リグノセルロースバイオマスのエタノールへの変換のための好熱性生物
様々なバイオマス由来基質を消費する、変異好熱性生物が本明細書中で開示される。酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの発現を排除したＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの系統が、本明細書中で開示される。さらに、系統ＡＬＫ１を部位特異的相同的組み換えによって操作して、酢酸および乳酸の産生をどちらもノックアウトした。基質濃度チャレンジを含む連続的培養は、ＡＬＫ１の進化、そしてＡＬＫ２と呼ばれるより強い系統の形成を引き起こした。その生物を、例えばセルラーゼ活性に最適な温度で行われる好熱性ＳＳＦおよびＳＳＣＦ反応において利用して、ピルビン酸脱炭酸酵素を発現することなく、理論的に近い収率でエタノールを産生し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年５月１日に出願された米国特許出願第６０／７９６，３８０号への優先権を主張する、２００６年１０月３１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０６／０４２４４２号への優先権を主張する。これらの特許はぞれぞれ、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府の利益）
米国政府は、本発明の開発に関連する研究が、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＩＳＴ）契約番号６０ＮＡＢ１Ｄ００６４により資金援助されたことから、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
（背景）
（１．発明の分野）
本発明は、エタノールを産生するためのバイオマス処理の分野に属する。特に、様々なバイオマス由来基質を消費し、そして高収率でエタノールを産生する新規好熱性生物、および産生の過程およびその生物の使用が開示される。
【背景技術】
【０００４】
（２．関連技術の説明）
バイオマスは、安価および容易に入手可能な、糖を産生し得るセルロース分解性（ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ）物質を代表する。これらの糖を単独で使用し得る、またはアルコールおよび他の産物を産生するために発酵し得る。生物変換産物の中で、エタノールは再生可能な国内燃料として使用し得るので、エタノールに関する関心は高い。
【０００５】
反応器の設計、前処理プロトコール、および分離技術の分野において、重要な研究が実施され、生物変換処理は、石油燃料技術と経済的に競合しつつある。しかし、２つまたはそれ以上の処理工程を組み合わせた場合に、最も大きく経費を節約し得ることが推定される。例えば、同時糖化および発酵（ＳＳＦ）および同時糖化および共発酵（ＳＳＣＦ）処理は、単一の反応器または連続的処理装置において、酵素的糖化工程を発酵と組み合わせる。ＳＳＦ処理において、可溶性の糖が連続的にエタノールへ発酵されるので、最終産物による阻害は除かれる。様々な加水分解産物を提供するために、複数の生物を使用する場合、ＳＳＦ処理は通常、同時糖化および共発酵（ＳＳＣＦ）処理と呼ばれる。より短い反応時間および主要な経費の抑制に関連する節約に加えて、共発酵処理はまた、そうでなければ代謝分解（ｍｅｔａｂｏｌｙｓｉｓ）または加水分解を阻害するレベルで生じるある化合物が、共発酵生物によって消費されるので、改善した産物の収率を提供し得る。そのような１つの例において、β−グルコシダーゼは、グルコースの存在下でセロビオースの加水分解を停止し、そして次にセロビオースの蓄積はセルロースの分解を阻害する。セルロースおよびヘミセルロース加水分解産物の共発酵を含むＳＳＣＦ処理は、グルコースを、β−グルコシダーゼの加水分解活性を阻害しない１つまたはそれ以上の産物へ変換することによって、この問題を軽減し得る。
【０００６】
統合バイオプロセス（ＣＢＰ）は、４つの生物学的に媒介されるイベント：（１）酵素産生、（２）基質の加水分解、（３）ヘキソースの発酵、および（４）ペントースの発酵を含む。これらのイベントを、単一の工程で行い得る。この戦略は、セルロースおよびヘミセルロースを利用する微生物を必要とする。ＣＢＰ生物の開発は、潜在的に、専用の処理工程において糖分解酵素を産生する、より従来的なアプローチと比較して、非常に大きな経費の抑制をもたらし得る。４つの生物学的に媒介されるイベントを達成するために１つ以上の生物を利用するＣＢＰ処理は、統合バイオプロセス共培養発酵と呼ばれる。
【０００７】
いくつかの細菌は、ペントースをヘキソースへ変換する能力、および解糖によってヘキソースを有機酸および他の産物の混合物に発酵する能力を有する。解糖経路は、６炭素のグルコース分子の、２つの３炭素分子のピルビン酸への変換から始まる。次いでピルビン酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ（「ｌｄｈ」）の作用によって乳酸へ、またはピルビン酸デヒドロゲナーゼまたはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素の作用によってアセチル補酵素Ａ（「アセチル−ＣｏＡ」）へ変換され得る。アセチル−ＣｏＡはさらに、ホスホトランスアセチラーゼおよび酢酸キナーゼによって酢酸へ変換される、またはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（「ＡｃＤＨ」）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（「ａｄｈ」）によってエタノールへ還元される。全体的にみて、エタノール産生生物の能力は、エタノール以外の有機産物の産生によって、特にｌｄｈによるピルビン酸から乳酸への変換によって、およびホスホトランスアセチラーゼおよび酢酸キナーゼによるアセチル−ＣｏＡの酢酸への変換によって損なわれる。
【０００８】
細菌の代謝的操作は、最近好熱性、嫌気性、グラム陽性細菌Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍにおいて乳酸デヒドロゲナーゼのノックアウトの産生を引き起こした。Ｄｅｓａｉ，Ｓ．Ｇ．；Ｇｕｅｒｉｎｏｔ，Ｍ．Ｌ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５における、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼのクローニングおよび遺伝子ノックアウトによる乳酸産生の排除」非特許文献１を参照のこと。
【０００９】
ｌｄｈのノックアウトは、当該分野における進歩であるが、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのこの系統が、有機酸−特に酢酸を産生し続けることは、この生物のいくつかの使用に関して問題がある。
【非特許文献１】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：６００−６０５、２００４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（要旨）
本手段は、様々なバイオマス由来基質を消費し、そしてエタノールを理論的収率付近で産生する好熱性、嫌気性細菌を提供することによって、その分野を進歩させ、そして上記で概略を述べた問題を克服する。その生物を用いてエタノールを産生する方法も開示される。
【００１１】
本明細書中で報告された手段は、単独で、または組み合わせて、様々な遺伝子のノックアウトを生じ、ここでそのような遺伝子は、天然の生物においてそうでなければ有機酸の形成を引き起こす。例えば、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５における（ａ）酢酸キナーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼ、および（ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）のノックアウトが存在し得る。本明細書中で報告された結果は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍに関するものであるが、その方法および材料を、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｏｔｅａｒｏｅｎｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の他のメンバーにも適用する。その方法および材料は、一般的に、代謝的に操作された、好熱性、グラム陽性細菌の分野で有用である。
【００１２】
１つの実施態様において、ピルビン酸脱炭酸酵素を発現しない、単離された生物は、セルロース分解性基質を発酵して、理論的収率の少なくとも９０％である濃度でエタノールを産生する。
【００１３】
１つの実施態様において、天然の状態で、グラム陽性細菌に、発酵産物として酢酸を産生する能力を与える少なくとも１つの遺伝子を含むグラム陽性細菌を形質転換して、その少なくとも１つの遺伝子の発現を排除する。その細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのような、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒであり得る。グラム陽性細菌に発酵産物として酢酸を産生する能力を与える遺伝子は、酢酸キナーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼの発現をコードし得る。
【００１４】
別の実施態様において、グラム陽性細菌をさらに形質転換して、グラム陽性細菌に発酵産物として乳酸を産生する能力を与える１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を排除し得る。例えば、乳酸を産生する能力を与える遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼであり得る。
【００１５】
１つの実施態様において、エタノールを産生する方法は、天然の生物を形質転換して、グラム陽性細菌に発酵産物として有機酸を産生する能力を与える全ての遺伝子の発現を排除するよう形質転換したグラム陽性細菌を産生して、形質転換した細菌宿主を産生すること、および形質転換した細菌宿主を、グルコース、キシロース、セロビオース、スクロース、キシラン、デンプン、およびその組み合わせから成るグループから選択される物質を含む基質を含む培地中で、適当な条件下で、基質の糖化および発酵を可能にするのに十分な時間培養することを含む。
【００１６】
１つの実施態様においてＡＬＫ１と呼ばれ、そしてＡＴＣＣにＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＰＴＡ−７２０６の項目下で寄託された微生物の、生物学的に純粋な培養物が記載される。
【００１７】
１つの実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号第１０番の配列、または（ｂ）配列番号第９番および配列番号第１０番の配列、または（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列を含む。（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、および（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチドの相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）を発現するよう遺伝的に操作された宿主細胞が記載される。別の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含む。さらに別の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１８】
１つの実施態様において、エタノールを産生する方法は、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の単離されたポリヌクレオチドの相補体を発現する変異細菌を、グルコース、キシロース、セロビオース、スクロース、キシラン、デンプン、およびその組み合わせから成るグループから選択される基質を含む培地中で、適当な条件下で、基質のエタノールへの発酵を可能にするのに十分な時間培養することを含む。
【００１９】
１つの実施態様において、エタノールを産生する方法は、反応容器内に、リグノセルロース基質、セルラーゼ、および発酵剤を含む反応混合物を提供することを含む。発酵剤は、グラム陽性細菌に、天然状態で、発酵産物として酢酸を産生する能力を与える少なくとも１つの遺伝子の発現を排除するよう形質転換したグラム陽性細菌を含む。その反応混合物を、適当な条件下で、リグノセルロース基質の糖化および発酵を可能にするのに十分な時間反応させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
バイオマスのエタノールへの変換における、好熱性、嫌気性グラム陽性細菌の操作および利用の方法を示し、そして説明する。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、もし遺伝的に操作されなければ、または他の方法でヒトの手によって意図的にその生物の遺伝的および／または表現型の構成を変化させる方式で操作されなければ、生物は「天然の状態」である。例えば、野生型の生物は、天然の状態であると考えられ得る。
【００２２】
天然の状態のＴ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍから有機酸の産生を完全に排除することは、２つの部位特異的ＤＮＡ相同的組み換えの発生を用いて達成された。変異系統、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ＡＬＫ１（「ＡＬＫ１」）は、約３０−６６℃の範囲の温度、および約３．８５−６．５の範囲のｐＨを有するバッチ培養で、低い基質の供給で、理論的な量に近いエタノールを産生する。１つの実施態様において、エタノールの収率は、理論的最大量の少なくとも約９０％である。ＡＬＫ１、およびその子孫は、ＳＳＦおよびＳＳＣＦ処理におけるセルラーゼ活性に実質的に最適である、その増殖条件のために、リグノセルロースバイオマスからエタノールへの変換において、有意な節約に寄与する可能性を有する。例えば、最適なセルラーゼ活性のパラメーターは、４−５の間のｐＨおよび４０−５０℃の間の温度を含む。さらに、有機酸を産生する能力を欠くノックアウト生物を使用する場合、発酵ブロスのｐＨを調整する必要がない。ＡＬＫ１、および同様の生物はまた、統合バイオプロセス共培養発酵にも適当であり得、ここでそのノックアウト生物は、ペントースをエタノールへ変換し、そしてセルロースはＣ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのような、セルロース分解性生物によって分解される。
