１週間後、２週間後および３週間後に、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｋｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｔｅｌ Ａｖｉｖ、イスラエル）のスタッフによって調べられた。それぞれの検査において、皮膚色素沈着および副作用が記録された。
【０２２８】
皮膚色素沈着の評価−皮膚色素沈着が、Ｄｅｒｍａ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｃｏｒｔｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（デンマーク））、同じ距離および光露光を使用して撮影されたカラー写真、Ｂｒｅｎｎｅｒ博士（皮膚科学学部長（Ｓｏｕｒａｓｋｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｅｌ Ａｖｉｖ、イスラエル）））によって行われる目視検査を使用して評価された。
【０２２９】
研究結果
ＬＩＰクリームは３週間の適用の後で皮膚色素沈着を低下させた−皮膚白化におけるＬＩＰクリームの効果を評価するために、ＬＩＰクリームが１２名の健康な志願者の右腕の上部部分に１日に２回塗布された。２名の研究被験者の代表的な写真を含む図１１ａ〜図１１ｂおよび図１３ａ〜図１３ｂに示されるように、３週間のクリーム塗布の後、右前腕の上部部分は、クリーム塗布前よりもはるかに白くなっているようであった。
【０２３０】
ＬＩＰクリームはヒドロキノンクリームよりも皮膚白化において効率的である−皮膚色素沈着を軽減することにおけるＬＩＰクリームの効果が、２％ヒドロキノンの効果と比較された。２１日間のクリーム塗布の後、研究被験者番号１のＬＩＰ処置領域の色素沈着は３．３３単位ほど低下していた（図１２ａの青色カラムおよび図１２ｃの青色曲線）。他方で、同じ前腕における非処置領域の色素沈着は１．１３単位ほど低下していた（図１２ａの明青色カラム）。他方で、ヒドロキノンクリームを使用した２１日間の処置の後では、処置された領域の色素沈着はわずかに１単位だけ低下していた（図１２ｂのピンク色カラムおよび図１２ｃのピンク色曲線）。類似する効果が、図１４ａ〜図１４ｃに示されるように、他の研究被験者において観測された。１２名すべての研究被験者から得られた結果がまとめられたとき、皮膚色素沈着における平均低下は、ＬＩＰ処置の前腕およびヒドロキノン処置の前腕において、それぞれ１．５７単位（図１５ａ、青色曲線）および１．４９単位（図１５ａ、ピンク色曲線）であることが見出された。そのうえ、皮膚色素沈着の低下が初期の皮膚色素沈着に対して正規化されたとき、皮膚色素沈着の平均低下は、ＬＩＰ処置の前腕およびヒドロキノン処置の前腕において、それぞれ４．３％（図１５ｂ、青色曲線）および３．８％（図１５ｂ、ピンク色曲線）であった。
【０２３１】
まとめると、これらの結果は、ＬＩＰクリームが、皮膚色素沈着を低下させることにおける非常に効率的であることを明らかにしている。そのうえ、これらの結果は、ＬＩＰクリームの相対的な白化効果が、２％ヒドロキノンクリームを使用して観測された相対的な白化効果よりも大きいことを示唆している。
【０２３２】
本発明のいくつかの特定の特徴が、明確化のために、別個の実施形態に関連して記載されているが、これらの特徴はまた、１つの実施形態において組合せで提供され得ることが理解される。逆に、本発明の様々な特徴が、簡略化のために、１つの実施形態に関連して記載されているが、これらの特徴はまた、別個に提供され得るか、または任意の好適な部分的組合せで提供され得る。
【０２３３】
本発明を、その具体的実施態様とともに説明してきたが、多くの変形と変更が当業技術者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内に入っているこのような変形と変更をすべて含むものである。本明細書に記載のすべての刊行物、特許、特許願、及びそれらのアセッション番号によって同定される配列は、あたかも、個々の刊行物、特許、特許願又はそれらのアセッション番号によって同定される配列各々が、本願に具体的にかつ個々に参照して示されているように、本願に援用するものである。さらに、本願における任意の文献の引用もしくは確認は、このような文献が本発明に対する従来技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグニンペルオキシダーゼを製造する方法であって：
（ａ）ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）菌を、所定の期間、グリセロールを含有する撹拌および通気された培養培地において多孔性マトリックス上で培養すること；
（ｂ）前記所定の期間の後、可溶性画分を前記ファネロカエテ・クリソスポリウム菌から抽出して、それによりリグニンペルオキシダーゼを製造すること；
を含む方法。
【請求項２】
前記培養培地はマンガンイオンを含まない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記通気された培養は、前記培養培地を０．１〜１リットルの空気／培養培地１リットル／分の範囲における通気速度に供することによって得られる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培養は３７℃の温度で達成される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記撹拌された培養培地は、前記培養培地を５０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍの範囲における速度で撹拌することによって得られる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記所定の期間は、３日〜１０日の範囲から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記グリセロールは３グラム／リットル〜２０グラム／リットルの濃度範囲で提供される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地はベラトリルアルコールをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ベラトリルアルコールは０．