【００２３】
好熱性の温度でＳＳＦ、ＳＳＣＦ、またはＣＢＰ処理のいずれかを行うことは、３０−３７℃の従来の中温性の発酵温度に比べていくつかの重要な利点を提供する。特に、好熱性温度におけるより高い酵素活性のために、所定の量の変換を達成するために必要な酵素の濃度を抑制し得る。結果として、セルラーゼ産生に費やされる処理工程の経費が、好熱性ＳＳＦおよびＳＳＣＦに関しては実質的に抑制され（例えば２倍またはそれ以上）、そしてＣＢＰに関しては排除される。発酵槽の冷却および発酵前および後の熱交換に関連する経費も、好熱性ＳＳＦ、ＳＳＣＦ、およびＣＢＰに関して抑制されることが予測される。最後に、好熱性生体触媒を特徴とする処理は、従来の中温性生体触媒を特徴とする処理と比較して、微生物が混入しにくくあり得る。
【００２４】
天然に存在するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの組み換え系統のような、公知の「ホモエタノール発酵」微生物と対照的に、現在開示される生物は、ピルビン酸脱炭酸酵素の作用によるピルビン酸からアセトアルデヒドへの変換に依存しない（図１、９を参照のこと）。実際、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌は、天然の状態でピルビン酸脱炭酸酵素を発現しない。図１に示す解糖経路の反応から、ピルビン酸は、酵素ピルビン酸−フェレドキシン酸化還元酵素２によって、アセチルＣｏＡ、二酸化炭素、および還元フェレドキシンに代謝され得る。しかし、唯一の発酵産物としてエタノールを産生するために、還元フェレドキシンによって運ばれる電子は、全てＮＡＤ：フェレドキシン酸化還元酵素３によってＮＡＤに転移され、ＮＡＤＨを形成しなければならない。ＮＡＤＨは続いて、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ７およびアルコールデヒドロゲナーゼ８によって、アセチルＣｏＡのエタノールへの２段階の還元の過程において、ＮＡＤにまた酸化される。ＮＡＤＨの効率的な利用の証拠を、図２において、ａｃｋおよびｐｔａを発現できない酢酸ノックアウト生物、およびａｃｋ、ｐｔａ、およびｌｄｈを発現できないダブルノックアウト生物（ＡＬＫ１）の両方による、Ｈ２の産生の減少として観察し得る。これらの生物は、還元フェレドキシンからＮＡＤへ、そして続いてエタノールへの化学量論的な電子移動の最初の実証を提供する。
【００２５】
ＰＤＣを発現する能力を有さない生物において、化学量論的なエタノール収率を産生する、上記で記載した経路は、以前に記載されたホモエタノール発酵系統の全てにおいて採用された経路と対照的である。以前に記載された系統は、内因性のピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）を利用する、または外来性のＰＤＣを発現するように操作される。ＰＤＣの発現は、微生物の世界ではまれであるので、電子の流れを、炭素の流れに対する修飾によって切り換える能力は、広い意味を有する。例えば、このアプローチを使用して、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ以外の系統において、高いエタノール収率を生じ得る、および／またはエタノール以外の溶媒を生じ得る。特に、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｅｒ属のメンバーのようなグラム陽性細菌；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよび他の好熱性および中温性Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ；好熱性および中温性Ｂａｃｉｌｌｕｓ種；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａのようなグラム陰性細菌；Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓおよび他のＦｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ種；Ｔｈｅｒｍｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａおよび他のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ種；およびＮｅｏｃａｌｌｉｍａｔｉｘおよびＰｉｒｏｍｙｃｅｓ種を含む嫌気性真菌は、ＰＤＣを発現する能力を欠き、そして開示された手段から利益を得得る。
【００２６】
糖化されて１つまたはそれ以上のグルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナンおよびデンプンを産生する、リグノセルロース材料を、開示される生物によって利用し得ることが認識される。様々な実施態様において、リグノセルロースバイオマスは、木、トウモロコシの茎や葉、おがくず、樹皮、葉、農業および森林の残留物、スイッチグラスのような草、反芻動物の消化産物、市の廃棄物、製紙工場の廃棄物、新聞、厚紙、またはその組み合わせを含む。
【実施例】
【００２７】
実施例１
ＡＬＫ１系統の産生
材料および方法
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ系統ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５（ＤＳＭ８６９１）は、イエローストーン国立公園、ワイオミングのＷｅｓｔ Ｔｈｕｍｂ Ｂａｓｉｎから単離された好熱性、嫌気性の細菌である（Ｌｕｉ，Ｓ．Ｙ．；Ｇｈｅｒａｒｄｉｎｉ，Ｆ．Ｃ．；Ｍａｔｕｓｃｈｅｋ，Ｍ．；Ｂａｈｌ，Ｈ．；Ｗｉｅｇｅｌ，Ｊ．「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ系統ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５由来の大きなＳ層関連エンドキシラナーゼをコードする遺伝子のクローニング、配列決定および発現」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１５３９−１５４７、１９９６；Ｍａｉ，Ｖ．；Ｗｉｅｇｅｌ，Ｊ．「Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐの遺伝的システム開発における進歩：加水分解酵素をコードする遺伝子の発現、２番目のシャトルベクターの開発、および染色体への遺伝子の組み込み」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：４８１７−４８２１、２０００）。それは３０−６６℃の範囲の温度、および３．８５−６．５の範囲のｐＨで増殖する。それは単糖類グルコースおよびキシロース、二糖類セロビオースおよびスクロース、および多糖類キシランおよびデンプンを含む様々なバイオマス由来基質を消費するが、セルロースは消費しない。その生物は、主な発酵産物として、エタノールおよび有機酸である乳酸および酢酸を産生する。
【００２８】
クローニングおよび配列決定
乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ−ｌｄｈ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）、および酢酸キナーゼ（ａｃｋ）遺伝子を、Ｌ−ｌｄｈに関して以前に報告されたように（Ｄｅｓａｉ、２００４）、標準的な技術を用いて、同定および配列決定した。縮重プライマーを、ＣＯＤＥ−ＨＯＰアルゴリズムを用いて作成し（Ｒｏｓｅ，Ｔ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．；Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ，Ｓ．；ＭｃＣａｌｌｕｍ，Ｃ．；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．「遠く関連した配列を増幅するためのコンセンサス縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２６（７）：１６２８−１６３５、１９９８年４月１日）、そしてＰＣＲ反応を行って保存された領域間のＤＮＡ配列を得た。保存された領域の外の遺伝子断片を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキットｖ３．１（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）と共に、ＴｈｅｒｍｏＦｉｄｅｌａｓｅ（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）酵素を用いて、ゲノムＤＮＡから直接配列決定した。
【００２９】
自殺ベクターの構築
酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼノックアウトベクター、ｐＳＧＤ９
標準的なクローニング技術に従った（Ｓｍｂｒｏｏｋ）。６．２ｋｂの自殺ベクターｐＳＧＤ９は、前に報告されたものと同様のデザインアプローチを用いて（Ｄｅｓａｉ、２００４；Ｍａｉ、２０００）、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づいた。ｐｔａ／ａｃｋ配列の遺伝子断片、ｐｔａ−ｕｐ（〜１．２ｋｂ）およびａｃｋ−ｄｏｗｎ（〜０．６ｋｂ）を、プライマーペア配列番号第１−２番および配列番号第３−４番を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ増幅を、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行い、そしてその断片を１％の電気泳動ゲルから抽出した。断片ｐｔａ−ｕｐおよびａｃｋ−ｄｏｗｎを次いで、ＴａｑポリメラーゼでＡ−ｔａｉｌ処理し、そしてＴＯＰＯ ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングした。カナマイシンマーカーを含む１．５ｋｂの断片を、ｐＩＫＭ１のＰｓｔＩ／ＸｂａＩ消化物から得て、そしてｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＳＫ（＋）にサブクローニングした。ｐｔａ−ｕｐを含むＴＯＰＯをＸｈｏＩ／ＢｓｉＨＫＡＩで消化し、そしてＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ消化したｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＳＫ（＋）に、以前にサブクローニングしたカナマイシンマーカーの上流にサブクローニングした。ａｃｋ−ｄｏｗｎを含むＴＯＰＯを、ＸｂａＩ／ＳｐｈＩで消化し、そしてｐＵＣ１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。ａｃｋ−ｄｏｗｎを含むＸｂａＩ／ＡｆｌＩＩＩ断片を、消化し、そしてカナマイシンマーカーの下流にサブクローニングして、最終的な構築物ｐＳＧＤ９を得た。
【００３０】
エリスロマイシン耐性を有する乳酸デヒドロゲナーゼノックアウトベクター、ｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ
５．５ｋｂの自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍは、Ｄｅｓａｉら、２００４によって産生されたようなプラスミドｐＳＧＤ８に基づいた。ａｐｈカナマイシン抗生物質マーカーの代わりに、プラスミドｐＩＫＭ１由来のａｐｈプロモーターおよびプラスミドｐＣＴＣ１由来のエリスロマイシン耐性を与えるアデニンメチラーゼ遺伝子に基づく融合遺伝子（Ｋｌａｐａｔｃｈ，Ｔ．Ｒ．；Ｇｕｅｒｉｎｏｔ，Ｍ．Ｌ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの電気形質転換」Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６（６）３４２−７、１９９６年６月）を、選択のために用いた。ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔａｔｅｇｅｎｅ）およびａｐｈプロモーターに関しては配列番号第５−６番、およびアデニンメチラーゼオープンリーディングフレームに関しては配列番号第７−８番のプライマーを用いて、ＰＣＲ遺伝子断片を産生した。断片をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ（ａｐｈ断片）およびＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ（アデニンメチラーゼ）で消化し、そしてｐＩＫＭ１の複数のクローニング部位にライゲーションした。この融合遺伝子を、次いでＢｓｅＲＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、そして同様に消化したｐＳＧＤ８にライゲーションした。
【００３１】
Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの形質転換
Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの形質転換を、２つの方法で交換可能に行い、１つは以前に記載されたものであり（Ｍａｉ，Ｖ．：Ｌｏｒｅｎｚ，Ｗ．；Ｗｅｉｇｅｌ，Ｊ．「カナマイシン耐性を与えるプラスミドＰＩＫＭ１による、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．系統ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５の形質転換」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４８：１６３−１６７、１９９７）、および２つ目は細胞回収後にいくつかの修飾を有するものであり、そしてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍに関して開発された方法に基づいた（Ｔｙｕｒｉｎ，Ｍ．Ｖ．；Ｄｅｓａｉ，Ｓ．Ｇ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの電気形質転換」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（２）：８８３−８９０、２００４）。細胞を、前もって還元した培地ＤＳＭＺ１２２を用いて、５５℃に維持したインキュベーター中で、嫌気性チャンバーの中で、滅菌ディスポーザブル培養チューブで一晩増殖させた。その後、細胞を、最初の誘導期の後に培地に加えた、細胞壁を弱める薬剤である４μｇ／ｍｌのイソニコチン酸ヒドラジド（イソナイアシン（ｉｓｏｎｉａｃｉｎ））（Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｊ．；Ｂｏｓｃｈｌｏｏ，Ｊ．Ｇ．；ｄｅ Ｂｏｎｔ，Ｊ．Ａ．Ｍ．「エレクトロポレーションによるＭ．ａｕｒｕｍの形質転換：形質転換効率の増強におけるグリシン、リゾチーム、およびイソニコチン酸ヒドラジドの使用」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７２、２２１−２２４、１９９０）と共に継代培養した。対数期の細胞を回収し、そして前もって還元した冷却滅菌２００ｍＭセロビオース溶液で洗浄し、そして同じ溶液に再懸濁し、そして氷上に維持した。細胞の回収後、それらを遠心の間も含めてずっと冷たく（約４℃）維持するために、非常に注意をした。
【００３２】
９０μｌの細胞懸濁液およびパルス適用の直前に加えた２から６μｌのｐＳＧＤ９またはｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（１から３μｇ）から成るサンプルを、電気形質転換キュベットとしてはたらく滅菌２ｍｌポリプロピレン微量遠心ディスポーザブルチューブに入れた。パルス長を１０ｍｓに設定した方形波を、あつらえたパルスジェネレーター／チタン電極システムを用いて適用した。細胞における電気孔の形成に対応する電圧閾値を、パルス電圧が２００Ｖの増加で直線的に増加する場合に、非線形の電流変化として評価した。所定のＤＮＡ濃度で、形質転換収率対細胞生存率の最もよい比を与えた特定の電圧を使用し、それは、この特定の場合には２５ｋＶ／ｃｍであった。パルスした細胞を、最初に５００μｌのＤＳＭ １２２培地で希釈し、氷上で１０分間保持し、そして次いで５５℃で４−６時間回復させた。回復後、ｐＳＧＤ９で形質転換した細胞を、カナマイシンを７５μｇ／ｍｌで含む２％の寒天培地と混合し、そしてペトリ皿に注ぎ、そして嫌気性のジャーで４日間インキュベートした。ｐＳＧＤ８−Ｅｒｍで形質転換した細胞を、４８℃で４−６時間回復させ、そしてエリスロマイシンを５μｇ／ｍｌで含むｐＨ６．０の２％寒天培地か、または同様の液体培地にまき、そして嫌気性のジャーで、４８℃で６日間インキュベートした。形質転換細胞の系統のいずれかを、さらなる操作なしに使用し得る。しかし、有機酸を産生する能力を与える全ての遺伝子の発現を排除した生物を、２番目の（連続的な）形質転換を行うことによって得た。第１次の形質転換体を、非形質転換細胞懸濁液の代わりに用いて、２番目の形質転換を、上記で記載したように行った。２番目の形質転換体、ＡＬＫ１を、カナマイシンおよびエリスロマイシンを両方含む培地で増殖させた。
【００３３】
ノックアウト領域の配列決定
部位特異的ノックアウト領域の配列決定を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびゲノムおよび自殺ベクター間の相同的オーバーラップ領域の外側のプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲによって行った。ＰＣＲ産物の内側のプライマーを、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキットｖ３．１（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）による配列決定のために使用した。ＣＡＰ３ソフトウェアプログラム（Ｈｕａｎｇ，Ｘ．「改良した配列アッセンブリープログラム」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３：２１−３１、１９９６）を用いて領域を配置し、そしてＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズム（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．；Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｊ．；Ｆｕｃｈｓ，Ｒ．「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ：複数の配列アラインメントのための改良されたソフトウェア」Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ）、８（２）：１８９−１９１、１９９２）を用いて、予測されるＤＮＡ配列と比較した。実験的に編集された配列および公知の野生型および自殺ベクター配列に基づいて予測される配列間には、高い程度の相同性（同一性パーセント）が存在した（図３および４）。
【００３４】
「同一性」は、核酸またはアミノ酸分子のペア間の比較を指す。配列同一性を決定する方法は公知である。例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９のアルゴリズムを用いる、ＧＡＰプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のような、この目的のために通常採用されるコンピュータープログラムを参照のこと。
【００３５】
変異系統の検証
変異系統Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ＡＬＫ１（「ＡＬＫ１」）由来のゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定によって、Ｌ−ｌｄｈおよびｐｔａ／ａｃｋ遺伝子座において、予測される部位特異的相同的組み換えを示した。両方の組み込みイベントは、２本鎖の組み込み（ｄｏｕｂｌｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）であり、それはより遺伝的に安定な遺伝子型である。
【００３６】
実施例２
ＡＬＫ１および野生型Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍによるエタノールの産生を示す比較データ
Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍを、２．５ｇ／Ｌの酵母抽出物を含む、部分的に既知組成のＭＴＣ培地中で増殖させた（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「嫌気性セルロース発酵中の細胞およびセルラーゼ量濃度の定量：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍバッチ培養への適用を伴う、酵素結合免疫吸着測定法に基づく方法の開発」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５：２１９−２２２、２００３）。グルコース、キシロース、酢酸、乳酸およびエタノールを、Ａｍｉｎｅｘ ８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で、５５℃におけるＨＰＬＣによって分析した。移動相は、０．７ｍｌ／ｍｉｎの流速で、５ｍＭの硫酸から成っていた。検出は、Ｗａｔｅｒｓ４１０屈折計（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて、屈折率によった。酢酸の最低検出レベルは、１．０ｍＭであった。５ｇ／Ｌのキシロース、５ｇ／Ｌの乳酸、５ｇ／Ｌの酢酸、および５ｇ／Ｌのエタノールを含む標準トレースを、図５に示す。
【００３７】
系統ＡＬＫ１は、１７ｇ／Ｌまでのキシロース、または５ｇ／Ｌのキシロースおよび５ｇ／Ｌのグルコースで、エタノールのみを産生し、有機酸または他の産物はＨＰＬＣによって検出されなかった。図６は、０時におけるＡＬＫ１系統の発酵を示し、そして図７は、７２時間における同じ発酵を示す。６．０の最初のｐＨ、５５℃、および１００ｒｐｍでの、８ｇ／ＬのＭＥＳで緩衝化されたキシロース培地における、系統ＡＬＫ１および野生型の時間経過発酵プロットは、系統ＡＬＫ１は、９９％以上のキシロースをエタノールへ変換でき（図８）、一方同様の条件下の野生型は、有機酸産生のためにｐＨ制限され、そして存在する全てのキシロースを消費できないことを示す（図９）。野生型生物は０．１５ｍＭのエタノールを産生し、一方ＡＬＫ１は０．４６ｍＭのエタノールを産生した。
【００３８】
実施例３
ＡＬＫ１の進化
図１０に示すように、供給基質濃度を時間につれて増加させる連続培養を用いて、ＡＬＫ１に負荷をかけた。図１０は、連続培養中のキシロース、キシルロースおよびエタノール濃度を示す。このストレス−進化サイクルに１０００時間以上接触させた後、改良された系統、ＡＬＫ２が、発酵ブロスから単離された。ＡＬＫ２は、バッチ培養において５０ｇ／Ｌのキシロースで増殖を開始できた。図１１は、系統ＡＬＫ２による発酵中の、キシロース、有機酸、吸光度（ＯＤ）およびエタノール濃度を示す。
【００３９】
実施例４
好熱性同時糖化および発酵
いくつかの熱耐性酵母系統を、４０−４５℃の温度で、ＳＳＦによるエタノール産生に関して試験し、これらより上の温度では収率が減少した（Ｂａｎａｔ，Ｉ．Ｍ．；Ｎｉｇａｍ，Ｐ．；Ｓｉｎｇｈ，Ｄ．；Ｍａｒｃｈａｎｔ，Ｒ．；ＭｃＨａｌｅ，Ａ．Ｐ．「概説：上昇した温度およびアルコール濃度におけるエタノール産生：第Ｉ部−酵母一般」Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８０９−８２１、１９９８）。それに加えて、Ｐａｔｅｌらは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ系統を用いて、乳酸の産生に関して、５０℃でのＳＳＦを実証した（Ｐａｔｅｌ，Ｍ．Ａ．；Ｏｕ，Ｍ．Ｓ．；Ｉｎｇｒａｍ，Ｌ．Ｏ．；Ｓｈａｎｍｕｇａｍ，Ｋ．Ｔ．「熱耐性好酸性Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．による結晶セルロースおよびサトウキビバガスヘミセルロース加水分解産物の乳酸への同時糖化および共発酵」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１：１４５３−１４６０、２００５）。しかし、５０℃における酵素の必要量が減少したエタノールの産生に関して、好熱性ＳＳＦは以前に実証されていなかった。
【００４０】
上記で議論したように、本開示によって形質転換された好熱性生物は、ＳＳＦ処理におけるセルラーゼ活性に実質的に最適なその増殖条件のために、リグノセルロースバイオマスのエタノールへの変換において、有意な節約に寄与する可能性を有する。例えば、ＡＬＫ１およびＡＬＫ２は、５０℃およびｐＨ５．０で増殖し得る嫌気性好熱菌であり、一方最適なセルラーゼ活性パラメーターは、４−５の間のｐＨおよび４０−５０℃の間の温度を含む。
【００４１】
バッチ反応器において、５０℃で、１．５Ｌスケールで行われた好熱性同時糖化および発酵（ｔＳＳＦ）反応において、ＡＬＫ２を４ＦＰＵ／ｇのＴ．ｒｅｅｓｅｉセルラーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）と組み合わせて使用し、固体基質Ａｖｉｃｅｌ（２０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌおよび８０ｇ／Ｌ）からエタノールを産生した。１６時間の発酵後、可溶性の糖は測定されず、そしていずれの試験においても０．５ｇ／Ｌより少ない乳酸が産生された。図１２は、ｔＳＳＦ反応が８０ｇ／ｌのＡｖｉｃｅｌに対して行われた場合、１４０時間で３０ｇ／Ｌのエタノールが産生され、３０ｇ／Ｌのエタノールのうち２５ｇ／Ｌが最初の５０時間に産生されたことを示す。図１３は、図１２で説明した反応に関するエタノール収率を示す。収率を、グルコース等価物１グラムあたり０．５１ｇのエタノールの理論的な最大値に基づいて計算した。２０ｇ／ＬのＡｖｉｃｅｌにおいて、１４０時間で約９０％の変換が達成された。
【００４２】
Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍは、ペントースおよびヘキソース糖を両方発酵し得ることが認識される。従って開示された生物を、同時糖化および共発酵（ＳＳＣＦ）反応において使用し得、ここでヘミセルロースをペントース糖に変換する酵素（例えばキシラーゼ）を、セルラーゼと組み合わせて利用し得る。
【００４３】
ＡＬＫ１の寄託
ＡＬＫ１を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託した。２００５年１１月１日に寄託し、そしてＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−７２０６を受け取った。この寄託は、ブタペスト条約の必要条件に従って行われ、寄託の期間は、寄託日から３０年間、または寄託所における寄託の最後の依頼から５年間、またはこの申請から発達した米国特許の施行期間の、いずれか長いものである。ＡＬＫ１は、寄託所において生育不能になったら補充される。
【００４４】
特定の実施態様の説明は、一般的な概念を明らかにし、それを様々な適用または一般的な概念から離れない使用のために他者が修飾および／または適合させ得る。従って、そのような適合および修飾は、開示された実施態様の等価物の目的および範囲内に含まれるべきであり、そしてそのように意図される。本明細書中で採用される語句または専門用語は、説明の目的のためであり、そして制限のためでないことが理解される。
【００４５】
前述の実施例を、あらゆるグラム陽性細菌、および特にＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｏｔｅａｒｏｅｎｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属のメンバーに対して使用するために適当に修飾し得る。