５ｍＭ〜４ｍＭの濃度範囲で提供される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リグニンペルオキシダーゼはイソ酵素Ｈ１または改変された形態のイソ酵素Ｈ２である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記多孔性マトリックスはポリウレタンフォームである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法によって製造されるファネロカエテ・クリソスポリウム菌の水性抽出物。
【請求項１３】
５００ユニット／リットル〜２０００ユニット／リットルの範囲でリグニンペルオキシダーゼ酵素活性を示す請求項１２に記載のファネロカエテ・クリソスポリウム菌の水性抽出物。
【請求項１４】
前記リグニンペルオキシダーゼ活性は１５００ユニット／リットルである請求項１３に記載の水性抽出物。
【請求項１】
リグニンペルオキシダーゼを製造する方法であって：
（ａ）ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）菌を、所定の期間、グリセロールを含有する撹拌および通気された培養培地において多孔性マトリックス上で培養すること；
（ｂ）前記所定の期間の後、可溶性画分を前記ファネロカエテ・クリソスポリウム菌から抽出して、それによりリグニンペルオキシダーゼを製造すること；
を含む方法。
【請求項２】
前記培養培地はマンガンイオンを含まない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記通気された培養は、前記培養培地を０．１〜１リットルの空気／培養培地１リットル／分の範囲における通気速度に供することによって得られる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培養は３７℃の温度で達成される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記撹拌された培養培地は、前記培養培地を５０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍの範囲における速度で撹拌することによって得られる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記所定の期間は、３日〜１０日の範囲から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記グリセロールは３グラム／リットル〜２０グラム／リットルの濃度範囲で提供される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地はベラトリルアルコールをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ベラトリルアルコールは０．５ｍＭ〜４ｍＭの濃度範囲で提供される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リグニンペルオキシダーゼはイソ酵素Ｈ１または改変された形態のイソ酵素Ｈ２である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記多孔性マトリックスはポリウレタンフォームである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法によって製造されるファネロカエテ・クリソスポリウム菌の水性抽出物。
【請求項１３】
５００ユニット／リットル〜２０００ユニット／リットルの範囲でリグニンペルオキシダーゼ酵素活性を示す請求項１２に記載のファネロカエテ・クリソスポリウム菌の水性抽出物。
【請求項１４】
前記リグニンペルオキシダーゼ活性は１５００ユニット／リットルである請求項１３に記載の水性抽出物。
【図１】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図１２ａ−ｂ】
【図１２ｃ】
【図１４ａ−ｂ】
【図１４ｃ】
【図１５】
【図２】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図１２ａ−ｂ】
【図１２ｃ】
【図１４ａ−ｂ】
【図１４ｃ】
【図１５】
【図２】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【公開番号】特開２００９−１００７５６（Ｐ２００９−１００７５６Ａ）
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１４７（Ｐ２００９−２１４７）
【出願日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【分割の表示】特願２００４−５５８３３６（Ｐ２００４−５５８３３６）の分割
【原出願日】平成１５年１２月１１日（２００３．１２．１１）
【出願人】（５０５２２２２３３）アール．ビー．ティー （ラクト バイオ テクノロジーズ） リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【分割の表示】特願２００４−５５８３３６（Ｐ２００４−５５８３３６）の分割
【原出願日】平成１５年１２月１１日（２００３．１２．１１）
【出願人】（５０５２２２２３３）アール．ビー．ティー （ラクト バイオ テクノロジーズ） リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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