【００４６】
この申請において言及された全ての参考文献は、本明細書中で完全に繰り返されたように同じ程度、参考文献に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】解糖経路の反応を示す。
【図２】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの様々なノックアウト系統と比較した、野生型Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍにおける水素産生を示す。
【図３−１】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ９（配列番号第９番）のｌｄｈ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図３−２】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ９（配列番号第９番）のｌｄｈ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図３−３】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ９（配列番号第９番）のｌｄｈ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図３−４】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ９（配列番号第９番）のｌｄｈ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図３−５】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ９（配列番号第９番）のｌｄｈ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図４−１】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（配列番号第１０番）のｐｔａ／ａｃｋ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図４−２】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（配列番号第１０番）のｐｔａ／ａｃｋ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図４−３】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（配列番号第１０番）のｐｔａ／ａｃｋ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図４−４】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（配列番号第１０番）のｐｔａ／ａｃｋ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図４−５】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（配列番号第１０番）のｐｔａ／ａｃｋ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図４−６】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（配列番号第１０番）のｐｔａ／ａｃｋ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図５】ＡＬＫ１の増殖中の様々な時間間隔における、発酵ブロスの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トレースを示す。
【図６】ＡＬＫ１の増殖中の様々な時間間隔における、発酵ブロスの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トレースを示す。
【図７】ＡＬＫ１の増殖中の様々な時間間隔における、発酵ブロスの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トレースを示す。
【図８】系統ＡＬＫ１による発酵中の、キシロース、有機酸およびエタノール濃度を示す。
【図９】野生型Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍによる発酵中の、キシロース、有機酸およびエタノール濃度を示す。
【図１０】ＡＬＫ１の連続的培養チャレンジ中の、キシロース、有機酸およびエタノール濃度を示す。
【図１１】系統ＡＬＫ２による発酵中の、キシロース、有機酸およびエタノール濃度を示す。
【図１２】５０℃でＡＬＫ２およびセルラーゼを含む好熱性ＳＳＦ反応中の、様々なＡｖｉｃｅｌ濃度におけるエタノール産生を示す。
【図１３】図１２に示した好熱性ＳＳＦ反応のエタノール収率を示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年５月１日に出願された米国特許出願第６０／７９６，３８０号への優先権を主張する、２００６年１０月３１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０６／０４２４４２号への優先権を主張する。これらの特許はぞれぞれ、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府の利益）
米国政府は、本発明の開発に関連する研究が、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＩＳＴ）契約番号６０ＮＡＢ１Ｄ００６４により資金援助されたことから、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
（背景）
（１．発明の分野）
本発明は、エタノールを産生するためのバイオマス処理の分野に属する。特に、様々なバイオマス由来基質を消費し、そして高収率でエタノールを産生する新規好熱性生物、および産生の過程およびその生物の使用が開示される。
【背景技術】
【０００４】
（２．関連技術の説明）
バイオマスは、安価および容易に入手可能な、糖を産生し得るセルロース分解性（ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ）物質を代表する。これらの糖を単独で使用し得る、またはアルコールおよび他の産物を産生するために発酵し得る。生物変換産物の中で、エタノールは再生可能な国内燃料として使用し得るので、エタノールに関する関心は高い。
【０００５】
反応器の設計、前処理プロトコール、および分離技術の分野において、重要な研究が実施され、生物変換処理は、石油燃料技術と経済的に競合しつつある。しかし、２つまたはそれ以上の処理工程を組み合わせた場合に、最も大きく経費を節約し得ることが推定される。例えば、同時糖化および発酵（ＳＳＦ）および同時糖化および共発酵（ＳＳＣＦ）処理は、単一の反応器または連続的処理装置において、酵素的糖化工程を発酵と組み合わせる。ＳＳＦ処理において、可溶性の糖が連続的にエタノールへ発酵されるので、最終産物による阻害は除かれる。様々な加水分解産物を提供するために、複数の生物を使用する場合、ＳＳＦ処理は通常、同時糖化および共発酵（ＳＳＣＦ）処理と呼ばれる。より短い反応時間および主要な経費の抑制に関連する節約に加えて、共発酵処理はまた、そうでなければ代謝分解（ｍｅｔａｂｏｌｙｓｉｓ）または加水分解を阻害するレベルで生じるある化合物が、共発酵生物によって消費されるので、改善した産物の収率を提供し得る。そのような１つの例において、β−グルコシダーゼは、グルコースの存在下でセロビオースの加水分解を停止し、そして次にセロビオースの蓄積はセルロースの分解を阻害する。セルロースおよびヘミセルロース加水分解産物の共発酵を含むＳＳＣＦ処理は、グルコースを、β−グルコシダーゼの加水分解活性を阻害しない１つまたはそれ以上の産物へ変換することによって、この問題を軽減し得る。
【０００６】
統合バイオプロセス（ＣＢＰ）は、４つの生物学的に媒介されるイベント：（１）酵素産生、（２）基質の加水分解、（３）ヘキソースの発酵、および（４）ペントースの発酵を含む。これらのイベントを、単一の工程で行い得る。この戦略は、セルロースおよびヘミセルロースを利用する微生物を必要とする。ＣＢＰ生物の開発は、潜在的に、専用の処理工程において糖分解酵素を産生する、より従来的なアプローチと比較して、非常に大きな経費の抑制をもたらし得る。４つの生物学的に媒介されるイベントを達成するために１つ以上の生物を利用するＣＢＰ処理は、統合バイオプロセス共培養発酵と呼ばれる。
【０００７】
いくつかの細菌は、ペントースをヘキソースへ変換する能力、および解糖によってヘキソースを有機酸および他の産物の混合物に発酵する能力を有する。解糖経路は、６炭素のグルコース分子の、２つの３炭素分子のピルビン酸への変換から始まる。次いでピルビン酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ（「ｌｄｈ」）の作用によって乳酸へ、またはピルビン酸デヒドロゲナーゼまたはピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素の作用によってアセチル補酵素Ａ（「アセチル−ＣｏＡ」）へ変換され得る。アセチル−ＣｏＡはさらに、ホスホトランスアセチラーゼおよび酢酸キナーゼによって酢酸へ変換される、またはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（「ＡｃＤＨ」）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（「ａｄｈ」）によってエタノールへ還元される。全体的にみて、エタノール産生生物の能力は、エタノール以外の有機産物の産生によって、特にｌｄｈによるピルビン酸から乳酸への変換によって、およびホスホトランスアセチラーゼおよび酢酸キナーゼによるアセチル−ＣｏＡの酢酸への変換によって損なわれる。
【０００８】
細菌の代謝的操作は、最近好熱性、嫌気性、グラム陽性細菌Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍにおいて乳酸デヒドロゲナーゼのノックアウトの産生を引き起こした。Ｄｅｓａｉ，Ｓ．Ｇ．；Ｇｕｅｒｉｎｏｔ，Ｍ．Ｌ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５における、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼのクローニングおよび遺伝子ノックアウトによる乳酸産生の排除」非特許文献１を参照のこと。
【０００９】
ｌｄｈのノックアウトは、当該分野における進歩であるが、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのこの系統が、有機酸−特に酢酸を産生し続けることは、この生物のいくつかの使用に関して問題がある。
【非特許文献１】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：６００−６０５、２００４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（要旨）
本手段は、様々なバイオマス由来基質を消費し、そしてエタノールを理論的収率付近で産生する好熱性、嫌気性細菌を提供することによって、その分野を進歩させ、そして上記で概略を述べた問題を克服する。その生物を用いてエタノールを産生する方法も開示される。
【００１１】
本明細書中で報告された手段は、単独で、または組み合わせて、様々な遺伝子のノックアウトを生じ、ここでそのような遺伝子は、天然の生物においてそうでなければ有機酸の形成を引き起こす。例えば、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５における（ａ）酢酸キナーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼ、および（ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）のノックアウトが存在し得る。本明細書中で報告された結果は、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍに関するものであるが、その方法および材料を、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｏｔｅａｒｏｅｎｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属の他のメンバーにも適用する。その方法および材料は、一般的に、代謝的に操作された、好熱性、グラム陽性細菌の分野で有用である。
【００１２】
１つの実施態様において、ピルビン酸脱炭酸酵素を発現しない、単離された生物は、セルロース分解性基質を発酵して、理論的収率の少なくとも９０％である濃度でエタノールを産生する。
【００１３】
１つの実施態様において、天然の状態で、グラム陽性細菌に、発酵産物として酢酸を産生する能力を与える少なくとも１つの遺伝子を含むグラム陽性細菌を形質転換して、その少なくとも１つの遺伝子の発現を排除する。その細菌は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのような、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒであり得る。グラム陽性細菌に発酵産物として酢酸を産生する能力を与える遺伝子は、酢酸キナーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼの発現をコードし得る。
【００１４】
別の実施態様において、グラム陽性細菌をさらに形質転換して、グラム陽性細菌に発酵産物として乳酸を産生する能力を与える１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を排除し得る。例えば、乳酸を産生する能力を与える遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼであり得る。
【００１５】
１つの実施態様において、エタノールを産生する方法は、天然の生物を形質転換して、グラム陽性細菌に発酵産物として有機酸を産生する能力を与える全ての遺伝子の発現を排除するよう形質転換したグラム陽性細菌を産生して、形質転換した細菌宿主を産生すること、および形質転換した細菌宿主を、グルコース、キシロース、セロビオース、スクロース、キシラン、デンプン、およびその組み合わせから成るグループから選択される物質を含む基質を含む培地中で、適当な条件下で、基質の糖化および発酵を可能にするのに十分な時間培養することを含む。
【００１６】
１つの実施態様においてＡＬＫ１と呼ばれ、そしてＡＴＣＣにＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＰＴＡ−７２０６の項目下で寄託された微生物の、生物学的に純粋な培養物が記載される。
【００１７】
１つの実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号第１０番の配列、または（ｂ）配列番号第９番および配列番号第１０番の配列、または（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列を含む。（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、および（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチドの相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）を発現するよう遺伝的に操作された宿主細胞が記載される。別の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含む。さらに別の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１８】
１つの実施態様において、エタノールを産生する方法は、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の単離されたポリヌクレオチドの相補体を発現する変異細菌を、グルコース、キシロース、セロビオース、スクロース、キシラン、デンプン、およびその組み合わせから成るグループから選択される基質を含む培地中で、適当な条件下で、基質のエタノールへの発酵を可能にするのに十分な時間培養することを含む。
【００１９】
１つの実施態様において、エタノールを産生する方法は、反応容器内に、リグノセルロース基質、セルラーゼ、および発酵剤を含む反応混合物を提供することを含む。発酵剤は、グラム陽性細菌に、天然状態で、発酵産物として酢酸を産生する能力を与える少なくとも１つの遺伝子の発現を排除するよう形質転換したグラム陽性細菌を含む。その反応混合物を、適当な条件下で、リグノセルロース基質の糖化および発酵を可能にするのに十分な時間反応させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
バイオマスのエタノールへの変換における、好熱性、嫌気性グラム陽性細菌の操作および利用の方法を示し、そして説明する。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、もし遺伝的に操作されなければ、または他の方法でヒトの手によって意図的にその生物の遺伝的および／または表現型の構成を変化させる方式で操作されなければ、生物は「天然の状態」である。例えば、野生型の生物は、天然の状態であると考えられ得る。
【００２２】
天然の状態のＴ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍから有機酸の産生を完全に排除することは、２つの部位特異的ＤＮＡ相同的組み換えの発生を用いて達成された。変異系統、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ＡＬＫ１（「ＡＬＫ１」）は、約３０−６６℃の範囲の温度、および約３．８５−６．５の範囲のｐＨを有するバッチ培養で、低い基質の供給で、理論的な量に近いエタノールを産生する。１つの実施態様において、エタノールの収率は、理論的最大量の少なくとも約９０％である。ＡＬＫ１、およびその子孫は、ＳＳＦおよびＳＳＣＦ処理におけるセルラーゼ活性に実質的に最適である、その増殖条件のために、リグノセルロースバイオマスからエタノールへの変換において、有意な節約に寄与する可能性を有する。例えば、最適なセルラーゼ活性のパラメーターは、４−５の間のｐＨおよび４０−５０℃の間の温度を含む。さらに、有機酸を産生する能力を欠くノックアウト生物を使用する場合、発酵ブロスのｐＨを調整する必要がない。ＡＬＫ１、および同様の生物はまた、統合バイオプロセス共培養発酵にも適当であり得、ここでそのノックアウト生物は、ペントースをエタノールへ変換し、そしてセルロースはＣ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのような、セルロース分解性生物によって分解される。
【００２３】
好熱性の温度でＳＳＦ、ＳＳＣＦ、またはＣＢＰ処理のいずれかを行うことは、３０−３７℃の従来の中温性の発酵温度に比べていくつかの重要な利点を提供する。特に、好熱性温度におけるより高い酵素活性のために、所定の量の変換を達成するために必要な酵素の濃度を抑制し得る。結果として、セルラーゼ産生に費やされる処理工程の経費が、好熱性ＳＳＦおよびＳＳＣＦに関しては実質的に抑制され（例えば２倍またはそれ以上）、そしてＣＢＰに関しては排除される。発酵槽の冷却および発酵前および後の熱交換に関連する経費も、好熱性ＳＳＦ、ＳＳＣＦ、およびＣＢＰに関して抑制されることが予測される。最後に、好熱性生体触媒を特徴とする処理は、従来の中温性生体触媒を特徴とする処理と比較して、微生物が混入しにくくあり得る。
【００２４】
天然に存在するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの組み換え系統のような、公知の「ホモエタノール発酵」微生物と対照的に、現在開示される生物は、ピルビン酸脱炭酸酵素の作用によるピルビン酸からアセトアルデヒドへの変換に依存しない（図１、９を参照のこと）。実際、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌は、天然の状態でピルビン酸脱炭酸酵素を発現しない。図１に示す解糖経路の反応から、ピルビン酸は、酵素ピルビン酸−フェレドキシン酸化還元酵素２によって、アセチルＣｏＡ、二酸化炭素、および還元フェレドキシンに代謝され得る。しかし、唯一の発酵産物としてエタノールを産生するために、還元フェレドキシンによって運ばれる電子は、全てＮＡＤ：フェレドキシン酸化還元酵素３によってＮＡＤに転移され、ＮＡＤＨを形成しなければならない。ＮＡＤＨは続いて、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ７およびアルコールデヒドロゲナーゼ８によって、アセチルＣｏＡのエタノールへの２段階の還元の過程において、ＮＡＤにまた酸化される。ＮＡＤＨの効率的な利用の証拠を、図２において、ａｃｋおよびｐｔａを発現できない酢酸ノックアウト生物、およびａｃｋ、ｐｔａ、およびｌｄｈを発現できないダブルノックアウト生物（ＡＬＫ１）の両方による、Ｈ２の産生の減少として観察し得る。これらの生物は、還元フェレドキシンからＮＡＤへ、そして続いてエタノールへの化学量論的な電子移動の最初の実証を提供する。
【００２５】
ＰＤＣを発現する能力を有さない生物において、化学量論的なエタノール収率を産生する、上記で記載した経路は、以前に記載されたホモエタノール発酵系統の全てにおいて採用された経路と対照的である。以前に記載された系統は、内因性のピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）を利用する、または外来性のＰＤＣを発現するように操作される。ＰＤＣの発現は、微生物の世界ではまれであるので、電子の流れを、炭素の流れに対する修飾によって切り換える能力は、広い意味を有する。例えば、このアプローチを使用して、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ以外の系統において、高いエタノール収率を生じ得る、および／またはエタノール以外の溶媒を生じ得る。特に、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｅｒ属のメンバーのようなグラム陽性細菌；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよび他の好熱性および中温性Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ；好熱性および中温性Ｂａｃｉｌｌｕｓ種；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａのようなグラム陰性細菌；Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓおよび他のＦｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ種；Ｔｈｅｒｍｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａおよび他のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ種；およびＮｅｏｃａｌｌｉｍａｔｉｘおよびＰｉｒｏｍｙｃｅｓ種を含む嫌気性真菌は、ＰＤＣを発現する能力を欠き、そして開示された手段から利益を得得る。
【００２６】
糖化されて１つまたはそれ以上のグルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナンおよびデンプンを産生する、リグノセルロース材料を、開示される生物によって利用し得ることが認識される。様々な実施態様において、リグノセルロースバイオマスは、木、トウモロコシの茎や葉、おがくず、樹皮、葉、農業および森林の残留物、スイッチグラスのような草、反芻動物の消化産物、市の廃棄物、製紙工場の廃棄物、新聞、厚紙、またはその組み合わせを含む。
【実施例】
【００２７】
実施例１
ＡＬＫ１系統の産生
材料および方法
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ系統ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５（ＤＳＭ８６９１）は、イエローストーン国立公園、ワイオミングのＷｅｓｔ Ｔｈｕｍｂ Ｂａｓｉｎから単離された好熱性、嫌気性の細菌である（Ｌｕｉ，Ｓ．Ｙ．；Ｇｈｅｒａｒｄｉｎｉ，Ｆ．Ｃ．；Ｍａｔｕｓｃｈｅｋ，Ｍ．；Ｂａｈｌ，Ｈ．；Ｗｉｅｇｅｌ，Ｊ．「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ系統ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５由来の大きなＳ層関連エンドキシラナーゼをコードする遺伝子のクローニング、配列決定および発現」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１５３９−１５４７、１９９６；Ｍａｉ，Ｖ．；Ｗｉｅｇｅｌ，Ｊ．「Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐの遺伝的システム開発における進歩：加水分解酵素をコードする遺伝子の発現、２番目のシャトルベクターの開発、および染色体への遺伝子の組み込み」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：４８１７−４８２１、２０００）。それは３０−６６℃の範囲の温度、および３．８５−６．５の範囲のｐＨで増殖する。それは単糖類グルコースおよびキシロース、二糖類セロビオースおよびスクロース、および多糖類キシランおよびデンプンを含む様々なバイオマス由来基質を消費するが、セルロースは消費しない。その生物は、主な発酵産物として、エタノールおよび有機酸である乳酸および酢酸を産生する。
【００２８】
クローニングおよび配列決定
乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ−ｌｄｈ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）、および酢酸キナーゼ（ａｃｋ）遺伝子を、Ｌ−ｌｄｈに関して以前に報告されたように（Ｄｅｓａｉ、２００４）、標準的な技術を用いて、同定および配列決定した。縮重プライマーを、ＣＯＤＥ−ＨＯＰアルゴリズムを用いて作成し（Ｒｏｓｅ，Ｔ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．；Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ，Ｓ．；ＭｃＣａｌｌｕｍ，Ｃ．；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．「遠く関連した配列を増幅するためのコンセンサス縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２６（７）：１６２８−１６３５、１９９８年４月１日）、そしてＰＣＲ反応を行って保存された領域間のＤＮＡ配列を得た。保存された領域の外の遺伝子断片を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキットｖ３．１（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）と共に、ＴｈｅｒｍｏＦｉｄｅｌａｓｅ（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）酵素を用いて、ゲノムＤＮＡから直接配列決定した。
【００２９】
自殺ベクターの構築
酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼノックアウトベクター、ｐＳＧＤ９
標準的なクローニング技術に従った（Ｓｍｂｒｏｏｋ）。６．２ｋｂの自殺ベクターｐＳＧＤ９は、前に報告されたものと同様のデザインアプローチを用いて（Ｄｅｓａｉ、２００４；Ｍａｉ、２０００）、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づいた。ｐｔａ／ａｃｋ配列の遺伝子断片、ｐｔａ−ｕｐ（〜１．２ｋｂ）およびａｃｋ−ｄｏｗｎ（〜０．６ｋｂ）を、プライマーペア配列番号第１−２番および配列番号第３−４番を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ増幅を、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行い、そしてその断片を１％の電気泳動ゲルから抽出した。断片ｐｔａ−ｕｐおよびａｃｋ−ｄｏｗｎを次いで、ＴａｑポリメラーゼでＡ−ｔａｉｌ処理し、そしてＴＯＰＯ ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングした。カナマイシンマーカーを含む１．５ｋｂの断片を、ｐＩＫＭ１のＰｓｔＩ／ＸｂａＩ消化物から得て、そしてｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＳＫ（＋）にサブクローニングした。ｐｔａ−ｕｐを含むＴＯＰＯをＸｈｏＩ／ＢｓｉＨＫＡＩで消化し、そしてＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ消化したｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＳＫ（＋）に、以前にサブクローニングしたカナマイシンマーカーの上流にサブクローニングした。ａｃｋ−ｄｏｗｎを含むＴＯＰＯを、ＸｂａＩ／ＳｐｈＩで消化し、そしてｐＵＣ１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。ａｃｋ−ｄｏｗｎを含むＸｂａＩ／ＡｆｌＩＩＩ断片を、消化し、そしてカナマイシンマーカーの下流にサブクローニングして、最終的な構築物ｐＳＧＤ９を得た。
【００３０】
エリスロマイシン耐性を有する乳酸デヒドロゲナーゼノックアウトベクター、ｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ
５．５ｋｂの自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍは、Ｄｅｓａｉら、２００４によって産生されたようなプラスミドｐＳＧＤ８に基づいた。ａｐｈカナマイシン抗生物質マーカーの代わりに、プラスミドｐＩＫＭ１由来のａｐｈプロモーターおよびプラスミドｐＣＴＣ１由来のエリスロマイシン耐性を与えるアデニンメチラーゼ遺伝子に基づく融合遺伝子（Ｋｌａｐａｔｃｈ，Ｔ．Ｒ．；Ｇｕｅｒｉｎｏｔ，Ｍ．Ｌ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの電気形質転換」Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６（６）３４２−７、１９９６年６月）を、選択のために用いた。ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔａｔｅｇｅｎｅ）およびａｐｈプロモーターに関しては配列番号第５−６番、およびアデニンメチラーゼオープンリーディングフレームに関しては配列番号第７−８番のプライマーを用いて、ＰＣＲ遺伝子断片を産生した。断片をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ（ａｐｈ断片）およびＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ（アデニンメチラーゼ）で消化し、そしてｐＩＫＭ１の複数のクローニング部位にライゲーションした。この融合遺伝子を、次いでＢｓｅＲＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、そして同様に消化したｐＳＧＤ８にライゲーションした。
【００３１】
Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの形質転換
Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの形質転換を、２つの方法で交換可能に行い、１つは以前に記載されたものであり（Ｍａｉ，Ｖ．：Ｌｏｒｅｎｚ，Ｗ．；Ｗｅｉｇｅｌ，Ｊ．「カナマイシン耐性を与えるプラスミドＰＩＫＭ１による、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．系統ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５の形質転換」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４８：１６３−１６７、１９９７）、および２つ目は細胞回収後にいくつかの修飾を有するものであり、そしてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍに関して開発された方法に基づいた（Ｔｙｕｒｉｎ，Ｍ．Ｖ．；Ｄｅｓａｉ，Ｓ．Ｇ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの電気形質転換」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（２）：８８３−８９０、２００４）。細胞を、前もって還元した培地ＤＳＭＺ１２２を用いて、５５℃に維持したインキュベーター中で、嫌気性チャンバーの中で、滅菌ディスポーザブル培養チューブで一晩増殖させた。その後、細胞を、最初の誘導期の後に培地に加えた、細胞壁を弱める薬剤である４μｇ／ｍｌのイソニコチン酸ヒドラジド（イソナイアシン（ｉｓｏｎｉａｃｉｎ））（Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｊ．；Ｂｏｓｃｈｌｏｏ，Ｊ．Ｇ．；ｄｅ Ｂｏｎｔ，Ｊ．Ａ．Ｍ．「エレクトロポレーションによるＭ．ａｕｒｕｍの形質転換：形質転換効率の増強におけるグリシン、リゾチーム、およびイソニコチン酸ヒドラジドの使用」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７２、２２１−２２４、１９９０）と共に継代培養した。対数期の細胞を回収し、そして前もって還元した冷却滅菌２００ｍＭセロビオース溶液で洗浄し、そして同じ溶液に再懸濁し、そして氷上に維持した。細胞の回収後、それらを遠心の間も含めてずっと冷たく（約４℃）維持するために、非常に注意をした。
【００３２】
９０μｌの細胞懸濁液およびパルス適用の直前に加えた２から６μｌのｐＳＧＤ９またはｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（１から３μｇ）から成るサンプルを、電気形質転換キュベットとしてはたらく滅菌２ｍｌポリプロピレン微量遠心ディスポーザブルチューブに入れた。パルス長を１０ｍｓに設定した方形波を、あつらえたパルスジェネレーター／チタン電極システムを用いて適用した。細胞における電気孔の形成に対応する電圧閾値を、パルス電圧が２００Ｖの増加で直線的に増加する場合に、非線形の電流変化として評価した。所定のＤＮＡ濃度で、形質転換収率対細胞生存率の最もよい比を与えた特定の電圧を使用し、それは、この特定の場合には２５ｋＶ／ｃｍであった。パルスした細胞を、最初に５００μｌのＤＳＭ １２２培地で希釈し、氷上で１０分間保持し、そして次いで５５℃で４−６時間回復させた。回復後、ｐＳＧＤ９で形質転換した細胞を、カナマイシンを７５μｇ／ｍｌで含む２％の寒天培地と混合し、そしてペトリ皿に注ぎ、そして嫌気性のジャーで４日間インキュベートした。ｐＳＧＤ８−Ｅｒｍで形質転換した細胞を、４８℃で４−６時間回復させ、そしてエリスロマイシンを５μｇ／ｍｌで含むｐＨ６．０の２％寒天培地か、または同様の液体培地にまき、そして嫌気性のジャーで、４８℃で６日間インキュベートした。形質転換細胞の系統のいずれかを、さらなる操作なしに使用し得る。しかし、有機酸を産生する能力を与える全ての遺伝子の発現を排除した生物を、２番目の（連続的な）形質転換を行うことによって得た。第１次の形質転換体を、非形質転換細胞懸濁液の代わりに用いて、２番目の形質転換を、上記で記載したように行った。２番目の形質転換体、ＡＬＫ１を、カナマイシンおよびエリスロマイシンを両方含む培地で増殖させた。
【００３３】
ノックアウト領域の配列決定
部位特異的ノックアウト領域の配列決定を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびゲノムおよび自殺ベクター間の相同的オーバーラップ領域の外側のプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲによって行った。ＰＣＲ産物の内側のプライマーを、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキットｖ３．１（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）による配列決定のために使用した。ＣＡＰ３ソフトウェアプログラム（Ｈｕａｎｇ，Ｘ．「改良した配列アッセンブリープログラム」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３：２１−３１、１９９６）を用いて領域を配置し、そしてＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズム（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．；Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｊ．；Ｆｕｃｈｓ，Ｒ．「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ：複数の配列アラインメントのための改良されたソフトウェア」Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ）、８（２）：１８９−１９１、１９９２）を用いて、予測されるＤＮＡ配列と比較した。実験的に編集された配列および公知の野生型および自殺ベクター配列に基づいて予測される配列間には、高い程度の相同性（同一性パーセント）が存在した（図３および４）。
【００３４】
「同一性」は、核酸またはアミノ酸分子のペア間の比較を指す。配列同一性を決定する方法は公知である。例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９のアルゴリズムを用いる、ＧＡＰプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のような、この目的のために通常採用されるコンピュータープログラムを参照のこと。
【００３５】
変異系統の検証
変異系統Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ＡＬＫ１（「ＡＬＫ１」）由来のゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定によって、Ｌ−ｌｄｈおよびｐｔａ／ａｃｋ遺伝子座において、予測される部位特異的相同的組み換えを示した。両方の組み込みイベントは、２本鎖の組み込み（ｄｏｕｂｌｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）であり、それはより遺伝的に安定な遺伝子型である。
【００３６】
実施例２
ＡＬＫ１および野生型Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍによるエタノールの産生を示す比較データ
Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍを、２．５ｇ／Ｌの酵母抽出物を含む、部分的に既知組成のＭＴＣ培地中で増殖させた（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．；Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．「嫌気性セルロース発酵中の細胞およびセルラーゼ量濃度の定量：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍバッチ培養への適用を伴う、酵素結合免疫吸着測定法に基づく方法の開発」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５：２１９−２２２、２００３）。グルコース、キシロース、酢酸、乳酸およびエタノールを、Ａｍｉｎｅｘ ８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で、５５℃におけるＨＰＬＣによって分析した。移動相は、０．７ｍｌ／ｍｉｎの流速で、５ｍＭの硫酸から成っていた。検出は、Ｗａｔｅｒｓ４１０屈折計（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて、屈折率によった。酢酸の最低検出レベルは、１．０ｍＭであった。５ｇ／Ｌのキシロース、５ｇ／Ｌの乳酸、５ｇ／Ｌの酢酸、および５ｇ／Ｌのエタノールを含む標準トレースを、図５に示す。
【００３７】
系統ＡＬＫ１は、１７ｇ／Ｌまでのキシロース、または５ｇ／Ｌのキシロースおよび５ｇ／Ｌのグルコースで、エタノールのみを産生し、有機酸または他の産物はＨＰＬＣによって検出されなかった。図６は、０時におけるＡＬＫ１系統の発酵を示し、そして図７は、７２時間における同じ発酵を示す。６．０の最初のｐＨ、５５℃、および１００ｒｐｍでの、８ｇ／ＬのＭＥＳで緩衝化されたキシロース培地における、系統ＡＬＫ１および野生型の時間経過発酵プロットは、系統ＡＬＫ１は、９９％以上のキシロースをエタノールへ変換でき（図８）、一方同様の条件下の野生型は、有機酸産生のためにｐＨ制限され、そして存在する全てのキシロースを消費できないことを示す（図９）。野生型生物は０．１５ｍＭのエタノールを産生し、一方ＡＬＫ１は０．４６ｍＭのエタノールを産生した。
【００３８】
実施例３
ＡＬＫ１の進化
図１０に示すように、供給基質濃度を時間につれて増加させる連続培養を用いて、ＡＬＫ１に負荷をかけた。図１０は、連続培養中のキシロース、キシルロースおよびエタノール濃度を示す。このストレス−進化サイクルに１０００時間以上接触させた後、改良された系統、ＡＬＫ２が、発酵ブロスから単離された。ＡＬＫ２は、バッチ培養において５０ｇ／Ｌのキシロースで増殖を開始できた。図１１は、系統ＡＬＫ２による発酵中の、キシロース、有機酸、吸光度（ＯＤ）およびエタノール濃度を示す。
【００３９】
実施例４
好熱性同時糖化および発酵
いくつかの熱耐性酵母系統を、４０−４５℃の温度で、ＳＳＦによるエタノール産生に関して試験し、これらより上の温度では収率が減少した（Ｂａｎａｔ，Ｉ．Ｍ．；Ｎｉｇａｍ，Ｐ．；Ｓｉｎｇｈ，Ｄ．；Ｍａｒｃｈａｎｔ，Ｒ．；ＭｃＨａｌｅ，Ａ．Ｐ．「概説：上昇した温度およびアルコール濃度におけるエタノール産生：第Ｉ部−酵母一般」Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８０９−８２１、１９９８）。それに加えて、Ｐａｔｅｌらは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ系統を用いて、乳酸の産生に関して、５０℃でのＳＳＦを実証した（Ｐａｔｅｌ，Ｍ．Ａ．；Ｏｕ，Ｍ．Ｓ．；Ｉｎｇｒａｍ，Ｌ．Ｏ．；Ｓｈａｎｍｕｇａｍ，Ｋ．Ｔ．「熱耐性好酸性Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．による結晶セルロースおよびサトウキビバガスヘミセルロース加水分解産物の乳酸への同時糖化および共発酵」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１：１４５３−１４６０、２００５）。しかし、５０℃における酵素の必要量が減少したエタノールの産生に関して、好熱性ＳＳＦは以前に実証されていなかった。
【００４０】
上記で議論したように、本開示によって形質転換された好熱性生物は、ＳＳＦ処理におけるセルラーゼ活性に実質的に最適なその増殖条件のために、リグノセルロースバイオマスのエタノールへの変換において、有意な節約に寄与する可能性を有する。例えば、ＡＬＫ１およびＡＬＫ２は、５０℃およびｐＨ５．０で増殖し得る嫌気性好熱菌であり、一方最適なセルラーゼ活性パラメーターは、４−５の間のｐＨおよび４０−５０℃の間の温度を含む。
【００４１】
バッチ反応器において、５０℃で、１．５Ｌスケールで行われた好熱性同時糖化および発酵（ｔＳＳＦ）反応において、ＡＬＫ２を４ＦＰＵ／ｇのＴ．ｒｅｅｓｅｉセルラーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）と組み合わせて使用し、固体基質Ａｖｉｃｅｌ（２０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌおよび８０ｇ／Ｌ）からエタノールを産生した。１６時間の発酵後、可溶性の糖は測定されず、そしていずれの試験においても０．５ｇ／Ｌより少ない乳酸が産生された。図１２は、ｔＳＳＦ反応が８０ｇ／ｌのＡｖｉｃｅｌに対して行われた場合、１４０時間で３０ｇ／Ｌのエタノールが産生され、３０ｇ／Ｌのエタノールのうち２５ｇ／Ｌが最初の５０時間に産生されたことを示す。図１３は、図１２で説明した反応に関するエタノール収率を示す。収率を、グルコース等価物１グラムあたり０．５１ｇのエタノールの理論的な最大値に基づいて計算した。２０ｇ／ＬのＡｖｉｃｅｌにおいて、１４０時間で約９０％の変換が達成された。
【００４２】
Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍは、ペントースおよびヘキソース糖を両方発酵し得ることが認識される。従って開示された生物を、同時糖化および共発酵（ＳＳＣＦ）反応において使用し得、ここでヘミセルロースをペントース糖に変換する酵素（例えばキシラーゼ）を、セルラーゼと組み合わせて利用し得る。
【００４３】
ＡＬＫ１の寄託
ＡＬＫ１を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託した。２００５年１１月１日に寄託し、そしてＰａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−７２０６を受け取った。この寄託は、ブタペスト条約の必要条件に従って行われ、寄託の期間は、寄託日から３０年間、または寄託所における寄託の最後の依頼から５年間、またはこの申請から発達した米国特許の施行期間の、いずれか長いものである。ＡＬＫ１は、寄託所において生育不能になったら補充される。
【００４４】
特定の実施態様の説明は、一般的な概念を明らかにし、それを様々な適用または一般的な概念から離れない使用のために他者が修飾および／または適合させ得る。従って、そのような適合および修飾は、開示された実施態様の等価物の目的および範囲内に含まれるべきであり、そしてそのように意図される。本明細書中で採用される語句または専門用語は、説明の目的のためであり、そして制限のためでないことが理解される。
【００４５】
前述の実施例を、あらゆるグラム陽性細菌、および特にＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｏｔｅａｒｏｅｎｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属のメンバーに対して使用するために適当に修飾し得る。
【００４６】
この申請において言及された全ての参考文献は、本明細書中で完全に繰り返されたように同じ程度、参考文献に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】解糖経路の反応を示す。
【図２】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの様々なノックアウト系統と比較した、野生型Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍにおける水素産生を示す。
【図３−１】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ９（配列番号第９番）のｌｄｈ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図３−２】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ９（配列番号第９番）のｌｄｈ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図３−３】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ９（配列番号第９番）のｌｄｈ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図３−４】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ９（配列番号第９番）のｌｄｈ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図３−５】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ９（配列番号第９番）のｌｄｈ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図４−１】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（配列番号第１０番）のｐｔａ／ａｃｋ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図４−２】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（配列番号第１０番）のｐｔａ／ａｃｋ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図４−３】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（配列番号第１０番）のｐｔａ／ａｃｋ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図４−４】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（配列番号第１０番）のｐｔａ／ａｃｋ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図４−５】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（配列番号第１０番）のｐｔａ／ａｃｋ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図４−６】Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのゲノムに組み込まれた自殺ベクターｐＳＧＤ８−Ｅｒｍ（配列番号第１０番）のｐｔａ／ａｃｋ領域の実験的および予測されるポリヌクレオチド配列の比較を示す。
【図５】ＡＬＫ１の増殖中の様々な時間間隔における、発酵ブロスの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トレースを示す。
【図６】ＡＬＫ１の増殖中の様々な時間間隔における、発酵ブロスの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トレースを示す。
【図７】ＡＬＫ１の増殖中の様々な時間間隔における、発酵ブロスの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トレースを示す。
【図８】系統ＡＬＫ１による発酵中の、キシロース、有機酸およびエタノール濃度を示す。
【図９】野生型Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍによる発酵中の、キシロース、有機酸およびエタノール濃度を示す。
【図１０】ＡＬＫ１の連続的培養チャレンジ中の、キシロース、有機酸およびエタノール濃度を示す。
【図１１】系統ＡＬＫ２による発酵中の、キシロース、有機酸およびエタノール濃度を示す。
【図１２】５０℃でＡＬＫ２およびセルラーゼを含む好熱性ＳＳＦ反応中の、様々なＡｖｉｃｅｌ濃度におけるエタノール産生を示す。
【図１３】図１２に示した好熱性ＳＳＦ反応のエタノール収率を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース分解性基質の糖化産物を発酵して、理論的収率の少なくとも９０％である濃度でエタノールを産生する、単離された生物であって、該生物はピルビン酸脱炭酸酵素を発現しない、生物。
【請求項２】
エタノールを産生するための方法であって、該方法は：
天然の生物を形質転換して、請求項１に記載の単離された生物を生成し、形質転換した宿主を提供する工程；ならびに
該形質転換した宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、デンプンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含む培地中で、適当な条件下で、該基質の糖化および発酵を可能にするのに十分な時間、培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
形質転換した生物であって、以下：
グラム陽性細菌であって、天然の状態において、該グラム陽性細菌に発酵産物として酢酸を産生する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子を含む、グラム陽性細菌、
を含み、該グラム陽性細菌は、該少なくとも１つの遺伝子の発現を排除するように形質転換されている、形質転換した生物。
【請求項４】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属のメンバーである、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項５】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項６】
前記少なくとも１つの遺伝子が酢酸キナーゼの発現をコードする、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項７】
前記少なくとも１つの遺伝子がホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項８】
前記少なくとも１つの遺伝子が複数の遺伝子を含む、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項９】
前記複数の遺伝子が酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、請求項８に記載のグラム陽性細菌。
【請求項１０】
前記グラム陽性細菌に発酵産物として乳酸を産生する能力を付与する１つ以上の遺伝子の発現を排除するようにさらに形質転換される、請求項９に記載のグラム陽性細菌。
【請求項１１】
前記グラム陽性細菌に発酵産物として乳酸を産生する能力を付与する１つ以上の遺伝子の発現を排除するようにさらに形質転換される、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの遺伝子が乳酸デヒドロゲナーゼの発現をコードする、請求項１１に記載のグラム陽性細菌。
【請求項１３】
エタノールを産生するための方法であって、該方法は：
天然の生物を形質転換して、請求項１１に記載のグラム陽性細菌を産生し、形質転換した細菌宿主を産生する工程；ならびに
該形質転換した宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、デンプンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含む培地中で、適当な条件下で、該基質の糖化および発酵を可能にするのに十分な時間、培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記細菌宿主がＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＡＬＫ１と呼ばれ、Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＰＴＡ−７２０６の下に寄託された、微生物の生物学的に純粋な培養物。
【請求項１７】
単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
（ａ）配列番号１０の配列；
（ｂ）配列番号９および配列番号１０の配列；または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有する、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドの相補体を発現するように遺伝的に操作された宿主細胞。
【請求項２１】
細菌細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
エタノールを産生する方法であって、該方法は：
請求項２１に記載の変異体細菌を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、デンプンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含む培地中で、適当な条件下で、該基質のエタノールへの発酵を可能にするのに十分な時間、培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記変異体細菌が、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変異体細菌が、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＬＫ１（ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ＡＬＫ１）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細菌中で発現可能なプロモーターに作動可能に連結された配列番号１０を含む、遺伝子構築物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の遺伝子構築物を含む組換え細菌。
【請求項２７】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、請求項２６に記載の組換え細菌。
【請求項２８】
エタノールを産生するための方法であって、該方法は：
反応容器内に、リグノセルロース基質、セルラーゼおよび発酵剤を含む反応混合物を提供する工程を包含し、該発酵剤はグラム陽性細菌を含み、該グラム陽性細菌は、天然の状態で、該グラム陽性細菌に発酵産物として酢酸を産生する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子の発現を排除するように形質転換されており、該反応混合物を、適当な条件下で、該リグノセルロース基質の糖化および発酵を可能にするのに十分な時間、反応させる、方法。
【請求項２９】
前記適当な条件が、少なくとも５０℃の温度を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記グラム陽性細菌が、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｔｏｂａｃｔｅｒ属のメンバーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記グラム陽性細菌が、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの遺伝子が、酢酸キナーゼの発現をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの遺伝子が、ホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの遺伝子が、複数の遺伝子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数の遺伝子が、酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記グラム陽性細菌を形質転換して、該グラム陽性細菌に発酵産物として乳酸を産生する能力を付与する１つ以上の遺伝子の発現を排除する工程をさらに包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼの発現をコードする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記グラム陽性細菌を形質転換して、該グラム陽性細菌に発酵産物として乳酸を産生する能力を付与する１つ以上の遺伝子の発現を排除する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼの発現をコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項１】
セルロース分解性基質の糖化産物を発酵して、理論的収率の少なくとも９０％である濃度でエタノールを産生する、単離された生物であって、該生物はピルビン酸脱炭酸酵素を発現しない、生物。
【請求項２】
エタノールを産生するための方法であって、該方法は：
天然の生物を形質転換して、請求項１に記載の単離された生物を生成し、形質転換した宿主を提供する工程；ならびに
該形質転換した宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、デンプンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含む培地中で、適当な条件下で、該基質の糖化および発酵を可能にするのに十分な時間、培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
形質転換した生物であって、以下：
グラム陽性細菌であって、天然の状態において、該グラム陽性細菌に発酵産物として酢酸を産生する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子を含む、グラム陽性細菌、
を含み、該グラム陽性細菌は、該少なくとも１つの遺伝子の発現を排除するように形質転換されている、形質転換した生物。
【請求項４】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属のメンバーである、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項５】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項６】
前記少なくとも１つの遺伝子が酢酸キナーゼの発現をコードする、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項７】
前記少なくとも１つの遺伝子がホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項８】
前記少なくとも１つの遺伝子が複数の遺伝子を含む、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項９】
前記複数の遺伝子が酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、請求項８に記載のグラム陽性細菌。
【請求項１０】
前記グラム陽性細菌に発酵産物として乳酸を産生する能力を付与する１つ以上の遺伝子の発現を排除するようにさらに形質転換される、請求項９に記載のグラム陽性細菌。
【請求項１１】
前記グラム陽性細菌に発酵産物として乳酸を産生する能力を付与する１つ以上の遺伝子の発現を排除するようにさらに形質転換される、請求項３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの遺伝子が乳酸デヒドロゲナーゼの発現をコードする、請求項１１に記載のグラム陽性細菌。
【請求項１３】
エタノールを産生するための方法であって、該方法は：
天然の生物を形質転換して、請求項１１に記載のグラム陽性細菌を産生し、形質転換した細菌宿主を産生する工程；ならびに
該形質転換した宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、デンプンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含む培地中で、適当な条件下で、該基質の糖化および発酵を可能にするのに十分な時間、培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記細菌宿主がＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＡＬＫ１と呼ばれ、Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＰＴＡ−７２０６の下に寄託された、微生物の生物学的に純粋な培養物。
【請求項１７】
単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
（ａ）配列番号１０の配列；
（ｂ）配列番号９および配列番号１０の配列；または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有する、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドの相補体を発現するように遺伝的に操作された宿主細胞。
【請求項２１】
細菌細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
エタノールを産生する方法であって、該方法は：
請求項２１に記載の変異体細菌を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、デンプンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含む培地中で、適当な条件下で、該基質のエタノールへの発酵を可能にするのに十分な時間、培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記変異体細菌が、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変異体細菌が、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＬＫ１（ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５ ＡＬＫ１）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細菌中で発現可能なプロモーターに作動可能に連結された配列番号１０を含む、遺伝子構築物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の遺伝子構築物を含む組換え細菌。
【請求項２７】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、請求項２６に記載の組換え細菌。
【請求項２８】
エタノールを産生するための方法であって、該方法は：
反応容器内に、リグノセルロース基質、セルラーゼおよび発酵剤を含む反応混合物を提供する工程を包含し、該発酵剤はグラム陽性細菌を含み、該グラム陽性細菌は、天然の状態で、該グラム陽性細菌に発酵産物として酢酸を産生する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子の発現を排除するように形質転換されており、該反応混合物を、適当な条件下で、該リグノセルロース基質の糖化および発酵を可能にするのに十分な時間、反応させる、方法。
【請求項２９】
前記適当な条件が、少なくとも５０℃の温度を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記グラム陽性細菌が、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｔｏｂａｃｔｅｒ属のメンバーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記グラム陽性細菌が、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの遺伝子が、酢酸キナーゼの発現をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの遺伝子が、ホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの遺伝子が、複数の遺伝子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数の遺伝子が、酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記グラム陽性細菌を形質転換して、該グラム陽性細菌に発酵産物として乳酸を産生する能力を付与する１つ以上の遺伝子の発現を排除する工程をさらに包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼの発現をコードする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記グラム陽性細菌を形質転換して、該グラム陽性細菌に発酵産物として乳酸を産生する能力を付与する１つ以上の遺伝子の発現を排除する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼの発現をコードする、請求項３８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図４−５】
【図４−６】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図４−５】
【図４−６】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１０−５０４７３４（Ｐ２０１０−５０４７３４Ａ）
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１００３１（Ｐ２００９−５１００３１）
【出願日】平成１９年５月１日（２００７．５．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６７９４１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３０９８４
【国際公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（５０４３０３７１３）ザ トラスティーズ オブ ダートマウス カレッジ (12)
【出願人】（５０８３２７２６１）マスコマ コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１日（２００７．５．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６７９４１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３０９８４
【国際公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（５０４３０３７１３）ザ トラスティーズ オブ ダートマウス カレッジ (12)
【出願人】（５０８３２７２６１）マスコマ コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
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